JPH07500010A - ウレアーゼの調節及び成熟のために必要なＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの遺伝子及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３０）請求の範囲第２項〜第１２項又は第１５項のいずれが１項に記載のヌクレ オチド配列を含むし」弘国はの菌株であることを特徴とする請求の範囲第２９項 に記載の組換え型宿主細胞。

３１）遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉのうちの 少な（とも１つのレベルでの、ＮＣＩＭＢ４０５１２という番号で１９９２年６ 月２６日にＮＣＩＭＢに寄託されたＬ」立国１のＮｏ菌株の突然変異により得ら れるような、請求の範囲第３０項に記載の組換え型宿主細胞。

３２）請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に より変更されたＥ、　ｃｏｌｉ菌株であることを特徴とする請求の範囲第２９項 〜第３１項のいずれか１項に記載の組換え型宿主細胞。

３３）　そのウレアーゼ活性が減衰されていることを特徴とする請求の範囲第２ ９項〜第３１項のいずれか１項に記載の組換え型宿主細胞。

３４）請求の範囲第２４項〜第３３項のいずれか１項に記載の組換え型宿主細胞 を含むことを特徴とする免疫原性組成物。

３５）決められた生物学的試料についてのし」■匡ムによる感染のインビトロ診 断のためのキットにおいて、−ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ％ｕｒｅＨ又はｕ ｒｅＩの中がら選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的なヌクレオチドフラ グメントの５″及び３′末端にハイブリダイズすることができる、請求の範囲第 １３項に記載の少な（とも一対のヌクレオチドブライマー、 一処理された試料から核酸を抽出するのに必要な試薬、−増幅したいと考えてい るフラグメントの増幅を実施するのに充分な量の、ヌクレオチドブライマーから の前記ヌクレオチドフラグメントの重合を行なうための試薬、特に重合酵素、− プローブとして用いることができ、かつ増幅されたヌクレオチドフラグメントと 規定の条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１つのヌクレオチ ド鎖、−場合によっては、ハイブリダイゼーションを明らかにするための手段 を含むことを特徴とするキット。

３６）　Ｌ」立匡已による感染のインビトロ診断のためのキットにおいて、 一一定量の請求の範囲第１３項に記載のプローブ、−検出すべきＬ」！垣はの核 酸とプローブとの間のハイブリダイゼーション反応の実施に適した媒体、 −場合により形成されるハイブリッドの検出のための試薬、を含むことを特徴と するキット。

３７）請求の範囲第１８項又は第１９項のいずれか１項に記載のポリペプチド又 は該ポリペプチドのフラグメントを認識することを特徴とする、ポリクローナル 又はモノクローナル抗体。

３８）請求の範囲第１８項又は第１９項のいずれか１項に記載の抗体を含むこと を特徴とする、ｎによる感染の治療のための組成物。

明細書 ウレアーゼの・ｕ　び　軌のためにＩ゛１　なＨｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　１ｏ ｒｉの゛　びその　゛・・ 肚旦ユα回μ二旺包ム（Ｌ」１国はという表現でも呼ばれる）は、今日、ヒトの 胃粘膜、より特定的には胃潰瘍及び十二指腸潰瘍のクレータ−の病巣のまわりの 表面のみに排他的に見い出されるグラム陰性菌である。この細菌は、当初Ｃａｍ 　１ｏｂａｃｔｅｒ　１ｏｒｉｄｉｓと呼ばれていた［Ｗａｒｒｅｎ　ｅｔ　ａ ｌ、　（１９８３）　Ｌａｎｃｅｔ　ｌ、　１２７３−１２７５）。

大部分の細菌と同様、Ｌ」１国１は、酸性ｐＨの培地に対し感受性をもつが、そ れでも生理的割合の尿素の存在下で酸性度を許容することができる［Ｍａｒｓｈ ａｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　Ｇａ３ｔｒｏｅｎｔｅｒｏ１．９９：６ ９７−７０２１°細菌の微環境内で塩析される、二酸化炭素及びアンモニアの形 に尿素を加水分解することにより、Ｌ」１国１のウレアーゼは、胃の酸性環境内 での細菌の生存を可能にするものと想定されている。最近になって、動物のモデ ルに対して実施された研究により、ウレアーゼが胃粘膜のコロニー化において重 要な因子であることを示唆する要素が提供された［Ｅａｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　 （１９９１）　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、　５９：　２４７０−２４７５　］　、ウレアーゼは、同様に、直 接的又は間接的に胃粘膜に損傷をひきおこすのではないかと考えられている。

Ｈｅ１ｉｃｏ抑回旦二旺旦ｒｉ　（Ｌ」■匝己）は、現在のところ、幽門洞の胃 炎の病因作用物質として認められており、潰瘍の発達に必要な補因子の１つと思 われる。又、胃がん腫の発達をＬ」Ｌ肛辷の存在に結びつけることができると思 われる。

生検又は胃液から臨床的に分離された全ての菌株は、Ｌ」■匝１の最も免疫原性 のタンパク質の１つである、細菌の表面に露呈されるきわめて活性の高いウレア ーゼ（尿素分解酵素）を合成する。ウレアーゼは、病因論上のプロセスにおいで ある役目を果たすのではないかと考えられ、このことは、化学的突然変異誘発に より得られたウレアーゼ産生能力の低い菌株がブタの胃をコロニー化することが できなかったということを示す、ブタに対して実施された実験によって認識され ている。それでも、化学的突然変異誘発の後に得られたこれらの結果は、−膜化 された突然変異誘発の際にその他の遺伝子が不活性化され得たことから、胃をコ ロニー化させることができなかったことがウレアーゼ産生の低減のせいであると 確実に断言することを可能にするものではない。従って、これは制御可能な突然 変異ではなく、そのためこの技術は、Ｌ」弘匡己による感染の場合のウレアーゼ の有害な効果を減少し、ひいては予防するための手段を考え出す上で、実際的な 利点を示すものではない。

胃のコロニー化におけるこの役割以外に、ウレアーゼならびに遊離アンモニアは 、上皮細胞に対する直接的細胞障害効果、および胃の病巣の原因となる炎症性応 答を誘発することによる間接的効果を有しうるということが示された。

従って、ウレアーゼは、最も重要な病原性決定因子の１つであり、構造遺伝子に せよ補助遺伝子にせよウレアーゼの発現に関連する遺伝子内で特異的に不活性化 されたＬｌ［有］ユの同質遺伝子菌株の構築は、コロニー化段階におけるウレア ーゼの役割を限定するために、及び例えば弱毒化菌株の構築によりワクチン接種 プロセスにおいて個体を保護するのに利用可能な菌株の構築に応用するために、 非常に大きな重要性をもつものである。

今まで、ウレアーゼの遺伝子は、Ｌ」■棟己の染色体の３４ｋｂのフラグメント 上に局在化され、又、このフラグメント内に存在する４、２ｋｂの領域に関連づ けられてきた。この４．２ｋｂの領域には、ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ及び ｕｒｅＤという用語で呼ばれる４つの遺伝子が関連づけられた。この領域は、Ｃ ａｍ　１ｏｂａｃｔｅｒ社す瓜においてシャトルベクターを介して４．２ｋｂの ＤＮＡを移入させた時、ウレアーゼ陽性の表現型を得ることを可能にした。

しかしながら、前述の４．２ｋｂのＤＮＡでのＥ、　ｃｏｌｉの細胞の形質転換 は、Ｅ、　ｃｏｌｔにおいてウレアーゼ活性の発現を得ることを可能にしなかっ た。

本発明者は、遺伝学的観点と同時に培養条件の観点からみて、Ｌ」１匝１内で得 られるようなウレアーゼ活性をＥ、　ｃｏｌｉにおいて発現させるのに必要な要 素は何かを決定することに成功した。本発明者は、この点において、Ｅ、　ｃｏ ｌｉにおけるウレアーゼの発現が、１：、　ｃｏｌｉの窒素調節システムの活性 化と同時にウレアーゼの構造遺伝子の補助遺伝子の存在にも依存するということ を決定した。

又本発明者は、以下でウレアーゼの「補助遺伝子」という表現で往々にして呼ん でいる、Ｅ、　ｃｏｌｉ内でのウレアーゼの機能的発現を可能にし、かつＬ」工 国１内でウレアーゼの成熟及び調節を決定する複数の遺伝子を同定し、分離した 。

従って、本発明は、Ｌ」収匝己及びＥ、　ｃｏｌｉにおけるウレアーゼの機能的 発現に決定的役割を果たすか又は少なくともそれに介入する可能性のある５つの 新しい遺伝子の集合体、ならびに他の遺伝子とは独立して個別に考慮したこれら の遺伝子の各々に関する。本発明は、同様に、刊行物中に記載され（Ｌａｂｉｇ ｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：　１ ９２０−１９３１３　、ウレアーゼのｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ及びｕｒｅ Ｄと呼称されている構造遺伝子と関連づけられた状態での、場合により変更され たこれらの遺伝子の集合体にも関する。

なお、本発明は、Ｌ」１国１による感染の新しいインビトロ検出手段ならびにＬ 」ｌ匡１による感染に対する保護のために利用可能な組成物にも関する。

従って、本発明は、以下に示すヌクレオチド鎖に対応し、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、 ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ，ｕｒｅＩと呼ばれる遺伝子に相当する少なくとも１つの核 配列又はこれらの核配列のうち少な（とも１つのあらゆる部分によって構成され るか又はそれを含むことを特徴とするヌクレオチド配列を目的とする。

ＣＪＯＣ５菊　←Ｉ：　−の　←Φ　←；　ロ：シ＝　２シ　瓢：　セ＝　仁且 　８ぞ　百；〈リ　ＣＪＯ←−〈酌　〈リ　ト＝　←−≦＞　Ｑ−←ｇ＋　ぺ≧ 　〈−（リ　ロω（−ｕｏ、、　ｏ＞　４＋ｗ　ｃＩ７＋　＜＝　（Ｉｌｌ＜ロ 　←１１１　Ｃｕ２Ｏ口Ｉ！ｌ　計Φ　く＝　←哨＝こ　ｕ　−１ｇ−ｓ　ｔｅ 、ｘ、　、　Ｆ豆　ご９　巴ゴロｃＰ　ｕ　−ωΦ　べ轡　〈＝　←−ロロロー 　＜ロ　←−←−く−←ｒｒｒ　（Ｊｍ＜ａ　ＯＳ　＜−〇ン　ω功　Ｃン　υ ユ３ｗ　＜ｔｎ　！−＋＠　＜＝　←１．Ｉ　Ｃ：ｌ＞　ＬＩＪＪ足己　コご　 ２＝　已”；；”；＝　：　Ｃ””　４雲Ｕロ　Ｑロ　←ｅ５　Ｑ−Φ＝　υ＝ 　くＣＪ　−（Ｊ　１．Ｉ　ＣＪ−←市　に−べの　←ロ　閃　ω　ユ　ロ　− Ｏ〉　ω　■　ぺ　−←に＝　Ｑユ　ロ匍　ω−〇−く＝　← （＋ＩＩｃ菊　く＞　ロΦ　（ｉｌｌ　（−←し　；　じ　閃　クー＜　リ　く 　の　Ｕ＝、Ｃ（：　（：＋　（の　くり　←Φ　←−くく←ＧＩ＜−（＞　（ シ　←二　←ｒ′５　ロー←−ロロ　く轡　く−←ニ　ロ）　←ＣＣＪｌｊ　υ −口＝　←−←Ｏω−←−Ｑ＋：　ｕ＝　Ｉ＋ＩΦ　８句　υ−ロロ　００ｇ　 ｗ　に　Ｑ　？−〇＞　Ｑユ　（リ　ト旬く　口　＜　ｅ　（：　リ　の　ω　 −に　＝　ローζシ　に−は−口＞　Ｃ：ａｏ　（Ｊ−←ω＜−（Ｊひ　ロ；　 ←ロ　く菊　Ｑζ　くε←ロ　く＝　ぜΦ　Ｑ＝　く：　ロー　←−←−（−、 −（リ　く−０−≦論 く−ω（７１＜−＜ｔｏ＝コ　口−− Ｕロ　トＩ′１５Ｃニジ　←Φ　ψ＝　ω＝ト＝！＋＝　（Ｊ＋−Ｉ　Ｌ）−← −７Ｗ　ａシ　←Φトニ　ロの　ロゴ　＜　−Ｍ　ｙ　−１ｈ　’、；　ＣＪ　 Ｍｃ、＋Ｈ冨ミ　旨＝　＝１８毎　旨呂　８ピごり　←−←−口〉　くの　←− 口の ＜：　ＣＪｃ、　υ−←＝　Ｑ：　ω−り一←ロ　（旬　口Φ　ト０　く切　０ ＝　←Φ←−，Ｃ！１１１１　＜リ　ＣＪ−１（ロ　クー＜さくり　くコ　←− ←−〈＝＜ロ　ロー ロー　←Φ　ＯＸ　＜メ　クー＜（ロー０口　←−く−トー　Ｃ；ひ　く−ロー ロ＝　＜＝　、ＣＪつ　←の　トー＜＝　口のに！　邑；　８；　巴＝？＝　巴 ９　乏よｃ；＝　ｇ＝　（の　ｅ、Ｃ：ロ　ロコ　４０８０　＜−り＞　ロ　← エ　ロー　〇−ｈ　−Ｃ：ｌ　Ｏ’ｌ　ｉＣ−＋　ｉ−ｇ　ロ　ｒｓ　ＣＪＯ。

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本発明は、同様に、変更された遺伝子によりコードされるポリペプチドの機能的 特性が、Ｌ」弘匡已により発現されるようなポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、 ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ又はＵｒｅＩの特性との関係において、保持又は減衰又は削 除されるような形で、あるいはこの配列がＬ」１匡１内でポリペプチドを発現し ないような形で、単数又は複数のヌクレオチドの欠失、付加、置換又は逆位によ り、上述のヌクレオチド配列との関係において変更されたヌクレオチド配列にも 関する。

本発明の特定の実施態様に従い、前述の定義づけの枠内において、ヌクレオチド 配列は、 ａ）図４に示されているヌクレオチド鎖に対応し、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅ Ｇ、ｕｒｅＨ，ｕｒｅＩと呼ばれる遺伝子に相当する核配列の集合体、又は、 ｂ）互いに独立して変更されたこれらの遺伝子に相当する核配列（変異体）によ り形成された集合体であり、変異体の集合体が、Ｌ」１国１によって発現される ようなポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ又はＯｒｅ　Ｉと の機能的相同性をもつポリペプチドをコードするか、又は逆に、ｎにより発現さ れるようなポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ又はＵｒｅＩ の機能的特性を減衰ひいては削除するような変更されたポリペプチドをコードす る形のものによって構成されているか又はそれを含むことを特徴とする。

上述のヌクレオチド配列のフラグメント（ヌクレオチド＃Ｒ）は、さまざまな理 由で有利なものであり、−例としては、以下のものを記載することができるニ ー　Ｌ」■匡已においてｕｒｅＥ％ｕｒｅＦ％ｕｒｅＧ又はｕｒｅ　Ｉの中から 選択された遺伝１．子の発現により得られるようなポリペプチドと機能的相同性 を有するポリペプチドをコードする能力を保持する、上述の配列のフラグメント ；−Ｌ」■匡已において得られるような上述のポリペプチドのあらゆる部分をコ ードする、特にし」ヅ匡１に対して向けられた抗体により認識されるか又はハブ テンもしくは免疫原として挙動することができるペプチド又はポリペプチドの部 分をコードするフラグメント； 一遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ％ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉから発現され るようなし」弘匡１のポリペプチドをコードする能力が備わっていない上述の配 列のフラグメント；−Ｌ」１国１の遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ％ｕｒｅＧ％ｕｒ ｅＨ又はｕｒｅ　Ｉによりコードされるポリペプチドの特性との関係において、 減衰、さらには削除された特性をもつポリペプチド又はペプチドをコードするフ ラグメント。

このようなフラグメントは、有利には、少な（とも１５個、好ましくは少なくと も２０個のヌクレオチドを有する。

これらの遺伝子ｕｒｅＥ％ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ及びｕｒｅＩは、Ｌ」 ■担已の染色体上に存在する：これらの遺伝子は、ウレアーゼの構造遺伝子（ｕ ｒｅＡ、ｕｒｅＢ）との関係において、いわゆる補助遺伝子である。構造遺伝子 とは反対に、補助遺伝子は、ウレアーゼ酵素の形成にとって必要ではない。逆に 、これらの遺伝子は、形成されたウレアーゼの調節及び／又は成熟手段によって 、Ｌ」■匡旦内で発現されるようなウレアーゼの機能的発現には介入しない。つ １ノアーゼは、実際には、機能的酵素の形態を付与する段階であるし」霞旦己内 部での成熟段階を受ける前に、不活性なアポ酵素の形態で発現される。

なお、本発明者は又、これら５つの補助遺伝子の存在が、構造遺伝子ｕｒｅＡ、 ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ及びｕｒｅＤで予め形質転換されたＥ、、　ｃｏｌｉの細胞 中での機能的ウレアーゼの発現にとって不可欠のものであることを確認した。

従って、これらの遺伝子及びそのヌクレオチド配列の同定は、Ｌ」ｎ棟屯の菌株 のウレアーゼ活性を調整するため、特に弱毒化された菌株を調製するための手段 を検討することを可能にする。

本発明の第１の実施態様に従うと、有利なヌクレオチド配列は、天然のポリペプ チドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ及びＵｒｅＩと機能的な相同性を 有するポリペプチドをコードする。

ポリペプチド間のこれらの相同性は、天然のポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、 ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ及びＵｒｅＩとして、Ｌ」１巨１の内部で機能する、ひいて はアポ酵素からの機能的ウレアーゼの形成に貢献するというこれらのポリペプチ ドの能力との関係において評価される。

この機能的相同性は、以下のテストを利用して検出することができる：すなわち 、１０°個の細菌を１−の尿素−インドール培地に再懸濁させ、３７℃でインキ ュベートする。尿素の加水分解は、アンモニアの遊離をもたらし、こうしてその ｐＨを増大させることにより、オレンジ色からツクシア（ｆｕｓｈｉａ）赤への 色の変化が誘発される。

反対に、本発明の枠内では、自らがコードするポリペプチドがＬ」■匡已におい て又は場合によって別の種において機能的ウレアーゼの産生を可能にする天然ポ リペプチドの能力をもはやもたなくなるように変更された、遺伝子ｕｒｅＥ、ｕ ｒｅＦ、ｕｒｅＧ。

ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉに相当する核配列の集合体に対応するヌクレオチド配列 を利用することができる。この場合は、Ｌ」Σ１ｏｒｉにより発現されるような 天然ポリペプチドの機能的特性を減衰又は削除しようとする。本発明に従ったヌ クレオチド配列が中に挿入された菌株が、例えばアポ酵素の形態の非病原性ウレ アーゼを産生じた場合に、機能的特性は減衰したものとみなされる。この病原性 は、以下のテストを利用して評価できる： Ｅａｔｏｎら（１９９１，Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５９：　２４７０− ２４７５）によって記載されている技術を利用することにより、動物、好ましく はノドパイオートの（ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｑｕｅ）仔ブタの胃の中への組換え 型菌株の移植をテストする。

本発明の第１の実施態様に従うと、前述のようなヌクレオチド配列は、Ｌ」Ｌ泣 １内でウレアーゼサブユニットをコードする構造遺伝子ｕｒｅＡ及びｕｒｅＢに 対応する核配列と関連づけることができる。

本発明のもう１つの実施態様に従うと、このヌクレオチド配列は、Ｌ」ユニ以内 でウレアーゼをコードする遺伝子ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ及び／又はｕｒ ｅＤと関連づけられる。

この場合、さまざまな遺伝子は、全（異なるレプリコン上に局在させることがで きる。

本発明は同様に、前述の定義づけの範囲内に入り、かつ遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅ Ｆ、ｕｒｅＧ％ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉに対応するコードするヌクレオチド鎖の １つに対応するヌクレオチド配列にも関する。この点において、本発明は特に以 下の鎖に関するニー　図４の配列のヌクレオチド８００〜１３０９に相当する＃ ｌｕ　ｒ　ｅ　Ｅ、又は、ストリンジェント条件下、つまり６ＸＳＳＣデンハル ト（Ｄｅｎｈａｒｄ）媒体中、６８℃でもしくは５ＸＳＳＣ−５０％ホルムアミ ド中、３７℃で、鎖ｕｒｅＥもしくはこの鎖に相補的な配列とハイブリダイズし た場合のこの鎖のあらゆるフラグメント、 一図４の配列のヌクレオチド１３２４〜２０９１に相当する鎖ｕｒｅＦ、又は、 ストリンジェント条件下、つまり６ＸＳＳＣＤｅｎｈａｒｄ媒体中、６８℃でも しくは５ＸＳＳＣ−５０％ホルムアミド中、３７℃で、連鎖ｕｒｅＦもしくはこ の鎖に相補的な配列とハイブリダイズした場合のこの鎖のあらゆるフラグメント 、−図４の配列のヌクレオチド２１２３〜２７１９に相当する鎖ｕ　ｒ　ｅ　Ｇ 、又は、ストリンジェント条件下、つまり６ＸＳＳＣＤｅｎｈａｒｄ媒体中、６ ８℃でもしくは５ＸＳＳＣ−５０％ホルムアミド中、３７℃で、鎖ｕｒｅＧもし くはこの鎖に相補的な配列とハイブリダイズした場合のこの鎖のあらゆるフラグ メント−図４の配列のヌクレオチド２７２２〜３５１６に相当する１１ｕｒｅＨ １又は、ストリンジェント条件下、つまり６ＸＳＳＣＤｅｎｈａｒｄ媒体中、６ ８℃でもしくは５ＸＳＳＣ−５０％ホルムアミド中、３７℃で、鎖ｕｒｅＨもし くほこの鎖に相補的な配列とハイブリダイズした場合のこの鎖のあらゆるフラグ メント、−図４の配列のヌクレオチド２１１〜７９５に相当する鎖ｕｒｅ　Ｉ、 又は、ストリンジェント条件下、つまり６ＸＳＳＣＤｅｎｈａｒｄ媒体中、６８ ℃でもしくは５ＸＳＳＣ−５０％ホルムアミド中、３７℃で、鎖ｕｒｅＩもしく ほこの鎖に相補的な配列とハイブリダイズした場合のこの鎖のあらゆるフラグメ ント。

ここでＤＮＡ配列に関して「相補的配列」と呼んでいるのは、逆位及び相補的配 列のことである。「逆」という語は、一定の与えられた配列との関係において、 ヌクレオチドの性質上相補的な核酸の５’−３’の配向（オリエンテーション） の回復を考慮している。

本発明は又、 ＧＣＧ　ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＴＧＣＴＡＴ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣＣＧ ＣＣＡＴという配列に対応する特定のヌクレオチド鎮にも関する。

本発明は、同様に、このヌクレオチド鎖を含むあらゆるＤＮＡ配列にも関する。

前述の定義づけに対応する本発明に従ったヌクレオチド配列は、例えばその５′ 及び／又は３′末端で、検出される物質により標識されている場合、プローブの 構成の中に入り得る。標識としては、放射性同位元素、酵素、化学的標識又は化 学発光標識、蛍光色素、ハブテン又は抗体、塩基類縁体、さらには物理的標識を 挙げることができる。これらの標識は、場合によっては、磁性球のような粒状又 は膜状の支持体などの固体支持体に固定することができる。

好ましい標識の一例としては、プローブとして利用される配列の５′末端に取り 込まれた放射性リン（”Ｐ）を挙げることができる。

有利なことに１本発明に従ったヌクレオチドプローブは、例えば約４５ヌクレオ チドのフラグメントのような、上述の遺伝子のあらゆるフラグメントを含む。

本発明に従った好ましいプローブは、遺伝子ｕｒｅＨ又は好ましくは遺伝子ｕｒ ｅ　Ｉに由来するフラグメントにより構成されている。

本発明に従ったヌクレオチド配列から、Ｌ」Ｌ１已による感染のインビトロ検出 のために利用可能なプライマーを構成することもできる。プライマー−は、約１ ８〜約３０個、好ましくは約２５〜約３０個のヌクレオチドを含む、前述の配列 に由来するようなヌクレオチドフラグメントが含まれていることを特徴とする。

このようなプライマーは、例えば鎖重合技術に従った遺伝子増幅反応において利 用することができる。

増幅技術における利用のため、本発明のプライマーは、規定の条件下で、それぞ れ増幅すべきヌクレオチドフラグメントの５′及び３′末端とハイブリダイズす るように、２つずつ組合わせて取られる。

ＰＣＲ技術を利用する場合には、検出すべきＤＮＡとのプライマーの特異的ハイ ブリダイゼーションに必要とされる条件は、欧州出願第２００３６３号、第２０ １１８４号、第２２９７０１号に記載されている条件であり、温度は次の式に従 って計算される：Ｔ　（”Ｃ）＝　［４（Ｃ＋Ｇ）＋２　（Ａ＋Ｔ）−１０１な お、式中、Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇは、それぞれ利用されるプライマー中のヌクレオチド Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇの数を表わす。

本発明の枠内で利用可能な増幅技術には、例えば、Ｃｅｔｕｓの欧州特許出願（ 第２００３６３号、２０１１８４号及び２２９７０１号）に記載されているＰＣ Ｒ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術、又はＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（第６巻 、１９８８年ｌＯ月）の中に記載されている「Ｑβレプリカーゼ」技術などが含 まれる。

本発明に従ったその他のヌクレオチド配列は、以上で定義づけしてきた配列又は これらの配列に相補的な配列と上述のストリンジェント条件下でハイブリダイズ する配列である。

本発明のヌクレオチド配列及びベクターは、同様に、Ｌ」弘ｌは又はその他の菌 株のその他の遺伝子又は配列を、Ｌ」弘匡１、又はＥ、　ｃｏｌｔ　、アデノウ ィルスのようなその他の宿主の中で発現させるためにも利用できる。

本発明はさらに、図４に示されているポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ％Ｕｒｅ Ｇ、ＵｒｅＨ又はＵｒｅＩのうちの１つ、又はこれらのポリペプチドのうちの少 なくとも１つのポリペプチドのあらゆる部分に相当することを特徴とするポリペ プチドにも関する。本発明は、特に、Ｌ」」ムにより発現されるようなＵｒｅＥ ％ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ又はＵｒｅ　Ｉ由来のポリペプチドと機能的相 同性を示す場合に直ちに変更されるか、あるいは反対に単数又は複数のアミノ酸 の欠失、付加、置換又は逆位によって変更されて、Ｌ」立担己により発現される ようなウレアーゼ活性といったその機能的特性を減衰さらには削除された、あら ゆるポリペプチドに関する。

ポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ及びＵｒｅ　Ｉは、特に 、Ｌ」ｎ１１におけるウレアーゼの調節及び成熟に介入する。

本発明に従った別のポリペプチドは、 Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　 Ａｒｇ　Ｈｉｓという１１個のアミノ酸の鎖に対応するものである。

本発明のポリペプチド、特に上にその配列が与えられているポリペプチドは、ポ リクローナル又はモノクローナル抗体の産生のため、又はＬ」ヱ国１に感染した 生物学的試料の中の抗体の検出のために利用できる。

モノクローナル抗体は、ヒト抗体を調製するための既知の技術又はハイブリドー マ技術によって調製することができる。

これらの抗体は、同様に、Ｍａｒｋｓら　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１９ ９１２２２、５８１−５９７）により記載されている技術を用いても調製可能で ある。

本発明は又、抗イデイオタイプ抗体にも関する。

上述の１１個のアミノ酸の鎖に対する抗体を、ウレアーゼの成熟の遮断反応の枠 内で利用することが可能である。

本発明は、さらに、Ｌ」■匡ムによる感染を処置するための組成物におけるモノ クローナル又はポリクローナル抗体の用途にも関する。

本発明は、同様に、本発明のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする組換え型ベクタ ーをも目的とする。このような組換え型ベクターは、例えば、コスミド又はプラ スミドであってよい。

本発明の実施のために特に有利なベクターは、それが１９９１年１０月３日にｌ −１１４８という番号でＣＮＣＭ　［フランス、パリ市の国立微生物培養収蔵所 （Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）　］に寄託された、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１ ０１中に含まれているプラスミドｐＩＬＬ７５３であることを特徴とする特に有 利な別の組換え型ベクターは、それが１９９１年１０月３日にｌ−１１４９とい う番号でＣＮＣＭに寄託された。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１に含まれているプラスミドｐＩＬＬ７６３である ことを特徴とする。

本発明は、同様に、前述の定義づけを満たすヌクレオチド配列によって形質転換 されていることを特徴とする組換え型宿主細胞（又は組換え型細胞株）をも目的 としている。このように形質転換された宿主細胞は、場合によっては前述の定義 に従って変更されたウレアーゼの補助遺伝子のヌクレオチド配列の発現を可能に しなくてはならない。

好ましい例としては、組換え型宿主細胞は、前述のヌクレオチド配列の１つによ って変更された、又は、有利なことに自ら発現する変更された補助遺伝子の産物 が、ウレアーゼの効果、特にその病原性効果を減衰させるのに貢献するような形 で変更された、Ｌ」■国己の菌株である。

例えば、このような組換え型菌株は、１９９２年６月２６日にＮＣＩＭＢ４０５ １２という番号でイギリス＜７）ＮＣＩＭＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅ ｒｉａＬＴＤ）に寄託されたし」■説己のＮ６株の突然変異によって得ることが でき、ここで、この突然変異は、遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅ Ｈ又はｕｒｅ　Ｉのうちの少なくとも１つのレベル、及び／又は、例えばｕｒｅ Ａ又はｕｒｅＢのような、単数又は複数の構造遺伝子のレベルで行なわれる。

好ましくは、本発明の枠内で、以前に規定した基準に従って、ウレアーゼ活性が 減衰されている組換え型菌株、特にＬ」■匡ム菌株が形成される。

かくして、特に有利な組換え型Ｎ６株は、ウレアーゼ陰性表現型を得ることを可 能にし、しかも突然変異を受けた遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅ Ｈ又はｕｒｅ　Ｉの少な（とも１つを含むものである。

遺伝子ｕｒｅ　Ｉの不活性化により、例えばウレアーゼ陰性のし」工迫ム菌株を 調製することが可能となる。同様に、遺伝子ｕｒｅＡ及びｕｒｅＢの産物が発現 されるのに対して、ｕｒｅ　Ｉの内部のいくつかの突然変異によりＬ上（至）ユ 内でウレアーゼ陰性表現型を得ることが可能となる。例えば、例中に記載されて いる突然変異Ｎｏ、８がそれである。

特にワクチン菌株、なかでもワクチンＬ」ｎ匡ム菌株の調製のために特に有利な 別の突然変異は、遺伝子ｕｒｅＧの突然変異である。遺伝子ｕｒｅＧが突然変異 を受けている組換え型り上［有］坦菌株は、以下のような特性を示すニ ー　このような突然変異を受けた菌株は、免疫応答を開始させる能力を保持して いる。

一このような突然変異を受けた菌株は、ウレアーゼ活性を備えていない。

しかしながら、本発明の配列でその他の菌株を形質転換することが可能である。

特に、例えばプラスミドを介してこの菌株の中に予め挿入された遺伝子ｕｒｅＥ 、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ％ｕｒｅＨ又はｕｒｅＩの中の突然変異を実現するために は、Ｅ、　ｃｏｌｔを利用することになる。このように突然変異を受けた遺伝子 は、次に、対立遺伝子の置換を可能にして突然変異を生み出すため、別の宿主細 胞、例えばＬ」立国己の中に導入することができる。

本発明に従った組換え型Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞での遺伝子ｕｒｅＩの欠失は、ウレ アーゼ陽性表現型の発現のためのその他の条件がととのった場合、この表現型を 変えることはない、という点に留意されたい。

組換え型Ｅ、　ｃｏｌｉ菌株は、さらに、ポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ％Ｕ ｒｅＧ、ＵｒｅＨ又はＵｒｅＩを産生するため、及び従来の技術によりこれらを 精製するために利用できる。

ウレアーゼ活性が減衰されたし」１国１の組換え型菌株は、同様に、例えばコレ ラやサルモネラの遺伝子のような異種遺伝子の輸送及び発現のためにも利用可能 である。

組換え型菌株を実現するためには、さまざまな技術を用いることができる。例え ば、本願の例中で記載されているような電気穿孔法が利用される。

場合によっては、この電気穿孔法は、形質転換すべき細胞のレベルで電気ショッ クを与えることから成る段階を削除することによって変更することができる。

本発明は、特に、ウレアーゼ活性が減衰されていることを特徴とする組換え型細 胞株を含む免疫原性組成物の投与によって、Ｌ」■泣已による感染に対して保護 するための手段を提供する。このような免疫原性組成物は、人間医学で利用可能 である。

免疫原性組成物は、場合によってウレアーゼ活性を低下させるため変更された遺 伝子ｕｒｅＥ％ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉに相当する少なく とも１つの配列を含む、本発明に従ったヌクレオチド配列の菌株内への挿入によ りウレアーゼ活性が減衰されたし」ユニ已の細胞のような菌株を含んでいてよい 。

一般に、ここで問題となりつるのは、例えば、単数又は複数の遺伝子ｕｒｅＡ、 ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ％ｕｒｅＤ％ｕｒｅＥ。

ｕｒｅＦ％ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉのヌクレオチド配列の突然変異に よって、又はウレアーゼの構造、成熟もしくは調節に介入するポリペプチドの部 分切除形態の発現によって、減衰されたウレアーゼを産生ずることができるあら ゆる宿主である。

本発明は、同様に、定められた生物学的試料についてのし」ユニ已による感染の インビトロ診断のためのキットにおいて、 −ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ％ｕｒｅＨ又はｕｒｅ　Ｉの中から選択される 遺伝子に相当する少な（とも１つの核配列に特異的なヌクレオチドフラグメント の５′及び３′末端にハイブリダイズすることができる、上述の基準を満たす少 なくとも一対のヌクレオチドブライマー、 一処理された試料から核酸を抽出するのに必要な試薬、−増幅したいと考えてい るフラグメントの増幅を実施するのに充分な量の、ヌクレオチドブライマーから の前記ヌクレオチドフラグメントの重合を行なうための試薬、特に重合酵素、− プローブとして用いることができ、かつ増幅されたＤＮＡフラグメントと規定条 件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１つのヌクレオチド鎖、 一場合によっては、ハイブリダイゼーションを明らかにするための手段 を含むことを特徴とするキットをも、その目的としている。

本発明の特定の一実施態様によると、このキットの中には同様に、 一例えば抗生物質に対する耐性遺伝子を含んでいること又はＮＣの染色体ＤＮＡ で構成されていることなどによって、ハイブリダイゼーションにより容易に検出 されうる、場合によっては１つのプラスミドにより担持されている核酸によって 構成され、前記フラグメントにはさらにこれら２つの末端に少なくとも１つの増 幅プライマーが備わり、これらのプライマーが本発明のプライマーの中から選ば れている又は選ばれていない、増幅反応内部対照、及び −内部対照の中に含まれている核酸とハイブリダイズすることができるプローブ 、 一場合によっては、テストされる試料中に場合により存在するＲＮＡからｃＤＮ Ａを得るための逆転写酵素、を包含させることもできる。

試料に添加される内部対照の存在により、試料のうちの「偽陰性」の存在を検出 することが可能となる。実際、内部対照の特異的プローブが増幅産物を検出しな い場合、おそらく、Ｌ」霞ユ１のＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅を妨げる阻害物質で ある、Ｔａｑポリメラーゼの阻害物質を含む試料が存在する。この場合、テスト される試料のさまざまな希釈により、Ｌ」１匡１の核酸の存在を実証することが 可能となる。

内部対照が陽性反応を示す場合、テストされた試料のレベルでの陰性反応により 、し」■国己がまさに欠如していると結論することができる。

内部対照に取り込まれるプライマーは必ずしも本発明のプライマーではないとい う点に留意されたい。ただし、その他のプライマーを選択した場合、感度が低下 する可能性がある。

Ｌ」上匡已によるヒトの感染を検出するための生物学的試料の一例として、生検 、胃液、又は場合によっては唾液もしくは便などの採取標本を用いる。

このキットは、同様に、水質汚染検査又は食品検査のためにも利用できる。

本発明は同様に、規定の生物学試料のし」工巨己による感染のインビトロ診断の ための方法において、ａ）一本領ＤＮＡ又はＲＮＡの形態でのアクセス可能性を 与える条件下で、Ｌ」霞ぷはを含んでいる可能性がある試料の核酸を、Ｌ」■諌 己の核酸が存在する場合それとハイブリダイズし、かつブライマーエクステンシ ョン（延長）産物の合成を開始させることができる本発明に従った少なくとも１ 対のヌクレオチドブライマーと接触させる段階であって、ここでＬ」立国１のヌ クレオチド配列の各ストランドがプライマーと組合わさった時点で鋳型として役 立つ段階、 ｂ）合成された核酸ストランドをその鋳型から分離する段階、Ｃ）検出できるほ ど充分な請求められている核酸の増幅が得られるまで、プライマーとハイブリダ イズすることができ、かつ段階ｂ）の終了時点で存在する核酸の各ストランドか らの延長産物の合成を反復する段階、 ｄ）求められている増幅済みの核酸の存在を検出できるようにする条件下で、ヌ クレオチドプローブと段階Ｃ）の産物とを接触させる段階、 ｅ）場合により形成されたハイブリダイゼーション産物を検出する段階 を含むことを特徴とする方法にも関する。

上述のインビトロ診断のための方法の好ましい実施態様に従うと、テストされる 試料の接触の前に、核酸を抽出するような試料の処理段階がある。

好ましい別の一実施態様に従うと、この方法には、テストされる試料中に場合に より存在するＲＮＡからｃＤＮＡを合成するための、逆転写酵素での試料の核酸 の処理から成る、プライマーとの接触段階に先立つ１つの段階が含まれている。

本発明は又、Ｌ」■圧損による感染のインビトロ診断のためのキットにおいて、 一前述の定義に従った一定量のプローブ、−検出すべきＬ」■匡ムの核酸とプロ ーブとの間のハイブリダイゼーション反応の実施に適した媒体、 −場合により形成されるハイブリッドの検出のための試薬を含むことを特徴とす るキットにも関する。

このキットの利用、及び生物学的試料に基づ＜ｐによる感染のインビトロ診断の ための方法は、−そのＤＮＡ及び／又はＲＮＡが予めアクセス可能にされている テストすべき試料を、プローブとの核酸のハイブリダイゼーションを可能にする 条件下で、前述のプローブと接触させる段階； 一核酸とプローブとの間の場合により起こるハイブリダイゼーション反応を明ら かにする段階 を含むことを特徴とする。

本発明のヌクレオチド配列は、し」■匝己の核酸の抽出及び選択されたエンドヌ クレアーゼでの消化及び精製、さらに又は化学合成によって得ることができる。

一例としては、このような核酸フラグメントの合成のためには、Ｎａｒａｎｇ、 　Ｓ、　Ａ、らがＭｅｔｈ、　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６８．９０　（１９ ７９）の中で記載しているようなホスホトリエステル法を挙げることができる。

ヌクレオチドフラグメントの調製のために適合された別の方法は、Ｂｒｏｗｎ　 Ｅ、　Ｌ、ら力（Ｍｅｔｈ、　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　６Ａ、　１０９　（ １９７９）の中で記載しているようなホスホトリエステル法である。

この調製は、同様に、例えば出発成分としてジエチルホスホアミダイトな介入さ せることなどによる自動化された方法によっても実施でき、この場合、合成は、 Ｂｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　 （１９Ｊ１１）、　２２．１８５９−１８６２の記載に従って行なうことができ る。

本発明のその他の利点及び特性は、以下の例及び図面から明らかになる。

図 ［：　ｐＩ　Ｌ　Ｌ　７５３のトランスポゾンによるサブクローニング及び突然 変異誘発 Ａ：ハイブリッドコスミドｐｌＬＬ５８５及びプラスミドｐＩＬＬ５９０の線形 制限地図（Ｌａｂｉｇｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　−１９９１）。灰色の枠組は、虹− 邑坦酊でのウレアーゼの発現に必要とされるＤＮＡフラグメントを表わす。

Ｂ：トランスポゾンＭｉｎｔ　Ｔｎ３−Ｋｍの無作為挿入。°数字（１〜２４） も、円と同様、ｐＩＬＬ７５３内のトランスポゾンの挿入部位に対応する；（＋ ）符号はトランスポゾンがウレアーゼの発現を不活性化しなかったことを示し、 一方、（−）符号はウレアーゼの発現が消え去ったことを示す。

Ｃ：ｐＩＬＬ７５３の内部での欠失（△）により生成されたハイブリッドプラス ミドｐＩＬＬ７６８及びｐＩＬＬ７６８の線形制限地図。遺伝子（ｕｒｅＡ−ｕ ｒｅＨ）の局在は、長方形によって表わされている。長方形の長さは、ポリペプ チドを発現するため必要とされるＤＮＡの長さに対応する。

矢印は、転写の向きを示す。図の下にある枠組の数は、制限フラグメントのキロ ベース単位のサイズを表わす。カッコ内の数字は、クローニングベクター（ｐＩ ＬＬ５７５、ｐ　Ｉ　Ｌ　Ｌ　５５０又はｐＩＬＬ５７０）のうちの１つの中に 挿入されたし」１国１のＤＮＡフラグメントのサイズに対応する。Ｂ、且互二Ｈ １，Ｅ、旦立旦ＲＩ、Ｐ、二旦１■、Ｈ，ＨＬ　ｎｄＩｌｌ　；　Ｃ，立上ａ　 Ｉ　；　Ｓｍ、Ｓｍａ　Ｉ。カッコ内の文字は、制限部位がベクターに属するこ とを表わす。

区ｌ：時間に応じての、ｐＩＬＬ７５３を担持するＥ、　ｃｏｌｉＨＢ　１０１ により発現されたウレアーゼ活性１０ｍＭのし一アルギニン（ＭＭ）で補完され たし寒天培地（ＭＬ）又はＭ９最少培地で調製した箱の各々に１００４の培養ア リコート部分を接種し、０．８５％の無菌的ＮａＣｇ中に懸濁させた（１０”細 菌／−）。箱を、好気的又は微好気的媒体内で、（Ａ）３０℃又は（Ｂ）３７℃ でインキュベートし、必要な時期に活性測定を行なった。星印は、ウレアーゼ活 性が全く検出されなかったことを表わす。

区立：Ｌ」ヅ至はのウレアーゼの補助遺伝子のＤＮＡ配列Δ：ハイブリッドプラ スミドｐ　Ｉ　ＬＬ７５３のウレアーゼ領域の補助遺伝子の配列決定のための戦 略。矢印は、配列決定されたＤＮＡフラグメントのサイズに相当する。矢印の頭 は、オリゴヌクレオチドの決定を実施し、確認するために利用されるオリゴヌク レオチドを表オつす。

旦：ヌクレオチド配列の分析から推定した５つの読み取り枠（オーブンリーディ ングフレーム；　０ＲＦｓ）及びそのヌクレオチドサイズの概略的表示。ＡＴＧ は、各遺伝子に関する開始コドンに相当する。

Ｃ：Ｌ」立国己のウレアーゼの補足的な５つのポリペプチドの計算上のサイズ及 び分子量を示す。

図Ａ−：Ｌ」１巨１のウレアーゼの補助遺伝子のヌクレオチド配列配列の上の数 は、ヌクレオチドの位置を表わす。配列順に、予測されるアミノ酸配列は次のと おりである：ＵｒｅＩ　（ｂｐ２１１〜７９５）　、ＵｒｅＥ　（ｂｐ８００〜 １３０９）、ＵｒｅＦ　（ｂｐ１３２４〜２０９１）、ＵｒｅＧ　（ｂｐ２１２ ３〜２７１９）及びＵｒｅＨ（ｂｐ２７２２〜３５１６）。リポソームとの潜在 的結合配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ、　ＳＤ部位）には下線を引いであ る。囲みのある配列は、プロモータ一様タイプ（σ５４）の配列に相当し、配列 の上の矢印は、ｒｈｏ非依存性の転写の終結シグナルの要素を伴うループ状の構 造を表わす（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７９）　Ａｎｎｕ、　 Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、　１３：３１９−３５９］。アミノ酸配列の下の点線は、 ＤＮＡ（ｕｒｅＩ）、又はタンパク質のＡＴＰ　（ｕｒｅＧ）の結合ドメインに 相当する［Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、　４： 　１０３３−１０４０及びＰａｂｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　Ａｎｎ、　Ｒ ｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、５３：　２９３−３２１　］　。

２２区５：ウレアーゼオベの遺伝的編成Ｐ、　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ　［Ｊｏｎｅ ｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１７１：　６４１４−６４２２　］、＄　（Ｍｕｌｒｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ。

−１９９０）及びＬ」立国己のウレアーゼオペロンと関連づけられたポリペプチ ドをコードする遺伝子の相対的位置を表わす。百分率は、類似した２つの遺伝子 間の同一のアミノ酸の割合に関するものである。空白の枠は、オペロンに独自の 遺伝子を表わす。

区立及ｍユニ親菌株及び突然変異を受けた菌株の分析。

図３．：菌株８５Ｐ、Ｎ６及び突然変異を受けたＮ６（ウレアーゼ−）の総ＤＮ Ａの酵素消化後の制限プロフィールｌジ及μ上旦：菌株８５Ｐ及びＮ６のゲノム 内の４つの且二旦遺伝子のゲノム編成。ＤＮＡ特異フラグメントは、図１０に従 った８対のプライマーを用いることにより、Ｌ」■国以の単離株８５Ｐ及びＮ６ から抽出した染色体ＤＮＡから増幅させた。増幅産物を、１．４％のアガロース ゲル上での電気泳動により分離した。ゲルの各々の側の値は、標準として用いら れたｌｋｂのスケールの寸法（キロベース単位）に相当する。

区エユ：抗体を用いたイムノブロッティング皿上ユニトランスポゾンによる突然 変異誘発二も」■国己細菌における突然変異体の構築に必要な４つの連続的段階 の概略的表示。

接合１：トランスポゾンＭｉｎｔ　Ｔｎ３−Ｋｍを収容するＩｎｃＦ群の移入可 能なプラスミドｐＯＸ３８を、１）トランスボゼースＴｎ３　（ＴｎｐＡ）を構 成的に発現し、かつ配列Ｔｎ３−３８ｂｐの存在を考慮してＴｎ３に対する免疫 性をもつプラスミドｐＴＣＡ、及び２）突然変異を誘発するべきし」１国１のク ローニングされたフラグメントを含む接合自殺ベクターを含む、Ｅ、　ｃｏｌｉ 　ＨＢ　１０１中に導入する。カナマイシンＨＢ１０１トランス接合個体を３０ ℃で４８時間培養し、細菌なＥ、　ｃｏｌｉ　Ｄ　Ｈ１（Ｎａｌ）と接合させる 。

接合２；リシルベースの不在下でのｐｌＬＬ５７０から誘導されたプラスミド中 でのＭｉｎｉ　Ｔｎ３−Ｋｍの転位の結果として得られた弁組込み体（コインテ グレート）を、ＤＨＩ細胞内の接合カナマイシン弁組込み体として選択する。

接合３：弁組込み体を、トランスポゾン（ｐ　ＯＸ　３８−ＭｉｎｉＴｎ３−Ｋ ｍ）のための始原ドナーから成るものとＭｉｎｉＴｎ３−Ｋｍが挿入されたｐＩ ＬＬ５７０から誘導されるハイブリッドプラスミドから成るものという、２つの レプリコンへの弁組込み体の特異的組換えによる分離を生じることができる立二 旦遺伝子を収容するＮ３２１１４株（Ｒｉｆ）に導入する。弁組込み体の分離さ れた形態の正の選択は、３００νｇ／−のカナマイシン及び３００μｇ／−のス ペクチノマイシンを含む培地上での、カナマイシンでのトランス接合体Ｎ５２１ １４の選択により得られた。Ｌ」ｎ国己の突然変異を受けたＤＮＡの導入から成 る最後の段階は、段階３で得られたＥ、　ｃｏｌｉＮＳ２１１４（基準菌株）を 抽出したプラスミドを用いてＬ」Ｌ国己を電気穿孔することによって実施できる 。

区±３　＋　５ｅｉｆｅｒｔら（１９８６，ＰＮＡＳ、　ＵＳＡ、　８３：　７ ３５−７３９）に従ったＭｉｎｉ　Ｔｎ３の制限地図 星印は、プラスミドｐＩＬＬ５７０内の、ベクター構築中に変更された制限部位 を表わす。

■−遺伝子の同定 杯扛監方伝 、プラスミド　び１立 胃炎を患う患者の体内のし」立匡已８５　Ｐを単離した。これはＬａｂｉｇｎｅ ら［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：　１９２０−１９３１　（１９９１ ）　］により記載されている菌株に相当する。クローニング実験における宿主と しては、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（ １９８３）、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　、　（：ｏｌｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　ｔ（ａｒｂｏｒＮ、　Ｙ、　］を利用し、ウレアーゼ発現の定量分析のための 宿主としと）　［Ｂｏｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９６９）　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　４１：　４５９−４７２　］を利用した。この研究において利用し たベクター及びハイブリッドを、表１に記す。Ｅ、　ｃｏｌｔ菌株をグルコース 無しのしブロス（１リツトルあたり、トリプトンｌｏｇ、酵母エキス５ｇ及びＮ ａＣ４２５ｇ、ｐＨ＝７．０）中又はＬゲロースのボックス（１，５％のゲロー スを含む）上で、３７℃で培養した。形質転換体の選択のための抗生物質濃度は 、以下のとおりであった（１リツトルあたりのミリグラムの単位で）：カナマイ シン：２０、テトラサイクリン：８、アンピシリン：１００、スペクチノマイシ ン：１００、カルベニシリン＝１００°ウレアーゼ活性の発現のためには、炭素 源として０．４％のＤ−グルコースと、窒素源として、相反する指示が無い限り ろ過滅菌した新たに調製した０、２％（重量／体積）のし−グルタミン［Ｐａｈ ｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５０：　 ２０２−２１３）を含む、アンモニウム無しのゲロース入りＭ９最少培地（ｐＨ ＝７．４）から成る、窒素源濃度を制限した培地上で、Ｅ、　ｃｏｌｔ細菌を培 養した。

クローニング　びＤＮＡ 制限エンドヌクレアーゼでの消化、末端の充てん及びその他の一般的なりＮＡ操 作は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの標準的技術に従って行なった（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｔ、　（１９８３）、分子クローニング、実験室マニュアル、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＮ、Ｙ、］。酵素活性を抑制する形で、２０℃で、１且旦 ３Ａを用いた部分的消化を行なった。制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラ ーターのラージ（大）フラグメント、Ｔ４のＤＮＡポリメラーゼ（フラグメント の末端を平滑にするのに利用される）及びＴ４のＤＮＡリガーゼは、Ａｍｅｒｓ ｈａｍ　Ｃｏｒｐ、から供給された。修生の腸アルカリホスファターゼは、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａがら供給された。ＤＮＡフラグメントを、１％又は１．４％のア ガロースを含むゲルの水平ブロック上の電気泳動により分離し、トリス−酢酸塩 又はトリス−リン酸塩緩衝液中で処理した［Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　 （１９８３）、分子クローニング、実験室マニュアル、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｎ、Ｙ、］　、分子量の標準としてｌｋｂのスケールを用いた（Ｂｅｔｈｅ ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　＠臭化エチジウム（ ０，４％ｇ／ｄ）を含むアガロースゲルからのＤＮＡフラグメントの電気溶出を 、前述のとおりに実施した［Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３：１９２０− １９３１　（１９９１）、　Ｌａｂｉｇｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　］。

１に二二旦括皿 ウレアーゼ活性の検出を、尿素−インドール培地（ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＰａｓ ｔｅｕｒ）　ｌ　ｙｎｌ中での１０９個の細菌の再懸濁、及び変化する時間の３ ７℃でのインキュベーションにより行なった。ウレアーゼ活性によるアンモニア の遊離は、ｐＨを高め、オレンジ色から赤色への変色を誘発した。

前述の作業様式の変更に従って［Ｆｅｒｒｅｒｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１） Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｅｃｏｌ、　Ｈｌｔｈ、　Ｄｉｓ、　４：　１２１−１３４） 、ベルテロ（Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ）　。

反応によってウレアーゼ活性を測定した。簡潔に言うと、細菌を、ゲロースボッ クスから無菌的０．８５％ＮａＣｌ２２．Ｏ−中に収集し、４°Ｃで１０分間、 １２．０００回転／分で遠心分離した。

０．８５％ＮａＣｊ２中で沈渣を２回洗浄し、１０ｍＭＥＤＴＡを含む１００ｍ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）（ＰＥＢ）中に再懸濁させた。超音波 処理された抽出物を調製するため、細胞を、３０ｗ、サイクル５０％に調節した Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒ４５０型を用いて、３０秒のインパルス４回 で溶解させた。細胞破砕物は、ウレアーゼの測定前に除去した。調製したばかり の試料（１０〜５０４）を、２０ＯＮ！の尿素基質溶液（ＰＥＢ中に調製した５ ０ｍＭ尿素）に添加し、３０分間、通常の温度で反応させた。４００４のフェノ ール−ニトロプルシド試薬及び４００ｕのアルカリ性次亜塩素酸塩試薬の添加に より、反応を停止させた。反応混合物を５０℃でインキュベートした。基質添加 の前に５分間沸とうさせてウレアーゼ活性を不活性化したブランクも、同様の要 領で処理した。

遊離アンモニアの量は、Ａ６□とアンモニウム濃度（ＮＨ４（ｌからの）との関 係を設定する標準曲線から決定した。２　ｐｒｎｏｌのアンモニアの遊離が、１ 　ｐｍｏｌの尿素の加水分解と等価であることを考慮した。ウレアーゼ活性は、 細菌タンパク質１ｍｇあたりの１分間に加水分解された尿素のｐｍｏｌ数の単位 で表わした。

久Ｚ益之亘辺ｌ淀 ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試験に従って（Ｓｉｇｍａ（：ｈｅｍｉ ｃａｌｓ）、タンパク質の濃度を測定した。全細胞の抽出物中のタンパク質を可 溶化するため、ＴＰＥ中に調製した細胞懸濁液を遠心分離し、沈渣をオクチル− β−Ｄ−グルコピラノシド溶液中に再懸濁させて、最終界面活性剤濃度（染料試 薬中）を０．１〜０．２％（重量／体積）とした。

トランス接合体の”然′・　舌　び内体・・　のｐＩＬＬ５７０内にクローニン グされたＤＮＡフラグメント内への無作為挿入により突然変異を生じさせるため 、Ｍｉｎｉ　Ｔｎ３−Ｋｍの供給システムを利用した。

転位因子のドナ・−としてのプラスミドｐｏｘ３ｇ及びトランスで作用して酵素 トランスボゼースＴｎ３を供給するプラスミドｐ　Ｔ　ＣＡ　（Ｓｅｉｆｅｒｔ 　ｅｔ　ａｌ、　１９８５．　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＰｒｉ ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ（遺伝子工学の原理と方法）第８巻＝ ｐ１２３−１３４．　Ｓｅｔｌｏｗ、　Ｊ、　ａｎｄ　ｔ（ｏｌｌａｅｉｎｄｅ ｒ、　Ａ、　Ｅｄｉｔｏｒｓ、　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ を介入させる５ｅｉｆｅｒｔら（１９８６，ＰＮＡＳ　ｔＪｓＡ　８３ニア３５ −７３９）により記載されているＭｉｎｉ　Ｔｎａ系、ならびに上立五部位に対 して特異的なリコンビカーゼ（組換え酵素）Ｐｌをコードする二二二遺伝子を収 容する菌株Ｎ５２１１４を、以下の変更を伴うＤＮＡフラグメントの突然変異誘 発のために利用した：ｌ）プラスミドｐＴｎ　（上述の５ｅｉｆｅｒｔ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８６）内のβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子のｎ±１一旦ｃ ｏＲＩフラグメントを除去し、これをカナマイシンカセットＣ１ａＩ−（」見逗 旦［Ｌａｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕｓｓｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８，Ｊ、　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、　１７０＋１７０４−１７０８１に記載されている１、４ｋｂの 長さのもの〕で置換することによって、Ｍｉｎｉ　Ｔｎ３を変更した。この新し い挿入因子ＭｉｎｉＴｎ３−Ｋｍを、プラスミドｐＩＬＬ５５３の獲得を誘導す る、５ｅｉｆｅｒｔら（１９８６，前出）によって記載されているような移入可 能なプラスミドｐＯＸ３８内に転位させた。

１１）突然変異誘発のために利用するフラグメントのクローニングのため、Ｌａ ｂｉｇｎｅら（１９９１，Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７３＋　１９２０− １９３１）により以前に記載された接合スペクチノマイシンｐＩＬＬ５７０自殺 ベクターを用いた。この自殺ベクターは、Ｔｎ３に対する免疫性に関連するＤＮ Ａ配列が欠失しているｐ　Ｉ　Ｌ　Ｌ　５６０　（Ｌａｂｉｇｎｅ−Ｒｏｕｓｓ ｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７０：　 １７０４−１７０８）から誘導されたものである。

冒）「相補性プラスミド」のプラスミドＩｎｃＰ、ｐＲＫ２１２、１　（Ｆｉｇ ｕｒｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７６：　１６４ ８−１６５２）を接合によりＥ、　ｃｏｌｉ　ＮＳ２１１４株に導入し、立二旦 遺伝子を収容するＮ５２２１４のりファンピシン自然突然変異体を得て、共組込 み体を収容するトランス接合体の選択のためにこれを利用した。

１ｖ）５００％ｇのカナマイシン及び３００μｇのスペクチノマイシンを含む培 地上に得られた第３の混合物をボックス上に被着させることによりｐＩＬＬ５７ ０から誘導されたプラスミドの大量のコピーによって、共組込み体［共組込み（ コインテグレーション）の産物］の効果的な分離を、正の選択により選択した。

ユ■ΔΩ坦泗迭亙 ２つの相補的ストランドを独立して読みとるため、Ｍ１３ｍｐ１９とＭ　１３　 ｍ　ｐ　１８　［Ｍｅｉｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１ ９：２６９−２７６１内にＤＮＡの適切なフラグメントをクローニングした。

挿入フラグメントを含むクローンを、Ｘ−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３ −インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）及びイソプロピル−β−Ｄ−チオ ガラクトピラノシドを用いて同定した。組換えられたプラスミドＭ１３ｍｐ１８ 及びＭ１３ｍｐ１９の一本鎖を、ポリエチレングリコール法［Ｓａｎｇｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４３：　１６１−１７８　］に従って得た。必要な５ ｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃ ｏｒｐ、）を用いて、ジデオキシヌクレオチドを用いるチェインターミネータ− 法［Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４：　５４６３−５４６７　］に従って、配列決定 を行なった。二本鎖ＤＮＡの配列決定も、同様に、塩化セシウム勾配上で精製し たプラスミドＤＮＡを利用して、必要な５ｅｑｕｅｎａｓｅを用いて、ジデオキ シヌクレオチドを用いるチェインターミネータ−法によって行なった［Ｚｈａｎ ｇ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ匹：　１２２０　］　、　ＤＮＡａｕｇの試料を、まずＩＭのＮａＯＨ溶液（ 総容量２０μ）で変性させ、次に、２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ４，６）２μ で中和した。１００％の氷結したエタノール６ＣＩＩ！を添加し、−７０℃で１ ００分間インキュベート、４℃で２０分間遠心分離した後、ＤＮＡを沈殿させた 。８０％の氷結したエタノール６０μで洗浄した後、沈渣を、プライマー０、５ 　ｐｍｏｌを含む配列決定緩衝液１０ＩＬＩ中に再懸濁させ、６５℃で３分間イ ンキュベートした。通常の温度での３０分のインキュベーション時間の後、配列 決定を行なった。

殖里 、　え刑コスミド　ＩＬＬ５８５を又１　るＥ、　ｃｏｌｔのにおけるウレアー ゼ゛　の ロスミドｐ　Ｉ　ＬＬ５８５を収容するＥ、　ｃｏｌｔの形質転換体を、（唯一 の窒素源として）０．２％の１−グルタミンを添加したグルコース入りＭ９最少 培地又はＬ培地上に広げ、３７℃で４８時間インキュベートした。次に、形質転 換体を、尿素−インドール培地中で行なう定性比色試験に従って、ウレアーゼ活 性に関してスクリーニングした。好気性条件下、３７℃で、最少培地上で複数の 継代（５継代以上）を受けたＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１の形質転換体におい てのみ、活性が観察された。従って、これが、Ｅ、　ｃｏｌｔのクローン内のウ レアーゼの発現の定性的測定に利用した条件である。窒素の豊富な培地上で培養 された形質転換体には、いかなるウレアーゼ活性も検出されなかった。

窒素源の濃度を制限する培地での培養及び継代の後でさえ、Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞 内でのｍにおけるウレアーゼの発現に必要な最小領域として同定された４、２ｋ ｂのフラグメント［Ｌａｂｉｇｎｅｅｔ　ａｌ、（１９９１）　Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌ、　１７３：　（１９２０−１９３１）　）を含むプラスミドｐＩＬＬ ５９０でのＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１株の形質転換。

このことはすなわち、ロスミド上に存在するが、しかしプラスミドｐＩＬＬ５９ ０に欠如している遺伝子が、Ｅ、　ｃｏｌｔにおけるウレアーゼの発現に必要で あるということを暗に意味している。

Ｅ、　ｃｏＬＬ　のウレアーゼゞ　にＩ′１　な゛　−のサブクローニンダ 組換え型プラスミドｐＩＬＬ５９０を収容するＥ、　ｃｏｌｔ菌株において検出 可能なウレアーゼ活性が欠如している状態で、ロスミドｐＩＬＬ５８５の３４ｋ ｂの挿入フラグメントを、エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａを用いて部分消化して 、７〜１２ｋｂのフラグメントを産生させた。これらのフラグメントを、はじめ のゲノムの再配置（リアレンジメント）をことごとく避けるためアルカリホスフ ァターゼで処理し、ＢａｍＨＩで線形化されたプラスミドｐＩＬＬ５７０に連結 した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１における形質転換の後、スペクチノマイシ ンに対する耐性をもつ各々の形質転換体を、誘導条件下でウレアーゼの加水分解 するその能力についてその後の試験に付した。１つのクローンが、ウレアーゼ陽 性表現型を示した。

これはｐ　Ｉ　Ｌ　Ｌ　７５３と呼ばれる組換え型プラスミドを収容していた。

このプラスミドは１１．２ｋｂの挿入フラグメントを含んでいた。ベクターｐＴ ＬＬ５７０の単独の制限部位旦旦ｏＲＩ及び旦且１１との関係において、１旦ｍ ＨＩ及びＨｉｎｄｌｌｌ認識部位をマツピングした（図１）、プラスミドｐＩＬ Ｌ７５３の制限地図を前述の組換え型プラスミドの制限地図と比較することによ り、ｐＩＬＬ７５３の挿入フラグメントが、プラスミドｐＩＬＬ５９０において 前に同定されたウレアーゼの４つの遺伝子（すなわち、ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕ 　ｒ　ｅ　Ｃ及びｕｒｅＤ）の下流にある４、６ｋｂの付加的ＤＮＡフラグメン トを有していることが明らかになった。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１におしるウレアーゼ２　の　Ｅ、　ｃｏｌｉ内で Ｌ」■ヒムのウレアーゼの遺伝子の最適な発現を確保する培養条件を定義するた め、さまざまな窒素源を添加した最少培地での培養後に、ｐ　Ｉ　ＬＬ７５３を 収容するクローンの活性を定量的に評価した。いずれの場合においても、液体培 地で行なった培養においてウレアーゼ活性がきわめて低いことが諸々の研究によ って示されたことから、固体の最少基本培地を用いた。

Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸塩、ＮＨ，Ｃ℃及び尿素で 補完した培地（各々最終濃度１０ｎ＋Ｍ）での培養の相対的活性は、それぞれ１ ００％、３６％、２７％、４６％及び２０％であった。

ウレアーゼ活性は、Ｌ−アルギニンを添加した培地上で行なった培養において、 最適であった。ウレアーゼ活性は、窒素の豊富な培地上で実施し、培養には検出 されなかった。

遊離Ｎ、パイオンの存在は、ウレアーゼ活性を刺激する効果を有する可能性があ るが［Ｍｕｌｒｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９ｇ９）　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３５：　１７６９−１７７６　、及びＭｃ＋ｂｌｅｙ 　ｅｔ　ａｌ、（１９８９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　５３：　８５− １０８　］　、これは、ｐ１．ＬＬ７５３を収容する細胞のウレアーゼ活性につ いては現われなかった。

さまざまな条件下で培養された、ｐＩＬＬ７５３を担持するＥ、　ｃｏｌｔのク ローンにおけるウレアーゼの発現経過（コース）の分析は、最大のウレアーゼ活 性が、Ｌ−アルギニンを添加した最少培地上で３７℃で３日間好気的に培養した 後に得られるということを示した（図２）。窒素の豊富な培地上で実施した培養 のウレアーゼ活性は、微好気生活での培養後に最高であった。逆に、微好気的条 件は、窒素が制限された培養の活性については抑制的効果を有していた。

アルギニンを添加した最少培地で３７℃で３日間の好気的条件下での培養におけ る、ｐＩＬＬ７５３を収容するＥ、　ｃｏｌｔ細胞のウレアーゼ活性は、タンパ ク質１ｍｇにつき１分あたり０，９±０，４Ｐｍｏｌの尿素加水分解であった。

これと比較して、ウレアーゼの遺伝子をクローニングするために利用したし」立 国１の単離物は、タンパク質１ｍｇにつき１分あたり２３．２±２、３　Ｐｒｎ ｏｌの比率で（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質）尿素を加水分解していた。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　にお（るウレアーゼに、１　な゛　の百及Ｍ圃立孔 陽性ウレアーゼ表現型に必要なりＮＡ領域を決定するため、まず最初に、転位因 子Ｍｉｎｔ　Ｔｎ３−Ｋｍを担持するｐＩＬＬ７５３の誘導体を、前述の作業様 式に従って単離した（「材料と方法」の項参照）。トランスポゾンを担持するＥ 、　ｃｏｌｔ　ＨＢ　１０１の形質転換体を全て、ウレアーゼ活性に関してスク リーニングした。これらは、Ｘが図１の地図上に現われるようなＭｉｎｉ　Ｔｎ ３−Ｋｍの挿入部位を指すものとして、ｐＩＬＬ７５３：　：ｘと呼称された。

分析のために選択された２４の挿入のうち、１０個の誘導体は尿素を加水分解す る能力を完全に失っており（２，３，４，５，６，１０，１１゜１２．１３及び １４）、一方、１４個はウレアーゼ陽性表現型を保持していた。これらの結果は 、遺伝子ｕｒｅＡ又はｕｒｅＢに相当する地図を有するあらゆる挿入突然変異（ 突然変異体２．３．４゜５及び６）がウレアーゼ活性を消し去るということを確 認しているが、同様に遺伝子ｕｒｅＢからさらに下流にある２、６ｋｂのＤＮＡ フラグメントが、窒素を制限する条件下で培養されたＥ、　ｃｏｌｉにおけるウ レアーゼ陽性表現型の発現に必要である、ということをも明らかにしている。逆 に、トランスポゾンの突然変異誘発に関する結果からは、遺伝子ｕｒｅＢのすぐ 下流にある６００ｂｐのフラグメントがＥ、　ｃｏｌｉでのウレアーゼ活性にと って必須であるということは明らかにされなかった。

ｐＩＬＬ７５３挿入フラグメ挿入フラグメン室内を含む付加的な分析を、Ｅ、　 ｃｏｌｔの培養での活性ウレアーゼの発現に必要な条件をより良（理解する目的 で行なった。プラスミド誘導体を担持するＥ、　ｃｏｌｉのサブクローンを、上 述の窒素制限条件下でのウレアーゼ活性の定量的測定の対象とした。結果を表２ にまとめる。全てのサブクローンは、同じベクターｐＩＬＬ５７０の誘導体であ ったため、結果を比較することができる。そのうちの１つ、プラスミドｐＩＬＬ ７６８は、プラスミドｐＩＬＬ７５３　：　：１６の制限酵素による消化産物か ら作られた大きいＥｃ且旦Ｉフラグメントの自己再連結によって得られた（図１ ）。この構築物は、ｐＩＬＬ７５３挿入セグメントの３′末端での２．９５ｋｂ の欠失を導いた。このプラスミドを担持する細胞は、比較的低いウレアーゼ活性 を発現する（表２）。プラスミドｐＩＬＬ７６３は、線形化されたベクターｐＩ ＬＬ５７０内へのプラスミドｐＩＬＬ７５３　：　：　ｌの立上ａＩ−Ｐ旦１１ 制限フラグメントのクローニングにより得られた。前述の遺伝子ｕｒｅＣ及びＰ ｒ旦りを含む１．７５ｋｂのＤＮＡフラグメントが削除されたこの構築物は、ｐ ＩＬＬ７５３を収容する細胞のウレアーゼ活性に比べて約２倍高いウレアーゼ活 性を発現していた。いずれの場合でも、欠失や挿入によって構成的ウレアーゼ活 性が導かれることはなかった。

１：、　ｃｏｌｔでのウレアーゼの　に八　な′　の　１のＥ、　ｃｏｌｔでの ウレアーゼの発現に必要な１１．２ｋｂのフラグメントにおいて、遺伝子ｕｒｅ Ｂのすぐ下流に局在している３、２ｋｂのＤＮＡフラグメントを、図３の戦略に 従って同定した。

ｉ）１．２ｋｂのＨｉｎｄｕフラグメント及び１．３ｋｂの旦且二ＨＩ−Ｈｉｎ ｄｌｌｌフラグメントを、ファージＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９のＤＮＡ 内のプラスミドｐＩＬＬ７５３：：１２、ｐＩＬＬ７５３　：　：　１１％　ｐ ＩＬＬ７５３　：　：１０の、ａ）上述の制限フラグメントのクローニング、ｂ ）凡り旦Ｉ−Ｂ旦皿ＨＩフラグメント、旦２且Ｉ　−Ｈｉ　ｎｄＩＩＩフラグメ ント、ｃ）ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの後に、独立して配列決定 した； ｉｉ　）ファージＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９のＤＮＡ内に、プラスミド ｐＩＬＬ７５３及びｐＩＬＬ５８９　（前述）から来た制限フラグメント、つま り１．２ｋｂのＨｉｎｄｌＩ［，３，８ｋｂのｌにＨＩ−見立１１及び１．３ｋ ｂのｌにＨＩ一旦ヱ旦■をクローニングした； −）読取りを確認し、独立して配列決定された３つのフラグメントにまたがる配 列を生成するため、１２個のオリゴヌクレオチドブライマーを合成した。これら のプライマーを、２本鎖ＤＮＡの配列決定分析のために利用した。

配列の分析は、ｕｒｅ　Ｉ、ｕ　ｒ　ｅ　Ｅ％ｕ　ｒ　ｅ　Ｆ、　ｕ　ｒ　ｅ　 Ｇ及びＬｌ　ｒ　ｅ　Ｈと呼ばれる５つのオープンリーディングフレーム（ＯＲ Ｆｓ）を明らかにした。これらの遺伝子は全て同一方向に転写され、これらは１ ９５．１７０．２５６．１９９及び２６５個のアミノ酸のペプチドをコードする 。図４に示されている配列の逆の相補体上には、著しい長さのＯＲＦは全（観察 されなかった。５つのＯＲＦは、特徴的開始コドンＡＴＧで始まる。５つのＯＲ Ｆのうち４つには、その前に［：、　ｃｏｌｉのリポソームに対する結合用コン センサス（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列に類似する部位があった［５ｈ ｉｎｅ　ｅｔａｌ、（１９７４）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　７１：　１３４２−１３４６）。

各ＯＲＦの上流領域は、Ｙ＝Ｔ又はＣ，Ｒ＝Ｇ又はＡ１及びＺ＝Ａ又はＴとして 、配列ＴＧＧＹＡＹＲＮ４ＹＹＧＣＺを伴う窒素に関する調節部位の存在につい ての研究の対象となった［Ｍｏｒｅｔｔｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２１０：　６５−７７１　、遺伝子座ｕｒｅＧの上流２１ ０ｂｐのところに、唯一の部位が発見された。その精確な位置は、図４に表わさ れている。Ｅ、　ｃｏｌｉのプロモータータイプ（Ｇ７０）のコンセンサス配列 が、遺伝子ｕｒｅＩ、ｕｒｅＦ及びｕｒｅＨの上流に観察された（ＴＴＧＡＣＡ 、−３５、及びＴＡＴＡＡＴ、−１０）。

艮ｌ クローニングされたし」弘匝己のＤＮＡの突然変異誘発及び窒素制限条件下で培 養されたＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１のクローンのウレアーゼ活性に対する効 果 （１）Ｏ，ＯＩＭのし一アルギニンを補完したＭ９最少培地上で、３７℃で３日 間好気性培地で培養された細菌。

（２）比較のため、ＤＮＡをクローニングした元の単離物であるＬ」Ｌ国己８５ Ｐのウレアーゼ活性は、２３±２．３　ｐｍｏＩ尿素／分／ｍｇタンパク質であ った。

（３）いかなるウレアーゼ活性も検出されなかった。

（４）特定の測定についての結果：０．７３゜（５）特定の測定についての結果 ：０．１０゜１察 Ｅ、　ｃｏｌｉの菌株におけるし」弘匡１由来の遺伝子の機能的発現の第１のケ ースをここで紹介する。

これは、制限された窒素源を含む最少培地上で、ｐＩＬＬ５８５ウレアーゼ組換 え型コスミドを収容するＥ、　ｃｏｌｉ細胞を培養することにより可能であった （前述のＬａｂｉｇｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　−１９９１）。得られた結果により、 ４のウレアーゼの遺伝子が窒素調節システム（ＮＴＲ）の制御下にありうるとい うこと、モしてＥ、　ｃｏｌｔ細胞内のウレアーゼ活性が前述の遺伝子集合体の 存在に依存することを示すことができた。この遺伝子集合体は、前述のＬａｂｉ ｇｎｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９９１の刊行物中に記載されている４つの遺伝子ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅ Ｃ及びｕｒｅＤのすぐ下流に局在していた。これらの新しい遺伝子は、ｕｒｅａ 、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ及びｕ　ｒ　ｅ　Ｈと呼ばれる５つのオーブン リーディングフレームを含む３．２ｋｂのフラグメント上にある。

始原コスミドからサブクローニングされた１１．２ｋｂのＤＮＡフラグメント（ ｐＩＬＬ７５３）のレベルでの、挿入及び欠失による突然変異の利用により、Ｅ 、　ｃａｎ内でのウレアーゼ活性の発現にとって遺伝子ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕ ｒｅＦ、ｕｒｅＧ及びｕｒｅＨが必要であることを示すことができた。反対に、 遺伝子ｕｒｅ　Ｉ内部での挿入による突然変異は、Ｅ、　ｃｏｌｔの細胞内での ウレアーゼ活性に著しい影響を及ぼさなかった。遺伝子ｕｒｅＣ及び遺伝子ｕｒ ｅＤの欠失（プラスミドｐＩＬＬ７６３内のような）は、無傷の状態の遺伝子座 を有するプラスミドを担持する細胞で得られるものよりもはるかに強い活性とい う結果をもたらし、このことは、Ｌ」全頁のウレアーゼの遺伝子群（クラスター ）のこの領域の調節因子としての役割を示唆している。

ｐＩＬＬ７５３がウレアーゼの完全な発現に必要な要素全体をおそらく担持して いないということは、明らかであると思われる。

その主な証拠としては、一方では、ｐＩ　Ｌ　Ｌ　７５３を収容するＥ、　ｃｏ ｌｉの細胞が、クローニングのために当初使用されたし」■組己単離株のウレア ーゼ活性に比べて約２５倍弱いウレアーゼ活性を有していたということ、又他方 では、ｕｒｅＨの下流の領域の欠失（ｐＩ　ＬＬ７６Ｂ）がウレアーゼ活性の著 しい低下を導いたということ、が挙げられる。虹」全血が、Ｅ、　ｃｏｌｉの中 で得られる結果に比べて酵素発現のためにさらに少ない遺伝子数を必要とすると いうのは興味深いことである。従って、ｍはＬ」■迫１のクローニングされた遺 伝子の機能を補完できなくてはならない。

補助遺伝子の必要性は、同様に、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ　５ｔｕａｒｔｉｉ［ Ｍｕｌｒｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ 、　１７０：　２２０２−２２０７］、ウレアーゼ陽性Ｅ、　ｃｏｌｉ　（Ｃｏ ｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　−１９１Ｓ８）　、　Ｋｌｅｓｉｅｌｌａ匹駐＝」 ［Ｇｅｒｌａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　Ｌｅｔｔ。

５０：　１３１−１３５　）、Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌ　ａｒｉｓ　［Ｍｏｒｓ ｄｏｒｆ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔ ｔ、　６６：　６７−７４　］　、　Ｓｔａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓｓａｒｏ　 ｈ　ｔｉｃｕｓ　［Ｇａｔｅｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｉｎｆ ｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５７：２９９ｇ−３００２］　、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ ａ　ａｅｒｏ　ｅｎｅｓ　（Ｍｕｌｒｏｏｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ。

−１９９０１及びＰｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ　［Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８９）　Ｊ、　Ｂａｃｔ。

１７１＋　６４１４−６４２２及びＷａｌｚ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　Ｊ、 　Ｂａｃｔｅｒｔａｌ、　１７０：１０２７−１０３３　］についても立証され た。

図５は、複数の細菌種についての、ウレアーゼをコードする３つの領域の比較を 示し、各々の類似性と特殊性を表わしている。遺伝子編成及びコードされるポリ ペプチドで表わされる近縁性の度合いは、Ｐ、　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓとＬ」肛匹 弘朋の間では、Ｌ」Σ１１に対するこれらの各々の近縁性の度合いに比べ、さら に強いものである。

Ｌ」■迫１のポリペプチドＵｒｅＧは、Ｌ」肛」凹皿のポリペプチドＵｒｅＧと 強い類似性を呈した（９２％保存、５９％同一）が、一方Ｌ」［相］旦とＬ」肛 皿肛朋のポリペプチドＵｒｅＥ及びＵｒｅＦの間の（保存及び同一の）度合いは 、それぞれ（３３％及び１４％）、（４４％及び１１，６％）であった。Ｍｕｌ ｒｏｏｎｅｙらは、補助タンパク質ＵｒｅＥ、ＵｒｓＩ及びＵｒｅＧをコードす る７の遺伝子が、ウレアーゼのサブユニットへのニッケルの取り込みによるアポ 酵素の活性化に関与していることを確認した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及びＰｒｏ ｔｅｕｓのポリペプチドＵｒｅＥのカルボキシ末端に一連のヒスチジン残基が存 在することから％Ｍｕｌｒｏｏｎｅｙらは、ＵｒｅＥが、ニッケルと相互作用し て次にこれをアポ酵素に移入させることができるということを提案した。このよ うな一連の残基は、ＵのポリペプチドＵｒｅＥにも、又ウレアーゼ遺伝子のその 他のいずれの産物にも発見されなかった。

ｍのウレアーゼの遺伝子から推定されたアミノ酸配列と、ＤＮＡの結合部位（Ｐ ａｂｏ　ｅｔ　ａｌ、　−１９８１）又はＡＴＰの結合部位Ｕｉｇｇｉｎｓ　ｅ ｔ　ａｌ、　−１９８５）に関与するコンセンサス配列との間の類似性の研究は 、遺伝子ｕｒｅＩの産物の内部のＤＮＡの結合部位の同定を可能にした（図４） 。その上、充分に保存されたＡＴＰの結合部位（−ＧＶＣＧＳＧＫＴ−）が、遺 伝子ｕｒｅＧの産物のＮＨ，末端に存在している。

ｍのウレアーゼの領域は、以下のようないくつかの独特の要素を呈している：す なわち、まず第１に、遺伝子ｕｒｅＣ１ｕｒｅＤ、ｕｒｅＩはし」弘１１に独特 のものである。次に、ウレアーゼの領域は、同じ方向に転写され、ｕｒｅＤとｕ ｒｅＡの間に４２０ｂｐ、及びｕｒｅＢとｕｒｅＩの間に２００ｂ、の遺伝子開 領域を呈する、３つの遺伝子ブロックから成る。このことは、３つの遺伝子ブロ ックが独立して調節されつる、し」１国１独自の遺伝子編成を示唆している。

一般に、Ｌ」ユ匡已によるウレアーゼ合成は、構成的に行なわれると仮定されて いる。ここで紹介する結果は、Ｌ」Ｌ国已のウレアーゼの遺伝子発現が、実際、 調節システムの制御下にありうるということを示す傾向をもつ。実際、ひとたび Ｅ、　ｃｏｌｉ内に移入されたし」Σ棟屯のウレアーゼ遺伝子の発現は、完全に 窒素の調節システム（ＮＴＲ）の制御下にある。Ｌ上セ亘のウレアーゼの遺伝子 が、Ｅ、　ｃｏＨの遺伝子ｎｔｒＡ、ｎｔｒＢ、ｎｔｒＣの産物の合成に直接依 存する可能性はあるものの、それらがＥ、　ｃａｎのｎｔｒ産物に類似の単数又 は複数のタンパク質をコードするその他の単数又は複数の遺伝子の発現に依存す るという可能性を考慮しないわけにはいかない。これらのデータに基づいて、固 体培地又は微好気的雰囲気の存在のような生理学的パラメーターが、インビトロ 又はインビボでのし」■匡１におけるウレアーゼの発現においである役割を果た し得ると考えることができる。

■、突然変異株の調製 一電気穿孔実験のために利用する菌種：ウレアーゼの遺伝子の当初のクローニン グを実施するのに用いた前述のＬａｂｉｇｎｅｅｔ　ａｌ、　−１９９１の刊行 物中に記載されている菌株８５Ｐを含む、生検から分離された複数の菌株を、そ の電気穿孔適性について試験した。１９９１年１０月３日にｌ−１１５０という 番号でＣＮＣＭに寄託されたＮｏと呼称される唯一の菌株が陽性の結果を示した 。

−Ｌ」■国已８５Ｐ株の染色体のクローニングされたフラグメントにおける突然 変異体の作成：要素（転位因子）の無作為挿入を可能にするトランスポゾン（Ｍ ｉｎｉ　Ｔｎ３−Ｋｍ）を用いて、突然変異誘発により突然変異体を調製する。

各転位因子の挿入部位は、誘導されたプラスミドの制限分析により定めた（図１ 参照）。

−電気穿孔：グリセロール／ショ糖（１５％ｖ／ｖ　及び９％ｖ／ｖ）溶液中で 洗浄した血液ゲロース（１０％のウマの血液）上のし」９国１の細胞ＩＱＩＯ個 を採取し、４℃で５０ｍの体積に再懸濁させた。ＣｓＣ１上で精製し、蒸留水に 対して即時に透析したプラスミドＤＮＡ５００ｎｇを、４℃で１μの体積で細胞 に添加した。氷上で１分経過した後、ＤＮＡ細胞を、予め一２０’Ｃに冷却して おいた電気穿孔キュベツト（ＢｉｏＲａｄ　ｒｅｆ：　１６５−２０８６、幅０ ．２ｃｍ）の中に移し、次に、２５Ｆ、２．５ｋｖ及び２００オームというパラ メーターに設定された装置「遺伝子パルサー装置−Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｊの中に置 いた。４，５〜５　ｍ５ｅｃの時間定数で電気パルスを送り出した後、１００＃ ＩｆｌのＳＯＣ緩衝液（２％のバクトドリブトン、０．５％のバクト酵母エキス 、１０ｍＭのＮａ（１１２゜２．５ｍＭのＫＣｆｉ、１０ｍＭのＭ　ｇ　ＣＱ　 ＊、１０ｍＭのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４゜２０ｍＭのグルコース）の中に細菌を再懸濁 させ、微好気的雰囲気の下、３７℃で４８時間、非選択的血液ゲロース（カナマ イシンは含まないが、バンコマイシン、トリメトプリム、ポリミキシン、ナリジ キシン酸、アンフォテリシンＢを含む）上にこれを接種した。次に細菌を採取し 、■容積のＢｒｕｃｅｌｌａ培地（０，５−）中に再懸濁させ、選択的血液ゲロ ースボックス（２０ｕｇ／ｙｄのカナマイシン及び上述の抗生物質カクテルを含 む）上に１００μの懸濁液を広げた。形質転換され、カナマイシン耐性をもつ細 菌の成長は、微好気的雰囲気中、３７℃で４日間のインキュベーション後に現わ れる。

ＰＣＲ、サザン法及びウェスタン法を含むその他の技術は、従来通りの技術であ る。

稙釆 プラスミドｐＩＬＬ７５３上に存在する遺伝子ｕｒｅＢ内へのＭｉｎｔ丁ｎ３− Ｋｍの挿入により生成された２つの突然変異を、詳しく研究した。すなわち、３ 及び４という番号を付した突然変異である。

各々の挿入の精確な位置を、図６に示す。これらの挿入に相当するプラスミドを 調製し、精製し、濃縮した。電気穿孔に用いたし」Σ１ｏｒｉＮＢ株の全ての特 性を示すカナマイシン耐性の細菌が得られた。これらの細菌は、尿素を加水分解 する能力を全くもたな対照により、突然変異株が同質遺伝子型菌株であることを 確認することができた： ☆　菌株は、「ウレアーゼ陰性」であるものの、し」１国１種に属する細菌に特 徴的な生化学的特性を有する（オキシダーゼ、カタラーゼ、酸素に対する感受性 ）。

☆　母細菌（Ｎｏ）（ＣＮＣＭ　Ｎｏ、ｌ−１１５０）ならびに同質遺伝子型細 菌Ｎ　６　：　：　ＴｎＫｍ−３及びＮ　６　：　：　ＴｎＫｍ−４は、全ＤＮ Ａの酵素消化の後、同じ制限プロフィールを有する（図８参照）。

☆　Ｌ」■匡は特異プライマーを用いた酵素的増幅及び増幅産物の配列決定の後 、Ｌ」ヱ国１の独立菌株が同じ配列を示すことは決してなく、逆に重大な遺伝子 冬型現象を示すのに対し、同じヌクレオチド配列が見い出された。

☆　突然変異を受けた親菌株のＤＮＡの見見ｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる制 限プロフィールのサザンタイブのハイブリダイゼーションによる分析は、遺伝子 の置換を証明している（図７及びその解釈図６）。

遭遇する問題点の１つは、形質転換された菌株（Ｎｏ）が、ウレアーゼ遺伝子の クローニングが実施された元となった菌株ではなく、この菌株は８５Ｆ株である こと、そして制限部位Ｈｉ　ｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩがある菌株から別の菌株 まで保存されないことにある：ｐＩＬＬ５９０から来る８、１ｋｂのフラグメン トに相当するプローブ（図１）は、明らかに、Ｎｏと８５Ｐの間で異なるＨｉｎ ｄＩＩＩ制限プロフィール、特に１．２５ｋｂと１．１５ｋｂのフラグメントの 欠如を示している（図９）、これに対して、４．１ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ及び５ ．１と１．３ｋｂのＢａｍＨＩのフラグメントは保存されている。従って、遺伝 子ｕｒｅＡ、ｕｒｅＢ、ｕｒｅＣ及びｕｒｅＤに相当する領域全体にわたり分布 したオリゴヌクレオチドを用いた酵素的増幅（ＰＣＲ）により、図１０に示され ている増幅産物１〜６が２つの菌株で同じであること、そしてＨｉｎｄＩＩＩ制 限部位の欠如はウレアーゼ領域の主要な再配置ではなく遺伝子冬型現象を反映し ていたことが確認された。このような確認がなされたことから、作り出された２ つの突然変異体内の突然変異を受けた対立遺伝子による野生型対立遺伝子の遺伝 子置換を明確に確認することが可能である。

☆　最後に、抗ウレアーゼ抗体又はウサギの体内で調製された抗し」立国１抗体 又はＬ」工匡１による感染を受けた患者の血清内に存在する抗し」１匡は抗体を 用いたイムノブロッティングによって、突然変異を受けた菌株Ｎ　６　：　：　 ＴｎＫｍ−３及びＮ６二二ＴｎＫｍ−４が、遺伝子ｕｒｅＢによりコードされる ６１ｋＤ（キロダルトン）のポリペプチドをもはや発現せず、従ってこれらの菌 株の遺伝子ｕｒｅＢがまさに中断されていたことが確認された（図１１）。

（μｍｏｌ尿素／分／ｍｇクンバク質）υΦ　Ｃ５町　←＝　＜Φ　←Φ　←ｅ ｈｏコシ＝　乏シ　乏：　シ＝　にｔ　８ぞ　邑；ヨ３　Ｉ　■　ヨ３　言伍　 Ｉ　Ｉ （の　！−ＩＩＩ＋　ロ　−ロ　−←　Φ　（：　←　ｎ乏シ　ｒ、ｊ−２ｒ、 ４−；　１ｇ２．　に１　巴；　已ゴロ＋７１　ＣＪＱ、　（Ｊｍ　ベー　〈＝ 　←−υロロＩ＋Ｉ　に情　！−−１　１−１ｍ　（−←−ロー（Ｉｌｌ　ロｅ ａ＜−ロー〉　ロａｔ　Ｃ：ｌ＞　ＣＪＱ。

Ｉ　ヨニ　ジ３３曇　■　践ミ　ジ層 ！−ＩΦ　ωい　Φ幻　Φ−０糎　口切　ロー←＝Ｃ：ＪＩ＋１＜≧　←司　ロ ー　（＞　←−ａｃｔ　ＣＪ−ベー　ロ〉　ロζ　ベー　ロ〉謳き　乏＝　ミ訃 　に：　８ピ　８巳　ギ訃ＣＤ＋６　０５１　Φ−く−ω−υα　ローωΦ　（ 豹　トー　−１−１＜・　トΦ　べ一←ｇ　（＞　ωΦ　υΦ　ト−１？；　Ｃ Ｊω←α　く−←―　←旬　（−１ｉ＋Ｉα　トＱ（旬　←７　←＠　ロコ　く コ　←−くコ＜＞Ｃ５ひ　＃＝ｉ：二　に！　＝ご　乙：く−ロ ロー　く、←酌　ω−くテ　ロー　ロメ冨寞　乏−巴；　日ご　乏−＝肖　８； Ｃ＋＋の　０ロ　←−ω−Ｃ＝　ω：　＜Ｑ−○−（Ｊ−［−１６（−＜旬　← ローＱ−ロ句口〉Ｕい（田ト ＜ＣＣＪ　−ロ　リ　ω　−ＣＪＩ：　＜Ｈ←＜−＜の　く＞　口ａｌ（旬　く −← Ｑ■　ロ司　クークの　く悶　Ｑ■　くＱ−ω−口＝　トー　←ロ　ロー　←− ｕ＝　ｕｘ　ａΦ　←−υ−〇Φ　υΦべ一　く−←−ロー＞ｃＪＱｌ＜リ　ト 町＜の　＜ｅ　（リ　ＣＪ旬　ＣＪＩ−１＜市　ロー（＞＜−に−Ｃ：＋＞　ロ ａ＋Ｕ−←Φ＜−ｓ　ｐｅｎ　■ロ　←υ　く句　ロー　くεｈａ＋＜ｃ　←ω 　ロ；　く＝　０句　←−トー＜−←−（ロ　く−ロー　＜≧ ＜　−ＣＪ　１７１（−（ｍ　Ｃ；ラ　ロ巾　トーくコ　○ａ　ロー　トコ　Ｑ −ω−ロー←＠　くη　ロω　トΦ　く目　ω＝　←Φトー　ロ帽　（Ｉｌｌ　 （Ｊｍ　＜悶　ベー　ベε？：　乏：　８二　＃二　乙冨　乏：　定菰トー　ロ ｃｒＩ　Ｑ−ω＝　←−〇〇　に−Ｌ９　。

プローブ：ＡＢ 丁（０，ら ＦＸＧＵ肛８ ｎＧＯＵ、１１ ＦＩＧＵＲＥ　１２ ３１０　１　．２．ｂ　ｈｓｘｌ’　３１ｈｐ−５，３ｋｂ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：０１） （７２）発明者　キュサック、バレリーフランス国、７５０２０　パＩＪ、リュ ー・ダブロン、５９ Ｉ （７２）発明者　フェレーロ、リシャールフランス国、７５０１５　パリ、リュ ー・ドウ・ポージタール、１５４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）図４に示されているヌクレオチド鎖に対応し、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅ Ｇ、ｕｒｅＨ、ｕｒｅＩと呼ばれる遺伝子に相当する核配列の少なくとも１つ又 はこれらの核配列の少なくとも１つのあらゆる部分によって構成されているか、 又はそれを含むことを特徴とするヌクレオチド配列。 ２）変更された配列によりコードされるポリペプチドの機能的特性がＨ．ｐｙｌ ｏｒｉにより発現されるようなポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、Ｕ ｒｅＨ又はＵｒｅ工の特性との関係において保持、減衰、又は削除されるような 形で、又は変更された配列がＨ．ｐｙｌｏｒｉにおいてポリペプチドを発現しな いような形で、単数又は複数のヌクレオチドの欠失、付加、置換又は逆位によっ て変更されていることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のヌクレオチド配 列。 ３）ａ）図４に示されているヌクレオチド鎖に対応し、ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕ ｒｅＧ、ｕｒｅＨ、ｕｒｅＩと呼ばれる遺伝子に相当する核配列の集合体、又は ｂ）互いに独立して変更されたこれらの遺伝子に相当する核配列（変異体）によ り形成された集合体であり、変異体の集合体が、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによって発現 されるようなポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、ＵｒｅＨ又はＵｒｅ Ｉとの機能的相同性をもつポリペプチドをコードするか、又は逆に、Ｈ．ｐｙｌ ｏｒｉにより発現されるようなポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、Ｕ ｒｅＨ又はＵｒｅＩの機能的特性を減衰ひいては削除するような、又はポリペプ チドとしてもはや発現されない、変更されたポリペプチドをコードする形のもの によって構成されているか又はそれを含むことを特徴とする、請求の範囲第１項 又は第２項に記載のヌクレオチド配列。 ４）請求の範囲第１項又は第２項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列のフ ラグメントであり、このフラグメントが少なくとも１５個のヌクレオチドを含み 、特に −Ｈ．ｐｙｌｏｒｉにおいてｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ又はｕｒｅＩの中か ら選択された遺伝子の発現により得られるようなポリペプチドと機能的相同性を 有するポリペプチドをコードする能力を保持するフラグメント； −Ｈ．ｐｙｌｏｒｉにおいて得られるようなポリペプチドｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、 ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒｅＩのあらゆる部分をコードする、特にＨ．ｐｙｌ ｏｒｉに対して向けられた抗体により認識されるか又はハプテンもしくは免疫原 として挙動することができるペプチド又はポリペプチドの一部分をコードするフ ラグメント； 一遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒｅＩから発現される ようなＨ．ｐｙｌｏｒｉのポリペプチドをコードする能力が備わっていないフラ グメント； −Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒ ｅＩによりコードされるポリペプチドの特性との関係において、減衰、さらには 削除された特性をもつポリペプチド又はペプチドをコードするフラグメント の中から選ぶことができることを特徴とするヌクレオチド鎖。 ５）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉにおいてウレアーゼサブユニットをコードする構造遺伝子 ｕｒｅＡ及びｕｒｅＢに相当する核配列と関連づけられていることを特徴とする 、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 ６）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉにおいてウレアーゼをコードする遺伝子ｕｒｅＡ、ｕｒｅ Ｂ、ｕｒｅＣ及び／又はｕｒｅＤと関連づけられていることを特徴とする、請求 の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 ７）図４の配列のヌクレオチド８００〜１３０９に相当する鎖ｕｒｅＥ、又はス トリンジェント条件下で鎖ｕｒｅＥもしくはこの鎖に相補的な配列とハイブリダ イズした場合のこの鎖のあらゆるフラグメントに対応することを特徴とする、請 求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 ８）図４の配列のヌクレオチド１３２４〜２０９１に相当する鎖ｕｒｅＦ、又は ストリンジェント条件下で鎖ｕｒｅＦもしくはこの鎖に相補的な配列とハイブリ ダイズした場合のこの鎖のあらゆるフラグメントに対応することを特徴とする、 請求の範囲第１項〜第６項のし、ずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 ９）図４の配列のヌクレオチド２１２３〜２７１９に相当する鎖ｕｒｅＧ、又は ストリンジェント条件下で鎖ｕｒｅＧもしくはこの鎖に相補的な配列とハイブリ ダイズした場合のこの鎮のあらゆるフラグメントに対応することを特徴とする、 請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 １０）図４の配列のヌクレオチド２７２２〜３５１６に相当する鎖ｕｒｅＨ、又 はストリンジェント条件下で鎖ｕｒｅＨもしくはこの鎖に相補的な配列とハイブ リダイズした場合のこの鎖のあらゆるフラグメントに対応することを特徴とする 、請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 １１）図４の配列のヌクレオチド２１１〜７９５に相当する鎖ｕｒｅＩ、又はス トリンジェント条件下で鎖ｕｒｅＩもしくはこの鎖に相補的な配列とハイブリダ イズした場合のこの鎖のあらゆるフラグメントに対応することを特徴とする、請 求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。 １２）以下のヌクレオチド鎖： 【配列があります】 に対応するか又はこの鎖を含むことを特徴とする、請求の範囲第７項に記載のヌ クレオチド配列。 １３）請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列に より構成され、この配列が標識されていることを特徴とする、ヌクレオチドプロ ーブ。 １４）遺伝子増幅反応における利用のため、約１８〜約３０、好ましくは約２５ 〜約３０のヌクレオチドを含む、請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか１項に 記載の配列に由来するようなヌクレオチドフラグメントを含むことを特徴とする 、ヌクレオチドプライマー。 １５）請求の範囲第１項〜第１４項のいずれか１項に記載の配列と、ストリンジ ェント条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列。 １６）生物学的試料に基づき、遺伝子増幅反応の終了時点でＨ．ｐｙｌｏｒｉに よる感染をインビトロで検出するための、請求の範囲第１４項に記載のプライマ ーの用途。 １７）場合によっては遺伝子増幅反応の終了時点で、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによる感 染について生物学的試料のインビトロ検出を行なうための、請求の範囲第１３項 に記載のプローブの用途。 １８）図４に示されているポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、Ｕｒｅ ＨもしくはＵｒｅＩの１つ又はこれらのポリペプチドのうちの少なくとも１つの あらゆる部分、例えば鎖：ＡｌａＬｙｓＩｌｅＣｙｓＴｙｒＧｌｕＩｌｅＧｌｙ ＡｓｎＡｒｇＨｉｓに対応するポリペプチドに相当することを特徴とするポリペ プチド。 １９）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉにおいてポリペプチドＵｒｅＥ、ＵｒｅＦ、ＵｒｅＧ、 ＵｒｅＨ、ＵｒｅＩにより発現されるようなウレアーゼの調節及び／又は成熟に おいてその特性を減衰さらには削除するため、単数又は複数のアミノ酸の付加、 置換、欠失又は逆位により変更された形の、請求の範囲第１８項に記載のポリペ プチド。 ２０）請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか１項に記載の配列を含むことを特 徴とする組換え型ベクター。 ２１）コスミド又はプラスミドであることを特徴とする、請求の範囲第２０項に 記載の組換え型ベクター。 ２２）１９９１年１０月３日にＩ−１１４８という番号でＣＮＣＭに寄託された Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の中に含まれているプラスミドｐＩＬＬ７５３であるこ とを特徴とする、請求の範囲第２０項又は第２１項のいずれか１項に記載の組換 え型ベクター。 ２３）１９９１年１０月３日にＩ−１１４９という番号でＣＮＣＭに寄託された Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１の中に含まれているブラスミドｐＩＬＬ７６３であるこ とを特徴とする、請求の範囲第２０項又は第２１項のいずれか１項に記載の組換 え型ベクター。 ２４）組換え型菌株がウレアーゼ陰性の表現型を発現するような条件下で遺伝子 ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ、ｕｒｅＩ又はｕｒｅＡもしくはｕｒ ｅＢの中から選ばれる少なくとも１つの遺伝子のレベルでの突然変異を示すか、 又はウレアーゼの効果、特にその病理学的効果の減衰を示すことを特徴とする、 組換え型のＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株。 ２５）遺伝子ｕｒｅＧのレベルで突然変異を受けていることを特徴とする、請求 の範囲第２４項に記載の組換え型のＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株。 ２６）遺伝子ｕｒｅＡのレベルで突然変異を受けていることを特徴とする、請求 の範囲第２４項に記載の組換え型のＨ．ｐｙｌｏｒｉ菌株。 ２７）遺伝子ｕｒｅＢのレベルで突然変異を受けていることを特徴とする、請求 の範囲第２４項に記載の組換え型Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ菌株。 ２８）突然変異を受けたＮ６菌株（ＮＣＩＭＢＮｏ．４０５１２）であることを 特徴とする、請求の範囲第２４項〜第２７項のいずれか１項に記載の組換え型Ｈ ．ｐｙｌｏｒｉ菌株。 ２９）宿主内でのその発現を可能にする条件下で、請求の範囲第１項〜第１２項 又は第１５項のいずれか１項に記載の配列によって形質転換されていることを特 徴とする、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの異なる組換え型宿主細胞。 ３０）請求の範囲第２項〜第１２項又は第１５項のいずれか１項に記載のヌクレ オチド配列を含むＨ．ｐｙｌｏｒｉの菌株であることを特徴とする、請求の範囲 第２９項に記載の組換え型宿主細胞。 ３１）遺伝子ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ又はｕｒｅＩのうちの少 なくとも１つのレベルでの、ＮＣＩＭＢ４０５１２という番号で１９９２年６月 ２６日にＮＣＩＭＢに寄託されたＨ．ｐｙｌｏｒｉのＮ６菌株の突然変異により 得られるような、請求の範囲第３０項に記載の組換え型宿主細胞。 ３２）請求の範囲第１項〜第１２項のいずれか）１項に記載のヌクレオチド配列 により変更されたＥ．ｃｏｌｉ菌株であることを特徴とする、請求の範囲第２９ 項〜第３１項のいずれか１項に記載の組換え型宿主細胞。 ３３）そのウレアーゼ活性が減衰されていることを特徴とする、請求の範囲第２ ９項〜第３１項のいずれか１項に記載の組換え型宿主細胞。 ３４）請求の範囲第２４項〜第３３項のいずれか１項に記載の組換え型宿主細胞 を含むことを特徴とする免疫原性組成物。 ３５）決められた生物学的試料についてのＨ．ｐｙｌｏｒｉによる感染のインビ トロ診断のためのキットにおいて、−ｕｒｅＥ、ｕｒｅＦ、ｕｒｅＧ、ｕｒｅＨ 又はｕｒｅＩの中から選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的なヌクレオチ ドフラグメントの５′及び３′末端にハイプリダイズすることができる、請求の 範囲第１３項に記載の少なくとも一対のヌクレオチドプライマー、 −処理された試料から核酸を抽出するのに必要な試薬、−増幅したいと考えてい るフラグメントの増幅を実施するのに充分な量の、ヌクレオチドプライマーから の前記ヌクレオチドフラグメントの重合を行なうための試薬、特に重合酵素、− プローブとして用いることができ、かつ増幅されたヌクレオチドフラグメントと 規定の条件下でハイブリダイズすることができる、少なくとも１つのヌクレオチ ド鎖、一場合によっては、ハイブリダイゼーションを明らかにするための手段 を含むことを特徴とするキット。 ３６）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによる感染のインビトロ診断のためのキットにおいて、 −一定量の請求の範囲第１３項に記載のプローブ、ー検出すべきＨ．ｐｙｌｏｒ ｉの核酸とプローブとの間のハイブリダイゼーション反応の実施に適した媒体、 −場合により形成されるハイブリッドの検出のための試薬、を含むことを特徴と するキット。 ３７）請求の範囲第１８項又は第１９項のいずれか１項に記載のポリペプチド又 は該ポリペプチドのフラグメントを認識することを特徴とする、ポリクローナル 又はモノクローナル抗体。 ３８）請求の範囲第１８項又は第１９項のいずれか１項に記載の抗体を含むこと を特徴とする、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉによる感染の治療のための組成物。