JP5249987B2 - 安定化された水性アルファ−ガラクトシダーゼ組成物およびこれに関連する方法 - Google Patents
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Y—ENZYMES
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Description
ODλ = log10 O = - log10 T = - log10(I/I0)
式中、
O = 単位当たりの不透過率
T = 単位当たりの透過率
I0 = 入射光線の強度
I = 透過光線の強度。
式中、
F は散乱光の強度、
I0 は入射光線の強度、
Φ は放出対吸収フォトンの比率、
ε は混合物中の粒状物質のモル吸収係数、
c はキュベット内の液体サンプル(不均質混合物)の容量当たりの粒状物質の量
d はキュベット内の空間の厚み。
装置番号: EL06033429
データモード: 蛍光
Em.波長(nm): 800
Ex.波長(nm): 800
Ex.スリット(nm): 5
Em.スリット(nm): 5
Ave時間(sec): 0.1
Ex.フィルター: Auto
Em.フィルター: Open
PMT電圧(V): Medium
Multicellホルダー: Multicell
Multi zero: Off
Replicates: 1
サンプルアベレージング(Sample averaging): off
本発明の目的に関しては、「透明な」水性組成物とは、アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質を含まないこと以外は同一の組成と濃度のそれぞれの成分を含む溶液の濁度とほぼ同等の(すなわちほぼ等しい)濁度(上記のようにして判定)であることを特徴とする。好ましくは、これは、記載された条件下で、波長800 nmの光を使用する90°側方散乱によって判定して、0〜0.40の範囲、より好ましくは0〜0.13の範囲に相当し、0.05〜0.130の範囲がさらにより好ましい。
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln; His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
His Asn; Gln
Ile Leu; Val
Leu Ile; Val
Lys Arg; Gln; Asn
Met Leu; Ile
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Val Ile; Leu
本発明のタンパク質をさらに、エピトープタグの1つであって、抗タグ物質が選択的に結合することができる1エピトープを提供するものに融合させることができる。エピトープタグは一般的にペプチドのアミノ-もしくはカルボキシル-末端に置かれるが、生物学的活性が許す限り、内部挿入もしくは置換によって組み込んでもよい。こうしたエピトープタグを付けた形態のペプチドの存在を、このタグを付けたペプチドに対する抗体などの物質を使用して、検出することができる。また、エピトープタグの付設によって、そのペプチドを、抗タグ抗体もしくはエピトープタグに結合するその他のタイプのアフィニティマトリックスを使用するアフィニティ精製によって、容易に精製することが可能になる。各種のタグポリペプチドおよびそれに対応する抗体は当分野で周知である。例として、以下が含まれる: ポリ-ヒスチジン(poly-his)、ポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ、HAタグポリペプチド、c-mycタグ、StrepタグおよびFLAGタグ。
(i) アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つ、天然に生起するタンパク質、好ましくはSEQ ID NO: 1のアルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質、および
(ii) 250 mM〜320 mMの濃度のアルギニン、
を含んでいて、
(iii) 電導度が20 mS/cm ± 0.1 mS、
であることを特徴とする。
(i) アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つ、天然に生起するタンパク質、好ましくはSEQ ID NO: 1のアルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質、および
(ii) 250 mM〜320 mMの濃度のアルギニン、
を含んでいて、
(iii) pHが5.8〜6.2、
であることを特徴とする。
(i) アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つ、天然に生起するタンパク質、好ましくはSEQ ID NO: 1のアルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質、および
(ii) 250 mM〜320 mMの濃度のアルギニン、
を含んでいて、
(iii) 電導度が20 mS/cm ± 0.1 mS、かつ
(iv) pHが5.8〜6.2、
であることを特徴とする。
(i) アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つ、天然に生起するタンパク質、好ましくはSEQ ID NO: 1のアルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質、および
(ii) 250 mM〜320 mMの濃度、好ましくは310 mMの濃度のアルギニン、および
(iii) 50 mM以下の濃度の1、2、もしくは3価塩イオン、
を含んでいて、
(iv) 電導度が20 mS/cm ± 0.1 mS、かつ
(v) pHが5.8〜6.2、
であることを特徴とする。
(a) アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質を含有する組成物を提供し、
(b) ステップ(a)の組成物を、100 mMを超える濃度、特に少なくとも150 mMのアルギニンの存在中で濃縮し、そして
(c) ステップ(b)の組成物をカチオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
(i) 例えば、ポリミン沈殿によって核酸を除去する処理をし;
(ii) 例えばアルギニン、例えば250〜320 mMアルギニンを含有するバッファー中での遠心分離および/または限外ろ過によって、アルギニンの存在中で濃縮し; かつ/あるいは
(iii) クロマトグラフィー方法、例えば、カチオン交換クロマトグラフィーおよび、場合によってアニオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
(i) 例えば、ポリミン沈殿によって核酸を除去する処理をし;
(ii) 例えばアルギニン、例えば250〜320 mMアルギニンを含有するバッファー中での遠心分離および/または限外ろ過によって、アルギニンの存在中で濃縮し; かつ
(iii) クロマトグラフィー方法、例えば、カチオン交換クロマトグラフィーおよび、場合によってアニオン交換クロマトグラフィーによって精製する。
レーン 1: 分子量マーカー(Mark 12(登録商標), Invitrogen, CA, USA)
レーン 2: アルファ-ガラクトシダーゼ(B-zyme)3μg
レーン 3: アルファ-ガラクトシダーゼ(B-zyme)4.5μg
レーン 4: アルファ-ガラクトシダーゼ(B-zyme)9μg
アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を、基本的に既述(Liuら、2007)の通りにして測定した。合成基質として、4-ニトロフェニル-α-D-ガラクトシドを使用した。p-ニトロ-フェノールの放出を、100 mMリン酸ナトリウム、50 mM塩化ナトリウムを含有する反応バッファー、pH 6.8中、26℃で、405 nmの波長で追跡した。
部分的に精製されたアルファ-ガラクトシダーゼの溶解性を改善するため、多様な添加剤を試験した。ポリミン沈殿ステップ(下記実施例5参照)の上清をサンプルとして使用した。
アルファ-ガラクトシダーゼの溶解性を特性決定するため、各種バッファー条件を試験した。この目的のため、サンプルとして、ポリミン沈殿ステップの上清(実施例5参照)を使用した。50 mMリン酸ナトリウムバッファー中で、pH 4.5〜pH 9.5の範囲を試験した。
280 nmでのタンパク質吸光度を測定することによって、それぞれの画分およびプールのタンパク質濃度を判定した。タンパク質濃度の測定は当分野で既知の標準的方法である。組換えアルファ-ガラクトシダーゼについては、分子減衰係数1.279を使用して、酵素の濃度を算出した。
組換えアルファ-ガラクトシダーゼを過剰発現したE.coli HB101細胞を出発物質として使用して、安定化されたアルファ-ガラクトシダーゼ(B-zyme)の組成物を調製した。その調製は、細胞溶解および核酸の分離後、限外ろ過、およびその後の透析ステップによって、実施した。この調製工程で、安定な組換えアルファ-ガラクトシダーゼ酵素(B-zyme)の組成物が生成されるので、これを保存するか、または次の精製操作のために使用することができる。
バッファーB: 50 mMリン酸ナトリウム、310 mM L-アルギニン、pH 6.0 +/- 0.2(20 mS/cm +/- 0.1)
細胞溶解:
凍結E. coli細胞260 g(乾燥量; 湿潤量約1000 gと等量)に、バッファーA 3.6 lを添加した。細胞を解凍して懸濁させた。その後、氷上で懸濁液を冷却しながら、APV高圧器具(750〜800 bar)によって、細胞を溶解させた。精製操作の以下のステップを室温で実施した。
細胞溶解後、粗抽出物中に存在する核酸を、ポリミン沈殿によって除去した。この目的のため、抽出物にに3 M塩化ナトリウムの一部(容積の10 %)を、最終濃度が300 mMになるように、添加した。必要ならば、4 N NaOHまたは4 N HClのいずれかを使用して、pH値をpH 7.5 ± 0.2に再調整した。その後、核酸の完全な沈殿が得られるまで、ポリミンP溶液(10 %)を段階的に添加した。その後、溶液を5000 rpmで10分間遠心分離した。得られた上清を、場合によって4℃で一晩保存した後、次の濃縮ステップに供した。
遠心分離ステップ後に得られる透明な上清(すなわちポリミンP上清)は、典型的にはタンパク質濃度が20〜30 mg/mlである。Amicon Ultra 4(登録商標)(Millipore, MA, USA)膜を使用して、この上清を濃縮した。濃縮したポリミンP上清を場合によって4℃で保存した。次に、上清を、限外ろ過器によってダイアフィルターろ過した。この目的のため、30 kDa膜(例えば、Pellicon 2, Millipore, MA, USA)を使用した。最初に、30 kDa膜(例えば、Pellicon 2, Millipore, USA)を使用して、溶液を濃縮し、その後、5倍容積のバッファーB(HCl 25 %でpHを調整)に対して、十分に透析(ダイアフィルターろ過)した。透析ステップの結果、0.5〜0.8 U/mgの比活性を持つ、安定化されたアルファ-ガラクトシダーゼの組成物となる。
クロマトグラフィー方法によって、精製を実施した。2つの連続したクロマトグラフィーを実施した。最初のクロマトグラフィーステップ中、アルファ-ガラクトシダーゼをカチオン交換樹脂に結合させ、そして高塩処理によってカラムから溶出させた。第2のクロマトグラフィーステップ中、この酵素をアニオン交換樹脂に適用し、流下物から取得した。この精製工程で、組換えアルファ-ガラクトシダーゼ酵素が高度に精製された品質で生成した。
バッファーC: 50 mMリン酸ナトリウム、0.043 M L-アルギニン、pH 6.0 +/- 0.2(7 mS/cm +/- 0.1)
バッファーD: 50 mMリン酸ナトリウム、0.043 M L-アルギニン、350 mM NaCl; pH 6.0 +/- 0.2(40 mS/cm +/- 0.1)
バッファーE: 20 mM Tris/HCl、60 mM NaCl、pH 8.0 +/- 0.2(7.5 mS/cm +/- 0.1)
バッファーF: 25 mMリン酸ナトリウム、0.3 M NaCl、pH 7.0 +/- 0.2(>30 mS/cm)。
Poros(登録商標)HS 50 カラム(5 l、Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)をバッファーCで平衡化した。実施例5に記載したようにして取得した、安定化されたアルファ-ガラクトシダーゼ組成物をカラムに負荷した。本発明で使用したPoros(登録商標)HS 50カラムには、イオン交換物質33 mlについてタンパク質0.2〜1 gを負荷することができる。
酵素を含有する画分のプールを、限外ろ過器によってダイアフィルターろ過した。30 kDa膜(例えば、Pellicon 2, Millipore, USA)を使用した。このタンパク質溶液をバッファーEに対して十分に透析した。このタンパク質溶液を場合によって4℃で保存した後、その後の処理をした。
透析したプールを、2カラム体積のバッファーEで平衡化したQ Sepharose(登録商標)高速流カラム(500 ml、Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)に適用した。このカラムには多くとも、イオン交換樹脂1 mlに対して、タンパク質40 mgの最大濃度で適用すべきである。バッファーEを使用して、カラムを洗浄した。画分を回収し、アルファ-ガラクトシダーゼ活性についてモニターした。画分のアリコートを取り、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、活性について分析し、かつ可視化した。流下物に組換えアルファ-ガラクトシダーゼを溶出させた。分子量が64.5 kDaのアルファ-ガラクトシダーゼの純粋バンドを示す画分をプールして、保存用バッファー(バッファーF)に対して透析した。SDSゲル電気泳動が示すように、この酵素調製物は純粋である(図1)。HPLC分析において、この酵素調製物について、純度>99 %と判定された(図2)。
市販のゲル(4-20 %, Invitrogen, CA, USA)を使用して、SDSゲル電気泳動を実施した。ゲルに通した後、Coomassie Blue(Simply Blue(登録商標)、Invitrogen, CA, USA)で染色することによって、タンパク質を検出した。分子量マーカー(Mark 12(登録商標)、Invitrogen, CA, USA)を使用して、このタンパク質の見かけの分子量を決定した。結果を図1に示す。
分析用HPLCを使用して、タンパク質画分およびプールの純度を決定した。アリコート(100μl)をTSK G3000 SW(Tosoh Bioscience GmbH, Stuttgart, Germany)上に適用した。カラムに適切なバッファー(50 mM Tris/HCl、100 mM NaCl、pH 7.5)を通した。280 nmでの吸光度を測定することによって、タンパク質を検出した。結果を図2に示す。
Altschul et al.(1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410.
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Claims (16)
- アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質を含んでいる水性組成物であって、100 mMを超える濃度のアルギニンを含み、かつ、組成物の電導度が40 mS/cm以下であることを特徴とする、組成物。
- 組成物が150 mM〜2 M、または200〜400 mMの濃度のアルギニンを含んでいることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- さらに組成物の電導度が15 mS/cm〜25 mS/cm、または18 mS/cm〜22 mS/cmであることを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
- 組成物のpHがpH 5〜pH 7.5、またはpH 5.8〜pH 6.5であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
- 組成物が細菌宿主細胞から誘導されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- さらに組成物の総タンパク質含量が少なくとも20 mg/mlであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- さらにアルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性が0.5〜0.8単位/総タンパク質mgであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- タンパク質がEC 3.2.1.22の基質特異性を持つことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質が天然に生起するタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質が細菌生物体Bacteroides fragilisに由来する天然に生起するタンパク質であることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質が、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質を含んでいる水性組成物を安定化する方法であって、100 mMを超える最終濃度になるようにアルギニンを組成物に添加するステップを含み、かつ、組成物の電導度が40 mS/cm以下であることを特徴とする、方法。
- さらに組成物が請求項2〜11のいずれか1項に記載の組成物であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 精製されたアルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質を含んでいる水性組成物を調製する方法であって、以下のステップを含む方法:
(a) アルファ-ガラクトシダーゼの酵素活性を持つタンパク質を含有する組成物を提供し、
(b) 40 mS/cm以下の電導度を有するステップ(a)の組成物を、100 mMを超える濃度のアルギニンの存在中で濃縮し、そして
(c) ステップ(b)の組成物をカチオン交換クロマトグラフィーによって精製する。 - さらにステップ(b)の組成物が請求項2〜11のいずれか1項に記載の組成物であることを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 方法が、
(i) ステップ(b)の前および/または後、ならびに/あるいは
(ii) ステップ(c)の前および/または後に、
さらに1以上の別の精製ステップを含んでいることを特徴とする、請求項14または15に記載の方法。
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