CN107188936B - 特异性结合免疫球蛋白的蛋白质以及免疫球蛋白结合性亲和配体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是制作出新的修饰型蛋白质A配体，其具有比现有的修饰型蛋白质A配体更好的抗体酸解离特性。本发明提供了对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中该蛋白质是具有如下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列相对于来源于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的任何结构域的氨基酸序列，将至少1个氨基酸取代突变导入至在与所有结构域中都保守的、A、B和C结构域的第31～37位(E结构域的第29～35位，D结构域的第34～40位)相对应的氨基酸残基上而得到的氨基酸序列，并且，与具有导入该突变前的氨基酸序列的蛋白质相比，本发明的蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低。

Description

特异性结合免疫球蛋白的蛋白质以及免疫球蛋白结合性亲和 配体
本申请是申请日为2011年3月24日、申请号为201180015330.2的中国发明申请“特异性结合免疫球蛋白的蛋白质以及免疫球蛋白结合性亲和配体”的分案申请。
技术领域
本发明涉及与抗体特异性结合的蛋白质，以及以该蛋白质作为免疫球蛋白结合性亲和配体的亲和分离基质，以及使用所述基质对抗体进行分离纯化或吸附去除的方法。
背景技术
抗体具有与被称为抗原的物质进行特异性结合的功能，以及协同其他的生物分子或细胞，将具有抗原的因子脱毒、去除的功能。所谓“抗体”这个名称，是强调这种与抗原结合的功能的名称，这类物质也被称为“免疫球蛋白(Ig)”。
近年来，伴随着基因工程、蛋白质工程和细胞工程的发展，被称为抗体药物的利用抗体所具有的功能的药物开发盛行。由于与传统药物相比，抗体药物更加特异性地作用于靶分子，因此预期其可以使副作用减轻并且获得高疗效，实际上有助于改善各种疾病。
另一方面，因为抗体药物是向生物体内大量施用的，因此与其他的重组蛋白质药品相比的情况下，抗体药物的纯度对品质产生更大的影响。由此，为了制造高纯度的抗体，亲和层析等方法被普遍使用，亲和层析利用特异性结合抗体的分子作为配体的吸附材料。
作为抗体药物得到开发的基本上是单克隆抗体，使用重组的细胞培养技术等进行大量生产。“单克隆抗体”是指从来源于单一抗体生产细胞的克隆所获得的抗体。现在上市的抗体药物，基本上在分子结构上都是免疫球蛋白G(IgG)亚类。作为与IgG抗体具有亲和性的免疫球蛋白结合蛋白质，普遍已知的是蛋白质A。蛋白质A是由革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产的细胞壁蛋白质的1种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合结构域(E结构域、D结构域、A结构域、B结构域、C结构域)以及细胞壁结合结构域即XM结构域构成(非专利文献1)。在抗体药物制造步骤的早期纯化步骤(捕获步骤)中，将蛋白质A作为配体固定在水不溶性担载体上的亲和层析用柱(下文称为蛋白质A柱)被普遍使用(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。
为了改善蛋白质A柱的性能，进行了种种技术开发。从配体方面出发的技术研发也在进行中。最初使用野生型蛋白质A作为配体，但以加入蛋白质工程修饰的重组蛋白质A作为配体而对于柱子性能进行改善的技术也日益增多。
作为典型的重组蛋白质A，可列举没有免疫球蛋白结合活性的、去除了XM区域的重组蛋白质A(rProtein A Sepharose(注册商标)，GE healthcare Japan公司生产)。以去除了XM区域的重组蛋白质A作为配体的柱子，具有抑制传统制品中的蛋白质的非特异性吸附的优点，现在在产业上普遍使用。
此外，还有以向蛋白质A中导入1个Cys突变的重组蛋白质A(专利文献1)，或者导入多个Lys突变的重组蛋白质A(专利文献2)作为配体使用的发明。这些技术表现出固定在水不溶性担载体上的效果，具有降低抗体与柱子的结合容量和减少固定化配体泄露的优点。
作为进行了修饰的重组蛋白质A，普遍已知利用在B结构域中导入突变的修饰结构域(被称为Z结构域)作为配体的技术(非专利文献1、非专利文献4、专利文献3)。Z结构域相对于B结构域，是导入了将第29位的Gly取代为Ala的突变的修饰结构域。并且，在Z结构域中，可以同时导入Val取代B结构域的第1位的Ala的取代突变，这是以方便基因工程制造复数个结构域连接而成的编码基因为目的的突变，对结构域的功能几乎没有影响(例如，在专利文献4中，实施例使用了Ala取代了Z结构域的第1位的Val的变体)。
已知Z结构域比B结构域的耐碱性更高，具有使用杀菌、洗涤效果好的碱溶液洗涤后可对柱子重复利用的优点。以Z结构域为基础，发明了用其他氨基酸取代Asn，产生更高的耐碱性的配体(专利文献5、专利文献6)，也开始用于产业。
由此可见，对于蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域(E、D、A、B和C结构域)，导入将第29位的Gly取代为Ala的突变的有效性是普遍已知的。实际上，自1987年公开该“G29A”的突变以来，在后研发的涉及修饰蛋白质A的现有技术中，也导入了该“G29A”的突变(专利文献2、专利文献4、专利文献6)。
作为Z结构域的另一个特征，可列举与免疫球蛋白的Fab区域结合力变弱(非专利文献5)。由于该特征，在用酸来解离结合的抗体的步骤中，具有易于解离抗体的优点(非专利文献1、专利文献7)。抗体易于解离，是可以用更少体积的洗脱液回收含有更高浓度抗体的洗脱液。近年来，在抗体药物制造中，每一批次的细胞培养液量超过10,000升，近几年抗体表达水平提高到了10g/L(非专利文献6)。下游的纯化步骤必须达到与该处理规模扩大对应，对以少量洗脱液回收含有更高浓度抗体的洗脱液的技术改进具有极大期望。
除Z结构域以外，作为修饰蛋白质A·配体，以蛋白质A的C结构域为基础的研究不断深入(专利文献4)。这类配体的特征是产生了野生型C结构域本来具有的高耐碱性，代替基于B结构域制造而成的Z结构域，作为新的基础结构域受到关注。但是，对于C结构域的检验结果证实，在使用酸将与C结构域结合的抗体进行解离的步骤中，存在抗体难以解离的缺点。在非专利文献2和专利文献4中，C结构域表现出与免疫球蛋白的Fab区域的强结合力，推测该特征是难以用酸解离抗体的原因。为了改善这一缺点，使用导入了第29位的Gly被Ala取代的突变的C结构域，在检验抗体酸解离特性时，相比野生型C结构域，可见抗体有变得易于解离的倾向，但仍不充分。
由此可见，现在公知的使抗体变得易于从蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域上解离的突变只有“G29A”。如前所述，“G29A”除了易于解离抗体这一点以外还有优点，预期通过第29位以外的突变技术来改善。但是，尚未报道除第29位以外的突变，能够使抗体更易于解离。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第6399750号公报
专利文献2：日本特开2007-252368号公报
专利文献3：美国专利第5143844号公报
专利文献4：日本特开2006-304633号公报
专利文献5：欧州专利第1123389号公报
专利文献6：国际公开第03/080655号公报
专利文献7：美国公开第2006/0194950号公报
非专利文献
非专利文献1：Hober S.等人，“J.Chromatogr.B”2007年，第848卷，第40～47页
非专利文献2：Low D.等人，“L.Chromatogr.B”2007年，第848卷，第48～63页
非专利文献3：Roque A.C.A.等人“J.Chromatogr.A”2007年，第1160卷，第44～55页
非专利文献4：Nilsson B.等人“Protein Engineering”1987年，第1卷，第107～113页
非专利文献5：Jansson B.等人“FEMS Immunology and MedicalMedicalMicrobiology”1998年，第20卷，第69～78页
非专利文献6：稻川淳一等人“分离技术(分離技術)”2008年，第38卷，第201～207页
发明内容
发明要解决的问题
本发明要解决的问题是：通过向第29位以外的氨基酸导入突变，产生了具有比现有的修饰型蛋白质A配体具有更好的抗体酸解离特性的新型修饰蛋白质A配体。
解决问题的方法
本发明人对在第29位以外的位置具有氨基酸取代突变的大量重组蛋白质A变体进行了分子设计，使用蛋白质工程的方法和基因工程的方法，通过转化细胞获得了所述突变体，通过比较检验所述突变体的活性，完成了本发明。
换言之，本发明涉及对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中：
该蛋白质是具有下述氨基酸序列：在来源于选自序列号1～5所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的至少一个结构域的氨基酸序列中，将至少1个氨基酸取代突变导入至A、B和C结构域的第31～37位的氨基酸残基、E结构域的第29～35位的氨基酸残基、或D结构域的第34～40位的氨基酸残基中而得到的氨基酸序列，并且，与导入突变前的蛋白质相比，该蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低。
优选导入突变前的来源于结构域的氨基酸序列是：
序列号1～5所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列，或
序列号6～10所记载的来源于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列。
优选导入突变前的来源于结构域的氨基酸序列是：
序列号5所记载的蛋白质A的C结构域的氨基酸序列，
或序列号10所记载的来源于蛋白质A的C结构域的氨基酸序列。
优选在导入突变前的氨基酸残基中，
各结构域中的对应于C结构域的第33位的氨基酸残基是Ser，
各结构域中的对应于C结构域的第35位的氨基酸残基是Lys，
各结构域中的对应于C结构域的第36位的氨基酸残基是Asp，或
各结构域中的对应于C结构域的第37位的氨基酸残基是Asp。
优选所导入的氨基酸取代突变是：
将对应于C结构域的第33位的Ser取代为Glu、Leu或Thr的突变，
将对应于C结构域的第35位的Lys取代为Arg的突变，
将对应于C结构域的第36位的Asp取代为Arg或Ile的突变，或
将对应于C结构域的第37位的Asp取代为Glu的突变。
优选所导入的氨基酸取代突变是将对应于C结构域的第33位的Ser取代为Glu的突变。
此外，本发明涉及将2个以上的上述蛋白质相互连接而得到的由多个结构域所构成的蛋白质。
优选相互连接的蛋白质是不同种类的蛋白质，相互连接的蛋白质的个数为2～5个。
此外，本发明涉及编码前述蛋白质的DNA。
优选在上述DNA中，构成相互连接的结构域的碱基序列的序列同一性在90％以下。
此外，本发明涉及包含上述DNA的载体。
此外，本发明涉及用上述载体对宿主进行转化而得到的转化体。
在上述转化体中，宿主优选是革兰氏阳性菌。
优选革兰氏阳性菌是短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌，优选短芽孢杆菌属细菌是桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)。
此外，本发明涉及采用上述转化体，或者采用使用了上述DNA的无细胞蛋白质合成体系制造制造上述蛋白质的方法。
在上述制造方法中，优选将蛋白质积蓄在转化体的细胞内和/或周质区域中，和/或将蛋白质分泌到转化体的细胞外。
此外，本发明涉及亲和分离基质，其是以上述蛋白质作为亲和配体固定于由水不溶性基体材料构成的担载体而得到。
优选水不溶性基体材料包括合成高分子或多糖类，优选多糖类是纤维素。
上述亲和分离基质，优选与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合，更优选与免疫球蛋白G或免疫球蛋白G的衍生物结合。
此外，本发明涉及上述亲和分离基质的用途，其用于分离含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质。分离含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质，优选其目的在于分离回收只含有免疫球蛋白的Fab区域的蛋白质。
发明的效果
本发明的蛋白质表现出优异的抗体酸解离特性。通过使用将所述蛋白质固定在载体上的亲和分离基质，可以改善抗体的分离纯化。本发明的蛋白质由于在所有结构域中都保守的氨基酸位置上导入了突变，因此不论在使用E、D、A、B和C结构域中的任何结构域的情况下，本发明的蛋白质以及亲和分离基质都具有上述共同的效果。
附图说明
图1是葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的序列比对表。
图2是本发明的实施例10和比较例3中涉及的Biacore测定中的，与各种GST融合C结构域突变体的单克隆IgG-Fab(VH3型)的结合传感图。
图3是本发明的实施例12中涉及的，关于相对于亲和分离基质(4)抗体的5％dBC的图。
图4是本发明的实施例13和比较例1中涉及的，显示了使用亲和分离基质(1)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。
图5是本发明的实施例13和比较例2中涉及的，显示了使用亲和分离基质(2)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。
图6是本发明的实施例13和比较例1中涉及的，显示了使用亲和分离基质(3)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。
图7是本发明的实施例13涉及的，显示了使用亲和分离基质(4)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的图。
具体实施方式
本发明的蛋白质，是对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其中，该蛋白质是具有如下氨基酸序列的蛋白质，并且，与具有导入突变前的氨基酸序列的蛋白质相比，该蛋白质与免疫球蛋白的Fab区域的亲和性降低；所述氨基酸序列是在来源于选自序列号1～5所记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的至少一个结构域的氨基酸序列中，
将至少1个氨基酸取代突变导入至A、B和C结构域的第31～37位的氨基酸残基、E结构域的第29～35位的氨基酸残基、或D结构域的第34～40位的氨基酸残基中而得到的氨基酸序列。
蛋白质A是由5个免疫球蛋白结合结构域，即免疫球蛋白结合蛋白质相互连接而构成的蛋白质。蛋白质A的E、D、A、B或C结构域是能够与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)之外的区域结合的免疫球蛋白结合结构域，任一个结构域都具有分别与免疫球蛋白的各个区域结合的活性，所述各个区域是免疫球蛋白的Fc区域、Fab区域以及Fab中特别是Fv区域。此外，本发明中对蛋白质A的来源也没有特殊的限定，优选是来自葡萄球菌属(Staphylococcus)的蛋白质A。
被称为“蛋白质”的术语包含了具有多肽结构的所有分子，片段化的或者通过肽键连接的多肽链也都包含在被称为“蛋白质”的术语中。此外，所谓“结构域”是蛋白质的高级结构单位，由数十至数百个氨基酸残基序列构成，足以显现出某种物理化学或生物化学上的功能的蛋白质单位。
来源于结构域的氨基酸序列是指导入突变前的氨基酸序列，不仅限于蛋白质A的E、D、A、B及C结构域中任何的野生型氨基酸序列，即使有通过氨基酸的取代、插入、缺失或化学修饰而部分被改变的氨基酸序列，只要其是具有与Fc区域的结合力的蛋白质，就包含在所述来源于结构域的氨基酸序列中。来源于结构域的氨基酸序列，例如可列举构成序列号1～5中记载的葡萄球菌属蛋白质A的E、D、A、B或C结构域的氨基酸序列，以及构成序列号6～10记载的蛋白质A的E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列。此外，由序列号6～10记载的氨基酸序列构成的蛋白质是如下蛋白质：该蛋白质是由相对于蛋白质A的E、D、A、B和C结构域(序列号1～5)、向对应于C结构域的第29位导入了将Gly取代为Ala的突变的氨基酸序列构成的蛋白质。此外，由于在B结构域中导入了被称为A1V和G29A的突变的Z结构域也具有与Fc区域的结合力，因此也是来源于结构域的氨基酸序列。优选例如导入突变前的氨基酸序列是化学稳定性高的结构域或其突变体。
导入氨基酸取代突变的蛋白质是与蛋白质A的E、D、A、B及C结构域中的任一个的野生型氨基酸具有优选85％以上，更优选90％以上的氨基酸序列同一性，并具有与Fc区域的结合力的蛋白质。
在所有结构域中都保守的氨基酸残基是指在比较E、D、A、B和C结构域的氨基酸序列时，存在于相同位置上的相同的氨基酸残基。如图1的序列比对表所示，A、B和C结构域的第26～39位，E结构域的第24～37位，D结构域的第29～42位的氨基酸残基是在所有结构域中都是保守的。在所有结构域中保守的具体氨基酸残基是指，例如可列举A、B和C结构域的第31～37位的氨基酸，E结构域的第29～35位的氨基酸，以及D结构域的第34～40位的氨基酸。优选是对于于C结构域的第33位的Ser，对应于C结构域的第35位的Lys，对应于C结构域的第36位的Asp，和对应于C结构域的第37位的Asp。特别优选对应于C结构域的第33位的Ser，但不限于此。此外，“对应”是指如图1所示，将蛋白质A的E、D、A、B和C结构域比对时，位于纵列上相同的位置上。
一般而言，氨基酸序列高度保守的区域大部分是对蛋白质功能重要的区域，一旦在这样的区域中导入突变，在很多情况下蛋白质的功能会丧失。但是，尽管上述区域中的氨基酸序列是高度保守的，但导入突变对与免疫球蛋白Fc区域的结合力没有太多影响，同时可以极大的降低与免疫球蛋白Fab区域的结合力。
此外，公知的事实是，在导入突变前的氨基酸序列是化学稳定性高的结构域或其突变体的情况下，由于构成结构域的氨基酸是较少的60个氨基酸左右，一旦导入新的突变，很多时候会降低化学稳定性。例如，对应于C结构域的第30位的Phe被Ala取代的突变体对碱的化学稳定性大幅降低(Linhult M等人，PROTEINS:Structure,Function,andBioinformatics,2004年，第55卷，第407～416页)。但是，本发明中的氨基酸突变可以在保持原有的化学稳定性的基础上，发挥出上述效果。
氨基酸的取代突变是指消除原来的氨基酸，并在相同的位置补充其他的不同种类的氨基酸的突变。所补充的其他氨基酸不受特别的限制，例如可列举天然的构成蛋白质的氨基酸、不构成蛋白质的氨基酸、非天然氨基酸。其中，从基因工程生产的观点看，可以良好地适用天然氨基酸。天然氨基酸可列举例如Ala、Phe、Val、Trp、Leu、Pro、Ile、Met、Gly、Asn、Ser、Gln、Thr、Tyr、Cys、Lys、His、Asp、Glu和Arg，特别优选是Glu或Arg。氨基酸取代突变的个数没有特殊的限定，只要包含突变的蛋白质对免疫球蛋白Fab区域的亲和力降低，但保持与免疫球蛋白整体的亲和力即可，基于保持突变导入前的蛋白质立体构造的观点来看，优选4个以下，更优选2个以下。
此外，对于氨基酸取代突变的表述，取代位置的编号之前记载了野生型或非突变型的氨基酸，而在取代位置的编号之后，记载了突变的氨基酸。例如，将29位的Gly取代为Ala的突变记载为G29A。
在将氨基酸取代突变导入到在上述所有结构域都保守的氨基酸部位中的情况下，作为导入实例可列举例如与C结构域的第33位相对应的Ser被Glu、Leu或Thr取代突变，对应于C结构域的第35位的Lys被Arg取代的突变，对应于C结构域的第36位的Asp被Arg或Ile取代的突变，和对应于C结构域的第37位的Asp被Glu取代的突变。特别优选的是对应于C结构域的第33位的Ser被Glu取代的突变，但不限于此。
导入氨基酸取代突变所获得的蛋白质，是与蛋白质A的E、D、A、B和C结构域中的任一个的野生型氨基酸具有优选85％以上，更优选90％以上的序列同一性，并具有与Fc区域的结合力的蛋白质。
本发明的蛋白质可以是只由导入了氨基酸取代突变的单个结构域构成的蛋白质，也可以是由2个以上的上述蛋白质连接而成的由多个结构域构成的蛋白质。
在由多个结构域构成的蛋白质的情况下，所连接的蛋白质可以是来源于同一种结构域的蛋白质(同源二聚体、同源三聚体等同源多聚体)，也可以是来源于种类不同的结构域的蛋白质(异源二聚体、异源三聚体等异源多聚体)。连接的蛋白质数量优选是2个以上，进一步优选是2～10个，更优选是2～5个。
在由多个结构域构成的蛋白质中，使单体蛋白质之间、单个结构域之间连接的方法，可列举不通过作为接头的氨基酸残基连接的方法，或者以一个或多个氨基酸残基连接的方法，但不限于此。对连接的氨基酸残基个数没有特别的限制。对连接模式和连接个数没有特别的限制，只要没有使单体蛋白质的三维立体结构不稳定即可。
此外，上述蛋白质或者由上述多个结构域构成的蛋白质作为1个组成成分，与功能不同的其他蛋白质融合而成的融合蛋白，也包含在本发明的蛋白质中。作为融合蛋白的实例，可列举与卵清蛋白、GST(谷胱甘肽S转移酶)或MBP(麦芽糖结合蛋白)融合的蛋白质，但不限于此。通过作为与GST、MBP的融合蛋白表达，可以方便的纯化蛋白质。此外，融合DNA适体等核酸、抗生物素等药物、PEG(聚乙二醇)等大分子的情况，只要实现与本发明相同的效果，就包含在本发明的蛋白质中。
本发明还涉及编码上述蛋白质的DNA。只要由所述DNA构成的碱基序列翻译的氨基酸序列构成本发明的蛋白质即可。此类碱基序列可利用普遍使用的公知方法获得，例如聚合酶链式反应(下文简称为PCR)法。此外，还可以由公知的化学合成法合成，或者由DNA文库获得。所述碱基序列的密码子可进行简并密码子替换，只要在翻译时编码相同的氨基酸即可，而不必需与原来的碱基序列相同。
本发明的DNA，相对于编码野生型或突变型蛋白质A的结构域的以往已知的DNA，是通过导入位点特异性突变而获得的。位点特异性的突变导入可以如下所述使用重组DNA技术、PCR方法等进行。
通过重组DNA技术导入突变，例如可以进行盒式突变法，既在编码本发明的蛋白质的基因中，在希望导入突变的目的位点两侧存在合适的限制性酶识别序列的情况下，用上述限制性酶切开这些限制性酶识别序列部分，去除包含希望导入突变的位置的区域后，插入通过化学合成等仅在目的位置导入了突变的DNA片段。
此外，通过PCR导入位置特异性突变可如下进行，例如通过以编码蛋白质的双链质粒为模板，使用与+或-链互补的、含有突变的2种合成寡核苷酸引物进行PCR的双引物法。
此外，将编码本发明的单体蛋白质(1个结构域)的DNA按期望数量串联连接，来制造编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA。例如，编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA的连接方法可以是在DNA序列中导入合适的限制性酶切位点，用DNA连接酶将限制性酶片段化了的双链DNA连接而成。限制性酶切位点可以是一种，也可以导入多种不同种类的限制性酶切位点。或者，可以在编码蛋白质A的DNA(例如，国际公开第WO06/004067号公报)中应用上述突变导入法来制造编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA。在本文中，在编码由多个结构域构成的蛋白质的DNA中，在编码各个单体蛋白质的碱基序列相同的情况下，由于存在引起宿主的同源重组的可能性，因此编码连接而成的单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同一性优选90％以下，更优选85％以下。
本发明的载体包含编码上述蛋白质或由多个结构域构成的蛋白质的碱基序列，以及与所述碱基序列可操作连接的、可在宿主中发挥功能的启动子。一般而言，编码上述蛋白质的DNA可以通过与载体连接或插入而获得。
用于插入基因的载体只要是可以在宿主中自主复制的即可，没有特别的限定，质粒DNA或噬菌体DNA都可作为载体使用。就用于插入基因的载体而言，例如，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可列举pQE系列载体(QIAGEN公司生产)、pET系列载体(Merck公司生产)和pGEX系列载体(GE HealthCare Japan公司生产)等载体。在使用短芽孢杆菌属细菌作为宿主的情况下，可以使用例如作为枯草芽孢杆菌载体而公知的pUB110或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)，或者，大肠杆菌和短芽孢杆菌属细菌的穿梭载体即pNCMO2(日本特开2002-238569号公报)等。
可以通过用载体转化宿主，获得转化体。对于宿主，并没有特别的限制，在可廉价的大量生产的基础上，优选可恰当的使用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)等细菌(真细菌)。更优选的可以是枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒杆菌属(Corynebacterium)等革兰氏阳性菌。进一步优选的可以是公知的大量生产蛋白质A的适用例(国际公开第WO06/004067号公报)的短芽孢杆菌属细菌。
短芽孢杆菌属细菌虽无限定，但可示例土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)、波茨坦短芽孢杆菌(B.borstelensis)、短短芽孢杆菌(B.brevis)、中孢短芽孢杆菌(B.centrosporus)、桥石短芽孢杆菌(B.choshinensis)、美丽短芽孢杆菌(B.formosus)、污染短芽孢杆菌(B.Invocatus)、侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporus)、B.limnophilus、类短短芽孢杆菌(B.parabrevis)、罗伊氏短芽孢杆菌(B.reuszeri)、嗜热红短芽孢杆菌(B.thermoruber)。优选的可示例短短芽孢杆菌47株(JCM6285)、短短芽孢杆菌47K株(FERMBP-2308)、短短芽孢杆菌47-5Q株(JCM8970)、桥石短芽孢杆菌HPD31株(FERM BP-1087)或桥石短芽孢杆菌HPD31-OK株(FERM BP-4573)。以提高产量为目的，可以使用上述短芽孢杆菌属细菌的蛋白酶缺陷株、高表达株或芽孢形成能力缺失株等突变株(或诱导株)。具体可列举来源于桥石短芽孢杆菌HPD31的蛋白酶突变株即桥石短芽孢杆菌HPD31-OK(日本特开平6-296485号公报)，或没有芽孢形成能力的桥石短芽孢杆菌HPD31-SP3(国际公开第WO05/045005号公报)。
向宿主细胞导入载体的方法可列举例如使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质体法、醋酸锂法、农杆菌感染法、基因枪法，或聚乙二醇法等，但不限于此。此外，在宿主中表达所获得的基因的功能的方法，可列举在染色体中重组本发明获得的基因的方法等。
可通过上述转化体或使用了DNA的无细胞蛋白质合成系统来制造蛋白质。
在使用转化体制造蛋白质的情况下，可以通过在培养基中培养转化细胞，使本发明的蛋白质生产积蓄在培养菌体内(包含菌体的细胞周质区域内)或培养液中(细胞外)来制造，并从所述培养物中收集所需的蛋白质。
在使用转化细胞制造蛋白质的情况下，蛋白质可以积蓄在转化体的细胞内和/或细胞周质区域内。在此情况下，如果积蓄在细胞内，则具有可以防止表达的蛋白质发生氧化，也不与培养基组分发生副反应的优点，积蓄在周质区域内时，优点是可以抑制细胞内蛋白酶引起的分解。另一方面，在制造蛋白质的情况下，蛋白质可以分泌到转化体的细胞外。在此情况下，就不需要菌体破碎、提取工艺，优点是降低了生产成本。
在培养基中培养本发明的转化细胞的方法，通过用于宿主培养的常用方法进行。用于培养所获得的转化体的培养基并无特殊限制，只要能够高效、高产量的生产所述蛋白质即可。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、聚胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等作为碳源或氮源。此外，必要时相应添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。在使用营养缺陷型的宿主细胞的情况下，可添加生长繁殖必需的营养物。此外，必要时也可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。
进一步的，为了抑制位于菌体内外的来源于宿主的蛋白酶导致该目标蛋白质的分解和小分子化，可以添加适当浓度的各种公知的蛋白酶抑制剂，即，苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、抗蛋白酶(AntiPain)、糜蛋白酶抑素、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素A、膦酰二肽(Phosphoramidon)、抑肽酶(aprotinin)、乙二胺四乙酸(EDTA)，和/或其他市售的蛋白酶抑制剂。
进一步的，为了正确的折叠本发明的蛋白质，可以利用例如GroEL/ES、Hsp70/DnaK、Hsp90、Hsp104/ClpB等分子伴侣。在此情况下，分子伴侣可以通过例如共表达或融合蛋白化等方法与本发明的蛋白质共存。在以蛋白质的正确折叠为目的的情况下，虽然也存在向培养基中添加促进正确折叠的添加剂，或者在低温下培养等方法，但不限于此。
培养以大肠杆菌为宿主获得的转化细胞的培养基没有特殊的限定，例如，可列举LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)或2x YT培养基(1.6％胰蛋白胨，1.0％酵母提取物，0.5％NaCl)等。
培养以短芽孢杆菌属细菌作为宿主获得的转化体的培养基没有特殊的限定，例如，可列举TM培养基(1％蛋白胨，0.5％肉提取物，0.2％酵母提取物，1％葡萄糖，pH7.0)或2SL培养基(4％蛋白胨，0.5％酵母提取物，2％葡萄糖，pH7.2)等。
此外，通过在15～42℃，优选20～37℃的培养温度下，在通气搅拌的条件下好氧培养数小时至数天，使本发明的蛋白质积蓄在培养细胞内(包含菌体的细胞周质区域内)或培养液(细胞外)中并回收。根据具体情况，也可以切断通气进行厌氧培养。
在分泌生产重组蛋白质的情况下，可以在培养结束后，通过离心分离、过滤等普通的分离方法，将培养细胞和含有分泌生产的蛋白质的上清液分离，回收所生产的重组蛋白质。
此外。在积蓄在培养细胞内(包含周质空间区域内)的情况下，可以通过例如从培养液离心分离、过滤等方法收集菌体，然后，通过超声破碎、法式压滤法等将所述菌体破碎和/或通过添加表面活性剂等使其溶解，回收细胞内积蓄生产的蛋白质。
在通过无细胞蛋白质合成体系制造本发明的蛋白质的情况下，所述无细胞蛋白质合成体系并无特殊限制，例如，可以使用原核细胞来源的、植物细胞来源的、高等动物细胞来源的合成体系等。
可以通过亲和层析、阳离子或阴离子交换层析、凝胶过滤层析等单独或恰当的组合，进行本发明的蛋白质的提纯。
确认所获得的纯化物质是否是目标蛋白质，一般可以进行的方法是例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、Western印迹等。
通过将上述方法生产的蛋白质作为亲和配体固定在由水不溶性基体材料组成的担载体上，可以制造亲和分离基质。在此，“亲和配体”是指以抗原和抗体的结合为代表，基于特异性的分子间亲和力，从某些分子的集合中选择性地捕获(结合)目标分子的物质(官能团)的术语，在本发明中，指特异性结合免疫球蛋白的蛋白质。在本说明书中，在只记载“配体”的情况下，与“亲和配体”是同义的。
在本发明中使用的由水不溶性基体材料组成的担载体可以列举玻璃珠、硅胶等无机担载体，交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子，或包括结晶纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联右旋糖酐等多糖的有机担载体，此外，由这些组合获得的有机-有机、有机-无机等复合载体等。
作为市售商品，可以列举作为多孔纤维素凝胶的GCL2000、烯丙基右旋糖酐和亚甲基双丙烯酰胺共价结合交联的Sephacryl S-1000、作为甲基丙烯酸酯类的担载体的Toyopearl、作为琼脂糖类交联担载体的Sepharose CL4B和作为纤维素类交联担载体的Cellufine等。但是，本发明中的水不溶性担载体不限于这些示例的担载体。
此外，本发明中使用的水不溶性担载体，从所述亲和分离基质的使用目的和方法来看，希望是表面积大的，优选是具有大量合适大小的细孔的多孔物质。担载体的形状可以选择任意的形状，珠状、独石状、纤维状、膜状(包括中空纤维)等都是可以的。
关于配体的固定化方法，可以是例如利用配体中存在的氨基、羧基或硫醇基，通过传统的偶联方法与担载体结合。偶联方法可列举使担载体与溴化氰、表氯醇、二环氧甘油醚、对甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼和高碘酸钠等反应而活化担载体(或者在担载体表面导入反应官能团)，与作为配体的进行固定化的化合物进行偶联反应的固定化方法，此外，可列举添加在担载体和配体这样的固定化化合物中存在的类似碳化二亚胺这类的缩合试剂，或者类似戊二醛这类的在分子中具有多个官能团的试剂，通过缩合、交联来固定化的方法。
此外，可以在配体和担载体之间导入由多个原子构成的间隔分子，也可以将配体直接固定在担载体上。然而，为了进行固定化，可以对本发明的蛋白质进行化学修饰，也可以加入对固定化有利的氨基酸残基。对固定化有利的氨基酸可列举侧链具有对固定化的化学反应有利的官能团的氨基酸，例如可列举侧链含有氨基的Lys、侧链含有硫醇基的Cys。本发明的实质是，只要将在本发明中赋予蛋白质的效果，也同样赋予给将该蛋白质作为配体而固定化的基质即可，不论为固定化而进行何种修饰、变化，也都包含在本发明的范围内。
由于亲和分离基质是通过固定本发明的蛋白质而获得的，因此基于本发明蛋白质本身的活性，可以结合包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质。由此可见，利用本发明的蛋白质和亲和分离基质，可以通过亲和柱层析纯化方法分离纯化包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质。“包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质”是指包含结合蛋白质A的Fc区域一侧部分的蛋白质。但是，只要能够结合蛋白质A即可，不必是包含完整Fc区域的蛋白质。
作为包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质，可列举免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物，但不限于此。作为包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质的具体实例，可列举属于VH3亚家族的IgG，特别是属于VH3亚家族的人IgG(单克隆抗体)。优选的，本发明的蛋白质和亲和分离基质与属于VH3亚家族的IgG的Fab区域的亲和力与导入突变前的蛋白质的亲和力相比降低，同时，优选是与亚型1、2和4的IgG的Fc区域具有亲和力的。人的VH生殖细胞基因约一半属于VH3亚家族，实际上，由属于VH3亚家族的IgG抗体构成的药物正在销售、开发中。进一步的，在抗体纯化中，虽然属于VH3亚家族的免疫球蛋白Fab片段残留了对于与作为亲和分离基质使用的配体的结合力，但却对抗体的酸解离特性产生不良影响，上述内容由于参考文献等已成为公知信息(Ghose S.等，Biotechnology and bioengineering,2005年，第92卷，第6期)。因此，本发明的蛋白质和亲和分离基质优选与属于VH3亚家族的人IgG的Fab区域的结合力降低。
上述“免疫球蛋白G衍生物”是指能够结合蛋白质A的修饰型人工蛋白质的总称，例如将人免疫球蛋白G的一部分结构域替换为其他物种的免疫球蛋白G的结构域而融合成的嵌合型免疫球蛋白G，或将人免疫球蛋白G的CDR(互补决定区)部分替换为其他物种的抗体的CDR部分而融合成的人源化免疫球蛋白，向Fc区域的糖链中增加分子修饰的免疫球蛋白G，人免疫球蛋白G的Fv区域与Fc区域融合成的人工免疫球蛋白G等。
此外，结合区域广义上定义为Fab区域(特别是Fv区域)和Fc区域，由于抗体的立体结构是已知的，因此在本发明的蛋白质以及作为亲和分离基质结合对象的蛋白质，在蛋白质工程学上保持与蛋白质A的结合区域的立体结构的基础上，也可以对Fab区域或Fc区域实施进一步修饰(片段化等)。
使用填充了本发明的亲和分离基质的亲和柱纯化包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质的方法，可以依照亲和柱层析提纯法，使用已经作为市售品存在的蛋白质A柱来实现(非专利文献3)。换言之，将包含含有免疫球蛋白Fc区域的蛋白质的缓冲液调整为中性后，使所述溶液通过填充了本发明的亲和分离基质的亲和柱，吸附含有免疫球蛋白Fc区域的蛋白质。然后，使适量的纯净缓冲液通过亲和柱，将柱内部洗净。此时，所期望的含有免疫球蛋白Fc区域的蛋白质被吸附到柱内的本发明的亲和分离基质上。然后，使调整到合适的pH的酸性缓冲液(也有含有促进从所述基质解离的物质的情况)流经柱子，通过洗提所期望的含有免疫球蛋白Fc区域的蛋白质，实现高纯度的提纯。
通过使缓冲液流经本发明的亲和分离基质对其进行清洗，本发明的亲和分离基质可以循环利用，所述缓冲液是不完全损坏配体化合物或担载体基体材料的功能的、适当的强酸性或强碱性的纯净缓冲液(也有含合适的变性剂或有机溶剂的溶液的情况)。
本发明的蛋白质以及使用了所述蛋白质的亲和分离基质产生的效果是与免疫球蛋白具有亲和力，而与免疫球蛋白的Fab区域的亲和力下降。一般而言，蛋白质A的各个结构域与Fc区域的结合比与Fab(Fv)区域的结合更强(非专利文献3)。但是，蛋白质A和各个结构域的“对免疫球蛋白的亲和力”实质上是指对Fc区域的亲和性的表述，仅与Fab区域的结合力发生变化，与免疫球蛋白的亲和性的强度也没有很大的变化。本发明的蛋白质具有蛋白质A的免疫球蛋白结合结构域，与Fab区域的次级亲和性低，产生如下效果，即可以排除与免疫球蛋白的相互作用中的次级结合的影响。另一方面，由于保持了与Fc区域的亲和性，因而保持了与免疫球蛋白整体的亲和性。当通过下文所述的Biacore系统测定与人免疫球蛋白G制品的亲和性时，本发明的蛋白质所具有的与免疫球蛋白的亲和性其亲和常数(KA)优选在106(M-1)以上，更优选在107(M-1)以上。
本发明的蛋白质和亲和分离基质与包含免疫球蛋白Fc区域的蛋白质的亲和性可以通过例如使用表面等离子体共振原理的Biacore系统(GE HealthCare Japan公司生产)等生物传感器来测定，但不限于这类测定方法。
作为测定条件，可以检测出蛋白质A与免疫球蛋白的Fc区域结合时的结合信号就行，可以在20～40℃(恒定温度)的温度，pH6～8的中性条件下测定来进行简单的评价。
结合对象的免疫球蛋白只要可以检出与Fab区域的结合即可，没有特殊的限定，但是由于一旦使用含Fc区域的免疫球蛋白分子也就检测出与Fc区域的结合，故优选使用将Fab区域片段化从而去除Fc区域所获得的免疫球蛋白分子(Fab片段、Fv片段)。进一步的，优选通过属于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段，该片端已经确认蛋白质A与Fab区域的结合。
通过在相同的测定条件下，获得与相同的免疫球蛋白分子的结合反应曲线，根据分析时所获得的结合参数，比较导入突变前的蛋白质和导入突变后的蛋白质，本领域技术人员可以方便的验证亲和性的差异。此时，比较亲和性不同的两条序列在突变位置以外的序列必须是相同的，例如，在评价突变D36R的效果的情况时，如导入突变前的蛋白质的氨基酸序列是B结构域，而导入突变后的蛋白质的氨基酸序列是C结构域中导入了突变D36R的序列，则所述比较是不恰当的。
作为结合参数可使用例如亲和指数(KA)或解离指数(KD)(永田等著“生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法”，Springer-Verlag东京，1998年，第41页)。本发明的各个结构域突变体与Fab的亲和常数可以如下获得，例如利用Biacore系统，在传感芯片中固定属于VH3亚家族的免疫球蛋白的Fab片段，在温度25℃，pH7.4的条件下向流路中添加各结构域突变体的实验体系。对于具有导入了本发明所涉及突变的序列的蛋白质而言，可以优选使用与具有导入该突变前的序列的蛋白质相比，可以恰当的使用所述蛋白质的亲和常数(KA)降低至1/2以下的蛋白质，更优选降低1/5以下，进一步优选降低至1/10以下的蛋白质。并且，在某些文献中，将亲和常数记载为结合常数，两者的定义基本上是相同的。
第29位的Gly替换为Ala的C结构域突变体对Fab的KA通常在1×104～1×105(M-1)之间，可以在本发明中优选使用导入了将第29位的Gly替换为Ala的突变和本发明涉及的突变的C结构域突变体，其是KA降低至低于1×104(M-1)的变体，更优选适用KA降低至0.5×104(M-1)以下的该突变体。并且，在上述KA测定中，可以使用通过木瓜蛋白酶解将免疫球蛋白G片段化为Fab片段和Fc片段而获得的Fab，或者可以使用通过基因工程方法获得的、只表达免疫球蛋白G的Fab区域的生产系统制造的Fab。
由于本发明的亲和分离基质具有与免疫球蛋白的Fab区域的结合力降低的性质，在用酸性溶液洗提抗体的步骤中，其解离抗体的特性是优异的。具体而言，可以通过更偏中性的酸性洗提条件进行洗提，而获得抑制酸性条件对抗体的破坏的效果。具体而言，普通的酸性洗提条件是pH2.0～3.5左右，相对于此更偏中性的酸性洗提条件是pH3.0～5.0左右的条件，此条件下的洗提对抗体的破坏小(Ghose S.等，Biotechnology andbioengineering，2005，第92卷，第6期)。优异的抗体酸解离特性，是指在更偏中性的酸性洗提条件下解离、在酸性条件下洗提抗体时的洗提峰形更加尖锐这样的特性。层析的洗提峰形变得更尖锐，则可以用更小体积的洗提液回收含有更高浓度的抗体的洗提液。
此外，通过使用本发明的亲和分离基质，可以从包括含有Fc区域的分子与只含有Fab区域的分子的混合物中，作为直接通过的级分，方便的分离回收Fab区域。
实施例
以下基于实施例，对本发明进行更详细地说明，但是本发明不限于这些实施例。
对于实施例中获得的各种蛋白质，以“表示结构域的字母-导入的突变(野生型时注为“野生型(wild)”)”的形式表述。例如，蛋白质A的野生型C结构域以“C-野生型”的形式表述，导入G29A突变的C结构域突变体以“C-G29A”的形式表述。对于同时导入2种突变的突变体的表述，用斜杠来表述。例如，导入G29A突变和S33E突变的C结构域突变体以“C-G29A/S33E”的形式表述。此外，对于由多个单结构域连接而成的蛋白质，加入“.”号，在连接数后添加“d”来组合表述。例如，由5个导入G29A突变和S33E突变的C结构域突变体连接而成的蛋白质以“C-G29A/S33E.5d”的形式表述。
[实施例1]制造编码C-G29A.5d的DNA
由5个C-G29V连接而成的蛋白质的氨基酸序列(C-G29A.5d，序列号11)进行逆翻译，设计出编码该蛋白质的碱基序列。所述蛋白质的密码子使用频率与桥石短芽孢杆菌HPD31菌株中大量表达的细胞表面蛋白HWP(Ebisu S.著，“J.Bacteriol.”1990年，第172期，1312～1320页)的密码子使用频率接近，并且，考虑到使5个结构域之间的碱基序列的序列同一性变低而分配密码子。此外，在编码5连接型结构域的序列的5’端制作PstI，和在3’端制作XbaI的限制性酶识别位点。DNA片段的制造是委托Takara BIO公司完成的。制造的DNA片段的序列记载在序列号12中。
用PstI和XbaI(均为TakaraBio公司生产)消化所制造的编码C-G29V.5d的DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化。另一方面，pNK3262是短芽孢杆菌属细菌用的质粒载体，用PstI和XbaI消化后，纯化回收再通过碱性磷酸酶(TakaraBIO公司生产)处理进行脱磷酸化处理。将两者混合后，用Ligation High(TOYOBO公司生产)连接，构建C-G29V.5d表达质粒载体pNK3262-C-G29V.5d。使用由上述操作获得的质粒载体进行桥石短芽孢杆菌FY-1菌株的转化。转化是通过已知的方法由电转法来实施的(“Biosci.Biotech.Biochem.J”，1997年，第61期，202～203页)。此外，桥石短芽孢杆菌FY-1菌株是对桥石短芽孢杆菌HPD31-OK菌株(日本特开平6-296485号公报)进行突变处理获得的Phe、Tyr缺陷性菌株。
由所制造的质粒pNK3262-C-G29V.5d来制造DNA片使其包含各结构域的Val-29的、分成5段的编码C-G29V.5d的基因。从N端开始，各结构域按顺序赋予1～5的编号。分别用PstI和NarI消化结构域1，用NarI和HindIII消化结构域2，用HindIII和MluI消化结构域3，用MluI和BglII消化结构域4，用BglII和XbaI消化结构域5(NarI由东洋纺织株式会社生产，其他酶由Takara BIO公司生产)，用琼脂糖凝胶电泳分离、纯化，获得各DNA片段。
使用与用于编码各个结构域的DNA片段所使用的相同的2种限制性酶消化2种两种克隆载体pSL301(Invitrogen公司生产)和pUC19(Takara BIO公司生产)，与上述DNA片段混合后，用Ligation High连接，构建具有切割成5份的DNA片段的质粒。在各个质粒中，与结构域所附编号对应的，各个质粒分别表述为pUC19-V29-d1、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5。序列号13～17中显示了各个C-G29V.5d编码区的DNA片段的序列(包含限制性内切酶识别部位)。
以pUC19-V29-d1、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5为模板，使用序列号18-27的寡核苷酸引物实施QuickChange法，制造含有各结构域的Val-29被Ala替换了的C-G29A的DNA片段的质粒pUC19-A29-d1、pUC19-A29-d2、、pSL301-A29-d3、pSL301-A29-d4、pSL301-A29-d5，用Ligation High依次连接5个片段，构建具有编码C-G29A.5d(序列号28)的DNA片段(序列号29)的表达质粒pNK3262-C-G29A.5d，实施FY-1重组菌的转化。QuickChange法是使用DNA聚合酶Pfu Turbo和甲基化DNA(模板DNA)切割酶DpnI(均为Stratagene公司生产)，依照Stratagene公司的规程实施的。例如，对于包含序列号13的DNA片段的质粒pUC19-V29-d1，使用序列号18和序列号19这两条合成DNA引物，实施QuickChange法，制造包含结构域1的Val-29被Ala替换的DNA片段的质粒pUC19-A29-d1。
[实施例2]制造编码C-G29A/S33E.5d、C-G29A/D36R.5d和C-G29A/K35R/D37E.5d的DNA
以实施例1制造的含有编码C-G29A的DNA片段的5种质粒，即pUC19-A29-d1、pUC19-V29-d2、pSL301-V29-d3、pSL301-V29-d4、pSL301-V29-d5为模板，使用序列号30～59的寡核苷酸引物，按实施例1相同的方式，采取利用QuickChange法的方法，制造含有C-G29A/S33E、C-G29A/D36R和C-G29A/K35R/D37E的DNA片段的质粒。
之后，用实施例1中记载的方法将各种DNA片段进行连接，分别制造包含编码C-G29A/S33E.5d(序列号60)的DNA片段(序列号61)的表达质粒pNK3262-C-G29A/S33E.5d，包含编码C-G29A/D36R.5d(序列号62)的DNA片段(序列号63)的表达质粒pNK3262-C-G29A/D36R.5d，和包含编码C-G29A/K35R/D37E.5d(序列号64)的DNA片段(序列号65)的表达质粒pNK3262-C-G29A/K35R/D37E.5d，实施FY-1重组菌的转化。此外，在连接编码C-G29A的DNA片段时利用限制性酶HindIII，由于HindIII的识别序列与突变导入位点接近，因此，在制造了将编码未导入突变的结构域2的DNA片段和编码导入了突变的结构域3的DNA片段在HindIII位点连接而成的质粒之后，在编码结构域2的区域中导入相应的突变。此外，以pNK3262-C-G29A/S33E.5d为模板质粒，使用序列号66～67的寡核苷酸引物，PCR扩增编码C-G29A/S33E.4d(序列号68)的DNA片段(序列号69)。用PstI和XbaI消化该DNA片段，插入到用相同的酶消化的载体pNK3262中，制造表达质粒pNK3262-C-G29A/S33E.4d，实施FY-1重组菌的转化。
[实施例3]DNA序列确认
使用DNA测序仪3130x1 Genetic Analyzer(Applied Biosystem公司生产)，确认实施例1～2所获得的各种表达质粒的DNA碱基序列。使用BigDye Terminator v.1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystem公司生产)，根据附带的规程，进行各个质粒DNA的测序PCR反应，纯化所述测序产物，进行序列分析。略去测序中使用的寡核苷酸引物的序列。
[实施例4]表达重组菌中目标蛋白质的表达
将实施例1～2所获得的各种桥石短芽孢杆菌FY-1重组菌，在含有60μg/mL新霉素的5mL 3YC培养基(聚胨(polypeptone)3％，酵母提取物0.2％，葡萄糖3％，硫酸镁0.01％、硫酸铁0.001％、氯化锰0.001％、氯化锌0.0001％)中，30℃下振荡培养3天。
离心处理培养物，分离菌体，从所获得的培养上清液中，利用SPFast Flow柱(GEhealthcare Japan公司生产)进行阳离子交换层析，纯化目标蛋白质(初步纯化)。具体而言，将添加醋酸钠使其终浓度为50mM，再将用盐酸调节至pH4.0的培养上清液加入到用阳离子交换缓冲液A(50mM醋酸-醋酸钠，pH4.0)平衡过的SP Fast Flow柱中，用阳离子交换缓冲液A洗净后，利用阳离子交换缓冲液A和阳离子交换缓冲液B(50mM醋酸-醋酸钠，1M NaCl，pH4.0)的盐浓度梯度，分离中途洗提出的目标蛋白质。
然后，在使用DEAE Fast Flow柱(GE healthcare Japan公司生产)的阴离子交换层析中，纯化目标蛋白质。具体而言，在超纯水中透析所分离的目标蛋白质溶液，将其添加到用阴离子交换缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡过的DEAE Fast Flow柱中，用阴离子交换缓冲液A洗净后，利用阴离子交换缓冲液A和阴离子交换缓冲液B(50mM醋酸-醋酸钠，0.3M NaCl，pH8.0)的盐浓度梯度，分离中途洗提出的目标蛋白质。再次在超纯水中透析所分离的目标蛋白质溶液，以只含有目标蛋白质的水溶液作为最终纯化的样品。
此外，上述通过使用柱子的层析进行的蛋白质的纯化，是利用AKTAprime plus系统(GE healthcare Japan公司生产)来实施的。
[实施例5]
使用Biacore 3000(GE HealthCare Japan公司生产)对实施例4中获得的各种蛋白质与免疫球蛋白的亲和性进行解析来解析所获得的蛋白质与人免疫球蛋白G(人IgG)的亲和性，Biacore 3000利用了表面等离子体共振(surface plasmon resonance)。在本实施例中，利用从人血浆中分级的人免疫球蛋白G制品(下文称为人IgG)。将人IgG固定在传感芯片上，使各种蛋白质流至芯片上，检测两者的相互作用。用氨基偶联法将人IgG固定在传感芯片CM5上，所述氨基偶联法使用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺氯化物(EDC)进行，使用乙醇胺进行封闭(传感芯片和固定化试剂都是GEHealthCare Japan公司生产的)。将Gammagard(Baxter公司生产)按1.0mg/ml溶解在标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mM NaCl，pH7.4)中，调制人IgG溶液。用固定化用缓冲液(10mM醋酸-醋酸钠，pH4.5)将人IgG溶液稀释100倍，依照Biacore 3000附带的规程，将人IgG固定在传感芯片上。此外，对于芯片上其他的流动池，在用EDC/NHS活化后，进行乙醇胺固定的处理，准备好作为阴性对照的参照池。使用上样缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mM NaCl，0.005％P-20，pH7.4)，在10～1000nM的范围内恰当配制(将各种蛋白质分别配制3种不同的蛋白质浓度的溶液)各种蛋白质，将各种蛋白质溶液以20μl/min的流速利用30秒添加至传感芯片中。测定温度为25℃，依次观测添加时(结合相，30秒)和添加结束后(解离相，60秒)的结合反应曲线。在各种观测结束后，添加50mM NaOH(15秒)，使传感芯片再生(目的是去除传感芯片上残留的添加蛋白质，确认固定化的人IgG的结合活性几乎完全恢复)。针对所获得的结合反应曲线(减去参照池的结合反应曲线的结合反应曲线)，使用系统附带的BIA evaluation软件，通过1:1结合模型进行适合度解析，计算出结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)、亲和常数(KA＝kon/koff)和解离常数(KD＝koff/kon)。
根据表1所示，各种蛋白质与人IgG的结合参数和C-G29A.5d(比较例1)是相同程度的。具体而言，对于任一种蛋白质，与人IgG的亲和常数(KA)落入5.0×107M-1～5.0×108M-1的范围。
表1
Figure GDA0002803498940000231
[实施例6]制造来源于人源化单克隆抗体的Fab片段
对于本发明中的“与Fab区域的亲和性”，使用不含免疫球蛋白的Fc区域的Fab片段进行研究。
以人源化单克隆IgG制品为原料，通过木瓜蛋白酶片段化为Fab片段和Fc片段，仅分离纯化制造Fab片段。
将人源化单克隆IgG制品赫赛汀(Herceptin，中外制药公司生产)溶解在木瓜蛋白酶消化缓冲液(0.1M AcOH-AcONa，2mM EDTA，1mM半胱氨酸，pH 5.5)中，加入来自papayalatex的Papain Agarose即固定了木瓜蛋白酶的琼脂糖(Sigma公司生产)，一边用旋转器(rotator)混合，一边在37℃温育约8小时。从固定了木瓜蛋白酶的琼脂糖分离的反应溶液(Fab片段和Fc片段混合存在)中，通过使用Resource S柱(GE HealthCare Japan公司生产)的离子交换层析，分离纯化Fab片段(下文记载为单克隆IgG-Fab)。具体而言，反应溶液用离子交换缓冲液A(50mM CH3COOH-CH3COONa，pH4.5)稀释至pH4.5，将所述反应溶液添加到用离子交换缓冲液A平衡的Resource S柱中，用离子交换缓冲液A洗涤后，使用离子交换缓冲液A和离子交换缓冲液B(50mM CH3COOH-CH3COONa，1M NaCl，pH4.5)的盐浓度梯度(在用10倍柱体积的缓冲液流过柱的时侯，将缓冲液B的浓度从0％直线升高至50％)，在中途分离提取洗脱的单克隆IgG-Fab。
用Superdex 75 10/300GL柱(在平衡和分离中使用标准缓冲液)凝胶过滤层析来纯化分离提取的单克隆IgG-Fab溶液，获得单克隆IgG-Fab溶液。
此外，与实施例4相同，通过使用AKTAprime plus系统的层析来进行蛋白质的纯化。
[实施例7]解析所获得的各种蛋白质与单克隆IgG-Fab的亲和性
对于解析实施例4所获得的各种蛋白质与IgG-Fab的亲和性，按实施例5相同的方式，也使用Biacore 3000来实施。
将实施例6中获得的单克隆IgG-Fab固定在传感芯片CM5上，检测实施例4所获得的各种蛋白质在芯片上流动时的相互作用。参照池是固定化的人血清白蛋白(Sigma-Aldrich公司生产)。单克隆IgG-Fab和人血清白蛋白的固定方法与实施例5相同。
使用上样缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mM NaCl，0.005％P-20，pH7.4)，将测定的各种蛋白质分别配制成4μM、8μM、16μM、32μM的不同蛋白质浓度的溶液(某些情况下未配制32μM)，将各种蛋白质溶液以20μL/min的流速利用30秒添加至传感芯片中。在25℃的测定温度下，依次观测添加时(结合相，30秒)和添加结束后(解离相，60秒)的结合反应曲线。在各种观测结束后，添加10mM NaOH(30秒)，使传感芯片再生。解析方法与实施例6相同。但是，作为解析时的结合参数的1种，将Rmax作为常数进行拟合。Rmax值是所有的固定化的分子都与添加的分子结合时的信号量，在固定了相同分子(单克隆IgG-Fab)的本实验系统中，该值不可能有大的变化。然而，在结合信号非常微弱的情况下，为了避免Rmax值成为极小值而导致错误的拟合，将Rmax值作为常数进行拟合。如表2所示，各种蛋白质与单克隆IgG-Fab的结合参数与C-G29A.5d(比较例1)相比显著降低。具体而言，对于任一种蛋白质而言，与单克隆IgG-Fab的亲和常数(KA)，与C-G29A.5d相比，显示出低于其1/10的数值。
表2
Figure GDA0002803498940000241
[实施例8]制造表达单个结构域的各种变体的转化细胞
除实施例7中评价的突变以外，出于有效的评价本发明发现的其他突变的目的，在单个结构域水平上制造各种变体。
作为导入突变的蛋白质序列，选择来源于蛋白质A的C结构域的氨基酸序列(序列号10，C-G29A.1d)。以包含序列号70所示的编码C-G29A.1d的DNA序列的GST融合蛋白表达载体pGEX-6P-1(GE HealthCare Japan公司生产)作为导入突变的模板质粒。模板质粒的制造方法已记载在公开的专利文献(国际公开第2010/110288号公报)中。
以上述2种质粒作为模板，使用序列号71～80的寡核苷酸引物，利用QuickChange法，获得编码序列号81～85所示各种C结构域突变体(C-G29A/S33L.1d、C-G29A/S33T.1d、C-G29A/D36I.1d、C-G29A/D36R.1d、C-G29A/D37E.1d)的各种表达质粒。例如，以包含序列号70的DNA序列的表达质粒(pGEX-6P-C-G29A.1d)为模板，使用序列号71～72的寡核苷酸引物，利用QuickChange法，获得序列号81所示的C结构域突变体(C-G29A/S33L.1d)。对于所获得的表达质粒，按实施例3相同的方法，确认DNA序列。此外，使用所获得的各种表达质粒，按实施例1相同的方法，实施对大肠杆菌HB101株(TAKARA公司生产)的转化。
[实施例9]单结构域型的各种突变体的表达、纯化
由实施例8获得的各种转化细胞以GST融合蛋白的形式表达各种突变体。将这些转化细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养过夜。将这些培养液接种在2×YT培养基(含有氨苄青霉素)中，37℃下培养约1小时。添加IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)使其终浓度为0.1mM，进一步在37℃培养18小时。培养结束后，离心收集细菌，重新悬浮于含EDTA(0.5mM)的PBS缓冲液中。超声破碎细胞，离心分离，将上清液级分(无细胞提取液)和不溶性级分分级。使用与GST具有亲和性的GSTrap FF柱(GE HealthCare Japan公司生产)的亲和层析，从包含GST融合蛋白的各种无细胞提取液中纯化GST融合蛋白(初步纯化)。将各种无细胞提取液添加到GSTrap FF柱中，用标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mMNaCl，pH7.4)洗涤柱，然后用洗提缓冲液(50mM Tris-HCl，20mM谷胱甘肽，pH8.0)洗提目标GST融合蛋白。将洗提的级分通过超滤替换为标准缓冲液的溶液，作为最终纯化的样品。
[实施例10]解析单结构域型的各种突变体与单克隆IgG-Fab的亲和性
对于解析实施例9所获得的各种单结构域型突变体，按实施例7记载的相同的方法，使用Biacore测定其与单克隆IgG-Fab的亲和性，解析导入各种突变对IgG-Fab结合力的改变。但是，只测定蛋白质浓度为4μM(在280nm下相同吸光度表示的浓度)的各种单结构域型突变体的传感图。
图2显示了所获得的IgG-Fab结合传感图。与C-G29A.1d(比较例3)相比，各种蛋白质对单克隆IgG-Fab的结合响应显著降低，减少至不能检出的程度。可以确定通过本发明获得的突变降低了Fab的结合力。此外，由于降低至不能检出结合的程度，因此不进行亲和常数的计算。
[实施例11]C-G29A/S33E.5d的耐碱性评估
关于实施例4获得的C-G29A/S33E.5d的耐碱性，在碱性条件下进行一段时间的温育处理后，比较相对于人IgG的结合量降低的程度(相对于人IgG的残留的结合活性)来进行评估。
针对C-G29A/S33E.5d，使用Biacore 3000测定在碱处理前后与人IgG的结合量。关于碱处理，在26.2μM的各种蛋白质(10μL)中加入一定量的0.625M NaOH，使最终浓度为0.5M，在30℃温育8小时。之后，在各种处理溶液中加入0.5M HCl(预先确定pH恢复中性的一定体积)进行中和，用上样缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mM NaCl，0.005％P-20，pH7.4)稀释2倍，制造成碱处理后的C-G29A/S33E.5d溶液。
碱处理前的C-G29A/S33E.5d溶液，是将碱处理时添加的NaOH溶液、以及中和处理时添加的HCl溶液预先混合得到的溶液添加到26.2μM的C-G29A/S33E.5d(10μL)中使得蛋白质浓度、溶液组成都是相同的而制造的。关于传感芯片的制造(人IgG的固定化等)、测定时的上样缓冲液、测定温度、芯片的再生处理都与实施例7相同。将碱处理之前和处理之后的C-G29A/S33E.5d溶液，以20μL/min的流速利用150秒添加至传感芯片中。依次观测添加时(结合相，150秒)和添加结束时(解离相，210秒)的结合反应曲线。
解析方法与实施例5相同，在此对所获得的结合参数的解释进行补充。此次的解析方法中，虽然碱处理前后的蛋白质浓度相同，但与人IgG具有结合活性的蛋白质浓度发生了变化。然而，由于浓度作为变量难以拟合，将处理前后的浓度作为定值进行拟合。此时，与IgG具有结合活性的蛋白质浓度的变化反映在表示最大结合容量的Rmax上，计算并比较C-G29A/S33E.5d的碱处理前的Rmax和碱处理后的Rmax的相对值(残留的IgG结合活性[％])，评估耐碱性。
对于碱处理后残留的IgG结合活性，C-G29A.5d(比较例1)是85.4％，相对的C-G29A/S33E.5d是85.5％。确认到本发明的突变可以在不损害C-G29A的优异耐碱性的基础上发挥其效果。
[实施例12]制造固定了所获得的各种蛋白质(配体)的亲和分离基质
亲和分离基质(1)：甲基丙烯酸酯类聚合物基底
作为水不溶性基体材料，使用市售的活化型亲和层析填充剂“TOYO PEARL AF-Formyl-650M”(TOSOH公司生产)。该填充剂以甲基丙烯酸酯类的聚合物为基底，导入了固定蛋白质类配体用的甲酰基。制造固定了以实施例4中获得的C-G29A/S33E.5d的最终纯化样品作为配体的亲和分离基质(1)。
具体而言，将5mL填充剂在玻璃过滤器上用柠檬酸缓冲液(0.25M二水合柠檬酸三钠，pH9.0，用NaOH调节)替换后，使离心管内总量为7.5mL。向其中加入0.64mL含有C-G29A/S33E.5d的溶液(64.6mg/mL)，用Mix Rotor(ミックスローター)(AZONE生产的Mix Rotor MR-31-336-05)在6℃振荡4小时。之后，用2.4M柠檬酸水溶液调节至pH3，在6℃继续振荡4小时。之后，加入2.8mL浓度为5.5重量％的二甲胺硼烷水溶液(和光纯药工业公司生产)，25℃下振荡18小时。将该担载体在玻璃过滤器上，使用RO水洗涤至洗涤滤液的电导率降至5μS/cm以下，制造成亲和分离基质。
亲和分离基质(2)：交联琼脂糖基底
作为水不溶性基体材料，使用1mL的市售的活化型已填充(prepack)柱(HitrapNHS activated HP)(GE healthcare公司生产)。该柱子以交联琼脂糖为基底，导入了固定蛋白质类配体用的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基。基本遵循商品手册，制造固定了以实施例4中获得的C-G29A/S33E.4d的最终纯化样品作为配体的亲和分离基质(2)。
具体而言，用偶联缓冲液(0.2M碳酸钠，0.5M NaCl，pH8.3)将最终纯化样品制造成1mL终浓度稀释为约6mg/mL的溶液。将冰浴冷却的1mM HCl，按1mL/min的流速流过2mL，重复操作3次，去除柱内的异丙醇。之后立刻以相同的流速添加之前制造的样品稀释溶液，塞住柱子上下端，在25℃静置30分钟，将获得的蛋白质固定在柱子里。之后打开塞子，以相同的流速流过3mL偶联缓冲液，回收未反应的蛋白质。之后，流过2mL封闭缓冲液(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3)，重复实施3次，流过2mL洗涤缓冲液(0.1M醋酸，0.5M NaCl，pH4.0)，重复实施3次，最后流过2mL标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mM NaCl，pH7.4)，完成亲和分离柱的制造。
亲和分离基质(3)：纤维素基底
作为水不溶性基体材料，使用市售的凝胶过滤用填充剂“Cellufine(セルロファイン)GCL-2000-m”(Chisso公司生产)。该填充剂以交联的多孔纤维素为基底。制造固定了以实施例4中获得的C-G29A/S33E.5d的最终纯化样品作为配体的亲和分离基质(3)。
具体而言，将12mL填充剂在玻璃过滤器(TOP公司生产17G-2)上用柠檬酸缓冲液(0.01M二水合柠檬酸三钠-一水合柠檬酸，pH3)替换后，使离心管内液量为18mL。向其中加入6mL由0.08g高碘酸钠(和光纯药工业公司生产)溶解在RO水中的水溶液，用Mix Rotor(AZONE生产的Mix Rotor MR-31-336-05)在6℃振荡约30分钟。在玻璃过滤器上，使用足量的RO水洗涤，获得含有甲酰基的担载体。
将5mL该含有甲酰基的担载体在玻璃过滤器上用柠檬酸缓冲液(0.25M二水合柠檬酸三钠，pH8.0，用NaOH调节)替换后，使离心管内总量为8.5mL。向其中加入0.64mL含有C-G29A/S33E.5d的溶液(64.6mg/mL)，用0.4M NaOH调节至pH12以后，用Mix Rotor在6℃振荡4小时。之后，用2.4M柠檬酸水溶液(一水合柠檬酸)调节至pH3，在6℃继续振荡4小时。之后，加入2.8mL浓度为5.5重量％的二甲胺硼烷水溶液，25℃下振荡18小时。将该担载体在玻璃过滤器上，使用RO水洗涤至洗涤滤液的电导率降至5μS/cm以下，获得亲和分离基质。
亲和分离基质(4)：纤维素基底-2
作为水不溶性基体材料，使用结晶型高度交联纤维素(Chisso公司生产，通过美国公开0062118号(日本特开2009-242770)获得的凝胶)。制造固定了以实施例4中获得的C-G29A/S33E.5d的最终纯化样品作为配体的亲和分离基质(4)。
具体而言，将12mL凝胶在玻璃过滤器上用柠檬酸缓冲液(0.01M二水合柠檬酸三钠-一水合柠檬酸，pH3)替换后，使离心管内液量为18mL。向其中加入6mL由0.08g高碘酸钠溶解在RO水中的水溶液，用Mix Rotor在6℃振荡约30分钟。
将5mL该含有甲酰基的担载体在玻璃过滤器上用柠檬酸缓冲液(0.25M二水合柠檬酸三钠，pH8.0，用NaOH调节)替换后，使离心管内总量为8.5mL。向其中加入0.96mL实施例4获得的含有C-G29A/S33E.5d的溶液(64.6mg/mL)，用0.4M NaOH调节至pH12以后，用MixRotor在6℃振荡4小时。
之后，用2.4M柠檬酸水溶液(一水合柠檬酸)调节至pH5，在6℃继续振荡4小时。之后，加入0.46mL浓度为5.5重量％的二甲胺硼烷水溶液，25℃下振荡18小时。反应后，测量反应溶液在275nm附近最大吸收的吸光度值，其结果是C-G29A/S33E.5d的导入量为11mg/mL-凝胶，配体在担载体上的固定化收率为90％。
将该载体在玻璃过滤器上，使用RO水洗涤至洗涤滤液的电导率降至5μS/cm以下，进一步用0.1M柠檬酸水溶液(一水合柠檬酸)、氢氧化钠-硫酸钠混合水溶液(0.05M NaOH，0.5M硫酸钠)、柠檬酸缓冲液(0.5M二水合柠檬酸三钠-一水合柠檬酸，pH6)依次洗涤。最终，使用RO水洗涤至洗涤滤液的电导率降至5μS/cm以下，获得亲和分离基质。
此外，对于该亲和分离基质(4)，施用国际公开号2010/064437中记载的测定，测量对抗体的吸附容量和配体泄漏量。在接触时间1.8分钟、3分钟时的5％dBC分别是33、41mg/mL，相对于洗脱的IgG，配体泄漏量是30ppm。此外，在相同条件下测量的市售高交联琼脂糖载体“MabSelect”(GE healthcare Bioscience公司生产)的5％dBC分别是28、37mg/mL。图3中图示了比较5％dBC的图。此外，对于配体泄漏量，存在研究了市售的亲和分离基质的公知文献(Hagn R.等人，J.Chromatogr.A.，2006年，1102卷，224～231页)。由此可见，已知本实施例获得的亲和分离基质(4)在对抗体药物纯化工艺中表示重要性能的参数方面达到了充分有效的水平。
[实施例13]评价各种亲和分离基质的抗体酸洗脱特性
将实施例12中制造的亲和分离基质(1)～(4)，分别填充到Empty ColumnTricornTM 5/50柱(GE healthcare公司生产)中，连接层析系统AKTA prime plus(GEhealthcare Japan公司生产)，通过抗体纯化层析评价抗体酸洗脱特性。但是，亲和分离基质(2)由于是预填充柱，可以直接连接。在所有情况下，使柱子体积为约1mL。用标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4，150mM NaCl，pH7.4)平衡上述亲和分离柱后，按2mL/min的流速，添加500μL属于VH3亚家族的人源化单克隆IgG制品赫赛汀在标准缓冲液中制造成的1mg/mL的溶液。然后，用相同的流速流过5mL标准缓冲液，然后，用相同的流速流过5mL洗提缓冲液(35mM醋酸-醋酸钠，pH3.5)，监控280nm的吸光度值，确定所获得的IgG洗脱峰的层析谱。进一步连续的，用相同的流速流过5mL标准缓冲液，然后，用相同的流速流过3mL强洗脱液(0.5M醋酸，0.1M Na2SO4，pH2.5)，监控280nm的吸光度值，确定强行分离的柱内残留IgG的峰。此外，对于亲和分离基质(2)，强洗脱液的组成是20mM醋酸钠-醋酸，1M NaCl(pH3.2)。
对于亲和分离基质(1)～(3)，使用调节至pH3.75的洗脱缓冲液，通过相同的抗体纯化层析评价抗体酸洗脱特性。
亲和分离基质(1)的抗体酸洗脱特性
在图4中显示了使用固定了C-G29A/S33E.5d和C-G29A.5d(比较例1)的各种亲和分离基质(1)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的重叠图。上图是洗脱pH3.5时，下图是洗脱pH3.75时的洗脱峰谱。如图4所示，可以确定，固定了C-G29A/S33E.5d的基质的洗脱峰谱与C-G29A.5d的情况相比明显更尖锐。通过洗脱pH3.75时的洗脱峰谱，可以确定导入突变前的C-G29A.5d所吸附的IgG难以回收，而导入突变后的C-G29A/S33E.5d上吸附的IgG可以全部回收。可认为这是一个显示出通过本发明可以显著提高在更偏中性的酸性溶液中的抗体回收率的例子。
亲和分离基质(2)的抗体酸洗脱特性
在图5中显示了使用固定了C-G29A/S33E.4d和C-G29A.4d(比较例2)的各种亲和分离基质(2)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的重叠图。与亲和分离基质(1)的情况相同，可以确定固定了C-G29A/S33E.4d的基质的洗脱峰谱与C-G29A.4d的情况相比明显更尖锐。通过这一数据，显示本发明的蛋白质不依赖于作为基体材料的水不溶性基体材料的种类、基体材料上的配体固定方法和作为配体的蛋白质的结构域个数的效果的实现。
亲和分离基质(3)的抗体酸洗脱特性
在图6中显示了使用固定了C-G29A/S33E.5d和C-G29A.5d(比较例1)的各种亲和分离基质(3)的抗体纯化层析的洗脱峰谱的重叠图。可以确定固定了C-G29A/S33E.5d的基质的洗脱峰谱与C-G29A.5d的情况相比明显更尖锐。通过这一数据，显示本发明的蛋白质通过与作为基体材料时具有优异的抗体洗脱特性(洗脱快)的基体材料组合，可以进一步发挥优异的效果。
亲和分离基质(4)的抗体酸洗脱特性
在图7中显示了使用固定了C-G29A/S33E.5d的亲和分离基质(4),的抗体纯化层析的洗脱峰谱(洗脱pH3.5)。在产业上，对表现出高抗体结合容量的基质的需求高，增加配体的固定量对提高抗体结合容量是有效的。通过这一数据，确定了本发明即使在蛋白质固定量高的情况下，也可以正常实现本发明的效果。
比较例1：制造、使用C-G29A.5d
用与实施例3～5记载的相同的方法，使用实施例1中获得的重组菌，制造C-G29A.5d(序列号28)。对于与人IgG及单克隆IgG-Fab的亲和性的解析方法，用与实施例5及实施例7记载的相同的方法，解析结果合并显示在表1～2中。
此外，对于耐碱性，用实施例11记载的方法解析评价。此外，在实施例12的亲和分离基质(1)、(3)的制造中也使用C-G29A.5d，按与实施例13相同的方法评价抗体酸洗脱特性，其结果合并显示在图4和图6中。此外，在亲和分离基质(1)、(3)的制造中，所用溶液的蛋白质浓度是58.2mg/mL，使用的量是0.79mL。
比较例2：制造、使用C-G29A.4d
用与实施例2相同的方法，使用实施例1中获得的表达质粒pNK3262-C-G29A.5d作为模板，和序列号66～67的寡核苷酸引物，获得C-G29A.4d的表达质粒及其转化细胞。用与实施例3～5记载的相同的方法，制造C-G29A.4d。此外，在实施例12的亲和分离基质(2)的制造中也使用C-G29A.4d，按与实施例13相同的方法评价抗体酸洗脱特性，其结果合并显示在图5中。
比较例3：制造C-G29A.1d
用包含实施例8所使用的模板质粒的转化细胞(HB101)，用与实施例9相同的方法，制造C-G29A.1d，用与实施例10相同的方法，解析与单克隆IgG-Fab的亲和性。解析结果合并显示在图2中。
序列表
<110> 株式会社钟化(KANEKA CORPORATION)
<120> 特异性结合免疫球蛋白的蛋白质以及免疫球蛋白结合性亲和配体
<130> B100013WO01
<140> PCT/JP2011/057156
<141> 2011-03-24
<150> JP2010-068870
<151> 2010-03-24
<160> 85
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 56
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 1
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 2
Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 3
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 3
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 4
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 5
<211> 58
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌
<400> 5
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 6
<211> 56
<212> PRT
<213> E-野生型突变体
<400> 6
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
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Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
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Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys
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<212> PRT
<213> D-野生型突变体
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Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe
1 5 10 15
Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala
20 25 30
Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu
35 40 45
Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
50 55 60
<210> 8
<211> 58
<212> PRT
<213> A-野生型突变体
<400> 8
Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
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<212> PRT
<213> B-野生型突变体
<400> 9
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
35 40 45
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<210> 10
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<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 10
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 11
<211> 290
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 11
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Val Phe Ile Gln
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Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Val Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Val Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
165 170 175
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Val Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
225 230 235 240
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Val Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Lys
290
<210> 12
<211> 881
<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 12
ctgcagataa caaatttaac aaagaacaac aaaacgcttt ctacgaaatc ctgcacttgc 60
caaaccttac tgaagaacaa cgtaatgttt tcatccaatc cctgaaagat gatccatctg 120
tatccaaaga aattttggca gaggctaaaa aacttaacga cgctcaggcg cctaaggctg 180
ataacaaatt caacaaagaa caacaaaacg ctttttatga aatccttcac ctgccaaatc 240
ttacagaaga acaacgcaac gtattcattc aaagcttgaa ggatgaccct tccgttagca 300
aagagatcct ggctgaagca aaaaagttga atgatgcgca agcaccaaaa gctgataata 360
aattcaacaa agaacaacaa aatgcattct acgaaatctt gcaccttcct aacctgactg 420
aagagcagcg taacgttttt atccagagct tgaaagacga tccatctgtc tccaaagaaa 480
ttctcgcaga agcgaagaaa ctgaacgatg ctcaagctcc gaaagcagac aacaaattca 540
ataaggaaca gcaaaacgcg ttttatgaaa ttctgcatct tccaaacttg acagaggaac 600
aacgcaatgt tttcatccaa tccctgaaag atgatccgag cgtttctaag gaaatcttgg 660
ctgaagcaaa aaaactgaac gacgctcaag ctccaaaagc ggataacaag tttaacaaag 720
aacaacaaaa tgctttctac gagatcttgc accttccgaa cctgactgaa gaacaacgta 780
acgtatttat tcagtctttg aaggatgacc catccgtaag caaagagatc ctggcagaag 840
ctaaaaaatt gaatgatgca caagctccaa aataatctag a 881
<210> 13
<211> 172
<212> DNA
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<400> 13
ctgcagataa caaatttaac aaagaacaac aaaacgcttt ctacgaaatc ctgcacttgc 60
caaaccttac tgaagaacaa cgtaatgttt tcatccaatc cctgaaagat gatccatctg 120
tatccaaaga aattttggca gaggctaaaa aacttaacga cgctcaggcg cc 172
<210> 14
<211> 111
<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 14
ggcgcctaag gctgataaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcttttt atgaaatcct 60
tcacctgcca aatcttacag aagaacaacg caacgtattc attcaaagct t 111
<210> 15
<211> 290
<212> DNA
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<400> 15
aagcttgaag gatgaccctt ccgttagcaa agagatcctg gctgaagcaa aaaagttgaa 60
tgatgcgcaa gcaccaaaag ctgataataa attcaacaaa gaacaacaaa atgcattcta 120
cgaaatcttg caccttccta acctgactga agagcagcgt aacgttttta tccagagctt 180
gaaagacgat ccatctgtct ccaaagaaat tctcgcagaa gcgaagaaac tgaacgatgc 240
tcaagctccg aaagcagaca acaaattcaa taaggaacag caaaacgcgt 290
<210> 16
<211> 192
<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 16
acgcgtttta tgaaattctg catcttccaa acttgacaga ggaacaacgc aatgttttca 60
tccaatccct gaaagatgat ccgagcgttt ctaaggaaat cttggctgaa gcaaaaaaac 120
tgaacgacgc tcaagctcca aaagcggata acaagtttaa caaagaacaa caaaatgctt 180
tctacgagat ct 192
<210> 17
<211> 140
<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 17
agatcttgca ccttccgaac ctgactgaag aacaacgtaa cgtatttatt cagtctttga 60
aggatgaccc atccgtaagc aaagagatcc tggcagaagc taaaaaattg aatgatgcac 120
aagctccaaa ataatctaga 140
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 18
acaacgtaat gctttcatcc aat 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 19
attggatgaa agcattacgt tgt 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 20
acaacgcaac gcattcattc aaa 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 21
tttgaatgaa tgcgttgcgt tgt 23
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<211> 23
<212> DNA
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<400> 22
gcagcgtaac gcttttatcc aga 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 23
tctggataaa agcgttacgc tgc 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 24
acaacgcaat gctttcatcc aat 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 25
attggatgaa agcattgcgt tgt 23
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<211> 23
<212> DNA
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acaacgtaac gcatttattc agt 23
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<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 27
actgaataaa tgcgttacgt tgt 23
<210> 28
<211> 290
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 28
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
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Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile
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Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
225 230 235 240
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Lys
290
<210> 29
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<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 29
gcagataaca aatttaacaa agaacaacaa aacgctttct acgaaatcct gcacttgcca 60
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aaggaacagc aaaacgcgtt ttatgaaatt ctgcatcttc caaacttgac agaggaacaa 600
cgcaatgctt tcatccaatc cctgaaagat gatccgagcg tttctaagga aatcttggct 660
gaagcaaaaa aactgaacga cgctcaagct ccaaaagcgg ataacaagtt taacaaagaa 720
caacaaaatg ctttctacga gatcttgcac cttccgaacc tgactgaaga acaacgtaac 780
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<212> DNA
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ctttcatcca agagctgaaa gatg 24
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<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 31
catctttcag ctcttggatg aaag 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 32
gcattcattc aagagttgaa ggatg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
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<400> 33
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<211> 24
<212> DNA
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<400> 34
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<210> 35
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<212> DNA
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<400> 35
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<210> 36
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<400> 36
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<400> 37
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<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 39
catccttcaa ctcctgaata aatgc 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 40
caatccctga aaagagatcc atctg 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 41
cagatggatc tcttttcagg gattg 25
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 42
caaagcttga agagagaccc ttc 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 43
gaagggtctc tcttcaagct ttg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 44
gagcttgaaa cgtgatccat ctg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 45
cagatggatc acgtttcaag ctc 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 46
caatccctga aaagagatcc gag 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 47
ctcggatctc ttttcaggga ttg 23
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 48
gtctttgaag agagacccat cc 22
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 49
ggatgggtct ctcttcaaag ac 22
<210> 50
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 50
catccaatcc ctgcgtgatg aaccatctgt atcc 34
<210> 51
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 51
ggatacagat ggttcatcac gcagggattg gatg 34
<210> 52
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 52
cattcaaagc ttgcgcgatg agccttccgt tagc 34
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 53
gctaacggaa ggctcatcgc gcaagctttg aatg 34
<210> 54
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 54
atccagagct tgcgtgacga accatctgtc tcc 33
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 55
ggagacagat ggttcgtcac gcaagctctg gat 33
<210> 56
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 56
catccaatcc ctgcgcgatg agccgagcgt ttc 33
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 57
gaaacgctcg gctcatcgcg cagggattgg atg 33
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 58
attcagtctt tgcgtgatga accatccgta agc 33
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 59
gcttacggat ggttcatcac gcaaagactg aat 33
<210> 60
<211> 290
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 60
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
165 170 175
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
180 185 190
Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu
195 200 205
Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
225 230 235 240
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Lys
290
<210> 61
<211> 873
<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 61
gcagataaca aatttaacaa agaacaacaa aacgctttct acgaaatcct gcacttgcca 60
aaccttactg aagaacaacg taatgctttc atccaagagc tgaaagatga tccatctgta 120
tccaaagaaa ttttggcaga ggctaaaaaa cttaacgacg ctcaggcgcc taaggctgat 180
aacaaattca acaaagaaca acaaaacgct ttttatgaaa tccttcacct gccaaatctt 240
acagaagaac aacgcaacgc attcattcaa gagttgaagg atgacccttc cgttagcaaa 300
gagatcctgg ctgaagcaaa aaagttgaat gatgcgcaag caccaaaagc tgataataaa 360
ttcaacaaag aacaacaaaa tgcattctac gaaatcttgc accttcctaa cctgactgaa 420
gagcagcgta acgcttttat ccaggaattg aaagacgatc catctgtctc caaagaaatt 480
ctcgcagaag cgaagaaact gaacgatgct caagctccga aagcagacaa caaattcaat 540
aaggaacagc aaaacgcgtt ttatgaaatt ctgcatcttc caaacttgac agaggaacaa 600
cgcaatgctt tcatccaaga gctgaaagat gatccgagcg tttctaagga aatcttggct 660
gaagcaaaaa aactgaacga cgctcaagct ccaaaagcgg ataacaagtt taacaaagaa 720
caacaaaatg ctttctacga gatcttgcac cttccgaacc tgactgaaga acaacgtaac 780
gcatttattc aggagttgaa ggatgaccca tccgtaagca aagagatcct ggcagaagct 840
aaaaaattga atgatgcaca agctccaaaa taa 873
<210> 62
<211> 290
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 62
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Arg Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
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Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
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Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
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Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu
195 200 205
Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys
210 215 220
Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu
225 230 235 240
Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu
245 250 255
Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val
260 265 270
Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala
275 280 285
Pro Lys
290
<210> 63
<211> 873
<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 63
gcagataaca aatttaacaa agaacaacaa aacgctttct acgaaatcct gcacttgcca 60
aaccttactg aagaacaacg taatgctttc atccaatccc tgaaaagaga tccatctgta 120
tccaaagaaa ttttggcaga ggctaaaaaa cttaacgacg ctcaggcgcc taaggctgat 180
aacaaattca acaaagaaca acaaaacgct ttttatgaaa tccttcacct gccaaatctt 240
acagaagaac aacgcaacgc attcattcaa agcttgaaga gagacccttc cgttagcaaa 300
gagatcctgg ctgaagcaaa aaagttgaat gatgcgcaag caccaaaagc tgataataaa 360
ttcaacaaag aacaacaaaa tgcattctac gaaatcttgc accttcctaa cctgactgaa 420
gagcagcgta acgcttttat ccagagcttg aaacgtgatc catctgtctc caaagaaatt 480
ctcgcagaag cgaagaaact gaacgatgct caagctccga aagcagacaa caaattcaat 540
aaggaacagc aaaacgcgtt ttatgaaatt ctgcatcttc caaacttgac agaggaacaa 600
cgcaatgctt tcatccaatc cctgaaaaga gatccgagcg tttctaagga aatcttggct 660
gaagcaaaaa aactgaacga cgctcaagct ccaaaagcgg ataacaagtt taacaaagaa 720
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aaaaaattga atgatgcaca agctccaaaa taa 873
<210> 64
<211> 290
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 64
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Arg Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
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Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
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Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Arg Asp Glu Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
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115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
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<400> 65
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ctcgcagaag cgaagaaact gaacgatgct caagctccga aagcagacaa caaattcaat 540
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caacaaaatg ctttctacga gatcttgcac cttccgaacc tgactgaaga acaacgtaac 780
gcatttattc agtctttgcg tgatgaacca tccgtaagca aagagatcct ggcagaagct 840
aaaaaattga atgatgcaca agctccaaaa taa 873
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 66
ggcgcctact gcagataaca aattc 25
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 67
tctagattat tttggagc 18
<210> 68
<211> 232
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 68
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1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn
50 55 60
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro
85 90 95
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
100 105 110
Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala
115 120 125
Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn
130 135 140
Ala Phe Ile Gln Glu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp
165 170 175
Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His
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Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Glu Leu
195 200 205
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<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 69
gcagataaca aattcaacaa agaacaacaa aacgcttttt atgaaatcct tcacctgcca 60
aatcttacag aagaacaacg caacgcattc attcaagagt tgaaggatga cccttccgtt 120
agcaaagaga tcctggctga agcaaaaaag ttgaatgatg cgcaagcacc aaaagctgat 180
aataaattca acaaagaaca acaaaatgca ttctacgaaa tcttgcacct tcctaacctg 240
actgaagagc agcgtaacgc ttttatccag gaattgaaag acgatccatc tgtctccaaa 300
gaaattctcg cagaagcgaa gaaactgaac gatgctcaag ctccgaaagc agacaacaaa 360
ttcaataagg aacagcaaaa cgcgttttat gaaattctgc atcttccaaa cttgacagag 420
gaacaacgca atgctttcat ccaagagctg aaagatgatc cgagcgtttc taaggaaatc 480
ttggctgaag caaaaaaact gaacgacgct caagctccaa aagcggataa caagtttaac 540
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cgtaacgcat ttattcagga gttgaaggat gacccatccg taagcaaaga gatcctggca 660
gaagctaaaa aattgaatga tgcacaagct ccaaaa 696
<210> 70
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<212> DNA
<213> DNA编码
<400> 70
gctgacaaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatttt acatttacct 60
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<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 71
ccttcatcca actgcttaaa gacg 24
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 72
cgtctttaag cagttggatg aagg 24
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 73
ccttcatcca aacccttaaa gacg 24
<210> 74
<211> 24
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 74
cgtctttaag ggtttggatg aagg 24
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 75
caaagcctta aaattgatcc ttcag 25
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 76
ctgaaggatc aattttaagg ctttg 25
<210> 77
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 77
caaagcctta aacgtgatcc ttcag 25
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 78
ctgaaggatc acgtttaagg ctttg 25
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 79
gccttaaaga cgaaccttca gtg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 合成寡核苷酸(DNA引物)
<400> 80
cactgaaggt tcgtctttaa ggc 23
<210> 81
<211> 58
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 81
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Leu Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 82
<211> 58
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 82
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Thr Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 83
<211> 58
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 83
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Ile Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 84
<211> 58
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 84
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Arg Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55
<210> 85
<211> 58
<212> PRT
<213> C-野生型突变体
<400> 85
Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile
1 5 10 15
Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln
20 25 30
Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala
35 40 45
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
50 55

Claims (16)

1.一种对免疫球蛋白具有亲和性的蛋白质，其由选自序列号81、序列号82、序列号83、序列号84、序列号60以及序列号62中的氨基酸序列构成。
2.编码权利要求1所记载的蛋白质的DNA。
3.含有权利要求2所记载的DNA的载体。
4.用权利要求3所记载的载体对宿主进行转化而得到的转化体。
5.权利要求4所记载的转化体，其中，
宿主是革兰氏阳性菌。
6.权利要求5所记载的转化体，其中，
革兰氏阳性菌是短芽孢杆菌属(Brevibacillus)细菌。
7.权利要求6记载的转化体，其中，
短芽孢杆菌属细菌是桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)。
8.权利要求1所记载的蛋白质的制造方法，该方法采用权利要求4～7中任一项所记载的转化体，或者采用使用了权利要求2所记载的DNA的无细胞蛋白质合成体系。
9.权利要求8所记载的制造方法，其中，
将蛋白质积蓄在转化体的细胞内和/或周质区域中，和/或将蛋白质分泌到转化体的细胞外。
10.亲和分离基质，其中，
该亲和分离基质是将权利要求1所记载的蛋白质作为亲和配体固定于由水不溶性基体材料构成的担载体而得到。
11.权利要求10所记载的亲和分离基质，其中，
水不溶性基体材料包括合成高分子或多糖类，
所述合成高分子为交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺或交联聚苯乙烯。
12.权利要求11所记载的亲和分离基质，其中，多糖类是纤维素。
13.权利要求10所记载的亲和分离基质，其中，
该亲和分离基质与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。
14.权利要求13所记载的亲和分离基质，其中，
含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质是免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物。
15.权利要求10～14中任一项所记载的亲和分离基质在分离含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质中的用途。
16.权利要求15所记载的亲和分离基质的用途，其中，
分离含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质是以分离回收只含有免疫球蛋白的Fab区域的蛋白质为目的。
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