ES2585203T3

ES2585203T3 - Construcción de variantes nuevas de dextransacarasa DSR-S mediante ingeniería genética

Info

Publication number: ES2585203T3
Application number: ES07734270.7T
Authority: ES
Inventors: Pierre Monsan; Magali Remaud-Simeon; Gabrielle Potocki-Veronese; Claire Moulis
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2006-02-08
Filing date: 2007-02-08
Publication date: 2016-10-04
Anticipated expiration: 2027-02-08
Also published as: ES2800724T3; PT3103874T; WO2007091178A3; EP2365084B1; FR2897069B1; US10017748B2; BRPI0706981A2; JP5753340B2; US20090258389A1; EP3103874B1; AU2007213436A1; FR2897069A1; US9399765B2; EP1981914A2; PT2365084T; WO2007091178A2; US8263380B2; US20110178289A1; JP2009525745A; BRPI0706981B1

Abstract

Una secuencia de nucleótidos que consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del fragmento de la posición 373 a la posición 4269 de SEQ ID Nº: 1 y como se definió en SEQ ID Nº: 17 o una secuencia de longitud completa complementaria a ella, el fragmento de la posición 373 a la posición 4005 de SEQ ID Nº: 2 y como se definió en SEQ ID Nº: 18 o una secuencia de longitud completa complementaria a ella, el fragmento de la posición 373 a la posición 3408 de SEQ ID Nº: 3 y como se definió en SEQ ID Nº: 19 o una secuencia de longitud completa complementaria a ella, el fragmento de la posición 373 a la posición 3018 de SEQ ID Nº: 4 y como se definió en SEQ ID Nº: 20 o una secuencia de longitud completa complementaria a ella, y el fragmento de la posición 373 a la posición 4269 de SEQ ID Nº: 5 y como se definió en SEQ ID Nº: 21 o una secuencia de longitud completa complementaria a ella.

Description

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longitud exactamente tal como se indica en el número de identificación de la secuencia, pero se pueden añadir de 1 a 4 aminoácidos extra en los extremos N-o C-terminales. Estos aminoácidos extra no tienen efecto sobre la actividad de la enzima.

De manera más específica, la presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican una dextransacarasa truncada o una dextransacarasa mutada, una secuencia complementaria a las secuencias de longitud completa o una secuencia que hibrida en condiciones rigurosas con una de las secuencias anteriores, con tal de que se mantenga la actividad enzimática de la dextransacarasa. Se debería apreciar que las secuencias de nucleótidos que hibridan con ella tienen el mismo número de nucleótidos, e hibridan a lo largo de la longitud completa del fragmento.

La expresión "condiciones de hibridación rigurosas", tal como se usa en la presente memoria, significa condiciones como describió Sambrook et al, Molecular Cloning Manual, 3ª edición (2001), es decir, por ejemplo, las condiciones siguientes: tampones de hibridación: SSC 2 X, disolución de Denhardt 10 X (Ficoll 400 y PEG y BSA, proporción 1:1:1), 0,1% de SDS, EDTA 5 mM, Na2HPO4 50 mM, 250 µg/ml de ADN de esperma de arenque, 50 µg/ml de t-ARN

o 0,25 M de tampón de fosfato sódico con un pH de 7,2, EDTA 1 mM, 7% de SDS;

Temperatura de hibridación: 60 °C;

Tampón de lavado: SSC 2 X, 0,1 % de SDS;

Temperatura de lavado: 60 °C.

Las moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas con los ácidos nucleicos de la presente invención pueden codificar en principio una dextransacarasa de cualquier microorganismo tal como bacterias, bacterias gram-positivas y, en un aspecto de la invención, bacterias de los géneros Leuconostoc, Streptococcus o Lactobacillus.

La presente invención se refiere a ácidos nucleicos que codifican proteínas de dextransacarasa que tienen al menos un 70% o 80% o 90% de identidad de secuencia con las de las secuencias SEQ ID Nºs: 1 a SEQ ID Nº: 5 y SEQ ID Nºs 17 a 21, con tal de que la proteína codificada por dichas secuencias tenga una actividad enzimática de dextransacarasa.

En otro aspecto, se describen secuencias de nucleótidos que codifican una proteína que consiste básicamente o que consiste en secuencias de aminoácidos consecutivos de cualquiera de SEQ ID Nºs:6 a 10 o 22 a 26.

En un aspecto adicional de la invención, también se incluyen en la presente invención las secuencias complementarias a las secuencias de la invención o las secuencias que hibridan con dichas secuencias en condiciones rigurosas, con tal de que se mantenga la actividad enzimática de dextransacarasa.

Las derivaciones de las secuencias de nucleótidos básicas SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 4

o SEQ ID Nº: 5), en las que las secuencias se seleccionan del fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 1 de la posición 373 a la posición 4269, el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 2 de la posición 373 a la posición 4005, el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 3 de la posición 373 a la posición 3408, el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 4 de la posición 373 a la posición 3018, y el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 5 de un nucleótido de la posición 373 a la posición 4269, las secuencias complementarias a dichas secuencias o las secuencias que hibridan con dichas secuencias en condiciones rigurosas, con tal de que se mantenga la actividad enzimática de dextransacarasa, se pueden producir mediante deleción, sustitución, inserción o recombinación, por ejemplo; los métodos para llevar a cabo dichas etapas y transformaciones se conocen bien en la técnica y los describió, por ejemplo, Sambrook et al., anteriormente mencionado.

Se debería entender en la presente memoria que si tiene lugar cualquier deleción, sustitución, inserción o recombinación de cualquiera de las secuencias citadas anteriormente, las proteínas codificadas por las secuencias deben mantener su actividad enzimática de dextransacarasa. Así, se pueden modificar de 1 a 132, preferiblemente 2 a 60 nucleótidos, más preferiblemente 15 a 36 nucleótidos y aún más preferiblemente 12 a 27 nucleótidos, por ejemplo, mediante deleción, sustitución, inserción o recombinación. Según la invención, un 90%, preferiblemente un 95%, de los nucleótidos permanecen inalterados.

La actividad enzimática de dextransacarasa se puede medir como se describe en la sección de métodos y en los Ejemplos de la presente solicitud.

Los oligonucleótidos que se pueden usar como sonda o cebador son, por ejemplo, SEQ ID Nº: 1 a SEQ ID Nº: 5 o las secuencias de nucleótidos seleccionadas del fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 1 de la posición 373 a la posición 4269, el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 2 de la posición 373 a la posición 4005, el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 3 de la posición 373 a la posición 3408, el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 4 de la posición 373 a la posición 3018, y el fragmento de la secuencia SEQ ID Nº: 5 de un nucleótido de la posición 373 a la posición 4269.

La longitud de las sondas y cebadores puede variar dependiendo de sus aplicaciones. En general, deben tener al

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menos 25 nucleótidos, y pueden comprender todas las secuencias de dextransacarasa descritas, tal como 3.896 nucleótidos. La longitud también puede variar para estar en el intervalo de 25 a 150 nucleótidos, 25 y 800 nucleótidos o 25 y 3000 nucleótidos, por ejemplo.

Los cebadores comprenden en general de 18 a 25 nucleótidos de longitud, pero también pueden ser más largos, dependiendo de la aplicación prevista. Los ejemplos de cebadores que se pueden usar son:

GGC TTC TCT GGT GTG ATT (SEQ ID Nº:11)

GAT CTG TCA GAA ACT GGC (SEQ ID Nº:12)

ACA CAA CAA GTT AGC GGC (SEQ ID Nº: 13)

CCA GAT ACT AAC TTG AGT (SEQ ID Nº: 14)

TTC ATT GAT GCA GAC GGG (SEQ ID Nº:15)

CAC GAC TAC GAC GCG CAA (SEQ ID Nº :16)

Se debería indicar que los cebadores de las posiciones 5' y 3' terminales de los nucleótidos codifican la dextransacarasa (SEQ ID Nºs: 11 a 15) y el lado de 5' y 3' de la secuencia mutante (SEQ ID Nº: 16). Sin embargo, una persona experta puede usar cada una de estas secuencias para producir cebadores o sondas mediante el uso de nucleótidos consecutivos. Además, estas secuencias de nucleótidos que se usan como sonda se pueden marcar con radiactividad, marcaje enzimático, marcaje fluorescente, en particular.

Para modificar genéticamente la célula procariótica o eucariótica, se pueden introducir los ácidos nucleicos de la presente solicitud o una porción de los ácidos nucleicos de la presente solicitud en plásmidos que permiten la mutagénesis o modificación de las secuencias mediante la recombinación de secuencias de nucleótidos. El experto conoce los métodos habituales que usan estas técnicas, y han sido descritos, en particular, por Sambrook et al, anteriormente mencionado. Los fragmentos de ADN también se pueden conectar entre sí mediante adaptadores o ligadores, y se pueden usar enzimas de restricción adecuadas para eliminar ciertas secuencias de ADN. Se pueden usar métodos tales como mutagénesis, restricción tras el restablecimiento de cebadores o ligaduras para obtener la secuencia deseada con las inserciones adecuadas, deleciones o sustituciones necesarias o deseables.

Además, se pueden unir marcadores bien definidos que codifican ácidos nucleicos a los extremos N-o C-terminales de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención. Pueden ser péptidos tales como poli-His, epítopo cmyc o marcador de HA o proteínas pequeñas tales como GST bacteriana, MBP (proteína de unión a maltosa), tiorredoxina, β-galactosidasa, VSV-glicoproteína y similares.

Los ácidos nucleicos particulares que codifican otros marcadores proteicos son el marcador de His, marcador T7, marcador S, un péptido "flag", trpE, avidina/estreptavidina, proteína estafilocócica A o G, dihidrofolato reductasa, dominios de unión a celulosa, policisteína, polifenilalanina y similares, que se pueden usar también en la presente invención.

Según un aspecto de la presente invención, se fusiona un ácido nucleico que codifica una tiorredoxina a la secuencia de ácido nucleico N-terminal. Se fusiona un ácido nucleico que codifica un marcador de 6xHis al extremo 3' de las secuencias de ácidos nucleicos.

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden unir a una unidad de transcripción que comprende (1) elementos de regulación de la expresión génica tales como promotores y potenciadores y (2) una secuencia codificante o estructural que se transcribe hasta un mARN y se traduce hasta la proteína correspondiente, y (3) señales adecuadas de inicio y terminación.

Se conocen en la técnica varias secuencias adecuadas de control de la expresión. También se conocen métodos generales para expresar la proteína recombinante, y se ejemplifican en el documento de R Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) [17].

Las regiones promotoras que se pueden usar en los vectores de la presente invención incluyen lacL, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, tre y ara.

La presente invención también se refiere a vectores, en particular plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores que se conocen en el campo de la ingeniería genética y que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos de la presente solicitud en un aspecto de la presente invención, y dichos vectores son plásmidos y se seleccionan de DSR-S vardel Δ4N, DSR-S vardel Δ3, DSR-S vardel Core, DSR-S Core ΔA y DSR-S vardel Δ4N SEV663YDA.

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden expresar en células procarióticas o eucarióticas. Los ejemplos no limitantes de tales células que se pueden citar son las células VERO, células HELA tales como ATCC Nº CCL3, líneas de células CHO tales como ATCC CCL61, células COS tales como COS-7 y células CR ATCC Nº:

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En el método de la invención, la dextransacarasa está en forma libre o inmovilizada sobre un soporte. Dicha inmovilización se puede llevar a cabo mediante adsorción, inclusión o unión covalente, por ejemplo.

Finalmente, para llevar a cabo el método, el pH está en el intervalo de 3,0 a 10,0, preferiblemente 4,0 a 7,0; más preferiblemente 4,5 a 6,0 e incluso más preferiblemente alrededor de 5,2.

5 Otros aspectos de la invención pueden ser evidentes a partir de un estudio de los Ejemplos siguientes.

Ejemplo 1: Construcción de variantes

Se usó el vector pBad/TOPO Thiofusion (Invitrogen) para clonar y expresar genes dsrS truncados y/o mutados bajo control del promotor de L-arabinosa. Permite la fusión del gen al marcador de 6xHis en el extremo C-terminal, y un marcador de tiorredoxina en el extremo N-terminal.

10 Para el uso como una matriz, se extrajo el ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-512F mediante el uso del kit "Blood and Cell culture DNA maxi" (Qiagen). La cepa se obtiene de la colección NCAUR, Peoria, IL, EE.UU.

Se usaron células One Shot TOP10 (Invitrogen) para la expresión de los genes dsrS truncados y/o mutados. Las enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se purificó mediante el uso de los kits "QIAquick" (purificación mediante PCR y extracción en gel)

15 y "QIAprep" (purificación de plásmidos) de Qiagen.

Las variantes se construyeron mediante amplificación por PCR del gen DSR-S a partir de ADN genómico de L. mesenteroides NRRL B-512F mediante el uso de la polimerasa "Expand High Fidelity" (Roche) y los cebadores siguientes (proporcionados en la dirección 5'→ 3'):

1 DSR-S vardel Δ4N se construyó mediante el uso de los cebadores pBad y DSR-S vardel: 45420 acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 y PBad Δ4N: 4350-actcaagttagtatctggatccacaatgatagc-4317. Contuvo los aminoácidos T152 a S1450 de DSR-S.

2 DSR-S vardel Δ3 se construyó mediante el uso de los cebadores PBad y DSR-S vardel: 454acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 y PBad Δ3: 4086-cccgtctgcatcaatgaattcacc-4062. Contuvo los aminoácidos T152 a G1362 de DSR-S.

25 3 DSR-S vardel Core se construyó mediante el uso de los cebadores PBad y DSR-S vardel: 454acacaacaagttagcggcaagtacgttgaaaaagac-490 y PBad Core: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Contuvo los aminoácidos T152 a G1162 de DSR-S.

4 DSR-S Core ΔA se construyó mediante el uso de los cebadores PBad DSR-S cat: 843ggcttctctggtgtgattgatggtcaa-870 y PBad Core: 3489-gccagtttctgacagatcattagttaactg-3459. Contiene los 30 aminoácidos G282 a G1162 de DSR-S.

5 El mutante DSR-S vardel Δ4N SEV663YDA se construyó mediante mutagénesis dirigida mediante el uso de la técnica del "mega cebador" [33, 21] y la ADN polimerasa Pfu (Strategene). Se llevó a cabo una primera reacción de PCR mediante el uso de la matriz plasmídica DSR-S vardel Δ4N y el par de cebadores SEV663YDA: 1965-agctttgtacgagctcacgactacgacgcgcaaacggtt-2004 e inverso: 3447

35 gtcaccatcctcagtgttcgaaacg-3422, que comprende el sitio de restricción BstBI (subrayado). Este producto de PCR se usó después como un mega cebador inverso en una segunda PCR con el cebador directo: 1329caaccacagtggaatgaaactagtc-1354 que comprende el sitio de restricción SpeI. Este segundo producto de PCR se digirió después con las dos enzimas de restricción SpeI y BstBI de acuerdo con las condiciones del fabricante (New England Biolabs) y se clonó en el vector pBad DSR-S vardel Δ4N digerido previamente con las

40 mismas enzimas. El cebador SEV663YDA se diseñó para introducir un único sitio de restricción para seleccionar los clones positivos (en este caso, el sitio SacI).

La estructura primaria de cada una de las variantes DSR-S vardel Δ4N, DSR-S vardel Δ3, DSR-S vardel Core y DSR-S Core ΔA se muestra esquemáticamente en la Figura 6.

Ejemplo 2: Producción de variantes en E coli

45 Se llevaron a cabo cultivos en un matraz Erlenmeyer con deflectores en medio YT 2X tamponado a un pH de 6,4 con 100 mN de Tris-HCl, ya que se sabe que DSR-S es inestable en condiciones de pH alcalino [3].

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Composición del medio YT 2X:

Bactotriptona 16 g/l

Extracto de levadura 10 g/l

NaCl 5 g/l

Tris 12,1 g/l

Se cultivaron células de E. coli TOP10 que portaban plásmidos pBad DSR-S vardel Δ4N y pBad DSR-S vardel Δ4N SEV663YDA a 23 °C. Se llevó a cabo la inducción con L-arabinosa cuando el crecimiento celular alcanzó una DO600 nm de 0,2 con un 0,002% (p/v) de inductor. El cultivo se paró cuando el crecimiento celular alcanzó una meseta (DO600 nm de alrededor de 3-3,5) antes de iniciar la fase de lisis celular.

Las células de E. coli TOP10 que portaban los plásmidos pBad DSR-S vardel Δ3, pBad DSR-S vardel Core y pBad DSR-S Core ΔA se llevaron a 16 °C. La inducción se llevó a cabo cuando el crecimiento celular alcanzó una DO600nm de 0,2 con un 0,005% (p/v) de L-arabinosa en el caso de DSR-S vardel Δ3 y un 0,02% (p/v) en el caso de DSR-S vardel Core y DSR-S Core ΔA. El cultivo se detuvo cuando el crecimiento celular alcanzó una meseta (DO600 nm de alrededor de 2,5) antes de iniciar la fase de lisis celular.

Tras el cultivo, las células se recuperaron mediante centrifugación (8.000 x g, 10 minutos, 4 °C), se resuspendieron y se concentraron a una DO600 nm equivalente a 80 en un tampón de acetato sódico 50 mM, pH 5,2, complementado con 0,05 g/l de CaCl2 1 mM y fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF). La ruptura de las células se llevó a cabo mediante sonicación. Las preparaciones se centrifugaron después una vez más (20.000 x g, 30 min, 4 °C) para eliminar los restos celulares y recuperar solamente el sobrenadante de sonicación.

La actividad enzimática de los extractos se midió mediante el uso del método de ácido dinitrosalicílico (DNS) de Sumner y Howell, 1935 [22]. Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la formación de un µmol de fructosa por minuto a una temperatura determinada (4 °C a 40 °C dependiendo del caso, más exactamente 20 °C o 30 °C) y en un tampón de acetato sódico (50 mM), pH 5,2, que contiene 0,05 g/l de CaCl2 y 100 g/l de sacarosa.

Ejemplo 3: Purificación de la variante DSR-S vardel Δ4N

Se produjeron diferentes formas enzimáticas de DSR-S vardel Δ4N durante el cultivo de E. coli TOP10: una forma completa muy mayoritaria y diferentes formas degradadas en el extremo C-terminal (Figura 7). El origen de estas degradaciones sigue estando poco claro. La producción en el Ejemplo 2 alcanzó alrededor de 5500 U/l de cultivo en los sobrenadantes de sonicación (actividad ensayada a 30 °C).

Para determinar el número de formas enzimáticas activas en los extractos, se produjeron geles de electroforesis en condiciones nativas o desnaturalizantes. Tras la renaturalización del gel, se incubó durante la noche a 25 °C en un tampón de acetato sódico, 50 mM, pH 5,2 complementado con 100 g/l de sacarosa. Las formas enzimáticas activas sintetizaron después un polímero en la región en la que migraron en el gel. Se usó un reactivo (reactivo de Schiff) que coloreó de manera específica los polímeros sintetizados por las dextransacarasas activas, tras la oxidación de las funciones alcohol primarias del polímero con ácido peryódico, y los geles se tiñeron con este reactivo. Este tipo de gel se denomina zimograma. En el caso de DSR-S vardel Δ4N, o su mutante SEV663YDA, solamente se detectaron como activas las dos formas de mayor masa molar (resultados no mostrados). Sin embargo, solamente la forma completa tuvo tanto el marcador de tiorredoxina como el marcador de 6xHis.

La presencia del marcador de 6×His solamente en la forma completa de DSR-S vardel Δ4N se aprovechó para purificar la enzima mediante cromatografía de afinidad en una de resina níquel (Probond Ni-NTA, Invitrogen).

La purificación se llevó a cabo a 4 °C. Todos los tampones tuvieron concentraciones de acetato sódico 50 mM, 400 mM de NaCl, concentraciones diferentes de imidazol, y se ajustaron a un pH de 7,5. La resina se equilibró con 8 volúmenes de tampón que tenía una concentración de 40 mM de imidazol. La fijación se llevó a cabo durante 2 horas con 7 volúmenes de extracto enzimático complementado con 20 mM de imidazol y ajustado a un pH de 7,5. A continuación, la resina se lavó con 40 volúmenes de tampón de imidazol 40 mM, 8 volúmenes a 60 mM y 4 volúmenes a 100 mM. Finalmente, las proteínas se eluyeron con 7 volúmenes de tampón que tenía una concentración de 250 mM de imidazol.

Las fracciones que contenían las proteínas de fusión eluidas se mezclaron y se dializaron durante la noche a 4 °C con un tampón que contenía una concentración de 50 mM de acetato sódico, pH de 5,2, y 0,05 g/l de CaCl2. La concentración de proteínas se determinó mediante el método de microbradford (Biorad Laboratories) con BSA (albúmina de suero bovino) como patrón.

Se estimó que la pureza de la preparación al final del procedimiento fue de alrededor de un 90% (Figura 8). Las

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proteínas DSR-S vardel Δ4N purificadas tuvieron una tendencia muy intensa a agregarse, lo que provocó la formación de precipitados blancos y limitó los rendimientos obtenidos al final del procedimiento (Tabla 1). Sin embargo, se estimó que la actividad específica de la preparación fue de 584 U/mg de proteína, que correspondió a la mejor actividad específica descrita de una dextransacarasa recombinante. A modo de comparación, se estimó que la actividad específica de la DSR-S nativa (expresada por L. mesenteroides NRRL B-512F) fue de alrededor de 170 U/mg [24].

Tabla 1: Purificación de DSR-S vardel Δ4N mediante cromatografía de afinidad en una resina de níquel

Etapa de purificación: Volumen (ml) Actividad (U/ml) Conc. de proteína (mg/l) Actividad específica (U/mg) Factor de purificación Rendimiento (%)

Sobrenadantes de sonicación: 150 149,2 9,46 15,7 1 100

Fracción de elución tras la diálisis: 150 67,6 0,25 270,5 17 45,3

Fracción soluble tras la eliminación de agregados: 150 38,2 0,09 424,4 27 25,4

Ejemplo 4: Secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos

Las construcciones se secuenciaron, y las secuencias correspondientes se muestran en las Figuras 1 a 5.

Ejemplo 5: Síntesis de dextrano mediante DSR-S vardel Δ4N, comparación con DSR-S de L. mesenteroides NRRL B-512F

Se sintetizó dextrano con DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F, DSR-S recombinante completa (sobrenadante de sonicación) y DSR-S vardel Δ4N (sobrenadante de sonicación y enzima purificada).

Condiciones de síntesis y análisis de los productos formados

Se construyó DSR-S recombinante completa según el mismo principio que las variantes descritas en el Ejemplo 1, con cebadores que fueron adecuados para la amplificación del gen completo. Se cultivaron células de E. coli TOP10 que portaban el plásmido pBad DSR-S mediante el uso del protocolo descrito para DSR-S vardel Δ4N (Ejemplo 2). El sobrenadante contuvo tres formas enzimáticas, incluyendo dos con una masa molar activa mayor.

La forma con el tamaño mayor contuvo DSR-S en su totalidad; las otras dos formas se degradaron en su posición Nterminal (datos no mostrados).

Se determinó la actividad de cada preparación enzimática a 30 °C.

Las síntesis de dextrano se llevaron a cabo a 25 °C comenzando con una disolución de sacarosa de 100 g/l, en un tampón de acetato sódico 50 mM que contenía 0,05 g/l de CaCl2 y con 1 unidad por ml de enzima. El agotamiento progresivo de sacarosa se monitorizó mediante análisis HPAEC-PAD (véase más adelante) y la reacción se paró tras su consumo completo, mediante calentamiento durante 5 min a 95 °C (desnaturalización completa de las dextransacarasas citadas).

Los productos formados se analizaron mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada) con respecto a los mono-, di-y oligosacáridos, y mediante HPSEC (cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento) con respecto a los polisacáridos.

El sistema HPAEC-PAD comprendió una columna Dionex "Carbopack PA100" 4 x 250 mm. Se aplicó un gradiente de acetato sódico de 6 a 300 mM en 28 minutos en una disolución de hidróxido sódico 150 mM a un caudal de 1 ml/min. La detección se llevó a cabo mediante amperometría con el uso de un módulo Dionex ED40 con un electrodo de oro y un electrodo de referencia de pH de Ag/AgCl.

El sistema HPSEC estuvo constituido por dos columnas en serie Shodex OH-Pack SB-805 y SB-802.5, mediante el uso de nitrato sódico 0,45 M + 1% (v/v) de etilen glicol como disolvente, en una cantidad de 0,3 ml/min. Las columnas y pre-columnas se mantuvieron a 70 °C y las muestras se filtraron en filtros de 0,45 µm (Sartorius) antes de la inyección. La detección fue de tipo refractométrico, acoplada a un detector de difusión de luz (Wyatt) para determinar la masa de los dextranos.

Las concentraciones en peso de glucosa, fructosa y leucrosa (isómero de sacarosa) se determinaron mediante análisis HPAEC-PAD. Los porcentajes de residuos de glucosilo de la sacarosa incorporada en la glucosa y leucrosa libres se calcularon mediante el uso de la fórmula siguiente:

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%Gglucosa = [glucosatf]/([sacarosat0]x(180/342))

y

%Gleucrosa = [leucrosatf]/[sacarosat0]

en las que [glucosatf] y [leucrosatf] corresponden a las concentraciones finales de glucosa y leucrosa al final de la reacción, y [sacarosat0] corresponde a la del sustrato inicial (g/l).

El porcentaje de residuos de glucosilo incorporados en el polímero MME se determinó mediante análisis HPSEC con el uso de la fórmula:

%Gdextrano = área superficialdextrano-tf/(área superficialsacarosa-t0/(162/342))

en la que el área superficialdextrano tf corresponde al área superficial del pico de dextrano, determinada mediante el uso del cromatograma de HPSEC al final de la reacción, y el área superficialsacarosa-t0 corresponde a la del pico del sustrato inicial. Para una concentración determinada, la superficie obtenida mediante refractometría es idéntica independientemente del carbohidrato.

La proporción de unidades de glucosilo incorporadas en los polímeros u oligosacáridos MMI para los que no se pudo cuantificar directamente la concentración mediante HPAEC-PAD o HPSEC se determinó mediante el uso de la fórmula:

%GMMI = 100 -%Gglucosa-tf -%Gleucrosa-tf -%Gdextrano-tf

Los perfiles de elución de los cuatro dextranos obtenidos mediante HPSEC se muestran en la Figura 9. Se pueden distinguir diferentes poblaciones: un primer pico eluido a los 38 minutos, que correspondió al polímero de masa molar elevada (MME), y un segundo pico a los 75 minutos que correspondió a fructosa, glucosa, leucrosa (5-O-α-D glucosil fructosa) y otros oligosacáridos con un grado de polimerización (GP) menor de 7, no separados por el sistema o en concentraciones muy bajas. Entre estos dos picos principales, tal como se indica mediante las perturbaciones de la línea base, también estuvieron presentes productos de tamaño intermedio (dextranos MMI). Estos compuestos, con tamaños muy variables, entre 1000 y 107 Da, fueron muy polidispersos, y estuvieron a concentraciones muy bajas, lo que explica su baja intensidad en el cromatograma. Sin embargo, los análisis HPAEC-PAD confirmaron su presencia (resultados no mostrados).

La cantidad relativa de unidades de glucosilo derivadas de sacarosa e incorporadas en los diferentes productos se enumera más adelante en la Tabla 2. El rendimiento de la síntesis para el dextrano MME representa alrededor del 60% de las unidades de glucosilo para cada una de las preparaciones. La transferencia de unidades de glucosilo a agua (glucosa) o fructosa (leucrosa) representa menos del 8%, mientras la síntesis de dextranos de tamaño intermedio (MMI) representó del 25% al 32% de las unidades de glucosilo transferidas. Todas las formas recombinantes de DSR-S tendieron a sintetizar más dextranos de tamaño intermedio. Los análisis HPSEC también mostraron que la enzima nativa pareció sintetizar dos poblaciones diferentes de dextrano, en lugar de solamente una para las enzimas recombinantes. La masa molar de los dextranos MME se determinó mediante difusión de luz y se estimó que fue de más de 107 g/mol para todas las muestras (límite de exclusión de las columnas usadas).

Tabla 2: Porcentaje de unidades de glucosilo incorporadas en los diversos productos derivados de la síntesis de dextrano a 25 °C y 100 g/l de sacarosa, para las cuatro preparaciones de DSR-S citadas

Glucosa: Leucrosa Dextranos MMI Dextranos MME

% rel.: MME (g/mol)

DSR-S nativa: 4,12 5,80 25,60 64,47 1,5 x 108 8,88 x 107

DSR-S completa: 2,32 5,39 29,32 62,96 1,86 x 108

DSR-S vardel Δ4N: 2,43 5,90 31,03 60,64 4,87 x 107

DSR-S vardel Δ4N purificada: 2,33 5,80 32,24 59,62 2,47 x 107

Estructura de los dextranos formados

La estructura del dextrano producido mediante DSR-S vardel Δ4N (purificada o no) se comparó con la de los dextranos sintetizados a partir de DSR-S recombinante completa y DSR-S nativa. Estas estructuras se determinaron mediante resonancia magnética nuclear (1H RMN) con el uso de un aparato Brücker AC 300, a 85 °C y con una

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frecuencia de adquisición de 300,13 MHz. El tiempo de adquisición fue 3 seg, con 32 a 64 pasos. Los dextranos se separaron inicialmente de la fructosa co-producida precipitando 3 veces con 1 volumen de etanol absoluto, se recuperaron mediante centrifugación, se lavaron con agua destilada y se liofilizaron. Las muestras se disolvieron en D2O hasta una concentración de 6 mg/ml.

Los espectros de RMN se muestran en la Figura 10. Solamente se detectaron enlaces α-1,6. También se llevó a cabo un análisis de RMN de carbono-13 con el dextrano sintetizado mediante DSR-S vardel Δ4N purificada. El espectro obtenido fue idéntico a los publicados para el dextrano de L. mesenteroides NRRL B-512F y DSR-S completa [3].

Estos polímeros se digirieron también con endodextranasa de Chaetomium gracile realizado durante 16 h a 37 °C con 3 unidades de enzima por ml de medio de síntesis. Los productos de la digestión se analizaron mediante HPAEC-PAD (Figura 11). Los perfiles de digestión obtenidos fueron idénticos a los cuatro dextranos analizados, lo que confirmó que todos tuvieron al menos un 95% de enlaces α-1,6.

Las deleciones hechas en las posiciones N-y C-terminales de la DSR-S para construir la variante DSR-S vardel Δ4N, así, no tienen una influencia significativa sobre la actividad inicial de DSR-S o sobre la porción de unidades de glucosilo derivadas de la sacarosa incorporada en la síntesis del dextrano MME, el tamaño o la estructura del polisacárido.

Comportamiento reológico de los dextranos formados

El comportamiento reológico de los cuatro dextranos se analizó mediante el uso de un sistema cono-placa (AR 1000, TA Instruments) equipado con un cono de 4 cm de diámetro en un ángulo de 3,59°, y cubriendo velocidades de 0,01 a 100 s-1. Las medidas se llevaron a cabo a 25 °C. Los experimentos dinámicos se llevaron a cabo en el dominio lineal entre 0 y 10 Pa, con una deformación del 8% para el dextrano sintetizado mediante DSR-S nativa de L. mesenteroides NRRL B-512F (control), 3% para el sintetizado mediante la DSR-S recombinante completa, 5% para el sintetizado mediante un extracto no purificado de DSR-S vardel Δ4N y 0,4% para el sintetizado mediante DSR-S vardel Δ4N purificada. El módulo de rigidez complejo se define mediante la relación:

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El módulo de conservación de energía G'(ω) es mayor cuando la muestra es predominantemente elástica o sumamente estructurada. El módulo de pérdida G" (ω) representa la energía disipada durante la deformación. Las muestras predominantemente viscosas tienen un G" (ω) elevado.

Estos análisis reológicos produjeron resultados completamente originales (Figura 12). Como se describió en la bibliografía, la DSR-S nativa sintetizó un dextrano con comportamiento newtoniano [25].

Los extractos de DSR-S recombinante completa y los extractos de DSR-S vardel Δ4N sin purificar produjeron disoluciones viscosas con un comportamiento idéntico (viscosidad alrededor de 10 veces mayor que la del dextrano producido mediante la enzima nativa). Cuando se observó a simple vista, también tuvieron un comportamiento fibroso bastante pronunciado. Además, tras la aplicación de nuevas tensiones de corte, el comportamiento de dichos polímeros cambió desde un tipo de disolución a un tipo de gel, lo cual es una propiedad nueva que se ha identificado para este tipo de biopolímero. El dextrano producido mediante la enzima nativa, en contraste, no fue fibroso, y su comportamiento fue completamente reversible tras la aplicación de una segunda serie de tensiones (Figura 12A).

La enzima purificada sintetizó directamente un polímero que tuvo las propiedades de un gel sumamente estructurado (Figura 12B, módulo G' mucho mayor que G"), que retuvo sus características en un intervalo de temperaturas de 10 °C a 70 °C (resultados no mostrados). Este comportamiento es completamente diferente del de la enzima nativa.

Solamente la preparación de DSR-S vardel Δ4N purificada contuvo solamente una dextransacarasa activa en el extracto. Se sabe que la DSR-S nativa es propensa a problemas de degradación proteolítica [26], y las técnicas de purificación desarrolladas podrían no resolver ese problema [27, 28, 29]. La DSR-S recombinante completa usada en el ensayo contuvo al menos dos formas enzimáticas activas, similares a la preparación de DSR-S vardel Δ4N antes de la purificación. Sin embargo, las formas degradadas de DSR-S nativa, DSR-S recombinante completa y DSR-S vardel Δ4N son completamente diferentes. Actualmente se supone que la cooperación entre estas diferentes formas enzimáticas activas presentes en el medio podría ser el origen de las modificaciones en las cadenas de dextrano, que provoca estas diferencias de comportamiento.

Ejemplo 6: Síntesis de isomaltosa a partir de sacarosa

Se estudió la capacidad de DSR-S vardel Δ4N mutante SEV663YDA de sintetizar solamente isomaltosa (IMO con GP 2) a partir de sacarosa en detrimento de los dextranos de masa molar elevada.

El mutante se purificó mediante cromatografía de afinidad con el uso del procedimiento descrito para DSR-S vardel Δ4N proporcionado en el Ejemplo 3.

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Referencias

[1] Monsan, P., Bozonnet, S., Albenne, C., Joucla, G., Willemot, R. M., y Remaud-Simeon, M. 2001. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria. International Dairy Journal 11, 675-685.

[2] Coutinho, P. M., y Henrissat, B. 1999, Carbohydrate-Active Enzymes server, http://afmb.cnrs-mrs.fr/cazy/CAZYlindex.html

[3] Monchois, V., Remaud-Simeon, M., Russell, R. R., Monsan, P., y Willemot, R. M. 1997. Characterization of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase (DSR-S) and identification of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity. Appl.Microbiol.Biotechnol. 48,465.

[4] Koepsell, H. J., Tsuchiya, H. M., Hellman, N. N., Kazenko, A., Hoffman, C. A., Sharpe, E. S., y Jackson, R. W. 1953. Enzymatic synthesis of dextran; acceptor specificity and chain initiation. J Biol Chem 200, 793-801.

[5] Groenwall, A. J., e Ingelman, G. A. 1948. Manufacture of infusion and injection fluids. Patente de EE.UU.

2.437.518.

[6] Robyt, J. F. 1985. Dextran, págs. 753-767. En J. I. Kroschwitz (ed.), Encyclopedia of polymer Science, vol. 4. Wiley-VCH, Nueva York.

[7] Ahsan, N. 1998. Intravenous infusion of total dose iron is superior to oral iron in treatment of anemia in peritoneal dialysis patients: a single center comparative study. J Am Soc Nephrol 9, 664-8.

[8] De Belder, A. N. 1996 Medical applications of dextran and its derivatives, págs. 275-296. En S. Domitriu (ed.), Polysaccharides in medicinal applications. Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

[9] Jagodzinski, P. P., Lewandowska, M., Januchowski, R., Franciszkiewicz, K., y Trzeciak, W. H. 2002. The effect of high molecular weight dextran sulfate on the production of interleukin-8 in monocyte cell culture. Biomed Pharmacother 56, 254-7.

[10] Hersline, R. 2004. Antiviral composition. Patente de EE.UU. 6.821.958.

[11] Nakakuki, T. 2002. Present status and future of functional oligosaccharide development in Japan. Pure App Chem 74, 1245-1251.

[12] Goulas, A. K., Fisher, D. A., Grimble, G. K.. Grandison, A. S., y Rastall, R. A. 2004b. Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans by the combined use of dextransucrase and dextranase. Enzyme and Microbial Technology 35,327-338.

[13] Rousseau, V., Lepargneur, J., Roques, C., Remaud-Simeon, M., y Paul, F. 2005. Prebiotic effect of oligosaccharides on selected vaginal lactobacilli and pathogenic microorganisms. Anaerobe, 11(3),145-153.

[14] Goulas, A. K., Cooper, J. M., Grandison, A. S., y Rastall, R. A. 2004a. Synthesis of isomaltooligosaccharides and oligodextrans in a recycle membrane bioreactor by the combined use of dextransucrase and dextranase. Biotechnol Bioeng 88, 778-87.

[15] Scientific Committee On Food. 2000. Opinion on the scientific committee on food on a dextran preparation produced using Leuconostoc mesenteroides, Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus ssp as a novel food ingredient in bakery products. Comisión Europea, Dirección General de Sanidad y Protección de los Consumidores, Bruselas.

[16] Monchois, V., Reverte, A., Remaud-Simeon, M., Monsan, P., y Willemot, R. M. 1998. Effect of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase carboxy-terminal deletions on dextran and oligosaccharide synthesis. Appl.Environ.Microbiol. 64, 1644-49.

[17] R. Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990)

[18] Tannock, W. G. Probiotics and Prebiotics. Where are we going? Caister Academic Press, Wymondham, R.U. 2002

[19] Khalikova, E., Susi, P. y Korpela, T., 2005. Microbial dextran-hydrolyzing enzymes: fundamentals and applications. Microbial. Mol. Biol. 69,306-25

[20] Merrifield, R.B., 1963 J. Am. Chem. Soc. 85,2149.

[21] Monsan, P., Paul, F., 1995 Enzymatic synthesis of oligosaccharides FEMS Microbiol. Rev, 16, 187-192.

[22] Sumner, J., y Howell, S. 1935. A method for determination of invertase activity. Journal of Biological Chemistry 108, 51.

[23] Gibson, G. R., Roberfroid, M. B., 1995 Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics J. Nutr., 125, 1401-12.

[24] Paul, F., Auriol, D., Oriol, E., y Monsan, P. 1984. Production and purification of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F. Ann. N.Y. Acad. Sci. 434, 267-270.

5 [25] Carrasco, F., Chornet, E., Overend, R. P., y Costa, J. 1989 A generalized correlation for the viscosity of dextrans in aqueous solutions as a function of temperature, concentration, and molecular weight at low shear rate. J Appl Polymer Sci 37, 2087-98.

[26] Arguello-Morales, M., Sanchez-Gonzalez. M., Canedo, M., Quirasco. M., Farres, A., y Lopez-Munguia, A. 2005.

Proteolytic modification of Leuconostoc mesenteroides B-512F dextransucrase. Antonie Van Leeuwenhoek 87, 13110 41.

[27] Miller, A. W., Eklund; S. H., y Robyt, J. F. 1986. Milligram to gram scale purification and characterization of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F. Carbohydr.Res. 147, 119.

[28] Kobayashi, M., y Matsumada, K. 1986. Electrophoretic analysis of the multiple forms of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides. J.Biochem. (Tokyo) 100, 615

15 [29] Kobayashi, M., Mihara, K., y Matsuda, K. 1986. Dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F: characterization of the enzyme bound to Sephadex gel. Agric Biol Chem 50,551-556.

[30] Paul, F., Monsan, P., Remaud, M., Pelenc, V. Process for preparing enzymatically a sugar mixture having a high content of isomaltose from sucrose, Patente de EE.UU. 4.861.381

[31] Blood Products Committee 83rd Meeting -21 de julio de 2005

20 [32] Potocki-de-Montalk, G., Remaud-Simeon, M., Willemot, R.M., Planchot, V., y Monsan, P. 1999. Sequence analysis of the gene encoding amylosucrase from Neisseria polysaccharea and characterization of the recombinant enzyme. J. Bacteriol. 181, 375-381.

[33] Barik, S. 1995. Site-directed mutagenesis by double polymerase chain reaction. Mol Biotechno/3, 1-7.

Claims

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