BRPI0706981B1

BRPI0706981B1 - Sequência de nucleotídeos, vetor, dextrana sacarase truncada e/ou mutada, proteína de fusão, método de preparação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada, método de produção de dextranas e/ou isomalto-oligossacarídeos e uso de uma dextrana sacarase truncada e/ou mutada

Info

Publication number: BRPI0706981B1
Application number: BRPI0706981-2A
Authority: BR
Inventors: Pierre Monsan; Magali Remaud-Simeon; Gabrielle Potocki-Veronese; Claire Moulis
Original assignee: Institut National Des Sciences Appliquees De Toulouse (Fr); Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement; Centre National De La Recherche Scientifique
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2021-11-23
Also published as: US9399765B2; US20150344853A1; US8263380B2; ES2800724T3; MX2008010147A; US7897373B2; CA2947729A1; EP2365084A2; FR2897069A1; PT3103874T; CA2639150C; US20120289689A1; EP2365084B1; EP1981914A2; JP5753340B2; JP2009525745A; KR20090010024A; AU2007213436A1; FR2897069B1; US20160298091A1

Abstract

sequências de nucleotídeos, vetor, células hospedeiras transformadas por vetor, proteína codificada, dextrana sacarase truncada, proteína de fusão, método de preparação de dextrana sacarase, método de produção de dextranas e/ou isomalto-oligossacarídeos, dextrana, isomalto-oligossacarídeos, composição, composição farmacêutica ou alimentícia, composição de texturização, uso de dextrana sacarase, uso de dextrana e uso de dextrana ou imo a presente invenção refere-se a um processo recombinante de produção de dextrana sacarases truncadas e/ou mutadas, conservando ao mesmo tempo a sua atividade enzimática e/ou a sua especificidade na síntese das uniões alfa-1,6. mais precisamente, a presente invenção refere-se a seqüências de ácidos nucléicos de dextrana sacarases truncadas e/ou mutadas, vetores que contêm as mencionadas seqüências de ácidos nucléicos e células hospedeiras transformadas por seqüências que codificam dextrana sacarases truncadas e/ou que sofreram mutadas. em aspecto adicional, a presente invenção refere-se a método de produção, de forma recombinante, de dextrana sacarases truncadas e/ou que sofreram mutadas que conservam a sua atividade enzimática e/ou que conservam a sua especificidade na síntese de uniões alfa-1 ,6 e podem produzir, entretanto, a partir de sacarose, dextranas com alta massa molar e com propriedades reológicas modificadas, em comparação com as propriedades de dextrana obtida com a enzima nativa nas mesmas condições e isomalto-oligossacarídeos com massa molar controlada e dextranas. as dextranas e imo de acordo com a presente invenção podem ser utilizados, nomeadamente, como agentes de texturização ou como prebióticos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a processo recombinante de produção de dextrana sacarases truncadas e/ou mutadas, conservando ao mesmo tempo a sua atividade enzimática e/ou conservando a sua especificidade para a síntese de ligações α-1,6. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a sequências de ácidos nucleicos de dextrana sacarases truncadas ou mutadas, vetores que contêm as mencionadas sequências de ácidos nucleicos e células hospedeiras transformadas por sequências que codificam dextrana sacarases truncadas ou mutadas. Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se a método de produção, de forma recombinante, de dextrana sacarases truncadas e/ou mutadas que conservam a sua atividade enzimática e/ou conservam a sua especificidade para a síntese de ligações α- 1,6 no produto final e métodos de produção de dextranas ou isomalto- oligossacarídeos, em uma única etapa, com massa molar controlada e dextranas com propriedades reológicas modificadas, especialmente em comparação com as propriedades de dextranas obtidas com a enzima nativa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Dextranas são α-D-glucanos com várias estruturas, que compreendem unidades de glicosila, das quais mais de 50% contêm ligações α-1,6 na cadeia principal e ramificações α-1,2, α-1,3 e/ou α-1,4 [1]. As enzimas que produzem esses dextranas a partir de sacarose são denominadas dextrana sacarases e pertencem à família de glicosídeo hidrolases 70 [2]. Durante a reação, frutose derivada da sacarose é liberada e pode ser aprimorada em outro local. Dextrana sacarases são produzidas por bactérias lácticas dos gêneros Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus [1].

[003] Dextrana sacarase (DSR-S) de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F contém 1527 aminoácidos [3]. Esta enzima catalisa a síntese de homopolímeros de glicose com mais de 95% de ligações α-1,6. A produção de dextrana pode ser novamente direcionada para a de oligossacarídeos ou conjugados glicosilados por meio da adição de aceitador apropriado à mistura de reação [4].

[004] O número de aplicações industriais para dextranas e derivados de dextranas está aumentando, particularmente para dextranas com tamanho específico. Dextranas com tamanho na faixa de 70.000 a 100.000 Da são utilizadas, por exemplo, como substituto de plasma [5, 31]. Além disso, dextrana de 40.000 Da é utilizada para aumentar o fluxo sanguíneo, mais provavelmente por meio da redução da viscosidade do sangue e inibição da agregação de eritrocitários [6,8]. Após a sulfatação, dextranas menores com cerca de 10.000 daltons, por exemplo, são utilizadas como transportadores para ferro [7] ou anticoagulantes [8]. Estes compostos podem possuir propriedades antivirais [9, 10].

[005] Além disso, derivados de dextrana reticulados são utilizados há muito tempo no campo de separação molecular; suportes cromatográficos com o nome comercial Sephadex® vêm sendo vendidos desde 1961 [6].

[006] Adicionalmente, a União Européia aprovou recentemente o uso de dextrana como ingrediente alimentício em produtos de confeitaria quando contiverem mais de 95% de ligações α-1,6 e possuírem massa molar de mais de 2 x 106Da [15].

[007] Dextrana sacarase pode também produzir isomalto- oligossacarídeos (IMO) por meio de reação de aceitação. Reações de aceitação conduzidas por glucana sacarases consistem de transferência de resíduos de glucosila de sacarose para outras moléculas adicionadas ao meio de reação. É de interesse comercial crescente, particularmente no Japão, onde a demanda por isomalto-oligossacarídeos representa cerca de quinze mil toneladas por ano [11]. Esses IMOs pequenos (DP 2 a 6) são utilizados em produtos de confeitaria, para bebidas, em saquê, temperos, confeitaria e adoçantes anticariogênicos. Também se demonstrou que os mencionados IMOs possuem propriedades prebióticas que são úteis com relação à flora intestinal e/ou vaginal [12, 13]. Estas propriedades aparentemente variam com o tamanho dos IMOs e são favorecidas por altos graus de polimerização [14].

[008] A única fonte comercial e habitual de dextrana consiste do cultivo de L. mesenteroides NRRL B-512F com sacarose, que gera a formação de polímeros com alta massa molar de cerca de 108Da. A síntese direta de dextranas menores de 10.000 a 100.000 Da atualmente é impossível. Dextranas são atualmente produzidas convencionalmente por meio de hidrólise ácida de polímeros nativos com alta massa molar seguida por fracionamento utilizando solventes orgânicos. Esta segunda etapa é, entretanto, conhecida pelos seus baixos rendimentos [19].

[009] Do ponto de vista comercial, IMOs com DP 2 a 6 não são produzidos por reação de aceitação com dextrana sacarase DSR-S e glicose devido aos baixos rendimentos de reação, mas a partir de hidrolisatos de amido e mistura de a-amilases e glucosidases [11].

[010] Monchois et al [16] descrevem exclusões carbóxi-terminais da dextrana sacarase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F e concluem que o papel do domínio C-terminal é de facilitar a transferência de dextran e oligossacarídeos além do local ativo.

[011] A Patente US 5.229.277 descreve processo de produção de polímeros de dextran que possuem massa molar baixa homogênea utilizando Leuconostoc mesenteroides e microorganismo mutante de Lipomyces starkeyi ATCC 74054, que é levedura que possui atividade de dextranase, enzima específica para a hidrólise de ligações a-1,6 de dextrana. Este método necessita de condições de cultivo específicas e duração e temperatura precisamente reguladas, de forma que a atividade de dextranase reduza a massa molar das dextranas. Polímeros de dextrana produzidos por meio daquele método possuem massa molar na faixa de 40.000 a 150.000 Da.

[012] O acima demonstra que existe necessidade de produção de dextranas com massa molar de cerca de 10.000 a 100.000 Da utilizando método mais rápido com melhor rendimento, que particularmente não necessite de hidrólise ácida nem fracionamento.

[013] A presente invenção refere-se a dextrana sacarases produzidas de forma recombinante, que são truncadas e/ou mutadas, conservando ao mesmo tempo a sua atividade enzimática e/ou conservando a sua especificidade para a síntese de ligações a-1,6, ou variantes truncadas de dextrana sacarase que produzem dextranas com massa molar controlada. Mais precisamente, elas conservam a especificidade de união de DSR-S nativa e/ou conservam a sua especificidade de síntese de ligações a-1,6 e, a partir de sacarose, produzem dextranas com alta massa molar e interessantes propriedades de texturização e/ou dextranas e IMOs com massa molar controlada.

[014] A presente invenção também se refere ao fornecimento de sequências de ácido nuclrico de dextrana sacarase truncada e/ou mutada, vetores e células hospedeiras transformadas pelos ditos vetores, bem como sequências de aminoácidos de dextrana sacarases truncadas e/ou mutadas.

[015] Particularmente, como será evidente a partir dos Exemplos, certas dextrana sacarases produzem polímeros com propriedades de texturização interessantes, ou seja, substancialmente superiores às do polímero produzido pela enzima nativa; outros produzem dextranas e isomalto- oligossacarídeos com massa molar controlada. Isomaltose é produzida por pelo menos uma dextrana sacarase truncada e mutada.

[016] Aspectos adicionais da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir do relatório descritivo a seguir e dos Exemplos ou realizações preferidas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[017] Em primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma sequência de nucleotídeos que consiste essencialmente ou consiste de uma sequência de nucleotídeos de acordo com a Figura 1 (SEQ ID N° 1), uma sequência de nucleotídeos de acordo com a Figura 2 (SEQ ID N° 2), uma sequência de nucleotídeos de acordo com a Figura 3 (SEQ ID N° 3), uma de nucleotídeos de acordo com a Figura 4 (SEQ ID N° 4), uma sequência de nucleotídeos de acordo com a Figura 5 (SEQ ID N° 5), uma sequência complementar de uma das sequências com SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 ou 5 ou uma sequência que se hibridiza com sequência com SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 ou 5 sob condições de hibridização estringentes, desde que conserve a atividade enzimática de dextrana sacarase.

[018] Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se a sequências de nucleotídeos de dextrana sacarase que consistem essencialmente ou consiste de sequência de nucleotídeos selecionada a partir do fragmento de SEQ ID N° 1 da posição 373 até a posição 4269 (SEQ ID N° 17), o fragmento da sequência SEQ ID N° 2 da posição 373 até a posição 4005 (SEQ ID N° 18), o fragmento da sequência SEQ ID N° 3 da posição 373 até a posição 3408 (SEQ ID N° 19), o fragmento da sequência SEQ ID N° 4 da posição 373 até a posição 3018 (SEQ ID N° 20) e o fragmento da sequência SEQ ID N° 5 da posição 373 até a posição 4269 (SEQ ID N° 21).

[019] Ela também se refere a sequências de nucleotídeos que consistem essencialmente ou consistem de sequência de nucleotídeos selecionada a partir de sequência de nucleotídeos complementar do fragmento de SEQ ID N° 1 do nucleotídeo na posição 373 até o nucleotídeo da posição 4269, sequência de nucleotídeos complementar do fragmento de SEQ ID N° 2 do nucleotídeo na posição 373 até o nucleotídeo da posição 4005, sequência de nucleotídeos complementar do fragmento de SEQ ID N° 3 do nucleotídeo na posição 373 até o nucleotídeo da posição 3408, sequência de nucleotídeos complementar do fragmento de SEQ ID N° 4 do nucleotídeo na posição 373 até o nucleotídeo da posição 3018 e sequência de nucleotídeos complementar ao fragmento de SEQ ID N° 5 do nucleotídeo na posição 373 até o nucleotídeo da posição 4269.

[020] Ela também se refere a sequências de nucleotídeos que se hibridizam sob condições estringentes com sequência de nucleotídeos selecionada a partir do fragmento de sequência SEQ ID N° 1 da posição 373 até a posição 4269, fragmento de sequência SEQ ID N° 2 da posição 373 até a posição 4005, fragmento de sequência SEQ ID N° 3 da posição 373 até a posição 3408, fragmento de sequência SEQ ID N° 4 da posição 373 até a posição 3018 e fragmento de sequência SEQ ID N° 5 da posição 373 até a posição 4269, desde que conserve a atividade enzimática de dextrana sacarase e as mencionadas sequências de nucleotídeos que nela se hibridizam contenham o mesmo número de nucleotídeos e hibridizem-se ao longo de todo o comprimento do fragmento.

[021] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a sequências de nucleotídeos que codificam proteína que consiste essencialmente ou consiste de sequências de aminoácidos consecutivas de qualquer dentre SEQ ID N° 6 a 10 ou 22 a 26.

[022] Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores, tais como plasmídeos e células hospedeiras transformadas por ditos vetores e que contêm a dita sequência de ácidos nucleicos de dextrana sacarase truncada e/ou mutada, particularmente as variantes dos Exemplos.

[023] Em ainda outro aspecto da presente invenção, a presente invenção refere-se a proteína codificada pela dita sequência de nucleotídeos de dextrana sacarase truncada e/ou mutada selecionada a partir do fragmento de SEQ ID N° 6 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N° 22), fragmento de SEQ ID N° 7 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335 (SEQ ID N° 23), fragmento de SEQ ID N° 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1136 (SEQ ID N° 24), fragmento de SEQ ID N° 9 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1006 (SEQ ID N° 25) e fragmento de SEQ ID N° 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N° 26).

[024] Além disso, a presente invenção refere-se à dextrana sacarase truncada e/ou que mutada que consiste essencialmente ou consiste de uma das sequências descritas no presente, particularmente selecionadas a partir do fragmento de SEQ ID N° 6 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N° 22), fragmento de SEQ ID N° 7 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335 (SEQ ID N° 23), fragmento de SEQ ID N° 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1136 (SEQ ID N° 24), fragmento de SEQ ID N° 9 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1006 (SEQ ID N° 25) e fragmento de SEQ ID N° 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N° 26).

[025] Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se à preparação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada por meio de cultura de células hospedeiras que contêm dextrana sacarase truncada e/ou mutada sob condições que permitam a expressão de dextrana sacarase e isolamento da mencionada dextrana sacarase do meio de cultura.

[026] A presente invenção também se refere a método de produção de dextranas e/ou isomalto-oligossacarídeos (IMO) com massa molar controlada por meio da reação de dextrana sacarase que mutada e/ou truncada de acordo com a presente invenção com sacarose e, opcionalmente, um aceitador, para obter as mencionadas dextranas ou IMO com massa molar controlada, incluindo isomaltose.

[027] Método de produção direta de IMOs essencialmente a partir de sacarose também constitui aspecto da presente invenção. O termo “essencialmente”, da forma utilizada no presente, indica que não é necessário o emprego do aceitador na reação.

[028] As dextranas com alta massa molar de acordo com a presente invenção possuem propriedades reológicas modificadas comparáveis com as de dextrana sintetizada por enzima nativa, particularmente de natureza não Newtoniana, filamentosa e/ou gelificante.

[029] Por fim, a presente invenção refere-se a composições que compreendem dextranas obtidas utilizando as mencionadas dextrana sacarases e o uso das mencionadas dextrana sacarases para a produção de dextranas e isomalto-oligossacarídeos com massa molar controlada na faixa de 342 e 109Da. Mais precisamente, a presente invenção produz (i) isomaltose (342 Da), (ii) isomalto-oligossacarídeos com 342 a 5000 Da, (iii) dextranas com tamanho controlado de 1300 a 52.000 Da, mais precisamente 5000 a 22.000 Da, e centralizadas em cerca de 10.000 Da, (iv) dextranas com tamanho controlado de 7000 a 1,7 x 105Da, mais precisamente de 22.000 a 70.000 Da, centralizadas em cerca de 40.000 Da.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[030] A Figura 1 exibe a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos de DSR-S vardel Δ4N dextrana sacarase truncada com etiqueta de tioredoxina na posição 5’ terminal da sequência e etiquetas 6 histidina na posição 3’ terminal da sequência, bem como braços espaçadores entre as etiquetas de proteínas e a codificação de sequências para dextrana sacarase.

[031] A Figura 2 exibe a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos para DSR-S vardel Δ3 truncado com etiqueta de tioredoxina na posição 5’ da sequência, etiquetas de 6 histidinas na posição 3’ terminal da sequência e braços espaçadores entre as etiquetas de proteína e a codificação de sequências para dextrana sacarase.

[032] A Figura 3 exibe a sequência de aminoácidos e nucleotídeos para DSR-S núcleo vardel truncada com etiqueta de tioredoxina na posição 5’ terminal da sequência, etiquetas 6 histidina na posição 3’ terminal da sequência e braços espaçadores entre as etiquetas de proteínas e a codificação de sequências para dextrana sacarase.

[033] A Figura 4 exibe a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos para DSR-S núcleo ΔA truncada com etiqueta de tioredoxina na posição 5’ terminal da sequência, seis etiquetas de histidina na posição 3’ terminal da sequência e braços espaçadores entre as etiquetas de proteína e a codificação de sequência para dextrana sacarase.

[034] A Figura 5 exibe a sequência de aminoácidos e nucleotídeos para DSR-S vardel Δ4N mutante SEV663YDA com etiqueta de tioredoxina na posição 5’ terminal da sequência, seis etiquetas de histidina na posição 3’ terminal da sequência e braços espaçadores entre as etiquetas de proteína e a codificação de sequências para dextrana sacarase.

[035] A Figura 6 é representação diagramática das variantes truncadas de DSR-S e sua atividade relativa. os quatro domínios diferentes (i) a (iv) de DSR-S correspondem a: (i) peptídeo de sinal, (ii) região variável, (iii) domínio catalítico e (iv) domínio C-terminal, bem como as unidades de repetição A, C e N (nas caixas sombreadas) localizadas de acordo com Monchois et al, 1998 [16].

[036] A Figura 7 (A, B) exibe Western Blots anti-tioredoxina (A) e anti-6xHis (B) conduzidas em DSR-S vardel Δ4N produzida por E. coli TOP10 a 23°C.

[037] A Figura 8 exibe eletroforese de gel após manchar as proteínas com azul coloidal sobre extratos de DSR-S vardel Δ4N durante purificação por afinidade sobre resina de níquel (Probond, Invitrogen). A pista 1 corresponde ao sobrenadante da sonicação de E. coli TOP10 ao final do cultivo; a pista 2 corresponde ao efluente obtido após a união das proteínas 6xHis etiquetadas sobre a resina, a pista 3 corresponde à fração de eluição e a pista 4 corresponde à fração de eluição após eliminar agregados.

[038] A Figura 9 exibe os perfis de eluição obtidos por meio de HPSEC de dextranas produzidas por meio da preparação de a) DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F, b) DSR-S recombinante integral, c) DSR-S vardel Δ4N antes da purificação e d) DSR-S vardel Δ4N purificada. O pico 1 corresponde ao polímero com alta massa molar (HMW), pico 2 a frutose, glicose e oligossacarídeos com DP de menos de 7, não separados pelo sistema. Entre estes dois picos, perturbações da linha base refletem a presença de dextranas com tamanho intermediário (103a 107Da) em concentração muito baixa.

[039] As Figuras 10 A a E exibem os espectros obtidos por meio de NMR de prótons sobre dextranas sintetizadas por a) DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F, B), a DSR-S recombinante completa, C) DSR-S vardel Δ4N antes da purificação e D) DSR-S vardel ΔN após a purificação. O espectro E) é espectro de carbono 13 da dextrana sintetizada por DSR-S vardel Δ4N purificada.

[040] A Figura 11 corresponde ao cromatograma de HPAEC-PAD dos produtos de digestão utilizando endodextranase (dase) das quatro dextranas sintetizadas por DSR-S nativa, DSR-S recombinante completa e DSR-S vardel Δ4N, antes e depois da purificação.

[041] A Figura 12 exibe o comportamento reológico de quatro dextranas sintetizadas por DSR-S nativa (1) antes e (2) depois do corte, DSR-S recombinante completa (3) antes e (4) depois da aplicação de segunda série de tensões de corte, DSR-S vardel Δ4N (6) antes e (7) depois da aplicação de segunda série de tensões de corte, DSR-S vardel Δ4N purificada (5) em que A) representa a medição do fluxo de viscosidade, B) medições de viscosidade de modo dinâmico (oscilações de 0 a 10 Pa), antes da determinação dos módulos de conservação G1 e dissipação de energia G” para as dextranas sintetizadas pelas preparações de DSR-S vardel Δ4N não purificadas (o e •; comportamento do tipo de solução, G’ < G”; em deformação de 5%) e preparação purificada (□ e ■; comportamento do tipo de gel G’ > G”; 0,4% deformação).

[042] A Figura 13 exibe cromatograma de HPAEC-PAD de produtos sintetizados por DSR-S vardel Δ4N SEV663YDA com 100 g/L de sacarose isolada (A) ou por meio de reação de aceitador com 100 g/L de sacarose e 50 g/L de glicose (B). O símbolo G significa glicose, F: frutose, I2: isomaltose, I3: isomaltotriose, N/M: nigerose ou maltose (não separada por meio do sistema de almofada de HPAEC) e o símbolo “?” corresponde a produtos com estrutura desconhecida.

[043] A Figura 14 exibe o cromatograma de HPSEC de dextranas sintetizadas por DSR-S vardel Δ3 a 20°C e 10°C. As setas correspondem aos tempos de retenção de dextranas comerciais de 2 x 106Da, 70.000 e 10.000 Da que serviram de referências.

[044] A Figura 15 exibe o cromatograma de HPSEC de dextranas sintetizadas a 20°C com 100 g/L de sacarose e com 1 U/ml de (1) DSR-S vardel Δ4N, (2) DSR-S vardel Δ3, (3) DSR-S núcleo vardel e (4) DSR-S núcleo ΔA e o perfil de eluição (5) de dextrana comercial de 10.000 Da (Sigma).

[045] A Figura 16 exibe o perfil de HPAEC-PAD de dextranas sintetizadas a 20°C com 100 g/L de sacarose e com 1 U/ml de DSR-S vardel Δ4N (1), DSR-S vardel Δ3 (2), DSR-S núcleo vardel (3) e DSR-S núcleo vardel ΔA (4).

[046] A Figura 17 exibe o perfil de HPAEC-PAD (A) e distribuição (B) de IMOs produzidos por meio de reação de aceitador a 20°C com as variantes DSR-S vardel Δ4N (1), DSR-S vardel Δ3 (2), DSR-S núcleo vardel (3) e DSR-S núcleo vardel ΔA (4). G: glicose; F: frutose; L: leucrose; T: trealulose; I2 a I20: isomalto-oligossacarídeos com DP 2 a DP 20. O inserto da Figura B corresponde a ampliação dos IMOs de DP 15 para 27.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[047] A expressão “enzima que possui atividade enzimática de dextrana sacarase” conforme utilizado no presente indica enzima que catalisa a conversão de sacarose em oligosídeos e poliosídeos que compreendem mais de 50% de unidades de glicosila unidas por ligações α-1,6 com tamanho na faixa de 342 e 109Da e, mais especificamente, dextranas e isomalto- oligossacarídeos que compreendem mais de 95% de ligações α-1,6. Esta conversão pode ter lugar na presença ou ausência de aceitadores externos tais como maltose, glicose, isomaltose ou frutose, ou isomalto-oligossacarídeos. Maltose, isomaltose e glicose são os aceitadores preferidos na presente invenção. A atividade enzimática das dextranas sacarases de acordo com a presente invenção pode ser medida conforme descrito nos Exemplos.

[048] Os termos “nucleotídeos”, “polinucleotídeos”, “ácidos nucleicos” e “oligonucleotídeos”, da forma utilizada no presente, são intercambiáveis e incluem, sem limitação, sequências de RNA, DNA e DNA/RNA que compreendem mais de um nucleotídeo em uma única cadeia ou na forma de cadeia dupla. As sequências de polinucleotídeos de acordo com a presente invenção podem ser preparadas por meio de qualquer método conhecido, incluindo, sem limitações, qualquer método de síntese recombinante e qualquer método de geração ex vivo, bem como combinações destes métodos.

[049] O termo “truncado”, da forma utilizada no presente, indica que pelo menos uma das extremidades N ou C-terminais da sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos foi reduzida. Esta redução pode ser conduzida utilizando enzimas de restrição, enzimas proteolíticas ou sinteticamente, incluindo por meio de amplificação específica de sequências de nucleotídeos, particularmente por meio de PCR.

[050] A expressão “dextrana sacarase purificada”, da forma utilizada no presente, indica dextrana sacarase que possui apenas uma forma ativa de dextrana sacarase nas preparações, que possui grau de pureza de proteína de pelo menos 70%, 85% ou 95%.

[051] A expressão “propriedade de texturização original interessante”, da forma utilizada no presente, indica as propriedades reológicas das dextranas de acordo com a presente invenção que, em comparação com dextranas sintetizadas por enzima nativa sob as mesmas condições, por exemplo, exibem comportamento não newtoniano, especialmente comportamento de gel ou do tipo filamentoso. “Polímero do tipo gel” é caracterizado no presente por medições reológicas de modo dinâmico, detectando os módulos de conservação de energia (G’) e dissipação de energia (G”). Para gel, G’ é mais alto que G” ao longo de toda a faixa de frequências estudada, como se tornará evidente no Exemplo 5. O caráter filamentoso pode ser identificado a olho nu. As dextranas filamentosas de acordo com a presente invenção alteram-se de comportamento de tipo solução para comportamento de tipo gel após a aplicação de segunda série de tensões de corte, como também será observado no Exemplo 5.

[052] As abreviações a seguir utilizadas no presente possuem os seguintes significados: DSR-S para dextrana sacarase de L. mesenteroides NRRL B-512F; DP para grau de polimerização; HMW para “alta massa molar”, IMW para “massa molar intermediária”, em que os polímeros de IMW são polímeros altamente polidispersos com tamanhos na faixa de 1000 a 107Da, em que a separação por HPSEC é difícil devido à sua baixa concentração. Polímeros com LMW (baixa massa molar) são, de acordo com a presente invenção, população que é muito mais alta e facilmente detectada entre 750 e 70.000 Da, centralizada em cerca de 10.000 Da ou na faixa de 2.000 a 1,7 x 105Da e centralizada em cerca de 40.000 Da.

[053] A expressão “dextrana de 10.000 Da”, da forma utilizada no presente, indica população de dextranas com tamanho na faixa de 1300 a 52.000 Da, mais precisamente de 5000 a 22.000 Da, centralizada na altura do pico em cerca de 10.000 Da. Durante a caracterização, a base do pico de eluição obtido por meio de permeação de gel estava na faixa de 1300 a 52.000 Da, a faixa de massa molar estimada no pico de eluição em metade da altura estava na faixa de 5000 a 22.000 Da e o pico foi centralizado na altura do pico em massa de cerca de 10.000 Da. Quando a massa molar foi expressa no pico de meia altura, pelo menos 50% da população de dextrana caíram dentro da faixa indicada.

[054] A expressão “dextrana de 40.000 Da”, da forma utilizada no presente, indica população de dextrana com tamanho na faixa de 7000 a 1,7 x 105Da, mais precisamente de 22.000 a 70.000 Da, centralizada na altura do pico em cerca de 40.000 Da. Durante a caracterização, a base do pico de eluição obtido por meio de permeação de gel estava na faixa de 7000 a 1,7 x 105Da, a faixa de massa molar estimada no pico de eluição a meia altura estava na faixa de 22.000 a 70.000 Da e o pico estava centralizado em massa de cerca de 40.000 Da. Quando a massa molar era expressa no pico a meia altura, pelo menos 50% da população de dextranas caiu dentro da faixa indicada.

[055] IMO indica isomalto-oligossacarídeos.

[056] A expressão “que consiste essencialmente de”, quando utilizada com relação a ácidos nucleicos ou aminoácidos da forma utilizada no presente, indica que outros ingredientes menores ou moléculas podem estar presentes com as sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos. A sequência de ácido nucleico possui exatamente o mesmo comprimento indicado no número de identificação da sequência, mas pode possuir três a doze nucleotídeos adicionais nos terminais N e C. De forma similar, a sequência de aminoácidos possui exatamente o mesmo comprimento indicado no número de indicação de sequências, mas de um a quatro aminoácidos adicionais podem ser agregados aos terminais N ou C. Estes aminoácidos adicionais não possuem efeito sobre a atividade enzimática.

[057] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a ácidos nucleicos que codificam dextrana sacarase truncada ou dextrana sacarase mutada, sequência complementar a todas ou parte destas sequências ou sequência que se hibridiza sob condições estringentes com uma das sequências acima, desde que a atividade enzimática de dextrana sacarase seja mantida. Dever-se-á apreciar que as sequências de nucleotídeos que nela se hibridizam contêm a mesma quantidade de nucleotídeos e hibridizam-se ao longo de todo o comprimento do fragmento.

[058] A expressão “condições de hibridização estringentes”, da forma utilizada no presente, indica condições conforme descrito por Sambrook et al, Molecular Cloning Manual, 3a edição (2001), ou seja, por exemplo, as condições a seguir: tampões de hibridização: 2 X SSC, 10 X solução de Denhardt (Ficoll 400 e PEG e BSA, razão 1:1:1), 0,1% SDS, 5 mM de EDTA, 50 mM de Na2HPO4, 250 μg/ml de DNA de esperma de arenque, 50 μg/ml de t-RNA ou 0,25 M de tampão fosfato de sódio com pH 7,2, 1 mM de EDTA, 7% SDS; Temperatura de hibridização: 60°C; Tampão de lavagem: 2 X SSC, 0,1% SDS; Temperatura de lavagem: 60°C.

[059] As moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes com os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem, em princípio, codificar dextrana sacarases de qualquer microorganismo, tal como bactéria, bactéria grama positiva e, em um aspecto da presente invenção, bactéria dos gêneros Leuconostoc, Streptococcus ou Lactobacillus.

[060] A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos que codificam proteínas de dextrana sacarase que contêm pelo menos 70%, 80% ou 90% de identidade de sequências com as sequências SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 17 a 21, desde que a proteína codificada pelas mencionadas sequências possua atividade enzimática de dextrana sacarase.

[061] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a sequências de nucleotídeos que codificam proteína que consiste essencialmente ou consiste de sequências de aminoácidos consecutivas de qualquer dentre SEQ ID N° 6 a 10 ou 22 a 26.

[062] Em aspecto adicional da presente invenção, as sequências complementares às sequências de acordo com a presente invenção ou sequências que se hibridizam com as mencionadas sequências sob condições estringentes, desde que a atividade enzimática de dextrana sacarase seja mantida, também são incluídas na presente invenção.

[063] Derivações das sequências de nucleotídeos básicas SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 5), em que as sequências são selecionadas a partir do fragmento de sequência SEQ ID N° 1 da posição 373 até a posição 4269, fragmento de sequência SEQ ID N° 2 da posição 373 até a posição 4005, fragmento de sequência SEQ ID N° 3 da posição 373 até a posição 3408, fragmento de sequência SEQ ID N° 4 da posição 373 até a posição 3018 e fragmento de sequência SEQ ID N° 5 de nucleotídeo na posição 373 até a posição 4269, as sequências complementares às mencionadas sequências ou sequências que se hibridizam com as mencionadas sequências sob condições estringentes, desde que a atividade enzimática de dextrana sacarase seja mantida, podem ser produzidas por meio de exclusão, substituição, inserção ou recombinação, por exemplo; em que os métodos de condução das mencionadas etapas e transformações são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, por Sambrook et al, acima.

[064] Dever-se-á compreender no presente que, caso tenham lugar quaisquer exclusões, substituições, inserções ou recombinações de quaisquer das sequências mencionadas acima, as proteínas codificadas pelas sequências devem manter a sua atividade enzimática de dextrana sacarase. Desta forma, 1 a 132, preferencialmente 2 a 60 nucleotídeos, de maior preferência 15 a 36 nucleotídeos e, de preferência ainda maior 12 a 27 nucleotídeos podem ser modificados, por exemplo, por meio de exclusão, substituição, inserção ou recombinação. Segundo a presente invenção, 90%, preferencialmente 95% dos nucleotídeos permanecem inalterados.

[065] A atividade enzimática de dextrana sacarase pode ser medida conforme descrito no capítulo de método e nos Exemplos do presente pedido.

[066] Os oligonucleotídeos que podem ser utilizados como sonda ou primer são, por exemplo, SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 5 ou sequências de nucleotídeos selecionadas a partir do fragmento de sequência SEQ ID N° 1 da posição 373 até a posição 4269, fragmento de sequência SEQ ID N° 2 da posição 373 até a posição 4005, fragmento de sequência SEQ ID N° 3 da posição 373 até a posição 3408, fragmento de sequência SEQ ID N° 4 da posição 373 até a posição 3018 e fragmento de sequência SEQ ID N° 5 de nucleotídeo na posição 373 até a posição 4269.

[067] O comprimento das sondas e primers pode variar dependendo das suas aplicações. Geralmente, eles devem possuir pelo menos 25 nucleotídeos e podem compreender todas as sequências de dextrana sacarase descritas, tais como 3896 nucleotídeos. O comprimento pode também variar para que esteja na faixa de 25 a 150 nucleotídeos, 25 e 800 nucleotídeos ou 25 e 300 nucleotídeos, por exemplo.

[068] Os primers geralmente compreendem 18 a 25 nucleotídeos de comprimento, mas podem também ser mais longos, dependendo da aplicação idealizada. Exemplos de primers que podem ser utilizados na presente invenção são: GGC TTC TCT GGT GTG ATT (SEQ ID N° 11) GAT CTG TCA GAA ACT GGC (SEQ ID N° 12) ACA CAA CAA GTT AGC GGC (SEQ ID N° 13) CCA GAT ACT AAC TTG AGT (SEQ ID N° 14) TTC ATT GAT GCA GAC GGG (SEQ ID N° 15) CAC GAC TAC GAC GCG CAA (SEQ ID N° 16)

[069] Dever-se-á observar que os primers nas posições 5’ e 3’ terminais dos nucleotídeos codificam a dextrana sacarase (SEQ ID N° 11 a 15) e o lado 5’ e 3’ da sequência mutante (SEQ ID N° 16). Os técnicos no assunto podem, entretanto, utilizar cada uma destas sequências para produzir primers ou sondas utilizando nucleotídeos consecutivos. Além disso, estas sequências de nucleotídeos que são utilizadas como sonda podem ser particularmente etiquetadas com radioatividade, etiquetação enzimática ou etiquetação fluorescente.

[070] A fim de elaborar geneticamente a célula procariótica ou eucariótica, os ácidos nucleicos de acordo com o presente pedido ou parte dos ácidos nucleicos de acordo com o presente pedido podem ser introduzidos em plasmídeos que permitam a mutagênese ou modificação de sequências por meio de recombinação de sequências de nucleotídeos. Métodos padrão utilizando estas técnicas são conhecidos dos técnicos no assunto e foram descritos por Sambrook et al, acima, especificamente. Os fragmentos de DNA podem também ser conectados entre si por adaptadores ou links e enzimas de restrição apropriadas podem ser utilizadas para remover certas sequências de DNA. Métodos tais como mutagênese, restrição após a restauração de primers ou ligaduras podem ser utilizados para obter a sequência desejada com as inserções, exclusões apropriadas ou substituições necessárias ou desejáveis.

[071] Além disso, etiquetas bem definidas que codificam ácidos nucleicos podem ser ligadas às extremidades N ou C-terminais das sequências de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção. Elas podem ser peptídeos tais como poli-His, epítopo c-myc ou etiqueta HA ou pequenas proteínas tais como GST bacteriano, MBP (proteína de união de maltose), tioredoxina, β-galactosidase, glicoproteína VSV e similares.

[072] Ácidos nucleicos específicos que codificam outras etiquetas de proteína são etiqueta His, etiqueta T7, etiqueta S, peptídeo de “etiqueta”, trpE, avidina/estreptavidina, proteína A ou G de estafilococo, di-hidrofolato redutase, domínios de união de celulose, policisteína, polifenilalanina e similares, que podem também ser utilizados na presente invenção.

[073] Segundo um aspecto da presente invenção, ácido nucleico que codifica tioredoxina é fundido à sequência de ácido nucleico N-terminal. Ácido nucleico que codifica etiqueta 6xHis é fundido à extremidade 3’ das sequências de ácidos nucleicos.

[074] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser ligados a unidade de transcrição que compreende (1) elementos de regulagem da expressão genética tais como promotores e amplificadores, (2) sequência de codificação ou estrutural que é transcrita em mRNA e traduzida na proteína correspondente e (3) sinais de início e término apropriados.

[075] Uma série de sequências de controle de expressão apropriadas é conhecida na técnica. Métodos gerais de expressão da proteína recombinante também são conhecidos e exemplificados no documento de R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) [17].

[076] As regiões promotoras que podem ser utilizadas nos vetores de acordo com a presente invenção incluem lacL, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, tre e ara.

[077] A presente invenção também se refere a vetores, particularmente plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores que são conhecidos no campo de engenharia genética e que compreendem as sequências de ácidos nucleicos de acordo com o presente pedido em um aspecto da presente invenção, em que os mencionados vetores são plasmídeos selecionados a partir de DSR-S vardel Δ4N, DSR-S vardel Δ3, DSR-S núcleo vardel, DSR-S núcleo ΔA e DSR-S vardel Δ4N SEV663YDA.

[078] Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podem ser expressos em células procarióticas ou eucarióticas. Exemplos não limitadores destas células que podem ser mencionados são células VERO, células HELA tais como ATCC n° CCL3, linhagens de células CHO tais como ATCC CCL61, células de COS tais como COS-7 e células ATCC N° CR: 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3 tais como ATCC N° CRL 6361, A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 tais como ATCC N° CRL 1711, células Cv1 tais como ATCC N° CCL70 e células JRKAT tais como ATCC Tib152.

[079] Células não limitadoras que podem ser utilizadas no presente pedido incluem linhagens das células hospedeiras procarióticas tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou linhagens dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, ou linhagens de células hospedeiras eucarióticas tais como os parasitas Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia), Leishmania ou Trypanosoma.

[080] Outras células apropriadas podem ser utilizadas na presente invenção e incluem, particularmente, células de leveduras tais como Saccharomyces, como Saccharomyces cervisiae ou pombe, Pichia pastoris e células eucarióticas (células de plantas, células de CHO e similares).

[081] Em aspecto adicional, as células utilizadas para expressão de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são Escherichia coli e linhagens selecionadas, por exemplo, a partir de JM109, BL21 (DE3) pLysS, TOP10 ou Pir1. A linhagem INVsc de Saccharomyces cerevisiaetambém pode ser utilizada.

[082] A presente invenção refere-se a células hospedeiras transformadas com as sequências de ácidos nucleicos descritas acima ou com vetor conforme descrito acima e células derivadas de células transformadas que contêm o vetor ou as sequências de ácidos nucleicos descritas no presente.

[083] Exemplos dessas células hospedeiras que podem ser mencionados são Escherichia coli, em que a dextrana sacarase truncada e/ou mutada pode ser produzida. A preparação destas células hospedeiras é conhecida na técnica.

[084] Proteínas e fragmentos biologicamente ativos dessas proteínas, bem como proteínas mutadas e codificadas pelas moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e seus métodos de preparação, também se enquadram dentro do escopo da presente invenção.

[085] Desta forma, a presente invenção refere-se a método de preparação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada, que compreende as etapas de: a. cultivo de células hospedeiras transformadas com as sequências de ácidos nucleicos descritas acima ou com vetor conforme descrito acima sob condições que permitam a expressão de dextrana sacarase; e b. isolamento da dita dextrana sacarase do meio de cultura.

[086] Mais especificamente, as sequências de ácidos nucleicos podem ser selecionadas a partir de SEQ ID N° 1 da posição 373 até a posição 4269, fragmento de sequência SEQ ID N° 2 da posição 373 até a posição 4005, fragmento de sequência SEQ ID N° 3 da posição 373 até a posição 3408, fragmento de sequência SEQ ID N° 4 do precursor 373 até a posição 3018 e fragmento de sequência SEQ ID N° 5 da posição 373 até a posição 4269, sequências complementares das mencionadas sequências e sequências que se hibridizam com as mencionadas sequências sob condições estringentes, desde que seja mantida a atividade enzimática de dextrana sacarase.

[087] Após o isolamento, as dextranas sacarases de acordo com a presente invenção podem também ser purificadas. Neste particular, podem ser utilizados os métodos habituais de purificação, tais como precipitação, cromatografia de troca de íons, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca hidrofóbica, filtragem com gel, HPLC de fase reversa, desmistura de fases e similares. Em um aspecto da presente invenção, as dextranas sacarases mutadas ou truncadas de acordo com a presente invenção podem ser purificadas utilizando resina carregada com níquel, considerando a existência da tioredoxina e etiqueta 6xHis.

[088] Outro aspecto da presente invenção refere-se a proteínas de dextrana sacarase que consistem essencialmente ou consistem de sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N° 6 a 10 ou sequência de aminoácidos selecionada a partir do fragmento de SEQ ID N° 6 a partir do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423, fragmento de SEQ ID N° 7 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335, fragmento de SEQ ID N° 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1136, fragmento de SEQ ID N° 9 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1006 e fragmento de SEQ ID N° 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423.

[089] Proteína codificada por uma das sequências de nucleotídeos SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 5 ou fragmentos das mencionadas sequências, conforme descrito acima é outra realização da presente invenção.

[090] Sequências de aminoácidos homólogos, ou seja, em que o grau de similaridade com as sequências definidas acima é suficiente para a manutenção da atividade enzimática, também são incluídas no objeto do presente pedido. Desta forma, programas Blast e Fasta podem ser utilizados para investigar a similaridade. Como se demonstrou no presente que era possível truncar as extremidades N e C-terminais de dextrana sacarases, mantendo a atividade enzimática, a similaridade de sequências não pode ser considerada apenas para a sequência completa isolada, mas também para as sequências truncadas. A presente invenção refere-se, portanto, qualquer sequência que contenha 80%, 90% ou 98% de similaridade de sequências com a sequência completa, mas também aquelas que possuiriam 80%, 90% ou 98% de similaridade de sequências com uma das sequências truncadas, desde que a atividade enzimática seja mantida.

[091] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a sequências que possuem grau de similaridade da ordem de 90%, 95% ou 98% de similaridade com SEQ ID N° 6 a 10 ou sequências de aminoácidos selecionadas a partir do fragmento de SEQ ID N° 6 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423, SEQ ID N° 7 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335, SEQ ID N° 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1136, SEQ ID N° 9 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1006 e SEQ ID N° 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423, desde que estas proteínas possuam a atividade enzimática das mencionadas dextrana sacarases. Claramente, as sequências de aminoácidos com identidade específica definida acima possuem maior parte de substituições de aminoácidos conservadoras.

[092] Substituições de aminoácidos conservadoras incluem substituições de aminoácidos da mesma classe. Estas classes compreendem, por exemplo, aminoácidos que contêm cadeias laterais polares não carregadas, tais como Asn, Gln, Ser, Thr ou Tyr; aminoácidos que contêm cadeias laterais básicas, tais como His, Lys ou Arg; aminoácidos que contêm cadeias laterais ácidas, tais como Glu ou Asp e aminoácidos que contêm cadeias laterais não polares, tais como Ala, Gly, Leu, Val, Ile, Phe, Cys ou Trp.

[093] Além disso, com referência à atividade enzimática de dextrana sacarase com substituições de aminoácidos, esta pode ser testada conforme descrito nos Exemplos, mas a atividade pode também ser avaliada por meio de análises de HPLC ou das previsões habituais referentes à forma em que as alterações de aminoácidos afetam as funções das proteínas.

[094] Em aspecto adicional, como as sequências de aminoácidos são indicadas no presente, a proteína pode ser sintetizada utilizando o método de R. B. Merrifield, 1963 [20]. Por esta razão, as proteínas de dextrana sacarase sintetizadas constituem outro aspecto da presente invenção.

[095] A presente invenção também se refere à dextrana sacarases mutantes denominadas mutante SEV663YDA de DSR-S vardel Δ4N em que a serina, ácido glutâmico e valina nas posições 663, 664 e 665 tenham sido modificadas para tirosina, ácido aspártico e alanina, respectivamente.

[096] Este mutante pode ser utilizado para sintetizar isomaltose de sacarose, utilizando sacarose como o único substrato em rendimento que é equivalente ao obtido quando aceitador, tal como glicose, é adicionado ao meio de reação.

[097] Por esta razão, a presente invenção refere-se a método de produção de isomaltose diretamente a partir de sacarose, em que o mencionado método compreende a reação de dextrana sacarase mutante com SEQ ID N° 10 com sacarose e produção de isomaltose.

[098] As proteínas de fusão que contêm etiqueta de proteína conforme descrito acima também fazem parte da presente invenção. Neste particular, as proteínas mutadas e/ou truncadas de acordo com a presente invenção podem ser fundidas com pelo menos uma etiqueta de proteína.

[099] A preparação de dextranas com alta massa molar (cerca de 106a 108Da) e com propriedades reológicas modificadas em comparação com dextrana sintetizada por DSR-S nativo de L. mesenteroides NRRL B-512F utilizando a dextrana sacarase truncada de acordo com a presente invenção é outro aspecto da presente invenção.

[0100] Mais especificamente, microorganismos que secretam dextrana sacarase ou extratos celulares de microorganismos que produzem dextrana sacarase de forma intracelular podem ser cultivados ou utilizados em meio que compreende sacarose, o que resulta na síntese de isomaltose (342 Da), (ii) isomalto-oligossacarídeos de 342 a 5000 Da, (iii) dextranas com tamanho controlado de 1300 a 5200 Da centralizadas em cerca de 10.000 Da, (iv) dextranas com tamanho controlado de 7000 a 1,7 x 105Da centralizadas em cerca de 40.000 Da e (v) dextranas com alta massa molar de 2 x 106Da a 109Da. Estes compostos podem ser isolados do meio de cultura por meio de métodos convencionais tais como ultrafiltragem, nanofiltragem, precipitação alcoólica, cromatografia de líquidos e similares.

[0101] Alternativamente, as dextranas sacarases truncadas e/ou mutadas descritas na presente invenção podem ser purificadas e utilizadas em método de produção de dextranas com massa molar controlada.

[0102] Desta forma, a presente invenção refere-se a método de produção de dextranas e/ou isomalto-oligossacarídeos com massa molar controlada, que compreende a reação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada que consiste essencialmente ou consiste de sequência selecionada a partir de sequências de nucleotídeos SEQ ID N° 6 a SEQ ID N° 10 definidas acima com pelo menos sacarose e opcionalmente aceitador.

[0103] A presente invenção também se refere a método de produção de isomaltose, em que o método compreende a reação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada com sequência SEQ ID N° 10 essencialmente com sacarose. A presente invenção também se refere a método de produção de dextranas com interessantes propriedades de textura, em que o método compreende a reação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada com a sequência de SEQ ID N° 6.

[0104] A presente invenção também se refere a dextranas e isomalto-oligossacarídeos que possuem as características definidas no presente pedido, que podem ser obtidas por meio dos métodos descritos no presente. Estas propriedades características incluem o fato de que dextranas com alta massa molar possuem comportamento não newtoniano e possuem a característica de gel ou natureza filamentosa e a propriedade de alteração de comportamento do tipo solução para o de gel após a aplicação de segunda série de tensões de corte.

[0105] Como ficará evidente nos Exemplos, as diferentes propriedades reológicas podem ser convenientemente obtidas dependendo se a enzima é purificada ou não purificada.

[0106] As dextranas produzidas enzimaticamente de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas como suporte na indústria farmacêutica, como substituto de plasma, aditivos em produtos têxteis ou tintas, em cosméticos e na indústria agroalimentar, bem como agente de texturização, tal como substituto para goma arábica ou agente gelificante. A presente invenção também se refere a composições que compreendem as dextranas e IMOs de acordo com a presente invenção.

[0107] Uma aplicação importante das dextranas e isomalto- oligossacarídeos de acordo com o presente pedido é o seu uso como prebióticos. Estes produtos não são completamente metabolizados e são fermentados seletivamente no cólon por espécies bacterianas apropriadas, tais como Bifidobacteria e Lactobacilli.

[0108] Oligossacarídeos vêm sendo tradicionalmente utilizados para alimentos animais ou humanos, nas indústrias farmacêuticas e na indústria de cosméticos ou como adoçante, estabilizante ou carga [21]. Durante os últimos quinze anos, novo campo de atividade foi desenvolvido para as propriedades prebióticas de certas moléculas não digeríveis [23]. Oligossarídeos como prebióticos são interessantes com relação à sua capacidade de resistência a ataques por enzimas digestivas e para acentuar o crescimento de bactérias “saudáveis”, principalmente Bifidobacteria e Lactobacilli, no intestino. Este conceito foi estimulado pelo surgimento de produtos prebióticos comerciais que rapidamente obtiveram popularidade. Oligômeros tais como fruto-oligossacarídeos, lactulose, galacto- oligossacarídeos, xilo-olligossacarídeos, oligossacarídeos extraídos de soja ou isomalto-oligossacarídeos que são normalmente obtidos por meio de processos biológicos ou de extração de plantas, também são promissores. Atualmente, pesquisas neste campo concentraram-se na produção de estruturas de oligossacarídeos inovadoras denominadas prebióticos de segunda geração que deverão possuir propriedades físico-químicas inovadoras e atividades biológicas mais específicas [18].

[0109] Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se à composição que compreende dextrana obtida a partir de dextrana sacarase de acordo com a presente invenção e veículo farmaceuticamente aceitável ou veículo com qualidade alimentícia.

[0110] O veículo aceitável pode ser selecionado, por exemplo, a partir de adjuvantes, sais e similares e os adjuvantes podem ser selecionados a partir de peptídeos de muramil, alúmen, montanida e similares. As dextrana sacarases que sofreram mutação e/ou truncadas podem ser proteína purificada, proteína produzida de forma recombinante ou proteína produzida de forma sintética.

[0111] Com relação ao método de produção das dextranas e/ou IMOs, aceitadores preferidos, quando utilizados, são glicose, isomaltose, maltose e isomalto-oligossacarídeos.

[0112] Preferencialmente, o método de produção de isomalto- oligossacarídeos com massa molar controlada compreende a reação de dextrana sacarase mutada e/ou truncada que consiste de sequências SEQ ID N° 7, 8, 9 ou 10 essencialmente com sacarose. O grau de polimerização varia, portanto, de duas a sessenta unidades glicosila (DP2 a DP60).

[0113] A reação de produção tem lugar sob temperaturas na faixa de 4°C a 80°C, preferencialmente 4°C a 40°C.

[0114] Preferencialmente, quando a sequência for SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8 ou SEQ ID N° 9, a temperatura encontra-se na faixa de 4°C a 15°C, preferencialmente 8°C a 12°C e, de maior preferência, a temperatura é da ordem de 10°C para a produção de dextranas com tamanho controlado. Além disso, para estas sequências, a temperatura encontra-se preferencialmente na faixa de cerca de 8°C a 25°C, de maior preferência na ordem de 20°C para síntese de IMO.

[0115] Além disso, preferencialmente quando a sequência for SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 10, a temperatura encontra-se na faixa de 15°C a 45°C, preferencialmente 17°C a 30°C e, de maior preferência, da ordem de 20°C a 25°C.

[0116] Adicionalmente, a concentração de sacarose encontra-se na faixa de 10 a 600 g/L, preferencialmente 75 a 400 g/L e, de maior preferência, 90 a 280 g/L.

[0117] Quando a sequência for SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8 ou SEQ ID N° 9, a concentração de sacarose no meio é preferencialmente da ordem de 250 g/L.

[0118] Além disso, quando a sequência for SEQ ID N° 6 ou SEQ ID N° 10, a concentração de sacarose pode ser da ordem de 100 g/L.

[0119] Adicionalmente, conforme apropriado, a razão em peso entre sacarose e aceitador pode ser da ordem de 0,5 a 12, preferencialmente 1 a 4, de maior preferência cerca de 2.

[0120] No método de acordo com a presente invenção, a dextrana sacarase encontra-se na forma livre ou imobilizada sobre suporte. A mencionada imobilização pode ser efetuada, por exemplo, por meio de adsorção, inclusão ou ligação covalente.

[0121] Por fim, para a condução do método, o pH encontra-se na faixa de 3,0 a 10,0, preferencialmente 4,0 a 7,0, de maior preferência 4,5 a 6,0 e, de preferência ainda maior, cerca de 5,2.

[0122] Outros aspectos da presente invenção podem tornar-se evidentes a partir de estudo dos Exemplos abaixo.

EXEMPLO 1 CONSTRUÇÃO DE VARIANTES

[0123] O vetor Thiofusion pBad/TOPO (Invitrogen) foi utilizado para clonar e expressar genes dsrS truncados e/ou que sofreram mutação sob o controle do promotor L-arabinose. Ele permite a fusão do gene à etiqueta 6xHis na extremidade C-terminal e a etiqueta de tioredoxina na extremidade N- terminal.

[0124] Para uso como matriz, DNA genômico de L. mesenteroides NRRL B-512F foi extraído utilizando o kit Blood and Cell Culture DNA Maxi (Qiagen). A linhagem é derivada da coleção NCAUR, Peoria IL, Estados Unidos.

[0125] Células TOP10 One Shot (Invitrogen) foram utilizadas para expressão dos genes dsrS truncados e/ou que sofreram mutação. As enzimas de restrição foram adquiridas da New England Biolabs e utilizadas de acordo com as instruções do fabricante. DNA foi purificado utilizando os kits “QIAquick” (purificação por meio de PCR e extração de gel) e “QIAprep” (purificação de plasmídeos) da Qiagen.

[0126] As variantes foram construídas por meio de amplificação por PCR do gene DSR-S a partir de DNA genômico de L. mesenteroides NRRL B-512F utilizando a polimerase Expand High Fidelity (Roche) e os primers a seguir (fornecidos na direção 5’ ^ 3’): 1. DSR-S vardel Δ4N foi construída utilizando os primers pBad e DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 e PBad Δ4N: 4350-actcaagttagtatctggatccacaatgatagc-4317. Ele continha os aminoácidos T152 a S1450 de DSR-S. 2. DSR-S vardel Δ3 foi construída utilizando os primers PBad e DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 e PBad Δ3: 4086-cccgtctgcatcaatgaattcacc-4062. Ele continha os aminoácidos T152 a G1362 de DSR-S. 3. DSR-S núcleo vardel foi construída utilizando os primers PBad e DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 e núcleo PBad: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Ele continha os aminoácidos T152 a G1162 de DSR-S. 4. DSR-S núcleo ΔA foi construída utilizando os primers PBad DSR-S cat: 843-ggcttctctggtgtgattgatggtcaa-870 e núcleo PBad: 3489- gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Ela contém os aminoácidos G282 a G1162 de DSR-S. 5. A DSR-S vardel Δ4N mutante SEV663YDA foi construída por meio de mutagênese dirigida utilizando o método de “mega primer” [33, 21] e DNA polimerase Pfu (Stratagene). Primeira reação de PCR foi conduzida utilizando a matriz de plasmídeo DSR-S vardel Δ4N e o par de primers SEV663YDA: 1965- agctttgtacgagctcacgactacgacgcgcaaacggtt-2004 e rev: 3447- gtcaccatcctcagtgttcgaaacg-3422, que compreende o local de restrição de BsfBI (sublinhado). Este produto de PCR foi utilizado em seguida como mega primer reverso em segunda PCR com o primer frontal: 1329-caaccacagtggaatgaaactagtc- 1354 que compreende o local de restrição SpeI. Este segundo produto de PCR foi digerido em seguida com as duas enzimas de restrição SpeI e BstBI de acordo com as condições do fabricante (New England BIolabs) e clonado no vetor pBad DSR-S vardel Δ4N previamente digerido com as mesmas enzimas. O primer SEV663YDA foi projetado para introduzir um único local de restrição para selecionar clones positivos (neste caso, o local SacI).

[0127] A estrutura primária de cada uma das variantes DSR-S vardel Δ4N, DSR-S vardel Δ3, DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA é exibida em forma de diagrama na Figura 6.

EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE VARIANTES EM E. COLI

[0128] Foram conduzidos cultivos em frasco Erlenmeyer com membrana sobre meio 2X YT tamponado até pH de 6,4 com 100 mN de Tris- HCl, em que se sabe que DSR-S é instável sob condições de pH alcalino [3]. COMPOSIÇÃO DE MEIO 2X YT - Bactotripona: 16 g/L - Extrato de levedura: 10 g/L - NaCl: 5 g/L - Tris: 12,1 g/L

[0129] Células TOP10 de E. coli que conduzem plasmídeos pBad DSR-S vardel Δ4N e pBad DSR-S vardel Δ4N SEV663YDA foram cultivadas a 23°C. Conduziu-se indução de L arabinose quando o crescimento celular atingiu OD600nm de 0,2 com 0,002% (p/v) de indutor. O cultivo foi suspenso quando o crescimento celular atingiu nível estável (OD600nm de cerca de 3 a 3,5) antes de iniciar a fase de lise celular.

[0130] Células TOP10 de E. coli que conduzem plasmídeos pBad DSR-S vardel Δ3, pBad DSR-S núcleo vardel e pBad DSR-S núcleo ΔA foram trazidas para 16°C. Conduziu-se indução quando o crescimento celular atingiu OD600nm de 0,2 com 0,005% (p/v) de L-arabinose no caso de DSR-S vardel Δ3 e 0,02% (p/v) no caso de DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA. O cultivo foi suspenso quando o crescimento celular atingiu nível estável (OD600nm de cerca de 2,5) antes de iniciar a fase de lise celular.

[0131] Após o cultivo, as células foram recuperadas por meio de centrifugação (8000 x g, 10 minutos, 4°C), novamente suspensas e concentradas até OD600nm equivalente a 80 em tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 5,2, suplementado com 0,05 g/L de 1 mM CaCl2 e fluoreto de fenilmetanossulfonila (PMSF). O rompimento celular foi conduzido por meio de sonicação. As preparações foram novamente centrifugadas (20.000 x g, 30 min, 4°C) para eliminar fragmentos celulares e recuperar apenas o sobrenadante de sonicação.

[0132] A atividade enzimática dos extratos foi medida utilizando o método de ácido dinitrossalicílico (DNS) de Sumner e Howell, 1935 [22]. Unidade enzimática é definida como a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 μmol de frutose por minuto sob dada temperatura (4°C a 40°C, dependendo do caso, mais precisamente 20°C ou 30°C) e em tampão de acetato de sódio (50 mM), pH 5,2, contendo 0,05 g/L de CaCl2 e 100 g/L de sacarose.

EXEMPLO 3 PURIFICAÇÃO DEDSR-S VARDELΔ4N VARIANTE

[0133] Formas enzimáticas de DSR-S vardel Δ4N foram produzidas durante o cultivo de E. coli TOP10: forma completa vastamente mais importante e formas degradadas diferentes na extremidade C-terminal (Figura 7). A origem destas degradações permanece incerta. A produção no Exemplo 2 atingiu cerca de 5500 U/L de cultivo nos sobrenadantes de sonicação (atividade testada a 30°C).

[0134] Para determinar a quantidade de formas enzimáticas ativas nos extratos, foram produzidos géis de eletroforese sob condições nativas ou de desnaturação. Após a renaturação com gel, ele foi incubado por uma noite a 25°C em tampão de acetato de sódio, 50 mM, pH 5,2, suplementado com 100 g/L de sacarose. As formas enzimáticas ativas sintetizaram polímero em seguida na região para a qual migraram no gel. Reagente (reagente de Schiff) que coloriu especificamente os polímeros sintetizados por dextrana sacarases ativas, após a oxidação de funções álcool primárias do polímero ácido periódico, foi utilizado e os géis foram manchados com esse reagente. Este tipo de gel é denominado zimograma. No caso de DSR-S vardel Δ4N, ou seu mutante SEV663YDA, somente as duas formas com massa molar mais alta foram detectadas como sendo ativas (resultados não exibidos). Entretanto, somente a forma completa continha a etiqueta de tioredoxina e a etiqueta 6xHis.

[0135] A presença da etiqueta 6xHis somente na forma completa de DSR-S vardel Δ4N foi explorada para purificar a enzima por meio de cromatografia de afinidade sobre resina de níquel (Probond Ni- NTA, Invitrogen).

[0136] Purificação foi conduzida a 4°C. Todos os tampões continham concentrações de 50 mM de acetato de sódio, 400 mM de NaCl, diferentes concentrações de imidazol e foram ajustados até pH 7,5. A resina foi equilibrada com oito volumes de tampão que contém concentração de 40 mM de imidazol. A fixação foi conduzida por duas horas com sete volumes de extrato enzimático suplementado com 20 mM de imidazol e ajustada até pH de 7,5. Em seguida, a resina foi lavada com quarenta volumes de 40 mM de tampão imidazol, oito volumes a 60 mM e quatro volumes a 100 mM. Por fim, as proteínas foram eluídas com sete volumes de tampão que possui concentração de 250 mM de imidazol.

[0137] As frações que contêm as proteínas de fusão eluídas foram misturadas e dialisadas por uma noite a 4°C contra tampão que contém concentração de 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2 e 0,05 g/L de CaCl2. A concentração de proteína foi determinada por meio do método Microbradford (Biorad Laboratories) com BSA (albumina de soro bovino) como padrão.

[0138] A pureza da preparação ao final do procedimento foi estimada em cerca de 90% (Figura 8). As proteínas DSR-S vardel Δ4N purificadas apresentaram tendência muito forte a agregar-se, causando a formação de precipitados brancos e limitando os rendimentos obtidos ao final do procedimento (Tabela 1). A atividade específica da preparação foi estimada, entretanto, em 584 U/mg de proteína, que correspondeu à melhor atividade específica descrita de dextrana sacarase recombinante. Como forma de comparação, a atividade específica de DSR-S nativa (expressa por L. mesenteroides NRRL B-512F) foi estimada em cerca de 170 U/mg [24]. TABELA 1PURIFICAÇÃO DEDSR-S VARDELΔ4N POR MEIO DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE SOBRE RESINA DE NÍQUEL

EXEMPLO 4 SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS E SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS

[0139] As construções foram sequenciadas e as sequências correspondentes são exibidas nas Figuras 1 a 5.

EXEMPLO 5 SÍNTESE DE DEXTRAN POR DSR-S VARDELΔ4N, COMPARAÇÃO COM DSR-S DE L. MESENTEROIDES NRRL B-512F

[0140] Dextrana foi sintetizada a partir de DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F, DSR-S recombinante integral (sobrenadante de sonicação) e DSR-S vardel Δ4N (sobrenadante de sonicação e enzima purificada).

CONDIÇÕES DA SÍNTESE E ANÁLISE DOS PRODUTOS FORMADOS

[0141] DSR-S recombinante integral foi construída sobre o mesmo princípio das variantes descritas no Exemplo 1, com primers que foram apropriados para amplificação do gene integral. Células TOP10 de E. coli que conduzem o plasmídeo pBad DSR-S foram cultivadas utilizando o protocolo descrito para DSR-S vardel Δ4N (Exemplo 2). O sobrenadante continha três formas enzimáticas, que incluem duas com massa molar ativa mais alta.

[0142] A forma com maior tamanho continha DSR-S integral; as duas outras formas foram degradadas na sua posição N-terminal (dados não exibidos).

[0143] A atividade de cada preparação enzimática foi determinada a 30°C.

[0144] Sínteses de dextrana foram conduzidas a 25°C a partir de solução de 100 g/L de sacarose, em 50 mM de tampão acetato de sódio que contém 0,05 g/L de CaCl2 e com uma unidade por ml de enzima. A exaustão progressiva de sacarose foi monitorada por meio de análises de HPAEC-PAD (vide abaixo) e a reação foi suspensa após o seu consumo completo, por meio de aquecimento por cinco minutos a 95°C (desnaturação completa das dextrana sacarases mencionadas).

[0145] Os produtos formados foram analisados por meio de HPAEC-PAD (cromatografia de troca de ânions com alto desempenho com detecção amperométrica pulsada) com relação aos mono, di e oligossacarídeos e por meio de HPSEC (cromatografia de exclusão de tamanhos com alto desempenho) com relação aos polissacarídeos.

[0146] O sistema HPAEC-PAD compreendeu coluna 4 x 250 mm Dionex “Carbopack PA100”. Gradiente de 6 a 300 mM de acetato de sódio em 28 minutos em solução de 150 mM de hidróxido de sódio foi aplicado sob velocidade de fluxo de 1 ml/min. Detecção foi conduzida por meio de amperometria utilizando módulo Dionex ED40 com eletrodo de ouro e eletrodo de referência de pH Ag/AgCl.

[0147] O sistema HPSEC foi constituído por duas colunas Shodex OH-Pack SB-805 e SB-802.5 em série, utilizando 0,45 M de nitrato de sódio + 1% (v/v) etileno glicol como solvente em quantidade de 0,3 ml/min. As colunas e colunas prévias foram mantidas a 70°C e as amostras foram filtradas sobre filtros de 0,45 μm (Sartorius) antes da injeção. A detecção foi do tipo refratométrico, acoplado a detector de difusão de luz (Wyatt) para determinar a massa das dextranas.

[0148] As concentrações em peso de glicose, frutose e leucrose (isômero de sacarose) foram determinadas por meio de análises HPAEC-PAD. Os percentuais de resíduos de glicosila da sacarose incorporada à glicose e leucrose livre foram calculados utilizando a fórmula a seguir:

em que [glicosetf] e [leucrosetf] correspondem às concentrações finais de glicose e leucrose ao final da reação e [sacaroset0] corresponde à do substrato inicial (g/L).

[0149] O percentual de resíduos de glicosila incorporados ao polímero de HMW foi determinado por meio de análises de HPSEC utilizando a fórmula:

em que a extensãodextran-tf corresponde à extensão do pico de dextrana, determinado utilizando o cromatograma de HPSEC ao final da reação, e a extensãosacarose-t0 corresponde à do pico do substrato inicial. Para dada concentração, a superfície obtida por meio de refratometria é idêntica, independentemente do açúcar.

[0150] A proporção de unidades de glicosila incorporadas aos polímeros de IMW ou oligossacarídeos para os quais a concentração não poderá ser quantificada diretamente por meio de HPAEC-PAD ou HPSEC foi determinada utilizando a fórmula:

[0151] Os perfis de eluição das quatro dextranas obtidas por meio de HPSEC são exibidos na Figura 9. Diferentes populações podem ser diferenciadas: primeiro pico em eluição após 38 minutos, correspondente ao polímero com alta massa molar (HMW), e segundo pico após 75 minutos, correspondente a frutose, glicose, leucrose (5-O-a-D glicosil frutose) e outros oligossacarídeos com grau de polimerização (DP) de menos de 7, não separados pelo sistema ou em concentrações muito baixas. Entre estes dois picos principais, conforme indicado pelas perturbações de linha base, os produtos com tamanho intermediário (IMW dextranas) também estavam presentes. Estes compostos, com tamanhos muito variáveis, de 1000 a 107Da, foram altamente polidispersos e em concentrações muito baixas, o que explica a sua baixa intensidade sobre o cromatograma. Análises HPAEC-PAD confirmaram, entretanto, a sua presença (resultados não exibidos).

[0152] A quantidade relativa de unidades de glicosila derivadas de sacarose e incorporadas aos diferentes produtos encontra-se relacionada abaixo na Tabela 2. O rendimento de síntese para dextrana HMW representa cerca de 60% das unidades glicosila para cada uma das preparações. A transferência de unidades glicosila para água (glicose) ou frutose (leucrose) representa menos de 8%, enquanto a síntese de dextranas com tamanho intermediário (IMW) representou 25% a 32% das unidades glicosila transferidas. Todas as formas recombinantes de DSR-S tenderam a sintetizar mais dextranas com tamanho intermediário. As análises de HPSEC também demonstraram que a enzima nativa aparentemente sintetiza duas populações diferentes de dextrana, ao contrário de apenas uma para as enzimas recombinantes. A massa molar de dextranas HMW foi determinada por meio de difusão de luz e estimada como sendo de mais de 107g/mol para todas as amostras (limite de exclusão das colunas utilizadas). TABELA 2 PERCENTUAL DE UNIDADES DE GLICOSILA INCORPORADAS AOS VÁRIOS PRODUTOS DERIVADOS DA SÍNTESE DE DEXTRANA A 25°C E 100 G/L DE SACAROSE, PARA AS QUATRO PREPARAÇÕES DE DSR-S MENCIONADAS

ESTRUTURA DE DEXTRANAS FORMADAS

[0153] A estrutura da dextrana produzida por DSR-S vardel Δ4N (purificada ou de outra forma) foi comparada com a de dextranas sintetizadas a partir de DSR-S recombinante integral e DSR-S nativa. Estas estruturas foram determinadas por meio de ressonância magnética nuclear (NMR 1H) utilizando Brucker AC 300 a 85°C e com frequência de obtenção de 300,13 MHz. O tempo de obtenção foi de três segundos, com 32 a 64 passagens. As dextranas foram inicialmente separadas da frutose coproduzida por meio de precipitação por três vezes com um volume de etanol absoluto, recuperadas por meio de centrifugação, lavadas com água destilada e secas por congelamento. As amostras foram dissolvidas em D2O até concentração de 6 mg/ml.

[0154] Os espectros de NMR são exibidos na Figura 10. Somente ligações α-1,6 foram detectadas. Análise NMR de carbono 13 também foi conduzida sobre a dextrana sintetizada por DSR-S vardel Δ4N purificada. O espectro obtido foi idêntico aos publicados para a dextrana de L. mesenteroides NRRL B-512F e DSR-S integral [3].

[0155] Estes polímeros também foram digeridos com endodextranase de Chaetomium gracileconduzida por dezesseis horas a 37°C com três unidades de enzima por ml de meio de síntese. Os produtos de digestão foram analisados por meio de HPAEC-PAD (Figura 11). Os perfis de digestão obtidos foram idênticos para as quatro dextranas analisadas, o que confirma que todas elas continham pelo menos 95% de ligações α-1,6.

[0156] As exclusões realizadas nas posições N e C-terminais da DSR-S para construir a variante DSR-S vardel Δ4N, portanto, não apresentam influência significativa sobre a atividade inicial de DSR-S ou sobre a parte de unidades de glicosila derivadas de sacarose incorporada à síntese da dextrana HMW, o tamanho ou a estrutura do polissacarídeo.

COMPORTAMENTO REOLÓGICO DE DEXTRANAS FORMADAS

[0157] O comportamento reológico das quatro dextranas foi analisado utilizando sistema de cone plano (AR 1000, TA Instruments) equipado com cone com 4 cm de diâmetro em ângulo de 3,59° e velocidades de cobertura de 0,01 a 100 s-1. As medições foram conduzidas a 25°C. Experimentos dinâmicos foram conduzidos no domínio linear de 0 a 10 Pa com deformação de 8% para a dextrana sintetizada por DSR-S nativo de L. mesenteroides NRRL B-512F (controle), 3% para a sintetizada pelo DSR-S recombinante integral, 5% para a sintetizada por extrato não purificado de DSR-S vardel Δ4N e 0,4% para a sintetizada por DSR-S vardel Δ4N purificado. O módulo de rigidez complexo é definido pela relação: G» = G’(o) + iG».

[0158] O módulo de conservação de energia G’(o) é maior quando a amostra for predominantemente elástica ou altamente estruturada. O módulo de perda G”(o) representa a energia dissipada durante a deformação. Predominantemente, amostras viscosas possuem alto G”(o).

[0159] Estas análises reológicas produziram resultados inteiramente originais (Figura 12). Conforme descrito na literatura, DSR-S nativa sintetizou dextrana com comportamento newtoniano [25].

[0160] Os extratos de DSR-S recombinantes integrais e extratos de DSR-S vardel Δ4N não purificados produziram soluções viscosas com comportamento idêntico (viscosidade cerca de dez vezes mais alta que a de dextrana produzida por enzima nativa). Quando observados a olho nu, eles também apresentaram comportamento filamentoso razoavelmente pronunciado. Além disso, após a aplicação de novas tensões de corte, o comportamento dos mencionados polímeros alterou-se de tipo de solução para tipo de gel, o que é propriedade inovadora que foi identificada para este tipo de biopolímero. A dextrana produzida pela enzima nativa, por outro lado, não foi filamentosa e seu comportamento foi completamente reversível após a aplicação de segunda série de tensões (Figura 12A).

[0161] A enzima purificada sintetizou diretamente polímero que possui as propriedades de gel altamente estruturado (Figura 12B, módulo G’ muito maior que G”), retendo as suas características ao longo de uma série de temperaturas de 10°C a 70°C (resultados não exibidos). Este comportamento é completamente diferente da enzima nativa.

[0162] Apenas a preparação de DSR-S vardel Δ4N purificada continha apenas uma dextrana sacarase ativa no extrato. DSR-S nativa é conhecidamente propensa a problemas de degradação proteolítica [26] e os métodos de purificação desenvolvidos não poderão resolver aquele problema [27, 28, 29]. DSR-S recombinante integral utilizada no teste continha pelo menos duas formas enzimáticas ativas, como a preparação de DSR-S vardel Δ4N antes da purificação. As formas degradadas de DSR-S nativa, DSR-S recombinante integral e DSR-S vardel Δ4N, entretanto, são completamente diferentes. Compreende-se atualmente que a cooperação entre essas diferentes formas enzimáticas ativas presentes no meio poderá ser a origem de modificações para as cadeias de dextrana, causando estas diferenças de comportamento.

EXEMPLO 6 SÍNTESE DE ISOMALTOSE A PARTIR DE SACAROSE

[0163] Foi estudada a capacidade de DSR-S vardel Δ4N mutante SEV663YDA de sintetizar apenas isomaltose (IMO com DP 2) a partir de sacarose para prejuízo de dextranas com alta massa molar.

[0164] O mutante foi purificado por meio de cromatografia de afinidade utilizando o procedimento descrito para DSR-S vardel Δ4N fornecida no Exemplo 3.

[0165] A atividade foi testada a 30°C.

[0166] Com atividade específica de apenas 9 U/mg, as mutações de SEV663YDA induziram efeitos severos sobre a atividade de DSR-S (perda de 98% da taxa de consumo inicial de sacarose). Esta atividade específica, entretanto, é equivalente à de amilosucarase recombinante de N. polysaccharea [32], que foi amplamente estudada pelo seu potencial de aplicação.

[0167] As caracterizações que foram conduzidas demonstram a viabilidade da produção de isomaltose por esta DSR-S mutante, enquanto a enzima selvagem produz apenas dextranas com alta massa molar. Foram conduzidas sínteses a 25°C em tampão que contém concentração de 50 mM de acetato de sódio sob pH 5,2 e 0,05 g/L de CaCl2, 1 U/ml de enzima purificada e utilizando 100 g/L de sacarose como o único substrato, ou por meio de reação de aceitador a partir de 100 g/L de sacarose e 50 g/L de glicose. A exaustão de sacarose foi monitorada por meio de análises HPAEC-PAD (vide Exemplo 4 para condições de análise) e as reações foram interrompidas após o consumo completo.

[0168] A produção de isomaltose atingiu, portanto, rendimento de 47% utilizando sacarose como o único substrato (Tabela 3 e Figura 13), rendimento que foi equivalente ao obtido pela reação de aceitador. A adição de aceitador exógeno, portanto, não foi necessária. Traços de isomaltotriose, maltose ou nigerose (não separados pelo sistema) também foram identificados (Figura 13), bem como a presença de outros oligossacarídeos com DP de menos de 7 e com estrutura desconhecida. TABELA 3 SÍNTESE DE ISOMALTOSE POR DSR-S VARDELΔ4N MUTANTE SEV663YDA A PARTIR DE 100 G/L DE SACAROSE ISOLADA OU POR MEIO DE REAÇÃO DE ACEITADOR COM 50 G/L DE GLICOSE CONCENTRAÇÕES DE DIFERENTES PRODUTOS PRESENTES AO FINAL DA REAÇÃO

2Calculado a partir de resíduos de glicosila derivados de glicose exógena e sacarose adicionados ao meio.

[0169] Desta forma, neste Exemplo, a produção de isomaltose atingiu rendimento de 47%. Atualmente, este é o primeiro método que envolve uma única enzima para sintetizar isomaltose a partir de sacarose; todos os estudos anteriores são ligados à degradação de amido por um coquetel de a- amilases e glicosidases [11], ou à ação conjunta de dextrana sacarase e dextranase [30]. Além disso, sacarose é substrato barato e amplamente disponível e a frutose liberada durante as sínteses constitui coproduto cujo valor pode ser explorado separadamente.

EXEMPLO 7 SÍNTESE DE DEXTRAN POR DSR-S VARDELΔ3

[0170] Diferentes formas enzimáticas de DSR-S vardel Δ3 foram produzidas durante o cultivo de E. coli TOP10. A forma completa, entretanto, encontrava-se em grande parte na maioria e os zimogramas produzidos (vide Exemplo 3) demonstraram que somente a forma integral era ativa.

[0171] A temperatura de atividade ideal para esta variante foi de 20°C. Desta forma, foram conduzidos testes de atividade sob esta temperatura. A produção de DSR-S vardel Δ3 de acordo com o Exemplo 2 atingiu cerca de 320 U/I de cultivo.

[0172] Sínteses de dextrana foram conduzidas a 20°C em tampão contendo 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2 e 0,05 g/L de CaCl2, 100 g/L de sacarose e 1 U/ml de extrato de DSR-S vardel Δ3 não purificado. O extrato de DSR-S vardel Δ3 pôde ser purificado por meio de cromatografia de afinidade sobre resina de níquel utilizando o protocolo descrito para DSR-S vardel Δ4N no Exemplo 3. Como o sobrenadante da sonicação continha apenas uma única forma enzimática de dextrana sacarase e E. coli não produziu outra enzima que pudesse consumir a sacarose, entretanto, a purificação da variante não constituiu requisito prévio para a caracterização rigorosa das suas propriedades. Como forma de comparação, as sínteses de dextrana foram conduzidas sob as mesmas condições de DSR-S vardel ΔN (não purificada). O desaparecimento da sacarose foi monitorado por meio de análises HPAEC-PAD e as reações foram suspensas (cinco minutos, 95°C) após exaustão total.

[0173] Os produtos sintetizados foram analisados e quantificados por meio de HPAEC-PAD e HPSEC utilizando as condições descritas no Exemplo 4. Para as análises de HPSEC, o tamanho das dextranas foi estimado utilizando dextranas disponíveis comercialmente com tamanhos de 2 x 106, 503 x 103, 70.000, 10.000 Da, maltoheptose e glicose (Sigma).

[0174] Como se pode observar na Figura 13, a 20°C a variante DSR-S vardel Δ3 sintetizou duas populações de polímeros; população principal de dextrana HMW com tamanho de 2 x 106Da, que representa cerca de 39% dos resíduos de glicosila derivados de sacarose (Tabela 4) e segunda população de 1300 a 52.000 Da, centralizada no pico mais alto em cerca de 10.000 Da (cerca de 25% de resíduos de glicosila). Esta é a primeira vez em que segunda população de dextrana que é claramente visível no cromatograma de HPSEC foi observada para variante de DSR-S.

EFEITO DE TEMPERATURA SOBRE O PERFIL DOS PRODUTOS

[0175] Sínteses de dextrana também foram conduzidas sob temperatura de 10°C, ainda com buffer contendo 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2, 0,05 g/L de CaCl2 e 1 U/ml de enzima (atividade testada a 20°C). Exaustão de sacarose foi monitorada por meio de análises HPAEC- PAD e as reações foram suspensas (cinco minutos, 95°C) após o seu consumo total.

[0176] Como se pode observar na Figura 14, a 10°C a variante DSR-S vardel Δ3 sintetizou população de dextrana que era muito diferente da produzida a 20°C. O polímero principal (cerca de 44%) formado àquela temperatura apresentou massa molar na faixa de 7000 e 1,7 x 105Da centralizada no pico em cerca de 40.000 Da. TABELA4 PERCENTUAL DE UNIDADES DE GLICOSILA INCORPORADAS EM DIFERENTES PRODUTOS SINTETIZADOS POR DSR-S VARDELΔ4N E DSR-S VARDELΔ3 A 10°C E 20°C A PARTIR DE 100 G/L DE SACAROSE

1 nd: não detectado 2 grau de polimerização calculado a partir do tempo de retenção estimado em limite inferior de pico de dextrana de 10.000 Da.

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE SACAROSE

[0177] Foram testadas quatro concentrações crescentes de sacarose (100, 150, 200 e 250 g/L) para as sínteses de dextrana 3 (1 U/ml). O consumo total conduzidas a 20ºC e 10ºC com DSR-S vardel de sacarose foi monitorado por meio de análises HPAEC-PAD e as sínteses foram suspensas após o seu consumo total (menos de 48 horas).

[0178] Para as duas temperaturas, o aumento inicial da concentração de substrato incentivou a síntese de dextranas com baixa massa molar. A 20ºC, a síntese de dextrana com 10.000 Da foi alterada, portanto, de rendimento de 25% para 48% ao mudar de 100 para 250 g/L de sacarose inicial. A 10ºC e a partir de 250 g/L, a síntese de dextrana HMW foi completamente abolida e a de dextrana com a população principal com massa molar centralizada em cerca de 40.000 Da atingiu convenientemente rendimento de 69%.

[0179] Para todas as dextranas sintetizadas por DSR-S vardel Δ3, a 10°C e 20°C, e de 100 a 250 g/L de sacarose, os perfis de digestão de endodextranase (vide Exemplo 5) conduzidos confirmaram que a especificidade de união de DSR-S foi inalterada (os mesmos perfis de oligossacarídeos detectados por HPAEC-PAD com DSR-S vardel Δ4N, ou seja, pelo menos 95% de ligações α-1,6).

EXEMPLO 8 SÍNTESE DE DEXTRANA POR DSR-S NÚCLEO VARDEL E DSR-S NÚCLEOΔA

[0180] As variantes DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA também foram levemente degradadas durante a expressão por E. coli TOP sob as condições descritas no Exemplo 2. Da mesma forma que para o caso da variante DSR-S vardel Δ3, entretanto, somente a forma integral, que era a vasta maioria, era ativa de acordo com o zimograma (resultados não exibidos).

[0181] A temperatura de atividade ideal para estas variantes também foi de 20°C. A produção atingiu, portanto, 38 e 180 U/L de cultivo para DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA, respectivamente.

[0182] Sínteses de dextrana foram conduzidas a 20°C e 10°C utilizando 100 a 250 g/L de sacarose em tampão que contém 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2, 0,05 g/L de CaCl2 e 1 U/ml de extrato enzimático (não purificado). O consumo de sacarose foi monitorado por meio de análises de HPAEC-PAD e as sínteses foram suspensas (5 min, 95°C) após completa exaustão (menos de 48 horas). Os produtos formados foram analisados por meio de HPAEC-PAD e HPSEC e a sua concentração foi quantificada conforme descrito no Exemplo 5.

[0183] A Figura 15 exibe o perfil dos produtos sintetizados a 20°C pelas duas variantes (cromatograma de HPSEC). Pode-se observar claramente que, com estas variantes e ao contrário de DSR-S vardel Δ4N e DSR-S vardel Δ3, a principal população de dextrana formada possuía massa molar de cerca de 10.000 Da com a base do pico entre 1300 e 52.000 (a meia altura entre 5000 e 22.000). Com a variante DSR-S núcleo ΔA, a síntese de dextrana HMW foi completamente abolida (Tabela 5). Redução da temperatura para 10°C poderá aumentar os rendimentos de dextrana com cerca de 10.000 Da sem diferença significativa de tamanho, como foi o caso com DSR-S vardel Δ3 (Tabela 5). A síntese de dextrana com a variante DSR-S núcleo ΔA atingiu, portanto, rendimento de 75%. Rendimento equivalente foi obtido com a variante DSR-S núcleo vardel quando a concentração inicial de sacarose foi de 250 g/L (resultados não exibidos). TABELA 5 PERCENTUAL DE UNIDADES DE GLICOSILA INCORPORADAS A DIFERENTES PRODUTOS SINTETIZADOS POR DSR-S NÚCLEO VARDEL E DSR-S NÚCLEOΔA A 10°C E 20°C A PARTIR DE 100 G/L DE SACAROSE

1 nd: não detectado. 2 grau de polimerização calculado a partir do tempo de retenção estimado no limite inferior de pico de 10.000 Da.

[0184] Análise HPAEC-PAD da dextrana sintetizada a partir de 100 g/L de sacarose a 20°C pelas diferentes variantes demonstrou a polidispersão muito alta do produto (Figura 16), contendo isomalto- oligossacarídeos com DP 2 a DP de cerca de 60 para DSR-S núcleo ΔA em particular.

[0185] Para todas as dextranas sintetizadas por DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA a 10°C e 20°C e utilizando 100 a 250 g/L de sacarose, os perfis de digestão de endodextranase (vide Exemplo 5) conduzidos confirmaram que a especificidade de união de DSR-S foi inalterada (mesmo os perfis de oligossacarídeos detectados por HPAEC-PAD em comparação com DSR-S vardel Δ4N, portanto pelo menos 95% de ligações α- 1,6).

EXEMPLO9 REAÇÃO DE ACEITADOR COM GLICOSE

[0186] Reações de aceitador foram conduzidas a 20°C com razão de sacarose/glicose de 2 (100 g/L de sacarose, 50 g/L de glicose), 1 U/mL de extrato de DSR-S vardel Δ4N, DSR-S vardel Δ3, DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA em tampão que contém 50 mM de acetato de sódio sob pH 5,2 e 0,05 g/L de CaCl2. O consumo total de sacarose foi monitorado por meio de HPAEC-PAD e as reações foram suspensas após a sua completa exaustão. Todas as variantes sintetizaram isomalto-oligossacarídeos (IMO) com DP 2 a cerca de 30, para prejuízo da síntese de polímero com DP mais alto.

[0187] Os rendimentos obtidos, entretanto, foram mais altos para as variantes truncadas de unidades A. Desta forma, a produção de IMO atingiu 52% no caso de DSR-S vardel Δ3 e 58% para DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔA, contra 47% no caso de DSR-S vardel Δ4N. A distribuição de oligossacarídeos também foi modificada (Figura 17).

[0188] Para DSR-S vardel Δ3, a proporção entre IMO com DP 2 a DP 15 foi menor que a de produtos sintetizados por DSR-S vardel Δ4N. A situação reverteu-se para IMOs com DP de mais de 15.

[0189] De forma similar, os mutantes DSR-S núcleo vardel e DSR- S núcleo ΔA demonstraram melhor desempenho para a síntese de IMO com alto DP que DSR-S vardel Δ4N ou DSR-S nativo (DP essencialmente 2 a 15): a produção de IMO com DP 12 a DP 27 foi duas a cinco vezes mais alta com estas duas variantes (de acordo com a razão entre as extensões obtidas por meio de HPAEC-PAD). REFERÊNCIAS [1] Monsan, P., Bozonnet, S., Albenne, C., Joucla, G., Willemot, R. M. e Remaud-Simeon, M. 2001. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria. International Dairy Journal 11, 675-685. [2] Coutinho, P. M. e Henrissat, B. 1999, Carbohydrate-Active Enzymes. Servidor, http://afmb.cnrs-mrs.fr/-cazy/CAZYlindex.html [3] Monchois, V., Remaud-Simeon, M., Russell, R. R., Monsan, P. e Willemot, R. M. 1997. Characterization of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F dextranasucrase (DSR-S) and identification of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, 465. 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Claims

1. SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, caracterizada por consistir: (a) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1; ou (b) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 21.

2. VETOR, caracterizado por conter uma sequência de nucleotídeos conforme definida na reivindicação 1.

3. VETOR, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus e um bacteriófago.

4. VETOR, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser um plasmídeo.

5. DEXTRANA SACARASE TRUNCADA E/OU MUTADA, caracterizada por consistir: (a) na sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 6, desde que conserve a sua atividade enzimática de dextrana sacarase; ou (b) na sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 26.

6. PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada por consistir em, na posição N-terminal e/ou C-terminal, uma etiqueta de proteína selecionada a partir do grupo que consiste em etiqueta de poli-His, etiqueta de epítopo c-myc, etiqueta HA, etiqueta T7, etiqueta S, etiqueta de trpE, etiqueta de avidina/estreptavidina, etiqueta de estafilococo A, etiqueta de proteína G, etiqueta de di-hidrofolato redutase, etiqueta de domínio de união de celulose, etiqueta de policisteína, etiqueta de polifenilalanina, etiqueta de GST bacteriano, etiqueta de proteína de união de maltose, etiqueta de tioredoxina, etiqueta de beta-galactosidase e etiqueta de proteína VSV e a sequência de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25 e SEQ ID N° 26.

7. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por uma etiqueta de tioredoxina ser fundida à sequência de ácidos nucleicos N-terminal e por uma etiqueta 6xHis ser fundida à extremidade 3’ da sequência de ácidos nucleicos.

8. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE DEXTRANA SACARASE MUTADA E/OU TRUNCADA, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (a) cultivo de células hospedeiras transformadas por um vetor sob condições que permitam a expressão de dextrana sacarase; (b) isolamento da dita dextrana sacarase do meio de cultura; e (c) opcionalmente, purificação da dextrana sacarase isolada, em que dito vetor contém uma sequência de nucleotídeos que consiste: (a)’ na sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1; ou (b)’ em uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 17, SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19, SEQ ID N°: 20 e SEQ ID N° 21.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo vetor ser selecionado a partir do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um vírus e um bacteriófago.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo vetor ser um plasmídeo.

11. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE DEXTRANAS E/OU ISOMALTO-OLIGOSSACARÍDEOS com massa molar controlada, caracterizado por compreender a reação de uma dextrana sacarase truncada e/ou mutada que consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25 e SEQ ID N° 26 com pelo menos sacarose e, opcionalmente, pelo menos um aceitador.

12. USO DE UMA DEXTRANA SACARASE TRUNCADA E/OU MUTADA, que consiste: (a) na sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 6, desde que conserve a sua atividade enzimática de dextrana sacarase; ou (b) em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 25 e SEQ ID N° 26, caracterizado por ser na fabricação de (i) isomaltose com 342 Da, (ii) isomalto-oligossacarídeos com 342 a 5.000 Da, (iii) dextranas com tamanho controlado de 1.300 a 52.000 Da centralizadas em 10.000 Da, (iv) dextranas com tamanho controlado de 7000 a 1,7 x 105Da centralizadas em 40.000 Da e (v) dextranas com alta massa molar de 2 x 106Da.