KR100263313B1 - 새로운 인간 n-아세틸글루코사민전이효소v 유전자 및 이를 이용한 활성형 효소의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 N-아세틸글루코사민 전이효소 V (N-acetylglucosaminyl transferase V) 유전자 및 이를 이용한 N-아세틸글루코사민 전이효소의 제조 방법 에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 정상세포에서는 발현되지 않고 전이성이 강한 암세포에서만 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 새로운 유전자 및 이를 막통과 영역 (transmembrane domain)을 포함하는 형태로 대장균에서 대량 발현시켜 활성화된 효소 형태로 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 효소는 암을 진단하는 항체의 생산 및 암을 치료하는 특이적인 활성 저해제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

새로운 인간 Ｎ-아세틸글루코사민 전이효소 Ｖ 유전자 및 이를 이용한 활성형효소의 제조방법

본 발명은 새로운 N-아세틸글루코사민 전이효소 V (N-acetylglucosaminyl transferase V) 유전자 및 이를 이용한 N-아세틸글루코사민 전이효소의 제조 방법 에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 발명은 정상세포에서는 발현되지 않고 전이성이 강한 암세포에서만 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 새로운 유전자 및 이를 막통과 영역 (transmembrane domain)을 포함하는 형태로 대장균에서 대량 발현시켜 활성형화된 효소 형태로 정제하는 방법에 관한 것으로서, 상기 효소는 암을 진단하는 항체의 생산 및 암을 치료하는 특이적인 활성 저해제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

세포 표면의 당쇄는 포유동물의 세포 외막을 이루는 당단백질과 당지질의 구성 요소중 하나로서, 세포의 유형에 따라 매우 독특한 구조를 가지고 있다 (Kornfeld, R. and Kornfeld, S.,Annu. Rev. Biochem., 45,217-237, 1976; Rademacher, T. W. 등,Annu. Rev. Biochem., 57, 785-838, 1988). 당쇄의 구조는 동물세포가 수정, 발생, 분화 또는 종양화되는 과정에 따라 특이적으로 변화되며, 세포 분화의 각 단계는 특정한 구조의 당쇄를 지닌다 (Feizi, T.,Nature, 314, 53-57, 1985). 또한, 당쇄는 세포 분화의 과정에서 항원으로 작용하여 특정한 항체에 의하여 인식되며, 렉틴과 당전이 효소와 같은 당쇄결합 단백질과 결합하여 세포간 상호 작용에 관여한다 (Fukuda, M.,Biochem. Biophys. Acta., 780, 119-123, 1985).

한편 인간 ABO 혈액형이 당쇄 구조에 의해 결정되는 것이 밝혀진 이후 약 20년만인 1990년에 혈액형을 결정하는 당전이 효소들의 cDNA 가 클로닝되어, A형 효소 유전자와 B형 효소 유전자 사이에 4개의 아미노산만이 다르다는 사실이 밝혀졌다 (F. Yamamoto, H. Clausen, T. White, J. Marken and S. Hakomori,Nature, 345, 229, 1991). 또한 당쇄의 생합성과 관련된 효소의 게놈 유전자에 대한 연구가 진행되어, α2-6 시아릴 전이효소 (α2-6 sialyltransferase), β1-4/α1-3 갈락토실 전이효소 (β1-4/α1-3 galactosyltransferases), α1-3/1-4 퓨코실 전이효소 (α1-3/1-4 fucosyltransferases), β1-4-N-아세틸글루코사민 전이효소 (β1-4-N-acetylglucosaminyltransferase) I 및 Ⅲ 등의 7종류 효소 유전자에 관하여 이미 보고된 바 있었다. 이들 중 α2-6 시아릴 전이효소와 β1-4 갈락토실 전이효소는 전사 조절 부위에 대한 연구도 이루어졌다 (D. H. Joziasse,Glycobiology, 3, 271, 1992). 이러한 당전이 효소들은 세포의 암화 및 암전이 과정과 관련되어 있어 상기 효소를 이용하면 암의 발생을 효과적으로 억제하는 연구 등을 활발히 진행시킬 수 있다.

당단백질에서의 당쇄 구조는N-결합형 당쇄와O-결합형 당쇄로 분류되는데,O-결합형 당쇄는 세린 (serine)의 히드록시기 (-OH기)에 결합되는 것이고N-결합형 당쇄는 N-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine, GlcNAc)의 환원성 말단인 아스파라긴산-X-세린/트레오닌 서열 중에서 아스파라긴산의 아마이드기에 결합하는 것이다.

구체적으로N-결합형 당쇄는 고만노스형, 복합형 그리고 혼성형으로 대별되며 이들은 공통적으로 트리만노실 중심 (trimannosyl core), Man α1→6 (Man α1→3) Man β1→4 GlcNAc β1→4 GlcNAc→Asn, 이라 불리는 구조를 가진다. 특히 복합형의N-결합형 당쇄는 세포의 종양화에 수반되어 다음과 같은 변화를 거치는데, 트리만노실 중심에서 분지 (branching)가 증가되고, 폴리락토스아미노글리칸 사슬 (polylactosaminoglycan chain)이 형성되며 시알산 첨가가 증가된다 (Yamashita, K. 등,J. Biol. Chem., 259, 10834-10840, 1984; Pierce and Arango,J. Biol. Chem., 261, 10772-10777, 1986; Hubbard, S. C.,J. Biol. Chem.,262, 16403-16411, 1987; Warren 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1838-1842, 1972). 이러한 당쇄 구조는 특정한 당전이 효소 (Glycosyltransferase)와 당분해 효소의 순차적인 작용에 의하여 분지 정도와 측쇄의 말단 구조가 조절되면서 변화된다 (Paulson and Colley,J. Biol. Chem., 264, 17615-17618, 1989).

당전이 효소는 소포체 (endoplasmic reticulum)와 골지체 (Golgi apparatus)에 존재하는 막 단백질로서, 당핵산 유도체인 활성형 공여체 기질 (donor substrate)로부터 당분자를 수용체 기질 (acceptor substrate)에 전이하여 당쇄의 합성을 조절하는 효소이다. 현재 포유동물 세포의 당쇄 구조 합성에 필요한 당전이 효소의 수는 공여체 기질, 수용체 기질, 결합 상태 등을 고려하는 경우 100-150 여종으로 추정되고 있으며, 공여체 기질의 유형에 따라 패밀리 (family)를 나눌 수 있다. 동일 패밀리를 이루는 당전이 효소들은 유사한 수용체 기질과 공여체 기질을 가지므로 공통적인 아미노산 서열이 존재할 것으로 기대되지만, 놀랍게도 현재까지 클로닝된 당전이 효소의 cDNA 염기 서열로부터 유추한 아미노산 서열을 비교하여 보면 시알산 전이효소 (sialyltranferase)를 제외하고는 촉매 영역 (catalytic domain)에 상동성이 거의 없는 것으로 알려져 있다. 그러나 당전이 효소는 세포질 꼬리 (cytoplasmic tail) 영역, 막통과 (transmembrane) 영역, 줄기 (stem) 영역과 촉매 영역(catalytic domain)의 4가지 영역으로 구성된 구조를 가지는 공통점이 있다.

이와 같은 당전이 효소는 의약용 제제로 기대를 모으고 있는 당질 또는 기능성 올리고당의 합성에 직접 응용될 수 있기 때문에, 현재 활성형 당전이 효소를 대량 생산하는데 관심이 모아지고 있다.

구체적으로 복합형의N-결합형 당쇄에 작용하는 당전이 효소로서, 생쥐 및 흰쥐 유래의 글루타민 전이효소 I (GnT-Ⅰ)가 알려져 있고 그의 cDNA 를 대장균에서 발현시켜 활성형의 가용성 단백질이 생산된 바 있다 (Kumar 등,Glycobiology., 2, 383-393, 1992). 또한 베큘로바이러스 (vaculovirus) 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 활성형의 당전이 효소가 대량 생산된 바 있다 (Williams 등,Glycoconjugate J., 12, 755-761, 1995).

복합형N-결합형 당쇄는 N-아세틸글루코사민 전이효소 (N-acetyl glucosaminyltransferase) 군의 조합적인 반응에 의해 다양한 유형으로 나누어진다. 이들 중 UDP-N-아세틸글루코사민 : β-D-만노사이드 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐 전이효소 V (UDP-N-acetylglucosamine : β-D-mannoside β-1,4-N-acetylglucosaminyl transferase V ; 이하 " N-아세틸글루코사민 전이효소 V "로 약칭함)[EC 2. 4. 1. 155]는N-결합형 당쇄의 트리만노실 중심의 β-연결 만노스 (β-linked mannose)에 N-아세틸글루코사민을 β-1,6-결합으로 부가시켜서 분지된 글루코사민 잔기를 형성하는 효소이다. 이러한 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 다양한 암바이러스로 형질전환된 세포 또는ras와 v-src등의 암 유전자에 의하여 발현이 증가된다 (Santer 등,Cancer Research, 44, 3730-3735, 1984; Dennis 등,Oncogene, 4, 853-860, 1989; Easton 등,J. Biol. Chem., 266, 21674-21680, 1991). 또한 상기 효소의 활성 변화는 암세포의 전이능과도 깊은 관련성이 있어, 실제로 인간 간암 세포주인 Hep3B 와 HepG2 그리고 대장암 세포에서 과잉으로 발현되고 있음이 보고되었다 (Dennis 등,Science, 236, 582-586, 1987; Saito 등,J. Biol. Chem., 267, 5700-5711, 1991; 김철호 등,Kor. J. Chitin Chitosan, 2, 27-39, 1997). 아마도 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 암전이에 필요한 세포 접착성 당쇄를 생합성하는데 관여하는 것으로 보인다.

최근, 흰쥐의 신장으로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 가 정제되고 그의 유전자가 클로닝되었다 (Shoreibah 등,J. Biol. Chem., 268, 15381-15385, 1993). 또한, 인간 폐암 세포주에서도 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 가 정제되고 그의 유전자가 클로닝되었다 (Gu 등,J. Biochem., 113, 614-619, 1993; Saito 등,Biochem. Biophys. Res. Comm., 198,318-327, 1994). 구체적으로, 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자는 염색체 2q.21 위치에 단일 사본수 (single copy)로 존재하며 이로부터 740개의 아미노산을 암호화한다. N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 활성에 의한 N-결합형 당쇄의 구조 변화가 세포에 어떠한 영향을 미치는가에 대하여 아직 명백하게 밝혀지지는 않았지만, 세포의 악성 암화 및 암의 전이에 따라 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 활성이 크게 증가하는 것이 확인되었다.

이와 같이 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 활성과 세포의 악성 암화 및 암전이가 밀접하게 관련되어 있음에도 불구하고, 암 세포주의 유전자를 이용하여 활성형의 효소를 대량 생산한 연구는 아직 보고된 바가 없었다. 실제로 유전자 재조합 방법으로 활성형의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대량 얻을 수 있다면, 암의 악성화 및 전이 과정에 특이적으로 발현되는 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 검출하는 진단기술 및 그의 발현 조절을 통한 암 치료기술 등을 개발하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 이외에도, 상기 효소는 암세포에 특이적으로 작용하는 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 활성 저해제를 천연 한방제제 등으로부터 탐색, 선별하는데 매우 유용하다.

그러나 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 막통과 영역 (transmembrane domain)을 가지고 있어 재조합 대장균에서 생산하는 경우, 대장균이 사멸되므로 이를 대량으로 발현하는 것이 어렵고, 발현이 되는 경우라도 봉합체 형태로 생산되어 활성이 없는 경우가 대부분이었다.

이에 본 발명자들은 암의 특이 진단 항체 및 효과적인 암 치료제를 개발하기 위하여, 인간 간암 세포주로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 얻어 새로운 염기 서열을 가짐을 확인하고 이를 이용하여 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대장균에서 막통과 영역을 제거하지 않은 봉합체 형태로 생산한 다음 환원, 투석, 재산화하는 과정으로 다시 리폴딩시켜 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 활성화 형태로 정제함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 암의 특이 진단 항체 및 암 치료제의 개발에 유용한 활성형의 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대량 생산하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

도 1은 인간 간암 세포주 HepG2 의 cDNA 를 주형으로 이용하여 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 분리하는 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 시발체의 위치와 함께 도식화하여 나타낸 것이고,

■ : N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 암호 영역

도 2는 인간 간암 세포주 및 정상조직에서 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 발현 정도를 나타내는 중합효소 연쇄반응의 결과이고,

레인 1 : HepG2 세포의 cDNA 를 주형으로 한 PCR 생성물;

레인 2 : Hep3B 세포의 cDNA; 레인 3 : NIH 3T3 세포의 cDNA;

레인 4 : 사람 태아 cDNA; 레인 5 : 사람 간 cDNA;

레인 6 : 사람 뇌 cDNA; 레인 7 : 사람 신장 cDNA

도 3은 상기 HepG2 세포로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 대량 얻어 아가로스 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이고,

레인 M : 표준 분자량 크기;

레인 1 : 증폭된 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자

도 4는 상기 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 포함하는 대장균 발현 벡터 pBGNT-5 의 제작 과정을 나타낸 것이고,

도 5는 상기 과정으로 제작한 발현 벡터 pBGNT-5 를 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 것이고,

레인 M : 표준 분자량 크기;

레인 1, 2, 3, 6 : 플라스미드 벡터 pBluescript SK+1 을 제한효소EcoRV 로 절단 (2.95 Kb);

레인 5 : 발현 벡터 pBGNT-5 를 제한효소EcoRV 로 절단 (4.3 및 0.9 Kb)

도 6은 대장균E. coliDHα 균주에서 발현된 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동하여 봉합체 형태의 효소의 정제 정도를 확인한 것이다.

(A) 레인 1 : 플라스미드 벡터 pBluescriptSK+1 만 발현;

레인 2 : 발현 벡터 pBGNT-5 를 IPTG 첨가하여 발현;

레인 3, 5, 6 : 발현 벡터 pBGNT-5 를 그대로 발현;

레인 4 : 발현 벡터 pBGNT-5 에 포도당 없이 IPTG 첨가하여 발현;

(B) 레인 1 : 정제된 효소 10μg; 레인 2 : 5μg; 레인 3 : 1μg

레인 M : 표준 단백질

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 간암 세포주로부터 분리한 새로운 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 제공한다. 구체적으로, 상기 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자는 서열 1 및 서열 2 의 염기 서열을 가지는 시발체를 이용하여 얻고, 서열 3 의 염기 서열을 가진다.

본 발명은 상기 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 낮게 유도함으로 막통과 영역을 포함하는 재조합 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대장균에서 봉합체 (inclusion body) 형태로 얻은 다음 우레아 및 β-메르캅토에탄올을 사용하여 환원, 투석, 재산화하는 과정으로 활성화된 형태의 효소를 정제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 일부 또는 전체를 포함하는 대장균 발현 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 막통과 영역을 포함하는 전체 유전자를 포함하는 대장균 발현 벡터 pBGNT-5 및 그의 대장균 형질전환체E. coliDH5α/pBGNT-5 (수탁번호 : KCTC 8862 P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 암을 임상적으로 진단하는 항체의 생산 및 암의 치료하는 특이적인 활성 저해제의 개발·탐색에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 간암 세포주로부터 얻은 새로운 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 제공한다.

우선 본 발명은 인간 간암 세포주 HepG2 로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 암호화하는 구조 유전자를 분리하기 위하여, 약간의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 정제하고 그의 아미노 말단 및 카복시 말단의 아미노산 서열을 결정한 다음 이를 기초로 하여 시발체를 디자인하고 이를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한다.

이 때 시발체로는 서열 1 의 염기 서열을 가지는 순방향 시발체 및 서열 2 의 염기 서열을 가지는 역방향 시발체를 이용하고, 주형으로는 인간 간암 세포주 HepG2 의 cDNA 를 이용한다. 그 외에도 HepG3b 의 cDNA 그리고 조직 재료인 사람 태아, 간, 뇌, 신장 등의 cDNA 를 이용하여 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 분리할 수 있다.

상기 과정으로 분리한 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 cDNA 유전자를 분석한 결과, 이는 2,223개 염기로 이루어진 서열 3 의 염기 서열을 가지고 이로부터 740개 아미노산으로 구성된 서열 4 의 아미노산 서열을 포함하는 효소를 코딩함을 확인하였다 (서열 목록 참조). 따라서, 간암 세포주로부터 분리한 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 기존에 보고된 사람 태아의 효소와 아미노산 서열은 동일하지만, 그 유전자 염기 서열에는 차이가 있음을 알 수 있었다 (Ihara, 등,J. Biochem., 113, 692-698, 1993).

또한, 본 발명은 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대장균에서 대량 생산하는 방법을 제공한다.

우선, 본 발명은 상기 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 대장균 발현 벡터를 제작한다.

구체적으로, 본 발명은 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 막통과 영역 (transmembrane domain)을 포함하는 전체 유전자를 발현할 수 있는 대장균 발현 벡터 pET-GNT5 를 플라스미드 벡터 pET-3a 를 이용하여 제작한다. 그러나 상기 발현 벡터를 이용하여 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대장균에서 발현시키면 소수성 아미노산으로 구성된 상기 효소의 막통과 영역이 함께 대량 생산되어 대장균이 사멸되는 유해 효과를 유발한다.

따라서, 본 발명은 외부 유전자가 발현되는 정도가 낮은 발현 플라스미드인 pBluescriptSK+1 를 이용하여 발현 벡터 pBGNT-5 를 제작한다.

상기 발현 벡터 pBGNT-5 를 대장균E. coliDH5α(DE3)에 형질전환시켜 얻은 형질전환체를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 12월 24일에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 8862 P).

본 발명은 상기 발현 벡터를 이용하여 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 막통과 영역을 포함하는 형태로 대장균에서 대량 생산한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 대장균 형질전환체를 배양하고 IPTG (isopropyl thiogalactoside) 등을 사용하여 재조합 효소의 발현을 유도시킨 다음 세포를 파쇄하고 원심분리 과정 등으로 봉합체 형태의 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 얻는다.

또한, 본 발명은 상기에서 얻은 봉합체를 변형된 마슨 (Marston) 등의 방법으로 정제한다. 구체적으로, 세포 침전물로부터 불용성 단백질을 제거하여 봉합체 형태의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 만을 얻은 다음 이를 요소 (urea) 용액에 녹여 β-메르캅토에탄올로 환원시키고 다시 트리스-염산 완충용액 등을 사용하여 투석, 재산화시키는 과정으로 활성형의 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 제조한다.

상기에서 얻은 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 기존의 방법 (김 등,Kor. J. Chitin ＆ Chitosan, 2, 27-39, 1997)으로 활성을 측정한 결과 표 1 에 나타난 바와 같이 탁월한 활성을 나타내었다.

따라서, 상기 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 암의 치료제 등으로 사용될 수 있는 특이적인 활성 저해제를 천연 생약제제 또는 한방제제로부터 선별, 탐색하고 이를 이용하여 선도 물질 (leader compound)을 고안하는데 유용하게 이용될 수 있다. 이외에도, 상기 효소는 막통과 영역을 그대로 포함한 상태로 대장균에서 대량 생산되므로 암을 효과적으로 진단하는 항체를 생산하는데 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 인간 간암 세포주 HepG2 로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 분리

인간 간암 세포주 HepG2 로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 암호화하는 구조 유전자를 분리하기 위하여, 우선 상기 유전자의 선별에 사용되는 DNA 탐침을 제조하였다. 구체적으로 HepG2 세포로부터 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 고압 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 사용하여 정제함으로 150μg 의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 얻어 그의 아미노 말단 및 카복시 말단의 아미노산 서열을 결정하였다. 상기에서 정제된 효소의 아미노 말단 아미노산 서열을 분석한 결과, 기존에 보고된 인간 태아의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 서열과 동일함을 확인하여 유전자 은행 뉴클레오타이드 서열 데이터 베이스 [GenBank Nucleotide Sequence Database (승인번호 D13789)]에 의거하여 시발체를 디자인하였다 (도 1참조).

상기 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 증폭하기 위하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하고, 이 때 시발체로는 정제된 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 아미노 말단과 카복시 말단의 아미노산 서열을 참조하여 합성한 올리고 뉴클레오타이드를 사용하며, PCR 기기로는 타카라 (Takara)사의 온도 순환기 480 (Thermocycler 480)을 사용하였다.

시발체로 서열 1 의 염기 서열을 가지는 순방향 시발체 GNN1 (attatct AGAGCC AAG GAC AGG TGA AGT TGC)과 서열 2 의 염기 서열을 가지는 역방향 시발체 GNN8 (attaggtac CTA TAG GCA GTC TTT GCA GAG AGC C)로 구성된 한 개조를 DNA 합성기 (Applied Biosystem 391 DNA Synthesizer, USA)를 사용하여 합성하였다. 서열 1 의 GNN1 시발체의 소문자 부분에는 제한효소XbaI 위치를, 서열 2 의 GNN8 시발체의 소문자 부분에는 제한효소KpnI 위치를 인공적으로 삽입하였다.

상기 과정으로 PCR 을 수행하여 인간 간암 세포주 HepG2 및 HepG3b 의 cDNA 그리고 조직 재료인 사람 태아 간 cDNA 등에 본 효소 유전자가 존재함을 PCR 로 확인하였다 (도 2참조). 암세포주 및 사람 조직으로부터 cDNA 라이브러리를 합성하고 파지용균액을 제조하는 과정은 합성 킷트 (Promega사 제품)를 사용하고, 마니아티스 (Maniatis) 등의 방법을 참조하였다 (Maniatis 등,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982).

구체적으로, 상기 간암 세포주 HepG2 의 cDNA 라이브러리로부터 분리한 DNA 20 ng 을 주형으로 하여 PCR 을 수행하였다 (Saiki 등,Science, 239, 487-491, 1988). 주형 DNA 20 ng 에 10× 반응완충용액 [500 mM KCl, 100 mM 트리스-염산 (pH 8.3), 15 mM MgCl₂, 0.1% 젤라틴] 5μl, dNTP 200μM, 시발체 각각 0.2μM,Taq폴리머라제 2.5 U 를 넣고 멸균된 증류수를 넣어 총 부피가 50μl가 되도록 하고, 미네랄 오일을 한 두 방울 넣은 다음, 94 ℃에서 40초, 52 ℃에서 40초, 72 ℃에서 1분씩 30회 반복하여 반응을 수행하였다. 이렇게 하여 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 cDNA 전영역인 2.2 kb (시발체 GNN1 및 GNN8)의 단편을 증폭시켰다. 중합효소 연쇄반응 산물은 1% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음, 진클린 (Geneclean) 키트 (Bio 101, USA)를 사용하여 겔로부터 분리하였다 (도 3참조).

상기 유전자 산물을 클로닝하기 위하여, 플라스미드 벡터 pBluescript SK(+) 10μg 을 제한효소XbaI 및KpnI 으로 이중절단하고 증폭된 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 DNA 단편을 상기 플라스미드 벡터 내의 제한효소XbaI 및KpnI 으로 2중 절단한 위치에 클로닝하여 플라스미드 벡터 pBGNT-5 를 제작하였다. 상기 플라스미드는 알칼리 용균방법으로 분리하였다 (Feliciello, Chinali,Anal. Biochem., 212, 394-401, 1993). 클로닝된 플라스미드를 50μl의 물에 녹이고 2μl 를 취하여 제한효소EcoRV 로 절단한 다음, 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 클론을 확인하였다. 확인된 클론은 시퀀케이즈 버전 2.0 (Sequencase ver. 2.0) 시퀀싱 키트 (USB, USA)를 사용하여 생거-디데옥시 (Sanger-dideoxy) 방법에 따라 염기 서열을 결정하였다 (Sanger, F. 등,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467, 1977). 그 결과, 기존에 발표된 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 cDNA 염기 서열과 거의 일치하였으나 일부분에서는 약간의 차이를 보였다. 구체적으로, 인체 간암 및 폐암에 특이적으로 존재하는 당전이효소 유전자의 염기 서열과 서열 3 에서 보는 바와 같이, 진하게 표시된 세 번째 코돈 등에서 차이가 발견되었고 그의 아미노산 서열에는 변화가 없었다. 따라서 상기 플라스미드 벡터에 삽입된 DNA 단편이 새로운 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자임을 확인하였다.

〈실시예 2〉 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 특이적 발현 확인

본 발명의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자가 암세포에서만 특이적으로 발현되는지를 중합효소 연쇄반응으로 확인하였다. 그 결과 상기 유전자가 사람의 정상조직에서는 발현되지 않으나, 간암 세포주인 HepG2 와 Hep3B 에서는 특이적으로 발현되며, 허파 (lung), 위암 (stomach), 대장암 (intestine), 자궁암 및 간암 (liver)의 초대조직 배양암 세포표면에 있는 당단백질 및 당지질의 당쇄구조 변화에 본 효소가 관여함을 알 수 있었다.

〈실시예 3〉 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 대장균 발현 벡터의 제작

전 영역의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대장균에서 생산할 수 있는 발현 벡터를 제작하기 위하여, 상기 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 기존의 발현 플라스미드 pET-3a 의 제한효소XbaI 및KpnI 위치에 클로닝하여 전체 길이 (full-length) 유전자를 포함하는 클론을 얻음으로 발현 벡터 pET-GNT5 를 제작하였다. 상기 발현 벡터는 대장균E. coliDH5α 균주에 형질전환하여 선별하였으며 그의 염기 서열을 부분적으로 결정하여 전사 해독틀 (reading frame)을 정확히 확인하였다. 그러나, 상기 발현 벡터 pET-GNT5 로부터 생산된 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 는 아미노 말단쪽 영역 (domain) 구조 중 소수성 아미노산으로 구성된 막통과 영역이 함께 대장균에서 발현되지만 이들 재조합 대장균이 사멸되는 유해 효과 (toxic effect)가 발생하여 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 대량 생산하는 것이 불가능하였다.

따라서 본 발명은도 4와 같이, 전 영역의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 발현시킴으로 대장균이 사멸되는 것을 방지하기 위하여, 외부 유전자가 발현되는 정도가 낮은 플라스미드 벡터인 pBluescriptSK+1 를 제한효소XbaI 및KpnI 으로 절단한 다음 그의XbaI 및KpnI 위치에 전체 길이 유전자를 삽입하여 발현 벡터 pBGNT-5 제작하였다. 상기 발현 벡터는 대장균E. coliDH5α에 형질전환하여 선별하였으며 그의 염기 서열을 부분적으로 결정하여 전사 해독틀을 정확히 확인하였다 (도 5참조). 상기 발현 벡터 pBGNT-5 를 제한효소EcoRV 로 절단하면 2개의 DNA 단편으로 분리되고, 이는E. coliDH5α에서 벡터 내의 프로모터 (promoter)의 하류로부터 재조합 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 발현시킨다.

〈실시예 4〉 대장균에서 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 발현 유도

본 발명은 대장균에서 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 발현을 유도하기 위하여, 발현 벡터 pBGNT-5 를E. coliDHα에 형질전환하고 하룻밤 배양한 다음 형질전환된E. coliDHα를 앰피실린 (ampicillin)이 100 ㎍/ml의 농도로 함유된 LB 배지 100 ml 에 1/100로 희석하여, A₆₀₀이 0.6 이 될 때까지 37℃에서 300 rpm 으로 진탕 배양하고 IPTG 를 0.4 mM 농도로 첨가하였다. IPTG 를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 다음 원심분리하여 균체를 회수하고 10 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5) 5 ml 에 현탁하여 -70 ℃에서 동결하였다. 이를 얼음 물에서 다시 해동하는 과정을 2회 반복하고 초음파기 [울트라소닉 호모게나이저, 콜-파머 인트루먼트사 (Ultrasonic Homogenizer, Cole-Parmer Instrument Co., U.S.A.)]로 1 분씩 3 회 초음파 파쇄한 다음 10,000 g 에서 20 분간 원심분리하여 세포질 분획과 불용성 단백질을 분리하였다.

플라스미드 벡터 pBluescriptSK+1 를 이용하면 Lac 프로모터에 의하여 β-갈락토시다제 리더 시그날 펩타이드 (β-galactosidase leader signal peptide)에 융합된 형태로 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자가 발현되며,E. coliBL21(DE3)는 lacUV5 프로모터의 조절을 받는 T7 RNA 폴리머라제 (polymerase) 유전자가 염색체에 존재하여 IPTG 에 의해 단백질의 발현이 유도된다.도 6은 최종농도 0.4 mM IPTG 용액으로 발현을 유도시켰을 때 단백질의 발현 양상을 나타내었다. 이 때 대조군으로 발현 플라스미드 pBluescriptSK+1 만을 형질전환한 대장균의 용균체와 발현 유도 전의 대장균의 용균체를 이용하였다. SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 10% 겔 농도에서 불용성 단백질을 5 ml의 10 mM 트리스-염산 (pH 7.5) 완충용액에 현탁하고, 이중 5μl 를 2× SDS-PAGE 시료 완충용액 [125 mM 트리스-염산 (pH 6.8), 4% SDS, 20% 글리세롤, 10 % 2-메르캅토에탄올, 0.2 % 브로모페놀 블루] 5μl와 섞고 세포질 분획 5μl도 2× SDS-PAGE 시료 완충용액 5μl와 섞어서 3분간 끓인 다음 20 mA 에서 수행하였다. 전기영동 후, 염색용액 [0.025 % 쿠마시 브릴리언트 블루 R 250, 40% 메탄올, 7% 초산]으로 하룻밤 염색한 다음 탈색용액 (10% 메탄올, 10% 초산)으로 탈색하였다. SDS-PAGE 전기영동은 램리 (Laemmli) 방법으로 실시하였으며, 분자량 표지로는 바이오-래드 (Bio-Rad)사 제품인 미오신 (200 kDa), 포스포릴라제 b (94 kDa), 소혈청 알부민 (67 kDa), 오브알부민 (45 kDa), 카르보닉 안히드로라제 (30 kDa), 시토크롬 C (12.5 kDa)를 사용하였다. 단백질 정량은 라우리 (Lowry) 등의 방법으로 소혈청 알부민을 표준물질로 사용하여 실시하였다. 발현된 단백질을 보다 명확하게 확인하기 위하여, 플라스미드 벡터만을 발현시킨 분획과 발현 유도하지 않은 분획을 함께 전기영동하여 그 양상을 비교하였다.

N-아세틸글루코사민 전이효소 V 은 대략 분자량 75,000 Da의 봉합체 (inclusion body) 형태로 발현되었다. 봉합체의 형성 과정은 명백히 이해되지는 않으나, 외래 단백질의 발현 수준이 급격히 높아짐으로 인해 단백질이 올바르게 폴딩 (folding)하지 못하고 RNA 와 복합체를 이루어 세포질 내에서 결정을 형성하는 것으로 생각되어지고 있다 (Studier, 등,Meth. Enzymol., 185, 60-89, 1990). 2% 트리톤 X-100 으로 대장균 유래의 단백질을 가용화하고 봉합체만을 회수하여 정제한 결과를도 6에 나타내었다. 대장균 400 ml 배양액으로부터 약 40 mg의 봉합체를 회수하였다.

〈실시예 5〉 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 봉합체 정제

상기 실시예에서 얻은 봉합체는 변형된 마슨 (Marston)등의 방법을 사용하여 정제하였다 (Marston 등,Bio/Technology, 2, 800-802, 1984). 전배양한 대장균을 앰피실린이 100μg/ml 로 함유된 LB 배지 400 ml에 1% 로 접종하여 37℃, 300 rpm으로 진탕배양하고 A₆₀₀이 0.6 이 되었을 때 IPTG 를 1 mM 되도록 넣어서 다시 3 시간 동안 배양하였다. 다음 배양액을 2,000 g로 10분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고, 회수한 균체는 젖은 무게 (wet weight) 1 g당 100 ml의 10 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)에 2 회 세척하였다. 다시 원심분리하여 균체를 회수하고 40 ml의 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)에 현탁시켜서 초음파 처리하여 15,000 g 에서 20 분간 원심분리한 다음 침전물을 회수하였다. 침전물을 30 ml의 50 mM 트리스-염산 (pH 7.5)에 현탁시키고, 10 % 트리톤 X-100 용액과 0.5 M EDTA 용액을 각각 2 % 와 10 mM이 되도록 넣은 다음, 실온에서 가끔씩 흔들어 주어 대장균의 불용성 단백질을 제거하고 15,000 g, 4 ℃ 에서 20 분간 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 침전물은 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5) 30 ml로 2 회 세척하고 4 ml의 50 mM 트리스-염산 완충용액 (pH 7.5)에 현탁하여 이중 10μl을 전기영동하여 밴드를 확인하였다.

봉합체의 형태로 생산된 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 융합단백질은 2 % 트리톤 X-100 으로 세척함으로 봉합체만을 정제하였다.

〈실시예 6〉 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 활성화

상기 실시예에서 정제한 봉합체 형태의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 정제효소 젖은 무게 10 mg 당 2 ml의 150 mM 트리스-염산 (pH 8.6), 8 M 요소 용액으로 녹인 다음 β-메르캅토에탄올 50μl를 첨가하여 환원시켰다. 다음 4℃에서 6시간 동안 150 mM 트리스-염산 용액 (pH 8.0) 5 L로 3 회 투석하여 재산화시킨 후, 1 L의 100 mM MES 완충용액 (pH 7.0)으로 6시간 동안 투석하여 활성을 검정하고 마지막으로 20 mM 인산 나트륨 (Sodium Phosphate, pH 6.0) 완충용액에서 2시간 동안 투석을 수행한 결과, 활성형의 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 가 얻어졌다 (표 1).

N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 활성 검정은 기존의 방법을 이용하여 (김 등,Kor. J. Chitin ＆ Chitosan, 2, 27-39, 1997) 기질로서 UDP-GlcNAc [시그마사 (Sigma Co., USA)와 피리딜아미노 (Pyridylamino ; PA) 형광표식 비안테너리 (biantennary) 올리고당인 GlcN,GlcN-biant-PA 및 GlcN(GlcN)GlcN-biant-PA 를 사용하였다. 반응은 120 mM MES 완충용액 (pH 7.0), 300 mM GlcNAc, 15 mM MnCl₂, 0.5% 트리톤 X-100, 50 mM 올리고당 GlcN,GlcN-biant-PA, 200 mM UDP-GlcNAc 그리고 정제효소 (0.5 -1.5μg 단백질) 100μl에서 12시간 동안 37℃에서 실시하였다. 반응은 100℃에서 5분 동안 끓여 정지시키고 반응생성물은 시마즈 (Shimadzu) HPLC 에 장착된 리크로소브 (Lichrosorb)-NH₂칼럼 (4 x 220 mm) (머크사 제품, Darmstadt)에 찌른 후, 0.2% n-부탄올 함유-0.1 M 아세테이트 완충용액 (pH 4.5)에서 유속 0.5 ml/분 조건에서 분석하였다. 검출은 PA-N-아세틸글루코사민 (PA-N-acetylglucosamine)을 검출하는 형광검출기를 이용하였으며 활성은 전이된N-아세틸글루코사민 pmol/h/mg로 하였다.

활성화된 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 의 활성 검정

기원	활성 (pmol/시간/mg)
봉합체	N.D (O)
처음 150 mM 트리스-염산 (pH 9.0) 완충용액에서	활성화 과정 중 투석1시간째	13.1
	2시간째	25.4
	4시간째	34.4
	6시간째	52.2
2번째 100 mM MES (pH 7.0) 완충용액에서	1시간째	54.5
	2시간째	73.1
	4시간째	78.3
	6시간째	90.8
3번째 20 mM 인산나트륨 (pH 6.0) 완충용액에서	2시간째	118.1

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 를 막통과 영역을 포함한 상태로 대장균에서 대량으로 발현시키고 이를 간단한 리폴딩 (refolding) 과정을 거쳐 활성화 형태로 정제함으로써, 본 발명의 효소는 다양한 암을 임상적으로 진단하는 항체를 생산하고 암의 치료제로 이용될 수 있는 특이적인 활성 저해제 또는 그의 선도 물질을 개발·탐색하는데 유용하다.

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 31

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

ATTATCTAGA GCCAAGGACA GGTGAAGTTG C

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 34

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

ATTAGGTACC TATAGGCAGT CTTTGCAGAG AGCC

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 3

서열의 길이 : 2421

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 유전자

1 CATCAGAATG GAAGTGAGGA AAGGCAACCA GCTGACACAG GAGCCAGAGT GAGACCAGCA

61 GACTCTCACA CTCAACCTAC ACCATGAATT TGTGTCTATC TTCTACGCGT TAAGAGCCAA

121 GGACAGGTGA AGTTGCCAGA GAGCAATGGC TCTCTTCACT CCGTGGAAGT TGTCCTCTCA

181 GAAGCTGGGC TTTTTCCTGG TGACTTTTGG CTTCATTTGG GGTATGATGC TTCTGCACTT

241 TACCATCCAG CAGCGAACTC AGCCTGAAAG CAGCTCCATG CTGCGCGAGC AGATCCTGGA

301 CCTCAGCAAA AGGTACATCA AGGCACTGGC AGAAGAAAAC AGGAATGTGG TGGATGGGCC

361 ATACGCTGGA GTCATGACAG CTTATGATCT GAAGAAAACC CTTGCTGTGT TATTAGATAA

421 CATTTTGCAG CGCATTGGCA AGTTGGAGTC GAAGGTGGAC AATCTTGTTG TCAATGGCAC

481 CGGAACAAAC TCAACCAACT CCACTACAGC TGTTCCCAGC TTGGTTGCAC TTGAGAAAAT

541 TAATGTGGCA GATATCATTA ACGGAGCTCA AGAAAAATGT GTATTGCCTC CTATGGACGG

601 CTACCCTCAC TGTGAGGGAA AGATCAAGTG GATGAAAGAC ATGTGGCGTT CAGATCCCTG

661 CTACGCAGAC TATGGAGTGG ATGGATCCAC CTGCTCTTTT TTTATTTACC TCAGTGAGGT

721 TGAAAATTGG TGTCCTCATT TACCTTGGAG AGCAAAAAAT CCCTACGAAG AAGCTGATCA

781 TAATTCATTG GCGGAAATTC GTACAGATTT TAATATTCTC TACAGTATGA TGAAAAAGCA

841 TGAAGAATTC CGGTGGATGA GACTACGGAT CCGGCGAATG GCTGACGCAT GGATCCAAGC

901 AATCAAGTCC CTGGCAGAAA AGCAGAACCT TGAAAAGAGA AAGCGGAAGA AAGTCCTCGT

961 TCACCTGGGA CTCCTGACCA AGGAATCTGG ATTTAAGATT GCAGAGACAG CTTTCAGTGG

1021 TGGCCCTCTT GGTGAATTAG TTCAATGGAG TGATTTAATT ACATCTCTGT ACTTACTGGG

1081 CCATGACATT AGGATTTCAG CTTCACTGGC TGAGCTCAAG GAAATCATGA AGAAGGTTGT

1141 AGGAAACCGA TCTGGCTGCC CAACTGTAGG AGACAGAATT GTTGAGCTCA TTTACATTGA

1201 TATTGTAGGA CTTGCTCAAT TCAAGAAAAC TCTTGGACCA TCCTGGGTTC ATTACCAGTG

1261 CATGCTCCGA GT G CT G GA T T C C TTTGG A AC A GAACC T GA G TT C AATCA C G CAAATTATGC

1321 CCAATCGAAA GGCCACAAGA CCCCTTGGGG AAAATGGAAT CTGAACCCTC AGCAGTTTTA

1381 TACCATGTTC CCTCATACCC CAGACAACAG CTTTCTGGGG TTTGTGGTTG AGCAGCACCT

1441 GAACTCCAGT GATATCCACC ACATTAATGA AATCAAAAGG CAGAACCAGT CCCTTGTGTA

1501 TGGCAAAGTG GATAGCTTCT GGAAGAATAA GAAGATCTAC TTGGACATTA TTCACACATA

1561 CATGGAAGTG CATGCAACTG TTTATGGCTC CAGCACAAAG AATATTCCCA GTTACGTGAA

1621 AAACCATGGT ATCCTCAGTG GACGGGACCT GCAGTTCCTT CTTCGAGAAA CCAAGTTGTT

1681 TGTTGGACTT GGGTTCCCTT ACGAGGGCCC AGCTCCCCTG GAAGCTATCG CAAATGGATG

1741 TGCTTTTCTG AATCCCAAGT TCAACCCACC CAAAAGCAGC AAAAACACAG ACTT C TTCAT

1801 TGGCAAGCCA AC A CTGAGAG AGCT C ACATC CCAGCATCCT TACGCTGAAG TTTTCATCGG

1861 GCGGCCACAT GTGTGGACTG TTGACCTCAA CAATCAGGAG GAAGTAGAGG ATGCAGTGAA

1921 AGC C AT C TTA AA C CAGAAGA TTGAGCCATA CATGCCATAT GAATTTACGT GCGAGGGGAT

1981 GCTACAGAGA ATCAATGCTT TCATTGAAAA ACAGGACTTC TGCCATGGGC AAGTGATGTG

2041 GCCACCCCTC AGCGCCCTAC AGGTCAAGCT TGCTGAGCCC GGGCAGTCCT GCAAGCAGGT

2101 GTGCCAGGAG AGCCAGCTCA TCTGCGAGCC TTCTTTCTTC CAGCACCTCA ACAAGGACAA

2161 GGACATGCTG AAGTACAAGG TGACCTGCCA AAGCTCAGAG CTGGCCAAGG ACATCCTGGT

2221 GCCCTCCTTT GACCCTAAGA ATAAGCACTG TGTGTTTCAA GGTGACCTCC TGCTCTTCAG

2281 CTGTGCAGGC GCCCACCCCA GGCACCAGAG GGTCTGCCCC TGCCGGGACT TCATCAAGGG

2341 CCAGGTGGCT CTCTGCAAAG ACTGCCTATA GCAGCTACCT GCTCAGCCCT GCACCATGCT

2401 GCTGGGGAAG ACAGTGGCCC C 2421

〔서 열 목 록〕

서열번호 : 4

서열의 길이 : 740

서열의 형 : 아미노산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 효소 단백질

16 M A L F T P W K L S S Q K L G F

32 F L V T F G F I W G M M L L H F

48 T I Q Q R T Q P E S S S M L R E

64 Q I L D L S K R Y I K A L A E E

80 N R N V V D G P Y A G V M T A Y

96 D L K K T L A V L L D N I L Q R

112 I G K L E S K V D N L V V N G T

128 G T N S T N S T T A V P S L V A

144 L E K I N V A D I I N G A Q E K

160 C V L P P M D G Y P H C E G K I

176 K W M K D M W R S D P C Y A D Y

192 G V D G S T C S F F I Y L S E V

208 E N W C P H L P W R A K N P Y E

224 E A D H N S L A E I R T D F N I

240 L Y S M M K K H E E F R W M R L

256 R I R R M A D A W I Q A I K S L

272 A E K Q N L E K R K R K K V L V

288 H L G L L T K E S G F K I A E T

304 A F S G G P L G E L V Q W S D L

320 I T S L Y L L G H D I R I S A S

336 L A E L K E I M K K V V G N R S

352 G C P T V G D R I V E L I Y I D

368 I V G L A Q F K K T L G P S W V

384 H Y Q C M L R V L D S F G T E P

400 E F N H A N Y A Q S K G H K T P

416 W G K W N L N P Q Q F Y T M F P

432 H T P D N S F L G F V V E Q H L

448 N S S D I H H I N E I K R Q N Q

464 S L V Y G K V D S F W K N K K I

480 Y L D I I H T Y M E V H A T V Y

496 G S S T K N I P S Y V K N H G I

512 L S G R D L Q F L L R E T K L F

528 V G L G F P Y E G P A P L E A I

544 A N G C A F L N P K F N P P K S

560 S K N T D F F I G K P T L R E L

576 T S Q H P A E V F I G R P H V W

592 T V D L N N Q E E V E D A V K A

608 I L N Q K I E P Y M P Y E F T C

624 E G M L Q R I N A F I E K Q D F

640 C H G Q V M W P P L S A L Q V K

656 L A E P G Q S C K Q V C Q E S Q

672 L I C E P S F F Q H L N K D K D

688 M L K Y K V T C Q S S E L A K D

704 I L V P S F D P K N K H C V F Q

720 G D L L L F S C A G A H P R H Q

736 R V C P C R D F I K G Q V A L C

740 K D C L

Claims (6)

1. 인간 간암 세포주로부터 분리한 것으로, 서열 3의 염기 서열을 가지는 새로운 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자.
2. 제1항의 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전환제를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 낮게 유도함으로 막통과 영역(transmembrane domain)을 포함하는 재조합 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V를 얻는 제조 방법.
3. 제2항에 있어서, 재조합 인간 V-아세틸글루코사민 전이효소 V를 대장균에서 봉합체(inclusion body) 형태로 얻은 다음 우레아 및 β-메르캅토에탄올을 사용하여 환원, 투석, 재산화하는 과정으로 활성화된 형태의 효소를 정제하는 것을 특징으로 하는 재조합 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V의 제조 방법.
4. 제1항의 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 대장균 발현 벡터.
5. 제4항에 있어서, 인간 N-아세틸글루코사민 전이효소 V 유전자는 막통과 영역을 포함하는 전체 유전자인 것을 특징으로 하는 대장균 발현 벡터 pBGNT-5.
6. 제5항의 발현 벡터 pBGNT-5 로 대장균 DH5균주를 형질전화시킨 형질전환체 E. coli DH/pBGNT-5(수탁번호 : KCTC 8862 P).