BRPI0706981A2

BRPI0706981A2 - seqüências de nucleotìdeos, vetor, células hospedeiras transformadas por vetor, proteìna codificada, dextrana sacarase truncada, proteìna de fusão, método de preparação de dextrana sacarase, método de produção de dextranas e/ou isomalto-oligossacarìdeos, dextrana, isomalto-oligossacarìdeos, composição, composição farmacêutica ou alimetìcia, composiçaõ de texturização, uso de dextrana sacarase, uso de dextrana e uso de dextrana ou imo

Info

Publication number: BRPI0706981A2
Application number: BRPI0706981-2A
Authority: BR
Inventors: Pierre Monsan; Magali Remaud-Simeon; Gabrielle Potocki-Veronese; Claire Moulis
Original assignee: Centre Nat Rech Scient; Agronomique Inst Nat Rech; Inst Nac Des Sciences Appliquees De Toulouse
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2011-04-12
Also published as: ES2800724T3; PT3103874T; WO2007091178A3; EP2365084B1; FR2897069B1; US10017748B2; JP5753340B2; US20090258389A1; EP3103874B1; AU2007213436A1; FR2897069A1; US9399765B2; EP1981914A2; ES2585203T3; PT2365084T; WO2007091178A2; US8263380B2; US20110178289A1; JP2009525745A; BRPI0706981B1

Abstract

SEQUêNCIAS DE NUCLEOTIDEOS, VETOR, CéLULAS HOSPEDEIRAS TRANSFORMADAS POR VETOR, PROTEINA CODIFICADA, DEXTRANA SACARASE TRUNCADA, PROTEINA DE FUSãO, MéTODO DE PREPARAçãO DE DEXTRANA SACARASE, MéTODO DE PRODUçãO DE DEXTRANAS EIOU ISOMALTO-OLIGOSSACARIDEOS, DEXTRANA, ISOMALTO-OLIGOSSACARIDEOS, COMPOSIçãO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA OU ALIMENTICIA, COMPOSIçãO DE TEXTURIZAçãO, USO DE DEXTRANA SACARASE, USO DE DEXTRANA E USO DE DEXTRANA OU IMO A presente invenção refere-se a processo recombinante de produção de dextrana sacarases truncadas e/ou que sofreram mutação, conservando ao mesmo tempo a sua atividade enzimática e/ou a sua especificidade na síntese das uniões <244>-1 ,6. Mais precisamente, a presente invenção refere-se a seqúências de ácidos nucleicos de dextrana sacarasestruncada <244>e/ou que sofreram mutação, vetores que contêm as mencionadas seqúências de ácidos nucíeicos e células hospedeiras transformadas por seqúéncias que codificam dextrana sacarases truncadas e/ou que sofreram mutação. Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se a método de produção, de forma recombinante, de dextrana sacarases truncadas e/ou que sofreram mutação que conservam a sua atividade enzimática e/ou que conservam a sua especificidade na síntese de uniões c~-1 ,6 e podem produzir, entretanto, a partir de sacarose, dextranas com alta massa molar e com propriedades reológicas modificadas, em comparação com as propriedades de dextrana obtida com a enzima nativa nas mesmas condições e isomalto- oligossacarídeos com massa molar controlada e dextranas. As dextranas e IMO de acordo com a presente invenção podem ser utilizados, nomeadamente, como agentes de texturização ou como prebióticos.

Description

"SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS, VETOR, CÉLULAS HOSPEDEIRASTRANSFORMADAS POR VETOR, PROTEÍNA CODIFICADA, DEXTRANASACARASE TRUNCADA, PROTEÍNA DE FUSÃO, MÉTODO DEPREPARAÇÃO DE DEXTRANA SACARASE, MÉTODO DE PRODUÇÃO DEDEXTRANAS E/OU ISOMALTO-OLIGOSSACARÍDEOS, DEXTRANA,ISOMALTO-OLIGOSSACARÍDEOS, COMPOSIÇÃO, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA OU ALIMENTÍCIA, COMPOSIÇÃO DE TEXTURIZAÇÃO,USO DE DEXTRANA SACARASE, USO DE DEXTRANA E USO DEDEXTRANA OU IMO"

A presente invenção refere-se a processo recombinante deprodução de dextrana sacarases truncadas e/ou que sofreram mutação,conservando ao mesmo tempo a sua atividade enzimática e/ou conservando asua especificidade para a síntese de uniões a-1,6. Mais precisamente, apresente invenção refere-se a seqüências de ácidos nucleicos de dextranasacarases truncadas ou que sofreram mutação, vetores que contêm asmencionadas seqüências de ácidos nucleicos e células hospedeirastransformadas por seqüências que codificam dextrana sacarases truncadas ouque sofreram mutação. Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se amétodo de produção, de forma recombinante, de dextrana sacarases truncadase/ou que sofreram mutação que conservam a sua atividade enzimática e/ouconservam a sua especificidade para a síntese de uniões a-1,6 no produto finale métodos de produção de dextranas ou isomalto-oligossacarídeos, em umaúnica etapa, com massa molar controlada e dextranas com propriedadesreológicas modificadas, especialmente em comparação com as propriedadesde dextranas obtidas com a enzima nativa.

Campo da Invenção

Dextranas são α-D-glucanos com várias estruturas, quecompreendem unidades de glicosila, das quais mais de 50% contêm uniões a-1,6 na cadeia principal e ramificações a-1,2, a-1,3 e/ou a-1,4 [1], As enzimasque produzem esses dextranas a partir de sacarose são denominadas dextranasacarases e pertencem à família de glicosídeo hidrolases 70 [2], Durante areação, frutose derivada da sacarose é liberada e pode ser aprimorada emoutro local. Dextrana sacarases são produzidas por bactérias lácticas dosgêneros Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus [1].

Dextrana sacarase (DSR-S) de Leueonostoe mesenteroidesNRRL B-512F contém 1527 aminoácidos [3]. Esta enzima catalisa a síntese dehomopolímeros de glicose com mais de 95% de uniões α-1,6. A produção dedextrana pode ser novamente direcionada para a de oligossacarídeos ouconjugados glicosilados por meio da adição de aceitador apropriado à misturade reação [4],

O número de aplicações industriais para dextranas e derivados dedextranas está aumentando, particularmente para dextranas com tamanhoespecífico. Dextranas com tamanho na faixa de 70.000 a 100.000 Da sãoutilizadas, por exemplo, como substituto de plasma [5, 31]. Além disso,dextrana de 40.000 Da é utilizada para aumentar o fluxo sangüíneo, maisprovavelmente por meio da redução da viscosidade do sangue e inibição daagregação de eritrocitários [6,8], Após a sulfatação, dextranas menores comcerca de 10.000 daltons, por exemplo, são utilizadas como transportadorespara ferro [7] ou anticoagulantes [8], Estes compostos podem possuirpropriedades antivirais [9, 10].

Além disso, derivados de dextrana reticulados são utilizados hámuito tempo no campo de separação molecular; suportes cromatográficos como nome comercial Sephadex® vêm sendo vendidos desde 1961 [6].

Adicionalmente, a União Européia aprovou recentemente o uso dedextrana como ingrediente alimentício em produtos de confeitaria quandocontiverem mais de 95% de uniões a-1,6 e possuírem massa molar de mais de2 χ 106 Da [15].

Dextrana sacarase pode também produzir isomalto-oligossacarídeos (IMO) por meio de reação de aceitação. Reações deaceitação conduzidas por glucana sacarases consistem de transferência deresíduos de glucosila de sacarose para outras moléculas adicionadas ao meiode reação. É de interesse comercial crescente, particularmente no Japão, ondea demanda por isomalto-oligossacarídeos representa cerca de quinze miltoneladas por ano [11]. Esses IMOs pequenos (DP 2 a 6) são utilizados emprodutos de confeitaria, para bebidas, em saquê, temperos, confeitaria eadoçantes anticariogênicos. Também se demonstrou que os mencionadosIMOs possuem propriedades prebióticas que são úteis com relação à floraintestinal e/ou vaginal [12, 13]. Estas propriedades aparentemente variam como tamanho dos IMOs e são favorecidas por altos graus de polimerização [14].

A única fonte comercial e habitual de dextrana consiste do cultivode L. mesenteroides NRRL B-512F com sacarose, que gera a formação depolímeros com alta massa molar de cerca de 108 Da. A síntese direta dedextranas menores de 10.000 a 100.000 Da atualmente é impossível.Dextranas são atualmente produzidas convencionalmente por meio de hidróliseácida de polímeros nativos com alta massa molar seguida por fracionamentoutilizando solventes orgânicos. Esta segunda etapa é, entretanto, conhecidapelos seus baixos rendimentos [19].

Do ponto de vista comercial, IMOs com DP 2 a 6 não sãoproduzidos por reação de aceitação com dextrana sacarase DSR-S e glicosedevido aos baixos rendimentos de reação, mas a partir de hidrolisatos deamido e mistura de α-amilases e glucosidases [11].

Monchois et al [16] descrevem exclusões carbóxi-terminais dadextrana sacarase de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F e concluemque o papel do domínio C-terminal é de facilitar a transferência de dextran eoligossacarídeos além do local ativo.

A Patente Norte-Americana n° US-A-5.229.277 descreveprocesso de produção de polímeros de dextran que possuem massa molarbaixa homogênea utilizando Leuconostoc mesenteroides e microorganismomutante de Lipomyces starkeyi ATCC 74054, que é levedura que possuiatividade de dextranase, enzima específica para a hidrólise de uniões oc-1,6 dedextrana. Este método necessita de condições de cultivo específicas e duraçãoe temperatura precisamente reguladas, de forma que a atividade de dextranasereduza a massa molar das dextranas. Polímeros de dextrana produzidos pormeio daquele método possuem massa molar na faixa de 40.000 a 150.000 Da.

O acima demonstra que existe necessidade de produção dedextranas com massa molar de cerca de 10.000 a 100.000 Da utilizandométodo mais rápido com melhor rendimento, que particularmente não necessitede hidrólise ácida nem fracionamento.

A presente invenção refere-se a dextrana sacarases produzidasde forma recombinante, que são truncadas e/ou sofrem mutação, conservandoao mesmo tempo a sua atividade enzimática e/ou conservando a suaespecificidade para a síntese de uniões a-1,6, ou variantes truncadas dedextrana sacarase que produzem dextranas com massa molar controlada. Maisprecisamente, elas conservam a especificidade de união de DSR-S nativa e/ouconservam a sua especificidade de síntese de uniões a-1,6 e, a partir desacarose, produzem dextranas com alta massa molar e interessantespropriedades de texturização e/ou dextranas e IMOs com massa molarcontrolada.

A presente invenção também se refere ao fornecimento deseqüências de ácido nucleico de dextrana sacarase truncada e/ou que sofreumutação, vetores e células hospedeiras transformadas pelos mencionadosvetores, bem como seqüências de aminoácidos de dextrana sacarasestruncadas e/ou que sofreram mutação.

Particularmente, como será evidente a partir dos Exemplos, certasdextrana sacarases produzem polímeros com propriedades de texturizaçãointeressantes, ou seja, substancialmente superiores às do polímero produzidopela enzima nativa; outros produzem dextranas e isomalto-oligossacarídeoscom massa molar controlada. Isomaltose é produzida por pelo menos umadextrana sacarase truncada que sofreu mutação.

Aspectos adicionais da presente invenção tornar-se-ão evidentesa partir do relatório descritivo a seguir e dos Exemplos ou realizaçõespreferidas.

Descrição Resumida da Invenção

Em primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a seqüênciade nucleotídeos que consiste essencialmente ou consiste de seqüência denucleotídeos de acordo com a Figura 1 (SEQ ID N0 1), seqüência denucleotídeos de acordo com a Figura 2 (SEQ ID N0 2), seqüência denucleotídeos de acordo com a Figura 3 (SEQ ID N0 3), seqüência denucleotídeos de acordo com a Figura 4 (SEQ ID N0 4), seqüência denucleotídeos de acordo com a Figura 5 (SEQ ID N0 5), seqüênciacomplementar de uma das seqüências com SEQ ID N0 1, 2, 3, 4 ou 5 ouseqüência que se hibridiza com seqüência com SEQ ID N0 1, 2, 3, 4 ou 5 sobcondições de hibridização estringente, desde que conserve a atividadeenzimática de dextrana sacarase.

Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se a seqüênciasde nucleotídeos de dextrana sacarase que consistem essencialmente ouconsiste de seqüência de nucleotídeos selecionada a partir do fragmento deSEQ ID N0 1 da posição 373 até a posição 4269 (SEQ ID N0 17), o fragmentoda seqüência SEQ ID N0 2 da posição 373 até a posição 4005 (SEQ ID N018),o fragmento da seqüência SEQ ID N0 3 da posição 373 até a posição 3408(SEQ ID N0 19), o fragmento da seqüência SEQ ID N0 4 da posição 373 até aposição 3018 (SEQ ID N0 20) e o fragmento da seqüência SEQ ID N0 5 daposição 373 até a posição 4269 (SEQ ID N0 21).

Ela também se refere a seqüências de nucleotídeos queconsistem essencialmente ou consistem de seqüência de nucleotídeosselecionada a partir de seqüência de nucleotídeos complementar do fragmentode SEQ ID N0 1 do nucleotídeo na posição 373 até o da posição 4269,seqüência de nucleotídeos complementar do fragmento de SEQ ID N0 2 donucleotídeo na posição 373 até o da posição 4005, seqüência de nucleotídeoscomplementar do fragmento de SEQ ID N0 3 do nucleotídeo na posição 373 atéo da posição 3408, seqüência de nucleotídeos complementar do fragmento deSEQ ID N0 4 do nucleotídeo na posição 373 até o da posição 3018 e seqüênciade nucleotídeos complementar ao fragmento de SEQ ID N0 5 do nucleotídeo naposição 373 até o da posição 4269.

Ela também se refere a seqüências de nucleotídeos que sehibridizam sob condições estringentes com seqüência de nucleotídeosselecionada a partir do fragmento de seqüência SEQ ID N0 1 da posição 373até a posição 4269, fragmento de seqüência SEQ ID N0 2 da posição 373 até aposição 4005, fragmento de seqüência SEQ ID N0 3 da posição 373 até aposição 3408, fragmento de seqüência SEQ ID N0 4 da posição 373 até aposição 3018 e fragmento de seqüência SEQ ID N0 5 da posição 373 até aposição 4269, desde que conserve a atividade enzimática de dextranasacarase e as mencionadas seqüências de nucleotídeos que nela se hibridizamcontenham o mesmo número de nucleotídeos e hibridizem-se ao longo de todoo comprimento do fragmento.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se aseqüências de nucleotídeos que codificam proteína que consisteessencialmente ou consiste de seqüências de aminoácidos consecutivas dequalquer dentre SEQ ID N0 6 a 10 ou 22 a 26.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores,tais como plasmídeos, e células hospedeiras transformadas pelosmencionados vetores e que contêm a mencionada seqüência de ácidosnucleicos de dextrana sacarase truncada e/ou que sofreu mutação,particularmente as variantes dos Exemplos.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, a presenteinvenção refere-se a proteína codificada pela mencionada seqüência denucleotídeos de dextrana sacarase truncada e/ou que sofreu mutaçãoselecionada a partir do fragmento de SEQ ID N0 6 do aminoácido na posição125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N0 22), fragmento de SEQ IDN0 7 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335 (SEQ IDN0 23), fragmento de SEQ ID N0 8 do aminoácido na posição 125 até oaminoácido na posição 1136 (SEQ ID N0 24), fragmento de SEQ ID N0 9 doaminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1006 (SEQ ID N0 25)e fragmento de SEQ ID N0 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácidona posição 1423 (SEQ ID N0 26).

Além disso, a presente invenção refere-se a dextrana sacarasetruncada e/ou que sofreu mutação que consiste essencialmente ou consiste deuma das seqüências descritas no presente, particularmente selecionadas apartir do fragmento de SEQ ID N0 6 do aminoácido na posição 125 até oaminoácido na posição 1423 (SEQ ID N0 22), fragmento de SEQ ID N0 doaminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335 (SEQ ID N0 23),fragmento de SEQ ID N0 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido naposição 1136 (SEQ ID N0 24), fragmento de SEQ ID N0 9 do aminoácido naposição 125 até o aminoácido na posição 1006 (SEQ ID N0 25) e fragmento deSEQ ID N0 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição1423 (SEQ ID N0 26).Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se à preparaçãode dextrana sacarase que sofreu mutação e/ou truncada por meio de cultivo decélulas hospedeiras que contêm dextrana sacarase truncada e/ou que sofreumutação sob condições que permitam a expressão de dextrana sacarase eisolamento da mencionada dextrana sacarase do meio de cultivo.

A presente invenção também se refere a método de produção dedextranas e/ou isomalto-oligossacarídeos (IMO) com massa molar controladapor meio da reação de dextrana sacarase que sofreu mutação e/ou truncada deacordo com a presente invenção com sacarose e, opcionalmente, umaceitador, para obter as mencionadas dextranas ou IMO com massa molarcontrolada, incluindo isomaltose.

Método de produção direta de IMOs essencialmente a partir desacarose também constitui aspecto da presente invenção. O termo"essencialmente", da forma utilizada no presente, indica que não é necessárioo emprego do aceitador na reação.

As dextranas com alta massa molar de acordo com a presenteinvenção possuem propriedades reológicas modificadas comparáveis com asde dextrana sintetizada por enzima nativa, particularmente de natureza nãonewtoniana, filamentosa e/ou gelificante.

Por fim, a presente invenção refere-se a composições quecompreendem dextranas obtidas utilizando as mencionadas dextranasacarases e o uso das mencionadas dextrana sacarases para a produção dedextranas e isomalto-oligossacarídeos com massa molar controlada na faixa de342 e 109 Da. Mais precisamente, a presente invenção produz (i) isomaltose(342 Da), (ii) isomalto-oligossacarídeos com 342 a 5000 Da, (iii) dextranas comtamanho controlado de 1300 a 52.000 Da, mais precisamente 5000 a 22.000Da, e centralizadas em cerca de 10.000 Da, (iv) dextranas com tamanhocontrolado de 7000 a 1,7 χ 105 Da, mais precisamente de 22.000 a 70.000 Da,centralizadas em cerca de 40.000 Da.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 exibe a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeosde DSR-S vardel Δ4Ν dextrana sacarase truncada com marca de tioredoxinana posição 5' terminal da seqüência e marcas 6 histidina na posição 3' terminalda seqüência, bem como braços espaçadores entre as marcas de proteínas e acodificação de seqüências para dextrana sacarase.

A Figura 2 exibe a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeospara DSR-S vardel Δ3 truncado com marca de tioredoxina na posição 5' daseqüência, marcas de 6 histidina na posição 3' terminal da seqüência e braçosespaçadores entre as marcas de proteína e a codificação de seqüências paradextrana sacarase.

A Figura 3 exibe a seqüência de aminoácidos e nucleotídeos paraDSR-S núcleo vardel truncada com marca de tioredoxina na posição 5' terminalda seqüência, marcas 6 histidina na posição 3' terminal da seqüência e braçosespaçadores entre as marcas de proteínas e a codificação de seqüências paradextrana sacarase.

A Figura 4 exibe a seqüência de aminoácidos e de nucleotídeospara DSR-S núcleo ΔΑ truncada com marca de tioredoxina na posição 5'terminal da seqüência, seis marcas de histidina na posição 3' terminal daseqüência e braços espaçadores entre as marcas de proteína e a codificaçãode seqüência para dextrana sacarase.

A Figura 5 exibe a seqüência de aminoácidos e nucleotídeos paraDSR-S vardel Δ4Ν mutante SEV663YDA com marca de tioredoxina na posiçãoterminal da seqüência, seis marcas de histidina na posição 3' terminal daseqüência e braços espaçadores entre as marcas de proteína e a codificaçãode seqüências para dextrana sacarase.

A Figura 6 é representação diagramática das variantes truncadasde DSR-S e sua atividade relativa, os quatro domínios diferentes (i) a (iv) deDSR-S correspondem a: (i) peptídeo de sinal, (ii) região variável, (iii) domíniocatalítico e (iv) domínio C-terminal, bem como as unidades de repetição A, C eN (nas caixas sombreadas) localizadas de acordo com Monchois et al, 1998[16].

A Figura 7 (A, B) exibe Western Blots anti-tioredoxina (A) e anti-6xHis (B) conduzidas em DSR-S vardel Δ4Ν produzida por E. coli TOPIO a 23°C.

A Figura 8 exibe eletroforese de gel após manchar as proteínascom azul coloidal sobre extratos de DSR-S vardel Δ4Ν durante purificação porafinidade sobre resina de níquel (Probond, Invitrogen). A pista 1 correspondeao sobrenadante da sonicação de E. coli TOPIO ao final do cultivo; a pista 2corresponde ao efluente obtido após a união das proteínas 6xHis marcadassobre a resina, a pista 3 corresponde à fração de eluição e a pista 4corresponde à fração de eluição após eliminar agregados.

A Figura 9 exibe os perfis de eluição obtidos por meio de HPSECde dextranas produzidas por meio da preparação de a) DSR-S nativa de Lmesenteroides NRRL B-512F, b) DSR-S recombinante integral, c) DSR-Svardel Δ4Ν antes da purificação e d) DSR-S vardel Δ4Ν purificada. O pico 1corresponde ao polímero com alta massa molar (HMW), pico 2 a frutose,glicose e oligossacarídeos com DP de menos de 7, não separados pelosistema. Entre estes dois picos, perturbações da linha base refletem apresença de dextranas com tamanho intermediário (103 a 107 Da) emconcentração muito baixa.

As Figuras 10 A a E exibem os espectros obtidos por meio deNMR de prótons sobre dextranas sintetizadas por a) DSR-S nativa de Lmesenteroides NRRL B-512F, B), a DSR-S recombinante completa, C) DSR-Svardel Δ4Ν antes da purificação e D) DSR-S vardel ΔΝ após a purificação. Oespectro Ε) é espectro de carbono 13 da dextrana sintetizada por DSR-Svardel Δ4Ν purificada.

A Figura 11 corresponde ao cromatograma de HPAEC-PAD dosprodutos de digestão utilizando endodextranase (dase) das quatro dextranassintetizadas por DSR-S nativa, DSR-S recombinante completa e DSR-S vardelΔ4Ν, antes e depois da purificação.

A Figura 12 exibe o comportamento reológico de quatro dextranassintetizadas por DSR-S nativa (1) antes e (2) depois do corte, DSR-Srecombinante completa (3) antes e (4) depois da aplicação de segunda série detensões de corte, DSR-S vardel Δ4Ν (6) antes e (7) depois da aplicação desegunda série de tensões de corte, DSR-S vardel Δ4Ν purificada (5) em que A)representa a medição do fluxo de viscosidade, B) medições de viscosidade demodo dinâmico (oscilações de 0 a 10 Pa), antes da determinação dos módulosde conservação G1 e dissipação de energia G" para as dextranas sintetizadaspelas preparações de DSR-S vardel Δ4Ν não purificadas (o e ·;comportamento do tipo de solução, G' < G"; em deformação de 5%) epreparação purificada (□ e ■; comportamento do tipo de gel G' > G"; 0,4%deformação).

A Figura 13 exibe cromatograma de HPAEC-PAD de produtossintetizados por DSR-S vardel Δ4Ν SEV663YDA com 100 g/l de sacaroseisolada (A) ou por meio de reação de aceitador com 100 g/l de sacarose e 50g/l de glicose (Β). O símbolo G significa glicose, F: frutose, I2: isomaltose, 13:isomaltotriose, N/M: nigerose ou maltose (não separada por meio do sistemade almofada de HPAEC) e o símbolo "?" corresponde a produtos com estruturadesconhecida.

A Figura 14 exibe o cromatograma de HPSEC de dextranassintetizadas por DSR-S vardel Δ3 a 20 0C e 10 0C. As setas correspondem aostempos de retenção de dextranas comerciais de 2 χ 106 Da, 70.000 e 10.000Da que serviram de referências.

A Figura 15 exibe o cromatograma de HPSEC de dextranassintetizadas a 20 0C com 100 g/l de sacarose e com 1 U/ml de (1) DSR-Svardel Δ4Ν, (2) DSR-S vardel Δ3, (3) DSR-S núcleo vardel e (4) DSR-S núcleoMeo perfil de eluição (5) de dextrana comercial de 10.000 Da (Sigma).

A Figura 16 exibe o perfil de HPAEC-PAD de dextranassintetizadas a 20 0C com 100 g/l de sacarose e com 1 U/ml de DSR-S vardelΔ4Ν (1), DSR-S vardel Δ3 (2), DSR-S núcleo vardel (3) e DSR-S núcleo vardelΔΑ (4).

A Figura 17 exibe o perfil de HPAEC-PAD (A) e distribuição (B) deIMOs produzidos por meio de reação de aceitador a 20 0C com as variantesDSR-S vardel Δ4Ν (1), DSR-S vardel Δ3 (2), DSR-S núcleo vardel (3) e DSR-Snúcleo vardel ΔΑ (4). G: glicose; F: frutose; L: leucrose; T: trehalulose; 12 a I20:isomalto-oligossacarídeos com DP 2 a DP 20. O inserto da Figura Bcorresponde a ampliação dos IMOs de DP 15 para 27.

Descrição Detalhada da Invenção

A expressão "enzima que possui atividade enzimática de dextranasacarase" conforme utilizado no presente indica enzima que catalisa aconversão de sacarose em oligosídeos e poliosídeos que compreendem maisde 50% de unidades de glicosila unidas por uniões a-1,6 com tamanho na faixade 342 e 109 Da e, mais especificamente, dextranas e isomalto-oligossacarídeos que compreendem mais de 95% de uniões a-1,6. Estaconversão pode ter lugar na presença ou ausência de aceitadores externos taiscomo maltose, glicose, isomaltose ou frutose, ou isomalto-oligossacarídeos.

Maltose, isomaltose e glicose são os aceitadores preferidos na presenteinvenção. A atividade enzimática das dextrana sacarases de acordo com apresente invenção pode ser medida conforme descrito nos Exemplos.

Os termos "nucleotídeos", "polinucleotídeos", "ácidos nucleicos" e"oligonucleotídeos", da forma utilizada no presente, são intercambiáveis eincluem, sem limitação, seqüências de RNA1 DNA e DNA/RNA quecompreendem mais de um nucleotídeo em uma única cadeia ou na forma decadeia dupla. As seqüências de polinucleotídeos de acordo com a presenteinvenção podem ser preparadas por meio de qualquer método conhecido,incluindo, sem limitações, qualquer método de síntese recombinante e qualquermétodo de geração ex vivo, bem como combinações destes métodos.

O termo "truncado", da forma utilizada no presente, indica quepelo menos uma das extremidades N ou C-terminais da seqüência deaminoácidos ou ácidos nucleicos foi reduzida. Esta redução pode serconduzida utilizando enzimas de restrição, enzimas proteolíticas ousinteticamente, incluindo por meio de amplificação específica de seqüências denucleotídeos, particularmente por meio de PCR.

A expressão "dextrana sacarase purificada", da forma utilizada nopresente, indica dextrana sacarase que possui apenas uma forma ativa dedextrana sacarase nas preparações, que possui grau de pureza de proteína depelo menos 70%, 85% ou 95%.

A expressão "propriedade de texturização original interessante",da forma utilizada no presente, indica as propriedades reológicas dasdextranas de acordo com a presente invenção que, em comparação comdextranas sintetizadas por enzima nativa sob as mesmas condições, porexemplo, exibem comportamento não newtoniano, especialmentecomportamento de gel ou do tipo filamentoso. "Polímero do tipo gel" écaracterizado no presente por medições reológicas de modo dinâmico,detectando os módulos de conservação de energia (G') e dissipação deenergia (G"). Para gel, G' é mais alto que G" ao longo de toda a faixa defreqüências estudada, como se tornará evidente no Exemplo 5. O caráterfilamentoso pode ser identificado a olho nu. As dextranas filamentosas deacordo com a presente invenção alteram-se de comportamento de tipo soluçãopara comportamento de tipo gel após a aplicação de segunda série de tensõesde corte, como também será observado no Exemplo 5.

As abreviações a seguir utilizadas no presente possuem osseguintes significados: DSR-S para dextrana sacarase de L mesenteroidesNRRL B-512F; DP para grau de polimerização; HMW para "alta massa molar",IMW para "massa molar intermediária", em que os polímeros de IMW sãopolímeros altamente polidispersos com tamanhos na faixa de 1000 a 107 Da,em que a separação por HPSEC é difícil devido à sua baixa concentração.Polímeros com LMW (baixa massa molar) são, de acordo com a presenteinvenção, população que é muito mais alta e facilmente detectada entre 750 e70.000 Da, centralizada em cerca de 10.000 Da ou na faixa de 2.000 a 1,7 χ105 Da e centralizada em cerca de 40.000 Da.

A expressão "dextrana de 10.000 Da", da forma utilizada nopresente, indica população de dextranas com tamanho na faixa de 1300 a52.000 Da, mais precisamente de 5000 a 22.000 Da, centralizada na altura dopico em cerca de 10.000 Da. Durante a caracterização, a base do pico deeluição obtido por meio de permeação de gel estava na faixa de 1300 a 52.000Da, a faixa de massa molar estimada no pico de eluição em metade da alturaestava na faixa de 5000 a 22.000 Da e o pico foi centralizado na altura do picoem massa de cerca de 10.000 Da. Quando a massa molar foi expressa no picode meia altura, pelo menos 50% da população de dextrana caíram dentro dafaixa indicada.

A expressão "dextrana de 40.000 Da", da forma utilizada nopresente, indica população de dextrana com tamanho na faixa de 7000 a 1,7 χ105 Da, mais precisamente de 22.000 a 70.000 Da, centralizada na altura dopico em cerca de 40.000 Da. Durante a caracterização, a base do pico deeluição obtido por meio de permeação de gel estava na faixa de 7000 a 1,7 χ105 Da1 a faixa de massa molar estimada no pico de eluição a meia alturaestava na faixa de 22.000 a 70.000 Da e o pico estava centralizado em massade cerca de 40.000 Da. Quando a massa molar era expressa no pico a meiaaltura, pelo menos 50% da população de dextranas caiu dentro da faixaindicada.

IMO indica isomalto-oligossacarídeos.

A expressão "que consiste essencialmente de", quando utilizadacom relação a ácidos nucleicos ou aminoácidos da forma utilizada no presente,indica que outros ingredientes menores ou moléculas podem estar presentescom as seqüências de aminoácidos ou ácidos nucleicos. A seqüência de ácidonucleico possui exatamente o mesmo comprimento indicado no número deidentificação da seqüência, mas pode possuir três a doze nucleotídeosadicionais nos terminais N e C. De forma similar, a seqüência de aminoácidospossui exatamente o mesmo comprimento indicado no número de indicação deseqüências, mas de um a quatro aminoácidos adicionais podem ser agregadosaos terminais N ou C. Estes aminoácidos adicionais não possuem efeito sobrea atividade enzimática.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a ácidosnucleicos que codificam dextrana sacarase truncada ou dextrana sacarase quesofreu mutação, seqüência complementar a todas ou parte destas seqüênciasou seqüência que se hibridiza sob condições estringentes com uma dasseqüências acima, desde que a atividade enzimática de dextrana sacarase sejamantida. Dever-se-á apreciar que as seqüências de nucleotídeos que nela sehibridizam contêm a mesma quantidade de nucleotídeos e hibridizam-se aolongo de todo o comprimento do fragmento.

A expressão "condições de hibridização estringentes", da formautilizada no presente, indica condições conforme descrito por Sambrook et al,Molecular Cloning Manual, terceira edição (2001), ou seja, por exemplo, ascondições a seguir: tampões de hibridização: 2 X SSC1 10 X solução deDenhardt (Ficoll 400 e PEG e BSA1 razão 1:1:1), 0,1% SDS1 5 mM de EDTA,50 mM de Na2HPO4, 250 μο/ml de DNA de esperma de arenque, 50 μο/ml de t-RNA ou 0,25 M de tampão fosfato de sódio com pH 7,2, 1 mM de EDTA, 7%SDS;

Temperatura de hibridização: 60 °C;

Tampão de lavagem: 2 X SSC, 0,1% SDS;

Temperatura de lavagem: 60 0C.

As moléculas de ácidos nucleicos que se hibridizam sobcondições estringentes com os ácidos nucleicos de acordo com a presenteinvenção podem, em princípio, codificar dextrana sacarases de qualquermicroorganismo, tal como bactéria, bactéria grama positiva e, em um aspectoda presente invenção, bactéria dos gêneros Leuconostoc, Streptococcus ouLactobacillus.

A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos que codificamproteínas de dextrana sacarase que contêm pelo menos 70%, 80% ou 90% deidentidade de seqüências com as seqüências SEQ ID N0 1 a SEQ ID N0 5 eSEQ ID N0 17 a 21, desde que a proteína codificada pelas mencionadasseqüências possua atividade enzimática de dextrana sacarase.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a seqüências denucleotídeos que codificam proteína que consiste essencialmente ou consistede seqüências de aminoácidos consecutivas de qualquer dentre SEQ ID N0 6 a10 ou 22 a 26.

Em aspecto adicional da presente invenção, as seqüênciascomplementares às seqüências de acordo com a presente invenção ouseqüências que se hibridizam com as mencionadas seqüências sob condiçõesestringentes, desde que a atividade enzimática de dextrana sacarase sejamantida, também são incluídas na presente invenção.Derivações das seqüências de nucleotídeos básicas SEQ ID N0 1,SEQ ID N0 2, SEQ ID N0 3, SEQ ID N0 4 ou SEQ ID N0 5), em que asseqüências são selecionadas a partir do fragmento de seqüência SEQ ID N0 1da posição 373 até a posição 4269, fragmento de seqüência SEQ ID N0 2 daposição 373 até a posição 4005, fragmento de seqüência SEQ ID N0 3 daposição 373 até a posição 3408, fragmento de seqüência SEQ ID N0 4 daposição 373 até a posição 3018 e fragmento de seqüência SEQ ID N0 5 denucleotídeo na posição 373 até a posição 4269, as seqüênciascomplementares às mencionadas seqüências ou seqüências que se hibridizamcom as mencionadas seqüências sob condições estringentes, desde que aatividade enzimática de dextrana sacarase seja mantida, podem ser produzidaspor meio de exclusão, substituição, inserção ou recombinação, por exemplo;em que os métodos de condução das mencionadas etapas e transformaçõessão bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, por Sambrook et al,acima.

Dever-se-á compreender no presente que, caso tenham lugarquaisquer exclusões, substituições, inserções ou recombinações de quaisquerdas seqüências mencionadas acima, as proteínas codificadas pelasseqüências devem manter a sua atividade enzimática de dextrana sacarase.Desta forma, 1 a 132, preferencialmente 2 a 60 nucleotídeos, de maiorpreferência 15 a 36 nucleotídeos e, de preferência ainda maior 12 a 27nucleotídeos podem ser modificados, por exemplo, por meio de exclusão,substituição, inserção ou recombinação. Segundo a presente invenção, 90%,preferencialmente 95% dos nucleotídeos permanecem inalterados.

A atividade enzimática de dextrana sacarase pode ser medidaconforme descrito no capítulo de método e nos Exemplos do presente pedido.

Os oligonucleotídeos que podem ser utilizados como sonda ouprimer são, por exemplo, SEQ ID N0 1 a SEQ ID N0 5 ou seqüências denucleotídeos selecionadas a partir do fragmento de seqüência SEQ ID N0 1 daposição 373 até a posição 4269, fragmento de seqüência SEQ ID N0 2 daposição 373 até a posição 4005, fragmento de seqüência SEQ ID N0 3 daposição 373 até a posição 3408, fragmento de seqüência SEQ ID N0 4 daposição 373 até a posição 3018 e fragmento de seqüência SEQ ID N0 5 denucleotídeo na posição 373 até a posição 4269.

O comprimento das sondas e primers pode variar dependendodas suas aplicações. Geralmente, eles devem possuir pelo menos 25nucleotídeos e podem compreender todas as seqüências de dextrana sacarasedescritas, tais como 3896 nucleotídeos. O comprimento pode também variarpara que esteja na faixa de 25 a 150 nucleotídeos, 25 e 800 nucleotídeos ou 25e 300 nucleotídeos, por exemplo.

Os primers geralmente compreendem 18 a 25 nucleotídeos decomprimento, mas podem também ser mais longos, dependendo da aplicaçãoidealizada. Exemplos de primers que podem ser utilizados na presenteinvenção são:

GGC TTC TCT GGT GTG ATT (SEQ ID N0 11)GAT CTG TCA GAA ACT GGC (SEQ ID N0 12)ACA CAA CAA GTT AGC GGC (SEQ ID N0 13)CCA GAT ACT AAC TTG AGT (S EQ ID N0 14)TTC ATT GAT GCA GAC GGG (SEQ ID N0 15)CAC GAC TAC GAC GCG CAA (SEQ ID N0 16)

Dever-se-á observar que os primers nas posições 5' e 3' terminaisdos nucleotídeos codificam a dextrana sacarase (SEQ ID N0 11 a 15) e o lado5' e 3' da seqüência mutante (SEQ ID N0 16). Os técnicos no assunto podem,entretanto, utilizar cada uma destas seqüências para produzir primers ousondas utilizando nucleotídeos consecutivos. Além disso, estas seqüências denucleotídeos que são utilizadas como sonda podem ser particularmentemarcadas com radioatividade, marcação enzimática ou marcação fluorescente.

A fim de elaborar geneticamente a célula procariótica oueucariótica, os ácidos nucleicos de acordo com o presente pedido ou parte dosácidos nucleicos de acordo com o presente pedido podem ser introduzidos emplasmídeos que permitam a mutagênese ou modificação de seqüências pormeio de recombinação de seqüências de nucleotídeos. Métodos padrãoutilizando estas técnicas são conhecidos dos técnicos no assunto e foramdescritos por Sambrook et al, acima, especificamente. Os fragmentos de DNApodem também ser conectados entre si por adaptadores ou links e enzimas derestrição apropriadas podem ser utilizadas para remover certas seqüências deDNA. Métodos tais como mutagênese, restrição após a restauração de primersou ligaduras podem ser utilizados para obter a seqüência desejada com asinserções, exclusões apropriadas ou substituições necessárias ou desejáveis.

Além disso, marcas bem definidas que codificam ácidos nucleicospodem ser ligadas às extremidades N ou C-terminais das seqüências de ácidosnucleicos de acordo com a presente invenção. Elas podem ser peptídeos taiscomo poli-His, epítopo c-myc ou marca HA ou pequenas proteínas tais comoGST bacteriano, MBP (proteína de união de maltose), tioredoxin, β-galactosidase, glicoproteína VSV e similares.

Ácidos nucleicos específicos que codificam outras marcas deproteína são marca His, marca 11, marca S, peptídeo de "marca", trpE,avidina/estreptavidina, proteína A ou G de estafilococo, di-hidrofolatoreductase, domínios de união de celulose, policisteína, polifenilalanina esimilares, que podem também ser utilizados na presente invenção.

Segundo um aspecto da presente invenção, ácido nucleico quecodifica tioredoxina é fundido à seqüência de ácido nucleico N-terminal. Ácidonucleico que codifica marca 6xHis é fundido à extremidade 3' das seqüênciasde ácidos nucleicos.Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podemser ligados a unidade de transcrição que compreende (1) elementos deregulagem da expressão genética tais como promotores e amplificadores, (2)seqüência de codificação ou estrutural que é transcrita em mRNA e traduzidana proteína correspondente e (3) sinais de início e término apropriados.

Uma série de seqüências de controle de expressão apropriadas éconhecida na técnica. Métodos gerais de expressão da proteína recombinantetambém são conhecidos e exemplificados no documento de R. Kaufman,Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) [17].

As regiões promotoras que podem ser utilizadas nos vetores deacordo com a presente invenção incluem IacL1 IacZ1 T3, T7, gpt, Iambda PR1 tree ara.

A presente invenção também se refere a vetores, particularmenteplasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores que sãoconhecidos no campo de engenharia genética e que compreendem asseqüências de ácidos nucléicos de acordo com o presente pedido em umaspecto da presente invenção, em que os mencionados vetores sãoplasmídeos selecionados a partir de DSR-S vardel Δ4Ν, DSR-S vardel Δ3,DSR-S núcleo vardel, DSR-S núcleo ΔΑ e DSR-S vardel Δ4Ν SEV663YDA.

Os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção podemser expressos em células procarióticas ou eucarióticas. Exemplos nãolimitadores destas células que podem ser mencionados são células VERO,células HELA tais como ATCC n° CCL3, linhagens de células CHO tais comoATCC CCL61, células de COS tais como COS-7 e células ATCC N0 CR: 1650,W138, BHK, HepG2, 3T3 tais como ATCC N0 CRL 6361, A549, PC12, K562,células 293, células Sf9 tais como ATCC N0 CRL 1711, células Cv1 tais comoATCC N0 CCL70 e células JRKAT tais como ATCC Tib152.

Células não limitadoras que podem ser utilizadas no presentepedido incluem linhagens das células hospedeiras procarióticas tais comoEscherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium ou linhagens dosgêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, ou linhagens decélulas hospedeiras eucarióticas tais como os parasitas Apicomplexan(,Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia), Leishmania ou Trypanosoma.

Outras células apropriadas podem ser utilizadas na presenteinvenção e incluem, particularmente, células de leveduras tais comoSaceharomyces, como Saccharomyces cen/isiae ou pombe, Piehia pastoris ecélulas eucarióticas (células de plantas, células de CHO e similares).

Em aspecto adicional, as células utilizadas para expressão deácidos nucleicos de acordo com a presente invenção são Eseheriehia coli elinhagens selecionadas, por exemplo, a partir de JM109, BL21 (DE3) pLysS,TOPIO ou Pir1. A linhagem INVsc de Saccharomyees eerevisiae também podeser utilizada.

A presente invenção refere-se a células hospedeirastransformadas com as seqüências de ácidos nucleicos descritas acima ou comvetor conforme descrito acima e células derivadas de células transformadasque contêm o vetor ou as seqüências de ácidos nucleicos descritas nopresente.

Exemplos dessas células hospedeiras que podem sermencionados são Escheriehia coli, em que a dextrana sacarase truncada e/ouque sofreu mutação pode ser produzida. A preparação destas célulashospedeiras é conhecida na técnica.

Proteínas e fragmentos biologicamente ativos dessas proteínas,bem como proteínas que sofreram mutação e são codificadas pelas moléculasde ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção e seus métodos depreparação, também se enquadram dentro do escopo da presente invenção.

Desta forma, a presente invenção refere-se a método depreparação de dextrana sacarase que sofreu mutação e/ou truncada, quecompreende as etapas a seguir:

a. cultivo de células hospedeiras transformadas com asseqüências de ácidos nucleicos descritas acima ou com vetor conformedescrito acima sob condições que permitam a expressão de dextrana sacarase;e

b. isolamento da mencionada dextrana sacarase do meio decultivo.

Mais especificamente, as seqüências de ácidos nucleicos podemser selecionadas a partir de SEQ ID N0 1 da posição 373 até a posição 4269,fragmento de seqüência SEQ ID N0 2 da posição 373 até a posição 4005,fragmento de seqüência SEQ ID N0 3 da posição 373 até a posição 3408,fragmento de seqüência SEQ ID N0 4 do precursor 373 até a posição 3018 efragmento de seqüência SEQ ID N0 5 da posição 373 até a posição 4269,seqüências complementares das mencionadas seqüências e seqüências quese hibridizam com as mencionadas seqüências sob condições estringentes,desde que seja mantida a atividade enzimática de dextrana sacarase.

Após o isolamento, as dextrana sacarases de acordo com apresente invenção podem também ser purificadas. Neste particular, podem serutilizados os métodos habituais de purificação, tais como precipitação,cromatografia de troca de íons, cromatografia de afinidade, cromatografia detroca hidrofóbica, filtragem com gel, HPLC de fase reversa, desmistura defases e similares. Em um aspecto da presente invenção, as dextrana sacarasesque sofreram mutação ou truncadas de acordo com a presente invençãopodem ser purificadas utilizando resina carregada com níquel, considerando aexistência da tioredoxina e marca 6xHis.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a proteínas dedextrana sacarase que consistem essencialmente ou consistem de seqüênciade aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID N0 6 a 10 ou seqüência deaminoácidos selecionada a partir do fragmento de SEQ ID N0 6 a partir doaminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423, fragmento deSEQ ID N0 7 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335,fragmento de SEQ ID N0 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido naposição 1136, fragmento de SEQ ID N0 9 do aminoácido na posição 125 até oaminoácido na posição 1006 e fragmento de SEQ ID N0 10 do aminoácido naposição 125 até o aminoácido na posição 1423.

Proteína codificada por uma das seqüências de nucleotídeos SEQID N0 1 a SEQ ID N0 5 ou fragmentos das mencionadas seqüências, conformedescrito acima, é outra realização da presente invenção.

Seqüências de aminoácidos homólogos, ou seja, em que o graude similaridade com as seqüências definidas acima é suficiente para amanutenção da atividade enzimática, também são incluídas no objeto dopresente pedido. Desta forma, programas Blast e Fasta podem ser utilizadospara investigar a similaridade. Como se demonstrou no presente que erapossível truncar as extremidades N e C-terminais de dextrana sacarases,mantendo a atividade enzimática, a similaridade de seqüências não pode serconsiderada apenas para a seqüência completa isolada, mas também para asseqüências truncadas. A presente invenção refere-se, portanto, qualquerseqüência que contenha 80%, 90% ou 98% de similaridade de seqüências coma seqüência completa, mas também aquelas que possuiriam 80%, 90% ou 98%de similaridade de seqüências com uma das seqüências truncadas, desde quea atividade enzimática seja mantida.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se aseqüências que possuem grau de similaridade da ordem de 90%, 95% ou 98%de similaridade com SEQ ID N0 6 a 10 ou seqüências de aminoácidosselecionadas a partir do fragmento de SEQ ID N0 6 do aminoácido na posição125 até o aminoácido na posição 1423, SEQ ID N0 7 do aminoácido na posição125 até o aminoácido na posição 1335, SEQ ID N0 8 do aminoácido na posição125 até o aminoácido na posição 1136, SEQ ID N0 9 do aminoácido na posição125 até o aminoácido na posição 1006 e SEQ ID N0 10 do aminoácido naposição 125 até o aminoácido na posição 1423, desde que estas proteínaspossuam a atividade enzimática das mencionadas dextrana sacarases.

Claramente, as seqüências de aminoácidos com identidade específica definidaacima possuem maior parte de substituições de aminoácidos conservadoras.

Substituições de aminoácidos conservadoras incluemsubstituições de aminoácidos da mesma classe. Estas classes compreendem,por exemplo, aminoácidos que contêm cadeias laterais polares nãocarregadas, tais como Asn, Gln, Ser, Thr ou Tyr; aminoácidos que contêmcadeias laterais básicas, tais como His, Lys ou Arg; amninoácidos que contêmcadeias laterais ácidas, tais como Glu ou Asp e aminoácidos que contêmcadeias laterais não polares, tais como Ala, Gly, Leu, Vai, lie, Phe, Cys ou Trp.

Além disso, com referência à atividade enzimática de dextranasacarase com substituições de aminoácidos, esta pode ser testada conformedescrito nos Exemplos, mas a atividade pode também ser avaliada por meio deanálises de HPLC ou das previsões habituais referentes à forma em que asalterações de aminoácidos afetam as funções das proteínas.

Em aspecto adicional, como as seqüências de aminoácidos sãoindicadas no presente, a proteína pode ser sintetizada utilizando o método deR. B. Merrifield, 1963 [20]. Por esta razão, as proteínas de dextrana sacarasesintetizadas constituem outro aspecto da presente invenção.

A presente invenção também se refere a dextrana sacarasesmutantes denominadas mutante SEV663YDA de DSR-S vardel Δ4Ν em que aserina, ácido glutâmico e valina nas posições 663, 664 e 665 tenham sidomodificadas para tirosina, ácido aspártico e alanina, respectivamente.Este mutante pode ser utilizado para sintetizar isomaltose desacarose, utilizando sacarose como o único substrato em rendimento que éequivalente ao obtido quando aceitador, tal como glicose, é adicionado ao meiode reação.

Por esta razão, a presente invenção refere-se a método deprodução de isomaltose diretamente a partir de sacarose, em que omencionado método compreende a reação de dextrana sacarase mutante comSEQ ID N0 10 com sacarose e produção de isomaltose.

As proteínas de fusão que contêm marca de proteína conformedescrito acima também fazem parte da presente invenção. Neste particular, asproteínas que sofreram mutação e/ou truncadas de acordo com a presenteinvenção podem ser fundidas com pelo menos uma marca de proteína.

A preparação de dextranas com alta massa molar (cerca de 106 a108 Da) e com propriedades reológicas modificadas em comparação comdextrana sintetizada por DSR-S nativo de L. mesenteroides N RRL B-512Futilizando a dextrana sacarase truncada de acordo com a presente invenção éoutro aspecto da presente invenção.

Mais especificamente, microorganismos que secretam dextranasacarase ou extratos celulares de microorganismos que produzem dextranasacarase de forma intracelular podem ser cultivados ou utilizados em meio quecompreende sacarose, o que resulta na síntese de isomaltose (342 Da), (ii)isomalto-oligossacarídeos de 342 a 5000 Da, (iii) dextranas com tamanhocontrolado de 1300 a 5200 Da centralizadas em cerca de 10.000 Da, (iv)dextranas com tamanho controlado de 7000 a 1,7 χ 105 Da centralizadas emcerca de 40.000 Da e (v) dextranas com alta massa molar de 2 χ 106 Da a 109Da. Estes compostos podem ser isolados do meio de cultivo por meio demétodos convencionais tais como ultrafiltragem, nanofiltragem, precipitaçãoalcoólica, cromatografia de líquidos e similares.Alternativamente, as dextrana sacarases truncadas e/ou quesofreram mutação descritas na presente invenção podem ser purificadas eutilizadas em método de produção de dextranas com massa molar controlada.

Desta forma, a presente invenção refere-se a método deprodução de dextranas e/ou isomalto-oligossacarídeos com massa molarcontrolada, que compreende a reação de dextrana sacarase que sofreumutação e/ou truncada que consiste essencialmente ou consiste de seqüênciaselecionada a partir de seqüências de nucleotídeos SEQ ID N0 6 a SEQ ID N010 definidas acima com pelo menos sacarose e opcionalmente aceitador.

A presente invenção também se refere a método de produção deisomaltose, em que o método compreende a reação de dextrana sacarase quesofreu mutação e/ou truncada com seqüência SEQ ID N0 10 essencialmentecom sacarose. A presente invenção também se refere a método de produçãode dextranas com interessantes propriedades de textura, em que o métodocompreende a reação de dextrana sacarase que sofreu mutação e/ou truncadacom a seqüência de SEQ ID N0 6.

A presente invenção também se refere a dextranas e isomalto-oligossacarídeos que possuem as características definidas no presente pedido,que podem ser obtidas por meio dos métodos descritos no presente. Estaspropriedades características incluem o fato de que dextranas com alta massamolar possuem comportamento não newtoniano e possuem a característica degel ou natureza filamentosa e a propriedade de alteração de comportamento dotipo solução para o de gel após a aplicação de segunda série de tensões decorte.

Como ficará evidente nos Exemplos, as diferentes propriedadesreológicas podem ser convenientemente obtidas dependendo se a enzima épurificada ou não purificada.

As dextranas produzidas enzimaticamente de acordo com apresente invenção podem ser utilizadas como suporte na indústriafarmacêutica, como substituto de plasma, aditivos em produtos têxteis outintas, em cosméticos e na indústria agroalimentar, bem como agente detexturização, tal como substituto para goma arábica ou agente gelificante. Apresente invenção também se refere a composições que compreendem asdextranas e IMOs de acordo com a presente invenção.

Uma aplicação importante das dextranas e isomalto-oligossacarídeos de acordo com o presente pedido é o seu uso comoprebióticos. Estes produtos não são completamente metabolizados e sãofermentados seletivamente no cólon por espécies bacterianas apropriadas, taiscomo Bifidobacteria e Lactobacilli.

Oligossacarídeos vêm sendo tradicionalmente utilizados paraalimentos animais ou humanos, nas indústrias farmacêuticas e na indústria decosméticos ou como adoçante, estabilizante ou carga [21]. Durante os últimosquinze anos, novo campo de atividade foi desenvolvido para as propriedadesprebióticas de certas moléculas não digeríveis [23]. Oligossaarídeos comoprebióticos são interessantes com relação à sua capacidade de resistência aataques por enzimas digestivas e para acentuar o crescimento de bactérias"saudáveis", principalmente Bifidobacteria e Lactobacilli, no intestino. Esteconceito foi estimulado pelo surgimento de produtos prebióticos comerciais querapidamente obtiveram popularidade. Oligômeros tais como fruto-oligossacarídeos, lactulose, galacto-oligossacarídeos, xilo-olligossacarídeos,oligossacarídeos extraídos de soja ou isomalto-oligossacarídeos que sãonormalmente obtidos por meio de processos biológicos ou de extração deplantas, também são promissores. Atualmente, pesquisas neste campoconcentraram-se na produção de estruturas de oligosscarídeos inovadorasdenominadas prebióticos de segunda geração que deverão possuirpropriedades físico-químicas inovadoras e atividades biológicas maisespecíficas [18].

Em aspecto adicional, a presente invenção refere-se acomposição que compreende dextrana obtida a partir de dextrana sacarase deacordo com a presente invenção e veículo farmaceuticamente aceitável ouveículo com qualidade alimentícia.

O veículo aceitável pode ser selecionado, por exemplo, a partir deadjuvantes, sais e similares e os adjuvantes podem ser selecionados a partir depeptídeos de muramil, alúmen, montanida e similares. As dextrana sacarasesque sofreram mutação e/ou truncadas podem ser proteína purificada, proteínaproduzida de forma recombinante ou proteína produzida de forma sintética.

Com relação ao método de produção das dextranas e/ou IMOs,aceitadores preferidos, quando utilizados, são glicose, isomaltose, maltose eisomalto-oligossacarídeos.

Preferencialmente, o método de produção de isomalto-oligossacarídeos com massa molar controlada compreende a reação dedextrana sacarase que sofreu mutação e/ou truncada que consiste deseqüências SEQ ID N0 7, 8, 9 ou 10 essencialmente com sacarose. O grau depolimerização varia, portanto, de duas a sessenta unidades glicosila (DP2 aDP60).

A reação de produção tem lugar sob temperaturas na faixa de 4°C a 80°C preferencialmente 4 0C a 40 °C.

Preferencialmente, quando a seqüência for SEQ ID N0 7, SEQ IDN0 8 ou SEQ ID N0 9, a temperatura encontra-se na faixa de 4 0C a 15 °C,preferencialmente 8 °C a 12 °C e, de maior preferência, a temperatura é daordem de 10 °C para a produção de dextranas com tamanho controlado. Alémdisso, para estas seqüências, a temperatura encontra-se preferencialmente nafaixa de cerca de 8 °C a 25 °C, de maior preferência na ordem de 20 °C parasíntese de IMO.Além disso, preferencialmente quando a seqüência for SEQ ID N06 ou SEQ ID N0 10, a temperatura encontra-se na faixa de 15 0C a 45 0C1preferencialmente 17 0C a 30 0C e, de maior preferência, da ordem de 20 0C a25'C.

Adicionalmente, a concentração de sacarose encontra-se na faixade 10 a 600 g/l, preferencialmente 75 a 400 g/l e, de maior preferência, 90 a280 g/l.

Quando a seqüência for SEQ ID N0 7, SEQ ID N0 8 ou SEQ ID N09, a concentração de sacarose no meio é preferencialmente da ordem de 250g/l.

Além disso, quando a seqüência for SEQ ID N0 6 ou SEQ ID N010, a concentração de sacarose pode ser da ordem de 100 g/l.

Adicionalmente, conforme apropriado, a razão em peso entresacarose e aceitador pode ser da ordem de 0,5 a 12, preferencialmente 1 a 4,de maior preferência cerca de 2.

No método de acordo com a presente invenção, a dextranasacarase encontra-se na forma livre ou imobilizada sobre suporte. Amencionada imobilização pode ser efetuada, por exemplo, por meio deadsorção, inclusão ou união covalente.

Por fim, para a condução do método, o pH encontra-se na faixade 3,0 a 10,0, preferencialmente 4,0 a 7,0, de maior preferência 4,5 a 6,0 e, depreferência ainda maior, cerca de 5,2.

Outros aspectos da presente invenção podem tornar-se evidentesa partir de estudo dos Exemplos abaixo.

Exemplo 1

Construção de Variantes

O vetor Thiofusion pBad/TOPO (Invitrogen) foi utilizado paraclonar e expressar genes dsrS truncados e/ou que sofreram mutação sob ocontrole do promotor L-arabinose. Ele permite a fusão do gene à marca 6xHisna extremidade C-terminal e a marca de tioredoxina na extremidade N-terminal.

Para uso como matriz, DNA genômico de L mesenteroides NRRLB-512F foi extraído utilizando o kit Blood and Cell Culture DNA Maxi (Qiagen).A linhagem é derivada da coleção NCAUR, Peoria IL1 Estados Unidos.

Células TOPIO One Shot (Invitrogen) foram utilizadas paraexpressão dos genes dsrS truncados e/ou que sofreram mutação. As enzimasde restrição foram adquiridas da New England Biolabs e utilizadas de acordocom as instruções do fabricante. DNAfoi purificado utilizando os kits "QIAquick"(purificação por meio de PCR e extração de gel) e "QIAprep" (purificação deplasmídeos) da Qiagen.

As variantes foram construídas por meio de amplificação por PCRdo gene DSR-S a partir de DNA genômico de L mesenteroides NRRL B-512Futilizando a polimerase Expand High Fidelity (Roche) e os primers a seguir(fornecidos na direção 5' —> 3'):

1. DSR-S vardel Δ4Ν foi construída utilizando os primerspBad e DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 ePBad Δ4Ν: 4350-actcaagttagtatctggatccacaatgatagc-4317. Ele continha osaminoácidos T152 a S1450 de DSR-S.

2. DSR-S vardel Δ3 foi construída utilizando os primers PBade DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagao-490 e PBad Δ3:4086-cccgtctgcatcaatgaattcacc-4062. Ele continha os aminoácidos T152 aG1362 de DSR-S.

3. DSR-S núcleo vardel foi construída utilizando os primersPBad e DSR-S vardel: 454-acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 enúcleo PBad: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Ele continha osaminoácidos T152 a G1162 de DSR-S.

4. DSR-S núcleo ΔΑ foi construída utilizando os primers PBadDSR-S cat: 843-ggcttctctggtgtgattgatggtcaa-870 e núcleo PBad: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Ela contém os aminoácidos G282 aG1162 de DSR-S.

5. A DSR-S vardel Δ4Ν mutante SEV663YDA foi construídapor meio de mutagênese dirigida utilizando o método de "mega primer" [33, 21]e DNA polimerase Pfu (Stratagene). Primeira reação de PCR foi conduzidautilizando a matriz de plasmídeo DSR-S vardel Δ4Ν e o par de primersSEV663YDA: 1965-agctttgtacgagçtçacgactacgacgcgcaaacggtt-2004 e rev:3447-gtcaccatcctcagtgttçgaaacg-3422, que compreende o local de restrição deSsfBI (sublinhado). Este produto de PCR foi utilizado em seguida como megaprimer reverso em segunda PCR com o primer frontal: 1329-caaccacagtggaatgaaaçtagtç-1354 que compreende o local de restrição Spel.Este segundo produto de PCR foi digerido em seguida com as duas enzimasde restrição Spel e BsfBI de acordo com as condições do fabricante (NewEngland Blolabs) e clonado no vetor pBad DSR-S vardel Δ4Ν previamentedigerido com as mesmas enzimas. O primer SEV663YDA foi projetado paraintroduzir um único local de restrição para selecionar clones positivos (nestecaso, o local Saci).

A estrutura primária de cada uma das variantes DSR-S vardelΔ4Ν, DSR-S vardel Δ3, DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔΑ é exibida emforma de diagrama na Figura 6.

Exemplo 2

Produção de Variantes em e. cou

Foram conduzidos cultivos em frasco Erlenmeyer com membranasobre meio 2X YT tamponado até pH de 6,4 com 100 mN de Tris-HCI, em quese sabe que DSR-S é instável sob condições de pH alcalino [3].

Composição de meio 2X YT

Bactotripona: 16 g/lExtrato de levedura: 10 g/l

NaCI: 5 g/l

Tris: 12,1 g/l

Células TOPIO de E. colique conduzem plasmídeos pBad DSR-Svardel Δ4Ν e pBad DSR-S vardel Δ4Ν SEV663YDA foram cultivadas a 23°C.Conduziu-se indução de L arabinose quando o crescimento celular atingiuODeoonm de 0,2 com 0,002% (p/v) de indutor. O cultivo foi suspenso quando ocrescimento celular atingiu nível estável (OD6oonm de cerca de 3 a 3,5) antes deiniciar a fase de Iise celular.

Células TOPIO de E. coli que conduzem plasmídeos pBadDSR-S vardel Δ3, pBad DSR-S núcleo vardel e pBad DSR-S núcleo ΔΑforam trazidas para 16°C. Conduziu-se indução quando o crescimentocelular atingiu OD600nm de 0,2 com 0,005% (p/v) de L-arabinose no caso deDSR-S vardel Δ3 e 0,02% (p/v) no caso de DSR-S núcleo vardel e DSR-Snúcleo ΔΑ. O cultivo foi suspenso quando o crescimento celular atingiunível estável (OD600nm de cerca de 2,5) antes de iniciar a fase de Iisecelular.

Após o cultivo, as células foram recuperadas por meio decentrifugação (8000 χ g, 10 minutos, 4 °C), novamente suspensas econcentradas até OD600nm equivalente a 80 em tampão de acetato de sódio 50mM, pH 5,2, suplementado com 0,05 g/l de 1 mM CaCI2 e fluoreto defenilmetanossulfonila (PMSF). O rompimento celular foi conduzido por meio desonicação. As preparações foram novamente centrifugadas (20.000 χ g, 30min, 4 °C) para eliminar fragmentos celulares e recuperar apenas osobrenadante de sonicação.

A atividade enzimática dos extratos foi medida utilizando ométodo de ácido dinitrossalicílico (DNS) de Sumner e Howell, 1935 [22],Unidade enzimática é definida como a quantidade de enzima que catalisa aformação de 1 Hmol de frutose por minuto sob dada temperatura (4 0C a 40 0C1dependendo do caso, mais precisamente 20 0C ou 30 0C) e em tampão deacetato de sódio (50 mM), pH 5,2, contendo 0,05 g/l de CaCI2 e 100 g/l desacarose.

Exemplo 3

Purificação de DSR-S vardel Δ4Ν Variante

Formas enzimáticas de DSR-S vardel Δ4Ν foram produzidasdurante o cultivo de E. coli TOPIO: forma completa vastamente maisimportante e formas degradadas diferentes na extremidade C-terminal (Figura7). A origem destas degradações permanece incerta. A produção no Exemplo 2atingiu cerca de 5500 U/l de cultivo nos sobrenadantes de sonicação (atividadetestada a 30 0C).

Para determinar a quantidade de formas enzimáticas ativasnos extratos, foram produzidos géis de eletroforese sob condições nativasou de desnaturação. Após a renaturação com gel, ele foi incubado por umanoite a 25 0C em tampão de acetato de sódio, 50 mM, pH 5,2,suplementado com 100 g/l de sacarose. As formas enzimáticas ativassintetizaram polímero em seguida na região para a qual migraram no gel.

Reagente (reagente de Schiff) que coloriu especificamente os polímerossintetizados por dextrana sacarases ativas, após a oxidação de funçõesálcool primárias do polímero ácido periódico, foi utilizado e os géis forammanchados com esse reagente. Este tipo de gel é denominado zimograma.

No caso de DSR-S vardel Δ4Ν, ou seu mutante SEV663YDA, somente asduas formas com massa molar mais alta foram detectadas como sendoativas (resultados não exibidos). Entretanto, somente a forma completacontinha a marca de tioredoxina e a marca 6xHis.

A presença da marca 6xHis somente na forma completa deDSR-S vardel Δ4Ν foi explorada para purificar a enzima por meio decromatografia de afinidade sobre resina de níquel (Probond Ni-NTA1Invitrogen).

Purificação foi conduzida a 4 0C. Todos os tampões continhamconcentrações de 50 mM de acetato de sódio, 400 mM de NaCI1 diferentesconcentrações de imidazol e foram ajustados até pH 7,5. A resina foiequilibrada com oito volumes de tampão que contém concentração de 40 mMde imidazol. A fixação foi conduzida por duas horas com sete volumes deextrato enzimático suplementado com 20 mM de imidazol e ajustada até pH de7,5. Em seguida, a resina foi lavada com quarenta volumes de 40 mM detampão imidazol, oito volumes a 60 mM e quatro volumes a 100 mM. Por fim,as proteínas foram eluídas com sete volumes de tampão que possuiconcentração de 250 mM de imidazol.

As frações que contêm as proteínas de fusão eluídas forammisturadas e dialisadas por uma noite a 4 0C contra tampão que contémconcentração de 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2 e 0,05 g/l de CaCI2. Aconcentração de proteína foi determinada por meio do métodoMicrobradford (Biorad Laboratories) com BSA (albumina de soro bovino)como padrão.

A pureza da preparação ao final do procedimento foi estimadaem cerca de 90% (Figura 8). As proteínas DSR-S vardel Δ4Ν purificadasapresentaram tendência muito forte a agregar-se, causando a formação deprecipitados brancos e limitando os rendimentos obtidos ao final doprocedimento (Tabela 1). A atividade específica da preparação foiestimada, entretanto, em 584 U/mg de proteína, que correspondeu àmelhor atividade específica descrita de dextrana sacarase recombinante.Como forma de comparação, a atividade específica de DSR-S nativa(expressa por L. mesenteroides NRRL B-512F) foi estimada em cerca de170 U/mg [24],Tabela 1

Purificação de DSR-S Vardel Δ4Ν por Meio de Cromatografia de AfinidadeSobre Resina de Níquel

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Exemplo 4

Seqüências de Nucleotídeos ε Seqüências de Aminoácidos

As construções foram seqüenciadas é as seqüênciascorrespondentes são exibidas nas Figuras 1 a 5.

Exemplo 5

Síntese de Dextran por DSR-S Vardel Δ4Ν, Comparação com DSR-S de L.mesenteroides NRRL B-512F

Dextrana foi sintetizada a partir de DSR-S nativa de L.mesenteroides NRRL B-512F, DSR-S recombinante integral (sobrenadante desonicação) e DSR-S vardel Δ4Ν (sobrenadante de sonicação e enzimapurificada).

Condições da síntese ε análise dos produtos formados

DSR-S recombinante integral foi construída sobre o mesmoprincípio das variantes descritas no Exemplo 1, com primers que foramapropriados para amplificação do gene integral. Células TOPIO de E. coli queconduzem o plasmídeo pBad DSR-S foram cultivadas utilizando o protocolodescrito para DSR-S vardel Δ4Ν (Exemplo 2). O sobrenadante continha trêsformas enzimáticas, que incluem duas com massa molar ativa mais alta.

A forma com maior tamanho continha DSR-S integral; as duasoutras formas foram degradadas na sua posição N-terminal (dados nãoexibidos).

A atividade de cada preparação enzimática foi determinada a 30°C.

Sínteses de dextrana foram conduzidas a 25 °C a partir desolução de 100 g/l de sacarose, em 50 mM de tampão acetato de sódio quecontém 0,05 g/l de CaCI2 e com uma unidade por ml de enzima. A exaustãoprogressiva de sacarose foi monitorada por meio de análises de HPAEC-PAD(vide abaixo) e a reação foi suspensa após o seu consumo completo, por meiode aquecimento por cinco minutos a 95°C (desnaturação completa de dextranasacarases mencionadas).

Os produtos formados foram analisados por meio de HPAEC-PAD(cromatografia de troca de ânions com alto desempenho com detecçãoamperométrica pulsada) com relação aos mono, di e oligossacarídeos e pormeio de HPSEC (cromatografia de exclusão de tamanhos com altodesempenho) com relação aos polissacarídeos.

O sistema HPAEC-PAD compreendeu coluna 4 χ 250 mm Dionex"Carbopack PA100". Gradiente de 6 a 300 mM de acetato de sódio em 28minutos em solução de 150 mM de hidróxido de sódio foi aplicado sobvelocidade de fluxo de 1 ml/min. Detecção foi conduzida por meio deamperometria utilizando módulo Dionex ED40 com eletrodo de ouro e eletrodode referência de pH Ag/AgCI.

O sistema HPSEC foi constituído por duas colunas Shodex OH-Pack SB-805 e SB-802.5 em série, utilizando 0,45 M de nitrato de sódio + 1%(v/v) etileno glicol como solvente em quantidade de 0,3 ml/min. As colunas ecolunas prévias foram mantidas a 70 0C e as amostras foram filtradas sobrefiltros de 0,45 μηι (Sartorius) antes da injeção. A detecção foi do tiporefratométrico, acoplado a detector de difusão de luz (Wyatt) para determinar amassa das dextranas.

As concentrações em peso de glicose, frutose e Ieucrose (isômerode sacarose) foram determinadas por meio de análises HPAEC-PAD. Ospercentuais de resíduos de glicosila da sacarose incorporada à glicose eIeucrose livre foram calculados utilizando a fórmula a seguir:

%Ggiicose = [glicosetf]/([sacaroseto]x(180/342))

e

%Gieucrose = [leucrosetf]/[sacaroseto]

em que [glicosetf] e [Ieucrosetf] correspondem às concentraçõesfinais de glicose e Ieucrose ao final da reação e [sacaroset0] corresponde à dosubstrato inicial (g/l).

O percentual de resíduos de glicosila incorporados ao polímero deHMW foi determinado por meio de análises de HPSEC utilizando a fórmula:%Gdextran = extensãOdextran-tf/(extensãOSacarose-to/(162/342))em que a extensãodextran-tf corresponde à extensão do pico dedextrana, determinado utilizando o cromatograma de HPSEC ao final dareação, e a extensãosacarose-to corresponde à do pico do substrato inicial. Paradada concentração, a superfície obtida por meio de refratometria é idêntica,independentemente do açúcar.

A proporção de unidades de glicosila incorporadas aos polímerosde IMW ou oligossacarídeos para os quais a concentração não poderá serquantificada diretamente por meio de HPAEC-PAD ou HPSEC foi determinadautilizando a fórmula:

%G|MW = 1 00 - %Gg|icose-tf - %G|eucrose-tf " %Gdextran-tf

Os perfis de eluição das quatro dextranas obtidas por meio deHPSEC são exibidos na Figura 9. Diferentes populações podem serdiferenciadas: primeiro pico em eluição após 38 minutos, correspondenteao polímero com alta massa molar (HMW)1 e segundo pico após 75minutos, correspondente a frutose, glicose, Ieucrose (5-0-a-D glicosilfrutose) e outros oligossacarídeos com grau de polimerização (DP) demenos de 7, não separados pelo sistema ou em concentrações muitobaixas. Entre estes dois picos principais, conforme indicado pelasperturbações de linha base, os produtos com tamanho intermediário (IMWdextranas) também estavam presentes. Estes compostos, com tamanhosmuito variáveis, de 1000 a 107 Da, foram altamente polidispersos e emconcentrações muito baixas, o que explica a sua baixa intensidade sobre ocromatograma. Análises HPAEC-PAD confirmaram, entretanto, a suapresença (resultados não exibidos).

A quantidade relativa de unidades de glicosila derivadas desacarose e incorporadas aos diferentes produtos encontra-se relacionadaabaixo na Tabela 2. O rendimento de síntese para dextrana HMWrepresenta cerca de 60% das unidades glicosila para cada uma daspreparações. A transferência de unidades glicosila para água (glicose) oufrutose (leucrose) representa menos de 8%, enquanto a síntese dedextranas com tamanho intermediário (IMW) representou 25% a 32% dasunidades glicosila transferidas. Todas as formas recombinantes de DSR-Stenderam a sintetizar mais dextranas com tamanho intermediário. Asanálises de HPSEC também demonstraram que a enzima nativaaparentemente sintetiza duas populações diferentes de dextrana, aocontrário de apenas uma para as enzimas recombinantes. A massa molarde dextranas HMW foi determinada por meio de difusão de luz e estimadacomo sendo de mais de 107 g/mol para todas as amostras (limite deexclusão das colunas utilizadas).Tabela 2

Percentual de Unidades de Glicosila Incorporadas aos Vários ProdutosDerivados da Síntese de Dextrana a 25 0C ε 100 g/l de Sacarose1 para asQuatro Preparações de DSR-SMencionadas

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Estrutura de dextranas formadas

A estrutura da dextrana produzida por DSR-S vardel Δ4Ν(purificada ou de outra forma) foi comparada com a de dextranas sintetizadas apartir de DSR-S recombinante integral e DSR-S nativa. Estas estruturas foramdeterminadas por meio de ressonância magnética nuclear (NMR 1H) utilizandoBrücker AC 300 a 85 0C e com freqüência de obtenção de 300,13 MHz. Otempo de obtenção foi de três segundos, com 32 a 64 passagens. As dextranasforam inicialmente separadas da frutose coproduzida por meio de precipitaçãopor três vezes com um volume de etanol absoluto, recuperadas por meio decentrifugação, lavadas com água destilada e secas por congelamento. Asamostras foram dissolvidas em D2O até concentração de 6 mg/ml.

Os espectros de NMR são exibidos na Figura 10. Somente uniõesa-1,6 foram detectadas. Análise NMR de carbono 13 também foi conduzidasobre a dextrana sintetizada por DSR-S vardel Δ4Ν purificada. O espectroobtido foi idêntico aos publicados para a dextrana de L. mesenteroides NRRLB-512F e DSR-S integral [3].

Estes polímeros também foram digeridos com endodextranase deChaetomium gracile conduzida por dezesseis horas a 37°C com três unidadesde enzima por ml de meio de síntese. Os produtos de digestão foramanalisados por meio de HPAEC-PAD (Figura 11). Os perfis de digestão obtidosforam idênticos para as quatro dextranas analisadas, o que confirma que todaselas continham pelo menos 95% de uniões a-1,6.

As exclusões realizadas nas posições N e C-terminais da DSR-Spara construir a variante DSR-S vardel Δ4Ν, portanto, não apresentaminfluência significativa sobre a atividade inicial de DSR-S ou sobre a parte deunidades de glicosila derivadas de sacarose incorporada à síntese da dextranaHMW1 o tamanho ou a estrutura do polissacarídeo.

Comportamento reológico de dextranas formadas

O comportamento reológico das quatro dextranas foi analisadoutilizando sistema de cone plano (AR 1000, TA Instruments) equipado comcone com 4 cm de diâmetro em ângulo de 3,59° e velocidades de cobertura de0,01 a 100 s"1. As medições foram conduzidas a 25 °C. Experimentosdinâmicos foram conduzidos no domínio linear de 0 a 10 Pa com deformaçãode 8% para a dextrana sintetizada por DSR-S nativo de L. mesenteroidesNRRL B-512F (controle), 3% para a sintetizada pelo DSR-S recombinanteintegral, 5% para a sintetizada por extrato não purificado de DSR-S vardel Δ4Νe 0,4% para a sintetizada por DSR-S vardel Δ4Ν purificado. O módulo derigidez complexo é definido pela relação:

G*(co) = G'(co) + iG"(co).

O módulo de conservação de energia Θ'(ω) é maior quando aamostra for predominantemente elástica ou altamente estruturada. O módulode perda G"(a>) representa a energia dissipada durante a deformação.Predominantemente, amostras viscosas possuem alto G"(a>).

Estas análises reológicas produziram resultados inteiramenteoriginais (Figura 12). Conforme descrito na literatura, DSR-S nativa sintetizoudextrana com comportamento newtoniano [25].

Os extratos de DSR-S recombinantes integrais e extratos deDSR-S vardel Δ4Ν não purificados produziram soluções viscosas comcomportamento idêntico (viscosidade cerca de dez vezes mais alta que a dedextrana produzida por enzima nativa). Quando observados a olho nu, elestambém apresentaram comportamento filamentoso razoavelmentepronunciado. Além disso, após a aplicação de novas tensões de corte, ocomportamento dos mencionados polímeros alterou-se de tipo de solução paratipo de gel, o que é propriedade inovadora que foi identificada para este tipo debiopolímero. A dextrana produzida pela enzima nativa, por outro lado, não foifilamentosa e seu comportamento foi completamente reversível após aaplicação de segunda série de tensões (Figura 12A).

A enzima purificada sintetizou diretamente polímero que possui aspropriedades de gel altamente estruturado (Figura 12B, módulo G' muito maiorque G"), retendo as suas características ao longo de uma série detemperaturas de 10 0C a 70 0C (resultados não exibidos). Este comportamentoé completamente diferente da enzima nativa.

Apenas a preparação de DSR-S vardel Δ4Ν purificada continhaapenas uma dextrana sacarase ativa no extrato. DSR-S nativa éconhecidamente propensa a problemas de degradação proteolítica [26] e osmétodos de purificação desenvolvidos não poderão resolver aquele problema[27, 28, 29], DSR-Srecombinante integral utilizada no teste continha pelomenos duas formas enzimáticas ativas, como a preparação de DSR-S vardelΔ4Ν antes da purificação. As formas degradadas de DSR-S nativa, DSR-Srecombinante integral e DSR-S vardel Δ4Ν, entretanto, são completamentediferentes. Compreende-se atualmente que a cooperação entre essasdiferentes formas enzimáticas ativas presentes no meio poderá ser a origem demodificações para as cadeias de dextrana, causando estas diferenças decomportamento.

Exemplo 6

Síntese de Isomaltose a Partir de Sacarose

Foi estudada a capacidade de DSR-S vardel Δ4Ν mutanteSEV663YDA de sinte tizar apenas isomaltose (IMO com DP 2) a partir desacarose para prejuízo de dextranas com alta massa molar.

O mutante foi purificado por meio de cromatografia de afinidadeutilizando o procedimento descrito para DSR-S vardel Δ4Ν fornecida noExemplo 3.

A atividade foi testada a 30°C.

Com atividade específica de apenas 9 U/mg, as mutações deSEV663YDA induziram efeitos severos sobre a atividade de DSR-S (perda de98% da taxa de consumo inicial de sacarose). Esta atividade específica,entretanto, é equivalente à de amilo sucarase recombinante de N.polysaccharea [32], que foi amplamente estudada pelo seu potencial deaplicação.

As caracterizações que foram conduzidas demonstram aviabilidade da produção de isomaltose por esta DSR-S mutante, enquanto aenzima selvagem produz apenas dextranas com alta massa molar. Foramconduzidas sínteses a 25°C em tampão que contém concentração de 50 mMde acetato de sódio sob pH 5,2 e 0,05 g/l de CaCI2, 1 U/ml de enzimapurificada e utilizando 100 g/l de sacarose como o único substrato, ou por meiode reação de aceitador a partir de 100 g/l de sacarose e 50 g/l de glicose. Aexaustão de sacarose foi monitorada por meio de análises HPAEC-PAD (videExemplo 4 para condições de análise) e as reações foram interrompidas após oconsumo completo.

A produção de isomaltose atingiu, portanto, rendimento de 47%utilizando sacarose como o único substrato (Tabela 3 e Figura 13), rendimentoque foi equivalente ao obtido pela reação de aceitador. A adição de aceitadorexógeno, portanto, não foi necessária. Traços de isomaltotriose, maltose ounigerose (não separados pelo sistema) também foram identificados (Figura 13),bem como a presença de outros oligossacarídeos com DP de menos de 7 ecom estrutura desconhecida.

Tabela 3

Síntese de Isomaltose por DSR-S Vardel Δ4Ν Mutante SEV663YDA a Partir de 100 g/l de Sacarose Isolada ou Por Meio de Reação de Aceitador com 50 g/l de Glicose Concentrações de Diferentes Produtos Presentes ao Final da Reação <table>table see original document page 44</column></row><table>

Calculado a partir de resíduos de glicosila derivados deglicose exógena e sacarose adicionados ao meio.

Desta forma, neste Exemplo, a produção de isomaltose atingiurendimento de 47%. Atualmente, este é o primeiro método que envolve umaúnica enzima para sintetizar isomaltose a partir de sacarose; todos os estudosanteriores são ligados à degradação de amido por um coquetel de α-amilases eglicosidases [11], ou à ação conjunta de dextrana sacarase e dextranase [30],Além disso, sacarose é substrato barato e amplamente disponível e a frutoseliberada durante as sínteses constitui coproduto cujo valor pode ser exploradoseparadamente.

Exemplo 7

Síntese de Dextran por DSR-S Vardel Δ3

Diferentes formas enzimáticas de DSR-S vardel Δ3 foramproduzidas durante o cultivo de E. coli TOPIO. A forma completa,entretanto, encontrava-se em grande parte na maioria e os zimogramasproduzidos (vide Exemplo 3) demonstraram que somente a forma integralera ativa.

A temperatura de atividade ideal para esta variante foi de 20 0C.Desta forma, foram conduzidos testes de atividade sob esta temperatura. Aprodução de DSR-S vardel Δ3 de acordo com o Exemplo 2 atingiu cerca de 320U/l de cultivo.

Sínteses de dextrana foram conduzidas a 20 0C em tampãocontendo 50 mM de acetato de sódio, pH 5,2 e 0,05 g/l de CaCI2, 100 g/l desacarose e 1 U/ml de extrato de DSR-S vardel Δ3 não purificado. O extratode DSR-S vardel Δ3 pôde ser purificado por meio de cromatografia deafinidade sobre resina de níquel utilizando o protocolo descrito para DSR-Svardel Δ4Ν no Exemplo 3. Como o sobrenadante da sonicação continhaapenas uma única forma enzimática de dextrana sacarase e E. coli nãoproduziu outra enzima que pudesse consumir a sacarose, entretanto, apurificação da variante não constituiu requisito prévio para a caracterizaçãorigorosa das suas propriedades. Como forma de comparação, as síntesesde dextrana foram conduzidas sob as mesmas condições de DSR-S vardelΔΝ (não purificada). O desaparecimento da sacarose foi monitorado pormeio de análises HPAEC-PAD e as reações foram suspensas (cincominutos, 95 0C) após exaustão total.

Os produtos sintetizados foram analisados e quantificados pormeio de HPAEC-PAD e HPSEC utilizando as condições descritas noExemplo 4. Para as análises de HPSEC, o tamanho das dextranas foiestimado utilizando dextranas disponíveis comercialmente com tamanhosde 2 χ 106, 503 χ 103, 70.000, 10.000 Da, maltoheptose e glicose (Sigma).

Como se pode observar na Figura 13, a 20°C a variante DSR-Svardel Δ3 sintetizou duas populações de polímeros; população principal dedextrana HMW com tamanho de 2 χ 106 Da1 que representa cerca de 39% dosresíduos de glicosila derivados de sacarose (Tabela 4) e segunda populaçãode 1300 a 52.000 Da, centralizada no pico mais alto em cerca de 10.000 Da(cerca de 25% de resíduos de glicosila). Esta é a primeira vez em que segundapopulação de dextrana que é claramente visível no cromatograma de HPSECfoi observada para variante de DSR-S.

Efeito de temperatura sobre o perfil dos produtos

Sínteses de dextrana também foram conduzidas sobtemperatura de 10 °C, ainda com buffer contendo 50 mM de acetato desódio, pH 5,2, 0,05 g/l de CaCI2 e 1 U/ml de enzima (atividade testada a 20°C). Exaustão de sacarose foi monitorada por meio de análises HPAEC-PAD e as reações foram suspensas (cinco minutos, 95 °C) após o seuconsumo total.

Como se pode observar na Figura 14, a 10 °C a variante DSR-Svardel Δ3 sintetizou população de dextrana que era muito diferente daproduzida a 20°C. O polímero principal (cerca de 44%) formado àquelatemperatura apresentou massa molar na faixa de 7000 e 1,7 χ 105 Dacentralizada no pico em cerca de 40.000 Da.Tabela 4

Percentual de Unidades de Glicosila Incorporadas em DiferentesProdutos Sintetizados por DSR-S Vardel Δ4Ν ε DSR-S Vardel Δ3 a 10 0C ε20 °C a Partir de 100 g/l de Sacarose

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1 nd: não detectado

2 grau de polimerização calculado a partir do tempo deretenção estimado em limite inferior de pico de dextrana de 10.000 Da.

Efeito da concentração de sacarose:

Foram testadas quatro concentrações crescentes de sacarose(100, 150, 200 e 250 g/l) para as sínteses de dextrana conduzidas a 20 0C e 100C com DSR-S vardel Δ3 (1 U/ml). O consumo total de sacarose foi monitoradopor meio de análises HPAEC-PAD e as sínteses foram suspensas após o seuconsumo total (menos de 48 horas).

Para as duas temperaturas, o aumento inicial da concentração desubstrato incentivou a síntese de dextranas com baixa massa molar. A 20 0C1 asíntese de dextrana com 10.000 Da foi alterada, portanto, de rendimento de25% para 48% ao mudar de 100 para 250 g/l de sacarose inicial. A 10 0C e apartir de 250 g/l, a síntese de dextrana HMW foi completamente abolida e a dedextrana com a população principal com massa molar centralizada em cerca de40.000 Da atingiu convenientemente rendimento de 69%.

Para todas as dextranas sintetizadas por DSR-S vardel Δ3, a 100C e 20 0C, e de 100 a 250 g/l de sacarose, os perfis de digestão deendodextranase (vide Exemplo 5) conduzidos confirmaram que aespecificidade de união de DSR-S foi inalterada (os mesmos perfis deoligossacarídeos detectados por HPAEC-PAD com DSR-S vardel Δ4Ν, ou seja,pelo menos 95% de uniões de a-1,6).

Exemplo 8

Síntese de Dextrana por DSR-S Núcleo Vardel ε DSR-S Núcleo AA

As variantes DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleo ΔΑ tambémforam levemente degradadas durante a expressão por E. coli TOP sob ascondições descritas no Exemplo 2. Da mesma forma que para o caso davariante DSR-S vardel Δ3, entretanto, somente a forma integral, que era avasta maioria, era ativa de acordo com o zimograma (resultados não exibidos).

A temperatura de atividade ideal para estas variantes também foide 20 0C. A produção atingiu, portanto, 38 e 180 U/l de cultivo para DSR-Snúcleo vardel e DSR-S núcleo ΔΑ, respectivamente.

Sínteses de dextrana foram conduzidas a 20 0C e 10 0C utilizando100 a 250 g/l de sacarose em tampão que contém 50 mM de acetato de sódio,pH 5,2, 0,05 g/l de CaCI2 e 1 U/ml de extrato enzimático (não purificado). Oconsumo de sacarose foi monitorado por meio de análises de HPAEC-PAD eas sínteses foram suspensas (5 min, 95 0C) após completa exaustão (menosde 48 horas). Os produtos formados foram analisados por meio de HPAEC-PAD e HPSEC e a sua concentração foi quantificada conforme descrito no

Exemplo 5.

A Figura 15 exibe o perfil dos produtos sintetizados a 20 0C pelasduas variantes (cromatograma de HPSEC). Pode-se observar claramente que,com estas variantes e ao contrário de DSR-S vardel Δ4Ν e DSR-S vardel Δ3, aprincipal população de dextrana formada possuía massa molar de cerca de10.000 Da com a base do pico entre 1300 e 52.000 (a meia altura entre 5000 e22.000). Com a variante DSR-S núcleo ΔΑ, a síntese de dextrana HMW foicompletamente abolida (Tabela 5). Redução da temperatura para 10°C poderáaumentar os rendimentos de dextrana com cerca de 10.000 Da sem diferençasignificativa de tamanho, como foi o caso com DSR-S vardel Δ3 (Tabela 5). Asíntese de dextrana com a variante DSR-S núcleo ΔΑ atingiu, portanto,rendimento de 75%. Rendimento equivalente foi obtido com a variante DSR-Snúcleo vardel quando a concentração inicial de sacarose foi de 250 g/l(resultados não exibidos).

Tabela 5

Percentual de Unidades de Glicosila Incorporadas a Diferentes ProdutosSintetizados por DSR-S Núcleo Vardel ε DSR-S Núcleo aa a 10 °C ε 20 °C a

Partir de 100 g/l de Sacarose

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1 nd: não detectado.

2 grau de polimerização calculado a partir do tempo deretenção estimado no limite inferior de pico de 10.000 Da.

Análise HPAEC-PAD da dextrana sintetizada a partir de 100 g/l desacarose a 20 0C pelas diferentes variantes demonstrou a polidispersão muitoalta do produto (Figura 16), contendo isomalto-oligossacarídeos com DP 2 aDP de cerca de 60 para DSR-S núcleo ΔΑ em particular.

Para todas as dextranas sintetizadas por DSR-S núcleo vardel eDSR-S núcleo ΔΑ a 10 0C e 20 0C e utilizando 100 a 250 g/l de sacarose, osperfis de digestão de endodextranase (vide Exemplo 5) conduzidosconfirmaram que a especificidade de união de DSR-S foi inalterada (mesmo osperfis de oligossacarídeos detectados por HPAEC-PAD em comparação comDSR-S vardel Δ4Ν, portanto pelo menos 95% de uniões a-1,6).

Exemplo 9

Reação de Aceitador com Glicose

Reações de aceitador foram conduzidas a 20 0C com razão desacarose/glicose de 2 (100 g/l de sacarose, 50 g/l de glicose), 1 U/ml de extratode DSR-S vardel Δ4Ν, DSR-S vardel Δ3, DSR-S núcleo vardel e DSR-S núcleoΔΑ em tampão que contém 50 mM de acetato de sódio sob pH 5,2 e 0,05 g/l deCaCI2. O consumo total de sacarose foi monitorado por meio de HPAEC-PAD eas reações foram suspensas após a sua completa exaustão. Todas asvariantes sintetizaram isomalto-oligossacarídeos (IMO) com DP 2 a cerca de30, para prejuízo da síntese de polímero com DP mais alto.

Os rendimentos obtidos, entretanto, foram mais altos para asvariantes truncadas de unidades A. Desta forma, a produção de IMO atingiu52% no caso de DSR-S vardel Δ3 e 58% para DSR-S núcleo vardel e DSR-Snúcleo ΔΑ, contra 47% no caso de DSR-S vardel Δ4Ν. A distribuição deoligossacarídeos também foi modificada (Figura 17).

Para DSR-S vardel Δ3, a proporção entre IMO com DP 2 a DP 15foi menor que a de produtos sintetizados por DSR-S vardel Δ4Ν. A situaçãoreverteu-se para IMOs com DP de mais de 15.

De forma similar, os mutantes DSR-S núcleo vardel e DSR-Snúcleo ΔΑ demonstraram melhor desempenho para a síntese de IMO com altoDP que DSR-S vardel Δ4Ν ou DSR-S nativo (DP essencialmente 2 a 15): aprodução de IMO com DP 12 a DP 27 foi duas a cinco vezes mais alta comestas duas variantes (de acordo com a razão entre as extensões obtidas pormeio de HPAEC-PAD).

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<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUEINSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUEINSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE TOULOUSE

<120> CONSTRUÇÃO DE NOVAS VARIANTES DE DEXTRAN-SUCRASE DSR-S PELAENGENHARIA GENÉTICA

<130> B6624A-JAZ/JV

<140> Novo pedido de patente PCT<141> 08-02-2007

<150> FR 06/01117<151> 08-02-2006

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 4356

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada<400> 1

atgggatctg ataaaattat tcatctgact gatgattctt ttgatactgagcagatggtg caatcctggt tgatttctgg gcacactggt gcggtccgtggctccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgtaacatcgatc acaacccggg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtatctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtcttgaaagagt tcctcgacgc taacctggcc ggctctggat ccggtgatgactcgccctta tgacacaaca agttagcggc aagtacgttg aaaaagacggtattattttg atgatggcaa aaatgctaaa ggtttatcaa cgatagacaatatttttacg agagtggtaa acaagccaaa ggacagtatg tcacaattgatattattttg ataagggctc aggtgatgag ttaactggtc tgcaaagcatatagttgctt ttaacgatga agggcaacaa atttttaatc aatattaccaggtacaacat actactttga tgataaagga cacgctgcta ccggtattaa

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ctaaaggcta gagttcagta tgttgctggt 2220

gtgttaacaa gtgttcgcta tggtaaagat 2280

gagacgcgta ctgaaggtat tggagtcatc 2340

gatgggcata ctgtcacatt gcatatgggg 2400gcagctcata agaaccaagc ttatcgtgct ttgttatcaa caactgcaga tggattagct 2460tattatgata ctgatgaaaa tgcacctgtg gcgtacacag atgctaacgg cgatttgatt 2520tttacgaatg aatcaattta tggtgtacaa aatccacaag tttctggtta cttggcagtt 2580tgggttccgg taggtgcgca acaagatcaa gatgcacgaa cggcctctga tacaacaaca 2640aacacgagtg ataaagtgtt ccattcaaac gctgctcttg attctcaagt catctacgaa 2700ggtttctcaa acttccaagc atttgctaca gacagcagtg aatatacaaa cgtagtcatc 2760gctcagaatg cggaccaatt taagcaatgg ggtgtgacaa gcttccaatt ggcaccacaa 2820tatcgttcaa gtacagatac aagtttcttg gattcaatta ttcaaaacgg gtatgcattc 2880acggatcgtt atgacttagg ttatggcaca ccgacaaaat atggaactgc tgatcagttg 2940cgcgatgcta ttaaagcctt acatgctagc ggtattcaag ccattgccga ttgggtgccg 3000gaccaaattt ataatttgcc agagcaagaa ttagctactg tcacaagaac aaattcattt 3060ggagatgacg atacagattc tgatattgac aatgccttat atgttgtaca aagtcgtggg 3120ggtggtcaat atcaagagat gtatggtggt gccttcttag aagagttaca ggcactctat 3180ccatccctat ttaaagtgaa tcaaatctca actggcgttc caattgatgg cagtgtaaag 3240attactgagt gggcggctaa gtacttcaat ggctctaaca tccaaggtaa aggtgctgga 3300tacgtattga aagatatggg ttctaataag tactttaagg tcgtttcgaa cactgaggat 3360ggtgactact taccaaaaca gttaactaat gatctgtcag aaactggctt tacacacgat 3420gataaaggaa tcatctatta tacattaagt ggttatcgtg cccaaaatgc atttattcaa 3480gatgatgata ataactatta ctattttgat aaaacaggtc atttagtaac aggtttgcaa 3540aagattaata accataccta cttcttctta cctaatggta tcgaactggt caagagcttc 3600ttacaaaacg aagatggtac aattgtttat ttcgataaga aaggtcatca agtttttgat 3660caatatataa ctgatcaaaa tggaaatgcg tattactttg atgatgctgg tgtaatgctt 3720aaatcagggc ttgcaacgat tgatggacat caacagtatt ttgatcaaaa tggtgtgcag 3780gttaaggata agtttgtgat tggcactgat ggttataagt attactttga accaggtagt 3840ggtaacttag ctatcctacg ttatgtgcaa aatagtaaga atcaatggtt ctattttgat 3900ggtaatggcc atgctgtcac tggtttccaa acaattaatg gtaaaaaaca atatttctat 39604092

aatgatggtc atcaaagtaa aggtgaattc attgatgcag acgggtacaa gggcgagctt 4020gaaggtaagc ctatccctaa ccctctcctc ggtctcgatt ctacgcgtac cggtcatcat 4080

caccatcacc at

<210> 3

<211> 3495

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada

<400> 3

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60120180240300360420480

gcagatggtg caatcctggt tgatttctgg gcacactggt gcggtccgtg caaaatgatcgctccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactgaacatcgatc acaacccggg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctgctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcagttgaaagagt tcctcgacgc taacctggcc ggctctggat ccggtgatga cgatgacaagctcgccctta tgacacaaca agttagcggc aagtacgttg aaaaagacgg tagttggtattattattttg atgatggcaa aaatgctaaa ggtttatcaa cgatagacaa caatattcaatatttttacg agagtggtaa acaagccaaa ggacagtatg tcacaattga taatcaaaca 540tattattttg ataagggctc aggtgatgag ttaactggtc tgcaaagcat tgatgggaac 600atagttgctt ttaacgatga agggcaacaa atttttaatc aatattacca atctgaaaat 660ggtacaacat actactttga tgataaagga cacgctgcta ccggtattaa gaatatcgag 720ggcaaaaatt attattttga taatcttggg caactaaaaa aaggcttctc tggtgtgatt 780gatggtcaaa taatgacatt tgatcaggaa acagggcaag aagtttctaa cacaacttct 840gaaataaaag aaggtttgac gactcaaaac acggattata gcgaacataa tgcagcccac 900ggtacggatg ctgaggactt tgaaaatatt gacggctatt taacagctag ttcatggtat 960cgtccaacag gtattttacg taacggaaca gactgggaac cttctacaga tacagatttc 1020agaccaatat tgtcagtgtg gtggccagat aagaacaccc aggtcaatta tttaaattac 1080atggctgatt tagggtttat cagtaatgcg gacagttttg aaactgggga tagccaaagc 1140ttattaaatg aagcaagtaa ctatgttcaa aaatcaattg aaatgaaaat tagtgcgcaa 1200caaagtacag agtggttaaa ggatgcaatg gcggccttca ttgtcgcgca accacagtgg 1260aatgaaacta gtgaagatat gagcaatgac catttacaaa atggcgcatt aacttatgtc 1320aacagtccac tgacacctga cgctaattca aactttagac tacttaatcg gacaccaaca 1380aaccagactg gtgaacaagc gtataattta gataattcaa aaggtggttt tgaattgttg 1440ttagccaatg acgttgataa ttcaaaccct gtagtacaag cagaacaatt gaattggtta 1500tattatttaa tgaattttgg tacgattacg gccaacgacg cggatgctaa ttttgatggt 1560attcgtgtag atgcagtcga caatgtggat gctgatttgt tacaaattgc tgccgattat 1620ttcaaactag cttacggtgt tgatcaaaat gatgctactg ctaatcagca tctttcaatt 1680ttggaagatt ggagtcacaa tgatcctttg tatgtaacag atcaaggaag caatcaatta 1740accatggatg attatgtgca cacacaatta atctggtctc taacaaaatc atctgacata 1800cgaggtacaa tgcagcgctt cgtggattat tatatggtgg atcgatctaa tgatagtaca 1860gaaaacgaag ccattcctaa ttacagcttt gtacgtgcac acgacagcga agtgcaaacg 1920gttattgccc aaattgtttc cgatttgtat cctgatgttg aaaatagttt agcaccaaca 1980acagaacaat tggcagctgc tttcaaagta tacaatgaag atgaaaaatt agcagacaaa 2040aagtacacac aatataatat ggctagtgct tatgcgatgt tgctaaccaa taaggatact 2100gttcctcgtg tctattatgg cgatttatat acagatgatg gtcaatatat ggcaacaaag 2160tcaccatact atgatgcgat taacactttg ctaaaggcta gagttcagta tgttgctggt 2220ggccaatcga tgtccgttga tagtaatgac gtgttaacaa gtgttcgcta tggtaaagat 2280gccatgacag cttctgacac tggaacatct gagacgcgta ctgaaggtat tggagtcatc 2340gtcagcaata acgcggagct acaattagag gatgggcata ctgtcacatt gcatatgggg 2400gcagctcata agaaccaagc ttatcgtgct ttgttatcaa caactgcaga tggattagct 2460tattatgata ctgatgaaaa tgcacctgtg gcgtacacag atgctaacgg cgatttgatt 2520tttacgaatg aatcaattta tggtgtacaa aatccacaag tttctggtta cttggcagtt 2580tgggttccgg taggtgcgca acaagatcaa gatgcacgaa cggcctctga tacaacaaca 2640aacacgagtg ataaagtgtt ccattcaaac gctgctcttg attctcaagt catctacgaa 2700ggtttctcaa acttccaagc atttgctaca gacagcagtg aatatacaaa cgtagtcatc 2760gctcagaatg cggaccaatt taagcaatgg ggtgtgacaa gcttccaatt ggcaccacaa 2820tatcgttcaa gtacagatac aagtttcttg gattcaatta ttcaaaacgg gtatgcattc 2880acggatcgtt atgacttagg ttatggcaca ccgacaaaat atggaactgc tgatcagttg 2940cgcgatgcta ttaaagcctt acatgctagc ggtattcaag ccattgccga ttgggtgccg 3000gaccaaattt ataatttgcc agagcaagaa ttagctactg tcacaagaac aaattcattt 3060ggagatgacg atacagattc tgatattgac aatgccttat atgttgtaca aagtcgtggg 3120ggtggtcaat atcaagagat gtatggtggt gccttcttag aagagttaca ggcactctat 3180ccatccctat ttaaagtgaa tcaaatctca actggcgttc caattgatgg cagtgtaaag 3240attactgagt gggcggctaa gtacttcaat ggctctaaca tccaaggtaa aggtgctgga 3300tacgtattga aagatatggg ttctaataag tactttaagg tcgtttcgaa cactgaggat 3360ggtgactact taccaaaaca gttaactaat gatctgtcag aaactggcta caagggcgag 3420cttgaaggta agcctatccc taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat 3480catcaccatc accat 3495

<210> 4

<211> 3105

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada<400> 4

atgggatctg ataaaattat tcatctgact gatgattctt ttgatactga tgtacttaag 60

gcagatggtg caatcctggt tgatttctgg gcacactggt gcggtccgtg caaaatgatc 120

gctccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactg 180

aacatcgatc acaacccggg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg 240

ctgctgttca aaaacggtga agtggcggca accaaagtgg gtgcactgtc taaaggtcag 300

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ctcgccctta tgggcttctc tggtgtgatt gatggtcaaa taatgacatt tgatcaggaa 420

acagggcaag aagtttctaa cacaacttct gaaataaaag aaggtttgac gactcaaaac 480540600660720780840900960

acggattata gcgaacataa tgcagcccac ggtacggatg ctgaggactt tgaaaatattgacggctatt taacagctag ttcatggtat cgtccaacag gtattttacg taacggaacagactgggaac cttctacaga tacagatttc agaccaatat tgtcagtgtg gtggccagataagaacaccc aggtcaatta tttaaattac atggctgatt tagggtttat cagtaatgcggacagttttg aaactgggga tagccaaagc ttattaaatg aagcaagtaa ctatgttcaaaaatcaattg aaatgaaaat tagtgcgcaa caaagtacag agtggttaaa ggatgcaatggcggccttca ttgtcgcgca accacagtgg aatgaaacta gtgaagatat gagcaatgaccatttacaaa atggcgcatt aacttatgtc aacagtccac tgacacctga cgctaattca

aactttagac tacttaatcg gacaccaaca aaccagactg gtgaacaagc gtataattta 1020

gataattcaa aaggtggttt tgaattgttg ttagccaatg acgttgataa ttcaaaccct 1080

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gccaacgacg cggatgctaa ttttgatggt attcgtgtag atgcagtcga caatgtggat 1200

gctgatttgt tacaaattgc tgccgattat ttcaaactag cttacggtgt tgatcaaaat 1260

gatgctactg ctaatcagca tctttcaatt ttggaagatt ggagtcacaa tgatcctttg 1320

tatgtaacag atcaaggaag caatcaatta accatggatg attatgtgca cacacaatta 1380

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tatgcgatgt tgctaaccaa taaggatact gttcctcgtg tctattatgg cgatttatat 1740

acagatgatg gtcaatatat ggcaacaaag tcaccatact atgatgcgat taacactttg 1800

ctaaaggcta gagttcagta tgttgctggt ggccaatcga tgtccgttga tagtaatgac 1860

gtgttaacaa gtgttcgcta tggtaaagat gccatgacag cttctgacac tggaacatct 1920

gagacgcgta ctgaaggtat tggagtcatc gtcagcaata acgcggagct acaattagag 1980

gatgggcata ctgtcacatt gcatatgggg gcagctcata agaaccaagc ttatcgtgct 2040ttgttatcaa caactgcaga tggattagct tattatgata ctgatgaaaa tgcacctgtg 2100

gcgtacacag atgctaacgg cgatttgatt tttacgaatg aatcaattta tggtgtacaa 2160

aatccacaag tttctggtta cttggcagtt tgggttccgg taggtgcgca acaagatcaa 2220

gatgcacgaa cggcctctga tacaacaaca aacacgagtg ataaagtgtt ccattcaaac 2280

gctgctcttg attctcaagt catctacgaa ggtttctcaa acttccaagc atttgctaca 2340

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ccgacaaaat atggaactgc tgatcagttg cgcgatgcta ttaaagcctt acatgctagc 2580

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aatgccttat atgttgtaca aagtcgtggg ggtggtcaat atcaagagat gtatggtggt 2760

gccttcttag aagagttaca ggcactctat ccatccctat ttaaagtgaa tcaaatctca 2820

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tactttaagg tcgtttcgaa cactgaggat ggtgactact taccaaaaca gttaactaat 3000

gatctgtcag aaactggcta caagggcgag cttgaaggta agcctatccc taaccctctc 3060

ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accat 3105

<210> 5

<211> 4356

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase mutante

<400> 5

atgggatctg ataaaattat tcatctgact gatgattctt ttgatactga tgtacttaag

gcagatggtg caatcctggt tgatttctgg gcacactggt gcggtccgtg caaaatgatcgctccgattc tggatgaaat cgctgacgaa tatcagggca aactgaccgt tgcaaaactgaacatcgatc acaacccggg cactgcgccg aaatatggca tccgtggtat cccgactctg 240

60120180ctgctgttca aaaacggtga agtggcggcattgaaagagt tcctcgacgc taacctggccctcgccctta tgacacaaca agttagcggctattattttg atgatggcaa aaatgctaaatatttttacg agagtggtaa acaagccaaatattattttg ataagggctc aggtgatgagatagttgctt ttaacgatga agggcaacaaggtacaacat actactttga tgataaaggaggcaaaaatt attattttga taatcttggggatggtcaaa taatgacatt tgatcaggaagaaataaaag aaggtttgac gactcaaaacggtacggatg ctgaggactt tgaaaatattcgtccaacag gtattttacg taacggaacaagaccaatat tgtcagtgtg gtggccagatatggctgatt tagggtttat cagtaatgcgttattaaatg aagcaagtaa ctatgttcaacaaagtacag agtggttaaa ggatgcaatgaatgaaacta gtgaagatat gagcaatgacaacagtccac tgacacctga cgctaattcaaaccagactg gtgaacaagc gtataatttattagccaatg acgttgataa ttcaaacccttattatttaa tgaattttgg tacgattacgattcgtgtag atgcagtcga caatgtggatttcaaactag cttacggtgt tgatcaaaatttggaagatt ggagtcacaa tgatcctttgaccatggatg attatgtgca cacacaatta

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atctggtctc taacaaaatc atctgacata 1800cgaggtacaa tgcagcgctt cgtggattatgaaaacgaag ccattcctaa ttacagctttgttattgccc aaattgtttc cgatttgtatacagaacaat tggcagctgc tttcaaagtaaagtacacac aatataatat ggctagtgctgttcctcgtg tctattatgg cgatttatattcaccatact atgatgcgat taacactttgggccaatcga tgtccgttga tagtaatgacgccatgacag cttctgacac tggaacatctgtcagcaata acgcggagct acaattagaggcagctcata agaaccaagc ttatcgtgcttattatgata ctgatgaaaa tgcacctgtgtttacgaatg aatcaattta tggtgtacaatgggttccgg taggtgcgca acaagatcaaaacacgagtg ataaagtgtt ccattcaaacggtttctcaa acttccaagc atttgctacagctcagaatg cggaccaatt taagcaatggtatcgttcaa gtacagatac aagtttcttgacggatcgtt atgacttagg ttatggcacacgcgatgcta ttaaagcctt acatgctagcgaccaaattt ataatttgcc agagcaagaaggagatgacg atacagattc tgatattgacggtggtcaat atcaagagat gtatggtggtccatccctat ttaaagtgaa tcaaatctcaattactgagt gggcggctaa gtacttcaattacgtattga aagatatggg ttctaataagggtgactact taccaaaaca gttaactaat

tatatggtgg atcgatctaa tgatagtaca 1860

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aatccacaag tttctggtta cttggcagtt 2580

gatgcacgaa cggcctctga tacaacaaca 2640

gctgctcttg attctcaagt catctacgaa 2700

gacagcagtg aatatacaaa cgtagtcatc 2760

ggtgtgacaa gcttccaatt ggcaccacaa 2820

gattcaatta ttcaaaacgg gtatgcattc 2880

ccgacaaaat atggaactgc tgatcagttg 2940

ggtattcaag ccattgccga ttgggtgccg 3000

ttagctactg tcacaagaac aaattcattt 3060

aatgccttat atgttgtaca aagtcgtggg 3120

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gatgatgata ataactatta ctattttgat aaaacaggtc atttagtaac aggtttgcaa 3540

aagattaata accataccta cttcttctta cctaatggta tcgaactggt caagagcttc 3600

ttacaaaacg aagatggtac aattgtttat ttcgataaga aaggtcatca agtttttgat 3660

caatatataa ctgatcaaaa tggaaatgcg tattactttg atgatgctgg tgtaatgctt 3720

aaatcagggc ttgcaacgat tgatggacat caacagtatt ttgatcaaaa tggtgtgcag 3780

gttaaggata agtttgtgat tggcactgat ggttataagt attactttga accaggtagt 3840

ggtaacttag ctatcctacg ttatgtgcaa aatagtaaga atcaatggtt ctattttgat 3900

ggtaatggcc atgctgtcac tggtttccaa acaattaatg gtaaaaaaca atatttctat 3960

aatgatggtc atcaaagtaa aggtgaattc attgatgcag acggggatac tttctatacg 4020

agtgccactg atggtcgcct agtaactggt gttcagaaga ttaatggtat tacctatgct 4080

tttgataaca caggaaattt gatcacaaat cagtattatc aattagcaga tggtaaatat 4140

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agatacttcg atcaaaacgg tgagcaagtg aaagatgcta tcattgtgga tccagatact 4260

aacttgagtt acaagggcga gcttgaaggt aagcctatcc ctaaccctct cctcggtctc 4320

gattctacgc gtaccggtca tcatcaccat caccat 4356

<210> 6

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<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada

<400> 6

Met Cly Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr1 5 10 15

Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala His20 25 BO

Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala35 40 45Asp Clu Tyr Cln Cly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp His50 55 60

Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu65 70 75 80

Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu85 90 95

Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser100 105 HO

Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ala Leu Met Thr Gln Gln Val115 120 125

Ser Gly Lys Tyr Val Glu Lys Asp Gly Ser Trp Tyr Tyr Tyr Phe AspIBO 135 140

Asp Gly Lys Asn Ala Lys Gly Leu Ser Thr Ile Asp Asn Asn Ile Gln145 150 155 160

Tyr Phe Tyr Glu Ser Gly Lys Gln Ala Lys Gly Gln Tyr Val Thr Ile165 170 175

Asp Asn Gln Thr Tyr Tyr Phe Asp Lys Gly Ser Gly Asp Glu Leu Thr180 185 190

Gly Leu Gln Ser Ile Asp Gly Asn Ile Val Ala Phe Asn Asp Glu Gly195 200 205

Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr Tyr Cln Ser Clu Asn Gly Thr Thr Tyr210 215 220

Tyr Phe Asp Asp Lys Gly His Ala Ala Thr Gly Ile Lys Asn Ile Glu225 230 235 240

Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Asp Asn Leu Cly Cln Leu Lys Lys Cly Phe245 250 ' 255Ser Cly Val Ile Asp Gly Cln Ile Met Thr Phe Asp Gln Clu Thr Cly260 265 270

Gln Glu Val Ser Asn Thr Thr Ser Glu Ile Lys Glu Cly Leu Thr Thr275 280 285

Gln Asn Thr Asp Tyr Ser Glu His Asn Ala Ala His Gly Thr Asp Ala290 295 300

Glu Asp Phe Glu Asn Ile Asp Gly Tyr Leu Thr Ala Ser Ser Trp Tyr310 315 320

305

Arg

Pro Thr Gly Ile Leu Arg Asn Gly Thr Asp Trp Glu Pro Ser Thr

325

330

335

Asp Thr Asp Phe Arg Pro Ile Leu Ser Val Trp Trp Pro Asp Lys Asn340 345 350

Thr Gln Val Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Ala Asp Leu Gly Phe Ile Ser355 360 365

Asn Ala Asp Ser Phe Glu Thr Gly Asp Ser Gln Ser Leu Leu Asn Glu370 375 380

Ala Ser Asn Tyr Val Gln Lys Ser Ile Glu Met Lys Ile Ser Ala Gln

395 400

385

390

Gln Ser Thr Glu Trp Leu Lys Asp Ala Met Ala Ala Phe Ile Val Ala405 410 415

Gln Pro Gln Trp Asn Clu Thr Ser Glu Asp Met Ser Asn Asp His Leu420 425 430

Gln Asn Gly Ala Leu Thr Tyr Val Asn Ser Pro Leu Thr Pro Asp Ala435 440 445

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His Lys Asn Gln Ala Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Thr Thr Ala Asp Gly675 680 685

Leu Ala Tyr Tyr Asp Thr Asp Glu Asn Ala Pro Val Ala Tyr Thr Asp690 695 700

Ala Asn Gly Asp Leu Ile Phe Thr Asn Glu Ser Ile Tyr Gly Val Gln705 710 715 720

Asn Pro Gln Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Trp Val Pro Val Gly Ala725 730 735

Gln Gln Asp Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ser Asp Thr Thr Thr Asn Thr740 745 750

Ser Asp Lys Val Phe His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser Gln Val Ile755 760 765Tyr Glu Cly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Asp Ser Ser Glu770 775 780

Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Gln Asn Ala Asp Gln Phe Lys Gln Trp785 790 795 800

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Arg Tyr Asp Leu Gly Tyr Gly Thr Pro Thr Lys Tyr Gly Thr Ala Asp835 840 845

Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu His Ala Ser Gly Ile Gln Ala850 855 860

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Leu Ala Thr Val Thr Arg Thr Asn Ser Phe Gly Asp Asp Asp Thr Asp885 890 895

Ser Asp Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Val Val Gln Ser Arg Gly Gly Gly900 905 910

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<210> 10<211> 1452<212> PRT<213> Artificial<220> <223> Dextrana sacarase<400> 10

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Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu65 70 75 80

Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu85 90 95

Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser100 105 110Gly Ser Cly Asp Asp Asp Asp Lys Leu Ala Leu Met Thr Cln Gln Val115 120 125

Ser Gly Lys Tyr Val Glu Lys Asp Gly Ser Trp Tyr Tyr Tyr Phe Asp130 135 140

Asp Gly Lys Asn Ala Lys Gly Leu Ser Thr Ile Asp Asn Asn Ile Gln145 150 155 160

Tyr Phe Tyr Glu Ser Gly Lys Gln Ala Lys Gly Gln Tyr Val Thr Ile165 170 175

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Gly Leu Gln Ser Ile Asp Gly Asn Ile Val Ala Phe Asn Asp Glu Gly195 200 205

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Tyr Phe Asp Asp Lys Gly His Ala Ala Thr Gly Ile Lys Asn Ile Glu225 230 235 240

Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Asp Asn Leu Gly Gln Leu Lys Lys Gly Phe245 250 255

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Glu Asp Phe Glu Asn Ile Asp Gly Tyr Leu Thr Ala Ser Ser Trp Tyr305 310 315 320Arg Pro Thr Cly Ile Leu Arg Asn Gly Thr Asp Trp Clu Pro Ser Thr325 BBO 335

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Cln Ser Thr Glu Trp Leu Lys Asp Ala Met Ala Ala Phe Ile Val Ala405 410 415

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Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val Gln Ala Clu Cln485 490 495

Leu Asn Trp Leu Tyr Tyr Leu Met Asn Phe Cly Thr Ile Thr Ala Asn500 505 510

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Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr Phe Lys Leu Ala530 535 540Tyr Gly Val Asp Cln Asn Asp Ala Thr Ala Asn Cln His Leu Ser Ile545 550 555 560

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Ser Asn Gln Leu Thr Met Asp Asp Tyr Val His Thr Gln Leu Ile Trp580 585 590

Ser Leu Thr Lys Ser Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met Gln Arg Phe Val595 600 605

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Val Ile Ala Gln Ile Val Ser Asp Leu Tyr Pro Asp Val Glu Asn Ser645 650 655

Leu Ala Pro Thr Thr Glu Gln Leu Ala Ala Ala Phe Lys Val Tyr Asn660 665 670

Glu Asp Glu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln Tyr Asn Met Ala675 680 685

Ser Ala Tyr Ala Met Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr Val Pro Arg Val690 695 700

Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala Thr Lys705 710 715 720

Ser Pro Tyr Tyr Asp Ala Ile Asn Thr Leu Leu Lys Ala Arg Val Gln725 730 735

Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ser Met Ser Val Asp Ser Asn Asp Val Leu740 745 750Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Asp Ala Met Thr Ala Ser Asp Thr Cly755 760 765

Thr Ser Glu Thr Arg Thr Glu Gly Ile Gly Val Ile Val Ser Asn Asn770 775 780

Ala Glu Leu Gln Leu Glu Asp Gly His Thr Val Thr Leu His Met Gly785 790 795 800

Ala Ala His Lys Asn Gln Ala Tyr Arg Ala Leu Leu Ser Thr Thr Ala805 810 815

Asp Gly Leu Ala Tyr Tyr Asp Thr Asp Glu Asn Ala Pro Val Ala Tyr820 825 830

Thr Asp Ala Asn Gly Asp Leu Ile Phe Thr Asn Glu Ser Ile Tyr Gly835 840 845

Val Gln Asn Pro Gln Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val Trp Val Pro Val850 855 860

Gly Ala Gln Gln Asp Gln Asp Ala Arg Thr Ala Ser Asp Thr Thr Thr865 870 875 880

Asn Thr Ser Asp Lys Val Phe His Ser Asn Ala Ala Leu Asp Ser Gln885 890 895

Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe Ala Thr Asp Ser900 905 910

Ser Glu Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Gln Asn Ala Asp Gln Phe Lys915 920 925

Gln Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln Tyr Arg Ser Ser930 935 940

Thr Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe945 950 955 960Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Cly Tyr Gly Thr Pro Thr Lys Tyr Gly Thr965 970 975

Ala Asp Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu His Ala Ser Gly Ile980 985 990

Gln Ala Ile Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Ile Tyr Asn Leu Pro Glu995 1000 1005

Gln Glu Leu Ala Thr Val Thr Arg Thr Asn Ser Phe Gly Asp Asp1010 1015 1020

Asp Thr Asp Ser Asp Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Val Val Gln Ser1025 1030 1035

Arg Gly Gly Gly Gln Tyr Gln Glu Met Tyr Gly Gly Ala Phe Leu1040 1045 1050

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Ala Gly Tyr Val Leu Lys Asp Met Gly Ser Asn Lys Tyr Phe Lys1100 1105 HlO

Val Val Ser Asn Thr Glu Asp Gly Asp Tyr Leu Pro Lys Gln Leu1115 1120 1125

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Ile Ile Tyr Tyr Thr Leu Ser Gly Tyr Arg Ala Gln Asn Ala Phe1145 1150 1155

Ile Gln Asp Asp Asp Asn Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Lys Thr Gly1160 H65 1170His Leu Val Thr Cly Leu Cln Lys Ile Asn Asn His Thr Tyr Phe1175 1180 1185

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Glu Asp Gly Thr Ile Val Tyr Phe Asp Lys Lys Gly His Gln Val1205 1210 1215

Phe Asp Gln Tyr Ile Thr Asp Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Tyr Phe1220 1225 12BO

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Phe Gln Thr Ile Asn Gly Lys Lys Gln Tyr Phe Tyr Asn Asp Gly1310 1315 1320

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Ile Asn Gly Ile Thr Tyr Ala Phe Asp Asn Thr Gly Asn Leu Ile1355 1360 1365Thr Asn Cln Tyr Tyr Gln Leu Ala Asp Cly Lys Tyr Met Leu Leu1370 1375 1380

Asp Asp Ser Gly Arg Ala Lys Thr Gly Phe Val Leu Gln Asp Gly1385 1390 1395

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Ile Ile Val Asp Pro Asp Thr Asn Leu Ser Tyr Lys Gly Glu Leu1415 1420 1425

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<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 11

ggcttctctg gtgtgatt

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 12

gatctgtcag aaactggc

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Primer

<400> 13

acacaacaag ttagcggc

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 14

ccagatacta acttgagt

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 15

ttcattgatg cagacggg

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Primer

<400> 16

cacgactacg acgcgcaa

<210> 17

<211> 3897

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada

<400> 17acacaacaag ttagcggcaa gtacgttgaa aaagacggta gttggtatta ttattttgat 60

gatggcaaaa atgctaaagg tttatcaacg atagacaaca atattcaata tttttacgag 120

agtggtaaac aagccaaagg acagtatgtc acaattgata atcaaacata ttattttgat 180

aagggctcag gtgatgagtt aactggtctg caaagcattg atgggaacat agttgctttt 240

aacgatgaag ggcaacaaat ttttaatcaa tattaccaat ctgaaaatgg tacaacatac 300

tactttgatg ataaaggaca cgctgctacc ggtattaaga atatcgaggg caaaaattat 360

tattttgata atcttgggca actaaaaaaa ggcttctctg gtgtgattga tggtcaaata 420

atgacatttg atcaggaaac agggcaagaa gtttctaaca caacttctga aataaaagaa 480

ggtttgacga ctcaaaacac ggattatagc gaacataatg cagcccacgg tacggatgct 540

gaggactttg aaaatattga cggctattta acagctagtt catggtatcg tccaacaggt 600

attttacgta acggaacaga ctgggaacct tctacagata cagatttcag accaatattg 660

tcagtgtggt ggccagataa gaacacccag gtcaattatt taaattacat ggctgattta 720

gggtttatca gtaatgcgga cagttttgaa actggggata gccaaagctt attaaatgaa 780

gcaagtaact atgttcaaaa atcaattgaa atgaaaatta gtgcgcaaca aagtacagag 840

tggttaaagg atgcaatggc ggccttcatt gtcgcgcaac cacagtggaa tgaaactagt 900

gaagatatga gcaatgacca tttacaaaat ggcgcattaa cttatgtcaa cagtccactg 960

acacctgacg ctaattcaaa ctttagacta cttaatcgga caccaacaaa ccagactggt 1020

gaacaagcgt ataatttaga taattcaaaa ggtggttttg aattgttgtt agccaatgac 1080

gttgataatt caaaccctgt agtacaagca gaacaattga attggttata ttatttaatg 1140

aattttggta cgattacggc caacgacgcg gatgctaatt ttgatggtat tcgtgtagat 1200

gcagtcgaca atgtggatgc tgatttgtta caaattgctg ccgattattt caaactagct 1260

tacggtgttg atcaaaatga tgctactgct aatcagcatc tttcaatttt ggaagattgg 1320

agtcacaatg atcctttgta tgtaacagat caaggaagca atcaattaac catggatgat 1380

tatgtgcaca cacaattaat ctggtctcta acaaaatcat ctgacatacg aggtacaatg 1440

cagcgcttcg tggattatta tatggtggat cgatctaatg atagtacaga aaacgaagcc 1500

attcctaatt acagctttgt acgtgcacac gacagcgaag tgcaaacggt tattgcccaa 1560

attgtttccg atttgtatcc tgatgttgaa aatagtttag caccaacaac agaacaattg 1620gcagctgctt tcaaagtata caatgaagat gaaaaattag cagacaaaaa gtacacacaa 1680

tataatatgg ctagtgctta tgcgatgttg ctaaccaata aggatactgt tcctcgtgtc 1740

tattatggcg atttatatac agatgatggt caatatatgg caacaaagtc accatactat 1800

gatgcgatta acactttgct aaaggctaga gttcagtatg ttgctggtgg ccaatcgatg 1860

tccgttgata gtaatgacgt gttaacaagt gttcgctatg gtaaagatgc catgacagct 1920

tctgacactg gaacatctga gacgcgtact gaaggtattg gagtcatcgt cagcaataac 1980

gcggagctac aattagagga tgggcatact gtcacattgc atatgggggc agctcataag 2040

aaccaagctt atcgtgcttt gttatcaaca actgcagatg gattagctta ttatgatact 2100

gatgaaaatg cacctgtggc gtacacagat gctaacggcg atttgatttt tacgaatgaa 2160

tcaatttatg gtgtacaaaa tccacaagtt tctggttact tggcagtttg ggttccggta 2220

ggtgcgcaac aagatcaaga tgcacgaacg gcctctgata caacaacaaa cacgagtgat 2280

aaagtgttcc attcaaacgc tgctcttgat tctcaagtca tctacgaagg tttctcaaac 2340

ttccaagcat ttgctacaga cagcagtgaa tatacaaacg tagtcatcgc tcagaatgcg 2400

gaccaattta agcaatgggg tgtgacaagc ttccaattgg caccacaata tcgttcaagt 2460

acagatacaa gtttcttgga ttcaattatt caaaacgggt atgcattcac ggatcgttat 2520

gacttaggtt atggcacacc gacaaaatat ggaactgctg atcagttgcg cgatgctatt 2580

aaagccttac atgctagcgg tattcaagcc attgccgatt gggtgccgga ccaaatttat 2640

aatttgccag agcaagaatt agctactgtc acaagaacaa attcatttgg agatgacgat 2700

acagattctg atattgacaa tgccttatat gttgtacaaa gtcgtggggg tggtcaatat 2760

caagagatgt atggtggtgc cttcttagaa gagttacagg cactctatcc atccctattt 2820

aaagtgaatc aaatctcaac tggcgttcca attgatggca gtgtaaagat tactgagtgg 2880

gcggctaagt acttcaatgg ctctaacatc caaggtaaag gtgctggata cgtattgaaa 2940

gatatgggtt ctaataagta ctttaaggtc gtttcgaaca ctgaggatgg tgactactta 3000

ccaaaacagt taactaatga tctgtcagaa actggcttta cacacgatga taaaggaatc 3060

atctattata cattaagtgg ttatcgtgcc caaaatgcat ttattcaaga tgatgataat 3120

aactattact attttgataa aacaggtcat ttagtaacag gtttgcaaaa gattaataac 3180catacctact tcttcttacc taatggtatc gaactggtca agagcttctt acaaaacgaa 3240

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gatcaaaatg gaaatgcgta ttactttgat gatgctggtg taatgcttaa atcagggctt 3360

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atcctacgtt atgtgcaaaa tagtaagaat caatggttct attttgatgg taatggccat 3540

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<210> 18<211> 3633<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada<400> 18

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tactttgatg ataaaggaca cgctgctacc ggtattaaga atatcgaggg caaaaattat 360

tattttgata atcttgggca actaaaaaaa ggcttctctg gtgtgattga tggtcaaata 420

atgacatttg atcaggaaac agggcaagaa gtttctaaca caacttctga aataaaagaa 480

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gcaagtaact atgttcaaaa atcaattgaa atgaaaatta gtgcgcaaca aagtacagag 840

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gaagatatga gcaatgacca tttacaaaat ggcgcattaa cttatgtcaa cagtccactg 960

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gaacaagcgt ataatttaga taattcaaaa ggtggttttg aattgttgtt agccaatgac 1080

gttgataatt caaaccctgt agtacaagca gaacaattga attggttata ttatttaatg 1140

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gatggtacaa ttgtttattt cgataagaaa ggtcatcaag tttttgatca atatataact 3300

gatcaaaatg gaaatgcgta ttactttgat gatgctggtg taatgcttaa atcagggctt 3360

gcaacgattg atggacatca acagtatttt gatcaaaatg gtgtgcaggt taaggataag 3420

tttgtgattg gcactgatgg ttataagtat tactttgaac caggtagtgg taacttagct 3480

atcctacgtt atgtgcaaaa tagtaagaat caatggttct attttgatgg taatggccat 3540

gctgtcactg gtttccaaac aattaatggt aaaaaacaat atttctataa tgatggtcat 3600

caaagtaaag gtgaattcat tgatgcagac ggg 3633

<210> 19<211> 3036<212> DNA<21Β> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada<400> 19

acacaacaag ttagcggcaa gtacgttgaa aaagacggta gttggtatta ttattttgat 60

gatggcaaaa atgctaaagg tttatcaacg atagacaaca atattcaata tttttacgag 120

agtggtaaac aagccaaagg acagtatgtc acaattgata atcaaacata ttattttgat 180

aagggctcag gtgatgagtt aactggtctg caaagcattg atgggaacat agttgctttt 240

aacgatgaag ggcaacaaat ttttaatcaa tattaccaat ctgaaaatgg tacaacatac 300

tactttgatg ataaaggaca cgctgctacc ggtattaaga atatcgaggg caaaaattat 360

tattttgata atcttgggca actaaaaaaa ggcttctctg gtgtgattga tggtcaaata 420

atgacatttg atcaggaaac agggcaagaa gtttctaaca caacttctga aataaaagaa 480

ggtttgacga ctcaaaacac ggattatagc gaacataatg cagcccacgg tacggatgct 540

gaggactttg aaaatattga cggctattta acagctagtt catggtatcg tccaacaggt 600

attttacgta acggaacaga ctgggaacct tctacagata cagatttcag accaatattg 660

tcagtgtggt ggccagataa gaacacccag gtcaattatt taaattacat ggctgattta 720

gggtttatca gtaatgcgga cagttttgaa actggggata gccaaagctt attaaatgaa 780

gcaagtaact atgttcaaaa atcaattgaa atgaaaatta gtgcgcaaca aagtacagag 840

tggttaaagg atgcaatggc ggccttcatt gtcgcgcaac cacagtggaa tgaaactagt 900

gaagatatga gcaatgacca tttacaaaat ggcgcattaa cttatgtcaa cagtccactg 960

acacctgacg ctaattcaaa ctttagacta cttaatcgga caccaacaaa ccagactggt 1020

gaacaagcgt ataatttaga taattcaaaa ggtggttttg aattgttgtt agccaatgac 1080

gttgataatt caaaccctgt agtacaagca gaacaattga attggttata ttatttaatg 1140

aattttggta cgattacggc caacgacgcg gatgctaatt ttgatggtat tcgtgtagat 1200

gcagtcgaca atgtggatgc tgatttgtta caaattgctg ccgattattt caaactagct 1260

tacggtgttg atcaaaatga tgctactgct aatcagcatc tttcaatttt ggaagattgg 1320

agtcacaatg atcctttgta tgtaacagat caaggaagca atcaattaac catggatgat 1380tatgtgcaca cacaattaat ctggtctcta acaaaatcat ctgacatacg aggtacaatg 1440

cagcgcttcg tggattatta tatggtggat cgatctaatg atagtacaga aaacgaagcc 1500

attcctaatt acagctttgt acgtgcacac gacagcgaag tgcaaacggt tattgcccaa 1560

attgtttccg atttgtatcc tgatgttgaa aatagtttag caccaacaac agaacaattg 1620

gcagctgctt tcaaagtata caatgaagat gaaaaattag cagacaaaaa gtacacacaa 1680

tataatatgg ctagtgctta tgcgatgttg ctaaccaata aggatactgt tcctcgtgtc 1740

tattatggcg atttatatac agatgatggt caatatatgg caacaaagtc accatactat 1800

gatgcgatta acactttgct aaaggctaga gttcagtatg ttgctggtgg ccaatcgatg 1860

tccgttgata gtaatgacgt gttaacaagt gttcgctatg gtaaagatgc catgacagct 1920

tctgacactg gaacatctga gacgcgtact gaaggtattg gagtcatcgt cagcaataac 1980

gcggagctac aattagagga tgggcatact gtcacattgc atatgggggc agctcataag 2040

aaccaagctt atcgtgcttt gttatcaaca actgcagatg gattagctta ttatgatact 2100

gatgaaaatg cacctgtggc gtacacagat gctaacggcg atttgatttt tacgaatgaa 2160

tcaatttatg gtgtacaaaa tccacaagtt tctggttact tggcagtttg ggttccggta 2220

ggtgcgcaac aagatcaaga tgcacgaacg gcctctgata caacaacaaa cacgagtgat 2280

aaagtgttcc attcaaacgc tgctcttgat tctcaagtca tctacgaagg tttctcaaac 2340

ttccaagcat ttgctacaga cagcagtgaa tatacaaacg tagtcatcgc tcagaatgcg 2400

gaccaattta agcaatgggg tgtgacaagc ttccaattgg caccacaata tcgttcaagt 2460

acagatacaa gtttcttgga ttcaattatt caaaacgggt atgcattcac ggatcgttat 2520

gacttaggtt atggcacacc gacaaaatat ggaactgctg atcagttgcg cgatgctatt 2580

aaagccttac atgctagcgg tattcaagcc attgccgatt gggtgccgga ccaaatttat 2640

aatttgccag agcaagaatt agctactgtc acaagaacaa attcatttgg agatgacgat 2700

acagattctg atattgacaa tgccttatat gttgtacaaa gtcgtggggg tggtcaatat 2760

caagagatgt atggtggtgc cttcttagaa gagttacagg cactctatcc atccctattt 2820

aaagtgaatc aaatctcaac tggcgttcca attgatggca gtgtaaagat tactgagtgg 2880

gcggctaagt acttcaatgg ctctaacatc caaggtaaag gtgctggata cgtattgaaa 2940

gatatgggtt ctaataagta ctttaaggtc gtttcgaaca ctgaggatgg tgactactta 3000ccaaaacagt taactaatga tctgtcagaa actggc 3036

<210> 20<211> 2646<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada<400> 20

ggcttctctg gtgtgattga tggtcaaata atgacatttg atcaggaaac agggcaagaa 60

gtttctaaca caacttctga aataaaagaa ggtttgacga ctcaaaacac ggattatagc 120

gaacataatg cagcccacgg tacggatgct gaggactttg aaaatattga cggctattta 180

acagctagtt catggtatcg tccaacaggt attttacgta acggaacaga ctgggaacct 240

tctacagata cagatttcag accaatattg tcagtgtggt ggccagataa gaacacccag 300

gtcaattatt taaattacat ggctgattta gggtttatca gtaatgcgga cagttttgaa 360

actggggata gccaaagctt attaaatgaa gcaagtaact atgttcaaaa atcaattgaa 420

atgaaaatta gtgcgcaaca aagtacagag tggttaaagg atgcaatggc ggccttcatt 480

gtcgcgcaac cacagtggaa tgaaactagt gaagatatga gcaatgacca tttacaaaat 540

ggcgcattaa cttatgtcaa cagtccactg acacctgacg ctaattcaaa ctttagacta 600

cttaatcgga caccaacaaa ccagactggt gaacaagcgt ataatttaga taattcaaaa 660

ggtggttttg aattgttgtt agccaatgac gttgataatt caaaccctgt agtacaagca 720

gaacaattga attggttata ttatttaatg aattttggta cgattacggc caacgacgcg 780

gatgctaatt ttgatggtat tcgtgtagat gcagtcgaca atgtggatgc tgatttgtta 840

caaattgctg ccgattattt caaactagct tacggtgttg atcaaaatga tgctactgct 900

aatcagcatc tttcaatttt ggaagattgg agtcacaatg atcctttgta tgtaacagat 960

caaggaagca atcaattaac catggatgat tatgtgcaca cacaattaat ctggtctcta 1020

acaaaatcat ctgacatacg aggtacaatg cagcgcttcg tggattatta tatggtggat 1080

cgatctaatg atagtacaga aaacgaagcc attcctaatt acagctttgt acgtgcacac 1140

gacagcgaag tgcaaacggt tattgcccaa attgtttccg atttgtatcc tgatgttgaa 1200aatagtttag caccaacaac agaacaattg gcagctgctt tcaaagtata caatgaagat 1260

gaaaaattag cagacaaaaa gtacacacaa tataatatgg ctagtgctta tgcgatgttg 1320

ctaaccaata aggatactgt tcctcgtgtc tattatggcg atttatatac agatgatggt 1380caatatatgg caacaaagtc accatactat gatgcgatta acactttgct aaaggctaga 1440

gttcagtatg ttgctggtgg ccaatcgatg tccgttgata gtaatgacgt gttaacaagt 1500

gttcgctatg gtaaagatgc catgacagct tctgacactg gaacatctga gacgcgtact 1560

gaaggtattg gagtcatcgt cagcaataac gcggagctac aattagagga tgggcatact 1620

gtcacattgc atatgggggc agctcataag aaccaagctt atcgtgcttt gttatcaaca 1680

actgcagatg gattagctta ttatgatact gatgaaaatg cacctgtggc gtacacagat 1740

gctaacggcg atttgatttt tacgaatgaa tcaatttatg gtgtacaaaa tccacaagtt 1800

tctggttact tggcagtttg ggttccggta ggtgcgcaac aagatcaaga tgcacgaacg 1860

gcctctgata caacaacaaa cacgagtgat aaagtgttcc attcaaacgc tgctcttgat 1920

tctcaagtca tctacgaagg tttctcaaac ttccaagcat ttgctacaga cagcagtgaa 1980

tatacaaacg tagtcatcgc tcagaatgcg gaccaattta agcaatgggg tgtgacaagc 2040

ttccaattgg caccacaata tcgttcaagt acagatacaa gtttcttgga ttcaattatt 2100

caaaacgggt atgcattcac ggatcgttat gacttaggtt atggcacacc gacaaaatat 2160

ggaactgctg atcagttgcg cgatgctatt aaagccttac atgctagcgg tattcaagcc 2220

attgccgatt gggtgccgga ccaaatttat aatttgccag agcaagaatt agctactgtc 2280

acaagaacaa attcatttgg agatgacgat acagattctg atattgacaa tgccttatat 2340

gttgtacaaa gtcgtggggg tggtcaatat caagagatgt atggtggtgc cttcttagaa 2400

gagttacagg cactctatcc atccctattt aaagtgaatc aaatctcaac tggcgttcca 2460

attgatggca gtgtaaagat tactgagtgg gcggctaagt acttcaatgg ctctaacatc 2520

caaggtaaag gtgctggata cgtattgaaa gatatgggtt ctaataagta ctttaaggtc 2580

gtttcgaaca ctgaggatgg tgactactta ccaaaacagt taactaatga tctgtcagaa 2640

actggc 2646

<210> 21<211> 3897<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> Mutante / truncado<400> 21

acacaacaag ttagcggcaa gtacgttgaa aaagacggta gttggtatta ttattttgat 60

gatggcaaaa atgctaaagg tttatcaacg atagacaaca atattcaata tttttacgag 120

agtggtaaac aagccaaagg acagtatgtc acaattgata atcaaacata ttattttgat 180

aagggctcag gtgatgagtt aactggtctg caaagcattg atgggaacat agttgctttt 240

aacgatgaag ggcaacaaat ttttaatcaa tattaccaat ctgaaaatgg tacaacatac 300

tactttgatg ataaaggaca cgctgctacc ggtattaaga atatcgaggg caaaaattat 360

tattttgata atcttgggca actaaaaaaa ggcttctctg gtgtgattga tggtcaaata 420

atgacatttg atcaggaaac agggcaagaa gtttctaaca caacttctga aataaaagaa 480

ggtttgacga ctcaaaacac ggattatagc gaacataatg cagcccacgg tacggatgct 540

gaggactttg aaaatattga cggctattta acagctagtt catggtatcg tccaacaggt 600

attttacgta acggaacaga ctgggaacct tctacagata cagatttcag accaatattg 660

tcagtgtggt ggccagataa gaacacccag gtcaattatt taaattacat ggctgattta 720

gggtttatca gtaatgcgga cagttttgaa actggggata gccaaagctt attaaatgaa 780

gcaagtaact atgttcaaaa atcaattgaa atgaaaatta gtgcgcaaca aagtacagag 840

tggttaaagg atgcaatggc ggccttcatt gtcgcgcaac cacagtggaa tgaaactagt 900

gaagatatga gcaatgacca tttacaaaat ggcgcattaa cttatgtcaa cagtccactg 960

acacctgacg ctaattcaaa ctttagacta cttaatcgga caccaacaaa ccagactggt 1020

gaacaagcgt ataatttaga taattcaaaa ggtggttttg aattgttgtt agccaatgac 1080

gttgataatt caaaccctgt agtacaagca gaacaattga attggttata ttatttaatg 1140

aattttggta cgattacggc caacgacgcg gatgctaatt ttgatggtat tcgtgtagat 1200

gcagtcgaca atgtggatgc tgatttgtta caaattgctg ccgattattt caaactagct 1260

tacggtgttg atcaaaatga tgctactgct aatcagcatc tttcaatttt ggaagattgg 1320

cagcgcttcg tggattatta tatggtggat cgatctaatg atagtacaga aaacgaagcc 1500

attcctaatt acagctttgt acgagctcac gactacgacg cgcaaacggt tattgcccaa 1560

attgtttccg atttgtatcc tgatgttgaa aatagtttag caccaacaac agaacaattg 1620

gcagctgctt tcaaagtata caatgaagat gaaaaattag cagacaaaaa gtacacacaa 1680

tataatatgg ctagtgctta tgcgatgttg ctaaccaata aggatactgt tcctcgtgtc 1740

tattatggcg atttatatac agatgatggt caatatatgg caacaaagtc accatactat 1800

gatgcgatta acactttgct aaaggctaga gttcagtatg ttgctggtgg ccaatcgatg 1860

tccgttgata gtaatgacgt gttaacaagt gttcgctatg gtaaagatgc catgacagct 1920

tctgacactg gaacatctga gacgcgtact gaaggtattg gagtcatcgt cagcaataac 1980

gcggagctac aattagagga tgggcatact gtcacattgc atatgggggc agctcataag 2040

aaccaagctt atcgtgcttt gttatcaaca actgcagatg gattagctta ttatgatact 2100

gatgaaaatg cacctgtggc gtacacagat gctaacggcg atttgatttt tacgaatgaa 2160

tcaatttatg gtgtacaaaa tccacaagtt tctggttact tggcagtttg ggttccggta 2220

ggtgcgcaac aagatcaaga tgcacgaacg gcctctgata caacaacaaa cacgagtgat 2280

aaagtgttcc attcaaacgc tgctcttgat tctcaagtca tctacgaagg tttctcaaac 2340

ttccaagcat ttgctacaga cagcagtgaa tatacaaacg tagtcatcgc tcagaatgcg 2400

gaccaattta agcaatgggg tgtgacaagc ttccaattgg caccacaata tcgttcaagt 2460

acagatacaa gtttcttgga ttcaattatt caaaacgggt atgcattcac ggatcgttat 2520

gacttaggtt atggcacacc gacaaaatat ggaactgctg atcagttgcg cgatgctatt 2580

aaagccttac atgctagcgg tattcaagcc attgccgatt gggtgccgga ccaaatttat 2640

aatttgccag agcaagaatt agctactgtc acaagaacaa attcatttgg agatgacgat 2700

acagattctg atattgacaa tgccttatat gttgtacaaa gtcgtggggg tggtcaatat 2760

caagagatgt atggtggtgc cttcttagaa gagttacagg cactctatcc atccctattt 2820

aaagtgaatc aaatctcaac tggcgttcca attgatggca gtgtaaagat tactgagtgg 2880

gcggctaagt acttcaatgg ctctaacatc caaggtaaag gtgctggata cgtattgaaa 2940

gatatgggtt ctaataagta ctttaaggtc gtttcgaaca ctgaggatgg tgactactta 3000ccaaaacagt taactaatga tctgtcagaa actggcttta cacacgatga taaaggaatc 3060

atctattata cattaagtgg ttatcgtgcc caaaatgcat ttattcaaga tgatgataat 3120

aactattact attttgataa aacaggtcat ttagtaacag gtttgcaaaa gattaataac 3180

catacctact tcttcttacc taatggtatc gaactggtca agagcttctt acaaaacgaa 3240

gatggtacaa ttgtttattt cgataagaaa ggtcatcaag tttttgatca atatataact 3300

gatcaaaatg gaaatgcgta ttactttgat gatgctggtg taatgcttaa atcagggctt 3360

gcaacgattg atggacatca acagtatttt gatcaaaatg gtgtgcaggt taaggataag 3420

tttgtgattg gcactgatgg ttataagtat tactttgaac caggtagtgg taacttagct 3480

atcctacgtt atgtgcaaaa tagtaagaat caatggttct attttgatgg taatggccat 3540

gctgtcactg gtttccaaac aattaatggt aaaaaacaat atttctataa tgatggtcat 3600

caaagtaaag gtgaattcat tgatgcagac ggggatactt tctatacgag tgccactgat 3660

ggtcgcctag taactggtgt tcagaagatt aatggtatta cctatgcttt tgataacaca 3720

ggaaatttga tcacaaatca gtattatcaa ttagcagatg gtaaatatat gttgttagat 3780

gatagtggtc gtgcgaaaac agggtttgta ttgcaagatg gtgtactaag atacttcgat 3840

caaaacggtg agcaagtgaa agatgctatc attgtggatc cagatactaa cttgagt 3897

<210> 22

<211> 1299

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Dextrana sacarase truncada<400> 22

Thr Gln Cln Val Ser Gly Lys Tyr Val Glu Lys Asp Gly Ser Trp Tyr15 10 15

Tyr Tyr Phe Asp Asp Gly Lys Asn Ala Lys Gly Leu Ser Thr Ile Asp20 25 30

Asn Asn Ile Gln Tyr Phe Tyr Glu Ser Gly Lys Gln Ala Lys Gly Gln35 40 45TyrVal Thr Ile Asp Asn Gln Thr Tyr Tyr Phe Asp Lys Cly Ser Gly50 55 60

Asp Glu Leu Thr Gly Leu Gln Ser Ile Asp Gly Asn Ile Val Ala Phe65 70 75 80

Asn Asp Glu Gly Gln Gln Ile Phe Asn Gln Tyr Tyr Gln Ser Glu Asn85 90 95

Gly Thr Thr Tyr Tyr Phe Asp Asp Lys Gly His Ala Ala Thr Gly Ile100 105 HO

Lys Asn Ile Glu Gly Lys Asn Tyr Tyr Phe Asp Asn Leu Gly Gln Leu115 120 125

Lys Lys Gly Phe Ser Gly Val Ile Asp Gly Gln Ile Met Thr Phe Asp130 135 140

Gln Glu Thr Gly Gln Glu Val Ser Asn Thr Thr Ser Glu Ile Lys Glu145 150 155 160

Gly Leu Thr Thr Gln Asn Thr Asp Tyr Ser Glu His Asn Ala Ala His165 170 175

Gly Thr Asp Ala Glu Asp Phe Glu Asn Ile Asp Gly Tyr Leu Thr Ala180 185 190

Ser Ser Trp Tyr Arg Pro Thr Gly Ile Leu Arg Asn Gly Thr Asp Trp195 200 205

Glu Pro Ser Thr Asp Thr Asp Phe Arg Pro Ile Leu Ser Val Trp Trp210 215 220

Pro Asp Lys Asn Thr Gln Val Asn Tyr Leu Asn Tyr Met Ala Asp Leu225 230 235 240

Gly Phe Ile Ser Asn Ala Asp Ser Phe Glu Thr Gly Asp Ser Gln Ser245 250 255Leu Leu Asn Clu Ala Ser Asn Tyr Val Cln Lys Ser Ile Clu Met Lys260 265 270

Ile Ser Ala Gln Cln Ser Thr Clu Trp Leu Lys Asp Ala Met Ala Ala275 280 285

Phe Ile Val Ala Gln Pro Cln Trp Asn Clu Thr Ser Glu Asp Met Ser290 295 300

Asn Asp His Leu Gln Asn Gly Ala Leu Thr Tyr Val Asn Ser Pro Leu305 310 315 320

Thr Pro Asp Ala Asn Ser Asn Phe Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr325 330 335

Asn Gln Thr Gly Glu Gln Ala Tyr Asn Leu Asp Asn Ser Lys Cly Gly340 345 350

Phe Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Val Val355 360 365

Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu Tyr Tyr Leu Met Asn Phe Gly Thr370 375 380

Ile Thr Ala Asn Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp385 390 395

400

Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ala Ala Asp Tyr405 410 415

Phe Lys Leu Ala Tyr Gly Val Asp Gln Asn Asp Ala Thr Ala Asn Gln420 425 430

His Leu Ser Ile Leu Glu Asp Trp Ser His Asn Asp Pro Leu Tyr Val435 440 445

Thr Asp Gln Gly Ser Asn Gln Leu Thr Met Asp Asp Tyr Val His Thr450 455 460

Gln Leu Ile Trp Ser Leu Thr Lys Ser Ser Asp Ile Arg Gly Thr Met465 470 475 480Gln Arg Phe Val Asp Tyr Tyr Met Val Asp Arg Ser Asn Asp Ser Thr485 490 495

Glu Asn Glu Ala Ile Pro Asn Tyr Ser Phe Val Arg Ala His Asp Ser500 505 510

Glu Val Gln Thr Val Ile Ala Gln Ile Val Ser Asp Leu Tyr Pro Asp515 520 525

Val Glu Asn Ser Leu Ala Pro Thr Thr Glu Gln Leu Ala Ala Ala Phe530 535 540

Lys Val Tyr Asn Glu Asp Glu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Tyr Thr Gln545 550 555 560

Tyr Asn Met Ala Ser Ala Tyr Ala Met Leu Leu Thr Asn Lys Asp Thr565 570 575

Val Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Leu Tyr Thr Asp Asp Gly Gln Tyr580 585 590

Met Ala Thr Lys Ser Pro Tyr Tyr Asp Ala Ile Asn Thr Leu Leu Lys595 600 605

Ala Arg Val Gln Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ser Met Ser Val Asp Ser610 615 620

Asn Asp Val Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Asp Ala Met Thr Ala625 630 635 640

Ser Asp Thr Gly Thr Ser Glu Thr Arg Thr Glu Gly Ile Gly Val Ile645 650 655

Val Ser Asn Asn Ala Glu Leu Gln Leu Glu Asp Gly His Thr Val Thr660 665 670

Leu His Met Gly Ala Ala His Lys Asn Gln Ala Tyr Arg Ala Leu Leu675 680 685Ser Thr Thr Ala Asp Cly Leu Ala Tyr Tyr Asp Thr Asp Glu Asn Ala690 695 700

Pro Val Ala Tyr Thr Asp Ala Asn Cly Asp Leu Ile Phe Thr Asn Clu705 710 715 720

Ser Ile Tyr Gly Val Gln Asn Pro Gln Val Ser Gly Tyr Leu Ala Val725 730 735

Trp Val Pro Val Gly Ala Gln Cln Asp Cln Asp Ala Arg Thr Ala Ser740 745 750

Asp Thr Thr Thr Asn Thr Ser Asp Lys Val Phe His Ser Asn Ala Ala755 760 765

Leu Asp Ser Gln Val Ile Tyr Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ala Phe770 775 780

Ala Thr Asp Ser Ser Glu Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Gln Asn Ala785 790 795 800

Asp Gln Phe Lys Gln Trp Gly Val Thr Ser Phe Gln Leu Ala Pro Gln805 810 815

Tyr Arg Ser Ser Thr Asp Thr Ser Phe Leu Asp Ser Ile Ile Gln Asn820 825 830

Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Tyr Gly Thr Pro Thr835 840 845

Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Gln Leu Arg Asp Ala Ile Lys Ala Leu His850 855 860

Ala Ser Gly Ile Cln Ala Ile Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Ile Tyr865 870 875 880

Asn Leu Pro Glu Gln Glu Leu Ala Thr Val Thr Arg Thr Asn Ser Phe885 890 895Gly Asp Asp Asp Thr Asp Ser Asp Ile Asp Asn Ala Leu Tyr Val Val900 905 910

Cln Ser Arg Gly Gly Gly Gln Tyr Gln Glu Met Tyr Gly Gly Ala Phe915 920 925

Leu Glu Glu Leu Gln Ala Leu Tyr Pro Ser Leu Phe Lys Val Asn Gln930 935 940

Ile Ser Thr Gly Val Pro Ile Asp Gly Ser Val Lys Ile Thr Glu Trp945 950 955 960

Ala Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Gln Gly Lys Gly Ala Gly965 970 975

Tyr Val Leu Lys Asp Met Gly Ser Asn Lys Tyr Phe Lys Val Val Ser980 985 990

Asn Thr Glu Asp Gly Asp Tyr Leu Pro Lys Gln Leu Thr Asn Asp Leu995 1000 1005

Ser Glu Thr Gly Phe Thr His Asp Asp Lys Gly Ile Ile Tyr Tyr1010 1015 1020

Thr Leu Ser Gly Tyr Arg Ala Gln Asn Ala Phe Ile Gln Asp Asp1025 1030 1035

Asp Asn Asn Tyr Tyr Tyr Phe Asp Lys Thr Gly His Leu Val Thr1040 1045 1050

Gly Leu Gln Lys Ile Asn Asn His Thr Tyr Phe Phe Leu Pro Asn1055 1060 1065

Gly Ile Glu Leu Val Lys Ser Phe Leu Gln Asn Glu Asp Gly Thr1070 1075 1080

Ile Val Tyr Phe Asp Lys Lys Gly His Gln Val Phe Asp Gln Tyr1085 1090 1095

Ile Thr Asp Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Tyr Phe Asp Asp Ala Gly1100 1105 1110Val Met Leu Lys Ser Gly Leu Ala Thr Ile Asp Gly His Gln Gln1115 1120 1125

Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Val Gln Val Lys Asp Lys Phe Val Ile1130 1135 1140

Gly Thr Asp Gly Tyr Lys Tyr Tyr Phe Glu Pro Gly Ser Gly Asn1145 1150 1155

Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Val Gln Asn Ser Lys Asn Gln Trp Phe1160 1165 1170

Tyr Phe Asp Gly Asn Gly His Ala Val Thr Gly Phe Gln Thr Ile1175 1180 1185

Asn Gly Lys Lys Gln Tyr Phe Tyr Asn Asp Gly His Gln Ser Lys1190 1195 1200

Gly Glu Phe Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Thr Ser Ala1205 1210 1215

Thr Asp Gly Arg Leu Val Thr Gly Val Gln Lys Ile Asn Gly Ile1220 1225 1230

Thr Tyr Ala Phe Asp Asn Thr Gly Asn Leu Ile Thr Asn Gln Tyr1235 1240 1245

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Gly Ile Glu Leu Val Lys Ser Phe Leu Gln Asn Glu Asp Gly Thr1070 1075 1080

Ile Val Tyr Phe Asp Lys Lys Gly His Gln Val Phe Asp Gln Tyr1085 1090 1095

Ile Thr Asp Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Tyr Phe Asp Asp Ala GlyHOO 1105 mo

Val Met Leu Lys Ser Gly Leu Ala Thr Ile Asp Gly His Gln Gln1115 1120 1125

Tyr Phe Asp Gln Asn Gly Val Gln Val Lys Asp Lys Phe Val Ile1130 1135 1140Gly Thr Asp Cly Tyr Lys Tyr Tyr Phe Glu Pro Gly Ser Gly Asn1145 Ii50

1155

Leu Ala Ile Leu Arg Tyr Val Cln Asn Ser Lys Asn Gln Trp Phe1160 1165 ii7o

Tyr Phe Asp Cly Asn Gly His Ala Val Thr Gly Phe Gln Thr 11«

1175

1180

1185

Asn Gly Lys Lys Gln Tyr Phe Tyr Asn Asp Gly His Gln Ser Lys1190 1195 I200

Gly Glu Phe Ile Asp Ala Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Thr Ser Ala12°5 1210 1215

Thr Asp Gly Arg Leu Val Thr Cly Val Gln Lys Ile Asn Gly Ilel220 1225 1230

Thr Tyr Ala Phe Asp Asn Thr Gly Asn Leu Ile Thr Asn Gln Tyri235 1240 1245

Tyr Gln Leu Ala Asp Gly Lys Tyr Met Leu Leu Asp Asp Ser Gly1250 1255 1260

Arg Ala Lys Thr Cly Phe Val Leu Gln Asp Gly Val Leu Arg Tyr1265 1270

1275

Phe Asp Gln Asn Cly Glu Cln Val Lys Asp Ala Ile Ile Val Asp1280 1285 1290

Pro Asp Thr Asn Leu Ser1295

Claims

1. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, que consisteessencialmente de seqüência de nucleotídeos de acordo com a Figura 1 (SEQID N0 1), seqüência de nucleotídeos de acordo com a Figura 2 (SEQ ID N0 2),seqüência de nucleotídeos de acordo com a Figura 3 (SEQ ID N0 3), seqüênciade nucleotídeos de acordo com a Figura 4 (SEQ ID N0 4), seqüência denucleotídeos de acordo com a Figura 5 (SEQ ID N0 5), seqüênciacomplementar a qualquer das seqüências com SEQ ID N0 1, 2, 3, 4 ou 5 ouseqüência que se hibridiza em seqüência com SEQ ID N0 1, 2, 3, 4 ou 5 sobcondições de hibridização estringente, desde que conserve a atividadeenzimática de dextrana sacarase.

2. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo com areivindicação 1, que consiste essencialmente de seqüência de nucleotídeosselecionada a partir do fragmento de SEQ ID N0 1 da posição 373 até aposição 4269 (SEQ ID N0 17), fragmento de seqüência SEQ ID N0 2 da posição373 até a posição 4005 (SEQ ID N0 18), fragmento de seqüência SEQ ID N0 3da posição 373 até a posição 3408 (SEQ ID N0 19), fragmento de seqüênciaSEQ ID N0 4 da posição 373 até a posição 3018 (SEQ ID N0 20) e fragmentode seqüência SEQ ID N0 5 de nucleotídeo na posição 373 até a posição 4269(SEQ ID N0 21).

3. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo comqualquer das reivindicações 1 ou 2, que consiste essencialmente de seqüênciade nucleotídeos selecionada a partir de seqüência de nucleotídeoscomplementar do fragmento de SEQ ID N0 1 do nucleotídeo na posição 373 atéo da posição 4269, seqüência de nucleotídeos complementar do fragmento deSEQ ID N0 2 do nucleotídeo na posição 373 até o da posição 4005, seqüênciade nucleotídeos complementar do fragmento de SEQ ID N0 3 do nucleotídeo naposição 373 até o da posição 3408, seqüência de nucleotídeos complementardo fragmento de SEQ ID N0 4 do nucleotídeo na posição 373 até o da posição-3018 e seqüência de nucleotídeos complementar ao fragmento de SEQ ID N0 5do nucleotídeo na posição 373 até o da posição 4269.

4. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, de acordo comqualquer das reivindicações 1 ou 2, em que a seqüência de nucleotídeoshibridiza-se sob condições estringentes em seqüência de nucleotídeosselecionada a partir do fragmento de seqüência SEQ ID N0 1 da posição 373até a posição 4269, fragmento de seqüência SEQ ID N0 2 da posição 373 até aposição 4005, fragmento de seqüência SEQ ID N0 3 da posição 373 até aposição 3408, fragmento de seqüência SEQ ID N0 4 da posição 373 até aposição 3018 e fragmento de seqüência SEQ ID N0 5 da posição 373 até aposição 4269, desde que conserve a atividade enzimática de dextranasacarase.

5. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, caracterizada pelo fatode que é pelo menos 70% idêntica a qualquer das seqüências de nucleotídeosde acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4.

6. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, caracterizada pelo fatode que é pelo menos 80% idêntica, preferencialmente 90% idêntica a qualquerdas seqüências de nucleotídeos de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4.

7. VETOR, que contém seqüência de nucleotídeos de acordocom qualquer das reivindicações 1 a 6.

8. VETOR, de acordo com a reivindicação 7, que éplasmídeo.

9. VETOR, de acordo com qualquer das reivindicações 7 ou-8, que compreende seqüência de ácidos nucleicos que codifica enzima que évariante da enzima dextrana sacarase selecionada a partir de DSR-S vardelΔ4Ν, DSR-S vardel Δ3, DSR-S núcleo vardel, DSR-S núcleo ΔΑ e DSR-Svardel Δ4Ν mutante SEV663YDA.

10. CÉLULAS HOSPEDEIRAS TRANSFORMADAS PORVETOR, de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 9.

11. PROTEÍNA CODIFICADA, por qualquer das seqüências denucleotídeos SEQ ID N0 1 a SEQ ID N0 5 ou fragmentos das mencionadasseqüências, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6.

12. DEXTRANA SACARASE TRUNCADA, e/ou que sofreumutação que consiste essencialmente de uma das seqüências selecionadas apartir de SEQ ID N0 6 a SEQ ID N0 10, desde que conserve a sua atividadeenzimática.

13. DEXTRANA SACARASE, de acordo com a reivindicação 12, que consiste essencialmente de seqüência de aminoácidos selecionada apartir do fragmento de SEQ ID N0 6 do aminoácido na posição 125 até oaminoácido na posição 1423 (SEQ ID N0 22), fragmento de SEQ ID N0 7 doaminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335 (SEQ ID N0 23),fragmento de SEQ ID N0 8 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido naposição 1136 (SEQ ID N0 24), fragmento de SEQ ID N0 9 do aminoácido naposição 125 até o aminoácido na posição 1006 (SEQ ID N0 25) e fragmento deSEQ ID N0 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N0 26).

14. PROTEÍNA DE FUSÃO, que compreende, na posição N-terminal e/ou C-terminal, marcas de proteína para seqüências de aminoácidosselecionadas a partir do fragmento de SEQ ID N0 6 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1423 (SEQ ID N0 22), fragmento de SEQ IDN0 do aminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1335 (SEQ IDN0 23), fragmento de SEQ ID N0 8 do aminoácido na posição 125 até oaminoácido na posição 1136 (SEQ ID N0 24), fragmento de SEQ ID N0 9 doaminoácido na posição 125 até o aminoácido na posição 1006 (SEQ ID N0 25)e fragmento de SEQ ID N0 10 do aminoácido na posição 125 até o aminoácidona posição 1423 (SEQ ID N0 26).

15. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com a reivindicação 14,em que a marca proteica é tioredoxina localizada na extremidade N-terminal.

16. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com qualquer dasreivindicações 14 ou 15, em que a marca de proteína é marca 6xHis localizadana extremidade C-terminal.

17. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE D EXTRAN ASACARASE, que sofreu mutação e/ou truncada, que compreende as etapas aseguir:a. cultivo de células hospedeiras de acordo com areivindicação 10 sob condições que permitam a expressão de dextranasacarase; eb. isolamento da mencionada dextrana sacarase do meio decultivo.

18. MÉTODO, conforme a reivindicação 17, caracterizado pelofato de que compreende adicionalmente etapa de purificação da dextranasacarase isolada.

19. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE D EXTRAN AS E/OUISOMALTO-OLIGOSSACARÍDEOS, com massa molar controlada, quecompreende a reação de dextrana sacarase truncada e/ou que sofreu mutaçãoque consiste essencialmente de seqüência selecionada a partir das seqüênciasde nucleotídeos SEQ ID N0 6 a SEQ ID N0 10 de acordo com qualquer dasreivindicações 12 ou 13 com pelo menos sacarose e, opcionalmente, pelomenos um aceitador.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, em que areação tem lugar na presença de pelo menos um aceitador selecionado a partirde glicose, maltose, isomaltose, frutose, isomalto-oligossacarídeos e suasmisturas, preferencialmente maltose, isomaltose e/ou glicose.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19 para aprodução de isomaltose, em que o método compreende a reação de dextranasacarase que consiste essencialmente de seqüência SEQ ID N0 10essencialmente com sacarose.

22. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a reação tem lugar sob temperaturasna faixa de 4 °C a 80 °C, preferencialmente 4 °C a 40 °C.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 19ou 20, caracterizado pelo fato de que a mencionada seqüência é SEQ ID N0 7,SEQ ID N0 8 ou SEQ ID N0 9 e a temperatura encontra-se na faixa de 4 °C a 15 °Cpreferencialmente 8 °C a 12 °C.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que a temperatura é da ordem de 10 °C.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que a mencionada seqüência é SEQ ID N0 6,SEQ ID N0 7, SEQ ID N0 8, SEQ ID N0 9 ou SEQ ID N0 10 e a temperaturaencontra-se na faixa de 15 °C a 45 °C, preferencialmente 17°C a 30 °C.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que a temperatura é da ordem de 20°C a 25 °C.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de que a concentração de sacarose encontra-se nafaixa de 10 a 600 g/l, preferencialmente 75 a 400 g/l, de maior preferência 90 a 280 g/l.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 19, 20 e 22 a 27, caracterizado pelo fato de que a mencionada seqüência é SEQID N0 7, SEQ ID N0 8 ou SEQ ID N0 9 e a concentração de sacarose é daordem de 250 g/l.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que a mencionada seqüência é SEQ ID N0 6 ou SEQ ID N0 10 e aconcentração de sacarose é da ordem de 100 g/l.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 19 a-29, caracterizado pelo fato de que a dextrana sacarase encontra-se na formalivre ou imobilizada sobre suporte por meio de adsorção, inclusão ou uniãocovalente.

31. MÉTODO, de acordo com qualquer das reivindicações 19 a-30, caracterizado pelo fato de que o pH encontra-se na faixa de 3,0 a 10,0,preferencialmente 4,5 a 6,0, de maior preferência cerca de 5,2.

32. DEXTRANA, que pode ser obtida por meio do método deacordo com qualquer das reivindicações 19 a 31, com comportamento nãonewtoniano.

33. ISOMALTO-OLIGOSSACARÍDEOS, que podem serobtidos por meio do método de acordo com qualquer das reivindicações 19 a-31.

34. COMPOSIÇÃO, que compreende dextrana ou IMO obtidopor meio da intermediação de dextrana sacarase de acordo com qualquer dasreivindicações 12 ou 13 ou obtido por meio do método de acordo com qualquerdas reivindicações 17 ou 18 ou obtido por meio de método de acordo comqualquer das reivindicações 19 a 31 ou dextrana de acordo com a reivindicação-32 ou isomalto-oligossacarídeo de acordo com a reivindicação 33.

35. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA OU ALIMENTÍCIA, quecompreende dextrana ou IMO obtido por meio da intermediação de dextranasacarase de acordo com qualquer das reivindicações 12 ou 13 ou obtido pormeio do método de acordo com qualquer das reivindicações 17 ou 18 ou obtidopor meio de método de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 31 oudextrana de acordo com a reivindicação 32 ou isomalto-oligossacarídeo deacordo com a reivindicação 33 e veículo farmacêutica ou nutricionalmenteaceitável.

36. COMPOSIÇÃO DE TEXTURIZAÇÃO, caracterizada pelofato de que compreende pelo menos uma dextrana obtida por meio daintermediação de dextrana sacarase de acordo com qualquer dasreivindicações 12 ou 13 ou obtida por meio do método de acordo com qualquerdas reivindicações 17 ou 18 ou obtida por meio de método de acordo comqualquer das reivindicações 19 a 31.

37. USO DE DEXTRANA SACARASE, de acordo com0 qualquer das reivindicações 12 ou 13 ou obtida por meio de método de acordocom qualquer das reivindicações 17 ou 18 em método de fabricação de (i)isomaltose (342 Da), (ii) isomalto-oligossacarídeos com 342 a 5000 Da, (iii)dextranas com tamanho controlado de 1300 a 52.000 Da centralizadas emcerca de 10.000 Da1 (iv) dextranas com tamanho controlado de 7000 a 1,7 χ-105 Da centralizadas em cerca de 40.000 Da e (v) dextranas com alta massamolar de 2 χ 106 Da ou dextrana ou IMO obtido por meio de método de acordocom qualquer das reivindicações 19 a 31.

38. USO DE DEXTRANA, de acordo com a reivindicação 32como agente de texturização.

39. USO DE DEXTRANA OU IMO, de acordo com qualquerdas reivindicações 32 ou 33 como prebiótico, especialmente dextrana comtamanho controlado de 1300 a 52.000 Da centralizada em cerca de 10.000 Da.

40. SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS, que codifica proteínaque consiste essencialmente de seqüências de aminoácidos consecutivas deacordo com qualquer das SEQ ID N0 6 a 10 ou 22 a 26.