KR20040017947A

KR20040017947A - 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-Ｎ-아세틸글루코사민을생산하는 융합단백질

Info

Publication number: KR20040017947A
Application number: KR1020020049887A
Authority: KR
Inventors: 도수일; 이상수; 이기영; 채정일
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2002-08-22
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2004-03-02
Also published as: KR100481910B1

Abstract

본 발명은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 갖는 융합단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1을 포함하는 융합단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 융합단백질을 대량 생산하는 방법 및 상기 융합단백질을 이용하여 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Galactose-β-1,4-N-acetylglucosamine)과 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Galactose-α-1,3- galactose-β-1,4-N-acetylglucosamine) 구조를 갖는 기능성복합당질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 동시에 갖고 있어서 이형조직이식에서 면역거부억제제로 중요한 삼당류의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-Ｎ-아세틸글루코사민을 생산하는 융합단백질{Fusion protein producing galactose α-1,3-galactose-β-1,4-N-acetyl glucosamine}

본 발명은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제와 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 동시에 갖는 재조합 단백질에 관한 것으로, 보다 상세하게는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제와 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 포함하는 융합단백질, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자, 상기 융합단백질을 대량 생산하는 방법 및 상기 단백질을 이용하여 기능성당질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

세포표면에 존재하는 복합당질들은 세포의 주변환경에 가장 먼저 접해 세포와 세포간의 상호인식 및 상호접착(Galili, 1971) 등의 중요한 역할을 수행하며,동물세포의 수정(Maryet al.,1991), 발생, 분화 및 노화에 이르는 생명체의 전 과정에서 조직 특이적으로 발현이 조절되고(Feizi.,1985; Barry,1993), 세포분화의 각 단계에 따라서 특정구조의 당질이 만들어진다. 또한, 종의 다른 조직마다 복합당질의 다양한 유형들이 나타난다(Masahiroet al., 2000).

다양한 유형의 복합당질들은 당전이효소(glycosyltransferase)들에 의해 합성되는데 당전이효소중의 하나인 갈락토실트랜스퍼라제(galactosyltransferase)는 기증자 기질인 UDP-Gal을 수용체 기질인N-아세틸글루코사민(GlcNAc)에 β-1,4 연결고리로 결합시켜주는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 다른 수용체 기질에 UDP-Gal을 α-1,3 연결고리로 전달해 주는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제로 나뉜다. β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제에 의해 합성되는 α-갈락토스 에피토프를 갖는 삼당류인 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Gal-α-1,3-Gal-β-1,4-GlcNAc)은 이형조직 이식에서 면역거부 억제제(Uriet al., 1987; Goodet al., 1992; Galiliet al., 1993; Oriolet al.,1993; Sandrinet al., 1993; Franciscaet al., 1994; Pakeret al., 1994; Uriet al., 1996; McMorrowet al., 1997)와 몇몇의 암세포를 표지하는 지시제로서 활용이 가능하다.

하지만, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 따로 따로 넣어서 삼당류(Gal-α-1,3-Gal-β-1,4-GlcNAc)를 합성할 시에는 단당을 기질로 사용하여 이당류(Gal-β-1,4-GlcNAc)를 먼저 합성하고, 이 당질을 순수하게 얻은 후 다시 두 번째 효소반응을 해야하는 번거로움이 있다. 또한, 아직까지 상기 두 효소의 활성을 동시에 나타내게 하는 재조합 효소는 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 이형조직이식에서 면역거부억제제로 중요한 삼당류를 대량 합성하기 위해 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제와 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 연결하여 융합단백질을 제조하고, 상기 융합단백질을 대량 생산하는 방법 및 상기 융합단백질을 이용하여 한번의 반응으로도 삼당류인 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Gal-α-1,3-Gal-β-1,4-GlcNAc)을 합성할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제와 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 융합시킨 융합단백질, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자, 상기 융합단백질을 대량생산하는 방법 및 상기 융합단백질을 이용하여 기능성복합당질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제와 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 비기능성 연결고리를 사용하여 제조한 본 발명의 융합단백질의 모식도이다.

도 2는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-GalT), β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(β-1,4-GalT) 및 본 발명의 융합단백질을 대장균에서 발현시킨 후 수용성 상층액과 불용성 침전물을 분리하여 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.

도 3은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-GalT), β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(β-1,4-GalT) 및 본 발명의 융합단백질을 대장균에서 IPTG로 발현시키고 NiNTA-컬럼으로 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 사진이다.

(a), (c), (e): 쿠마시 블루 염색,

(b), (d), (f): 항 히스티딘 태그 항체를 사용한 웨스턴 블럿

-:IPTG 비존재, +: IPTG 존재 하에서 발현

도 4는 본 발명의 방법에 의해 생산된 융합효소의 베타머캅토에탄올에 의한 효소활성 정도를 나타낸 그래프이다.

침전 1: 분쇄버퍼 Ⅰ(2% NP 40, 1 mM Tris-HCl)에 녹인 융합단백질,

침전 2: 분쇄버퍼Ⅰ에 녹지 않은 침전물을 분쇄버퍼 Ⅱ(2% NP 40, 1 mM Tris-HCl, 1 mM β-머캅토에탄올)에 다시 녹인 융합단백질

도 5는 본 발명의 방법에 의해 생산된 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 및 본 발명의 융합단백질에 의해 합성된 이당류 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Gal-β-1,4-GlcNAc) 및 삼당류 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Gal-α-1,3-Gal-β-1,4-GlcNAc)을 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 이용하여 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민과 갈락토스-α-1,3갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민 구조를 갖는 기능성복합당질을 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

상기 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 세포질 부위 및 막관통 부위에 해당하는 아미노말단이 제거된 것이 바람직하고, 구체적으로는,서열번호 2의 63번 내지 414번 아미노산 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1의 세포질 부위 및 막관통 부위에 해당하는 아미노말단이 제거된 것이 바람직하고, 구체적으로는,서열번호 4의 49번 내지 398번 아미노산 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 융합단백질은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제와 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1의 연결부위에 비기능성 연결고리를 포함하는 것이 바람직하며, 2개의 아미노산 서열(Leu-Glu)을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 말단에는 히스티딘 태그를 포함하는 것이 바람직하다. C-말단에 첨가된 히스티딘 태그는 융합단백질 발현 후 정제를 용이하게 한다.

본 발명의 융합단백질은서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 융합단백질은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성과 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 동시에 나타내며, 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민과 갈락토스-α-1,3갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민 구조를 갖는 기능성복합당질을 제조할 수 있다(도 5참조).

본 발명의 바람직한 실시예에서는서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성과 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 동시에 나타내는 융합단백질을 제조하고, 이를 "α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제"라 명명하였다(도 1참조).

또한, 본 발명은 상기 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성과 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 동시에 나타내는 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

상기 유전자는서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 대량 생산하는 방법은

1) α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성과 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 동시에 나타내는 융합단백질을 코딩하는 유전자 및 히스티딘 태그가 포함된 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 발현벡터를 ompT 결핍 대장균에 형질전환하는 단계;

3) 상기 형질전환체를 배양하고 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 발현을 유도하는 단계; 및

4) 상기 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 정제하는 단계를 포함한다.

상기 ompT 결핍 균주인 대장균 BL21(DE3)를 숙주세포로 사용하였으며, IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다(도 2및도 3참조).

본 발명의 융합효소를 발현시킨 후 정제하는 경우에는 NiNTA-아가로스를 이용하였다(도 3참조). 이는 히스티딘이 금속이온과 결합하는 능력을 이용한 것이다. 구체적으로 히스티딘 결합 레진을 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수용하여 융합효소를 정제하였다. 히스티딘 결합 레진은 히스티딘이 Ni 금속에 결합하는 원리를 이용한 모든 레진을 사용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Ni-NTA 레진을 사용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 융합효소를 정제하였다.

그러나 상기 형질전환체를 37℃에서 발현시키는 경우에 수용성 및 불용성 상태로 발현되게 된다(도 2참조). 따라서, 본 발명에서 형질전환체를 배양하고 융합단백질 발현을 IPTG로 유도한 후 불용성 상태의 효소를 수용성으로 유도하기 위해 베타머캅토에탄올을 이용하여 높은 활성을 갖는 융합효소를 획득할 수 있다(도 4참조).

또한, 본 발명은 상기 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성과 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1 활성을 동시에 나타내는 융합단백질을 이용하여 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민과 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민 구조를 갖는 기능성복합당질을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 융합효소 활성을 분석한 결과, 단당N-아세틸글루코사민에서 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민 구조를 갖는 기능성복합당질을 한번의 반응으로 제조할 수 있고, 효율적인 효소 활성을 갖는 것으로 확인되었다(도 5참조). 따라서, 본 발명의 융합단백질은 장기이식시 나타나는 면역거부억제작용을 갖는 복합당질의 생산에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 클로닝 및 발현

본 발명자들은 융합단백질을 제조하기 위하여,서열번호 1로 기재되는 생쥐 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 cDNA 유전자(GeneBank Accession No.:P23336)와서열번호 3으로 기재되는 인간 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 전체 cDNA 유전자(GeneBank Accession No: X55415)를 이용하여 융합단백질을 제조하였다.

구체적으로,서열번호 2의 생쥐 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 세포질 부위 및 막관통 부위에 해당하는 NH₂-말단 일부분인 62개 아미노산 서열을 제거한수용성(soluble) 부분을 코딩하는 cDNA 유전자와서열번호 4의 인간 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 세포질 부위 및 막관통 부위에 해당하는 NH₂-말단 일부분인 48개 아미노산 서열을 제거한 수용성(soluble) 부분(Arg⁴⁹부터 Ser³⁹⁸)을 코딩하는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 1:1로 융합시켰다.

이를 위하여 본 발명자들은 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 프라이머의 설계는 NCBI의 Genbank 뉴클레오타이드 서열 데이타베이스(Accession number P23336)를 기초로 설계하였고,서열번호 7로 기재되는NcoI 절단부위를 포함하는 프라이머 및서열번호 8로 기재되는 XhoI 절단부위를 포함하는 프라이머를 사용하였다. PCR은 주형 DNA 20 ng에 10X 반응버퍼 5 ㎕, dNTP 2.5 mM, 프라이머 각각 50 pmol 0.5 ㎕, ExTaq(Takara) 5U를 넣고 멸균된 증류수를 넣어 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하고, 미네럴 오일을 한 두 방울 넣은 다음 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 30번 반복하였다. PCR 산물은 전기영동으로 대략적인 DNA 농도를 확인하였다. 상기 PCR 산물은 NcoⅠ과 XhoⅠ로 절단하고 전기영동하여 겔에서 분리한 후 진클린 킷트(Geneclean kit)를 사용하여 필요한 DNA를 얻고, 페놀/클로로포름이소아밀알콜로 정제한 것을 에탄올 침전시킨 후 적당량의 멸균수에 녹인 후 전기영동으로 대략적인 DNA 농도를 확인하였다.

또한, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 경우는 pET29b(Novagen, Darmstadt, Germany)에서 이 벡터를 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 카르복실기 말단에 연결시키기 위해XhoI으로 N-말단 부분을 제한효소로 자르고 같은 방법으로 정제하였다.

상기에서 제조된 벡터와 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 1:1 비로 섞고 연결시키기 위해 16℃에서 12-16시간 반응시켰다. 결합된 반응산물을 컴피턴트 세포(competent cell; DH5α) 100 ㎕와 섞어 얼음에서 30분간 정치시키고, 42℃에서 90초간 열처리 후, SOC 배지 900 ㎕를 넣어 37℃에서 1시간 배양한 다음 카나마이신 50 ㎍/㎖이 함유된 LB 배양접시에 도말하여 37℃에서 12-16시간 배양하였다.

배양된 배양접시로부터 클론을 카나마이신 50 ㎍/㎖이 함유된 LB배지 5 ㎖에 접종하고 37℃, 250 rpm에서 12-16시간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 플라스미드의 분리는 알카라인 용해 방법을 사용하였다. 즉, 원심분리하여 침전시킨 균체에 200 ㎕의 용액Ⅰ(50 mM 글루코스, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 현탁시키고 200 ㎕의 용액Ⅱ(0.2 N NaOH, 1% SDS)를 섞어 얼음에서 5분간 균체를 분해한 뒤 200 ㎕의 용액Ⅲ(4 M 포타슘 아세테이트, 2 M 아세트산, pH 4.8)를 넣고 섞어 얼음에서 5분간 방치시킨 다음 4℃, 12,000 rpm에서 원심 분리하여 상층액을 취하였다. 상층액 0.5배 부피의 이소프로판올을 가하고 12,000 rpm에서 원심 분리하여 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA는 100% 에탄올과 70% 에탄올로 세척하고 에탄올을 회전 냉동 건조기로 완전히 말렸다. 완전히 말린 플라스미드는 RNase 10 ㎎/㎖이 들어있는 TE 100 ㎕에 잘 녹였다. 상기 플라스미드는HindⅢ 또는EcoRⅠ으로 절단하여 1% 아가로스 겔에 전기영동하고 클론을 확인하였다. 확인된 클론을 "pET/α-1,3/β-1,4-GT"라 표기하였다.

상기 융합 유전자가 발현되어 생성되는 융합단백질은 α-갈락토실트랜스퍼라제 신호 서열을 이용하여 배지에 분비되도록 하였으며,도 1에서 보여지는 대로 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제와 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 연결부위에 2개의 아미노산 서열(Leu-Glu)을 추가하였고, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 말단에는 히스티딘 태그(His₆-tag) 서열을 추가하였다. 본 발명자들은 상기에서 제조한 융합단백질을 "α-1,3/β-1,4갈락토실트랜스퍼라제"라 명명하였다.

<실시예 2> α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 발현 및 정제

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 융합단백질을 포함하는 벡터(pET/α-1,3/β-1,4-GT)를 ompT 결핍 숙주세포인 대장균(E. coli) BL21(DE3)(Novagen, Darmstadt, Germany)에 형질전환하였다. 하룻밤 배양한 형질전환된 대장균을 BL21(DE3)를 카나마이신이 50 ㎍/㎖의 농도로 함유된 LB배지 20 ㎖에 1/100으로 희석하여, A₆₀₀이 0.7이 될 때까지 37℃에서 250 rpm으로 진탕배양하고 IPTG를 3 mM 농도로 첨가하여 발현을 유도하였다.

구체적으로, IPTG 첨가 후 37℃에서 4-5시간 배양하고 원심분리하여 균체를 회수한 다음 30 mM Tris-HCl, 30 mM NaCl 용액(pH 7.5) 3 ㎖에 현탁하여 얼음에 10분 동안 정치해 팽창시켰다. 팽창된 균주를 원심분리하여 상층액은 버리고 균주를 용해 버퍼Ⅰ(1 mM Tris-HCl(pH 7.5), 2% NP40) 1-2 ㎖에 현탁한 후 초음파 분해기로 4초간 4회 분쇄 한 후, 15,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 다시 한번 남은 불용성 단백질에 용해 버퍼 Ⅱ(8 M 우레아 또는 1 mM β-머캅토에탄올, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA(pH 8.0)) 1-3 ㎖을 첨가하여 잘 섞어준 후 다시 10초간 3번씩 분쇄 한 후, 15,000 rpm에서 원심분리하여 상층액을 모았다. 모은 상층액을 투과성 막에 넣고 저온실에서 14 - 16시간동안 1X PBS (6.7mM K₂HPO₄, 150mM NaCl, pH 7.4)에 투석하였다. 각 수용성 및 불용성 분획을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulgate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다. 전기영동 한 젤을 젤 염색 용액(0.025% Coomassie Brilliant Blue R, 250, 40% 메탄올, 7% 아세트산)으로 1시간 염색하고, 탈색 용액(30% 메탄올, 7% 아세트산, 63% H₂O)으로 탈색하였다.

그 결과, 37℃에서 세포 배양한 경우 60%의 융합단백질은 불용성으로 발현되고, 40%만이 수용성 단백질로 발현되었다(도 2). 또한, IPTG로 발현을 유도하였을 때 주요 밴드는 85 kDa에서 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제가 발현되는 것으로 나타났다(도 3의 e).

웨스턴 블럿 분석은 융합단백질의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제에 히스티딘 태그(His·Tag) 부분이 있어 항 His·Tag 항체를 이용하였고, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 항 S·Tag 항체를 이용하였다. 단백질이 전이된 막의 코팅은 5% 탈지분유로 하였고, TTBS(20 mM Tris-HCl(pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.05% tween 20) 용액으로 15분간 3번 세척하였다. TTBS 용액에 5 ㎍/㎖로 생쥐에서 얻은 항 His·Tag항체와 항 S·Tag 항체를 각각 섞고, 상온에서 1시간동안 전이된 막에 결합시킨 후 TTBS 용액로 15분간 3번 세척하였다. 첫 번째 반응한 항 His·Tag 항원을 검출하기 위해 양에서 얻은 항 생쥐 IgG-POD 0.06 U/㎖를 TTBS 용액에서 섞고, 상온에서 1시간 동안 전이된 막에 결합시킨 후 세척하였다. 처리된 막을 수퍼 신호 웨스트 피고 화학발광 기질(super signal west pico chemiluminescent substrate; PIERCE, U.S.A.)에 5분간 상온에서 결합시킨 후 코닥 필름 (13X18 ㎝)에 감응시켰다.

각 pET/β-1,4-GalT와 융합단백질(pET/α-1,3-GalT/β-1,4-GalT)에는 His·Tag부분이 있어 수용성 단백질이 있는 상층액을 5 ㎖ Ni-NTA 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 용해버퍼로 세척한 후, 단백질은 세척 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, 20 mM imidazole, 300 mM NaCl, pH 8.0)로 세척한 후 이 비드(bead)를 바로 효소활성실험에 사용하였다.

그 결과, IPTG로 발현을 유도하였을 때 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 42 kDa에서 발현되었고, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 50 kDa에서 발현되었다. 또한, α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 주요 밴드는 85 kDa에서 주로 발현되는 것으로 나타났다(도 3의 b, d, f).

<실시예 3> α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소활성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 정제한 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 효소활성을 분석하였다. 갈락토실트랜스퍼라제 효소활성 분석은 도 등(Do et al., 1995,J. Biological Chem.270, 18447-18451)이 보고한 방법을 변형하여 수행하였다.

구체적으로, 정제된 단백질의 효소 활성은 에펜도르프 튜브에 있는 0.1 M Na-카코딜산(Na-cacodylic acid, pH 6.7) , 10 mM MnCl₂, 10 mM ATP,N-아세틸글루코사민 1 mM 및 이미 건조된 1.6 pmol(1X10⁵cpm)의 [³H]UDP-α-D-갈락토스(UDP-Gal)이 포함된 50 ㎕ 반응액에 의해 시험관 내에서 측정하였다. 37℃에서 1시간 동안 반응 후, 1 ㎖ 증류수를 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응 혼합물은 5% 소듐 보레이트로 미리 평형화시킨 1 ㎖ 다우엑스(Dowex, AG1-X8) 피펫 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 상기와 동일한 용액 1 ㎖로 5회 세척한 후, 각각의 분획에서 트리튬-표지된 갈락토스-β1-4N-아세틸글루코사민(Galβ1-4GlcNAc), 트리튬-표지된 갈락토스-α-1,3-갈락토스-β1-4N-아세틸글루코사민(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc)을 리퀴드 신틸레이션 카운터로 정량하였다. 반응산물 이당류(Galβ1-4GlcNAc)와 삼당류(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc)를 확인하기 위하여, 반응 혼합물은 100 mM 암모니움 하이드로젠 카보네이트(pH 7.7)로 미리 평형화시킨 바이오-젤 P-4 컬럼(Bio-Gel P-4 column; 1.5X100 ㎝)에 로딩하였다. 이당류와 삼당류에서 삽입된 트리튬-표지된 갈락토스를 리퀴드 신틸레이션 카운터(Beckman liquid scintillation counter LS6500)를 사용하여 측정하였다.

그 결과,도 5에서 보는 바와 같이 반응산물 이당류(분획 160-170)와 삼당류(분획 150-160)는 자유 갈락토스(분획 190-200)로부터 분리되어, 상기에서 제조한 α1-3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 단당N-아세틸글루코사민으로부터 3당류를 효과적으로 만들 수 있는 것을 보여주고 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 α1-3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 생산방법은 ompT 결핍 숙주세포를 이용하여 완전한 효소활성을 나타내는 수용성 단백질 형태로 대량 생산할 수 있고, 상기 방법에 의해 제조된 α1-3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제는 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민와 갈락토스-α-1,3갈락토스 -β-1,4-N-아세틸글루코사민 구조를 갖는 당질을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1을 포함하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, 상기 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 세포질 부위 및 막관통 부위에 해당하는 아미노말단을 제거한 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제 2항에 있어서, 상기 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제는서열번호 2의 63번 내지 414번 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1은 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1의 세포질 부위 및 막관통 부위에 해당하는 아미노말단을 제거한 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 4항에 있어서, 상기 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제-1은서열번호 4의 49번 내지 398번 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항에 있어서, 상기 융합단백질은서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
제 1항의 융합단백질을 코딩하는 유전자.
제 7항에 있어서, 상기 유전자는서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
1) 제 7항의 유전자 및 히스티딘 태그가 포함된 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 발현벡터를 ompT 결핍 대장균에 형질전환하는 단계;

3) 상기 형질전환체를 배양하고 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 발현을 유도하는 단계; 및

4) 상기 α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 정제하는 단계를 포함하는α-1,3/β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 생산방법.
제 1항의 융합단백질을 이용하여 갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민 (galactose-β-1,4-N-acetylglucosamine)과 갈락토스-α-1,3갈락토스-β-1,4-N-아세틸글루코사민(Galactose-α-1,3-galactose-β-1,4-N-acetylglucosamine) 구조를 갖는 기능성복합당질을 제조하는 방법.