KR102588044B1 - 폴리비닐알코올 분해효소와 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

아미노산 서열의 레벨까지 실체가 명확히 규명된 신규 PVA 분해효소를 제공하는 동시에, 그 제조방법, 해당 효소를 코딩하는 DNA, 이를 포함하여 된 재조합 DNA 및 형질전환체를 제공하는 것을 과제로 하고, 하기 (1) 내지 (3)의 특징을 갖는 폴리비닐알코올 분해효소, 그 제조방법, 해당 효소를 코딩하는 DNA, 및 이를 포함하는 재조합 DNA 및 형질전환체를 제공함으로써 상기 과제를 해결한다: (1) 폴리비닐알코올을 산화하고 과산화수소를 생성하는 활성을 갖는다; (2) β-디케톤을 가수분해하는 활성을 갖는다; 및 (3) SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분자량 100,000±20,000을 나타낸다.

Description

폴리비닐알코올 분해효소와 그 제조방법

본 발명은 폴리비닐알코올 분해효소와 그 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 신규 폴리비닐알코올 분해효소와 그 제조방법, 해당 효소를 코딩하는 DNA와 이를 포함하여 된 재조합 DNA, 및 형질전환체에 관한 것이다.

폴리비닐알코올(이하, "PVA"로 약칭함)은 아세트산비닐의 모노머를 중합시켜 얻어지는 폴리머인 폴리아세트산비닐을 비누화(알칼리 가수분해)함으로써 얻어지는 수용성 폴리머로서, 접착성, 점결성, 조막성(造膜性), 피막성, 계면활성이 우수한 동시에 높은 화학적 안정성을 구비하고 있기 때문에, 비닐론 섬유, 섬유 호제(糊劑), 종이 가공제, 접착제, 필름 및 중합보조제 등의 원료로서 공업적으로 널리 사용되고 있다. 단, 섬유 호제 등의 용도에서는 사용 후에 PVA를 제거할 필요가 있으며, PVA의 제거에는 대량의 물이나 약제 등이 사용되기 때문에, 비용에 미치는 영향이나 환경에 가해지는 부하가 크다. PVA는 합성 고분자이기 때문에 자연계에서 분해되기 어렵다는 단점을 가지고 있다.

PVA를 분해하는 수단으로는, PVA를 포함하는 공장폐수를 처리하기 위한 활성 슬러지로부터 PVA 분해능을 갖는 미생물을 분리하고, 해당 미생물을 이용하여 PVA를 분해하는 시도가 수없이 보고되고 있다. PVA 분해능을 갖는 미생물로서, 특허문헌 1 내지 5 등에는 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 스핑고픽시스(Sphingopyxis)(이전에는 스핑고모나스(Sphingomonas), 슈도모나스(Pseudomonas)로 분류), 코마모나스(Comamonas)(홍색 세균, 광합성 세균), 마이크로박테리움(Microbacterium), 엔테로박터(Enterobacter), 코리네박테리움(Corynebacterium), 로도코쿠스(Rhodococcus), 카세오박터(Caseobacter), 산토모나스(Xanthomonas), 나이세리아(Neisseria), 바실루스(Bacillus), 부레비박테리움(Brevibacterium), 에세리키아(Escherichia), 에어로박터(Aerobacter), 알칼리제니즈(Alcaligenes), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아스로박터(Arthrobacter), 패니바실러스(Paenibacillus), 카르디오박테리움(Cardiobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 포발리박터(Povalibacter)(이전에는 스테로이도박터(steroidobacter)로 분류), 사랏소스피라(Thalassospira) 등의 세균이 개시되어 있으며, 페니실륨(Penicillium), 지오트리쿰(Geotrichum) 등의 곰팡이류, 담자균류도 개시되어 있다.

미생물에 의한 PVA의 분해는, 일반적으로 PVA를 산화하는 효소와 산화된 PVA를 가수분해하는 효소의 공동작용에 의해 이루어지는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 1). 도 1에 PVA의 효소분해 메커니즘을 모식적으로 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있듯이, PVA를 산화하는 효소로서는, PVA 산화효소(PVA 옥시다아제, "2급 알코올 옥시다아제(Secondary Alcohol Oxidase)"라고도 호칭된다.)와, 피롤로퀴놀린퀴논(Pyrroloquinoline Quinone, PQQ)을 보효소(coenzyme)로 하는 PVA 탈수소효소(PVA 디히드로게나아제, PVADH)의 2종류가 알려져 있으며, 한편, 산화된 PVA를 가수분해하는 효소로서는 산화 PVA 가수분해효소(산화 PVA 히드롤라아제(Oxidized PVA Hydrolase, OPH), "β-디케톤 가수분해효소"라고도 호칭된다.)가 알려져 있다.

슈도모나스속 미생물 유래의 2급 알코올 옥시다아제(PVA 산화효소) 및 산화 PVA 가수분해효소에 대해서는 1970년대 후반부터 1980년대 전반에 걸쳐, 효소의 정제와 그 성질이 각각 보고되고 있으며(비특허문헌 2 및 3), PVA 산화효소는 분자량 약 50,000의 단일 폴리펩타이드로서, 또한 산화 PVA 가수분해효소는 분자량 약 38,000의 단일 폴리펩타이드로서 각각 특징지어져 있다. 또한, 특정 크로마토그래피용 담체를 이용하여 PVA 산화효소와 산화 PVA 가수분해효소를 효율적으로 분리 정제하는 방법도 보고되고 있다(비특허문헌 4). 또한, 특허문헌 6에는 슈도모나스속 미생물의 배양액으로부터 제조된 "효소 조성물"이 개시되어 있으며, PVA를 산화가능한 효소와, 산화된 PVA를 가수분해가능한 효소를 포함하는 해당 "효소 조성물"이, PVA를 포함하는 문화재를 수복할 때의 PVA의 제거에 이용될 수 있음이 기재되어 있다. PQQ을 보효소로 하는 PVA 탈수소효소와 관련해서는, 복수의 미생물 유래의 효소에 대해 그 아미노산 서열이 밝혀져 있으며(특허문헌 7, 비특허문헌 5), 산화 PVA 가수분해효소에 대해서는 슈도모나스속 미생물 유래 효소의 아미노산 서열(특허문헌 3 참조)이나, 그 입체구조까지가 이미 밝혀져 있다(비특허문헌 6). 한편, PVA 산화효소를 폴리펩타이드로서 단일한 레벨까지 정제하여 이화학적 성질을 밝혀낸 보고예는 적으며, 또한 구체적인 아미노산 서열 등은 전혀 보고되어 있지 않다. 이 때문에 PVA의 분해에 관여하는 종래 공지의 효소 또는 효소군의 실체에는 불분명한 점이 많아, PVA의 분해를 산업적 규모로 안정적으로 또한 효율적으로 수행하기에 충분한 레벨로까지 그 실체가 명확히 규명된 PVA 분해효소는 아직 알려져 있지 않다.

일본 특허공개 2004-000259호 공보 일본 특허공개 2005-278639호 공보 일본 특허공개 2006-042611호 공보 일본 특허공개 2006-042612호 공보 일본 특허공개 2006-180706호 공보 일본 특허 제5891478호 공보 일본 특허공개 평9-206079호 공보

Matsumura 등, "매크로몰레큘즈(Macromolecules)", 32권, 7753-7761페이지(1999년) Morita 등, "어그리컬쳐럴 바이오로지컬 케미스트리 (Agric.Biol.Chem.)", 43권, 1225-1235페이지(1979년) Sakai 등, "어그리컬쳐럴 바이오로지컬 케미스트리 (Agric.Biol.Chem)", 45권, 63-71페이지(1981년) Sakai 등, "어그리컬쳐럴 바이오로지컬 케미스트리 (Agric.Biol.Chem)", 47권, 153-155페이지(1983년) Shimao 등, "Biosci.　Biotechnol.　Biochem.", 60권, 1056-1062페이지(1996년) Yang 등, "Chembiochem.", 15권, 1882-1886페이지(2014년)

본 발명의 과제는 그 아미노산 서열의 레벨까지 실체가 명확히 규명된 신규 PVA 분해효소를 제공하는 동시에, 그 제조방법, 해당 효소를 코딩하는 DNA, 이를 포함하여 된 재조합 DNA 및 형질전환체를 제공하는 것에 있으며, 이로써, PVA를 산업적 규모로 안정적이고 효율적으로 분해하는 데에 이바지하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해, 신규 PVA 분해효소에 기대를 담아, PVA의 분해에 관여하는 효소를 생산하는 미생물에 대해 검토를 거듭해왔다. 그 과정에서, 종래부터 PVA 산화효소나 산화 PVA 가수분해효소를 생산하는 것으로 알려져 있던 슈도모나스종(Pseudomonas sp.) VT1B주(NBRC110478)가 의외로, PVA 산화활성과 산화 PVA 가수분해활성을 모두 겸비하며, 쌍두(雙頭)효소로서 단독으로 PVA를 분해할 수 있는, 완전히 신규의 PVA 분해효소를 생산하는 것을 발견하였다. 그리고, 해당 PVA 분해효소의 아미노산 서열 및 모든 성질을 밝히는 동시에, 그 제조방법을 확립하고, 또한, 해당 효소를 코딩하는 DNA와 이를 포함하여 된 재조합 DNA 및 형질전환체를 확립하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 하기 (1) 내지 (3)의 특징을 갖는 신규 PVA 분해효소를 제공하는 동시에, 그 제조방법, 해당 효소를 코딩하는 DNA 및 이를 포함하여 된 재조합 DNA, 및 형질전환체를 제공함으로써 상기 과제를 해결하는 것이다:

(1) PVA를 산화하고 과산화수소를 생성하는 활성을 갖는다;

(2) β-디케톤을 가수분해하는 활성을 갖는다; 및

(3) SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분자량 100,000±20,000을 나타낸다.

본 발명에 따르면, 그 실체가 아미노산 서열 레벨 및 DNA 레벨에서 명확하게 규명된 신규 PVA 분해효소와 그 제조방법을 제공할 수 있으므로, 분해효소의 생산도 포함하여, PVA의 분해를 공업적 또는 산업적 규모로 보다 효율적으로 안정적으로 실행하는 것이 가능하게 된다는 이점이 있다. 또한, 해당 PVA 분해효소는 PVA 산화활성과 산화 PVA 가수분해활성을 모두 겸비한 쌍두효소이며, 다른 효소와 병용할 필요가 없고, 그 단독으로 PVA를 효율적으로 산화 및 분해할 수 있으므로, 사용 편의성이 좋다는 장점을 가지고 있다. 따라서, 본 발명이 제공하는 신규 PVA 분해효소는 PVA의 분해뿐만 아니라, PVA 함유 제품의 개질, 개량 등, PVA가 관여하는 폭 넓은 분야에 유리하게 사용할 수 있다.

도 1은 PVA 산화효소와 산화 PVA 가수분해효소의 공동 작용에 의한 PVA의 분해 메커니즘을 모식적으로 나타낸 도.
도 2는 PVA 분해효소의 정제 표본품 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동도.
도 3은 PVA 분해효소의 정제 표본품 PVA-A의 PVA 산화활성의 최적 온도를 나타낸 도.
도 4는 PVA 분해효소의 정제 표본품 PVA-A의 PVA 산화활성의 최적 pH를 나타낸 도.
도 5는 PVA 분해효소의 정제 표본품 PVA-A의 PVA 산화활성의 온도 안정성을 나타낸 도.
도 6은 PVA 분해효소의 정제 표본품 PVA-A의 PVA 산화활성의 pH 안정성을 나타낸 도.
도 7은 본 발명의 PVA 분해효소의 N말단측 전반부의 아미노산 서열과, 공지의 PVA 탈수소효소와의 상동성을 조사한 결과를 나타낸 도.
도 8은 본 발명의 PVA 분해효소의 C말단측 후반부의 아미노산 서열과, 공지의 산화 PVA 가수분해효소와의 상동성을 조사한 결과를 나타낸 도.
도 9은 PVA 분해효소, PVA-A 및 PVA-B의 구조를 모식적으로 나타낸 도.
도 10은 PVA 분해효소 PVA-A를 코딩하는 DNA를 포함하는 자율복제가능한 재조합 DNA "pRSET A-PVA-A"의 구조를 나타낸 모식도.
도 11은 기질 PVA에 PVA 분해효소 PVA-A를 작용시켜 얻어진 PVA 분해물의 겔 여과 크로마토그램.

본 발명은 하기 (1) 내지 (3)의 특징을 갖는 신규 PVA 분해효소에 관한 것이다:

(1) PVA를 산화하고 과산화수소를 생성하는 활성을 갖는다;

(2) β-디케톤을 가수분해하는 활성을 갖는다; 및

(3) SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분자량 100,000±20,000을 나타낸다.

본 발명의 PVA 분해효소는 상기 (1)에 나타난 대로, 기질인 PVA를 산화하는 동시에 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 활성, 즉 PVA 산화활성을 갖고 있다. PVA 산화활성은 예를 들어, 다음과 같은 방법에 의해 측정할 수 있다.

<PVA 산화활성의 측정방법>

PVA(시약급 폴리비닐알코올, 중합도 2,000, 나카라이테스크 주식회사 판매)를 2%(w/v)의 농도가 되도록 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 용해한 기질용액 0.5mL에, 2%(w/v)의 아지드화나트륨 용액을 15μL 첨가하고, 여기에 효소액 0.5mL를 첨가하여 27℃에서 60분간 진탕하면서 반응시킨다. 반응 후, 반응액 0.32mL를 티타늄 시약 0.8mL와 혼합하여 반응을 정지시키고, 효소 반응에 의해 생성한 과산화수소와 티타늄 시약이 반응하여 생기는 노랑색을 410nm의 흡광도(A₄₁₀)를 지표로 측정한다. 별도로, 기질용액에 효소액을 첨가하고, 바로 티타늄 시약과 혼합하여 마찬가지로 측정한 값을 반응 0분의 값으로 하며, 이하에 나타낸 식에 기초하여 생성한 과산화수소의 양을 구하여 PVA 산화활성을 산출한다. 참고로, 과산화수소가 3.65μmol/mL 생성되면, 410nm의 흡광도(A₄₁₀)는 "1" 변화함을 알 수 있기 때문에, 하기 식 1에서는 흡광도의 변화량에 "3.65"의 계수가 곱셈되어 있다. PVA 산화활성 1단위는 상기 조건에서 1분 동안 1μmol의 과산화수소를 생성하는 효소량으로 정의한다. 또한, 티타늄 시약은 황산티타늄(IV) 용액(5%, 나카라이테스크 주식회사 판매)을 10%(w/w) 황산으로 25배 희석하여 조제한다.

식 1 :

또한, 본 발명의 PVA 분해효소는, 상기 (2)에 나타난 바와 같이, β-디케톤을 가수분해하는 활성, 즉 β-디케톤 가수분해활성을 가지고 있다. β-디케톤 가수분해활성을 갖는 효소는 β-디케톤 구조를 갖는 산화된 PVA(산화 PVA)를 가수분해할 수 있다. β-디케톤 가수분해활성은, β-디케톤 구조를 갖는 산화 PVA의 모델 화합물인 2,4-펜탄디온의 가수분해를 조사함으로써 확인할 수 있다. PVA 분해효소가 2,4-펜탄디온을 가수분해하면 아세톤과 아세트산을 생성한다. 따라서, β-디케톤 가수분해활성은 2,4-펜탄디온을 기질로 사용하여, 예를 들면 다음과 같은 방법으로 확인할 수 있다.

<β-디케톤 가수분해활성의 확인방법>

2,4-펜탄디온(시약, 와코쥰야쿠공업주식회사 판매)을 0.2%(w/v)의 농도가 되도록 조제한 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 1mL를 기질용액으로 하고, 이에 효소액 0.2mL, 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 0.8mL를 첨가한 후, 27℃에서 3시간 진탕하여 반응시킨다. 반응 후, 2mL의 반응액을 글라스 바이알에 분주, 밀폐하고, 95℃에서 40분간 가열하며, 바이알 중의 기체 1mL를 채취하여 하기의 가스 크로마토그래피(GC) 분석에 제공함으로써, 2,4-펜탄디온의 가수분해산물인 아세톤을 검출한다. 아세톤의 생성이 확인된 효소액을 "β-디케톤 가수분해활성 있음"으로 판정한다.

(GC 조건)

장치 : GC-2010 Plus(주식회사 시마즈제작소 제품)

컬럼 : DB-5(Part number.122-5032)(애질런트테크놀로지 주식회사 제품)

기화실 온도 : 150℃; 주입 모드 : 스플릿;

캐리어 가스 : 헬륨;

제어 모드 : 선속도 압력 : 114.6kPa

총유량 : 12.6mL/min 컬럼 유량 : 1.6mL/min

선속도 : 35.0cm/sec 퍼지 유량 : 3.0mL/min

스플릿비 : 5.0

컬럼 온도 : 40℃; 평형시간 : 1.0분;

컬럼 온도 프로그램 : 컬럼 온도 40℃에서 5분간 유지한 후, 12분에 걸쳐 100℃까지 5℃/min으로 승온하고, 이어, 15분에 걸쳐 250℃까지 10℃/min으로 승온한 후, 250℃에서 3분간 유지

검출기 : FID; 검출기 온도: 260℃;

본 발명의 PVA 분해효소는 상술한 PVA 산화활성(특징 (1))과 β-디케톤 가수분해활성(특징 (2))을 겸비함으로써, PVA 분해 활성을 가지며, 단독으로 PVA 분해효소로서 기능하는 것인데, PVA 분해효소로서의 활성은 예를 들어, 하기의 방법으로 PVA의 분해에 따른 PVA 용액의 점도 저감을 지표로 하여 측정할 수 있다.

<PVA 분해활성(점도 저감 활성)의 측정방법>

PVA(시약급 폴리비닐알코올, 중합도 2,000, 나카라이테스크 주식회사 판매)를 2%(w/v)의 농도가 되도록 100mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에 용해한 기질용액 0.5mL에, 2%(w/v)의 아지드화나트륨 용액을 15μL 첨가한 후, 여기에 효소액 0.5mL를 첨가하여 27℃에서 60분간 진탕하면서 반응시킨다. 반응 후, 반응액 0.6mL를 사용하고, 콘 플레이트형 점도계(상품명 "DV-II+Pro", 브룩필드사 제품)를 사용하여 30℃에서 점도를 측정한다. 별도로, 기질용액에 효소액을 첨가하고, 바로 측정한 점도를 반응 0분의 점도로 하여, 하기 식에 기초하여 PVA 분해활성을 산출한다. PVA 분해활성 1단위는 상기 조건 하에, 1분 동안 10%의 상대점도의 저감을 야기하는 효소량으로 정의한다.

식 2 :

또한, 본 발명의 PVA 분해효소는, 통상적으로, 상기 (3)에 나타나는 특징, 즉 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 있어서, 100,000±20,000의 분자량을 나타낸다는 특징을 갖는다.

또한, 본 발명의 PVA 분해효소의 바람직한 일 양태로서는, PVA 산화활성과 관련하여, 하기 (4) 내지 (7)의 효소학적 성질을 갖는 효소를 들 수 있다:

(4) 최적 온도

pH 7.0, 60분간 반응 조건하에서, 35 내지 40℃;

(5) 최적 pH

27℃, 60분간 반응 조건하에서, pH 6.5 내지 8.0;

(6) 온도 안정성

pH 7.0, 60분간 유지 조건하에서, 45℃까지 안정; 및

(7) pH 안정성

4℃, 24시간 유지 조건하에서, pH 4.5 내지 10.5에서 안정.

또한, 본 발명의 PVA 분해효소의 보다 바람직한 일 양태로서는, 하기 (8)의 특징을 더 갖는 효소를 들 수 있다:

(8) N말단 아미노산 서열로서, 서열목록에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 PVA 분해효소는, 통상적으로, 폴리펩타이드로서 소정의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 그 바람직한 예로는 예를 들어, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열, 또는 그들에게 상동적인 아미노산 서열을 들 수 있다. 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열에 상동적인 아미노산 서열을 갖는 효소로서는, PVA를 산화하고 과산화수소를 생성하는 활성, 및, β-디케톤을 분해하는 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열에서 1개 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있으며, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열에 대해, 통상적으로 84% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성(서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열로서 예시되는, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열은, 실험 항에서 후술하는 바와 같이, 모두 아미노산 서열의 N말단측 전반부에 공지의 PVA 탈수소효소와 상동성을 나타내는 영역이 존재하고, 또한, C말단측 후반부에 공지의 산화 PVA 가수분해효소와 상동성을 나타내는 영역이 각각 존재한다는 특징적인 구조를 갖는 아미노산 서열이다. 이러한 특징적인 아미노산 서열을 가지고 있다는 사실은 본 발명의 PVA 분해효소가 쌍두효소로서, 그 폴리펩타이드의 N말단측 전반부에서 PVA를 산화하고, C말단측 후반부에서 산화 PVA를 가수분해하고 있을 가능성을 시사하고 있다.

또한, 후술하는 실험 항에서도 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드의 N말단측 전반부에서 유래하는 PVA 산화효소 단편(fragment)과, 폴리펩타이드의 C말단측 후반부에서 유래하는 산화 PVA 가수분해효소 단편이 슈도모나스종 VT1B주의 배양액 중에 실제로 확인되었기 때문에, 본 발명의 PVA 분해효소가 쌍두효소로서 기능하고 있으며, 해당 N말단측 전반부와 해당 C말단측 후반부에 각각 PVA 산화효소와 산화 PVA 가수분해효소가 존재하고 있음이 실증되었다. 이는 필요에 따라, 본 발명의 PVA 분해효소를 인위적으로 프로테아제 등으로 한정분해함으로써, PVA 산화효소와 산화 PVA 가수분해효소를 따로따로 조제할 수 있음을 말해주는 것이다.

본 발명의 PVA 분해효소는 그 공급원에 의해 제한되지 않지만, 바람직한 공급원로서, 슈도모나스속에 속하는 미생물을 들 수 있으며, 본 발명자들이 발견한 미생물, 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) VT1B주 또는 그 변이주가 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA란, 상술한 본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 DNA 전반을 의미한다. 본 발명의 DNA는, 본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 갖는 것인 한, 그것이 천연 유래의 것이어도, 인위적으로 합성된 것이어도 좋다. 천연의 공급원으로서는, 예를 들면, 슈도모나스종 VT1B주를 포함하는 슈도모나스속 미생물을 들 수 있으며, 이들 균체로부터 본 발명의 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 얻을 수 있다. 즉, 이러한 미생물을 영양배지에 접종하여, 호기적 조건하에서 약 5 내지 10일간 배양 후, 배양물로부터 균체를 채취하고, 리소자임과 β-글루카나아제(Glucanase) 등의 세포벽 용해효소나 초음파로 처리함으로써 해당 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 균체 밖으로 용출시킨다. 이 때, 프로테아제 등의 단백질 분해효소를 병용하거나, SDS 등의 계면활성제를 공존시키거나 동결 융해하여도 좋다. 이렇게 하여 얻어지는 처리물에, 예를 들면, 페놀 추출, 알코올 침전, 원심 분리, 리보뉴클레아제 처리 등의 통상적인 방법을 적용하면 목적의 게놈 DNA가 얻어진다. 본 발명의 DNA를 인위적으로 합성하기 위해서는 예를 들어, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열에 기초하여 화학적으로 합성하면 된다. 또한, 해당 DNA를 포함하는 게놈 DNA를 주형으로 하여, 적당한 프라이머가 되는 화학적 합성 DNA를 사용하여 PCR 합성하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명의 DNA는 통상적으로 소정의 염기서열을 가지고 있으며, 그 예로서는 서열목록에서 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열, 또는 그들에 상동적인 염기서열, 나아가서는 그들의 염기서열에 상보적인 염기서열을 들 수 있다. 서열목록에서 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열에 상동적인 염기서열을 갖는 DNA로서는, 코딩하는 PVA 분해효소의 활성을 유지하는 범위에서, 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열에서 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 것을 들 수 있으며, 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열에 대해, 통상적으로, 82% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 또한 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성(서열 동일성)을 갖는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한 이들 PVA 분해효소를 코딩하는 DNA에 있어서, 유전자 코드의 축중(degeneracy)에 기초하여, 각각이 코딩하는 PVA 분해효소의 아미노산 서열을 바꾸지 않고 염기의 1개 또는 2개 이상을 다른 염기로 치환한 것도 당연히 본 발명의 DNA에 포함된다.

본 발명의 DNA를 자율복제가능한 적절한 벡터에 삽입하여 재조합 DNA로 하는 것도 유리하게 실시될 수 있다. 재조합 DNA는 통상적으로, DNA와 자율복제가능한 벡터로 이루어지며, DNA를 입수할 수 있다면, 통상적인 방법의 재조합 DNA 기술에 의해 비교적 용이하게 조제할 수 있다. 이러한 벡터의 예로는 플라스미드, 파지 또는 코스미드 등을 들 수 있으며, 도입되는 세포 또는 도입방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 벡터의 구체적인 종류는 특별히 한정되는 것이 아니며, 숙주세포 중에서 발현가능한 벡터를 적절히 선택하면 된다. 숙주세포의 종류에 따라, 확실하게 상기 유전자를 발현시키기 위해 적절히 프로모터 서열을 선택하고, 이와 상기 유전자를 각종 플라스미드 등에 삽입한 것을 발현 벡터로서 사용하면 된다. 이러한 발현 벡터로서는, 예를 들면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 염색체 벡터, 에피솜 벡터 및 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 엘리먼트 및 바이러스(예를 들면, 바큘로 바이러스, 파포바 바이러스, 백시나 바이러스(vaccinia virus), 아데노 바이러스, 조류 폭스 바이러스(Avian Pox virus), 가성 광견병 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌치 바이러스 및 레트로 바이러스)) 및 이들 조합에서 유래하는 벡터(예를 들면, 코스미드 및 파지미드)를 이용 가능하다.

세균에서의 사용에 바람직한 벡터로서는 예를 들어, pQE-70, pQE-60, pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescipt 벡터, pNH8A, pNH6a, pNH18A 및 pNH46A; 및 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5 등을 들 수 있다. 또한, 진핵 생물에서의 사용에 바람직한 벡터로서는 pWLNE0, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 그리고 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL 등을 들 수 있다.

본 발명의 DNA를 이러한 벡터에 삽입하기 위해서는 해당 분야에서 통상 일반적인 방법이 채택된다. 구체적으로는 우선, 목적으로 하는 DNA를 포함하는 유전자 DNA와 자율복제가능한 벡터를 제한 효소 및/또는 초음파에 의해 절단하고, 이어, 생성한 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 이렇게 하여 얻어지는 재조합 DNA는 적절히 숙주에 도입하여 형질전환체로 하고, 이를 배양함으로써 무한히 복제할 수 있다.

이렇게 하여 얻어지는 재조합 DNA는 대장균, 고초균, 방선균, 효모를 비롯한 적절한 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 형질전환체를 취득하기 위해서는 콜로니 하이브리다이제이션법을 적용하거나, 영양배지에서 배양하여, PVA 분해효소를 생산하는 것을 선택하면 된다.

본 발명의 PVA 분해효소는 PVA 산화활성과 산화 PVA 가수분해활성을 모두 겸비하며, 또한 실험 항에서 후술하는 바와 같이, 효소 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 N말단측 전반부에 공지의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열과 낮으면서도 상동성을 나타내는 영역을 가지며, 또한, C말단측 후반부에 공지의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열과 비교적 높은 상동성을 나타내는 영역을 갖는다. 이러한 사실에 기초하여, 본 발명의 DNA, 즉, 본 발명의 PVA 분해효소를 코딩하는 DNA의 중간부에 시종 코돈, 터미네이터 서열 등을 삽입함으로써, PVA 분해효소의 N말단측 전반부만의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 인위적으로 창출하고, 재조합 DNA 기술을 이용하여 적절한 숙주 미생물 중에서 그 개변 유전자를 발현시킴으로써, PVA 산화활성만을 갖는 폴리펩타이드(효소)를 창출할 수 있고, 이를 재조합형 PVA 산화효소로서 제조 및 이용할 수 있다.

본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열로서 예시한 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과, 마찬가지로 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은 실험 항에서 후술하는 대로, 아미노산 서열 전체에서는 상동성(서열 동일성)이 약 84%를 나타내지만, 공지의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열과의 상동성을 갖는 N말단측 전반부 약 450 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열의 영역에 한정하면, 그 상동성(서열 동일성)은 약 90%가 된다. 이 때문에, 상기에서 창출되는 PVA 산화활성만을 갖는 효소로서는 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N말단측 전반부 약 450 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 갖거나, 또는, 해당 아미노산 서열에서, 약 90%의 상동성(서열 동일성)을 유지하는 범위 내에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 부가 또는 치환된 변이체 효소를 들 수 있다.

한편, 마찬가지로 상술한 사실에 기초하여, 본 발명의 DNA, 즉 본 발명의 PVA 분해효소를 코딩하는 DNA의 중간부에 프로모터 서열, 개시 코돈, 분비 신호 서열을 코딩하는 염기서열 등을 삽입함으로써, 본 발명의 PVA 분해효소의 C말단측 후반부만의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA를 인위적으로 창출하고, 마찬가지로 발현시킴으로써, 산화 PVA 가수분해활성만을 갖는 폴리펩타이드(효소)를 창출할 수 있고, 이를 재조합형 산화 PVA 가수분해효소로서 이용할 수 있다.

또한, 상기와 같이, 본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열로서 예시한 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과, 마찬가지로 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열은, 아미노산 서열 전체에서는 상동성(서열 동일성)이 약 84%를 나타내지만, 공지의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열과의 상동성을 갖는 C말단측 후반부 약 340 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열의 영역으로 한정하면, 그 상동성(서열 동일성)은 약 85%가 된다. 이 때문에, 상기에서 창출되는 산화 PVA 가수분해활성만을 갖는 효소로서는, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열의 C말단측 후반부 약 340 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 갖거나, 또는, 해당 아미노산 서열에서, 약 85%의 상동성(서열 동일성)을 유지하는 범위 내에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 부가 또는 치환된 변이체 효소를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열로서 예시한 서열목록에서 서열번호 2 및 3으로 표시되는 아미노산 서열은, 그 어느 것에서든, N말단측 전반부의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 영역과 C말단측 후반부의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 영역 사이에, 약 90 내지 100 아미노산 잔기의 서열로 이루어진 링커부를 가지고 있다. 본 발명의 PVA 분해효소가 N말단측 전반부만으로 PVA 산화효소의 기능을 가지며, C말단측 후반부만으로 산화 PVA 가수분해효소의 기능을 가지고 있는 것이면, 해당 링커가 2종류의 효소 활성에 악영향을 미치지 않고 쌍두효소의 구성에 도움이 되고 있다고 생각된다. 해당 링커부는 본 발명의 PVA 분해효소뿐만 아니라, 다른 적당한 2종류의 효소를 연결하여 쌍두효소로 하기 위해 이용될 수 있는 가능성이 있다.

본 발명의 PVA 분해효소 생산능을 갖는 미생물(형질전환체를 포함)의 배양에 사용하는 배지는 미생물을 생육할 수 있으며, PVA 분해효소를 생산할 수 있는 영양배지이면 되고, 합성배지 및 천연배지 중 어느 것이어도 좋다. 탄소원으로서는 미생물을 생육에 이용할 수 있는 것이면 되며, 예를 들면, 글리세린, 에틸렌글리콜, PVA 등의 폴리알코올류, 식물 유래의 전분이나 피토글리코겐, 동물이나 미생물 유래의 글리코겐이나 풀루란, 또한, 이들의 부분분해물이나 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 당밀 등의 당질, 또한 구연산, 호박산 등의 유기산도 사용할 수 있다. 배지에서의 이들 탄소원의 농도는 탄소원의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다. 질소원으로서는 예를 들면, 암모늄염, 질산염 등의 무기 질소 화합물, 및 예를 들어, 요소, CSL(Corn Steep Liquor), 카제인, 펩톤, 효모 추출물, 육즙 등의 유기 질소 함유물을 적절하게 사용할 수 있다. 또한, 무기 성분으로는 예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 망간염, 아연염, 철염, 구리염, 몰리브덴염, 코발트염 등의 염류를 적절히 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 아미노산, 비타민 등도 적절하게 사용할 수 있다.

미생물의 배양은 통상적으로 온도 15 내지 37℃에서 pH 5.5 내지 10의 범위, 바람직하게는 온도 20 내지 34℃에서 pH 5.5 내지 8.5의 범위로부터 선택되는 조건에서 호기적으로 이루어진다. 배양시간은 해당 미생물이 증식할 수 있는 시간이면 되며, 바람직하게는 5일 내지 10일간이다. 또한, 배양조건에서의 배양액의 용존산소 농도는 특별히 제한은 없지만, 통상적으로는 0.5 내지 20ppm이 바람직하다. 그 때문에, 통기량을 조절하거나 교반하거나 하는 등의 수단을 적절히 채택한다. 또한, 배양방식은 회분배양(batch culture) 또는 연속배양(continuous culture) 중 어느 것이어도 좋다.

이렇게 하여 미생물을 배양한 후, 본 발명의 PVA 분해효소를 포함하는 배양물을 회수한다. PVA 분해효소의 활성은 주로 배양물로부터 균체를 제거하여 얻어지는 배양상층액에서 확인되며, 배양상층액을 조(crude)효소액으로서 채취하는 것도, 배양물 전체를 조효소액으로서 사용할 수도 있다. 배양물로부터 균체를 제거하기 위해서는 공지의 고액분리법이 채택된다. 예를 들어, 배양물 그 자체를 원심분리하는 방법, 혹은 프리코팅 필터 등을 사용하여 여과분리하는 방법, 평막, 중공사막 등의 막 여과에 의해 분리하는 방법 등이 적절하게 채택된다. 배양상층액을 그대로 조효소액으로서 사용할 수 있지만, 일반적으로는 농축하여 사용된다. 농축법으로는 황산암모늄 염석법, 아세톤 및 알코올 침전법, 평막, 중공사막 등을 이용한 막 농축법 등을 채택할 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 PVA 분해효소는 조효소액을 그대로 또는 농축하여 사용할 수 있는데, 필요에 따라, 공지의 방법에 의해 더욱 분리·정제하여 이용할 수도 있다. 예를 들어, 실험 항에서 후술하는 바와 같이, 배양액의 처리물을 황산암모늄 염석하여 농축한 부분정제효소를 투석 후, "DEAE-Toyopearl 650S"를 이용한 음이온 교환 컬럼크로마토그래피, 이어 "CM-Toyopearl 650S"를 이용한 양이온 교환 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제함으로써, 본 발명의 PVA 분해효소를 전기영동적으로 단일한 효소 형태로 얻을 수 있다. 또한, PVA 분해효소의 정제에는 기타 소수성 컬럼크로마토그래피, 겔 여과 컬럼크로마토그래피, 친화성 컬럼크로마토그래피, 조제용 등전점 전기영동 등의 적절한 정제방법을 유리하게 이용할 수 있다.

PVA 분해효소가 재조합형 효소인 경우에는, 숙주의 종류에 따라서는 균체 내에 효소가 축적될 수 있다. 이러한 경우에는 균체 또는 배양물을 그대로 사용하는 것도 가능하지만, 통상적으로는 사용에 앞서, 필요에 따라, 삼투압 충격이나 계면활성제에 의해 균체로부터 추출한 후, 또는 초음파나 세포벽 용해효소에 의해 균체를 파쇄한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 재조합형 효소를 균체 또는 균체 파쇄물로부터 분리하여 사용하는 것도 유리하게 실시될 수 있다.

본 발명의 PVA 분해효소의 기질인 PVA는 그 분자량(또는 중합도), 비누화도에 의해 특별히 한정되는 것은 아니지만, 일반적으로 분자량은 15,000 내지 200,000(중합도는 400 내지 3,900)이고 비누화도는 70 내지 99몰% 등인 것을 들 수 있다.

본 발명의 PVA 분해효소를 기질인 PVA에 작용시킬 때에는, 그 기질 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 기질 농도 0.1%(w/v)의 비교적 저농도의 용액을 사용한 경우일지라도, 본 발명의 PVA 분해효소의 반응은 진행되어 PVA를 분해한다. 공업적으로는 기질 농도 1%(w/v) 이상이 바람직하며, 이 조건에서 PVA를 유리하게 분해할 수 있다. 반응온도는 반응이 진행되는 온도, 즉 55℃ 부근까지 실시하면 된다. 바람직하게는 25 내지 50℃ 부근의 온도를 사용한다. 반응 pH는 통상적으로 4.5 내지 8.0의 범위, 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.5의 범위로 조정하는 것이 좋다. 효소의 사용량과 반응시간은 밀접하게 관련되어 있어, 목적으로 하는 효소 반응의 진행에 따라 적절히 선택하면 된다.

이하, 실험에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다.

<실험 1 : 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)의 배양과 조(crude)효소제의 조제>

PVA(시약급 폴리비닐알코올, 중합도 500, 나카라이테스크 주식회사 판매) 1g/L, 인산이칼륨 0.3g/L, 인산일칼륨 1g/L, 염화나트륨 0.5g/L, 질산암모늄 1g/L 및 물로 이루어진 액체배지를 pH 7.0으로 조정한 후, 오토 클레이브(121℃, 20분)로 멸균하고, 멸균배지에 별도로 여과멸균한 황산마그네슘 7수화물, 염화칼슘 2수화물 및 황산제이철 7수화물을 각각 최종 농도 0.5g/L, 0.05g/L 및 0.02g/L가 되도록 첨가하며, 다시, 여과멸균한 염산 티아민 및 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 각각 최종 농도 0.01g/L 및 10μg/L가 되도록 첨가하여 얻어지는 액체배지를 배양에 사용하였다.

평판 한천배지에서 계대배양한 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)를 백금이로 긁어내어, 멸균한 0.85% 식염수(약 2mL)에 현탁하였다. 현탁액의 탁도(파장 660nm의 흡광도, A₆₆₀)를 0.5로 조정하고, 상기 액체배지 3mL를 넣은 시험관에 60μL 식균한 후, 27℃에서 240rpm으로 5일간 진탕 배양하여 종균배양(seed culture)으로 하였다.

또한, 소포제(아데카놀 LG-126)를 최종 농도 0.2g/L가 되도록 첨가한 것 이외는 상기 액체배지와 동일한 것을 200mL씩 20개의 500mL 삼각 플라스크에 분주하고, 각각에, 상기에서 얻은 종균배양액을 2%(v/v)씩 식균한 후, 27℃에서 240rpm으로 10일간 진탕 배양하여, 메인 배양으로 하였다. 배양 후, 배양액을 원심분리(8,000rpm, 20분간)하여 균체를 제거하고, 배양상층액 약 4L를 조(crude)효소액으로서 얻었다. 조효소액의 PVA 산화활성은 총활성으로서 약 139단위였다.

<실험 2 : PVA 분해효소의 정제>

실험 1에서 얻은 배양상층액 4L에, 최종 농도 60% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가하고, 4℃에서 24시간 방치함으로써 염석하였다. 생성한 염석 침전물을 원심분리(11,000rpm, 30분간)로 회수하고, 이를 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해한 후, 동일 완충액에 대해 투석하여 황산암모늄 염석 투석액을 약 45mL 얻었다. 이 황산암모늄 염석 투석액을 "DEAE-Toyopearl 650S" 겔(토소 주식회사 제품)을 이용한 음이온 교환 컬럼크로마토그래피(겔 용량 24mL)에 제공하였다. PVA 산화활성은 10mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 컬럼에 흡착하지 않고 비흡착 획분으로 용출하는 활성 획분과, 컬럼에 흡착하여 동일 완충액의 식염 농도를 0M에서 0.5M까지 직선적으로 상승시키는 구배(gradient) 용출로 용출하는 활성 획분으로 나뉘었다. "DEAE-Toyopearl 650S" 겔에 흡착하여 식염으로 용출시킨 활성 획분을 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하여 PVA 분해효소 정제 표본품 (PVA-B)로 하였다.

이어서, "DEAE-Toyopearl 650S"를 이용한 음이온 교환 컬럼에 흡착하지 않은 활성 획분을 "CM-Toyopearl 650S" 겔(토소 주식회사 제품)을 이용한 양이온 교환 컬럼크로마토그래피(겔 용량 23mL)에 제공하였다. PVA 산화활성은 "CM-Toyopearl 650S" 겔에 흡착하여 식염 농도 0M 내지 0.5M의 선형 구배로 용출시킨 결과, 식염 농도 약 0.08M 부근으로 용출되었다. 활성 획분을 회수하고 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하여 PVA 분해효소 정제 표본품 (PVA-A)로 하였다.

상기 정제공정의 각 단계에서 측정한 PVA 분해효소의, PVA 산화활성으로서의 총활성, 총단백질, 비(比)활성 및 수율을 표 1에 정리하였다. 또한, 별도로, 배양상층액(조(粗)효소)와 정제 효소 표본품에 대해 정성적으로 확인한 2,4-펜탄디온 분해활성과, PVA 산화활성의 측정과 함께 정제공정의 각 단계에서 측정한 PVA 분해활성에 대해 각각 표 1에 병기하였다. 또한, 표 1에서 2,4-펜탄디온 분해활성에 대한 표기 "○"는 2,4-펜탄디온의 가수분해산물인 아세톤이 검출된 것을 의미한다.

표 1에서 볼 수 있듯이, PVA를 산화하여 과산화수소를 생성하는 PVA 산화활성과 β-디케톤인 2,4-펜탄디온을 가수분해하는 활성, 나아가서는 PVA 분해활성(점도 저감 활성)을 모두 갖는 2종류의 정제 효소 표본품 "PVA-A" 및 "PVA-B"가 얻어졌다.

PVA 분해효소 정제 표본품인 PVA-A 및 PVA-B를 각각 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(8 내지 16w/v% 농도구배)에 제공하여 순도를 검정한 결과, 모두 단일한 단백질 밴드를 나타내며, 순도가 높은 표본품인 것이 판명되었다.

<실험 3 : PVA 분해효소의 성질>

<실험 3-1 : 분자량>

실험 2에서 얻은 PVA 분해효소 정제 표본품, 즉 PVA-A 및 PVA-B를 각각 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(8 내지 16w/v% 농도구배)에 제공하는 동시에, 영동한 분자량 마커(상품명 "프리시젼 Plus 프로테인 미착색 스탠다드", 일본 Bio-Rad laboratories 주식회사 판매)와 비교하여 분자량을 측정하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 도 2에 있어서, 부호 M은 동시에 전기영동한 분자량 마커를 의미하고, 부호 A와 B는 각각 PVA-A 및 PVA-B를 의미한다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, PVA-A 및 PVA-B는 모두 거의 단일한 단백질 밴드를 나타내고, 또한, 분자량 마커와의 대비를 통해, 거의 동등한 분자량, 100,000±20,000을 갖는 것이 판명되었다.

<실험 3-2 : 최적 온도 및 최적 pH>

실험 2에서 얻은 PVA 분해효소 정제 표본품 중, PVA-A를 사용하고, PVA 산화활성을 지표로 하여, 효소 활성에 미치는 온도, pH의 영향을 활성측정법에 준해 조사하였다. 이들 결과를 도 3(최적 온도), 도 4(최적 pH)에 나타내었다. 또한, 도 4 중의 부호 ●, ■ 및 ▲는 각각 pH 컨트롤에 아세트산 완충액, 인산 완충액 및 글리신-NaOH 완충액을 사용하여 측정한 값을 의미한다. PVA 산화활성의 최적 온도는 pH 7.0, 60분간 반응 조건하에서 35 내지 40℃이며, 최적 pH는 27℃, 60분간 반응 조건하에서 6.5 내지 8.0인 것이 판명되었다. 또한, 상세한 데이터는 생략하지만, PVA-B도 PVA-A와 거의 동일한 최적 온도 및 최적 pH를 나타내었다.

<실험 3-3 : 온도 안정성 및 pH 안정성>

실험 2의 방법으로 얻은 PVA 분해효소 정제 표본품 중, PVA-A를 사용하고, PVA 산화활성을 지표로 하여, 온도 안정성 및 pH 안정성을 조사하였다. 온도 안정성은 효소용액(10mM 인산 완충액, pH 7.0)을 각 온도로 60분간 유지하고 수냉한 후, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. pH 안정성은 효소용액을 각 pH의 100mM 완충액 중에서 4℃에서 24시간 유지한 후, pH를 7.0으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 이들 결과를 도 5(온도 안정성), 도 6(pH 안정성)에 나타내었다. 또한, 도 6 중의 부호 ●, ■, ▲ 및 ◆는 각각 pH 컨트롤에 아세트산 완충액, 인산 완충액, 글리신-NaOH 완충액 및 염화칼륨-NaOH 완충액을 사용하여 얻은 값을 의미한다. 도 5에서 알 수 있듯이, PVA 산화활성의 온도 안정성은 45℃까지인 것이 판명되었다. 또한, 도 6에서 알 수 있듯이, PVA 산화활성의 pH 안정성은 pH 4.5 내지 10.5의 범위인 것이 판명되었다. 또한, 상세한 데이터는 생략하지만, PVA-B도 PVA-A와 거의 같은 온도 안정성 및 pH 안정성을 나타내었다.

<실험 3-4 : PVA 산화활성에 미치는 각종 금속염의 영향>

실험 2의 방법으로 얻은 PVA-A 및 PVA-B의 정제 효소 표본품을 사용하고, PVA 산화활성을 지표로 하여, 각종 금속염이 효소 활성에 미치는 영향을 농도 1mM의 금속염의 존재 하에서 활성측정방법에 준해 조사하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에서 볼 수 있듯이, PVA 산화활성에 미치는 금속염의 영향에서 PVA-A와 PVA-B 사이에 큰 차이는 확인되지 않으며, Hg²⁺, Fe³⁺　이온으로 현저하게 저해되고, 또한 EDTA에 의해서도 저해되는 것이 판명되었다.

<실험 3-5 : PVA 산화활성에 대한 기질 특이성>

실험 2의 방법으로 얻은 PVA-A 및 PVA-B의 정제 효소 표본품을 사용하고, 기질로서 각종 2급 알코올, 1급 알코올, 그 밖에 작용시켜, PVA 산화활성에 대한 기질 특이성을 조사하였다. 즉, 사슬 길이가 다른 1급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 데칸올), 2급 알코올(2-프로판올, 2-펜탄올, 2-헥산올, 4-헵탄올, 2-옥탄올, 4-데칸올, 2,4-펜탄디올), 3급 알코올(tert-부탄올)에 대한 효소 활성을 측정하였다. 기질 농도는 1%(v/v)로 하고, 물에 용해되지 않는 것은 현탁하여 포화농도로 하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3에서 볼 수 있듯이, PVA-A 및 PVA-B는 PVA에 대한 산화활성을 100%로 한 경우의 상대 활성에서, 2급 알코올인 4-헵탄올에 대해 12 내지 21%로 약하게 작용하고, 마찬가지로 2급 알코올인 2-헥산올, 2-옥탄올에 대해 3 내지 8%로 근소하게 작용한 것 이외에는 다른 2급 알코올, 1급 알코올, 3급 알코올(tert-부탄올), 디올에는 거의 작용하지 않았다.

<실험 3-6 : N말단 아미노산 서열>

실험 2에서 얻은 PVA 분해효소의 정제 표본품, 즉 PVA-A 및 PVA-B를 각각 N말단 아미노산 서열 분석에 제공하고, N말단으로부터 20잔기까지의 아미노산 서열을 분석하였다. 또한, N말단 아미노산 서열 분석은 펩타이드 시퀀서(장치명 "PPSQ-31A", 시마즈제작소 제품)를 사용하여 실시하였다. 그 결과, PVA-A는 서열목록에서 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열, 즉, 알라닌-글루타민산-아스파라긴-트립토판-프롤린-메티오닌-페닐알라닌-글리신-리신-아스파라긴-티로신-글루타민산-아스파라긴-트레오닌-아르기닌-알라닌-트레오닌-세린-아스파르트산-트레오닌;의 아미노산 서열을 가지고 있으며, 또한, PVA-B는 서열목록에서 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열, 즉, 알라닌-글루타민산-아스파라긴-트립토판-프롤린-메티오닌-페닐알라닌-글리신-리신-아스파라긴-티로신-글루타민산-아스파라긴-세린-아르기닌-알라닌-트레오닌-알라닌-아스파르트산-트레오닌;의 아미노산 서열을 가지고 있음이 판명되었다. 또한, 양자는 N말단으로부터 13잔기까지는 동일한 아미노산 서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 공통적으로 가지고 있음이 판명되었다.

<실험 4 : 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)의 전체 게놈 분석>

본 발명의 PVA 분해효소를 코딩하는 DNA의 염기서열 및 PVA 분해효소의 아미노산 서열을 결정하기 위해, 동일 효소를 생산하는 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)의 전체 게놈 분석을 실시하였다.

<실험 4-1 : 게놈 DNA의 조제>

평판 한천 배지에서 계대배양한 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)를 하나의 백금이로 긁어내어, 실험 1에서 사용한 액체배지 3mL를 넣은 시험관에 식균한 후, 27℃에서 240rpm으로 5일간 진탕 배양하였다. 배양 종료 후, 배양액을 원심분리하여 회수한 균체로부터, 시판하는 전체 DNA 정제키트(상품명 "DNeasy Blood & Tissue Kit", QIAGEN사 판매)를 사용하여, 통상적인 방법에 의해 게놈 DNA를 조제하였다.

<실험 4-2 : 차세대 시퀀서를 이용한 전체 게놈 염기서열의 결정>

실험 4-1에서 얻은 게놈 DNA를, 시판하는 키트(상품명 "Nextera XT DNA Library Preparation Kit", 일루미나사 판매)를 사용하여 효소적으로 단편화하고, 단편화한 DNA의 말단을 평활화 처리하고 DNA 말단에 어댑터 서열을 부가함으로써 DNA 단편을 라이브러리화하며, 또한 PCR로 증폭한 후, 시판의 DNA 정제키트(상품명 "AMPure XP", 벡크만콜터사 판매)를 사용하여 정제하였다. 이어서, 라이브러리화한 DNA 단편의 염기서열을 차세대 시퀀서(장치명 "MiSeq", 일루미나사 제품)를 사용하여 결정하고, 결정한 각 DNA 단편의 염기서열(코딩 서열)을 컴퓨터 상에서 통합함으로써, 전체 게놈 DNA의 염기서열을 얻었다.

이어서, 유전자 영역 예측 소프트웨어("Glimmer")를 사용하여 전체 게놈 DNA의 염기서열을 분석하여, 단백질을 코딩하고 있는 것으로 추정되는 오픈 리딩 프레임(Open Reading Frame, ORF: 추정 유전자 영역)을 예측한 결과, 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)의 전체 게놈 DNA에는 ORF가 4,749개 있음이 판명되었다.

<실험 4-3 : PVA 분해효소를 코딩하는 ORF의 동정>

실험 4-2의 전체 게놈 분석에서 확인된 4,749개의 ORF를 대상으로 하고, 실험 3-2에서 결정한 2종의 PVA 분해효소 PVA-A 및 PVA-B의 N말단 아미노산 서열과 일치하는 아미노산 서열을 코딩하는 ORF를 검색한 결과, PVA-A의 N말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 아미노산 서열이 ORF3286에 코딩되어 있으며, 또한, PVA-B의 N말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 아미노산 서열이 ORF3283에 코딩되어 있음이 판명되었다. 이 결과로부터, ORF3286의 염기서열, 즉 서열목록에서 서열번호 4로 표시되는 염기서열이 PVA-A의 구조 유전자 DNA이며, PVA-A는 서열목록에서 서열번호 4로 표시되는 염기서열에 병기된 아미노산 서열로부터, 분비 신호 서열로 추정되는 N말단 부분의 26 아미노산 잔기가 제거된 아미노산 서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이 판명되었다. 또한, 마찬가지로, ORF3283의 염기서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 5로 표시되는 염기서열이 PVA-B의 구조 유전자 DNA이며, PVA-B는 서열목록에서 서열번호 5로 표시되는 염기서열에 병기된 아미노산 서열로부터, 분비 신호 서열로 추정되는 N말단 부분의 26 아미노산 잔기가 제거된 아미노산 서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이 판명되었다.

참고로, 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PVA-A의 분자량은 101,426으로 산출되고, 또한, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PVA-B의 분자량은 109,679로 산출되며, 이들 양자의 분자량은 모두, 상기 실험 3-1에서 SDS-PAGE에 의해 구한 분자량 100,000±20,000과 잘 일치하였다. 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 PVA-A의 아미노산 서열과, 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 PVA-B의 아미노산 서열과의 상동성(서열 동일성)을 시판의 유전정보처리 소프트웨어("GENETYX Ver.13", 주식회사 제네틱스 판매)를 사용하여 조사한 결과, 84%로 산출되었다. 또한, 마찬가지로, 각각의 효소를 코딩하는 서열목록에서 서열번호 4로 표시되는 염기서열과 서열번호 5로 표시되는 염기서열과의 상동성(서열 동일성)은 82%로 산출되었다.

<실험 5 : PVA 분해효소의 아미노산 서열에 근거한 상동성 탐색>

실험 4에서 얻은 PVA-A 및 PVA-B의 아미노산 서열, 즉 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열에 기초하여, 서열 데이터베이스 GenBank를 대상으로 BLAST 검색한 결과, 완전히 의외로, PVA-A 및 PVA-B의 아미노산 서열은 GenBank에 등록되어 있는 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열, 및 이것과의 촉매 반응이 전혀 다른 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열 양쪽 모두와 상동성을 나타냄이 판명되었으며, 또한 이들 PVA-A 및 PVA-B의 아미노산 서열은 PVA 탈수소효소와 상동성을 나타내는 N말단측 전반부와, 산화 PVA 가수분해효소와 상동성을 나타내는 C말단측 후반부가 링커로 예측되는 상동성이 비교적 낮은 아미노산 서열을 통해 연결되어 있는 것이 판명되었다.

상기 BLAST 검색에 있어서 본 발명의 PVA 분해효소와 상동성을 갖는 것이 판명되었된 공지의 효소군의 아미노산 서열 중, PVA-A 및 PVA-B의 N말단측 전반부의 아미노산 서열과 비교적 높은 상동성을 갖는 효소의 아미노산 서열로서, 슈도모나스종 VM15C주 유래의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열(GenBank 등록번호 BAA94193.1)과 스핑고픽시스종(Sphingopyxis sp.) 113P3주 유래의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열(GenBank 등록번호 BAD95543.3)의 2개의 아미노산 서열을 선택하고, 그 상동성을 유전정보처리 소프트웨어("GENETYX Ver.13", 주식회사 제네틱스 판매)를 사용하여 조사하였다.

그 결과, PVA-A의 아미노산 서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 N말단측 전반부(1 내지 442 잔기)는 슈도모나스종 VM15C주 유래 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열(144 내지 627 잔기)과 약 24%의 상동성(서열 동일성)을 나타내고, 또한 동일 N말단측 전반부(1 내지 429 잔기)는 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열(151 내지 627 잔기)과 약 26%의 상동성(서열 동일성)을 나타내었다.

한편, PVA-B의 아미노산 서열, 즉 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N말단측 전반부(1 내지 445 잔기)는 슈도모나스종 VM15C주 유래 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열(144 내지 630 잔기)과 약 23%의 상동성(서열 동일성)을 나타내고, 또한, 동일 N말단측 전반부(1 내지 429 잔기)는 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열(151 내지 627 잔기)과 약 25%의 상동성(서열 동일성)을 나타내었다.

PVA-A 및 PVA-B의 N말단측 전반부의 아미노산 서열과, 슈도모나스종 VM15C주 유래 및 스핑고픽시스종 113P3주 유래 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열의 총 4종의 아미노산 서열의 다중 시퀀스 정렬(Multiple sequence alignment)을 도 7에 나타내었다. PVA-A 및 PVA-B의 아미노산 서열의 N말단측 전반부가 각각 슈도모나스종 VM15C주 유래, 또는 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열과 낮으면서도 상동성을 보이는 것은 도 7에서도 시각적으로 파악할 수 있다. 이들 결과는 본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열의 N말단측 전반부가, PVA 분해효소가 갖는 2개의 활성 중, PVA를 산화하는 활성을 갖는 도메인을 형성하고 있음을 시사하는 것이다.

또한, N말단측 전반부의 아미노산 서열에 대해 조사한 것과 마찬가지로, 상기 BLAST 검색에서 본 발명의 PVA 분해효소와 상동성을 갖는 것이 판명된 공지의 효소군의 아미노산 서열 중에서, PVA-A 및 PVA-B의 C말단측 후반부의 아미노산 서열과 비교적 높은 상동성을 갖는 효소의 아미노산 서열로서, 슈도모나스종 VM15C주 유래의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열(GenBank 등록번호 BAA94192. 1)과 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열(GenBank 등록번호 BAD95542.3)의 2개의 아미노산 서열을 선택하고, 그 상동성을 마찬가지로 조사하였다.

그 결과, PVA-A의 아미노산 서열, 즉, 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 C말단측 후반부(625 내지 973 잔기)는 슈도모나스종 VM15C주 유래 산화 PVA 가수분해효소 아미노산 서열(34 내지 379 잔기)과 약 54%의 상동성(서열 동일성)을 나타내며, 또한 동일 C말단측 후반부(643 내지 973 잔기)는 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열(39 내지 363 잔기)과 약 55%의 상동성(서열 동일성)을 나타내었다.

한편, PVA-B의 아미노산 서열, 즉 서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 C말단측 후반부(586 내지 963 잔기)는 슈도모나스종 VM15C주 유래 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열(3 내지 379 잔기)과 약 50%의 상동성(서열 동일성)을 나타내고, 또한 동일 C말단측 후반부(619 내지 963 잔기)는 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열(24 내지 363 잔기)과 약 51%의 상동성(서열 동일성)을 나타내었다.

PVA-A와 PVA-B의 C말단측 후반부의 아미노산 서열과, 슈도모나스종 VM15C주 유래 및 스핑고픽시스종 113P3주 유래 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열의 총 4종의 아미노산 서열의 다중 시퀀스 정렬을 도 8에 나타내었다. PVA-A 및 PVA-B의 아미노산 서열의 C말단측 후반부가 슈도모나스종 VM15C주 유래, 또는 스핑고픽시스종 113P3주 유래의 산화 PVA 가수분해효소와 비교적 높은 상동성을 나타내는 것은 도 8에서도 시각적으로 파악할 수 있다. 이들 결과는 본 발명의 PVA 분해효소의 아미노산 서열의 C말단측 후반부가, PVA 분해효소가 갖는 2개의 활성 중, 산화 PVA 가수분해활성을 갖는 도메인을 형성하고 있음을 시사하는 것이다.

상기의 사실을 정리하여, PVA 분해효소로서의 PVA-A와 PVA-B의 구조를 도 9에 각각 모식적으로 나타내었다. 도 9에서 볼 수 있듯이, PVA-A의 아미노산 서열(서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열) 중, 442번째 아미노산 잔기까지의 N말단측 전반부는 공지의 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 PVA의 산화를 촉매하는 도메인을 형성하고 있으며, 아미노산 잔기 약 90잔기 길이의 링커 서열을 통해, 633번째 아미노산 잔기로부터 963번째 아미노산 잔기까지의 C말단측 후반부는 공지의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열과 상동성을 나타내는 산화 PVA의 가수분해를 촉매하는 도메인을 형성하고 있게 된다. PVA-B의 아미노산 서열(서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열)의 경우도 거의 마찬가지이다.

<실험 9 : PVA 분해효소를 코딩하는 DNA의 클로닝과 재조합 DNA의 조제>

ORF3286과 ORF3283이 각각 코딩하는 PVA 분해효소의 분비 신호 서열로 추정되는 부분을 결손시킨 DNA를 In-Fusion 반응시킴으로써, PVA-A 또는 PVA-B를 코딩하는 DNA의 클로닝을 실시하였다.

<실험 9-1 : PVA 분해효소를 코딩하는 DNA의 클로닝과 재조합 DNA의 조제>

우선, 플라스미드 벡터-pRSET A를 주형으로 하고, 서열목록에서 서열번호 6 및 7로 표시되는 염기서열을 각각 갖는 프라이머 1 및 프라이머 2를 사용하여 PCR을 수행하여, 직쇄상의 pRSET A를 제작하였다. 이어서, 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열목록에서 서열번호 8 및 9로 표시되는 염기서열을 각각 갖는 프라이머 3 및 프라이머 4를 이용하여 PCR을 수행하여, ORF3286이 코딩하는 아미노산 서열로부터 신호 서열이 제거된 아미노산 서열, 즉 PVA-A를 코딩하는 DNA를 증폭하였다. 또한, 마찬가지로, 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열목록에서 서열번호 8 및 10로 표시되는 염기서열을 각각 갖는 프라이머 3 및 프라이머 5를 이용하여 PCR을 수행함으로써, ORF3283이 코딩하는 아미노산 서열로부터 신호 서열이 제거된 아미노산 서열, 즉 PVA-B를 코딩하는 DNA를 증폭하였다.

상기에서 제작한 직쇄상 플라스미드와 PVA-A 유전자 또는 PVA-B 유전자를 시판의 In-Fusion 클로닝 키트(상품명 "In-Fusion HD Cloning Kit", 다카라바이오 주식회사 판매)를 사용하여 In-Fusion 반응시킴으로써, 각각 재조합 플라스미드를 제작하고, 각각 "pRSET A-PVA-A" 및 "pRSET A-PVA-B"라고 명명하였다. 상기의 방법으로 얻어진, PVA-A를 코딩하는 재조합 DNA인 "pRSET A-PVA-A"의 구조를 모식적으로 도 10에 나타내었다.

<실험 9-2 : 형질전환체의 조제와 PVA 분해효소 단백질의 발현>

실험 9-1에서 얻은 PVA-A를 코딩하는 재조합 DNA, "pRSET A-PVA-A"를 사용하고, 통상적인 방법에 따라 대장균 HST08을 형질전환하여 재조합 DNA를 대량 조제한 후, 대장균 BL21(DE3)을 형질전환하여 재조합 효소의 발현을 시도한 결과, 재조합 DNA의 발현에 따른 발현 단백질의 생성이 확인되었다.

<실험 10 : PVA 분해효소에 의한 PVA의 분해>

실험 2의 방법으로 얻은 PVA-A 정제 효소 표본품을 사용하고, PVA 농도를 바꾼 기질용액에 효소작용량을 바꿔 작용시킨 후, 용액의 점도저하를 지표로 하여 PVA의 분해를 시간 경과에 따라 조사하였다.

기질인 PVA(시약급 폴리비닐알코올, 중합도 2,000, 나카라이테스크 주식회사 판매), 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 및 동일 완충액에 용해된 PVA-A의 정제 효소액을 혼합하고, PVA의 최종 농도가 1%, 4% 또는 10%(w/v), PVA-A의 효소작용량이 PVA 1g당 PVA 산화활성으로서 1(또는 1.25), 5 또는 10단위가 되는 반응액(반응액량 각 1mL)을 조제하고, 플라스틱 튜브 내에서 35℃에서 1, 4 또는 20시간 동안 160rpm으로 진탕하면서 반응시켰다. 또한, 각 PVA 농도에서 효소액으로 바꾸어 50mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)을 추가한 것을 대조군(효소작용량 0단위)으로 하였다. 각 조건하에서 반응시킴으로써 얻은 반응액 0.6mL를 콘 플레이트형 점도계(상품명 "DV-II+Pro", 브룩필드사 제품)를 사용한 점도 측정에 제공하였다. 각 반응조건에서의 반응액의 점도를 표 4에 정리하였다.

표 4에서 볼 수 있듯이, 어느 PVA 농도에서도, PVA 1g당 PVA 산화활성으로서 1단위 이상의 PVA 분해효소를 작용시킨 경우, PVA 용액의 점도저하가 관찰되었다. 농도 1%(w/v)의 PVA 용액을 기질로 한 반응에서는, 반응 개시시의 용액의 점도가 2.7mPa·s이었던 것이 효소작용량 10단위로 20시간 작용시킨 반응액에서는, 점도는 1.2mPa·s까지 저하되었다(참고로, 동일 조건에서의 점도측정에 있어서, 정제수의 점도는 약 1.0mPa·s이다.). 또한, 농도 4%(w/v)의 PVA 용액을 기질로 한 반응에서는, 반응 개시시의 용액의 점도가 약 36mPa·s이었던 것이 효소작용량 5단위로 20시간 작용시킨 반응액에서는, 점도는 약 1/10의 3.7mPa·s까지 저하되었다. 또한, PVA 분해효소 PVA-A는 10%(w/v)로 비교적 높은 농도의 기질용액일지라도 잘 작용하고, PVA 1g당 5단위의 효소작용량으로 20시간 작용시키면, 반응액의 점도가 반응개시시의 2,430mPa·s로부터 약 1/10의 231mPa·s까지 저하되었다.

한편, PVA 농도 1%(w/v), 효소작용량 10단위로 20시간 작용시켜 얻은 반응액에 대해, PVA 분해물의 분자량을 통상적인 방법의 겔 여과 HPLC법으로 분석하였다. 겔 여과 HPLC는 컬럼에 "TSKgel α-4000"(토소 주식회사 제품)을 2개 연결한 것을 사용하고, 용리액에 50mM 인산 완충액(pH 7.0)을 사용하여, 컬럼 온도 40℃, 유속 0.5ml/min의 조건에서 수행하고, 검출은 시차굴절계 RID-20A(주식회사 시마즈제작소 제조)를 사용하여 실시하였다. 또한, PVA 및 PVA 분해물의 분자량은 분자량 측정용 풀루란 표준품(주식회사 하야시바라 판매)을 마찬가지로 겔 여과 HPLC에 제공하여 작성한 분자량의 검량선에 기초하여 각각 산출하였다. 도 11에 반응액의 겔 여과 HPLC 크로마토그램(도 11에서의 부호 b)을, 기질로서 사용한 PVA의 겔 여과 HPLC 크로마토그램(도 11에서의 부호 a)과 비교하면서 나타내었다.

도 11에서 볼 수 있듯이, 기질로서 사용한 PVA(부호 a)는 유지시간 30.6분에 피크 톱을 나타내고, 그 중량평균분자량(Mw)은 약 10.6×10⁴로 산출되었다. 한편, PVA 농도 1%(w/v), 효소작용량 10단위로 20시간 작용시켜 얻은 PVA 분해반응액(부호 b)에서는, 분해물이 유지시간 40.4분에 피크 톱을 나타내고, 그 중량평균분자량(Mw)은 약 4,400으로 산출되었다. 이 결과로부터, PVA 분해반응액에서 기질로 한 PVA는 PVA-A에 의해 저분자까지 분해되어 있음을 알 수 있었다.

상기와 같이, 본원의 PVA 분해효소는 단독으로 효율적으로 PVA를 분해할 수 있다. 이는 본 출원의 PVA 분해효소가 PVA 산화활성과 산화 PVA 가수분해활성을 모두 갖는 쌍두효소이어서 비로소 가능한 것이다.

<실험 11 : PVA 산화효소 단편과 산화 PVA 가수분해효소 단편의 검출>

실험 2의 PVA-A 및 PVA-B의 정제공정에서 CM-Toyopearl 650S 컬럼크로마토그래피에 의해 얻어진 분획(fraction)에는, PVA-A 및 PVA-B 이외에도 PVA 산화활성을 나타내는 획분이 확인되며, 동일 획분을 실험 3과 동일한 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 제공한 결과, PVA-A 및 PVA-B보다도 저분자인 분자량 약 50,000의 단백질 밴드가 검출되었다. 이 단백질에 대해 실험 3-6과 동일한 방법으로 N말단 아미노산 서열을 N말단으로부터 20잔기 조사한 결과, PVA-A의 N말단 아미노산 서열과 완전히 동일한 아미노산 서열, 즉, 알라닌-글루타민산-아스파라긴-트립토판-프롤린-메티오닌-페닐알라닌-글리신-리신-아스파라긴-티로신-글루타민산-아스파라긴-트레오닌-아르기닌-알라닌-트레오닌-세린-아스파르트산-트레오닌;이 확인되었다. 또한, 상세한 데이터는 생략하지만, PVA 산화활성을 나타내는 동일 획분에는, 산화 PVA를 가수분해하는 활성은 확인되지 않았다. 이 결과는 동일 획분에 존재하는 PVA 산화활성을 갖는 효소가, PVA-A에서 유래하는 PVA 산화활성만을 갖는 PVA 산화효소 단편임을 말해주고 있다.

또한, 마찬가지로, 실험 2의 PVA-A 및 PVA-B 정제공정에서 CM-Toyopearl 650S 컬럼크로마토그래피에 의해 얻어진 분획에는, PVA-A 및 PVA-B와는 다르며, 또한 산화 PVA 가수분해활성을 갖는 획분도 발견되었다. 동일 획분을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 제공한 결과, PVA-A 및 PVA-B보다도 저분자인 분자량 약 35,000의 단백질 밴드가 검출되었다. 이 단백질에 대해 실험 3-6과 동일한 방법으로 N말단 아미노산 서열을 조사한 결과, 5 아미노산 잔기가 판명되었으며, 발린-세린-글리신-글리신-트레오닌;이 확인되었다. 이 아미노산 서열은 PVA-A의 아미노산 서열, 즉 서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 623 잔기에서 627 잔기까지의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다. PVA-A 및 PVA-B의 아미노산 서열과 공지의 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열을 비교한 도 8, 및 PVA-A와 PVA-B의 구조를 모식적으로 표시한 도 9에 나타난 사실과 조합해보면, 이 PVA-A의 아미노산 서열의 623잔기에서 627잔기까지의 아미노산 서열을 N말단 아미노산 서열로서 갖는 분자량 약 35,000의 단백질은 PVA-A에서 유래하는 산화 PVA 가수분해활성만을 갖는 산화 PVA 가수분해효소 단편이라고 생각된다.

상기 결과는 슈도모나스종 VT1B주(NBRC110478)의 배양액에 있어서, PVA 산화활성과 산화 PVA 가수분해활성을 모두 겸비한 쌍두효소로서 생산된 PVA 분해효소 중, 적어도 PVA-A가 부분분해를 받아, PVA 산화효소 단편과 산화 PVA 가수분해효소 단편이 생성하고 있음을 말해주는 것이다. 이 때문에, 쌍두효소인 PVA-A 및 PVA-B를 프로테아제로 인위적으로 한정분해함으로써, PVA 산화효소와 산화 PVA 가수분해효소를 따로따로 조제하는 것도 가능하다고 생각된다.

이하, 실시예에 의하여 더욱 상세하게 본 발명에 대해 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

<PVA 분해효소의 조제>

PVA(시약급 폴리비닐알코올, 중합도 500, 나카라이테스크 주식회사 판매) 1g/L, 인산일칼륨 1g/L, 염화나트륨 0.5g/L, 질산암모늄 4g/L, 황산마그네슘 7수화물 0.5g/L, 효모추출물(효모추출물 D-3H, 일본제약주식회사 제품) 0.5g/L 및 물로 이루어진 액체배지를 pH 7.0으로 조정 후 오토 클레이브(121℃, 20분)로 멸균하고, 다시 여과멸균한 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 최종농도 10μg/L가 되도록 첨가하여 얻어지는 액체배지를 배양에 사용하였다.

슈도모나스종 VT1B주를 실험 1과 동일한 방법으로 종균배양하고, 상기 액체배지 50mL를 500mL 삼각 플라스크에 분주한 것에 종균배양액을 1%(w/v) 식균한 후, 27℃에서 240rpm으로 5일간 진탕배양하였다. 배양 후에 얻어진 배양상층액의 PVA 분해효소의 활성은 PVA 산화활성으로서 0.034 단위/mL이었다. 또한, 본 배양상층액을 2,4-펜탄디온에 작용시킨 결과, 가수분해산물인 아세톤이 검출되었으며, β-디케톤 가수분해활성, 즉, 산화 PVA 가수분해활성도 가지고 있음이 확인되었다. 본 배양상층액은 PVA 분해효소의 조(粗)효소로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 2

<PVA 분해효소제>

실시예 1의 방법으로 얻은 슈도모나스종 VT1B주의 배양액 약 1L를 원심분리(10,000rpm, 30분)하고, 얻어진 배양상층액 약 960mL(PVA 산화활성 약 32단위)에 25% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가, 용해하여, 냉실에서 하룻밤 방치하였다. 얻어진 염석물을 원심분리로 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여, 동일 완충액에 대해 투석하였다. 얻어진 투석액에 대해 실험 3-1의 방법으로 SDS-PAGE를 실시한 결과, 분자량 100,000±20,000을 나타내는 단백질 밴드만이 검출되었으며, 배양상층액 중에 확인된 협잡 단백질은 거의 제거되어 있었다. 이 정제수단에 의해, PVA 분해효소를 효율적으로 정제할 수 있음을 알 수 있었다. 얻어진 부분정제 PVA 분해효소에는 PVA 산화활성과 함께 β-디케톤 가수분해활성, 즉, 산화 PVA 가수분해활성이 확인되었기 때문에, PVA 분해효소제로서 유리하게 이용할 수 있다.

실시예 3

<PVA 분해효소제>

실험 1의 방법으로 얻은 슈도모나스종 VT1B주의 배양액 약 600mL를 원심분리(10,000rpm, 30분)하고, 얻어진 배양상층액 약 560mL(PVA 산화활성 19. 1 단위)에 60% 포화가 되도록 황산암모늄을 첨가, 용해한 후, 냉실에서 하룻밤 방치하였다. 얻어진 염석물을 원심분리로 회수하고, 5mM 인산 완충액(pH 7.0)에 용해하여, 동일 완충액에 대해 투석하였다. 얻어진 투석액을 동일 인산 완충액으로 평형화한 "Toyopearl AF-Blue HC-650M"(관능기로서 "Cibacron Blue F3GA"를 갖는 담체)을 충전한 컬럼을 이용한 액체 크로마토그래피에 제공하여, 염화칼륨 0M 내지 1M의 선형 구배(gradient)에 의해 용출하였다. PVA 분해효소는 염화칼륨 농도 약 0.2M로 용출하였기 때문에, 활성 획분을 회수하여 PVA 분해효소 부분 정제품으로 하였다. 본 품은 PVA 산화활성과 함께 β-디케톤 가수분해활성, 즉, 산화 PVA 가수분해활성도 갖는 것이 확인되었기 때문에, PVA 분해효소제로 유리하게 이용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 종래 미지(未知)이었던, PVA 산화활성과 산화 PVA 가수분해활성을 모두 겸비한, 완전히 새로운 쌍두효소로서의 PVA 분해효소를 대량으로 생산하고 제공하는 것이 가능하게 된다. 완전히 새로운 PVA 분해효소의 제공을 가능하게 하는 본 발명은, PVA의 분해, 제거 등이 요구되는 다양한 이용분야에 공헌하게 되어, 그 산업적 의의는 매우 크다.

도 2에 있어서,
M : 분자량 마커
A : PVA 분해효소 정제 표본품 PVA-A
B : PVA 분해효소 정제 표본품 PVA-B
도 4 및 도 6에 있어서,
● : 아세트산 완충액
■ : 인산 완충액
▲ : 글리신-NaOH 완충액
◆ : 염화칼륨-NaOH 완충액
도 7 및 도 8에 있어서,
아미노산 잔기는 한 문자 표기로 나타내고, 회색으로 음영표시한 아미노산 잔기는 비교한 4종 아미노산 서열 중 3종에서 일치하고 있는 아미노산 잔기를 의미하며, 검은색으로 음영표시한 아미노산 잔기는 4종 아미노산 서열의 전부에서 일치하고 있는 아미노산 잔기를 의미한다.
PVA-A : PVA-A의 아미노산 서열(서열목록에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열)
PVA-B : PVA-B의 아미노산 서열(서열목록에서 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열)
PVADH_VM15C : 슈도모나스종 VM15C주 유래 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열
PVADH_113P3 : 스핑고픽시스종 113P3주 유래 PVA 탈수소효소의 아미노산 서열
OPH_VM15C : 슈도모나스종 VM15C주 유래 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열
OPH_113P3 : 스핑고픽시스종 113P3주 유래 산화 PVA 가수분해효소의 아미노산 서열
도 9에 있어서, 숫자는 아미노산 잔기 번호를 나타내고, N은 N말단, C는 C말단을 의미한다.
도 10에 있어서.
f1 ori : f1 파지 복제 기점
Ampicillin : 암피실린 내성 유전자
pUC ori : pUC 복제 기점
PVA-A : PVA-A 유전자
도 11에 있어서,
a : 기질로 한 PVA의 겔 여과 HPLC 크로마토그램
b : PVA 분해물의 겔 여과 HPLC 크로마토그램

SEQUENCE LISTING <110> Hayashibara Co., Ltd. <120> Novel polyvinylalcohol-degrading enzyme and process for producing the same <130> WO100128901 <160> 12 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. <400> 1 Ala Glu Asn Trp Pro Met Phe Gly Lys Asn Tyr Glu Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 966 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. <400> 2 Ala Glu Asn Trp Pro Met Phe Gly Lys Asn Tyr Glu Asn Thr Arg Ala 1 5 10 15 Thr Ser Asp Thr Gln Ile Ser Thr Ala Asn Ile Ser Thr Leu Asn Val 20 25 30 Val Arg Arg Thr Thr Asp Gly Gly Ile Thr Gly Thr Pro Thr Val Val 35 40 45 Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Phe Ser Gly Tyr Val Lys Ala Val 50 55 60 Arg Val Ser Asp Gly Val Val Leu Trp Arg Val Arg Pro Gln Thr Thr 65 70 75 80 Met Leu Ser Pro Ser Pro Phe Val Thr Ala Asp Thr Val Tyr Val Ala 85 90 95 Gly Asn Asn Ser Tyr Val Tyr Ala Leu Asn Arg Ala Asn Gly Ala Val 100 105 110 Arg Trp Thr Thr Gln Ile Glu Thr Ser Pro Asn Ser Arg Ile Ser Ser 115 120 125 Ser Pro Ile Val Val Gly Asn Ile Leu Ile Ile Gly Thr Gly Ser Tyr 130 135 140 Gln Val Phe Leu Pro Ala Thr Pro Met Phe Arg Gly Arg Val Ala Phe 145 150 155 160 Leu Asn Ala Thr Thr Gly Ala Ile Leu Pro Tyr Ser Thr Asn Met Cys 165 170 175 Pro Ser Ala Ser Cys Gly Gly Gly Ile Ser Val Trp Ser Thr Ala Ala 180 185 190 Ile Asp Glu Ser Thr Arg Thr Gly Tyr Ile Gly Thr Gly Gln Ala Tyr 195 200 205 Arg Asp Pro Ala Gly Pro Tyr Ser Asp Ala Leu Val Ala Phe Asn Ile 210 215 220 Asp Thr Gly Ala Ile Arg Trp Ala Arg Gln Phe Leu Ala Asn Asp Val 225 230 235 240 Tyr Gln Leu Gly Gly Thr Leu Arg Tyr Asp Tyr Asp Val Gly Ala Ala 245 250 255 Pro Asn Leu Phe Val Ala Asn Gly Gln Arg Met Val Gly Val Gly Gly 260 265 270 Lys Asp Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Asn Arg Asp Thr Gly Ala Pro Ile 275 280 285 Trp Asn Thr Pro Val Gly Arg Gly Ser Ala Ile Gly Gly Val Met Gln 290 295 300 Ser Thr Ala Tyr Gly Asp Gly Arg Ile Tyr Val Thr Ser Asn Thr Ser 305 310 315 320 Thr Ile Gly Ser Gly Arg Asn Asp Pro Val Pro Ala Thr Ala Glu Ala 325 330 335 Ser Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Ala Pro Val Trp Ile Arg Gln Leu 340 345 350 Asp Ala Gly Gly Phe Gly Gly Val Ala Tyr Ala Asn Gly Leu Met Tyr 355 360 365 Ala Ser Thr Trp Asp Gly Arg Leu Arg Val Phe Asn Ala Ala Asn Gly 370 375 380 Asn Ile Val Arg Glu Val Gln Val Ser Pro Ser Arg Gly Ala Tyr Val 385 390 395 400 Pro Ala Pro Thr Asp Gly Phe Pro Asn Gly Ser Ala Gly Gly Pro Val 405 410 415 Val Tyr Gly Asn Arg Val Leu Met Gly Tyr Gly Trp Thr Trp Val Leu 420 425 430 Asn Ile Asn Gly Gly Leu Thr Thr Met Glu Ala Thr Val Gly Gly Gly 435 440 445 Ala Ser Gln Thr Val Thr Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Tyr Val Gln 450 455 460 Ser Gly Thr Pro Thr Thr Asn Tyr Ala Tyr Asp Val Asn Leu Leu Ala 465 470 475 480 Arg Leu Ala Asp Ala Glu Gly Leu Thr Arg Ala Ser Phe Leu Gln Phe 485 490 495 Pro Leu Thr Ala Val Pro Ala Gly Thr Ile Thr Ser Ala Arg Leu Arg 500 505 510 Leu Tyr Gly Arg His Asp Ala Pro Thr Gly Thr Gly Gln Ser Val Ser 515 520 525 Val Trp Pro Gly Thr Lys Thr Thr Thr Trp Ser Gly Pro Asn Val Thr 530 535 540 Tyr Asn Asn Ser Ser Thr Glu Thr Gly Val Asp Phe Tyr Ala Thr Ser 545 550 555 560 Ser Ile Ala Thr Ala Thr Val Gly Ile Thr Pro Gln Tyr Tyr Glu Trp 565 570 575 Asn Val Thr Asp Tyr Val Ala Ser Arg Arg Ser Leu Gly His Ala Thr 580 585 590 Phe Gly Val Ala Val Asn Ser Ala His Gln Tyr Arg Val Thr Leu Asn 595 600 605 Ser Ala Asp Asn Thr Ala Asn Arg Pro Glu Leu Val Val Thr Val Ser 610 615 620 Gly Gly Thr Gly Ser Gln Leu Pro Gly Ser Cys Pro Ser Gly Phe Thr 625 630 635 640 Ala Arg Ala Gly Val Asn Gln Gly Phe Met His Asn Gly Val Ala Arg 645 650 655 Gly Phe Val Leu Asn Val Pro Ala Asn Val Ser Thr Pro Arg Pro Val 660 665 670 Phe Val Ser Leu Thr Gly Ser Val Glu Ser Thr Asn Glu Asn Leu Gly 675 680 685 Ala Arg Gly Gly Ala Gly Ala Leu Asn Asn Asp Gly Phe Leu Val Ile 690 695 700 Gly Pro Val Arg Arg Cys Ala Gly Gln Asp Pro Asn Gly Ala Gly Thr 705 710 715 720 Ser Val Asn Gly Gly Thr Cys Asn Gln Ala Gly Thr Gly Gly Trp Asn 725 730 735 Trp Asn Pro Trp Asn Glu Gly Arg Val Phe Ala Ala Ala Gly Asp Pro 740 745 750 Trp Lys Thr Ala Glu Gly Pro Asp Ser Gln Phe Leu Glu Ala Val Val 755 760 765 Arg Cys Val Ala Ala Ser Tyr Pro Val Asp Ser Thr Arg Met Tyr Leu 770 775 780 Gly Gly Ile Ser Ser Gly Ala Thr Met Thr His Arg Ala Leu Leu Phe 785 790 795 800 Asn Ser Asp Phe Trp Ala Gly Gly Leu Pro Leu Ser Gly Glu Trp Tyr 805 810 815 Val Ser Gln Asp Asn Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Ala Asp Glu Phe Ala 820 825 830 Ala Arg Arg Gln Ala Val Ile Asn Asn Pro Thr Lys Ile Phe Gln Gly 835 840 845 Arg Val Gly Pro Leu Pro Leu Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Ile Val 850 855 860 Ile Ser Met Trp Gly Gly Ala Asn Asp Ile Trp Tyr Cys Gly Ser Thr 865 870 875 880 Leu Cys Ala Asp Tyr Arg Pro Ser Thr Gln Ala Ala Ser Asn Tyr Phe 885 890 895 Ser Ala Leu Pro Asn Val Val His Val Ala Cys Ser Ser Ser His Gly 900 905 910 His Gln Trp Pro Thr Gln Asn Arg Ala Ala Phe Asn Thr Trp Ala Ala 915 920 925 Thr Thr Leu Ala Ser His Pro Lys Gly Thr Pro Ala Ser Ser Phe Val 930 935 940 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Ser Cys Arg Val Gly Arg Tyr Thr 945 950 955 960 Asp His Tyr Ser Gly Thr 965 <210> 3 <211> 1036 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. <400> 3 Ala Glu Asn Trp Pro Met Phe Gly Lys Asn Tyr Glu Asn Ser Arg Ala 1 5 10 15 Thr Ala Asp Thr Gln Leu Ser Thr Ser Asn Ile Ser Ser Leu Asn Val 20 25 30 Val Arg Arg Thr Ala Asp Gly Gly Ile Thr Gly Thr Pro Thr Val Val 35 40 45 Asp Gly Val Ala Tyr Tyr Ser Asp Phe Ser Gly Tyr Val Lys Ala Val 50 55 60 Arg Val Asn Asp Gly Ala Val Leu Trp Arg Val Arg Pro Gln Thr Thr 65 70 75 80 Met Leu Ser Pro Ser Pro Phe Val Thr Asp Asp Thr Val Tyr Val Ala 85 90 95 Gly Asn Asn Ser Tyr Val Tyr Ala Leu Asn Arg Leu Asp Gly Ala Val 100 105 110 Arg Trp Thr Thr Gln Ile Glu Thr Ser Pro Asn Ser Arg Ile Ser Ser 115 120 125 Ser Pro Ile Val Val Asp Asn Ile Leu Met Ile Gly Thr Gly Ser Tyr 130 135 140 Gln Val Phe Ile Pro Ala Thr Pro Met Phe Arg Gly Arg Val Val Phe 145 150 155 160 Leu Asn Ala Thr Thr Gly Ala Ile Leu Pro Tyr Ser Thr Asn Met Cys 165 170 175 Pro Glu Gly Leu Cys Gly Gly Gly Ile Ser Val Trp Ser Thr Ala Ala 180 185 190 Val Asp Val Ser Thr Arg Thr Gly Tyr Ile Gly Thr Gly Gln Ala Tyr 195 200 205 Arg Asp Pro Ala Gly Pro Tyr Ser Asp Ser Leu Val Ala Phe Asp Ile 210 215 220 Asp Thr Gly Ala Ile Arg Trp Ser Gln Gln Phe Leu Ala Asn Asp Val 225 230 235 240 Tyr Gln Leu Gly Gly Val Leu Arg Tyr Asp Tyr Asp Val Gly Ala Ala 245 250 255 Pro Asn Leu Phe Val Ala Asp Glu Arg Arg Met Val Gly Val Gly Gly 260 265 270 Lys Asp Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Asp Arg Asp Thr Gly Ala Pro Ile 275 280 285 Trp Thr Thr Pro Val Gly Arg Gly Ser Pro Ile Gly Gly Val Met Gln 290 295 300 Ser Thr Ala Tyr Gly Asp Gly Arg Ile Tyr Val Thr Ser Asn Thr Ser 305 310 315 320 Thr Ile Gly Gly Gly Arg Asn Asp Pro Val Pro Ala Thr Ala Glu Ala 325 330 335 Leu Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Thr Pro Val Trp Ile Arg Gln Leu 340 345 350 Asp Ala Gly Gly Phe Gly Gly Val Ala Tyr Ala Asn Gly Leu Met Tyr 355 360 365 Ala Ser Val Trp Asp Gly Arg Met Arg Val Phe Asn Ala Ala Asn Gly 370 375 380 Asn Ile Val Lys Glu Val Gln Val Ser Pro Ser Arg Gly Val Tyr Val 385 390 395 400 Ala Ala Pro Thr Asp Gly Phe Pro Asn Gly Ser Ala Gly Gly Pro Ile 405 410 415 Val Tyr Gly Asn Arg Val Leu Met Gly Tyr Gly Trp Thr Trp Val Leu 420 425 430 Asn Ile Ser Gly Gly Leu Ala Thr Met Glu Leu Val Ser Gly Gly Gly 435 440 445 Glu Thr Gln Thr Val Thr Leu Ala Ser Asn Gln Asp Thr Tyr Val Gln 450 455 460 Ser Gly Thr Pro Thr Thr Ser Tyr Asn Ala Asn Glu Phe Leu Leu Ala 465 470 475 480 Arg Leu Ala Asp Ala Glu Gly Leu Thr Arg Ala Ser Phe Leu Gln Phe 485 490 495 Pro Leu Thr Ala Ile Pro Ala Gly Thr Ile Thr Ser Ala Arg Leu Arg 500 505 510 Leu Tyr Gly Arg His Asp Ala Pro Thr Gly Thr Gly Gln Pro Val Ser 515 520 525 Val Trp Pro Gly Thr Phe Thr Thr Pro Trp Asn Gly Ala Asp Val Ile 530 535 540 Tyr Asn Asn Ser Asp Leu Val Thr Gly Val Asn Phe Tyr Leu Thr Ser 545 550 555 560 Pro Ile Ala Asn Ala Leu Ile Gly Ile Thr Pro Gln Tyr Tyr Glu Trp 565 570 575 Asp Val Thr Gly Tyr Val Asp Ser Arg Arg Ala Leu Gly His Ala Thr 580 585 590 Phe Gly Val Ala Val Asp Tyr Gly His Leu Tyr Arg Val Thr Phe Asn 595 600 605 Ser Ala Asp Asn Ala Ala Asn Arg Pro Glu Leu Val Val Ala Val Ser 610 615 620 Thr Gly Gly Thr Ser Glu Pro Asp Pro Glu Leu Pro Pro Gly Ser Met 625 630 635 640 Glu Gly Ser Cys Pro Ala Gly Phe Thr Pro Arg Ala Gly Val Asn Gln 645 650 655 Gly Phe Ile His Asn Gly Val Ala Arg Gly Phe Val Leu Asn Val Pro 660 665 670 Ala Asn Val Ser Thr Pro Arg Pro Met Phe Val Ser Leu Thr Gly Ser 675 680 685 Val Glu Ser Thr Asn Glu Asn Leu Gly Pro Arg Gly Gly Ala Gly Ala 690 695 700 Leu Thr Asn Asp Gly Phe Leu Val Ile Gly Pro Val Arg Arg Cys Ala 705 710 715 720 Gly Gln Asp Pro Asn Gly Ser Gly Thr Ser Val Gly Gly Gly Thr Cys 725 730 735 Asn Gln Pro Gly Thr Gly Gly Trp Asn Trp Asn Pro Trp Asn Glu Gly 740 745 750 Arg Ala Phe Gly Ala Ala Gly Asp Gln Trp Lys Thr Ala Glu Gly Pro 755 760 765 Asp Ser Glu Phe Leu Glu Ser Val Ala Arg Cys Val Ala Lys Arg Phe 770 775 780 Pro Val Asp Ser Lys Arg Met Tyr Leu Gly Gly Ile Ser Ser Gly Gly 785 790 795 800 Thr Leu Thr Asn Arg Ala Leu Leu Phe Asn Ser Asp Phe Trp Ala Gly 805 810 815 Gly Leu Pro Ile Ser Gly Glu Trp Tyr Val Thr Arg Asp Asp Gly Thr 820 825 830 Ala Tyr Pro Gly Pro Asp Glu Phe Ala Ala Arg Arg Gln Ala Val Ile 835 840 845 Asp Asp Pro Thr Lys Ile Phe Gln Gly Arg Val Gly Pro Leu Pro Leu 850 855 860 Arg Ser Thr Leu Asp Pro Met Ile Val Ile Thr Val Trp Gly Gly Thr 865 870 875 880 Asn Asp Val Trp Ser Cys Asp Gly Val Thr Leu Cys Ala Asp Tyr Arg 885 890 895 Pro Ser Thr Gln Val Ala Ser Asn Tyr Phe Ser Ala Gln Pro Asn Val 900 905 910 Val His Val Ala Cys Ser Ser Ser His Gly His Gln Trp Pro Thr Ile 915 920 925 Asn Arg Ala Ala Phe Asn Thr Trp Ala Ala Thr Thr Leu Ala Ser His 930 935 940 Pro Lys Gly Thr Pro Ala Ser Ala Phe Val Leu Pro Pro Pro Pro Ala 945 950 955 960 Gly Tyr Thr Cys Arg Ile Gly Pro Tyr Ile Asp His Tyr Glu Arg Ala 965 970 975 Cys Ser Val Asp Gly Asp Gly Asp Ile Asp Arg Asn Asp Ile Ala Val 980 985 990 Ile Thr Ala Ala Arg Asn Gln Pro Ala Ser Gly Pro Thr Asp Leu Arg 995 1000 1005 Asp Val Asp Arg Ser Gly Val Ile Asp Val Asn Asp Ala Arg Ala Cys 1010 1015 1020 Thr Leu Arg Cys Asp Arg Pro Asn Cys Ala Val Gln 1025 1030 1035 <210> 4 <211> 2976 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. <400> 4 atg aaa cag ttg agg aca ctg gca tgt att gcc gcg gtg ggt ctc agt 48 Met Lys Gln Leu Arg Thr Leu Ala Cys Ile Ala Ala Val Gly Leu Ser 1 5 10 15 gtg tcc ggc atg atg agt ccg gcc acg gct gct gag aac tgg ccg atg 96 Val Ser Gly Met Met Ser Pro Ala Thr Ala Ala Glu Asn Trp Pro Met 20 25 30 ttc ggc aag aat tat gag aac aca cgc gcc acc agc gac aca cag atc 144 Phe Gly Lys Asn Tyr Glu Asn Thr Arg Ala Thr Ser Asp Thr Gln Ile 35 40 45 tcg acc gcc aac att tcg acg ctc aac gtc gta cgt cgt acg acc gat 192 Ser Thr Ala Asn Ile Ser Thr Leu Asn Val Val Arg Arg Thr Thr Asp 50 55 60 ggc ggc atc act ggc aca ccg acc gtg gtc gac ggt gtg gct tac tac 240 Gly Gly Ile Thr Gly Thr Pro Thr Val Val Asp Gly Val Ala Tyr Tyr 65 70 75 80 tct gac ttc tcc ggt tat gtg aag gcg gtg cgc gtc agc gat ggc gtc 288 Ser Asp Phe Ser Gly Tyr Val Lys Ala Val Arg Val Ser Asp Gly Val 85 90 95 gtg ttg tgg cgc gtg cgt ccg cag acg acg atg ctc tcg cca tcg cca 336 Val Leu Trp Arg Val Arg Pro Gln Thr Thr Met Leu Ser Pro Ser Pro 100 105 110 ttc gtg acg gcc gac acg gtc tat gtc gcc ggc aac aac tcg tac gtg 384 Phe Val Thr Ala Asp Thr Val Tyr Val Ala Gly Asn Asn Ser Tyr Val 115 120 125 tat gcg ctc aac cgc gcg aac ggt gca gtt cgc tgg acg acg cag atc 432 Tyr Ala Leu Asn Arg Ala Asn Gly Ala Val Arg Trp Thr Thr Gln Ile 130 135 140 gag acg tcg ccg aac agc cgt atc tcc tcc tcg ccg atc gtg gtc ggc 480 Glu Thr Ser Pro Asn Ser Arg Ile Ser Ser Ser Pro Ile Val Val Gly 145 150 155 160 aac atc ctg atc atc ggt acg ggt tcg tat cag gtg ttc ctt ccc gca 528 Asn Ile Leu Ile Ile Gly Thr Gly Ser Tyr Gln Val Phe Leu Pro Ala 165 170 175 acg ccg atg ttc cgc ggt cgg gtc gca ttc ctg aat gcg acg acg ggc 576 Thr Pro Met Phe Arg Gly Arg Val Ala Phe Leu Asn Ala Thr Thr Gly 180 185 190 gcg atc ctg ccg tac agc acc aac atg tgt ccg agc gct tcc tgc ggc 624 Ala Ile Leu Pro Tyr Ser Thr Asn Met Cys Pro Ser Ala Ser Cys Gly 195 200 205 ggc ggc atc tcg gtg tgg tcg acc gcg gcc att gac gag tcc acg cgc 672 Gly Gly Ile Ser Val Trp Ser Thr Ala Ala Ile Asp 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Ala Ala Arg Arg Gln Ala Val Ile Asp Asp Pro Thr Lys Ile 865 870 875 880 ttc cag gga cgg gtc ggt ccg ctg ccg ctg cgc tca acg ctg gat ccg 2688 Phe Gln Gly Arg Val Gly Pro Leu Pro Leu Arg Ser Thr Leu Asp Pro 885 890 895 atg atc gtg atc acg gtc tgg ggt ggc acg aac gat gtg tgg agc tgc 2736 Met Ile Val Ile Thr Val Trp Gly Gly Thr Asn Asp Val Trp Ser Cys 900 905 910 gac ggc gtc acc ctg tgt gcc gac tac aga cca agc acg cag gta gcg 2784 Asp Gly Val Thr Leu Cys Ala Asp Tyr Arg Pro Ser Thr Gln Val Ala 915 920 925 tcc aac tac ttc agt gcg cag ccc aat gtc gtc cac gtg gcc tgc tcg 2832 Ser Asn Tyr Phe Ser Ala Gln Pro Asn Val Val His Val Ala Cys Ser 930 935 940 tcg agt cac ggt cat caa tgg ccg acc ata aac cgc gct gca ttc aat 2880 Ser Ser His Gly His Gln Trp Pro Thr Ile Asn Arg Ala Ala Phe Asn 945 950 955 960 acg tgg gct gcc acg acg ctg gcc tcg cat ccg aag gga acg ccg gct 2928 Thr Trp Ala Ala Thr Thr Leu Ala Ser His Pro Lys Gly Thr Pro Ala 965 970 975 tct gca ttc gtg ctg ccg ccg ccg ccc gcg ggt tac acc tgc cgc atc 2976 Ser Ala Phe Val Leu Pro Pro Pro Pro Ala Gly Tyr Thr Cys Arg Ile 980 985 990 ggt ccc tac atc gat cac tac gag cgc gcc tgc tcg gtc gat ggg gac 3024 Gly Pro Tyr Ile Asp His Tyr Glu Arg Ala Cys Ser Val Asp Gly Asp 995 1000 1005 ggt gat atc gac cgg aat gac atc gcg gtg atc act gcc gcc cgc aac 3072 Gly Asp Ile Asp Arg Asn Asp Ile Ala Val Ile Thr Ala Ala Arg Asn 1010 1015 1020 cag ccg gcg tca ggc ccc acg gat ctg cgc gac gta gat cgc agt ggc 3120 Gln Pro Ala Ser Gly Pro Thr Asp Leu Arg Asp Val Asp Arg Ser Gly 1025 1030 1035 1040 gtg atc gat gtc aac gat gcg cgt gcc tgc acg ctg cgc tgt gac cgt 3168 Val Ile Asp Val Asn Asp Ala Arg Ala Cys Thr Leu Arg Cys Asp Arg 1045 1050 1055 ccc aat tgc gca gtc cag 3186 Pro Asn Cys Ala Val Gln 1060 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 CATATGTATA TCTCCTTCTT AAAG 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 CATGGTATGG CTAGCATGAC TGG 23 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 8 TAAGAAGGAG ATATACATAT GGCCGAGAAC TGGCCAATGT TC 42 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 9 ATGCTAGCCA TACCCATGTT ACTGGACTGC GCAATTGGG 39 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 10 CATGCTAGCC ATACCATGTC ACGTTCCGCT GTAGTGATCC G 41 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. <400> 11 Ala Glu Asn Trp Pro Met Phe Gly Lys Asn Tyr Glu Asn Thr Arg Ala 1 5 10 15 Thr Ser Asp Thr 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. <400> 12 Ala Glu Asn Trp Pro Met Phe Gly Lys Asn Tyr Glu Asn Ser Arg Ala 1 5 10 15 Thr Ala Asp Thr 20

Claims (13)

1. 하기 (1) 내지 (7)의 특징을 갖는 폴리비닐알코올 분해효소이고, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열이나, 또는, 이들 아미노산 서열에 있어서, 폴리비닐알코올 분해효소의 활성을 유지하는 범위에서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 서열이며, 또한, 서열목록에서 서열번호 2 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열과의 상동성(서열 동일성)이 90% 이상인 아미노산 서열을 갖는 폴리비닐알코올 분해효소:
   (1) 폴리비닐알코올을 산화하고 과산화수소를 생성하는 활성을 갖는다;
   (2) β-디케톤을 가수분해하는 활성을 갖는다;
   (3) SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에서 분자량 100,000 ± 20,000을 나타낸다;
   (4) 최적 온도
   pH 7.0, 60분간 반응 조건하에서, 35 내지 40℃;
   (5) 최적 pH
   27℃, 60분간 반응 조건하에서, pH 6.5 내지 8.0;
   (6) 온도 안정성
   pH 7.0, 60분간 유지 조건하에서, 45℃까지 안정 ; 및
   (7) pH 안정성
   4℃, 24시간 유지 조건하에서, pH 4.5 내지 10.5에서 안정.
2. 제1항에 있어서,
   추가로, 하기 (8)의 특징을 갖는 폴리비닐알코올 분해효소 :
   (8) N말단 아미노산 서열로서, 서열목록에서 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   슈도모나스(Pseudomonas)속 미생물 유래의 효소인 폴리비닐알코올 분해효소.
4. 제1항 또는 제2항의 폴리비닐알코올 분해효소를 코딩하는 DNA.
5. 제4항에 있어서,
   서열목록에서 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열이나, 혹은, 그들 염기서열에 있어서, 코딩하는 폴리비닐알코올 분해효소의 활성을 유지하는 범위에서 1개 이상의 염기가 결실, 부가 또는 치환된 염기서열이며, 또한, 서열목록에서 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열과의 상동성(서열 동일성)이 90% 이상인 염기서열, 또는 그들에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA.
6. 제4항에 있어서,
   유전자 코드의 축중에 기초하여, 코딩하는 아미노산 서열을 변경하지 않고, 서열목록에서 서열번호 4 또는 5로 표시되는 염기서열에서의 염기 1개 이상을 다른 염기로 치환한 DNA.
7. 제4항의 DNA와 자율복제가능한 벡터를 포함하여 이루어진 복제가능한 재조합 DNA.
8. 제7항의 재조합 DNA를 적절한 숙주에 도입하여 이루어진 형질전환체.
9. 제1항 또는 제2항의 폴리비닐알코올 분해효소의 생산능을 갖는 미생물을 영양배지에서 배양하는 공정, 및 얻어지는 배양물로부터, 제1항 또는 제2항의 폴리비닐알코올 분해효소를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리비닐알코올 분해효소의 제조방법.
10. 제9항에 있어서,
    미생물이 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물인 폴리비닐알코올 분해효소의 제조방법.
11. 제8항의 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 재조합형 폴리비닐알코올 분해효소를 채취하는 것을 특징으로 하는 재조합형 폴리비닐알코올 분해효소의 제조방법.
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