FR2779736A1 - Genes codant pour des beta-agarases et leur utilisation pour la production d'enzymes de biodegradation des agars - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne la nouvelle souche Cytophaga drobachiensis déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 8 mai 1998 sous le numéro DSM 12170, le gène agaA codant pour une -agarase et ayant la SEQ ID Ndegre 1, ledit gène codant pour une -agarase de Cytophaga drobachiensis DSM 12170, et la séquence d'acides nucléiques particulière du gène agaA codant pour un fragment peptidique particulier AgaA' qui a conservé l'activité -agarase, et ayant la SEQ ID Ndegre 3, ainsi que la protéine AgaA de C. drobachiensis DSM 12170 ayant la SEQ ID Ndegre 2 et ledit fragment peptidique AgaA' de C. drobachiensis DSM 12170 ayant la SEQ ID Ndegre 4. Application : biodégradation des agars.
Description
La présente invention concerne un nouveau gène codant pour une 13- agarase
et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars.
Elle concerne également la souche Cytophaga drobachiensis à partir de
laquelle ce gène a été isolé.
Les galactanes sulfatés des Rhodophycées, tels que les agars et les carraghénanes, représentent les polysaccharides majeurs des Rhodophycées et sont très largement utilisés en tant qu'agents gélifiants ou épaississants dans diverses branches d'activité, notamment l'agroalimentaire. Environ 6000 tonnes d'agars et 22 000 tonnes de carraghénanes sont extraits annuellement des algues rouges marines à cet effet. Les agars sont produits industriellement à partir des algues rouges des genres Gelidium et Gracilaria. Les carraghénanes sont quant à eux largement extraits
des genres Chondrus, Gigartina et Euchema.
Les agaro-colloïdes sont des complexes polysaccharidiques constitués principalement des agars et des agaroides. Chaque agaro-colloïde présente une teneur différente en chacun des composés ci-dessus de sorte que sa force de gel est différente. Le gel d'agar comprend une matrice de chaînes polymères à double hélice
maintenues par des liaisons hydrogène.
Il existe deux types d'enzyme capables de dégrader les agars: les cagarases et les 3-agarases. Les 03-agarases agissent sur la liaison 1-1, 4 et les at-agarases sur la
liaison ca-1,3.
Des microorganismes produisant des enzymes capables d'hydrolyser les agars ont déjà été isolés. Cette capacité à digérer l'agar a été attribuée aux genres Pseudomonas, (MORRICE et al., Eur. J. Biochem. 137, 149-154, (1983)), Streptomyces (HODGSON et CHATER, J. Gen. Microbiol. 124, 339-348, (1981)), Cytophaga (VAN DER MEULEN et HARDER, J. Microbiol. 41, 431-447, (1975)) et Vibrio (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 1549-1554, (1993)). Plusieurs gènes de,3-agarase ont déjà été isolés. Ainsi, BELAS et al. ont isolé le gène d'une
agarase chez Pseudomonas atlantica (Appl. Environ. Microbiol. 54, 30-37, (1988)).
BUTINER et al. ont isolé une agarase chez Streptomyces coelicolor et séquencé le gène correspondant (Mol. Gen. Genet. 209, 101-109, (1987)). SUGANO et al. ont cloné et séquencé deux gènes différents d'agarase chez Vibrio sp. JT0107, qu'ils ont appelé agaA (Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750-3756, (1993)) et agaB (Biochimica
et Biophysica Acta 1 218, 105-108, (1994)).
La demanderesse a maintenant isolé une souche bactérienne à partir de
l'algue rouge Delesseria sanguinea, laquelle présente une activité agarase.
Cette souche a été déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 8 mai 1998 sous le numéro
DSM 12170. Elle constitue le premier objet de la présente invention.
La recherche taxonomique de cette souche, réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier, montre qu'elle appartient au genre Cytophaga (bactéries du groupe CFB pour "Cytophaga/Flexibacter/Bacteroides"). En effet, cette souche se développe en s'étalant, présente des colonies jaunes incrustées dans l'agar qui est ensuite liquéfié. La bactérie est à Gram-négatif, a une forme de bâtonnet non mobile de 0,3-0,4x3,0-8,0 gmx[m. Lorsqu'une goutte de culture de la souche est inoculée au centre d'une boîte d'agar, la colonie se développe avec accroissement concentrique du bord et cette mobilité n'est pas inhibée par du diéthyléther qui est un inhibiteur de l'appareil flagellaire. La souche est aérobie et possède un métabolisme oxydatif. Elle produit la flexirubine qui est un pigment rarement trouvé dans les
isolats de Cytophaga marines mais qui est présent chez les Cytophaga non marines.
Elle est capable d'assimiler diverses sources carbonées et de dégrader plusieurs types
de macromolécules, tels que l'agar, le carraghénanc, l'amidon et la gélatine.
La Demanderesse a recherché à quelle espèce appartenait cette souche en réalisant une étude approfondie. Ainsi, elle a déterminé les valeurs en pourcentage de la composition en guanine et cytosine de l'ADN de la souche de l'invention et elle a trouvé qu'elles étaient comprises entre 43 et 49%. Elle a également réalisé le séquençage de son ADN 16S selon le procédé bien connu de l'homme du métier pour connaître la position taxonomique d'une souche (FOX et al., Int. J. Syst. Bacteriol. 22, 44-57, (1977)). Le résultat du séquençage montre que la souche de l'invention est très similaire à Cytophaga uliginosa. (Les similitudes de séquence entre l'ADN 16S de C. uliginosa et celui de la souche de l'invention est de 99%.) Toutefois, l'hybridation ADN/ADN entre les deux souches (45%) montre qu'il s'agit de deux espèces différentes. De plus, la souche de l'invention présente des caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques similaires à celles de la souche
Pseudomonas drobachiensis nov. comb. isolée par HUMM (Duke Univ. Mar. Stn.
Bull. 3, 43-75, (1946)). Elle a donc été appelée Cytophaga drobachiensis.
La Demanderesse a également isolé un gène à activité 03-agarase à partir de
Cytophaga drobachiensis DSM 12170.
Ainsi, la présente invention a également pour objet le nouveau gène agaA
codant pour une 03-agarase qui a la séquence d'ADN SEQ ID N 1.
Ce gène code pour une 0-agarase produite par C. drobachiensis DSM
12170, à savoir la 03-agarase dénommée protéine AgaA.
La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADN ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour la protéine AgaA ou pour l'un quelconque de ses fragments peptidiques
tels que définis ci-après.
L'invention concerne donc: - Toutes les séquences d'acides nucléiques codant pour la protéine AgaA dans son entier, ou pour un ou plusieurs de ses fragments peptidiques. Ces séquences sont représentées de préférence par: a) la séquence d'ADN SEQ ID N 1 codant pour la protéine AgaA et ses fragments codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine; b) les séquences d'ADN hybridant en conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaA ou les fragments de celle-ci; et
d) les séquences d'ARNm correspondantes.
La présente invention concerne également la séquence d'acides nucléiques SEQ ID N 3 qui code pour le fragment peptidique particulier AgaA' qui va être décrit ci-après. Cette séquence correspond aux acides nucléiques 223-1050 de la
SEQ ID N 1.
L'invention concerne donc également les séquences d'acides nucléiques codant pour ledit fragment peptidique AgaA' et ses fragments peptidiques qui sont représentés par: a) la séquence d'ADN SEQ ID N 3 codant pour le fragment peptidique AgaA' et ses fragments codant pour les fragments peptidiques dudit fragment peptidique AgaA'; b) les séquences d'ADN hybridant en conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour le fragment peptidique AgaA' ou les fragments de celui-ci; et
d) les séquences d'ARNm correspondantes.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. ("Molecular Cloning: a
Laboratory Manual" Ed. Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989).
Par exemple, la synthèse des séquences d'ADN selon l'invention peut être effectuée par amplification des gènes de Cytophaga drobachiensis à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144, (1989)) en utilisant des oligonucléotides
synthétiques comme amorces, définis à partir de la séquence d'ADN SEQ ID N 1.
Le fragment d'acides nucléiques ainsi amplifié peut ensuite être cloné dans un vecteur d'expression selon les techniques décrites dans MANIATIS et al.
(Molecular Cloning. A laboratory manual, NEW YORK (1982)).
L'invention a également pour objet les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'acides nucléiques de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du microorganisme à transformer, les moyens
nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention.
Les microorganismes procaryotes préférés aux fins de l'invention sont
Escherichia coli et Bacillus subtilis.
A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules de Aspergillus figer, Trichoderma
viridae ou Pichia pastoris.
La présente invention a également pour objet la nouvelle protéine AgaA de
C drobachiensis qui comprend la SEQ ID N 2.
La nouvelle protéine AgaA est composée de 539 acides aminés et a une masse moléculaire théorique de 60,001 kDa. Après élimination du peptide signal,
cette protéine a une masse moléculaire calculée de 57,768 kDa.
La présente invention concerne également les fragments peptidiques de la protéine AgaA résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou
plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité [3-
agarase. La présente invention concerne également le fragment peptidique AgaA' qui
a la SEQ ID N 4.
Ce fragment peptidique AgaA', composé de 276 acides aminés, correspond
aux acides aminés 20-295 de la protéine AgaA.
L'invention concerne également les fragments peptidiques de AgaA' qui résultent de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides
aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité 3agarase.
Les protéines et fragments peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par les techniques dc génie génétique qui comprend les étapes de: - culture de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes transformées par un vecteur d'expression possédant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et - récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit lesdites cellules. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Pour plus de détails les concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après: Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai; Annals of the New-York
Academy of Sciences, volume 646,1991.
Les fragments peptidiques peuvent également être préparés par synthèse
peptidique chimique classique bien connue de l'homme du métier.
L'invention va maintenant être décrite en détail à l'aide de l'exposé
expérimental ci-après.
Une grande partie des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme du métier, est exposée en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al.
(supra) ou dans l'ouvrage de MANIATIS et al. (supra).
La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 6 sur
lesquelles: - la figure 1 est la photographie d'un gel d'électrophorèse sur SDS-PAGE du surnageant de culture de C. drobachiensis de l'invention; - la figure 2 représente les cartes physiques des clones génomiques de Cytophaga drobachiensis présentant une activité agarase; - la figure 3 donne les séquences nucléotidiques et d'acides aminés déduites du gène d'agarase A provenant de C. drobachiensis; - la figure 4 montre l'alignement de la protéine AgaA (ligne supérieure) selon la présente demande et de la protéine AgaB (ligne inférieure) selon la 2e' demande divisionnaire, les deux protéines provenant de la souche C. drobachiensis; - la figure 5 est une représentation de l'analyse des amas hydrophobes (analyse HCA) connue sous la dénomination anglaise "Hydrophobic Cluster Analysis" des gènes d'agarase et d'autres gènes de glycoside hydrolases; les figures 6A à 6B représentent les profils d'élution des produits d'hydrolyse du néoagarododécaose par l'agarase provenant de la souche
C. drobachiensis selon l'invention.
Exemple 1: Isolement. culture de la souche CvtoDhaga drobachiensis DSM 12170 et extraction de son ADN La souche DSM 12170 a été isolée à partir de frondes vivantes de l'algue rouge Delesseria sanguinea. L'isolement a été réalisé sur une boîte de Pétri sur le milieu de Zobell (ZOBELL, J. Mar. Res. 4, 41-75, (1941)) contenant 2% de t-carraghénane. La culture de la souche a été réalisée à 25 C sur le milieu de Zobell (ZOBELL,
J. Mar. Res. 4, 41-75, (1941)).
Le protocole employé pour extraire l'ADN de la souche Cytophaga
drobachiensis DSM 12170 est dérivé de celui de Marmur (MARMUR, J. Mol. Biol.
3, 208-218, (1961)) et est décrit en détail ci-après.
Après culture, les bactéries ont été centrifugées à 3000 g durant 15 min, puis lavées dans de l'eau de mer stérile. Les cellules ont subi une dernière centrifugation,
identique à la précédente, et ont été traitées immédiatement ou congelées à -20 C.
à 10 g de cellules selon la concentration cellulaire (poids humide après centrifugation) ont été repris dans 25 ml de tampon Sph (Tris-HCI, pH 8, 50 mM; saccharose 25%), puis par 5 ml de tampon TES (Tris-HCI, pH 8, 50 mM; acide éthylènediaminetétraacétique 5 mM; chlorure de sodium 50 mM), et 50 mg de lysosyme ont été ajoutés. Des sphéroplastes sont apparus après une incubation de
min à température ambiante.
L'ADN a été aussitôt protégé par l'ajout de 100 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (concentration finale) et l'incubation a été poursuivie dans la glace pendant encore 10 min. La lyse a été totalement achevée par l'addition de 2% de dodécylsulfate de sodium (concentration finale) et de 25 ml de solution de lyse (Tris-HCl, pH 8,
mM; acide éthylènediaminetétraacétique 100 mM; chlorure de sodium 100 mM).
Les protéines ont été pleinement dénaturées par une incubation de 1 heure à C en présence de 40 mg de protéinase K. A la fin de cette incubation, 1 M (concentration finale) de perchlorate de sodium a été ajouté pour que les liaisons
ADN-protéines soient rompues.
La solution a été déprotéinisée en l'agitant en présence de 0,5 volume de phénol saturé pendant 5 min. L'agitation a été faite manuellement et a dû être suffisamment énergique, sans l'être trop pour ne pas déchirer I'ADN, pour former une émulsion (sans laquelle il ne pourrait y avoir d'extraction). La déprotéinisation a été poursuivie encore pendant 5 min après ajout de 0,5 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1). Les protéines ont été concentrées à l'interface entre la phase aqueuse et la
phase organique, par une centrifugation de 15 min à 10000 g à température ambiante.
La phase aqueuse contenant les acides nucléiques a été transvasée dans un tube propre avec une pipette dont l'embout a été agrandi pour ne pas déchirer l'ADN. La déprotéinisation a été poursuivie et les traces de phénol ont été extraites de la phase aqueuse, par agitation de la solution pendant 5 min en présence de 1 volume de
chloroforme/alcool isoamylique (24/1).
Après une centrifugation de 5 min à 10000 g à température ambiante, la phase aqueuse a été prélevée avec les mêmes précautions que précédemment, et les acides nucléiques ont été précipités en versant délicatement 0,6 volume d'isopropanol (de façon à former deux phases). L'ADN de haut poids moléculaire a été récupéré avec une baguette de verre, lavé dans de l'éthanol à 70%, déshydraté dans de l'éthanol
absolu et séché à l'air.
Après séchage, l'ADN a été dissous dans 20 ml de tampon TE (10 mM, Tris-
HCI, pH 8; 1 mM, acide éthylènediaminetétraacétique). La dissolution a nécessité environ 12 heures et elle a pu être facilitée par un chauffage à 50 C. Lorsque la solution obtenue a été opalescente, signe d'une contamination importante en protéines, ces dernières ont été efficacement éliminées en passant une fraction de
l'ADN sur un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthydium.
Après ce passage sur gradient et élimination du bromure d'éthydium, l'ADN ainsi
obtenu a été quantifié. Il a pu être conservé à 4 C ou congelé à -20 C.
La composition d'ADN, exprimée en pourcentage molaire de guanine + cytosine (mol% G+C), a été déterminée par la méthode spectroscopique de ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272, 1-11, (1972)) et le procédé de gradient en chlorure de
césium en présence de 2'-[4-hydroxyphényl]-5-[4-méthyl-1-pipérazinyl]-2, 5'-bi-
1H-benzimidazole (Hoechst 33258/Sigma) (KARLOVSKY et DE COCK, Anal.
Biochem. 194, 192-197, (1991)). Dans le premier cas, il est de 44 + 1% (moyenne de 2 manipulations) et dans le deuxième cas de 48,8%. Ce pourcentage molaire G+C a
été calculé en utilisant l'ADN de E. coli comme référence standard.
Exemple 2: Séquençage de I'ADN 16S de Cytophaga drobachiensis L'ADN 16S a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN génomique de la souche C. drobachiensis comme matrice et la polymérase Taq (Proméga) comme enzyme. Le mélange réactionnel typique de PCR, de 50 /ul de volume, avait la composition suivante: 100 ng de matrice, 10 ng de chacun des deux oligonucléotides spécifiques de l'ADN 16S du règne des Bacteria, 200 mM de chacun des dNTP (dNTP étant le déoxyribonucléoside triphosphate), 1,5 mM de MgCI2, du tampon Taq et 2,5 U d'enzyme. Les différentes étapes de PCR étaient les suivantes: * 6 minà 95 C (1 fois), À 1,5 min à 95 C; 1,5 min à 54 C; 2,5 min à 72 C (25 fois),
* 8,5 min à 72 C (étape de polymérisation).
Le produit obtenu par PCR a été soit au préalable cloné puis séquencé, soit directement séquencé par PCR en utilisant la Thermoséquenase (Amersham) comme enzyme, avec différents oligonucléotides spécifiques pour l'ADN 16S marqués en 5' 1 5 au rouge Texas. Les différentes étapes de PCR étaient les suivantes: * 5 min à 97 C (1 fois),
* 1 min à 97 C; 1 min à 54 C; 1 min à 61 C (25 fois).
Ce séquençage, qui permet de connaître la position taxonomique de la souche, a montré que la souche selon l'invention était phylogénétiquement très proche de
Cytophaga uliginosa.
Exemple 3: Mise en évidence et purification de l'activité agarase dans la souche Cvtophaga drobachiensis DSM 12170 L'activité agarase de la souche a été induite dans un milieu de Zobell supplémenté par 2,5 mg/I d'agar. On considère qu'une souche présente une activité
agarase lorsqu'elle digère l'agar sur lequel elle se développe.
On a cultivé les souches à activité agarase dans le milieu ci-dessus à 20 C. On a centrifugé la culture à 1000 g pendant 20 min. On a récupéré le surnageant de culture et on l'a concentré jusqu'à 50 ml par ultrafiltration tangentielle (seuil de coupure: 10 kDa), opération suivie d'une précipitation au sulfate d'ammonium. Le culot de protéines a été remis en suspension dans 9 ml de tampon MES (MES étant l'acide 2-[N-morpholino]éthanesulfonique). On a ensuite ajouté 2 ml de Sépharose CL6B afin de réaliser une chromatographie par affinité. On a récupéré deux fractions
dont l'une s'est fixée sur la colonne de Sépharose.
On a testé l'activité agarase par un dosage des sucres réducteurs selon la technique de KIDBY D.K. & DAVIDSON DJ. (Annal. Biochem., Vol. 55, 321-325 (1973)) dans le surnageant avant la chromatographie par affinité (qui est bien évidemment positif) et dans les deux fractions obtenues après la chromatographie. On
a détecté une activité agarase dans chaque fraction.
On a mis en oeuvre une électrophorèse sur SDS-PAGE avec la fraction fixée sur la colonne. Celle-ci a présenté une bande principale avec une masse moyenne de 31 kDa (figure 1). Cette protéine a été microséquencée. La séquence du peptide interne obtenu a été trouvée dans la séquence d'acides aminés déduite du gène agaA
(figure 3).
Exemple 4: Clonage du gène d'agarase
On a préparé une banque d'ADN génomique de la souche de C. drobachiensis.
Des fragments de 4 à 10 kb, provenant de la digestion partielle par NdeII de l'ADN chromosomique, ont été fractionnés sur un gradient de saccharose. Ces fragments ont été insérés dans le site BamHI du plasmide pAT153 (TWIGG et SHERRATT, Nature,
283, 216, (1980)).
Les clones recombinants (environ 6000) de la souche DH5ca de E. coli (SAMBROOK et al., supra) ont été inoculés indépendamment sur des plaques de microtitration dans le milieu LBA (milieu Luria-Bertani (MANIATIS et al., supra) supplémenté en ampicilline à une concentration de 50,ug/ml). Après incubation, toute la nuit à 37 C, ces clones ont été étalés à 22 C sur du milieu Zd (5 mg/1 de bactotryptone, 1 mg/l d'extrait de levure, 10 mg/l de NaCl, pH 7,2) supplémenté à 50ug/ml d'ampicilline pour observer la production d'agarase (trou dans la gélose
lorsqu'il y a production d'agarase).
En deux mois de culture à 22 C, 2 colonies indépendantes, appelées pAC1 et
pAC2, ont fait un trou dans le substrat.
Les cartes des plasmides correspondant à ces colonies sont représentées sur la figure 2, sur laquelle: -les lignes fines représentent les régions de pAT153, les segments en gras représentent les inserts de C. drobachiensis et les rectangles blancs représentent le gène agarase; - les différentes abréviations ont les significations ci-après: B/S: site de clonage BamHI-Sau3A Bg: BglII C: ClaI E: EcoRI H: HindII K: KnpI Nc: NcoI Nd: NdeI Ps: PstI Pv: PvuII Sa SalI Sp: SphI
X: XbaI.
La cartographie de ces plasmides montre donc la présence d'un fragment commun, ce qui suggère la présence d'au moins un gène agarase dans le génome de
C. drobachiensis. Les plasmides pAC1 et pAC2 partagent un fragment commun SalI-
PstI de 5 kb (délimité par les lignes en pointillés sur la figure 2).
Le fragment commun a été sous-cloné dans le phagemide pBluescript (Stratagène) et est appelé pASP5, comme indiqué sur la figure 2. Ce sousclone
présente un phénotype agarase +.
Exemple 5: Analyse de la séquence nucléotidique du gène d'agarase Le plasmide pASP5 a été utilisé pour déterminer, sur les deux brins, les
séquences nucléotidiques du gène de structure d'agarase.
Ce séquençage a été réalisé par une technique bien connue de l'homme du métier, à savoir la méthode de Sanger (SANGER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74,
5463-5467, (1977)) également appelée méthode aux didéoxynucléotides.
L'inscrt pASP5 a été séquencé sur 2980 pb du site BamHI au site HindIII (délimité par les lettres B/S et H sur la figure 2). Il contient un unique cadre ouvert de
lecture (ORF) de 1617 pb appelé gène agaA. Ce gène a la SEQ ID N 1.
La séquence d'acides nucléiques obtenue est illustrée sur la figure 3. Deux hexamères, TaGAaA et TATAtT, compatibles avec les promoteurs consensus "-35" et "-10" de E. coli, les majuscules correspondant au promoteur consensus de E. coli (ROSENBERG, M. & COURT, D., Ann. Rev. 13, 319-353, (1979)), et séparés par 15 nucléotides, sont trouvés à 62 nucléotides en amont du codon initiateur putatif du gène agaA. Dans la région 3' non traduite, une boucle d'arrêt de transcription est
trouvée en aval du codon stop TAA, suivi de trois résidus thymidine.
Le coefficient de Chargaff (GC%) du gène d'agarase A est compris entre 41 et 45 %, ce qui est en accord avec celui du genre Cytophaga trouvé par REICHENBACH et al. (30-45 %; Genus Cytophaga, in Bergey's Manual of
systematic bacteriology, 2015-2050, (1989)).
Exemple 6: Analyse de la séquence d'acides aminés déduite du gène d'agarase Le produit de traduction du gène agaA est une protéine de 539 acides aminés présentant une masse moléculaire théorique de 60,001 kDa. La séquence d'acides aminés déduite, SEQ ID N 2, comprend le peptide interne déterminé à partir du microséquençage de l'agarase A purifiée (soulignée sur la figure 3). Comme indiqué
par l'analyse du profil d'hydropathie (KYTE et DOOLITLE, J. Mol. Biol., 157, 105-
132, (1982)) la partie N-terminale de.a protéine correspond à un domaine très hydrophobe, ce qui suggère que ce domaine est le peptide signal (VON HELINE, Eur. J. Biochem. 133, 17-21, (1983); J. Mol. Biol. 184, 99- 105, (1985)). Selon la règle "(-3,-1)" de Von Heijne, le site de coupure le plus probable de la signal-peptidase
est attribué entre Alal9 et Ala20.
Il est à noter que la masse moléculaire de la protéine AgaA calculée après élimination du peptide signal, égale à environ 57,768 kDa, est supérieure à la masse moléculaire déterminée initialement par électrophorèse sur SDS-PAGE, qui est de 31 kDa (voir figure 1). Cette différence indique une possible transformation après la
traduction qui éliminerait une grande partie de l'extrémité C-terminale de la protéine.
Exemple 7: Similitudes de séquence entre les protéines AgaA et AgaB de C. drobachiensis et avec d'autres 8-glycanases Les similitudes de séquence entre les protéines AgaA selon la présente
demande et AgaB selon la 2" demande divisionnaire sont illustrées sur la figure 4.
La protéine AgaA présente une identité de 44,5% et une similitude de 65, 7% avec la protéine AgaB. De nombreux domaines sont assez similaires dans les séquences primaires, de IlellO à Val287 (numérotation sur la séquence de l'agarase A). En particulier, dans l'un des motifs les mieux conservés, deux résidus acide glutamique sont présents et séparés par 4 acides aminés (Glu147 et Glu152 dans la séquence d'AgaA, et Glu184 et Glu189 dans la séquence d'AgaB, en gras sur la figure 4). Cette
organisation est caractéristique du site catalytique de la famille 16 des glycoside-
hydrolases (HENRISSAT, Biochem. J. 280, 309-316, (1991)).
Aucune similitude de séquence n'a été trouvée avec les agarases de la souche Vibrio sp. JT0107 (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750-3756,
(1993); Biochim. Biophys. Acta 1218, 105-108, (1994)).
Néanmoins, les agarases (AgaA et AgaB) partagent des identités de séquence significatives avec les 03-agarases de Alteromonas atlantica GenBank M73783 (BELAS et al., J. Bacteriol. 54, 30-37, (1988)) (53,5% et 48% avec AgaA et AgaB,
respectivement) et de Streptomyces coelicolor (BU'TITNER et al., Mol. Gen. Genet.
209, 101-109, (1987) (33% avec AgaA et avec AgaB).
Ces similitudes sont également mises en évidence grâce à la méthode HCA (hydrophobic cluster analysis; LEMESLE-VARLOOT et al., Biochimie 72, 555-574, (1990)). La figure 5 illustre la comparaison HCA entre les agarases AgaA et AgaB, respectivement Agar A Cd et Agar B Cd sur la figure, et d'autres enzymes de la famille 16 des glycoside-hydrolases, àsavoir la 3-agarase de Alteromonas atlantica (Agar Aa), la [3-agarase de Streptomyces coecicolor (Agar Sc), la Kc-carrageenase de C. drobachiensis (Kap Cd), la laminarinase de Rhodothermus marinus (Lamn Rm), la lichenase de Bacillus macerans (Lich Bm), et la xyloglucane- endotransglycosylase
deArabidopsis thaliana (XET At).
Les deux résidus catalytiques Glu, présents dans la lichénase de Bacillus macerans, ont été pris comme points d'ancrage pour la comparaison HCA et les séquences segmentées en prenant comme référence la structure tridimensionnelle
connue de cette lichénase.
Treize segments de structure distincte (I-XIII) sont mis en évidence sur la figure 5, les segments I, II, IX, X, XI et XIII apparaissant les mieux conservés. On peut noter que le segment VI est spécifique des agarases dans cette famille de glycoside-hydrolases et que le site catalytique se trouve dans le segment de structure
III.
Exemple 8: Spécificités de substrat de l'agarase recombinée AgaA Les spécificités de substrat de l'agarase de l'invention ont été étudiées en analysant les produits de dégradation du néoagarododécaose par l'agarase
recombinante AgaA.
Le néoagarododécaose a été préparé de la façon suivante: de l'agarose a été hydrolysé par de l'agarase, en utilisant 0,32 U/mg de polymère. La fraction résistante a été précipitée dans de l'isopropanol et les oligosaccharides solubles ont été fractionnés par chromatographie d'exclusion préparatoire sur Bio-gel P2 ( 95 cm x 4,4 cm; 25 C; éluant: eau distillée). La détection a été réalisée avec un appareil d'enregistrement de l'indice de réfraction différentiel (ROCHAS & HEYRAUD, Polymer Bull. 5, 81-86, (1981)). La fraction oligomère correspondant au
néoagardodécaose a été concentrée sur un évaporateur rotatif et lyophilisé.
On a cultivé pendant 12 heures dans 1 litre de milieu LB à 37 C (milieu Luria-Bertani), les clones recombinants de E. coli contenant le plasmide pAC1. On a centrifugé les cellules à 2000 g pendant 20 minutes, on les a mises en suspension dans ml de tampon MES et on les a fait éclater à l'aide d'une presse de French à 20000 p.s.i. On a réalisé une centrifugation à 20000 g pendant 1 heure. On a rejeté les fragments cellulaires et on a réduit le volume du surnageant à 5 ml en utilisant une
cellule d'ultrafiltration (Amicon, seuil de coupure de 10 kDa).
On a ajouté 500 gl de chaque extrait ainsi obtenu à 1 ml de néoagaro-
dodécaose dans du tampon MES (50 mg/ml) et on a incubé à 37 C pendant 18 heures.
On a ajouté 500 gl de chaque extrait ainsi obtenu à 1 ml de néoagaro-
dodécaose dans du tampon MES (50 mg/ml) et on a incubé à 37 C pendant 18 heures.
On a déterminé le degré de polymérisation des produits finaux par chromatographie HPAE en utilisant un détecteur électrochimique pulsé et une colonne échangeuse d'anions (Carbo-PAC PA100, Dionex) dans les conditions suivantes: débit 1 ml/min; tampon A 150mM NaOH; tampon B 500 mM d'acétate de sodium dans 150 mM de NaOH; gradient * 0 à 5 min 70% de A, 30% de B; * 5 à 16 min 40% de A, 60% de B; * 16 à 20 min 100% de B. Les résultats obtenus par chromatographie HPAE (chromatographie échangeuse d'anions haute performance) sont illustrés sur les figure 6A et 6B sur lesquelles les différentes abréviations ont les significations ci-après: nC: manocoulomb DP1: néoagarobiose DP2: néoagarotétraose DP3: néoagarohexaose DP4: néoagarooctaose DP5: néoagarodécaose DP6: néoagarododécaose DP7: néoagarotétradécaose DP8: néoagarohexadécaose Les produits finaux d'hydrolyse du néoagarododécaose par l'agarase A sont représentés sur la figure 6B. Par comparaison avec le néoagarododécaose sans enzyme (figure 6A), le profil d'élution après 18 heures de digestion présente le néoagarotétraose (DP2) comme produit majoritaire et le néoagarohexaose (DP3)
comme produit minoritaire.
14 2779736
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: LABORATOIRES GOEMAR
(B) RUE: La Madeleine B.P. 55 (C) VILLE: Saint-Malo (E) PAYS: France (F) CODE POSTAL: 35413 Cédex (ii) TITRE DE L'INVENTION: Gène codant pour la agarase AgaA de Cytophaga drobachiensis souche Dsij et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 4 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 2035 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:166..1782
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TTATTCTTAC TAATATTGTA GGAAAATTTA ACACAAAAAA CATCTTTGTT CAGTTTTTGT 60
CGAGTTGGTA AAACCTAGAA AACAGACACG GCATTGTATA TTTGGCGATG ATTCATCTGT 120
TTGTTTGTTG AATACATTTT TATTAACCCC TAAAATTACA TTATC ATG AAA AAA 174
Met Lys Lys
AAT TAT CTT TTA CTG TAT TTT ATT TTT CTT TTG TGT GGC TCT ATC GCT 222
Asn Tyr Leu Leu Leu Tyr Phe Ile Phe Leu Leu Cys Gly Ser Ile Ala
10 15
GCA CAG GAC TGG AAC GGA ATT CCT GTA CCT GCC AAT CCC GGA AAT GGT 270
Ala Gln Asp Trp Asn Gly Ile Pro Val Pro Ala Asn Pro Gly Asn Gly
25 30 35
ATG ACT TGG CAA TTA CAG GAT AAT GTT TCG GAT AGT TTT AAT TAC ACA 318
Met Thr Trp Gln Leu Gln Asp Asn Val Ser Asp Ser Phe Asn Tyr Thr
45 50
AGT AGT GAA GGA AAT AGG CCT ACT GCC TTT ACT AGT AAA TGG AAA CCT 366
Ser Ser Glu Gly Asn Arg Pro Thr Ala Phe Thr Ser Lys Trp Lys Pro
60 65
TCC TAT ATC AAT GGA TGG ACT GGT CCT GGA TCA ACA ATT TTT AAT GCC 414
Ser Tyr Ile Asn Gly Trp Thr Gly Pro Gly Ser Thr Ile Phe Asn Ala
75 80
GCG CAG GCA TGG ACC AAT GGT TCT CAA TTG GCA ATT CAG GCA CAA CCA 462
Ala Gln Ala Trp Thr Asn Gly Ser Gln Leu Ala Ile Gln Ala Gln Pro
90 95
GCA GGG AAT GGA AAA TCT TAC AAC GGA ATT ATC ACC TCC AAA AAT AAG 510
Ala Gly Asn Gly Lys Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Ser Lys Asn Lys
105 110 115
ATC CAG TAC CCG GTG TAT ATG GAA ATT AAG GCC AAG ATA ATG GAC CAG 558
Ile Gln Tyr Pro Val Tyr Met Glu Ile Lys Ala Lys Ile Met Asp Gln
125 130
GTA CTA GCA AAT GCT TTC TGG ACC TTG ACT GAC GAC GAG ACT CAG GAA 606
Val Leu Ala Asn Ala Phe Trp Thr Leu Thr Asp Asp Glu Thr Gln Glu
140 145
ATT GAT ATT ATG GAA GGC TAT GGC AGT GAT CGG GGG GGA ACT TGG TTC 654
Ile Asp Ile Met Glu Gly Tyr Gly Ser Asp Arg Gly Gly Thr Trp Phe
155 160
GCC CAA AGA ATG CAT TTG AGC CAC CAT ACA TTT ATT CGT AAC CCC TTT 702
Ala Gln Arg Met His Leu Ser His His Thr Phe Ile Arg Asn Pro Phe
170 175
ACG GAT TAT CAG CCT ATG GGA GAC GCT ACA TGG TAT TAC AAC GGA GGT 750
Thr Asp Tyr Gln Pro Met Giy Asp Ala Thr Trp Tyr Tyr Asn Gly Gly
185 190 195
ACA CCA TGG CGT TCA GCA TAT CAC CGT TAT GGA TGT TAT TGG AAA GAT 798
Thr Pro Trp Arg Ser Ala Tyr His Arg Tyr Gly Cys Tyr Trp Lys Asp
205 210
CCA TTT ACA TTG GAA TAT TAT ATT GAC GGG GTA AAG GTT AGA ACG GTC 846
Pro Phe Thr Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Lys Val Arg Thr Val
215 220 225
ACA AGA GCC GAA ATT GAT CCT AAT AAT CAT CTC GGC GGA ACA GGG TTG 894
Thr Arg Ala Glu Ile Asp Pro Asn Asn His Leu Gly Gly Thr Gly Leu
230 235 240
AAT CAG GCA ACA AAT ATT ATT ATT GAT TGT GAA AAT CAA ACA GAT TGG 942
Asn Gln Ala Thr Asn Ile Ile Ile Asp Cys Glu Asn Gln Thr Asp Trp
245 250 255
AGG CCC GCG GCT ACT CAA GAA GAA CTG GCC GAT GAT AGC AAA AAT ATC 990
Arg Pro Ala Ala Thr Gln Glu Glu Leu Ala Asp Asp Ser Lys Asn Ile
*260 265 270 275
TTC TGG GTC GAT TGG ATA CGT GTG TAC AAG CCT GTT GCG GTA AGT GGA 1038
Phe Trp Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro Val Ala Val Ser Gly
280 285 290
GGT GGA AAC AAC GGT AAC GAC GGT GCC ACT GAA TTT CAA TAT GAT TTA 1086
Gly Gly Asn Asn Gly Asn Asp Gly Ala Thr Glu Phe Gln Tyr Asp Leu
295 300 305
GGA ACG GAC ACC TCG GCA GTA TGG CCA GGG TAT ACA CGG GTT TCC AAC 1134
Gly Thr Asp Thr Ser Ala Val Trp Pro Gly Tyr Thr Arg Val Ser Asn
310 315 320
ACC ACT AGG GCT GGT AAT TTT GGA TGG GCG AAC ACC AAT GAC ATC GGA 1182
Thr Thr Arg Ala Gly Asn Phe Gly Trp Ala Asn Thr Asn Asp Ile Gly
325 330 335
TCA AGA GAT CGT GGG GCT TCT AAC GGA AGG AAC AAT ATA AAC CGT GAT 1230
Ser Arg Asp Arg Gly Ala Set Asn Gly Arg Asn Asn Ile Asn Arg Asp
340 345 350 355
ATT AAT TTT AGT TCA CAA ACT AGG TTC TTC ACT CAA GAC CTA TCC AAT 1278
Ile Asn Phe Ser Ser Gin Thr Arg Phe Phe Thr Gin Asp Leu Set Asn
360 365 370
GGC ACT TAT AAC GTA TTG ATC ACT TTT GGG GAC ACC TAT GCC CGA AAA 1326
Gly Thr Tyr Asn Val Leu Ile Thr Phe Gly Asp Thr Tyr Ala Arg Lys
375 380 385
AAT ATG AAC GTC GCG GCC GAA GGG CAA AAT AAA TTA ACA AAC ATA AAC 1374
Asn Met Asn Val Ala Ala Glu Gly Gln Asn Lys Leu Thr Asn Ile Asn
390 395 400
ACC AAT GCC GGG CAA TAT GTT AGT AGG TCG TTT GAC GTA AAT GTC AAC 1422
Thr Asn Ala Gly Gln Tyr Val Set Arg Set Phe Asp Val Asn Val Asn
405 410 415
GAC GGA AAA CTA GAT TTG CGA TTT TCA GTT GGT AAT GGC GGG GAT GTG 1470
Asp Gly Lys Leu Asp Leu Arg Phe Ser Val Gly Asn Gly Gly Asp Val
420 425 430 435
TGG TCC ATT ACA AGA ATC TGG ATT AGA AAA GTT ACG AGC AAC AGC GCT 1518
Trp Ser Ile Thr Arg Ile Trp Ile Arg Lys Val Thr Ser Asn Ser Ala
440 445 450
AAT TTG TTA GCG GCA AAA GGA TTA ACA TTG GAA GAT CCT GTG GAA ACT 1566
Asn Leu Leu Ala Ala Lys Gly Leu Thr Leu Glu Asp Pro Val Glu Thr
455 460 465
ACG GAA TTT TTA TAT CCT AAC CCC GCA AAA ACA GAT GAT TTT GTG ACT 1614
Thr Glu Phe Leu Tyr Pro Asn Pro Ala Lys Thr Asp Asp Phe Val Thr
470 475 480
GTT CCC AAT AGT GAA ATT GGA AGT AGT ATA ATC ATC TAT AAT AGT GCA 1662
Val Pro Asn Ser Glu Ile Gly Ser Set Ile Ile Ile Tyr Asn Ser Ala
485 490 495
GGT CAA GTA GTG AAA AAA GTA AGT GTG GTT TCC GAA AAT CAG AAA ATA 1710
Gly Gln Val Val Lys Lys Val Set Val Val Ser Glu Asn Gln Lys Ile
500 505 510 515
TCA CTA GAA GGA TTT GCT AAA GGA ATG TAC TTT ATC AAT TTG AAT GGT 1758
Set Leu Glu Gly Phe Ala Lys Gly Met Tyr Phe Ile Asn Leu Asn Gly
520 525 530
CAG AGT ACA AAA CTT ATT GTC CAA TAAACACAAT AACAATTTCA ATTAAACGAC 1812
Gln Set Thr Lys Leu Ile Val Gin
AAAGGCGCTC TGATGATACA GAAAGGCCTT TGTCGTTTTT TAAGTTACTT CAGGAACCAA 1872
GATAAATTTT TAGGTGGTAT TGTTAGCTTC TTCTAACTAG AATATGATCT GTGTTTTGCG 1932
GGCTTCTTGT ACTTGCTGTA ACCGCTTCGT TTTTGTGCAA TGTCGGCACA TGGTGTATGC 1992
CCTGTTTACT GGGTAAATTA GGTACTTTTC TTTTTGAAGC TTA 2035
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 539 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Met Lys Lys Asn Tyr Leu Leu Leu Tyr Phe Ile Phe Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ile Ala Ala Gln Asp Trp Asn Gly Ile Pro Val Pro Ala Asn Pro
25 30
Gly Asn Gly Met Thr Trp Gln Leu Gln Asp Asn Val Ser Asp Ser Phe
40 45
Asn Tyr Thr Ser Ser Glu Gly Asn Arg Pro Thr Ala Phe Thr Ser Lys
55 60
Trp Lys Pro Ser Tyr Ile Asn Gly Trp Thr Gly Pro Gly Ser Thr Ile
70 75 80
Phe Asn Ala Ala Gln Ala Trp Thr Asn Gly Ser Gln Leu Ala Ile Gln
90 95
Ala Gln Pro Ala Gly Asn Gly Lys Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Ser
105 110
Lys Asn Lys Ile Gln Tyr Pro Val Tyr Met Glu Ile Lys Ala Lys Ile
120 125
Met Asp Gln Val Leu Ala Asn Ala Phe Trp Thr Leu Thr Asp Asp Glu
135 140
Thr Gln Glu Ile Asp Ile Met Glu Gly Tyr Gly Ser Asp Arg Gly Gly
150 155 160
Thr Trp Phe Ala Gln Arg Met His Leu Ser His His Thr Phe Ile Arg
170 175
Asn Pro Phe Thr Asp Tyr Gln Pro Met Gly Asp Ala Thr Trp Tyr Tyr
185 190
Asn Gly Gly Thr Pro Trp Arg Ser Ala Tyr His Arg Tyr Gly Cys Tyr
200 205
Trp Lys Asp Pro Phe Thr Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Lys Val
210 215 220
Arg Thr Val Thr Arg Ala Glu Ile Asp Pro Asn Asn His Leu Gly Gly
225 230 235 240
Thr Gly Leu Asn Gln Ala Thr Asn Ile Ile Ile Asp Cys Glu Asn Gln
245 250 255
Thr Asp Trp Arg Pro Ala Ala Thr Gln Glu Glu Leu Ala Asp Asp Ser
260 265 270
Lys Asn Ile Phe Trp Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro Val Ala
275 280 285
Val Ser Gly Gly Gly Asn Asn Gly Asn Asp Gly Ala Thr Glu Phe Gln
290 295 300
Tyr Asp Leu Gly Thr Asp Thr Set Ala Val Trp Pro Gly Tyr Thr Arg
305 310 315 320
Val Ser Asn Thr Thr Arg Ala Gly Asn Phe Gly Trp Ala Asn Thr Asn
325 330 335
Asp Ile Gly Ser Arg Asp Arg Gly Ala Ser Asn Gly Arg Asn Asn Ile
340 345 350
Asn Arg Asp Ile Asn Phe Ser Set Gln Thr Arg Phe Phe Thr Gln Asp
355 360 365
Leu Set Asn Gly Thr Tyr Asn Val Leu Ile Thr Phe Gly Asp Thr Tyr
370 375 380
Ala Arg Lys Asn Met Asn Val Ala Ala Glu Gly Gln Asn Lys Leu Thr
385 390 395 400
Asn Ile Asn Thr Asn Ala Gly Gln Tyr Val Ser Arg Ser Phe Asp Val
405 410 415
Asn Val Asn Asp Gly Lys Leu Asp Leu Arg Phe Set Val Gly Asn Gly
420 425 430
Gly Asp Val Trp Ser Ile Thr Arg Ile Trp Ile Arg Lys Val Thr Set
435 440 445
Asn Set Ala Asn Leu Leu Ala Ala Lys Gly Leu Thr Leu Glu Asp Pro
450 455 460
Val Glu Thr Thr Glu Phe Leu Tyr Pro Asn Pro Ala Lys Thr Asp Asp
465 470 475 480
Phe Val Thr Val Pro Asn Ser Glu Ile Gly Set Set Ile le e Ile Tyr
485 490 495
Asn Set Ala Gly Gln Val Val Lys Lys Val Set Val Val Set Glu Asn
500 505 510
Gln Lys Ile Set Leu Glu Gly Phe Ala Lys Gly Met Tyr Phe Ile Asn
515 520 525
Leu Asn Gly Gln Ser Thr Lys Leu Ile Val Gln
530 535
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 828 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN génomique
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
GCACAGGACT GGAACGGAAT TCCTGTACCT GCCAATCCCG GAAATGGTAT GACTTGGCAA 60
TTACAGGATA ATGTTTCGGA TAGTTTTAAT TACACAAGTA GTGAAGGAAA TAGGCCTACT 120
GCCTTTACTA GTAAATGGAA ACCTTCCTAT ATCAATGGAT GGACTGGTCC TGGATCAACA 180
ATTTTTAATG CCGCGCAGGC ATGGACCAAT GGTTCTCAAT TGGCAATTCA GGCACAACCA 240
GCAGGGAATG GAAAATCTTA CAACGGAATT ATCACCTCCA AAAATAAGAT CCAGTACCCG 300
GTGTATATGG AAATTAAGGC CAAGATAATG GACCAGGTAC TAGCAAATGC TTTCTGGACC 360
TTGACTGACG ACGAGACTCA GGAAATTGAT ATTATGGAAG GCTATGGCAG TGATCGGGGG 420
GGAACTTGGT TCGCCCAAAG AATGCATTTG AGCCACCATA CATTTATTCG TAACCCCTTT 480
ACGGATTATC AGCCTATGGG AGACGCTACA TGGTATTACA ACGGAGGTAC ACCATGGCGT 540
TCAGCATATC ACCGTTATGG ATGTTATTGG AAAGATCCAT TTACATTGGA ATATTATATT 600
GACGGGGTAA AGGTTAGAAC GGTCACAAGA GCCGAAATTG ATCCTAATAA TCATCTCGGC 660
GGAACAGGGT TGAATCAGGC AACAAATATT ATTATTGATT GTGAAAATCA AACAGATTGG 720
AGGCCCGCGG CTACTCAAGA AGAACTGGCC GATGATAGCA AAAATATCTT CTGGGTCGAT 780
TGGATACGTG TGTACAAGCC TGTTGCGGTA AGTGGAGGTG GAAACAAC 828
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 276 acides aminés (B) TYPE: acide aminé (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Ala Gln Asp Trp Asn Gly Ile Pro Val Pro Ala Asn Pro Gly Asn Gly i 5 10 15 Met Thr Trp Gln Leu Gln Asp Asn Val Ser Asp Ser Phe Asn Tyr Thr
25 30
Ser Ser Glu Gly Asn Arg Pro Thr Ala Phe Thr Ser Lys Trp Lys Pro
40 45
Ser Tyr Ile Asn Gly Trp Thr Gly Pro Gly Ser Thr Ile Phe Asn Ala
55 60
Ala Gln Ala Trp Thr Asn Gly Ser Gln Leu Ala Ile Gln Ala Gln Pro
70 75 80
Ala Gly Asn Gly Lys Ser Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Ser Lys Asn Lys
90 95
Ile Gln Tyr Pro Val Tyr Met Glu Ile Lys Ala Lys Ile Met Asp Gln
105 110
Val Leu Ala Asn Ala Phe Trp Thr Leu Thr Asp Asp Glu Thr Gln Glu
120 125
Ile Asp Ile Met Glu Gly Tyr Gly Ser Asp Arg Gly Gly Thr Trp Phe
135 140
Ala Gln Arg Met His Leu Ser His His Thr Phe Ile Arg Asn Pro Phe
150 155 160
Thr Asp Tyr Gln Pro Met Gly Asp Ala Thr Trp Tyr Tyr Asn Gly Gly
170 175
Thr Pro Trp Arg Ser Ala Tyr His Arg Tyr Gly Cys Tyr Trp Lys Asp
185 190
Pro Phe Thr Leu Glu Tyr Tyr Ile Asp Gly Val Lys Val Arg Thr Val
200 205
Thr Arg Ala Glu Ile Asp Pro Asn Asn His Leu Gly Gly Thr Gly Leu
210 215 220
Asn Gln Ala Thr Asn Ile Ile Ile Asp Cys Glu Asn Gln Thr Asp Trp
225 230 235 240
Arg Pro Ala Ala Thr Gln Glu Glu Leu Ala Asp Asp Ser Lys Asn Ile
245 250 255
Phe Trp Val Asp Trp Ile Arg Val Tyr Lys Pro Val Ala Val Ser Gly
260 265 270
Gly Gly Asn Asn
Claims (13)
1. Souche Cytophaga drobachiensis déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GmbI-) le 8 mai 1998 sous le numéro DSM 12170.
2. Gène agaA codant pour une 3- agarase, caractérisé en ce qu'il a la
SEQ ID N 1.
3. Gène selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il code pour une
13-agarase de Cytophaga drobachiensis DSM 12170 selon la revendication 1.
4. Protéine AgaA de C drobachiensis DSM 12170 caractérisée en ce qu'elle a
la SEQ ID N 2.
5. Fragments peptidiques de la protéine selon la revendication 4 résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés,
lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité [3-agarase.
6. Fragment peptidique AgaA' de la protéine selon la revendication 4,
caractérisé en ce qu'il a la SEQ ID N 4 et l'activité 13-agarase.
7. Fragments peptidiques du fragment peptidique selon la revendication 6 résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides
aminés, lesdits fragments peptidiqucs ayant conservé l'activité [3agarase.
8. Séquence d'acides nucléiques codant pour la protéine selon la
revendication 4 et les fragments peptidiques selon la revendication 5.
9. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADN SEQ ID N 1 codant pour la protéine AgaA et ses fragments codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaA ou les fragments dc celle-ci; et
d) les séquences d'ARNm correspondantes.
10. Séquence d'acides nucléiques codant pour le fragment peptidique selon la
revendication 6 et les fragments peptidiques selon la revendication 7.
11. Séquence d'acides nucléiques selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle est constituée par: a) la séquence d'ADN SEQ ID N 3 codant pour le fragment peptidique AgaA' et ses fragments codant pour les fragments peptidiques dudit fragment peptidique AgaA'; b) les séquences d'ADN hybridant en conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour le fragment peptidique AgaA' ou les fragments de celui-ci; et
d) les séquences d'ARNm correspondantes.
12. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides
nucléiques selon l'une quelconque des revendications 8 à 11 et les moyens nécessaires
à son expression.
13. Microorganismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression
selon la revendication 12.
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