JPH07298880A - 組換え型酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents

組換え型酵素とその製造方法並びに用途

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JPH07298880A
JPH07298880A JP7072533A JP7253395A JPH07298880A JP H07298880 A JPH07298880 A JP H07298880A JP 7072533 A JP7072533 A JP 7072533A JP 7253395 A JP7253395 A JP 7253395A JP H07298880 A JPH07298880 A JP H07298880A
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Toshiyuki Sugimoto
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 末端にトレハロース構造を有するグルコース
重合度3以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離す
る組換え型酵素と、その酵素の製造方法並びに用途を提
供する。 【構成】 特定の作用を有する組換え型酵素と、その組
換え型酵素を産生する形質転換体を培養し、培養物から
組換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法と、末
端にトレハロース構造を有するグルコース重合度3以上
の非還元性糖質に組換え型酵素を作用させてその非還元
性糖質からトレハロースを遊離させる工程を含んでなる
非還元性糖質の変換方法を構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】この発明は、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度3以上の非還元性糖質か
らトレハロースを遊離する組換え型酵素と、その製造方
法並びに用途に関するものである。
【0002】
【従来の技術】トレハロースは、グルコース2分子が還
元性基同士結合した二糖類であり、天然には細菌、真
菌、藻類、昆虫などに微量存在する。トレハロースは分
子中に還元性基を持たないので、アミノ酸類の存在下で
加熱しても褐変反応を起こすことがなく、着色や変質の
懸念なく飲食物を甘味付けできる利点がある。しかしな
がら、従来の製造方法では所望量を入手するのが難し
く、実際に飲食物の甘味付けに使われることは殆どなか
った。
【0003】これまでの製造方法は、微生物の菌体を利
用する方法と、糖質に複合酵素系を作用させる方法とに
大別される。前者の方法は、特開昭50−154485
号公報などにも見られるように、細菌、酵母などの微生
物を栄養培地で増殖させ、培養物中の菌体からトレハロ
ースを採取するものである。一方、後者の方法は、特開
昭58−216695号公報などにも見られるように、
基質にマルトースを使用し、これにマルトース・フォス
フォリラーゼとトレハロース・フォスフォリラーゼから
なる複合酵素系を作用させ、生成したトレハロースを系
外に取出すものである。前者の方法は、微生物そのもの
の増殖は比較的容易なものの、トレハロースを菌体から
採取するのに一連の繁雑な工程を要し、しかも、菌体に
含まれるトレハロースが15%(w/w)と僅少である
という問題があった。後者の方法は、トレハロースその
ものの分離は比較的容易なものの、反応自体が2種類の
酵素による平衡反応であり、しかも、その平衡が常時グ
ルコース燐酸側に傾いていることから、基質を高濃度に
して反応させ、トレハロースの収量を上げることが原理
的に難しかった。
【0004】斯かる状況に鑑み、本発明者が、澱粉糖か
らトレハロース構造を有する糖質を生成する酵素につき
鋭意検索したところ、リゾビウム・スピーシーズM−1
1やアルスロバクター・スピーシーズQ36などの微生
物がグルコース重合度3以上の還元性澱粉糖から末端に
トレハロース構造を有する非還元性糖質を生成するとい
う、従来未知の全く新規な酵素を産生することが判明し
た。この知見とあい前後して、この非還元性糖質は、同
じくリゾビウム・スピーシーズM−11やアルスロバク
ター・スピーシーズQ36などが産生する別の酵素によ
り、ほぼ定量的にトレハロースとグルコース及び/又は
マルトオリゴ糖に加水分解されることが判明した。これ
ら酵素を併用することにより、澱粉を原料に所望量のト
レハロースが比較的容易に得られることとなり、トレハ
ロースに係わる前記課題は悉く解決されていくものと期
待される。しかしながら、リゾビウム・スピーシーズM
−11もアルスロバクター・スピーシーズQ36もこれ
ら酵素の産生能が充分でなく、トレハロースや末端にト
レハロース構造を有する非還元性糖質を大規模に製造し
ようとすると、微生物を大量に培養しなければならない
という問題がある。
【0005】一方、昨今の組換えDNA技術の進歩には
目覚しいものがある。今日では、全アミノ酸配列が解明
されていない酵素であっても、これをコードする遺伝子
を単離し、その塩基配列を解明できれば、その酵素をコ
ードするDNAを含む組換えDNAを作製し、これを微
生物や動植物の細胞に導入して得られる形質転換体を培
養することにより、比較的容易に所望量の酵素が取得で
きるようになった。斯かる状況に鑑み、両酵素をコード
する遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急
務となっている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】この発明の目的は、組
換えDNA技術を応用して斯かる酵素を創製することに
ある。
【0007】この発明の別の目的は、その創製された酵
素の製造方法を提供することにある。
【0008】この発明のさらに別の目的は、その創製さ
れた酵素を使用する末端にトレハロース構造を有する非
還元性糖質の変換方法を提供することにある。
【0009】
【課題を解決するための手段】この発明は、前記第一の
課題を、末端にトレハロース構造を有するグルコース重
合度3以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する
組換え型酵素により解決するものである。
【0010】この発明は、前記第二の課題を、その組換
え型酵素を産生する形質転換体を培養し、培養物から組
換え型酵素を採取する組換え型酵素の製造方法により解
決するものである。
【0011】この発明は、前記第三の課題を、末端にト
レハロース構造を有するグルコース重合度3以上の非還
元性糖質にその組換え型酵素を作用させて該非還元性糖
質からトレハロースを遊離させる工程を含んでなる非還
元糖質の変換方法により解決するものである。
【0012】
【作用】この発明による組換え型酵素は、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度3以上の非還元性
糖質に作用してトレハロースを遊離する。
【0013】この発明の製造方法にしたがって形質転換
体を培養すれば、所望量の組換え型酵素が比較的容易に
得られる。
【0014】この発明の変換方法により、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度3以上の非還元性
糖質は、トレハロースとグルコース及び/又はマルトオ
リゴ糖からなる糖組成物に変換される。
【0015】この発明は、末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度3以上の非還元性糖質からトレハ
ロースを遊離する、従来未知の全く新規な酵素の発見に
基づくものである。斯かる酵素はリゾビウム・スピーシ
ーズM−11やアルスロバクター・スピーシーズQ36
の培養物から得ることができ、本発明者がカラムクロマ
トグラフィーを中心とする種々の精製方法を組合せてこ
の酵素を単離し、その性質・性状を調べたところ、その
本質はポリペプチドであり、次のような理化学的性質を
有することが判明した。 (1) 作用 末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度3以
上の非還元性糖質からトレハロースを遊離する。 (2) 分子量 約57,000乃至68,000ダルトン(SDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動) (3) 等電点 約3.3乃至4.6(等電点電気泳動) (4) 至適温度 pH7.0で30分間インキュベートすると、35乃至
45℃付近に至適温度を示す。 (5) 至適pH 40℃で30分間インキュベートすると、pH6.0乃
至7.5付近に至適pHを示す。 (6) 熱安定性 pH7.0で60分間インキュベートすると、30乃至
45℃付近まで安定である。 (7) pH安定性 25℃で16時間インキュベートすると、pH5.5乃
至10.0付近まで安定である。
【0016】次に、リゾビウム・スピーシーズM−11
又はアルスロバクター・スピーシーズQ36が産生する
酵素(以下、それぞれ「酵素M−11」又は「酵素Q3
6」と言う。)の理化学的性質を解明すべく行なった実
験について説明する。
【0017】
【実験例1 酵素の精製】
【0018】
【実験例1−1 酵素M−11の精製】500ml容三
角フラスコに松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデ
ックス#4』2.0%(w/v)、ペプトン0.5%
(w/v)、酵母エキス0.1%(w/v)、燐酸水素
二ナトリウム0.1%(w/v)及び燐酸二水素カリウ
ム0.1%(w/v)を含む液体培地(pH7.0)を
100mlずつとり、120℃で20分間オートクレー
ブして滅菌した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に
リゾビウム・スピーシーズM−11を植菌し、回転振盪
下、27℃で24時間種培養した。別途、30l容ジャ
ーファーメンタに上記と同組成の液体培地を20lと
り、滅菌後、上記で得た種培養液を1%(v/v)接種
し、液体培地をpH6乃至8に保ちつつ、30℃で24
時間通気撹拌培養した。
【0019】次に、上記で得た培養物約18lを超高圧
菌体破砕装置にとり、菌体を破砕後、遠心分離により採
取した上清約16lに硫酸アンモニウムを20%飽和に
なるように加え、4℃で1時間静置後、遠心分離により
沈澱部を除去した。得られた上清に60%飽和になるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、4℃で24時間静置後、
沈澱部を遠心分離により採取し、最少量の10mM燐酸
緩衝液(pH7.0)に溶解し、10mM燐酸緩衝液
(pH7.0)に対して24時間透析後、遠心分離によ
り不溶物を除去した。得られた上清を予め10mM燐酸
緩衝液(pH7.0)により平衡化させておいた東ソー
製イオン交換クロマトグラフィー用カラム『DEAE−
トヨパール』に負荷し、0Mから0.5Mに上昇する塩
化ナトリウムの濃度勾配下、カラムに10mM燐酸緩衝
液(pH7.0)を通液した。溶出液より酵素を含む画
分を採取し、2M硫酸アンモニウムを含む50mM燐酸
緩衝液(pH7.0)に対して10時間透析後、遠心分
離により不溶物を除去した。その後、上清を予め2M硫
酸アンモニウムを含む50mM燐酸緩衝液(pH7.
0)により平衡化させておいた東ソー製疎水クロマトグ
ラフィー用カラム『ブチルトヨパール』に負荷し、2M
から0Mに低下する硫酸アンモニウムの濃度勾配下、カ
ラムに50mM燐酸緩衝液(pH7.0)を通液した。
溶出液から酵素を含む画分を採取し、予め50mM燐酸
緩衝液(pH7.0)により平衡化させておいた東ソー
製ゲル濾過カラムクロマトグラフィー用カラム『トヨパ
ールHW−55』に負荷し、カラムに50mM燐酸緩衝
液(pH7.0)を通液し、溶出液から酵素を含む画分
を採取した。このようにして精製した酵素M−11の比
活性は約240単位/mg蛋白質であり、収量は培養物
1l当たり約650単位であった。
【0020】なお、この発明を通じて、酵素の活性は次
の方法により測定した活性値(単位)で表示する。すな
わち、α−マルトトリオシルトレハロースを1.25%
(w/v)含む50mM燐酸緩衝液(pH7.0)を4
mlとり、これに酵素液を1ml加え、40℃で30分
間インキュベートして反応させる。そして、反応液を1
mlとり、ソモギ銅液2mlに加えて反応を停止させた
後、ソモギ・ネルソン法により還元力を測定する。対照
には、予め100℃で10分間加熱して失活させた酵素
を上記と同様に処理する。当該酵素の1単位とは、上記
条件下において、1分間に1μmolのグルコースに相
当する還元力を増加させる酵素の量と定義する。
【0021】
【実験例1−2 酵素Q36の精製】実験例1−1と同
様にアルスロバクター・スピーシーズQ36を培養し、
培養物を処理したところ、比活性約450単位/mg蛋
白質の精製酵素Q36が、培養物1l当たり、約650
単位の収量で得られた。
【0022】
【実験例2 酵素の理化学的性質】
【0023】
【実験例2−1 作用】特願平5−349216号明細
書に開示された方法により、α−グルコシルトレハロー
ス、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリオシ
ルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロース
又はα−マルトペンタオシルトレハロースを固形分当た
り98%以上含む非還元性糖質を調製した。そして、そ
のいずれかを基質として50mM燐酸緩衝液(pH7.
0)に濃度20%(w/v)になるように溶解し、溶液
に実験例1で得た精製酵素M−11又は酵素Q36を基
質1g当たり2単位加え、40℃で48時間反応させ
た。常法により反応物を脱塩した後、和光純薬製高速液
体クロマトグラフィー用カラム『WB−T−330』に
負荷し、溶出液の糖濃度を東ソー製示差屈折計『RI−
8012型』でモニターしながら、室温下にてカラムに
蒸留水を0.5ml/分の流速で通液することにより、
反応物に含まれる糖質を分離した。別途、非還元性糖質
に代えて高純度のマルトトリオース、マルトテトラオー
ス、マルトペンタオース、マルトヘキサオース及びマル
トヘプタオースのいずれかを含む水溶液を上記と同様に
処理し、処理物を分析して対照とした。表1及び表2
に、それぞれ、M−11及びQ36を加えた場合の基質
並びに反応物の糖組成を示す。
【0024】
【表1】
【0025】
【表2】
【0026】表1及び表2に示すように、酵素M−11
及び酵素Q36は、末端にトレハロース構造を有するグ
ルコース重合度3以上の非還元性糖質からトレハロース
とグルコース又はマルトオリゴ糖をほぼ定量的に遊離し
た。一方、グルコース重合度3以上のマルトオリゴ糖を
基質にすると、両酵素とも全く作用を示さなかった。こ
れらの事実は、当該酵素が末端にトレハロース構造を有
するグルコース重合度3以上の非還元性糖質に選択的に
作用し、そのトレハロース残基とグリコシル残基間のグ
リコシド結合を特異的に加水分解することを示唆してい
る。斯かる酵素作用は未だ報告されておらず、全く新規
な作用機序を辿るものと推定される。
【0027】
【実験例2−2 分子量】ユー・ケー・レムリが『ネー
チャー』、第227巻、第680〜685頁(1970
年)に報告している方法に準じて精製酵素をSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動したところ、酵素M−1
1、酵素Q36とも、分子量約57,000乃至68,
000ダルトンに相当する位置に単一バンドを示した。
なお、このときの分子量マーカは、ミオシン(200,
000ダルトン)、β−ガラクトシダーゼ(116,2
50ダルトン)、フォスフォリラーゼB(97,400
ダルトン)、血清アルブミン(66,200ダルトン)
及びオボアルブミン(45,000ダルトン)であっ
た。
【0028】
【実験例2−3 等電点】等電点電気泳動法により測定
したところ、酵素M−11、酵素Q36とも、約3.3
乃至4.6に等電点を示した。
【0029】
【実験例2−4 至適温度】常法により、50mM燐酸
緩衝液(pH7.0)中で30分間インキュベートする
条件で試験したところ、図1又は図2に示すように、酵
素M−11、酵素Q36とも、35乃至45℃付近に至
適温度を示した。
【0030】
【実験例2−5 至適pH】常法により、pHの相違す
る50mM酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウム
−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、40℃で30分間イン
キュベートする条件で試験したところ、図3又は図4に
示すように、酵素M−11、酵素Q36とも、pH6.
0乃至7.5付近に至適pHを示した。
【0031】
【実験例2−6 熱安定性】常法により、50mM燐酸
緩衝液(pH7.0)中で60分間インキュベートする
条件で試験したところ、図5又は図6に示すように、酵
素M−11、酵素Q36とも、30乃至45℃付近まで
安定であった。
【0032】
【実験例2−7 pH安定性】常法により、pHの相違
する50mM酢酸緩衝液、燐酸緩衝液又は炭酸ナトリウ
ム−炭酸水素ナトリウム緩衝液中、25℃で16時間イ
ンキュベートする条件で試験したところ、図7又は図8
に示すように、酵素M−11、酵素Q36とも、pH
5.5乃至10.0付近まで安定であった。
【0033】
【実験例2−8 N末端アミノ酸配列】常法により、ア
プライッド・バイオシステム製気相プロテイン・シーケ
ンサ『470A型』を使用して分析したところ、酵素M
−11は、N末端に配列表における配列番号7に示すア
ミノ酸配列を有していることが判明した。
【0034】同様に分析したところ、酵素Q36は、N
末端に配列表における配列番号8に示すアミノ酸配列を
有していることが判明した。
【0035】
【実験例2−9 部分アミノ酸配列】実験例1−1で得
た精製酵素M−11を適量とり、10mMトリス−塩酸
緩衝液(pH9.0)に対して4℃で18時間透析後、
10mMトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)を加えて酵
素濃度を約1mg/mlとした。この溶液を約1mlと
り、リジルエンドペプチダーゼを10μg加え、30℃
で22時間インキュベートして酵素を部分加水分解し
た。加水分解物を、予め16%(v/v)水性アセトニ
トリルを含む0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸によ
り平衡化させておいた資生堂製逆相高速液体クロマトグ
ラフィー用カラム『カプセルパックC18』に負荷し、
16%(v/v)から64%(v/v)に上昇するアセ
トニトリルの濃度勾配下、カラムに0.1%(v/v)
トリフルオロ酢酸を0.9ml/分の流速で通液した。
そして、通液開始から約43分後又は約57分後に溶出
したペプチド断片(以下、それぞれ「ペプチド断片A」
又は「ペプチド断片B」と言う。)を含む画分を採取
し、真空乾燥後、50%(v/v)水性アセトニトリル
を含む0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸に溶解し
た。以後、実験例2−8と同様に分析したところ、ペプ
チド断片A及びBは、配列表における配列番号9及び1
0に示すアミノ酸配列を有していることが判明した。
【0036】別途、実験例1−2で得た精製酵素Q36
を上記と同様にして部分加水分解し、予め24%(v/
v)水性アセトニトリルを含む0.1%(v/v)トリ
フルオロ酢酸により平衡化させておいた日本ミリポア・
リミテッド製逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム
『マイクロボンダパックC18』に負荷し、24%(v
/v)から44%(v/v)に上昇する水性アセトニト
リルの濃度勾配下、カラムに0.1%(v/v)トリフ
ルオロ酢酸を0.9ml/分の流速で通液した。そし
て、通液開始から約4分後又は約24分後に溶出したペ
プチド断片(以下、それぞれ「ペプチド断片C」又は
「ペプチド断片D」と言う。)を含む画分を採取し、真
空乾燥後、50%(v/v)水性アセトニトリルを含む
0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸に溶解した。以
後、上記と同様に分析したところ、ペプチド断片C及び
Dは、配列表における配列番号11及び12に示すアミ
ノ酸配列を有していることが判明した。
【0037】以上のような理化学的性質を有する酵素は
未だ知られておらず、新規物質であると判断される。な
お、リゾビウム・スピーシーズM−11は岡山県岡山市
の土壌から分離され、平成4年12月24日以降、茨城
県つくば市東1丁目1番3号にある通商産業省工業技術
院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに
寄託番号『FERM BP−4130』で寄託されてい
る。一方、アルスロバクター・スピーシーズQ36は岡
山県総社市の土壌から分離されたものであり、平成5年
6月3日以降、同センターに寄託番号『FERM BP
−4316』で寄託されている。同じ出願人による特願
平5−340343号明細書には、酵素の性質・性状と
ともに、両微生物の菌学的性質が詳細に開示されてい
る。
【0039】そこで、本発明者が、実験例2−8又は2
−9で明らかにした酵素M−11の部分アミノ酸配列に
基づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブに
し、リゾビウム・スピーシーズM−11の染色体DNA
を鋭意検索したところ、配列表における配列番号3に示
す塩基配列を有する1,767塩基対からなるDNA断
片が得られた。そして、その塩基配列を解読したとこ
ろ、酵素M−11は589個のアミノ酸からなる、配列
表における配列番号1に示すアミノ酸配列を有している
ことが判明した。
【0040】一方、酵素Q36の部分アミノ酸配列に基
づき化学合成したオリゴヌクレオチドをプローブにし、
アルスロバクター・スピーシーズQ36の染色体DNA
を同様に検索したところ、配列表における配列番号4に
示す塩基配列を有する1,791塩基対からなるDNA
断片が得られた。この塩基配列を解読したところ、酵素
Q36は597個のアミノ酸からなり、配列表における
配列番号2に示すアミノ酸配列を有していることが判明
した。
【0041】配列表における配列番号1乃至4に示す塩
基配列及びアミノ酸配列を解明するに到った一連の工程
を要約すると、次のようになる。 (1) 供与体微生物の培養物から当該酵素を分離し、
高度に精製した。精製酵素をプロテアーゼにより部分加
水分解後、加水分解物より2種類のペプチド断片を単離
し、そのアミノ酸配列を決定した。 (2) 別途、供与体微生物の菌体より染色体DNAを
分離し、精製後、制限酵素により部分的に切断した約
2,000乃至6,000塩基対からなるDNA断片を
採取した。DNAリガーゼにより、このDNA断片を予
め制限酵素で切断しておいたプラスミドベクターに連結
し、組換えDNAを作製した。 (3) 大腸菌に組換えDNAを導入して形質転換体を
作製し、前記部分アミノ酸配列に基づき化学合成したオ
リゴヌクレオチドをプローブとするコロニーハイブリダ
イゼーションにより当該酵素をコードするDNAを含む
形質転換体を選択した。 (4) 形質転換体から組換えDNAを採取し、プライ
マーとともにアニーリング後、DNAポリメラーゼを作
用させてプライマーを伸長し、得られた相補鎖DNAを
ジデオキシ・チェーン・ターミネータ法により分析して
塩基配列を決定した。そして、その塩基配列から推定さ
れるアミノ酸配列と前記部分アミノ酸配列とを比較し、
その塩基配列が当該酵素をコードしていることを確認し
た。
【0042】次の実験例3乃至6では、上記の工程
(2)乃至(4)を具体的に説明するが、これら実験例
で用いる手法自体は斯界において公知のものであり、例
えば、ジェー・サムブルック等『モレキュラー・クロー
ニング・ア・ラボラトリー・マニュアル』、第2版、1
989年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー・プレス発行などにも詳述されている。
【0043】
【実験例3 リゾビウム・スピーシーズM−11由来の
DNAを含む組換えDNAと形質転換体の調製】
【0044】
【実験例3−1 染色体DNAの調製】リゾビウム・ス
ピーシーズM−11をバクト・ニュートリエント・ブロ
ス培地(pH7.0)に植菌し、27℃で24時間回転
振盪培養した。遠心分離により培養物から菌体を分離
し、TES緩衝液(pH8.0)に浮遊させ、リゾチー
ムを0.05%(w/v)加えた後、37℃で30分間
インキュベートした。処理物を−80℃で1時間凍結
後、TSS緩衝液(pH9.0)を加えて60℃に加温
し、TES緩衝液/フェノール混液を加え、氷冷後、遠
心分離により上清を採取した。この上清に2倍容の冷エ
タノールを加え、沈澱した粗染色体DNAを採取し、S
SC緩衝液(pH7.1)に溶解後、リボヌクレアーゼ
とプロテアーゼをそれぞれ7.5μg又は125μg加
え、37℃で1時間インキュベートして反応させた。そ
の後、反応物にクロロフォルム/イソアミルアルコール
混液を加えて染色体DNAを抽出し、冷エタノールを加
え、生成した染色体DNAを含む沈澱を採取した。この
ようにして得た精製染色体DNAを濃度約1mg/ml
になるようにSSC緩衝液(pH7.1)に溶解し、溶
液を−80℃で凍結した。
【0045】
【実験例3−2 組換えDNA pBMU27と形質転
換体BMU27の調製】実験例3−1で得た精製染色体
DNA溶液を約1mlとり、これに制限酵素Sau 3
AIを約35単位加え、37℃で約20分間反応させて
染色体DNAを部分切断した後、蔗糖密度勾配超遠心法
により約2,000乃至6,000塩基対からなるDN
A断片を採取した。別途、プラスミドベクターBlue
script II SK(+)を1μgとり、常法に
より制限酵素Bam HIを作用させて完全に切断した
後、上記で得たDNA断片10μgとT4 DNAリガ
ーゼを2単位加え、4℃で一夜静置することによりDN
A断片をベクター断片に連結した。そして、得られた組
換えDNAに東洋紡績製コンピテントセル『Epicu
rian Coli XLI−Blue』を30μl加
え、氷冷下に30分間静置後、42℃に加温し、SOC
ブロスを加えて37℃で1時間インキュベートすること
により、組換えDNAを大腸菌に導入した。
【0046】上記で得た形質転換体を5−ブロモ−4−
クロロ−3−インドリル−β−ガラクトシド50μg/
mlを含む寒天平板培地(pH7.0)に植菌し、37
℃で18時間培養後、培地上にナイロン膜を載置し、培
地上に形成された約6,000個のコロニーをナイロン
膜上に固定した。別途、常法により、配列表における配
列番号9に示すアミノ酸配列における第8乃至13番目
のPhe−Asp−Ile−Trp−Ala−Proで
表される配列に基づき5′−TTYGAYATHTGG
GCNCC−3′で表される塩基配列のプローブ1を化
学合成し、同位体32Pで標識後、前記ナイロン膜上に固
定した形質転換体のコロニーにハイブリダイズさせ、顕
著な会合が認められた14種類の形質転換体を選択し
た。
【0047】その後、常法により、これら14種類の形
質転換体から組換えDNAを採取し、配列表における配
列番号10に示すアミノ酸配列における第2乃至6番目
のAsp−Trp−Ala−Glu−Alaで表される
配列に基づき化学合成した5′−GAYTGGGCNG
ARGC−3′で表される塩基配列のプローブ2をイー
・エム・サザーン『ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー』、第98巻、第503〜517頁(19
75年)に記載されている方法に準じてハイブリダイズ
させ、プローブ2と顕著な会合を示した組換えDNAを
選択した。以上のようにして選択した組換えDNAと形
質転換体を、それぞれ、『pBMU27』又は『BMU
27』と命名した。
【0048】上記で得た形質転換体BMU27をアンピ
シリン100μg/mlを含むL−ブロス培地(pH
7.0)に植菌し、37℃で24時間回転振盪培養し
た。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取
し、通常一般のアルカリ法により組換えDNAを菌体外
に溶出させた。処理物を常法により精製し、分析したと
ころ、組換えDNA pBMU27は約5,700塩基
対からなり、図9に示す制限酵素地図で表される構造を
有していた。図9に示すように、酵素M−11をコード
する1,767塩基対からなるDNAは、制限酵素Ec
o RVによる切断部位付近の下流に位置していること
が判明した。
【0049】
【実験例3−3 形質転換体BMU27による酵素の産
生】松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス#
4』2.0%(w/v)、ペプトン0.5%(w/
v)、酵母エキス0.1%(w/v)、燐酸水素二ナト
リウム0.1%(w/v)、燐酸二水素カリウム0.1
%(w/v)を含む液体培地をpH7.0に調整し、ア
ンピシリンを50μg/ml加え、120℃で20分間
加熱滅菌し、冷却後、実験例3−2で得た形質転換体B
MU27を植菌し、37℃で24時間回転振盪培養し
た。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離に
より不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したとこ
ろ、培養物1l当たりに換算して、約4,000単位の
酵素が産生していた。
【0050】別途、対照として、大腸菌XLI−Blu
e株及びリゾビウム・スピーシーズM−11をアンピシ
リン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、リゾビウム
・スピーシーズM−11の場合、培養温度を30℃に設
定した以外は上記と同様に培養・処理した。処理物の活
性を測定したところ、リゾビウム・スピーシーズM−1
1による酵素の産生は培養物1l当たり約2,000単
位と、形質転換体BMU27と比較して有意に低いもの
であった。なお、宿主に使用した大腸菌XLI−Blu
e株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【0051】その後、形質転換体BMU27が産生した
酵素を実験例1−1と同様に精製し、その性質・性状を
調べたところ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分子量値約57,000乃至68,000ダルトン
を、また、等電点電気泳動で約3.3乃至4.6に等電
点を示すなど、酵素M−11と同様の理化学的性質を有
することが判明した。このことは、組換えDNA技術に
よっても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有
意に向上することを示唆している。
【0052】
【実験例4 リゾビウム・スピーシーズM
−11に由来する相補鎖DNAの調製とその塩基配列、
アミノ酸配列の決定】実験例3−2で得た組換えDNA
pBMU27を、常法に従って、各種制限酵素で分解
し、Bluescript II SK(+)にサブク
ローニングして、塩基配列決定用DNAとした。これら
塩基配列決定用DNAを2μgとり、これに2M水酸化
ナトリウム水溶液を加えて変性させた後、適量の冷エタ
ノールを加え、生成したテンプレートDNAを含む沈澱
を採取し、真空乾燥した。このテンプレートDNAに化
学合成した5′−GTAAAACGACGGCCAGT
−3′で表される塩基配列のプライマー1を50pmo
l/mlと、20mM塩化マグネシウムと20mM塩化
ナトリウムを含む40mMトリス−塩酸緩衝液(pH
7.5)を10μl加え、65℃で2分間インキュベー
トしてアニーリングした後、dATP、dGTP及びd
TTPをそれぞれ7.5μM含む水溶液を2μlと、
[α−32P]dCTP(2mCi/ml)を0.5μl
と、0.1Mジチオスレイトールを1μlと、1.5単
位/mlのT7 DNAポリメラーゼを2μl加え、2
5℃で5分間インキュベートすることによりプライマー
1を5′末端から3′末端に向かって伸長させ、相補鎖
DNAを生成させた。
【0053】次に、上記で得た相補鎖DNAを含む反応
物を四等分し、それぞれにddATP、ddCTP、d
dGTP及びddTTPのいずれかを8μMと80μM
dNTPを含む50mM塩化ナトリウム水溶液を2.
5μl加え、37℃で5分間インキュベートして反応さ
せ、20mM EDTA、0.05%(w/v)ブロム
フェノールブルー及び0.05%(w/v)キシレンシ
アノールを含む98%(v/v)水性ホルムアミド溶液
を4μl加えて反応を停止させた。反応物を沸騰水溶中
で3分間加熱後、6%(w/v)ポリアクリルアミドゲ
ル上にとり、約2,000Vの定電圧を印加しながら電
気泳動してDNA断片を分離し、次いで、常法によりゲ
ルを固定し、乾燥させた後、オートラジオグラフィーし
た。
【0054】ラジオグラム上に分離したDNA断片を解
析した結果、相補鎖DNAは配列表における配列番号5
に示す2,161塩基対からなる塩基配列を含んでいる
ことが判明した。この塩基配列から推定されるアミノ酸
配列は配列表における配列番号5に併記したとおりであ
り、このアミノ酸配列と配列表における配列番号7、9
又は10に示す酵素M−11のN末端アミノ酸配列、部
分アミノ酸配列を比較したところ、配列番号7のN末端
アミノ酸配列は配列表における配列番号5における第8
乃至27番目の配列に、また、配列番号9又は10の部
分アミノ酸配列は配列表における配列番号5における第
10乃至30番目又は第493乃至509番目の配列に
一致した。これは、酵素M−11が配列表における配列
番号1に示すアミノ酸配列を有するものであり、リゾビ
ウム・スピーシーズM−11においては、酵素M−11
が配列表における配列番号3に示す塩基配列のDNAに
よりコードされていることを示している。
【0055】
【実験例5 アルスロバクター・スピーシーズQ36由
来のDNAを含む組換えDNAと形質転換体の調製】
【0056】
【実験例5−1 染色体DNAの調製】実験例3−1と
同様にしてアルスロバクター・スピーシーズQ36から
染色体DNAを分離・精製し、濃度約1mg/mlにな
るようにSSC緩衝液(pH7.1)に溶解し、−80
℃で凍結した。
【0057】
【実験例5−2 組換えDNA pBRT32と形質転
換体BRT32の調製】実験例5−1で得た精製染色体
DNA溶液を実験例3−2と同様に部分切断した後、蔗
糖密度勾配超遠心法により約2,000乃至6,000
塩基対からなるDNA断片を採取した。その後、T4
DNAリガーゼを使用し、このDNA断片を実験例3−
2と同様に制限酵素Bam HIによるベクターBlu
escript II SK(+)の消化物に連結し、
得られた組換えDNAを大腸菌XLI−Blue株に導
入した。得られた形質転換体を実験例3−2と同様に5
−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクト
シドを含む寒天平板培地で培養し、生成した約5,00
0個のコロニーをナイロン膜上に固定する一方、配列表
における配列番号11に示すアミノ酸配列における第5
乃至10番目のMet−Gly−Trp−Asp−Pr
o−Alaで表される配列に基づき5′−ATGGGN
TGGGAYCCNGC−3′で表される塩基配列のプ
ローブ3を化学合成し、同位体32Pで標識後、前記ナイ
ロン膜上に固定した形質転換体のコロニーにハイブリダ
イズさせ、顕著な会合が認められた10種類の形質転換
体を選択した。
【0058】実験例3−2と同様にして、これら10種
類の形質転換体から組換えDNAを採取し、これに配列
表における配列番号12に示すアミノ酸配列における第
8乃至12番目のTyr−Asp−Val−Trp−A
laで表される配列に基づき化学合成した5′−TAY
GAYGTNTGGGC−3′で表される塩基配列のプ
ローブ4をハイブリダイズさせ、顕著な会合を示した組
換えDNAを選択した。以上のようにして選択した組換
えDNAと形質転換体を、それぞれ、『pBRT32』
又は『BRT32』と命名した。
【0059】その後、この形質転換体BRT32をアン
ピシリンを含むL−ブロス培地で実験例3−2と同様に
培養し、培養物より採取した菌体から組換えDNAを溶
出させ、精製し、分析したところ、組換えDNA pB
RT32は約6,200塩基対からなり、図10に示す
制限酵素地図で表される構造を有していた。図10に示
すように、酵素Q36をコードする1,791塩基対か
らなるDNAは、制限酵素Kpn Iによる切断部位付
近の下流に位置していることが判明した。
【0060】
【実験例5−3 形質転換体BRT32による酵素の産
生】松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデックス#
4』2.0%(w/v)、ペプトン0.5%(w/
v)、酵母エキス0.1%(w/v)、燐酸水素二ナト
リウム0.1%(w/v)、燐酸二水素カリウム0.1
%(w/v)を含む液体培地をpH7.0に調整し、ア
ンピシリンを50μg/ml加え、120℃で20分間
加熱滅菌し、冷却後、実験例5−2で得た形質転換体B
RT32を植菌し、37℃で24時間回転振盪培養し
た。培養物を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離に
より不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測定したとこ
ろ、培養物1l当たりに換算して、約3,900単位の
酵素が産生していた。
【0061】別途、対照として、大腸菌XLI−Blu
e株及びアルスロバクター・スピーシーズQ36をアン
ピシリン無含有の同じ組成の液体培地に植菌し、アルス
ロバクター・スピーシーズQ36の場合、培養温度を3
0℃に設定した以外は上記と同様に培養・処理した。処
理物の活性を測定したところ、アルスロバクター・スピ
ーシーズQ36による酵素の産生は培養物1l当たり約
1,800単位と、形質転換体BRT32と比較して有
意に低いものであった。なお、宿主に使用した大腸菌X
LI−Blue株は、当該酵素を全く産生しなかった。
【0062】その後、形質転換体BRT32が産生した
酵素を実験例1−1と同様に精製し、その性質・性状を
調べたところ、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分子量値約57,000乃至68,000ダルトン
を、また、等電点電気泳動で約3.3乃至4.6に等電
点を示すなど、酵素Q36と同様の理化学的性質を有す
ることが判明した。このことは、組換えDNA技術によ
っても当該酵素を製造でき、且つ、酵素の生産性も有意
に向上することを示唆している。
【0063】
【実験例6 アルスロバクター・スピーシーズQ36に
由来する相補鎖DNAの調製とその塩基配列、アミノ酸
配列の決定】実験例5−2で得た組換えDNA pBR
T32を実験例4と同様に処理してテンプレートDNA
とし、これをプライマー1とともにアニーリング後、T
7DNAポリメラーゼを作用させてプライマー1を5′
末端から3′末端に向かって伸長させ、相補鎖DNAを
生成させた。実験例4と同様に、この相補鎖DNAにジ
デオキシ・チェーン・ターミネータ法を適用し、ラジオ
グラム上に分離したDNA断片を解析した結果、相補鎖
DNAは配列表における配列番号6に示す2,056塩
基対からなる塩基配列を含んでいることが判明した。こ
の塩基配列から推定されるアミノ酸配列は配列表におけ
る配列番号6に併記したとおりであり、このアミノ酸配
列と配列表における配列番号8、11又は12に示すN
末端アミノ酸配列、部分アミノ酸配列を比較したとこ
ろ、配列番号8のN末端アミノ酸配列は配列表における
配列番号6における第2乃至21番目の配列に、また、
配列番号11又は12の部分アミノ酸配列は配列表にお
ける配列番号6における第470乃至489番目又は第
12乃至31番目の配列に一致した。これは、酵素Q3
6が配列表における配列番号2のアミノ酸配列を有する
ものであり、アルスロバクター・スピーシーズQ36に
おいては、酵素Q36が配列表における配列番号4に示
す塩基配列のDNAによりコードされていることを示し
ている。
【0064】以上説明したように、末端にトレハロース
構造を有するグルコース重合度3以上の非還元性糖質か
らトレハロースを遊離する酵素は、本発明者が長年に亙
る研究の一成果として見出されたものであり、従来公知
の酵素には見られない独特の理化学的性質を具備してい
る。この発明は、組換えDNA技術を応用することによ
り、この酵素を創製しようというものである。以下、実
施例等を参照しながら、この発明の組換え型酵素とその
製造方法並びに用途につき、具体的に説明する。
【0065】この発明でいう組換え型酵素とは、組換え
DNA技術により創製され、末端にトレハロース構造を
有するグルコース重合度3以上の非還元性糖質からトレ
ハロースを遊離する酵素全般を意味する。この発明の組
換え型酵素は、通常、解明されたアミノ酸配列を有して
おり、その一例として、例えば、配列表における配列番
号1又は2に示すN末端からのアミノ酸配列かそれに相
同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列
番号1又は2に示すアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配
列を有する変異体は、所期の酵素作用を実質的に変える
ことなく、配列表における配列番号1又は2に示すアミ
ノ酸配列における構成アミノ酸の1個又は2個以上を他
のアミノ酸で置換することにより得ることができる。な
お、同じDNAであっても、それを導入する宿主や、そ
のDNAを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地の
成分・組成、培養温度・pHなどに依っては、宿主内酵
素によるDNA発現後の修飾などにより、所期の酵素作
用は保持しているものの、配列表における配列番号1又
は2に示すアミノ酸配列におけるN末端付近のアミノ酸
が1個又は2個以上欠失したり、N末端に1個又は2個
以上のアミノ酸が新たに付加した変異体の産生すること
がある。斯かる変異体も、それが末端にトレハロース構
造を有するグルコース重合度3以上の非還元性糖質から
トレハロースを遊離するかぎり、当然、この発明の組換
え型酵素に包含される。
【0066】この発明による組換え型酵素は、特定のD
NAを含む形質転換体の培養物から採取することができ
る。この発明で使用する形質転換体は、例えば、配列表
における配列番号3又は4に示す塩基配列かそれに相同
的な塩基配列又はそれらに相補的な塩基配列のDNAを
適宜宿主に導入することにより得ることができる。な
お、上記塩基配列は、遺伝子の縮重を利用して、コード
するアミノ酸配列を変えることなく、塩基の1個又は2
個以上を他の塩基で置き換えてもよい。また、DNAが
宿主中で実際に当該酵素の産生を発現するために、当該
酵素又はその相同変異体をコードする塩基配列における
塩基の1個又は2個以上を他の塩基で適宜置換し得るこ
とは言うまでもない。
【0067】この発明で使用するDNAは、それが前述
のような配列を有するかぎり、それが天然に由来するも
のか人為的に合成されたものであるかは問わない。天然
の給源としては、例えば、リゾビウム・スピーシーズM
−11(FERM BP−4130)、アルスロバクタ
ー・スピーシーズQ36(FERM BP−431
6)、ブレビバクテリウム・ヘロボルム(ATCC11
822)及びミクロコッカス・ロゼウス(ATCC18
6)を含むリヒゾビウム属、アルスロバクター属、ブレ
ビバクテリウム属、ミクロコッカス属の微生物が挙げら
れ、これら微生物の菌体からはこの発明のDNAを含む
遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地
に植菌し、好気的条件下で約1乃至3日間培養後、培養
物から菌体を採取し、リゾチームやβ−グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該
DNAを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。このとき、
細胞壁溶解酵素にプロテアーゼなどの蛋白質加水分解酵
素を併用したり、菌体を超音波処理する際、SDSなど
の界面活性剤を共存させたり凍結融解してもよい。斯く
して得られる処理物に、例えば、フェノール抽出、アル
コール沈澱、遠心分離、プロテアーゼ処理、リボヌクレ
アーゼ処理などの斯界における通常一般の方法を適用す
れば目的のDNAが得られる。一方、DNAを人為的に
合成するには、例えば、配列表における配列番号3又は
4に示す塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表に
おける配列番号1又は2に示すアミノ酸配列をコードす
るDNAを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換
えDNAとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質
転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、その菌体か
ら当該DNAを含むプラスミドを採取すればよい。
【0068】斯かるDNAは、通常、組換えDNAの形
態で宿主に導入される。組換えDNAは、通常、DNA
と自律複製可能なベクターを含んでなり、DNAが入手
できれば、通常一般の組換えDNA技術により比較的容
易に調製することができる。斯かるベクターの例として
は、pBR322、pUC18、Bluescript
II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC1
94、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7など
のプラスミドベクターやλgt・λC、λgt・λB、
ρ11、φ1、φ105などのファージベクターが挙げ
られ、このうち、この発明のDNAを大腸菌で発現させ
るにはpBR322、pUC18、Bluescrip
t II SK(+)、λgt・λC及びλgt・λB
が好適であり、一方、枯草菌で発現させるにはpUB1
10、pTZ4、pC194、ρ11、φ1及びφ10
5が好適である。pHV14、TRp7、TEp7及び
pBS7は、組換えDNAを2種以上の宿主内で増殖さ
せる場合に有用である。
【0069】DNAを斯かるベクターに挿入するには、
斯界において通常一般の方法が採用される。具体的に
は、先ず、DNAを含む遺伝子と自律複製可能なベクタ
ーとを制限酵素及び/又は超音波により切断し、次に、
生成したDNA断片とベクター断片とを連結する。遺伝
子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用す
る制限酵素、とりわけ、II型の制限酵素、詳細には、
Sau 3AI、EcoRI、Hind III、Ba
m HI、Sal I、Xba I、SacI、Pst
Iなどを使用すれば、DNA断片とベクター断片を連
結するのが容易となる。DNA断片とベクター断片を連
結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした
後、生体内又は生体外でDNAリガーゼを作用させれば
よい。斯くして得られる組換えDNAは、適宜宿主に導
入して形質転換体とし、これを培養することにより無限
に複製可能である。
【0070】このようにして得られる組換えDNAは、
大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母を始めとする適宜の宿主
微生物に導入することができる。宿主が大腸菌の場合に
は、宿主を組換えDNAとカルシウムイオンの存在下で
培養すればよく、一方、宿主が枯草菌の場合には、コン
ピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。
形質転換体をクローニングするには、コロニーハイブリ
ダイゼーション法を適用するか、末端にトレハロース構
造を有するグルコース重合度3以上の非還元性糖質を含
む栄養培地で培養し、該非還元性糖質よりトレハロース
を遊離するものを選択すればよい。
【0071】斯くして得られる形質転換体は、栄養培地
で培養すると、菌体内外に当該酵素を産生する。栄養培
地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、
必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を
補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源
としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコー
ス、果糖、蔗糖などの糖質が、また、窒素源としては、
例えば、アンモニア若しくはアンモニウム塩、尿素、硝
酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティ
ープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙
げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に植菌し、栄養
培地を温度25乃至65℃、pH2乃至8に保ちつつ、
通気撹拌などによる好気的条件下で約1乃至6日間培養
すれば、当該酵素を含む培養物が得られる。この培養物
は酵素剤としてそのまま使用可能ではあるが、通常は使
用に先立ち、必要に応じて、超音波や細胞壁溶解酵素に
より菌体を破砕した後、濾過、遠心分離などにより酵素
を菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には
酵素を精製するための通常一般の方法が採用でき、例え
ば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩
析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
動、等電点電気泳動などの1種若しくは2種以上を適宜
組合せて適用すればよい。
【0072】前述のとおり、この発明による組換え型酵
素は、末端にトレハロース構造を有するグルコース重合
度3以上の非還元性糖質からトレハロースを遊離すると
いう、従来の酵素には見られない顕著な作用を有する。
トレハロースはまろやかで上品な甘味を有し、そして、
何よりも、分子中に還元性基を有しないので、着色や変
質の懸念なく飲食物を甘味付けできるという大きな利点
がある。
【0073】斯かる変換方法につきさらに説明すると、
この発明による組換え型酵素の基質にはα−グルコシル
トレハロース、α−マルトシルトレハロース、α−マル
トトリオシルトレハロース、α−マルトテトラオシルト
レハロース、α−マルトペンタオシルトレハロースなど
の末端にトレハロース構造を有するグルコース重合度3
以上の一連の非還元性糖質が用いられる。斯かる非還元
性糖質は、澱粉又はアミロペクチン、アミロースなどの
澱粉質を酸及び/又はアミラーゼによって部分的に加水
分解して得られる還元性澱粉加水分解物に特願平5−3
49216号明細書に開示されている非還元性糖質生成
酵素を作用させることにより得ることができる。斯かる
澱粉加水分解物は、通常、マルトトリオース、マルトテ
トラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオー
ス、マルトヘプタオースなどのグルコース重合度3以上
のマルトオリゴ糖の1種若しくは2種以上を含んでな
る。アミラーゼ研究会編『ハンドブック・オブ・アミレ
ーシーズ・アンド・リレイテッド・エンザイムズ』、1
988年、パーガモン・プレス発行に記載されているα
−アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マ
ルトペンタオース生成アミラーゼ及びマルトヘキサオー
ス生成アミラーゼは、斯かる澱粉加水分解物の調製に特
に有用であり、これらアミラーゼのいずれかを使用する
ことにより、グルコース重合度3以上の還元性澱粉糖を
豊富に含む澱粉糖混合物が容易且つ効率的に得られる。
なお、このとき、必要に応じて、プルラナーゼやイソア
ミラーゼなどの澱粉枝切酵素を併用すれば、非還元性糖
質生成酵素の基質となり得る還元性澱粉糖の収量を上げ
ることができる。斯かる還元性澱粉糖の1種又は2種以
上を濃度50%(w/v)まで含む水溶液に非還元性糖
質生成酵素を適量共存せしめ、水溶液を、通常、温度約
40乃至55℃に、また、pHを約6乃至8の範囲に保
ちつつ、所望量の非還元性糖質が生成するまで反応させ
る。
【0074】この発明による変換方法においては、通
常、基質として上記したような非還元性糖質の1種又は
2種以上を含む水溶液にこの発明による組換え型酵素を
共存せしめ、水溶液を所定の温度、pHに保ちつつ、所
望量のトレハロースが遊離するまで反応させる。反応は
0.1%(w/w)程度の基質濃度下でも進行するが、
この発明による変換方法を大規模に実施する場合には、
より高濃度の2%(w/v)以上、望ましくは、5乃至
50%(w/w)とするのがよい。反応時の温度とpH
は組換え型酵素が失活することなく基質に効率的に作用
するレベルに設定され、温度は55℃付近まで、望まし
くは、約40乃至55℃に、また、pHは5乃至10、
望ましくは、約6乃至8の範囲に設定される。組換え型
酵素の量と反応時間は、反応の進行具合に依って適宜に
設定する。斯かる反応により、非還元性糖質は効率的に
トレハロースとグルコース及び/又はマルトオリゴ糖か
らなる糖組成物に変換され、α−マルトトリオシルトレ
ハロースの場合、変換率はほぼ100%に達する。澱粉
加水分解物に前記アミラーゼのいずれかと、非還元性糖
質生成酵素及び当該組換え型酵素を同時に作用させると
きには、非還元性糖質が生成すると同時にトレハロース
とグルコース及び/又はマルトオリゴ糖に分解されるの
で、トレハロース含量の高い糖組成物が収量良く、効率
的に得られる実益がある。
【0075】この発明の変換方法により得られた反応物
はそのまま使用可能ではあるが、通常、使用に先立ち精
製する。すなわち、濾過・遠心分離などにより反応物か
ら不溶物を除去し、活性炭により脱色した後、イオン交
換樹脂により脱塩・精製し、濃縮してシロップ状物とす
る。用途に依っては、このシロップ状物を真空乾燥、噴
霧乾燥などにより固状物としてもよい。実質的にトレハ
ロースのみからなる製品を得るには、上記シロップ状物
にイオン交換樹脂、活性炭、シリカゲルなどによる糖質
を分離するための種々のクロマトグラフィー、アルコー
ル、アセトンなどにより分別沈澱、膜濾過、酵母により
発酵、アルカリによる還元性糖質の分解除去などの1種
若しくは2種以上を適用する。大量の反応物を処理する
には、例えば、特開昭58−23799号公報や特開昭
58−72598号公報に開示されている強酸性カチオ
ン交換樹脂を使用する固定床方式、移動床方式又は擬似
移動床方式のイオン交換クロマトグラフィーが有用であ
り、これらの方法によるときには、従来、大量入手が難
しかったトレハロース含量が高い製品を大量且つ効率的
に得ることができる。
【0076】斯くして得られるトレハロース及びトレハ
ロースを含む糖組成物は、糖質甘味剤の還元性を嫌う種
々の物品に広範な用途を有し、例えば、食品一般、化粧
品、医薬品の甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、安定
剤、賦形剤として極めて有用である。
【0077】以下、2〜3の実施例により、この発明に
よる組換え型酵素の製造方法と非還元性糖質の変換方法
を具体的に説明する。
【0078】
【実施例A−1 組換え型酵素の製造】500ml容三
角フラスコに松谷化学工業製澱粉加水分解物『パインデ
ックス#4』2.0%(w/v)、ペプトン0.5%
(w/v)、酵母エキス0.1%(w/v)、燐酸水素
二ナトリウム0.1%(w/v)、燐酸二水素カリウム
0.1%(w/v)を含む液体培地(pH7.0)を1
00mlずつとり、アンピシリンを50μg/ml加え
た後、120℃で20分間オートクレーブして加熱滅菌
した。冷却後、三角フラスコ内の液体培地に実験例3−
2の方法で得た形質転換体BMU27を植菌し、回転振
盪下、27℃で24時間種培養した。別途、30l容ジ
ャーファーメンタに上記と同組成の液体培地を18lと
り、アンピシリンを50μg/ml加え、120℃で2
0分間加熱滅菌し、冷却後、上記で得た種培養液を1%
(v/v)接種し、液体培地をpH6乃至8に保ちつ
つ、30℃で24時間通気撹拌培養した。培養物を超音
波処理して菌体を破砕し、遠心分離より不溶物を除去
後、上清中の酵素活性を測定したところ、培養物1l当
りに換算して、約3,900単位の酵素が産生してい
た。この上清を実験例1−1の方法により精製したとこ
ろ、比活性約290単位/mg蛋白質の組換え型酵素を
1ml当たり165単位含む水溶液が67ml得られ
た。
【0079】
【実施例A−2 組換え型酵素の製造】実験例5−2の
方法により得た形質転換体BRT32を実施例A−1と
同様に培養し、培養物を超音波処理して菌体を破砕し、
遠心分離により不溶物を除去後、上清中の酵素活性を測
定したところ、培養物1l当たりに換算して、約4,0
00単位の酵素が産生していた。この上清を実験例1−
1の方法により精製したところ、比活性約420単位/
mg蛋白質の組換え型酵素を1ml当たり200単位含
む水溶液が55ml得られた。
【0080】
【実施例B−1 組換え型酵素による非還元性糖質の変
換】
【0081】
【実施例B−1(a) 非還元性糖質生成酵素の調製】
500ml容三角フラスコにマルトース2.0%(w/
v)、ペプトン0.5%(w/v)、酵母エキス0.1
%(w/v)、燐酸水素二ナトリウム0.1%(w/
v)及び燐酸二水素カリウム0.1%(w/v)を含む
液体培地(pH7.0)を100mlずつとり、120
℃で20分間オートクレーブして滅菌した。冷却後、三
角フラスコ内の液体培地にリゾビウム・スピーシーズM
−11を植菌し、回転振盪下、27℃で24時間種培養
した。別途、30l容ジャーファーメンタに上記と同組
成の液体培地を20lとり、滅菌後、上記で得た種培養
液を1%(v/v)接種し、液体培地をpH7乃至8に
保ちつつ、30℃で24時間通気撹拌培養した。培養物
を超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離により不溶物
を除去後、実験例1−1の方法に準じて精製したとこ
ろ、比活性約195単位/mg蛋白質の非還元性糖質生
成酵素が、培養物1l当たりに換算して、約220単位
の収量で得られた。
【0082】なお、この発明を通じて、非還元性糖質生
成酵素の活性は、次の方法により測定した活性値(単
位)で表示する。すなわち、マルトペンタオースを1.
25%(w/v)含む50mM燐酸緩衝液(pH7.
0)を4mlとり、これに酵素液を1ml加え、40℃
で60分間インキュベートして反応させた後、反応液を
100℃で10分間加熱して反応を停止させる。反応液
を蒸留水で10倍希釈した後、ソモギ・ネルソン法によ
り還元力を測定する。非還元性糖質生成酵素の1単位と
は、上記条件下において、1分間にマルトペンタオース
1μmolに相当する還元力を低下させる酵素の量と定
義する。
【0083】
【実施例B−1(b) トレハロースを含むシロップ状
物の調製】トウモロコシ澱粉を濃度15%(w/w)に
なるように水中に懸濁し、懸濁液に炭酸カルシウムを
0.1%(w/w)加えた。pH6.0に調整後、ノボ
・ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤
『ターマミル60L』を0.2%(w/w)加え、95
℃で15分間反応させて澱粉を糊化・液化した。液化液
を120℃で30分間オートクレーブして酵素を失活さ
せ、45℃に急冷後、澱粉固形分1g当たり、林原生物
化学研究所製プルラナーゼ剤を1,000単位、実施例
B−1(a)で得た非還元性糖質生成酵素を3.4単
位、実施例A−1の方法で得た組換え型酵素を4.2単
位加え、48時間反応させた。反応物を95℃で10分
間加熱して酵素を失活させ、冷却し、濾過後、常法にし
たがって活性炭により脱色し、イオン交換樹脂により脱
塩・精製し、濃縮して、濃度約60%(w/w)のシロ
ップ状物を澱粉固形分当たり約92%の収量で得た。
【0084】実験例2−1の方法により分析したとこ
ろ、本品は、固形分当たりトレハロースを70.2%、
α−グルコシルトレハロースを2.4%、α−マルトシ
ルトレハロースを3.3%、グルコースを0.7%、マ
ルトースを10.1%、マルトトリオースを12.9
%、グルコース重合度4以上のマルトオリゴ糖を0.4
%含んでいた。まろやかで上品な甘味に加えて適度の保
湿性を有し、粘度と還元性が低い本品は、食品一般、化
粧品、医薬品などに配合使用する甘味剤、呈味改善剤、
品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。
【0085】
【実施例B−1(c) トレハロースを含む粉状物の調
製】東京有機化学工業製強酸性カチオン交換樹脂『XT
−1016(Na+)』を内径5.4cm、長さ5mの
ジャケット付きステンレス製カラム4本に均一に充填
し、カラムを直列に連結して全長を20mとした。カラ
ム内温度を55℃に保ちつつ、実施例B−1(b)で得
たシロップ状物を樹脂に対して約5%(v/v)の割合
で負荷し、55℃の温水をSV0.3の流速で通液して
シロップ状物中の糖質を分画した。溶出液の糖組成を分
析し、トレハロース含量の高い画分のみを採取し、濃縮
し、真空乾燥し、破砕して、固形分当たりトレハロース
を約97%含む粉状物を原料固形分当たり約56%の収
率で得た。
【0086】まろやかで上品な甘味を有しながらも、実
質的な還元性を有しない本品は、食品一般、化粧品、医
薬品に配合使用する甘味剤、呈味改善剤、品質改善剤、
安定剤、賦形剤として有用である。
【0087】
【実施例B−1(d) 結晶性トレハロース粉状物の調
製】実施例B−1(c)で得たトレハロース含量の高い
画分を一部とり、濃度約75%(w/w)に濃縮後、助
晶罐に移し、種晶としてトレハロース含水結晶を固形分
当たり約2%加え、緩やかに撹拌しながら助晶して結晶
化度約45%のマスキットを得た。このマスキットを約
150kg/cm2の圧力下、噴霧乾燥塔の上部に設け
た噴霧ノズルより噴霧乾燥塔の下方に向かって噴霧する
一方、約85℃の温風を噴霧乾燥塔の上部から下方に向
かって送風しつつ、噴霧乾燥塔の底部に設けたベルトコ
ンベア上に蓄積した結晶性粉状物を噴霧乾燥塔外に徐々
に搬出した。その後、粉状物を熟成塔に移し、約40℃
の温風を送風しながら10時間熟成して結晶化と乾燥を
完了した。このようにして、トレハロース含水結晶から
なる粉状物を原料固形分当たり約90%の収量で得た。
【0088】まろやかで上品な甘味を有しながらも、実
質的な還元性や吸湿性を有しない本品は、食品一般、化
粧品、医薬品に配合使用する甘味剤、呈味改善剤、品質
改善剤、安定剤、賦形剤として有用である。
【0089】
【実施例B−2 組換え型酵素による非還元性糖質の変
換】馬鈴薯澱粉を濃度6%(w/w)になるように水中
に懸濁し、加熱糊化後、温度50℃、pH4.5に調整
し、林原生物化学研究所製イソアミラーゼ剤を澱粉固形
分1g当たり500単位加え、20時間反応させた。反
応物をpH6.5に調整し、120℃で10分間オート
クレーブして酵素を失活させ、95℃に急冷後、ノボ・
ノルディスク・インダストリー製α−アミラーゼ剤『タ
ーマミル60L』を澱粉固形分当たり0.1%(w/
w)加え、15分間反応させた。反応物を130℃で3
0分間加熱して酵素を失活させ、45℃に急冷後、澱粉
固形分1g当たり、実施例B−1(a)の方法で得た非
還元性糖質生成酵素を4.1単位、実施例A−2の方法
で得た組換え型酵素を4.9単位加え、64時間反応さ
せた。反応物を95℃で10分間加熱して酵素を失活さ
せ、55℃に急冷し、pH5.0に調整後、ナガセ生化
学工業製グルコアミーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固形
分1g当たり10単位加え、40時間反応させた。反応
物を95℃で10分間加熱して酵素を失活させ、冷却
し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イ
オン交換樹脂により脱塩・精製し、濃縮して、固形分当
たりトレハロースを80.5%含む濃度約60%(w/
w)のシロップ状物を得た。このシロップ状物を濃度約
84%(w/w)まで濃縮後、助晶罐に移し、種晶とし
てトレハロース含水結晶を固形分当たり約2%加え、緩
やかに撹拌しながら助晶して結晶化度約45%のマスキ
ットを得た。このマスキットをプラスチック製バットに
分注し、室温で3日間静置して固化・熟成させた後、バ
ットからブロック状物を取出し、切削機により破砕した
ところ、トレハロース含水結晶を含む固状物が澱粉固形
分当たり約90%の収量で得られた。
【0090】実質的な吸湿性を有さず、取扱い易い本品
は、食品一般、化粧品、医薬品に配合使用する甘味剤、
呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用で
ある。
【0091】
【実施例B−3 組換え型酵素による非還元性糖質の変
換】馬鈴薯澱粉を濃度6%(w/w)になるように水中
に懸濁し、ナガセ生化学工業製α−アミラーゼ剤『ネオ
スピターゼ』を0.01%(w/w)加え、pH6.2
に調整後、温度85乃至90℃に保ちつつ20分間反応
させて澱粉を糊化・液化させた。液化液を120℃で1
0分間加熱して酵素を失活させ、45℃に急冷後、澱粉
固形分1g当たり、林原生物化学研究所製イソアミラー
ゼ剤を500単位、実施例B−1(a)の方法で得た非
還元性糖質生成酵素を3.2単位、実施例A−1の方法
で得た組換え型酵素を5.0単位加えて48時間反応さ
せた。反応物を95℃で10分間加熱して酵素を失活さ
せ、55℃に急冷後、pH5.0に調整し、ナガセ生化
学工業製グルコアミラーゼ剤『グルコチーム』を澱粉固
形分1g当たり10単位加えて40時間反応させた。反
応物を95℃で10分間加熱して酵素を失活させ、冷却
し、濾過後、常法にしたがって活性炭により脱色し、イ
オン交換樹脂により脱塩・精製し、濃度約60%(w/
w)まで濃縮して、固形分当たりトレハロースを78.
3%含むシロップ状物を得た。このシロップ状物を強酸
性カチオン交換樹脂としてオルガノ製『CG6000
(Na+)』を使用した以外は実施例B−1(c)と同
様に分画して、固形分当たりトレハロースを約95%含
む画分を得た。この画分を濃度約75%(w/w)に濃
縮後、実施例B−2と同様に助晶し、得られたマスキッ
トのブロック状物を破砕してトレハロース含水結晶を含
む粉状物を澱粉固形分当たり約70%の収率で得た。
【0092】実質的な吸湿性を有さず、取扱い易い本品
は、食品一般、化粧品、医薬品に配合使用する甘味剤、
呈味改善剤、品質改善剤、安定剤、賦形剤として有用で
ある。
【0093】
【発明の効果】以上説明したように、この発明は、末端
にトレハロース構造を有するグルコース重合度3以上の
非還元性糖質からトレハロースを遊離する、従来未知の
全く新規な酵素の発見に基づくものである。この発明
は、組換えDNA技術により、斯かる酵素を大規模且つ
効率的に生産する道を拓くものである。この発明による
組換え型酵素を使用する変換方法により、末端にトレハ
ロース構造を有するグルコース重合度3以上の非還元性
糖質は効率的にトレハロースとグルコース及び/又はマ
ルトオリゴ糖からなる糖組成物に変換される。非還元性
糖質から遊離したトレハロースは、まろやかで上品な甘
味を有し、しかも、分子中に還元性基を有しないので、
着色や変質の懸念なく食品一般を甘味付けできる実益が
ある。加えて、この発明による組換え型酵素は、全アミ
ノ酸配列までが明らかにされた酵素であり、食品等への
配合使用を前提とするトレハロースの製造に安心して使
用し得るものである。
【0094】この発明は斯くも顕著な作用効果を奏する
意義のある発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な
発明であると言える。
【0095】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:589 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ポリペプチド 配列 Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Glu Met Gly Arg Arg 20 25 30 Pro Gly Asn Gly Pro Ala Asp Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ala Asp Ala Pro 35 40 45 50 Thr Gly Ala Asp Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ile Pro 55 60 65 Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Glu Gly Val His Ala Leu Ser 70 75 80 85 Arg Thr Phe Asp Pro Gly Ala His Arg Trp Gln Asp Ala Gly Trp Gln Gly 90 95 100 Arg Glu Leu Gln Gly Ser Val Ile Tyr Glu Leu His Ile Gly Thr Phe Thr 105 110 115 Pro Glu Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly 120 125 130 135 Leu Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr 140 145 150 His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Gly Tyr 155 160 165 170 Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly 175 180 185 Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn 190 195 200 Tyr Leu Pro Arg Tyr Gly Pro Tyr Leu Lys His Gly Glu Gly Asn Thr Trp 205 210 215 220 Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp His Val Arg Gln Tyr 225 230 235 Ile Leu Asp Asn Val Ala Met Trp Leu Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu 240 245 250 255 Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu 260 265 270 Glu Glu Phe Gly Ala Leu Ala Asp Ala Leu Ser Ser Glu Gly Gly Arg Pro 275 280 285 Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro 290 295 300 305 Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His 310 315 320 His Ala Val His Val Asn Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp 325 330 335 340 Phe Asp Ser Leu Gly Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His 345 350 355 Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Gly Arg Cys His Gly Arg Pro Ile Asn 360 365 370 Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp 375 380 385 390 Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro Tyr 395 400 405 Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro 410 415 420 425 Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Pro Trp Gln Phe Phe 430 435 440 Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile 445 450 455 Arg Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln 460 465 470 475 Asp Pro Glu Thr Phe Thr Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ser Ala 480 485 490 Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser Leu Ile Thr Leu Arg 495 500 505 510 Arg Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Leu Gly Phe Ala Asp Thr Ala Val Glu 515 520 525 Phe Asp Asp Asp Ala Arg Trp Leu Arg Tyr Trp Arg Gly Gly Val Gln Val 530 535 540 Val Leu Asn Phe Ala Asp Arg Pro Ile Ser Leu Asp Arg Pro Gly Thr Ala 545 550 555 560 Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala Val Arg Met Asp Gly Val Gln Val Glu 565 570 575 Leu Pro Pro Leu Ser Ala Ala Val Leu Arg Asp 580 585
【0096】配列番号:2 配列の長さ:597 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ポリペプチド 配列 Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu Ala Gly Gly 20 25 30 Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro Glu Asp Ala Gly 35 40 45 50 Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn Val Asp Tyr Gly Tyr 55 60 65 Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp Pro Arg Thr Arg Arg Gln 70 75 80 85 Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser 90 95 100 Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr 105 110 115 Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala 120 125 130 135 Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu 140 145 150 Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln 155 160 165 170 Trp Phe Ala Val His Glu Asp Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe 175 180 185 Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr 190 195 200 Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu 205 210 215 220 Lys Gln Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro 225 230 235 Gly Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu 240 245 250 255 Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys 260 265 270 Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala Asp Gln 275 280 285 Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu 290 295 300 305 Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Glu 310 315 320 Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn Val Thr Gly 325 330 335 340 Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu Ala Ala Leu Ala Lys 345 350 355 Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu 360 365 370 Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu 375 380 385 390 Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp 395 400 405 Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu 410 415 420 425 Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly 430 435 440 Ala Ser Thr Pro Trp Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly 445 450 455 Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp 460 465 470 475 Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys 480 485 490 Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu 495 500 505 510 Tyr Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu 515 520 525 Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu Arg 530 535 540 Phe Arg Arg Gly Gly Val Gln Val Leu Leu Asn Phe Ser Glu Gln Pro Val 545 550 555 560 Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala Val 565 570 575 Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser Ala Ala Val Val 580 585 590 595 Ser Asp
【0097】配列番号:3 配列の長さ:1767 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列 GCCAAGCCGG TGCAGGGAGC GGGGCGCTTC GATATCTGGG CGCCCGAGGC AGGCACCGTA 60 ACGCTGCTGG CCGGCGGGGA GCGCTACGAG ATGGGCCGCC GCCCCGGCAA CGGGCCGGCG 120 GACGAAGGCT GGTGGACGGC CGCGGATGCA CCGACAGGCG CGGACGTGGA CTACGGATAC 180 CTGCTCGACG GCGACGAAAT CCCGCTGCCG GACCCCCGGA CCCGCCGCCA GCCCGAAGGC 240 GTCCATGCCC TGTCCCGGAC CTTCGACCCC GGCGCCCACC GCTGGCAGGA CGCCGGGTGG 300 CAGGGCAGGG AACTCCAGGG CTCCGTGATT TACGAACTCC ACATCGGAAC GTTCACGCCG 360 GAAGGGACGC TGGACGCCGC CGCGGGCAAG CTGGACTACC TCGCCGGCCT GGGCATCGAC 420 TTCATTGAGC TGCTGCCCGT GAATGCCTTC AACGGCACGC ACAACTGGGG CTACGACGGC 480 GTCCAGTGGT TTGCCGTGCA TGAAGGCTAC GGCGGGCCTG CGGCGTACCA GCGGTTCGTG 540 GATGCGGCCC ACGCGGCCGG CCTCGGCGTC ATCCAGGACG TGGTCTACAA CCACCTCGGG 600 CCGAGCGGGA ACTACCTCCC CAGGTACGGC CCGTACCTCA AGCACGGCGA AGGCAACACC 660 TGGGGCGATT CGGTCAACCT GGACGGGCCG GGATCCGACC ACGTCCGCCA GTACATCCTG 720 GACAACGTGG CCATGTGGCT GCGCGACTAC CGGGTGGACG GCCTCCGCCT GGACGCCGTC 780 CACGCCCTGA AGGATGAGCG GGCCGTCCAC ATCCTGGAGG AGTTCGGCGC GCTGGCGGAC 840 GCCCTGTCGT CCGAAGGCGG CCGCCCGCTG ACCCTCATCG CCGAGTCCGA CCTCAACAAT 900 CCGCGGCTGC TGTACCCCCG GGATGTCAAC GGCTACGGAC TGGCCGGCCA GTGGAGCGAC 960 GACTTCCACC ACGCCGTGCA CGTCAACGTC AGCGGGGAAA CCACCGGCTA CTACAGCGAC 1020 TTCGACTCGC TCGGAGCCCT CGCCAAGGTC CTGCGTGACG GGTTCTTCCA CGACGGCAGC 1080 TACTCCAGCT TCCGCGGCCG CTGCCACGGC CGGCCGATCA ACTTCAGCGC CGTGCATCCG 1140 GCCGCGCTGG TGGTCTGCTC ACAGAACCAT GACCAGATCG GCAACCGGGC CACCGGGGAC 1200 CGGCTGTCCC AGTCACTTCC GTACGGCAGC CTGGCCCTGG CCGCCGTGCT GACCCTCACC 1260 GGTCCGTTCA CGCCCATGCT GTTCATGGGA GAGGAATACG GGGCCACCAC CCCGTGGCAG 1320 TTCTTCACCT CGCACCCTGA ACCCGAGCTG GGCAAGGCCA CGGCCGAGGG CAGGATCAGG 1380 GAGTTCGAGC GCATGGGGTG GGATCCCGCC GTCGTGCCCG ATCCGCAGGA TCCGGAGACC 1440 TTCACCCGCT CCAAACTGGA CTGGGCGGAA GCGTCCGCCG GCGATCATGC CCGCCTCCTG 1500 GAGCTGTACC GCTCGCTTAT CACGCTGCGG CGGTCAACTC CGGAGCTCGC GCGCCTGGGC 1560 TTTGCGGACA CCGCCGTCGA GTTCGACGAC GACGCCCGCT GGCTCCGTTA TTGGCGCGGA 1620 GGCGTGCAGG TGGTGCTGAA CTTCGCGGAC CGTCCCATCA GCCTGGACCG GCCGGGAACC 1680 GCGCTGCTGC TCGCCACCGA CGACGCCGTC CGGATGGACG GAGTCCAGGT GGAGCTGCCG 1740 CCGCTGAGCG CCGCGGTTCT GCGCGAC 1767
【0098】配列番号:4 配列の長さ:1791 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列 ACGCACACCT ACCCGCGGGA AGCCGCGAAA CCCGTCCTGG GCCCCGCACG CTACGACGTC 60 TGGGCGCCCA ACGCTGAATC CGTGACGCTG CTGGCCGGCG GGGAGCGCTA CGCCATGCAG 120 CGCCGGGCCG AGACCGGGCC GGAGGACGCC GGCTGGTGGA CCGCCGCCGG CGCGCCTACG 180 GATGGCAACG TGGACTACGG GTACCTTCTG GACGGCGACG AAACACCGCT TCCGGATCCA 240 CGGACCCGCC GCCAGCCCGA CGGCGTCCAC GCCCTGTCCC GCACGTTCGA CCCGTCCGCG 300 TACAGCTGGC AGGACGACGC CTGGCAGGGC AGGGAACTGC AGGGCGCCGT CATCTACGAG 360 CTCCACCTCG GAACATTCAC GCCCGAAGGG ACGCTGGAGG CGGCCGCCGG AAAGCTGGAC 420 TACCTCGCCG GCTTGGGCGT CGACTTCATC GAGCTGCTGC CGGTGAACGC TTTCAACGGC 480 ACGCACAACT GGGGTTACGA CGGTGTCCAG TGGTTCGCTG TGCACGAGGC ATACGGCGGG 540 CCGGAAGCGT ACCAGCGGTT CGTCGACGCC GCCCACGCCG CAGGCCTTGG CGTGATCCAG 600 GACGTGGTCT ACAACCACCT CGGCCCCAGC GGGAACTACC TGCCGCGGTT CGGGCCGTAC 660 CTCAAGCAGG GCGAGGGTAA CACGTGGGGC GACTCGGTGA ACCTGGACGG GCCCGGCTCC 720 GACCATGTGC GCCGGTACAT CCTGGACAAC CTGGCCATGT GGCTGCGTGA CTACCGGGTG 780 GACGGCCTGC GGCTGGACGC CGTCCACGCC CTGAAGGATG AGCGGGCGGT GCACATCCTG 840 GAGGACTTCG GGGCGCTGGC CGATCAGATC TCCGCCGAGG TGGGACGGCC GCTGACGCTC 900 ATCGCCGAGT CCGACCTCAA CAACCCGCGG CTGCTGTACC CGCGGGACGT CAACGGGTAC 960 GGGCTGGAAG GGCAGTGGAG CGACGACTTC CACCACGCCG TCCACGTCAA CGTCACCGGC 1020 GAAACCACCG GCTACTACAG TGACTTCGAC TCGCTGGCCG CCCTCGCCAA GGTGCTCCGG 1080 GACGGCTTCT TCCACGACGG CAGCTACTCC AGCTTCCGGG AACGCCACCA CGGACGGCCG 1140 ATTAATTTCA GCGCCGTACA CCCAGCCGCC CTGGTGGTCT GTTCGCAGAA CCACGACCAG 1200 ATCGGCAACC GTGCCACGGG GGACCGGCTC TCCCAGACCC TGCCGTACGG AAGCCTGGCC 1260 CTCGCTGCGG TGCTGACCCT GACGGGACCC TTCACGCCCA TGCTGCTCAT GGGCGAGGAG 1320 TACGGCGCCA GCACGCCGTG GCAGTTTTTC ACCTCGCACC CGGAGCCGGA GCTCGGCAAG 1380 GCCACCGCGG AGGGCCGGAT CAAGGAGTTC GAGCGCATGG GGTGGGATCC CGCCGTCGTG 1440 CCCGATCCCC AGGATCCTGA GACGTTCCGC CGGTCCAAGC TGGACTGGGC GGAAGCCGCC 1500 GAAGGCGACC ATGCCCGGCT GCTGGAGCTG TACCGTTCGC TCACCGCCCT GCGCCGCTCC 1560 ACGCCGGACC TCACCAAGCT GGGCTTCGAG GACACGCAGG TGGCGTTCGA CGAGGACGCC 1620 CGCTGGCTGC GGTTCCGCCG GGGTGGCGTG CAGGTGCTGC TCAACTTCTC GGAACAGCCC 1680 GTGAGCCTGG ACGGGGCGGG CACGGCCCTG CTGCTGGCCA CCGACGACGC CGTCCGGCTA 1740 GAAGGTGAGC GTGCGGAACT CGGTCCGCTG AGCGCCGCCG TCGTCAGCGA C 1791
【0099】配列番号:5 配列の長さ:2161 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名:リゾビウム・スピーシーズ(Rhizobium sp.) 株名:M-11(FERM BP-4130) 配列の特徴 特徴を表わす記号:5´UTR 存在位置:1..206 特徴を決定した方法:E 特徴を表わす記号:mat peptide 存在位置:207..1994 特徴を決定した方法:S 特徴を表わす記号:3´UTR 存在位置:1995..2161 特徴を決定した方法:E 配列 GGCGCCGGGG GAGTGCTGGC GCTTGCCACC CGGCTCCCCT ACGGGCTGGA ACAGTCGGGC 60 GGCTGGCGGG ACACCGCCGT CGAGCTTGAA GCCGCCATGA CGGACGAACT GACCGGCTCC 120 ACTTTCGGGC CGGGACCGGC GGCGCTGTCA GAAGTCTTCC GGGCCTACCC GGTGGCCTTG 180 TTGGTCCCCG CGACAGGAGG CAAGTC 206 ATG ACG CAG CCC AAC GAT GCG GCC AAG CCG GTG CAG GGA GCG GGG CGC 254 Met Thr Gln Pro Asn Asp Ala Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg 1 5 10 15 TTC GAT ATC TGG GCG CCC GAG GCA GGC ACC GTA ACG CTG CTG GCC GGC 302 Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala Gly Thr Val Thr Leu Leu Ala Gly 20 25 30 GGG GAG CGC TAC GAG ATG GGC CGC CGC CCC GGC AAC GGG CCG GCG GAC 350 Gly Glu Arg Tyr Glu Met Gly Arg Arg Pro Gly Asn Gly Pro Ala Asp 35 40 45 GAA GGC TGG TGG ACG GCC GCG GAT GCA CCG ACA GGC GCG GAC GTG GAC 398 Glu Gly Trp Trp Thr Ala Ala Asp Ala Pro Thr Gly Ala Asp Val Asp 50 55 60 TAC GGA TAC CTG CTC GAC GGC GAC GAA ATC CCG CTG CCG GAC CCC CGG 446 Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Ile Pro Leu Pro Asp Pro Arg 65 70 75 80 ACC CGC CGC CAG CCC GAA GGC GTC CAT GCC CTG TCC CGG ACC TTC GAC 494 Thr Arg Arg Gln Pro Glu Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr Phe Asp 85 90 95 CCC GGC GCC CAC CGC TGG CAG GAC GCC GGG TGG CAG GGC AGG GAA CTC 542 Pro Gly Ala His Arg Trp Gln Asp Ala Gly Trp Gln Gly Arg Glu Leu 100 105 110 CAG GGC TCC GTG ATT TAC GAA CTC CAC ATC GGA ACG TTC ACG CCG GAA 590 Gln Gly Ser Val Ile Tyr Glu Leu His Ile Gly Thr Phe Thr Pro Glu 115 120 125 GGG ACG CTG GAC GCC GCC GCG GGC AAG CTG GAC TAC CTC GCC GGC CTG 638 Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala Gly Leu 130 135 140 GGC ATC GAC TTC ATT GAG CTG CTG CCC GTG AAT GCC TTC AAC GGC ACG 686 Gly Ile Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn Gly Thr 145 150 155 160 CAC AAC TGG GGC TAC GAC GGC GTC CAG TGG TTT GCC GTG CAT GAA GGC 734 His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His Glu Gly 165 170 175 TAC GGC GGG CCT GCG GCG TAC CAG CGG TTC GTG GAT GCG GCC CAC GCG 782 Tyr Gly Gly Pro Ala Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala 180 185 190 GCC GGC CTC GGC GTC ATC CAG GAC GTG GTC TAC AAC CAC CTC GGG CCG 830 Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro 195 200 205 AGC GGG AAC TAC CTC CCC AGG TAC GGC CCG TAC CTC AAG CAC GGC GAA 878 Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Tyr Gly Pro Tyr Leu Lys His Gly Glu 210 215 220 GGC AAC ACC TGG GGC GAT TCG GTC AAC CTG GAC GGG CCG GGA TCC GAC 926 Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp 225 230 235 240 CAC GTC CGC CAG TAC ATC CTG GAC AAC GTG GCC ATG TGG CTG CGC GAC 974 His Val Arg Gln Tyr Ile Leu Asp Asn Val Ala Met Trp Leu Arg Asp 245 250 255 TAC CGG GTG GAC GGC CTC CGC CTG GAC GCC GTC CAC GCC CTG AAG GAT 1022 Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp 260 265 270 GAG CGG GCC GTC CAC ATC CTG GAG GAG TTC GGC GCG CTG GCG GAC GCC 1070 Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Glu Phe Gly Ala Leu Ala Asp Ala 275 280 285 CTG TCG TCC GAA GGC GGC CGC CCG CTG ACC CTC ATC GCC GAG TCC GAC 1118 Leu Ser Ser Glu Gly Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp 290 295 300 CTC AAC AAT CCG CGG CTG CTG TAC CCC CGG GAT GTC AAC GGC TAC GGA 1166 Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly 305 310 315 320 CTG GCC GGC CAG TGG AGC GAC GAC TTC CAC CAC GCC GTG CAC GTC AAC 1214 Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His Val Asn 325 330 335 GTC AGC GGG GAA ACC ACC GGC TAC TAC AGC GAC TTC GAC TCG CTC GGA 1262 Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser Leu Gly 340 345 350 GCC CTC GCC AAG GTC CTG CGT GAC GGG TTC TTC CAC GAC GGC AGC TAC 1310 Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly Ser Tyr 355 360 365 TCC AGC TTC CGC GGC CGC TGC CAC GGC CGG CCG ATC AAC TTC AGC GCC 1358 Ser Ser Phe Arg Gly Arg Cys His Gly Arg Pro Ile Asn Phe Ser Ala 370 375 380 GTG CAT CCG GCC GCG CTG GTG GTC TGC TCA CAG AAC CAT GAC CAG ATC 1406 Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp Gln Ile 385 390 395 400 GGC AAC CGG GCC ACC GGG GAC CGG CTG TCC CAG TCA CTT CCG TAC GGC 1454 Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Ser Leu Pro Tyr Gly 405 410 415 AGC CTG GCC CTG GCC GCC GTG CTG ACC CTC ACC GGT CCG TTC ACG CCC 1502 Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe Thr Pro 420 425 430 ATG CTG TTC ATG GGA GAG GAA TAC GGG GCC ACC ACC CCG TGG CAG TTC 1550 Met Leu Phe Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Thr Thr Pro Trp Gln Phe 435 440 445 TTC ACC TCG CAC CCT GAA CCC GAG CTG GGC AAG GCC ACG GCC GAG GGC 1598 Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly 450 455 460 AGG ATC AGG GAG TTC GAG CGC ATG GGG TGG GAT CCC GCC GTC GTG CCC 1646 Arg Ile Arg Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro 465 470 475 480 GAT CCG CAG GAT CCG GAG ACC TTC ACC CGC TCC AAA CTG GAC TGG GCG 1694 Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Thr Arg Ser Lys Leu Asp Trp Ala 485 490 495 GAA GCG TCC GCC GGC GAT CAT GCC CGC CTC CTG GAG CTG TAC CGC TCG 1742 Glu Ala Ser Ala Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser 500 505 510 CTT ATC ACG CTG CGG CGG TCA ACT CCG GAG CTC GCG CGC CTG GGC TTT 1790 Leu Ile Thr Leu Arg Arg Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Leu Gly Phe 515 520 525 GCG GAC ACC GCC GTC GAG TTC GAC GAC GAC GCC CGC TGG CTC CGT TAT 1838 Ala Asp Thr Ala Val Glu Phe Asp Asp Asp Ala Arg Trp Leu Arg Tyr 530 535 540 TGG CGC GGA GGC GTG CAG GTG GTG CTG AAC TTC GCG GAC CGT CCC ATC 1886 Trp Arg Gly Gly Val Gln Val Val Leu Asn Phe Ala Asp Arg Pro Ile 545 550 555 560 AGC CTG GAC CGG CCG GGA ACC GCG CTG CTG CTC GCC ACC GAC GAC GCC 1934 Ser Leu Asp Arg Pro Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp Asp Ala 565 570 575 GTC CGG ATG GAC GGA GTC CAG GTG GAG CTG CCG CCG CTG AGC GCC GCG 1982 Val Arg Met Asp Gly Val Gln Val Glu Leu Pro Pro Leu Ser Ala Ala 580 585 590 GTT CTG CGC GAC 1994 Val Leu Arg Asp 595 TGAGCGTGCG CGCCTTCGGG GCGGGCGTCC TTCCGGTGAC CGGATGCTGG ACGCCCGCCC 2054 CGCAGCTCCA CAGGCGCTGG CAGGATGGAA CGTATGACTT TTCTGGCAGC GGACAACCGC 2114 TACGAAACCA TGCCATACCG CCGCGTCGGA CGCAGCGGGC TGAAGCT 2161
【0100】配列番号:6 配列の長さ:2056 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Genomic DNA 配列の特徴 起源 生物名:アルスロバクター・スピーシーズ(Arthrobacte
r sp.) 株名:Q36(FERM BP-4316) 配列の特徴 特徴を表わす記号:5´UTR 存在位置:1..89 特徴を決定した方法:E 特徴を表わす記号:mat peptide 存在位置:90..1883 特徴を決定した方法:S 特徴を表わす記号:3´UTR 存在位置:1884..2056 特徴を決定した方法:E 配列 GCCGGCTTCG GACCGGGGGC AGTGAAGATC GCCGACATCT TCCGGTCGTT CCCCGTTGCG 60 CTGCTGGTGC CGCAGACAGG AGGAGAGTC 89 ATG ACG CAC ACC TAC CCG CGG GAA GCC GCG AAA CCC GTC CTG GGC CCC 137 Met Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro 1 5 10 15 GCA CGC TAC GAC GTC TGG GCG CCC AAC GCT GAA TCC GTG ACG CTG CTG 185 Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser Val Thr Leu Leu 20 25 30 GCC GGC GGG GAG CGC TAC GCC ATG CAG CGC CGG GCC GAG ACC GGG CCG 233 Ala Gly Gly Glu Arg Tyr Ala Met Gln Arg Arg Ala Glu Thr Gly Pro 35 40 45 GAG GAC GCC GGC TGG TGG ACC GCC GCC GGC GCG CCT ACG GAT GGC AAC 281 Glu Asp Ala Gly Trp Trp Thr Ala Ala Gly Ala Pro Thr Asp Gly Asn 50 55 60 GTG GAC TAC GGG TAC CTT CTG GAC GGC GAC GAA ACA CCG CTT CCG GAT 329 Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly Asp Glu Thr Pro Leu Pro Asp 65 70 75 80 CCA CGG ACC CGC CGC CAG CCC GAC GGC GTC CAC GCC CTG TCC CGC ACG 377 Pro Arg Thr Arg Arg Gln Pro Asp Gly Val His Ala Leu Ser Arg Thr 85 90 95 TTC GAC CCG TCC GCG TAC AGC TGG CAG GAC GAC GCC TGG CAG GGC AGG 425 Phe Asp Pro Ser Ala Tyr Ser Trp Gln Asp Asp Ala Trp Gln Gly Arg 100 105 110 GAA CTG CAG GGC GCC GTC ATC TAC GAG CTC CAC CTC GGA ACA TTC ACG 473 Glu Leu Gln Gly Ala Val Ile Tyr Glu Leu His Leu Gly Thr Phe Thr 115 120 125 CCC GAA GGG ACG CTG GAG GCG GCC GCC GGA AAG CTG GAC TAC CTC GCC 521 Pro Glu Gly Thr Leu Glu Ala Ala Ala Gly Lys Leu Asp Tyr Leu Ala 130 135 140 GGC TTG GGC GTC GAC TTC ATC GAG CTG CTG CCG GTG AAC GCT TTC AAC 569 Gly Leu Gly Val Asp Phe Ile Glu Leu Leu Pro Val Asn Ala Phe Asn 145 150 155 160 GGC ACG CAC AAC TGG GGT TAC GAC GGT GTC CAG TGG TTC GCT GTG CAC 617 Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly Val Gln Trp Phe Ala Val His 165 170 175 GAG GCA TAC GGC GGG CCG GAA GCG TAC CAG CGG TTC GTC GAC GCC GCC 665 Glu Asp Tyr Gly Gly Pro Glu Ala Tyr Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala 180 185 190 CAC GCC GCA GGC CTT GGC GTG ATC CAG GAC GTG GTC TAC AAC CAC CTC 713 His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln Asp Val Val Tyr Asn His Leu 195 200 205 GGC CCC AGC GGG AAC TAC CTG CCG CGG TTC GGG CCG TAC CTC AAG CAG 761 Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Pro Arg Phe Gly Pro Tyr Leu Lys Gln 210 215 220 GGC GAG GGT AAC ACG TGG GGC GAC TCG GTG AAC CTG GAC GGG CCC GGC 809 Gly Glu Gly Asn Thr Trp Gly Asp Ser Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly 225 230 235 240 TCC GAC CAT GTG CGC CGG TAC ATC CTG GAC AAC CTG GCC ATG TGG CTG 857 Ser Asp His Val Arg Arg Tyr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Met Trp Leu 245 250 255 CGT GAC TAC CGG GTG GAC GGC CTG CGG CTG GAC GCC GTC CAC GCC CTG 905 Arg Asp Tyr Arg Val Asp Gly Leu Arg Leu Asp Ala Val His Ala Leu 260 265 270 AAG GAT GAG CGG GCG GTG CAC ATC CTG GAG GAC TTC GGG GCG CTG GCC 953 Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu Glu Asp Phe Gly Ala Leu Ala 275 280 285 GAT CAG ATC TCC GCC GAG GTG GGA CGG CCG CTG ACG CTC ATC GCC GAG 1001 Asp Gln Ile Ser Ala Glu Val Gly Arg Pro Leu Thr Leu Ile Ala Glu 290 295 300 TCC GAC CTC AAC AAC CCG CGG CTG CTG TAC CCG CGG GAC GTC AAC GGG 1049 Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly 305 310 315 320 TAC GGG CTG GAA GGG CAG TGG AGC GAC GAC TTC CAC CAC GCC GTC CAC 1097 Tyr Gly Leu Glu Gly Gln Trp Ser Asp Asp Phe His His Ala Val His 325 330 335 GTC AAC GTC ACC GGC GAA ACC ACC GGC TAC TAC AGT GAC TTC GAC TCG 1145 Val Asn Val Thr Gly Glu Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Asp Phe Asp Ser 340 345 350 CTG GCC GCC CTC GCC AAG GTG CTC CGG GAC GGC TTC TTC CAC GAC GGC 1193 Leu Ala Ala Leu Ala Lys Val Leu Arg Asp Gly Phe Phe His Asp Gly 355 360 365 AGC TAC TCC AGC TTC CGG GAA CGC CAC CAC GGA CGG CCG ATT AAT TTC 1241 Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Glu Arg His His Gly Arg Pro Ile Asn Phe 370 375 380 AGC GCC GTA CAC CCA GCC GCC CTG GTG GTC TGT TCG CAG AAC CAC GAC 1289 Ser Ala Val His Pro Ala Ala Leu Val Val Cys Ser Gln Asn His Asp 385 390 395 400 CAG ATC GGC AAC CGT GCC ACG GGG GAC CGG CTC TCC CAG ACC CTG CCG 1337 Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp Arg Leu Ser Gln Thr Leu Pro 405 410 415 TAC GGA AGC CTG GCC CTC GCT GCG GTG CTG ACC CTG ACG GGA CCC TTC 1385 Tyr Gly Ser Leu Ala Leu Ala Ala Val Leu Thr Leu Thr Gly Pro Phe 420 425 430 ACG CCC ATG CTG CTC ATG GGC GAG GAG TAC GGC GCC AGC ACG CCG TGG 1433 Thr Pro Met Leu Leu Met Gly Glu Glu Tyr Gly Ala Ser Thr Pro Trp 435 440 445 CAG TTT TTC ACC TCG CAC CCG GAG CCG GAG CTC GGC AAG GCC ACC GCG 1481 Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala 450 455 460 GAG GGC CGG ATC AAG GAG TTC GAG CGC ATG GGG TGG GAT CCC GCC GTC 1529 Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val 465 470 475 480 GTG CCC GAT CCC CAG GAT CCT GAG ACG TTC CGC CGG TCC AAG CTG GAC 1577 Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp 485 490 495 TGG GCG GAA GCC GCC GAA GGC GAC CAT GCC CGG CTG CTG GAG CTG TAC 1625 Trp Ala Glu Ala Ala Glu Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr 500 505 510 CGT TCG CTC ACC GCC CTG CGC CGC TCC ACG CCG GAC CTC ACC AAG CTG 1673 Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Ser Thr Pro Asp Leu Thr Lys Leu 515 520 525 GGC TTC GAG GAC ACG CAG GTG GCG TTC GAC GAG GAC GCC CGC TGG CTG 1721 Gly Phe Glu Asp Thr Gln Val Ala Phe Asp Glu Asp Ala Arg Trp Leu 530 535 540 CGG TTC CGC CGG GGT GGC GTG CAG GTG CTG CTC AAC TTC TCG GAA CAG 1769 545 550 555 560 CCC GTG AGC CTG GAC GGG GCG GGC ACG GCC CTG CTG CTG GCC ACC GAC 1817 Pro Val Ser Leu Asp Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Leu Ala Thr Asp 565 570 575 GAC GCC GTC CGG CTA GAA GGT GAG CGT GCG GAA CTC GGT CCG CTG AGC 1865 Asp Ala Val Arg Leu Glu Gly Glu Arg Ala Glu Leu Gly Pro Leu Ser 580 585 590 GCC GCC GTC GTC AGC GAC 1883 Ala Ala Val Val Ser Asp 595 TGACGTTTTC TTGGGGGCGG CGTCCACCGC CGGTGACCGG ATGGTGGACG TCCGCCCCGA 1943 AGCCTCGGCG CGGCTGGCAG GATGGAACGC ATGACTTATG TGGCCTCGGA CACCCGCTAC 2003 GACACCATGC CCTACCGCCG CGTCGGACGC AGCGGCCTCA AACTGCCGGC CAT 2056
【0101】配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 配列 Ala Lys Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala 1 5 10 15 Gly Thr Val 20
【0102】配列番号:8 配列の長さ:20 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:N末端フラグメント 配列 Thr His Thr Tyr Pro Arg Glu Ala Ala Lys Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg 1 5 10 15 Tyr Asp Val 20
【0103】配列番号:9 配列の長さ:21 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチドフラグメント型:中間部フラグメ
ント 配列 Pro Val Gln Gly Ala Gly Arg Phe Asp Ile Trp Ala Pro Glu Ala Gly Thr 1 5 10 15 Val Thr Leu Leu 20
【0104】配列番号:10 配列の長さ:17 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント 配列 Leu Asp Trp Ala Glu Ala Ser Ala Gly Asp His Ala Arg Leu Leu Glu Leu 1 5 10 15
【0105】配列番号:11 配列の長さ:20 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント 配列 Glu Phe Glu Arg Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp 1 5 10 15 Pro Glu Thr 20
【0106】配列番号:12 配列の長さ:20 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド フラグメント型:中間部フラグメント 配列 Pro Val Leu Gly Pro Ala Arg Tyr Asp Val Trp Ala Pro Asn Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Thr Leu 20
【図面の簡単な説明】
【図1】酵素M−11の至適温度を示す図である。
【図2】酵素Q36の至適温度を示す図である。
【図3】酵素M−11の至適pHを示す図である。
【図4】酵素Q36の至適pHを示す図である。
【図5】酵素M−11の熱安定性を示す図である。
【図6】酵素Q36の熱安定性を示す図である。
【図7】酵素M−11のpH安定性を示す図である。
【図8】酵素Q36のpH安定性を示す図である。
【図9】この発明による組換えDNA pBMU27の
制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した部
分は酵素M−11をコードするDNAである。
【図10】この発明による組換えDNA pBRT32
の制限酵素地図を示す図である。図中、太線で表示した
部分は酵素Q36をコードするDNAである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 19/14 Z 7432−4B // A23L 1/236 A A61K 7/00 F C12N 1/21 8828−4B 15/09 ZNA (C12N 9/24 C12R 1:19) (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:41) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:06) C12R 1:41) (C12N 15/00 ZNA A C12R 1:06)

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 末端にトレハロース構造を有するグルコ
    ース重合度3以上の非還元性糖質からトレハロースを遊
    離する組換え型酵素。
  2. 【請求項2】 下記の理化学的性質を有する請求項1に
    記載の組換え型酵素。 (1) 分子量 約57,000乃至68,000ダルトン(SDS−ポ
    リアクリルアミドゲル電気泳動) (2) 等電点 約3.3乃至4.6(等電点電気泳動)
  3. 【請求項3】 配列表における配列番号1又は2に示す
    アミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸配列を有する請
    求項1又は2に記載の組換え型酵素。
  4. 【請求項4】 請求項1に記載の組換え型酵素を産生す
    る形質転換体を培養し、培養物から組換え型酵素を採取
    する組換え型酵素の製造方法。
  5. 【請求項5】 組換え型酵素が下記の理化学的性質を有
    する請求項4に記載の組換え型酵素の製造方法。 (1) 分子量 約57,000乃至68,000ダルトン(SDS−ポ
    リアクリルアミドゲル電気泳動) (2) 等電点 約3.3乃至4.6(等電点電気泳動)
  6. 【請求項6】 組換え型酵素が配列表における配列番号
    1又は2に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ酸
    配列を有する請求項4又は5に記載の組換え型酵素の製
    造方法。
  7. 【請求項7】 形質転換体が、末端にトレハロース構造
    を有するグルコース重合度3以上の非還元性糖質からト
    レハロースを遊離する酵素をコードするDNAと自律複
    製可能なベクターを含む組換えDNAを適宜宿主に導入
    してなる請求項4、5又は6に記載の組換え型酵素の製
    造方法。
  8. 【請求項8】 DNAが配列表における配列番号3又は
    4に示す塩基配列かそれに相同的な塩基配列又はそれら
    に相補的な塩基配列を有する請求項7に記載の組換え型
    酵素の製造方法。
  9. 【請求項9】 DNAが、遺伝子コードの縮重に基づ
    き、配列表における配列番号1又は2に示すアミノ酸配
    列を変えることなく、配列表における配列番号3又は4
    に示す塩基配列における塩基の1個又は2個以上を他の
    塩基で置換したものである請求項7又は8に記載の組換
    え型酵素の製造方法。
  10. 【請求項10】 DNAが配列表における配列番号5又
    は6に示す塩基配列を有する請求項7、8又は9に記載
    の組換え型酵素の製造方法。
  11. 【請求項11】 DNAがリゾビウム属、アルスロバク
    ター属、ブレビバクテリウム属又はミクロコッカス属の
    微生物に由来する請求項7、8、9又は10に記載の組
    換え型酵素の製造方法。
  12. 【請求項12】 宿主が大腸菌である請求項7、8、
    9、10又は11に記載の組換え型酵素の製造方法。
  13. 【請求項13】 自律複製可能なベクターがプラスミド
    ベクターBluescript II SK(+)であ
    る請求項7、8、9、10、11又は12に記載の組換
    え型酵素の製造方法。
  14. 【請求項14】 形質転換体を炭素源及び窒素源を含む
    pH2乃至8の液体培地に植菌し、温度25乃至65℃
    で1乃至6日間培養する請求項4、5、6、7、8、
    9、10、11、12又は13に記載の組換え型酵素の
    製造方法。
  15. 【請求項15】 培養物中の組換え型酵素を遠心分離、
    濾過、濃縮、塩析、透析、イオン交換クロマトグラフィ
    ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフ
    ィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳
    動及び/又は等電点電気泳動により採取する請求項4、
    5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14
    に記載の組換え型酵素の製造方法。
  16. 【請求項16】 末端にトレハロース構造を有するグル
    コース重合度3以上の非還元性糖質に請求項1に記載の
    組換え型酵素を作用させて該非還元性糖質からトレハロ
    ースを遊離させる工程を含んでなる非還元性糖質の変換
    方法。
  17. 【請求項17】 組換え型酵素が下記の理化学的性質を
    有する請求項16に記載の非還元性糖質の変換方法。 (1) 分子量 約57,000乃至68,000ダルトン(SDS−ポ
    リアクリルアミドゲル電気泳動) (2) 等電点 約3.3乃至4.6(等電点電気泳動)
  18. 【請求項18】 組換え型酵素が配列表における配列番
    号1又は2に示すアミノ酸配列かそれに相同的なアミノ
    酸配列を有する請求項16又は17に記載の非還元性糖
    質の変換方法。
  19. 【請求項19】 非還元性糖質の濃度が50%(w/
    w)以下の水溶液中に組換え型酵素を共存せしめ、温度
    40乃至55℃、pH5乃至10で作用させる請求項1
    6、17又は18に記載の非還元性糖質の変換方法。
  20. 【請求項20】 非還元性糖質がα−グルコシルトレハ
    ロース、α−マルトシルトレハロース、α−マルトトリ
    オシルトレハロース、α−マルトテトラオシルトレハロ
    ース又はα−マルトペンタオシルトレハロースである請
    求項16、17、18又は19に記載の非還元性糖質の
    変換方法。
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