JP7384787B2 - 遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Description
配列表の正式なコピーは、2018年9月11日作成の20180911_CL6159WOPCT_SequenceListing_ST25という名称のファイルにより、約315キロバイトのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表としてEFS-Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このASCIIフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(a)(i)配列番号4又は配列番号4の55~960位と少なくとも約40%同一であるアミノ酸配列を含み、且つ(ii)1,3-結合を含む不溶性α-グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定することと;
(b)工程(a)で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号62のアミノ酸残基Asn-531、Arg-534、Thr-563、Glu-567、Val-586、Gln-588、Ile-591、Lys-593、Ile-608、Ala-610、Leu-661、Arg-722、Thr-728、Met-732、Arg-741、Asn-743、Ala-777、Tyr-848又はIle-1453に対応する位置において親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのアミノ酸を置換し、それにより、親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α-グルカンの分子量よりも大きい分子量を有する不溶性α-グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することと
を含む。
1.配列番号62のアミノ酸残基Asn-531、Arg-534、Thr-563、Glu-567、Val-586、Gln-588、Ile-591、Lys-593、Ile-608、Ala-610、Leu-661、Arg-722、Thr-728、Met-732、Arg-741、Asn-743、Ala-777、Tyr-848又はIle-1453に対応する位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、1,3-結合を含む不溶性α-グルカンを合成し、及び不溶性α-グルカンの分子量は、置換位置においてのみ非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なる第2のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α-グルカンの分子量よりも大きい、非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
2.(i)アミノ酸残基Asn-531に対応する位置でのアミノ酸置換は、Gly、Leu又はMet残基によるものであり;(ii)アミノ酸残基Arg-534に対応する位置でのアミノ酸置換は、Lys、Gly、Ile、Leu又はMet残基によるものであり;(iii)アミノ酸残基Thr-563に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ala残基によるものであり;(iv)アミノ酸残基Glu-567に対応する位置でのアミノ酸置換は、Gln残基によるものであり;(v)アミノ酸残基Val-586に対応する位置でのアミノ酸置換は、Thr残基によるものであり;(vi)アミノ酸残基Gln-588に対応する位置でのアミノ酸置換は、Leu残基によるものであり;(vii)アミノ酸残基Ile-591に対応する位置でのアミノ酸置換は、Val、Lys又はArg残基によるものであり;(viii)アミノ酸残基Lys-593に対応する位置でのアミノ酸置換は、Met残基によるものであり;(ix)アミノ酸残基Ile-608に対応する位置でのアミノ酸置換は、Tyr残基によるものであり;(x)アミノ酸残基Ala-610に対応する位置でのアミノ酸置換は、Cys又はThr残基によるものであり;(xi)アミノ酸残基Leu-661に対応する位置でのアミノ酸置換は、Pro残基によるものであり;(xii)アミノ酸残基Arg-722に対応する位置でのアミノ酸置換は、His又はAsn残基によるものであり;(xiii)アミノ酸残基Thr-728に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ser残基によるものであり;(xiv)アミノ酸残基Met-732に対応する位置でのアミノ酸置換は、Leu残基によるものであり;(xv)アミノ酸残基Arg-741に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ser、Ala、Pro、Gln又はThr残基によるものであり;(xvi)アミノ酸残基Asn-743に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ser、Thr又はAsp残基によるものであり;(xvii)アミノ酸残基Ala-777に対応する位置でのアミノ酸置換は、Asn残基によるものであり;(xviii)アミノ酸残基Tyr-848に対応する位置でのアミノ酸置換は、Glu残基によるものであり;及び/又は(xix)アミノ酸残基Ile-1453に対応する位置でのアミノ酸置換は、Gly又はMet残基によるものである、実施形態1の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
3.配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Arg-741又はArg-722に対応する位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、任意選択的に、(i)アミノ酸残基Gln-588に対応する位置でのアミノ酸置換は、Leu残基によるものであり;(ii)アミノ酸残基Arg-741に対応する位置でのアミノ酸置換は、Ser残基によるものであり;及び/又は(iii)アミノ酸残基Arg-722に対応する位置でのアミノ酸置換は、His残基によるものである、実施形態1又は2の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
4.配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Arg-741又はArg-722に対応する位置において2つ以上のアミノ酸置換を含む、実施形態3の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
5.非天然グルコシルトランスフェラーゼによって生成される不溶性α-グルカンは、少なくとも約50%のα-1,3結合を含み、任意選択的に、α-グルカンは、少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する、実施形態1、2、3又は4の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
6.非天然グルコシルトランスフェラーゼによって生成される不溶性α-グルカンは、少なくとも650のDPwを有する、実施形態1、2、3、4又は5の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
7.配列番号4の残基55~960、配列番号65の残基54~957、配列番号30の残基55~960、配列番号28の残基55~960又は配列番号20の残基55~960と少なくとも約90%同一である触媒ドメインを含む、実施形態5又は6の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
8.配列番号4、配列番号65、配列番号30、配列番号28又は配列番号20と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を含む、実施形態5、6又は7の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
9.非天然グルコシルトランスフェラーゼによって生成される不溶性α-グルカンは、少なくとも約90%(又は少なくとも95%)のα-1,3結合を含む、実施形態1、2、3、4、5、6、7又は8の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
10.非天然グルコシルトランスフェラーゼによって生成される不溶性α-グルカンの分子量は、第2のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α-グルカンの分子量よりも少なくとも約10%大きい、実施形態1、2、3、4、5、6、7、8又は9の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
11.実施形態1~10のいずれか1つに記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、1つ以上の調節配列は、ヌクレオチド配列に作動可能に連結され、好ましくは、1つ以上の調節配列は、プロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
12.水、スクロース及び実施形態1~10のいずれか1つに記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
13.不溶性α-グルカンを生成する方法であって、(a)少なくとも水、スクロース及び実施形態1~10のいずれか1つに記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることであって、それにより、不溶性α-グルカンは、生成される、接触させることと;(b)任意選択的に、工程(a)で生成された不溶性α-グルカンを単離することとを含む方法。
14.非天然グルコシルトランスフェラーゼ(例えば、実施形態1~10のいずれか1つの)をコードするポリヌクレオチド配列を調製する方法であって、(a)(i)配列番号4又は配列番号4の55~960位と少なくとも約40%同一であるアミノ酸配列を含み、且つ(ii)1,3-結合を含む不溶性α-グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定することと;(b)工程(a)で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号62のアミノ酸残基Asn-531、Arg-534、Thr-563、Glu-567、Val-586、Gln-588、Ile-591、Lys-593、Ile-608、Ala-610、Leu-661、Arg-722、Thr-728、Met-732、Arg-741、Asn-743、Ala-777、Tyr-848又はIle-1453に対応する位置において親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのアミノ酸を置換し、それにより、親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α-グルカンの分子量よりも大きい分子量を有する不溶性α-グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することとを含む方法。
15.同定工程は、(a)in silicoで、(b)核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、(c)タンパク質シーケンシング工程を含む方法を用いて、且つ/若しくは(d)タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され、及び/又は改変工程は、(e)in silico、続いて非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列の合成において、若しくは(f)親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを用いて実施される、実施形態14に記載の方法。
グルコシルトランスフェラーゼα-グルカン生成物の分子量に影響を及ぼすアミノ酸部位の分析
本実施例は、分子量が増大したα-グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼバリアントに関するスクリーニングについて記載する。本スクリーニングは、部位評価ライブラリ(SEL)を使用して実施した。
より高分子量のα-グルカン生成物を生成するグルコシルトランスフェラーゼバリアントの生成
本実施例は、分子量が増大したα-グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼバリアントに関する別のスクリーニングについて記載する。
グルコシルトランスフェラーゼα-グルカン合成活性におけるアミノ酸置換組み合わせの効果の分析
本実施例は、グルコシルトランスフェラーゼに対する複数のアミノ酸置換の導入の効果及びそのα-グルカン合成機能におけるそれらの効果を決定することについて記載する。この分析は、例えば、α-グルカン生成物の分子量を増大させるために上記で同定されたアミノ酸置換が、同様にこの分子量の増大を付与する置換組み合わせに含まれ得ることを示す。
Claims (15)
- 配列番号62のアミノ酸残基Asn-531、Arg-534、Thr-563、Gln-588、Ile-591、Lys-593、Ile-608、Ala-610、Leu-661、Arg-722、Thr-728、Met-732、Arg-741、Tyr-848又はIle-1453に対応する位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、1,3-結合を含む不溶性α-グルカンを合成し、配列番号4の残基55~960と少なくとも90%同一である触媒ドメインを含み、
(i)アミノ酸残基Asp-531に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Gly、Leu又はMet基によるものであり;
(ii)アミノ酸残基Arg-534に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Lys、Gly、Ile、Leu又はMet残基によるものであり;
(iii)アミノ酸残基Thr-563に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ala残基によるものであり;
(iv)アミノ酸残基Gln-588に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Leu残基によるものであり;
(v)アミノ酸残基Ile-591に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Val、Lys又はArg残基によるものであり;
(vi)アミノ酸残基Lys-593に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Met残基によるものであり;
(vii)アミノ酸残基Ile-608に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Tyr残基によるものであり;
(viii)アミノ酸残基Ala-610に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Cys又はThr残基によるものであり;
(ix)アミノ酸残基Leu-661に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Pro残基によるものであり;
(x)アミノ酸残基Arg-722に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、His又はAsn残基によるものであり;
(xi)アミノ酸残基Thr-728に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ser残基によるものであり;
(xii)アミノ酸残基Met-732に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Leu残基によるものであり;
(xiii)アミノ酸残基Arg-741に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Ser、Ala、Pro、Gln又はThr残基によるものであり;
(xiv)アミノ酸残基Tyr-848に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Glu残基によるものであり;及び/又は
(xv)アミノ酸残基Ile-1453に対応する前記位置での前記アミノ酸置換は、Gly又はMet基によるものである、非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Arg-741又はArg-722に対応する位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号62のアミノ酸残基Gln-588、Arg-741又はArg-722に対応する位置において2つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項2に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α-グルカンは、少なくとも50%のα-1,3結合を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α-グルカンは、少なくとも100のDPwを有する、請求項1~4のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α-グルカンは、少なくとも650のDPwを有する、請求項5に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4の残基55~960と少なくとも95%同一である触媒ドメインを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項8に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α-グルカンは、少なくとも90%のα-1,3結合を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、1つ以上の調節配列が、前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、ポリヌクレオチド。
- 前記1つ以上の調節配列がプロモーター配列を含む、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- 水、スクロース及び請求項1~10のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
- 不溶性α-グルカンを生成する方法であって、
少なくとも水、スクロース及び請求項1~10のいずれか1項に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることであって、それにより、不溶性α-グルカンは、生成される、接触させること
を含む方法。 - 前記不溶性α-グルカンを単離することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
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