JPWO2002068661A1 - β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する融合タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩタンパク質との融合タンパク質及び該タンパク質を大腸菌体内で製造する方法を提供する。

Description

技術分野
本発明は、糖タンパク質プロセッシング酵素の一種である、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを、安価に効率よく生産する方法に関する。詳細には、マルトース結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩタンパク質との融合タンパク質及び該タンパク質を大腸菌体内で製造する方法に関する。さらに、本発明は糖タンパク質糖鎖に付加している糖鎖構造の改変に関する。
背景技術
種々の単糖がグリコシド結合により連結した糖鎖は、細胞において、細胞内オルガネラ成分、細胞表層成分、分泌糖タンパク質などとして存在している。これら糖鎖の構造は生物種や組織特異的に異なっているだけでなく、同一生物種や同一組織内でもその発生時期や疾病等によっても異なる。従って、糖鎖は従来考えられていたタンパク質の熱安定性、親水性、電荷、プロテアーゼ耐性等のタンパク質に対する物理的性質の付与といった機能の他に、発生・分化、神経系、免疫系、ガンの転移等の細胞間認識に糖鎖が関与していることが明らかになり、医薬品等の種々の分野への応用という点から近年非常に注目されるようになった。
これら糖鎖は、生体内においては糖転移酵素によって合成されている。糖転移酵素は、糖ヌクレオチドを糖供与体として、受容体となる糖鎖に糖を転移し、糖鎖伸長を行う酵素である。また、その糖受容体の糖鎖構造に対する特異性は厳密であり、通常、１つのグリコシド結合は対応する１つの糖転移酵素によって形成されると言われている。これら糖転移酵素は糖鎖研究、特に有用糖鎖の簡便な合成、天然の糖鎖の修飾に利用されるという点で重要な酵素である。しかしながら、天然に存在する糖転移酵素の量は、極僅かであり大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（以下、ＧｎＴＩＩと略称する場合もある。）は、糖タンパク質の複合型糖鎖の形成に関与する重要な酵素であり、少なくともＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、糖受容体であるＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲにＧｌｃＮＡｃをβ１−２結合で転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生じる作用を有する酵素である（但し、Ｒはアスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）。該酵素は、複合型糖鎖形成のＫｅｙ酵素という理由から、安定した供給が望まれていた。
この、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩは、各種動物の臓器から分離精製されている。しかし、大量且つ安定した臓器の入手は困難であり、かつ単一のタンパク質にまで精製しようとすると非常に手間がかかることから、遺伝子組換えによる生産が期待されている。
該酵素をコードするｃＤＮＡは、各種生体試料より単離されている。例えば、ヒト由来β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩは、白血球からＴａｎ ｅｔ ａｌ．によって単離されており［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１：３１７−３２８（１９９５）］。また植物では、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからＳｔｒａｓｓｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．によって単離されている［Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１６：７８７−７９１（２０００）］。
組換えタンパク質の大量生産には、コスト的な点を考慮すれば、細菌や酵母などの微生物で該タンパク質を発現させる方法が有利である。しかしながら、微生物の発現系では、発現したタンパク質の多くが不溶性の封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）として存在することがあり、精製に先立って可溶化・再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）の工程を必要とするので、効率的とは言えなかった。さらに、一部可溶性タンパク質として発現した酵素についても、それを高純度で得るためには、各種クロマトグラフィー処理を含む多くの精製工程が必要であり、多大な時間およびコストがかかるために、商業生産用の発現系としては十分ではなかった。
一方、目的とする遺伝子を大量に発現させ、かつ、発現産物の精製を容易にする方法として、目的タンパク質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やプロテインＡなどとの融合タンパク質として発現させる方法がある。該方法では、ＧＳＴとの融合タンパク質は、グルタチオンをリガンドとするアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、また、プロテインＡとの融合タンパク質はＩｇＧをリガンドとするアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、それぞれ容易に精製することができる。しかしながら、この方法を用いた場合、前記と同様に封入体を生成する可能性が高い。この様な理由からβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを大量且つ安定に供給することは事実上困難であった。
また、上記のように高等生物のタンパク質の多くは糖タンパク質として存在しており、その糖鎖構造は細胞間の認識や生体内物質の吸収、分解などの代謝速度に深く関与している。それ故、例えば動物由来の生理活性タンパク質をコードする遺伝子を酵母や植物を宿主として発現生産させた場合、得られる糖タンパク質の糖鎖構造は元の動物由来のものとは異なるため、生理活性が低下したり（場合によっては無くなったり）、代謝速度が速くなってしまったりすることがしばしばある。もし、この異なってしまった糖鎖を元の動物の糖鎖に改変できる方法があれば、非常に有用である。また、もともと結合していた糖鎖とは異なる糖鎖に改変することにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つことが期待される。発現させる宿主を変更したり、糖転移酵素遺伝子を導入することにより宿主を改変することにより、発現させるタンパク質に結合する糖鎖は変わるが、必ずしも望むものにかわるとは限らず、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた糖タンパク質の糖鎖を改変できる方が望ましい。そのような方法として、エンドグリコシダーゼの糖転移反応を利用した方法がいくつか開示されている（例えば、特開平５−６４５９４号公報）。しかしながら、エンドグリコシダーゼの糖転移反応は糖受容体に対する収率が一般に低く、効率よく糖鎖を改変できない。別の方法としては、エキソグリコシダーゼと糖転移酵素を用いる方法があるが（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９１：７５−７３（１９９０））、せいぜい非還元末端の糖残基を改変する程度であり、本格的な糖鎖の改変とはいえない。また、エンドグリコシダーゼと糖転移酵素を用いる方法もある（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２１１４−２１１８（１９９７））。ここでは、エンドグリコシダーゼで加水分解した後、蛋白質上に残ったＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端に糖転移酵素により糖鎖を伸長させ、シアリルルイスＸ４糖が結合した糖蛋白質へ改変しているが、結合している糖鎖は糖蛋白質糖鎖の非還元末端部分であり、糖鎖全体を改変するという点では不十分である。これまでのエキソあるいはエンドグリコシダーゼと糖転移酵素を用いる糖鎖改変方法が十分ではない理由の一つとして、変換のＫｅｙ酵素となるβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの大量且つ安定な供給が困難であったことが挙げられる。
したがって、本発明の目的は、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質を、安価に且つ効率的に提供することを目的とする。
さらに、本発明は糖タンパク質糖鎖に付加している糖鎖構造の改変を目的とする。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、遺伝子操作によりβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを、マルトース結合タンパク質（以下、ＭＢＰと略称する場合もある）等の糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させると、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを可溶性タンパク質として得ることができ、また、該タンパク質は糖結合タンパク質の特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製でき、得られた融合タンパク質がβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性（以下、ＧｎＴＩＩ活性ということがある。）を有することを見出した。
さらに、本発明者らは、糖結合タンパク質とＧｎＴＩＩとの融合部位の配列を特異的に切断するプロテアーゼにより、該融合タンパク質からＧｎＴＩＩも取得できることを見出した。
また、発明者らは大量且つ安定供給が可能になったＧｎＴＩＩを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの糖タンパク質糖鎖の変換が可能であることを見出した。
さらに、固定化酵素を用いてこのような糖タンパク質糖鎖の変換が可能であることも見出した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
１．糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとの組換え融合タンパク質（糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩ）。
２．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩがヒト由来である、項１に記載の融合タンパク質。
３．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｂ）上記（ａ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質
である項１に記載の融合タンパク質。
４．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４４７で示されるアミノ酸配列を含む、項３に記載のタンパク質。
５．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
６．糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとの間にプロテアーゼ認識配列を含有する項１に記載の融合タンパク質。
７．糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である項１に記載の融合タンパク質。
８．項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
９．項８のＤＮＡを含む発現ベクター。
１０．項９の発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
１１．以下の工程：
（１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡとβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
（２）得られる形質転換体を培養して、糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとの融合タンパク質を生成させ、
（３）得られる培養物から、該融合タンパク質を分離すること、
を含む糖結合タンパク質−β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ融合タンパク質の製造方法。
１２．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩがヒト由来である項１１記載の方法。
１３．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４４７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む項１２記載の方法。
１４．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号８５〜１３４１で示される塩基配列を含む項１２記載の方法。
１５．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩碁配列を含む項１１に記載の方法。
１６．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む項１１に記載の方法。
１７．糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である項１１に記載の方法。
１８．マルトース結合タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する項１７に記載の方法。
１９．（３）得られる培養物から、２価金属イオンの存在下、該融合タンパク質を分離する、項１１に記載の方法。
２０．２価金属がマンガン（Ｍｎ^２＋）である項１９記載の方法。
２１．項１１〜２０のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを採取する工程を含む、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの製造方法。
２２．糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去することを特徴とする項２１記載の方法。
２３．プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である項２２記載の方法。
２４．以下の工程１〜工程４を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
（工程１）糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる；
（工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
（工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にα−マンノシダーゼを作用させる。
（工程４）上記（工程３）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
２５．工程４の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項２４に記載の方法。
２６．糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項２５に記載の方法。
２７．糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項２５に記載の方法。
２８．糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼ、及びマンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項２４に記載の方法。
２９．糖加水分解酵素がα−マンノシダーゼである項２８に記載の方法。
３０．糖加水分解酵素がα１，２−マンノシダーゼである項２９に記載の方法。
３１．α−マンノシダーゼがα−マンノシダーゼＩＩである項２４に記載の方法。
３２．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである項２４に記載の方法。
３３．糖加水分解酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、αマンノシダーゼ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項２４に記載の方法。
３４．糖タンパク質が天然由来のものである項２４に記載の方法。
３５．糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項２４に記載の方法。
３６．以下の工程１〜工程３を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
（工程１）糖タンパク質上の糖鎖構造の全てあるいは一部がβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの基質となる構造を有している糖タンパク質に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
（工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にα−マンノシダーゼを作用させる；及び
（工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
３７．工程３の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項３６に記載の方法。
３８．糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項３７に記載の方法。
３９．糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項３７又は３８に記載の方法。
４０．α−マンノシダーゼがα−マンノシダーゼＩＩである項３６に記載の方法。
４１．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである項３６に記載の方法。
４２．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、αマンノシダーゼ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項３６〜４１のいずれかに記載の方法。
４３．糖タンパク質が天然由来のものである項３６に記載の方法。
４４．糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項３６に記載の方法。
４５．以下の工程１〜工程３を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
（工程１）糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。
（工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
（工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
４６．工程３の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項４５に記載の方法。
４７．糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項４５に記載の方法。
４８．糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項４６に記載の方法。
４９．糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼ、及びマンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項４５に記載の方法。
５０．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである項４５に記載の方法。
５１．糖加水分解酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項４５に記載の方法。
５２．糖タンパク質が天然由来のものである項４５に記載の方法。
５３．糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項４５に記載の方法。
５４．以下の工程１〜工程２を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
（工程１）混成型糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。
（工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
５５．工程２の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする項５４に記載の方法。
５６．糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項５５に記載の方法。
５７．糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項５５に記載の方法。
５８．糖加水分解酵素が、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、及びβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項５４に記載の方法。
５９．β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである項５４に記載の方法。
６０．糖加水分解酵素、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である項５４に記載の方法。
６１．糖タンパク質が天然由来のものである項５４に記載の方法。
６２．糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項５４に記載の方法。
６３．以下の工程１〜工程３を含む糖タンパク質上の糖鎖を混成型糖鎖に変換する方法であって、使用する糖加水分解酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、及びβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である方法：
（工程１）糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。
（工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
（工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−Ｇａｌとともにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを作用させる。
６４．工程３の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする糖タンパク質上の糖鎖を混成型糖鎖に変換する項６３に記載の方法。
６５．糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項６４に記載の方法。
６６．糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である項６４に記載の方法。
６７．糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、及びα−マンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである項６３に記載の方法。
６８．α−マンノシダーゼがα１，２−マンノシダーゼである項６３に記載の方法。
６９．糖タンパク質が天然由来のものである項６３に記載の方法。
７０．糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである項６３〜６８のいずれかに記載の方法。
発明の詳細な説明
本発明は、ＧｎＴＩＩ活性を有するタンパク質を、ＧｎＴＩＩと糖結合タンパク質との融合タンパク質としたこと、該融合タンパク質は可溶化タンパクであることを特徴とするものである。
さらに、本発明は、ＧｎＴＩＩを糖結合タンパク質との融合タンパク質として大腸菌で発現させることにより、ＧｎＴＩＩを可溶性融合タンパク質として生成させるのを可能にしたこと、並びに糖結合タンパク質の有する特異的親和性を利用して融合タンパク質及びＧｎＴＩＩを容易且つ大量に精製するのを可能にしたことを特徴とする。
さらに、本発明は糖蛋白質の糖鎖を糖加水分解酵素および糖転移酵素を用いることにより変換を可能にしたことを特徴とする。
本発明の融合タンパク質
本発明において、ＭＢＰなどの糖結合タンパク質とＧｎＴＩＩとの融合タンパク質（以下、マルトース結合タンパク質との融合タンパク質の場合には、「ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩ」と省略する場合もある）は、糖結合タンパク質の有する特異的親和性、すなわちＭＢＰの場合にはマルトース並びにマルトース残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持し、且つＧｎＴＩＩが有する酵素活性、すなわちＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、糖受容体であるＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ（但し、Ｒはアスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）にＧｌｃＮＡｃをβ１−２結合で転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する活性を保持する限り、いかなる形態のものであってもよい。更に、式１に示すごとく、少なくとも糖結合タンパク質部分を除去した後に得られるＧｎＴＩＩが本来の酵素活性、すなわちＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、糖受容体であるＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲにＧｌｃＮＡｃをβ１−２結合で転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生成する活性を保持するものがよい。

好ましくは、該融合タンパク質は、糖結合タンパク質のＣ末端側にＧｎＴＩＩが連結されたものであり、特に好ましくは糖結合タンパク質とＧｎＴＩＩが融合部位において、酵素学的または化学的手段により容易に切断され得る構造を有するものである。
糖結合タンパク質とは、単糖類並びに糖残基を有する少糖類および多糖類に対する高親和性を保持するタンパク質であって、例えば、各種レクチン、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質などが例示できる。好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質、キチン結合タンパク質等であり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質（以下ＭＢＰと省略することがある。）である。
糖結合タンパク質は、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
また、該ＭＢＰは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有する限り、必ずしも全配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。公知のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する部位を有するタンパク質が例示できる。
本発明においては、ＭＢＰをコードする遺伝子としてｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２（共にＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に由来するものを使用することができる。
本発明の糖結合タンパク質は、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、トロンビン、レニン等が挙げられるが、好ましくは、該プロテアーゼ認識配列は第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩの精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
また、より好ましい態様においては、糖結合タンパク質は、糖結合タンパク部位とプロテアーゼ認識部位の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＧｎＴＩＩから遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。本発明の場合には、配列番号９のスペーサー配列を含むｐＭＡＬ−ｐ２或いはｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。
ＧｎＴＩＩも、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、ＧｎＴＩＩは、ＧｎＴＩＩ活性を保持する限りＧｎＴＩＩ全長配列を含む必要はなく、該配列の一部を含むものであってもよい。例えば、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質や（ｂ）上記（ａ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質であってもよい。
特に、ＧｎＴＩＩはゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメイン領域の全部又は一部を除いたＧｎＴＩＩを使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも２９〜４４７で示されるアミノ酸配列を含んでいることが好ましい。
また、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも２９〜４４７で示されるアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質であってもよい。
本発明の融合タンパク質の製造方法
本発明において、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩは、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡとＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡを、結果的に上記性質を有する融合タンパク質として転写・翻訳されるように−すなわちインフレームに（ｉｎｆｒａｍｅ）−連結したキメラＤＮＡを含む発現ベクターで大腸菌を形質転換し、得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより取得される。
本発明において、ＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来である。さらに、本発明において、ＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡは、その転写翻訳産物がＧｎＴＩＩ活性を保持する限りＧｎＴＩＩ遺伝子の全コード領域を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。特に、ＧｎＴＩＩはゴルジ装置に存在する膜貫通タンパク質であるので、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩを可溶性タンパク質として生成させることを考慮すれば、疎水性の高い膜貫通ドメインをコードする領域を除いたＧｎＴＩＩコード配列を使用することも、本発明の好ましい実施態様の１つである。
ＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡは、公知のＧｎＴＩＩ遺伝子配列［例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１：３１７−３２８（１９９５）］の配列等に基づいて、公知のいかなる手法によっても調製することができる。例えば、公知のＧｎＴＩＩ遺伝子配列をもとに、ＧｎＴＩＩのコード領域の全部または一部をカバーする適当なオリゴヌクレオチドプライマー対を合成し、ＧｎＴＩＩを発現する細胞または組織から抽出した全ＲＮＡもしくはポリＡ^（＋）ＲＮＡ或いは染色体ＤＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲ又はＰＣＲを行うことによりクローニングすることができる。このとき、その後のベクターへのクローニングを容易にするために、用いるオリゴプライマーの末端に適当な制限酵素認識配列を付加することもできる。
あるいは、公知のＧｎＴＩＩ遺伝子配列をもとに適当なオリゴヌクレオチドプローブを合成し、これを用いてＧｎＴＩＩを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーをプラーク（またはコロニー）ハイブリダイゼーションによりスクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
さらに、ＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡは、部分または完全精製されたＧｎＴＩＩの全部または一部を抗原として常法により抗体を作製し、これを用いてＧｎＴＩＩを発現する細胞または組織から常法により調製したｃＤＮＡライブラリーを抗体スクリーニングすることによってもクローニングすることができる。
あるいは、当該ＤＮＡは、公知のＧｎＴＩＩ遺伝子配列をもとにＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて、センス鎖の部分配列とアンチセンス鎖の部分配列を一部がオーバーラップするように合成し、ＰＣＲ法によってより長い部分配列を二本鎖ＤＮＡとして得るという操作を繰り返すことによって、所望のＤＮＡ配列を得ることもできる。
本発明の好ましい態様においては、当該ＤＮＡはヒト由来β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（以下、ｈＧｎＴＩＩと省略する場合もある）をコードするＤＮＡの全部または一部を含むものである。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４４７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号８５〜１３４１で示される塩基配列を含むＤＮＡである。あるいは、ｈＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡは、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列、好ましくは該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸配列をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含むＤＮＡである。ｈＧｎＴＩＩの膜貫通ドメインは、疎水性プロット分析の結果から、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、アミノ酸番号１０〜２８で示される部分であると推定されている。したがって、該ドメインをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列中、塩基番号２８〜８４で示される塩基配列である。
もちろん、ｈＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の全部をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、好ましくは配列番号１に示される塩基配列の全部を含むＤＮＡであってもよい。
本発明において、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、上述の各種タンパク質をコードするＤＮＡが例示され、好ましくは、マルトース結合タンパク質、セルロース結合タンパク質またはキチン結合タンパク質をコードするＤＮＡであり、より好ましくは、マルトース結合タンパク質をコードするＤＮＡである。
また、該ＤＮＡは、いかなる生物種由来のものであってもよいが、好ましくは細菌などの原核生物由来であり、より好ましくは大腸菌由来である。
また、該ＭＢＰをコードするＤＮＡは、マルトースまたはマルトース残基を有する少糖類（例えば、マルトトリオース等）もしくは多糖類（例えば、アミロース等）に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。同様に、糖結合蛋白質は、結合する糖に対して特異的親和性を有する翻訳産物をコードする限り、必ずしもコード領域の全部を含む必要はなく、該コード領域の一部を含むものであってもよい。
大腸菌由来のＭＢＰは、ペリプラズムに存在する分泌タンパク質であり、初期翻訳産物はそのＮ末端にシグナルペプチドを含む。本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、宿主大腸菌で機能し得るシグナルペプチドをコードする塩基配列（シグナルコドン）を含むものであってもよいし、含まないものであってもよい。大腸菌は細胞壁の外側に外膜を有するグラム陰性菌であるから、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを含む場合であっても、発現したＭＢＰ−ＧｎＴＩＩが培地中にまで分泌される可能性は低い。しかしながら、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩがペリプラズム空間に蓄積すれば、菌体を完全に破砕せずにスフェロプラスト化することにより該融合タンパク質を回収することができるので、その後の精製をより容易に行うことができる。但し、この場合には、特にＧｎＴＩＩの膜貫通ドメインを削除しておくことが好ましい。該ドメインが存在すると、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩはペリプラズム空間に到達せずに内膜にとどまる可能性があり、該融合タンパク質の回収が煩雑になるからである。
本発明のＭＢＰをコードするＤＮＡは、該タンパク質のＣ末端側に配列特異性の高いプロテアーゼによって認識され切断されるアミノ酸配列（プロテアーゼ認識配列）をコードする塩基配列を含むことが特に好ましい。そのようなプロテアーゼとしては、第Ｘａ因子、トロンビン、レニン等が挙げられる。該プロテアーゼ認識配列は、好ましくは第Ｘａ因子認識配列、すなわち、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号３）である。このようなプロテアーゼ認識配列を糖結合タンパク質のＣ末端側に導入することにより、例えば、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩの精製後に該プロテアーゼを作用させて、ＭＢＰ部分を容易に除去することができる。
より好ましい態様においては、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡは、糖結合タンパク質コード領域とプロテアーゼ認識部位の間、または糖結合タンパク質コード領域とＧｎＴＩＩコード領域の間に５〜１５アミノ酸残基程度のスペーサー配列をコードする塩基配列を含む。該スペーサー配列の存在により、糖結合タンパク質はＧｎＴＩＩから遠ざかるために融合タンパク質の分子内相互作用の可能性が減じ、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩ融合タンパク質の場合、ＭＢＰ部分のマルトースやアミロースに対する特異的親和性が増大する。
ＭＢＰをコードするＤＮＡは、公知のＭＢＰ遺伝子配列［例えば、大腸菌由来ＭＢＰ（Ｄｕｐｌａｙ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：１０６０６−１０６１３（１９８４））等］をもとに、ＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡについて例示したと同様の自体公知の手段を用いてクローニングすることができ、また、常法によりＭＢＰのＣ末端側に上記のプロテアーゼ認織配列および／またはスペーサー配列を導入することができる。本発明の好ましい実施態様の場合には、配列番号８のスペーサー配列を含む。
また、大腸菌由来ＭＢＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製のｐＭＡＬ−ｐ２（シグナルコドンを含む）あるいはｐＭＡＬ−ｃ２（シグナルコドンを欠失する）のような市販のベクターから得ることができる。
糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡの構築を容易にするために、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡの末端に、常法により適当な制限酵素認識部位を付加することができる。ＧｎＴＩＩをコードするＤＮＡをベクター中にクローニングする際に、ＧｎＴＩＩのＮ未端側に制限酵素認識部位を付加した場合は、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡにも同じ制限酵素認識部位（もしくは同じ粘着末端を生じる別の制限酵素認識部位）を導入すればよい。
本発明の発現ベクターは、上記の糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩをコードするキメラＤＮＡが、大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下におかれた、任意の発現ベクターである。該プロモーター領域には、ＲＮＡポリメラーゼの結合位置を決定するコンセンサス配列である−３５領域および−１０領域が含まれる。所望の組換えタンパク質を大量に発現させる系として、誘導酵素のプロモーター領域を使用することがより望ましい。このようなプロモーター領域としてｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーター領域は、リプレッサータンパク質が結合するオペレーターをさらに含む。誘導物質（例えば、ｌａｃプロモーターではラクトースやＩＰＴＧ）を添加するとリプレッサータンパク質のオペレーターへの結合が抑制され、プロモーターの制御下におかれた遺伝子が大量に発現する。また、該発現ベクターは、翻訳開始コドンの上流にコンセンサスなＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含む。さらに、該発現ベクターは、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩをコードするキメラＤＮＡの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。ターミネーター領域としては、通常使用されている天然または合成のターミネーターを用いることができる。本発明の発現ベクターは、上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主大腸菌内で自律複製し得る複製起点を含む必要がある。このような複製起点としては、ＣｏｌＥ１ｏｒｉ、Ｍ１３ｏｒｉ等が挙げられる。
本発明の発現ベクターは、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子をさらに含有していることが好ましい。選択マーカー遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。また、宿主大腸菌が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカー遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターで宿主大腸菌を形質転換することにより調製することができる。宿主の菌株は特に限定されず、例えば、市販のＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＢＬ−２１株、ＪＭ１０７株、ＴＢ１株、ＪＭ１０９株、Ｃ６００株、ＤＨ５α株、ＨＢ１０１株等が挙げられる。
発現ベクターの宿主細胞への導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩは、上記の糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩをコードするキメラＤＮＡを含む発現ベクターを発現する形質転換体を、適当な培地中で培養し、得られる培養物から糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩを回収することにより得ることができる。
用いられる培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものである。また無機もしくは有機窒素源（例えば硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，カゼインの加水分解物，酵母抽出物，ポリペプトン，パクトトリプトン，ビーフ抽出物等）を含んでいてもよい。これらの炭素源および窒素源は、純粋な形で使用する必要はなく、純度の低いものも微量の生育因子や無機栄養素を豊富に含んでいるので有利である。さらに所望により、他の栄養源［例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム，リン酸水素二カリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウム，塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン，カナマイシン）など］を培地中に添加してもよい。
形質転換体の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５、好適にはｐＨ６〜８、通常１８〜４０℃、好適には２０〜３５℃で、１〜１５０時間行われるが、これらは培養条件および培養規模によって適宜変更することができる。
培養を大型タンク内で行う場合は、目的タンパク質の生産工程における生育遅延を回避するために、菌体を少量の培地に接種して１〜２４時間前培養した後、得られた培養物を大型タンク中に接種するのが好ましい。
糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩの発現が、誘導タンパク質遺伝子のプロモーター系によって制御される場合、誘導物質は培養開始時から添加しておいてもよいが、対数増殖期初期に添加するのがより好ましい。菌の増殖は、培養液の６６０ｎｍにおける吸光度を測定することによってモニタリングできる。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用する場合、６６０ｎｍにおける吸光度が０．４〜０．６になった時点で、誘導物質としてイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（以下、ＩＰＴＧと省略する場合もある）を、例えば０．１〜１．０ｍＭとなるように添加することができる。誘導物質の添加時期や添加速度は、培養条件、培養規模、誘導物質の種類等によって適宜変更することができる。
本発明の方法では、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩの精製は、該融合タンパク質の存在する画分を、その糖結合タンパク質と特異的に結合する各種糖残基を含むリガンドを結合した不溶性担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーに付すことにより、一段階で達成することができる。
例えば、糖結合タンパク質がＭＢＰの場合、ＭＢＰをコードするＤＮＡが、シグナルコドンを欠失している場合、ＭＢＰ−ＧｎＴＩＩは菌体の可溶性画分に局在するので、その場合、培養終了後に培養物を濾過もしくは遠心分離して菌体を回収し、リゾチーム処理および界面活性剤処理、超音波処理、あるいは浸透圧ショック等によって細胞を破砕して、得られる菌体抽出液をアフィニティクロマトグラフィーに供することができる。
一方、ＭＢＰをコードするＤＮＡがシグナルコドンを有する場合、発現したＭＢＰ−ＧｎＴＩＩは分泌されてペリプラズム空間に蓄積している可能性が高い。したがって、その場合、リゾチーム処理等によって菌体をスフェロプラスト化してＭＢＰ−ＧｎＴＩＩを溶液中に遊離させ、濾過もしくは遠心分離して菌体を除去した後、得られる上清をアフィニティクロマトグラフィーに供することができる。
本発明において、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩ含有画分は、２価金属イオンの存在下、上記精製を行うのが好ましい。具体的には、培養終了後２価金属イオン存在下で、培養物から菌体を集め、菌体破壊等を行って、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩ含有画分を得るのがよい。
２価金属イオンとしては、マンガンイオン（Ｍｎ^２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）などが例示できるが、好ましくは、マンガンイオンである。マンガンイオンは、塩化マンガン、硫酸マンガン、硝酸マンガン、臭化マンガンなどのマンガン塩として使用することができる。
アフィニティクロマトグラフィーの吸着体としては、例えば、ＭＢＰの場合には、アミロースをアガロースビーズに固定化したアミロース樹脂（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製のＡｍｙｌｏｓｅ ｒｅｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ等）を使用することができるが、他のＭＢＰに対するリガンドおよび他の不溶性マトリックス基（例えばセルロース、デキストラン、合成ポリマー等）を使用してもよい。
糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩは、上記のように調製されたそれを含む画分に該吸着体を加えて適当な時間攪拌した後濾過して、吸着体を洗浄し、さらに適当な濃度の糖結合タンパク質と吸着体の結合を阻害する糖（例えば、ＭＢＰの場合にはマルトース）を含む溶離液を加えて適当な時間攪拌した後濾過することにより、濾液中に精製される。あるいは、該吸着体をカラムに充填して糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩ含有画分をアプライし、適当な緩衝液で洗浄した後、適当な濃度の上記溶離液をアプライしてカラムに吸着した糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩを溶出させることによって得ることもできる。
このようにして得られた本発明のＭＢＰ−ＧｎＴＩＩは、ＧｎＴＩＩ活性を有するので、このまま、酵素として使用することができる。
ＧｎＴＩＩの調製
上述のように、本発明の好ましい態様においては、糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩはその融合部位に配列特異的なプロテアーゼによって認識切断されるアミノ酸配列を含むので、上記のようにして精製された糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩに、該プロテアーゼを作用させることにより糖結合タンパク質部分が除去されて、所望のＧｎＴＩＩが生成する。好ましくは、該プロテアーゼは第Ｘａ因子である。本発明においては配列番号３の第Ｘａ因子認識配列を含むｐＭＡＬ−ｐ２或いはｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用することができる。糖結合タンパク質−ＧｎＴＩＩにプロテアーゼを作用させる際の反応温度、溶液のｐＨ、反応時間等は、使用するプロテアーゼの種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、第Ｘａ因子の場合、中性緩衝液中、４〜４０℃で１〜２５時間反応させることにより、糖結合タンパク質とＧｎＴＩＩとを開裂させることができる。反応終了後、反応液に上記の吸着体を加えて適当な時間攪拌することにより、遊離した糖結合タンパク質のみが該吸着体に吸着するので、該吸着体を濾過することによりＧｎＴＩＩのみを精製することができる。あるいは、該吸着体を充填したカラムに反応液をアプライして素通り画分を回収することによってもＧｎＴＩＩを精製することができる。
糖タンパク質糖鎖の変換
本明細書において高マンノース型糖鎖とは、Ｎ−結合型糖鎖のコア構造であるＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−の非還元末端のマンノース残基にマンノースのみが結合した構造の糖鎖をいい、具体的にはＭａｎα１−２Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−２ Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−の構造を有する糖鎖が例示されるが、細胞内で糖鎖構造が成熟化する過程で１個または複数個のマンノース残基が分解を受けたものも含まれる。また、α１−３結合したマンノースやα１−６結合したマンノース及び、ガラクトースを含む構造も知られている｛Ｃｌｉｎｔｏｎ Ｅ．Ｂａｌｌｏｕ ｅｔ，ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９３２７（１９９４）｝。
また、本明細書において複合型糖鎖とはＮ−結合型糖鎖のコア構造であるＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−の非還元末端のマンノース残基に結合する糖がＮ−アセチルグルコサミンのみである構造を基本骨格とする構造の糖鎖をいい、基本骨格にはさらにガラクトース、シアル酸、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン等が結合していても良い。具体的にはＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−或いはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−或いはＳｉａα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（Ｓｉａα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−等の構造を有する糖鎖が例示されるが、Ｎ−結合型糖鎖のコア構造Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−の非還元末端に結合するＮ−アセチルグルコサミンの結合様式は必ずしもβ１−２結合でなくてもよく、例えば、β１−３結合、β１−４結合、β１−６結合、α１−２結合、α１−３結合、α１−４結合、α１−６結合でもよい。
また、本明細書において混成型糖鎖とはＮ−結合型糖鎖のコア構造であるＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−の非還元末端のα１−６マンノース残基に結合する糖がマンノースであり、α１−３マンノース残基に結合する糖がＮ−アセチルグルコサミンである構造を基本骨格とする構造の糖鎖をいい、基本骨格にはさらにガラクトース、シアル酸、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン等が結合していても良い。具体的にはＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｓｉａα２−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）（Ｘｙｌβ１−２）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ等の構造を有する糖鎖が例示される。
マンノース残基が９から２個の範囲にある高マンノース型糖鎖を有する遺伝子組換えにより発現させた糖タンパク質は、例えばＣＨＯなどの哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞、カビ、ニワトリ細胞または鶏卵、藻類、植物細胞などの真核細胞を或いは哺乳動物、昆虫、植物体を宿主として遺伝子組換えを行って得られた糖タンパク質が例示される。
近年の遺伝子工学的手法を用い、糖鎖構造を改変した組換えタンパク質生産の為の宿主が改良されている。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ｏｃｈ１，ｍｎｎ１，ｍｎｎ４の３重変異株にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来α１，２−マンノシダーゼ遺伝子を導入した組換え酵母細胞では、糖タンパク質の糖鎖構造がβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの最適の基質となるマンノース残基が５個からなるものも存在することが報告されている（Ｃｈｉｂａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２６２９８−２６３０４（１９９８））。この組換え酵母宿主にて、外来有用タンパク質遺伝子を導入し、発現させると、マンノース残基が５個からなる糖鎖構造を持ち、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させて ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４構造を持つ糖タンパク質に変換できる。或いは酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、ｏｃｈ１，ｍｎｎ１，ｍｎｎ４の３重変異株にて外来有用タンパク質遺伝子を導入し、発現させた後に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来α１，２−マンノシダーゼ或いはマンノシダーゼＩを作用させて、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させてＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４構造を持つ糖タンパク質に変換することもできる。
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの別の変異株ｏｃｈ１，ｍｎｎ１，ａｌｇ３の３重変異株では、マンノース残基が５或いは８個からなる糖鎖構造を持つ糖タンパク質が得られている（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ−Ｓｈｉｎｄｏ Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：２６３３８−２６３４５（１９９３））。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来α１，２−マンノシダーゼ或いはマンノシダーゼＩを作用させて、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させてＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４構造を持つ糖タンパク質に変換することもできる。
植物細胞では、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ遺伝子に変異のあるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａが発見されている（ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１１０９−１１１３（１９９３））。この変異植物体では、マンノース残基が５個からなる糖鎖構造を持つ糖タンパク質が得られている。マンノース残基が５個からなる糖鎖構造Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４はβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのより好ましい基質である。また、植物からクローン化されたβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのｃＤＮＡをタバコ植物に導入し、アンチセンス法或いはコサプレッション法により形質転換植物のβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性が低下した植物体が得られている（Ｗｅｎｄｅｒｏｔｈ Ｉ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ Ａ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１２３：１０９７−１１０８（２０００））。そこでこの様な組換え植物宿主にて、外来有用タンパク質遺伝子を導入し、発現させると、マンノース残基が５個からなる糖鎖構造を持ち、インビトロでβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させてＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３Ｍａｎβ１−４構造を持つ糖タンパク質に変換できる。
タンパク質の種類は問わず、全ての糖タンパク質が包含され、例えばＲＮａｓｅＢが挙げられる。
項２４の工程１或いは項６３の工程１では例えば混成型糖鎖（項２４、項６３）または高マンノース型糖鎖（項２４）（図９及び図１３参照）からＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが、これらの工程に用いられる好ましい糖加水分解酵素はα１，２−マンノシダーゼである。α１，２−マンノシダーゼは、α１，２−結合で結合したマンノース残基を加水分解する酵素であり、マンノシダーゼＩ或いはＭａｎ_９−マンノシダーゼも本発明におけるα１，２−マンノシダーゼに含まれる。変換される糖タンパク質糖鎖のＯｕｔｅｒ Ｃｈａｉｎにα１−３結合したマンノースやα１−６結合したマンノースが含まれている場合はα−マンノシダーゼを併用することも可能である。さらには、変換される糖タンパク質糖鎖にキシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、或いはシアル酸等が付加されている場合は、糖加水分解酵素としてキシロシダーゼ、フコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ及びシアリダーゼ等の少なくとも１種も併用することが可能である。
項２４の工程３或いは項３６の工程２では例えばＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃからＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが（図９及び図１０参照）、この場合に用いられるα−マンノシダーゼは、α−１，２−結合、α−１，３−結合、α−１，４−結合またはα−１，６−結合で結合されたマンノースを加水分解する酵素である。α−マンノシダーゼＩＩは、α−１，３−結合、またはα−１，６−結合で結合されたマンノースを加水分解する酵素であるが、その基質特異性は厳密であり、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ→Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃの反応を触媒し、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃまでマンノースを削除しないという点で本工程に用いるにおいてより好ましい酵素である｛Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６８７６（１９９１）｝。
項４５の工程１では例えば混成型糖鎖又は高マンノース型糖鎖（図１１参照）からＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが、この工程に用いられる糖加水分解酵素は好ましくはα−マンノシダーゼである。α−マンノシダーゼは、α−１，２−結合、α−１，３−結合、α−１，４−結合またはα−１，６−結合で結合されたマンノースを加水分解する酵素である。また、変換される糖タンパク質糖鎖にキシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、或いはシアル酸等が付加されている場合は、これらを加水分解するキシロシダーゼ、フコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、或いはシアリダーゼ等もα−マンノシダーゼと併用することが可能である。
項５４の工程１では、例えば混成型糖蛋白質（図１２参照）からＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への糖鎖構造の変換がなされ得るが、これらの工程に用いられる糖加水分解酵素は好ましくはα１，２−マンノシダーゼである。α１，２−マンノシダーゼは、α１，２−結合で結合したマンノース残基を加水分解する酵素であり、マンノシダーゼＩ或いはＭａｎ_９−マンノシダーゼも本発明におけるα１，２−マンノシダーゼに含まれる。変換される糖タンパク質糖鎖のＯｕｔｅｒ Ｃｈａｉｎにα１−３結合したマンノースやα１−６結合したマンノースが含まれている場合はα−マンノシダーゼを併用することも可能である。さらには、変換される糖タンパク質糖鎖にキシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、或いはシアル酸等が付加されている場合は、これらを加水分解するキシロシダーゼ、フコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ガラクトシダーゼ、或いはシアリダーゼ等も併用することが可能である。しかしながら、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは目的の構造であるＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃの形成を阻害するため望ましくない。
β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｎＴＩ）とは、少なくともＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、糖受容体であるＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲにＧｌｃＮＡｃをβ１−２結合で転移し、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生じる作用を有する酵素である（但し、Ｒはアスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）。また、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ或いはＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒに対してもＧｌｃＮＡｃをβ１−２結合で転移できる。
また、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｎＴＩＩ）とは、少なくともＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを糖供与体として、糖受容体であるＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−ＲにＧｌｃＮＡｃをβ１−２結合で転移し、ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｒを生じる作用を有する酵素である（但し、Ｒはアスパラギン残基、ペプチド、タンパク質或いはその他糖転移酵素の活性を阻害しない低分子或いは高分子化合物である。）。
また、本発明に用いられる、α１，２−マンノシダーゼ、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、α−マンノシダーゼ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である場合、糖鎖構造の変換された糖タンパク質の反応系からの分離がより容易になる。
項２４の工程１では、高マンノース型糖鎖または混成型糖鎖を有する糖蛋白質の加水分解を以下のような条件で実施することができる。他の糖鎖を有する糖蛋白質についてもこれらを参照して適切な条件下に加水分解を行うことができることは当業者には自明である。例えば図９の混成型糖鎖又は高マンノース型糖鎖のＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への糖鎖構造の変換がなされる。本工程では、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）などのｐＨ５〜７程度の緩衝液中、室温から４０℃程度の温度下に、高マンノース型糖鎖を含む糖タンパク質に適量のα１，２−マンノシダーゼなどの糖加水分解酵素を１〜７２時間程度作用させることで行うことができる。或いはα１，２−マンノシダーゼを作用させる前に小胞体マンノシダーゼをまず作用させることもできる。また、α１−３マンノース構造、α１−６マンノース構造、或いはガラクトースを含む場合には予めα−マンノシダーゼ或いはガラクトシダーゼを作用させることもできる。
また、本工程では、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）などのｐＨ５〜７程度の緩衝液中、室温から４０℃程度の温度下に、混成型糖鎖を含む糖タンパク質に適量のα１，２−マンノシダーゼを１〜７２時間程度作用させることで行うことができる。或いはα１，２−マンノシダーゼを作用させる前に小胞体マンノシダーゼをまず作用させることもできる。また、α１−３マンノース構造、α１−６マンノース構造、シアル酸、ガラクトース、キシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン等を含む場合には予めα−マンノシダーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等を作用させることもできる。
反応終了後は透析を行うことにより、目的物を精製することができるが、固定化α１，２−マンノシダーゼ等の固定化酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
項２４の工程２は、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）などのｐＨ５〜７程度の緩衝液中、工程１で得られた糖タンパク質に等モルから過剰量のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともに適量のβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを、室温から４０℃程度で１〜７２時間程度作用させ、実施することができる。β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる糖タンパク質は、糖鎖構造の骨格がＭａｎα１−３Ｍａｎβ１−４のマンノースの非還元末端が遊離していることが望ましく、遊離した非還元末端マンノースがα１−３結合したＭａｎβ１−４が存在するマンノース残基５個からなる糖鎖構造Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４がβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの最も適した基質である。しかし、項４５の工程２に見られるようなマンノース残基が３個からなる糖鎖構造Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４もβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩのより好ましい基質である。マンノース残基が６個からなる糖鎖構造Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４もβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの基質となる。また、糖鎖構造Ｍａｎα１−６Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４或いはＭａｎα１−３Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４もβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの基質となり得る。このことから上記（１）のマンノシダーゼ処理過程では、マンノシダーゼ処理により得られる糖タンパク質の高マンノース型糖鎖のマンノース残基数は３、４或いは６でも構わない。目的とする糖タンパク質は、透析などにより精製することができる。
また、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
項２４の工程３は、例えばＭａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（図９参照）からＧｎＴＩＩの基質となるＭａｎα１−６（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への変換がなされ得る。本工程は、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）などのｐＨ５〜８程度の緩衝液中、工程２で得られた糖タンパク質に適量のα−マンノシダーゼを作用させることにより、実施することができる。市販されているα−マンノシダーゼとしてはタチナタマメ由来α−マンノシダーゼ、アーモンド由来α−マンノシダーゼが挙げられるが、その他生物起源より抽出精製したα−マンノシダーゼ或いはα−マンノシダーゼＩＩであってもよい。
ヒトではマンノシダーゼＩＩのアイソザイムあるいはホモログ遺伝子が報告されているので、これらを用いてもよい。また、細菌由来のα−１，２／３結合或いはα−１，６結合を分解するマンノシダーゼ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社製）も市販されており、これらを組み合わせて用いてもよい。
目的とする糖タンパク質は、透析などにより精製することができるが、固定化α−マンノシダーゼを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
項２４の工程４は、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）などのｐＨ５〜７程度の緩衝液中、上記工程３で得られた糖タンパク質に等モルまたは過剰量のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び適量のβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを、室温から４０℃程度の温度で１〜７２時間程度作用させ、透析などにより精製することにより、β１，２−結合によりＧｌｃＮＡｃを糖タンパク質に結合させる。また、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ或いはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ等）とＵＤＰ−Ｇａｌ、シアリルトランスフェラーゼ（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ或いはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ等）とＣＭＰ−Ｓｉａ、及びフコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，３−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，４−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ等）とＧＤＰ−Ｆｕｃを作用させる操作へと適用できる。
また、この場合の糖転移酵素に固定化糖転移酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。尚、本発明に用いられる糖転移酵素は天然のものでも遺伝子組換えにより生産されたものでよい。
項３６の工程１は、項２４の工程１で得られた糖タンパク質に代えて遺伝子組換えにより発現させた糖タンパク質を用いる以外は項２４の工程２と同様にして実施することができる。
項３６の工程２は、項２４の工程２で得られた糖タンパク質に代えて項３６の工程１で得られた糖タンパク質を用い、項２４の工程３と同様にして実施することができる。
項３６の工程３は、項２４の工程３で得られた糖タンパク質に代えて項３６の工程２で得られた糖タンパク質を用い、項２４の工程４と同様にして実施することができる。
このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ或いはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ等）とＵＤＰ−Ｇａｌ、シアリルトランスフェラーゼ（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ或いはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ等）とＣＭＰ−Ｓｉａ、及びフコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，３−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，４−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ等）とＧＤＰ−Ｆｕｃを作用させる操作へと適用できる。
また、この場合の糖転移酵素に固定化糖転移酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。尚、本発明に用いられる糖転移酵素は天然のものでも遺伝子組換えにより生産されたものでよい。
項４５の工程１は糖タンパク質糖鎖、例えば、高マンノース型糖鎖或いは混成型糖鎖（図１１参照）のＭａｎα１−３（Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃへの糖鎖の変換がなされ得る。本工程は、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）などのｐＨ５〜７程度の緩衝液中、工程２で得られた糖タンパク質に適量のα−マンノシダーゼを作用させることにより、実施することができる。また、シアル酸、ガラクトース、キシロース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン等を含む場合には予めシアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等を作用させることもできる。
反応終了後は透析を行うことにより、目的物を精製することができが、固定化α−マンノシダーゼ等の固定化酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
項４５の工程２は項２４の工程１で得られた糖タンパク質に代えて、項４５の工程１で得られた糖タンパク質を用い、項２４の工程２と同様に実施することができる。
項４５の工程３は、項２４の工程３で得られた糖タンパク質に代えて、項４５の工程２で得られた糖タンパク質を用い、項２４の工程４と同様に実施することができる。
このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ或いはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ等）とＵＤＰ−Ｇａｌ、シアリルトランスフェラーゼ（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ或いはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ等）とＣＭＰ−Ｓｉａ、及びフコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，３−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，４−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ等）とＧＤＰ−Ｆｕｃを作用させる操作へと適用できる。
また、この場合の糖転移酵素に固定化糖転移酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。尚、本発明に用いられる糖転移酵素は天然のものでも遺伝子組換えにより生産されたものでよい。
項５４の工程１では、例えば糖タンパク質上の混成型糖鎖（図１２参照）からＭａｎα１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−６）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造への変換がなされ得る。本工程は、項４５の工程１で用いる糖タンパク質が混成型糖鎖を持つ糖タンパク質のみである点と、用いる糖加水分解酵素にβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いない点を除けば、項４５の工程１と同様に実施することができる。
項５４の工程２は項４５の工程２で得られた糖タンパク質に代えて、項５４の工程１で得られた糖タンパク質を用い、項４５の工程３と同様に実施することができる。
項６３は工程１〜３の少なくとも一つに固定化酵素を用いる高マンノース型糖鎖をもつ糖タンパク質の混成型糖鎖への変換方法である。
項６３の工程１は用いる糖タンパク質の糖鎖が高マンノース型のみである事を除けば、項２４の工程１と同様に実施することができる。
項６３の工程２は、項２４の工程１で得られた糖タンパク質に代えて項６３の工程１で得られた糖タンパク質を用いて、項２４の工程２と同様に実施することができる。
項６３の工程３は、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）などのｐＨ６〜９程度の緩衝液中、項６３の工程２で得られた糖タンパク質に等モルまたは過剰量のＵＤＰ−Ｇａｌ及び適量のβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを、室温から４０℃程度の温度で１〜７２時間程度作用させることにより実施することができる。反応終了後は透析を行うことにより、目的物を精製することができるが、固定化β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
このようにして得られた糖タンパク質糖鎖は、ガラクトシルトランスフェラーゼ（β１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ或いはβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ等）とＵＤＰ−Ｇａｌ、シアリルトランスフェラーゼ（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ或いはα２，３−シアリルトランスフェラーゼ等）とＣＭＰ−Ｓｉａ、及びフコシルトランスフェラーゼ（α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，３−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，４−フコシルトランスフェラーゼ、或いはα１，６−フコシルトランスフェラーゼ等）とＧＤＰ−Ｆｕｃを作用させる操作へと適用できる。
また、この場合の糖転移酵素に固定化糖転移酵素を用いることで目的物の精製がさらに容易になる。
尚、本発明に用いられる糖転移酵素は天然のものでも遺伝子組換えにより生産されたものでよい。
発明を実施するための最良の形態
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１：ＰＣＲによるｈＧｎＴＩＩｃＤＮＡ断片の取得
配列番号１記載のヒトβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ｈＧｎＴＩＩ）ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号４および５に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号４〜２７で示される塩基配列であり、後者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１３４１〜１３７７で示される塩基配列である。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、白人女性胎盤由来ヒト染色体遺伝子（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
｛０．１ｍｇ／ｍｌ白人女性胎盤由来ヒト染色体遺伝子１μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌプライマー各１μｌ、Ｔａｑ．ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｋｉｔ、宝酒造社製）０．５μｌ、１０倍濃度ＰＣＲバッファー（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｋｉｔ、宝酒造社製）５μｌ、ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｋｉｔ、宝酒造社製）４μｌ、滅菌水３７．５μｌ、反応液容量５０μｌ、反応温度（時間）：変性９４℃（２分間），アニーリング５０℃（２分間），伸長７２℃（１分間）；サイクル数：３０サイクル｝。
ＰＣＲ反応後、反応液をアガロースゲル電気泳動にかけ、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片の確認を行った。該ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）ベクターとＴＡクローニング法を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、ＩＰＴＧ，Ｘ−ｇａｌを含むＬＢプレート培地で選抜した。
大腸菌より該ＤＮＡ断片を保持するプラスミドを調製し、該ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を常法に従って決定したところ、配列番号１に示される塩基配列中塩基番号４〜１３７７で示される塩基配列と一致することが分かり、所望のｈＧｎＴＩＩが得られたことが確認された。
実施例２：発現ベクターｐＭＧＮＴ−ＩＩの構築
膜貫通部位欠損型ＧｎＴＩＩ遺伝子取得を目的として、配列番号１記載のヒトβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ｈＧｎＴＩＩ）ｃＤＮＡの塩基配列をもとに、配列番号６および７に示されるオリゴヌクレオチドを合成した。前者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号８５〜１０５で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位を連結したものであり、後者は配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１３３４〜１３５９で示される塩基配列の３’末端側に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を連結したものである。これらのオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、実施例１で得られたｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ上のｈＧｎＴＩＩｃＤＮＡを鋳型として、以下の条件でＰＣＲ反応を行った
［０．１ｍｇ／ｍｌ実施例１で得られたｈＧｎＴＩＩｃＤＮＡ１μｌ、１０ｐｍｏｌｅ／μｌプライマー各１μｌ、Ｔａｑ．ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｋｉｔ、宝酒造社製）０．５μｌ、１０倍濃度ＰＣＲバッファー（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｋｉｔ、宝酒造社製）５μｌ、ｄＮＴＰ（Ｔａｋａｒａ ＰＣＲ Ｋｉｔ、宝酒造社製）４μｌ、滅菌水３７．５μｌ、反応液容量５０μｌ、反応温度（時間）：変性９４℃（２分間），アニーリング５０℃（２分間），伸長７２℃（１分間）；サイクル数：３０サイクル］
ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断しアガロースゲルから約１．２ｋｂの断片を回収した。一方、プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロースゲルから約６．６ｋｂの断片を回収した。これらの断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせ、新規なプラスミドｐＭＧＮＴ−ＩＩを得た。
上記工程概略図を図１に示す。
実施例３：組換え大腸菌を用いたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ融合タンパク質の調製
常法に従い、実施例２で得た発現ベクターｐＭＧＮＴ−ＩＩで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌの入った試験管２本に一白金耳植菌し、３７℃で一晩振とう培養した。得られた培養液１０ｍｌを上記培地１Ｌの入った培養フラスコに植菌した。３７℃で振とう培養し、培養液の６１０ｎｍにおける吸光度が０．５に達した時点で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに３７℃で培養を４時間続けた。
菌体を遠心分離して集め、１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有）２３ｍｌで再懸濁した。懸濁液を超音波破砕装置にて処理した後、遠心分離し、その上清を粗酵素液とした。予め上記緩衝液で平衡化しておいたアミロースレジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）カラム（５ｍｌ）に、粗酵素液を通液することにより、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ融合タンパク質を吸着させた。上記緩衝液でカラムを洗浄した後、マルトースを１０ｍＭ含む上記緩衝液で、吸着した融合タンパク質を溶出させた。溶出画分を集め得られた融合タンパク質を上記緩衝液にて透析したものを融合タンパク質溶液（ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ）とした。
実施例４：ＧｎＴＩＩ活性の確認
実施例３で得た融合タンパク質溶液（ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ）２３μｌ、３０８ｍＭウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと省略する場合もある）１μｌ、並びに式２で表される１０μＭピリジルアミノ化オリゴ糖（宝酒造社製）１μｌ、

を含む反応液を３７℃で３時間反応させた。反応後、沸騰水中で２分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液をＨＰＬＣで分析することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンが転移した生成物（式３）を確認した。

結果を図２に示す。図２Ａは式２及び式３の標準ピリジルアミノ化オリゴ糖（宝酒造社製）の分析結果であり、図２Ｂは式２で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖を基質として３時間反応させた結果である。図２Ｂの式３で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖のピークがＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩによって生成したものである。
以上の結果から、本発明の方法で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩはＧｎＴＩＩ酵素活性を保持することが確認された。
実施例５：ｈＧｎＴＩＩの基質特性の検討
実施例３で得たＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ（２３μｌ）、３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１μｌ）、並びに式２及び式４〜式８で表される１０μＭピリジルアミノ化オリゴ糖１μｌを含む反応液５０μｌを３７℃で一晩反応させた。反応後、沸騰水中で２分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例４と同様な方法でＨＰＬＣで分析した結果、式２で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖の他は式６で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖のみ活性を示した（表１）。以上の結果から、発明の方法で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩは天然由来のものと同じ基質特異性を有することが確認された。

実施例６：ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応温度の解析
実施例３で得たＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ（２３μｌ）、３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１μｌ）、並びに式２で表される１０μＭピリジルアミノ化オリゴ糖１μｌを含む反応液５０μｌを０〜７０℃で３時間反応させた。反応後、沸騰水中で２分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例４と同様にしてＨＰＬＣで分析することによりＧｎＴＩＩ活性を測定し、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応温度の解析を行った。
その結果、至適反応温度は３０と４０℃の間に有ることが確認された（図３）。
実施例７：ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの熱安定性の解析
実施例３で得たＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ（２３μｌ）を０〜７０℃の各温度に４時間保温した後、氷上で５分間置き冷却を行った。これに、３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１μｌ）、並びに式２で表される１０μＭピリジルアミノ化オリゴ糖１μｌを添加し、３７℃にて５時間反応を行った。
反応後、沸騰水中で２分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例４と同様にＨＰＬＣで分析することによりＧｎＴＩＩ活性を測定し、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの熱安定性の解析を行った。その結果、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩは４０℃まで熱安定性を有することが確認された（図４）。
実施例８：ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応ｐＨの解析
実施例３で得たＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを３ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５，２４ｍＭ ＭｎＣｌ_２，６０ｍＭ ＮａＣｌ，１．２ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有）に対して透析を行い、バッファー濃度を低下させた。得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ（２５μｌ）、ｐＨ４．０〜１０．５の２００ｍＭの各種緩衝液５μｌ、式２で表される１０μＭピリジルアミノ化オリゴ糖１．５μｌ、３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１μｌ）を添加し、３７℃にて５時間反応させた。反応後、沸騰水中で２分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例４と同様にＨＰＬＣで分析することによりＧｎＴＩＩ活性を測定し、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応ｐＨの解析を行った。使用した緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、カコジル酸緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）、トリシン緩衝液（ｐＨ８．０〜８．８）、ビシン緩衝液（ｐＨ８．０〜８．８）、グリシン緩衝液（ｐＨ８．８〜１０．５）である。
その結果、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応ｐＨはｐＨ６．５〜９．０であることが確認された（図５）。
実施例９：ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩのｐＨ安定性の解析
実施例８と同様に透析し、得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ（２５μｌ）にｐＨ４．０〜１０．５の２００ｍＭの各種緩衝液５μｌを添加し、２５℃にて７時間保温した。保温後、１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有）７．５μｌ、式２で表される１０μＭピリジルアミノ化オリゴ糖２μｌ、３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１μｌ）を添加し、３７℃にて５時間反応させた。反応後、沸騰水中で２分間インキュベートすることにより反応を停止させた。これらの反応液を実施例４と同様にＨＰＬＣで分析することによりＧｎＴＩＩ活性を測定し、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩのｐＨ安定性の解析を行った。使用した緩衝液は酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、カコジル酸緩衝液（ｐＨ５．５〜７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）、トリシン緩衝液（ｐＨ８．０〜８．８）、ビシン緩衝液（ｐＨ８．０〜８．８）、グリシン緩衝液（ｐＨ８．８〜１０．５）である。
その結果、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩはｐＨ５．５〜９．５で安定であることが確認された（図６）。
実施例１０：高マンノース型糖鎖を持つＲＮａｓｅＢの複合型糖鎖をもつＲＮａｓｅＢへの変換
（１）糖鎖変換反応
工程１：α１，２−マンノシダーゼ消化
２０ｍｇのＲＮａｓｅＢを３６０μｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解、２０μｌの０．５Ｕ／ｍｌα１，２−マンノシダーゼを添加した後、３７℃にて１８時間反応を行った。これに１５μｌの０．５Ｕ／ｍｌα１，２−マンノシダーゼを再添加し、３７℃にてさらに９時間反応を行った。さらにこれに５μｌの０．５Ｕ／ｍｌα１，２−マンノシダーゼを再添加し、３７℃にてさらに１８時間反応を行った。
得られた反応液のうち、３００μｌを１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有）に対して透析を行った。残り１００μｌは蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化を確認するためのサンプルとした。
工程２：β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ反応
工程１にて得られたα１，２−マンノシダーゼ消化ＲｎａｓｅＢ（２８０μｌ）に、６０μｌの３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、及び６６０μｌのマルトース結合タンパク質−β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ融合タンパク質（以後、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩと省略する場合もある）を添加し、３７℃にて１８時間反応を行った。
得られた反応液のうち６６６μｌを１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析を行った。残り３３７μｌは蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化を確認するためのサンプルとした。
尚、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩは特開２００１−１７８４５３号公報に記載の方法により得られたものを使用した。
工程３：タチナタマメ由来α−マンノシダーゼ消化
工程２にて得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩ反応ＲＮａｓｅＢ（７５０μｌ）に、９４μｌの１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）及び９４μｌのタチナタマメ由来α−マンノシダーゼ（生化学工業社製）を添加し、３７℃にて１５．５時間反応を行った。反応後さらに４７μｌのタチナタマメ由来α−マンノシダーゼを再添加し、３７℃にて１３．５時間反応を行った。反応後、４７μｌのタチナタマメ由来α−マンノシダーゼを再添加し、３７℃にてさらに１０．５時間反応を行った。反応後、９４μｌのタチナタマメ由来α−マンノシダーゼを再添加し、３７℃にてさらに７時間反応を行った。反応後、９４μｌのタチナタマメ由来α−マンノシダーゼを再添加し、３７℃にてさらに４３．５時間反応を行い、合計９０時間の反応を行った。
得られた反応液の内６１０μｌを１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有）に対して透析を行った。残り６１０μｌは蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化を確認するためのサンプルとした。
工程４：β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ反応
工程３にて得られたタチナタマメ由来α−マンノシダーゼ消化ＲＮａｓｅＢ（７５０μｌ）に、６０μｌの３０８ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及び２．１９ｍｌの実施例３で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを添加し、３７℃にて４０時間反応を行った。反応後、１ｍｌのＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを再添加し、３７℃にてさらに１１時間反応を行った。反応後、１ｍｌのＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを再添加し、３７℃にてさらに１２．５時間反応を行った。反応後、３００μｌのＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを再添加し、３７℃にてさらに１１時間反応を行った。反応後、５００μｌのＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩを再添加し、３７℃にてさらに１０．５時間反応を行い、合計８５時間反応を行った。
得られた反応液を蒸留水に対して透析を行い、糖鎖変化の確認を行った。
（２）糖鎖変化の確認
上記工程１〜４で得られたサンプルから常法に従って糖鎖の切り出しを行い、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った。得られた各ピリジルアミノ化オリゴ糖を順相ＨＰＬＣにより分析を行った。
ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｍｉｄｅ ｃｏｌｕｍｎ Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉ ＰＡＫ、
Ｓｏｌｎ．Ａ：８０％ＣＨ_３ＣＮ、Ｓｏｌｎ．Ｂ：２０％ＣＨ_３ＣＮ、Ｇｒａｄｉｅｎｔ：１０→５０→１０％Ｓｏｌｎ．Ｂ（５→２５→２６ｍｉｎ）、
Ｔｉｍｅ：４０ｍｉｎ、
Ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐ．：３０℃
（ａ）工程１の確認
図７のＡは標準ピリジルアミノ化オリゴ糖の分析結果であり、ピーク１が式４、ピーク２が式５、ピーク３が式９、ピーク４が式１０、ピーク５が式１１、ピーク６が式１２、ピーク７が式１３で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖に対応する。
未処理ＲＮａｓｅＢの糖鎖分析の結果（図７Ｂ）、図７Ａのピーク４〜７に対応する種々の高マンノース型糖鎖が存在していることが確認された。
次に、工程１により得られたα１，２−マンノシダーゼ消化ＲＮａｓｅＢの糖鎖分析の結果（図７Ｃ）、図７Ｂで検出された種々の高マンノース型糖鎖のピークは全てピーク４（式１０）に変換されていることが確認された。
（ｂ）工程２の確認
図７Ｄもまた、標準ピリジルアミノ化オリゴ糖の分析結果であり、ピーク１が式５、ピーク２が式６、ピーク３が式３、ピーク４が式１４で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖に対応する。
工程２により得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩの反応生成物であるＲＮａｓｅＢの糖鎖分析の結果（図７Ｅ）、図７Ｄのピーク４（式１４）に対応するピークのみが検出された。
（ｃ）工程３の確認
工程３により得られたタチナタマメ由来α−マンノシダーゼ消化ＲＮａｓｅＢの糖鎖分析の結果（図７Ｆ）、図７Ｄのピーク２（式６）に対応するピークが主反応産物であることが確認された。
（ｄ）工程４の確認
工程４により得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの反応生成物であるＲＮａｓｅＢの糖鎖分析の結果（図７Ｇ）、図７Ｄのピーク３（式３）に対応するピークが主反応産物であることが確認された。
さらに、図７Ｇのメインピークを分取し、マススペクトル分析に供した結果（図８）、式３で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖の理論値（１３９５．３２）とほぼ一致した値が得られたことから、工程４により得られたβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの反応生成物であるＲＮａｓｅＢの糖鎖構造は式１５で表される構造を有することが確認された。
以上の結果から、種々の高マンノース型糖鎖をもつＲＮａｓｅＢを複合型糖鎖を持つＲＮａｓｅＢに酵素的に容易に変換できることが確認された。
実施例１１：α−マンノシダーゼＩＩの調製
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６８７６（１９９１）に記載の方法に従い、マウス３０匹の肝臓をホモジネートした後、ゴルジ体リッチな膜画分を得、膜画分よりα−マンノシダーゼＩＩを可溶化し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４による二相分離、α−キモトリプシンによる消化、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４による二相分離、ＭｏｎｏＳ（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６（アマシャムファルマシア社製）カラムクロマトグラフィーによる精製を行った。得られたα−マンノシダーゼＩＩ画分をセントリコンＹＭ−３０による膜濃縮を行い、α−マンノシダーゼＩＩ溶液０．５ｍｌを得た。
実施例１２：高マンノース型糖鎖を持つＲＮａｓｅＢの複合型糖鎖をもつＲＮａｓｅＢへの変換
工程３においてタチナタマメ由来α−マンノシダーゼの代わりに、実施例１１で得たα−マンノシダーゼＩＩ、１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）の代わりに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いる以外は実施例１０と同様に行い、ＲＮａｓｅＢの糖鎖を変換した。変換後のＲＮａｓｅＢの糖鎖を分析したところ、式３に対応する生成物が確認された。
実施例１３：固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの調製
実施例３と同様にして、アミロースレジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）カラム（５ｍｌ）に、ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ融合タンパク質を吸着させ、１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５，２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ２−メルカプトエタノール含有）で洗浄し、得られた樹脂をそのまま固定化酵素とした。
実施例１４：固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの調製
特開２００１−１７８４５３号公報記載のＭＢＰ−ｈＧｎＴＩ融合タンパク質生産組換え大腸菌を用いて、実施例１１と同様にして、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（５ｍｌ）を得た。
実施例１５：固定化α１，２−マンノシダーゼの調製
予め６０ｍｌの１ｍＭ塩酸で洗浄したＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦ（アマシャムファルマシア社製）１ｍｌにα１，２−マンノシダーゼ（生化学工業社製）０．５Ｕおよび牛血清アルブミン２０ｍｇを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）５ｍｌを加え、４℃で一晩穏やかに振とうさせることで、酵素を結合させた。振とう後、樹脂をろ別し、５ｍｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄後０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌ中に樹脂を加え、４℃で４時間穏やかに振とうすることにより、樹脂中に残存する活性化部位をブロックした。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄後、得られた固定化α１，２−マンノシダーゼ１ｍｌを５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）中に浸漬し、４℃で保存した。
実施例１６：固定化α−マンノシダーゼＩＩの調製
α１，２−マンノシダーゼ（生化学工業社製）０．５Ｕの代わりに実施例１１で得たα−マンノシダーゼＩＩ０．５ｍｌを用いる以外は実施例１５と同様にして、固定化α−マンノシダーゼＩＩ１ｍｌを得た。
実施例１７：固定化β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの調製
予め１００ｍｌの１ｍＭ塩酸で洗浄したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（アマシャムファルマシア社製）３ｍｌにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（東洋紡績社製）３０Ｕ、牛血清アルブミン１２０ｍｇ、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース（以下ＵＤＰ−Ｇａｌと略する）１ｍＭ、Ｎ−アセチルグルコサミン５ｍＭ、塩化マンガン２５ｍＭを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌを加え、４℃で一晩穏やかに振とうすることにより酵素を結合させた。振とう後、樹脂をろ別し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌで洗浄した。洗浄後０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に樹脂を加え、４℃で４時間穏やかに振とうすることにより、樹脂中に残存する活性化部位をブロックした。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄後、得られた固定化β１，４−ガラクトース転移酵素３ｍｌをＵＤＰ−Ｇａｌ（１ｍＭ）および塩化マンガン５ｍＭを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬し、４℃で保存した。
実施例１８：固定化α２，６−シアリルトランスフェラーゼの調製
予め１００ｍｌの１ｍＭ塩酸で洗浄したＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦ（アマシャムファルマシア社製）１．０ｇをα２，６−シアリルトランスフェラーゼ（東洋紡績社製）１．２Ｕ、牛血清アルブミン７５ｍｇ、シチジン−５’−ジホスフェート１ｍＭ、Ｎ−アセチルラクトサミン５ｍＭを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに加え、４℃で一晩穏やかに振とうすることにより酵素を結合させた。振とう後、樹脂をろ別し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌで洗浄した。洗浄後０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌ中に樹脂を加え、４℃で４時間穏やかに振とうすることにより、樹脂中に残存する活性化部位をブロックした。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、蒸留水で洗浄後、得られた固定化α２，６−シアル酸転移酵素３ｍｌをシチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃと略する）１ｍＭを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬し、４℃で保存した。
実施例１９：固定化α−マンノシダーゼの調製
α−マンノシダーゼ（タチナタマメ由来、生化学工業社製）３０Ｕを用い、実施例１１と同様にして、固定化α−マンノシダーゼを得、酢酸亜鉛０．０１ｍＭを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬し、４℃で保存した。
実施例２０：固定化酵素を用いたＲＮａｓｅＢの高マンノース型糖鎖の混成型糖鎖への変換
（１）糖鎖変換反応
工程１：高マンノース型糖鎖の固定化α１，２−マンノシダーゼによるトリミング
ＲＮａｓｅＢ（シグマ社製）１００ｍｇを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）２ｍｌに溶解させ、ここに実施例１５で得られた固定化α１，２−マンノシダーゼ１ｍｌを加えて、３７℃で２４時間穏やかに振とうさせながら反応させた。反応後、固定化１，２−マンノシダーゼをろ別し、固定化α１，２−マンノシダーゼを蒸留水５ｍｌで洗浄した。反応液と洗浄液を合わせ、分画分子量３．５ｋＤの透析膜（スペクトラム社製）に入れ、外液蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥することにより、目的物である糖鎖がトリミングされたＲＮａｓｅＢ（８７ｍｇ）を得た。
工程２：固定β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩによる糖鎖の伸長
糖鎖がトリミングされたＲＮａｓｅＢ（１５ｍｇ）をウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと略する）１０ｍＭ、塩化マンガン２０ｍＭ、塩化ナトリウム１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール０．２ｍＭを含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに溶解し、ここに実施例１４で得られた固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ１ｍｌを加え、２５℃で穏やかに振とうしながら２４時間反応させた。反応後、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩをろ別し、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを蒸留水５ｍｌで洗浄した。反応液と洗浄液を合わせ、分画分子量３．５ｋＤの透析膜（スペクトラム社製）に入れ、外液（塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５））に対して透析を行った。透析後、限外ろ過ユニットウルトラフリーＭＣ（ミリポア社製、分画分子量５，０００）を用いて、１ｍｌまで濃縮した。
工程３：固定化β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長
工程２で得られた溶液にＵＤＰ−Ｇａｌを１０ｍＭになるように加えた後、実施例１７で得られた固定化β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ１ｍｌを加え、２５℃で穏やかに振とうしながら２４時間反応させた。反応後、工程２と同様にして、目的物の溶液１ｍｌを得た。
工程４：固定化α２，６−シアリルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長
工程３で得られた溶液１ｍｌにＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを１０ｍＭになるように加えた後、実施例１８で得られた固定化α２，６−シアリルトランスフェラーゼ１ｍｌを加え、２５℃で穏やかに振とうしながら４８時間反応させた。反応後、工程２と同様にして、透析外液に蒸留水を用いて透析した後、凍結乾燥し、目的物１０ｍｇを得た。
（２）糖鎖変化解析
上記工程１〜４で得られたサンプルから常法に従って糖鎖の切り出しを行い、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った。得られた各ピリジルアミノ化オリゴ糖を順相ＨＰＬＣにより分析を行った結果、工程４で得られた凍結乾燥品の糖鎖構造が式１６で表される構造が主成分であることが確認された。
実施例２１：固定化酵素を用いたＲＮａｓｅＢの高マンノース型糖鎖の複合型糖鎖への変換
（１）糖鎖変換反応
工程１：高マンノース型糖鎖の固定化α１，２−マンノシダーゼによるトリミング
実施例２０の工程１と同様の方法で、糖鎖がトリミングされたＲＮａｓｅＢ（８７ｍｇ）を得た。
工程２：固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩによる糖鎖の伸長
糖鎖がトリミングされたＲＮａｓｅＢ（１５ｍｇ）をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（１０ｍＭ）、塩化マンガン２０ｍＭ、塩化ナトリウム１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール０．２ｍＭを含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに溶解し、ここに実施例１４で得られた固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（１ｍｌ）を加え、２５℃で穏やかに振とうしながら２４時間反応させた。反応後、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩをろ別し、固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを蒸留水５ｍｌで洗浄した。反応液と洗浄液を合わせ、分画分子量３．５ｋＤの透析膜（スペクトラム社製）に入れ、外液（酢酸亜鉛０．０１ｍＭを含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０））に対して透析を行った。透析後、限外ろ過ユニットウルトラフリーＭＣ（ミリポア社製、分画分子量５，０００）を用いて、１ｍｌまで濃縮した。
工程３：固定化α−マンノシダーゼによる糖鎖のトリミング
工程２で得られた反応生成物溶液１ｍｌに実施例１９で得られた固定化α−マンノシダーゼ１ｍｌを加え、２５℃で穏やかに振とうしながら２４時間反応させた。反応後、透析外液として塩化マンガン２０ｍＭ、塩化ナトリウム１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール０．２ｍＭを含む１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を用いる以外は工程２と同様にして、目的物の溶液１ｍｌを得た。
工程４：固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩによる糖鎖の伸長
工程３で得られた溶液に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを１０ｍＭになるよう加えた後、実施例１３で得られた固定化β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ１ｍｌを加え、２５℃で穏やかに振とうしながら４８時間反応させた。反応後、透析外液として、塩化マンガン１０ｍＭを含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いる以外は工程２と同様にして、目的物の溶液１ｍｌを得た。
工程５：固定化β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長
実施例２０の工程３と同様にして、糖鎖の伸長を行い、目的物の溶液１ｍｌを得た。
工程６：固定化α２，６−シアリルトランスフェラーゼによる糖鎖の伸長
反応時間を７２時間にする以外は実施例２０の工程４と同様にして、糖鎖の伸長を行い、目的物６ｍｇを得た。
（２）糖鎖変化解析
上記工程１〜６で得られたサンプルから常法に従って糖鎖の切り出しを行い、２−アミノピリジンによる蛍光標識を行った。得られた各ピリジルアミノ化オリゴ糖を順相ＨＰＬＣにより分析を行った結果、工程６で得られた凍結乾燥品の糖鎖構造が式１７で表される構造が主成分であることが確認された。
実施例２２：固定化酵素を用いたＲＮａｓｅＢの高マンノース型糖鎖の複合型糖鎖への変換
実施例２１の工程３において固定化α−マンノシダーゼの代わりに実施例１６で得られた固定化α−マンノシダーゼＩＩを用いる以外は実施例２１と同様にして、ＲＮａｓｅＢの糖鎖の変換を行った。変換後の糖鎖を切り出し糖鎖構造を分析した結果、式１７で表される構造が主成分であることが確認された。

本発明の方法では、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する融合タンパク質を可溶性タンパク質として容易に効率よく大量に生産することができる。また、融合タンパク質からＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩそのものも容易に得ることができ、得られたＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを利用することにより、糖鎖合成や診断等に有用なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ抗体を容易に得ることができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のベクターを作成した概略図である（実施例２）。
図２は、実施例３で得られた融合タンパク質溶液（ＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩ）の反応性を示すＨＰＬＣの結果を示す図である。図２Ａは式２及び式３の標準ピリジルアミノ化オリゴ糖（宝酒造社製）の分析結果であり、図２Ｂは式２で表されるピリジルアミノ化オリゴ糖を基質として３時間反応させた結果である（実施例４）。
図３は、実施例３で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応温度を示す図である（実施例６）。尚、４０℃における活性を１００％とした。
図４は、実施例３で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの熱安定性を示す図である（実施例７）。尚、１０℃における活性を１００％とした。
図５は、実施例３で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩの至適反応ｐＨを示す図である（実施例８）。尚、カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．０）での活性の値を１００％とした。
図６は、実施例３で得られたＭＢＰ−ｈＧｎＴＩＩのｐＨ安定性を示す図である（実施例９）。尚、グリシン緩衝液（ｐＨ８．８）での活性の値を１００％とした。
図７は、順相ＨＰＬＣによる、実施例１０の各工程で得られたサンプルの糖鎖分析を示す。
図８は、実施例１０の工程４のメインピークのマススペクトル分析の結果を示す。
図９は、項２４〜項３５に記載の発明の一実施態様を示す図である。
図１０は、項３６〜項４４に記載の発明の一実施態様を示す図である。
図１１は、項４５〜項５３に記載の発明の一実施態様を示す図である。
図１２は、項５４〜項６２に記載の発明の一実施態様を示す図である。
図１３は、項６３〜項７０に記載の発明の一実施態様を示す図である。
なお、図９〜図１３において、ｌ、ｍ、ｎ、ｘは０〜２０の整数を示す。

Claims (70)

1. 糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとの組換え融合タンパク質。
2. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩがヒト由来である、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが、
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
   （ｂ）上記（ａ）において、１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸からなり、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質
   である請求項１に記載の融合タンパク質。
4. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４４７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。
5. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列を含む請求項１に記載の融合タンパク質。
6. 糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとの間にプロテアーゼ認識配列を含有する請求項５に記載の融合タンパク質。
7. 糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項１に記載の融合タンパク質。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
9. 請求項８のＤＮＡを含む発現ベクター。
10. 請求項９の発現ベクターによって形質転換された形質転換体。
11. 以下の工程：
    （１）大腸菌で機能し得るプロモーターの制御下に、糖結合タンパク質をコードするＤＮＡとβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡを、該両タンパク質の融合タンパク質として発現するように連結した発現ベクターを用いて、大腸菌を形質転換し、
    （２）得られる形質転換体を培養して、糖結合タンパク質とβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩとの融合タンパク質を生成させ、
    （３）得られる培養物から、該融合タンパク質を分離すること、
    を含む糖結合タンパク質−β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ融合タンパク質の製造方法。
12. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩがヒト由来である請求項１１記載の方法。
13. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、少なくともアミノ酸番号２９〜４４７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項１２記載の方法。
14. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列中、少なくとも塩基番号８５〜１３４１で示される塩基配列を含む請求項１２記載の方法。
15. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸を削除したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む請求項１１記載の方法。
16. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードするＤＮＡが、配列番号１に示される塩基配列から該タンパク質の膜貫通部位の全部または一部に相当するアミノ酸をコードする塩基配列を削除した塩基配列を含む請求項１１に記載の方法。
17. 糖結合タンパク質が、マルトース結合タンパク質である請求項１１に記載の方法。
18. マルトース結合タンパク質をコードするＤＮＡが、ｐＭＡＬ−ｐ２あるいはｐＭＡＬ−ｃ２に由来する請求項１７に記載の方法。
19. （３）得られる培養物から、２価金属イオンの存在下、該融合タンパク質を分離する、請求項１１に記載の方法。
20. ２価金属がマンガンである請求項１９記載の方法。
21. 請求項１１〜２０のいずれかに記載の方法により得られる融合タンパク質から、糖結合タンパク質部分を除去してβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを採取する工程を含む、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの製造方法。
22. 糖結合タンパク質をコードするＤＮＡが、該タンパク質のＣ末端側にプロテアーゼ認識配列をコードする塩基配列を含み、該プロテアーゼの作用により融合タンパク質から糖結合タンパク質部分を除去することを特徴とする請求項２１記載の方法。
23. プロテアーゼが血液凝固第Ｘａ因子である請求項２２記載の方法。
24. 以下の工程１〜工程４を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
    （工程１）糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる；
    （工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
    （工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にα−マンノシダーゼを作用させる。
    （工程４）上記（工程３）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
25. 工程４の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
26. 糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項２５に記載の方法。
27. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項２５に記載の方法。
28. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼ、及びマンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項２４に記載の方法。
29. 糖加水分解酵素がα−マンノシダーゼである請求項２４に記載の方法。
30. 糖加水分解酵素がα１，２−マンノシダーゼである請求項２４に記載の方法。
31. α−マンノシダーゼがα−マンノシダーゼＩＩである請求項２４に記載の方法。
32. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが請求項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである請求項２４に記載の方法。
33. 糖加水分解酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、αマンノシダーゼ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項２４に記載の方法。
34. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項２４に記載の方法。
35. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項２４に記載の方法。
36. 以下の工程１〜工程３を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
    （工程１）糖タンパク質上の糖鎖構造の全てあるいは一部がβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩの基質となる構造を有している糖タンパク質に、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
    （工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にα−マンノシダーゼを作用させる；及び
    （工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
37. 工程３の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する請求項３６に記載の方法。
38. 糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項３７に記載の方法。
39. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項３７に記載の方法。
40. α−マンノシダーゼがα−マンノシダーゼＩＩである請求項３６に記載の方法。
41. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが請求項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである請求項３６に記載の方法。
42. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、αマンノシダーゼ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項３６に記載の方法。
43. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項３６に記載の方法。
44. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項３６に記載の方法。
45. 以下の工程１〜工程３を含む糖タンパク質上の糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
    （工程１）糖タンパク質の糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。
    （工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
    （工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
46. 工程３の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
47. 糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項４５に記載の方法。
48. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項４６に記載の方法。
49. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼ、及びマンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項４５に記載の方法。
50. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが請求項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである請求項４５に記載の方法。
51. 糖加水分解酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項４５に記載の方法。
52. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項４５に記載の方法。
53. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項４５に記載の方法。
54. 以下の工程１〜工程２を含む糖タンパク質上の混成型糖鎖を複合型糖鎖に変換する方法：
    （工程１）混成型糖タンパク質の混成型糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。
    （工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩを作用させる。
55. 工程２の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
56. 糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項５５に記載の方法。
57. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項５５に記載の方法。
58. 糖加水分解酵素が、マンノシダーゼ、キシロシダーゼ、フコシダーゼ、及びβ１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項５４に記載の方法。
59. β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩが請求項１〜７のいずれかに記載の組換え融合タンパク質もしくはプロテアーゼ認識配列で切断されて糖結合蛋白質を除去したβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩである請求項５４に記載の方法。
60. 糖加水分解酵素、及びβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である請求項５４に記載の方法。
61. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項５４に記載の方法。
62. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項５４に記載の方法。
63. 以下の工程１〜工程３を含む糖タンパク質上の高マンノース型糖鎖を混成型糖鎖に変換する方法であって、使用する糖加水分解酵素、β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、及びβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼのうち少なくともいずれか一つが固定化酵素である方法：
    （工程１）糖タンパク質の高マンノース型糖鎖に糖加水分解酵素を作用させる。
    （工程２）上記（工程１）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとともにβ１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを作用させる；
    （工程３）上記（工程２）で得られた糖タンパク質にＵＤＰ−Ｇａｌとともにβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼを作用させる。
64. 工程３の後にさらに少なくとも一種類の糖転移酵素を作用させることを特徴とする糖タンパク質上の糖鎖を混成型糖鎖に変換する請求項６３に記載の方法。
65. 糖転移酵素が、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、キシロシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、及びＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項６４に記載の方法。
66. 糖転移酵素のうち少なくとも一つが固定化酵素である請求項６４に記載の方法。
67. 糖加水分解酵素が、ガラクトシダーゼ、及びα−マンノシダーゼからなる群より選ばれる少なくとも一つである請求項６３に記載の方法。
68. α−マンノシダーゼがα１，２−マンノシダーゼである請求項６３に記載の方法。
69. 糖タンパク質が天然由来のものである請求項６３に記載の方法。
70. 糖タンパク質が遺伝子組換えにより発現されたものである請求項６３に記載の方法。

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