JP7405742B2 - 遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Description
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、米国仮特許出願第62/557,840号(2017年9月13日に出願された)の利益を主張するものである。
配列表の正式なコピーは、2018年9月11日作成の20180911_CL6613WOPCT_SequenceListing_ST25という名称のファイルにより、約406キロバイトのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表としてEFS-Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このASCIIフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
α-グルカン収率=((IS/2-(FS/2+LE/2+GL+SO))/(IS/2-FS/2))×100%。
グルコシルトランスフェラーゼ反応のフルクトース残余を評価して、該当する場合、HPLCデータが範囲外ではない(90~110%は、許容されると見なされる)ことを保証し得る。フルクトース残余は、次の式を使用して評価することができる:
フルクトース残余=((180/342×(FS+LE)+FR)/(180/342×IS))×100%。
上の2つの式では、ISは、[初期のスクロース]であり、FSは、[最終のスクロース]であり、LEは、[ロイクロース]であり、GLは、[グルコース]であり、SOは、[可溶性オリゴマー](グルコ-オリゴ糖)であり、FRは、[フルクトース]である(二重括弧で示された前述の各基質/生成物の濃度は、グラム/L単位であり、例えばHPLCにより測定した際の濃度である)。
(i)置換位置でのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第2のグルコシルトランスフェラーゼのα-グルカン収率よりも高いα-グルカン収率、及び/又は
(ii)第2のグルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに関する。
(i)A510、Q588、F607、R741、D948、R722、T877、M1253、及びK1277;
(ii)A510、Q588、F607、R741、D948、R722、T877、V1188、M1253、及びQ957;
(iii)A510、Q588、F607、R741、D948、T877、V1188、M1253、及びQ957;
(iv)A510、Q588、F607、R741、D948、及びM1253;
(v)A510、Q588、F607、R741、及びD948;
(vi)Q588、F607、R741、及びD948;
(vii)A510、Q588、F607、R741、D948、N628、T635、T877、M1253、F929、及びR1172;
(viii)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、S710、R722、T877、V1188、及びM1253;
(ix)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、S710、R722、T877、及びV1188;
(x)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、S710、T877、V1188、及びM1253;
(xi)A510、Q588、F607、R741、及びD948;
(xii)A510、Q588、F607、R741、D948、及びV1188;
(xiii)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、S710、及びV1188;
(xiv)A510、Q588、F607、R741、D948、S710、R722、T877、及びM1253;
(xv)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、R722、T877、V1188、及びM1253;
(xvi)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、T877、V1188、及びM1253;
(xvii)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、及びV1188;
(xviii)A510、Q588、F607、R741、D948、S631、R722、T877、V1188、及びM1253;又は
(xix)A510、Q588、F607、R741、D948、V1188、及びM1253に対応する。
(xx)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/R722H/T877K/M1253I/K1277N、
(xxi)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/R722H/T877K/V1188E/M1253I/Q957P、
(xxii)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/T877K/V1188E/M1253I/Q957P、
(xxiii)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/M1253I、
(xxiv)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G、
(xxv)Q588L/F607Y/R741S/D948G、
(xxvi)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/N628D/T635A/T877K/M1253I/F929L/R1172C、
(xxvii)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S631T/S710G/R722H/T877K/V1188E/M1253I、
(xxviii)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S631T/S710G/R722H/T877K/V1188E、
(xxix)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S631T/S710G/T877K/V1188E/M1253I、
(xxx)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G、
(xxxi)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/V1188E、
(xxxii)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S631T/S710G/V1188E、
(xxxiii)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S710G/R722H/T877K/M1253I、
(xxxiv)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/S631T/R722H/T877K/V1188E/M1253I、
(xxxv)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S631T/T877K/V1188E/M1253I、
(xxxvi)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/S631T/V1188E、
(xxxvii)A510D/Q588L/F607Y/R741S/D948G/S631T/R722H/T877K/V1188E/M1253I、又は
(xxxviii)A510D/Q588L/F607W/R741S/D948G/V1188E/M1253Iに対応する。
(a)(i)配列番号4又は配列番号4の55~960位と少なくとも約40%同一であるアミノ酸配列を含み、且つ(ii)1,3-結合を含むα-グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定することと;
(b)工程(a)で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Phe-607、及び/又はArg-741に対応する位置で親グルコシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも2つ、又は3つのアミノ酸を置換し、それにより、
(i)親グルコシルトランスフェラーゼのα-グルカン収率よりも高いα-グルカン収率、及び/又は
(ii)親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低いロイクロース収率
を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することと、を含む。
α-グルカン合成に対するグルコシルトランスフェラーゼの選択性に影響を及ぼすアミノ酸部位の分析
本実施例は、スクロースからのα-グルカンの合成に対して向上した選択性を有するグルコシルトランスフェラーゼバリアントに関するスクリーニングについて記載する。このスクリーニングの別の目的は、ロイクロース及びグルコ-オリゴ糖などの副生成物の合成の減少を示すグルコシルトランスフェラーゼバリアントを同定することであった。これらの収率特性のいずれか又は両方を有するバリアントを同定した。
他のグルコシルトランスフェラーゼにおける単一アミノ酸置換の効果の分析
本実施例は、GTF6855(配列番号4)以外のグルコシルトランスフェラーゼの活性における特定の単一アミノ酸置換の効果について記載する。概して、α-グルカン収率及び/又はロイクロース収率に著しい効果を有する実施例1において観察される置換に対応する(又は類似する)置換は、異なるグルコシルトランスフェラーゼに対して類似の効果を与えるのに有用であり得ると思われる。
実施例1は、例えば、配列番号62の607位に対応する位置でのGTF6855(配列番号4)における置換が酵素活性に影響を及ぼしたことを実証した(表3)。特に、Asn又はTrp残基によるPhe残基の置換は両方とも、非置換酵素のそれぞれの収率と比較して、α-1,3グルカン収率(増加)及びロイクロース収率(減少)に対して著しい効果を有した。
実施例1は、例えば、配列番号62の510位に対応する位置でのGTF6855(配列番号4)における置換が酵素活性に影響を及ぼしたことを実証した(表3)。特に、Glu、Ile、又はVal残基によるAla残基の置換の全ては、非置換酵素のそれぞれの収率と比較して、α-1,3グルカン収率(増加)及びロイクロース収率(減少)に対して著しい効果を有した。
α-グルカン合成に対するグルコシルトランスフェラーゼの選択性における2つ以上のアミノ酸置換の効果の分析
本実施例は、グルコシルトランスフェラーゼに対する複数のアミノ酸置換の導入の効果及びα-グルカン合成に対する酵素選択性におけるそれらの効果を決定することについて記載する。
α-グルカン合成に対するグルコシルトランスフェラーゼの選択性における更なるアミノ酸置換組み合わせの効果の分析
本実施例は、グルコシルトランスフェラーゼに対する複数のアミノ酸置換の導入の効果及びα-グルカン合成に対する酵素選択性におけるそれらの効果を決定することについて記載する。この分析は、実施例3で上記に開示した分析を補足するものであるが、いくつかの追加のアミノ酸置換の組み合わせが、更に高いα-1,3-グルカン収率を有する改変されたグルコシルトランスフェラーゼを提供することに注目することは興味深い。
Claims (17)
- 配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Phe-607、又はArg-741に対応する位置での少なくとも2つのアミノ酸置換を含む、非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、
前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、1,3-結合を含むα-グルカンを合成し、
前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、
(i)前記置換位置でのみ前記非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる親グルコシルトランスフェラーゼのα-グルカン収率よりも高い前記α-グルカン収率、及び/又は(ii)前記親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低い前記ロイクロース収率を有し;
前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、
配列番号4の残基55~960と少なくとも90%同一である触媒ドメインを含み;
および
(a)前記アミノ酸残基Gln-588に対応する位置でのアミノ酸置換が、Leu、Ala、若しくはVal残基によるものである;
(b)前記アミノ酸残基Phe-607に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Trp、Tyr、若しくはAsn残基によるものである;及び/又は
(c)前記アミノ酸残基Arg-741に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ser若しくはThr残基によるものである、
非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Phe-607、及びArg-741に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記アミノ酸残基Gln-588、Phe-607、およびArg-741に対応する位置での前記アミノ酸置換が、
(A)それぞれ、Leu、Tyr、およびSer残基によるものである;
(B)それぞれ、Leu、Trp、およびSer残基によるものである;又は
(C)それぞれ、Leu、Tyr、およびThr残基によるものである、
請求項2に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 配列番号62のアミノ酸残基の、前記(A)Gln-588およびPhe-607、または(B)Phe-607およびArg-741、に対応する位置でのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号62のアミノ酸残基Ala-510及び/又はAsp-948に対応する位置で、少なくとも1つのアミノ酸置換を更に含み:
(i)アミノ酸残基Ala-510に対応する前記位置での前記アミノ酸置換が、Asp、Glu、Ile、若しくはVal残基によるものである;及び/又は
(ii)アミノ酸残基Asp-948に対応する前記位置での前記アミノ酸置換が、Gly、Val、若しくはAla残基によるものである、請求項1~4のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号62のアミノ酸残基Ser-631、Ser-710、Arg-722、及び/又はThr-877に対応する位置で、少なくとも1つのアミノ酸置換を更に含み、:
(i)前記アミノ酸残基Ser-631に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Thr、Asp、Glu、若しくはArg残基によるものである;
(ii)前記アミノ酸残基Ser-710に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Gly、Ala、若しくはVal残基によるものである;
(iii)前記アミノ酸残基Arg-722に対応する位置での前記アミノ酸置換が、His若しくはLys残基によるものである、及び/又は
(iv)前記アミノ酸残基Thr-877に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Lys、His、若しくはArg残基によるものである、請求項1~5のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、配列番号62のアミノ酸残基Val-1188、Met-1253、及び/又はGln-957に対応する位置で、少なくとも1つのアミノ酸置換を更に含み:
(i)前記アミノ酸残基Val-1188に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Glu若しくはAsp残基によるものである;
(ii)前記アミノ酸残基Met-1253に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ile、Leu、Ala、若しくはVal残基によるものである;及び/又は
(iii)前記アミノ酸残基Gln-957に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Pro残基によるものである、請求項1~6のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 前記α-グルカンが、不溶性であり、且つ少なくとも50%のα-1,3結合を含み、任意選択的に、前記α-グルカンが、少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する、請求項1~7のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4の残基55~960と少なくとも95%同一である触媒ドメインを含む、請求項8に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項8または9に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、少なくとも90%のα-1,3-結合を有する不溶性α-1,3-グルカンを合成する、請求項1~10のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 請求項1~11のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、1つ以上の調節配列が、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
- 前記1つ以上の調節配列が、プロモーター配列を含む、請求項12に記載のポリヌクレオチド。
- 水、スクロース、及び請求項1~11のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
- α-グルカンを生成する方法であって、
(a)少なくとも水、スクロース、及び請求項1~11のいずれか一項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを接触させ、それにより、α-グルカンを生成させること;および
(b)任意選択的に、工程(a)で生成された前記α-グルカンを単離すること、を含む、方法。 - 非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドをスクリーニングする方法であって、前記方法が、
(a)(i)配列番号4又は配列番号4の55~960位と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、且つ(ii)1,3-結合を含むα-グルカンを合成する、親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を選択すること;ならびに(b)工程(a)で選択された前記ポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Phe-607、又はArg-741に対応する位置で前記親グルコシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも2つのアミノ酸を置換し、それにより、
(i)前記親グルコシルトランスフェラーゼのα-グルカン収率よりも高い前記α-グルカン収率、及び/又は
(ii)前記親グルコシルトランスフェラーゼのロイクロース収率よりも低い前記ロイクロース収率、を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供すること、を含む、方法。 - 前記選択工程が、
(a)in silicoで、
(b)核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
(c)タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、及び/若しくは
(d)タンパク質結合工程を含む方法を用いて、実施され、
並びに/又は前記改変工程が、
(e)in silicoで実施され、その後に前記非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列の合成がおこなわれる、若しくは
(f)前記親グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを用いて実施される、請求項16に記載の方法。
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