ES2800724T3 - Construcción de nuevas variantes de dextransacarasa DSR-S por ingeniería genética - Google Patents
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Abstract
1. Una dextransacarasa que consiste en una secuencia que tiene el 90 %, el 95 % o el 98 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423 de SEQ ID NO: 6 y como se define en SEQ ID NO: 22, el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido 1335 de SEQ ID NO: 7 y como se define en SEQ ID NO: 23, el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1136 de SEQ ID NO: 8 y como se define en SEQ ID NO: 24, el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1006 de SEQ ID NO: 9 y como se define en la SEQ ID NO: 25, y el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423 de SEQ ID NO: 10 y como se define en SEQ ID NO: 26, en donde la actividad enzimática de los dextranos que se forman se mantiene y en donde la dextransacarasa conserva su especificidad para sintetizar enlaces alfa-1,6.
Description
DESCRIPCIÓN
Construcción de nuevas variantes de dextransacarasa DSR-S por ingeniería genética
La divulgación describe un proceso recombinante para la producción de dextransacarasas truncadas y/o mutadas mientras conserva su actividad enzimática y/o conserva su especificidad para sintetizar enlaces a-1,6. De manera más precisa, la divulgación describe secuencias de ácido nucleico de dextransacarasas truncadas o mutadas, vectores que contienen dichas secuencias de ácido nucleico y células hospedadoras transformadas mediante secuencias que codifican dextransacarasas truncadas o mutadas. La divulgación también describe un método para producir, de una manera recombinante, dextransacarasas truncadas y/o mutadas que conservan su actividad enzimática y/o conservan su especificidad para sintetizar enlaces a-1,6 en el producto final y métodos para producir dextranos o isomaltooligosacáridos, en una sola etapa, con una masa molar controlada y dextranos con propiedades reológicas modificadas, especialmente en comparación con las propiedades de los dextranos obtenidos con la enzima nativa. La presente invención se refiere a una dextransacarasa que consiste en una secuencia que tiene el 90 %, el 95 % o el 98 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25 o 26, en donde la actividad enzimática de los dextranos que se forman se mantiene y en donde la dextransacarasa conserva su especificidad para sintetizar enlaces alfa-1,6. La presente invención también se refiere a proteínas de fusión que comprenden una etiqueta de proteína fusionada a dicha dextransacarasa.
Campo de la invención
Los dextranos son a-D-glucanos con diversas estructuras, que comprende unidades de glucosilo contiguas de las cuales más del 50 % tienen enlaces a-1,6 en la cadena principal y ramificaciones a-1,2, a-1,3 y/o a-1,4 [1]. Las enzimas que producen tales dextranos a partir de sacarosa se denominan dextransacarasas y pertenecen a la familia de las glucósido hidrolasas 70 [2]. Durante la reacción, la fructosa derivada de la sacarosa se libera y puede actualizarse en otro lugar. Las dextransacarasas se producen por bacterias lácticas de los géneros Leuconostoc, Streptococcus y Lactobacillus [1].
La dextransacarasa (DSR-S) de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F contiene 1.527 aminoácidos [3]. Esta enzima cataliza la síntesis de homopolímeros de glucosa con más del 95 % de enlaces a-1,6. La producción de dextrano puede redirigirse hacia la de oligosacáridos o conjugados glucosilados mediante la adición de un aceptor adecuado a la mezcla de reacción [4].
El número de aplicaciones industriales para dextranos y derivados de dextrano está aumentando, en particular para dextranos con un tamaño específico. Los dextranos con un tamaño en el intervalo de 70.000 a 100.000 Da se usan, por ejemplo, como sustituto de plasma [5, 31], Además, el dextrano de 40.000 Da se usa para mejorar el flujo sanguíneo, lo más probablemente reduciendo la viscosidad de la sangre e inhibiendo la agregación eritrocitaria [6,8]. Después de la sulfatación, los dextranos más pequeños de aproximadamente 10.000 Dalton, por ejemplo, se usan como transportadores de hierro [7] o anticoagulantes [8]. Esos compuestos pueden tener propiedades antivíricas [9, 10].
Además, los derivados de dextrano reticulados se han usado durante mucho tiempo en el campo de la separación molecular; los soportes de cromatografía con el nombre comercial Sephadex® se han vendido desde 1961 [6].
Por otra parte, la Unión Europea ha aprobado recientemente el uso de dextrano como ingrediente alimentario en productos de panadería cuando contienen más del 95 % de enlaces a-1,6 y tienen una masa molar de más de 2 x 106 Da [15].
La dextransacarasa también puede producir isomalto-oligosacáridos (IMO) a través de una reacción aceptora. Las reacciones aceptoras llevadas a cabo por las glucansacarasas consisten en una transferencia de restos glucosilo desde la sacarosa a otras moléculas añadidas al medio de reacción. Es de creciente interés comercial, particularmente en Japón, donde la demanda de isomalto-oligosacáridos representa aproximadamente quince mil toneladas por año [11]. Tales IMO pequeños (DP 2 a 6) se usan en artículos de panadería, para bebidas, en el sake, en condimentos, en confitería y como edulcorantes anticariogénicos. También se ha demostrado que dichos IMO tienen propiedades prebióticas que son útiles con respecto a la flora intestinal y/o vaginal [12,13]. Estas propiedades parecen variar con el tamaño de las IMO y se ven favorecidas por los altos grados de polimerización [14].
La única fuente comercial y habitual de dextranos consiste en cultivar L. mesenteroides NRRL B-512F con sacarosa, conduciendo a la formación de polímeros de alta masa molar de aproximadamente 108 Da. La síntesis directa de dextranos más pequeños de 10000 a 100000 Da es actualmente imposible. Los dextranos se producen actualmente de forma convencional por hidrólisis ácida de polímeros nativos de alta masa molar, seguido de fraccionamiento usando disolventes orgánicos. Esta segunda etapa, sin embargo, es famosa por sus bajos rendimientos [19].
Desde un punto de vista comercial, los IMO de DP 2 a 6 no se producen por una reacción aceptora con dextransacarasa DSR-S y glucosa debido a los bajos rendimientos de reacción, sino a partir de hidrolizados de almidón y una mezcla de a-amilasas y glucosidasas [11].
Monchois et al [16] describen deleciones carboxi-terminales de la dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F y concluyen que el papel del dominio C-terminal es facilitar la transferencia de dextrano y oligosacáridos más allá del sitio activo.
La patente de Estados Unidos US-A-5.229.277 describe un proceso para producir polímeros de dextrano que tienen una masa molar baja homogénea usando Leuconostoc mesenteroides y un microorganismo mutante de Lipomyces starkeyi ATCC 74054, que es una levadura que tiene actividad dextranasa, una enzima específica para la hidrólisis de enlaces a-1,6 de dextrano. Ese método requiere condiciones de cultivo particulares y una duración y temperatura reguladas con precisión de tal manera que la actividad de dextranasa reduzca la masa molar de los dextranos. Los polímeros de dextrano producidos por ese método tienen una masa molar en el intervalo de 40.000 y 150.000 Da.
Argüello-Morales et al., Antonie Van Leeuwenhoek, vol 87 n.° 2 (febrero de 2005), 131-141 desvela dos formas activas de dextransacarasa de Leuconostoc mesenteroides B-512 que tienen pesos moleculares de 155 y 129 kDa. Estas dextransacarasas surgen de la escisión proteolítica de un precursor de 170 kDa y se comportan en soluciones como fluidos newtonianos.
Lo anterior muestra que existe la necesidad de la producción de dextranos con una masa molar de aproximadamente 10.000 a 100.000 Da usando un método más rápido con un mejor rendimiento, que en particular no requiere hidrólisis ácida ni fraccionamiento.
La divulgación describe dextransacarasas producidas de manera recombinante, que están truncadas y/o mutadas, mientras conservan su actividad enzimática y/o conservan su especificidad para sintetizar enlaces a-1,6. La presente invención se refiere a variantes truncadas de dextransacarasa que producen dextranos con una masa molar controlada. De manera más precisa, conservan la especificidad de unión de DSR-S nativo y/o conservan su especificidad para sintetizar enlaces a-1,6 y, empezando a partir de sacarosa, produce dextranos de alta masa molar con propiedades de textura interesantes y/o dextranos e IMO con una masa molar controlada.
La divulgación también describe proporcionar secuencias de ácido nucleico de dextransacarasa truncada y/o mutada, vectores y células hospedadoras transformadas por dichos vectores y secuencias de aminoácidos de dextransacarasas truncadas y/o mutadas.
En particular, como se hará evidente a partir de los Ejemplos, determinadas dextransacarasas producen polímeros con propiedades de textura interesantes, es decir, sustancialmente superiores a las del polímero producido por la enzima nativa; otras producen dextranos e isomalto-oligosacáridos con una masa molar controlada. La isomaltosa se produce por al menos una dextransacarasa truncada y mutada.
Otros aspectos de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción y Ejemplos o implementaciones preferidos.
Sumario de la invención
La divulgación describe una secuencia de nucleótidos que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Figura 2 (SEQ ID NO: 2), una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Figura 3 (SEQ ID NO: 3), una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la Figura 5 (SEQ ID NO: 5), una secuencia complementaria de una de las secuencias con SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 o 5 o una secuencia que hibrida con una secuencia con SEQ ID NO: 1,2, 3, 4 o 5 en condiciones de hibridación rigurosas, con la condición de que conserve la actividad enzimática de dextransacarasa.
La divulgación también describe secuencias de nucleótidos de dextransacarasa que consisten esencialmente en o que consisten en una secuencia de nucleótidos seleccionada del fragmento de SEQ ID NO: 1 de la posición 373 a la posición 4269 (SEQ ID NO: 17), el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 2 de la posición 373 a la posición 4005 (SEQ ID NO: 18), el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 3 desde la posición 373 a la posición 3408 (SEQ ID NO: 19), el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 4 desde la posición 373 a la posición 3018 ( SEQ ID NO: 20) y el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 5 desde la posición 373 a la posición 4269 (SEQ ID nO: 21).
También describe secuencias de nucleótidos que consisten esencialmente en una secuencia de nucleótidos seleccionada de una secuencia de nucleótidos complementaria del fragmento de SEQ ID NO: 1 del nucleótido en la posición 373 a aquel en la posición 4269, una secuencia de nucleótidos complementaria del fragmento de SEQ ID NO: 2 del nucleótido en la posición 373 a aquel en la posición 4005, una secuencia de nucleótidos complementaria del fragmento de SEQ ID NO: 3 del nucleótido en la posición 373 a aquel en la posición 3408, una secuencia de nucleótidos complementaria del fragmento de SEQ ID NO: 4 del nucleótido en la posición 373 a aquel en la posición 3018 y una secuencia de nucleótidos complementaria al fragmento de SEQ ID NO: 5 del nucleótido en la posición 373 a aquel en la posición 4269.
También describe secuencias de nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos
seleccionada del fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 1 desde la posición 373 a la posición 4269, el fragmento de
la secuencia SEQ ID NO: 2 desde la posición 373 a la posición 4005, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 3
desde la posición 373 a la posición 3408, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 4 desde la posición 373 a la
posición 3018 y el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 5 desde la posición 373 a la posición 4269, con la condición
de que conserve la actividad enzimática de dextransacarasa y dichas secuencias de nucleótidos que se hibridan con
ellas tienen el mismo número de nucleótidos e hibridan sobre la longitud completa del fragmento.
La divulgación también describe secuencias de nucleótidos que codifican una proteína que consiste esencialmente en
o que consiste en aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10 o 22 a 26.
La divulgación también describe vectores, por ejemplo plásmidos, y células hospedadoras transformadas por dichos
vectores y que contienen dicha secuencia de ácidos nucleicos de dextransacarasa truncada y/o mutada, en particular
las variantes de los Ejemplos.
La divulgación describe una proteína codificada por dicha secuencia de nucleótidos de dextransacarasa truncada y/o
mutada seleccionada del fragmento de SEQ ID NO: 6 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición
1423 (SEQ ID NO: 22), el fragmento de SEQ ID NO: 7 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1335 (SEQ ID NO: 23), el fragmento de SEQ ID NO: 8 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1136 (SEQ ID NO: 24), el fragmento de SEQ ID NO: 9 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1006 (SEQ ID NO: 25) y el fragmento de SEQ ID NO: 10 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición
1423 (SEQ ID NO: 26).
Además, la presente invención se refiere a una dextransacarasa truncada y/o mutada que consiste en una secuencia
que tiene el 90 %, el 95 % o el 98 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del
fragmento de SEQ ID NO: 6 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423 (SEQ ID NO: 22), el
fragmento de SEQ ID NO: 7 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1335 (SEQ ID NO: 23), el
fragmento de SEQ ID NO: 8 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1136 (SEQ ID NO: 24), el
fragmento de SEQ ID NO: 9 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1006 (SEQ ID NO: 25) y
el fragmento de SEQ ID NO: 10 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423 (SEQ ID NO:
26).
La divulgación describe la preparación de una dextransacarasa mutada y/o truncada mediante el cultivo de células
hospedadoras que contienen una dextransacarasa truncada y/o mutada en condiciones que permiten la expresión de
una dextransacarasa, y aislar dicha dextransacarasa del medio de cultivo.
La divulgación también describe un método para producir dextranos y/o isomalto-oligosacáridos (IMO) con una masa
molar controlada controlada haciendo reaccionar una dextransacarasa mutada y/o truncada descrita en el presente
documento con sacarosa y opcionalmente un aceptor, para obtener dichos dextranos o IMO con una masa molar
controlada, incluyendo isomaltosa.
También se describe en el presente documento un método para la producción directa de IMO esencialmente a partir
de sacarosa. El término "esencialmente" como se usa en el presente documento significa que no es necesario que el
aceptor se emplee en la reacción.
Los dextranos de alta masa molar de la invención tienen propiedades reológicas modificadas en comparación con
aquellas del dextrano sintetizado por una enzima nativa, en particular de naturaleza no newtoniana, fibrosa y/o
gelificante.
Finalmente, la divulgación describe composiciones que comprenden dextranos obtenidos usando dichas
dextransacarasas y el uso de dichas dextransacarasas para la producción de dextranos e isomalto-oligosacáridos con
una masa molar controlada en el intervalo de 342 y 109 Da. De manera más precisa, puede producir (i) isomaltosa
(342 Da), (ii) isomalto-oligosacáridos de 342 a 5.000 Da, (iii) dextranos con un tamaño controlado de 1.300 a
52.000 Da, más precisamente de 5.000 a 22.000 Da y centrado alrededor de 10.000 Da, (iv) dextranos con un tamaño
controlado de 7.000 a 1,7 x 105 Da, más precisamente entre 22.000 y 70.000 Da, centrado alrededor de 40.000 Da.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos de una dextransacarasa DSR-S vardel A4N
truncada con una etiqueta de tiorredoxina en la posición terminal 5' de la secuencia y 6 etiquetas histidina en la
posición terminal 3' de la secuencia, así como brazos espaciadores entre las etiquetas de proteína y la secuencia
que codifica dextransacarasa.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos para una dextransacarasa DSR-S vardel A3
truncada con una etiqueta de tiorredoxina en la posición terminal 5' de la secuencia y 6 etiquetas histidina en la
posición terminal 3' de la secuencia y brazos espaciadores entre las etiquetas de proteína y la secuencia que
codifica dextransacarasa.
La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos para una DSR-S vardel Core truncada con una etiqueta de tiorredoxina en la posición terminal 5' de la secuencia y 6 etiquetas histidina en la posición terminal 3' de la secuencia y brazos espaciadores entre las etiquetas de proteína y la secuencia que codifica dextransacarasa. La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos y nucleótidos para una DSR-S Core AA truncada con una etiqueta de tiorredoxina en la posición terminal 5' de la secuencia y 6 etiquetas histidina en la posición terminal 3' de la secuencia y brazos espaciadores entre las etiquetas de proteína y la secuencia que codifica para dextransacarasa.
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos y nucleótidos para una DSR-S vardel A4N SEV663YDA mutante con una etiqueta de tiorredoxina en la posición terminal 5' de la secuencia y 6 etiquetas histidina en la posición terminal 3' de la secuencia y brazos espaciadores entre las etiquetas de proteína y la secuencia que codifica dextransacarasa.
La Figura 6 es una representación en diagrama de las variantes truncadas de DSR-S y su actividad relativa. Los cuatro dominios diferentes (i) a (iv) de DSR-S corresponden a: (i) péptido señal, (ii) región variable; (iii) dominio catalítico y (iv) dominio C-terminal, así como las unidades de repetición A, C y N (en las cajas sombreadas) ubicadas de acuerdo con Monchois et al., 1998 [16].
La Figura 7 (A, B) muestra transferencias Western anti-tiorredoxina (A) y anti-6xHis (B) llevadas a cabo en una DSR-S vardel A4N producida por E. coli TOP10 a 23 °C.
La Figura 8 muestra un gel de electroforesis después de teñir las proteínas con azul coloidal en extractos de DSR-S vardel A4N durante la purificación de afinidad en resina de níquel (Probond, Invitrogen). El carril 1 corresponde al sobrenadante del sometimiento a ultrasonidos de E. coli TOP10 al final del cultivo; el carril 2 corresponde al efluente obtenido después de unir las proteínas etiquetadas 6xHis en la resina, el carril 3 corresponde a la fracción de elución y el carril 4 corresponde a la fracción de elución después de eliminar los agregados.
La Figura 9 muestra los perfiles de elución obtenidos por HPSEC de dextranos producidos por la preparación de a) DSR-S nativo a partir de L. mesenteroides NRRL B-512F, b) DSR-S recombinante completa, c) d SR-S vardel A4N antes de la purificación y d) DSR-S vardel A4N purificada. El pico 1 corresponde al polímero de alta masa molar (HMW), el pico 2 a fructosa, glucosa y oligosacáridos con un DP de menos de 7, no separados por el sistema. Entre esos dos picos, las perturbaciones de la línea base reflejan la presencia de dextranos con un tamaño intermedio (entre 103 y 107 Da) en una concentración muy baja.
La Figura 10A-E muestra los espectros obtenidos por RMN de protón en dextranos sintetizados por A) DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F, B) la DSR-S recombinante completa, C) DSR-S vardel a 4n antes de la purificación y D) DSR-S vardel A4N después de la purificación. El espectro E) es un espectro de carbono 13 del dextrano sintetizado por DSR-S vardel A4N purificada.
La Figura 11 corresponde al cromatograma HPAEC-PAD de los productos de digestión usando endodextranasa (dasa) de los cuatro dextranos sintetizados por DSR-S nativa, DSR-S recombinante completa y DSR-S vardel A4N, antes y después de la purificación.
La Figura 12 muestra el comportamiento reológico de cuatro dextranos sintetizados por DSR-S nativa (1) antes y (2) después del cizallamiento, DSR-S recombinante completa (3) antes y (4) después de la aplicación de una segunda serie de esfuerzos de cizalla,, DSR-S vardel A4N (6) antes y (7) después de la aplicación de una segunda serie de esfuerzos de cizalla, DSR-S vardel A4N purificada (5) donde A) representa la medición del flujo de viscosidad, B) mediciones de viscosidad en modo dinámico (oscilaciones entre 0 y 10 Pa), antes de determinar los módulos de conservación G' y de disipación de energía G'' para los dextranos sintetizados por las preparaciones de DSR-S vardel A4N no purificadas (° y •; comportamiento de tipo de solución, G'< G''; al 5 % de deformación) y preparación purificada (□ y ■; comportamiento tipo gel G' > G''; 0,4 % de deformación).
La Figura 13 muestra un cromatograma HPAEC-PAD de productos sintetizados por el mutante DSR-S vardel A4N SEV663YDA con 100 g/l de sacarosa sola (A) o por reacción aceptora con 100 g/l de sacarosa y 50 g/l de glucosa (B). El símbolo G significa glucosa, F: fructosa, h: isomaltosa, I3: isomaltotriosa, N/M: nigerosa o maltosa (no separados por el sistema HPAEC-pad) y el símbolo "?" corresponde a productos con una estructura desconocida. La Figura 14 muestra el cromatograma HPSEC de dextranos sintetizados por DSR-S vardel A3 a 20 °C y 10 °C. Las flechas corresponden a los tiempos de retención de dextranos comerciales de 2 x 106 Da, 70.000 y 10.000 Da que sirvieron como referencias.
La Figura 15 muestra el cromatograma HPSEC de dextranos sintetizados a 20 °C con 100 g/l de sacarosa y con 1 U/ml de (1) DSR-S vardel A4N, (2) DSR-S vardel A3, (3) DSR-S vardel Core y (4) DSR-S Core AA y el perfil de elución (5) de un dextrano comercial de 10.000 Da (Sigma).
La Figura 16 muestra el perfil HPAEC-PAD de dextranos sintetizados a 20 °C con 100 g/l de sacarosa y con 1 U/ml de DSR-S vardel A4N (1), DSR-S vardel A3 (2), DSR-S vardel Core (3) y DSR-S vardel Core AA (4).
La Figura 17 muestra el perfil HPAEC-PAD (A) y la distribución (B) de los IMO producidos por una reacción aceptora a 20 °C con las variantes DSR-S vardel A4N (1), DSR-S vardel A3 (2), DSR-S vardel Core (3) y DSR-S vardel Core AA (4). G: glucosa; F: fructosa; L: leucrosa; T: trehalulosa; I2 a I20: isomalto-oligosacáridos con DP 2 a DP 20. El inserto de la Figura B corresponde a un alargamiento de los IMO de DP de 15 a 27.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La frase "enzima que tiene actividad enzimática de dextransacarasa" como se usa en el presente documento significa una enzima que cataliza la conversión de sacarosa en oligósidos y poliósidos que comprenden más del 50 % de unidades de glucosilo unidas por enlaces a-1,6 con un tamaño en el intervalo de 342 y 109 Da, y más particularmente dextranos e isomalto-oligosacáridos que comprenden más del 95 % de enlaces a-1,6. Esta conversión puede tener
lugar en ausencia de aceptores externos tales como maltosa, glucosa, isomaltosa o fructosa o isomalto-oligosacáridos. Maltosa, isomaltosa y glucosa son los aceptadores preferidos descritos en el presente documento. La actividad enzimática de las dextransacarasas de la presente invención puede medirse como se describe en los Ejemplos.
Los términos "nucleótidos", "polinucleótidos", "ácidos nucleicos" y "oligonucleótidos", como se usan aquí son intercambiables e incluyen, sin estar limitados a los mismos, secuencias de ARN, ADN, ADN/ARN que comprenden más de un nucleótido en una sola cadena o en forma de una doble cadena. Las secuencias de polinucleótidos descritas en el presente documento pueden prepararse por cualquier método conocido incluyendo, sin estar limitados a los mismos, cualquier método de síntesis recombinante y cualquier método de generación ex vivo, así como combinaciones de esos métodos.
El término "truncado" como se usa en el presente documento significa que al menos uno de los extremos N- o C-terminales de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos se ha acortado. Ese acortamiento puede llevarse a cabo usando enzimas de restricción, enzimas proteolíticas o sintéticamente, incluyendo por amplificación específica de secuencias de nucleótidos, en particular por PCR.
La frase "dextransacarasa purificada" como se usa aquí significa una dextransacarasa que tiene una sola forma activa de dextransacarasa en las preparaciones, que tiene un grado de pureza proteica de al menos el 70 % o el 85 % o el 95 %.
La frase "propiedad de texturizado original interesante" como se usa aquí significa las propiedades reológicas de los dextranos de la invención que, en comparación con los dextranos sintetizados por enzimas nativas en las mismas condiciones, por ejemplo, exhiben un comportamiento no newtoniano, especialmente un comportamiento de tipo gel o fibroso. Un "polímero tipo gel" se caracteriza aquí por mediciones reológicas en modo dinámico, detectando los módulos de conservación de energía (G') y de disipación de energía (G''). Para un gel, G' es mayor que G'' en todo el intervalo de frecuencia estudiado, como será evidente en el Ejemplo 5. El carácter fibroso puede identificarse a simple vista. Los dextranos fibrosos de la invención cambian del comportamiento del tipo solución al comportamiento del tipo gel después de la aplicación de una segunda serie de esfuerzos de cizalla, como también se verá en el Ejemplo 5.
Las siguientes abreviaturas usadas aquí tienen los siguientes significados: DSR-S para dextransacarasa de L. mesenteroides NRRL B-512F; DP para el grado de polimerización; HMW para "masa molar alta", IMW para "masa molar intermedia", siendo los polímeros IMW polímeros altamente polidispersos con tamaños en el intervalo de 1.000 a 107 Da, donde la separación por HPSEC es difícil debido a su baja concentración. Los polímeros LMW (masa molar baja) son, de acuerdo con la invención, una población que es mucho más alta y fácil de detectar entre 750 y 70.000 Da, centrada alrededor de 10.000 Da o en el intervalo de 2.000 a 1,7 x 105 Da y se centró alrededor de 40.000 Da.
La frase "dextrano de 10.000 Da" como se usa aquí significa una población de dextrano con un tamaño en el intervalo de 1.300 a 52.000 Da, más precisamente entre 5.000 y 22.000 Da y centrado a la altura del pico en aproximadamente 10.000 Da. Durante la caracterización, la base del pico de elución obtenido por permeación de gel estaba en el intervalo de 1.300 a 52.000 Da, el intervalo de masa molar estimado a la altura media del pico de elución estuvo en el intervalo de 5.000 a 22.000 Da y el pico se centró a la altura del pico a aproximadamente una masa de 10.000 Da. Cuando la masa molar se expresó a la altura media del pico, al menos el 50 % de la población de dextrano cayó dentro del intervalo indicado.
La frase "dextrano de 40.000 Da" como se usa aquí significa una población de dextrano con un tamaño en el intervalo de 7000 a 1,7 x 105 Da, más precisamente entre 22.000 y 70.000 Da y centrado a la altura del pico en aproximadamente 40.000 Da. Durante la caracterización, la base del pico de elución obtenido por permeación de gel estaba en el intervalo de 7.000 a 1,7 x 105 Da, el intervalo de masa molar estimado en la altura media del pico de elución estaba en el intervalo de 22.000 a 70.000 Da y el pico estaba centrado en una masa de aproximadamente 40.000 Da. Cuando la masa molar se expresó a la altura media del pico, al menos el 50 % de la población de dextrano cayó dentro del intervalo indicado.
IMO significa isomalto-oligosacáridos.
La frase "que consiste esencialmente en" cuando se usa en conexión con ácidos nucleicos o aminoácidos como se usa aquí significa que otros ingredientes menores o moléculas pueden estar presentes con las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. La secuencia de ácido nucleico tiene exactamente la misma longitud que se indica en el número de identificación de secuencia, pero puede tener de 3 a 12 nucleótidos adicionales en los N- y C-terminales. Igualmente, la secuencia de aminoácidos que tiene la misma longitud exacta como se indica en el número de identificación de secuencia, pero pueden añadirse de 1 a 4 aminoácidos adicionales en los N- y C-terminales. Estos aminoácidos adicionales no tienen efecto sobre la actividad enzimática.
La divulgación describe ácidos nucleicos que codifican una dextransacarasa truncada o una dextransacarasa mutada, una secuencia complementaria a todas o parte de esas secuencias o una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con una de las secuencias anteriores con la condición de que se mantenga la actividad enzimática de dextransacarasa. Debe apreciarse que las secuencias de nucleótidos que se hibridan con ellas tienen el mismo número
de nucleótidos e hibridan en toda la longitud del fragmento.
La frase "condiciones de hibridación rigurosas" como se usa aquí significa condiciones descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning Manual, 3a edición (2001), es decir, como un ejemplo, las siguientes condiciones: tampones de hibridación: SSC 2 X, solución de Denhardts 10X (Ficoll 400 y PEG y BSA, relación 1:1:1), SDS al 0,1 %, EdTa 5 mM, Na2HPO450 mM, ADN de esperma de arenque 250 mg/ml, ARN-t 50 mg/ml o tampón fosfato sódico 0,25 M con un pH de 7,2, EDTA 1 mM, SDS al 7 %;
Temperatura de hibridación: 60 °C;
Tampón de lavado: SSC 2 X, SDS al 0,1 %;
Temperatura de lavado: 60 °C.
Las moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con los ácidos nucleicos descritos en el presente documento en principio pueden codificar dextransacarasas de cualquier microorganismo tales como bacterias, bacterias gram positivas y, bacterias de los géneros Leuconostoc, Streptococcus o Lactobacillus.
La divulgación describe ácidos nucleicos que codifican proteínas de dextransacarasa que tienen al menos el 70 % o el 80 % o el 90 % de identidad de secuencia con aquellos de las secuencias SEQ ID nO: 1 a SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO 17 a 21, siempre que la proteína codificada por dichas secuencias tenga actividad enzimática de dextransacarasa.
La divulgación describe secuencias de nucleótidos que codifican una proteína que consiste esencialmente en o que consiste en aminoácidos consecutivos de cualquiera de las SEQ ID NO: 6 a 10 o 22 a 26.
Como se describe en el presente documento, las secuencias complementarias a las secuencias descritas en el presente documento o secuencias que hibridan con dichas secuencias en condiciones rigurosas, con la condición de que se mantenga la actividad enzimática de dextransacarasa, también se describen en el presente documento.
Las derivaciones de las secuencias de nucleótidos básicas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5, donde las secuencias se seleccionan del fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 1 de la posición 373 a la posición 4269, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 2 desde la posición 373 a la posición 4005, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 3 desde la posición 373 a la posición 3408, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 4 desde la posición 373 a la posición 3018 y el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 5 de un nucleótido en la posición 373 a la posición 4269, las secuencias complementarias a dichas secuencias o secuencias que hibridan con dichas secuencias en condiciones rigurosas con la condición de que se mantenga la actividad enzimática de dextransacarasa, pueden producirse por deleción, sustitución, inserción o recombinación, por ejemplo; siendo los métodos para llevar a cabo dichas etapas y transformaciones bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, por Sambrook et al., citado anteriormente.
Debe entenderse aquí que si tiene lugar cualquier deleción, sustitución, inserción o recombinación de cualquiera de las secuencias citadas anteriormente, las proteínas codificadas por las secuencias deben mantener su actividad enzimática de dextransacarasa. Por lo tanto, 1 a 132, preferentemente de 2 a 60 nucleótidos, más preferentemente de 15 a 36 nucleótidos y aún más preferentemente de 12 a 27 nucleótidos pueden modificarse, por ejemplo, por deleción, sustitución, inserción o recombinación. Como se describe en el presente documento, el 90 %, preferentemente el 95 % de los nucleótidos permanecen sin cambios.
La actividad enzimática de dextransacarasa puede medirse, como se describe en la sección de métodos y en los Ejemplos de la presente solicitud.
Los oligonucleótidos que pueden usarse como sonda o cebador son, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 o las secuencias de nucleótidos seleccionadas del fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 1 de la posición 373 a la posición 4269, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 2 desde la posición 373 a la posición 4005, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 3 desde la posición 373 a la posición 3408, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 4 desde la posición 373 a la posición 3018 y el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 5 de un nucleótido en la posición 373 a la posición 4269.
La longitud de las sondas y cebadores puede variar dependiendo de sus aplicaciones. En general, deben tener al menos 25 nucleótidos y pueden comprender todas las secuencias de dextransacarasa descritas, tales como 3.896 nucleótidos. La longitud también puede variar para estar en el intervalo de 25 a 150 nucleótidos, 25 y 800 nucleótidos o 25 y 3000 nucleótidos, por ejemplo.
Los cebadores generalmente comprenden de 18 a 25 nucleótidos de longitud, pero también pueden ser más largos, dependiendo de la aplicación prevista. Algunos ejemplos de cebadores que pueden usarse son:
GGC TTC TCT GGT GTG ATT (SEQ ID NO:11)
GAT CTG TCA GAA ACT GGC (SEQ ID NO:12)
ACA CAA CAA GTT AGC GGC (SEQ ID NO: 13)
CCA GAT ACT AAC TTG AGT (SEQ ID NO: 14)
TTC ATT GAT GCA GAC GGG (SEQ ID NO:15)
CAC GAC TAC GAC GCG CAA (SEQ ID NO:16)
Nótese que los cebadores en las posiciones terminales 5' y 3' de los nucleótidos codifican la dextransacarasa (SEQ ID NO: 11 a 15) y el lado 5' y 3' de la secuencia mutante (SEQ ID NO: 16). Sin embargo, una persona experta puede usar cada una de estas secuencias para producir cebadores o sondas usando nucleótidos consecutivos. Adicionalmente, estas secuencias de nucleótidos que se usan como sonda pueden etiquetarse con radiactividad, etiquetado enzimático, etiquetado fluorescente, en particular.
Para diseñar genéticamente la célula procariota o eucariota, los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una porción de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden introducirse en plásmidos que permiten la mutagénesis o modificación de secuencias mediante recombinación de secuencias de nucleótidos. Los métodos convencionales que usan estas técnicas son conocidos por los expertos y se han descrito por Sambrook et al., mencionado anteriormente, en particular. Los fragmentos de ADN también pueden conectarse entre sí mediante adaptadores o enlazadores y pueden usarse enzimas de restricción adecuadas para retirar ciertas secuencias de ADN. Métodos tales como la mutagénesis, la restricción después de la restauración de cebadores o ligaduras puede usarse para obtener la secuencia deseada con las inserciones deleciones o sustituciones apropiadas o necesarias o deseables.
Adicionalmente, pueden fijarse etiquetas bien definidas que codifican ácidos nucleicos a los extremos N- o C-terminales de las secuencias de ácido nucleico. Pueden ser péptidos tales como poli-His, epítopo c-myc o etiqueta HA o proteínas pequeñas tales como GST bacteriana, MBP (proteína de unión a maltosa), tiorredoxina, p-galactosidasa, vSV-glucoproteína y similares.
Los ácidos nucleicos particulares que codifican otras etiquetas de proteínas son etiqueta His, etiqueta T7, etiqueta S, un péptido "bandera", trpE, avidina/estreptavidina, proteína estafilocócica A o G, dihidrofolato reductasa, dominios de unión a celulosa, policisteína, polifenilalanina y similares, que también pueden usarse.
Un ácido nucleico que codifica una tiorredoxina puede fusionarse con la secuencia de ácido nucleico N-terminal. Un ácido nucleico que codifica una etiqueta 6xHis se fusiona al extremo 3' de las secuencias de ácido nucleico.
Los ácidos nucleicos pueden enlazarse a una unidad de transcripción que comprende (1) elementos de regulación de la expresión génica tales como promotores y amplificadores y (2) una secuencia codificante o estructural que se transcribe en un ARNm y se traduce en la proteína correspondiente y (3) señales de iniciación y terminación apropiadas.
Se conocen varias secuencias de control de expresión adecuadas en la técnica. Los métodos generales para expresar la proteína recombinante también son conocidos y se ejemplifican en el documento por R Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) [17].
Las regiones promotoras que pueden usarse en los vectores descritos en el presente documento incluyen lacL, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, tre y ara.
La divulgación también describe vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores que son conocidos en el campo de la ingeniería genética y que comprenden las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento, siendo dichos vectores plásmidos y seleccionados de DSR-S vardel A4N, DSR-S vardel A3, DSR-S vardel Core, DSR-S Core AA y DSR-S vardel A4N SEV663YDA.
Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden expresarse en células procariotas o eucariotas. Los ejemplos no limitantes de tales células que pueden citarse son células VERO, células HELA tales como ATCC N.° CCL3, líneas celulares CHO tales como AtCC CCL61, células COS tales como COS-7 y células ATCC N.° CR: 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3 tales como ATCC N.° CRL6361, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 tales como ATCC N.° CRL 1711, células Cv1 tales como ATCC N.° CCL70 y células JRKAT tales como ATCC Tib152.
Las células no limitantes que pueden usarse en el presente documento incluyen cepas de las células hospedadoras procariotas tales como Eschierichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium o cepas del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus o cepas de células hospedadoras eucariotas tales como los parásitos Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia), Leishmania o Trypanosoma.
Pueden usarse otras células apropiadas en el presente documento y en particular incluyen células de levadura tales como Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o pombe, Pichia pastoris y células eucariotas (células vegetales, células CHO y similares).
Las células usadas para expresar los ácidos nucleicos descritos en el presente documento son Escherichia coli y cepas seleccionadas, por ejemplo, de JM109, BL21 (DE3)pLysS, TOP10 o Pir1. La cepa INVsc de Saccharomyces cerevisiae también puede usarse.
La divulgación describe células hospedadoras transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente o con un vector como se describe anteriormente y células derivadas de células transformadas y que contienen el vector o las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento.
Algunos ejemplos de tales células hospedadoras que pueden citarse son Escherichia coli, en donde puede producirse la dextransacarasa truncada y/o mutada. La preparación de tales células hospedadoras se conoce en la técnica.
Las proteínas y los fragmentos biológicamente activos de dichas proteínas, así como las proteínas mutadas que están codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento y sus métodos de preparación también se describen en el presente documento.
Por lo tanto, la divulgación también describe un método para preparar dextransacarasa mutada y/o truncada, que comprende las siguientes etapas:
(a) cultivar células hospedadoras transformadas con las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente o con un vector como se describe anteriormente en condiciones que permitan la expresión de una dextransacarasa; y
(b) aislar dicha dextransacarasa del medio de cultivo.
Más específicamente, las secuencias de ácido nucleico pueden seleccionarse de SEQ ID NO: 1 de la posición 373 a la posición 4269, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 2 desde la posición 373 a la posición 4005, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 3 desde la posición 373 a la posición 3408, el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 4 desde el precursor 373 a la posición 3018 y el fragmento de la secuencia SEQ ID NO: 5 desde la posición 373 a la posición 4269, secuencias complementarias de dichas secuencias y secuencias que hibridan con dichas secuencias en condiciones rigurosas, con la condición de que se mantenga la actividad enzimática de dextransacarasa.
Después de aislarse, las dextransacarasas de la presente invención también pueden purificarse. Con respecto a esto, pueden usarse los métodos de purificación habituales tales como precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio hidrófobo, filtración en gel, HPLC en fase inversa, desmezcla de fase y similares. Las dextransacarasas mutadas o truncadas de la presente invención pueden purificarse usando una resina cargada con níquel, teniendo en cuenta la existencia de la tiorredoxina y la etiqueta 6xHis.
La divulgación también describe proteínas de dextransacarasa que consisten esencialmente en o consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 a 10 o una secuencia de aminoácidos seleccionada del fragmento de SEQ ID NO: 6 del aminoácido en la posición 125 al amino ácido en la posición 1423, el fragmento de SEQ ID NO: 7 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1335, el fragmento de SEQ ID NO: 8 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1136, el fragmento de SEQ ID NO: 9 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1006 y el fragmento de SEQ ID NO: 10 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423.
Una proteína codificada por una de las secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5 o fragmentos de dichas secuencias, como se ha expuesto anteriormente, se describe en el presente documento.
Las secuencias de aminoácidos homólogas, es decir, en donde el grado de similitud con las secuencias definidas anteriormente es suficiente para mantener la actividad enzimática, también se describen en el presente documento. Por lo tanto, los programas Blast y Fasta pueden usarse para investigar similitudes. Ya que se demostró en el presente documento que era posible truncar los extremos N- y C-terminales de las dextransacarasas, manteniendo la actividad enzimática, la similitud de secuencia no puede considerarse solo para la secuencia completa única, sino también para las secuencias truncadas. La divulgación describe de esa manera cualquier secuencia que contenga el 80 %, el 90 % o el 98 % de similitud de secuencia con la secuencia completa, pero también las que tendrían el 80 %, el 90 % o el 98 % de similitud de secuencia con una de las secuencias truncadas, con la condición de que se mantenga la actividad enzimática.
Más específicamente, la presente invención se refiere a secuencias que tienen el 90 %, el 95 % o el 98 % de similitud con las secuencias de aminoácidos seleccionadas del fragmento de SEQ ID NO: 6 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423, SEQ ID NO: 7 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1335, SEQ ID NO: 8 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1136, SEQ ID NO: 9 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1006 y SEQ ID NO: 10 del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423, siempre que estas proteínas tengan la actividad enzimática de dichas dextransacarasas. Claramente, las secuencias de aminoácidos con una identidad específica definida anteriormente tienen una mayoría de sustituciones conservativas de aminoácidos.
Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen sustituciones de aminoácidos de la misma clase. Estas clases comprenden, por ejemplo, aminoácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga, tales como Asn, Gln, Ser, Thr o Tyr; aminoácidos que contienen cadenas laterales básicas, tales como His, Lys o Arg; aminoácidos que
contienen cadenas laterales ácidas, tales como Glu o Asp y aminoácidos que contienen cadenas laterales no polares, tales como Ala, Gly, Leu, Val, Ile, Phe, Cys o Trp.
Adicionalmente, sobre la actividad enzimática de la dextransacarasa con sustituciones de aminoácidos, esto puede probarse como se establece en los Ejemplos, pero la actividad también puede evaluarse mediante análisis de HPLC o usando las predicciones habituales sobre la forma en que los cambios de aminoácidos afectan a las funciones de las proteínas.
En un aspecto adicional, ya que las secuencias de aminoácidos se indican aquí, la proteína puede sintetizarse usando el método de R B Merrifield, 1963 [20], Por este motivo, las proteínas dextransacarasa sintetizadas constituyen otro aspecto descrito en el presente documento.
Las dextransacarasas mutantes pueden ser SEV663YDA mutante de DSR-S vardel A4N en donde la serina, el ácido glutámico y la valina en las posiciones 663, 664 y 665 se han modificado a tirosina, ácido aspártico y alanina respectivamente.
Este mutante puede usarse para sintetizar isomaltosa a partir de sacarosa, usando sacarosa como único sustrato con un rendimiento que es equivalente al obtenido cuando un aceptor, tales como glucosa, se añade al medio de reacción.
La divulgación describe un método para producir isomaltosa directamente a partir de sacarosa, comprendiendo dicho método hacer reaccionar dextransacarasa mutante con SEQ ID NO: 10 con sacarosa y producir isomaltosa.
Las proteínas de fusión que contienen una etiqueta de proteína como se describe anteriormente también forman parte de la presente invención. A este respecto, las proteínas mutadas y/o truncadas de la presente invención pueden fusionarse con al menos una etiqueta de proteína.
De esta manera la presente invención también se refiere a una proteína de fusión que comprende en la posición N-terminal y/o C- terminal, una etiqueta de proteína seleccionada del grupo de una etiqueta poli-His, una etiqueta de epítopo c-myc, una etiqueta HA, una etiqueta T7, una etiqueta S, una etiqueta trpE, una etiqueta de avidina/estreptavadina, una etiqueta de estafilococo A, una etiqueta de proteína G, una etiqueta de dihidrofolato reductasa, etiquetas de dominio de unión a celulosa, una etiqueta de policisteína, una etiqueta de fenilalanina, una etiqueta bacteriana GST, una etiqueta de proteína de unión a maltosa, una etiqueta de tiorredoxina, una etiqueta de beta-galactosidasa y una etiqueta de proteína VSV fusionada a la dextransacarasa de acuerdo con la invención, en donde la proteína de fusión conserva su especificidad para sintetizar enlaces alfa-1,6.
La preparación de dextranos de alta masa molar (aproximadamente 106 - 108 Da) y con propiedades reológicas modificadas en comparación con dextrano sintetizado por DSR-S nativo de L. mesenteroides n Rr L B-512F que usa la dextransacarasa truncada de la presente invención es otro aspecto de la invención.
Más específicamente, los microorganismos que secretan dextransacarasa o extractos celulares de microorganismos que producen dextransacarasa de manera intracelular pueden cultivarse o usarse en un medio que comprende sacarosa, dando como resultado la síntesis de isomaltosa (342 Da), (ii) isomalto-oligosacáridos de 342 a 5.000 Da, (iii) dextranos con un tamaño controlado de 1.300 a 5.200 Da centrados alrededor de 10.000 Da, (iv) dextranos con un tamaño controlado de 7.000 a 1,7 x 105 Da centrado alrededor de 40.000 Da y (v) dextranos con una alta masa molar de 2 x 106 Da a 109 Da. Estos compuestos pueden aislarse del medio de cultivo mediante métodos convencionales tales como ultrafiltración, nanofiltración, precipitación alcohólica, cromatografía líquida y similares.
Alternativamente, las dextransacarasas truncadas y/o mutadas descritas en la presente invención pueden purificarse y usarse en un método para producir dextranos con una masa molar controlada.
Por lo tanto, la divulgación describe un método para producir dextranos y/o isomalto-oligosacáridos con una masa molar controlada, que comprende hacer reaccionar una dextransacarasa mutada y/o truncada que consiste esencialmente en o que consiste en una secuencia seleccionada de secuencias de nucleótidos SEQ ID NO: 6 a SEQ ID NO: 10 definida anteriormente con al menos sacarosa y opcionalmente un aceptor.
La divulgación también describe un método para producir isomaltosa, comprendiendo el método hacer reaccionar una dextransacarasa mutada y/o truncada con la secuencia SEQ ID NO: 10 esencialmente con sacarosa. La divulgación también se refiere a un método para producir dextranos con propiedades de textura interesantes, comprendiendo el método hacer reaccionar una dextransacarasa mutada y/o truncada con la secuencia de SEQ ID NO: 6.
La divulgación también describe dextranos e isomalto-oligosacáridos que tienen las características definidas en el presente documento que pueden obtenerse mediante los métodos descritos en el presente documento. Estas propiedades características incluyen el hecho de que los dextranos de alta masa molar tienen un comportamiento no newtoniano y tienen el carácter de un gel o una naturaleza fibrosa, y la propiedad de cambiar de forma un comportamiento de tipo solución al de un gel después de la aplicación de una segunda serie de esfuerzos de cizalla.
Como se hará evidente en los Ejemplos, ventajosamente, pueden obtenerse las diferentes propiedades reológicas dependiendo de si la enzima está purificada o no.
Los dextranos producidos enzimáticamente pueden usarse como un soporte en la industria farmacéutica, como un sustituto de plasma, aditivos en textiles o pinturas, en cosmética y en la industria agroalimentaria, así como un agente texturizante, por ejemplo como un sustituto de la goma arábiga o un agente gelificante. La divulgación también describe composiciones que comprenden los dextranos y los IMO descritos en el presente documento.
Una aplicación importante de los dextranos e isomalto-oligosacáridos descritos en el presente documento es su uso como prebióticos. Estos productos no se metabolizan por completo y se fermentan selectivamente en el colon por especies bacterianas apropiadas tales como Bifidobacteria y Lactobacilli.
Los oligosacáridos se han usado tradicionalmente para alimentos humanos o animales, en las industrias farmacéuticas y en la industria cosmética o como edulcorante, estabilizante o carga [21]. Durante los últimos quince años, se ha desarrollado un nuevo campo de actividad para las propiedades prebióticas de determinadas moléculas no digeribles [23]. Los oligosacáridos como prebióticos son interesantes con respecto a su capacidad para resistir el ataque por las enzimas digestivas y para acentuar el crecimiento de bacterias "sanas", principalmente Bifidobacteria y Lactobacilli, en el intestino. Este concepto ha sido estimulado por la aparición de productos prebióticos comerciales que han ganado popularidad rápidamente. Los oligómeros tales como fructo-oligosacáridos, lactulosa, galacto-oligosacáridos, xilooligosacáridos, oligosacáridos extraídos de soja o isomalto-oligosacáridos que habitualmente se obtienen por procesos biológicos o por extracción de plantas, también son prometedores. En la actualidad, la investigación en este campo se ha centrado en la producción de estructuras novedosas de oligosacáridos denominadas prebióticos de segunda generación que deberían tener nuevas propiedades fisicoquímicas y actividades biológicas más específicas [18].
La divulgación describe una composición que comprende un dextrano obtenido de una dextransacarasa descrita en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable o un vehículo de calidad alimentaria.
El vehículo aceptable puede, por ejemplo, seleccionarse de adyuvantes, sales y similares y los adyuvantes pueden seleccionarse de péptidos de muramilo, alumbre, montanida y similares. Las dextransacarasas mutadas y/o truncadas pueden ser una proteína purificada, una proteína producida de manera recombinante o una proteína producida sintéticamente.
Con respecto al método para producir los dextranos y/o los IMO descritos en el presente documento, los aceptores preferidos, cuando se usan, son glucosa, isomaltosa, maltosa e isomalto-oligosacáridos.
Preferentemente, como se describe en el presente documento, el método para producir isomalto-oligosacáridos con una masa molar controlada comprende hacer reaccionar una dextransacarasa mutada y/o truncada que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 7, 8, 9 o 10 esencialmente con sacarosa. El grado de polimerización puede variar de 2 a 60 unidades de glucosilo (DP2 a DP60).
La reacción de producción puede tener lugar a temperaturas en el intervalo de 4 °C a 80 °C, preferentemente de 4 °C a 40 °C.
Preferentemente, cuando la secuencia es SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, la temperatura puede estar en el intervalo de 4 °C a 15 °C, preferentemente 8 °C a 12 °C y más preferentemente la temperatura puede ser del orden de 10 °C para la producción de dextranos con un tamaño controlado. Además, para tales secuencias, la temperatura puede estar preferentemente en el intervalo de aproximadamente 8 °C a 25 °C, más preferentemente del orden de 20 °C para la síntesis de IMO.
Adicionalmente, de forma preferente cuando la secuencia es SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 10, la temperatura puede estar en el intervalo de 15 °C a 45 °C, preferentemente de 17 °C a 30 °C y más preferentemente del orden de 20 °C a 25 °C.
Además, la concentración de sacarosa puede estar en el intervalo de 10 a 600 g/l, preferentemente de 75 a 400 g/l y más preferentemente de 90 a 280 g/l.
Cuando la secuencia es SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, la concentración de sacarosa en el medio puede ser preferentemente del orden de 250 g/l.
Además, cuando la secuencia es SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 10, la concentración de sacarosa puede ser del orden de 100 g/l.
Además, según sea apropiado, la relación en peso de sacarosa/aceptor puede ser del orden de 0,5 a 12, preferentemente de 1 a 4, más preferentemente aproximadamente 2.
En el método descrito en el presente documento, la dextransacarasa está en forma libre o inmovilizada sobre un
soporte. Dicha inmovilización puede efectuarse por adsorción, inclusión o unión covalente, por ejemplo.
Finalmente, para llevar a cabo el método descrito en el presente documento, el pH está en el intervalo de 3,0 a 10,0, preferentemente de 4,0 a 7,0, más preferentemente de 4,5 a 6,0 y aún más preferentemente de aproximadamente 5,2.
Otros aspectos de la invención pueden hacerse evidentes a partir de un estudio de los Ejemplos a continuación.
Ejemplo 1: Construcción de variantes
El vector de Riofusión pBad/TOPO (lnvitrogen) se usó para clonar y expresar genes dsrS truncados y/o mutados bajo el control del promotor de L-arabinosa. Permite la fusión del gen con la etiqueta 6xHis en el extremo C-terminal y con una etiqueta de tiorredoxina en el extremo N-terminal.
Para su uso como una matriz, se extrajo ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-512F usando el kit "Blood and Cell culture DNA maxi" (Qiagen). La cepa deriva de la colección NCAUR, Peoria, IL, EE.UU.
Se usaron células One Shot TOP10 (lnvitrogen) para la expresión de los genes dsrS truncados y/o mutados. Las enzimas de restricción se compraron de New England Biolabs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se purificó usando los kits "QIAquick" (purificación por PCR y extracción en gel) y "QIAprep" (purificación de plásmidos) de Qiagen.
Las variantes se construyeron mediante amplificación por PCR del gen DSR-S a partir de ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-512F usando la polimerasa "Expand High fidelity" (Roche) y los siguientes cebadores (dados en la dirección 5'^- 3'):
1 DSR-S vardel A4N se construyó usando los cebadores pBad y DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 y PBadA4N: 4350-actcaagttagtatctggatccacaatgatagc-4317. Contenía los aminoácidos T152 a S1450 de DSR-S.
2 DSR-S vardel A3 se construyó usando los cebadores PBad y DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 y PBad A3: 4086-cccgtctgcatcaatgaattcacc-4062. Contenía los aminoácidos T152 a G1362 de DSR-S.
3 DSR-S vardel Core se construyó usando los cebadores PBad y DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 y PBad Core: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Contenía los aminoácidos T152 a G1162 de DSR-S.
4 DSR-S Core AA se construyó usado los cebadores PBad DSR-S cat: 843-ggcttctctggtgtgattgatggtcaa-870 y PBad Core: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Contiene los aminoácidos G282 a G1162 de DSR-S.
5 El mutante DSR-S vardel A4N SEV663YDA se construyó mediante mutagénesis dirigida usando la técnica de "mega cebador" [33, 21] y la ADN polimerasa Pfu (Strategene). Se llevó a cabo una primera reacción de PCR usando la matriz de plásmido DSR-S vardel A4N y el par de cebadores SEV663YDA: 1965-agctttgtacgagctcacgactacgacgcgcaaacggtt-2004 e inv: 3447-gtcaccatcctcagtgttcgaaacg-3422, que comprende el sitio de restricción SsfBI (subrayado). Este producto de PCR se usó después como un mega cebador inverso en una segunda PCR con el cebador dir: 1329-caaccacagtggaatgaaactagtc1354 que comprende el sitio de restricción Spel. Este segundo producto de PCR se digirió después con las dos enzimas de restricción Spel y SsfBI de acuerdo con las condiciones del fabricante (New England Biolabs) y se clonó en el vector pBad DSR-S vardel A4N previamente digerido con las mismas enzimas. El cebador SEV663YDA fue diseñado para introducir un único sitio de restricción para seleccionar clones positivos (en este caso, el sitio Sacl).
La estructura primaria de cada una de las variantes DSR-S vardel A4N, DSR-S vardel A3, DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA se muestran esquemáticamente en la Figura 6.
Ejemplo 2: Producción de variantes en E. coli
Los cultivos se llevaron a cabo en un matraz Erlenmeyer impedido en medio 2X YT tamponado a un pH de 6,4 con 100 mN de Tris-HCI, sabiéndose que DSR-S es inestable en condiciones de pH alcalino [3].
Composición del medio 2XYT:
Bactotriptona 16 g/l
Extracto de
levadura 10 g/l
NaCI 5 g/l
Tris 12,1 g/l
Las células de E. coli TOP10 que llevaban los plásmidos pBad DSR-S vardel A4N y pBad DSR-S vardel A4N SEV663YDA se cultivaron a 23 °C. La inducción de L arabinosa se llevó a cabo cuando el crecimiento celular alcanzó
una DO600 nm de 0,2 con un 0,002 % (p/v) de inductor. El cultivo se detuvo cuando el crecimiento celular alcanzó una meseta (DO600 nm de aproximadamente 3-3,5) antes de comenzar la fase de lisis celular.
Las células de E. coli TOP10 que llevaban los plásmidos pBad DSR-S vardel A3, pBad DSR-S vardel Core y pBad DSR-S Core AA se llevaron a 16 °C. La inducción se llevó a cabo cuando el crecimiento celular alcanzó una DO600 nm de 0,2 con un 0,005 % (p/v) de L arabinosa en el caso de DSR-S vardel A3 y un 0,02 % (p/v) en el caso de DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA. El cultivo se detuvo cuando el crecimiento celular alcanzó una meseta (DO600 nm de aproximadamente 2,5) antes de comenzar la fase de lisis celular.
Después del cultivo, las células se recuperaron por centrifugación (8.000 x g, 10 minutos, 4 °C), se resuspendieron y se concentraron a una DO600 nm de equivalente a 80 en un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 5,2, suplementado con 0,05 g/l de CaCb 1 mM y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF). La ruptura celular se realizó sometiendo a ultrasonidos. Las preparaciones se centrifugaron una vez más (20.000 x g, 30 min, 4 °C) para eliminar los restos celulares y recuperar solo el sobrenadante del sometimiento a ultrasonidos.
La actividad enzimática de los extractos se midió usando el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) de Sumner y Howell, 1935 [22], Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de un mmol de fructosa por minuto a una temperatura dada (4 °C a 40 °C dependiendo del caso, más precisamente 20 °C o 30 °C) y en un tampón acetato sódico (50 mM), pH 5,2, que contiene 0,05 g/l de CaCb y 100 g/l de sacarosa.
Ejemplo 3: Purificación de la variante DSR-S vardel A4N
Se produjeron diferentes formas enzimáticas de DSR-S vardel A4N durante el cultivo de E. coli TOP10: una forma completa muy importante y diferentes formas degradadas en el extremo C-terminal (Figura 7). El origen de estas degradaciones sigue sin estar claro. La producción en el Ejemplo 2 alcanzó aproximadamente 5500 U/l de cultivo en los sobrenadantes de sometimiento a ultrasonidos (actividad ensayada a 30 °C).
Para determinar el número de formas enzimáticas activas en los extractos, los geles de electroforesis se produjeron en condiciones nativas o desnaturalizantes. Después de re-naturalizar el gel, se incubó durante la noche a 25 °C en un tampón acetato sódico, 50 mM, pH 5,2 suplementado con 100 g/l de sacarosa. Las formas enzimáticas activas sintetizaron después el polímero en la región a la que migraron en el gel. Se usó un reactivo (reactivo de Schiff) que coloreó específicamente los polímeros sintetizados por dextransacarasas activas, después de la oxidación de las funciones primarias de alcohol del polímero ácido periódico y los geles se tiñeron con este reactivo. Este tipo de gel se denomina zimograma. En el caso de DSR-S vardel A4N, o su mutante SEV663YDA, solo las dos formas de masa molar superior se detectaron siendo activas (resultados no mostrados). Sin embargo, solo la forma completa tenía la etiqueta de tiorredoxina y la etiqueta 6xHis.
La presencia de la etiqueta 6xHis solo en la forma completa de DSR-S vardel A4N se explotó para purificar la enzima por cromatografía de afinidad en resina de níquel (Probond Ni-NTA, Invitrogen).
La purificación se llevó a cabo a 4 °C. Todos los tampones tenían concentraciones de acetato sódico 50 mM, 400 mM de NaCI, diferentes concentraciones de imidazol y se ajustaron a un pH de 7,5. La resina se equilibró con 8 volúmenes de tampón con una concentración de 40 mM de imidazol. La fijación se llevó a cabo durante 2 horas con 7 volúmenes de extracto enzimático suplementado con 20 mM de imidazol y se ajustó a un pH de 7,5. A continuación, la resina se lavó con 40 volúmenes de tampón imidazol 40 mM, 8 volúmenes a 60 mM y 4 volúmenes a 100 mM. Finalmente, las proteínas se eluyeron con 7 volúmenes de tampón con una concentración de 250 mM de imidazol.
Las fracciones que contenían las proteínas de fusión eluidas se mezclaron y se dializaron durante la noche a 4 °C contra un tampón que contenía una concentración de acetato sódico 50 mM, pH de 5,2 y 0,05 g/l de CaCb. La concentración de proteína se determinó por el método de microBradford (Biorad Laboratories) con BSA (albúmina de suero bovino) como patrón.
La pureza de la preparación al final del procedimiento se estimó en aproximadamente el 90 % (Figura 8). Las proteínas purificadas DSR-S vardel A4N tenían una tendencia muy fuerte a agregarse, provocando la formación de precipitados blancos y limitando los rendimientos obtenidos al final del procedimiento (Tabla 1). Sin embargo, La actividad específica de la preparación se estimó en 584 U/mg de proteína, que correspondía a la actividad específica mejor descrita de una dextransacarasa recombinante. A modo de comparación, la actividad específica de DSR-S nativa (expresado por L. mesenteroides NRRL B-512F) se estimó en aproximadamente 170 U/mg [24].
Tabla 1: Purificación de DSR-S vardel A4N por cromatografía de afinidad en resina de níquel
Ejemplo 4: Secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos
Las construcciones se secuenciaron y las secuencias correspondientes se muestran en las Figuras 1 a 5.
Ejemplo 5: Síntesis de dextrano por DSR-S vardel A4N, comparación con DSR-S de L. mesenteroides NRRL B-512F El dextrano se sintetizó a partir de DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F, DSR-S recombinante completa (sobrenadante de sometimiento a ultrasonidos) y DSR-S vardel A4N (sobrenadante de sometimiento a ultrasonidos y enzima purificada).
Condiciones de síntesis y análisis de productos formados
La DSR-S recombinante completa se construyó con el mismo principio que las variantes descritas en el Ejemplo 1, con cebadores que eran adecuados para la amplificación de todo el gen. Las células de E. coli TOP10 que llevaban el plásmido pBad DSR-S se cultivaron usando el protocolo descrito para DSR-S vardel A4N (Ejemplo 2). El sobrenadante contenía tres formas enzimáticas, incluyendo dos con una masa molar activa más alta.
La forma con el mayor tamaño contenía DSR-S en su totalidad; las otras dos formas se degradaron en su posición N-terminal (datos no mostrados).
La actividad de cada preparación enzimática se determinó a 30 °C.
Las síntesis de dextrano se llevaron a cabo a 25 °C comenzando con una solución de sacarosa 100 g/l, en un tampón acetato sódico 50 mM que contiene 0,05 g/l de CaCh y con 1 unidad por ml de enzima. El agotamiento progresivo de la sacarosa se controló mediante análisis HPAEC-PAD (véase a continuación) y la reacción se detuvo después de su consumo completo, calentando durante 5 min a 95 °C (desnaturalización completa de las dextransacarasas citadas). Los productos formados se analizaron por HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada) con respecto a los mono, di y oligosacáridos, y por HPSEC (cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento) con respecto a los polisacáridos.
El sistema HPAEC-PAD comprendía una columna Dionex "Carbopack PA100" de 4x250 mm. Se aplicó un gradiente de acetato sódico de 6 a 300 mM en 28 minutos en una solución de hidróxido sódico 150 mM a un caudal de 1 ml/min. La detección se realizó por amperometría usando un módulo Dionex ED40 con un electrodo de oro y un electrodo de referencia de pH de Ag/AgCI.
El sistema HPSEC estaba constituido por dos columnas Shodex OH-Pack SB-805 y SB-802.5 en serie, usando nitrato sódico 0,45 M etilenglicol al 1 % (v/v) como el disolvente, en una cantidad de 0,3 ml/min. Las columnas y precolumnas se mantuvieron a 70 °C y las muestras se filtraron en filtros de 0,45 mm (Sartorius) antes de la inyección. La detección fue del tipo refractométrico, acoplado a un detector de difusión de luz (Wyatt) para determinar la masa de los dextranos.
Las concentraciones en peso de glucosa, fructosa y leucrosa (isómero de la sacarosa) se determinaron mediante análisis HPAEC-PAD. Los porcentajes de restos glucosilo de la sacarosa incorporada en la glucosa libre y la leucrosa se calcularon usando la siguiente fórmula:
%Gglucosa = [glucosatf]/([sacarosat0]x(180/342))
y
%Gleucrosa = [leucrosat f]/[sacarosat0]
donde [glucosatf] y [leucrosatf] corresponden a las concentraciones finales de glucosa y leucrosa al final de la reacción y [sacarosatO] corresponde a la del sustrato inicial (g/l).
El porcentaje de restos glucosilo incorporados en el polímero HMW se determinó mediante análisis HPSEC usando la fórmula:
%Gdextrano = área superficialdextrano-tf/(área superficial sacarosa- t0/ (162/342)
en el cual el área superficialdextrano tf corresponde al área superficial del pico de dextrano, determinado usando el cromatograma HPSEC al final de la reacción y el área superficialsacarosa t0 corresponde a aquella del pico del sustrato inicial. Para una concentración dada, la superficie obtenida por refractometría es idéntica independientemente del azúcar.
La proporción de unidades de glucosilo incorporadas en los polímeros u oligosacáridos IMW para los cuales la concentración no pudo cuantificarse directamente por HPAEC-PAD o HPSEC se determinó usando la fórmula:
%G lMW = 100 - % de Gglucosa-tf - % de Gleucrosa-tf - % de Gdextrano-tf
Los perfiles de elución de los cuatro dextranos obtenidos por HPSEC se muestran en la Figura 9. Pueden distinguirse diferentes poblaciones: un primer pico eluyó a los 38 minutos, correspondiente al polímero de alta masa molar (HMW), y un segundo pico a los 75 minutos correspondiente a fructosa, glucosa, leucrosa (5-O-a-D glucosil fructosa) y otros oligosacáridos con un grado de polimerización (DP) de menos de 7, no separados por el sistema o en concentraciones muy bajas. Entre estos dos picos principales, como lo indican las perturbaciones de la línea base, los productos de tamaño intermedio (dextranos IMW) también estuvieron presentes. Estos compuestos, con tamaños muy variables, entre 1000 y 107 Da, estaban altamente polidispersados y en concentraciones muy bajas, lo que explica su baja intensidad en el cromatograma. Los análisis de HPAEC-PAD confirmaron su presencia, sin embargo (resultados no mostrados).
La cantidad relativa de unidades de glucosilo derivadas de sacarosa e incorporadas a los diferentes productos se enumeran a continuación en la Tabla 2. El rendimiento de síntesis para HMW dextrano representa aproximadamente el 60 % de las unidades de glucosilo para cada una de las preparaciones. La transferencia de unidades de glucosilo a agua (glucosa) o fructosa (leucrosa) representa menos del 8 %, mientras que la síntesis de dextranos de tamaño intermedio (IMW) representó del 25 % al 32 % de las unidades de glucosilo transferidas. Todas las formas recombinantes de DSR-S tienden a sintetizar más dextranos de tamaño intermedio. Los análisis de HPSEC también mostraron que la enzima nativa parecía sintetizar dos poblaciones diferentes de dextrano, a diferencia de uno solo para las enzimas recombinantes. La masa molar de HMW dextranos se determinó por difusión de luz y se estimó en más de 107 g/mol para todas las muestras (límite de exclusión de las columnas utilizadas).
Tabla 2: Porcentaje de unidades de glucosilo incorporadas en los diversos productos derivados de la síntesis de dextrano a 25 °C y 100 g/I de sacarosa, para las cuatro preparaciones de DSR-S citadas
Estructura de dextranos formados
La estructura del dextrano producido por DSR-S vardel A4N (purificada o no) se comparó con la de los dextranos sintetizados a partir de d SR-S recombinante completa y d SR-S nativa. Estas estructuras se determinaron por resonancia magnética nuclear (RMN1 H) usando un Brücker AC 300, a 85 °C y con una frecuencia de adquisición de 300,13 MHz. El tiempo de adquisición fue de 3 s, con 32 a 64 pases. Los dextranos se separaron inicialmente de la fructosa coproducida precipitando 3 veces con 1 volumen de etanol absoluto, se recuperaron por centrifugación, se lavaron con agua destilada y se secaron por congelación. Las muestras se disolvieron en D2O a una concentración de 6 mg/ml.
Los espectros de RMN se muestran en la Figura 10. Solo se detectaron enlaces a-1,6. El análisis de RMN de carbono
13 también se llevó a cabo en el dextrano sintetizado por DSR-S vardel A4N purificada. El espectro obtenido fue idéntico a aquellos publicados para el dextrano de L. mesenteroides NRRL B-512F y DSR-S completa [3].
Estos polímeros también se digirieron con endodextranasa de Chaetomium gracile llevado a cabo durante 16 h a 37 °C con 3 unidades enzimáticas por ml de medio de síntesis. Los productos de digestión fueron analizados por HPAEC-PAD (Figura 11). Los perfiles de digestión obtenidos fueron idénticos para los cuatro dextranos analizados, confirmando que todos tenían al menos 95 % de enlaces a-1,6.
Las supresiones realizadas en las posiciones N y C-terminal de la DSR-S para construir la variante DSR-S vardel A4N no tienen influencia significativa sobre la actividad inicial de DSR-S o sobre la porción de unidades de glucosilo derivadas de sacarosa incorporada en la síntesis del dextrano HMW, el tamaño o la estructura del polisacárido.
Comportamiento reológico de los dextranos formados
El comportamiento reológico de los cuatro dextranos se analizó utilizando un sistema de plano cónico (AR 1000, TA Instruments) provisto de un cono de 4 cm de diámetro en un ángulo de 3,59° y velocidades de cobertura de 0,01 a 100 s-1. Las mediciones se llevaron a cabo a 25 °C. Se realizaron experimentos dinámicos en el dominio lineal entre 0 y 10 Pa, con una deformación del 8 % para el dextrano sintetizado por DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F (control), el 3 % para aquel sintetizado por la DSR-S recombinante completa, el 5 % para aquel sintetizado por un extracto no purificado de DSR-S vardel A4N y el 0,4 % para aquel sintetizado por DSR-S vardel A4N purificada. El módulo de rigidez complejo está definido por la relación:
G*(w) = G'(w) iG" (w).
El módulo de conservación de energía G'(w) es más grande cuando la muestra es predominantemente elástica o altamente estructurada. El módulo de pérdida G'' (w) representa la energía disipada durante la deformación. Las muestras predominantemente viscosas tienen una alta G'' (w).
Estos análisis reológicos produjeron resultados completamente originales (Figura 12). Como se describe en la bibliografía, la DSR-S nativa sintetizó un dextrano con comportamiento newtoniano [25].
Los extractos de DSR-S recombinantes completos y los extractos de DSR-S vardel A4N no purificados produjeron soluciones viscosas con un comportamiento idéntico (viscosidad aproximadamente 10 veces mayor que la del dextrano producido por la enzima nativa). Cuando se observa a simple vista, también tuvieron un comportamiento fibroso bastante pronunciado. Además, después de la aplicación de nuevos esfuerzos de cizalla, el comportamiento de dichos polímeros cambió de un tipo de solución a un tipo de gel, que es una propiedad novedosa que se ha identificado para este tipo de biopolímero. El dextrano producido por la enzima nativa, por el contrario, no era fibroso y su comportamiento era completamente reversible después de la aplicación de una segunda serie de esfuerzos (Figura 12A).
La enzima purificada sintetizó directamente un polímero que tiene las propiedades de un gel altamente estructurado (Figura 12B, módulo G' mucho más alto que G''), conservando sus características a través de un intervalo de temperaturas de 10 °C a 70 °C (resultados no mostrados). Este comportamiento es completamente diferente del de la enzima nativa.
Solamente la preparación de DSR-S vardel A4N purificada contenía solo una dextransacarasa activa en el extracto. Se sabe que la DSR-S nativa es propensa a problemas de degradación proteolítica [26] y las técnicas de purificación desarrolladas no pudieron resolver ese problema [27, 28, 29]. La DSR-S recombinante completa usada en la prueba contenía al menos dos formas enzimáticas activas, como la preparación DSR-S vardel A4N antes de la purificación. Sin embargo, las formas degradadas de DSR-S nativa, DSR-S recombinante completa y DSR-S vardel A4N son completamente diferentes. Actualmente se supone que la cooperación entre estas diferentes formas enzimáticas activas presentes en el medio podría ser el origen de modificaciones en las cadenas de dextrano, provocando estas diferencias en el comportamiento.
Ejemplo 6: Síntesis de isomaltosa a partir de sacarosa
Se estudió la capacidad del mutante DSR-S vardel A4N SEV663YDA para sintetizar solo isomaltosa (IMO con DP 2) a partir de sacarosa en detrimento de los dextranos de alta masa molar.
El mutante se purificó por cromatografía de afinidad usando el procedimiento descrito para DSR-S vardel A4N dado en el Ejemplo 3.
La actividad se ensayó a 30 °C.
Con una actividad específica de solo 9 U/mg, las mutaciones SEV663YDA indujeron efectos graves sobre la actividad de DSR-S (pérdida del 98 % de la tasa de consumo inicial de sacarosa). Esa actividad específica, sin embargo, es
equivalente al de la amilosacarasa recombinante de N. polysaccharea [32], que se ha estudiado ampliamente por su posibilidad de aplicación.
Las caracterizaciones que se llevaron a cabo demuestran la factibilidad de producir isomaltosa por este mutante DSR-S, mientras que la enzima silvestre produce solo dextranos de alta masa molar. Las síntesis se llevaron a cabo a 25 °C en un tampón que contenía una concentración de 50 mM de acetato sódico a un pH de 5,2 y 0,05 g/l de CaCb, 1 U/ml de enzima purificada y usando 100 g/l de sacarosa como el único sustrato, o mediante reacción aceptora comenzando con 100 g/l de sacarosa y 50 g/l de glucosa. El agotamiento de sacarosa se monitorizó mediante análisis HPAEC-PAD (véase el Ejemplo 4 para las condiciones de análisis) y las reacciones se interrumpieron después de un consumo completo.
La producción de isomaltosa alcanzó de esta manera un rendimiento del 47 % usando sacarosa como el único sustrato (Tabla 3 y Figura 13), un rendimiento que fue equivalente al obtenido por la reacción del aceptor. Por lo tanto, no fue necesario añadir un aceptor exógeno. También se identificaron trazas de isomaltotriosa, maltosa o nigerosa (no separadas por el sistema) (Figura 13), así como la presencia de otros oligosacáridos con un DP de menos de 7 y de estructura desconocida.
Tabla 3: Síntesis de isomaltosa por mutante DSR-S vardel A4N SEV663YDA a partir de 100 g/l de sacarosa sola, o por reacción aceptora con 50 g/I de glucosa. Concentración de diferentes productos presentes al final de la reacción.
De esta manera en este Ejemplo, la producción de isomaltosa alcanzó un rendimiento del 47 %. En la actualidad, este es el primer método que involucra una sola enzima para sintetizar isomaltosa a partir de sacarosa; estando todos los estudios previos relacionados con la degradación del almidón por un cóctel de a-amilasas y glicosidasas [11], o con la acción conjunta de la dextransacarasa y la dextranasa [30]. Además, la sacarosa es un sustrato barato y ampliamente disponible y la fructosa liberada durante las síntesis constituye un co-producto cuyo valor puede explotarse por separado.
Ejemplo 7: Síntesis de dextrano por DSR-S vardel A3
Se produjeron diferentes formas enzimáticas de DSR-S vardel A3 durante el cultivo de E. coli TOP10. Sin embargo, la forma completa era ampliamente mayoritaria y los zimogramas producidos (véase el Ejemplo 3) mostraron que solo la forma completa era activa.
La temperatura de actividad óptima para esta variante fue de 20 °C. Así, los ensayos de actividad se llevaron a cabo a esta temperatura. La producción de DSR-S vardel A3 de acuerdo con el Ejemplo 2 alcanzó aproximadamente 320 U/l de cultivo.
Las síntesis de dextrano se llevaron a cabo a 20 °C en un tampón que contenía 50 mM de acetato sódico, pH de 5,2 y 0,05 g/l de CaCb, 100 g/l de sacarosa y 1 U/ml de extracto d Sr -S vardel A3 no purificada. El extracto DSR-S vardel A3 podría purificarse por cromatografía de afinidad en resina de níquel usando el protocolo descrito para DSR-S vardel A4N en el Ejemplo 3. Sin embargo, ya que el sobrenadante de sometimiento a ultrasonidos contenía solo una forma enzimática única de dextransacarasa y E. coli no produjo otra enzima que pudiera consumir la sacarosa, la purificación de la variante no constituyó un requisito previo para la caracterización rigurosa de sus propiedades. A modo de comparación, las síntesis de dextrano se llevaron a cabo en las mismas condiciones que con DSR-S vardel A4N (no purificada). La desaparición de la sacarosa se controló mediante análisis HPAEC-PAD y las reacciones se detuvieron (5 minutos, 95 °C) después del agotamiento total.
Los productos sintetizados se analizaron y cuantificaron por HPAEC-PAD y HPSEC usando las condiciones descritas en el Ejemplo 4. Para los análisis de HPSEC, el tamaño de los dextranos se estimó usando dextranos disponibles en el mercado con tamaños de 2 x 106, 503 x 103, 70.000, 10.000 Da, maltoheptaosa y glucosa (Sigma).
Como puede verse en la Figura 13, a 20 °C la variante DSR-S vardel A3 sintetizó dos poblaciones de polímeros; la
población principal de dextrano HMW con un tamaño de 2 x 106 Da, representando aproximadamente el 39 % de los restos glucosilo derivados de la sacarosa (Tabla 4) y una segunda población de 1.300 a 52.000 Da, centrado en el pico más alto a alrededor de 10.000 Da (aproximadamente el 25 % de restos glucosilo). Esta es la primera vez que se observa una segunda población de dextrano que es claramente visible en el cromatograma HPSEC para una variante de DSR-S.
Efecto de la temperatura sobre el perfil de los productos
Las síntesis de dextrano también se llevaron a cabo a una temperatura de 10 °C, todavía con un tampón que contiene 50 mM de acetato sódico, pH 5,2, 0,05 g/l de CaCb y 1 U/ml de enzima (actividad analizada a 20 °C). El agotamiento de la sacarosa se monitorizó mediante análisis HPAEC-PAD y las reacciones se detuvieron (5 min, 95 °C) después del consumo total de las mismas.
Como puede verse en la Figura 14, a 10 °C, la variante DSR-S vardel A3 sintetizó una población de dextrano que era muy diferente de la producida a 20 °C. El polímero principal (aproximadamente el 44 %) formado a esa temperatura tenía una masa molar en el intervalo de 7.000 y 1,7 x 105 Da se centró en el pico en alrededor de 40.000 Da.
Tabla 4: Porcentaje de unidades de glucosilo incorporadas en diferentes productos sintetizados por DSR-S vardelA4N y DSR-S vardel A3 a 10 °C y 20 °C a partir de 100 g/l de sacarosa
Efecto de la concentración de sacarosa
Se probaron cuatro concentraciones crecientes de sacarosa (100, 150, 200 y 250 g/l) para las síntesis de dextrano llevadas a cabo a 20 °C y 10 °C con DSR-S vardel A3 (1 U/ml). El consumo total de sacarosa se controló mediante análisis HPAEC-PAD y las síntesis se detuvieron después de su consumo total (menos de 48 h).
Para las dos temperaturas, el aumento inicial en la concentración de sustrato alentó la síntesis de dextranos de baja masa molar. A 20 °C, la síntesis de dextrano de 10.000 Da cambió de esta manera de un rendimiento del 25 % al 48 % al cambiar de 100 a 250 g/l de sacarosa inicial. A 10 °C y a partir de 250 g/l, la síntesis de dextrano HMW fue completamente abolida y la de dextrano con la población principal con una masa molar centrada alrededor de 40.000 Da alcanzó ventajosamente un rendimiento del 69 %.
Para todos los dextranos sintetizados por DSR-S vardel A3, a 10 °C y 20 °C y de 100 a 250 g/l de sacarosa, los perfiles de digestión con endodextranasa (véase el Ejemplo 5) llevados a cabo confirmaron que la especificidad de unión de DSR-S no cambió (mismos perfiles de oligosacáridos detectados por HPAEC-PAD que con DSR-S vardel A4N, es decir, al menos el 95 % de enlaces a-1,6).
Ejemplo 8: Síntesis de dextrano por DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA
Las variantes DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA también se degradaron ligeramente durante la expresión por E. coli TOP en las condiciones descritas en el Ejemplo 2. Sin embargo, como fue el caso de la variante DSR-S vardel A3, solo la forma completa, que estaba en la gran mayoría, fue activa de acuerdo con el zimograma (resultados no mostrados).
La temperatura de actividad óptima para estas variantes también fue de 20 °C. La producción alcanzó de esta manera 38 y 180 U/l de cultivo para DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA respectivamente.
Las síntesis de dextrano se llevaron a cabo a 20 °C y 10 °C usando 100 a 250 g/l de sacarosa en un tampón que contenía 50 mM de acetato sódico, pH 5,2, 0,05 g/l de CaCb y 1 U/ml de extracto enzimático (no purificado). El
consumo de sacarosa se monitorizó mediante análisis HPAEC-PAD y las síntesis se detuvieron (5 min, 95 °C) después del agotamiento completo (menos de 48 h). Los productos formados se analizaron por HPAEC-PAD y HPSEC y su concentración se cuantificó como se describe en el Ejemplo 5.
La Figura 15 muestra el perfil de los productos sintetizados a 20 °C por las dos variantes (cromatograma HPSEC). Puede verse claramente que con estas variantes, y en contraste con DSR-S vardel A4N y DSR-S vardel A3, la población principal de dextrano formado tenía una masa molar de cerca de 10.000 Da con la base del pico entre 1.300 y 52.000 (a media altura entre 5.000 y 22.000). Con la variante DSR-S Core AA, la síntesis de HMW dextrano fue completamente abolida (Tabla 5). Una reducción de la temperatura a 10 °C podría aumentar los rendimientos de dextrano con ~ 10.000 Da sin una diferencia de tamaño significativa, como fue el caso con DSR-S vardel A3 (Tabla 5). La síntesis de dextrano con la variante DSR-S Core AA alcanzó así un rendimiento del 75 %. Se obtuvo un rendimiento equivalente con la variante DSR-S vardel Core cuando la concentración inicial de sacarosa fue de 250 g/l (resultados no mostrados).
Tabla 5: Porcentaje de unidades de glucosilo incorporadas en diferentes productos sintetizados por DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA a 10 °C y 20 °C a partir de 100 g/l de sacarosa
El análisis HPAEC-PAD del dextrano sintetizado a partir de 100 g/l de sacarosa a 20 °C por las diferentes variantes mostró la muy alta polidispersibilidad del producto (Figura 16), que contiene isomalto-oligosacáridos con un DP de 2 a un DP de aproximadamente 60 para DSR-S Core AA en particular.
Para todos los dextranos sintetizados por DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA a 10 °C y 20 °C y usando de 100 a 250 g/l de sacarosa, los perfiles de digestión con endodextranasa (véase el Ejemplo 5) llevados a cabo confirmaron que la especificidad de unión de DSR-S no cambió (incluso los perfiles de oligosacáridos detectados por HPAEC-PAD en comparación con DSR-S vardel A4N, de esta manera al menos el 95 % de enlaces a-1,6).
Ejemplo 9: Reacción aceptora con glucosa
Las reacciones aceptoras se llevaron a cabo a 20 °C con una relación sacarosa/glucosa de 2 (100 g/l de sacarosa, 50 g/l de glucosa), 1 U/ml de extracto de DSR-S vardel A4N, DSR-S vardel A3, DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA en un tampón que contiene 50 mM de acetato sódico a un pH de 5,2 y 0,05 g/l de CaCb. El consumo total de sacarosa se controló mediante HPAEC-PAD y las reacciones se detuvieron después de que se hubo agotado por completo. Todas las variantes sintetizaron isomalto-oligosacáridos (IMO) con un DP de 2 a aproximadamente 30, en detrimento de la síntesis de polímero con un DP más alto.
Sin embargo, los rendimientos obtenidos fueron mayores para las variantes truncadas de las unidades A. De esta manera, la producción de IMO alcanzó el 52 % en el caso de DSR-S vardel A3 y el 58 % para DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA, a diferencia del 47 % en el caso de DSR-S vardel A4N. La distribución de oligosacáridos también se modificó (Figura 17).
Para DSR-S vardel A3, la proporción de IMO con un DP de 2 a un DP de 15 fue menor que la de los productos sintetizados por DSR-S vardel A4N. La situación se revirtió para las IMO con un DP de más de 15.
De forma similar, se demostró que los mutantes DSR-S vardel Core y DSR-S Core AA funcionan mejor para la síntesis de IMO con un DP alto que DSR-S vardel A4N o DSR-S nativo (DP esencialmente de 2 a 15): La producción de IMO con un DP de 12 a un DP de 27 fue de dos a cinco veces mayor con estas dos variantes (de acuerdo con la relación de las áreas superficiales obtenidas por HPAEC-PAD).
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Claims (6)
1. Una dextransacarasa que consiste en una secuencia que tiene el 90 %, el 95 % o el 98 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423 de SEQ ID NO: 6 y como se define en SEQ ID NO: 22, el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido 1335 de SEQ ID NO: 7 y como se define en SEQ ID NO: 23, el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1136 de SEQ ID NO: 8 y como se define en SEQ ID NO: 24, el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1006 de SEQ ID NO: 9 y como se define en la SEQ ID NO: 25, y el fragmento del aminoácido en la posición 125 al aminoácido en la posición 1423 de SEQ ID NO: 10 y como se define en SEQ ID NO: 26, en donde la actividad enzimática de los dextranos que se forman se mantiene y en donde la dextransacarasa conserva su especificidad para sintetizar enlaces alfa-1,6.
2. La dextransacarasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los dextranos formados tienen un tamaño controlado de 1.300 a 52.000 Da centrado alrededor de 10.000 Da o un tamaño controlado de 7.000 a 1,7 X 105 Da centrado alrededor de 40.000 Da.
3. La dextransacarasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde los dextranos formados tienen una masa molar alta de 106 a 108 Da y tiene propiedades reológicas modificadas.
4. La dextransacarasa de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las propiedades reológicas modificadas son aquellas que tienen la propiedad de cambiar de un comportamiento de tipo solución a un gel después de la aplicación de una segunda serie de tensiones de cizalla.
5. La dextransacarasa de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicha propiedad es el comportamiento no Newtoniano.
6. Una proteína de fusión que comprende en la posición N- terminal y/o C- terminal, una etiqueta de proteína seleccionada del grupo de una etiqueta poli-His, una etiqueta de epítopo c-myc, una etiqueta HA, una etiqueta T7, una etiqueta S, una etiqueta trpE, una etiqueta de avidina/estreptavadina, una etiqueta de estafilococo A, una etiqueta de proteína G, una etiqueta de dihidrofolato reductasa, etiquetas de dominio de unión a celulosa, una etiqueta de policisteína, una etiqueta de fenilalanina, una etiqueta bacteriana GST, una etiqueta de proteína de unión a maltosa, una etiqueta de tiorredoxina, una etiqueta de beta-galactosidasa y una etiqueta de proteína VSV fusionada a la dextransacarasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la proteína de fusión conserva su especificidad para sintetizar enlaces alfa-1,6.
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