FR2779738A1 - Gene codant pour la beta agarase agab de cytophaga drobachiensis souche dsij et son utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des agars - Google Patents

Abstract

L'invention concerne le gène agaB codant pour une -agarase et ayant la SEQ ID Ndegre 1, ledit gène codant pour une -agarase de Cytophaga drobachiensis déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 8 mai 1998 sous le numéro DSM 12170, et la protéine AgaB de C. drobachiensis DSM 12170 ayant la SEQ ID Ndegre 2. Application : biodégradation des agars.

Description

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La présente invention concerne un nouveau gène codant pour une 53- agarase

et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars.

Elle concerne également la souche Cytophaga drobachiensis à partir de

laquelle ce gène a été isolé.

Les galactanes sulfatés des Rhodophycées, tels que les agars et les carraghénanes, représentent les polysaccharides majeurs des Rhodophycées et sont très largement utilisés en tant qu'agents gélifiants ou épaississants dans diverses branches d'activité, notamment l'agroalimentaire. Environ 6000 tonnes d'agars et 22 000 tonnes dc carraghénanes sont extraits annuellement des algues rouges marines à cet effet. Les agars sont produits industriellement à partir des algues rouges des genres Gelidium et Gracilaria. Les carraghénanes sont quant à eux largement extraits

des genres Chondrus, Gigartina et Euchema.

Les agaro-colloides sont des complexes polysaccharidiques constitués principalement des agars et des agaroïdes. Chaque agaro-colloïde présente une teneur différente en chacun des composés ci-dessus de sorte que sa force de gel est différente. Le gel d'agar comprend une matrice de chaînes polymères à double hélice

maintenues par des liaisons hydrogène.

Il existe deux types d'enzyme capables de dégrader les agars: les ctagarases et les 13-agarases. Les 3-agarases agissent sur la liaison 3-1, 4 et les a-agarases sur la

liaison a-1,3.

Des microorganismes produisant des enzymes capables d'hydrolyser les agars ont déjà été isolés. Cette capacité à digérer l'agar a été attribuée aux genres Pseudomonas, (MORRICE et al., Eur. J. Biochem. 137, 149-154, (1983)), Streptomyces (HODGSON et CHATER, J. Gcn. Microbiol. 124, 339-348, (1981)), Cytophaga (VAN DER MEULEN et HARDER, J. Microbiol. 41, 431-447, (1975)) et Vibrio (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 1549-1554, (1993)). Plusieurs gènes de P3-agarase ont déjà été isolés. Ainsi, BELAS et al. ont isolé le gène d'une

agarase chez Pseudomonas atlantica (Appl. Environ. Microbiol. 54, 30-37, (1988)).

BUITINER et al. ont isolé une agarase chez Streptomyces coelicolor et séquencé le gène correspondant (Mol. Gen. Genet. 209, 101-109, (1987)). SUGANO et al. ont cloné et séquencé deux gènes différents d'agarase chez Vibrio sp. JT0107, qu'ils ont appelé agaA (Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750-3756, (1993)) et agaB (Biochimica

et Biophysica Acta 1 218, 105-108, (1994)).

La demanderesse a maintenant isolé une souche bactérienne à partir de

l'algue rouge Delesseria sanguinea, laquelle présente une activité agarase.

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Cette souche a été déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 8 mai 1998 sous le numéro

DSM 12170. Elle constitue le premier objet de la présente invention.

La recherche taxonomique de cette souche, réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier, montre qu'elle appartient au genre Cytophaga (bactéries du groupe CFB pour "Cytophaga/FlexibacterlBacteroïdes"). En effet, cette souche se développe en s'étalant, présente des colonies jaunes incrustées dans l'agar qui est ensuite liquéfié. La bactérie est à Gram-négatif, a une forme de bâtonnet non mobile de 0,3-0,4x3,0-8,0.mxlm. Lorsqu'une goutte de culture de la souche est inoculée au centre d'une boîte d'agar, la colonie se développe avec accroissement concentrique du bord et cette mobilité n'est pas inhibée par du diéthyléther qui est un inhibiteur de l'appareil flagellaire. La souche est aérobie et possède un métabolisme oxydatif. Elle produit la flexirubine qui est un pigment rarement trouvé dans les

isolats de Cytophaga marines mais qui est présent chez les Cytophaga non marines.

Elle est capable d'assimiler diverses sources carbonées et de dégrader plusieurs types

de macromolécules, tels que l'agar, le carraghénane, l'amidon et la gélatine.

La Demanderesse a recherché à quelle espèce appartenait cette souche en réalisant une étude approfondie. Ainsi, elle a déterminé les valeurs en pourcentage de la composition en guanine et cytosine de l'ADN de la souche de l'invention et elle a trouvé qu'elles étaient comprises entre 43 et 49%. Elle a également réalisé le séquençage de son ADN 16S selon le procédé bien connu de l'homme du métier pour connaîtrc la position taxonomique d'une souche (FOX et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 22, 44-57, (1977)). Le résultat du séquençage montre que la souche de l'invention est très similaire à Cytophaga uliginosa. (Les similitudes de séquence entre l'ADN 16S de C uliginosa et celui de la souche de l'invention est de 99%.) Toutefois, l'hybridation ADN/ADN entre les deux souches (45%) montre qu'il s'agit de dcux espèces différentes. De plus, la souche de l'invention présente des caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques similaires à celles de la souche

Pseudomonas drobachiensis nov. comb. isolée par HUMM (Duke Univ. Mar. Stn.

Bull. 3, 43-75, (1946)). Elle a donc été appelée Cytophaga drobachiensis.

La Demanderesse a également isolé un gène à activité 3-agarase à partir de

Cytophaga drobachiensis DSM 12170.

Ainsi, la présente invention a également pour objet le nouveau gène agaB

codant pour une 03-agarase qui a la séquence d'ADN SEQ ID N 1.

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Ce gène code pour une 3-agarase produite par C drobachiensis

DSM 12170, à savoir la 0-agarase dénommée protéine AgaB.

La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADN ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour la protéine AgaB ou pour l'un quelconque de ses fragments peptidiques

tels que définis ci-après.

L'invention concerne donc: - Toutes les séquences d'acides nucléiques codant pour la protéine AgaB dans son entier, ou pour un ou plusieurs de ses fragments peptidiques. Ces séquences sont représentées de préférence par: a) la séquence d'ADN SEQ ID N 1 codant pour la protéine AgaB et ses fragments codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine; b) les séquences d'ADN hybridant en conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaB ou les fragments de celle-ci; et

d) les séquences d'ARNm correspondantes.

Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. ("Molecular Cloning: a

Laboratory Manual" Ed. Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989).

Par exemple, la synthèse des séquences d'ADN selon l'invention peut être effectuée par amplification des gènes de Cytophaga drobachiensis à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144, (1989)) en utilisant des oligonucléotides

synthétiques comme amorces, définis à partir de la séquence d'ADN SEQ ID N 1.

Le fragment d'acides nucléiques ainsi amplifié peut ensuite être cloné dans un vecteur d'expression selon les techniques décrites dans MANIATIS et al.

(Molecular Cloning. A laboratory manual, NEW YORK (1982)).

L'invention a également pour objet les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'acides nucléiques de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que

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notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du microorganisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. Les microorganismes procaryotes préférés aux fins de l'invention sont

Escherichia coli et Bacillus subtilis.

A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules de Aspergillus figer, Trichoderma

viridae ou Pichia pastoris.

La présente invention a également pour objet la nouvelle protéine AgaB de

C drobachiensis qui comprend la SEQ ID N 2.

La nouvelle protéine AgaB est composée de 353 acides aminés. Après élimination du peptide signal, cette protéine a une masse moléculaire calculée de

40,680 kDa.

La présente invention concerne également les fragments peptidiques de la protéine AgaB résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité 03-agarase. Les protéines et fragments peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par les techniques de génie génétique qui comprend les étapes de: - culture de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes transformées par un vecteur d'expression possédant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et - récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit lesdites cellules. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Pour plus de détails les concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après: Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York

Academy of Sciences, volume 646,1991.

Les fragments peptidiques peuvent également être préparés par synthèse

peptidique chimique classique bien connue de l'homme du métier.

L'invention va maintenant être décrite en détail à l'aide de l'exposé

expérimental ci-après.

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Une grande partie des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme du métier, est exposée en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al.

(supra) ou dans l'ouvrage de MANIATIS et al. (supra).

La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 5 sur

lesquelles: - la figure 1 représente les cartes physiques des clones génomiques de Cytophaga drobachiensis présentant une activité agarase; la figure 2 donne les séquences nucléotidiques et d'acides aminés déduites du gène provenant de C. drobachiensis; - la figure 3 montre l'alignement de la protéine AgaA (ligne supérieure) selon la 1"e demande divisionnaire et de la protéine AgaB (ligne inférieure) selon la présente demande provenant de la souche C. drobachiensis; - la figure 4 est une représentation de l'analyse des amas hydrophobes (analyse HCA) connue sous la dénomination anglaise "Hydrophobic Cluster Analysis" des gènes d'agarase et d'autres gènes de glycoside hydrolases; - les figures 5A et 5B représentent les profils d'élution des produits d'hydrolyse du néoagarododécaose par l'agarase provenant de la souche

C drobachiensis selon l'invention.

Exemple 1: Isolement, culture de la souche Cvtophaga drobachiensis DSM 12170 et extraction de son ADN La souche DSM 12170 a été isolée à partir de frondes vivantes de l'algue rouge Delesseria sanguinea. L'isolement a été réalisé sur une boîte de Pétri sur le milieu de Zobell (ZOBELL, J. Mar. Res. 4, 41-75, (1941)) contenant 2% de i-carraghénane. La culture de la souche a été réalisée à 25 C sur le milieu de Zobell (ZOBELL,

J. Mar. Res. 4, 41-75, (1941)).

Le protocole employé pour extraire l'ADN de la souche Cytophaga

drobachiensis DSM 12170 est dérivé de celui de Marmur (MARMUR, J. Mol. Biol.

3, 208-218, (1961)) et est décrit en détail ci-après.

Après culture, les bactéries ont été centrifugées à 3000 g durant 15 min, puis lavées dans de l'eau de mer stérile. Les cellules ont subi une dernière centrifugation,

identique à la précédente, et ont été traitées immédiatement ou congelées à -20 C.

à 10 g de cellules selon la concentration cellulaire (poids humide après centrifugation) ont été repris dans 25 ml de tampon Sph (Tris-HCI, pH 8, 50 mM; saccharose 25%), puis par 5 ml de tampon TES (Tris-HCl, pH 8, 50 mM; acide éthylènediaminetétraacétique 5 mM; chlorure de sodium 50 mM), et 50 mg de

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lysosyme ont été ajoutés. Des sphéroplastes sont apparus apres une incubation de

min à température ambiante.

L'ADN a été aussitôt protégé par l'ajout de 100 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (concentration finale) et l'incubation a été poursuivie dans la glace pendant encore 10 min. La lyse a été totalement achevée par l'addition de 2% de dodécylsulfate de sodium (concentration finale) et de 25 ml de solution de lyse (Tris-HCl, pH 8,

mM; acide éthylènediaminetétraacétique 100 mM; chlorure de sodium 100 mM).

Les protéines ont été pleinement dénaturées par une incubation de 1 heure à 50 C en présence de 40 mg de protéinase K. A la fin de cette incubation, 1 M (concentration finale) de perchlorate de sodium a été ajouté pour que les liaisons

ADN-protéines soient rompues.

La solution a été déprotéinisée en l'agitant en présence de 0,5 volume de phénol saturé pendant 5 min. L'agitation a été faite manuellement et a dû être suffisamment énergique, sans l'être trop pour ne pas déchirer l'ADN, pour former une émulsion (sans laquelle il ne pourrait y avoir d'extraction). La déprotéinisation a été poursuivie encore pendant 5 min après ajout de 0,5 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1). Les protéines ont été concentrées à l'interface entre la phase aqueuse et la

phase organique, par une centrifugation de 15 min à 10000 g à température ambiante.

La phase aqueuse contenant les acides nucléiques a été transvasée dans un tube propre avec une pipette dont l'embout a été agrandi pour ne pas déchirer l'ADN. La déprotéinisation a été poursuivie et les traces de phénol ont été extraites de la phase aqueuse, par agitation de la solution pendant 5 min en présence de 1 volume de

chloroforme/alcool isoamylique (24/1).

Après une centrifugation de 5 min à 10000 g à température ambiante, la phase aqueuse a été prélevée avec les mêmes précautions que précédemment, et les acides nucléiques ont été précipités en versant délicatement 0,6 volume d'isopropanol (de façon à former deux phases). L'ADN de haut poids moléculaire a été récupéré avec une baguette de verre, lavé dans de l'éthanol à 70%, déshydraté dans de l'éthanol

absolu et séché à l'air.

Après séchage, I'ADN a été dissous dans 20 ml de tampon TE (10 mM, Tris-

HCI, pH 8; 1 mM, acide éthylènediaminetétraacétique). La dissolution a nécessité environ 12 heures et elle a pu être facilitée par un chauffage à 50 C. Lorsque la solution obtenue a été opalescente, signe d'une contamination importante en protéines, ces dernières ont été efficacement éliminées en passant une fraction de

l'ADN sur un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthydium.

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Après ce passage sur gradient et élimination du bromure d'éthydium, I'ADN ainsi

obtenu a été quantifié. Il a pu être conservé à 4 C ou congelé à -20 C.

La composition d'ADN, exprimée en pourcentage molaire de guanine + cytosine (mol% G+C), a été déterminée par la méthode spectroscopique de ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272, 1-11, (1972)) et le procédé de gradient en chlorure de

césium en présence de 2'-[4-hydroxyphényl]-5-[4-méthyl-1-pipérazinyl]-2, 5'-bi-

1H-benzimidazole (Hoechst 33258/Sigma) (KARLOVSKY et DE COCK, Anal.

Biochem. 194, 192-197, (1991)). Dans le premier cas, il est de 44 + 1% (moyenne de 2 manipulations) et dans le deuxième cas de 48,8%. Ce pourcentage molaire G+C a

été calculé en utilisant l'ADN de E. coli comme référence standard.

Exemple 2: Séquençage de l'ADN 16S de Cvtophaga drobachiensis L'ADN 16S a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche C. drobachiensis comme matrice et la polymérase Taq (Proméga) comme enzyme. Le mélange réactionnel typique de PCR, de 50 ul de volume, avait la composition suivante: 100 ng de matrice, 10 ng de chacun des deux oligonucléotides spécifiques de l'ADN 16S du règne des Bacteria, 200 mM de chacun des dNTP (dNTP étant le déoxyribonucléoside triphosphate), 1,5 mM de MgCI2, du tampon Taq et 2,5 U d'enzyme. Les différentes étapes de PCR étaient les suivantes: * 6 min à 95 C (1 fois), * 1,5 min à 95 C; 1,5 min à 54 C; 2,5 min à 72 C (25 fois),

* 8,5 min à 72 C (étape de polymérisation).

Le produit obtenu par PCR a été soit au préalable cloné puis séquencé, soit directement séquencé par PCR en utilisant la Thermoséquenase (Amersham) comme enzyme, avec différents oligonucléotides spécifiques pour l'ADN 16S marqués en 5' au rouge Texas. Les différentes étapes de PCR étaient les suivantes: * 5 min à 97 C (1 fois),

* 1 min à 97 C; 1 min à 54 C; 1 min à 61 C (25 fois).

Ce séquençage, qui permet de connaître la position taxonomique de la souche, a montré que la souche selon l'invention était phylogénétiquement très proche de

Cytophaga uliginosa.

Exemple 3: Mise en évidence et purification de l'activité agarase dans la souche Cvtophaga drobachiensis DSM 12170 L'activité agarase de la souche a été induite dans un milieu de Zobell supplémenté par 2,5 mg/l d'agar. On considère qu'une souche présente une activité

agarase lorsqu'elle digère l'agar sur lequel elle se développe.

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On a cultivé les souches à activité agarase dans le milieu ci-dessus à 20 C. On a centrifugé la culture à 1000 g pendant 20 min. On a récupéré le surnageant de culture et on l'a concentré jusqu'à 50 ml par ultrafiltration tangentielle (seuil de coupure: 10 kDa), opération suivie d'une précipitation au sulfate d'ammonium. Le culot de protéines a été remis en suspension dans 9 ml de tampon MES (MES étant l'acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique). On a ensuite ajouté 2 ml de Sépharose CL6B afin de réaliser une chromatographie par affinité. On a récupéré deux fractions

dont l'une s'est fixée sur la colonne de Sépharose.

On a testé l'activité agarase par un dosage des sucres réducteurs selon la technique de KIDBY D.K. & DAVIDSON DJ. (Annal. Biochem., Vol. 55, 321-325 (1973)) dans le surnageant avant la chromatographie par affinité (qui est bien évidemment positif) et dans les deux fractions obtenues après la chromatographie. On

a détecté une activité agarase dans chaque fraction.

Exemple 4: Clonage du gène d'agarase

On a préparé une banque d'ADN génomique de la souche de C. drobachiensis.

Des fragments de 4 à 10 kb, provenant de la digestion partielle par NdeII de l'ADN chromosomique, ont été fractionnés sur un gradient de saccharose. Ces fragments ont été insérés dans le site BamHI du plasmide pAT153 (TWIGG et SHERRA'IT, Nature,

283,216, (1980)).

Les clones recombinants (environ 6000) de la souche DH5a de E. coli (SAMBROOK et al., supra) ont été inoculés indépendamment sur des plaques de microtitration dans le milieu LBA (milieu Luria-Bertani (MANIATIS et al., supra) supplémenté en ampicilline à une concentration de 50 /g/ml). Après incubation, toute la nuit à 37 C, ces clones ont été étalés à 22 C sur du milieu Zd (5 mg/l de bactotryptone, 1 mg/l d'extrait de levure, 10 mg/e de NaCI, pH 7,2) supplémenté à /ug/ml d'ampicilline pour observer la production d'agarase (trou dans la gélose

lorsqu'il y a production d'agarase).

En deux mois de culture à 22 C, 2 colonies indépendantes, appelées pAC3 et

pAC4, ont fait un trou dans le substrat.

Les cartes des plasmides correspondant à ces colonies sont représentées sur la figure 1, sur laquelle: - les lignes fines représentent les régions de pAT153, les segments en gras représentent les inserts de C. drobachiensis et les rectangles blancs représentent le gène agarase;

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- les différentes abréviations ont les significations ci-après: B/S: site de clonage BamHI-Sau3A B: BamHI Bg: BglII C: ClaI E: EcoRI H: HindIlI K: KnpI Nc: NcoI Nd: NdeI Ps: PstI Pv: PvuII La cartographie de ces plasmides montre donc la présence d'un fragment commun, ce qui suggère la présence d'au moins un gène agarase dans le génome de C. drobachiensis. Les plasmides pAC3 et pAC4 partagent un fragment commun

ClaI-PstI de 5 kb (délimité par les lignes en pointillés sur la figure 1).

Le fragment commun a été sous-cloné dans le phagemide pBluescript (Stratagène) et est appelé pACP5, comme indiqué sur la figure 1. Ce sousclone

présente un phénotype agarase +.

Exemple 5: Analyse de la séquence nucléotidique du gène d'agarase Le plasmide pACP5 a été utilisé pour déterminer, sur les deux brins, les

séquences nucléotidiques du gène de structure d'agarase.

Ce séquencçage a été réalisé par une technique bien connue de l'homme du métier, à savoir la méthode de Sanger (SANGER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74,

5463-5467, (1977)) égalcment appelée méthode aux didéoxynucléotides.

L'insert pACP5 a été séquencé sur 2440 pb entre les deux sites EcoRI (délimité par les deux lettres E sur la figure 1). Il contient un unique ORF complet de

1059 pb appelé gène agaB, ainsi qu'un ORF partiel. Ce gène agaB a la SEQ ID N 1.

La séquence d'acides nucléiques obtenue est illustrée sur la figure 2. Deux hexamères, TTGAgA et TATtcT, compatibles avec les promoteurs consensus "-35" et "-10" de E. coli et séparés par 17 nucléotides, sont trouvés à 43 nucléotides en amont du codon initiateur putatif du gène agaB. Dans la région 3' non traduite, une boucle d'arrêt de transcription est trouvée en aval du codon stop TAA, suivi de quatre résidus thymidine. Le deuxième ORF, partiel, est trouvé en aval du gène agaB. Deux hexamères, TTGACc et TtaAtT, séparés par 17 nucléotides, sont également trouvés à

39 nucléotides en amont du codon initiateur putatif du deuxième ORF.

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Le coefficient de Chargaff (GC%) du gène d'agarase B est compris entre 41 et 45 %, ce qui est en accord avec celui du genre Cytophaga trouvé par REICHENBACH et al. (30-45 %; Genus Cytophaga, in Bergey's Manual of

systematic bacteriology, 2015-2050, (1989)).

Exemple 6 Analyse de la séquence d'acides aminés déduite du gène d'agarase Le produit de traduction du gène agaB est une protéine de 353 acides aminés présentant une masse moléculaire calculée de 40,680 kDa et ayant la séquence d'acides aminés déduite SED ID N 2. L'analyse du profil d'hydropathie montre un

segment N-terminal très hydrophobe sur un domaine d'environ 20 acides aminés.

Cependant, il n'existe pas de site de coupure selon la règle "(-3, -1)" de Von Heijne [VON HEIJNE Eur. J. Biochem. 133, 17-21, (1983); J. Mol. Biol. 184, 99-105, (1985)]. Ce segment semble donc être non clivable. Les résultats obtenus à partir du logiciel PSORT (Nakai's expert system PSORT) (NAKAI & KANEHISA, Proteins, Structure, Function and Genetics 11, 95-110, (1991)) concernant la recherche de

peptides signaux, laissent à penser que la protéine présente une séquence signal N-

terminale non clivable qui jouerait le rôle d'ancre transmembranaire. Il est à noter de plus, que la séquence LVFCCALLLGCGD est en parfait accord avec la signature de l'extrémité N-terminale des lipoprotéines procaryotiques (Prosite PS00013; BAIROCH et al., Nucl. Acids Res. 24, 189-196, (1995)). Dans ce cas un site de coupure serait possible entre les résidus G17 et C18. Ces résultats suggèrent que

AgaB pourrait être une lipoprotéine localisée dans la membrane interne de la cellule.

L'ORF qui suit le gène agaB code pour une protéine qui présente une

homologie significative avec la famille des protéines DnaJ (OHKI et al., J. Biol.

Chem. 261, 1778-1781, (1986)) (figure 2).

Exemple 7: Similitudes de séquence entre les protéines AgaA et AgaB de C. drobachiensis et avec d'autres.-glycanases Les similitudes de séquence entre les protéines AgaA selon la 1P demande divisionnaire et AgaB selon la présente demande sont illustrées sur la figure 3. La protéine AgaA présente une identité de 44,5% et une similitude de 65,7% avec la protéine AgaB. De nombreux domaines sont assez similaires dans les séquences primaires, de IlellO à Val287 (numérotation sur la séquence de l'agarase A). En particulier, dans l'un des motifs les mieux conservés, deux résidus acide glutamique sont présents et séparés par 4 acides aminés (Glu147 et Glu152 dans la séquence d'AgaA, et Glu184 et Glu189 dans la séquence d'AgaB, en gras sur la figure 3). Cette

organisation est caractéristique du site catalytique de la famille 16 des glycoside-

hydrolases (HENRISSAT, Biochem. J. 280, 309-316, (1991)).

il 2779738 Aucune similitude de séquence n'a été trouvée avec les agarases de la souche Vibrio sp. JT0107 (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750-3756,

(1993); Biochim. Biophys. Acta 1218, 105-108, (1994)).

Néanmoins, les agarases (AgaA et AgaB) partagent des identités de séquence significatives avec les i-agarases de Alteromonas atlantica GenBank M73783 (BELAS et al., J. Bacteriol. 54, 30-37, (1988)) (53,5% et 48% avec AgaA et AgaB,

respectivement) et de Streptomyces coelicolor (BU'INER et al., Mol. Gen. Genet.

209, 101-109, (1987) (33% avec AgaA et avec AgaB).

Ces similitudes sont également mises en évidence grâce à la méthode HCA (hydrophobic cluster analysis; LEMESLE-VARLOOT et al., Biochimie 72, 555-574, (1990)). La figure 4 illustre la comparaison HCA entre les agarases AgaA et AgaB, respectivement Agar A Cd et Agar B Cd sur la figure, et d'autres enzymes de la famille 16 des glycoside-hydrolases, à savoir la 3-agarase de Alteromonas atlantica (Agar Aa), la 3-agarase de Streptomyces coecicolor (Agar Sc), la:-carrageenase de C. drobachiensis (Kap Cd), la laminarinase de Rhodothermus marinus (Lam Rm), la lichenase de Bacillus macerans (Lich Bm), et la xyloglucane- endotransglycosylase

deArabidopsis thaliana (XET At).

Les deux résidus catalytiques Glu, présents dans la lichénase de Bacillus macerans, ont été pris comme points d'ancrage pour la comparaison HCA et les séquences segmentées en prenant comme référence la structure tridimensionnelle

connue de cette lichénase.

Treize segments de structure distincte (I-XIII) sont mis en évidence sur la figure 4, les segments I, II, IX, X, XI et XIII apparaissant les mieux conservés. On peut noter que le segment VI est spécifique des agarases dans cette famille de glycoside-hydrolases et que le site catalytique se trouve dans le segment de structure III. Exemple 8: Spécificités de substrat de l'agarasc recombinée AgaB Les spécificités de substrat de l'agarase de l'invention ont été étudiées en analysant les produits de dégradation du néoagarododécaose par l'agarase

recombinante AgaB.

Le néoagarododécaose a été préparé de la façon suivante: de l'agarose a été hydrolysé par de l'agarase, en utilisant 0,32 U/mg de polymère. La fraction résistante a été précipitée dans de l'isopropanol et les oligosaccharides solubles ont été fractionnés par chromatographie d'exclusion préparatoire sur Bio-gel P2 ( 95 cm x 4,4 cm; 25 C; éluant:eau distillée). La détection a été réalisée avec un appareil d'enregistrement de l'indice de réfraction différentiel (ROCHAS & HEYRAUD,

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Polymer Bull. 5, 81-86, (1981)). La fraction oligomère correspondant au

néoagardodécaose a été concentrée sur un évaporateur rotatif et lyophilisé.

On a cultivé pendant 12 heures dans 1 litre de milieu LB à 37 C (milieu Luria-Bertani), les clones recombinants de E. coli contenant le plasmide pAC4. On a centrifugé les cellules à 2000 g pendant 20 minutes, on les a mises en suspension dans ml de tampon MES et on les a fait éclater à l'aide d'une presse de French à 20000 p.s.i. On a réalisé une centrifugation à 20000 g pendant 1 heure. On a rejeté les fragments cellulaires et on a réduit le volume du surnageant à 5 ml en utilisant une

cellule d'ultrafiltration (Amicon, seuil de coupure de 10 kDa).

On a ajouté 500,l de chaque extrait ainsi obtenu à 1 ml de néoagaro-

dodécaose dans du tampon MES (50 mg/ml) et on a incubé à 37 C pendant 18 heures.

On a déterminé le degré de polymérisation des produits finaux par chromatographie HPAE en utilisant un détecteur électrochimique pulsé et une colonne échangeuse d'anions (Carbo-PAC PA100, Dionex) dans les conditions suivantes: débit 1 ml/min; tampon A 150mM NaOH; tampon B 500 mM d'acétate de sodium dans 150 mM de NaOH; gradient À 0 à 5 min 70% de A, 30% de B; * 5 à 16 min 40% de A, 60% de B; * 16à20 min 100% de B. Les résultats obtenus par chromatographie HPAE (chromatographie échangeuse d'anions haute performance) sont illustrés sur les figure SA et 5B sur lesquelles les différentes abréviations ont les significations ci-après: nC: manocoulomb DP1: néoagarobiose DP2: néoagarotétraose DP3: néoagarohexaose DP4: néoagarooctaose DP5: néoagarodécaose DP6: néoagarododécaose DP7: néoagarotétradécaose DP8: néoagarohexadécaose Les produits finaux d'hydrolyse du néoagarododécaose par l'agarase B sont représentés sur la figure 5B. Par comparaison avec le néoagarododécaose sans enzyme (figure SA), le profil d'élution après 18 heures de digestion présente le néoagarotétraose (DP2) comme produit majoritaire et le néoagarohexaose (DP3)

comme produit minoritaire.

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LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATIONS GENERALES:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: LABORATOIRES GOEMAR

(B) RUE: La Madeleine B.P. 55 (C) VILLE: Saint-Malo (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 35413 Cédex (ii) TITRE DE L'INVENTION: Gène codant pour la P-agarase AgaB de Cytophaga drobachiensis souche Dsij et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 1440 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: CDS

(B) EMPLACEMENT:196..1254

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

GTCTTTATCA CAATTCTATC TTAGAATTCT TACTAATGCT GACAAAACTA CGGCTGCAAC 60

CGTGTATTAC GATAACTTCT CTATCATTGA AAAAGAAGAG AGGCCATAAC AATTGTTGAG 120

TGTTTGAGAT AGAGGGAGAA TTGAAATATT CTCCCTTTTT ATCCTTTTTT CATTTTAAAC 180

AAATTACGTA TAAAC ATG TAT TTA ATA TAT CTT AGG TTG GTC TTT TGC TGT 231

Met Tyr Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Val Phe Cys Cys

540 545 550

GCC CTT TTG TTG GGG TGT GGC GAC AAT TCA AAA TTT GAT AGT GCA ACG 279

Ala Leu Leu Leu Gly Cys Gly Asp Asn Ser Lys Phe Asp Ser Ala Thr

555 560 565

GAT TTG CCG GTT GAA CAA GAA CAA GAA CAG GAA ACG GAA CAA GAG GGA 327

Asp Leu Pro Val Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Thr Glu Gln Glu Gly

570 575 580

GAA CCC GAA GAA AGT TCG GAG CAA GAC CTT GTC GAG GAG GTC GAT TGG 375

Glu Pro Glu Glu Ser Ser Glu Gln Asp Leu Val Glu Glu Val Asp Trp

585 590 595

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AAG GAT ATT CCC GTA CCC GCC GAT GCA GGA CCG AAT ATG AAG TGG GAG 423

Lys Asp Ile Pro Val Pro Ala Asp Ala Gly Pro Asn Met Lys Trp Glu

600 605 610 615

TTT CAA GAG ATT TCC GAT AAT TTT GAA TAT GAG GCC CCT GCG GAT AAT 471

Phe Gln Glu Ile Ser Asp Asn Phe Glu Tyr Glu Ala Pro Ala Asp Asn

620 625 630

AAG GGG AGT GAA TTT CTC GAA AAG TGG GAC GAT TTT TAT CAC AAT GCC 519

Lys Gly Ser Glu Phe Leu Glu Lys Trp Asp Asp Phe Tyr His Asn Ala

635 640 645

TGG GCA GGC CCA GGG CTG ACC GAA TGG AAA CGG GAC AGG TCC TAT GTA 567

Trp Ala Gly Pro Gly Leu Thr Glu Trp Lys Arg Asp Arg Ser Tyr Val

650 655 660

GCC GAT GGC GAG CTA AAG ATG TGG GCG ACA AGA AAA CCG GGC TCC GAT 615

Ala Asp Gly Glu Leu Lys Met Trp Ala Thr Arg Lys Pro Gly Ser Asp

665 670 675

AAA ATA AAC ATG GGG TGC ATT ACT TCT AAG ACC CGA GTG GTC TAT CCT 663

Lys Ile Asn Met Gly Cys Ile Thr Ser Lys Thr Arg Val Val Tyr Pro

680 685 690 695

GTT TAT ATT GAA GCA AGG GCA AAG GTC ATG AAC TCT ACC TTG GCT TCG 711

Val Tyr Ile Glu Ala Arg Ala Lys Val Met Asn Ser Thr Leu Ala Ser

700 705 710

GAT GTT TGG CTC TTA AGT GCC GAT GAC ACC CAA GAG ATA GAT ATT CTA 759

Asp Val Trp Leu Leu Ser Ala Asp Asp Thr Gln Glu Ile Asp Ile Leu

715 720 725

GAG GCA TAT GGG GCC GAT TAT TCC GAA AGT GCC GGA AAG GAT CAT TCC 807

Glu Ala Tyr Gly Ala Asp Tyr Ser Glu Ser Ala Gly Lys Asp His Ser

730 735 740

TAT TTT TCT AAA AAG GTA CAC ATA AGC CAT CAC GTC TTT ATT CGA GAC 855

Tyr Phe Ser Lys Lys Val His Ile Ser His His Val Phe Ile Arg Asp

745 750 755

CCA TTT CAA GAT TAT CAA CCA AAG GAT GCC GGT TCT TGG TTC GAA GAC 903

Pro Phe Gln Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Phe Glu Asp

760 765 770 775

GGC ACC GTC TGG AAC AAA GAG TTC CAT AGG TTT GGT GTG TAT TGG AGG 951

Gly Thr Val Trp Asn Lys Glu Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Arg

780 785 790

GAT CCA TGG CAT CTA GAA TAT TAC ATA GAC GGT GTT CTG GTG AGG ACC 999

Asp Pro Trp His Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu Val Arg Thr

795 800 805

GTT TCG GGA AAG GAC ATT ATC GAC CCC AAA CAC TTT ACG AAT ACA ACG 1047

Val Ser Gly Lys Asp Ile Ile Asp Pro Lys His Phe Thr Asn Thr Thr

810 815 820

GAT CCC GGT AAT ACG GAA ATC GAT ACC CGC ACC GGT CTC AAT AAA GAA 1095

Asp Pro Gly Asn Thr Glu Ile Asp Thr Arg Thr Gly Leu Asn Lys Glu

825 830 835

* ATG GAT ATT ATT ATC AAT ACA GAA GAC CAA ACT TGG CGG TCT TCA CCG 1143

Met Asp Ile Ile Ile Asn Thr Glu Asp Gln Thr Trp Arg Ser Ser Pro

840 845 850 855

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GCC TCG GGT TTA CAG TCT AAT ACC TAT ACG CCA ACG GAC AAT GAA TTG 1191

Ala Ser Gly Leu Gln Ser Asn Thr Tyr Thr Pro Thr Asp Asn Glu Leu

860 865 870

AGC AAT ATA GAA AAC AAT ACG TTC GGG GTC GAT TGG ATC AGG ATC TAT 1239

Ser Asn Ile Glu Asn Asn Thr Phe Gly Val Asp Trp Ile Arg Ile Tyr

875 880 885

AAA CCT GTA GAG AAA TAAGAAAATC CTTCTTTTGC TTTGGTCGCG CCCGTGAGCT 1294

Lys Pro Val Glu Lys

TATGATTCGG CGCTGTCTAA ATAGTTTTAT AAAACCATAG GTAGTTCCCC CTTTGTTCAA 1354

ACTACTTGCC TATGGTTTTT TTTATGTTTT ATTCCAGAAA GATGACTGGG GTCATATGAT 1414

GTTATTTATC TTTTTCTTCC CATAAA 1440

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 353 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Met Tyr Leu Ile Tyr Leu Arg Leu Val Phe Cys Cys Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Gly Cys Gly Asp Asn Ser Lys Phe Asp Ser Ala Thr Asp Leu Pro Val

25 30

Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Thr Glu Gln Glu Gly Glu Pro Glu Glu

40 45

Ser Ser Glu Gln Asp Leu Val Glu Glu Val Asp Trp Lys Asp Ile Pro

55 60

Val Pro Ala Asp Ala Gly Pro Asn Met Lys Trp Glu Phe Gln Glu Ile

70 75 80

Ser Asp Asn Phe Glu Tyr Glu Ala Pro Ala Asp Asn Lys Gly Ser Glu

90 95

Phe Leu Glu Lys Trp Asp Asp Phe Tyr His Asn Ala Trp Ala Gly Pro

105 110

Gly Leu Thr Glu Trp Lys Arg Asp Arg Ser Tyr Val Ala Asp Gly Glu

120 125

Leu Lys Met Trp Ala Thr Arg Lys Pro Gly Ser Asp Lys Ile Asn Met

135 140

Gly Cys Ile Thr Ser Lys Thr Arg Val Val Tyr Pro Val Tyr Ile Glu

150 155 160

Ala Arg Ala Lys Val Met Asn Ser Thr Leu Ala Ser Asp Val Trp Leu

170 175

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Leu Ser Ala Asp Asp Thr Gln Glu Ile Asp Ile Leu Glu Ala Tyr Gly

185 190

Ala Asp Tyr Ser Glu Ser Ala Gly Lys Asp His Ser Tyr Phe Ser Lys

200 205

Lys Val His Ile Ser His His Val Phe Ile Arg Asp Pro Phe Gln Asp

210 215 220

Tyr Gln Pro Lys Asp Ala Gly Ser Trp Phe Glu Asp Gly Thr Val Trp

225 230 235 240

Asn Lys Glu Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Arg Asp Pro Trp His

245 250 255

Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Leu Val Arg Thr Val Ser Gly Lys

260 265 270

Asp Ile Ile Asp Pro Lys His Phe Thr Asn Thr Thr Asp Pro Gly Asn

275 280 285

Thr Glu Ile Asp Thr Arg Thr Gly Leu Asn Lys Glu Met Asp Ile Ile

290 295 300

Ile Asn Thr Glu Asp Gln Thr Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ser Gly Leu

305 310 315 320

Gln Ser Asn Thr Tyr Thr Pro Thr Asp Asn Glu Leu Ser Asn Ile Glu

325 330 335

Asn Asn Thr Phe Gly Val Asp Trp Ile Arg Ile Tyr Lys Pro Val Glu

340 345 350

Lys

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Claims (8)

REVENDICATIONS

1. Gène agaB codant pour une 03-agarase, caractérisé en ce qu'il a la

SEQ ID N 1.

2. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une P-agarase de Cytophaga drobachiensis déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 8 mai 1998 sous le

numéro DSM 12170.

3. Protéine AgaB de C. drobachiensis DSM 12170 caractérisée en ce qu'elle a

la SEQ ID N 2.

4. Fragments peptidiques de la protéine selon la revendication 3 résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés,

lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité e-agarase.

5. Séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine selon la

revendication 3 et les fragments peptidiques selon la revendication 4.

6. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADN SEQ ID N 1 codant pour la protéine AgaB et ses fragments codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaB ou les fragments de celle-ci; et

d) les séquences d'ARNm correspondantes.

7. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides

nucléiques selon l'une quelconque des revendications 5 et 6 et les moyens nécessaires

à son expression.

8. Microorganismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression

selon la revendication 7.