JP2016117761A - 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド - Google Patents
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Abstract
Description
市販品としては、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S−1000、メタクリレート系の担体であるToyopearl、アガロース系の架橋担体であるSepharose CL4B、および、セルロース系の架橋担体であるCellufineなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明のアフィニティー分離マトリックスを用いることにより、Fc領域を含む分子とFab領域のみを含む分子からなる混合物から、Fab領域を素通り画分として容易に分離回収することが可能となる。
C−G29Vを5連結したタンパク質のアミノ酸配列(C−G29V.5d、配列番号11)から逆翻訳を行い、該タンパク質をコードする塩基配列を設計した。該タンパク質のコドン使用頻度が、ブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31株で大量に発現している細胞表層タンパク質であるHWP(Ebisu S.著、「J.Bacteriol.」、1990年、172号、1312−1320頁)のコドン使用頻度に近くなるように、かつ、5個の各ドメイン間での塩基配列の配列同一性が低くなるように考慮して、コドンを分配した。また、5連結ドメインをコードする配列の5’側にPstI、および、3’側にXbaIの制限酵素認識部位を作製した。DNA断片の作製はタカラバイオ社に依頼した。作製したDNA断片の配列を配列番号12に記した。
実施例1で作製した、C−G29AをコードするDNA断片を含む5種のプラスミド、pUC19−A29−d1、pUC19−A29−d2、pSL301−A29−d3、pSL301−A29−d4、pSL301−A29−d5を鋳型として、配列番号30〜59のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、実施例1と同様に、クイックチェンジ法を利用した手法にて、C−G29A/S33E、C−G29A/D36R、および、C−G29A/K35R/D37EのDNA断片を含むプラスミドを作製した。
実施例1〜2で得られた、各々の発現プラスミドDNA塩基配列の確認は、DNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems社製)を用いて行った。BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社製)を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドDNAのシークエンシングPCR反応を行い、そのシークエンシング産物を精製し、配列解析に用いた。シークエンシングに用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列については省略する。
実施例1〜2により得られた、各種ブレビバチルス・チョウシネンシスFY−1組み換え菌を、60μg/mLのネオマイシンを含む5mLの3YC培地(ポリペプトン 3%、酵母エキス 0.2%、グルコース 3%、硫酸マグネシウム 0.01%、硫酸鉄 0.001%、塩化マンガン 0.001%、塩化亜鉛 0.0001%)にて、30℃で3日間の振盪培養を行った。
本発明における「Fab領域への親和性」については、免疫グロブリンのFc領域を含まないFabフラグメントを用いて調べた。
実施例4で取得した各種タンパク質のIgG−Fabとの親和性の解析に関しても、実施例5と同様に、Biacore 3000を用いて実施した。
実施例7で評価した変異に加え、この発明によって見出されたその他の変異について効率的に評価することを目的に、単ドメインレベルで各種変異体を調製した。
変異を導入するタンパク質配列として、プロテインAのCドメインに由来するアミノ酸配列(配列番号10、C−G29A.1d)を選んだ。配列番号70に示したC−G29A.1dをコードするDNA配列を含む、GST融合タンパク質発現ベクターpGEX−6P−1(GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を変異導入の鋳型プラスミドとした。鋳型プラスミドの調製方法は、公開特許文献(国際公開第2010/110288号公報)の記載に準ずる。
実施例8で得られた各々の形質転換細胞は、各種変異体をGST融合タンパク質として発現する。これらの形質転換細胞を、アンピシリンを含むLB培地にて、37℃で終夜培養した。これらの培養液を、2×YT培地(アンピシリン含有)に接種し、37℃で約1時間培養した。終濃度0.1mMになるようIPTG(イソプロピル1−チオ−β−D−ガラクシド)を添加し、さらに、37℃にて18時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、EDTA(0.5mM)を含むPBS緩衝液に再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分(無細胞抽出液)と不溶性画分に分画した。GST融合タンパク質を含む各々の無細胞抽出液から、GSTに対して親和性のあるGSTrap FFカラム(GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、GST融合タンパク質を精製(粗精製)した。各々の無細胞抽出液をGSTrap FFカラムに添加し、標準緩衝液(20mM NaH2PO4−Na2HPO4,150mM NaCl,pH7.4)にてカラムを洗浄、続いて溶出用緩衝液(50mM Tris−HCl、20mM Glutathione、pH8.0)にて目的のGST融合タンパク質を溶出した。溶出画分を限外ろ過によって標準緩衝液に置換した溶液を、最終精製サンプルとした。
実施例9で得られた各種単ドメイン型変異体について、実施例7に記載の方法と同様に、モノクローナルIgG−Fabとの親和性をBiacoreにて測定し、各種変異を導入することによるIgG−Fab結合能の変化について解析した。ただし、タンパク質濃度を4μM(280nmで同じ吸光度を示す濃度)とした各種単ドメイン型変異体のセンサーグラムのみ測定した。
実施例4で取得したC−G29A/S33E.5dのアルカリ耐性について、アルカリ性条件下で一定時間インキュベートする処理を行った後の、ヒトIgGに対する結合量の低下度合い(ヒトIgGに対する残存結合活性)を比較することで評価した。
アルカリ処理前のC−G29A/S33E.5d溶液は、タンパク質濃度、溶液の組成が同じになるように、アルカリ処理時に加えるNaOH溶液、および、中和処理時に加えるHCl溶液を、あらかじめ混合させた溶液を、26.2μMのC−G29A/S33E.5d(10μL)に対して加えることで、調製した。センサーチップの準備(ヒトIgGの固定化など)、測定時のランニング緩衝液、測定温度、チップの再生処理に関しては、実施例7と同じである。アルカリ処理前、および、処理後のC−G29A/S33E.5d溶液を、流速20μL/minで150秒間センサーチップに添加した。添加時(結合相、150秒間)、および、添加終了後(解離相、210秒間)の結合反応曲線を順次観測した。
アフィニティー分離マトリックス(1):メタクリレート系ポリマー・ベース
水不溶性基材として、市販の活性化型アフィニティークロマトグラフィー用充填剤「TOYOPEARL AF−Formyl−650M」(東ソー(株)製)を使用した。この充填剤は、メタクリレート系ポリマーをベースとし、タンパク性リガンド固定化用のホルミル基が導入済みである。実施例4で取得したC−G29A/S33E.5dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス(1)を調製した。
水不溶性基材として、市販の活性化型プレパックカラム「Hitrap NHS activated HP」1mL(GEヘルスケア・ジャパン(株)製)を使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、タンパク性リガンド固定化用のN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)基が導入済みである。概ね製品マニュアルに従う形で、実施例4で取得したC−G29A/S33E.4dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス(2)を調製した。
水不溶性基材として、市販のゲル濾過用充填剤「セルロファインGCL−2000−m」(チッソ(株)製)を使用した。この充填剤は、架橋された多孔性セルロースをベースとする。実施例4で取得したC−G29A/S33E.5dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス(3)を調製した。
水不溶性基材として、結晶性高架橋セルロース(チッソ(株)製、米国公開第0062118号(特開2009−242770号公報)により得られるゲル)を使用した。実施例4で取得したC−G29A/S33E.5dの最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックス(4)を調製した。
具体的には、ゲル12mLを、グラスフィルター上にて、クエン酸緩衝液(0.01M クエン酸三ナトリウム二水和物−クエン酸一水和物、pH3)で置換後、遠沈管内で液量を18mLとした。これに0.08gの過ヨウ素酸ナトリウムをRO水に溶解させた水溶液6mLを加え、ミックスローターにて、6℃で約30分間振とうした。
その後、2.4Mクエン酸水溶液(クエン酸一水和物)でpH5とし、6℃で4時間振とうを継続した。続けて、5.5重量%濃度のジメチルアミンボラン水溶液を0.46mL加えて、25℃、18時間振とうした。反応後、反応液の275nm付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、C−G29A/S33E.5dの導入量は11mg/mL−gelであり、リガンドの担体への固定化収率は90%であった。
実施例12で調製したアフィニティー分離マトリックス(1)〜(4)を、エンプティーカラムTricornTM 5/50 Column(GEヘルスケア・ジャパン(株)製)に充填し、クロマトシステムAKTA prime plus(GEヘルスケア・ジャパン(株)製)に接続して、抗体精製クロマトグラフィーによる抗体酸溶出特性評価を行った。ただし、アフィニティー分離マトリックス(2)はプレパックカラムなので、そのまま接続可能である。全ての場合において、カラム容量は約1mLとなる。このアフィニティー分離カラムを標準緩衝液(20mM NaH2PO4−Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.4)で平衡化した後に、VH3サブファミリーに属するヒト化モノクローナルIgG製剤のハーセプチンを標準緩衝液で1mg/mLに調製した溶液500μLを、流速2mL/minにて添加した。その後、標準緩衝液を同じ流速で5mL流して洗浄した後に、溶出緩衝液(35mM CH3COOH−CH3COONa、pH3.5)を同じ流速で5mL流して、280nmの吸光度をモニタリングして得られたIgG溶出ピークのクロマトグラフィー・プロファイルを確認した。さらに連続して、5mLの標準緩衝液を同じ流速で流した後、強洗浄液(0.5M CH3COOH、0.1M Na2SO4、pH2.5)を同じ流速で3mL流し、280nmの吸光度をモニタリングして、強制的に分離されたカラム残存IgGのピークを確認した。なお、アフィニティー分離マトリックス(2)についてのみ、強洗浄液の組成は、20mM CH3COONa−CH3COOH、1M NaCl(pH3.2)とした。
アフィニティー分離マトリックス(1)〜(3)については、pH3.75に調整した溶出緩衝液を用いた、同様の抗体精製クロマトグラフィーによる抗体酸溶出特性評価を行った。
C−G29A/S33E.5d、および、C−G29A.5d(比較例1)を固定化した各々のアフィニティー分離マトリックス(1)を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピーク・プロファイルを重ねた図を、図4に示した。上の図が溶出pH3.5のときの、下の図が溶出pH3.75のときの、溶出ピーク・プロファイルである。図4に示す通り、C−G29A/S33E.5dを固定化したマトリックスの溶出ピーク・プロファイルは、C−G29A.5dの場合に比べて、明確にシャープであることが確認できた。溶出pH3.75のときの溶出ピーク・プロファイルより、変異導入前のC−G29A.5dは吸着したIgGの回収が困難であったものが、変異導入後のC−G29A/S33E.5dでは吸着したIgGを全て回収できることを確認した。本発明がより中性に近い酸性溶液での抗体回収率を劇的に向上することが可能であることを示した一例と考えられる。
C−G29A/S33E.4d、および、C−G29A.4d(比較例2)を固定化した各々のアフィニティー分離マトリックス(2)を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピーク・プロファイルを重ねた図を、図5に示した。アフィニティー分離マトリックス(1)の場合と同様に、C−G29A/S33E.4dを固定化したマトリックスの溶出ピーク・プロファイルは、C−G29A.4dの場合に比べて、明確にシャープであることが確認できた。本データにより、本発明のタンパク質は、ベースとなる水不溶性基材の種類、基材へのリガンド固定化方法、および、リガンドとなるタンパク質のドメイン数に依らず、効果を奏することが示された。
C−G29A/S33E.5d、および、C−G29A.5d(比較例1)を固定化した各々のアフィニティー分離マトリックス(3)を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピーク・プロファイルを重ねた図を、図6に示した。C−G29A/S33E.5dを固定化したマトリックスの溶出ピーク・プロファイルは、C−G29A.5dの場合に比べて、明確にシャープであることが確認できた。本データにより、本発明のタンパク質は、基材として抗体溶出特性(溶出の切れ)に優れた基材と組み合わせることによっても、さらに優れた効果が発揮されることが示された。
C−G29A/S33E.5dを固定化したアフィニティー分離マトリックス(4)を用いた、抗体精製クロマトグラフィーの溶出ピーク・プロファイル(溶出pH3.5)を図7に示した。産業的には、高い抗体結合容量を示すマトリックスへのニーズが高く、リガンド固定化量の増加は、抗体結合容量の向上に有効である。本データにより、本発明は、タンパク質固定化量が高い場合においても、問題なくその効果を奏することが確認された。
実施例1で得られた組み換え菌を用いて、実施例3〜5に記載の方法と同様の方法にてC−G29A.5d(配列番号28)を調製した。ヒトIgG、および、モノクローナルIgG−Fabとの親和性の解析方法についても、実施例5、および、実施例7に記載の方法と同様であり、解析結果については、表1〜2に併せて表記した。
実施例1で得られた発現プラスミドpNK3262−C−G29A.5dを鋳型とし、配列番号66〜67のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、実施例2と同様の手法にて、C−G29A.4dの発現プラスミド、および、その形質転換細胞を得た。実施例3〜5に記載の方法と同様の方法にて、C−G29A.4dを調製した。加えて、実施例12のアフィニティー分離マトリックス(2)の調製にも、C−G29A.4dを用い、実施例13と同様の手法にて抗体酸溶出特性を評価し、その結果を図5に併せて表記した。
実施例8で用いた鋳型プラスミドを含む形質転換細胞(HB101)を用いて、実施例9と同様の手法にて、C−G29A.1dを調製し、実施例10と同様の手法にて、モノクローナルIgG−Fabとの親和性を解析した。解析結果については、図2に併せて表記した。
Claims (22)
- 配列番号5に記載のプロテインAのCドメインに由来するアミノ酸配列において、
Cドメインの33位、または36位に対応するアミノ酸残基に
少なくとも1つのアミノ酸置換変異を導入したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、
配列番号5に記載のアミノ酸配列と85%以上の配列同一性を有し、
変異導入前のタンパク質と比較して、免疫グロブリンのFab領域に対する親和性が低下していることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。 - 変異導入前のアミノ酸残基において、
Cドメインの33位に対応するアミノ酸残基がSer、又は
Cドメインの36位に対応するアミノ酸残基がAsp
である、請求項1に記載のタンパク質。 - 導入するアミノ酸置換変異が、
Cドメインの33位に対応するSerをLeuまたはThrに置換する変異、又は
Cドメインの36位に対応するAspをArg若しくはIleに置換する変異
である、請求項1または2に記載のタンパク質。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質を2個以上連結した複数ドメインからなるタンパク質。
- 連結するタンパク質が、種類の異なるタンパク質である請求項4に記載のタンパク質。
- 連結するタンパク質の数が2〜5個である、請求項4または5に記載の複数ドメインからなるタンパク質。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質をコードするDNA。
- 請求項4〜6のいずれか1項に記載のタンパク質をコードし、連結されているドメインを構成する塩基配列の配列同一性が90%以下であることを特徴とするDNA。
- 請求項7または8に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項9に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主がグラム陽性菌であることを特徴とする、請求項10に記載の形質転換体。
- グラム陽性菌がブレビバチルス属細菌であることを特徴とする、請求項11に記載の形質転換体。
- ブレビバチルス属細菌がブレビバチルス・チョウシネンシスであることを特徴とする、請求項12に記載の形質転換体。
- 請求項10〜13のいずれか1項に記載の形質転換体、または、請求項7又は8に記載のDNAを用いた無細胞タンパク質合成系を用いる、請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質の製造方法。
- 形質転換体の細胞内及び/又はペリプラズム領域内にタンパク質を蓄積すること、及び/又は、形質転換体の細胞外にタンパク質を分泌することを特徴とする、請求項14に記載の製造方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質をアフィニティーリガンドとして、水不溶性基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティー分離マトリックス。
- 水不溶性基材が、合成高分子又は多糖類からなる請求項16に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 多糖類がセルロースである、請求項17に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする、請求項16〜18のいずれか1項に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質が免疫グロブリンG、または、免疫グロブリンG誘導体のいずれかであることを特徴とする、請求項19に記載のアフィニティー分離マトリックス。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離における、請求項16〜20のいずれか1項に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
- 免疫グロブリンのFc領域を含むタンパク質の分離が、免疫グロブリンのFab領域のみを含むタンパク質の分離回収を目的とする、請求項21に記載のアフィニティー分離マトリックスの使用。
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