ES2661929T3 - Nuevas alfa-galactosidasas - Google Patents

Abstract

El uso de una enzima purificada, que comprende: un polipéptido que tiene al menos 10 aminoácidos seleccionados de la posición en la siguiente secuencia numerada de acuerdo con ello cuando se alinea como se muestra en la figura 12 con la SEC. ID. n.º 2: M en residuo 10; G en residuo 47; G, en residuo 84; Y en residuo 86; Y en residuo 99; N en residuo 102; K en residuo 114; T en residuo 127; G en residuo 130; G en residuo 132; G en residuo 139; N en residuo 156; D en residuo 160; P en residuo 164; G en residuo 205; R en residuo 277; R en residuo 281; F en residuo 287; G en residuo 308; Q en residuo 312; I en residuo 317; R en residuo 333; D en residuo 340; G en residuo 346; G en residuo 349; G en residuo 360; D en residuo 363; D en residuo 364; N en residuo 367; H en residuo 369; G en residuo 370; T en residuo 371; G en residuo 396; E en residuo 462; N en residuo 463; T en residuo 465; T en residuo 467; P en residuo 468; R en residuo 483; G en residuo 484; L en residuo 486; T en residuo 489; N en residuo 498; I en residuo 508; D en residuo 513; W en residuo 517; E en residuo 519; G en residuo 521; D en residuo 525; I en residuo 528; N en residuo 531; F en residuo 533; I en residuo 549; P en residuo 553; I en residuo 573; A en residuo 590; G en residuo 595; N en residuo 601; e I en residuo 629; y donde la enzima tiene al menos identidad del 20 % con la SEC ID n.º: 2 cuando se alinea con la SEC ID n.°: 2, como una alfa-galactosidasa.

Description

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DESCRIPCION

Nuevas alfa-galactosidasas

Esta descripción se refiere a un grupo de polipéptidos que tienen actividades a-galactosidasa, demostrando especificidades de sustrato únicas y propiedades cinéticas superiores, que se usan para eliminación de monosacáridos inmunodominante en productos sanguíneos y tejidos. Específicamente se proporciona una nueva familia de a3 glucosidasas, usada para la retirada enzimática de antígenos de tipo B a partir de los productos sanguíneos reactivos de los grupos B y AB y el antígeno Galili a partir de tejidos de origen animal no humano, convirtiendo de este modo estos a células no inmunogénicas y a tejidos adecuados para trasplante.

Antecedentes de la invención

Como se usa en el presente documento, el término "productos sanguíneos" incluye sangre completa y componentes celulares derivados de sangre, incluyendo eritrocitos (glóbulos rojos) y plaquetas.

Hay más de treinta sistemas de grupos (o tipos) sanguíneos, de los que uno de los más importantes es el sistema AB0. Este sistema se basa en la presencia o ausencia de antígenos A y/o B. Estos antígenos se encuentran en la superficie de eritrocitos y plaquetas como así como en la superficie de células endoteliales y en la mayoría de las células epiteliales. El principal producto de la transfusión de sangre es eritrocitos, que son células sanguíneas rojas que contienen hemoglobina, de las que la función principal es el transporte de oxígeno. La sangre de grupo A contiene antígeno A en sus eritrocitos. De forma similar, la sangre de grupo B contiene antígeno B en sus eritrocitos. La sangre de grupo AB contiene ambos antígenos y la sangre de grupo 0 no contiene ningún antígeno.

Las estructuras del grupo sanguíneo son glucoproteínas o glucolípidos y se ha realizado un trabajo considerable para identificar las estructuras específicas que componen los determinantes o antígenos A y B. La especificidad del grupo sanguíneo ABH se determina por la naturaleza y unión de monosacáridos en los extremos de las cadenas de carbohidratos. Las cadenas de carbohidratos se unen a un armazón peptídico (glucoproteína) o lípido (glucoesfingolípido), que están unidos a la membrana celular de las células. El monosacárido inmunodominante que determina especificidad de tipo A es una W-acetilgalactosamina a1-3 enlazada terminal (GalNAc), mientras que el monosacárido correspondiente de especificidad de tipo B es una galactosa a1-3 enlazada (Gal). Las células de tipo 0 carecen de cualquiera de estos monosacáridos en los extremos de cadenas oligosacarídicas, que en cambio están terminadas con residuos de fucosa (Fuc) a1-2 enlazada.

Se encuentran una gran diversidad de estructuras de carbohidratos ABH de grupos sanguíneos debido a variaciones estructurales en las cadenas oligosacarídicas que llevan sacáridos inmunodominantes de ABH. La tabla 1 enumera las estructuras descritas en el hombre y aquellas que se han encontrado en extractos de glóbulos rojos humanos o en extractos de sangre. Para una revisión, véase, Clausen y Hakomori, Vox Sang 56 (1): 1-20,1989). Los glóbulos rojos contienen antígenos ABH de glicoproteínas N-ligadas y glucoesfingolípidos, mientras que se cree generalmente que los glucanos O-enlazados en glucoproteínas eritrocíticas, principalmente glucoforinas, están terminadas por ácido siálico y no con antígenos ABH. Los glucoesfingolípidos de cadena de tipo 1 no son productos endógenos de glóbulos rojos, pero se adsorben más a partir de plasma.

Tabla I:

Determinantes inmunorreactivos ABH de grupos sanguíneos de histocompatilidad de células humanas1

Nombre

Estructura hapténica Tipo de glucoconjugado Hallado en los glóbulos rojos n.°

Tipo 1 de A, ALeG

GalNAca1-3Galp1-3GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 1

Tipo 1 de A, ALeb

GalNAca1-3Galp1-3GlcNAcp1-R 2 4 Fuca1 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 2

A tipo 2, A

GalNAca1-3Galp1-4GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 3

Tipo 2 de A, ALey

GalNAca1-3Galp1-4GlcNAcp1-R 2 3 Fuca1 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado ¿Glucolípido? 4

Tipo 3 de A, O-ligado

GalNAca1-3Galp1-3GalNAca1-O-Ser/Thr 2 Fuca1 O-ligado 5

A tipo 3, Repetitivo

GalNAca1-3Galp1-3GalNAca1-3Galp1-4GlcNA cp1-R 2 2 Fuca1 Fuca1 Glucolípido Glucolípido 6

Tipo 4 de A, Globo

GalNAca1-3Galp1-3GalNAcp1-3Gala1-R 2 Fuca1 Glucolípido ¿Glucolípido? 7

Tipo 4 de A, Ganglio

GalNAca1-3Galp1-3GalNAcp1-3Galp1-R 2 Fuca1 Glucolípido 8

Tipo 1 de B, BLed

Gala1-3Galp1-3GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 9

Tipo 1 de B, BLeb

Gala1-3Galp1-3GlcNAcp1-R 2 4 Fuca1 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 10

Tipo 2 de B, B

Gala1-3Gap1-4GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 11

Tipo 2 de B, BLey

Gala1-3Galp1-4GlcNAcp1-R 2 3 Fuca1 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado ¿Glucolípido? 12

Tipo 3 de B, O-ligado

Gala1-3Galp-3GalNAca1-O-Ser/Thr 2 Fuca1 O-ligado 13

Tipo 4 de B, Globo

Gala1-3Galp1-3GalNAcp1-3Gala1-R 2 Fuca1 ¿Glucolípido? ¿Glucolípido? 14

Tipo 4 de B, Ganglio

Gala1-3Galp1-3GalNAcp1-3Galp1-R 2 Fuca1 ¿Glucolípido? 15

Tipo 1 de H, Lea

Galp1-3GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 16

Tipo 1 de H, Leb

Galp1-3GlcNAcp1-R 2 4 Fuca1 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido 17

Tipo 2 de H, H

Galp1-4GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado Glucolípido N-ligado 18

Tipo 2 de H, Ley

Galp1-4GlcNAcp1-R 2 3 Fuca1 Fuca1 Glucolípido N-ligado O-ligado ¿Glucolípido? 19

Tipo 3 de H, O-ligado

Galp1-3GalNAca1-O-Ser/Thr 2 Fuca1 O-ligado 20

Tipo 3 de H, H-A

Galp1-3GalNAca1-3Galp1-4GlcNAcp1-R 2 2 Fuca1 Fuca1 Glucolípido Glucolípido (A RBC) 21

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Tipo 4 de H, Globo

Galp1-3GalNAcp1-3Gala1-R 2 Fuca1 Glucolípido Glucolípido 22

Tipo 4 de H, Ganglio

Galp1-3GalNAcp1-3Gala1-R 2 Fuca1 Glucolípido 23

Thomsen-Frie Denrich Tf, T

Galp1-3GalNAca1-O-Ser/Thr O-ligado O-ligado (+SA) 24

Gal-A, reactividad cruzada de T

Galp1-3GalNAca1-3Galp1-4GlcNAcp1-R 2 Fuca1 Glucolípido Glucolípido (A RBC) 25

Tn, reactividad cruzada de A

GalNAca1-O-Ser/Thr O-ligado O-ligado (+SA) 26

1 Adaptado de Clausen y Hakomori, Vox Sang 56 (1): 1-20,1989. Designaciones: "?" indican estructuras glicolipídicas potenciales que no se han comunicado hasta la fecha.

La sangre de grupo A y B existe en varios subtipos. Los subtipos del grupo sanguíneo A son los más frecuentes y hay tres subtipos reconocidos de tipo A de sangre. Estos subtipos se conocen como A1, A intermedio (Aint) y A2. Hay diferencias tanto cuantitativas como cualitativas que distinguen estos tres subtipos. Cuantitativamente, los eritrocitos de A1 tienen más sitios A antigénicos, es decir, residuos W-acetilgalactosamina terminales, que eritrocitos de Aint que a su vez tienen más sitios A antigénicos que los eritrocitos de A2. Cualitativamente, los eritrocitos A1 tienen una estructura A repetida dual en un subgrupo de glucoesfingolípidos, mientras que las células A2 tienen una H en una estructura interna de un subgrupo similar de glicolípidos (Clausen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82 (4): 1199-203, 1985, Clausen y cois., J. Biol. Chem. 261 (3): 1380-7,1986). Estas diferencias entre A1 y subtipos A débiles se piensa que se refieren a las diferencias en las propiedades cinéticas de variantes de isoenzima A de grupo sanguíneo responsables de la formación de antígenos A (Clausen y cois., J. Biol. Chem. 261 (3): 1388-92,1986). Las diferencias de los subtipos del grupo B se cree que son exclusivamente de naturaleza cuantitativa.

La sangre de grupo A contiene anticuerpos frente al el antígeno B. A la inversa, la sangre del grupo B contiene anticuerpos frente al antígeno A. La sangre del grupo AB no contiene ningún anticuerpo y el grupo sanguíneo O tiene ambos. Los anticuerpos frente a estos y otros antígenos de grupos sanguíneos definidos de carbohidratos se cree que se facilitan por exposición continua a organismos microbianos que portan estructuras de carbohidratos relacionadas. Un individuo cuya sangre contiene cualquiera (o ambos) de los anticuerpos anti-A o anti-B no puede recibir una transfusión de sangre que contenga el/los antígenos correspondientes. Si una persona recibe una transfusión de sangre de un grupo incompatible, los anticuerpos del receptor de la transfusión de sangre revisten las células sanguíneas del grupo incompatible transfundido y causan que los glóbulos rojos sanguíneos se aglutinen, o se peguen conjuntamente. Pueden resultar de ahí reacciones de transfusión y/o hemólisis (la destrucción de los glóbulos rojos).

Con el fin de evitar reacciones de transfusión graves debidas a la presencia de anticuerpos frente a los antígenos de grupos sanguíneos A y B el grupo sanguíneo del donante y el receptor se hacen coincidir antes de transfusiones sanguíneas por procedimientos de tipificación. Por ejemplo, un receptor de tipo A de sangre puede transfundirse con seguridad con sangre de tipo A, que contiene antígenos compatibles, pero no con sangre de tipo B, que activaría una respuesta inmune adversa en el receptor. Debido a que la sangre de grupo O no contiene antígenos A o B, ella se puede transfundir en cualquier receptor con cualquier tipo de sangre, es decir, en receptores con tipos de sangre A, B, AB u O. Así, la sangre de grupo O se considera "universal" y se puede usar para todas las transfusiones. Así, es deseable para los bancos de sangre mantener grandes cantidades de sangre de tipo O. Sin embargo, existe una escasez de donantes de sangre de tipo O. Por lo tanto, es deseable y útil eliminar los antígenos A y B inmunodominantes en la sangre de tipos A, B y AB con el fin de mantener cantidades grandes de productos sanguíneos universales.

En un intento de incrementar el suministro de sangre de tipo O, se han desarrollado procedimientos para convertir sangre de tipo A, B y AB a sangre de tipo O. Aunque la conversión enzimática tanto de glóbulos rojos del grupo B como de glóbulos rojos del grupo A se ha logrado en el pasado, estos procedimientos más antiguos tienen varias desventajas, en particular que requieren cantidades excesivas de enzima y las especificidades de muchas enzimas modificadoras de glucano no están restringidas a escisión de solamente el grupo sanguíneo de los antígenos A o B.

Como se explicará más adelante, en el presente documento se describe una familia de polipéptidos que tienen especificidades de sustrato altamente refinadas y mejores propiedades cinéticas que se pueden usar para generar tejidos y productos sanguíneos que carecen de antígenos inmunodominantes, proporcionando de este modo un

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procedimiento comercial eficiente y rentable para suministrar, por ejemplo células sanguíneas universales (no inmunogénicas) para trasplante de células sanguíneas e incluso tejidos animales para xenotransplante en seres humanos.

Conversión de células del grupo B sanguíneas:

La conversión enzimática de sangre de tipo B usando a-galactosidasa de grano de café (Coffea canephora) recombinante se ha logrado usando 100-200 U/ml (Patente de los EE.UU. n.°: 4.427.777; Zhu y cois., Arch Biochem Biophys 1996; 327 (2): 324-9; Kruskall y cois., Transfusión 2000; 40 (11): 1290-8). La actividad específica de a-galactosidasa de grano de café se comunicó que es 32 U/mg usando p-nitrofenil-a-D-Gal con una unidad (U) definida como un nmol de sustrato hidrolizado por minuto (Zhu y cois., Arch Biochem Biophys 1996; 327 (2): 324-9). Se hicieron conversiones enzimáticas a pH 5,5 con aproximadamente 6 mg/ml de enzima a hematocrito al 80-90 % y las células O convertidas resultantes funcionaron normalmente en experimentos de transfusión y no se observaron parámetros clínicos adversos significativos (Kruskall y cois., Transfusión 2000; 40 (11): 1290-8). Este dato junto con publicaciones anteriores, demuestran claramente que la conversión enzimática de glóbulos rojos es factible y que tales células de grupo B convertidas en células del grupo O (B-ECO) por la enzima pueden funcionar tan bien como células no tratadas de tipo coincidente en medicina de transfusión. No obstante, las cantidades de enzimas requeridas para la seroconversión en estos estudios, incluso con la producción recombinante de la enzima, vuelven a este procedimiento para generar células ECO impracticable principalmente por razones económicas.

Las reivindicaciones de protocolos con una conversión mejorada de células B usando a-galactosidasa de Glycine max con una actividad específica de aproximadamente 200 U/mg, se han comunicado usando 5-10 unidades de enzima/ml de sangre (con hematocrito al 16 %) (véanse, Patentes de los U.S. n.°s: 5606042; 5633130; 5731426; 6184017). La a-galactosidasa de Glycine max se usó así a 25-50 |ig/ml, que representa una reducción significativa en las cantidades de proteína enzimática requeridas (50-200 veces) (Davis y cois., Biochemistry and Molecular Biology International, 39 (3): 471-485,1996). Esta reducción se debe en parte a la actividad específica más alta de la a-galactosidasa de Glycine max (aproximadamente 6 veces) así como a los procedimientos diferentes usados para conversión y evaluación. Los 200 U/ml de la enzima usada en el estudio de Kruskall y cois., (Transfusion, 40 (11): 1290-8, 2000) se calcularon para conversiones de unidades enteras (aproximadamente 220 ml de células envasadas) a hematocritos del 80-90 % y se analizaron cuidadosamente por clasificación de banco de grupos sanguíneos estándar así como por análisis de reactividad cruzada más sensible. Además, la eficiencia de conversión fue evaluada por el análisis de la supervivencia y la inmunidad inducida en pacientes que reciben transfusiones múltiples de células convertidas. Las conversiones enzimáticas se hicieron en tubos de prueba en escala de ml a hematocrito al 16 %, según se describe en la Patente de los EE.UU. n.°: 5606042 (y en las Patentes de los EE.UU. n.°s: 5633130; 5731426; 6184017) con a-galactosidasa de Glycine max y la eficiencia de conversión no se evaluó por análisis de reactividad cruzada. La conversión de las células a hematocrito al 16 % requirió 10 U/ml, mientras que las conversiones al 8 % requirieron 5 U/ml, indicando que convertir a hematocrito incrementado requiere más enzima aunque no se probaron concentraciones de células más altas. Así, parte de la reducción en cantidades de proteína enzimática requerida comparada con protocolos comunicados por Kruskall y cois., (Transfusión 2000; 40 (11): 1290-8), está relacionada con la concentración (hematocrito) de células usadas en conversión y esto puede representar más de 5-10 veces, aunque la comparación directa no es posible sin experimentación adicional. La Patente de los EE.UU. n.°: 5606042 (y las Patentes de los EE.UU. n.°s: 5633130; 5731426; 6184017) proporcionan adicionalmente mejoras en el tampón de conversión usando citrato de Na y glicina a pH menos ácida (preferentemente pH 5,8) e incluyendo proteína adicional en forma de BSA (albúmina de suero bovino) para la estabilización. De forma interesante, el tampón de conversión desarrollado para la a-galactosidasa de Glycine max se encontró que no era aplicable a la a-galactosidasa de grano de café. Aunque una cierta mejora en la conversión de células B puede proporcionarse por la Patente de los EE.UU. n.°: 5606042 (y por las Patentes de los EE.UU. n.°s: 5633130; 5731426; 6184017), es evidente que se requieren al menos más de 0,5 mg de enzima por mililitro de glóbulos rojos de tipo B envasados usando el protocolo revelado. Es probable que se requiera considerablemente más enzima que esto para obtener células plenamente convertidas a células O por los procedimientos más sensibles de clasificación usados en protocolos de clasificación de banco de grupos sanguíneos estándar. Además, el protocolo requiere introducción de proteína extraña adicional (BSA o albúmina de suero humano) así como exponer productos sanguíneos a un pH ácido significativo.

Bakunina y cois. (Bakunina y cois. Biochemistry (Moscú) 1998, p. 1420) han reivindicado la identificación y el aislamiento de una nueva a-galactosidasa a partir de la bacteria marina Pseudoaiteromonas spp. (KMM 701). La preparación de enzima aislada se purifica a una actividad específica de 9,8 U/mg, usando el sustrato pNP-Gal y tenía un peso molecular aparente por filtración de gel 195 kD. La preparación de enzimas escindió eficientemente el sustrato de monosacáridos pNP-Gal con una Km evidente por pNP-Gal de 0,29 mM así como varios disacáridos no ramificados con a-galactosa terminal que incluyen melibiosa y Gala1-3Gal y por tanto, no muestran una gran especificidad por el grupo sanguíneo B. Esta enzima escindirá por lo tanto oligosacáridos no ramificados con a-Gal tal como la estructura lineal B así como el antígeno Pt. La enzima se comunicó para tener un pH neutro óptimo (es decir, el pH óptimo que varía de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,7) y células del grupo B con tiempo de reacción de incubación 24 horas para clasificar células como células del grupo O. Sin embargo, los detalles del procedimiento de conversión y del consumo de enzimas no se describieron y la eficiencia de conversión evaluada por procedimientos de clasificación estándar con reactivos de clasificación autorizados sigue sin ponerse a prueba. La purificación a homogeneidad,

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clonación y expresión recombinante de la enzima se requerirá probablemente para proporcionar las cantidades y la calidad de proteína enzimática requerida para la conversión enzimática de los glóbulos rojos.

Los autores de la presente invención han revelado (documento U.S.S.N. 10/251271) la identificación y caracterización parcial de una actividad a-galactosidasa novedosa con actividad específica alta y especificidad de sustrato altamente restringida para el antígeno B de grupo sanguíneo. La actividad enzimática se identificó rastreando más de 2400 aislados bacterianos y fúngicos y se encontró en solamente unas pocas bacterias. La enzima estaba parcialmente purificada a partir de lisados celulares de cepa n.°: 2357 de Streptomyces griseoplanus (n.° de depósito en ATCC PTA-4077) y se obtuvo información de secuencia de aminoácidos parciales.

Es evidente a partir de lo anterior que se requieren mejoras adicionales en la conversión de las células B con el fin de hacer de esto una tecnología práctica y comercialmente aplicable. Las mejoras necesarias incluyen obtener enzimas de a-galactosidasa más eficientes y específicas, que permitan que la conversión tenga lugar preferentemente a pH neutro y sin proteína extraña añadida.

Ensayos para determinar aGal escindiendo actividades glucosidasa:

Los procedimientos anteriores de búsqueda, identificación y caracterización de exo-glucosidasas dependen del uso de derivados de monosacáridos simples como sustratos para identificar especificidad de sacáridos y especificidad de unión potencial. Sustratos de monosacáridos derivatizados, o raramente oligosacáricos derivatizados incluyen sin limitación p-nitrofenilo (pNP), bencilo (Bz), 4-metil-umbeliferilo (Umb), y 7-amino-4-metil-cumarina (AMC). El uso de tales sustratos proporciona herramientas fáciles, rápidas y económicas para identificar actividades glucosidasa y realiza rastreo a gran escala de diversas fuentes de enzimas aplicables en la práctica. Sin embargo, las propiedades cinéticas y las especificidades de sustrato buenas de enzimas glucosidasa pueden no reflejarse necesariamente en ensayos con tales estructuras simples. T ambién es posible que las enzimas novedosas con alto grado de especificidad y/o eficiencia selectiva para oligosacáridos de complejo y estructuras de glucoconjugados únicas existan, pero que éstas pueden haberse pasado por alto y permanezcan sin reconocer debido a los procedimientos de análisis. Por lo tanto, con el fin de identificar y seleccionar la exo-glucosidasas óptima para una estructura de oligosacárido o glucoconjugado complejo particular es preferible usar tales estructuras complejas en ensayos usados para rastrear fuentes de enzimas. Además, los ensayos preferidos usados para rastreo incluyen la selección para propiedades cinéticas preferibles tales como requerimiento de pH y actuación sobre sustratos, por ejemplo, unidos a la membrana de células.

En estudios previos, todas las a-galactosidasas (EC 3.2.1.22) y a-W-acetilgalactosaminidasas (EC 3.2.1.49) usadas para retirar los antígenos B y A de células sanguíneas se hubieron identificado y caracterizado usando principalmente derivados de p-nitrofenilmonosacáridos. De manera interesante, la mayoría de estas enzimas a-galactosidasa y a-W-acetilgalactosaminidasa usadas en estudios pasados son homólogos evolutivos como se evidencia por similitudes de secuencias de ADN significativas y de secuencias de aminoácidos significativas. Por lo tanto, la a-galactosidasa y la a-W-acetilgalactosaminidasa son homólogos cercanos (Wang y cois., J Biol Chem, 265: 21859-66,1990) y otras enzimas previamente usadas en la conversión de células sanguíneas, incluyendo la a-N-acetilgalactosaminidasa de hígado de pollo, la a-W-acetilgalactosaminidasa de acremonium fúngica y las a-galactosidasas bacterianas presentan todas similitudes de secuencia significativas. El análisis de secuencias de todas las hidrolasas de O-glicósido conocidas se ha agrupado en 85 familias distintas basadas en análisis de secuencias y las a-galactosidasas y a- acetilgalactosaminidasas anteriormente mencionadas se agrupan en la familia 27 (
http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/32.html ghf_). Estas enzimas se caracterizan por tener un mecanismo de retención de catálisis y por usar ácido aspártico ácido como el nucleófilo catalítico (Henrissat, Biochem Soc. Trans, 26 (2): 153-6, 1998; Rye y Withers, Curr Opin Chem Biol, 4 (5): 573-80, 2000). La estructura primaria de una a-W-acetilgalactosaminidasa bacteriana de Clostridium perfringens se comunicó que es distinta y no homóloga a a-W-acetilgalactosaminidasas eucariotas (Calcutt y cois. FEMS Micro Lett 214: 77-80, 2002) y se agruparon en una familia 36 de glucosidasas relacionada de forma distante, que contiene también a-galactosidasas y a-W-acetilgalactosaminidasas (
http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/ghf_32.html). El mecanismo catalítico de este grupo de enzimas se predice que sea similar a aquel de enzimas de la familia 27 debido a que existe alguna similitud de secuencia entre las enzimas de las dos familias.

Sumario de la invención

En un primer aspecto de la invención se proporciona la utilización de una enzima purificada, que comprende: un polipéptido que tiene al menos 10 aminoácidos seleccionados de la posición en la siguiente secuencia numerada de acuerdo con ello cuando se alinea como se muestra en la figura 12 con SEC. ID. n.°: 2:

M en residuo 10; G en residuo 47; G, en residuo 84; Y en residuo 86; Y en residuo 99; N en residuo 102; K en residuo 114; T en residuo 127; G en residuo 130; G en residuo 132; G en residuo 139; N en residuo 156; D en residuo 160; P en residuo 164; G en residuo 205; R en residuo 277; R en residuo 281; F en residuo 287; G en residuo 308; Q en residuo 312; I en residuo 317; R en residuo 333; D en residuo 340; G en residuo 346; G en residuo 349; G en residuo 360; D en residuo 363; D en residuo 364; N en residuo 367; H en residuo 369; G en residuo 370; T en residuo 371; G

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en residuo 396; E en residuo 462; N en residuo 463; T en residuo 465; T en residuo 467; P en residuo 468; R en residuo 483; G en residuo 484; L en residuo 486; T en residuo 489; N en residuo 498; I en residuo 508; D en residuo 513; W en residuo 517; E en residuo 519; G en residuo 521; D en residuo 525; I en residuo 528; N en residuo 531; F en residuo 533; I en residuo 549; P en residuo 553; I en residuo 573; A en residuo 590; G en residuo 595; N en residuo 601; e I en residuo 629; y

donde la enzima tiene al menos identidad del 20 % con la SEC ID n.°: 2 cuando se alinea con la SEC ID n.°: 2, como una alfa-galactosidasa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra el análisis de HPTLC de actividad a-galactosidasa el el sobrenadante de cultivo de Streptomyces griseoplanus en medios ricos (véase la tabla II para las formulaciones) con el sustrato tetrasacárido de grupo sanguíneo B marcado con AMC. La fermentación se lleva a cabo en durante 1 día en medios YM y durante 3 días en medios BP, a 30 °C, 220 rpm. Se llevaron a cabo ensayos mezclando volúmenes iguales del sobrenadante de cultivo y B-tetra 0,1 mM en NaPO4 100 mM (pH 6,8) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Se tomó muestra de un pl de cada reacción y se aplicó rápidamente en HPTLC. Designaciones: NE, sin control enzimático; Ctrl, reacción de control positivo usando la o-galactosidasa de grano de café; CS, sobrenadante del cultivo de S. griseoplanus; S, sustrato, es decir, tetrasacacárido B; B-tetra, tetrasacacárido B; H-tri, H-trisacárido; Origen: la posición en HPTLC donde se aplicaron las muestras. La placa de TLC se desarrolló en cloroformo-metanol-agua (volumen/volumen/volumen: 60/35/8). La placa se exploró y se fotografió por Bio-Rad Fluor-S Multilmager con un software Quantity One-4.1.1.

La figura 2 ilustra un análisis de HPTLC de ensayos enzimáticos de sobrenadantes de cultivo de Streptomyces griseoplanus, recuperados de cultivos cultivados en medios mínimos con 18 fuentes de carbono diferentes, con el sustrato de tetrasacárido de grupo sanguíneo B marcado con AMC. Se llevaron a cabo ensayos mezclando volúmenes iguales de cada sobrenadante de cultivo y B-tetra 0,025 mM en NaPO4 100 mM (pH 6,8) y se incubaron a temperatura ambiente. Se tomó muestra de un pl de cada reacción a 1 hora y se salpicó sobre placa de TLC. Las fuentes de carbono, indicadas por número 1-18 en la parte superior del panel, son 18 azúcares diferentes usados en la fermentación como se muestra en la tabla III. Designaciones: B-tetra: tetrasacacárido B, el sustrato; H-tri: trisacárido H, el producto del sustrato B-tetra por escisión con a-galactosidasa (los productos que se mueven deprisa por encima de H-tri indican la presencia de fucosidasa y pgalactosidasa en los sobrenadantes de cultivos que causan degradación adicional de trisacárido H en di- y monosacáridos). Fermentaciones: se descongelaron reservas criogenizadas de Streptomyces griseoplanus y se inocularon en YM (~1:5-10, v/v) y se incubaron a 30 °C, 220 rpm, durante 24 horas. El cultivo se hizo pasar sobre medios BP (~1:20, v/v) y la fermentación se continuó durante 72 horas. Los micelios, recogidos de 100 ml de cultivo BP por centrifugación, se lavaron 3 veces usando medios medios mínimos basales (los medios mínimos carecen de fuente de carbono y de aditivos de metales traza/vitaminas) para eliminar los medios ricos tanto como sea posible. El sedimento se resuspendió después en 100 ml de medios basales mínimos 2X con aditivos. La suspensión de micelios se alicuotó después en tubos cónicos de 50 ml a 2,5 ml/tubo. Las diferentes fuentes de carbono y agua se añadieron después a una concentración final del 0,5 % y a un volumen final de 5,5 ml. Cada fuente de carbono se puso a prueba por duplicado. Los 36 cultivos de 5,5 ml de cada una, con 18 diferentes fuentes de carbono diferentes se incubaron a 30 °C, 220 rpm. Se tomaron muestras alícuotas de 0,16 ml de cultivo de cada tubo a 43 y 71 horas.

La figura 3 ilustra un análisis de HPTLC de ensayos enzimáticos del sobrenadante de cultivo de Streptomyces griseoplanus cultivado en medios mínimos bien con galactosa o bien con lactosa como la única fuente de carbono con el sustrato tetrasacarídico de grupo sanguíneo B marcado con AMC. Se llevaron a cabo ensayos mezclando volúmenes iguales de cada sobrenadante de cultivo y B-tetra 0,1 mM en NaPO4 100 mM (pH 6,8) y se incubaron a temperatura ambiente. Se tomaron muestras de un pl a partir de cada reacción a 20 minutos y se aplicaron sobre una placa de HPTLC para análisis. Designaciones: B-tetra: tetrasacacárido B, el sustrato; H-tri: trisacárido H, el producto del sustrato B-tetra por escisión con a-galactosidasa (los productos que se mueven deprisa por encima de H-tri indican la presencia de fucosidasa y p-galactosidasa en los sobrenadantes de cultivos que causan degradación adicional de H-trisacárido en di- y monosacáridos); fuente de carbono: n.°: 4, galactosa; n.°: 7, lactosa; NE, sin control enzimático; Ctrl, reacción de control positivo usando la a-galactosidasa de grano de café.

La figura 4 ilustra un análisis de HPTLC del ensayo enzimático de actividad de a-galactosidasa en la solución de proteínas después de pasar con sustrato de B-tetra columna CEX o columna DEAE. Aproximadamente 450 ml de sobrenadante de Streptomyces griseoplanus, cosechados a partir de 800 ml de cultivo en una fermentación de 1 litro de fermentador cultivados en medios mínimos con galactosa, se almacenaron congelados a -80 °C, se descongelaron durante 24 horas a 4 °C y se centrifugaron durante 30 minutos a 4 °C, 20.000 rpm. El sobrenadante recuperado se hizo pasar a través de una columna de cromatografía de intercambio catiónico de 15 ml (CEX) (Macro-Prep High S Support, BioRad, n.° de Cat. 156-0031), pre-equilibrada con NaPO4 40 mM, NaCI 10 mM (pH 6,8). Se recogió el flujo dinámico que contenía la actividad de la enzima. La columna se lavó secuencialmente con 40 ml de tampón de equilibración, 40 ml del mismo tampón con un pH ligeramente incrementado (7,3). El flujo dinámico y los lavados se almacenaron y se cargaron directamente sobre una columna de DEAE de 2,5 ml (DEAE Sepharose, Sigma, n.° de Cat. DEF100)

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pre-equilibrada con tampón de equilibración de CEX y el flujo dinámico se recogió. La columna se lavó con 50 ml de tampón de equilibración CEX para eliminar la enzima residual de la columna. La solución de proteína almacenada de flujo dinámico de DEAE y lavado (600 ml) se concentró usando dispositivos de filtro Centricon Plus 80 Centrifugal (Millipore n.° de Cat. UFC5LGC02) y se intercambió el tampón en NaPO4 10 mM (pH 7,0) en el mismo dispositivo hasta un volumen final de 23 ml.

La figura 5 ilustra el análisis de HPTLC de actividad de a-galactosidasa en diversas fracciones de etapa de hidroxiapatita con sustrato de B-tetra. La muestra de proteínas en NaPO4 10 mM, pH 7,0, se cargó en una columna de hidroxiapatita de 2,5 ml (Bio-Gel HT Hydroxyapatite, Bio-Rad, n.° de Cat. 130-0150), pre-equilibrada con NaPO4 10 mM (pH 7,0). La columna se lavó con tampón de equilibración y se lavó/eluyó etapa a etapa con cantidad creciente de NaPO4 (10 a 100 mM). No se puede detectar ninguna actividad en el flujo dinámico, indicando la unión efectiva de la enzima a la columna en la presencia de NaPO4 10 mM (pH 7,0). La aparición de actividad enzimática en lavado de NaPO4 30 mM y la casi completa carencia de actividad en lavado de NaPO4 100 mM indican elución simple de la enzima a partir de la columna de hidroxiapatita simplemente usando NaPO4 30-50 mM (pH 7,0). Designaciones: Pre, solución proteica antes de que se cargue sobre la columna; FT, flujo dinámico.

La figura 6 ilustra el resultado de análisis de HPTLC de actividad de a-galactosidasa en fracciones de etapa de Cibacron Blue 3GA con sustrato de B-tetra. Las fracciones de actividad almacenadas de etapa de hidroxiapatita se diluyeron 1:1 con H2O y se aplicaron sobre una columna de Cibacron Blue de 2,5 ml (Cibacron Blue 3GA, Sigma, n.° de cat. C-1285), equilibrada con Tris 10 mM (pH 7,5). La columna se lavó con el tampón de equilibración y se lavó/se eluyó adicionalmente con tampón de equilibración con cantidad incrementada de sal según se indica al fondo del panel. La actividad enzimática se distribuyó entre lavados de NaCl 100 nM y de NaCl 400 mM. Designaciones: Pre, solución proteica antes de que se cargue sobre la columna; FT, flujo dinámico.

La figura 7 ilustra el análisis de HPTLC de actividad de a-galactosidasa en diversas fracciones de etapa de AEX con sustrato de B-tetra. La reserva de las fracciones de actividad enzimática de Cibacron Blue se concentraron y se sometieron a intercambio de tampón con Tris 40 mM, NaCl 10 mM (pH 8,5), a un volumen final de 3,7 ml. La solución de proteína se cargó en un 1 ml de columna AEX (Macro-Prep High Q Support, Bio-Rad n.° de Cat. 156-0051), pre-equilibrada con Tris 40 mM, NaCl 10 mM, pH 8,5. La columna se lavó en primer lugar con tampón de equilibración y después se lavó/eluyó con el mismo tampón conteniendo cantidad incrementante de sal según se indica el fondo del panel. Designaciones: Pre, solución de proteína antes de que se cargue en la columna; FT, flujo dinámico; Lavados/Eluidos, muestras de lavado o de elución de la columna; [NaCI] (mM), la concentración de sal en el tampón de lavado/elución; n.° de Fracción, fracciones recogidas en cada etapa de lavado/elución; B-tetra, tetrasacárido B, el sustrato; H-tri, trisacárido H, el producto (el producto que se mueve más rápido por encima de H-tri indica la presencia de actividad fucosidasa contaminante en la muestra de proteína que causa degradación de trisacárido H a disacárido).

La figura 8 ilustra un análisis de SDS-NuPAGE (gel de Bis-Tris al 4-12 % Novex con tampón MOPS, teñido con kit de tinción de plata SilverQuest, Estándar No Teñido Mark12, todos productos de Invitrogen) de actividad de a-galactosidasa de Streptomyces griseoplanus purificada por ALEX. El análisis de HPTLC de ensayos enzimáticos de fracción n.° 3 de la muestra de lavado/elución en cada concentración de sal en la etapa AEX cono se muestra en la figura 7, se situó en la parte superior del gel para comparación fácil de la actividad enzimática y la banda o bandas proteicas en el gel. Una única banda proteica, ~ 70 kDa, indicada por una flecha en el lado derecho del panel marcado con a-galactosidasa teórica, se muestra en la actividad de a-galactosidasa de pico. Designaciones: B-tetra, tetrasacárido B, el sustrato; H-tetra, trisacárido H, el producto.

La figura 9 ilustra el análisis comparativo de fracciones cromatográficas S12 de a-galactosidasa de Streptomyces griseoplanus parcialmente purificada por SDS-NuPAGE y ensayo de actividad enzimática usando tetrasacárido B, analizado por HPTLC. La a-galactosidasa de 70 kD teórica está indicada por una flecha en el lado derecho del panel usando marcador de peso molecular Rainbow (Amersham, n.° de Cat. RPN800). Designaciones: Ctrl, A-zima de NEB de concentración conocida; B-tetra, tetrasacárido B, el sustrato; H-tri, trisacárido H, el producto.

La figura 10 ilustra la alineación del péptido obtenido por secuenciación de Edman de digestión de tripsina fraccionada de HPLC de una a-galactosidasa de Streptomyces griseoplanus novedosa (SEC ID n.°: 1), con una proteína hipotética de Streptomyces avermitilis (n.° de acceso de GEnBaNK BAC74979.1, G 1:29610934, SeC ID n.°: 2). Los aminoácidos en SEC ID n.°: 2 que se corresponden con los de la SEC ID n.°: 1 están subrayados. La alineación se obtuvo por análisis de BLAST del péptido usando "búsqueda en corto, coincidencias casi exactas" frente a la base de datos NCBI nr [(Puntuación = 51,5 bits (114), Espera = 3e-06; Identidades = 18/29 (82 %), Luces = 24/29 (82 %), Huecos = 0/29 (0 %)]. La secuencia de aminoácidos se muestra en un código de letras individuales. Los residuos idénticos se indican por letras mayúsculas en negrita, residuos similares se indican por letras normales y residuos diferentes se indican por letras minúsculas.

La figura 11 ilustra un análisis de los ensayos enzimáticos de HPTLC del lisado del sobrenadante y del sedimento del cultivo de Streptomyces avermitilis cultivados en medios YM (véase la tabla II para formulaciones) con sustratos de tetrasacárido de grupo sanguíneo B marcado con AMC y de a-D-galactopiranósido (a-Gal pNP). La fermentación se llevó a cabo durante 3 días a 30 °C, 220 rpm. Se llevaron a cabo ensayos mezclando volúmenes iguales del

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sobrenadante de cultivo y B-tetra 0,1 mM o 0,5 mM de a-Gal pNP en NaPO4 100 mM (pH 6,8) y se incubaron a temperatura ambiente durante toda una noche. Se tomó muestra de un |il de cada reacción y se aplicó rápidamente en HPTLC. Designaciones: NE, sin control enzimático; Ctrl, reacción de control positivo usando a-galactosidasa de grano de café; CS, sobrenadante de cultivo de S. avermitilis; PT, lisado de precipitado; B-tetra, B tetrasacárido, H-tri, trisacárido H; MU, 4-metilumbeliferona, el producto de escisión de a-Gal pNP; Origen: la posición en HPTLC donde se aplicaron las muestras. La placa de TLC se desarrolló en cloroformo-metanol-agua (volumen/volumen/volumen: 60/35/8). La placa se exploró y se fotografió por Bio-Rad Fluor-S Multilmager con un software Quantity One-4.1.1.

La figura 12 ilustra la alineación de secuencia de proteínas de la a-galactosidasa novedosa teórica de Streptomyces avermitilis (SEC ID n.°: 2) con un número de serie de impactos de la primera proteína de funciones desconocidas sometiendo a BLAST la SEC ID n.°: 2 frente a bases de datos de NCBI nr. Se llevó a cabo el alineamiento usando alineamiento múltiple de CLUSTALW (NPS@: Network Protein Sequence Analysis, TIBS 2000: 25; 147-150, Combet C., C. Blanchet, C. y Geourjon Deléage G.). Datos de alineación: Longitud de alineación: 665; Identidad (*): 59 es 8,87 %; Fuertemente similar (:): 86 es 12,93 %; Débilmente similar (.): 42 es 6,32 %; Diferentes: 478 es 71,88 %. Las secuencias son como sigue: SA (625 residuos SEC ID n.°: 2); BTa(568 residuos SEC ID n.°: 3); BFa1 (605 residuos SEC ID n.°: 4); BFa2 (605 residuos SEC ID n.°: 5); BFp1 (595 residuos SEC ID n.°: 6);BFp (595 residuos SEC ID n.°: 7); BTp615 residuos SEC ID n.°: 8). SEC ID n.°: 9 es una secuencia consenso de las secuencias SEC ID n.°s: 2-8. Designaciones: SA, BT y BF, las a-galactosidasas teóricas de Streptomyces avermitilis MA-4680, Bacteroides thetaotaomicron VPI-5482 y Bacteroides fragilis, respectivamente; ay p 2 copias diferentes de a-galactosidasas de B. thetaotaomicron VPI-5482; a1 y p1: 2 copias diferentes de a-galactosidasas de B. fragilis YCH46; a2 y p2: dos copias diferentes de a-galactosidasas de diferentes B. fragilis NCTC 9343.

La figura 13 ilustra un análisis de HPTLC de las actividades enzimáticas, de lisados celulares completos del sedimento celular de cultivos inducidos por IPTG de clones de E. coli (que contienen plásmidos que expresan el gen de a-galactosidasa de Streptomyces avermitilis), con el sustrato tetrasacárido de grupo sanguíneo B marcado con AMC. Un ml de medio TB con antibióticos (48,2 g de Caldo EZmix Terrific, Sigma T-91790, 8 ml de glicerol, 34 mg de cloranfenicol y 30 mg de kanamicina por litro de medio) se añadió a cada 1,5 ml de microtubo conteniendo la clavija de agar que lleva una colonia individual. La tapa se cerró y la incubación se llevó a cabo durante toda una noche a 37 °C, 250 rpm. Medio ml de un cultivo durante toda una noche se inoculó en 10 ml de medio en un tubo cónico de 50 ml y la inoculación se llevó a cabo en las mismas condiciones. La densidad celular alcanzó D.O a 600 nm de 0,3-0,6 en aproximadamente 2 horas a 220 rpm. El cultivo se retiró del agitador y se mantuvo a temperatura ambiente durante ~ 20 minutos. Mientras tanto, la temperatura de la incubadora se bajó a ~ 26 °C. Se añadió después IPTG a cada cultivo a una concentración de 0,1 mM y todos los cultivos se re-situaron en el agitador y se agitaron a 220 rpm, para comenzar la inducción de proteínas. Se retiró una alícuota de 0,5 ml asépticamente de cada tubo en 1 hora y las células se sedimentaron con una centrífuga de mesa a su ajuste más alto durante 5 minutos. Se añadieron veinte |il de tampón de lisis (0,9 ml de NaPO4 40 mM, NaCI 10 mM, pH 6,8, 0,1 ml de BugBuster 10X, Novagen 70921-4,1 mg de lisozima/ml y 5 |il de benzonasa, Novagen 70664-3, por mililitro de tampón de lisis) a cada tubo para suspender el sedimento y lisar las células, lo que se ayudó pipeteando la suspensión arriba y abajo unas pocas veces. La lisis se completó durante 5-10 minutos. Una parte alícuota (2,2 |il) del lisado total en bruto se analizó subsiguientemente mezclando con igual volumen de una solución de sustrato conteniendo 0,1 mM de B-tetra en NaPO4 100 mM (pH 6,8) y se incubó a temperatura ambiente. Un |il de la digestión se retiró en 10 minutos y se salpicó sobre una placa de HPTLC. Designaciones: Ctrl, reacción de control positivo usando la a-galactosidasa de grano de café; 1 y 2: los lisados completos de dos colonias individuales de la misma construcción que expresan la galactosidasa novedosa de longitud total de Streptomyces avermitilis; B-tetra, tetrasacárido B; H-tri, trisacárido H; Origen: la posición en HPTLC donde se aplicaron las muestras. La placa de TLC se desarrolló en cloroformo-metanol-agua (volumen/volumen/volumen: 60/35/8). La placa se exploró y se fotografió por un Bio-Rad Fluor-S Multilmager con software Quantity One -4.1.1. La figura 14 confirmó que la B-zima novedosa se puede expresar eficientemente en E. coli, pero como cuerpos de inclusión. Por lo tanto, la expresión necesita optimizarse o un procedimiento de replegamiento eficiente necesita desarrollarse para la aplicación de esta B-zima novedosa.

La figura 14 ilustra un análisis SDS-NuPAGE de a-galactosidasa (SEC ID n.°: 2) expresado en E. coli (gel de Bis-Tris al 4-12 % Novex con tampón MOPS, teñido con kit de tinción de Azul Coloidal, Estándar no Teñido Mark12, todos productos de Invitrogen). El lisado de cada cultivo se preparó de forma similar como se describe en la leyenda de la figura 13 con una escala incrementada. Una alícuota de cada lisado completo se centrifugó a 14000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se eliminó. Doce |il de lisado o sobrenadante completo se mezcló con 4 |il de tampón LDS 4X, p-mecaptoetanol suplementado al 10 % (v/v). El sedimento se suspendió en tampón de muestra LDS 1X, suplementado con p-mecaptoetanol al 2,5 % (v/v), a una proporción de 16 |il de tampón de muestra/12 |il de lisado completo. Todas las muestras se calentaron a 70 °C durante 10 minutos para análisis de SDS-NuPAGE. Designaciones: WL, lisado completo; Sup, sobrenadante; PT, sedimento; U, muestra preparada a partir de cultivo no inducido; I, muestra preparada a partir de cultivo inducido.

La figura 15 ilustra alineación de secuencia de proteínas ClustalW Múltiple (BoxShade 3.21) de la familia de a-galactosidasa novedosa para identificar las regiones conservadas para el diseño de cebadores degenerados. Los restos idénticos y las sustituciones conservadas se destacan en negro y gris oscuro. Las secuencias alineadas son de

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S. avermitilis MA-4680, B. thetaiotaomicron VPI-5482 y B. fragilis NCTC 9343. Las dos secuencias de B. fragilis YCH624, casi idénticas a aquellas de B. fragilis NCTC 9343, no están incluidas. Las regiones conservadas usadas para diseñar un par de cebadores degenerados para clonar el gen de a-galactosidasa parcial de S. griseoplanus 2357 están indicadas con una flecha hacia delante para cebador directo y con una flecha hacia atrás para cebador inverso.

La figura 16 ilustra la secuencia de proteínas de una a-galactosidasa de S. griseoplanus destacando las regiones que corresponden a los cebadores usados para la clonación. Los cebadores directo e inverso están coloreados de gris oscuro y gris claro respectivamente. Los cebadores degenerados están subrayados.

La figura 17 ilustra un análisis de HPTLC de ensayos de enzima de FragB a-galactosidasa recombinante purificada con un panel de oligosacáridos de diversas estructuras. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con 10 nmoles de sustrato y 21 ng de enzima en 10 |il de NaPO4 10 mM, pH 6,8/NaCl 2,5 mM, suplementado con 0,25 mg/ml de BSA. Un |il de los ensayos enzimáticos se retiró en los puntos temporales deseados y se salpicó sobre una placa de TLC revestida de gel de sílice (EMD Chemicals, nJ), que se desarrolló en cloroformo-metanol-agua (vol./vol./vol.: 30/60/10) durante 15 minutos y los desarrollos de producto se detectaron por tinción de Orcinol/H2SO4. Designaciones: Tiempo de reacción para cada sustrato de izquierda a derecha: 0 (muestra tomada de la reacción control no conteniendo ninguna enzima), 5, 10, 20, 40 y 80 minutos. Las estructuras detalladas de los sustratos se describen en la tabla V. La escisión del sustrato dio como resultado migración incrementada como se observa para B-tri, B-di y B lineal, pero no para P1, Pk y A-tri, indicando la falta de escisiones.

La figura 18 ilustra un análisis de HPTLC de análisis enzimático de B-zima de FragB recombinante purificado con AMC-B-tetra a pH diferente. Las reacciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con 1 nmol de sustrato y ~ 8 ng de enzima en 10 |il de tampón a pH 2,0 a 9,0, suplementado con 0,25 mg/ml de BSA. Un |il de los ensayos enzimáticos se retiró en los puntos temporales deseados y se salpicó sobre una placa de HPTLC, que se desarrolló en cloroformo-metanol-agua (vol./vol./vol.: 60/35/8). La placa se exploró y se fotografió por Bio-Rad Fluor-S Multilmager con un software Quantity One-4.1.1. Los tampones 1 X usados en las reacciones se derivaron de tampones 2 X descritos como sigue: pH 2,0, ácido cítrico 0,1 M; pH 2,5-5,5, ácido cítrico 0,1 M/Na2HPO4 0,2 M; pH 6,0-7,5, Na2HPO4 0,2 M/NaH2PO4 0,2 M; pH 8,0-9,0, Tris 0,2 M/HCl. Se tomaron muestras de las mezclas de ensayo a los 5 (panel superior) y 10 min (panel inferior). Designaciones: B-tetra, tetrasacárido B; H-tri, trisacárido H; Origen: la posición en HPTLC donde se aplicaron las muestras.

La figura19 ilustra el análisis de la actividad enzimática a pH diferente usando derivado para-nitrofenilo cromogénico, Gala-pNP. Los ensayos se llevaron a cabo usando sustrato 2,5 mM, 8,5 |ig de enzima en 400 |il de tampones entre pH 2,0-9,0 como se describe en la leyenda de la figura17, a 26 °C durante 5 minutos, se terminaron con 600 |il de Na2CO3 1,0 M y lectura a 405 nm. Se usó un coeficiente de extinción molar de 18.300 para calcular el importe de nitrofenol liberado. Una unidad se definió como la cantidad de enzima necesaria para escindir 1 pinol de sustrato por minuto en la condición experimental. La actividad específica en cada pH se calculó después y se trazó frente a pH.

La figura 20 ilustra la especificidad de sustrato de a-galactosidasas de Bacteroides fragilis. Se llevaron a cabo ensayos enzimáticos sin enzima (-) y con ~ 30 ng de enzima (+), sustrato a ~ 1,0 mM en 10 |il de NaPO4 10 mM, pH 6,8, NaCI 2,5 mM, suplementado con 0,25 mg/ml de BSA. Las reacciones sometieron a seguimiento por TLC durante incubación a 26 °C y se muestra el punto temporal de 2 horas. Las escisiones del trisacárido de grupo sanguíneo B ramificado (B-tri) al disacárido de H (H-di) por a-galactosidasa de BFa2 (FragA) y de todas las estructuras de B por a-galactosidasa de BFR1 (FragB), se completaron en 20 minutos (no mostrado), mientras que no se detectó ninguna escisión de otros sustratos oligosacarídicos después de 2 horas de incubación. Las placas de TLC se desarrollaron en cloroformo/metanol/agua (30/60/10, v/v/v) durante 15 min y se tiñeron calentando con orcinol al 0,05 % en H2SO4 0,5 M.

Descripción detallada de la invención

Se divulga el desarrollo y la aplicación de una estrategia de rastreo y selección para a-galactosidasas novedosas con especificidades preferidas para las estructuras de grupo sanguíneo B y con realización preferida en la conversión enzimática de los productos de sangre y tejidos animales, a lo largo de un intervalo de pH aproximadamente neutro. La tabla 1 enumera las estructuras complejas de antígenos halladas en las células sanguíneas.

Para el propósito de esta divulgación, los derivados de oligosacárido activo de grupo B se sintetizaron o produjeron por retirada enzimática de aGal desde distintos sustratos. Adicionalmente, los glucoesfingolípidos con estructuras 3, 6, 21 y 25 se purificaron a partir de eritrocitos humanos o se produjeron de los mismos por tratamientos de glucosidasa como se describe previamente (Clausen y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82 (4): 1199-203,1985, Clausen y cols., J Biol Chem. 261(3): 1380-7,1986, Clausen y cols., Biochemistry 25 (22): 7075-85,1986, Clausen y cols., J Biol Chem. 262(29): 14228-34, 1987). Se desarrollaron ensayos de cromatografía en capa fina para determinar cuantitativamente la retirada de aGal o aGalNAc de los derivados de AMC o glucoesfingolípidos.

Las a-galactosidasas preferidas tienen especificidad de sustrato alta para estructuras de sacáridos ramificadas de grupo sanguíneo B, un pH óptimo generalmente neutro y se pueden producir de forma rentable como proteínas

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recombinantes en organismos unicelulares tales como bacterias y levadura. La solicitud de patente anterior de los autores de la presente invención (documento U.S.S.N. 10/251271), desarrolló un ensayo de rastreo para las actividades enzimáticas preferidas usando sustratos derivados de AMC de tetrasacárido B y midió actividades enzimáticas a pH neutro. Adicionalmente, se compararon actividades con actividades usando derivados monosacarídicos de p-nitrofenilo para identificar actividades con preferencia o exclusividad por los sustratos complejos, en esa solicitud, los autores de la presente invención revelan el uso de este ensayo de rastreo en un panel grande de aislados bacterianos y fúngicos (3100) y en ella los autores de la presente invención identificaron varios aislados bacterianos que expresan actividades a-Wgalactosaminidasa o a-galactosidasa medidas con sustratos de AMC de tetrasacárido A o B, pero ningún nivel o niveles insignificantes de actividad con los sustratos de monosacáridos correspondientes. Una de cada de estas actividades se analizó adicionalmente después de serotipar y genotipar estos aislados en forma de cepas de Streptomyces. El análisis de la cepa n.°: 8 que se determinó para tener actividad a-W-acetilgalactosaminidasa reveló que la actividad era insoluble y estaba asociada con la masa celular. La cepa n.°: 8 se depositó el 14 de febrero de 2002 con la American Type Culture Collection (ATCC) y se le hubo asignado el número de depósito de ATCC PTA-4076. En contraste, la cepa n.°: 2357 se determinó que tenía actividad a-galactosidasa y la actividad se determinó que era soluble, encontrada en el sobrenadante de células transformadas lisadas por prensa francesa. La cepa n.°: 2357 se depositó el 14 de febrero de 2002 con la American Type Culture Collection y se le asignó el n.° de Depósito de ATCC PTA-4077. Debido a que es en gran parte más simple purificar una proteína soluble, los autores de la presente invención eligen purificar y secuenciar inicialmente la proteína a partir de la cepa n.°: 2357.

La enzima que los autores de la presente invención encontraron en la fracción soluble de la cepa n.°: 2357 se purificó parcialmente. El análisis detallado de la especificidad de sustrato de la a-galactosidasa purificada parcialmente demostró una especificidad buena sin precedentes por las estructuras de grupo sanguíneo de cadena B ramificadas, pero no se escindió ninguna estructura lineal provista de caperuza por residuos de a1,3 o a1,4 galactosa por esta enzima. El análisis de su pH óptimo mostró que las condiciones preferidas son pH 5,5 a 7,0. La actividad a-galactosidasa identificada se prefiere altamente por lo tanto por encima de enzimas conocidas en la técnica anterior debido a su especificidad de sustrato restringida, su alta actividad específica para estructuras de grupo y su pH óptimo. El análisis por SDS-PAGE del extracto en bruto parcialmente purificado resultante reveló 3-4 bandas de proteína en la región de 40-80 KDa que tienen la actividad de a-galactosidasa. El análisis de filtración de gel de la preparación mostró la actividad migrada comparable con BSA, indicando una proteína globular que tiene un peso molecular de aproximadamente 40-80 kDa. Se obtuvo una secuencia corta individual: Phe-Ala-Asn-Gly-Leu-Leu-Leu-Thr (SEC ID n.°: 1).

Después de estos estudios y como se describe, hemos descubierto una nueva familia de polipéptidos, que tienen actividades a-galactosidasa y han desarrollado procedimientos para su inducción, purificación, secuenciación y clonación. Como se discute más adelante, la familia polipeptídica es distinta de la proteína purificada parcialmente previamente de la cepa n.°: 2357 y notablemente estos miembros de la familia no contienen la secuencia mostrada como SEC ID n.°: 1. La nueva estrategia de inducción implica crecimiento de la bacteria apropiada en fuentes de carbono definidas y medio mínimo, lo que da como resultado un incremento significativo en producción de los polipéptidos de a-galactosidasa. Los a-galactósidos conocidos (que generalmente tienen un pH óptimo ácido y especificidad de sustrato por Gala-pNP u otros monosacáridos simples) no se segregan en S. griseoplanus y en cepas de Streptomyces relacionadas en las mismas condiciones de cultivo que producen estos polipéptidos novedosos.

También se proporciona un procedimiento novedoso para la expresión recombinante y la purificación de ciertos polipéptidos a-galactósidos. Esta estrategia de purificación aplicada en combinación con los procedimientos de cultivo e inducción novedosos dio como resultado purificación exitosa a homogeneidad aparente de los polipéptidos de a-galactosidasa en cantidades suficientes para la secuenciación de aminoácidos y conversiones tisulares y de producto sanguíneo.

Las siguientes etapas sucesivas se usaron para lograr purificación a homogeneidad aparente: sobrenadante de caldo celular derivado de cultivos de S. griseoplanus n.°: 2357 se hizo pasar primero no unido exitosamente a través de columnas CEX y DEAE (figura 4). Subsiguientemente la actividad se une y se eluye sucesivamente en una columna de hidroxiapatita (figura 5), una columna Cibacron Blue (figura 6) y finalmente una columna AEX (figuras 7 y 8). Por todo el esquema de purificación la proteína se siguió por un análisis de su actividad enzimática en diversas fracciones; el producto de proteína final se analizó también por SDS-NuPAGE. Se obtuvo identificación de la proteína a-galactosidasa por comparación del patrón de bandas de proteínas por tinción de plata de SDS-NuPAGE y por cromatografías de filtración de gel de AEX y de S12 (figuras: 8-9). Solamente una banda que migra como 70 kD por SDS-NuPAGE y por filtración de gel de S12, correspondió con la actividad a-galactosidasa observada. La proteína identificada según se describe, se separó finalmente por electroforesis en gel NuPAGE y se cortó la banda de 70 kD teñida por Coomassie del gel y se sometió a análisis de secuencia de aminoácidos. Se obtuvo información de secuencia de aminoácidos interna por análisis espectrométrico de masas (MALDI-TOF) y degradación de Edman después de digestión con tripsina. Ninguna de las secuencias cortas obtenidas mostró un alto grado de identidad con secuencias conocidas en bases de datos públicas (GenBank). Una búsqueda de bases de datos de Blast de un péptido de 30 aminoácidos (la secuencia de péptidos más larga obtenida por secuenciación interna y confirmada por eM/EM, usando "Búsqueda en corto, coincidencias casi exactas") identificó una fase de lectura abierta teórica

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predicha para codificar una proteína (SEC ID n.°: 2) a partir de la secuencia del genoma Streptomyces avermitllis (n.° de acceso de Genbank: BAC74979.1, Gl.: 29610934). El genoma completo de Streptomyces griseoplanus no está disponible y ninguna secuencia relacionada derivada de este género se identificó en búsquedas de bases de datos. Streptomyces avermitilis y Streptomyces griseoplanus están estrechamente relacionados. Los autores de la presente invención pusieron a prueba por lo tanto si Streptomyces avermitilis contenía también la actividad a-galactosidasa identificada, que previamente se demostró que es muy rara entre aislados bacterianos incluyendo muchos aislados de Streptomyces.

El sobrenadante de cultivo de Streptomyces avermitilis (ATCC 31267) se sometió a ensayo para la a-galactosidasa segregada y como se muestra en la figura 11, se observó evidencia clara de la presencia de actividades a-galactosidasa tanto en sobrenadante de cultivo como en lisado de sedimento, según se determinó por digestión de sustratos oligosacarídicos B-tetra. Sin embargo, la escisión de un sustrato simple (a-Gal pNP) por la a-galactosidasa de Streptomyces avermitilis segregada fue insignificante. En contraste, la escisión completa de a-Gal pNP se observó para la a-galactosidasa de Streptomyces avermitilis obtenida a partir de la fracción celular. Por lo tanto, las a-galactosidasas segregadas y celulares no son probablemente de las mismas identidades. Parte de la galactosidasa segregada es probable que sea la a-galactosidasa novedosa que prefiere sustrato ramificado a sustratos simples (lineales), mientras que la mayoría de las actividades de a-galactosidasa celular si no todas se observa que tienen actividades glucosidasa convencionales. Las similitudes del polipéptido de S. avermitilis (SEC ID n.°: 2) a la a-galactosidasa de S. griseoplanus con respecto a la secreción en caldo de cultivo, peso molecular predicho y las similitudes de secuencia con S. griseoplanus, indica que la proteína de S. avermitilis representa un homólogo de la a-galactosidasa derivada de S. griseoplanus identificada originalmente.

El polipéptido identificado a partir de S. avermitilis (SEC ID n.°: 2) consiste en 625 aminoácidos y no mostró ninguna similitud significativa con cualesquiera otras proteínas conocidas. Búsquedas de nuevo con la SEC ID n.°: 2 identificaron varias secuencias de proteínas novedosas (SEC ID n.°: 3-8) a partir exclusivamente de genomas procariotas, con similitudes de secuencia mostradas como sigue en la tabla 1A:

Tabla 1A:

Identidad (en % general) de a-galactosidasa de Bacteroides frente a la enzima de S. avermitilis.

SEC ID n.°

Gl n.° Abreviat Aminoácidos Identidad a secuencia de S. avermitilis (%)

2

gi|29833810|ref|NP_828444.11 S. avermitilis SA 625 100

3

gi |29340474|gb|AA078266.1| Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 BTa 568 30,35

4

gi|53715733|ref|YP 101725.1| Bacteroides fragilis YCH46 BFa1 605 30,23

5

gi|60495103|emb|CAH09922.1| Bacteroides fragilis NCTC 9343 BFa2 605 29,30

6

gi|60491830|emb|CAH06588.1| Bacteroides fragilis NCTC 9343 BFP1 595 24,30

7

gi|53712216|ref|YP 098208.1| Bacteroides fragilis YCH46 BFP2 595 24,30

8

gi|29341569|gb|AA079356.11 Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482 BTP 615 22,82

Todos los polipéptidos identificados se analizaron por alineamientos de secuencias múltiples como se muestra en la figura 12; se proporciona una secuencia consenso como SEC ID n.°: 9. Estos polipéptidos representan una familia nueva de a-galactosidasas novedosas, que tienen especificidad de sustrato única descrita en más detalle más adelante y que tienen la característica común de un pH óptimo aproximadamente neutro.

Las secuencias génicas de estos miembros de esta familia de a-galactosidasas han permitido desarrollo de sistemas de expresión recombinante para estos polipéptidos, usando una diversidad de células procariotas y eucariotas y de sistemas de expresión procariotas y eucariotas, y permiten purificación de formas recombinantes de estas enzimas usando procedimientos de purificación establecidos (por ejemplo sistemas de expresión de marca His y sistemas de purificación).

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Ejemplos

Ensayos enzimáticos:

Los sustratos constituidos por una serie de estructuras oligosacarídicas de grupos sanguíneos ABH complejas, tales como derivados de 7-amino-4-metil-cumarina se sintetizaron a medida por Alberta Chemical Research Council (véase, documento U.S.S.N. 10/251271). Otros sustratos estaban disponibles a partir de los diferentes proveedores (Sigma-Aldrich). Todos los reactivos usados fueron de calidad analítica o mayor.

Se llevaron a cabo estudios enzimáticos estándar como sigue con los diferentes sustratos. Se llevaron a cabo ensayos típicos por el siguiente procedimiento: Se incubaron muestras proteicas con oligosacárido marcado con AMC a concentración 0,05 mM, con monosacárido marcado con MU a concentración 2,5 mM, en 2.2-10 |il de reacción en NaPO4 50 mM (pH 6,8) durante el tiempo deseado a 26 °C o a temperatura ambiente. Se tomó alícuota de un |il a diversos puntos temporales y se salpicó sobre HPTLC siguiendo el desarrollo de productos. La placa de TLC se desarrolló en cloroformo-metanol-agua (volumen/volumen/volumen: 60/35/8). La placa se exploró y se fotografió por Bio-Rad Fluor-S Multilmager con un software Quantity One-4.1.1. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de enzima requerida para escindir 1 |imol de sustrato por minuto en las condiciones experimentales.

Fermentaciones:

Las formulaciones de diversos medios se enumeran en la Tabla II. Fermentaciones en matraz y tubos cónicos de 50 ml se llevaron a cabo en condiciones convencionales: 30 °C, 220 rpm durante el periodo de tiempo deseado. La fermentación se llevó a cabo a pH 6,8, 30 °C, 300-600 rpm, O.D. = 50 %.

Tabla II

Formulaciones de medios1 para cultivar Streptomyces griseoplanus para la producción de polipéptidos de a-galactosidasa

Medio YM

Componentes

g/l.

Extracto de levadura

3

Extracto de malta

3

Bacto Soytone

5

Glucosa

10

Medio BP

Componentes

g/l

Bacto Soytone

15

Extracto de malta

5

Extracto de levadura

5

Pharmamedia

5

KH2PO4

1

MgSO4-7H2O

1

CaCO3

2.5

Glucosa

25

N-acetilglucosamina2

0,1

Medio mínimo

5

10

15

20

25

30

35

Componentes

g/l

(NH4)2SO4

2

MgSO4-7H2O

0,6

NaH2PO4 0,2 M /K2HPO4 a pH 6,8

7,5 ml

CaCl2

0,1

ZnSO4•7H2O

0,1

FeSO4•7H2O

0,1

MnCl2 • 4H2O

0,1

Fuente de carbono2

5

Suplemento de mineral traza (ATCC n.° de Cat. MD-TMS)2

10 ml

Suplemento de vitaminas (ATCC n.° de Cat. MD-TMS)2

10 ml

1. Todos los medios de comunicación sin los componentes indicados se esterilizaron a 121 °C durante 25 minutos.

2. Los componentes se esterilizaron por filtración de 0,22 |im y se añadieron a la receta deseada después de la esterilización.

Ejemplo 1: inducción de expresión en a-aalactosidasa en Streptomvces griseoplanus

S. griseoplanus se mostró en el pasado que era capaz de producir una a-aalactosidasa novedosa segregada cuando se cultivó en medios apropiados, aunque esta enzima nunca se purificó hasta homogeneidad. Una reserva criogenizada de este microorganismo se inoculó en 5 a 10 volúmenes de medios YM y se cultivó durante 24 horas a 30 °C, 200 rpm, en matraces en agitación o en tubos cónicos de 50 ml en agitación dependiendo de la escala del cultivo. El cultivo de YM se inoculó después en aproximadamente 20 volúmenes de medios BP continuando incubación en las mismas condiciones, induciendo producción de la galactosidasa. La actividad enzimática asociada con el cultivo usualmente presenta su pico en tres días. El sobrenadante de cultivo que contiene la actividad enzimática se recogió por centrifugación. La figura 1 muestra un análisis de HPTLC del ensayo enzimático de un sobrenadante de medios de cultivo gastados típicos con el sustrato B-tetra. Se expresó la a-galactosidasa identificada en un rendimiento volumétrico muy bajo tanto en lisados totales de células así como se segregó en el medio (aproximadamente ~0,1 U/l de cultivo según se analizó por el ensayo enzimático de B-tetra descrito en procedimientos generales). Por lo tanto, era grandemente imposible aislar suficiente cantidad de proteína pura para la secuenciación (véase, documento U.S.S.N. 10/251271). El nivel de expresión bajo de la proteína deseada, la heterogeneidad y la riqueza proteica de los medios ricos se consideró que representaban los factores principales dificultando purificar actividad suficiente para identificación de proteínas.

Se consideró necesario en el presente estudio, desarrollar una estrategia para inducir la expresión y secreción de la enzima para lograr una actividad específica de partida mayor. Una aproximación fue usar una fuente de carbono alternativa en lugar de glucosa. Otra aproximación fue reducir la complejidad de los medios usando medios homogéneos con materiales orgánicos pequeños en particular el contenido en proteínas, es decir, el medio mínimo. El aislamiento de la actividad enzimática de tales medios se espera que sea más fácil y se espera que los rendimientos de enzima en cada etapa se incrementen.

Considerando que el crecimiento del microorganismo en medios mínimos es muy lento y considerando la sensibilidad de producción de a-galactosidasa a la composición de medios de crecimiento, S. griseoplanus estuvo en primer lugar en medios ricos tras el protocolo estándar, es decir, 24 horas en YM, 72 horas en BP. Los micelios se recogieron después del cultivo por centrifugación. Los micelios sedimentados se lavaron intensamente con medios mínimos basales (los medios mínimos carecen de fuente de carbono y aditivos) eliminando los medios ricos residuales tanto como sea posible. El sedimento de micelios se resuspendió en medios mínimos carentes de una fuente de carbono, que pueden distribuirse fácilmente rastreando fuentes de carbono como se detalla en la figura 2. Los cultivos de tubos a pequeña escala se llevaron a cabo en condición de fermentación estándar. Se tomaron muestras alícuotas pequeñas en diferentes puntos temporales y se recuperaron los sobrenadantes para análisis de a-galactosidasa. Se estudiaron un total de 18 fuentes de carbono como se muestra en la Tabla III. Se muestran análisis de los ensayos enzimáticos de HPTLC de sobrenadantes de cultivos con B-tetra en la figura 2. La desaparición completa de los sustratos usando sobrenadantes de fermentación de 70 horas en carril 4 y 7 distinguieron claramente galactosa y lactosa de otras fuentes de carbono en su capacidad produciendo la a-galactosidasa. En la condición del ensayo actual, 25 pmol de

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sustrato/|il de muestra proteica, NaPO4 50 mM (pH 6,8), 1 h a temperatura ambiente, el rendimiento volumétrico de la actividad a-galactosidasa puede calcularse como sigue:

25 pmol/(1 |il * 60 minutos) = 0,4 mU/ml o 0,4 U/l.

El rendimiento es mucho más grande que un rendimiento típico obtenido de cultivo de medios ricos (~0,1 U/l). Además, el rendimiento está probablemente subestimado dado que carece de punto temporal antes de 1 hora puede haberse perdido en punto final de la reacción. El resultado preliminar muestra gran potencial de usar medios mínimos facilitando producción y purificación de a-galactosidasa.

Para confirmar la observación remarcable usando medios mínimos, los autores de la presente invención reevaluaron la fuente de carbono líder galactosa y lactosa para una inducción de a-galactosidasa novedosa. La figura 3 muestra el análisis de HPTLC de ensayos de reacción de muestras de fermentación tomadas a diferentes puntos temporales en medios mínimos por galactosa y lactosa como fuentes de carbón. Aproximadamente el 90 % del sustrato se escindió por muestras de cultivo de 3 días, que traducen aproximadamente 4 U/l de sobrenadante de cultivo. Por lo tanto, como se muestra en la figura 3, galactosa (carril n.°: 4) y sorprendentemente lactosa (carril n.°: 7) inducen actividad a-galactosidasa significativa. Después las condiciones para el crecimiento e inducción usando galactosa identificada anteriormente se usaron sin optimización adicional desarrollando fermentaciones a gran escala de la cepa de Streptomyces n.°: 2357 para el aislamiento de la enzima. Como será evidente a partir de los siguientes ejemplos estas condiciones eran esenciales para el aislamiento exitoso y la identificación exitosa de la proteína a-galactosidasa resultante, que fue diferente de la enzima descrita originalmente por el documento U.S.S.N. 10/251271.

Tabla III. Fuentes de carbón usadas rastreando inducción de a-galactosidasa novedosas a partir de Streptomyces griseoplanus usando medios mínimos.

Fuente de carbono n.°: Fuente de carbono

1

Harina de semilla de algarrobo

2

Dextrina de almidón de patata

3

D(-) Fructosa

4

D(+) Galactosa

5

D(+) Glucosamina

6

Glicerol

7

D(+) Monohidrato de lactosa

8

Extracto de malta

9

D(+) Monohidrato de maltosa

10

D-manitol

11

D(+) Manosa

12

D(+) Rafinosa

13

L(-) Sorbosa

14

Almidón

15

Sacarosa

16

Xilitol

17

D(+) Xilosa

18

D(+) Glucosa

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Ejemplo 2: purificación de una a-galactosidasa expresada en cepa de Streptomyces griseoplanus n.°: 2357

Una nueva estrategia de purificación se desarrolló para la enzima novedosa, ya que el material de partida era sustancialmente diferente que aquel usado para la purificación parcial descrita previamente (véase, documento U.S.S.N. 10/251271). Se usaron las siguientes etapas lograr la purificación hasta homogeneidad patente: sobrenadante de caldo celular (450 ml), derivado de 800 ml de cultivo llevado a cabo en un fermentador de 1 l según se describe en el ejemplo 1, se sometió a 30 minutos de centrifugación a alta velocidad a 20000 rpm, 4 °C. El sobrenadante se aplica a una columna CEX de 15 ml (soporte Macro-Prep High S, BioRad, n.° de Cat. 156-0031), pre-equilibrada con NaPO4 40 mM, NaCl 10 mM (pH 6,8) y se lavó con 40 ml de tampón de equilibración y PO4 40 mM, NaCl 10 mM (pH 7,3), respectivamente. El flujo dinámico y los dos lavados que contienen la actividad a-galactosidasa se almacenaron (figura 4, panel A) y se aplican sobre una segunda columna de 2,5 ml de DEAE (DEAE Sefarosa, Sigma, n.° de Cat. DEF100) pre-equilibrada con NaPO4 40 mM, NaCI 10 mM (pH 6,8). La columna se lavó después con 50 ml de tampón de equilibración. Se recogieron un total de 600 ml que contenían la actividad a-galactosidasa del flujo dinámico y el lavado (figura 4, panel B). Se almacenaron, se concentraron con dispositivo de filtro de Centricon Plus 80 Centrifugal (n.° de Cat. de Millipore UFC5LGC02) y se intercambió el tampón a NaPO4 10 mM (pH 7,0) en el mismo dispositivo hasta un volumen final de 23 ml.

La muestra de tampón intercambiado de 23 ml se aplicó a una columna de hidroxiapatita de 2,5 ml (BioRad, n.° de Cat. 103-0150) pre-equilibrada con NaPO4 10 mM (pH 7,0). La columna se lavó con 5 ml de tampón de equilibración y se eluyó la actividad a-galactosidasa etapa a etapa con un tampón de gradiente de NaPO4 (10 mM/etapa) a partir de 20 a 100 mM (pH 7,0). La actividad de a-galactosidasa eluyó en fracciones con NaPO4 30-50 mM (figura 5). Las fracciones activas se almacenaron y diluyeron 1:1 con H2O y se aplicaron a una columna Cibacron Blue de 2,5 ml (Sigma, n.° de Cat. C-1285) pre-equilibrada con Tris 10 mM (pH 7,5). La columna se lavó con 10 ml de Tris 10 mM (pH 7,5) y 5 ml de Tris 10 mM, NaCl 80 mM (pH 7,5). La actividad a-galactosidasa se eluyó con 25 ml de tampón de elución conteniendo Tris 10 mM (pH 7,5) con una cantidad incrementada de sal (figura 6). El eluato de enzima se concentró y se sometió a intercambio de tampón en Tris 40 mM, NaCl 10 mM (pH 8,5) con dispositivos de filtro de centrífuga Centricon YM10 (n.° de Cat. de Millipore 4205) hasta un volumen final de 3,7 ml. Finalmente, el eluato sometido a intercambio de tampón se aplicó a columna de AEX de 1 ml (BioRad, n.° de Cat. 156-0031), pre-equilibrada con Tris 40 mM, NaCl 10 mM (pH 8,5). La columna se lavó con 5 ml de tampón de equilibración y la actividad a-galactosidasa se eluyó con un gradiente de NaCI en Tris 40 mM (figura 7).

Los análisis de las fracciones de eluato de la columna de AEX se llevaron a cabo por SDS-NuPAGE y una banda individual con un peso molecular aparente de 70 kD se observó después de tinción con plata (SilverQuest, Invitrogen, n.° de Cat. LC6070) (figura 8). La verificación posterior de la identidad de la a-galactosidasa aislada se proporcionó por cromatografía de filtración de gel. Se equilibró una columna de S12 (Superose 12™, Amersham, n.° de Cat. 17-5173-01) y se puso en funcionamiento con acetato de amonio 150 nM. Se aplicó la a-galactosidasa parcialmente purificada como se describe anteriormente (volumen de 250 |il) y se recogieron 45 fracciones (0,5 ml/fracción en caudal de 1 ml/minuto) (figura 9). Las fracciones n.°s 19-21 contenían el pico de proteína principal (UV 280 nm). Se analizaron las fracciones 19-22 de a-galactosidasa con AMC B-tetra y 10 |il de cada una se analizaron por un gradiente de SDS-NuPAGE al 4-12 % usando 10 y 20 ng de NEB A-zima como controles (carril 2 y 3). Como se muestra en la figura 9 el pico a-galactosidasa correlaciona plenamente con la banda de 70 kD por SDS-PAGE.

Ejemplo 3: secuenciación de aminoácidos de a-galactosidasa purificada a partir de cepa de Streptomyces griseoplanus n.°: 2357

Aproximadamente 1 |jg de proteína a-galactosidasa como se estima por NuPAGE se preparó como se describe en el ejemplo 2. La proteína se separó por NuPAGE al 4-12 % y se tiñó con Kit de Tinción de Azul Coloidal (Invitrogen, n.° de Cat. LC6025). Después de desteñir el gel con H2O, las bandas de 70 kD teñidas se escindieron y lavaron con H2O de calidad HPLC y acetonitrilo al 50 % en H2O. El gel de sílice se sometió a análisis de secuencia directo en la Instalación de Microquímica de Harvard, Universidad de Harvard. Brevemente, las láminas de gel se redujeron con DTT y se alquilaron con yodoacetamida y después se digirieron con tripsina en tampón de bicarbonato de amonio 25 mM. La digestión con tripsina se analizó por espectrometría de masas en tándem de nanoelectropulverización de HPLC en fase reversa microcapilarmente (11LC/EM/EM) en un espectrómetro de masas de trampa iónica cuadrupolar LCQ DECA XP Plus de Finnigan. La secuenciación preliminar de péptidos se facilitaron por correlación de la base de datos con el algoritmo SEQUEST. Las secuencias peptídicas de EM/EM se revisaron después por consenso con proteínas conocidas y los resultados se confirmaron manualmente para fidelidad. Ninguna de las secuencias de NCBI nr o bases de datos est correlacionó con estos datos.

Varios intentos para obtener la secuencia N-terminal de la proteína no digerida habían fallado en generar cualquier información de secuencia, sugiriendo que se bloqueó el extremo N-terminal. A fin de obtener la información de secuencia interna de los péptidos a partir de la digestión con tripsina de las láminas de gel NuPAGE conteniendo ~ 5 |ig de la proteína deseada se fraccionaron mediante HPLC en una columna C18 de 0,3 x 150 mm. Se monitorizaron tres longitudes de onda; 205 nm (por enlaces de amida), 277 nm y 292 nm (para aminoácidos aromáticos Trp y Tyr) por medio de un detector de red de diodos. Unas pocos de los mejores picos/fracciones se rastrearon por MALDI seleccionando picos por secuenciación de Edman. Las búsquedas de bases de datos de Blast usando "búsqueda en

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corto, coincidencias casi exactas" frente a la base de datos de NCBI nr no identificaron secuencia idéntica alguna con cualquiera de las secuencias peptídicas obtenidas. Sin embargo, la búsqueda usando secuencia peptídica de 30 aminoácidos mostrada como SEC ID n.°: 12, la secuencia peptídica más larga secuenciada y confirmada por EM/EM, identificó una proteína teórica candidata (SEC ID n.°: 2) predicha a partir de la secuencia del genoma de Streptomyces avermitilis (n.° de acceso de Genbank BAC74979.1, Gl: 29610934) que muestra similitud de secuencia débil con SEC ID n.°: 12, la secuencia peptídica de Streptomyces griseoplanus obtenida (ilustrada en la figura 10).

SEC ID n.°: 12: TVIDVTDFGADPSGKADSAAAVSAAMAHAK

El genoma de Streptomyces griseoplanus no está disponible y no se han identificado secuencias relacionadas en búsquedas en bases de datos. Notablemente, esta secuencia no está compartida por la a-galactosidasa descrita en nuestra revelación anterior (y en el presente documento como SEC ID n.°: 1). Streptomyces avermitilis y Streptomyces griseoplanus están estrechamente relacionados. Por lo tanto los autores de la presente invención deberían analizar si Streptomyces avermitilis también contiene la a-galactosidasa novedosa, dado que se demostró que la a-galactosidasa anterior es muy rara entre muchos de los aislados de Streptomyces puestos a prueba (véase, documento U.S.S.N. 10/251.271).

Streptomyces avermitilis (ATCC 31267) se cultivó en medios YM y el sobrenadante de cultivo se sometió a ensayo para a-galactosidasa segregada usando el tetrasacárido B marcado con AMC y un monosacárido a-Gal pNP como sustratos. Como se muestra en la figura 11, se analizó una una clara evidencia de la presencia de actividades de a-galactosidasa tanto en sobrenadante de cultivo como en lisado de sedimento como se analiza por oligosacárido B-tetra. Sin embargo, la escisión de un sustrato simple a-Gal pNP es despreciable por las actividades a-galactosidasa segregadas. En contraste, la escisión completa de a-Gal pNP se observó para la(s) a-galactosidasa(s) celular(es).

La proteína teórica identificada consistió en 625 aminoácidos (SEC ID n.°: 2) y no mostró ninguna identidad significativa para cualesquiera otras proteínas conocidas. Búsquedas de nuevo con la secuencia de proteínas identificada identificaron muy pocas secuencias de proteínas con similitudes de secuencia bajas exclusivamente a partir de genomas procariotas. Todas las secuencias identificadas se analizaron por análisis de secuencias múltiples como se muestra en la figura 12.

Ejemplo 4: expresión recombinante y caracterización de gen de a-galactosidasa identificado a partir de Streptomyces avermitilis

La secuencia codificante predicha completa del gen de Streptomyces avermitilis identificado, de 1878 pares de bases en longitud, que codifica la proteína teórica (SEC ID n.°: 2) de 625 aminoácidos (longitud completa) se amplificó por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) usando el par cebador AVER1 (5'-GCGAATTCCCATGGCTCACGGATGCTCCGGAGGG-3', SEC ID. n.°: 13)/AVER3

(5'-GCCTCGAGAAGCTTCTAGTCCGTGACCACGGAGGTGTTC-3', SEC ID n.°: 14), se digirió con enzimas de restricción Ncol/Hindlll (sitios de restricción en cebadores subrayados) y se clonó en el sitio de Ncol/Hindlll del vector de expresión bacteriano pPET28 (Novagen, n.° de Cat. 70777-3) formando la construcción pZQ-B002a. Dado el hecho de que el gen posee un sitio Ncol interno en posición 1490, se llevó a cabo inserción de la construcción genética de longitud total usando un procedimiento de clonación de dos etapas. La construcción de expresión se secuenció por completo para confirmación. La construcción de expresión de longitud total generada pZQ-B002a se usó transformando la cepa de E. coli Rosetta (BL21-DE3)pLysS (Catálogo de Novagen. n.°: 70956-3) y se plaqueó aparte en placas de LB-agar en presencia de cloranfenicol (34 |ig/ml) y kanamicina (50 |ig/ml).

Para el análisis inicial de la expresión de proteína, se llevó a cabo la inducción a 26 °C en lugar de a los más comunes 37 °C con una concentración baja de inductor (IPTG 0,1 mM), una afección que favorece la formación de proteínas solubles. El sedimento celular inducido se lisó por un procedimiento químico detergente y el lisado completo se ensayó directamente en condición convencional para la actividad de B-zima estándar sin aclararse. Como se muestra en la figura 13, la escisión del sustrato tetrasacarídico de grupo sanguíneo B marcado con AMC fue fácilmente detectable como se indica por la formación de trisacárido H usando lisado crudo generado a partir de cultivos inducidos solamente durante 1 hora. Este resultado demuestra sin ambigüedades que la proteína de Streptomyces avermitilis (SEC ID n.°: 2) es de hecho una galactosidasa novedosa, una actividad característica compartida por otros miembros de esta familia de proteínas. La figura 14 confirma que la SEC ID n.°: 2 puede expresarse eficientemente en E. coli, pero se recupera en cuerpos de inclusión. Por lo tanto, la desnaturalización, la extracción de la enzima de cuerpos de inclusión y el replegado son necesarios primero, produciendo este polipéptido en E. coli.

Ejemplo 5: Conversión enzimática de glóbulos roios B a células de fenotipo O usando a-galactosidasa como se evalúa por protocolos de clasificación de rutina

Protocolo de Conversión Uno - Se llevaron a cabo reacciones de conversión enzimática en mezclas de reacción de 1 ml conteniendo glicina 200 mM, pH 6,8 y NaCl 3 mM con glóbulos rojos concentrados al 30 % (pRBC) y enzima según se indica. La sangre completa reciente se obtuvo del Oklahoma Blood Institute (Oklahoma City, OK) y se retiró la linfa cuajada. Se prelavaron RBC 1:1 y 1:4 volumen/volumen en tampón de conversión antes de adición de enzima y las

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reacciones se incubaron durante 60 minutos con mezclado suave a 26 °C, seguido por cuatro ciclos de lavado repetidos con 1:4 volumen/volumen de solución salina por centrifugación a 1.000 rpm. Los B-ECO RBC tratados con enzima lavados se clasificaron en grupos sanguíneos AB0 de acuerdo con técnicas de banco de sangre estándar usando diversos reactivos de anticuerpos monoclonales disponibles estándar ((Immucor Gamma Anti-B (Gamma Biologicals/lmmucor, Norcross, Ga.); Ortho Anti-B (Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, N.J.); y Diagast Anti-B (Diagast Laboratories, Francia)).

Protocolo de Conversión Dos - Se llevan glóbulos rojos B (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA) en tubos de EDTA y se almacenan a 4 °C durante hasta siete días y se lavan tres veces en PBS (Medio Salino Tamponado con Fosfato, pH 7,4) y se resuspenden al 10 % en una solución de PBS y PEG al 7,5 % (pH 7,4). Las células se tratan con a-galactosidasa recombinante (10-500 U/ml) a 30 °C durante 180 minutos agitando mientras. Las células se lavan tres veces en solución salina al 0,9 % y se resuspenden al 3-5 % en solución salina para clasificación.

Protocolo de Conversión Tres - Se llevan glóbulos rojos B (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA) en tubos de EDTA y los glóbulos rojos B leucorreducidos (Cruz Roja Americana, Región de Nueva Inglaterra, Dedham, MA) se congelan en Glycerolyte 57, (Baxter Healthcare Corporation, Fenwal División: Deerfield, IL) de acuerdo con el Manual Técnico AABB, 13a edición, Procedimiento 6.6 y se almacenan a -70 °C. Antes del tratamiento enzimático las células se desglicerolizan usando solución salina al 9,0 %, solución salina al 2,5 % y solución salina al 0,9 % (véase, Procedimiento 125 del documento Immunohematology Methods por la Cruz Roja Americana), después se resuspenden a un hematocrito del 50 % en una solución de PBS y PEG al 7,5 % (pH 7,4) y se añade a-galactosidasa recombinante (200 U/ml). Las reacciones se incuban a 37 °C con agitación durante 4 horas, seguido por tres lavados en solución salina al 0,9 % y suspensión final al 3-5 % en solución salina clasificando.

Protocolo de Conversión Cuatro - El origen y el almacenamiento de las células es el mismo que se describe en el protocolo B. Los glóbulos rojos desglicerolizados se lavan dos veces en PCl (pH 7,4) con NaCl 150 mM y se resuspenden a un hematocrito del 50 % en PCl (pH 7,4) con NaCl 150 mM. Las células se trataron con a-galactosidasa recombinante (200 U/ml) a 37 °C con agitación durante 4 horas, seguido por tres lavados en solución salina al 0,9 % y suspensión final al 3-5 % en solución salina para clasificación.

Los reactivos de clasificación autorizados usados en los ensayos de hemaglutinación son anticuerpos monoclonales murinos y lectinas de plantas obtenidos a partir de Ortho Diagnostics, Raritan, N.J.; Gamma Biologicals/lmmucor, Norcross, Ga. Los reactivos no autorizados por la FDA incluyen anticuerpos anti-B monoclonales murinos para las variantes de grupo sanguíneo B producidas por H. Clausen (Clausen y cois., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82 (4): 1199-203, 1985, Clausen y cois., J Biol Chem. 261(3): 1380-7,1986, Clausen y cois., Biochemistry 25 (22): 7075-85, 1986, Clausen y cois., J Biol Chem. 262(29): 14228- 34,1987). Los reactivos de clasificación se usan de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes y otros anticuerpos monoclonales según se determinan por valoraciones.

Ensayo de hemaglutinación (temperatura ambiente).

Se prepara una suspensión al 3-5 % de glóbulos rojos lavados en medio salino de banco de sangre isotónico. Se añade una gota (aproximadamente 50 microlitros) de reactivo de anticuerpo anti-B. Se añade una gota (aproximadamente 50 microlitros) de la suspensión de glóbulos rojos. Los tubos se mezclan y se centrifugan durante 15 segundos a 3500 rpm. Las células se resuspendieron por agitación suave y se examinaron macroscópicamente para aglutinación. La aglutinación se clasificó de acuerdo con el Procedimiento 1.8 en el Manual Técnico AABB, 13a edición.

Como se describe en los ejemplos anteriores, las enzimas preferidas para usar en eliminar epítopos del grupo sanguíneo B de glóbulos rojos es probable que tengan propiedades cinéticas particularmente buenas con sustratos oligosacarídicos semejantes a los antígenos del grupo B. Tales propiedades cinéticas preferidas podrían representarse por especificidades de sustrato preferidas o exclusivas para los oligosacáridos del grupo sanguíneo B y escasa o ninguna actividad con derivados monosacarídicos simples tales como sustratos de monosacárido-pNP. Las propiedades cinéticas preferidas podrían representarse también por una Km particularmente baja para sustratos relevantes. Las propiedades cinéticas preferidas adicionales consisten en un pH óptimo neutro de reacciones con sustratos activos de grupo sanguíneo y otras condiciones de reacción que son compatibles con la integridad y las funciones de los glóbulos rojos. Otras propiedades preferidas de la enzima tales como tamaño, carga, solubilidad y otras propiedades físico-químicas también pueden estar relacionadas con la actuación en la conversión enzimática de glóbulos rojos. La a-galactosidasa con propiedades cinéticas mejoradas se identificó a partir de diversas cepas bacterianas según se describe y proporciona una enzima con las características preferidas mencionadas anteriormente, que presentan actuación superior en conversiones de glóbulos rojos.

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Tabla 3A: resultados de aglutinación de glóbulos rojos humanos convertidos con a-galactosidasas recombinantes de FragA o FragB.

Protocolo de conversión de rutina (200 Glicina, pH 6,8, NaCl 3 mM)

Immucor Anti-B Diagast Anti-B

Enzima de FragB

Dosis |ig/ml IS 4 °C IS 4 °C

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Células B humanas

2,5 0 0 0 0

1,25 0 0 0 0

0,625 0 W+ W+ 1 +

0,3125 0 1 + 1 + 1 +

Enzima de Frag. A

10 0 0 0 0

5 0 0 0 0

Células B humanas

2,5 0 0 0 0

1,25 0 0 0 0

0,625 0 W+ W+ 1 +

0,3125 1 + 1 + 1 + 2+

Ejemplo 6: clonación y secuenciación de ADN de a-galactosidasa desde cepa de Streptomvces griseoplanus n.°: 2357 y deducción de su secuencia de aminoácidos

El aislamiento y purificación de la a-galactosidasa endógena de S. griseoplanus 2357 se describió en el ejemplo 2. La secuenciación aminoacídica parcial de a-galactosidasa que generó un péptido de 30 aminoácidos se describió en el ejemplo 3. La búsqueda de Blast usando este péptido frente a la base de datos "nr" (GenBank) identificó una familia de a-galactosidasas teórica. Las secuencias para las 5 a-galactosidasas se sometieron a las bases de datos EMBL/GenBank/DDBJ y se les asignaron los siguientes números de acceso: AM109953 (Streptomyces avermitilis), AM109954 y AM109955 (Bacteroides fragilis), AM109956 y AM109957 (Bacteriodes thetaiotaomicron). La alineación de secuencias múltiples de a-galactosidasas teóricas identificó unas pocas regiones conservadas (figura 15). La fase de lectura abierta que codifica una a-galactosidasa teórica de Streptomyces griseoplanus se clonó en base a la amplificación rápida 5' y 3' de extremos genómicos (RAGE). Los cebadores degenerados iniciales estaban basados en las regiones conservadas determinadas de alineamiento de secuencia múltiple de secuencias de a-galactosidasa teóricas. Los cebadores en sentido correcto y antisentido degenerados dAVER7 (5'-TTCGGXGTXGTXKGKCAGTWCAGXGAGAA-3' SEC ID. n.°: 15)/dAVER9

(5'-GTXCCXTGXATXTTXATXGGXTCXTCGTG-3' SEC ID. n.°: 16), donde X = inosina y K = G o T, se usaron amplificando por PCR un fragmento de ADN específico de B-zima de 185 pares de bases a partir de ADN genómico de Streptomyces griseoplanus. El producto de PCR se clonó en vector pCR4 (Invitrogen) y se secuenció generando pCR4-dAVER7/9. Los cebadores específicos de a-galactosidasa de Streptomyces griseoplanus GRIS10 (5'-AT CGACTCGGT CACCTT CAAGGCCGAC-3' SEC ID n.°: 17) y GRIS11

(5'-AAGACGCTGTTGGTGATGCGTACGGTGC-3' SEC ID. n.°: 18) se derivaron de pCR4-dAVER7/9. El ADN genómico de Streptomyces griseoplanus se trató con endonucleasas hasta finalización con la endonucleasa de restricción Haell, fraccionada en tamaño por electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y ADN de 2-3 kpb fraccionado se purificó por purificación de Quiagel (Qiagen). El ADN purificado se ligó a un adaptador Haell de doble hebra EBRETTE3 (5'-GCGCTCGAAATTAACCCT CACT AAAGGGGAATTCGGT ACCCTCGAGGCGC-3' SEC ID n.°: 19)/EBRETTE4 (5'-CTCGAGGGTACCGAATTCCGGAA-3' SEC ID n.°: 20) que codifica un sitio de unión T7 (subrayado) y saliente de restricción de Haell (mostrado en cursiva). ADN ligado a adaptador se usó en 5' RAGE usando AdN ligado a adaptador de 10 ng, T7/gRiS11 o 3' RAGE usando 10 ng de T7/GRIS10. Los productos 5' RAGE y 3' RAGE generados se clonaron en pCR4 generando 5'-T7/GRIS11-pCR4 y 3'-T7/GRIS10-pCR4 y se secuenciaron completamente. Las secuencias 5'-T7/GRIS11-pCR4 y 3'-T7/GRIST10-pCR4 solapantes representan 1.593 pares de bases de la secuencia génica de B-zima codificante completa. La secuencia 5' y 3' que queda se obtuvo por RAGE repetida en ADN genómico de Streptomyces griseoplanus digerido con BamHI fraccionado, ligado a EBRETTE3/6 de adaptador de BamHI (5'-GATCGCGCCTCGAGGGTACCGAATTCCGGAA-3' SEC ID n.°: 21) (saliente de BamHI mostrado en cursiva). La secuencia 5' completa se obtuvo usando la secuencia de ADN ligado a 10 ng de adaptador y T7/GRIS22 (5'-CGCTTCGGCGTCCGTTCGGGCCAG-3' SEC ID n.°: 22) y secuencia 3' usando T7/GRIS24 (5'-CCGGTGCACCGCAACGTCCTCATC-3' SEC ID n.°: 23). Los productos 5'' RAGE y 3'' RAGE generados se

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clonaron en pCR4 generando 5'-T7/GRIS22-pCR4 y 3'-T7/GRIS24-pCR4 y se secuenciaron completamente. 5'-T7/GRIS22-pCR4 contenía una metionina de partida que inicia predicha y 3'-T7/GRIS24-pCR4 contenía un codón de parada en fase, completando la secuencia codificante de 2184 pares de bases completa del gen de a-galactosidasa de Streptomyces griseoplanus (SEC ID n.°: 24) que codifica una a-galactosidasa de 727 aminoácidos (SEC ID n.°: 25). La secuencia se sometió a GenBank (número de acceso AM259273). Las regiones en la secuencia proteica de a-galactosidasa de las que se derivaron los cebadores se describen en la figura 16.

Ejemplo 7: expresión recombinante y caracterización de gen de a-galactosidasa identificado a partir de Bacteroides fragilis

La construcción de expresión de a-galactosidasa de FragB (SEC ID n.°: 6) se clonó a partir de ADN bacteriano genómico por PCR. El gen de a-galactosidasa de FragB, que carece de la región codificante para el péptido señal aminoterminal teórico 1-24, se 24, se elevó a partir del ADN genómico de Bacteroides fragilis (ATCC 25285D) por PCR usando cebadores BFRAGB (5'-GCGGGATCCCGGGATGGGACGTGTTTATGACATTTCCCAGTTTGGC-3' SEC ID n.°: 24)/BFRAGB3 (5'-GCCTCGAGAAGCTTTCACTCTGAAATCTTCACGTTTGTCACTCG-3' SEC ID n.°: 25) y se amplificó usando polimerasa Pfu Ultra (Stratagene). Los salientes de enzimas de restricción para BamHI y HindIII en los cebadores anteriores están subrayados. Después de la digestión con BamHI y HindIII, los productos polinucleotídicos amplificados se insertaron dentro del vector de expresión bacteriano pET28 (Novagen) en fase y más adelante en la secuencia de la marca His 6x codificada por el plásmido generando plásmido pZQ-B006a. Para la construcción de un vector de expresión no marcado, la marca His 6x en vector pET28 se retiró por digestión de Ncol/BamHI seguida por inserción de un oligo de cadena doble PETNCBAF (5'-CATGGATCCCAGGCCTCCGGATG-3' SEC ID n.°: 26)/(GATCCATCCGGAGGCCTGGGATC-3' SEC ID n.°: 27) que crea plásmido pET28-5His. La construcción FragB descrita anteriormente que codifica la proteína marcada con His se subclonó en el sitio de BamHI/HindIll de pET28-8His creando plásmido pZQ-B006c para la expresión de la a-galactosidasa de FragB no marcada. Todas las construcciones se secuenciaron totalmente en un instrumento ABI Prism 377 (Applied Biosystems). Para la expresión de proteínas, se transformó pZQ-B006c en E. coli, Rosetta2 (DE3) (Invitrogen). El clon de E. coli se cultivó en caldo Terrific 1X (Sigma), se suplementó con 34 |ig/ml de cloranfenicol y 50 |ig/ml de kanamicina a 37 °C, 220 rpm a D.O. ~ 0,6 a 600 nm y se añadió IPTG a 0,5 mM induciendo la expresión de proteínas objetivo. El cultivo se recogió después de 3 horas, por centrifugación a 3000 x g durante 30 minutos. El sedimento celular se almacenó a ~ 20 °C. El sedimento celular recogido de 350 ml de cultivo se lisó usando BugBuster 1X (Invitrogen) en NaOAc 25 mM, pH 5,5/NaCI 10 mM, se suplementó con 5 |il de Benzonasa (Invitrogen) y se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente. El lisado completo se aclaró por centrifugación a 40.000 x g, 5 °C, durante 30 minutos. Los restos celulares, conteniendo por encima del 90 % de la actividad enzimática, se resuspendieron en NaPO4 10 mM, pH 6,8/NaCl 400 mM NaCI y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La centrifugación de alta velocidad se repitió recuperando el sobrenadante que contenía la actividad enzimática. El sobrenadante resultante se cargó sobre una columna de hidroxiapatita de 5 ml, se pre-equilibró con NaPO4 10 mM, pH 7,0. La columna se lavó con 20 ml de tampón de equilibración, seguido por elución usando un gradiente de NaPO4, pH 7,0, desde 10 hasta 400 mM. Las actividades enzimáticas, eluidas entre NaPO4 200-400 mM, pH 7,0, se combinaron, se concentraron y el tampón se intercambió con un dispositivo de centrífuga Amicon (Grace) Plus 70, en 10 ml de Tris 40 mM, NaCI 400 mM/pH 7,5. La solución de proteína se dejó pasar a través de columna de alta resolución de fenilsefarosa (Amersham), preequilibrada con el tampón de diálisis y la columna se lavó con 10 ml de tampón de diálisis después de cargar. El flujo dinámico y el lavado se almacenaron, se ajustaron a pH 8,5 con Tris 1 M, se diluyeron con un volumen igual de H2O. La solución de proteína resultante se sometió a otra etapa de columna de paso, 2,3 ml de Macro-Prep High Q, se pre-equilibró con Tris 40 mM, pH 8,5/NaCl 10 mM y la columna se lavó con 10 ml de tampón de equilibrio. El flujo dinámico y el lavado se almacenaron y el tampón se intercambió en 7 ml de NaPO4 10 mM, pH 6,8/NaCl 50 mM. La concentración de proteínas se determinó por Kit de Ensayo de Proteína BCA de Pierce.

La a-galactosidasa de FragB purificada se evaluó por su capacidad escindiendo el sustrato de cadena de carbohidratos ramificada B-tetra en condiciones convencionales (1 nmoles de sustrato en 10 |il de NaPO4 100 mM, pH 6,8/NaCl 50 mM) y la enzima purificada demostró actividad específica extremadamente alta hacia el sustrato B-tetra: ~ 5-10 U/mg. El pH óptimo de la a-galactosidasa de FragB purificada se evaluó con el sustrato B-tetra-AMC a través de un intervalo de pH de 2,0 a 9,0 y los resultados se muestran en la figura 17. La enzima de FragB tiene un intervalo de pH óptimo amplio entre 4,5 y 7,5. El análisis con el ensayo colorimétrico más sensible/cuantitativo proporciona la conclusión similar como se muestra en la figura 18, aunque la actividad de la enzima se vio en el extremo más bajo del intervalo de pH puesto a prueba, es decir, se observó actividad hasta ~ pH 4,2, una sutil diferencia en la actividad que no es detectable usando el ensayo de AMC-B-tetra basado en TLC. Por lo tanto, la enzima novedosa se puede usar exitosamente en condiciones ácidas hasta en condición neutra e incluso hasta en condiciones ligeramente básicas, es decir, aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 7,4 o mayor. En realizaciones preferidas actualmente, la enzima se usa dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,5 y más preferentemente aproximadamente pH 6,5 a aproximadamente pH 7,5. El intervalo de pH más preferido actualmente para la enzima novedosa son aquellas condiciones que imitan el pH fisiológico de la sangre arterial o venosa circulante, con el fin de minimizar los efectos de pH sobre las células sanguíneas en sí mismas y no debido a limitaciones de pH en actividad y actuación enzimáticas.

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La a-galactosidasa de FragA (SEC ID n.°: 5) se clonó de forma similar por PCR a partir del mismo ADN genómico como para a-galactosidasa de FragB y se expresó de forma similar a la proteína de marca His6 en el extremo N-terminal en pLysS de Rosetta (DE3) (Novagen). La proteína soluble expresada se purificó a homogeneidad por cromatografía de afinidad metálica inmovilizada sucesiva (IMAC), cromatografía de intercambio catiónico y aniónico. Se mostró que la proteína purificada es similar a la a-galactosidasa de S. griseoplanus endógena (cepa 2357) en términos de actividad específica de sustrato ramificado, especificidad de sustrato y pH óptimo. El análisis de actividad con, un sustrato tetrasacárido marcado con AMC de grupo sanguíneo B en el intervalo de pH de 2-9 mostró que la enzima tiene un óptimo amplio entre 5 y 7,5. La especificidad de sustrato de la a-galactosidasa se determinó con un panel diverso de estructuras oligosacarídicas y se encontró una especificidad restrictiva remarcable para galactosa a1,3 unida en la estructura de grupo sanguíneo B ramificada (figura 20). La enzima no escindió ni enlaces a4Gal encontrados en antígenos de grupos sanguíneos P1 y Pk ni el enlace a3Gal en la estructura de B lineal sin fucosa.

Ejemplo 8: la a-galactosidasa de Bacteroides fragilis escinde eficientemente oligosacáridos B lineales a un pH neutro

El análisis adicional de la especificidad de sustrato de a-galactosidasa de FragB purificada recombinante sorprendentemente reveló que esta enzima (en contraste con la a-galactosidasa purificada a partir de S. griseoplanus anterior) presentó actividad baja con el sustrato de Gala-pNP (~ 1,6 U/ml usando el sistema de tampón NaPO4 100 mM, pH 6,8/NaCl 50 mM) (tabla IV).

Tabla IV. Comparación de las actividades específicas (U/mg) de a-galactosidasa de FragB y de a-galactosidasa de grano de café.

Sustrato

Grano de café B. fragilis (FragB)7

Gala-pNP

32 (pH 6.5)2 1,6 (pH 6,8)

Gala1-3(Fuca1-2)GapP-4Glc-AMC

0,017 (pH 5,5)4 9,4 (pH 6,8)

'Este trabajo.

2Derivados de Zhu, A., Monahan, C., Zhang, Z., Hurst, R., Leng, L. & Goldstein, J. (1995) Arch Biochem Biophys 324, 65-70.

3no determinado.

4Derivados de la solicitud de patente de los EE.UU., número de publicación 20050208655.

Esto impulsó a los autores de la presente invención a poner a prueba la especificidad de sustrato con sustratos que tienen diferentes uniones a1-3Gal y a1-4Gal. Como se muestra en la figura 19, el FragB mostró actividad elevada con uniones a1-3Gal (B-di y B lineal) además de las estructuras oligosacarídicas del grupo sanguíneo B. De forma interesante, la actividad de FragB con el disacárido Gala1-3Gal fue muy alta (~ 12 U/mg a pH 6,8) sugiriendo que esta enzima es adecuada para escisión eficiente del antígeno lineal B (Gala1-3Galp-4GlcNAcp1-R, donde R es cualquier estructura de oligosacáridos) también conocido como el antígeno Galili (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86). El antígeno Galili es un antígeno barrera de xenotrasplante principal encontrado en la mayoría de los tejidos animales salvo en los monos del viejo mundo y en el hombre (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86). El xenotrasplante de por ejemplo tejidos y células de cerdo en hombre da como resultado rechazo hiperagudo debido principalmente a la presencia de altas valoraciones en hombre de anticuerpos IgG contra el antígeno Galili. Hasta la fecha solamente se han usado a-galactosidasa ampliamente reactivas tales como enzimas derivadas del grano de café con pH óptimos ácidos para escisión del antígeno Galili a partir de células y tejidos. Esto puede constituir un problema significativo dado que todas las células animales expresan cantidades elevadas de por ejemplo la estructura glucolipídica de serie global Pk (Gala1-4Galp1-4Glcp1-ceramida). Es más deseable usar enzimas a-galactosidasas con eficiencia más alta, especificidad más alta y pH óptimo neutro, tales como aquellas reveladas en el presente documento.

La a-galactosidasa de FragB fue específica para las uniones a1-3Gal y no se observó escisión significativa de varias uniones a1-4Gal (P1 y Pk). Esto es similar a la a-galactosidasa obtenida a partir de S. griseoplanus, pero representa una propiedad que es diferente de cualquier otra enzima a-galactosidasa conocida incluyendo la enzima derivada de grano de café. Los resultados se resumen en la tabla V.

Tabla V. Especificidad de sustrato de las a-galactosidasas.

Sustratos

Especificidad de grupo Grano de S. B. fragilis2

sanguíneo

café1 griseoplanus1 (FragB)

Gala-pNP

NA3 +4 5 +

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Gala1-3Gal

B (B-di) + — +

Gala1-3Galp1 -4GlcNAc

B lineal + — +

Gala1-3(Fuca1-2)Gal

B-tri + + +

Gala1-4Gal

P1 + — -

Gala1-4Galp1-4Glc

Pk + — -

GalNAca1-3(Fuca1-2)Gal

A-tri - — -

Gala1-3(Fuca1-2)Galp-4Glc-AMC

B-tetra + + +

GalNAca1-3(Fuca1-2)Galp1-4GIc-AMC

A-tetra — — —

'Derivados de la patente de los EE.UU. 20050208655 (Ref.) y Zhu, A., Monahan, C., Zhang, Z., Hurst, R., Leng, L. y Goldstein, J. (1995) Arch Biochem Biophys 324, 65-70.

2Este trabajo.

3No aplicable.

4Actividad fácilmente detectable en condiciones de ensayo.

5Actividad no fácilmente detectable en condiciones de ensayo.

El hallazgo sorprendente de que la a-galactosidasa de FragB puede representar una enzima altamente eficiente novedosa para escisión de lineal B (epítopos de Galili) impulsó a los autores de la presente invención a poner a prueba la adecuación y eficiencia de esta enzima en retirar tales epítopos de las superficies celulares. Los glóbulos rojos de conejo contienen cadenas oligosacarídicas de glucolípidos y glucoproteínas similares a glóbulos rojos humanos, pero mientras que las cadenas oligosacarídicas en glóbulos rojos humanos terminan en estructuras ABH que dependen del estatus de grupo sanguíneo, los oligosacáridos de glóbulos rojos de conejo terminan con estructuras B lineales (epítopos de Galili) (Galp1-3Galp1-4GlcNAc). La lectina IB4 de Bandeira (Griffonia) simplicifolia se usa generalmente detectando estructuras de B lineales (epítopos de Galili) (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86) y como se muestra en la tabla VI esta lectina aglutina fuertemente glóbulos rojos de conejo (pero no humanos).

Tabla VI: Aglutinación de glóbulos rojos de ser humano y de conejo con lectina IB4 y reactivos de clasificación anti-B monoclonales de rutinas

Tipo de RBC

Immucor/Gamma Anti-B Diagast Anti-B Lectina B4

IS

4 °C IS 4 °C 10 ug/ml

Células de conejo nativas

2+ 4+ 4+ 4+ 4+

Células del grupo B de ser humano nativas

4+ 4+ 4+ 4+ 1 +

Células del grupo A de ser humano nativas

0 0 0 0 0

Células del grupo O de ser humano nativas

0 0 0 0 0

Los glóbulos rojos de conejo sirven por lo tanto como un modelo excelente para análisis de la eficiencia de a-galactosidasas en la retirada del residuo a1-3Gal inmunodominante a partir de estructuras B (epítopos de Galili) de las superficies celulares. Dado que los autores de la presente invención han desarrollado ya un procedimiento eficiente para la eliminación de los antígenos de tipo A inmunodominantes de las células sanguíneas usando una enzima a-N-acetilgalactosaminidasa de C. meningosepticum purificada, usando operativamente un sistema tampón de pH 6,8 de glicina, los autores de la presente invención pusieron a prueba las mismas condiciones para la escisión de FragB de glóbulos rojos de conejo en comparación con glóbulos rojos del grupo sanguíneo B humanos. Como se muestra en la Tabla VII, FragB elimina de manera eficiente aglutinación de lectina IB4 de glóbulos rojos de conejo a dosis muy bajas, casi comparables a las que se requieren para escisión de FragB del grupo sanguíneo B de glóbulos rojos humanos. La aglutinación de glóbulos rojos de conejo por la lectina IB4 casi se eliminó completamente por el tratamiento enzimático con dosis de 10 g/ml de enzima dando solamente una lectura microscópica (M+). Las concentraciones más altas de enzima o la incubación más larga eliminan completamente la reactividad. El gen homólogo FragA, sin embargo, solamente escindió el grupo sanguíneo B de las glóbulos rojos humanos.

Tabla VII: resultados de aglutinación de glóbulos rojos humanos y de conejo digeridas con enzimas modificadoras de glucanos FragA o FragB.

Conversión rutinaria

Anti-B de Immucor Diagast Anti-B Lectina B4

Enzima Frag B

Dosis ug/ml IS 4 °C IS 4 °C 10 ug/ml

Células B humanas

10 0 0 0 0 0

5

0 0 0 0 0

2,5

0 0 0 0 0

1,25

0 0 0 0 0

0,625

0 W+ W+ 1 + 0

0,3125

0 1 + 1 + 1 + 0

Células de conejo

10 0 0 0 W+ M+

5

0 0 0 W+ Vw+

2,5

0 0 0 W+ W+

1,25

0 0 0 1 + 1 +

0,625

0 W+ W+ 3+ 1 +

0,3125

0 2+ 4+ 4+ 2+

Enzima Frag A

Células B humanas

10 0 0 0 0 0

5

0 0 0 0 0

2,5

0 0 0 0 0

1,25

0 0 0 0 0

0,625

0 W+ W+ 1+. 0

0,3125

1 + 1 + 1 + 2+ 0

Células de conejo

10 4+ 4+ 4+ 4+ 3+

5

4+ 4+ 4+ 4+ 3+

2,5

4+ 4+ 4+ 4+ 3+

1,25

4+ 4+ 4+ 4+ 3+

0,625

4+ 4+ 4+ 4+ 3+

0,3125

4+ 4+ 4+ 4+ 3+

5 Esto demuestra que la isoterma del polipéptido purificado FragB descrita como parte de la familia de genes de a-galactosidasa novedosa comunicada en el presente documento, tiene especificidades de sustrato únicas que son diferentes de varios otros miembros dentro de esta familia, incluyendo los genes relacionados observados en Streptomyces. Además, que el polipéptido FragB descrito es adecuado para la retirada enzimática de los antígenos de grupo sanguíneo B inmunodominantes de los glóbulos rojos, así como para la eliminación del antígeno Galili de 10 xenotrasplantes de las células sanguíneas. El polipéptido purificado FragB es así superior a las otras enzimas conocidas actualmente, con respecto a su pH óptimo (lo más preferible pH 6,5 a pH 7,5), su especificidad de sustrato restringida a uniones Gala1-3 y su actividad específica alta observada.

La eliminación enzimática de la galactosa terminal a1-3 unida inmunodominante de los antígenos Galili tiene 15 aplicaciones importantes en el campo de xenotrasplantes. El antígeno Galili constituye la barrera más importante para xenotransplante de órganos, tejidos, tendones, ligamentos y células de animales al hombre y es la causa principal del fenómeno del rechazo hiper-agudo (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86). Aproximadamente el 10% de IgG del suero de individuos sanos normales está dirigido al antígeno Galili. La retirada enzimática del residuo de galactosa terminal expondrá estructuras comunes encontradas en el hombre, que pueden anular el rechazo hiperagudo (Galili U 20 (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El procedimiento descrito para la retirada enzimática del antígeno Galili en células de conejo en las que las células se lavan e incuban con la a-galactosidasa de FragB en un tampón adecuado a pH neutro durante un periodo de tiempo dio como resultado eliminación suficiente del epítopo de Galili (tabla VII). Un procedimiento similar aplicado a órganos, tejidos, tendones, ligamentos y células de animales, da como resultado la eliminación eficiente de antígenos Galili expuestos.

El proceso preferido implica poner en contacto los tejidos animales o las células animales con la a-galactosidasa de FragB (o miembros homólogos de la familia del gen con actividades enzimáticas similares) en un tampón adecuado tal como solución salina fisiológica, glicina u otros sistemas de tampón similares descritos en el presente documento, a pH neutro de 5,5 a 8,0 y más preferentemente 6,5 a 7,5. La dosis de enzima y el tiempo requerido para eliminación enzimática de la galactosa terminal a1-3 unida inmunodominante sigue generalmente los parámetros de digestión descritos anteriormente para las células sanguíneas, pero se evalúan empíricamente, según se determina por inmunoensayos basados en lectina y en anticuerpos tales como inmunocitología, inmunohistología y ELISA usando tales lectinas adecuadas tales como la lectina IB4 o anticuerpos monoclonales adecuados reactivos con el epítopo de Galili (Galili U (2005) Immunol Cell Biol 83: 674-86). Cuando la reacción se completa, el órgano, tejido, tendón, ligamento o células de animales modificados por enzima se lavan con una solución tampón apropiada (tal como solución salina fisiológica) eliminando la solución enzimática. Los tejidos o células de animales carecen de antígenos Galili inmunodominantes y se pueden usar ahora como xenotransplante apropiado en un sujeto humano en necesidad de un transplante tal. Un ejemplo de esto es un ligamento porcino modificado antigénicamente, que se usa para la reconstrucción de ligamento cruzado anterior roto en un paciente humano. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 6.402.783.

Antes del tratamiento, la superficie externa del xenoinjerto puede perforarse opcionalmente incrementando permeabilidad a agentes usados volviendo al xenotransplante sustancialmente no inmunogénico. Una aguja quirúrgica estéril para intervenciones tal como una aguja de calibre 18 se puede usar llevando a cabo esta etapa de perforación, o, alternativamente se puede usar un aparato similar a un peine conteniendo una pluralidad de agujas. La perforación se puede llevar a cabo con diversos patrones y con diversos espaciados perforación a perforación, con el fin de establecer un acceso deseado al interior del xenoinjerto. La perforación también se puede llevar a cabo con un láser. Preferentemente, uno o más líneas rectas de punciones con un intervalo de aproximadamente tres milímetros están establecidas circunferencialmente en la superficie exterior del xenoinjerto.

Antes de la implantación, el xenoinjerto ligamentoso se puede tratar con digestión limitada por enzimas proteolíticas tales como ficina o tripsina incrementando flexibilidad tisular o revestir con agentes anticalcificación, revestimientos antitrombóticos, antibióticos, factores de crecimiento, u otros fármacos que pueden potenciar la incorporación del xenotransplante dentro de la articulación de la rodilla del receptor. El xenoinjerto ligamentoso puede esterilizarse adicionalmente usando procedimientos conocidos, por ejemplo, con tratamiento de glutaraldehído o de formaldehído adicional, esterilización de óxido de etileno adicional, esterilización de óxido de propileno adicional, o similares. El xenoinjerto puede almacenarse congelado hasta que se requiere para uso.

El xenoinjerto de ligamento, o un segmento del mismo, se puede implantar en una articulación de rodilla humana dañada por aquellos de habilidad en la técnica usando técnicas quirúrgicas artroscópicas conocidas. Se conocen por aquellos expertos en la técnica instrumentos específicos para llevar a cabo técnicas artroscópicas, que aseguran la colocación segura y reproducible de implantes ligamentosos. Inicialmente, se lleva a cabo artroscopia diagnóstica completa de la articulación de la rodilla usando procedimientos conocidos. El ligamento dañado irreparablemente se elimina con una máquina de afeitar quirúrgica. Los sitios de inserción anatómicos para el ligamento se identifican y se perforan acomodando una clavija de hueso. El tamaño de la clavija de hueso puede ser aproximadamente 9-10 mm de anchura por aproximadamente 9-10 mm de profundidad por aproximadamente 20-40 mm de longitud. El ligamento xenogénico se lleva a través de los agujeros de perforaciones y se fija con tornillos de interferencia. Se lleva a cabo el cierre de rutina.

Usar los polipéptidos permite por lo tanto retirar el antígeno Galili de muchos tipos de tejidos diferentes, usando los procedimientos de modificación descritos en el presente documento y según puedan adaptarse adicionalmente a los tejidos particulares en vista de las enseñanzas proporcionadas, por un trabajador experto. Estos tejidos modificados se usan para una diversidad de procedimientos de transplante donde no se requieren xenotransplantes inmunogénicos, como se describe en lo siguiente: creando por ejemplo, colágeno inyectable sustancialmente no inmunogénico (véase, Patente de los EE.UU. 7064187); para xenoinjertos óseos (véase, Patente de los EE.UU. 6972041); para los xenoinjertos de tejidos blandos y de tejidos blancos con el proteoglucano reducido (véanse, Patentes de los EE.UU. 6758865 y 6455309); válvulas cardiacas de xenoinjerto (véase, Patente de los EE.UU. 6383732); y xenotrasplantes de menisco (véase, Patente de los EE.UU. 6093204 y 5984858).

También se proporcionan matrices de tejidos preferentemente aquellos fabricados a partir de tejidos deficientes en a1,3-galactosa (véase, Patente de los EE.UU. 6933326 y Solicitud de Patente de los Estados Unidos 20050159822 y 20050028228). Procedimientos de elaborar y usar estas matrices de tejido se describen anteriormente y la de-galactosilación de los tejidos se lleva a cabo usando las a3-galactosidasas como se describe en el presente documento (SEC ID n.°: 2-9, o fragmentos activos o equivalentes funcionales de las mismas).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Listado de secuencias <110> VELICO MEDICAL, INC.

<120> ALFA-GALACTOSIDASAS NOVEDOSAS

<130> 1395-0012

<140> EP

<141> 31-10-2.006

<150> US 60/836.000

<151> 7-8-2.006

<150> US 60/731.845

<151> 31-10-2.005

<160> 29

<170> PatentIn versión 3.5 <210> 1 <211>8 <212> PRT

<213> Streptomyces griseoplanus <400> 1

Phe Ala Asn Gly Leu Leu Leu Thr 1 5

<210>2 <211> 625 <212> PRT

<213> Streptromyces avermitilis <400>2

Claims (11)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   1. El uso de una enzima purificada, que comprende:

   un polipéptido que tiene al menos 10 aminoácidos seleccionados de la posición en la siguiente secuencia numerada de acuerdo con ello cuando se alinea como se muestra en la figura 12 con la SEC. ID. n.° 2:

   M en residuo 10; G en residuo 47; G, en residuo 84; Y en residuo 86; Y en residuo 99; N en residuo 102; K en residuo 114; T en residuo 127; G en residuo 130; G en residuo 132; G en residuo 139; N en residuo 156; D en residuo 160; P en residuo 164; G en residuo 205; R en residuo 277; R en residuo 281; F en residuo 287; G en residuo 308; Q en residuo 312; I en residuo 317; R en residuo 333; D en residuo 340; G en residuo 346; G en residuo 349; G en residuo 360; D en residuo 363; D en residuo 364; N en residuo 367; H en residuo 369; G en residuo 370; T en residuo 371; G en residuo 396; E en residuo 462; N en residuo 463; T en residuo 465; T en residuo 467; P en residuo 468; R en residuo 483; G en residuo 484; L en residuo 486; T en residuo 489; N en residuo 498; I en residuo 508; D en residuo 513; W en residuo 517; E en residuo 519; G en residuo 521; D en residuo 525; I en residuo 528; N en residuo 531; F en residuo 533; I en residuo 549; P en residuo 553; I en residuo 573; A en residuo 590; G en residuo 595; N en residuo 601; e I en residuo 629; y

   donde la enzima tiene al menos identidad del 20 % con la SEC ID n.°: 2 cuando se alinea con la SEC ID n.°: 2, como una alfa-galactosidasa.
2. 2. El uso de una enzima purificada de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la enzima comprende un polipéptido que tiene una secuencia especificada por SEC ID n.° 6 o SEC ID n.°7.
3. 3. El uso de una enzima purificada de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la enzima muestra un pH neutro óptimo y una actividad alfa-galactosidasa con especificidad por sustratos ramificados, especificidad por sustratos lineales o ambas.
4. 4. El uso de una enzima purificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para preparar un glóbulo rojo modificado, donde dicho uso comprende;

   (i) suspender eritrocitos del grupo B o grupo AB en una solución tampón que tiene un pH neutro;

   (ii) incubar los eritrocitos de la etapa i) con la enzima purificada;

   (iii) aislar el eritrocito convertido de la etapa ii) a partir de la enzima y el residuo de galactosa inmunodominante escindido enzimáticamente, para escindir por tanto los epítopos B inmunodominantes en el eritrocito del grupo B o del grupo AB según se determina por clasificación serológica o ensayos de hemaglutinación.
5. 5. El uso de una enzima purificada de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la célula sanguínea carece de epítopos B inmunodominantes pero mantiene los epítopos de alfa-1,4-Gal.

   00

   F1C;1L

   imagen1

   FIC. 2,

   00

   ro

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   4$

   Tiempo fermentación

   00

   co

   Enzima ;

   Fuente de carbono*

   H-tri

   B-tetra

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   00

   4^

   H*tri

   B-tetra

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   H-tri

   B-tetra

   00

   en

   H-tri

   B-tetra

   [NaP04](mM) 10 Ifl 10 20 30 40 30 100

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   00

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   FlC.íi.

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   Lavados/Eluatos

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   60 80 UK> L20 200

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   200 kDa ------

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   97,4
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7. 55.4 *----
8. 36.5 -----

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   Marcador

   proteico

   H-tri

   B-tetra

   cx-gula.ctnsidasa

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   teórica

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   HPTLC

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   Marcador

   proteico

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   75

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   35

   ■30

   25

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    U I U I U I

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    expresada

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    F1G, 1H

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    <

    Dependencia de pH de actividad Gabt-pNP de B-zima de FragB
11. 2.4

    2-i

    11

    1.4

    1l1

    0,8

    0,6

    0,4

    °’o2

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    1 1,5 2 2.5 3

    3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7

    7,5 8 8t5 9 9,5

    pH

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    rnm

    ■ asim-4<OafB1 -M3I¿ ^:; £ -jf¿:r-v " ■ . QÍINfií¿SÍ¡fkJcoWJÍ»j

    A. Especificidad de sustrato de a-galactosidasa de BFa2 (FragA).

    B. Especificidad de sustrato de a-gala otos rdasa de BFp1 (FragB).