ES2321520T3 - Fosforilacion de proteinas en rutas de señalizacion del receptor de celulas-t. - Google Patents

Abstract

Un método para detectar o cuantificar una proteína de señalización que está fosforilada en tirosina en las rutas de señalización de receptores de las células T, comprendiendo dicho método la etapa de utilizar uno o más de los siguientes reactivos para detectar o cuantificar la proteína de señalización de receptores de células T Cdk 6 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 13 o 24: (i) un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a dicha proteína solamente cuando está fosforilada en la tirosina 13 o 24, comprendida en la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina; y/o (ii) un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de dicha proteína, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61, que comprende la tirosina fosforilada 13 o 24.

Description

Fosforilación de proteínas en rutas de señalización del receptor de células-T.

Campo de la invención

La invención se refiere en general a anticuerpos y reactivos peptídicos para la detección de la fosforilación de proteínas, y a la fosforilación de proteínas en el cáncer.

Antecedentes de la invención

La activación de proteínas por medio de la modificación post-traduccional representa un importante mecanismo celular para regular la mayoría de los aspectos de la organización y el control biológicos, incluyendo el crecimiento, el desarrollo, la homeostasis, y la comunicación celular. Por ejemplo, la fosforilación de proteínas juega un papel crítico en la etiología de muchas condiciones patológicas y enfermedades, incluyendo el cáncer, los trastornos del desarrollo, las enfermedades autoinmunitarias, y la diabetes, así como en la propia función inmunitaria. A pesar de la importancia de la modificación de las proteínas, todavía no es bien conocida a nivel molecular. Las razones de esta carencia de comprensión son, primero, que el sistema de modificación celular es extraordinariamente complejo, y segundo, que la tecnología necesaria para desentrañar su complejidad no se ha desarrollado completamente.

La complejidad de la modificación de las proteínas, incluyendo la fosforilación, a gran escala del proteoma deriva de tres factores: el gran número de proteínas modificadoras, p. ej. quinasas, codificadas por el genoma, el número mucho mayor de sitios en las proteínas sustrato que son modificadas por estas enzimas, y la naturaleza dinámica de la expresión de las proteínas durante el crecimiento, el desarrollo, los estados de enfermedad, y el envejecimiento. El genoma humano codifica, por ejemplo, más de 520 proteína quinasas diferentes, haciendo de ellas la clase más abundante de enzimas conocidas. Véase Hunter, Nature 411: 355-65 (2001). Cada una de estas quinasas fosforila restos serina, treonina, o tirosina específicos localizados en distintas secuencias de aminoácidos, o motivos, contenidos en diferentes sustratos de proteína. La mayoría de las quinasas fosforilan muchas proteínas diferentes: se estima que un tercio de todas las proteínas codificadas por el genoma humano están fosforiladas, y muchas están fosforiladas en múltiples sitios por quinasas diferentes. Véase Graves et al., Pharmacol. Ther. 82: 111-21 (1999).

Muchos de estos sitios de fosforilación regulan procesos biológicos críticos y se puede demostrar que son dianas diagnósticas o terapéuticas importantes para la medicina molecular. Por ejemplo, de los más de 100 oncogenes dominantes identificados hasta a fecha, 46 son proteína quinasas. Véase Hunter, supra. Las quinasas oncogénicas, tales como ErbB2 y Jak3, ampliamente expresadas en tumores de mama y diversas leucemias, respectivamente, transforman las células en su fenotipo oncogénico al menos en parte debido a su capacidad para fosforilar las proteínas celulares. La comprensión de qué proteínas son modificadas por estas quinasas ampliará enormemente nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a la transformación oncogénica. De este modo, la capacidad de identificar los sitios de modificación, p. ej. los sitios de fosforilación, en una amplia variedad de proteínas celulares es crucialmente importante para comprender las proteínas de señalización y las rutas claves implicadas en el progreso de la enfermedad, así como los procesos biológicos críticos tales como la respuesta inmunitaria.

La identificación eficaz de los sitios de fosforilación de las proteínas relevantes para la transducción de la señal ha estado ayudada por el reciente desarrollo de una nueva clase potente de anticuerpos, denominados anticuerpos específicos de motivos, independientes del contexto, que son capaces de unirse específicamente a motivos de señalización recurrentes, cortos que comprenden uno o más aminoácidos modificados (p. ej. fosforilados) en muchas proteínas diferentes en las cuales se repite el motivo. Véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.441.140, Comb et al . Muchos de estos nuevos potentes anticuerpos se encuentran disponibles en el mercado en la actualidad. Véase CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC. Catálogo 2003-04. Más recientemente, se ha descrito un nuevo método potente para emplear tales anticuerpos específicos de motivos en técnicas de inmunoafinidad acopladas a análisis espectrométricos de masas para identificar rápidamente péptidos modificados de mezclas biológicas. Véase la Publicación de la Patente de los Estados Unidos Núm. 20030044848, Rush et al.). Tales técnicas permitirán la rápida elucidación de los eventos de activación y fosforilación de proteínas subyacentes a enfermedades, como el cáncer, que están dirigidos por la transducción
de señales, así como aquellos procesos biológicos críticos subyacentes tales como la respuesta inmunitaria.

La transmisión de la señalización intracelular resultante de la unión del receptor de linfocitos T (receptor de células T) a un antígeno foráneo presentado con el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células presentadoras de antígenos (CPA) es un proceso crítico para la generación de una respuesta inmunitaria apropiada en mamíferos. La unión de las células T específicas del antígeno por medio del receptor de las células T da como resultado una cascada de señalización mediada por quinasas que conduce a la proliferación específica de las células T activadas, y su participación en la respuesta inmunitaria frente antígenos y células foráneos. Los defectos en la señalización de las células T han sido asociados con las leucemias linfocíticas agudas de las células T. Véase Blume-Jensen et al., Nature 411: 355-365 (2001) (que describen la translocación del gen beta del receptor de las células T siguiente al gen que
codifica el gen de la tirosina quinasa Lck, dando como resultado la activación presumiblemente constitutiva de Lck).

La señalización inducida por el receptor de las células T está mediada por una variedad de segundos mensajeros, proteína quinasas y fosfatasas, y otras enzimas e intermedios. Se sabe ahora que la unión del receptor de las células T humanas al complejo antígeno-MHC específico da como resultado la activación y/o el reclutamiento de las quinasas de la familia de Src, Lck y Fyn, que a su vez fosforilan dos restos tirosina críticos en los motivos de activación en inmunorreceptores basados en tirosina (ITAM) en la cadena invariable TCR-\xi del complejo TCR. Véanse, p. ej. Mustelin et al., Biochem J. 371: 15-27 (2003); Pitcher et al., Trends in Immunol., 24: 554-560 (2003). Este procedimiento puede implicar también la exclusión de las proteínas tirosina fosfatasas que regularían a la baja Lck y Fyn, así como la exclusión de la quinasa Csk, que regula negativamente Lck y Fyn mediante fosforilación en la tirosina C-terminal conservada (Tyr505 en Lck y Try528 en Fyn). Véase Mustelin et al., supra.

La fosforilación de los ITAM los convierte en ligandos de elevada afinidad por la quinasa ZAP-70, que es reclutada selectivamente para el complejo receptor activado, y (junto con la quinasa Syk) es activada posteriormente mediante fosforilación en la tirosina 493 (Tyr493) por la quinasa Lck. Véase Mustelin et al., Pitcher et al., supra. Tras su activación, ZAP-70, junto con Syk, fosforila a su vez otras proteínas adaptadoras clave aguas abajo (tales como LAT) y proteínas efectoras (tales como SLP-76). Adicionalmente, ciertos sitios tirosina fosforilados de ZAP-70 activada proporcionan sitios de acoplamiento clave para las proteínas efectoras que contienen dominios SH-2 como Lck y Cbl, que participan en una cascada compleja - que implica las rutas Ca^{2+}/InsP_{3}, Ras/Raf/ERK y RhoA, conduciendo por último a la regulación génica y a la proliferación celular. Véase Mustelin et al., Pitcher et al., supra.

Lucas et al, J Immunol 154(12): 6275-6284 (1995) así como Nagasawa et al, J Immunol 158(11): 5146-5154 (1997) describen que la proteína quinasa Cdk6, cuya secuencia fue publicada por Meyerson et al, EMBO J 11 (8): 2909-2917 (1992) por primera vez, está implicada en la activación de las células T como tales, pero ninguno de ellos menciona la fosforilación de tirosina. Lavarone et al, Nature 387: 417-422 (1997) describen que el TGF-beta inhibe la Cdk6 por medio de la fosforilación de la tirosina 24, pero ninguno sugiere un anticuerpo anti-fosfotirosina específico del sitio correspondiente ni establece ningún enlace con una ruta de señalización de receptores de las células T.

Aunque algunas de las proteínas de señalización y sitios de fosforilación implicados en la propia señalización de receptores de células T han sido identificados, está por desarrollar un cuadro claro de las proteínas precisas y de los sitios de fosforilación implicados en la propagación de esta señal biológica esencial. Por ejemplo, la fosfatasa SHP1 y la quinasa Fyn pueden estar implicadas en la cascada de señalización, pero su papel preciso y sus sustratos son desconocidos. Véase Mustelin et al., supra. Otras proteínas tirosina quinasas de la familia Src, incluyendo las quinasas relacionadas con Tec, Itk/Emt y Txk/Rlk, también parecen estar implicadas, pero su papel preciso y sus sustratos están por determinar. Por consiguiente, el pequeño número de sitios de fosforilación relacionados con la ruta de señalización de los receptores de las células T que se han identificado hasta la fecha no facilitan una comprensión completa y exacta de cómo se propaga esta importante señal biológica. En efecto, se ha concluido recientemente que el principal desafío que queda en la biología de las células T es definir precisamente la contribución de las moléculas de señalización concretas implicadas en la señalización de las células T, y comprender mejor el juego entre las moléculas de señalización y las rutas implicadas. Véase Mustelin et al., supra.

Por consiguiente, existe la continua necesidad de desentrañar los mecanismos moleculares de la señalización de los receptores de las células T identificando las proteínas de señalización aguas abajo que median la cascada que conduce a la proliferación de las células T activadas y su participación en la respuesta inmunitaria. Identificar los sitios de fosforilación concretos de tales proteínas de señalización y proporcionar nuevos reactivos, tales como anticuerpos fosfo-específicos y péptidos AQUA, para detectarlos y cuantificarlos sigue siendo particularmente importante para avanzar en nuestro conocimiento de la biología de los procesos críticos de señalización de las células T. A su vez, tales avances conducirían a una mejor comprensión de las enfermedades, tales como las leucemias linfocíticas de las células T agudas, que implican una señalización aberrante de las células T. Véase Blume-Jensen et al., supra.

Compendio de la invención

La memoria describe 95 sitios de fosforilación novedosos identificados en proteínas de transducción de la señal y en rutas implicadas en la señalización de receptores de las células T, y proporciona nuevos reactivos, incluyendo anticuerpos específicos de sitios de fosforilación y péptidos AQUA, para la detección selectiva y la cuantificación de estos sitios/proteínas fosforilados. Asimismo se proporcionan métodos de uso de los reactivos para la detección y cuantificación de los sitios de fosforilación descritos.

Específicamente, un aspecto de la invención proporciona un método para detectar o cuantificar una proteína de señalización que está fosforilada en tirosina en las rutas de señalización de los receptores de las células T, comprendiendo el método la etapa de utilizar uno o más de los siguientes reactivos para detectar o cuantificar una o más proteínas de señalización de receptores de células T correspondientes a una o más de las Filas 61 y 62 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando están fosforiladas en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1: un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a la proteína solamente cuando está fosforilada en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida en la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61 enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, donde el anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina; y/o un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de la proteína, comprendiendo el péptido marcado la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61 enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, que comprende la tirosina fosforilada enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1.

Otro aspecto de la invención proporciona un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización del receptor de las células T humanas correspondiente a la Fila 61 o la Fila 62 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida en la secuencia peptídica fosforilable enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 60 y 61), donde el anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una línea celular inmortalizada que produce un anticuerpo que se une específicamente a una proteína de señalización del receptor de las células T humanas correspondiente a la Fila 61 o la Fila 62 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida en la secuencia peptídica fosforilable enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 60 y 61), donde el anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina. Opcionalmente, la línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o un hibridoma de ratón.

Otro aspecto de la invención proporciona un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de una proteína de señalización de un receptor de células T humanas correspondiente a una o más de las Filas 61 y 62 de la Columna A de la Tabla 1, comprendiendo el péptido marcado la secuencia peptídica fosforilable del SEQ ID NO: 60 o el SEQ ID NO: 61 enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, cuya secuencia comprende la tirosina fosforilable enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 - Es un diagrama que representa ampliamente la metodología del aislamiento por inmunoafinidad y la caracterización espectrométrica de masas (IAP) empleada para identificar los sitios de fosforilación novedosos descritos en la presente memoria.

Fig. 2 - Es una tabla (correspondiente a la Tabla 1) que enumera los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de receptores de las células T descritos en la presente memoria: Columna A = nombre abreviado de la proteína de origen; Columna B = nombre completo de la proteína de origen; Columna C = número de acceso SwissProt para la proteína (secuencia humana); Columna D = tipo de proteína/clasificación; Columna F = resto (en la secuencia de aminoácidos de la proteína de origen) en el que se produce la fosforilación en el sitio de fosforilación; y Columna G = secuencia del sitio de fosforilación que abarca el resto fosforilable; (resto tirosina en el que se produce la fosforilación (y correspondiente a la respectiva entrada de la Columna F) indicado por una "y" minúscula.

Fig. 3 - es una espectrografía de masas ilustrativa que representa la detección del sitio de fosforilación de la tirosina 123 en Max (véase la Fila 82 de la Figura 2/Tabla 1), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 (rojo y azul indican los iones detectados en el espectro MS/MS). El asterisco indica el resto fosfotirosina novedoso identificado.

Fig. 4 - es una espectrografía de masas ilustrativa que representa la detección del sitio de fosforilación de la tirosina 205 en ETS-1 (véase la Fila 78 de la Figura 2/Tabla 1), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 (rojo y azul indican los iones detectados en el espectro MS/MS). El asterisco indica el resto fosfotirosina novedoso identificado.

Fig. 5 - es una espectrografía de masas ilustrativa que representa la detección del sitio de fosforilación de la tirosina 13 en CDK6 (véase la Fila 61 de la Figura 2/Tabla 1), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 (rojo y azul indican los iones detectados en el espectro MS/MS). El asterisco indica el resto fosfotirosina novedoso identificado.

Fig. 6 - es una espectrografía de masas ilustrativa que representa la detección del sitio de fosforilación de la tirosina 248 en ZAP70 (véase la Fila 64 de la Figura 2/Tabla 1), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 (rojo y azul indican los iones detectados en el espectro MS/MS). El asterisco indica el resto fosfotirosina novedoso identificado.

Fig. 7 - es una espectrografía de masas ilustrativa que representa la detección del sitio de fosforilación de la tirosina 54 en Bid (véase la Fila 18 de la Figura 2/ Tabla 1), como se describe adicionalmente en el Ejemplo 1 (rojo y azul indican los iones detectados en el espectro MS/MS). El asterisco indica el resto fosfotirosina novedoso identificado.

Descripción detallada de la invención

Se han descubierto ahora 95 sitios de fosforilación de proteínas novedosos en las proteínas y rutas de señalización implicadas en la señalización de receptores de las células T. Estos sitios de fosforilación recientemente descritos fueron identificados empleando las técnicas descritas en "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides From Complex Mixtures", Publicación de la Patente de los Estados Unidos Núm. 20030044848, Rush et al., utilizando extractos celulares de una línea celular establecida, derivada de leucemia linfoblástica humana y linfoma no Hodgkin, en los cuales está activada la señalización de células T, como se describe adicionalmente más abajo. Los sitios de fosforilación novedosos, y sus correspondientes proteínas de origen, descritos en la presente memoria se enumeran en la Tabla I. Estos sitios de fosforilación corresponden a numerosas proteínas de origen diferentes (cuyas secuencias completas (humanas) se encuentran disponibles al público en la base de datos SwissProt y sus números de Acceso se enumeran en la Columna C de la Tabla 1/Fig. 2), cada uno de los cuales cae en grupos de tipos de proteínas discretos, por ejemplo proteínas Adaptadoras/de Andamiaje, proteínas Chaperonas, proteína Quinasas, y proteínas de unión a ARN, etc. (véase la Columna D de la Tabla 1), cuya fosforilación es relevante para la actividad de transducción de la señal de los receptores de células T, como se describe en la presente memoria.

El descubrimiento de los 95 sitios de fosforilación de proteínas novedosos descritos en la presente memoria permite la producción, mediante métodos normalizados, de nuevos reactivos, tales como anticuerpos específicos del sitio de fosforilación y péptidos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados), capaces de detectar y/o cuantificar estos sitios/proteínas fosforilados. Tales reactivos son muy útiles, entre otros, para estudiar eventos de transducción de señales subyacentes al progreso de las enfermedades, tales como las leucemias linfocíticas agudas, que pueden implicar una señalización aberrante de receptores de células T. Por consiguiente, la invención proporciona reactivos novedosos - anticuerpos fosfo-específicos y péptidos AQUA - para la detección específica y/o la cuantificación de una proteína/polipéptido de señalización de receptores de células T solamente cuando está fosforilado (o solamente cuando no está fosforilado) en un sitio de fosforilación concreto descrito en la presente memoria. Asimismo se proporcionan métodos de detección y/o cuantificación de una o más proteínas de señalización de receptores de células T fosforiladas utilizando los anticuerpos específicos del sitio de fosforilación y los péptidos AQUA.

En parte, la memoria proporciona un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una proteína de señalización de receptores de células T dada solamente cuando está fosforilada (o no fosforilada, respectivamente) en una tirosina concreta enumerada en la Columna F de la Tabla 1/Figure 2 comprendida en la secuencia del sitio peptídico fosforilable enumerada en la correspondiente Columna G. En una parte adicional, la memoria proporciona un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de una proteína de señalización de receptores de células T dada, comprendiendo el péptido marcado un sitio/secuencia peptídico fosforilable concreto enumerado en la Columna G de la Tabla 1/Figura 2 en la presente memoria. Por ejemplo, entre los reactivos proporcionados por la invención se encuentra un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a la quinasa Cdk6 (serina/treonina) solamente cuando está fosforilada (o solamente cuando no está fosforilada) en la tirosina 13 (véase la Fila 61 (y las Columnas F y G) de la Tabla 1/Figura 2). A modo de ejemplo adicional, entre el grupo de reactivos proporcionados por la invención se encuentra un péptido AQUA para la cuantificación de la quinasa Cdk6 fosforilada, comprendiendo el péptido AQUA la secuencia peptídica fosforilable enumerada en la Columna G, Fila 61, de la Tabla 1/Figura 2.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo específico del sitio de fosforilación que se une específicamente a una proteína de señalización de los receptores de células T humanas correspondientes a una o más de las Filas 61 y 62 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida en la secuencia peptídica del SEQ ID NO:60 o SEQ ID NO: 61 enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a una o más de las Filas 61 y 62 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando no está fosforilada en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1, comprendida en la secuencia peptídica SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61 enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando está fosforilada en dicha tirosina. Tales reactivos permiten la detección específica de la fosforilación (o no fosforilación) de un sitio fosforilable novedoso descrito en la presente memoria. La invención proporciona adicionalmente líneas celulares inmortalizadas productoras de tales anticuerpos. En una realización preferida, la línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o de ratón.

En otra realización, la invención proporciona un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de una proteína de señalización del receptor de las células T correspondiente a una o más de las Filas 61 y 62 de la Columna A de la Tabla 1, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia peptídica fosforilable SEQ ID NO. 60 o SEQ ID NO: 61 enumerada en la correspondiente Columna G de la Tabla 1, cuya secuencia comprende la tirosina fosforilable enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1. En ciertas realizaciones preferidas, la tirosina fosforilable del péptido marcado está fosforilada, mientras en otras realizaciones preferidas, la tirosina fosforilable del péptido marcado no está fosforilada.

Los reactivos (anticuerpos y péptidos AQUA) pueden ser agrupados convenientemente por el tipo de proteína de señalización del receptor de las células T en la cual existe un sitio de fosforilación (para los cuales se proporcionan los reactivos). Los tipos de proteína para cada proteína respectiva (en la cual se ha descubierto un sitio de fosforilación) se proporcionan en la Columna D de la Tabla 1/Figura 2, e incluyen: Proteínas de Unión a Actina, Proteínas Adaptadoras/de Andamiaje, Proteínas de Adherencia, Proteínas de Unión a Calcio, Proteínas de Regulación del Ciclo Celular o de Canales, Chaperonas, Proteína de Cofactores, Proteínas citoesqueléticas, Proteínas de Unión a ADN, Proteína G o proteínas Activadoras de GTPasa, Ligasas, Quinasas de lípidos y Proteínas de unión, Oxidorreductasas, Proteína Quinasas, Proteína Fosfatasas, Proteínas Receptoras, Proteínas de Unión a ARN, Proteínas de Factores de Transcripción/Complejos de Iniciación/Co-activadoras, Proteínas del Complejo de Iniciación de la Traducción, Proteínas del Sistema de Conjugación con Ubiquitina, y Proteínas de las Vesículas.

La invención también proporciona, en parte, una línea celular inmortalizada productora de un anticuerpo de la invención. En una realización preferida, la linea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o un hibridoma de ratón.

En otras ciertas realizaciones preferidas, el péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) de la invención comprende una secuencia del sitio descrito donde la tirosina fosforilable está fosforilada. En otras ciertas realizaciones preferidas, el péptido marcado con un isótopo pesado de la invención comprende una secuencia del sitio descrito donde la tirosina fosforilable no está fosforilada.

También son proporcionados por la invención los métodos para detectar o cuantificar una proteína de señalización de receptores de las células T que está fosforilada en tirosina, comprendiendo dicho método la etapa de utilizar uno o más de los reactivos descritos antes de la invención para detectar o cuantificar una o más proteínas de señalización de receptores de células T correspondientes a una o más de las Filas 61 y 62 de la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada en la tirosina enumerada en la correspondiente Columna F de la Tabla 1.

La identificación de los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de receptores de células T novedosa descrita, y la producción y el uso normalizados proporcionados por la invención se describen con mayor detalle más abajo.

TABLA 1 Sitios de Fosforilación de la Proteína de Señalización de Receptores de las Células T Descubiertos Recientemente

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

El nombre abreviado para cada proteína en la cual se ha identificado en la actualidad un sitio de fosforilación se proporciona en la columna A, y su número de acceso (humano) se proporciona en la Columna C. El tipo/grupo de proteína en el cual se encuentra la proteína se proporciona en la Columna D. El resto tirosina identificado en el cual se produce la fosforilación en una proteína dada se identifica en la Columna F, y la secuencia de aminoácidos del sitio de fosforilación que abarca el resto tirosina se proporciona en la Columna G (y minúscula = tirosina (identificada en la Columna F) en la cual se produce la fosforilación. La Tabla 1 anterior es idéntica a la Figure 2, excepto que la última incluye el nombre completo de la proteína (Columna B).

La identificación de estos 95 sitios de fosforilación se describe con más detalle en la Parte A más abajo y en el Ejemplo 1.

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Definiciones

Según se utilizan en la presente memoria, los siguientes términos tienen los significados indicados:

"Anticuerpo" o "anticuerpos" hace referencia a todos los tipos de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE, incluyendo los fragmentos F_{ab} o de reconocimiento de antígenos de los mismos, incluyendo los anticuerpos quiméricos, policlonales, y monoclonales. El término "no se une" con respecto a la unión de un anticuerpo a una forma fosfo de una secuencia significa que no reacciona sustancialmente en comparación con la unión del anticuerpo a la otra forma fosfo de la secuencia para la cual es específico el anticuerpo.

"Proteína de señalización de receptores de células T" representa cualquier proteína (o polipéptido derivado de ella) enumerado en la Columna A de la Tabla 1/Figura 2, que se describe en la presente memoria por estar fosforilada en una o más líneas celulares en las cuales la señalización de receptores de las células T está activada. Las proteínas de señalización de receptores de células T pueden ser sustratos directos del propio receptor de las células T, o pueden ser sustratos indirectos aguas abajo de las rutas de señalización de las células T. Una proteína de señalización de receptores de células T también puede estar fosforilada en otras líneas celulares que albergan actividad quinasa activada.

"Péptido marcado con isótopo pesado" (utilizado indistintamente con péptido AQUA) representa un péptido que comprende al menos una marca con un isótopo pesado, que es adecuado para la cuantificación absoluta o la detección de una proteína como se describe en el documento WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry" (Gygi et al.), comentado adicionalmente más abajo.

"Proteína" se utiliza indistintamente con polipéptido, e incluye fragmentos y dominios de proteínas así como proteínas completas.

"Aminoácido fosforilable" representa cualquier aminoácido que es susceptible de ser modificado mediante la adición de un grupo fosfato, e incluye ambas formas de semejante aminoácido.

"Secuencia del péptido fosforilable" representa una secuencia peptídica que comprende un aminoácido fosforilable.

"Anticuerpo específico del sitio de fosforilación" representa un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia/epítopo del péptido fosforilable solamente cuando está fosforilado, o solamente cuando no está fosforilado, respectivamente. El término se utiliza indistintamente con anticuerpo "fosfo-específico".

A. Identificación de Sitios de Fosforilación de proteínas de Señalización de Receptores de Células T Novedosos

Los 95 sitios de fosforilación de las proteínas de señalización de receptores de células T novedosos descritos en la presente memoria y enumerados en la Tabla 1/Figura 2 fueron descubiertos empleando técnicas de aislamiento y caracterización de péptidos modificadas descritas en "Immunoaffinity Isolation of Modified Peptides From Complex Mixtures", Publicación de la Patente de los Estados Unidos Núm. 20030044848, Rush et al . utilizando extractos de una línea celular Jurkat en la cual la señalización de receptores de las células T está activada constitutivamente. El aislamiento y la identificación de fosfopéptidos a partir de esta línea de células T, utilizando un anticuerpo específico de fosfotirosina general inmovilizado, se describe con detalle en el Ejemplo 1 más abajo. Además de los 95 sitios de fosforilación de proteínas desconocidos previamente, también se identificaron muchos sitios de fosforilación conocidos (no descritos en la presente memoria). La técnica de inmunoafinidad/espectrometría de masas descrita en la Publicación de Patente '848 (método "IAP") - y empleada como se describe con detalle en los Ejemplos - se resume brevemente más abajo.

El método IAP empleado comprende generalmente las siguientes etapas: (a) se obtiene una preparación proteinácea (p. ej., un extracto de células digeridas) que comprende fosfopéptidos de dos o más proteínas diferentes de un organismo; (b) se pone en contacto la preparación con al menos un anticuerpo específico de fosfotirosina general inmovilizado; (c) se aísla al menos un fosfopéptido unido específicamente por el anticuerpo inmovilizado en la etapa (b); y (d) el péptido modificado aislado en la etapa (c) se caracteriza mediante espectrometría de masas (MS) y/o espectrometría de masas en tándem (MS-MS). Con posterioridad, (e) se puede utilizar un programa de búsqueda (p. ej., Sequest) para emparejar sustancialmente los espectros obtenidos para el péptido modificado, aislado durante la caracterización de la etapa (d) con los espectros para una secuencia peptídica conocida. También se puede emplear una etapa de cuantificación, p. ej., SILAC o AQUA, para cuantificar péptidos aislados con el fin de comparar los niveles peptídicos de una muestra con una línea base.

En el método IAP empleado en la presente memoria, se utilizó un anticuerpo monoclonal específico de fosfotirosina general (asequible comercialmente de Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, Núm. Cat. 9411 (p-Tyr-100)) en la etapa de inmunoafinidad para aislar el mayor número posible de péptidos que contienen fosfotirosina de los extractos de células T.

Se emplearon extractos de una línea de células Yurkat tratada con pervanadato. Esta línea celular establecida deriva de pacientes con leucemia linfoblástica aguda y linfoma no Hodgkin transformado leucémico, en los cuales las rutas de señalización de receptores de células T están activados constitutivamente.

Como se describe con más detalle en los Ejemplos, se prepararon productos lisados de esta línea celular y se digirieron con tripsina tras el tratamiento con DTT y yodoacetamida para alquilar restos cisteína. Antes de la etapa de inmunoafinidad, los péptidos se pre-fraccionaron mediante extracción en fase sólida en fase reversa utilizando columnas C_{18} Sep-Pak para separar los péptidos de los otros componentes celulares. Los cartuchos de extracción en fase sólida se hicieron eluir con etapas variables de acetonitrilo. Cada fracción peptídica liofilizada se redisolvió en PBS y se trató con anticuerpo para fosfotirosina (P-Tyr-100, CST núm. 9411) inmovilizado sobre proteína G-Sefarosa. Los péptidos purificados por inmunoafinidad se hicieron eluir con TFA al 0,1% y una porción de esta fracción se concentró con boquillas Stage y se analizó mediante LC-MS/MS, utilizando un espectrómetro de masas con trampa de iones ThermoFinnigan LCQ Deca XP Plus. Los péptidos se hicieron eluir de una columna en fase reversa de 10 cm x 75 \mum con un gradiente lineal de 45 min. de acetonitrilo. Los espectros MS/MS se evaluaron utilizando el programa Sequest con la base de datos de proteínas humanas NCBI.

Esto reveló un total de 95 sitios de fosforilación de tirosina novedosos en las rutas de señalización afectadas por la activación de receptores de células T. Los sitios de fosforilación identificados y sus proteínas de origen se enumeran en la Tabla 1/Figura 2. La tirosina (secuencia humana) en la cual se produce la fosforilación se proporciona en la Columna F, y la secuencia peptídica que abarca el resto tirosina fosforilable en el sitio se proporciona en la Columna G.

Como resultado del descubrimiento de estos sitios de fosforilación, se pueden producir ahora anticuerpos fosfo-específicos y péptidos AQUA para la detección y cuantificación de estos sitios y sus proteínas de origen pueden ser producidas ahora mediante métodos normalizados, descritos más abajo. Se demostrará que estos nuevos reactivos son muy útiles en el estudio de las rutas y los eventos de señalización subyacentes al progreso de enfermedades mediadas por una señalización de receptores de las células T alterada y la identificación de nuevos biomarcadores y dianas para la diagnosis y el tratamiento de tales enfermedades.

B. Anticuerpos y Líneas Celulares

Los anticuerpos específicos del sitio de fosforilación aislados que se unen específicamente a una proteína de señalización de receptores de células T descrita en la Columna A de la Tabla 1 solamente cuando está fosforilada (o solamente cuando no está fosforilada) en el correspondiente aminoácido (tirosina) y sitio de fosforilación enumerado en las Columnas F y G de la Tabla 1 pueden ser producidos ahora mediante métodos de producción de anticuerpos normalizados, tales como métodos de anticuerpos anti-péptidos, utilizando la información sobre la secuencia del sitio de fosforilación proporcionada en la Columna G de la Tabla 1. Por ejemplo, luego se describen dos sitios de fosforilación de la quinasa Cdk6 previamente desconocidos (tirosinas 13 y 14) (véanse las Filas 61-62 de la Tabla 1). De este modo, los anticuerpos que se unen específicamente a uno cualquiera de estos sitios Cdk6 novedosos pueden ser producidos ahora utilizando (toda o parte de) la secuencia de aminoácidos que abarca el respectivo sitio fosforilado como antígeno peptídico utilizado para inmunizar el animal (p. ej., se puede emplear un antígeno peptídico que comprende la secuencia mostrada en la Fila 61, Columna G, de la Tabla 1 (que abarca la tirosina fosforilada de la posición 13 de Cdk6) para producir un anticuerpo que se une solamente a Cdk6 cuando está fosforilada en la Tyr13).

Los anticuerpos policlonales de la invención pueden ser producidos de acuerdo con las técnicas normalizadas inmunizando un animal adecuado (p. ej., conejo, cabra, etc.) con un antígeno peptídico correspondiente al sitio de fosforilación de la proteína del receptor de las células T de interés (esto es un sitio de fosforilación enumerado en la Columna G de la Tabla 1, que comprende el correspondiente aminoácido fosforilable enumerado en la Columna F de la Tabla 1), recogiendo el suero inmune del animal, y separando los anticuerpos policlonales del suero inmune, de acuerdo con los procedimientos conocidos. De un modo similar, se puede emplear un péptido que comprende cualquiera de las secuencias del sitio de fosforilación proporcionadas en la Columna G de la Tabla 1 como antígeno para producir un anticuerpo que se une solamente a la proteína correspondiente enumerada en la Columna A de la Tabla 1 cuando está fosforilada (o cuando no está fosforilada) en el correspondiente resto enumerado en la Columna F. Si se desea un anticuerpo que se une solamente a la proteína cuando está fosforilada en el sitio deseado, el antígeno peptídico incluye la forma fosforilada del aminoácido. Por el contrario, si se desea un anticuerpo que se une solamente a la proteína cuando no está fosforilada en el sitio descrito, el antígeno peptídico incluye la forma no fosforilada del aminoácido.

Se pueden diseñar, construir y emplear antígenos peptídicos adecuados para producir los anticuerpos de la invención, de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, p. ej., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Capítulo 5, págs. 75-76, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Czernik, Methods In Enzymology, 201: 264-283 (1991); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21-49 (1962)).

Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden emplear antígenos fosfopeptídicos más largos o más cortos. Véase Id. Por ejemplo, un antígeno peptídico puede consistir en la secuencia completa descrita en la Columna G de la Tabla 1, o puede comprender aminoácidos adicionales flanqueando semejante secuencia descrita, o puede comprender solamente una porción de la secuencia descrita flanqueando inmediatamente el aminoácido fosforilable (indicado en la Columna G por una "y" minúscula). Los anticuerpos policlonales producidos como se describe en la presente memoria pueden ser escrutados como se describe adicionalmente más abajo.

Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser producidos en una línea celular de hibridoma de acuerdo con la técnica bien conocida de Kohler y Milstein. Nature 265: 495-97 (1975); Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); véase también, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al. Eds. (1989). Los anticuerpos monoclonales producidos de este modo son altamente específicos, y mejoran la selectividad y especificidad de los métodos de análisis diagnóstico proporcionados por la invención. Por ejemplo, se puede inyectar una solución que contiene el antígeno apropiado a un ratón u otra especie y, después de un tiempo suficiente (de acuerdo con las técnicas convencionales), el animal se sacrifica y se obtienen células del bazo. Las células del bazo se inmortalizan después fusionándolas con células de mieloma, típicamente en presencia de polietilenglicol, para producir células de hibridoma. Se pueden producir hibridomas de fusión de conejo, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.675.063, C. Knight, Presentada el 7 de Octubre de 1997. Después se hacen crecer las células de hibridoma en un medio de selección adecuado, tal como hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), y el sobrenadante se escruta en busca de anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada, como se describe más abajo. El anticuerpo secretado puede ser recuperado del sobrenadante de cultivo de tejidos mediante métodos convencionales tales como precipitación, intercambio iónico o cromatografía de afinidad, o similar.

También se pueden producir fragmentos Fab monoclonales en Escherichia coli mediante mecanismos de recombinación conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., W. Huse, Science 246: 1275-81 (1989); Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8095 (1990). Si se prefieren anticuerpos monoclonales de un isotipo para una aplicación concreta, se pueden preparar isotipos concretos directamente, seleccionando entre la fusión inicial, o se pueden preparar secundariamente, a partir de un hibridoma parental secretando un anticuerpo monoclonal de diferente isotipo utilizando la técnica de selección sib para aislar variantes de cambio de clase (Steplewski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 8653 (1985); Spira et al., J. Immunol. Methods, 74: 307 (1984)).

El epítopo preferido de un anticuerpo específico del sitio de fosforilación de la invención es un fragmento peptídico que consiste esencialmente en aproximadamente 8 a 17 aminoácidos incluyendo la tirosina fosforilable, donde aproximadamente de 3 a 8 aminoácidos están situados a cada lado de la tirosina fosforilable, y de ese modo los anticuerpos de la invención se unen específicamente a un polipéptido de señalización de receptores de células T diana que comprende semejante secuencia epitópica. Los epítopos particularmente preferidos unidos por los anticuerpos de la invención comprenden toda o parte de una secuencia del sitio fosforilable enumerada en la Columna G de la Tabla 1, incluyendo el aminoácido fosforilable (tirosina).

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Están incluidas moléculas distintas de anticuerpos equivalentes, tales como dominios de unión a proteínas o aptámeros de ácido nucleico, que se unen, de una manera fosfo-específica, esencialmente al mismo epítopo fosforilable al cual se unen los anticuerpos fosfo-específicos de la invención. Véase, p. ej., Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984). Tales reactivos distintos de anticuerpos equivalentes se pueden emplear adecuadamente en los métodos descritos adicionalmente más abajo.

Los anticuerpos proporcionados por la invención pueden ser cualquier tipo de inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, incluyendo los fragmentos F_{ab} o de reconocimiento de antígenos de los mismos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden ser de cualquier especie de origen, incluyendo (por ejemplo) ratón, rata, conejo, caballo, o ser humano, o pueden ser anticuerpos quiméricos. Véase, p. ej., M. Walker et al., Molec. Immunol. 26: 403-11 (1989); Morrision et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604 (1984)). Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes de acuerdo con los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.474.893 (Reading) o la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567 (Cabilly et al.). Los anticuerpos también pueden ser construidos químicamente por anticuerpos específicos elaborados de acuerdo con el método descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.676.980 (Segel et al.).

La invención también proporciona líneas celulares inmortalizadas que producen un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, también se proporcionan clones de hibridomas, construidos como se ha descrito antes, que producen anticuerpos monoclonales para los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de los receptores de células T descrita en la presente memoria. De un modo similar, la invención incluye células recombinantes que producen un anticuerpo de la invención, cuyas células pueden ser construidas mediante mecanismos bien conocidos; por ejemplo el sitio de combinación con el antígeno del anticuerpo monoclonal puede ser clonado mediante PCR y los anticuerpos de cadena sencilla producidos en forma de anticuerpos recombinantes presentados en fagos o anticuerpos solubles en E. coli (véase, p. ej., ANTIBODY ENGINEERING PROTOCOLS, 1995, Humana Press, editor Sudhir Paul).

Los anticuerpos específicos del sitio de fosforilación de la invención, ya sean policlonales o monoclonales, pueden ser escrutados en busca de un epítopo y una fosfoespecificidad de acuerdo con técnicas normalizadas. Véase, p. ej., Czernik et al., Methods in Enzymology, 201: 264-283 (1991). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser escrutados frente a la genoteca de fosfo- y no fosfo-péptidos mediante ELISA para asegurar la especificidad tanto para el antígeno deseado (esto es aquél epítopo que incluye una secuencia del sitio de fosforilación enumerada en la Columna G de la Tabla 1) como para la reactividad solamente con la forma fosforilada (o no fosforilada) del antígeno. Se pueden llevar a cabo análisis competitivos de péptidos para confirmar la carencia de reactividad con otros fosfo-epítopos en una proteína de señalización de receptores de células T dada. Los anticuerpos también pueden ser sometidos a ensayo mediante transferencia Western frente a preparaciones celulares que contienen la proteína de señalización, p. ej. líneas celulares que expresan en exceso la proteína diana, para confirmar la reactividad con el epítopo/diana fosforilado deseado.

La especificidad frente al epítopo fosforilado deseado también se puede examinar construyendo mutantes que carecen de restos fosforilables en posiciones fuera del epítopo deseado conocido por estar fosforilado, o mutando el fosfo-epítopo deseado y confirmando la carencia de reactividad. Los anticuerpos específicos del sitio de fosforilación de la invención pueden mostrar algunos epítopos relacionados con reactividad cruzada limitada en proteínas no diana. Esto no es inesperado ya que la mayoría de los anticuerpos muestra cierto grado de reactividad cruzada, y los anticuerpos anti-peptídicos a menudo presentarán reacción cruzada con epítopos que tienen una elevada homología con el péptido inmunizante. Véase, p. ej., Czernik, supra. La reactividad cruzada con proteínas no diana es fácilmente caracterizada mediante transferencia Western con marcadores de peso molecular conocido. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas que presentan reactividad cruzada pueden ser examinadas para identificar sitios altamente homólogos al epítopo de la proteína de señalización de receptores de células T para el cual es específico el anticuerpo de la invención. En ciertos casos, los antisueros policlonales pueden mostrar una cierta reactividad cruzada general no deseable con fosfotirosina, que puede ser eliminada mediante purificación adicional de los antisueros, p. ej., sobre una columna de fosfotiramina. Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a su proteína diana (esto es una proteína enumerada en la Columna A de la Tabla 1/Figura 2) solamente cuando está fosforilada (o solamente cuando no está fosforilada, según sea el caso) en el sitio descrito en las correspondientes Columnas F/G, y no se unen (sustancialmente) a la otra forma (en comparación con la forma para la cual es específico el anticuerpo).

Los anticuerpos pueden ser caracterizados adicionalmente mediante tinción inmunohistoquímica (IHC) utilizando tejidos normales y enfermos para examinar el estado de fosforilación y activación de receptores de células T en tejido enfermo. La IHC se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, p. ej., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Capítulo 10, Harlow & Lane Eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1988). En resumen, se prepara tejido embebido en parafina (p. ej. tejido tumoral) para la tinción inmunohistoquímica desparafinando secciones de tejido con xileno seguido de etanol; hidratando en agua, después en PBS; desenmascarando el antígeno calentando el porta en tampón citrato de sodio; incubando las secciones en peróxido de hidrógeno; bloqueando en solución de bloqueo; incubando el porta en anticuerpo primario y anticuerpo secundario; y finalmente detectando mediante el uso de un método con avidina/biotina ABC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los anticuerpos pueden ser caracterizados adicionalmente mediante citometría de flujo realizada de acuerdo con métodos convencionales. Véase Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). En resumen y a modo de ejemplo, se puede emplear el siguiente protocolo para el análisis citométrico: se pueden centrifugar las muestras en gradientes de Ficoll para separar los eritrocitos, y después se pueden fijar las células con paraformaldehído al 2% durante 10 minutos a 37ºC seguido de permeabilización en metanol del 90% durante 30 minutos sobre hielo. Después las células se pueden teñir con el anticuerpo específico del sitio de fosforilación primario de la invención (que detecta una proteína de transducción de la señal de los receptores de las células T enumerada en la Tabla 1), lavar y marcar con anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. También se pueden añadir anticuerpos marcadores conjugados con fluorocromo adicionales (p. ej. CD45, CD34) en este momento para ayudar a la posterior identificación de tipos celulares hematopoyéticos específicos. Las células se analizarían después en un citómetro de flujo (p. ej. un Beckman Coulter FC500) de acuerdo con los protocolos específicos del aparato utilizado.

Los anticuerpos de la invención también se pueden conjugar ventajosamente con colorantes fluorescentes (p. ej. Alexa488, PE) para su uso en análisis multiparamétricos junto con otros anticuerpos marcadores de transducción de la señal (fosfo-CrkL, fosfo-Erk 1/2) y/o celulares (CD34).

Los anticuerpos de la invención específicos del sitio de fosforilación se unen específicamente a una proteína o polipéptido de transducción de la señal de los receptores de las células T humanas solamente cuando está fosforilada en un sitio descrito, pero no se limita solamente a la unión a la especie humana, per se. La invención incluye anticuerpos que también se unen a sitios de fosforilación conservados y altamente homólogos o idénticos en las respectivas proteínas de señalización de receptores de las células T de otras especies (p. ej. ratón, rata, mono, levadura), además de unirse al sitio de fosforilación humano. Los sitios altamente homólogos conservados en otras especies pueden ser fácilmente identificados mediante comparaciones convencionales de secuencias, tales como las que utilizan BLAST, con los sitios de fosforilación de la proteína de transducción de los receptores de células T humanas descritos en la presente memoria.

C. Péptidos Marcados con Isótopos Pesados (Péptidos AQUA)

Los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de los receptores de células T novedosos descritos en la presente memoria permiten ahora la producción de los correspondientes péptidos marcados con isótopos pesados para la cuantificación absoluta de tales proteínas de señalización (tanto fosforiladas como no fosforiladas en un sitio descrito) en muestras biológicas. La producción y el uso de péptidos AQUA para la cuantificación absoluta de proteínas (AQUA) en mezclas complejas ha sido descrita. Véase la publicación WO/03016861, "Absolute Quantification of Proteins and Modified Forms Thereof by Multistage Mass Spectrometry", Gygi et al. y también Gerber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 6940-5 (2003).

La metodología AQUA emplea la introducción de una cantidad conocida de al menos un péptido marcado con un isótopo pesado patrón (que tiene un distintivo único detectable mediante cromatografía LC-SRM) en una muestra biológica digerida con el fin de determinar, mediante comparación con el péptido patrón, la cantidad absoluta de un péptido con la misma secuencia y modificación de proteína en la muestra biológica. En resumen, la metodología AQUA tiene dos fases: selección y validación del patrón interno peptídico y desarrollo del método; e implementación utilizando patrones internos peptídicos validados para detectar y cuantificar una proteína diana en la muestra. El método es una técnica poderosa para detectar y cuantificar un péptido/proteína dado en una mezcla biológica compleja, tal como un producto lisado celular, y se puede emplear, p. ej., para cuantificar cambios en la fosforilación de la proteína como resultado de un tratamiento con fármaco, o para cuantificar diferencias en el nivel de proteína en diferentes estados biológicos.

Generalmente, para desarrollar un patrón interno adecuado, se selecciona un péptido concreto (o péptido modificado) en una secuencia de proteínas diana basándose en su secuencia de aminoácidos y la proteasa concreta a utilizar para la digestión. Después se genera el péptido mediante síntesis en fase sólida de manera que un resto es sustituido por ese mismo resto que contiene isótopos estables (C^{13}, C^{15}). El resultado es un péptido que es químicamente idéntico a su contraparte nativa formada mediante proteolisis, pero que es fácilmente distinguible mediante MS por medio de un desplazamiento en la masa de 7 Da. El péptido patrón interno AQUA recién sintetizado es evaluado después mediante LC-MS/MS. Este procedimiento proporciona información cualitativa a cerca de la retención de péptido mediante cromatografía en fase reversa, eficacia de ionización, y fragmentación vía disociación inducida por colisión. Se seleccionan iones fragmentados informativos y abundantes para los grupos de péptidos patrón nativos e internos y después se controlan específicamente en una sucesión rápida como una función de la retención cromatográfica para formar un método de control de la reacción seleccionado (LC-SRM) basado en el perfil único del patrón peptídico.

La segunda fase de la estrategia AQUA es su implementación para medir la cantidad de una proteína o una proteína modificada de mezclas complejas. Los productos lisados celulares completos son fraccionados típicamente mediante electroforesis en gel SDS-PAGE, y las regiones del gel coincidentes con la migración de la proteína son separadas por corte. Este proceso está seguido de proteolisis en gel en presencia de los péptidos AQUA y del análisis LC-SRM. (Véase Gerber et al. supra.) Los péptidos AQUA se aplican en la mezcla peptídica compleja obtenida mediante digestión del producto lisado celular completo con una enzima proteolítica y se someten a purificación por inmunoafinidad como se ha descrito antes. El tiempo de retención y el patrón de fragmentación del péptido nativo formado mediante digestión (p. ej. tripsinización) son idénticos a los del péptido patrón interno AQUA determinado previamente; de este modo, el análisis por LC-MS/MS utilizando un experimento SRM da como resultado la medición altamente específica y sensible tanto del patrón interno como del analito directamente a partir de mezclas peptídicas extremadamente complejas. Debido a que se añade una cantidad absoluta del péptido AQUA (p. ej. 250 fmoles), se puede utilizar la razón de las áreas bajo la curva para determinar los niveles de expresión precisos de una proteína o una forma fosforilada de una proteína en el producto lisado celular original. Además, el patrón interno está presente durante la digestión en gel a medida que se forman los péptidos nativos, de manera que la eficacia de extracción peptídica de los fragmentos de gel, las pérdidas absolutas durante la manipulación de la muestra (incluyendo la centrifugación a vacío), y la variabilidad durante
la introducción en el sistema LC-MS no afectan a la razón determinada de abundancias de péptido nativo y AQUA.

Se desarrolla un patrón peptídico AQUA para una secuencia del sitio de fosforilación conocida previamente identificada mediante el método IAP-LC-MS/MS dentro de una proteína diana. Se puede desarrollar un péptido AQUA incorporando la forma fosforilada del resto concreto del sitio, y un segundo péptido AQUA que incorpora la forma no fosforilada del resto desarrollado. De este modo, se pueden utilizar los dos patrones para detectar y cuantificar las formas tanto fosforilada como no fosforilada del sitio en una muestra biológica.

También se pueden generar patrones internos peptídicos examinando la secuencia de aminoácidos primaria de una proteína y determinando los límites de los péptidos producidos mediante la escisión con la proteasa. Alternativamente, una proteína puede ser realmente digerida con una proteasa y el fragmento peptídico concreto producido puede ser secuenciado después. Las proteasas adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, serina proteasas (p. ej. tripsina, hepsina), metaloproteasas (p. ej. PUMP1), quimotripsina, catepsina, pepsina, termolisina, carboxipeptidasas, etc.

Se selecciona una secuencia peptídica de una proteína diana de acuerdo con uno o más criterios para optimizar el uso del péptido como patrón interno. Preferiblemente, el tamaño del péptido se selecciona para minimizar las oportunidades de que la secuencia peptídica se repita otra vez en otras proteínas distintas de la diana. De este modo, un péptido tiene al menos preferiblemente alrededor de 6 aminoácidos. El tamaño del péptido también se optimiza para maximizar la frecuencia de ionización. De este modo, no se prefieren los péptidos más largos de aproximadamente 20 aminoácidos. El intervalo preferido es de aproximadamente 7 a 15 aminoácidos. También se selecciona una secuencia peptídica que no es probable que sea químicamente reactiva durante la espectrometría de masas, de este modo se evitan las secuencias que comprenden cisteína, triptófano, o metionina.

Se puede seleccionar una secuencia peptídica que no incluye una región modificada de la región diana de manera que se puede utilizar el patrón peptídico interno para determinar la cantidad de todas las formas de la proteína. Alternativamente, puede ser deseable un patrón interno peptídico que abarca un aminoácido modificado para detectar y cuantificar solamente la forma modificada de la proteína diana. Los patrones peptídicos para las regiones tanto modificadas como no modificadas se pueden utilizar juntos, para determinar el grado de modificación de una muestra concreta (esto es para determinar qué fracción de la cantidad total de proteína está representada por la forma modificada). Por ejemplo, se pueden utilizar patrones peptídicos tanto para la forma fosforilada como no fosforilada de una proteína que se sabe que está fosforilada en un sitio concreto para cuantificar la cantidad de forma fosforilada de una muestra.

El péptido se marca utilizando uno o más aminoácidos marcados (esto es la marca es una parte real del péptido) o menos preferiblemente, las marcas pueden ser ancladas después de la síntesis de acuerdo con los métodos convencionales. Preferiblemente, la marca es una marca que altera la masa seleccionada basándose en las siguientes consideraciones: La masa debe ser única para desplazar las masas de los fragmentos producidos mediante análisis MS a regiones del espectro con un fondo bajo; el componente distintivo de la masa de iones es la porción del radical de marcaje que muestra preferiblemente un distintivo de masa iónica único en el análisis MS; la suma de las masas de los átomos constitutivos de la marca es preferiblemente diferente sólo de los fragmentos de todos los posibles aminoácidos. Como resultado, los aminoácidos y péptidos marcados se distinguen fácilmente de los no marcados mediante el patrón ión/masa del espectro de masas resultante. Preferiblemente, el componente distintivo de la masa iónica confiere una masa al fragmento de proteína que no coincide con la masa del resto para cualquiera de los 20 aminoácidos naturales.

La marca debe ser robusta en las condiciones de fragmentación del MS y no experimentar una fragmentación desfavorable. La química de marcaje debe ser eficaz en un intervalo de condiciones, concretamente en condiciones desnaturalizantes y la etiqueta marcada permanece preferiblemente soluble en el sistema del tampón de MS de elección. La marca no suprime preferiblemente la eficacia de ionización de la proteína y no es químicamente reactiva. La marca puede contener una mezcla de dos o más especies isotópicamente distintas para generar un patrón espectrométrico de masas único en cada posición del fragmento marcado. Los isótopos estables, tales como H^{2}, C^{13}, N^{15}, O^{17}, O^{18}, o S^{34}, se encuentran entre las marcas preferidas. También se pueden preparar pares de patrones internos peptídicos que incorporan una marca isotópica diferente. Los restos aminoácido preferidos a los cuales se puede incorporar una marca de un isótopo pesado incluyen leucina, prolina, valina, y fenilalanina.

Los patrones internos peptídicos se caracterizan por su razón de masa a carga (m/z), y preferiblemente, también por su tiempo de retención en una columna cromatográfica (p. ej. una columna de HPLC). Los patrones internos que eluyen simultáneamente con péptidos no marcados de secuencia idéntica se seleccionan como patrones internos óptimos. El patrón interno se analiza después fragmentando el péptido mediante cualquier método adecuado, por ejemplo mediante disociación inducida por colisión (CID) utilizando, p. ej., argón o helio como gas de colisión. Después se analizan los fragmentos, por ejemplo mediante espectrometría de masas de múltiples fases (MS^{n}) para obtener un espectro iónico del fragmento, para obtener un distintivo de fragmentación del péptido. Preferiblemente, los fragmentos peptídicos tienen diferencias significativas en las razones m/z para permitir separar bien los picos correspondientes a cada fragmento, y se obtiene un distintivo que es único para el péptido diana. Si no se obtiene un distintivo del fragmento adecuado en la primera fase, se realizan fases de MS adicionales hasta que se obtiene un distintivo único.

Los iones de los fragmentos de los espectros MS/MS y MS^{3} son típicamente altamente específicos para el péptido de interés, y, junto con los métodos LC, permiten un método de detección y cuantificación altamente selectivo de un péptido/proteína diana en una mezcla de proteína compleja, tal como un producto lisado celular, que contiene muchos miles o decenas de miles de proteínas. Se puede analizar cualquier muestra biológica que contiene potencialmente una proteína/péptido diana de interés. Preferiblemente se emplean extractos celulares brutos o parcialmente purificados. Generalmente, la muestra tiene al menos 0,01 mg de proteína, típicamemte una concentración de 0,1-10 mg/mL, y se puede ajustar a una concentración de tampón y un pH deseados.

Una cantidad conocida de un patrón peptídico interno marcado, preferiblemente aproximadamente 10 femtomoles, correspondiente a una proteína diana que se va a detectar/cuantificar se añade después a una muestra biológica, tal como un producto lisado celular. La muestra aplicada se digiere después con una o más proteasas durante un período de tiempo adecuado para permitir la digestión. Luego se realiza una separación (p. ej. mediante HPLC, HPLC en fase reversa, electroforesis por capilaridad, cromatografía de intercambio iónico, etc.) para aislar el patrón interno marcado y su correspondiente péptido diana de otros péptidos de la muestra. La LC por microcapilaridad es un método preferido.

Después se examina cada péptido aislado controlando una reacción seleccionada en el MS. Esto implica el uso del conocimiento anterior obtenido mediante la caracterización del patrón interno peptídico y el requisito del MS para controlar continuamente un ión específico en el espectro MS/MS o MS^{n} tanto para el péptido de interés como para el patrón interno. Tras la elución, se calculan el área bajo la curva (AUC) para el patrón peptídico y los picos del péptido diana. La razón de las dos áreas proporciona la cuantificación absoluta que puede ser normalizada para el número de células utilizado en el análisis y el peso molecular de la proteína, para proporcionar el número preciso de copias de la proteína por célula. Se describen detalles adicionales de la metodología AQUA en Gygi et al., y Gerber et al. supra.

De acuerdo con la presente invención, los patrones peptídicos internos AQUA (péptidos marcados con isótopos pesados) pueden ser producidos ahora, como se ha descrito antes, para los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de receptores de células T novedosos descritos en la presente memoria (véase la Tabla 1/Figura 2). Los patrones peptídicos para un sitio de fosforilación dado pueden ser producidos para las formas tanto fosforilada como no fosforilada del sitio y tales patrones pueden ser empleados en la metodología AQUA para detectar y cuantificar ambas formas de semejante sitio de fosforilación en una muestra biológica.

Las secuencias peptídicas del sitio de fosforilación descritas en la presente memoria (véase la Columna G de la Tabla 1/Figura 2) son particularmente adecuadas para el desarrollo de los correspondientes péptidos AQUA, puesto que el método IAP mediante el cual fueron identificadas (véase la Parte A anterior y el Ejemplo 1) confirmaron inherentemente que tales péptidos son producidos de hecho mediante digestión enzimática (tripsinización) y son fraccionados/ionizados de hecho adecuadamente en el MS/MS. De este modo, se pueden sintetizar fácilmente equivalentes marcados con isótopos pesados (tanto en la forma fosforilada como no fosforilada) y determinar su distintivo MS y LC-SRM único, de manera que los péptidos sean validados como péptidos AQUA y sean fáciles de utilizar en experimentos de cuantificación.

Por consiguiente, la invención proporciona péptidos marcados con isótopos pesados (péptidos AQUA) para la detección y/o cuantificación de cualquiera de los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de receptores de las células T descritos en las Filas 61 o 62 de la Tabla 1(Figura 2 (véase la Columna G) y/o su correspondiente proteína/polipéptido de origen (véase la Columna A). Cada una de tales secuencias de fosforilación puede ser considerada un péptido AQUA preferido de la invención. Óptimamente, un péptido AQUA de la invención consiste en una secuencia del sitio de fosforilación enumerada en la Tabla 1.

No obstante, se apreciará que también se puede construir un péptido AQUA más grande que comprende la secuencia del sitio de fosforilación descrita (y restos adicionales aguas abajo o aguas arriba de la misma). De un modo similar, se puede construir alternativamente un péptido AQUA más pequeño que comprende menos de todos los restos de una secuencia del sitio de fosforilación descrita (pero comprendiendo todavía el resto fosforilable enumerado en la Columna F de la Tabla 1/Figura 2). Tales péptidos AQUA más grandes están dentro el alcance de la presente invención, y la selección y producción de los péptidos AQUA preferidos se pueden llevar a cabo como se ha descrito antes (véase Gygi et al., Gerber et al. supra.).

Ciertos subgrupos de péptidos AQUA particularmente preferidos se han descrito anteriormente (correspondientes a tipos/grupos de proteínas concretos de la Tabla 1, por ejemplo, proteínas Adaptadoras/de Andamiaje o Proteínas de Unión a ARN). El Ejemplo 4 se proporciona para ilustrar adicionalmente la construcción y el uso, mediante métodos convencionales descritos antes, de péptidos AQUA ilustrativos.

Los péptidos AQUA de la invención también se pueden emplear en un kit que comprende uno o múltiples péptidos AQUA proporcionados en la presente memoria (para la cuantificación de una proteína de transducción de la señal de receptores de células T descrita en la Tabla 1), y, opcionalmente, un segundo reactivo detector conjugado con un grupo detectable. Por ejemplo, un kit puede incluir péptidos AQUA tanto para la forma fosforilada como para la no fosforilada de un sitio de fosforilación descrito en la presente memoria. Los reactivos también pueden incluir agentes secundarios tales como agentes tamponadores y agentes estabilizadores de proteínas, p. ej., polisacáridos y similares. El kit puede incluir adicionalmente, cuando sea necesario, otros miembros del sistema productor de la señal del cual es miembro el grupo detectable (p. ej., sustratos de enzimas), agentes para reducir la interferencia del fondo en un ensayo, reactivos de control, aparatos para realizar un ensayo, y similares. El kit de ensayo puede ser empaquetado de una manera adecuada, típicamente con todos los elementos en un único contenedor junto con una hoja con las instrucciones impresas para llevar a cabo el ensayo.

Los péptidos AQUA proporcionados por la invención serán muy útiles en el estudio adicional de las anomalías en la transducción de la señal subyacentes a enfermedades, incluyendo linfomas, que implican una señalización alterada de receptores de las células T, y en la identificación de diagnósticos/bio-marcadores de estas enfermedades, nuevas dianas de fármacos potenciales, y/o en el control de los efectos de los compuestos de ensayo sobre las proteínas y rutas de transducción de la señal de receptores de las células T.

D. Formatos de Inmunoanálisis

Los anticuerpos proporcionados por la invención pueden ser empleados ventajosamente en una variedad de análisis inmunológicos convencionales (el uso de péptidos AQUA proporcionados por la invención se ha descrito antes por separado). Los análisis pueden ser análisis homogéneos o análisis heterogéneos. En un análisis homogéneo la reacción inmunológica implica normalmente un anticuerpo específico del sitio de fosforilación de la invención), un analito marcado, y la muestra de interés. La señal que se origina a partir de la marca es modificada, directamente o indirectamente, tras la unión del anticuerpo al analito marcado. Tanto la reacción inmunológica como la detección del grado de la misma se llevan a cabo en una solución homogénea. Las marcas inmunoquímicas que se pueden emplear incluyen radicales libres, radioisótopos, colorantes fluorescentes, enzimas, bacteriófagos, coenzimas, etcétera.

En un enfoque de análisis heterogéneo, los reactivos son normalmente el espécimen, un anticuerpo específico del sitio de fosforilación de la invención, y medios adecuados para producir una señal detectable. Se pueden utilizar especímenes similares a los descritos antes. El anticuerpo se inmoviliza generalmente sobre un soporte, tal como una cuenta, placa o porta, y se pone en contacto con el espécimen del que se sospecha que contiene el antígeno en una fase líquida. El soporte se separa después de la fase líquida y se examina la fase de soporte o la fase líquida en busca de una señal detectable empleando medios para producir semejante señal. La señal está relacionada con la presencia del analito en el espécimen. Los medios para producir una señal detectable incluyen el uso de marcas radiactivas, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas, etcétera. Por ejemplo, si el antígeno que se va a detectar contiene un segundo sitio de unión, se puede conjugar un anticuerpo que se une a ese sitio con un grupo detectable y añadir a la solución de reacción en fase líquida antes de la etapa de separación. La presencia del grupo detectable sobre el soporte sólido indica la presencia del antígeno en la muestra de ensayo. Los ejemplos de los inmunoanálisis adecuados son radioinmunoanálisis, métodos de inmunofluorescencia, inmunoanálisis con enzima ligada, y similares.

Los formatos de inmunoanálisis y las variaciones de los mismos que pueden ser útiles para llevar a cabo los métodos descritos en la presente memoria son bien conocidos en la técnica. Véase, en general, E. Maggio, Enzyme-Immunoassay, (1980) (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.); véase también, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.727.022 (Skold et al ., "Methods for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application"); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.659.678 (Forrest et al., "Immunoassay of Antigens"); Patente de los Estados Unidos Núm. 4.376.110 (David et al., "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies"). Las condiciones adecuadas para la formación de complejos reactivo-anticuerpo están bien descritas. Véase id. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser utilizados en un análisis de "dos sitios" o "sándwich", sirviendo una única línea celular como fuente para el anticuerpo monoclonal marcado y para el anticuerpo monoclonal unido. Tales análisis se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.376.110. La concentración de reactivo detectable debe ser suficiente de manera que la unión de una proteína de transducción de la señal de receptores de las células T sea detectable en comparación con el fondo.

Los anticuerpos específicos del sitio de fosforilación descritos en la presente memoria pueden ser conjugados a un soporte sólido adecuado para un análisis de diagnóstico (p. ej., cuentas, placas, portas o pocillos formados a partir de materiales tales como látex o poliestireno) de acuerdo con las técnicas conocidas, tales como la precipitación. Los anticuerpos, u otras proteínas diana o reactivos de unión a sitios diana, pueden ser conjugados del mismo modo a grupos detectables tales como radiomarcas (p. ej., S^{35}, I^{125}, I^{131}), marcas enzimáticas (p. ej., peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina), y marcas fluorescentes (p. ej., fluoresceína) de acuerdo con las técnicas conocidas.

Los anticuerpos de la invención también pueden ser optimizados para su uso en un análisis de citometría de flujo para determinar el estado de activación/fosforilación de una proteína de transducción de la señal de receptores de células T diana en pacientes antes, durante, y después del tratamiento con un fármaco dirigido a inhibir la fosforilación en semejante proteína en el sitio de fosforilación descrito en la presente memoria. Por ejemplo, se pueden analizar células de médula ósea o células de sangre periférica de pacientes mediante citometría de flujo para la fosforilación de la proteína de señalización de receptores de células T diana, así como para marcadores que identifican diversos tipos de células hematopoyéticas. De esta manera, se puede caracterizar específicamente el estado de activación de las células malignas. La citometría de flujo se puede llevar a cabo de acuerdo con los métodos convencionales, Véase, p. ej. Chow et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001). En resumen y a modo de ejemplo, se puede emplear el siguiente protocolo para el análisis citométrico: fijación de las células con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a 37ºC seguido de permeabilización en metanol del 90% durante 30 minutos sobre hielo. Las células pueden ser teñidas después con el anticuerpo primario (un anticuerpo fosfo-específico de la invención), lavadas y marcadas con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente. Alternativamente, las células pueden ser teñidas con un anticuerpo primario marcado fluorescentemente. Las células se analizarían después en un citómetro de flujo
(p. ej. Beckman Coulter EPICS-XL) de acuerdo con los protocolos específicos del aparato utilizado. Semejante análisis identificaría la presencia de una o varias proteínas de transducción de la señal de receptores de células T activadas en las células enfermas y revelaría la respuesta al fármaco en la proteína elegida como diana.

Alternativamente, se pueden emplear los anticuerpos de la invención en la tinción inmunohistoquímica (IHC) para detectar las diferencias en la transducción de la señal o en la actividad de la proteína utilizando tejidos normales y enfermos. La IHC se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas bien conocidas. Véase, p. ej., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra. En resumen, se prepara tejido embebido en parafina (p. ej. tejido tumoral) para la tinción inmunohistoquímica desparafinando las secciones de tejido con xileno seguido de etanol; hidratando en agua y después en PBS; desenmascarando el antígeno calentando el porta en tampón citrato de sodio; incubando secciones en peróxido de hidrógeno; bloqueando en solución de bloqueo; incubando el porta en anticuerpo primario y anticuerpo secundario; y finalmente detectando mediante el uso de un método con avidina/biotina ABC de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los anticuerpos de la invención también se pueden optimizar para su uso en otras aplicaciones clínicamente adecuadas, por ejemplo análisis de tipo múltiple basados en cuentas, tales como los formatos de análisis IGEN, Luminex® y/o Bioplex®, o se pueden optimizar de otro modo para otros formatos de matrices, tales como aplicaciones de matrices en fase reversa (véase, p. ej. Paweletz et al., Oncogene 20(16): 1981-89 (2001)). Por consiguiente, en otra realización, se proporciona un método para la detección múltiple de fosforilación de proteínas de señalización de receptores de células T en una muestra biológica, comprendiendo el método utilizar dos o más anticuerpos o péptidos AQUA para detectar la presencia de dos o más proteínas de señalización de receptores de células T fosforiladas enumeradas en la Columna A de la Tabla 1/Figura 2. En una realización preferida, se emplean de dos a cinco anticuerpos o péptidos AQUA en el método. En otra realización preferida, se emplean de seis a diez anticuerpos o péptidos AQUA, mientras en otra realización preferida se emplean de once a veinte de tales reactivos.

Los anticuerpos y/o péptidos AQUA de la invención también se pueden emplear en un kit que comprende al menos un anticuerpo específico del sitio de fosforilación o péptido AQUA de la invención (que se une a o detecta una proteína/sitio de señalización de receptores de células T descrita en la Tabla 1), y, opcionalmente, un segundo anticuerpo conjugado con un grupo detectable. En algunas realizaciones, el kit es adecuado para análisis múltiples y comprende dos o más anticuerpos o péptidos AQUA, y en algunas realizaciones, comprende de dos a cinco, de seis a diez, o de once a veinte reactivos. El kit también puede incluir agentes auxiliares tales como agentes tamponadores y agentes estabilizadores de proteínas, p. ej., polisacáridos y similares. El kit puede incluir adicionalmente, cuando sea necesario, otros miembros del sistema productor de la señal de cuyo sistema es miembro el grupo detectable (p. ej., sustratos enzimáticos), agentes para reducir la interferencia del fondo en un ensayo, reactivos de control, aparatos para realizar un ensayo, y similares. El kit de ensayo puede ser empaquetado de cualquier manera adecuada, típicamente con todos los elementos en un único contenedor junto con una hoja de instrucciones impresas para llevar a cabo el ensayo.

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Ejemplo 1 Aislamiento de Péptidos que Contienen Fosfotirosina de Extractos de Células Jurkat Activadas e Identificación de Sitios de Fosforilación Novedosos

Con el fin de descubrir los sitios de fosforilación de la proteína de señalización de receptores de las células T previamente desconocidos, se emplearon técnicas de aislamiento IAP para identificar los péptidos que contienen fosfotirosina en extractos celulares de células Jurkat tratadas con pervanadato con el fin de estimular la fosforilación de tirosina.

Se purificaron y se analizaron péptidos con fosfotirosina trípticos de extractos de la línea celular Jurkat como sigue. Las células se cultivaron en medio RPMI con un suplemento de suero bovino al 10% y penicilina/estreptomicina. Las células se cultivaron a una densidad de 1,2 x 10^{6} células/ml y se lavaron en PBS a la temperatura ambiente, después se resuspendieron en PBS a 7 x 10^{7} células/ml. Tras una preincubación a 37ºC durante 20 minutos, se añadieron caliculina A y pervanadato de sodio a concentraciones finales de 50 ng/ml y 1 mM, respectivamente, y las células se incubaron durante 20 minutos a 37ºC. Después de centrifugar a la temperatura ambiente, las células se resuspendieron en 1,25 x 10^{8} células/ml en tampón de lisis (HEPES 20 mM pH 8,0, urea 9 M, vanadato de sodio 1 mM) y se sometieron a sonicación.

Se aclararon los productos lisados celulares sometidos a sonicación mediante centrifugación a 20.000 x g, y las proteínas se redujeron con DTT a una concentración final de 4,1 mM y se alquilaron con yodoacetamida 8,3 mM. Para la digestión con tripsina, se diluyeron los extractos de proteína en HEPES 20 mM, pH 8,0 a una concentración final de urea 2 M y se añadió TLCK-tripsina inmovilizada (Pierce) a cuentas de 1-2,5 ml (200 unidades TAME de tripsina/ml) por 10^{9} células. La digestión se realizó durante 1-2 días a la temperatura ambiente.

Se añadió ácido trifluoroacético (TFA) a productos digeridos de proteína a una concentración final del 1%, el producto precipitado se separó mediante centrifugación, y los productos digeridos se cargaron en columnas C_{18} Sep-Pak (Waters) equilibradas con TFA al 0,1%. Se utilizó un volumen de la columna de 0,7-1,0 ml por 2 x 10^{8} células. Las columnas se lavaron con 15 volúmenes de TFA al 0,1%, seguido de 4 volúmenes de acetonitrilo al 5% (MeCN) en TFA al 0,1%. La fracción peptídica I se obtuvo eluyendo cada una de las columnas con 2 volúmenes de MeCN al 8, 12, y 15% en TFA al 0,1% y combinando los productos eluidos. Las fracciones II y III fueron una combinación de productos eluidos después de hacer eluir las columnas con MeCN al 18, 22, 25% en TFA al 0,1% y con MeCN al 30, 35, 40% en TFA al 0,1%, respectivamente. Todas las fracciones peptídicas se liofilizaron.

Los péptidos de cada fracción correspondiente a 2 x 10^{8} células se disolvieron en 1 ml de tampón IAP (Tris/HCl 20 mM o MOPS 50 mM pH 7,2, fosfato de sodio 10 mM, NaCl 50 mM) y la materia insoluble (principalmente en las fracciones peptídicas III) se separó mediante centrifugación. Se realizó la IAP en cada fracción peptídica por separado. El anticuerpo monoclonal de fosfotirosina P-Tyr-100 (Cell Signaling Technology, Inc., número de catálogo 9411) se acopló a 4 mg/ml de cuentas a proteína G agarosa (Roche).

Se añadió anticuerpo inmovilizado (15 \mul, 60 \mug) en forma de una suspensión 1:1 en tampón para IAP a 1 ml de cada fracción peptídica, y la mezcla se incubó durante la noche a 4ºC con rotación suave. Las cuentas de anticuerpo inmovilizado se lavaron tres veces con 1 ml de tampón para IAP y dos veces con 1 ml de agua, todo a 4ºC. Los péptidos se hicieron eluir de las cuentas mediante incubación con 75 \mul de TFA al 0,1% a la temperatura ambiente durante 10 minutos.

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Análisis mediante Espectrometría de Masas MALDI-TOF

Se aplicó una capa fina de matriz de ácido \alpha-ciano-4-hidroxi-cinámico (ACHA) a una diana Bruker 384-spot MALDI extendiendo 5 \mul de una solución saturada en MeCN/agua (2/1, v/v) a lo largo de una fila completa de aplicaciones sobre la diana; el secado se produjo en 2-5 seg. El producto eluido de la IAP (10 \mul) se cargó sobre C-18 ZipTip de 0,2 \mul (Millipore), que después se lavó con ácido fórmico al 5%. El péptido se hizo eluir con 1 \mul de 10 mg/ml de ACHA en metanol del 60%, ácido fórmico al 5% sobre la diana MALDI que contenía la capa fina de la matriz. Las muestras se analizaron en un aparato Bruker BiFlex III MALDI-TOF en el modo de ión positivo.

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Análisis mediante Espectrometría de Masas LC-MS/MS

Se purificaron 40 \mul de producto eluido de IAP mediante ZipTip C-18 de 0,2 \mul (Millipore). Los péptidos se eluyeron de las microcolumnas con 1 \mul de MeCN al 40%, TFA al 0,1% (fracciones I y II) o 1 \mul de MeCN al 60%, TFA al 0,1% (fracción III) en 7,6 \mul de ácido acético al 0,4%/ácido heptafluorobutírico al 0,005%. Esta muestra se cargó sobre una columna de capilaridad PicoFrit de 10 cm x 75 \mum (New Objective) empaquetada con resina para fase reversa Magic C18 AQ (Michrom Bioresources) utilizando un aparato para la toma de muestras automático Famos con una válvula para la inyección de muestras inerte (Dionex). La columna se reveló después con un gradiente lineal de 45 min. de acetonitrilo distribuido a 200 nl/min (Ultimate, Dionex), y se recogieron espectros de masas en tándem de una manera dependiente de los datos con un espectrómetro de masas con trampa de iones LCQ Deca XP Plus esencialmente como describen Gygi et al., supra.

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Análisis de la Base de Datos y Asignaciones

Se evaluaron los espectros MS/MS utilizando TurboSequest en el paquete Sequest Browser (v. 27, rev. 12) suministrado como parte de BioWorks 3.0 (ThermoFinnigan). Los espectros MS/MS individuales se extrajeron del archivo de datos bruto utilizando el programa CreateDta de Sequest Browser, con los siguientes ajustes: PM de la parte inferior, 700; PM de la parte superior 4.500; número de iones mínimo, 20; TIC mínimo, 4 x 10^{5}; y estado de carga del precursor, no especificado. Los espectros se extrajeron del comienzo del archivo de datos brutos antes de la inyección de la muestra hasta el final del gradiente de elución. No se utilizaron los programas IonQuest y VuDta para seleccionar adicionalmente los espectros MS/MS para el análisis Sequest. Se evaluaron los espectros MS/MS con los siguientes parámetros TurboSequest: tolerancia de masa peptídica, 2,5; tolerancia del ión del fragmento, 0,0; número máximo de aminoácidos diferenciales por modificación, 4; origen del tipo de masa, medio; fragmento del tipo de masa, medio; número máximo de sitios de escisión internos, 10; las pérdidas neutras de agua y amoníaco de los iones b e y se consideraron en el análisis de correlación. La enzima proteolítica fue especificada excepto para los espectros recogidos de productos digeridos con elastasa.

Se realizaron búsquedas frente a la base de datos de proteínas humanas NCBI (para todos los demás estudios) (liberada el 29 de Abril de 2003 y que contenía 37.490 secuencias de proteínas). La carboxamidometilación de la cisteína se especificó como modificación estática, y se dejó la fosforilación como una modificación variable en los restos serina, treonina, y tirosina o en restos tirosina solos. Se determinó que la fosforilación restrictiva para los restos tirosina tenía un efecto pequeño sobre el número de sitios de fosforilación asignados.

En proteómica, es deseable validar las identificaciones de proteína basándose solamente en la observación de un único péptido en un resultado experimental, con el fin de indicar que la proteína está, en efecto, presente en una muestra. Eso ha conducido al desarrollo de métodos estadísticos para validar asignaciones peptídicas, que no son aceptados universalmente todavía, y de pautas para la publicación de los resultados de la identificación de proteínas y péptidos (véase Carr et al. Mol Cell Proteomics 3: 531-533 (2004), que fueron seguidos en este Ejemplo. Sin embargo, debido a que la estrategia de inmunoafinidad separa los péptidos fosforilados de los péptidos no fosforilados, es un resultado común observar sólo un fosfopéptido de una proteína, puesto que muchas proteínas fosforiladas tienen solamente un sitio tirosina fosforilado. Por esta razón, resulta apropiado utilizar criterios adicionales para validar asignaciones de fosfopéptidos. Es probable que las asignaciones sean correctas si se cumple cualquiera de estos criterios adicionales: (i) se asigna la misma secuencia a iones que eluyen simultáneamente con diferentes estados de carga, puesto que espectro MS/MS cambia notablemente con el estado de carga; (ii) el sitio se encuentra en más de un contexto de secuencias peptídicas debido a que la secuencia se solapa por la proteolisis incompleta o el uso de proteasas distintas de tripsina; (iii) el sitio se encuentra en más de un contexto de secuencias peptídicas debido a isoformas de la proteína homólogas pero no idénticas; (iv) el sitio se encuentra en más de un contexto de secuencias peptídicas debido a proteínas homólogas pero no idénticas entre especies; y (v) los sitios eran validados por el análisis MS/MS de los fosfopéptidos sintéticos correspondientes a las secuencias asignadas, puesto que el espectrómetro de masas con trampas de iones produce espectros MS/MS altamente reproducibles. El último criterio se emplea rutinariamente para confirmar las asignaciones de sitios novedosos de particular interés.

Todos los espectros y todas las asignaciones de secuencias realizadas mediante Sequest fueron importados a una base de datos relacional. Las secuencias asignadas fueron aceptadas o rechazadas siguiendo un proceso conservativo, de dos etapas. En la primera etapa, se seleccionó un subgrupo de asignaciones de secuencias con una puntuación elevada filtrando los valores XCorr de al menos 1,5 para un estado de carga de +1, 2,2 para +2, y 3,3 para +3, permitiendo un valor RSp máximo de 10. Las asignaciones de este subgrupo se rechazaron si se satisfacía cualquiera de los siguientes criterios: (i) el espectro contenía al menos un pico principal (al menos 10% tan intenso como el ión más intenso del espectro) que no pudo ser mapeado para la secuencia asignada como un ión a, b, o y, como un ión que surgía de la pérdida neutra de agua o amoníaco a partir de un ión b o y, o como un ión múltiplemente protonado; (ii) el espectro no contenía una serie de iones b o y equivalente a al menos seis restos ininterrumpidos; o (iii) la secuencia no se observó al menos cinco veces en todos los estudios que realizaron los autores de la presente invención (excepto para secuencias solapantes debido a la proteolisis incompleta o al uso de proteasas distintas de tripsina). En la segunda etapa, se aceptaron asignaciones con puntuaciones por debajo del umbral si el espectro de baja puntuación mostraba un alto grado de similitud con un espectro de alta puntuación de otro estudio, lo que simula una referencia real genoteca-estrategia de búsqueda. Todos los espectros que apoyaron la lista final de secuencias asignadas enumeradas en la Tabla 1/Figura 2 en la presente memoria fueron revisados por al menos tres personas para establecer su
credibilidad.

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Ejemplo 2 Producción de Anticuerpos Policlonales Fosfo-específicos para la Detección de Fosforilación de Proteínas de Señalización de Receptores de Células T

Los anticuerpos policlonales que se unen específicamente a una proteína de transducción de la señal de receptores de células T solamente cuando está fosforilada en el respectivo sitio de fosforilación descritos en la presente memoria (véase la Tabla 1) se producen de acuerdo con métodos normalizados construyendo primero un antígeno peptídico sintético que comprende la secuencia del sitio de fosforilación e inmunizando después un animal para originar anticuerpos contra el antígeno, como se describe adicionalmente más abajo. La producción de anticuerpos policlonales ilustrativos se proporciona más abajo.

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A. Cdk6 (tirosina 24)

Se construye un antígeno fosfo-peptídico de 15 aminoácidos, AEIGEGAy*GKVFKAR (SEQ ID NO: 61) (donde y*= fosfotirosina), que corresponde al sitio de fosforilación de la tirosina 24 de la quinasa Cdk6 humana (véase la Fila 62 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, de acuerdo con las técnicas de síntesis normalizadas utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.; Merrifield, supra. Este péptido es acoplado después a KLH y utilizado para inmunizar animales para producir (y con posterioridad escrutar) anticuerpos policlonales fosfo-específicos de Cdk6 (Tyr24) como se describe más abajo en Inmunización/Escrutinio.

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B. ZAP70 (tirosina 248)

Se construye un antígeno fosfo-peptídico de 15 aminoácidos, LKADGLIyCLKEACP (SEQ ID NO: 63) (donde
y* = fosfotirosina), que corresponde al sitio de fosforilación de la tirosina 248 de la quinasa ZAP70 humana (véase la Fila 64 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.; Merrifield, supra. Este péptido es acoplado después a KLH y utilizado para inmunizar animales para producir (y con posterioridad escrutar) anticuerpos policlonales fosfo-específicos de ZAP70 (Tyr248) como se describe más abajo en Inmunización/Escrutinio.

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C. SIT (tirosina 95)

Se construye un antígeno fosfo-peptídico de 15 aminoácidos, PLYGNHyLQTGRLS (SEQ ID NO: 12) (donde y* = fosfotirosina) que corresponde al sitio de fosforilación de la tirosina 95 en la proteína SIT humana (véase la Fila 13 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.; Merrifield, supra. Este péptido es acoplado después a KLH y utilizado para inmunizar animales para producir (y con posterioridad escrutar) anticuerpos fosfo-específicos de SIT (Tyr95) como se describe más abajo en Inmunización/Escrutinio.

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Inmunización/Escrutinio

Se acopla un antígeno fosfo-peptídico sintético como se ha descrito antes en A-C a KLH, y se inyectan conejos intradérmicamente (ID) en el dorso con antígeno con coadyuvante completo de Freund (500 \mug de antígeno por conejo). Los conejos son reforzados con el mismo antígeno en coadyuvante incompleto de Freund (250 \mug de antígeno por conejo) cada tres semanas. Después del quinto refuerzo, se recogieron muestras de sangre. Los sueros se purifican por medio de cromatografía de afinidad con Proteína A mediante métodos convencionales (véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, supra.). Las inmunoglobulinas eluidas se cargan adicionalmente en columnas Knotes de resina con el antígeno peptídico sintético no fosforilado para retener los anticuerpos que se unen a la forma no fosforilada del sitio de fosforilación. La fracción de flujo directo se recoge y se aplica a una columna de resina con el antígeno peptídico fosfo-sintético para aislar los anticuerpos que se unen a la forma fosforilada del sitio. Después de lavar la columna extensamente, los anticuerpos unidos (esto es los anticuerpos que se unen a un péptido fosforilado descrito en A-C antes, pero que no se unen a la forma no fosforilada del péptido, se hacen eluir y se mantienen en tampón de almacenamiento de anticuerpos.

El anticuerpo aislado se somete a ensayo después en busca de fosfo-especificidad utilizando un análisis de transferencia Western empleando una línea celular apropiada que expresa (o expresa en exceso) la fosfo-proteína diana (esto es Cdk6, ZAP70, o SIT fosforiladas), por ejemplo, células Jurkat. Las células se cultivan en medio RPMI con un suplemento de FCS al 10% y penicilina/estreptomicina. Antes de la estimulación, las células dejaron de recibir medio RPMI sin suero durante 4 horas. Después las células son estimuladas con ligando (p. ej. 50 ng/ml) durante 5 minutos. Las células se recogen, se lavan con PBS y se lisan directamente en tampón de lisis celular. Después se mide la concentración de proteína de los productos lisados celulares. El tampón de carga se añade al producto lisado celular y la mezcla se hierve a 100ºC durante 5 minutos. Luego se añaden 20 \mul (10 \mug de proteína) de muestra a gel SDS-PAGE al 7,5%.

Se puede realizar una transferencia Western convencional de acuerdo con el Immunoblotting Protocol mostrado en CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC. Catálogo 2003-04, pág. 390. Se utiliza el anticuerpo fosfo-específico aislado a una dilución 1:1000. La especificidad del sitio de fosforilación del anticuerpo se demostrará mediante la unión de la forma fosforilada de la proteína diana únicamente. El anticuerpo policlonal fosfo-específico aislado no reconoce la proteína diana cuando no está fosforilada en el sitio de fosforilación apropiado en las células no estimuladas (p. ej. ZAP70 no se une cuando no está fosforilada en la tirosina 248).

Con el fin de confirmar la especificidad del anticuerpo aislado, se preparan diferentes productos lisados celulares que contienen diversas proteínas de transducción de la señal fosforiladas distintas de la proteína diana. El análisis de transferencia Western se realiza de nuevo utilizando estos productos lisados celulares. El anticuerpo policlonal fosfo-específico aislado como se ha descrito antes se utiliza (dilución 1:1000) para someter a ensayo la reactividad con las diferentes proteínas no diana fosforiladas sobre la membrana de transferencia Western. El anticuerpo fosfo-específico no presenta significativamente reacción cruzada con otras proteínas de transducción de la señal fosforiladas, aunque ocasionalmente se puede observar una ligera unión con un sitio de fosforilación altamente homólogo de otra proteína. En tal caso el anticuerpo puede ser purificado adicionalmente utilizando la cromatografía de afinidad, o la inmunorreactividad específica puede ser clonada mediante tecnología de hibridoma de conejo.

Ejemplo 3 Producción de Anticuerpos Monoclonales Fosfo-específicos para la Detección de Fosforilación de la Proteína de Señalización de Receptores de las Células T

Se producen anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a una proteína de transducción de la señal de receptores de las células T solamente cuando está fosforilada en el respectivo sitio de fosforilación descrito en la presente memoria (véase la Tabla 1) de acuerdo con los métodos convencionales construyendo primero un antígeno peptídico sintético que comprende la secuencia del sitio de fosforilación e inmunizando después un animal para producir anticuerpos contra el antígeno, y cosechando células de bazo de tales animales para producir hibridomas de fusión, como se describe adicionalmente más abajo. La producción de anticuerpos monoclonales ilustrativos se proporciona más abajo.

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A. Cdk6 (tirosina 13)

Se construye un antígeno fosfo-peptídico de 15 aminoácidos, LCRADQQy*ECVAEIG (SEQ ID NO: 60) (donde y* = fosfotirosina) que corresponde al sitio de fosforilación de la tirosina 13 en la quinasa Cdk6 humana (véase la Fila 61 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.; Merrifield, supra. Este péptido se acopla después a KLH y se utiliza para inmunizar animales y cosechar células de bazo para la generación (y posterior escrutinio) de anticuerpos monoclonales fosfo-específicos de Cdk6 (Tyr13) como se describe más abajo en Inmunización/Fusión/Escrutinio.

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B. FAF-X (tirosina 2533)

Se construye un antígeno fosfo-peptídico de 15 aminoácidos, GQRAQENy*EGSEEVS (SEQ ID NO: 59) (donde y* = fosfotirosina) que corresponde al sitio de fosforilación de la tirosina 2533 en la proteasa FAF-X humana (véase la Fila 60 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.; Merrifield, supra. Este péptido es acoplado después a KLH y utilizado para inmunizar animales y cosechar células de bazo para la generación (y posterior escrutinio) de anticuerpos monoclonales fosfo-específicos de FAF-X (Tyr2533) como se describe más abajo en Inmunización/Fusión/Escrutinio.

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C. Cortactina-a (tirosina 453)

Se construye un antígeno fosfo-peptídico de 15 aminoácidos, YSMEAADy*REASSQQ (SEQ ID NO: 43) (donde y* = fosfotirosina) que corresponde al sitio de fosforilación de la tirosina 453 de la Cortactina humana (véase la Fila 44 de la Tabla 1), más cisteína en el extremo C para el acoplamiento, de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony. Véase ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, supra.; Merrifield, supra. Este péptido es acoplado después a KLH y utilizado para inmunizar animales y cosechar células de bazo para la generación (y posterior escrutinio) de anticuerpos monoclonales fosfo-específicos de Cortactina a (Tyr453) como se describe más abajo en Inmunización/Fusión/Escrutinio.

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Inmunización/Fusión/Escrutinio

Se acopla un antígeno fosfo-peptídico sintético como se ha descrito en A-C antes a KLH, y se inyectan ratones BALB/c intradérmicamente (ID) en el dorso con el antígeno en coadyuvante completo de Freund (p. ej. 50 \mug de antígeno por ratón). Los ratones se refuerzan con el mismo antígeno en coadyuvante incompleto de Freund (p. ej. 25 \mug de antígeno por ratón) cada tres semanas. Después del quinto refuerzo, los animales se sacrifican y se recogen los bazos.

Las células de bazo cosechadas se fusionan con las células compañeras de fusión de mieloma de ratón SP2/0 de acuerdo con el protocolo normalizado de Kohler y Milstein (1975). Las colonias que se originan a partir de la fusión se escrutan mediante ELISA en busca de reactividad con las formas fosfo-peptídica y no fosfo-peptídica del antígeno y mediante análisis de transferencia Western (como se ha descrito en el Ejemplo 1 anterior). Las colonias que se ha encontrado por medio de ELISA que son positivas para el fosfo-péptido y negativas para el no-fosfo-péptido se caracterizan adicionalmente mediante análisis de transferencia Western. Las colonias que se ha encontrado que son positivas por medio de análisis de transferencia Western son subclonadas mediante dilución limitante. Se producen ascitis de ratón a partir de un único clon obtenido mediante subclonación, y se someten a ensayo en cuanto a la fosfo-especificidad (contra el antígeno fosfo-peptídico de Cdk6, FAF-X, o Cortactina a, según sea el caso) por medio de ELISA. Los clones identificados como positivos en el análisis de transferencia Western utilizando sobrenadante de cultivo celular por tener fosfo-especificidad, como indica una fuerte banda en la calle inducida y una banda débil en la calle no inducida de la transferencia, se aíslan y se subclonan como clones que producen anticuerpos monoclonales con la especificidad deseada.

El fluido de ascitis de los clones aislados puede ser sometido a ensayo adicionalmente mediante análisis de transferencia Western. El flujo de ascitis debe producir resultados similares en el análisis de transferencia Western a los observados previamente con el sobrenadante de cultivo celular, indicando fosfo-especificidad contra la diana fosforilada (p. ej. FAF-X fosforilada en la tirosina 2533).

Ejemplo 4 Producción y Uso de Péptidos AQUA para la Cuantificación de la Fosforilación de la Proteína de Señalización de Receptores de Células T

Los péptidos marcados con isótopos pesados (péptidos AQUA (patrones internos)) para la detección y cuantificación de una proteína de transducción de la señal de receptores de las células T solamente cuando está fosforilada en el respectivo sitio de fosforilación descrito en la presente memoria (véase la Tabla 1) son producidos de acuerdo con los métodos de la metodología AQUA convencional (véase Gygi et al., Gerber et al., supra.) construyendo primero un patrón peptídico sintético correspondiente a la secuencia del sitio de fosforilación e incorporando una marca de isótopo pesado. Con posterioridad, se valida el distintivo MS^{n} y LC-SRM del péptido patrón, y se utiliza el péptido AQUA para cuantificar el péptido nativo en una muestra biológica, tal como un extracto celular digerido. Más abajo se proporcionan la producción y el uso de péptidos AQUA ilustrativos.

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A. LPP (tirosina 317)

Se construye un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación de la tirosina 317 en la proteína compañera preferida del Lipoma (LPP) humana, RNDSDPTy*GQQGHPN (y* = fosfotirosina) (véase la Fila 14 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 13)) pero incorporando prolina marcada con C^{14}/N^{15} (indicado por una P en negrita) de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, supra.) como se describe adicionalmente más abajo en Síntesis y Distintivo MS/MS. El péptido AQUA de LPP (Tyr317) es aplicado en una muestra biológica para cuantificar la cantidad de LPP fosforilada en la muestra, como se describe adicionalmente más abajo en Análisis y Cuanti-
ficación.

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B. Ets-1 (tirosina 205)

Se construye un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación de la tirosina 205 en la proteína del factor de transcripción Ets-1 humana, SLKYENDy*PSVILRD (y* = fosfotirosina) (véase la Fila 78 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 77)) pero incorporando leucina marcada con C^{14}/N^{15} (indicada por una L en negrita) de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, supra.) como se describe adicionalmente más abajo en Síntesis y Distintivo MS/MS. El péptido AQUA de Ets-1 (Tyr205) es aplicado después a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de Ets-2 (Tyr205) fosforilada en la muestra, como se describe adicionalmente más abajo en Análisis y Cuantificación.

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C. Bid (tirosina 54)

Se construye un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación de la tirosina 54 de la proteína Bid humana, LAPQWEGy*DELQTDG (y* = fosfotirosina) (véase la Fila 18 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 17)) pero que incorpora leucina marcada con C^{14}/N^{15} (indicada por una L en negrita) de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, supra.) como se describe adicionalmente más abajo en Síntesis y Distintivo MS/MS. El péptido AQUA de Bid (Tyr54) se aplica después a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de Bid (Tyr54) fosforilada en la muestra, como se describe adicionalmente más abajo en Análisis y Cuantificación.

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D. GIT2 (tirosina 492)

Se construye un péptido AQUA que tiene una secuencia correspondiente al sitio de fosforilación de la tirosina 492 de la proteína GIT2 humana, QVQTGSEy*TDTSNHS (y* = fosfotirosina) (véase la Fila 51 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 50)) pero que incorpora valina marcada con C^{14}/N^{15} (indicada por una V en negrita) de acuerdo con las técnicas de síntesis convencionales utilizando, p. ej., un sintetizador peptídico Rainin/Protein Technologies, Inc., Symphony (véase Merrifield, supra.) como se describe adicionalmente más abajo en Síntesis y Distintivo MS/MS. Después se aplica el péptido AQUA de de GIT2 (Tyr492) a una muestra biológica para cuantificar la cantidad de GIT2 (Tyr492) fosforilada en la muestra, como se describe adicionalmente más abajo en Análisis y Cuantificación.

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Síntesis y Espectro MS/MS

Se pueden obtener monómeros de aminoácidos transformados con fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) de AnaSpec (San Jose, CA). Los monómeros con isótopos estables derivados con Fmoc que contienen un átomo N^{15} y de cinco a nueve átomos C^{13} se pueden obtener de Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA). Se pueden obtener resinas Wang precargadas de Applied Biosystems. Las escalas de la síntesis pueden variar entre 5 y 25 \mumoles. Los aminoácidos se activan in situ con 1-H-benzotriazolio, 1-bis(dimetilamino)metilen]-hexafluoro-fosfato(1-),3-oxido:hidrato 1-hidroxibenzotriazol y se acoplan a un exceso molar de 5 veces sobre el péptido. Cada ciclo de acoplamiento está seguido de protección terminal con anhídrido acético para evitar la acumulación de subproductos peptídicos de deleción de un resto. Tras la síntesis, las resinas con los péptidos se tratan con un captador convencional - que contiene ácido trifluoroacético (TFA) - solución de escisión acuosa, y los péptidos se hacen precipitar mediante la adición a éter frío. Los péptidos (esto es un péptido AQUA deseado descrito en el apartado A-D anterior) se purifican mediante HPLC C18 en fase reversa utilizando gradientes de TFA/acetonitrilo convencionales y se caracterizan mediante ionización por desorción láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (Biflex III, Bruker Daltonics, Billerica, MA) y trampa de iones (ThermoFinnigan, LCQ DecaXP) MS.

Los espectros MS/MS para cada péptido AQUA deben mostrar un pico de iones de tipo y fuerte como ión del fragmento más intenso que es adecuado para su uso en un control/análisis SRM. Se preparan columnas de microcapilaridad en fase reversa (0,1 \ring{A}\sim 150-220 mm) de acuerdo con los métodos convencionales. Se puede utilizar una cromatografía líquida Agilent 1100 para desarrollar y liberar un gradiente de disolvente [ácido acético al 0,4%/ácido heptafluorobutírico (HFBA) al 0,005%/metanol al 7% y ácido acético al 0,4%/HFBA al 0,005%/metanol al 65%/acetonitrilo al 35%] en la columna de microcapilaridad por medio de un separador de flujo. Las muestras se cargan después directamente sobre la columna de microcapilaridad utilizando un aparato para la toma de muestras automático de capilaridad inerte FAMOS (LC Packings, San Francisco) después de la separación de flujo. Los péptidos se reconstituyen en ácido acético al 6%/TFA al 0,01% antes de su inyección.

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Análisis y Cuantificación

La proteína diana (p. ej. una proteína fosforilada de los apartados A-D anteriores) de una muestra biológica se cuantifica utilizando un péptido AQUA validado (como se ha descrito antes). Después se aplica el método IAP a la mezcla de péptidos compleja derivada de la escisión proteolítica de los extractos celulares brutos a la cual se han aplicado los péptidos AQUA.

Después se lleva a cabo la LC-SRM de la muestra completa. Se puede realizar el MS/MS utilizando un espectrómetro de masas ThermoFinnigan (San Jose, CA) (trampa de iones LCQ DecaXP o cuadrupolo triple TSQ Quantum). En el DecaXP, se aíslan los iones de origen a una anchura de 1,6 m/z, estando limitado el tiempo de inyección de iones a 150 ms por microbarrido, con dos microbarridos por péptido promediado, y con un ajuste de AGC de 1 x 10^{8}; en el Quantum, se mantiene Q1 a 0,4 y Q3 a 0,8 m/z con un tiempo de barrido de 200 ms por péptido. En ambos aparatos, se analizan analito y patrón interno en alternancia en una ventana de retención en fase reversa conocida previamente; los pares bien resueltos del patrón interno y el analito se analizan en segmentos de retención separados para mejorar el ciclo pesado. Los datos se procesan integrando los picos apropiados en un cromatograma de iones extraídos (60,15 m/z del fragmento controlado) para el compuesto nativo y el patrón interno, seguido del cálculo de la razón de las áreas del pico multiplicada por la cantidad absoluta del patrón interno (p. ej., 500 fmoles).

<110> CELL SIGNALING TECHNOLOGY, INC.

\hskip1cm Moritz, Albrecht

\hskip1cm Rush, John

\hskip1cm Polakiewicz, Roberto

\hskip1cm Lee, Kimberly

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<120> REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE PROTEÍNAS EN RUTAS DE SEÑALIZACIÓN DE RECEPTORES DE CÉLULAS T

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<130> CST-217 PCT

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<160> 95

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada.

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<400> 1

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 2

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<210> 3

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 4

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<210> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina en la posición 8 está fosforilada

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<400> 6

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 7

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<210> 8

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 8

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<210> 9

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 9

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<210> 10

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<211> 15

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RE5

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 10

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<210> 11

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 11

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<210> 12

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 13

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 14

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<212> PRT

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada.

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<400> 15

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<210> 16

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<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm38

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<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada,

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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\hskip1cm52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm56

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<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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\hskip1cm58

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<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\newpage

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<210> 69

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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\vskip0.400000\baselineskip

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<210> 72

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<210> 73

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<210> 74

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<210> 75

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (8)..(8)

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<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

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<400> 75

\hskip1cm85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\hskip1cm90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\hskip1cm92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\hskip1cm94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip1cm95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip1cm96

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip1cm98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina de la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip1cm104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)..(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> FOSFORILACIÓN: la tirosina localizada en la posición 8 está fosforilada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\hskip1cm105

Claims (8)

1. Un método para detectar o cuantificar una proteína de señalización que está fosforilada en tirosina en las rutas de señalización de receptores de las células T, comprendiendo dicho método la etapa de utilizar uno o más de los siguientes reactivos para detectar o cuantificar la proteína de señalización de receptores de células T Cdk 6 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 13 o 24:

(i)

un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a dicha proteína solamente cuando está fosforilada en la tirosina 13 o 24, comprendida en la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina; y/o

(ii)

un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de dicha proteína, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61, que comprende la tirosina fosforilada 13 o 24.

\vskip1.000000\baselineskip

2. El método de la reivindicación 1, donde

(i)

dicho anticuerpo se une específicamente a Cdk 6 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 24, comprendida en la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 61; y

(ii)

dicho péptido marcado comprende la secuencia del sitio de fosforilación SEQ ID NO: 61, que comprende la tirosina fosforilada 24.

\vskip1.000000\baselineskip

3. Un anticuerpo específico del sitio de fosforilación aislado que se une específicamente a la proteína humana de señalización de receptores de células T humanas Cdk 6 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 13 o 24 comprendida en la secuencia peptídica fosforilable SEQ ID NO: 60 y 61, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína de señalización cuando no está fosforilada en dicha tirosina.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, donde dicho anticuerpo se une específicamente a Cdk 6 solamente cuando está fosforilada en la tirosina 24, comprendida en la secuencia peptídica fosforilable SEQ ID NO: 61, donde dicho anticuerpo no se une a dicha proteína cuando no está fosforilada en dicha tirosina.

5. Una línea celular inmortalizada productora del anticuerpo de la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

6. La línea celular de la reivindicación 5, donde dicha línea celular inmortalizada es un hibridoma de conejo o un hibridoma de ratón.

7. Un péptido marcado con un isótopo pesado (péptido AQUA) para la cuantificación de la proteína humana de señalización de receptores de células T humanas Cdk 6, comprendiendo dicho péptido marcado la secuencia peptídica fosforilable SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 61, cuya secuencia comprende la tirosina fosforilable 13 o 24.

8. Un péptido marcado con un isótopo pesado de la reivindicación 7, donde dicho péptido marcado comprende la secuencia peptídica fosforilable SEQ ID NO: 61, cuya secuencia comprende la tirosina fosforilable 24.