JPH07298887A

JPH07298887A - 酵素をコードするｄｎａとそれを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体

Info

Publication number: JPH07298887A
Application number: JP7072525A
Authority: JP
Inventors: Michio Kubota; 倫夫久保田; Keiji Tsusaki; 桂二津▲さき▼; Kazuko Hattori; 和子服部; Toshiyuki Sugimoto; 利行杉本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 1995-11-14
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: JP3557276B2

Abstract

(57)【要約】【目的】末端にトレハロース構造を有する非還元性糖
質からトレハロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡ
とそのＤＮＡを含む複製可能な組換えＤＮＡ並びに形質
転換体を提供する。【構成】特定の作用を有する酵素をコードするＤＮＡ
と、そのＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる
組換えＤＮＡと、その組換えＤＮＡを適宜宿主に導入し
てなる形質転換体を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質か
らトレハロースを遊離する酵素をコードする新規なＤＮ
Ａと、そのＤＮＡを含む組換えＤＮＡ並びに形質転換体
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、グルコース２分子が還
元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真
菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分
子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で
加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の
懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしな
がら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難し
く、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなか
った。

【０００３】これまでの製造方法は、微生物の菌体を利
用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに
大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５
号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生
物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロ
ースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開
昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、
基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォス
フォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼから
なる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系
外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのもの
の増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から
採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に
含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少である
という問題があった。後者の方法は、トレハロースその
ものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の
酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グ
ルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度に
して反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理
的に難しかった。

【０００４】斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖か
らトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき
鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１
１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生
物がグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端に
トレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するとい
う、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明し
た。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同
じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバク
ター・スピーシーズＱ３６などが産生する別の酵素によ
り、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又は
マルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これ
ら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のト
レハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハ
ロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期
待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ
−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６もこれ
ら酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にト
レハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造し
ようとすると、微生物を大量に培養しなければならない
という問題がある。

【０００５】一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には
目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明
されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子
を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコ
ードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微
生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培
養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得で
きるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコード
する遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急
務となっている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、末
端にトレハロース構造を有する非還元性糖質からトレハ
ロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡを提供するこ
とにある。

【０００７】この発明の別の目的は、そのＤＮＡを含む
複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。

【０００８】この発明のさらに別の目的は、その組換え
ＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供する
ことにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重
合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する
酵素をコードするＤＮＡにより解決するものである。

【００１０】この発明は、前記第二の課題を、末端にト
レハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還
元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードする
ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能
な組換えＤＮＡにより解決するものである。

【００１１】この発明は、前記第三の課題を、末端にト
レハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還
元性糖質からトレハロースを遊離する酵素をコードする
ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる組換えＤ
ＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決す
るものである。

【００１２】

【作用】この発明のＤＮＡは、自律複製可能な適宜ベク
ターに挿入して複製可能な組換えＤＮＡとし、この組換
えＤＮＡを、本来、当該酵素を産生しないけども、比較
的容易に増殖させることのできる宿主に導入して形質転
換体とすることにより、コードされた当該酵素の産生を
発現する。

【００１３】この発明の組換えＤＮＡは、本来、当該酵
素を産生しないけれども、比較的容易に増殖させること
のできる宿主に導入して形質転換体とし、この形質転換
体を培養することにより、コードされた当該酵素の産生
を発現する。

【００１４】この発明の形質転換体は、培養すると、当
該酵素を産生する。

【００１５】この発明は、末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハ
ロースを遊離する、従来未知の全く新規な酵素の発見に
基づくものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシ
ーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６
の培養物から得ることができ、本発明者がカラムクロマ
トグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこ
の酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その
本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を
有することが判明した。（１）作用末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以
上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。（２）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（３）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）（４）至適温度ｐＨ７．０で３０分間インキュベートすると、３５乃至
４５℃付近に至適温度を示す。（５）至適ｐＨ４０℃で３０分間インキュベートすると、ｐＨ６．０乃
至７．５付近に至適ｐＨを示す。（６）熱安定性ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３０乃至
４５℃付近まで安定である。（７）ｐＨ安定性２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃
至１０．０付近まで安定である。

【００１６】次に、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１
又はアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する
酵素（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３
６」と言う。）の理化学的性質を解明すべく行なった実
験について説明する。

【００１７】

【実験例１酵素の精製】

【００１８】

【実験例１−１酵素Ｍ−１１の精製】５００ｍｌ容三
角フラスコに松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデ
ックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％
（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素
二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウ
ム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を
１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレー
ブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪
下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャ
ーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌと
り、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種
し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４
時間通気撹拌培養した。

【００１９】次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧
菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採
取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和に
なるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により
沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、
沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離によ
り不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー
製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−
トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩
化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画
分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分
離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫
酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグ
ラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍ
から０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カ
ラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。
溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー
製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパ
ールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分
を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比
活性は約２４０単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物
１ｌ当たり約６５０単位であった。

【００２０】なお、この発明を通じて、酵素の活性は次
の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すな
わち、α−マルトトリオシルトレハロースを１．２５％
（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４
ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で３０分
間インキュベートして反応させる。そして、反応液を１
ｍｌとり、ソモギ銅液２ｍｌに加えて反応を停止させた
後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。対照
には、予め１００℃で１０分間加熱して失活させた酵素
を上記と同様に処理する。当該酵素の１単位とは、上記
条件下において、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相
当する還元力を増加させる酵素の量と定義する。

【００２１】

【実験例１−２酵素Ｑ３６の精製】実験例１−１と同
様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、
培養物を処理したところ、比活性約４５０単位／ｍｇ蛋
白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約６５０
単位の収量で得られた。

【００２２】

【実験例２酵素の理化学的性質】

【００２３】

【実験例２−１作用】特願平５−３４９２１６号明細
書に開示された方法により、α−グルコシルトレハロー
ス、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシ
ルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース
又はα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当た
り９８％以上含む非還元性糖質を調製した。そして、そ
のいずれかを基質として５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に濃度２０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、溶液
に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は酵素Ｑ３６を基
質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させ
た。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液
体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に
負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−
８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに
蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、
反応物に含まれる糖質を分離した。別途、非還元性糖質
に代えて高純度のマルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマル
トヘプタオースのいずれかを含む水溶液を上記と同様に
処理し、処理物を分析して対照とした。表１及び表２
に、それぞれ、Ｍ−１１及びＱ３６を加えた場合の基質
並びに反応物の糖組成を示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【表２】

【００２６】表１及び表２に示すように、酵素Ｍ−１１
及び酵素Ｑ３６は、末端にトレハロース構造を有するグ
ルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロース
とグルコース又はマルトオリゴ糖をほぼ定量的に遊離し
た。一方、グルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖を
基質にすると、両酵素とも全く作用を示さなかった。こ
れらの事実は、当該酵素が末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に選択的に
作用し、そのトレハロース残基とグリコシル残基間のグ
リコシド結合を特異的に加水分解することを示唆してい
る。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規
な作用機序を辿るものと推定される。

【００２７】

【実験例２−２分子量】ユー・ケー・レムリが『ネー
チャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０
年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１
１、酵素Ｑ３６とも、分子量約５７，０００乃至６８，
０００ダルトンに相当する位置に単一バンドを示した。
なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，
０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２
５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００
ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）
及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であっ
た。

【００２８】

【実験例２−３等電点】等電点電気泳動法により測定
したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．３
乃至４．６に等電点を示した。

【００２９】

【実験例２−４至適温度】常法により、５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０分間インキュベートする
条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵
素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４５℃付近に至
適温度を示した。

【００３０】

【実験例２−５至適ｐＨ】常法により、ｐＨの相違す
る５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で３０分間イン
キュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に
示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．
０乃至７．５付近に至適ｐＨを示した。

【００３１】

【実験例２−６熱安定性】常法により、５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする
条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵
素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３０乃至４５℃付近まで
安定であった。

【００３２】

【実験例２−７ｐＨ安定性】常法により、ｐＨの相違
する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間イ
ンキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８
に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ
５．５乃至１０．０付近まで安定であった。

【００３３】

【実験例２−８Ｎ末端アミノ酸配列】常法により、ア
プライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケ
ンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ
−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すア
ミノ酸配列を有していることが判明した。

【００３４】同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ
末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を
有していることが判明した。

【００３５】

【実験例２−９部分アミノ酸配列】実験例１−１で得
た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵
素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌと
り、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃
で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解し
た。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニ
トリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸によ
り平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグ
ラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、
１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセ
トニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）
トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。
そして、通液開始から約４３分後又は約５７分後に溶出
したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」
又は「ペプチド断片Ｂ」と言う。）を含む画分を採取
し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリル
を含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解し
た。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプ
チド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１
０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。

【００３６】別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６
を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／
ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリ
フルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・
リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム
『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ
／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニト
リルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そし
て、通液開始から約４分後又は約２４分後に溶出したペ
プチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は
「ペプチド断片Ｄ」と言う。）を含む画分を採取し、真
空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む
０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以
後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及び
Ｄは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミ
ノ酸配列を有していることが判明した。

【００３７】以上のような理化学的性質を有する酵素は
未だ知られておらず、新規物質であると判断される。な
お、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市
の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城
県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに
寄託番号『ＦＥＲＭＢＰ−４１３０』で寄託されてい
る。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡
山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年
６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭＢＰ
−４３１６』で寄託されている。同じ出願人による特願
平５−３４０３４３号明細書には、酵素の性質・性状と
ともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されてい
る。

【００３８】そこで、本発明者が、実験例２−８又は２
−９で明らかにした酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列に
基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブに
し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡ
を鋭意検索したところ、下記の配列表における配列番号
３に示す塩基配列を有する１，７６７塩基対からなるＤ
ＮＡ断片が得られた。そして、その塩基配列を解読した
ところ、酵素Ｍ−１１は５８９個のアミノ酸からなる、
配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有して
いることが判明した。

【００３９】一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基
づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、
アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡ
を同様に検索したところ、配列表における配列番号４に
示す塩基配列を有する１，７９１塩基対からなるＤＮＡ
断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素
Ｑ３６は５９７個のアミノ酸からなり、配列表における
配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明
した。

【００４０】配列表における配列番号１乃至４に示す塩
基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程
を要約すると、次のようになる。（１）供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、
高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加
水分解後、加水分解物より２種類のペプチド断片を単離
し、そのアミノ酸配列を決定した。（２）別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを
分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断した約
２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を
採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予
め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結
し、組換えＤＮＡを作製した。（３）大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を
作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオ
リゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダ
イゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む
形質転換体を選択した。（４）形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライ
マーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作
用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡを
ジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して
塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、
その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認し
た。

【００４１】両供与体微生物の遺伝子がコードするアミ
ノ酸配列は配列表における配列番号１又は２に示すとお
りであるが、この発明のＤＮＡは、配列表における配列
番号１又は２に示すとおりのアミノ酸配列をコードする
ものは無論のこと、これらと相同的なアミノ酸配列を有
するものをも包含するものとする。すなわち、組換えＤ
ＮＡ技術の進歩により、斯界においては、酵素の作用を
実質的に変えることなく、比較的容易にその構成アミノ
酸の１個又は２個以上を他のアミノ酸で置換できるよう
になった。また、同じＤＮＡであっても、それを導入す
る宿主や、そのＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用す
る栄養培地の成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依って
は、宿主内酵素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、
所期の酵素作用は保持しているものの、配列表における
配列番号１又は２のアミノ酸配列におけるＮ末端付近の
アミノ酸の１個又２個以上が欠失したり、Ｎ末端に１個
又は２個以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生
することがある。斯かる技術水準に鑑み、この発明でい
う酵素とは、配列表における配列番号１又は２に示すア
ミノ酸配列をそのまま具備するものは言うに及ばず、そ
のアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個又は２個以上が
他のアミノ酸に置き換わるか、欠失若しくは付加した変
異体であっても、それが末端にトレハロース構造を有す
るグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロ
ースを遊離するかぎり包含するものとする。

【００４２】さらに、斯界においては、遺伝子コードの
縮重により、コードするアミノ酸配列を変えることな
く、ＤＮＡにおける塩基の１個又は２個以上を他の塩基
で置換することができる。これにより、この発明のＤＮ
Ａは、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配列
をそのまま有するもののみならず、それが配列表におけ
る配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を有する酵素若
しくはその相同変異体をコードするものであるかぎり、
遺伝子コードの縮重に基づき、塩基の１個又は２個以上
が他の塩基に置き換わったものをも包含するものとす
る。

【００４３】また、現在の組換えＤＮＡ技術に依るとき
には、一般に５′末端からの塩基配列が決まれば、これ
に相補的な塩基配列は一義的に定まる。したがって、こ
の発明のＤＮＡは、上記いずれかの塩基配列に相補的な
塩基配列を有するものも包含するものとする。なお、こ
の発明のＤＮＡが宿主中で実際に当該酵素の産生を発現
するために、当該酵素又はその相同変異体をコードする
塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で
適宜置換し得ることは言うまでもない。

【００４４】この発明のＤＮＡは上記のごときものであ
るが、この発明のＤＮＡは、それが前記のごとき配列を
有するかぎり、それが天然に由来するものか人為的に合
成されたものであるかは問わない。天然の給源として
は、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１（ＦＥ
ＲＭＢＰ−４１３０）、アルスロバクター・スピーシ
ーズＱ３６（ＦＥＲＭＢＰ−４３１６）、ブレビバク
テリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１８２２）及びミク
ロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８６）を含むリゾビ
ウム属、アルスロバクター属、ブレビバクテリウム属、
ミクロコッカス属の微生物が挙げられ、これら微生物の
菌体からはこの発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。
すなわち、斯かる微生物を栄養培地に植菌し、好気的条
件下で約１乃至３日間培養後、培養物から菌体を採取
し、リゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素や超音波で処理することにより当該ＤＮＡを含む遺伝
子を菌体外に溶出させる。このとき、細胞壁溶解酵素に
プロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵素を併用したり、
菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなどの界面活性剤を共
存させたり凍結融解してもよい。斯くして得られる処理
物に、例えば、フェノール抽出、アルコール沈澱、遠心
分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理などの
斯界における通常一般の方法を適用すれば目的のＤＮＡ
が得られる。

【００４５】一方、この発明のＤＮＡを人為的に合成す
るには、例えば、配列表における配列番号３又は４に示
す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における
配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮ
Ａとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体
を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体から当該
ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。

【００４６】さて、この発明は、本来、当該酵素を産生
しないけれども、比較的容易に増殖させることのできる
微生物や動植物に導入すると当該酵素の産生を発現する
複製可能な組換えＤＮＡに係わるものでもある。斯かる
組換えＤＮＡは、通常、前述のごときＤＮＡと自律複製
可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、
通常一般の方法により比較的容易に調製することができ
る。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃ１８、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐ
ＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲ
ｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターや
λｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５
などのファージベクターが挙げられ、このうち、この発
明のＤＮＡを大腸菌で発現させるにはｐＢＲ３２２、ｐ
ＵＣ１８、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、λ
ｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草
菌で発現させるにはｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９
４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１
４、ＴＲｐ７、ＴＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡ
を２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。

【００４７】斯かるベクターにこの発明のＤＮＡを挿入
するには、斯界において通常一般の方法が採用される。
具体的には、先ず、この発明のＤＮＡを含む遺伝子と自
律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波に
より切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片
とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチ
ドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制
限酵素、詳細には、Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、Ｘｂａ
Ｉ、ＳａｃＩ、ＰｓｔＩなどを使用すれば、ＤＮＡ
断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ
断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両
者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリ
ガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤ
ＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培
養することにより無限に複製可能である。

【００４８】この発明による組換えＤＮＡは、大腸菌、
枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主微生物に
導入することができる。宿主が大腸菌の場合には、宿主
を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で培養すれ
ばよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コンピテント
セル法やプロトプラスト法を適用すればよい。形質転換
体をクローニングするには、コロニーハイブリダイゼー
ション法を適用するか、末端にトレハロース構造を有す
るグルコース重合度３以上の非還元性糖質を含む栄養培
地で培養し、該非還元性糖質よりトレハロースを遊離す
るものを選択すればよい。

【００４９】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培
地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、
必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を
補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源
としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコー
ス、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、
例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝
酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティ
ープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙
げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養
培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、
通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養
すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物
は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使
用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素に
より菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素
を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には
酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例え
ば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜
組合せて適用すればよい。

【００５０】前述のとおり、当該酵素は、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性
糖質からトレハロースを遊離するという、従来の酵素に
は見られない顕著な作用を有する。当該酵素のこの作用
を利用することにより、α−グルコシルトレハロース、
α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシルト
レハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース、α
−マルトペンタオシルトレハロースなどの一連の非還元
性糖質からトレハロースを収量良く、効率的に得ること
ができる。これら非還元性糖質は、特願平５−３４９２
１６号明細書に開示された非還元性糖質生成酵素を使用
することにより、澱粉又はアミロース、アミロペクチン
などの澱粉質に酸及び／又はアミラーゼを作用して得ら
れる澱粉加水分解物から好収量で得ることができる。し
たがって、当該酵素と特願平５−３４９２１６号明細書
に開示された非還元性糖質生成酵素を組合せて使用する
ことにより、澱粉又は澱粉質を原料に、従来大量入手の
難しかったトレハロースが比較的容易に所望量得られる
こととなる。

【００５１】以下、２〜３の実施例に基づき、この発明
を具体的に説明するが、これら実施例で用いる手法自体
は斯界において公知のものであり、例えば、ジェー・サ
ムブルック等『モレキュラー・クローニング・ア・ラボ
ラトリー・マニュアル』、第２版、１９８９年、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス発行
などにも詳述されている。

【００５２】

【実施例１リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来の
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】

【００５３】

【実施例１−１染色体ＤＮＡの調製】リゾビウム・ス
ピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロ
ス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転
振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離
し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチー
ムを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間
インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結
後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温
し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠
心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エ
タノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、Ｓ
ＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼ
とプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加
え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。そ
の後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール
混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加
え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。この
ようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌ
になるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶
液を−８０℃で凍結した。

【００５４】

【実施例１−２組換えＤＮＡｐＢＭＵ２７と形質転
換体ＢＭＵ２７の調製】実施例１−１で得た精製染色体
ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて
染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法
により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮ
Ａ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を１μｇとり、常法に
より制限酵素ＢａｍＨＩを作用させて完全に切断した
後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮ
Ａ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組
換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕ
ｒｉａｎＣｏｌｉＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加
え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣ
ブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすること
により、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００５５】上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／
ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７
℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培
地上に形成された約６，０００個のコロニーをナイロン
膜上に固定した。別途、常法により、配列表における配
列番号９に示すアミノ酸配列における第８乃至１３番目
のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏで
表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＡＴＨＴＧＧ
ＧＣＮＣＣ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化
学合成し、同位体³²Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固
定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕
著な会合が認められた１４種類の形質転換体を選択し
た。

【００５６】その後、常法により、これら１４種類の形
質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配
列番号１０に示すアミノ酸配列における第２乃至６番目
のＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａで表される
配列に基づき化学合成した５′−ＧＡＹＴＧＧＧＣＮＧ
ＡＲＧＣ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー
・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９
７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズ
させ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを
選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形
質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＵ２７』又は『ＢＭＵ
２７』と命名した。

【００５７】上記で得た形質転換体ＢＭＵ２７をアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ
７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取
し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外
に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したと
ころ、組換えＤＮＡｐＢＭＵ２７は約５，７００塩基
対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を
有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコード
する１，７６７塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶによる切断部位付近の下流に位置していること
が判明した。

【００５８】

【実施例１−３形質転換体ＢＭＵ２７による酵素の産
生】松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃
４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／
ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナト
リウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１
％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、ア
ンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間
加熱滅菌し、冷却後、実施例１−２で得た形質転換体Ｂ
ＭＵ２７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し
た。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離に
より不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したとこ
ろ、培養物１ｌ当たりに換算して、約４，０００単位の
酵素が産生していた。

【００５９】別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕ
ｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシ
リン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、リゾビウム
・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設
定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活
性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１
１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約２，０００単
位と、形質転換体ＢＭＵ２７と比較して有意に低いもの
であった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕ
ｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。

【００６０】その後、形質転換体ＢＭＵ２７が産生した
酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を
調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分子量値約５７，０００乃至６８，０００ダルトン
を、また、等電点電気泳動で約３．３乃至４．６に等電
点を示すなど、酵素Ｍ−１１と同様の理化学的性質を有
することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術に
よっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有
意に向上することを示唆している。

【００６１】

【実施例２リゾビウム・スピーシーズＭ
−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、
アミノ酸配列の決定】実施例１−２で得た組換えＤＮＡ
ｐＢＭＵ２７を、常法に従って、各種制限酵素で分解
し、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）にサブク
ローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら
塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタ
ノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱
を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化
学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏ
ｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと２０ｍＭ塩化
ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベー
トしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、
［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌ
と、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単
位／ｍｌのＴ７ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２
５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー
１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖
ＤＮＡを生成させた。

【００６２】次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応
物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ
ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．
５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応さ
せ、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロム
フェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシ
アノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液
を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水溶中
で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲ
ル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電
気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲ
ルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーし
た。

【００６３】ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解
析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５
に示す２，１６１塩基対からなる塩基配列を含んでいる
ことが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであ
り、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９
又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部
分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端
アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第８
乃至２７番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部
分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第
１０乃至３０番目又は第４９３乃至５０９番目の配列に
一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列
番号１のアミノ酸配列を有するものであり、リゾビウム
・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１が配
列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡにより
コードされていることを示している。

【００６４】

【実施例３アルスロバクター・スピーシーズＱ３６由
来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】

【００６５】

【実施例３−１染色体ＤＮＡの調製】実施例１−１と
同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から
染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌにな
るようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０
℃で凍結した。

【００６６】

【実施例３−２組換えＤＮＡｐＢＲＴ３２と形質転
換体ＢＲＴ３２の調製】実施例３−１で得た精製染色体
ＤＮＡ溶液を実施例１−２と同様に部分切断した後、蔗
糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００
塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実施例１−
２と同様に制限酵素ＢａｍＨＩによるベクターＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の消化物に連結し、
得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導
入した。得られた形質転換体を実施例１−２と同様に５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクト
シドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約５，００
０個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表
における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第５
乃至１０番目のＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａで表される配列に基づき５′−ＡＴＧＧＧＮ
ＴＧＧＧＡＹＣＣＮＧＣ−３′で表される塩基配列のプ
ローブ３を化学合成し、同位体³²Ｐで標識後、前記ナイ
ロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダ
イズさせ、顕著な会合が認められた１０種類の形質転換
体を選択した。

【００６７】実施例１−２と同様にして、これら１０種
類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、これに配列
表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第
８乃至１２番目のＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａ
ｌａで表される配列に基づき化学合成した５′−ＴＡＹ
ＧＡＹＧＴＮＴＧＧＧＣ−３′で表される塩基配列のプ
ローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組
換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換
えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＲＴ３２』
又は『ＢＲＴ３２』と命名した。

【００６８】その後、この形質転換体ＢＲＴ３２をアン
ピシリンを含むＬ−ブロス培地で実施例１−２と同様に
培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶
出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡｐＢ
ＲＴ３２は約６，２００塩基対からなり、図１０に示す
制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示
すように、酵素Ｑ３６をコードする１，７９１塩基対か
らなるＤＮＡは、制限酵素ＫｐｎＩによる切断部位付
近の下流に位置していることが判明した。

【００６９】

【実施例３−３形質転換体ＢＲＴ３２による酵素の産
生】松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃
４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／
ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナト
リウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１
％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、ア
ンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間
加熱滅菌し、冷却後、実施例３−２で得た形質転換体Ｂ
ＲＴ３２を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し
た。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離に
より不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したとこ
ろ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，９００単位の
酵素が産生していた。

【００７０】別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕ
ｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアン
ピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルス
ロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３
０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処
理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピ
ーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約
１，８００単位と、形質転換体ＢＲＴ３２と比較して有
意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌Ｘ
ＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。

【００７１】その後、形質転換体ＢＲＴ３２が産生した
酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を
調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分子量値約５７，０００乃至６８，０００ダルトン
を、また、等電点電気泳動で約３．３乃至４．６に等電
点を示すなど、酵素Ｑ３６と同様の理化学的性質を有す
ることが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によ
っても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意
に向上することを示唆している。

【００７２】

【実施例４アルスロバクター・スピーシ
ーズＱ３６に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配
列、アミノ酸配列の決定】実施例３−２で得た組換えＤ
ＮＡｐＢＲＴ３２を実施例２と同様に処理してテンプ
レートＤＮＡとし、これをプライマー１とともにアニー
リング後、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライ
マー１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相
補鎖ＤＮＡを生成させた。実施例２と同様に、この相補
鎖ＤＮＡにジデオキシ・チェーン・ターミネータ法を適
用し、ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した
結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す
２，０５６塩基対からなる塩基配列を含んでいることが
判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は
配列表における配列番号６に併記したとおりであり、こ
のアミノ酸配列と配列表における配列番号８、１１又は
１２に示すＮ末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比
較したところ、配列番号８のＮ末端アミノ酸配列は配列
表における配列番号６における第２乃至２１番目の配列
に、また、配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は
配列表における配列番号６における第４７０乃至４８９
番目又は第１１乃至３０番目の配列に一致した。これ
は、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号２のアミノ酸
配列を有するものであり、アルスロバクター・スピーシ
ーズＱ３６においては、酵素Ｑ３６が配列表における配
列番号４に示す塩基配列のＤＮＡによりコードされてい
ることを示している。

【００７３】

【発明の効果】以上説明したように、この発明は、末端
にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の
非還元性糖質からトレハロースを遊離する、従来未知の
全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明
は、組換えＤＮＡ技術により斯かる酵素を大規模且つ効
率的に生産する道を拓くものである。しかも、この発明
による形質転換体が産生する酵素は、全アミノ酸配列ま
でが明らかにされた酵素であり、食品等への配合使用を
前提とするトレハロースの製造に安心して使用し得るも
のである。

【００７４】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な
発明であると言える。

【００７５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：589 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Glu Met Gly Arg Arg 20 25 30 Pro Gly Asn Gly Pro Ala Asp Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ala Asp Ala Pro 35 40 45 50 Thr Gly Ala Asp Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ile Pro 55 60 65 Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Glu Gly Val His Ala Leu Ser 70 75 80 85 Arg Thr Phe Asp Pro Gly Ala His Arg Trp Gln Asp Ala Gly Trp Gln Gly 90 95 100 Arg Glu Leu Gln Gly Ser Val Ile Tyr Glu Leu His Ile Gly Thr Phe Thr 105 110 115 Pro Glu Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly 120 125 130 135 Leu Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr 140 145 150 His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Gly Tyr 155 160 165 170 Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly 175 180 185 Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn 190 195 200 Tyr Leu Pro Arg Tyr Gly Pro Tyr Leu Lys His Gly Glu Gly Asn Thr Trp 205 210 215 220 Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp His Val Arg Gln Tyr 225 230 235 Ile Leu Asp Asn Val Ala Met Trp Leu Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu 240 245 250 255 Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu 260 265 270 Glu Glu Phe Gly Ala Leu Ala Asp Ala Leu Ser Ser Glu Gly Gly Arg Pro 275 280 285 Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro 290 295 300 305 Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His 310 315 320 His Ala Val His Val Asn Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp 325 330 335 340 Phe Asp Ser Leu Gly Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His 345 350 355 Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Gly Arg Cys His Gly Arg Pro Ile Asn 360 365 370 Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp 375 380 385 390 Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro Tyr 395 400 405 Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro 410 415 420 425 Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Pro Trp Gln Phe Phe 430 435 440 Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile 445 450 455 Arg Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln 460 465 470 475 Asp Pro Glu Thr Phe Thr Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ser Ala 480 485 490 Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser Leu Ile Thr Leu Arg 495 500 505 510 Arg Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Leu Gly Phe Ala Asp Thr Ala Val Glu 515 520 525 Phe Asp Asp Asp Ala Arg Trp Leu Arg Tyr Trp Arg Gly Gly Val Gln Val 530 535 540 Val Leu Asn Phe Ala Asp Arg Pro Ile Ser Leu Asp Arg Pro Gly Thr Ala 545 550 555 560 Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala Val Arg Met Asp Gly Val Gln Val Glu 565 570 575 Leu Pro Pro Leu Ser Ala Ala Val Leu Arg Asp 580 585

【００７６】配列番号：2 配列の長さ：597 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly 20 25 30 Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro Glu Asp Ala Gly 35 40 45 50 Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn Val Asp Tyr Gly Tyr 55 60 65 Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln 70 75 80 85 Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser 90 95 100 Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr 105 110 115 Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala 120 125 130 135 Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu 140 145 150 Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln 155 160 165 170 Trp Phe Ala Val His Glu Asp Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe 175 180 185 Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr 190 195 200 Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu 205 210 215 220 Lys Gln Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro 225 230 235 Gly Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu 240 245 250 255 Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys 260 265 270 Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala Asp Gln 275 280 285 Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu 290 295 300 305 Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Glu 310 315 320 Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn Val Thr Gly 325 330 335 340 Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu Ala Ala Leu Ala Lys 345 350 355 Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu 360 365 370 Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu 375 380 385 390 Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp 395 400 405 Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu 410 415 420 425 Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly 430 435 440 Ala Ser Thr Pro Trp Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly 445 450 455 Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp 460 465 470 475 Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys 480 485 490 Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu 495 500 505 510 Tyr Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu 515 520 525 Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu Arg 530 535 540 Phe Arg Arg Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln Pro Val 545 550 555 560 Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala Val 565 570 575 Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser Ala Ala Val Val 580 585 590 595 Ser Asp

【００７７】配列番号：3 配列の長さ：1767 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 GCCAAGCCGG TGCAGGGAGC GGGGCGCTTC GATATCTGGG CGCCCGAGGC AGGCACCGTA 60 ACGCTGCTGG CCGGCGGGGA GCGCTACGAG ATGGGCCGCC GCCCCGGCAA CGGGCCGGCG 120 GACGAAGGCT GGTGGACGGC CGCGGATGCA CCGACAGGCG CGGACGTGGA CTACGGATAC 180 CTGCTCGACG GCGACGAAAT CCCGCTGCCG GACCCCCGGA CCCGCCGCCA GCCCGAAGGC 240 GTCCATGCCC TGTCCCGGAC CTTCGACCCC GGCGCCCACC GCTGGCAGGA CGCCGGGTGG 300 CAGGGCAGGG AACTCCAGGG CTCCGTGATT TACGAACTCC ACATCGGAAC GTTCACGCCG 360 GAAGGGACGC TGGACGCCGC CGCGGGCAAG CTGGACTACC TCGCCGGCCT GGGCATCGAC 420 TTCATTGAGC TGCTGCCCGT GAATGCCTTC AACGGCACGC ACAACTGGGG CTACGACGGC 480 GTCCAGTGGT TTGCCGTGCA TGAAGGCTAC GGCGGGCCTG CGGCGTACCA GCGGTTCGTG 540 GATGCGGCCC ACGCGGCCGG CCTCGGCGTC ATCCAGGACG TGGTCTACAA CCACCTCGGG 600 CCGAGCGGGA ACTACCTCCC CAGGTACGGC CCGTACCTCA AGCACGGCGA AGGCAACACC 660 TGGGGCGATT CGGTCAACCT GGACGGGCCG GGATCCGACC ACGTCCGCCA GTACATCCTG 720 GACAACGTGG CCATGTGGCT GCGCGACTAC CGGGTGGACG GCCTCCGCCT GGACGCCGTC 780 CACGCCCTGA AGGATGAGCG GGCCGTCCAC ATCCTGGAGG AGTTCGGCGC GCTGGCGGAC 840 GCCCTGTCGT CCGAAGGCGG CCGCCCGCTG ACCCTCATCG CCGAGTCCGA CCTCAACAAT 900 CCGCGGCTGC TGTACCCCCG GGATGTCAAC GGCTACGGAC TGGCCGGCCA GTGGAGCGAC 960 GACTTCCACC ACGCCGTGCA CGTCAACGTC AGCGGGGAAA CCACCGGCTA CTACAGCGAC 1020 TTCGACTCGC TCGGAGCCCT CGCCAAGGTC CTGCGTGACG GGTTCTTCCA CGACGGCAGC 1080 TACTCCAGCT TCCGCGGCCG CTGCCACGGC CGGCCGATCA ACTTCAGCGC CGTGCATCCG 1140 GCCGCGCTGG TGGTCTGCTC ACAGAACCAT GACCAGATCG GCAACCGGGC CACCGGGGAC 1200 CGGCTGTCCC AGTCACTTCC GTACGGCAGC CTGGCCCTGG CCGCCGTGCT GACCCTCACC 1260 GGTCCGTTCA CGCCCATGCT GTTCATGGGA GAGGAATACG GGGCCACCAC CCCGTGGCAG 1320 TTCTTCACCT CGCACCCTGA ACCCGAGCTG GGCAAGGCCA CGGCCGAGGG CAGGATCAGG 1380 GAGTTCGAGC GCATGGGGTG GGATCCCGCC GTCGTGCCCG ATCCGCAGGA TCCGGAGACC 1440 TTCACCCGCT CCAAACTGGA CTGGGCGGAA GCGTCCGCCG GCGATCATGC CCGCCTCCTG 1500 GAGCTGTACC GCTCGCTTAT CACGCTGCGG CGGTCAACTC CGGAGCTCGC GCGCCTGGGC 1560 TTTGCGGACA CCGCCGTCGA GTTCGACGAC GACGCCCGCT GGCTCCGTTA TTGGCGCGGA 1620 GGCGTGCAGG TGGTGCTGAA CTTCGCGGAC CGTCCCATCA GCCTGGACCG GCCGGGAACC 1680 GCGCTGCTGC TCGCCACCGA CGACGCCGTC CGGATGGACG GAGTCCAGGT GGAGCTGCCG 1740 CCGCTGAGCG CCGCGGTTCT GCGCGAC 1767

【００７８】配列番号：4 配列の長さ：1791 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ACGCACACCT ACCCGCGGGA AGCCGCGAAA CCCGTCCTGG GCCCCGCACG CTACGACGTC 60 TGGGCGCCCA ACGCTGAATC CGTGACGCTG CTGGCCGGCG GGGAGCGCTA CGCCATGCAG 120 CGCCGGGCCG AGACCGGGCC GGAGGACGCC GGCTGGTGGA CCGCCGCCGG CGCGCCTACG 180 GATGGCAACG TGGACTACGG GTACCTTCTG GACGGCGACG AAACACCGCT TCCGGATCCA 240 CGGACCCGCC GCCAGCCCGA CGGCGTCCAC GCCCTGTCCC GCACGTTCGA CCCGTCCGCG 300 TACAGCTGGC AGGACGACGC CTGGCAGGGC AGGGAACTGC AGGGCGCCGT CATCTACGAG 360 CTCCACCTCG GAACATTCAC GCCCGAAGGG ACGCTGGAGG CGGCCGCCGG AAAGCTGGAC 420 TACCTCGCCG GCTTGGGCGT CGACTTCATC GAGCTGCTGC CGGTGAACGC TTTCAACGGC 480 ACGCACAACT GGGGTTACGA CGGTGTCCAG TGGTTCGCTG TGCACGAGGC ATACGGCGGG 540 CCGGAAGCGT ACCAGCGGTT CGTCGACGCC GCCCACGCCG CAGGCCTTGG CGTGATCCAG 600 GACGTGGTCT ACAACCACCT CGGCCCCAGC GGGAACTACC TGCCGCGGTT CGGGCCGTAC 660 CTCAAGCAGG GCGAGGGTAA CACGTGGGGC GACTCGGTGA ACCTGGACGG GCCCGGCTCC 720 GACCATGTGC GCCGGTACAT CCTGGACAAC CTGGCCATGT GGCTGCGTGA CTACCGGGTG 780 GACGGCCTGC GGCTGGACGC CGTCCACGCC CTGAAGGATG AGCGGGCGGT GCACATCCTG 840 GAGGACTTCG GGGCGCTGGC CGATCAGATC TCCGCCGAGG TGGGACGGCC GCTGACGCTC 900 ATCGCCGAGT CCGACCTCAA CAACCCGCGG CTGCTGTACC CGCGGGACGT CAACGGGTAC 960 GGGCTGGAAG GGCAGTGGAG CGACGACTTC CACCACGCCG TCCACGTCAA CGTCACCGGC 1020 GAAACCACCG GCTACTACAG TGACTTCGAC TCGCTGGCCG CCCTCGCCAA GGTGCTCCGG 1080 GACGGCTTCT TCCACGACGG CAGCTACTCC AGCTTCCGGG AACGCCACCA CGGACGGCCG 1140 ATTAATTTCA GCGCCGTACA CCCAGCCGCC CTGGTGGTCT GTTCGCAGAA CCACGACCAG 1200 ATCGGCAACC GTGCCACGGG GGACCGGCTC TCCCAGACCC TGCCGTACGG AAGCCTGGCC 1260 CTCGCTGCGG TGCTGACCCT GACGGGACCC TTCACGCCCA TGCTGCTCAT GGGCGAGGAG 1320 TACGGCGCCA GCACGCCGTG GCAGTTTTTC ACCTCGCACC CGGAGCCGGA GCTCGGCAAG 1380 GCCACCGCGG AGGGCCGGAT CAAGGAGTTC GAGCGCATGG GGTGGGATCC CGCCGTCGTG 1440 CCCGATCCCC AGGATCCTGA GACGTTCCGC CGGTCCAAGC TGGACTGGGC GGAAGCCGCC 1500 GAAGGCGACC ATGCCCGGCT GCTGGAGCTG TACCGTTCGC TCACCGCCCT GCGCCGCTCC 1560 ACGCCGGACC TCACCAAGCT GGGCTTCGAG GACACGCAGG TGGCGTTCGA CGAGGACGCC 1620 CGCTGGCTGC GGTTCCGCCG GGGTGGCGTG CAGGTGCTGC TCAACTTCTC GGAACAGCCC 1680 GTGAGCCTGG ACGGGGCGGG CACGGCCCTG CTGCTGGCCA CCGACGACGC CGTCCGGCTA 1740 GAAGGTGAGC GTGCGGAACT CGGTCCGCTG AGCGCCGCCG TCGTCAGCGA C 1791

【００７９】配列番号：5 配列の長さ：2161 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴起源生物名：リゾビウム・スピーシーズ(Rhizobium sp.) 株名：M-11(FERM BP-4130) 配列の特徴特徴を表わす記号：5´UTR 存在位置：1..206 特徴を決定した方法：E 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：207..1994 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：3´UTR 存在位置：1995..2161 特徴を決定した方法：E 配列 GGCGCCGGGG GAGTGCTGGC GCTTGCCACC CGGCTCCCCT ACGGGCTGGA ACAGTCGGGC 60 GGCTGGCGGG ACACCGCCGT CGAGCTTGAA GCCGCCATGA CGGACGAACT GACCGGCTCC 120 ACTTTCGGGC CGGGACCGGC GGCGCTGTCA GAAGTCTTCC GGGCCTACCC GGTGGCCTTG 180 TTGGTCCCCG CGACAGGAGG CAAGTC 206 ATG ACG CAG CCC AAC GAT GCG GCC AAG CCG GTG CAG GGA GCG GGG CGC 254 Met Thr Gln Pro Asn Asp Ala Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg 1 5 10 15 TTC GAT ATC TGG GCG CCC GAG GCA GGC ACC GTA ACG CTG CTG GCC GGC 302 Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala Gly Thr Val Thr Leu Leu Ala Gly 20 25 30 GGG GAG CGC TAC GAG ATG GGC CGC CGC CCC GGC AAC GGG CCG GCG GAC 350 Gly Glu Arg Tyr Glu Met Gly Arg Arg Pro Gly Asn Gly Pro Ala Asp 35 40 45 GAA GGC TGG TGG ACG GCC GCG GAT GCA CCG ACA GGC GCG GAC GTG GAC 398 Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ala Asp Ala Pro Thr Gly Ala Asp Val Asp 50 55 60 TAC GGA TAC CTG CTC GAC GGC GAC GAA ATC CCG CTG CCG GAC CCC CGG 446 Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ile Pro Leu Pro Asp Pro Arg 65 70 75 80 ACC CGC CGC CAG CCC GAA GGC GTC CAT GCC CTG TCC CGG ACC TTC GAC 494 Thr Arg Arg Gln Pro Glu Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp 85 90 95 CCC GGC GCC CAC CGC TGG CAG GAC GCC GGG TGG CAG GGC AGG GAA CTC 542 Pro Gly Ala His Arg Trp Gln Asp Ala Gly Trp Gln Gly Arg Glu Leu 100 105 110 CAG GGC TCC GTG ATT TAC GAA CTC CAC ATC GGA ACG TTC ACG CCG GAA 590 Gln Gly Ser Val Ile Tyr Glu Leu His Ile Gly Thr Phe Thr Pro Glu 115 120 125 GGG ACG CTG GAC GCC GCC GCG GGC AAG CTG GAC TAC CTC GCC GGC CTG 638 Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu 130 135 140 GGC ATC GAC TTC ATT GAG CTG CTG CCC GTG AAT GCC TTC AAC GGC ACG 686 Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr 145 150 155 160 CAC AAC TGG GGC TAC GAC GGC GTC CAG TGG TTT GCC GTG CAT GAA GGC 734 His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Gly 165 170 175 TAC GGC GGG CCT GCG GCG TAC CAG CGG TTC GTG GAT GCG GCC CAC GCG 782 Tyr Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala 180 185 190 GCC GGC CTC GGC GTC ATC CAG GAC GTG GTC TAC AAC CAC CTC GGG CCG 830 Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro 195 200 205 AGC GGG AAC TAC CTC CCC AGG TAC GGC CCG TAC CTC AAG CAC GGC GAA 878 Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Tyr Gly Pro Tyr Leu Lys His Gly Glu 210 215 220 GGC AAC ACC TGG GGC GAT TCG GTC AAC CTG GAC GGG CCG GGA TCC GAC 926 Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp 225 230 235 240 CAC GTC CGC CAG TAC ATC CTG GAC AAC GTG GCC ATG TGG CTG CGC GAC 974 His Val Arg Gln Tyr Ile Leu Asp Asn Val Ala Met Trp Leu Arg Asp 245 250 255 TAC CGG GTG GAC GGC CTC CGC CTG GAC GCC GTC CAC GCC CTG AAG GAT 1022 Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp 260 265 270 GAG CGG GCC GTC CAC ATC CTG GAG GAG TTC GGC GCG CTG GCG GAC GCC 1070 Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Glu Phe Gly Ala Leu Ala Asp Ala 275 280 285 CTG TCG TCC GAA GGC GGC CGC CCG CTG ACC CTC ATC GCC GAG TCC GAC 1118 Leu Ser Ser Glu Gly Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp 290 295 300 CTC AAC AAT CCG CGG CTG CTG TAC CCC CGG GAT GTC AAC GGC TAC GGA 1166 Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly 305 310 315 320 CTG GCC GGC CAG TGG AGC GAC GAC TTC CAC CAC GCC GTG CAC GTC AAC 1214 Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn 325 330 335 GTC AGC GGG GAA ACC ACC GGC TAC TAC AGC GAC TTC GAC TCG CTC GGA 1262 Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu Gly 340 345 350 GCC CTC GCC AAG GTC CTG CGT GAC GGG TTC TTC CAC GAC GGC AGC TAC 1310 Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly Ser Tyr 355 360 365 TCC AGC TTC CGC GGC CGC TGC CAC GGC CGG CCG ATC AAC TTC AGC GCC 1358 Ser Ser Phe Arg Gly Arg Cys His Gly Arg Pro Ile Asn Phe Ser Ala 370 375 380 GTG CAT CCG GCC GCG CTG GTG GTC TGC TCA CAG AAC CAT GAC CAG ATC 1406 Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp Gln Ile 385 390 395 400 GGC AAC CGG GCC ACC GGG GAC CGG CTG TCC CAG TCA CTT CCG TAC GGC 1454 Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro Tyr Gly 405 410 415 AGC CTG GCC CTG GCC GCC GTG CTG ACC CTC ACC GGT CCG TTC ACG CCC 1502 Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro 420 425 430 ATG CTG TTC ATG GGA GAG GAA TAC GGG GCC ACC ACC CCG TGG CAG TTC 1550 Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Pro Trp Gln Phe 435 440 445 TTC ACC TCG CAC CCT GAA CCC GAG CTG GGC AAG GCC ACG GCC GAG GGC 1598 Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Glu 450 455 460 AGG ATC AGG GAG TTC GAG CGC ATG GGG TGG GAT CCC GCC GTC GTG CCC 1646 Arg Ile Arg Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro 465 470 475 480 GAT CCG CAG GAT CCG GAG ACC TTC ACC CGC TCC AAA CTG GAC TGG GCG 1694 Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Thr Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala 485 490 495 GAA GCG TCC GCC GGC GAT CAT GCC CGC CTC CTG GAG CTG TAC CGC TCG 1742 Glu Ala Ser Ala Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser 500 505 510 CTT ATC ACG CTG CGG CGG TCA ACT CCG GAG CTC GCG CGC CTG GGC TTT 1790 Leu Ile Thr Leu Arg Arg Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Leu Gly Phe 515 520 525 GCG GAC ACC GCC GTC GAG TTC GAC GAC GAC GCC CGC TGG CTC CGT TAT 1838 Ala Asp Thr Ala Val Glu Phe Asp Asp Asp Ala Arg Trp Leu Arg Tyr 530 535 540 TGG CGC GGA GGC GTG CAG GTG GTG CTG AAC TTC GCG GAC CGT CCC ATC 1886 Trp Arg Gly Gly Val Gln Val Val Leu Asn Phe Ala Asp Arg Pro Ile 545 550 555 560 AGC CTG GAC CGG CCG GGA ACC GCG CTG CTG CTC GCC ACC GAC GAC GCC 1934 Ser Leu Asp Arg Pro Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala 565 570 575 GTC CGG ATG GAC GGA GTC CAG GTG GAG CTG CCG CCG CTG AGC GCC GCG 1982 Val Arg Met Asp Gly Val Gln Val Glu Leu Pro Pro Leu Ser Ala Ala 580 585 590 GTT CTG CGC GAC 1994 Val Leu Arg Asp 595 TGAGCGTGCG CGCCTTCGGG GCGGGCGTCC TTCCGGTGAC CGGATGCTGG ACGCCCGCCC 2054 CGCAGCTCCA CAGGCGCTGG CAGGATGGAA CGTATGACTT TTCTGGCAGC GGACAACCGC 2114 TACGAAACCA TGCCATACCG CCGCGTCGGA CGCAGCGGGC TGAAGCT 2161

【００８０】配列番号：6 配列の長さ：2056 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴起源生物名：アルスロバクター・スピーシーズ(Arthrobacte
r sp.) 株名：Q36(FERM BP-4316) 配列の特徴特徴を表わす記号：5´UTR 存在位置：1..89 特徴を決定した方法：E 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：90..1883 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：3´UTR 存在位置：1884..2056 特徴を決定した方法：E 配列 GCCGGCTTCG GACCGGGGGC AGTGAAGATC GCCGACATCT TCCGGTCGTT CCCCGTTGCG 60 CTGCTGGTGC CGCAGACAGG AGGAGAGTC 89 ATG ACG CAC ACC TAC CCG CGG GAA GCC GCG AAA CCC GTC CTG GGC CCC 137 Met Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro 1 5 10 15 GCA CGC TAC GAC GTC TGG GCG CCC AAC GCT GAA TCC GTG ACG CTG CTG 185 Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu 20 25 30 GCC GGC GGG GAG CGC TAC GCC ATG CAG CGC CGG GCC GAG ACC GGG CCG 233 Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro 35 40 45 GAG GAC GCC GGC TGG TGG ACC GCC GCC GGC GCG CCT ACG GAT GGC AAC 281 Glu Asp Ala Gly Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn 50 55 60 GTG GAC TAC GGG TAC CTT CTG GAC GGC GAC GAA ACA CCG CTT CCG GAT 329 Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp 65 70 75 80 CCA CGG ACC CGC CGC CAG CCC GAC GGC GTC CAC GCC CTG TCC CGC ACG 377 Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr 85 90 95 TTC GAC CCG TCC GCG TAC AGC TGG CAG GAC GAC GCC TGG CAG GGC AGG 425 Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg 100 105 110 GAA CTG CAG GGC GCC GTC ATC TAC GAG CTC CAC CTC GGA ACA TTC ACG 473 Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr 115 120 125 CCC GAA GGG ACG CTG GAG GCG GCC GCC GGA AAG CTG GAC TAC CTC GCC 521 Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala 130 135 140 GGC TTG GGC GTC GAC TTC ATC GAG CTG CTG CCG GTG AAC GCT TTC AAC 569 Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn 145 150 155 160 GGC ACG CAC AAC TGG GGT TAC GAC GGT GTC CAG TGG TTC GCT GTG CAC 617 Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His 165 170 175 GAG GCA TAC GGC GGG CCG GAA GCG TAC CAG CGG TTC GTC GAC GCC GCC 665 Glu Asp Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala 180 185 190 CAC GCC GCA GGC CTT GGC GTG ATC CAG GAC GTG GTC TAC AAC CAC CTC 713 His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu 195 200 205 GGC CCC AGC GGG AAC TAC CTG CCG CGG TTC GGG CCG TAC CTC AAG CAG 761 Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu Lys Gln 210 215 220 GGC GAG GGT AAC ACG TGG GGC GAC TCG GTG AAC CTG GAC GGG CCC GGC 809 Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly 225 230 235 240 TCC GAC CAT GTG CGC CGG TAC ATC CTG GAC AAC CTG GCC ATG TGG CTG 857 Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu 245 250 255 CGT GAC TAC CGG GTG GAC GGC CTG CGG CTG GAC GCC GTC CAC GCC CTG 905 Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu 260 265 270 AAG GAT GAG CGG GCG GTG CAC ATC CTG GAG GAC TTC GGG GCG CTG GCC 953 Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala 275 280 285 GAT CAG ATC TCC GCC GAG GTG GGA CGG CCG CTG ACG CTC ATC GCC GAG 1001 Asp Gln Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu 290 295 300 TCC GAC CTC AAC AAC CCG CGG CTG CTG TAC CCG CGG GAC GTC AAC GGG 1049 Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly 305 310 315 320 TAC GGG CTG GAA GGG CAG TGG AGC GAC GAC TTC CAC CAC GCC GTC CAC 1097 Tyr Gly Leu Glu Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His 325 330 335 GTC AAC GTC ACC GGC GAA ACC ACC GGC TAC TAC AGT GAC TTC GAC TCG 1145 Val Asn Val Thr Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser 340 345 350 CTG GCC GCC CTC GCC AAG GTG CTC CGG GAC GGC TTC TTC CAC GAC GGC 1193 Leu Ala Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly 355 360 365 AGC TAC TCC AGC TTC CGG GAA CGC CAC CAC GGA CGG CCG ATT AAT TTC 1241 Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe 370 375 380 AGC GCC GTA CAC CCA GCC GCC CTG GTG GTC TGT TCG CAG AAC CAC GAC 1289 Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp 385 390 395 400 CAG ATC GGC AAC CGT GCC ACG GGG GAC CGG CTC TCC CAG ACC CTG CCG 1337 Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro 405 410 415 TAC GGA AGC CTG GCC CTC GCT GCG GTG CTG ACC CTG ACG GGA CCC TTC 1385 Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe 420 425 430 ACG CCC ATG CTG CTC ATG GGC GAG GAG TAC GGC GCC AGC ACG CCG TGG 1433 Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Trp 435 440 445 CAG TTT TTC ACC TCG CAC CCG GAG CCG GAG CTC GGC AAG GCC ACC GCG 1481 Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala 450 455 460 GAG GGC CGG ATC AAG GAG TTC GAG CGC ATG GGG TGG GAT CCC GCC GTC 1529 Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val 465 470 475 480 GTG CCC GAT CCC CAG GAT CCT GAG ACG TTC CGC CGG TCC AAG CTG GAC 1577 Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp 485 490 495 TGG GCG GAA GCC GCC GAA GGC GAC CAT GCC CGG CTG CTG GAG CTG TAC 1625 Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr 500 505 510 CGT TCG CTC ACC GCC CTG CGC CGC TCC ACG CCG GAC CTC ACC AAG CTG 1673 Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu 515 520 525 GGC TTC GAG GAC ACG CAG GTG GCG TTC GAC GAG GAC GCC CGC TGG CTG 1721 Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu 530 535 540 CGG TTC CGC CGG GGT GGC GTG CAG GTG CTG CTC AAC TTC TCG GAA CAG 1769 Arg Phe Arg Arg Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln 545 550 555 560 CCC GTG AGC CTG GAC GGG GCG GGC ACG GCC CTG CTG CTG GCC ACC GAC 1817 Pro Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp 565 570 575 GAC GCC GTC CGG CTA GAA GGT GAG CGT GCG GAA CTC GGT CCG CTG AGC 1865 Asp Ala Val Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser 580 585 590 GCC GCC GTC GTC AGC GAC 1883 Ala Ala Val Val Ser Asp 595 TGACGTTTTC TTGGGGGCGG CGTCCACCGC CGGTGACCGG ATGGTGGACG TCCGCCCCGA 1943 AGCCTCGGCG CGGCTGGCAG GATGGAACGC ATGACTTATG TGGCCTCGGA CACCCGCTAC 2003 GACACCATGC CCTACCGCCG CGTCGGACGC AGCGGCCTCA AACTGCCGGC CAT 2056

【００８１】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列 Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Gly Thr Val 20

【００８２】配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列 Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Val 20

【００８３】配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala Gly Thr 1 5 10 15 Val Thr Leu Leu 20

【００８４】配列番号：10 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ser Ala Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu 1 5 10 15

【００８５】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp 1 5 10 15 Pro Glu Thr 20

【００８６】配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Thr Leu 20

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。

【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。

【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。

【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。

【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。

【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。

【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。

【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。

【図９】この発明による組換えＤＮＡｐＢＭＵ２７の
制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した部
分は酵素Ｍ−１１をコードするＤＮＡである。

【図１０】この発明による組換えＤＮＡｐＢＲＴ３２
の制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した
部分は酵素Ｑ３６をコードするＤＮＡである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:06）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】末端にトレハロース構造を有するグルコ
ース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊
離する酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】酵素が下記の理化学的性質を有する請求
項１に記載のＤＮＡ。（１）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（２）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
【請求項３】酵素が配列表における配列番号１又は２
に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列を有
する請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】ＤＮＡが配列表における配列番号３又は
４に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれら
に相補的な塩基配列を有する請求項１、２又は３に記載
のＤＮＡ。
【請求項５】遺伝子コードの縮重に基づき、配列表に
おける配列番号１又は２に示すアミノ酸配列を変えるこ
となく、配列表における配列番号３又は４に示す塩基配
列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換し
た請求項１、２、３又は４に記載のＤＮＡ。
【請求項６】配列表における配列番号５又は６に示す
塩基配列を有する請求項１、２、３、４又は５に記載の
ＤＮＡ。
【請求項７】リゾビウム属、アルスロバクター属、ブ
レビバクテリウム属又はミクロコッカス属の微生物に由
来する請求項１、２、３、４、５又は６に記載のＤＮ
Ａ。
【請求項８】請求項１に記載のＤＮＡと自律複製可能
なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項９】ＤＮＡのコードする酵素が下記の理化学
的性質を有する請求項８に記載の複製可能な組換えＤＮ
Ａ。（１）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（２）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
【請求項１０】酵素が配列表における配列番号１又は
２に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列を
有する請求項８又は９に記載の複製可能な組換えＤＮ
Ａ。
【請求項１１】ＤＮＡが配列表における配列番号３又
は４に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれ
らに相補的な塩基配列を有する請求項８、９又は１０に
記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１２】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配
列を変えることなく、配列表における配列番号３又は４
に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の
塩基で置換したものである請求項８、９、１０又は１１
に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１３】ＤＮＡが配列表における配列番号５又
は６に示す塩基配列を有する請求項８、９、１０、１１
又は１２に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１４】ＤＮＡがリゾビウム属、アルスロバク
ター属、ブレビバクテリウム属又はミクロコッカス属の
微生物に由来する請求項８、９、１０、１１、１２又は
１３に記載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１５】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）であ
る請求項８、９、１０、１１、１２、１３又は１４に記
載の複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１６】請求項１に記載のＤＮＡと自律複製可
能なベクターを含んでなる組換えＤＮＡを適宜宿主に導
入してなる形質転換体。
【請求項１７】ＤＮＡのコードする酵素が下記の理化
学的性質を有する請求項１６に記載の形質転換体。（１）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（２）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
【請求項１８】酵素が配列表における配列番号１又は
２に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列を
有する請求項１６又は１７に記載の形質転換体。
【請求項１９】ＤＮＡが配列表における配列番号３又
は４に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれ
らに相補的な塩基配列を有する請求項１６、１７又は１
８に記載の形質転換体。
【請求項２０】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配
列を変えることなく、配列表における配列番号３又は４
に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の
塩基で置換したものである請求項１６、１７、１８又は
１９に記載の形質転換体。
【請求項２１】ＤＮＡが配列表における配列番号５又
は６に示す塩基配列を有する請求項１６、１７、１８、
１９又は２０に記載の形質転換体。
【請求項２２】ＤＮＡがリゾビウム属、アルスロバク
ター属、ブレビバクテリウム属又はミクロコッカス属の
微生物に由来する請求項１６、１７、１８、１９、２０
又は２１に記載の形質転換体。
【請求項２３】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）であ
る請求項１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２
に記載の形質転換体。
【請求項２４】宿主が大腸菌である請求項１６、１
７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３に記載の形
質転換体。