JPH07298880A

JPH07298880A - 組換え型酵素とその製造方法並びに用途

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Publication number: JPH07298880A
Application number: JP7072533A
Authority: JP
Inventors: Michio Kubota; 倫夫久保田; Keiji Tsusaki; 桂二津▲さき▼; Kazuko Hattori; 和子服部; Toshiyuki Sugimoto; 利行杉本
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-03-07
Publication date: 1995-11-14
Anticipated expiration: 2019-09-02
Also published as: JP3559609B2

Abstract

(57)【要約】【目的】末端にトレハロース構造を有するグルコース
重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離す
る組換え型酵素と、その酵素の製造方法並びに用途を提
供する。【構成】特定の作用を有する組換え型酵素と、その組
換え型酵素を産生する形質転換体を培養し、培養物から
組換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法と、末
端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上
の非還元性糖質に組換え型酵素を作用させてその非還元
性糖質からトレハロースを遊離させる工程を含んでなる
非還元性糖質の変換方法を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質か
らトレハロースを遊離する組換え型酵素と、その製造方
法並びに用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】トレハロースは、グルコース２分子が還
元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真
菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分
子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で
加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の
懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしな
がら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難し
く、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなか
った。

【０００３】これまでの製造方法は、微生物の菌体を利
用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに
大別される。前者の方法は、特開昭５０−１５４４８５
号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生
物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロ
ースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開
昭５８−２１６６９５号公報などにも見られるように、
基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォス
フォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼから
なる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系
外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのもの
の増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から
採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に
含まれるトレハロースが１５％（ｗ／ｗ）と僅少である
という問題があった。後者の方法は、トレハロースその
ものの分離は比較的容易なものの、反応自体が２種類の
酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グ
ルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度に
して反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理
的に難しかった。

【０００４】斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖か
らトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき
鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１
１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６などの微生
物がグルコース重合度３以上の還元性澱粉糖から末端に
トレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するとい
う、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明し
た。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同
じくリゾビウム・スピーシーズＭ−１１やアルスロバク
ター・スピーシーズＱ３６などが産生する別の酵素によ
り、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び／又は
マルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これ
ら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のト
レハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハ
ロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期
待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズＭ
−１１もアルスロバクター・スピーシーズＱ３６もこれ
ら酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にト
レハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造し
ようとすると、微生物を大量に培養しなければならない
という問題がある。

【０００５】一方、昨今の組換えＤＮＡ技術の進歩には
目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明
されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子
を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコ
ードするＤＮＡを含む組換えＤＮＡを作製し、これを微
生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培
養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得で
きるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコード
する遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急
務となっている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、組
換えＤＮＡ技術を応用して斯かる酵素を創製することに
ある。

【０００７】この発明の別の目的は、その創製された酵
素の製造方法を提供することにある。

【０００８】この発明のさらに別の目的は、その創製さ
れた酵素を使用する末端にトレハロース構造を有する非
還元性糖質の変換方法を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重
合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する
組換え型酵素により解決するものである。

【００１０】この発明は、前記第二の課題を、その組換
え型酵素を産生する形質転換体を培養し、培養物から組
換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法により解
決するものである。

【００１１】この発明は、前記第三の課題を、末端にト
レハロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還
元性糖質にその組換え型酵素を作用させて該非還元性糖
質からトレハロースを遊離させる工程を含んでなる非還
元糖質の変換方法により解決するものである。

【００１２】

【作用】この発明による組換え型酵素は、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性
糖質に作用してトレハロースを遊離する。

【００１３】この発明の製造方法にしたがって形質転換
体を培養すれば、所望量の組換え型酵素が比較的容易に
得られる。

【００１４】この発明の変換方法により、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性
糖質は、トレハロースとグルコース及び／又はマルトオ
リゴ糖からなる糖組成物に変換される。

【００１５】この発明は、末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハ
ロースを遊離する、従来未知の全く新規な酵素の発見に
基づくものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシ
ーズＭ−１１やアルスロバクター・スピーシーズＱ３６
の培養物から得ることができ、本発明者がカラムクロマ
トグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこ
の酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その
本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を
有することが判明した。（１）作用末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以
上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。（２）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（３）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）（４）至適温度ｐＨ７．０で３０分間インキュベートすると、３５乃至
４５℃付近に至適温度を示す。（５）至適ｐＨ４０℃で３０分間インキュベートすると、ｐＨ６．０乃
至７．５付近に至適ｐＨを示す。（６）熱安定性ｐＨ７．０で６０分間インキュベートすると、３０乃至
４５℃付近まで安定である。（７）ｐＨ安定性２５℃で１６時間インキュベートすると、ｐＨ５．５乃
至１０．０付近まで安定である。

【００１６】次に、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１
又はアルスロバクター・スピーシーズＱ３６が産生する
酵素（以下、それぞれ「酵素Ｍ−１１」又は「酵素Ｑ３
６」と言う。）の理化学的性質を解明すべく行なった実
験について説明する。

【００１７】

【実験例１酵素の精製】

【００１８】

【実験例１−１酵素Ｍ−１１の精製】５００ｍｌ容三
角フラスコに松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデ
ックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％
（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素
二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）及び燐酸二水素カリウ
ム０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を
１００ｍｌずつとり、１２０℃で２０分間オートクレー
ブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に
リゾビウム・スピーシーズＭ−１１を植菌し、回転振盪
下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジャ
ーファーメンタに上記と同組成の液体培地を２０ｌと
り、滅菌後、上記で得た種培養液を１％（ｖ／ｖ）接種
し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつつ、３０℃で２４
時間通気撹拌培養した。

【００１９】次に、上記で得た培養物約１８ｌを超高圧
菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採
取した上清約１６ｌに硫酸アンモニウムを２０％飽和に
なるように加え、４℃で１時間静置後、遠心分離により
沈澱部を除去した。得られた上清に６０％飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、４℃で２４時間静置後、
沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭ燐酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に対して２４時間透析後、遠心分離によ
り不溶物を除去した。得られた上清を予め１０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー
製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『ＤＥＡＥ−
トヨパール』に負荷し、０Ｍから０．５Ｍに上昇する塩
化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに１０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を通液した。溶出液より酵素を含む画
分を採取し、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１０時間透析後、遠心分
離により不溶物を除去した。その後、上清を予め２Ｍ硫
酸アンモニウムを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグ
ラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、２Ｍ
から０Ｍに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カ
ラムに５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を通液した。
溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化させておいた東ソー
製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパ
ールＨＷ−５５』に負荷し、カラムに５０ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）を通液し、溶出液から酵素を含む画分
を採取した。このようにして精製した酵素Ｍ−１１の比
活性は約２４０単位／ｍｇ蛋白質であり、収量は培養物
１ｌ当たり約６５０単位であった。

【００２０】なお、この発明を通じて、酵素の活性は次
の方法により測定した活性値（単位）で表示する。すな
わち、α−マルトトリオシルトレハロースを１．２５％
（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４
ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃で３０分
間インキュベートして反応させる。そして、反応液を１
ｍｌとり、ソモギ銅液２ｍｌに加えて反応を停止させた
後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。対照
には、予め１００℃で１０分間加熱して失活させた酵素
を上記と同様に処理する。当該酵素の１単位とは、上記
条件下において、１分間に１μｍｏｌのグルコースに相
当する還元力を増加させる酵素の量と定義する。

【００２１】

【実験例１−２酵素Ｑ３６の精製】実験例１−１と同
様にアルスロバクター・スピーシーズＱ３６を培養し、
培養物を処理したところ、比活性約４５０単位／ｍｇ蛋
白質の精製酵素Ｑ３６が、培養物１ｌ当たり、約６５０
単位の収量で得られた。

【００２２】

【実験例２酵素の理化学的性質】

【００２３】

【実験例２−１作用】特願平５−３４９２１６号明細
書に開示された方法により、α−グルコシルトレハロー
ス、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシ
ルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース
又はα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当た
り９８％以上含む非還元性糖質を調製した。そして、そ
のいずれかを基質として５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）に濃度２０％（ｗ／ｖ）になるように溶解し、溶液
に実験例１で得た精製酵素Ｍ−１１又は酵素Ｑ３６を基
質１ｇ当たり２単位加え、４０℃で４８時間反応させ
た。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液
体クロマトグラフィー用カラム『ＷＢ−Ｔ−３３０』に
負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『ＲＩ−
８０１２型』でモニターしながら、室温下にてカラムに
蒸留水を０．５ｍｌ／分の流速で通液することにより、
反応物に含まれる糖質を分離した。別途、非還元性糖質
に代えて高純度のマルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマル
トヘプタオースのいずれかを含む水溶液を上記と同様に
処理し、処理物を分析して対照とした。表１及び表２
に、それぞれ、Ｍ−１１及びＱ３６を加えた場合の基質
並びに反応物の糖組成を示す。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【表２】

【００２６】表１及び表２に示すように、酵素Ｍ−１１
及び酵素Ｑ３６は、末端にトレハロース構造を有するグ
ルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロース
とグルコース又はマルトオリゴ糖をほぼ定量的に遊離し
た。一方、グルコース重合度３以上のマルトオリゴ糖を
基質にすると、両酵素とも全く作用を示さなかった。こ
れらの事実は、当該酵素が末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度３以上の非還元性糖質に選択的に
作用し、そのトレハロース残基とグリコシル残基間のグ
リコシド結合を特異的に加水分解することを示唆してい
る。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規
な作用機序を辿るものと推定される。

【００２７】

【実験例２−２分子量】ユー・ケー・レムリが『ネー
チャー』、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０
年）に報告している方法に準じて精製酵素をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素Ｍ−１
１、酵素Ｑ３６とも、分子量約５７，０００乃至６８，
０００ダルトンに相当する位置に単一バンドを示した。
なお、このときの分子量マーカは、ミオシン（２００，
０００ダルトン）、β−ガラクトシダーゼ（１１６，２
５０ダルトン）、フォスフォリラーゼＢ（９７，４００
ダルトン）、血清アルブミン（６６，２００ダルトン）
及びオボアルブミン（４５，０００ダルトン）であっ
た。

【００２８】

【実験例２−３等電点】等電点電気泳動法により測定
したところ、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、約３．３
乃至４．６に等電点を示した。

【００２９】

【実験例２−４至適温度】常法により、５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）中で３０分間インキュベートする
条件で試験したところ、図１又は図２に示すように、酵
素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３５乃至４５℃付近に至
適温度を示した。

【００３０】

【実験例２−５至適ｐＨ】常法により、ｐＨの相違す
る５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、４０℃で３０分間イン
キュベートする条件で試験したところ、図３又は図４に
示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ６．
０乃至７．５付近に至適ｐＨを示した。

【００３１】

【実験例２−６熱安定性】常法により、５０ｍＭ燐酸
緩衝液（ｐＨ７．０）中で６０分間インキュベートする
条件で試験したところ、図５又は図６に示すように、酵
素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、３０乃至４５℃付近まで
安定であった。

【００３２】

【実験例２−７ｐＨ安定性】常法により、ｐＨの相違
する５０ｍＭ酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、２５℃で１６時間イ
ンキュベートする条件で試験したところ、図７又は図８
に示すように、酵素Ｍ−１１、酵素Ｑ３６とも、ｐＨ
５．５乃至１０．０付近まで安定であった。

【００３３】

【実験例２−８Ｎ末端アミノ酸配列】常法により、ア
プライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケ
ンサ『４７０Ａ型』を使用して分析したところ、酵素Ｍ
−１１は、Ｎ末端に配列表における配列番号７に示すア
ミノ酸配列を有していることが判明した。

【００３４】同様に分析したところ、酵素Ｑ３６は、Ｎ
末端に配列表における配列番号８に示すアミノ酸配列を
有していることが判明した。

【００３５】

【実験例２−９部分アミノ酸配列】実験例１−１で得
た精製酵素Ｍ−１１を適量とり、１０ｍＭトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ９．０）に対して４℃で１８時間透析後、
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて酵
素濃度を約１ｍｇ／ｍｌとした。この溶液を約１ｍｌと
り、リジルエンドペプチダーゼを１０μｇ加え、３０℃
で２２時間インキュベートして酵素を部分加水分解し
た。加水分解物を、予め１６％（ｖ／ｖ）水性アセトニ
トリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸によ
り平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグ
ラフィー用カラム『カプセルパックＣ１８』に負荷し、
１６％（ｖ／ｖ）から６４％（ｖ／ｖ）に上昇するアセ
トニトリルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）
トリフルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。
そして、通液開始から約４３分後又は約５７分後に溶出
したペプチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ａ」
又は「ペプチド断片Ｂ」と言う。）を含む画分を採取
し、真空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリル
を含む０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解し
た。以後、実験例２−８と同様に分析したところ、ペプ
チド断片Ａ及びＢは、配列表における配列番号９及び１
０に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。

【００３６】別途、実験例１−２で得た精製酵素Ｑ３６
を上記と同様にして部分加水分解し、予め２４％（ｖ／
ｖ）水性アセトニトリルを含む０．１％（ｖ／ｖ）トリ
フルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・
リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム
『マイクロボンダパックＣ１８』に負荷し、２４％（ｖ
／ｖ）から４４％（ｖ／ｖ）に上昇する水性アセトニト
リルの濃度勾配下、カラムに０．１％（ｖ／ｖ）トリフ
ルオロ酢酸を０．９ｍｌ／分の流速で通液した。そし
て、通液開始から約４分後又は約２４分後に溶出したペ
プチド断片（以下、それぞれ「ペプチド断片Ｃ」又は
「ペプチド断片Ｄ」と言う。）を含む画分を採取し、真
空乾燥後、５０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリルを含む
０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸に溶解した。以
後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片Ｃ及び
Ｄは、配列表における配列番号１１及び１２に示すアミ
ノ酸配列を有していることが判明した。

【００３７】以上のような理化学的性質を有する酵素は
未だ知られておらず、新規物質であると判断される。な
お、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１は岡山県岡山市
の土壌から分離され、平成４年１２月２４日以降、茨城
県つくば市東１丁目１番３号にある通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに
寄託番号『ＦＥＲＭＢＰ−４１３０』で寄託されてい
る。一方、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６は岡
山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成５年
６月３日以降、同センターに寄託番号『ＦＥＲＭＢＰ
−４３１６』で寄託されている。同じ出願人による特願
平５−３４０３４３号明細書には、酵素の性質・性状と
ともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されてい
る。

【００３９】そこで、本発明者が、実験例２−８又は２
−９で明らかにした酵素Ｍ−１１の部分アミノ酸配列に
基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブに
し、リゾビウム・スピーシーズＭ−１１の染色体ＤＮＡ
を鋭意検索したところ、配列表における配列番号３に示
す塩基配列を有する１，７６７塩基対からなるＤＮＡ断
片が得られた。そして、その塩基配列を解読したとこ
ろ、酵素Ｍ−１１は５８９個のアミノ酸からなる、配列
表における配列番号１に示すアミノ酸配列を有している
ことが判明した。

【００４０】一方、酵素Ｑ３６の部分アミノ酸配列に基
づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、
アルスロバクター・スピーシーズＱ３６の染色体ＤＮＡ
を同様に検索したところ、配列表における配列番号４に
示す塩基配列を有する１，７９１塩基対からなるＤＮＡ
断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素
Ｑ３６は５９７個のアミノ酸からなり、配列表における
配列番号２に示すアミノ酸配列を有していることが判明
した。

【００４１】配列表における配列番号１乃至４に示す塩
基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程
を要約すると、次のようになる。（１）供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、
高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加
水分解後、加水分解物より２種類のペプチド断片を単離
し、そのアミノ酸配列を決定した。（２）別途、供与体微生物の菌体より染色体ＤＮＡを
分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断した約
２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮＡ断片を
採取した。ＤＮＡリガーゼにより、このＤＮＡ断片を予
め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結
し、組換えＤＮＡを作製した。（３）大腸菌に組換えＤＮＡを導入して形質転換体を
作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオ
リゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダ
イゼーションにより当該酵素をコードするＤＮＡを含む
形質転換体を選択した。（４）形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、プライ
マーとともにアニーリング後、ＤＮＡポリメラーゼを作
用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖ＤＮＡを
ジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して
塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、
その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認し
た。

【００４２】次の実験例３乃至６では、上記の工程
（２）乃至（４）を具体的に説明するが、これら実験例
で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例
えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クロー
ニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第２版、１
９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス発行などにも詳述されている。

【００４３】

【実験例３リゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来の
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】

【００４４】

【実験例３−１染色体ＤＮＡの調製】リゾビウム・ス
ピーシーズＭ−１１をバクト・ニュートリエント・ブロ
ス培地（ｐＨ７．０）に植菌し、２７℃で２４時間回転
振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離
し、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチー
ムを０．０５％（ｗ／ｖ）加えた後、３７℃で３０分間
インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結
後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温
し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷冷後、遠
心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エ
タノールを加え、沈澱した粗染色体ＤＮＡを採取し、Ｓ
ＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼ
とプロテアーゼをそれぞれ７．５μｇ又は１２５μｇ加
え、３７℃で１時間インキュベートして反応させた。そ
の後、反応物にクロロフォルム／イソアミルアルコール
混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加
え、生成した染色体ＤＮＡを含む沈澱を採取した。この
ようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌ
になるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、溶
液を−８０℃で凍結した。

【００４５】

【実験例３−２組換えＤＮＡｐＢＭＵ２７と形質転
換体ＢＭＵ２７の調製】実験例３−１で得た精製染色体
ＤＮＡ溶液を約１ｍｌとり、これに制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩを約３５単位加え、３７℃で約２０分間反応させて
染色体ＤＮＡを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法
により約２，０００乃至６，０００塩基対からなるＤＮ
Ａ断片を採取した。別途、プラスミドベクターＢｌｕｅ
ｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）を１μｇとり、常法に
より制限酵素ＢａｍＨＩを作用させて完全に切断した
後、上記で得たＤＮＡ断片１０μｇとＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを２単位加え、４℃で一夜静置することによりＤＮ
Ａ断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組
換えＤＮＡに東洋紡績製コンピテントセル『Ｅｐｉｃｕ
ｒｉａｎＣｏｌｉＸＬＩ−Ｂｌｕｅ』を３０μｌ加
え、氷冷下に３０分間静置後、４２℃に加温し、ＳＯＣ
ブロスを加えて３７℃で１時間インキュベートすること
により、組換えＤＮＡを大腸菌に導入した。

【００４６】上記で得た形質転換体を５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド５０μｇ／
ｍｌを含む寒天平板培地（ｐＨ７．０）に植菌し、３７
℃で１８時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培
地上に形成された約６，０００個のコロニーをナイロン
膜上に固定した。別途、常法により、配列表における配
列番号９に示すアミノ酸配列における第８乃至１３番目
のＰｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏで
表される配列に基づき５′−ＴＴＹＧＡＹＡＴＨＴＧＧ
ＧＣＮＣＣ−３′で表される塩基配列のプローブ１を化
学合成し、同位体³²Ｐで標識後、前記ナイロン膜上に固
定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕
著な会合が認められた１４種類の形質転換体を選択し
た。

【００４７】その後、常法により、これら１４種類の形
質転換体から組換えＤＮＡを採取し、配列表における配
列番号１０に示すアミノ酸配列における第２乃至６番目
のＡｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａで表される
配列に基づき化学合成した５′−ＧＡＹＴＧＧＧＣＮＧ
ＡＲＧＣ−３′で表される塩基配列のプローブ２をイー
・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー』、第９８巻、第５０３〜５１７頁（１９
７５年）に記載されている方法に準じてハイブリダイズ
させ、プローブ２と顕著な会合を示した組換えＤＮＡを
選択した。以上のようにして選択した組換えＤＮＡと形
質転換体を、それぞれ、『ｐＢＭＵ２７』又は『ＢＭＵ
２７』と命名した。

【００４８】上記で得た形質転換体ＢＭＵ２７をアンピ
シリン１００μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロス培地（ｐＨ
７．０）に植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取
し、通常一般のアルカリ法により組換えＤＮＡを菌体外
に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したと
ころ、組換えＤＮＡｐＢＭＵ２７は約５，７００塩基
対からなり、図９に示す制限酵素地図で表される構造を
有していた。図９に示すように、酵素Ｍ−１１をコード
する１，７６７塩基対からなるＤＮＡは、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶによる切断部位付近の下流に位置していること
が判明した。

【００４９】

【実験例３−３形質転換体ＢＭＵ２７による酵素の産
生】松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃
４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／
ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナト
リウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１
％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、ア
ンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間
加熱滅菌し、冷却後、実験例３−２で得た形質転換体Ｂ
ＭＵ２７を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し
た。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離に
より不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したとこ
ろ、培養物１ｌ当たりに換算して、約４，０００単位の
酵素が産生していた。

【００５０】別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕ
ｅ株及びリゾビウム・スピーシーズＭ−１１をアンピシ
リン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、リゾビウム
・スピーシーズＭ−１１の場合、培養温度を３０℃に設
定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活
性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズＭ−１
１による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約２，０００単
位と、形質転換体ＢＭＵ２７と比較して有意に低いもの
であった。なお、宿主に使用した大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕ
ｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。

【００５１】その後、形質転換体ＢＭＵ２７が産生した
酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を
調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分子量値約５７，０００乃至６８，０００ダルトン
を、また、等電点電気泳動で約３．３乃至４．６に等電
点を示すなど、酵素Ｍ−１１と同様の理化学的性質を有
することが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術に
よっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有
意に向上することを示唆している。

【００５２】

【実験例４リゾビウム・スピーシーズＭ
−１１に由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、
アミノ酸配列の決定】実験例３−２で得た組換えＤＮＡ
ｐＢＭＵ２７を、常法に従って、各種制限酵素で分解
し、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）にサブク
ローニングして、塩基配列決定用ＤＮＡとした。これら
塩基配列決定用ＤＮＡを２μｇとり、これに２Ｍ水酸化
ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタ
ノールを加え、生成したテンプレートＤＮＡを含む沈澱
を採取し、真空乾燥した。このテンプレートＤＮＡに化
学合成した５′−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
−３′で表される塩基配列のプライマー１を５０ｐｍｏ
ｌ／ｍｌと、２０ｍＭ塩化マグネシウムと２０ｍＭ塩化
ナトリウムを含む４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を１０μｌ加え、６５℃で２分間インキュベー
トしてアニーリングした後、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄ
ＴＴＰをそれぞれ７．５μＭ含む水溶液を２μｌと、
［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２ｍＣｉ／ｍｌ）を０．５μｌ
と、０．１Ｍジチオスレイトールを１μｌと、１．５単
位／ｍｌのＴ７ＤＮＡポリメラーゼを２μｌ加え、２
５℃で５分間インキュベートすることによりプライマー
１を５′末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖
ＤＮＡを生成させた。

【００５３】次に、上記で得た相補鎖ＤＮＡを含む反応
物を四等分し、それぞれにｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄ
ｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのいずれかを８μＭと８０μＭ
ｄＮＴＰを含む５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を２．
５μｌ加え、３７℃で５分間インキュベートして反応さ
せ、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ブロム
フェノールブルー及び０．０５％（ｗ／ｖ）キシレンシ
アノールを含む９８％（ｖ／ｖ）水性ホルムアミド溶液
を４μｌ加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水溶中
で３分間加熱後、６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲ
ル上にとり、約２，０００Ｖの定電圧を印加しながら電
気泳動してＤＮＡ断片を分離し、次いで、常法によりゲ
ルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーし
た。

【００５４】ラジオグラム上に分離したＤＮＡ断片を解
析した結果、相補鎖ＤＮＡは配列表における配列番号５
に示す２，１６１塩基対からなる塩基配列を含んでいる
ことが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は配列表における配列番号５に併記したとおりであ
り、このアミノ酸配列と配列表における配列番号７、９
又は１０に示す酵素Ｍ−１１のＮ末端アミノ酸配列、部
分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号７のＮ末端
アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第８
乃至２７番目の配列に、また、配列番号９又は１０の部
分アミノ酸配列は配列表における配列番号５における第
１０乃至３０番目又は第４９３乃至５０９番目の配列に
一致した。これは、酵素Ｍ−１１が配列表における配列
番号１に示すアミノ酸配列を有するものであり、リゾビ
ウム・スピーシーズＭ−１１においては、酵素Ｍ−１１
が配列表における配列番号３に示す塩基配列のＤＮＡに
よりコードされていることを示している。

【００５５】

【実験例５アルスロバクター・スピーシーズＱ３６由
来のＤＮＡを含む組換えＤＮＡと形質転換体の調製】

【００５６】

【実験例５−１染色体ＤＮＡの調製】実験例３−１と
同様にしてアルスロバクター・スピーシーズＱ３６から
染色体ＤＮＡを分離・精製し、濃度約１ｍｇ／ｍｌにな
るようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０
℃で凍結した。

【００５７】

【実験例５−２組換えＤＮＡｐＢＲＴ３２と形質転
換体ＢＲＴ３２の調製】実験例５−１で得た精製染色体
ＤＮＡ溶液を実験例３−２と同様に部分切断した後、蔗
糖密度勾配超遠心法により約２，０００乃至６，０００
塩基対からなるＤＮＡ断片を採取した。その後、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを使用し、このＤＮＡ断片を実験例３−
２と同様に制限酵素ＢａｍＨＩによるベクターＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）の消化物に連結し、
得られた組換えＤＮＡを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導
入した。得られた形質転換体を実験例３−２と同様に５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクト
シドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約５，００
０個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表
における配列番号１１に示すアミノ酸配列における第５
乃至１０番目のＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏ−Ａｌａで表される配列に基づき５′−ＡＴＧＧＧＮ
ＴＧＧＧＡＹＣＣＮＧＣ−３′で表される塩基配列のプ
ローブ３を化学合成し、同位体³²Ｐで標識後、前記ナイ
ロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダ
イズさせ、顕著な会合が認められた１０種類の形質転換
体を選択した。

【００５８】実験例３−２と同様にして、これら１０種
類の形質転換体から組換えＤＮＡを採取し、これに配列
表における配列番号１２に示すアミノ酸配列における第
８乃至１２番目のＴｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａ
ｌａで表される配列に基づき化学合成した５′−ＴＡＹ
ＧＡＹＧＴＮＴＧＧＧＣ−３′で表される塩基配列のプ
ローブ４をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組
換えＤＮＡを選択した。以上のようにして選択した組換
えＤＮＡと形質転換体を、それぞれ、『ｐＢＲＴ３２』
又は『ＢＲＴ３２』と命名した。

【００５９】その後、この形質転換体ＢＲＴ３２をアン
ピシリンを含むＬ−ブロス培地で実験例３−２と同様に
培養し、培養物より採取した菌体から組換えＤＮＡを溶
出させ、精製し、分析したところ、組換えＤＮＡｐＢ
ＲＴ３２は約６，２００塩基対からなり、図１０に示す
制限酵素地図で表される構造を有していた。図１０に示
すように、酵素Ｑ３６をコードする１，７９１塩基対か
らなるＤＮＡは、制限酵素ＫｐｎＩによる切断部位付
近の下流に位置していることが判明した。

【００６０】

【実験例５−３形質転換体ＢＲＴ３２による酵素の産
生】松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス＃
４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／
ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナト
リウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム０．１
％（ｗ／ｖ）を含む液体培地をｐＨ７．０に調整し、ア
ンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２０分間
加熱滅菌し、冷却後、実験例５−２で得た形質転換体Ｂ
ＲＴ３２を植菌し、３７℃で２４時間回転振盪培養し
た。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離に
より不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したとこ
ろ、培養物１ｌ当たりに換算して、約３，９００単位の
酵素が産生していた。

【００６１】別途、対照として、大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕ
ｅ株及びアルスロバクター・スピーシーズＱ３６をアン
ピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルス
ロバクター・スピーシーズＱ３６の場合、培養温度を３
０℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処
理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピ
ーシーズＱ３６による酵素の産生は培養物１ｌ当たり約
１，８００単位と、形質転換体ＢＲＴ３２と比較して有
意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌Ｘ
ＬＩ−Ｂｌｕｅ株は、当該酵素を全く産生しなかった。

【００６２】その後、形質転換体ＢＲＴ３２が産生した
酵素を実験例１−１と同様に精製し、その性質・性状を
調べたところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分子量値約５７，０００乃至６８，０００ダルトン
を、また、等電点電気泳動で約３．３乃至４．６に等電
点を示すなど、酵素Ｑ３６と同様の理化学的性質を有す
ることが判明した。このことは、組換えＤＮＡ技術によ
っても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意
に向上することを示唆している。

【００６３】

【実験例６アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に
由来する相補鎖ＤＮＡの調製とその塩基配列、アミノ酸
配列の決定】実験例５−２で得た組換えＤＮＡｐＢＲ
Ｔ３２を実験例４と同様に処理してテンプレートＤＮＡ
とし、これをプライマー１とともにアニーリング後、Ｔ
７ＤＮＡポリメラーゼを作用させてプライマー１を５′
末端から３′末端に向かって伸長させ、相補鎖ＤＮＡを
生成させた。実験例４と同様に、この相補鎖ＤＮＡにジ
デオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオ
グラム上に分離したＤＮＡ断片を解析した結果、相補鎖
ＤＮＡは配列表における配列番号６に示す２，０５６塩
基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。こ
の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表におけ
る配列番号６に併記したとおりであり、このアミノ酸配
列と配列表における配列番号８、１１又は１２に示すＮ
末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したとこ
ろ、配列番号８のＮ末端アミノ酸配列は配列表における
配列番号６における第２乃至２１番目の配列に、また、
配列番号１１又は１２の部分アミノ酸配列は配列表にお
ける配列番号６における第４７０乃至４８９番目又は第
１２乃至３１番目の配列に一致した。これは、酵素Ｑ３
６が配列表における配列番号２のアミノ酸配列を有する
ものであり、アルスロバクター・スピーシーズＱ３６に
おいては、酵素Ｑ３６が配列表における配列番号４に示
す塩基配列のＤＮＡによりコードされていることを示し
ている。

【００６４】以上説明したように、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質か
らトレハロースを遊離する酵素は、本発明者が長年に亙
る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知
の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備してい
る。この発明は、組換えＤＮＡ技術を応用することによ
り、この酵素を創製しようというものである。以下、実
施例等を参照しながら、この発明の組換え型酵素とその
製造方法並びに用途につき、具体的に説明する。

【００６５】この発明でいう組換え型酵素とは、組換え
ＤＮＡ技術により創製され、末端にトレハロース構造を
有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からトレ
ハロースを遊離する酵素全般を意味する。この発明の組
換え型酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有して
おり、その一例として、例えば、配列表における配列番
号１又は２に示すＮ末端からのアミノ酸配列かそれに相
同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列
番号１又は２に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配
列を有する変異体は、所期の酵素作用を実質的に変える
ことなく、配列表における配列番号１又は２に示すアミ
ノ酸配列における構成アミノ酸の１個又は２個以上を他
のアミノ酸で置換することにより得ることができる。な
お、同じＤＮＡであっても、それを導入する宿主や、そ
のＤＮＡを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の
成分・組成、培養温度・ｐＨなどに依っては、宿主内酵
素によるＤＮＡ発現後の修飾などにより、所期の酵素作
用は保持しているものの、配列表における配列番号１又
は２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端付近のアミノ酸
が１個又は２個以上欠失したり、Ｎ末端に１個又は２個
以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生すること
がある。斯かる変異体も、それが末端にトレハロース構
造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質から
トレハロースを遊離するかぎり、当然、この発明の組換
え型酵素に包含される。

【００６６】この発明による組換え型酵素は、特定のＤ
ＮＡを含む形質転換体の培養物から採取することができ
る。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表
における配列番号３又は４に示す塩基配列かそれに相同
的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のＤＮＡを
適宜宿主に導入することにより得ることができる。な
お、上記塩基配列は、遺伝子の縮重を利用して、コード
するアミノ酸配列を変えることなく、塩基の１個又は２
個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、ＤＮＡが
宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該
酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における
塩基の１個又は２個以上を他の塩基で適宜置換し得るこ
とは言うまでもない。

【００６７】この発明で使用するＤＮＡは、それが前述
のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するも
のか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然
の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズＭ
−１１（ＦＥＲＭＢＰ−４１３０）、アルスロバクタ
ー・スピーシーズＱ３６（ＦＥＲＭＢＰ−４３１
６）、ブレビバクテリウム・ヘロボルム（ＡＴＣＣ１１
８２２）及びミクロコッカス・ロゼウス（ＡＴＣＣ１８
６）を含むリヒゾビウム属、アルスロバクター属、ブレ
ビバクテリウム属、ミクロコッカス属の微生物が挙げら
れ、これら微生物の菌体からはこの発明のＤＮＡを含む
遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地
に植菌し、好気的条件下で約１乃至３日間培養後、培養
物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該
ＤＮＡを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、
細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵
素を併用したり、菌体を超音波処理する際、ＳＤＳなど
の界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯く
して得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アル
コール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用す
れば目的のＤＮＡが得られる。一方、ＤＮＡを人為的に
合成するには、例えば、配列表における配列番号３又は
４に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表に
おける配列番号１又は２に示すアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換
えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質
転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体か
ら当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取すればよい。

【００６８】斯かるＤＮＡは、通常、組換えＤＮＡの形
態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡ
と自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手
できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１
９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７など
のプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、
ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げ
られ、このうち、この発明のＤＮＡを大腸菌で発現させ
るにはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢ
が好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはｐＵＢ１
１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０
５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＴＥｐ７及び
ｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖さ
せる場合に有用である。

【００６９】ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、
斯界において通常一般の方法が採用される。具体的に
は、先ず、ＤＮＡを含む遺伝子と自律複製可能なベクタ
ーとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、
生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝
子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用す
る制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、
Ｓａｕ３ＡＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａ
ｍＨＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＳａｃＩ、Ｐｓｔ
Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連
結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連
結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした
後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させれば
よい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導
入して形質転換体とし、これを培養することにより無限
に複製可能である。

【００７０】このようにして得られる組換えＤＮＡは、
大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主
微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合に
は、宿主を組換えＤＮＡとカルシウムイオンの存在下で
培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コン
ピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。
形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリ
ダイゼーション法を適用するか、末端にトレハロース構
造を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質を含
む栄養培地で培養し、該非還元性糖質よりトレハロース
を遊離するものを選択すればよい。

【００７１】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培
地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、
必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を
補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源
としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコー
ス、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、
例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝
酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティ
ープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙
げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養
培地を温度２５乃至６５℃、ｐＨ２乃至８に保ちつつ、
通気撹拌などによる好気的条件下で約１乃至６日間培養
すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物
は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使
用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素に
より菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素
を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には
酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例え
ば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などの１種若しくは２種以上を適宜
組合せて適用すればよい。

【００７２】前述のとおり、この発明による組換え型酵
素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合
度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離すると
いう、従来の酵素には見られない顕著な作用を有する。
トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、そして、
何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変
質の懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点
がある。

【００７３】斯かる変換方法につきさらに説明すると、
この発明による組換え型酵素の基質にはα−グルコシル
トレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マル
トトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルト
レハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースなど
の末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度３
以上の一連の非還元性糖質が用いられる。斯かる非還元
性糖質は、澱粉又はアミロペクチン、アミロースなどの
澱粉質を酸及び／又はアミラーゼによって部分的に加水
分解して得られる還元性澱粉加水分解物に特願平５−３
４９２１６号明細書に開示されている非還元性糖質生成
酵素を作用させることにより得ることができる。斯かる
澱粉加水分解物は、通常、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオースなどのグルコース重合度３以上
のマルトオリゴ糖の１種若しくは２種以上を含んでな
る。アミラーゼ研究会編『ハンドブック・オブ・アミレ
ーシーズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、１
９８８年、パーガモン・プレス発行に記載されているα
−アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マ
ルトペンタオース生成アミラーゼ及びマルトヘキサオー
ス生成アミラーゼは、斯かる澱粉加水分解物の調製に特
に有用であり、これらアミラーゼのいずれかを使用する
ことにより、グルコース重合度３以上の還元性澱粉糖を
豊富に含む澱粉糖混合物が容易且つ効率的に得られる。
なお、このとき、必要に応じて、プルラナーゼやイソア
ミラーゼなどの澱粉枝切酵素を併用すれば、非還元性糖
質生成酵素の基質となり得る還元性澱粉糖の収量を上げ
ることができる。斯かる還元性澱粉糖の１種又は２種以
上を濃度５０％（ｗ／ｖ）まで含む水溶液に非還元性糖
質生成酵素を適量共存せしめ、水溶液を、通常、温度約
４０乃至５５℃に、また、ｐＨを約６乃至８の範囲に保
ちつつ、所望量の非還元性糖質が生成するまで反応させ
る。

【００７４】この発明による変換方法においては、通
常、基質として上記したような非還元性糖質の１種又は
２種以上を含む水溶液にこの発明による組換え型酵素を
共存せしめ、水溶液を所定の温度、ｐＨに保ちつつ、所
望量のトレハロースが遊離するまで反応させる。反応は
０．１％（ｗ／ｗ）程度の基質濃度下でも進行するが、
この発明による変換方法を大規模に実施する場合には、
より高濃度の２％（ｗ／ｖ）以上、望ましくは、５乃至
５０％（ｗ／ｗ）とするのがよい。反応時の温度とｐＨ
は組換え型酵素が失活することなく基質に効率的に作用
するレベルに設定され、温度は５５℃付近まで、望まし
くは、約４０乃至５５℃に、また、ｐＨは５乃至１０、
望ましくは、約６乃至８の範囲に設定される。組換え型
酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に
設定する。斯かる反応により、非還元性糖質は効率的に
トレハロースとグルコース及び／又はマルトオリゴ糖か
らなる糖組成物に変換され、α−マルトトリオシルトレ
ハロースの場合、変換率はほぼ１００％に達する。澱粉
加水分解物に前記アミラーゼのいずれかと、非還元性糖
質生成酵素及び当該組換え型酵素を同時に作用させると
きには、非還元性糖質が生成すると同時にトレハロース
とグルコース及び／又はマルトオリゴ糖に分解されるの
で、トレハロース含量の高い糖組成物が収量良く、効率
的に得られる実益がある。

【００７５】この発明の変換方法により得られた反応物
はそのまま使用可能ではあるが、通常、使用に先立ち精
製する。すなわち、濾過・遠心分離などにより反応物か
ら不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交
換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とす
る。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴
霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的にトレハ
ロースのみからなる製品を得るには、上記シロップ状物
にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質
を分離するための種々のクロマトグラフィー、アルコー
ル、アセトンなどにより分別沈澱、膜濾過、酵母により
発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの１種
若しくは２種以上を適用する。大量の反応物を処理する
には、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報や特開昭
５８−７２５９８号公報に開示されている強酸性カチオ
ン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は擬似
移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であ
り、これらの方法によるときには、従来、大量入手が難
しかったトレハロース含量が高い製品を大量且つ効率的
に得ることができる。

【００７６】斯くして得られるトレハロース及びトレハ
ロースを含む糖組成物は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種
々の物品に広範な用途を有し、例えば、食品一般、化粧
品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定
剤、賦形剤として極めて有用である。

【００７７】以下、２〜３の実施例により、この発明に
よる組換え型酵素の製造方法と非還元性糖質の変換方法
を具体的に説明する。

【００７８】

【実施例Ａ−１組換え型酵素の製造】５００ｍｌ容三
角フラスコに松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデ
ックス＃４』２．０％（ｗ／ｖ）、ペプトン０．５％
（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸水素
二ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、燐酸二水素カリウム
０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体培地（ｐＨ７．０）を１
００ｍｌずつとり、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え
た後、１２０℃で２０分間オートクレーブして加熱滅菌
した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に実験例３−
２の方法で得た形質転換体ＢＭＵ２７を植菌し、回転振
盪下、２７℃で２４時間種培養した。別途、３０ｌ容ジ
ャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を１８ｌと
り、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌ加え、１２０℃で２
０分間加熱滅菌し、冷却後、上記で得た種培養液を１％
（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ６乃至８に保ちつ
つ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。培養物を超音
波処理して菌体を破砕し、遠心分離より不溶物を除去
後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物１ｌ当
りに換算して、約３，９００単位の酵素が産生してい
た。この上清を実験例１−１の方法により精製したとこ
ろ、比活性約２９０単位／ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を
１ｍｌ当たり１６５単位含む水溶液が６７ｍｌ得られ
た。

【００７９】

【実施例Ａ−２組換え型酵素の製造】実験例５−２の
方法により得た形質転換体ＢＲＴ３２を実施例Ａ−１と
同様に培養し、培養物を超音波処理して菌体を破砕し、
遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測
定したところ、培養物１ｌ当たりに換算して、約４，０
００単位の酵素が産生していた。この上清を実験例１−
１の方法により精製したところ、比活性約４２０単位／
ｍｇ蛋白質の組換え型酵素を１ｍｌ当たり２００単位含
む水溶液が５５ｍｌ得られた。

【００８０】

【実施例Ｂ−１組換え型酵素による非還元性糖質の変
換】

【００８１】

【実施例Ｂ−１（ａ）非還元性糖質生成酵素の調製】
５００ｍｌ容三角フラスコにマルトース２．０％（ｗ／
ｖ）、ペプトン０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．１
％（ｗ／ｖ）、燐酸水素二ナトリウム０．１％（ｗ／
ｖ）及び燐酸二水素カリウム０．１％（ｗ／ｖ）を含む
液体培地（ｐＨ７．０）を１００ｍｌずつとり、１２０
℃で２０分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三
角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズＭ
−１１を植菌し、回転振盪下、２７℃で２４時間種培養
した。別途、３０ｌ容ジャーファーメンタに上記と同組
成の液体培地を２０ｌとり、滅菌後、上記で得た種培養
液を１％（ｖ／ｖ）接種し、液体培地をｐＨ７乃至８に
保ちつつ、３０℃で２４時間通気撹拌培養した。培養物
を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物
を除去後、実験例１−１の方法に準じて精製したとこ
ろ、比活性約１９５単位／ｍｇ蛋白質の非還元性糖質生
成酵素が、培養物１ｌ当たりに換算して、約２２０単位
の収量で得られた。

【００８２】なお、この発明を通じて、非還元性糖質生
成酵素の活性は、次の方法により測定した活性値（単
位）で表示する。すなわち、マルトペンタオースを１．
２５％（ｗ／ｖ）含む５０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．
０）を４ｍｌとり、これに酵素液を１ｍｌ加え、４０℃
で６０分間インキュベートして反応させた後、反応液を
１００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。反応液
を蒸留水で１０倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法によ
り還元力を測定する。非還元性糖質生成酵素の１単位と
は、上記条件下において、１分間にマルトペンタオース
１μｍｏｌに相当する還元力を低下させる酵素の量と定
義する。

【００８３】

【実施例Ｂ−１（ｂ）トレハロースを含むシロップ状
物の調製】トウモロコシ澱粉を濃度１５％（ｗ／ｗ）に
なるように水中に懸濁し、懸濁液に炭酸カルシウムを
０．１％（ｗ／ｗ）加えた。ｐＨ６．０に調整後、ノボ
・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤
『ターマミル６０Ｌ』を０．２％（ｗ／ｗ）加え、９５
℃で１５分間反応させて澱粉を糊化・液化した。液化液
を１２０℃で３０分間オートクレーブして酵素を失活さ
せ、４５℃に急冷後、澱粉固形分１ｇ当たり、林原生物
化学研究所製プルラナーゼ剤を１，０００単位、実施例
Ｂ−１（ａ）で得た非還元性糖質生成酵素を３．４単
位、実施例Ａ−１の方法で得た組換え型酵素を４．２単
位加え、４８時間反応させた。反応物を９５℃で１０分
間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にし
たがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱
塩・精製し、濃縮して、濃度約６０％（ｗ／ｗ）のシロ
ップ状物を澱粉固形分当たり約９２％の収量で得た。

【００８４】実験例２−１の方法により分析したとこ
ろ、本品は、固形分当たりトレハロースを７０．２％、
α−グルコシルトレハロースを２．４％、α−マルトシ
ルトレハロースを３．３％、グルコースを０．７％、マ
ルトースを１０．１％、マルトトリオースを１２．９
％、グルコース重合度４以上のマルトオリゴ糖を０．４
％含んでいた。まろやかで上品な甘味に加えて適度の保
湿性を有し、粘度と還元性が低い本品は、食品一般、化
粧品、医薬品などに配合使用する甘味剤、呈味改善剤、
品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。

【００８５】

【実施例Ｂ−１（ｃ）トレハロースを含む粉状物の調
製】東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『ＸＴ
−１０１６（Ｎａ⁺）』を内径５．４ｃｍ、長さ５ｍの
ジャケット付きステンレス製カラム４本に均一に充填
し、カラムを直列に連結して全長を２０ｍとした。カラ
ム内温度を５５℃に保ちつつ、実施例Ｂ−１（ｂ）で得
たシロップ状物を樹脂に対して約５％（ｖ／ｖ）の割合
で負荷し、５５℃の温水をＳＶ０．３の流速で通液して
シロップ状物中の糖質を分画した。溶出液の糖組成を分
析し、トレハロース含量の高い画分のみを採取し、濃縮
し、真空乾燥し、破砕して、固形分当たりトレハロース
を約９７％含む粉状物を原料固形分当たり約５６％の収
率で得た。

【００８６】まろやかで上品な甘味を有しながらも、実
質的な還元性を有しない本品は、食品一般、化粧品、医
薬品に配合使用する甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、
安定剤、賦形剤として有用である。

【００８７】

【実施例Ｂ−１（ｄ）結晶性トレハロース粉状物の調
製】実施例Ｂ−１（ｃ）で得たトレハロース含量の高い
画分を一部とり、濃度約７５％（ｗ／ｗ）に濃縮後、助
晶罐に移し、種晶としてトレハロース含水結晶を固形分
当たり約２％加え、緩やかに撹拌しながら助晶して結晶
化度約４５％のマスキットを得た。このマスキットを約
１５０ｋｇ／ｃｍ²の圧力下、噴霧乾燥塔の上部に設け
た噴霧ノズルより噴霧乾燥塔の下方に向かって噴霧する
一方、約８５℃の温風を噴霧乾燥塔の上部から下方に向
かって送風しつつ、噴霧乾燥塔の底部に設けたベルトコ
ンベア上に蓄積した結晶性粉状物を噴霧乾燥塔外に徐々
に搬出した。その後、粉状物を熟成塔に移し、約４０℃
の温風を送風しながら１０時間熟成して結晶化と乾燥を
完了した。このようにして、トレハロース含水結晶から
なる粉状物を原料固形分当たり約９０％の収量で得た。

【００８８】まろやかで上品な甘味を有しながらも、実
質的な還元性や吸湿性を有しない本品は、食品一般、化
粧品、医薬品に配合使用する甘味剤、呈味改善剤、品質
改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。

【００８９】

【実施例Ｂ−２組換え型酵素による非還元性糖質の変
換】馬鈴薯澱粉を濃度６％（ｗ／ｗ）になるように水中
に懸濁し、加熱糊化後、温度５０℃、ｐＨ４．５に調整
し、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形
分１ｇ当たり５００単位加え、２０時間反応させた。反
応物をｐＨ６．５に調整し、１２０℃で１０分間オート
クレーブして酵素を失活させ、９５℃に急冷後、ノボ・
ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『タ
ーマミル６０Ｌ』を澱粉固形分当たり０．１％（ｗ／
ｗ）加え、１５分間反応させた。反応物を１３０℃で３
０分間加熱して酵素を失活させ、４５℃に急冷後、澱粉
固形分１ｇ当たり、実施例Ｂ−１（ａ）の方法で得た非
還元性糖質生成酵素を４．１単位、実施例Ａ−２の方法
で得た組換え型酵素を４．９単位加え、６４時間反応さ
せた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せ、５５℃に急冷し、ｐＨ５．０に調整後、ナガセ生化
学工業製グルコアミーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固形
分１ｇ当たり１０単位加え、４０時間反応させた。反応
物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却
し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イ
オン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して、固形分当
たりトレハロースを８０．５％含む濃度約６０％（ｗ／
ｗ）のシロップ状物を得た。このシロップ状物を濃度約
８４％（ｗ／ｗ）まで濃縮後、助晶罐に移し、種晶とし
てトレハロース含水結晶を固形分当たり約２％加え、緩
やかに撹拌しながら助晶して結晶化度約４５％のマスキ
ットを得た。このマスキットをプラスチック製バットに
分注し、室温で３日間静置して固化・熟成させた後、バ
ットからブロック状物を取出し、切削機により破砕した
ところ、トレハロース含水結晶を含む固状物が澱粉固形
分当たり約９０％の収量で得られた。

【００９０】実質的な吸湿性を有さず、取扱い易い本品
は、食品一般、化粧品、医薬品に配合使用する甘味剤、
呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用で
ある。

【００９１】

【実施例Ｂ−３組換え型酵素による非還元性糖質の変
換】馬鈴薯澱粉を濃度６％（ｗ／ｗ）になるように水中
に懸濁し、ナガセ生化学工業製α−アミラーゼ剤『ネオ
スピターゼ』を０．０１％（ｗ／ｗ）加え、ｐＨ６．２
に調整後、温度８５乃至９０℃に保ちつつ２０分間反応
させて澱粉を糊化・液化させた。液化液を１２０℃で１
０分間加熱して酵素を失活させ、４５℃に急冷後、澱粉
固形分１ｇ当たり、林原生物化学研究所製イソアミラー
ゼ剤を５００単位、実施例Ｂ−１（ａ）の方法で得た非
還元性糖質生成酵素を３．２単位、実施例Ａ−１の方法
で得た組換え型酵素を５．０単位加えて４８時間反応さ
せた。反応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せ、５５℃に急冷後、ｐＨ５．０に調整し、ナガセ生化
学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固
形分１ｇ当たり１０単位加えて４０時間反応させた。反
応物を９５℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、冷却
し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イ
オン交換樹脂により脱塩・精製し、濃度約６０％（ｗ／
ｗ）まで濃縮して、固形分当たりトレハロースを７８．
３％含むシロップ状物を得た。このシロップ状物を強酸
性カチオン交換樹脂としてオルガノ製『ＣＧ６０００
（Ｎａ⁺）』を使用した以外は実施例Ｂ−１（ｃ）と同
様に分画して、固形分当たりトレハロースを約９５％含
む画分を得た。この画分を濃度約７５％（ｗ／ｗ）に濃
縮後、実施例Ｂ−２と同様に助晶し、得られたマスキッ
トのブロック状物を破砕してトレハロース含水結晶を含
む粉状物を澱粉固形分当たり約７０％の収率で得た。

【００９２】実質的な吸湿性を有さず、取扱い易い本品
は、食品一般、化粧品、医薬品に配合使用する甘味剤、
呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用で
ある。

【００９３】

【発明の効果】以上説明したように、この発明は、末端
にトレハロース構造を有するグルコース重合度３以上の
非還元性糖質からトレハロースを遊離する、従来未知の
全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明
は、組換えＤＮＡ技術により、斯かる酵素を大規模且つ
効率的に生産する道を拓くものである。この発明による
組換え型酵素を使用する変換方法により、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度３以上の非還元性
糖質は効率的にトレハロースとグルコース及び／又はマ
ルトオリゴ糖からなる糖組成物に変換される。非還元性
糖質から遊離したトレハロースは、まろやかで上品な甘
味を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、
着色や変質の懸念なく食品一般を甘味付けできる実益が
ある。加えて、この発明による組換え型酵素は、全アミ
ノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、食品等への
配合使用を前提とするトレハロースの製造に安心して使
用し得るものである。

【００９４】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な
発明であると言える。

【００９５】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：589 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Glu Met Gly Arg Arg 20 25 30 Pro Gly Asn Gly Pro Ala Asp Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ala Asp Ala Pro 35 40 45 50 Thr Gly Ala Asp Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ile Pro 55 60 65 Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Glu Gly Val His Ala Leu Ser 70 75 80 85 Arg Thr Phe Asp Pro Gly Ala His Arg Trp Gln Asp Ala Gly Trp Gln Gly 90 95 100 Arg Glu Leu Gln Gly Ser Val Ile Tyr Glu Leu His Ile Gly Thr Phe Thr 105 110 115 Pro Glu Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly 120 125 130 135 Leu Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr 140 145 150 His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Gly Tyr 155 160 165 170 Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly 175 180 185 Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn 190 195 200 Tyr Leu Pro Arg Tyr Gly Pro Tyr Leu Lys His Gly Glu Gly Asn Thr Trp 205 210 215 220 Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp His Val Arg Gln Tyr 225 230 235 Ile Leu Asp Asn Val Ala Met Trp Leu Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu 240 245 250 255 Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu 260 265 270 Glu Glu Phe Gly Ala Leu Ala Asp Ala Leu Ser Ser Glu Gly Gly Arg Pro 275 280 285 Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro 290 295 300 305 Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His 310 315 320 His Ala Val His Val Asn Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp 325 330 335 340 Phe Asp Ser Leu Gly Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His 345 350 355 Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Gly Arg Cys His Gly Arg Pro Ile Asn 360 365 370 Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp 375 380 385 390 Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro Tyr 395 400 405 Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro 410 415 420 425 Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Pro Trp Gln Phe Phe 430 435 440 Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile 445 450 455 Arg Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln 460 465 470 475 Asp Pro Glu Thr Phe Thr Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ser Ala 480 485 490 Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser Leu Ile Thr Leu Arg 495 500 505 510 Arg Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Leu Gly Phe Ala Asp Thr Ala Val Glu 515 520 525 Phe Asp Asp Asp Ala Arg Trp Leu Arg Tyr Trp Arg Gly Gly Val Gln Val 530 535 540 Val Leu Asn Phe Ala Asp Arg Pro Ile Ser Leu Asp Arg Pro Gly Thr Ala 545 550 555 560 Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala Val Arg Met Asp Gly Val Gln Val Glu 565 570 575 Leu Pro Pro Leu Ser Ala Ala Val Leu Arg Asp 580 585

【００９６】配列番号：2 配列の長さ：597 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列 Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly 20 25 30 Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro Glu Asp Ala Gly 35 40 45 50 Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn Val Asp Tyr Gly Tyr 55 60 65 Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln 70 75 80 85 Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser 90 95 100 Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr 105 110 115 Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala 120 125 130 135 Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu 140 145 150 Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln 155 160 165 170 Trp Phe Ala Val His Glu Asp Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe 175 180 185 Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr 190 195 200 Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu 205 210 215 220 Lys Gln Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro 225 230 235 Gly Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu 240 245 250 255 Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys 260 265 270 Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala Asp Gln 275 280 285 Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu 290 295 300 305 Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Glu 310 315 320 Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn Val Thr Gly 325 330 335 340 Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu Ala Ala Leu Ala Lys 345 350 355 Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu 360 365 370 Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu 375 380 385 390 Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp 395 400 405 Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu 410 415 420 425 Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly 430 435 440 Ala Ser Thr Pro Trp Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly 445 450 455 Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp 460 465 470 475 Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys 480 485 490 Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu 495 500 505 510 Tyr Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu 515 520 525 Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu Arg 530 535 540 Phe Arg Arg Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln Pro Val 545 550 555 560 Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala Val 565 570 575 Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser Ala Ala Val Val 580 585 590 595 Ser Asp

【００９７】配列番号：3 配列の長さ：1767 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 GCCAAGCCGG TGCAGGGAGC GGGGCGCTTC GATATCTGGG CGCCCGAGGC AGGCACCGTA 60 ACGCTGCTGG CCGGCGGGGA GCGCTACGAG ATGGGCCGCC GCCCCGGCAA CGGGCCGGCG 120 GACGAAGGCT GGTGGACGGC CGCGGATGCA CCGACAGGCG CGGACGTGGA CTACGGATAC 180 CTGCTCGACG GCGACGAAAT CCCGCTGCCG GACCCCCGGA CCCGCCGCCA GCCCGAAGGC 240 GTCCATGCCC TGTCCCGGAC CTTCGACCCC GGCGCCCACC GCTGGCAGGA CGCCGGGTGG 300 CAGGGCAGGG AACTCCAGGG CTCCGTGATT TACGAACTCC ACATCGGAAC GTTCACGCCG 360 GAAGGGACGC TGGACGCCGC CGCGGGCAAG CTGGACTACC TCGCCGGCCT GGGCATCGAC 420 TTCATTGAGC TGCTGCCCGT GAATGCCTTC AACGGCACGC ACAACTGGGG CTACGACGGC 480 GTCCAGTGGT TTGCCGTGCA TGAAGGCTAC GGCGGGCCTG CGGCGTACCA GCGGTTCGTG 540 GATGCGGCCC ACGCGGCCGG CCTCGGCGTC ATCCAGGACG TGGTCTACAA CCACCTCGGG 600 CCGAGCGGGA ACTACCTCCC CAGGTACGGC CCGTACCTCA AGCACGGCGA AGGCAACACC 660 TGGGGCGATT CGGTCAACCT GGACGGGCCG GGATCCGACC ACGTCCGCCA GTACATCCTG 720 GACAACGTGG CCATGTGGCT GCGCGACTAC CGGGTGGACG GCCTCCGCCT GGACGCCGTC 780 CACGCCCTGA AGGATGAGCG GGCCGTCCAC ATCCTGGAGG AGTTCGGCGC GCTGGCGGAC 840 GCCCTGTCGT CCGAAGGCGG CCGCCCGCTG ACCCTCATCG CCGAGTCCGA CCTCAACAAT 900 CCGCGGCTGC TGTACCCCCG GGATGTCAAC GGCTACGGAC TGGCCGGCCA GTGGAGCGAC 960 GACTTCCACC ACGCCGTGCA CGTCAACGTC AGCGGGGAAA CCACCGGCTA CTACAGCGAC 1020 TTCGACTCGC TCGGAGCCCT CGCCAAGGTC CTGCGTGACG GGTTCTTCCA CGACGGCAGC 1080 TACTCCAGCT TCCGCGGCCG CTGCCACGGC CGGCCGATCA ACTTCAGCGC CGTGCATCCG 1140 GCCGCGCTGG TGGTCTGCTC ACAGAACCAT GACCAGATCG GCAACCGGGC CACCGGGGAC 1200 CGGCTGTCCC AGTCACTTCC GTACGGCAGC CTGGCCCTGG CCGCCGTGCT GACCCTCACC 1260 GGTCCGTTCA CGCCCATGCT GTTCATGGGA GAGGAATACG GGGCCACCAC CCCGTGGCAG 1320 TTCTTCACCT CGCACCCTGA ACCCGAGCTG GGCAAGGCCA CGGCCGAGGG CAGGATCAGG 1380 GAGTTCGAGC GCATGGGGTG GGATCCCGCC GTCGTGCCCG ATCCGCAGGA TCCGGAGACC 1440 TTCACCCGCT CCAAACTGGA CTGGGCGGAA GCGTCCGCCG GCGATCATGC CCGCCTCCTG 1500 GAGCTGTACC GCTCGCTTAT CACGCTGCGG CGGTCAACTC CGGAGCTCGC GCGCCTGGGC 1560 TTTGCGGACA CCGCCGTCGA GTTCGACGAC GACGCCCGCT GGCTCCGTTA TTGGCGCGGA 1620 GGCGTGCAGG TGGTGCTGAA CTTCGCGGAC CGTCCCATCA GCCTGGACCG GCCGGGAACC 1680 GCGCTGCTGC TCGCCACCGA CGACGCCGTC CGGATGGACG GAGTCCAGGT GGAGCTGCCG 1740 CCGCTGAGCG CCGCGGTTCT GCGCGAC 1767

【００９８】配列番号：4 配列の長さ：1791 配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列 ACGCACACCT ACCCGCGGGA AGCCGCGAAA CCCGTCCTGG GCCCCGCACG CTACGACGTC 60 TGGGCGCCCA ACGCTGAATC CGTGACGCTG CTGGCCGGCG GGGAGCGCTA CGCCATGCAG 120 CGCCGGGCCG AGACCGGGCC GGAGGACGCC GGCTGGTGGA CCGCCGCCGG CGCGCCTACG 180 GATGGCAACG TGGACTACGG GTACCTTCTG GACGGCGACG AAACACCGCT TCCGGATCCA 240 CGGACCCGCC GCCAGCCCGA CGGCGTCCAC GCCCTGTCCC GCACGTTCGA CCCGTCCGCG 300 TACAGCTGGC AGGACGACGC CTGGCAGGGC AGGGAACTGC AGGGCGCCGT CATCTACGAG 360 CTCCACCTCG GAACATTCAC GCCCGAAGGG ACGCTGGAGG CGGCCGCCGG AAAGCTGGAC 420 TACCTCGCCG GCTTGGGCGT CGACTTCATC GAGCTGCTGC CGGTGAACGC TTTCAACGGC 480 ACGCACAACT GGGGTTACGA CGGTGTCCAG TGGTTCGCTG TGCACGAGGC ATACGGCGGG 540 CCGGAAGCGT ACCAGCGGTT CGTCGACGCC GCCCACGCCG CAGGCCTTGG CGTGATCCAG 600 GACGTGGTCT ACAACCACCT CGGCCCCAGC GGGAACTACC TGCCGCGGTT CGGGCCGTAC 660 CTCAAGCAGG GCGAGGGTAA CACGTGGGGC GACTCGGTGA ACCTGGACGG GCCCGGCTCC 720 GACCATGTGC GCCGGTACAT CCTGGACAAC CTGGCCATGT GGCTGCGTGA CTACCGGGTG 780 GACGGCCTGC GGCTGGACGC CGTCCACGCC CTGAAGGATG AGCGGGCGGT GCACATCCTG 840 GAGGACTTCG GGGCGCTGGC CGATCAGATC TCCGCCGAGG TGGGACGGCC GCTGACGCTC 900 ATCGCCGAGT CCGACCTCAA CAACCCGCGG CTGCTGTACC CGCGGGACGT CAACGGGTAC 960 GGGCTGGAAG GGCAGTGGAG CGACGACTTC CACCACGCCG TCCACGTCAA CGTCACCGGC 1020 GAAACCACCG GCTACTACAG TGACTTCGAC TCGCTGGCCG CCCTCGCCAA GGTGCTCCGG 1080 GACGGCTTCT TCCACGACGG CAGCTACTCC AGCTTCCGGG AACGCCACCA CGGACGGCCG 1140 ATTAATTTCA GCGCCGTACA CCCAGCCGCC CTGGTGGTCT GTTCGCAGAA CCACGACCAG 1200 ATCGGCAACC GTGCCACGGG GGACCGGCTC TCCCAGACCC TGCCGTACGG AAGCCTGGCC 1260 CTCGCTGCGG TGCTGACCCT GACGGGACCC TTCACGCCCA TGCTGCTCAT GGGCGAGGAG 1320 TACGGCGCCA GCACGCCGTG GCAGTTTTTC ACCTCGCACC CGGAGCCGGA GCTCGGCAAG 1380 GCCACCGCGG AGGGCCGGAT CAAGGAGTTC GAGCGCATGG GGTGGGATCC CGCCGTCGTG 1440 CCCGATCCCC AGGATCCTGA GACGTTCCGC CGGTCCAAGC TGGACTGGGC GGAAGCCGCC 1500 GAAGGCGACC ATGCCCGGCT GCTGGAGCTG TACCGTTCGC TCACCGCCCT GCGCCGCTCC 1560 ACGCCGGACC TCACCAAGCT GGGCTTCGAG GACACGCAGG TGGCGTTCGA CGAGGACGCC 1620 CGCTGGCTGC GGTTCCGCCG GGGTGGCGTG CAGGTGCTGC TCAACTTCTC GGAACAGCCC 1680 GTGAGCCTGG ACGGGGCGGG CACGGCCCTG CTGCTGGCCA CCGACGACGC CGTCCGGCTA 1740 GAAGGTGAGC GTGCGGAACT CGGTCCGCTG AGCGCCGCCG TCGTCAGCGA C 1791

【００９９】配列番号：5 配列の長さ：2161 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴起源生物名：リゾビウム・スピーシーズ(Rhizobium sp.) 株名：M-11(FERM BP-4130) 配列の特徴特徴を表わす記号：5´UTR 存在位置：1..206 特徴を決定した方法：E 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：207..1994 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：3´UTR 存在位置：1995..2161 特徴を決定した方法：E 配列 GGCGCCGGGG GAGTGCTGGC GCTTGCCACC CGGCTCCCCT ACGGGCTGGA ACAGTCGGGC 60 GGCTGGCGGG ACACCGCCGT CGAGCTTGAA GCCGCCATGA CGGACGAACT GACCGGCTCC 120 ACTTTCGGGC CGGGACCGGC GGCGCTGTCA GAAGTCTTCC GGGCCTACCC GGTGGCCTTG 180 TTGGTCCCCG CGACAGGAGG CAAGTC 206 ATG ACG CAG CCC AAC GAT GCG GCC AAG CCG GTG CAG GGA GCG GGG CGC 254 Met Thr Gln Pro Asn Asp Ala Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg 1 5 10 15 TTC GAT ATC TGG GCG CCC GAG GCA GGC ACC GTA ACG CTG CTG GCC GGC 302 Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala Gly Thr Val Thr Leu Leu Ala Gly 20 25 30 GGG GAG CGC TAC GAG ATG GGC CGC CGC CCC GGC AAC GGG CCG GCG GAC 350 Gly Glu Arg Tyr Glu Met Gly Arg Arg Pro Gly Asn Gly Pro Ala Asp 35 40 45 GAA GGC TGG TGG ACG GCC GCG GAT GCA CCG ACA GGC GCG GAC GTG GAC 398 Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ala Asp Ala Pro Thr Gly Ala Asp Val Asp 50 55 60 TAC GGA TAC CTG CTC GAC GGC GAC GAA ATC CCG CTG CCG GAC CCC CGG 446 Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ile Pro Leu Pro Asp Pro Arg 65 70 75 80 ACC CGC CGC CAG CCC GAA GGC GTC CAT GCC CTG TCC CGG ACC TTC GAC 494 Thr Arg Arg Gln Pro Glu Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp 85 90 95 CCC GGC GCC CAC CGC TGG CAG GAC GCC GGG TGG CAG GGC AGG GAA CTC 542 Pro Gly Ala His Arg Trp Gln Asp Ala Gly Trp Gln Gly Arg Glu Leu 100 105 110 CAG GGC TCC GTG ATT TAC GAA CTC CAC ATC GGA ACG TTC ACG CCG GAA 590 Gln Gly Ser Val Ile Tyr Glu Leu His Ile Gly Thr Phe Thr Pro Glu 115 120 125 GGG ACG CTG GAC GCC GCC GCG GGC AAG CTG GAC TAC CTC GCC GGC CTG 638 Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu 130 135 140 GGC ATC GAC TTC ATT GAG CTG CTG CCC GTG AAT GCC TTC AAC GGC ACG 686 Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr 145 150 155 160 CAC AAC TGG GGC TAC GAC GGC GTC CAG TGG TTT GCC GTG CAT GAA GGC 734 His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Gly 165 170 175 TAC GGC GGG CCT GCG GCG TAC CAG CGG TTC GTG GAT GCG GCC CAC GCG 782 Tyr Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala 180 185 190 GCC GGC CTC GGC GTC ATC CAG GAC GTG GTC TAC AAC CAC CTC GGG CCG 830 Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro 195 200 205 AGC GGG AAC TAC CTC CCC AGG TAC GGC CCG TAC CTC AAG CAC GGC GAA 878 Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Tyr Gly Pro Tyr Leu Lys His Gly Glu 210 215 220 GGC AAC ACC TGG GGC GAT TCG GTC AAC CTG GAC GGG CCG GGA TCC GAC 926 Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp 225 230 235 240 CAC GTC CGC CAG TAC ATC CTG GAC AAC GTG GCC ATG TGG CTG CGC GAC 974 His Val Arg Gln Tyr Ile Leu Asp Asn Val Ala Met Trp Leu Arg Asp 245 250 255 TAC CGG GTG GAC GGC CTC CGC CTG GAC GCC GTC CAC GCC CTG AAG GAT 1022 Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp 260 265 270 GAG CGG GCC GTC CAC ATC CTG GAG GAG TTC GGC GCG CTG GCG GAC GCC 1070 Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Glu Phe Gly Ala Leu Ala Asp Ala 275 280 285 CTG TCG TCC GAA GGC GGC CGC CCG CTG ACC CTC ATC GCC GAG TCC GAC 1118 Leu Ser Ser Glu Gly Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp 290 295 300 CTC AAC AAT CCG CGG CTG CTG TAC CCC CGG GAT GTC AAC GGC TAC GGA 1166 Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly 305 310 315 320 CTG GCC GGC CAG TGG AGC GAC GAC TTC CAC CAC GCC GTG CAC GTC AAC 1214 Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn 325 330 335 GTC AGC GGG GAA ACC ACC GGC TAC TAC AGC GAC TTC GAC TCG CTC GGA 1262 Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu Gly 340 345 350 GCC CTC GCC AAG GTC CTG CGT GAC GGG TTC TTC CAC GAC GGC AGC TAC 1310 Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly Ser Tyr 355 360 365 TCC AGC TTC CGC GGC CGC TGC CAC GGC CGG CCG ATC AAC TTC AGC GCC 1358 Ser Ser Phe Arg Gly Arg Cys His Gly Arg Pro Ile Asn Phe Ser Ala 370 375 380 GTG CAT CCG GCC GCG CTG GTG GTC TGC TCA CAG AAC CAT GAC CAG ATC 1406 Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp Gln Ile 385 390 395 400 GGC AAC CGG GCC ACC GGG GAC CGG CTG TCC CAG TCA CTT CCG TAC GGC 1454 Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro Tyr Gly 405 410 415 AGC CTG GCC CTG GCC GCC GTG CTG ACC CTC ACC GGT CCG TTC ACG CCC 1502 Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro 420 425 430 ATG CTG TTC ATG GGA GAG GAA TAC GGG GCC ACC ACC CCG TGG CAG TTC 1550 Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Pro Trp Gln Phe 435 440 445 TTC ACC TCG CAC CCT GAA CCC GAG CTG GGC AAG GCC ACG GCC GAG GGC 1598 Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly 450 455 460 AGG ATC AGG GAG TTC GAG CGC ATG GGG TGG GAT CCC GCC GTC GTG CCC 1646 Arg Ile Arg Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro 465 470 475 480 GAT CCG CAG GAT CCG GAG ACC TTC ACC CGC TCC AAA CTG GAC TGG GCG 1694 Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Thr Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala 485 490 495 GAA GCG TCC GCC GGC GAT CAT GCC CGC CTC CTG GAG CTG TAC CGC TCG 1742 Glu Ala Ser Ala Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser 500 505 510 CTT ATC ACG CTG CGG CGG TCA ACT CCG GAG CTC GCG CGC CTG GGC TTT 1790 Leu Ile Thr Leu Arg Arg Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Leu Gly Phe 515 520 525 GCG GAC ACC GCC GTC GAG TTC GAC GAC GAC GCC CGC TGG CTC CGT TAT 1838 Ala Asp Thr Ala Val Glu Phe Asp Asp Asp Ala Arg Trp Leu Arg Tyr 530 535 540 TGG CGC GGA GGC GTG CAG GTG GTG CTG AAC TTC GCG GAC CGT CCC ATC 1886 Trp Arg Gly Gly Val Gln Val Val Leu Asn Phe Ala Asp Arg Pro Ile 545 550 555 560 AGC CTG GAC CGG CCG GGA ACC GCG CTG CTG CTC GCC ACC GAC GAC GCC 1934 Ser Leu Asp Arg Pro Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala 565 570 575 GTC CGG ATG GAC GGA GTC CAG GTG GAG CTG CCG CCG CTG AGC GCC GCG 1982 Val Arg Met Asp Gly Val Gln Val Glu Leu Pro Pro Leu Ser Ala Ala 580 585 590 GTT CTG CGC GAC 1994 Val Leu Arg Asp 595 TGAGCGTGCG CGCCTTCGGG GCGGGCGTCC TTCCGGTGAC CGGATGCTGG ACGCCCGCCC 2054 CGCAGCTCCA CAGGCGCTGG CAGGATGGAA CGTATGACTT TTCTGGCAGC GGACAACCGC 2114 TACGAAACCA TGCCATACCG CCGCGTCGGA CGCAGCGGGC TGAAGCT 2161

【０１００】配列番号：6 配列の長さ：2056 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴起源生物名：アルスロバクター・スピーシーズ(Arthrobacte
r sp.) 株名：Q36(FERM BP-4316) 配列の特徴特徴を表わす記号：5´UTR 存在位置：1..89 特徴を決定した方法：E 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：90..1883 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：3´UTR 存在位置：1884..2056 特徴を決定した方法：E 配列 GCCGGCTTCG GACCGGGGGC AGTGAAGATC GCCGACATCT TCCGGTCGTT CCCCGTTGCG 60 CTGCTGGTGC CGCAGACAGG AGGAGAGTC 89 ATG ACG CAC ACC TAC CCG CGG GAA GCC GCG AAA CCC GTC CTG GGC CCC 137 Met Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro 1 5 10 15 GCA CGC TAC GAC GTC TGG GCG CCC AAC GCT GAA TCC GTG ACG CTG CTG 185 Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu 20 25 30 GCC GGC GGG GAG CGC TAC GCC ATG CAG CGC CGG GCC GAG ACC GGG CCG 233 Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro 35 40 45 GAG GAC GCC GGC TGG TGG ACC GCC GCC GGC GCG CCT ACG GAT GGC AAC 281 Glu Asp Ala Gly Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn 50 55 60 GTG GAC TAC GGG TAC CTT CTG GAC GGC GAC GAA ACA CCG CTT CCG GAT 329 Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp 65 70 75 80 CCA CGG ACC CGC CGC CAG CCC GAC GGC GTC CAC GCC CTG TCC CGC ACG 377 Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr 85 90 95 TTC GAC CCG TCC GCG TAC AGC TGG CAG GAC GAC GCC TGG CAG GGC AGG 425 Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg 100 105 110 GAA CTG CAG GGC GCC GTC ATC TAC GAG CTC CAC CTC GGA ACA TTC ACG 473 Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr 115 120 125 CCC GAA GGG ACG CTG GAG GCG GCC GCC GGA AAG CTG GAC TAC CTC GCC 521 Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala 130 135 140 GGC TTG GGC GTC GAC TTC ATC GAG CTG CTG CCG GTG AAC GCT TTC AAC 569 Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn 145 150 155 160 GGC ACG CAC AAC TGG GGT TAC GAC GGT GTC CAG TGG TTC GCT GTG CAC 617 Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His 165 170 175 GAG GCA TAC GGC GGG CCG GAA GCG TAC CAG CGG TTC GTC GAC GCC GCC 665 Glu Asp Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala 180 185 190 CAC GCC GCA GGC CTT GGC GTG ATC CAG GAC GTG GTC TAC AAC CAC CTC 713 His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu 195 200 205 GGC CCC AGC GGG AAC TAC CTG CCG CGG TTC GGG CCG TAC CTC AAG CAG 761 Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu Lys Gln 210 215 220 GGC GAG GGT AAC ACG TGG GGC GAC TCG GTG AAC CTG GAC GGG CCC GGC 809 Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly 225 230 235 240 TCC GAC CAT GTG CGC CGG TAC ATC CTG GAC AAC CTG GCC ATG TGG CTG 857 Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu 245 250 255 CGT GAC TAC CGG GTG GAC GGC CTG CGG CTG GAC GCC GTC CAC GCC CTG 905 Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu 260 265 270 AAG GAT GAG CGG GCG GTG CAC ATC CTG GAG GAC TTC GGG GCG CTG GCC 953 Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala 275 280 285 GAT CAG ATC TCC GCC GAG GTG GGA CGG CCG CTG ACG CTC ATC GCC GAG 1001 Asp Gln Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu 290 295 300 TCC GAC CTC AAC AAC CCG CGG CTG CTG TAC CCG CGG GAC GTC AAC GGG 1049 Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly 305 310 315 320 TAC GGG CTG GAA GGG CAG TGG AGC GAC GAC TTC CAC CAC GCC GTC CAC 1097 Tyr Gly Leu Glu Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His 325 330 335 GTC AAC GTC ACC GGC GAA ACC ACC GGC TAC TAC AGT GAC TTC GAC TCG 1145 Val Asn Val Thr Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser 340 345 350 CTG GCC GCC CTC GCC AAG GTG CTC CGG GAC GGC TTC TTC CAC GAC GGC 1193 Leu Ala Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly 355 360 365 AGC TAC TCC AGC TTC CGG GAA CGC CAC CAC GGA CGG CCG ATT AAT TTC 1241 Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe 370 375 380 AGC GCC GTA CAC CCA GCC GCC CTG GTG GTC TGT TCG CAG AAC CAC GAC 1289 Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp 385 390 395 400 CAG ATC GGC AAC CGT GCC ACG GGG GAC CGG CTC TCC CAG ACC CTG CCG 1337 Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro 405 410 415 TAC GGA AGC CTG GCC CTC GCT GCG GTG CTG ACC CTG ACG GGA CCC TTC 1385 Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe 420 425 430 ACG CCC ATG CTG CTC ATG GGC GAG GAG TAC GGC GCC AGC ACG CCG TGG 1433 Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Trp 435 440 445 CAG TTT TTC ACC TCG CAC CCG GAG CCG GAG CTC GGC AAG GCC ACC GCG 1481 Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala 450 455 460 GAG GGC CGG ATC AAG GAG TTC GAG CGC ATG GGG TGG GAT CCC GCC GTC 1529 Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val 465 470 475 480 GTG CCC GAT CCC CAG GAT CCT GAG ACG TTC CGC CGG TCC AAG CTG GAC 1577 Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp 485 490 495 TGG GCG GAA GCC GCC GAA GGC GAC CAT GCC CGG CTG CTG GAG CTG TAC 1625 Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr 500 505 510 CGT TCG CTC ACC GCC CTG CGC CGC TCC ACG CCG GAC CTC ACC AAG CTG 1673 Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu 515 520 525 GGC TTC GAG GAC ACG CAG GTG GCG TTC GAC GAG GAC GCC CGC TGG CTG 1721 Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu 530 535 540 CGG TTC CGC CGG GGT GGC GTG CAG GTG CTG CTC AAC TTC TCG GAA CAG 1769 545 550 555 560 CCC GTG AGC CTG GAC GGG GCG GGC ACG GCC CTG CTG CTG GCC ACC GAC 1817 Pro Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp 565 570 575 GAC GCC GTC CGG CTA GAA GGT GAG CGT GCG GAA CTC GGT CCG CTG AGC 1865 Asp Ala Val Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser 580 585 590 GCC GCC GTC GTC AGC GAC 1883 Ala Ala Val Val Ser Asp 595 TGACGTTTTC TTGGGGGCGG CGTCCACCGC CGGTGACCGG ATGGTGGACG TCCGCCCCGA 1943 AGCCTCGGCG CGGCTGGCAG GATGGAACGC ATGACTTATG TGGCCTCGGA CACCCGCTAC 2003 GACACCATGC CCTACCGCCG CGTCGGACGC AGCGGCCTCA AACTGCCGGC CAT 2056

【０１０１】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列 Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Gly Thr Val 20

【０１０２】配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：Ｎ末端フラグメント配列 Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Val 20

【０１０３】配列番号：9 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメ
ント配列 Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala Gly Thr 1 5 10 15 Val Thr Leu Leu 20

【０１０４】配列番号：10 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ser Ala Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu 1 5 10 15

【０１０５】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp 1 5 10 15 Pro Glu Thr 20

【０１０６】配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列 Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Thr Leu 20

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素Ｍ−１１の至適温度を示す図である。

【図２】酵素Ｑ３６の至適温度を示す図である。

【図３】酵素Ｍ−１１の至適ｐＨを示す図である。

【図４】酵素Ｑ３６の至適ｐＨを示す図である。

【図５】酵素Ｍ−１１の熱安定性を示す図である。

【図６】酵素Ｑ３６の熱安定性を示す図である。

【図７】酵素Ｍ−１１のｐＨ安定性を示す図である。

【図８】酵素Ｑ３６のｐＨ安定性を示す図である。

【図９】この発明による組換えＤＮＡｐＢＭＵ２７の
制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した部
分は酵素Ｍ−１１をコードするＤＮＡである。

【図１０】この発明による組換えＤＮＡｐＢＲＴ３２
の制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した
部分は酵素Ｑ３６をコードするＤＮＡである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ // Ａ２３Ｌ 1/236 ＡＡ６１Ｋ 7/00 ＦＣ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:06）Ｃ１２Ｒ 1:41） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:06）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】末端にトレハロース構造を有するグルコ
ース重合度３以上の非還元性糖質からトレハロースを遊
離する組換え型酵素。
【請求項２】下記の理化学的性質を有する請求項１に
記載の組換え型酵素。（１）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（２）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
【請求項３】配列表における配列番号１又は２に示す
アミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列を有する請
求項１又は２に記載の組換え型酵素。
【請求項４】請求項１に記載の組換え型酵素を産生す
る形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取
する組換え型酵素の製造方法。
【請求項５】組換え型酵素が下記の理化学的性質を有
する請求項４に記載の組換え型酵素の製造方法。（１）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（２）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
【請求項６】組換え型酵素が配列表における配列番号
１又は２に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸
配列を有する請求項４又は５に記載の組換え型酵素の製
造方法。
【請求項７】形質転換体が、末端にトレハロース構造
を有するグルコース重合度３以上の非還元性糖質からト
レハロースを遊離する酵素をコードするＤＮＡと自律複
製可能なベクターを含む組換えＤＮＡを適宜宿主に導入
してなる請求項４、５又は６に記載の組換え型酵素の製
造方法。
【請求項８】ＤＮＡが配列表における配列番号３又は
４に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれら
に相補的な塩基配列を有する請求項７に記載の組換え型
酵素の製造方法。
【請求項９】ＤＮＡが、遺伝子コードの縮重に基づ
き、配列表における配列番号１又は２に示すアミノ酸配
列を変えることなく、配列表における配列番号３又は４
に示す塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の
塩基で置換したものである請求項７又は８に記載の組換
え型酵素の製造方法。
【請求項１０】ＤＮＡが配列表における配列番号５又
は６に示す塩基配列を有する請求項７、８又は９に記載
の組換え型酵素の製造方法。
【請求項１１】ＤＮＡがリゾビウム属、アルスロバク
ター属、ブレビバクテリウム属又はミクロコッカス属の
微生物に由来する請求項７、８、９又は１０に記載の組
換え型酵素の製造方法。
【請求項１２】宿主が大腸菌である請求項７、８、
９、１０又は１１に記載の組換え型酵素の製造方法。
【請求項１３】自律複製可能なベクターがプラスミド
ベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）であ
る請求項７、８、９、１０、１１又は１２に記載の組換
え型酵素の製造方法。
【請求項１４】形質転換体を炭素源及び窒素源を含む
ｐＨ２乃至８の液体培地に植菌し、温度２５乃至６５℃
で１乃至６日間培養する請求項４、５、６、７、８、
９、１０、１１、１２又は１３に記載の組換え型酵素の
製造方法。
【請求項１５】培養物中の組換え型酵素を遠心分離、
濾過、濃縮、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ
ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動及び／又は等電点電気泳動により採取する請求項４、
５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４
に記載の組換え型酵素の製造方法。
【請求項１６】末端にトレハロース構造を有するグル
コース重合度３以上の非還元性糖質に請求項１に記載の
組換え型酵素を作用させて該非還元性糖質からトレハロ
ースを遊離させる工程を含んでなる非還元性糖質の変換
方法。
【請求項１７】組換え型酵素が下記の理化学的性質を
有する請求項１６に記載の非還元性糖質の変換方法。（１）分子量約５７，０００乃至６８，０００ダルトン（ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動）（２）等電点約３．３乃至４．６（等電点電気泳動）
【請求項１８】組換え型酵素が配列表における配列番
号１又は２に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ
酸配列を有する請求項１６又は１７に記載の非還元性糖
質の変換方法。
【請求項１９】非還元性糖質の濃度が５０％（ｗ／
ｗ）以下の水溶液中に組換え型酵素を共存せしめ、温度
４０乃至５５℃、ｐＨ５乃至１０で作用させる請求項１
６、１７又は１８に記載の非還元性糖質の変換方法。
【請求項２０】非還元性糖質がα−グルコシルトレハ
ロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリ
オシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロ
ース又はα−マルトペンタオシルトレハロースである請
求項１６、１７、１８又は１９に記載の非還元性糖質の
変換方法。