JP2010268794A - α−ガラクトシダーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定される配列を含むポリペプチドを含み、アルファガラクトシダーゼの分岐基質特異性および中性の至適pHを示す、精製された酵素。血液製剤および組織上に存在する免疫優性の単糖の酵素的除去用の新規α-ガラクトシダーゼ。
【選択図】なし
Description
本発明は、血液製剤および組織上の免疫優性の単糖の除去に使用される、固有の基質特異性、および優れた動態学的特性を示す、α-ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドの新規ファミリーに関する。具体的には本発明は、血液型B型およびAB型に反応性の血液製剤からB型抗原を、ならびに非ヒト動物組織からGalili抗原を酵素的に除去することで、これらを移植に適切な非免疫原性の細胞および組織に変換するために使用される、α3グリコシダーゼの新規ファミリーを提供する。
本明細書で用いる「血液製剤」という表現は、全血、ならびに赤血球(erythrocyte)(赤血球(red blood cell))および血小板を含む血液由来の細胞成分を含む。
1Clausen and Hakomori, Vox Sang 56(1): 1-20, 1989(非特許文献1)を改変。記号:「?」は、現時点で報告されていない潜在的な糖脂質構造を意味する。
精製されたか、または組換え型のコーヒー豆(Coffea canephora)α-ガラクトシダーゼを使用するB型血液の酵素的変換は、100〜200 U/mlを使用することで達成されている(米国特許第4,427,777号(特許文献1);Zhu et al., Arch Biochem Biophys 1996;327(2): 324-9(非特許文献5);Kruskall et al., Transfusion 2000;40(11): 1290-8(非特許文献6))。コーヒー豆α-ガラクトシダーゼの比活性は、p-ニトロフェニルα-D-Galを使用して32 U/mgと報告されている(1単位(U)は1分間に1μmoleの基質を加水分解する量と定義)(Zhu et al., Arch Biochem Biophys 1996;327(2): 324-9(非特許文献5))。酵素的変換は、pH 5.5で、ヘマトクリット値が80〜90%で、約6 mg/mlの酵素を使用して行われ、ならびに結果として得られた、変換O型細胞は輸血実験で正常に機能し、および有意な有害な臨床パラメータは観察されなかった(Kruskall et al., Transfusion 2000;40(11): 1290-8(非特許文献6))。このデータは、初期の報告とともに、酵素による赤血球の変換が可能であること、ならびにこのような酵素によるB型変換O型(B-ECO)細胞が機能可能であり、ならびに輸血医学における非処理細胞とマッチ可能なことを明瞭に示している。それにもかかわらず、これらの試験における変換に必要な酵素量は、組換えによる酵素の産生であっても、ECO細胞の作製法を、主に経済的な理由のために実用的としない。
エキソ-グリコシダーゼをスクリーニング、同定、および解析する過去の方法は一般に、糖および潜在的な結合に対する特異性を同定するための基質として単純な単糖誘導体を使用することに依存している。誘導体化された単糖、またはまれにはオリゴ糖の基質は、p-ニトロフェニル(pNP)、ベンジル(Bz)、4-メチル-ウンベリフェリル(Umb)および7-アミノ-4-メチル-クマリン(AMC)を含むが、これらに限定されない。このような基質の使用は、グリコシダーゼ活性を同定し、ならびに酵素の多様な供給源の大規模スクリーニングを実際的に応用可能とするための、容易で、迅速で、および安価なツールを提供する。しかしながら、グリコシダーゼ酵素の動態学的特性および優れた基質特異性は必ずしも、このような単純な構造に関するアッセイに反映されていない可能性がある。複合オリゴ糖に対する特異性、および/または選択効率の程度が高く、かつ固有の複合糖質構造の新規酵素が存在する可能性もあるが、このような酵素は、解析法のために見過ごされ、また認識されていない可能性がある。したがって、特定の複合オリゴ糖または複合糖質の構造に対する最適なエキソ-グリコシダーゼを同定して選択するためには、このような複雑な構造を、酵素の供給源のスクリーニングに使用されるアッセイで使用することが好ましい。さらに、スクリーニングに使用される好ましいアッセイは、要求されるpH、および例えば細胞膜に結合する基質に対する機能などの、好ましい動態学的特性に対する選択を含む。
本発明は、ほぼ中性のpH範囲において、血液型B型構造に対して好ましい特異性を有し、ならびに血液製剤および動物組織の酵素的変換に好ましい機能を有する新規α-ガラクトシダーゼのスクリーニングおよび選択の戦略の開発および応用に関する。表1に、血液細胞上に存在する抗原の複雑な構造を挙げる。
7-アミノ-4-メチル-クマリン誘導体などの、一連の複雑なABH式血液型のオリゴ糖構造からなる基質は、Alberta Chemical Research Councilによってカスタム合成された(U.S.S.N. 10/251,271を参照)。他の基質は、さまざまな供給業者(Sigma-Aldrich)から入手可能であった。使用した全ての試薬は、分析グレードまたはこれ以上のものとした。標準的な酵素アッセイを、さまざまな基質を使用して以下のように実施した。
さまざまな培地の組成を表IIに示す。フラスコおよび50 mLのコニカルチューブ中における発酵を標準的な条件(30℃、220 rpmで望ましい時間)で行った。発酵は、pH 6.8、30℃、300〜600 rpm、DO=50%で実施した。
1.指定の成分を含まない全ての培地は、121℃で25分間かけて滅菌した。
2.成分を0.22μmで濾過して滅菌し、および滅菌後に所望のレシピに添加した。
S.グリセオプラヌスは過去に、適切な培地で成長時に、分泌型の新規α-ガラクトシダーゼを産生可能なことが報告されているが、同酵素は均一となるまで精製されていなかった。この微生物のクリオストック(cryostock)を、5〜10容のYM培地に添加し、および30℃、220 rpmで24時間、振盪フラスコ中で、または培養の規模に応じて、50 mLのコニカルチューブ中で成長させた。次にYM培地を約20容のBP培地に添加し、ガラクトシダーゼの産生を誘導するために、続けて同条件でインキュベートした。培養物に関連する酵素活性は通常、3日以内にピークを迎える。酵素活性を含む培養上清を遠心分離して回収した。図1は、基質B-tetraによる、典型的な消費培地上清の酵素アッセイのHPTLC解析を示す。同定されたα-ガラクトシダーゼは、細胞の全ライセートの両方において、極めて低い容量収量(volumetric yield)で発現され、ならびに培地中に分泌された(一般的な方法に記載されたB-tetra AMC酵素アッセイで解析された約0.1 U/Lの培養物)。したがって、配列決定用に十分な量の純粋なタンパク質を単離することは、ほとんど不可能である(U.S.S.N. 10/251,271を参照)。所望のタンパク質の発現レベルが低いこと、富栄養培地が不均一であること、およびタンパク質を多く含むことは、タンパク質同定用の十分な活性の精製が困難であることの主要因であると見なされた。
25 pmol/(1μl * 60分)≒0.4 mU/mLまたは0.4 U/L
この収率は、富栄養培地による培養物で得られる典型的な収率(約0.1 U/L)よりかなり高い。さらに、この収率はおそらく1時間より前における時点のデータが無いために、反応のエンドポイントを失ったことから、過小評価されている。予備的な結果は、α-ガラクトシダーゼの産生および精製を促進するために最小培地を使用することの大きな可能性を示している。
出発材料が、文献(U.S.S.N. 10/251,271を参照)に記載された部分的な精製に使用される材料とは実質的に異なるため、新規酵素用の新たな精製戦略を開発した。見かけ上、均一となるまで精製するために、以下の段階を使用した:実施例1に記載された手順で1 Lの発酵槽で行われた800 mlの培養物に由来する細胞ブロス上清(450 ml)を対象に、20,000 rpm、4℃で30分間の高速遠心分離を行った。上清を、40 mM NaPO4、10 mM NaCl(pH 6.8)で事前に平衡化した15 mlのCEXカラム(Macro-Prep High S support, BioRad, Cat. #156-0031)にアプライし、ならびに、それぞれ40 mlの平衡緩衝液および40 mM PO4、10 mM NaCl(pH 7.3)で洗浄した。α-ガラクトシダーゼ活性を含むフロースルーおよび2種類の洗浄液をプールし(図4、パネルA)、ならびに40 mM NaPO4、10 mM NaCl(pH 6.8)で事前に平衡化した2.5 mLのDEAE(DEAE Sepharose, Sigma, Cat. #DEF100)の第2のカラムにアプライした。次にカラムを、50 mlの平衡緩衝液で洗浄した。α-ガラクトシダーゼ活性を含む計600 mlをフロースルーおよび洗浄液から回収した(図4、パネルB)。これらをプールし、Centricon Plus 80 Centrifugalフィルター装置(Millipore Cat. #UFC5LGC02)で濃縮し、および同装置内で緩衝液を10 mM NaPO4(pH 7.0)に、最終容量が23 mLとなるように交換した。
NuPAGEによって推定された、約1μgのα-ガラクトシダーゼタンパク質を、実施例2に記載された手順で調製した。タンパク質を4〜12%のNuPAGEで分離し、およびColloidal Blue染色キット(Invitrogen, Cat. #LC6025)で染色した。ゲルをH2Oで脱色後、染色された70 KDのバンドを切り出して、HPLCグレードのH2Oおよび50%アセトニトリル(溶媒はH2O)で洗浄した。切片化したゲルを対象に、ハーバード大学のHarvard Microchemistry Facilityで直接、配列解析が行われた。簡単に説明すると、ゲルの切片をDTTで還元し、およびヨードアセトアミドでアルキル化した後に、25 mM炭酸水素アンモニウム緩衝液中でトリプシン処理した。トリプシン消化物を、Finnigan LCQ DECA XP Plus四極子イオントラップ質量分析計で、ミクロキャピラリー逆相HPLCナノ-エレクトロスプレータンデム質量分析(μLC/MS/MS)で解析した。ペプチドの予備的な配列決定を、アルゴリズムSEQUESTとのデータベース相関によって速めた。次にMS/MSペプチド配列を、既知タンパク質とのコンセンサスに関して検討し、および結果の正確さを手計算で確認した。NCBI nrデータベースまたはestデータベース上の配列に、このデータと相関するものは見あたらなかった。
625アミノ酸(全長)の推定タンパク質(SEQ ID NO: 2)をコードする、長さが1878塩基対の、同定されたストレプトマイセス・アベルミティリスの遺伝子の推定全コード配列を、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)で、プライマー対
を使用して増幅し、NcoI/HindIII制限酵素(プライマー中の制限酵素切断部位を下線で示す)で切断し、および細菌発現ベクターpPET28(Novagen, Cat. No. 70777-3)のNcoI/HindIII部位にクローニングして、pZQ-B002aコンストラクトを得た。この遺伝子が内部の1490位にNcoI切断部位を有するという事実をふまえて、完全長の遺伝子コンストラクトの挿入を、2段階のクローニング手順で行った。発現コンストラクトの全配列を決定して確認した。作製された完全長の発現コンストラクトpZQ-B002aで大腸菌株Rosetta(BL21-DE3)pLysS(Novagen Cat. No.70956-3)を形質転換し、ならびにLB-寒天プレート上に、クロラムフェニコール(34μg/ml)およびカナマイシン(50μg/ml)の存在下でプレーティングした。
変換プロトコル1:酵素による変換反応を、図に示すように、30%の濃厚赤血球(pRBC)および酵素と、200 mMグリシン, pH 6.8、および3 mM NaClを含む1 mlの反応混合物中で行った。新鮮な全血を、Oklahoma Blood Institute(Oklahoma City, OK)から入手し、バフィーコートを除去した。RBCを、1:1および1:4(vol/vol)で変換用緩衝液で洗浄後に酵素を添加し、ならびに反応物を26℃でゆるやかに混合しながら60分間インキュベートし、続いて1:4(vol/vol)の生理食塩水で1,000 rpmの遠心分離による4回の洗浄サイクルを繰返し行った。洗浄後の酵素処理B-ECO RBCを対象に、さまざまな市販のモノクローナル抗体試薬((Immucor Gamma Anti-B(Gamma Biologicals/Immucor, Norcross, Ga.);Ortho Anti-B(Ortho Clinical Diagnostics, Raritan, N.J.);およびDiagast Anti-B)(Diagast Laboratories, France)を使用する標準的な血液バンキング法でABO式血液型を決定した。
等張性の血液バンク生理食塩水を溶媒とする、洗浄済みの赤血球の3〜5%の懸濁物を調製する。1滴(約50μl)の抗B型抗体試薬を添加する。1滴(約50μl)の赤血球懸濁物を添加する。チューブを混合し、および3500 rpmで15秒間、遠心分離する。細胞を、緩やかに攪拌しながら再懸濁し、および凝集の程度を肉眼で調べた。凝集の程度を、AABB Technical Manual、第13版のMethod 1.8に従って決定する。
S.グリセオプラヌス2357に由来する内因性のα-ガラクトシダーゼの単離および精製は、実施例2に記載されている。30アミノ酸のペプチドを生じた、精製済みのα-ガラクトシダーゼのアミノ酸配列の部分的な決定については、実施例3に記載されている。このペプチドを使用した、「nr」データベース(GenBank)に対するBlast検索によって、推定α-ガラクトシダーゼのファミリーが同定された。5α-ガラクトシダーゼの配列を、EMBL/GenBank/DDBJデータベースに寄託して以下のアクセッション番号が割り当てられた:AM109953(ストレプトマイセス・アベルミティリス)、AM109954およびAM109955(バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis))、AM109956およびAM109957(バクテロイデス・テタオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron))。推定α-ガラクトシダーゼの多重配列アラインメントによって、少数の保存された領域が同定された(図15)。ストレプトマイセス・グリセオプラヌスに由来する推定α-ガラクトシダーゼをコードするオープンリーディングフレームを、ゲノム末端の5'および3'を対象とした速やかな増幅(RAGE)を元にクローニングした。最初の縮重プライマーは、推定α-ガラクトシダーゼ配列の多重配列アラインメントで決定された保存領域を元にした。縮重性のセンスおよびアンチセンスのプライマー
(X=イノシン、およびK=GまたはT)を使用して、ストレプトマイセス・グリセオプラヌスのゲノムDNAから、1つの185 bpのBZyme特異的なDNA断片をPCR増幅した。PCR産物をpCR4ベクター(Invitrogen)にクローニングし、および配列を決定してpCR4-dAVER7/9を得た。ストレプトマイセス・グリセオプラヌスのα-ガラクトシダーゼに特異的なプライマーGRIS10
およびGRIS11
はpCR4-dAVER7/9に由来する。ストレプトマイセス・グリセオプラヌスのゲノムDNAをエンドヌクレアーゼで処理して、制限エンドヌクレアーゼHaeIIによって完了し、0.8%アガロースゲル電気泳動によってサイズに従って分画化し、および2〜3 kbpの分画化されたDNAを、Qiagel精製(Qiagen)によって精製した。精製後のDNAを、T7結合部位(下線部)、およびHaeII制限酵素オーバーハング(斜体字で表示)をコードする2本鎖HaeIIアダプターEBRETTE3
に連結した。アダプター結合DNAを、10 ngのアダプター結合DNAであるT7/GRIS11を使用した5'RAGE、または10 ngのT7/GRIS10を使用した3'RAGEに使用した。生じた5'RAGE産物および3'RAGE産物をpCR4にクローニングして、5'-T7/GRIS11-pCR4および3'-T7/GRIS10-pCR4を得て、全配列を決定した。重複する5'-T7/GRIS11-pCR4および3'-T7/GRIST10-pCR4の配列は、BZymeの遺伝子配列を完全に含む1593 bpである。残りの5'および3'の配列は、分画化されたBamHI切断済みのストレプトマイセス・グリセオプラヌスのゲノムDNAである、連結されたBamHIアダプターEBRETTE3/6
を対象としたRAGEを繰り返すことで得られた(BamHIオーバーハングを斜体字で示す)。完全な5'配列を、10 ngのアダプター結合DNAおよびT7/GRIS22
を使用して得た。また3'配列を、T7/GRIS24
を使用して得た。生じた5'RAGE生成物および3'RAGE生成物をpCR4にクローニングし、5'-T7/GRIS22-pCR4および3'-T7/GRIS24-pCR4を得て、全配列を決定した。5'-T7/GRIS22-pCR4は、推定開始メチオニンを含んでおり、および3'-T7/GRIS24-pCR4は、727アミノ酸のα-ガラクトシダーゼ(SEQ ID NO: 25)をコードするストレプトマイセス・グリセオプラヌスのα-ガラクトシダーゼ遺伝子(SEQ ID NO: 24)の完全な2184 bpのコード配列を完成する、終止コドンを同じフレームで含んでいた。この配列をGenBankに寄託した(アクセッション番号AM259273)。プライマーが由来する、α-ガラクトシダーゼのタンパク質配列の領域を図16に示す。
FragB α-ガラクトシダーゼ(SEQ ID NO: 6)の発現コンストラクトを、細菌のゲノムDNAからPCRでクローニングした。推定アミノ末端シグナルペプチド1〜24をコードする領域を欠くFragB α-ガラクトシダーゼ遺伝子を、バクテロイデス・フラジリスのゲノムDNA(ATCC 25285D)から、プライマーBFRAGB2
を使用したPCRで抜き出し、およびPfu Ultraポリメラーゼ(Stratagene)を使用して増幅した。上記プライマー中におけるBamHIおよびHindIIIの制限酵素オーバーハングに下線を付す。BamHIおよびHindIIIによる切断後に、増幅されたポリヌクレオチド産物を、細菌発現ベクターpET28(Novagen)に、同じフレームで、6xHisタグをコードするプラスミドの下流に挿入してプラスミドpZQ-B006aを得た。非タグ発現ベクターの構築に関しては、pET28ベクター中の6xHisタグをNcoI/BamHIで切断して除去した後に、2本鎖オリゴであるPETNCBAF
を挿入し、プラスミドpET28-δHisを得た。Hisタグタンパク質をコードする上記のFragBコンストラクトを、pET28-δHisのBamHI/HindIII部位にサブクローニングし、非タグFragB α-ガラクトシダーゼ発現用のプラスミドpZQ-B006cを得た。全てのコンストラクトの全配列を、377 ABI Prism装置(Applied Biosystems)で決定した。タンパク質の発現に関しては、pZQ-B006cで大腸菌Rosetta2(DE3)(Invitrogen)を形質転換した。大腸菌クローンは、34μg/mLのクロラムフェニコールおよび50μg/mLのカナマイシンを添加した1X Terrific Broth(Sigma)で37℃、220 rpmで、OD600が約0.6となるまで成長させ、ならびにIPTGを0.5 mMとなるように添加して、標的タンパク質の発現を誘導した。3時間後に、3000 xgで30分間、遠心分離して培養物を回収した。細胞ペレットを-20℃で保存した。350 mlの培養物から回収した細胞ペレットを、25 mM NaOAc, pH 5.5/10 mM NaClを溶媒とする1X BugBuster(Invitrogen)を使用して溶解し、5μLのベンゾナーゼ(Benzonase)(Invitrogen)を添加して室温で1時間攪拌した。全ライセートを40,000 x gで5℃で30分間、遠心分離して清澄化した。90%以上の酵素活性を含む細胞デブリを、10 mM NaPO4, pH 6.8/400 mM NaClに再懸濁して室温で30分間、攪拌した。高速遠心分離を繰り返し、酵素活性を含む上清を回収した。結果として得られた上清を、10 mM NaPO4, pH 7.0で事前に平衡化した5 mlのヒドロキシアパタイトカラムにロードした。カラムを20 mlの平衡用緩衝液で洗浄後に、10〜400 mMのNaPO4勾配、pH 7.0を使用して溶出した。200〜400 mMのNaPO4, pH 7.0に溶出された酵素活性をプールし、濃縮し、および緩衝液を、Amicon(Grace)遠心分離装置Plus 70内で、10 mlの40 mM Tris、400 mM NaCl/pH 7.5と交換した。タンパク質溶液を、透析用緩衝液で事前に平衡化した5 mlのPhenyl Sepharose High Performanceカラム(Amersham)を通過させ、およびローディング後にカラムを、10 mLの透析用緩衝液で洗浄した。フロースルーおよび洗浄液をプールし、1 M TrisでpH 8.5に調整し、等量のH2Oで希釈した。結果として得られたタンパク質溶液を対象に、別のカラムを通過させる段階を、40 mM Tris, pH 8.5/10 mM NaClで事前に平衡化した2.3 mLのMacro-Prep High Qで行い、およびカラムを、10 mLの平衡用緩衝液で洗浄した。フロースルーおよび洗浄液をプールし、ならびに緩衝液を、7 mlの10 mM NaPO4, pH 6.8/50 mM NaClに交換した。タンパク質濃度を、PierceのBCA Protein Assayキットで決定した。
組換え型の精製されたFragB α-ガラクトシダーゼの基質特異性をさらに解析した結果、驚くべきことに、この酵素は、(S.グリセオプラヌスに由来する初期の精製されたα-ガラクトシダーゼとは対照的に)、Galα-pNP基質に低い活性を示すことがわかった(100 mM NaPO4, pH 6.8/50 mM NaClの緩衝液系の使用時に約1.6 U/ml)(表IV)。
1本研究。
2Zhu, A., Monahan, C., Zhang, Z., Hurst, R., Leng, L. & Goldstein, J. (1995) Arch Biochem Biophys 324, 65-70による。
3決定せず。
4米国特許出願第20050208655号による。
1US patent 20050208655 (Ref.)、およびZhu, A., Monahan, C, Zhang, Z., Hurst, R., Leng, L. & Goldstein, J. (1995) Arch Biochem Biophys 324, 65-70による。
2本研究。
3該当なし。
4アッセイの条件で容易に検出可能な活性。
5アッセイの条件で容易に検出可能でない活性。
Claims (28)
- 血清学的タイピングによって判定される、免疫優性のB型エピトープを欠くB型赤血球またはAB型赤血球を含む、修飾された赤血球。
- 血液細胞が、免疫優性のB型エピトープを欠くが、α1,3Galエピトープまたはα1,4Galエピトープのいずれかを保持する、請求項1記載の修飾された赤血球。
- 以下の段階を含む方法で調製される、修飾された赤血球:B型赤血球またはAB型赤血球を得る段階、赤血球を中性pHの緩衝液に懸濁する段階、ならびに赤血球に、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを接触させることで、赤血球から免疫優性のB型エピトープを実質的に切断するが、α1,3Galエピトープまたはα1,4Galエピトープを切断しない段階。
- 赤血球の処理に使用される酵素が、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、もしくはSEQ ID NO: 9によって特定される酵素のポリペプチド配列、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項3記載の修飾された赤血球。
- 赤血球の酵素的処理が約6.0〜8.0のpHで行われる、請求項4記載の修飾された赤血球。
- 赤血球の酵素的処理が約6.5〜7.5のpHで行われる、請求項5記載の修飾された赤血球。
- 赤血球の酵素的処理が約7.0〜7.5のpHで行われる、請求項5記載の修飾された赤血球。
- 赤血球の酵素的処理が、血液細胞1 mlあたり1〜10μgの酵素を使用して行われる、請求項5記載の修飾された赤血球。
- 以下の段階を含む、赤血球を修飾する方法:B型またはAB型の赤血球を得る段階、これを中性pHの緩衝液に懸濁する段階、ならびにこれに、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、もしくはSEQ ID NO: 9によって特定される配列を有するポリペプチドを接触させることで、血清学的タイピングまたは赤血球凝集アッセイによって決定される、B型またはAB型の赤血球上の分岐状の免疫優性のB型エピトープを切断する段階。
- 以下の段階を含む、対象を治療する方法:抗B型抗体に対して血清反応陽性である、血液を必要とするヒト対象を同定する段階;請求項1記載の修飾された血液細胞調製物、または請求項3記載の方法で得られた血液細胞調製物を得る段階、ならびに;血液細胞調製物を対象に輸血する段階であって、対象は輸血された血液細胞を免疫学的に拒絶しない、段階。
- SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、またはSEQ ID NO: 9によって特定される配列を含むポリペプチドを含み、アルファガラクトシダーゼの分岐基質特異性および中性の至適pHを示す、精製された酵素。
- 以下を含む、精製された酵素:
(a)SEQ ID. NO: 2とのアラインメントに従って番号が付された、以下の配列中の少なくとも10アミノ酸を有するポリペプチド:
残基10におけるM;残基47におけるG;残基84におけるG;残基86におけるY;残基99におけるY;残基102におけるN;残基114におけるK;残基127におけるT;残基130におけるG;残基132におけるG;残基139におけるG;残基156におけるN;残基160におけるD;残基164におけるP;残基205におけるG;残基277におけるR;残基281におけるR;残基287におけるF;残基308におけるG;残基312におけるQ;残基317におけるI;残基333におけるR;残基340におけるD;残基346におけるG;残基349におけるG;残基360におけるG;残基363におけるD;残基364におけるD;残基367におけるN;残基369におけるH;残基370におけるG;残基371におけるT;残基396におけるG;残基462におけるE;残基463におけるN;残基465におけるT;残基467におけるT;残基468におけるP;残基483におけるR;残基484におけるG;残基486におけるL;残基489におけるT;残基498におけるN;残基508におけるI;残基513におけるD;残基517におけるW;残基519におけるE;残基521におけるG;残基525におけるD;残基528におけるI;残基531におけるN;残基533におけるF;残基549におけるI;残基553におけるP;残基573におけるI;残基590におけるA;残基595におけるG;残基601におけるN;および残基629におけるI;
(b)ポリペプチドは、SEQ ID NO: 2と少なくとも20%の同一性を有し、ならびにα3ガラクトシダーゼ活性を有する。 - 配列DD(P/A)(V/I)N(V/I)HGTを有する9個の隣接アミノ酸を含む、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドを含む、精製された酵素。
- 機能的等価物をさらに含む、請求項11、12、13、または14の精製された酵素。
- シグナル配列を含まない短縮型バリアントを含む、請求項15記載の精製された酵素。
- 請求項12、13、14、15、または16のアルファガラクトシダーゼ酵素を使用して、赤血球が酵素的に処理され、免疫優性のB型エピトープが除去される、請求項3記載の修飾された赤血球。
- 以下の段階を含む、組換え酵素を作製する方法:SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 8をコードする核酸を得る段階;核酸を、それをトランスフェクトした細胞で発現させる段階;酵素をコードする核酸の発現を誘導する段階;ならびに、発現された酵素を細胞から精製する段階であって、酵素はα3ガラクトシダーゼ活性を有する、段階。
- 以下を含む、非天然の原核細胞:野生型の原核細胞中には見られない発現ベクターであって、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、またはSEQ ID NO: 9によって特定される配列を含む、α3ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する発現ベクター。
- Galα1-3結合の切断に対しては限定的な特異性を有するが、Galα1-4結合の切断に対しては有さない、請求項11または請求項12の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
- 血液型B型構造におけるような、分岐状Galα1-3結合の切断に対する特異性を有する、請求項20記載の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
- 直鎖状B型構造および血液型B型構造におけるような、直鎖状および分岐状のGalα1-3結合の切断に対する特異性を有する、請求項20記載の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
- 直鎖状および分岐状のGalα1-3結合を5.0〜7.5のpH範囲で切断する、請求項11、12、20、および22の精製された原核生物α-ガラクトシダーゼ。
- 以下の段階を含む、異種移植用の組織を調製する方法:非ヒト動物供給源から組織を得る段階;組織を、α3-ガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチドとともにインキュベートすることで、免疫優性のα1-3結合末端ガラクトース残基を組織から除去する段階;ならびに、ポリペプチドおよび酵素的に除去されたガラクトースから組織を単離することで、組織をヒトへの異種移植に適切な状態にする段階。
- 組織がブタの結合組織である、請求項24記載の方法。
- ブタの結合組織が靱帯である、請求項25記載の方法。
- 組織が、肝臓、腎臓、または心臓を含む器官である、請求項24記載の方法。
- 組織が、非免疫原性の注射可能なコラーゲン;骨の異種移植片;軟部組織およびプロテオグリカン低減軟部組織の異種移植片;異種移植心臓弁;半月板の異種移植片;ならびに組織マトリックスであって、SEQ ID NO: 2〜9のいずれかのα3ガラクトシダーゼを使用して修飾されたα1,3-ガラクトース欠損組織である、請求項24記載の方法。
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