CN110651049A - α-1,3-葡聚糖的酶促生产 - Google Patents
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- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
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Abstract
公开了一种用于生产不溶性α‑1，3‑葡聚糖的方法。所述方法的实施例包括提供(i)包含α‑1，3和α‑1，6糖苷键的低聚糖，或(ii)衍生自葡糖基转移酶反应的低聚糖；和至少接触水、蔗糖、葡糖基转移酶、和在第一步骤中提供的低聚糖。还公开了体现此类方法的葡糖基转移酶反应组合物、及其不溶性产物。当实践所公开的主题时，可实现产率和其他的产物益处。
Description
本申请要求美国临时申请号62/509,915(2017年5月23日提交)和62/519,217(2017年6月14日提交)的权益，这两个申请以其全文通过引用并入本文。
技术领域
本公开属于酶促过程的领域。例如，本公开涉及包含添加的低聚糖的葡糖基转移酶反应。
以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20180522_CL6007WOPCT_SequenceListing，创建于2018年5月18日，且具有约157千字节的大小，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
背景技术
受到在多种应用中使用多糖的期望所驱动，研究人员已经探索了可生物降解的、并且可以从可再生来源的原料节约地制造的多糖。一种这样的多糖是α-1，3-葡聚糖，这种多糖是特征在于具有α-1，3-糖苷键的不溶性葡聚糖聚合物。例如，已经使用从唾液链球菌(Streptococcus salivarius)分离的葡糖基转移酶制备了这种聚合物(Simpson等人，Microbiology[微生物学]141：1451-1460，1995)。还例如，美国专利号7000000公开了从酶促生产的聚α-1，3-葡聚糖制备纺成纤维。
在反应中进行了各种葡聚糖聚合物的酶促合成，其中已经添加了多糖(例如，右旋糖酐)或低聚糖(例如，来自水解的多糖)来影响葡糖基转移酶功能(例如，Koga等人，1983，J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]129：751-754；Komatsu等人，2011，FEBSJ.[FEBS杂志]278：531-540；Simpson等人；O'Brien等人，美国专利号8642757)。尽管有这些公开，对于调节葡糖基转移酶反应以用于不溶性α-1，3-葡聚糖合成的了解是很少的。
发明内容
在一个实施例中，本公开涉及一种用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：
(a)提供低聚糖，所述低聚糖：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)产生自葡糖基转移酶反应；
(b)至少接触水、蔗糖、低聚糖、和合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶，
其中产生了不溶性α-1，3-葡聚糖；以及
(c)任选地，分离在步骤(b)中产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖。
在另一个实施例中，本公开涉及用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的反应组合物，所述反应组合物至少包含水、蔗糖、合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶、和低聚糖，其中所述低聚糖在制备反应组合物期间添加并且(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或(ii)产生自葡糖基转移酶反应，其中不溶性α-1，3-葡聚糖在反应组合物中产生。
在另一个实施例中，本公开涉及包含不溶性α-1，3-葡聚糖的组合物，所述不溶性α-1，3-葡聚糖是根据本文所述的任何生产不溶性α-1，3-葡聚糖的方法产生的。
附图说明
图1：浓缩的低聚糖制剂的1H-NMR谱(参见实例2)。
图2：该图示出在三个连续的反应中制备的每个α-1，3-葡聚糖产物的水性浆液粘度，其中第二和第三反应包含分别衍生自第一和第二反应的滤液(参见实例10)。方块、圆圈和菱形分别说明用在第一、第二和第三反应中产生的α-1，3-葡聚糖的水性浆液获得的粘度测量值。剪切速率单位为1/s(示出为“s-1”)。
表1.核酸和蛋白质序列识别号的总结
a将该DNA编码序列进行密码子优化用于在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且仅公开为合适编码序列的实例。
具体实施方式
所有引用的专利和非专利文献的公开内容以其全文通过引用并入本文。
除非另有公开，否则如本文中所用的术语“一个/一种”旨在涵盖一个/一种或多个/多种(即至少一个/一种)所引用的特征。
如果存在，所有范围是包含性的和可组合的，除非另有说明。例如，当列举“1至5”的范围时，所列举的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。
除非另有说明，否则本文使用的术语“糖类”是指单糖和/或二糖/低聚糖。本文中的“二糖”是指具有通过糖苷键连接的两个单糖的碳水化合物。本文的“低聚糖”可指具有例如通过糖苷键连接的2至15个单糖的碳水化合物。低聚糖也可以被称为“低聚物”。包含在二糖/低聚糖内的单糖(例如，葡萄糖和/或果糖)可以被称为“单体单元”、“单糖单元”或其他类似术语。
术语“α-葡聚糖”、“α-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-葡聚糖是包含通过α-糖苷键连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物。在典型的实施例中，本文中的α-葡聚糖包含至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的α-糖苷键。α-1，3-葡聚糖是α-葡聚糖的实例。
术语“α-1，3-葡聚糖”、“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换地使用。α-1，3-葡聚糖是包含通过糖苷键(即，葡糖苷键)连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物，典型地其中至少约50％的糖苷键是α-1，3-糖苷键。在某些实施例中，α-1，3-葡聚糖包含至少约90％或95％的α-1，3糖苷键。本文中α-1，3-葡聚糖中的大部分键或全部其他键典型地是α-1，6，尽管一些键还可以是α-1，2和/或α-1，4。
术语“糖苷键(glycosidic linkage和glycosidic bond)”、“键(linkage)”等在本文中可互换地使用并且是指将碳水化合物(糖类)分子彼此连接的共价键类型。本文中所公开的所有糖苷键都是α-糖苷键，除非另有说明。“葡糖苷键”是指α-D-葡萄糖和另一碳水化合物分子之间的糖苷键。本文中的“α-D-葡萄糖”也将被称为“葡萄糖”。本文中的术语“α-1，3葡糖基-葡萄糖键”、“α-1，3葡萄糖-葡萄糖键”和“葡萄糖-α1，3-葡萄糖”是指α-1，3糖苷键。本文中的术语“α-1，6葡糖基-葡萄糖键”、“α-1，6葡萄糖-葡萄糖键”和“葡萄糖-α1，6-葡萄糖”是指α-1，6糖苷键。
本文中的任何多糖(例如，α-1，3-葡聚糖、低聚糖)的糖苷键谱图可以使用本领域已知的任何方法来测定。例如，可以使用采用核磁共振(NMR)波谱法(例如，13C NMR或1HNMR)的方法确定键谱图。可以使用的这些和其他方法公开于例如，Food Carbohydrates： Chemistry，Physical Properties，and Applications[食品碳水化合物：化学、物理特性和 应用](S.W.Cui编，第3章，S.W.Cui，Structural Analysis of Polysaccharides[多糖的结构分析]，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton，FL[佛罗里达州波卡拉顿的泰勒与弗朗西斯基团有限公司]，2005)中，其通过引用并入本文。
本文中大α-葡聚糖聚合物的“分子量”可以表示为重均分子量(Mw)或数均分子量(Mn)，其单位为道尔顿或克/摩尔。可替代地，大α-葡聚糖聚合物的分子量可以被表示为DPw(重均聚合度)或DPn(数均聚合度)。如果需要，较小α-葡聚糖聚合物(例如低聚糖)的分子量可以典型地以“DP”(聚合度)提供，该分子量仅指α-葡聚糖内包含的葡萄糖的数量。用于计算这些不同分子量测量值的各种手段在本领域中是已知的，例如采用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)。
术语“葡糖基转移酶(glucosyltransferase)”、“葡糖基转移酶(glucosyltransferase enzyme)”、“GTF”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文中可互换地使用。本文中的葡糖基转移酶的活性催化底物蔗糖的反应以制成产物α-葡聚糖和果糖。葡糖基转移酶反应的其他产物(副产物)可以包括葡萄糖、各种可溶性葡萄糖-低聚糖、和明串珠菌二糖。葡糖基转移酶的野生型形式典型地含有(在N-末端至C-末端方向上)信号肽(通常被裂解过程除去)、可变结构域、催化结构域和葡聚糖-结合结构域。根据CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(Cantarel等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]37：D233-238，2009)，将本文中的葡糖基转移酶分类在糖苷水解酶家族70(GH70)下。
本文中的术语“葡糖基转移酶催化结构域”是指为葡糖基转移酶提供α-葡聚糖合成活性的葡糖基转移酶的结构域。典型地，葡糖基转移酶催化结构域不需要存在任何其他的结构域以具有此活性。
术语“酶促反应”、“葡糖基转移酶反应”、“葡聚糖合成反应”、“反应组合物”“反应制剂”等在本文中可互换地使用，并且通常指最初包含水、蔗糖、至少一种活性葡糖基转移酶和任选的其他组分的反应。典型地在葡糖基转移酶反应开始后可以进一步存在于该反应中的组分包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性葡萄糖-低聚糖(例如，DP2-DP7)(这类糖可以被认为是基于使用的葡糖基转移酶的产物或副产物)、和/或DP8或更高(例如，DP100和更高)的一种或多种不溶性α-葡聚糖产物。应当理解的是，具有聚合度(DP)为至少8或9的某些葡聚糖产物(如α-1，3-葡聚糖)是水不溶性的(“不溶性α-1，3-葡聚糖”)，并因此不溶解于葡聚糖合成反应，而是可能存在于溶液之外(例如，由于从反应中沉淀出来)。在葡聚糖合成反应中，进行了使水、蔗糖和葡糖基转移酶接触的步骤。如本文所使用的术语“在合适的反应条件下”是指通过葡糖基转移酶活性支持将蔗糖转化为一种或多种α-葡聚糖产物的反应条件。
本文中所使用的“对照”反应可是指如下的葡糖基转移酶反应，在所述反应中，没有直接向所述反应添加包含(共同包含)α-1，3和α-1，6糖苷键的低聚糖。对照反应溶液的所有其他特征(例如，蔗糖浓度、温度、pH、GTF类型)可以其与之进行比较的反应组合物的那些相同。
本文的溶液(例如可溶性级分、水性组合物)的“干固体百分比”(百分比DS)是指溶解在溶液中的所有材料(即固体)的wt％。例如，具有10wt％的DS的100g溶液包含10g的溶解材料。
在某些实施例中，通过葡糖基转移酶反应产生的α-1，3-葡聚糖的“产率”表示在反应中转化的被表达为蔗糖底物的重量百分比的α-1，3-葡聚糖产物的重量。例如，如果将反应溶液中的100g蔗糖转化成产物，并且10g产物是α-1，3-葡聚糖，那么α-1，3-葡聚糖的产率为10％。在一些方面中，通过葡糖基转移酶反应产生的α-1，3-葡聚糖的“产率”表示基于转化的蔗糖的摩尔产率。可以基于α-葡聚糖产物的摩尔数除以转化的蔗糖的摩尔数来计算α-葡聚糖产物的摩尔产率。转化的蔗糖的摩尔数可以按如下计算：(初始蔗糖的质量-最终蔗糖的质量)/蔗糖的分子量[342g/mol]。这些产率计算(基于重量或摩尔的产率)可以被看作是反应对α-1，3-葡聚糖的选择性的测量值。在一些方面，葡糖基转移酶反应中α-葡聚糖产物的“产率”可以基于该反应的葡糖基组分。可以使用以下公式测量这样的产率(基于葡糖基的产率)：
α-葡聚糖产率＝((IS/2-(FS/2+LE/2+GL+SO))/(IS/2-FS/2))x 100％。
可以测量葡糖基转移酶反应的果糖平衡以确保HPLC数据(如果适用)不超出范围(90％-110％被认为是可接受的)。可以使用以下公式测量果糖平衡：
果糖平衡＝((180/342x(FS+LE)+FR)/(180/342x IS))x 100％。
在以上两个公式中，IS是[初始蔗糖]，FS是[最终蔗糖]，LE是[明串珠菌二糖]，GL是[葡萄糖]，SO是[可溶性低聚物](葡萄糖-低聚糖)，以及FR是[果糖](所有浓度以克/L为单位，并且如例如通过HPLC所测量的)。
如本文所使用的术语“相对反应速率”是指特定葡聚糖合成反应相比另一葡聚糖合成反应的速率。例如，如果反应A具有x的速率，并且反应B具有y的速率，那么相对于反应B的反应速率，反应A的相对反应速率可以表达为x/y(x除以y)。术语“反应速率”和“反应的速率”在本文中可互换使用以指每单位时间每单位酶的一个或多个反应物的浓度/量的变化或一个或多个产物的浓度/量的变化。鉴于已知GTF酶遵循米-曼氏(Michaelis-Menten)动力学，典型地在聚合开始的时候测量这些速率，这时候蔗糖的量远远高于酶的Km。在这种情况下，当在反应中蔗糖的量高于至少约50g/L蔗糖时，典型地测量该速率。葡聚糖合成反应的本文中的优选的反应物和产物分别是蔗糖和α-1，3-葡聚糖。
本文中的葡糖基转移酶反应的“可溶性级分”或“可溶性部分”是指葡糖基转移酶反应的液体溶液部分。可溶性级分可以是来自葡糖基转移酶反应的液体溶液的一部分或全部，并且典型地已经从在所述反应中合成的不溶性葡聚糖产物中分离。可溶性级分可以可替代地称为“母液”。可溶性级分的实例是葡糖基转移酶反应的滤液。因为可溶性级分可含有溶解糖类，例如蔗糖、果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性葡萄糖-低聚糖，级分还可称为衍生自葡糖基转移酶反应的“混合的糖溶液”。本文中的可溶性级分在其获得后可保持不处理，或可替代地，将其经受如本文公开的一个或多个处理步骤。
术语“滤液”、“葡聚糖反应滤液”等在本文中可互换使用并且是指从在葡糖基转移酶反应中合成的不溶性葡聚糖产物中过滤掉的可溶性级分。
术语“按体积计百分比(percent by volume)”、“体积百分比(volume percent)”、“体积％(vol％)”、“体积/体积％(v/v％)”等在本文中可互换地使用。溶质在溶液中的按体积计百分比可以使用下式确定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。
术语“按重量计百分比(percent by weight)”、“重量百分比(weightpercentage，wt％)”、“重量-重量百分比(weight-weight percentage，％w/w)”等在本文中可互换地使用。按重量计重量比是指当材料包含在组合物、混合物、或溶液中时，该材料在质量基础上的百分比。
本文中的术语“水性条件”等术语是指其中溶剂为例如至少约60wt％的水的溶液或混合物。本文中的葡糖基转移酶反应在水性条件下进行。
“不溶性的”、“水性不溶性的”、“水-不溶性的”葡聚糖(和相似的术语)(例如，不溶性α-1，3-葡聚糖)在水中或其他水性条件下不溶解(或不明显地溶解)，任选地其中所述水性条件的进一步特征是具有4-9(例如，6-8)的pH和/或约1℃至85℃(例如，20℃-25℃)的温度。相比之下，葡聚糖例如本文中的某些“可溶性”、“水性可溶性”、“水-可溶性”的低聚糖等在这些条件下明显地溶解。
本文中的“水性组合物”具有包含例如至少约10wt％水(例如，液体组分可以是至少约70％、80％、90％、95％水、或100％水)的液体组分。水性组合物的实例包括例如混合物、溶液、分散体(例如胶体分散体)、悬浮液和乳液。在某些实施例中，水性组合物包含如本文中所生产的α-1，3-葡聚糖，其在水性组合物中混合(例如，通过均质化)或溶解(例如，通过在苛性水性条件溶解，例如，在至少11.0的pH[如使用碱性溶质例如像NaOH或KOH所提供的])。本文中的“非水性组合物”可以是“干的”(例如，包含不超过2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05、或0.01wt％水)和/或包含非水性液体组分(例如，可溶解α-1，3-葡聚糖的有机液体，例如N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)/0.5％-5％LiCl)。
本文中的术语“纯化的”可表征低聚糖制剂，其包含不超过25％(以干重计)的不被低聚糖的上述定义包含的糖类和/或其他无盐/无缓冲液材料。如所述定义所暗示，纯化的低聚糖制剂可以任选地包含盐和/或缓冲液，其任一者的水平不决定低聚糖纯度。本文中的术语“未纯化的”可表征低聚糖制剂，其包含超过25％(以干重计)的不被低聚糖的上述定义包含的糖类和/或其他无盐/无缓冲液材料。
如本文中所使用，术语“粘度”是指流体(水性或非水性)抵抗趋于导致其流动的力的程度的测量值。本文可以使用的各种粘度单位包括例如厘泊(cP、cps)和帕斯卡秒(Pa·s)。一厘泊是一泊的百分之一；一泊等于0.100kg·m-1·s-1。在一些方面，粘度可以报告为“本征粘度”(IV、η、mL/g的单位)；该术语是指葡聚糖聚合物对包含葡聚糖聚合物的液体(例如，溶液)的粘度贡献的量度。
如本文中所使用的术语“增加的”可以是指比该增加的量或活性与之进行比较的量或活性多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、50％、100％、或200％的量或活性。术语“增加的”、“提高的”、“增强的”、“大于”、“改进的”等在本文中可互换地使用。例如，可以将这些术语用于表征编码蛋白质的多核苷酸的“过表达”或“上调”。
如本文中所使用的，关于本文中的多核苷酸或多肽序列的术语“序列同一性”、“同一性”等是指在两个序列中的核酸残基或氨基酸残基当在指定的比较窗口上比对最大对应度时是相同的。因此，“序列同一性百分比”、“百分比同一性”等是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)比较两个序列的最佳比对时，该多核苷酸或多肽序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比。应当理解的是，当计算DNA序列和RNA序列之间的序列同一性时，DNA序列的T残基与RNA序列的U残基比对，并且可以被认为与其“同一”。出于确定第一和第二多核苷酸的“百分比互补性”的目的，可以通过确定(i)第一多核苷酸和第二多核苷酸的补体序列之间的百分比同一性(或反之亦然)，例如和/或(ii)将产生规范的沃森和克里克碱基对的第一和第二多核苷酸之间的碱基百分比来获得。
百分比同一性可以通过任何已知的方法容易地确定，包括但不限于以下文献中所述的那些：1)Computationl Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk，A.M.编辑)牛津大学：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects[生物计算：信息学 和基因组项目](Smith，D.W.编辑)学术出版社(Academic)：NY(1993)；3)Computer Ahalysis of Sequence Data，Part I[序列数据的计算机分析，第一部分](Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)胡玛纳出版社(Humana)：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析](von Heinje，G.编辑)Academic(1987)；和5)Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov，M.和Devereux，J.，编辑)斯托克顿出版社(Stockton)：NY(1991)，将这些文献全部通过引用并入本文。
用于确定百分比同一性的优选方法被设计为在测试序列之间给出最佳匹配。例如，确定同一性和相似性的方法被编入公共可用的计算机程序中。例如，序列比对和百分比同一性计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR公司，麦迪逊(Madison)，威斯康星州)的MEGALIGN程序进行。例如，可以使用Clustal比对方法进行序列的多重比对，所述Clustal比对方法涵盖几种算法，包括Clustal V比对方法(描述于以下文献中：Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]，8：189-191(1992))，并在LASERGENE生物信息学计算套件的MEGALIGN v8.0程序(DNASTAR公司)中找到。对于多重比对，默认值可能对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10和空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10。使用Clustal方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可以为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5、以及存储的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。对于核酸，这些参数可以是KTUPLE＝2、空位罚分＝5、窗口＝4、以及存储的对角线＝4。此外，可以使用Clustal W比对方法(描述于以下文献中：Higgins和Sharp，CABIOS.[计算机在生物学中的应用]5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学]，8：189-191(1992)；Thompson，J.D.等人，Nucleic Acids Research[核酸研究]，22(22)：4673-4680，1994)，并在LASERGENE生物信息学计算套件的MEGALIGN v8.0程序(DNASTAR公司)中找到。用于多重比对(蛋白质/核酸)的默认参数可以是：空位罚分＝10/15、空位长度罚分＝0.2/6.66、延迟发散序列(Delav Divergen Seqs)(％)＝30/30、DNA转换权重＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列、DNA权重矩阵＝IUB。
作为某些实施例的特征，本文公开了各种多肽氨基酸序列和多核苷酸序列。可以使用或引用与本文公开的序列具有至少约70％-85％、85％-90％、或90％-95％同一性的这些序列的变体。可替代地，变体氨基酸序列或多核苷酸序列可以与本文公开的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体氨基酸序列或多核苷酸序列具有所公开的序列的相同功能/活性，或具有所公开的序列的功能/活性的至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能/活性。典型地，本文公开的不以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以在氨基酸序列的N-末端进一步包含至少一个起始甲硫氨酸。相反，本文公开的以甲硫氨酸开始的任何多肽氨基酸序列可以任选地缺少这种甲硫氨酸残基。
据信本文所公开的所述组合物(例如，在某些实施例中，不溶性α-1，3-葡聚糖)和葡糖基转移酶反应/方法是合成的和非天然存在的。因此，本文中的此类方面可任选地表征为“分离的”，这意味着例如它们可以按在自然中不存在的方式进行。进一步据信，上述主题的性质/作用不是自然存在的。
现公开了当将某些低聚糖用于葡糖基转移酶反应以产生不溶性α-1，3-葡聚糖时，可以实现产率和其他的产物益处。
本公开的实施例涉及用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的方法。所述方法包括：
(a)提供低聚糖，所述低聚糖：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)产生自葡糖基转移酶反应；以及
(b)至少接触水、蔗糖、葡糖基转移酶、和在步骤(a)中提供的低聚糖。在该方法中产生了不溶性α-1，3-葡聚糖。在某些实施例中，相比于如果在没有步骤(a)中提供的低聚糖的情况下进行步骤(b)时已经产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率，不溶性α-1，3-葡聚糖产物的产率提高了。本方法的步骤(b)中产生的不溶性α-1，3-葡聚糖可以是任选地分离的。
显著地，本文公开了包含α-1，3和α-1，6糖苷键的低聚糖以调节产生不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的活性。此类低聚糖可任选地衍生为如本文公开的葡糖基转移酶反应的副产物。因此，在某些实施例中，所公开的方法表示再循环葡糖基转移酶反应的低聚糖副产物的有利方法。本文中还显著的是即使在以未纯化的状态下提供，例如，在从葡糖基转移酶反应中获得的滤液中提供，低聚糖副产物可用于调节葡糖基转移酶活性。
在某些实施例中，本公开的低聚糖包含α-1，3糖苷键和α-1，6糖苷键。例如，本文中的低聚糖可包含约60％-99％、60％-95％、70％-90％、或80％-90％的α-1，3糖苷键，和约1％-40％、5％-40％、10％-30％、或1％-10％的α-1，6糖苷键。尽管如此，在一些方面，低聚糖可包含约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％(或这些值中的任意两个之间的范围)的α-1，3糖苷键，和约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、或40％(或这些值中的任意两个之间的范围)的α-1，6糖苷键。此类键谱图可表征本文的任何分子量的低聚糖(例如，DP2-7、DP2-8、DP2-9、或DP2-10)。前述键谱图可任选地表征葡萄糖-低聚糖。
本文的低聚糖可例如“共同包含”前述键谱图中的任一个。“共同包含”意味着各种低聚糖的混合物的键谱图是基于所述组合物中出现的全部键的组合。本文中使用的低聚糖可因此包括仅含有α-1，3糖苷键、仅含有α-1，6糖苷键、和/或含有α-1，3和α-1，6糖苷键的特定低聚糖种类，只要存在的全部低聚糖种类的总键谱图属于任何前述键谱图(例如，约78％α-1，3键和约22％α-1，6键、或约87-88％α-1，3键和约7％α-1，6键)。在某些方面，低聚糖不包含/共同包含100％α-1，3糖苷键或100％α-1，6糖苷键。
本文中的葡萄糖-低聚糖优选地含有大部分α-1，3和α-1，6糖苷键。例如，低聚糖的总键的至少约95％、96％、97％、98％、99％、或100％是α-1，3和α-1，6糖苷键。其他的键，如果存在于低聚糖，可以是例如α-1，4(例如，≤1.5％或1％)或α-1，2(例如，≤1％或0.7％)糖苷键。
在一些方面，本文中的低聚糖可具有2至15的聚合度(DP)。作为实例，所述低聚糖可具有的2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11、2-12、2-13、2-14、或2-15的DP。如本领域将理解的，本文中的低聚糖的组可以关于DP数量或范围来参比，其指定了所述组中的单个低聚糖种类的单体单元的数量或范围。例如，DP2-7的低聚糖典型地包含DP2、DP3、DP4、DP5、DP6和DP7低聚糖的混合物。前述低聚糖可任选地称为葡萄糖-低聚糖。
在用于提供本文的低聚糖的组合物中的低聚糖的分布可以变化。例如，包含DP 2-7的低聚糖的组合物可包含具有与表5中如下公开的相同或相似的分布谱的低聚糖。因此，包含DP2-7的低聚糖的组合物可包含，基于组合物的糖类组分或以干重计，例如，约5-15wt％(例如，约9-11wt％)的DP2、约19-29wt％(例如，约23-25wt％)的DP3、约27-37wt％(例如，约31-33wt％)的DP4、约15-25wt％(例如，约19-21wt％)的DP5、约3-13wt％(例如，约7-9wt％)的DP6、和约1至10 wt％(例如，约4-6wt％)的DP7的低聚糖。在一些方面，包含DP2-7的低聚糖的组合物可包含具有与表16中如下公开的相同或相似的分布谱的低聚糖。因此，包含DP2-7的低聚糖的组合物可包含，基于组合物的糖类组分或以干重计，例如，约6-16wt％(例如，约10-12wt％)的DP2、约18-28wt％(例如，约22-24wt％)的DP3、约23-33wt％(例如，约27-29wt％)的DP4、约16-26wt％(例如，约20-22wt％)的DP5、约7-17wt％(例如，约11-13wt％)的DP6、和约1至10wt％(例如，约4-6wt％)的DP7的低聚糖。据信，准确的DP分布对于本公开是不关键的；其他分布应该提供本文所述的相同的行为。
在本公开的某些实施例中，所述低聚糖可以是纯化的或未纯化的。可以使用本领域任何合适的方法提供纯化的低聚糖，例如通过如以下实例中公开的色谱法或通过遵循欧洲专利公开号EP 2292803B1的公开，其通过引用并入本文中。例如，可以干燥的形式或水性形式(水性溶液)提供纯化的低聚糖，其各自还可任选地含有一种或多种盐(例如，NaCl)和/或缓冲液。在某些实施例中，纯化的低聚糖制剂可包含小于约25、20、15、10、5、2.5、2、1.5、1.0、0.5、或0.1wt％的(i)不被如本文公开的低聚糖的定义包含的糖类(例如，本文中的低聚糖不是单糖或DP11+糖类)和/或(ii)其他的无盐/无缓冲液材料。
未纯化的低聚糖可用于本公开的在某些实施例中。未纯化的低聚糖制剂可包含例如，超过约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或95％wt％的不被如本文公开的低聚糖的定义包含的糖类和/或其他的无盐/无缓冲液材料。本文的未纯化的低聚糖制剂的实例是来自葡糖基转移酶反应的可溶性级分(例如，滤液)。可存在于本文的可溶性级分中的其他的“无盐/无缓冲液材料”包括例如蔗糖、果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、和葡糖基转移酶蛋白质。
所公开的方法的步骤(a)中提供的低聚糖可以产生自(“衍生自”，源自或获得自)葡糖基转移酶反应。例如，所述低聚糖可以是葡糖基转移酶反应的副产物。此类的副产物可以来自在某些实施例中合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶反应。
本文中低聚糖可从中产生的葡糖基转移酶反应通常是指至少包含蔗糖、水和一种活性葡糖基转移酶、和任选地其他组分的水性组合物。在葡糖基转移酶反应中可以有的其他的组分至少包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、和葡萄糖-低聚糖。应当理解的是，某些葡聚糖产物，例如具有至少8或9的DP的α-1，3-葡聚糖，可以是水-不溶性并且因此在葡糖基转移酶反应中不溶解，而是存在于溶液之外。因此，本文中的低聚糖可衍生自产生不溶性葡聚糖产物(例如，α-1，3-葡聚糖)的葡糖基转移酶反应。
可衍生低聚糖的葡糖基转移酶反应可包含葡糖基转移酶中的一个或多个以下类型：产生具有至少50％的α-1，3糖苷键的α-1，3-葡聚糖的GTF(例如，本文公开的GTF也可在所公开的方法本身中用作GTF)、齿斑葡聚糖蔗糖酶(mutansucrase)、葡聚糖蔗糖酶、罗伊氏蔗糖酶(reuteransucrase)、交替蔗糖酶。在某些实施例中，低聚糖来自如下反应，所述反应包含产生不溶性α-1，3-葡聚糖的仅一种或两种葡糖基转移酶。
本文中的低聚糖典型地衍生自如下阶段的葡糖基转移酶反应，在所述阶段，所述反应中已经形成了副产物低聚糖。整个聚合反应过程中形成了低聚糖。例如，低聚糖可来自葡糖基转移酶反应，所述反应只是部分完成至将近完成(例如，80％至90％完成)或已完成(例如＞95％完成)，其中完成被定义为消耗的蔗糖的量除以进料至聚合作用的蔗糖的总量。
在本公开的某些实施例中低聚糖可以作为葡糖基转移酶反应的可溶性级分来提供。本文中的可溶性级分可以是处理的或未处理的。可溶性级分可以是来自葡糖基转移酶反应的液体溶液的一部分或全部。典型地，可溶性级分从在反应中合成的一种或多种固体葡聚糖产物中分离；这适用于在水中不溶性的葡聚糖产物，例如α-1，3-葡聚糖，这些产物在其合成期间从溶液中析出。在本公开的某些实施例中可溶性级分来自产生α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶反应。然而，可溶性级分可任选地来自不产生不溶性葡聚糖产物(例如，右旋糖酐)的葡糖基转移酶反应。
在某些实施例中，收集的可溶性级分(在任选地处理可溶性级分之前，参见如下)的体积可以是从其获得的葡糖基转移酶反应的体积的至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。典型地，在产生不溶性葡聚糖(例如，α-1，3-葡聚糖)的葡糖基转移酶反应中，所述可溶性级分将是反应的液体溶液组分的一部分(不是全部)。可溶性级分可以在葡糖基转移酶反应的一个阶段获得，在这一阶段中所述反应中形成了副产物低聚糖。例如，可溶性级分可以来自仅部分完成至将近完成(例如，80％至90％完成)或已完成(例如＞95％完成)的葡糖基转移酶反应。
在某些实施例中，葡糖基转移酶反应的可溶性级分的实例包括滤液和上清液。因此，可以使用漏斗、过滤器(例如，表面过滤器如转筒真空过滤机、错流过滤器、筛滤器、带式过滤器、螺杆式压机、或具有或不具有膜挤压能力的压滤机；或深度过滤器如砂滤器)、离心机和/或本领域已知的允许从固体中除去一些或全部液体的任何其他方法或设备从葡糖基转移酶反应中获得(分离)本文的可溶性级分。例如，过滤可以通过重力、真空或压滤。过滤优选地除去全部或大部分不溶性葡聚糖；可以使用具有足以从液体中除去固体的平均孔径(例如，约10微米-50微米)的任何过滤材料(例如布、金属筛网或滤纸)。可溶性级分典型地保留其全部或大部分溶解的组分，例如葡糖基转移酶反应中的某些副产物。本文中的滤液或上清液可来自在某些实施例中合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶反应。
如果需要，可以处理本文的可溶性级分。本文中的处理的实例包括稀释、浓缩、水解处理、pH改变、盐改变、和/或缓冲液改变。处理还可包括灭活(例如，热灭活)从其中获得可溶性级分的葡糖基转移酶反应中使用的一种或多种葡糖基转移酶。可以使用本领域已知的适用于浓缩溶液的任何方法或设备来进行可溶性级分的浓缩。例如，可通过蒸发，例如用旋转蒸发器(例如，约40℃-50℃的温度)浓缩可溶性级分。其他合适类型的蒸发设备包括强制循环蒸发器或降膜蒸发器。本文中的可溶性级分可浓缩至如下的体积，该体积是例如原始可溶性级分体积的约或小于约75％、80％、85％、90％、或95％。浓缩的可溶性级分(例如浓缩的滤液)可以任选地称为糖浆。
本文中的可溶性级分可任选地使用水解处理来处理。水解处理可以是酶促处理，其中所述可溶性级分用例如一种或多种水解酶来处理。水解酶可以是例如水解葡糖基转移酶反应的一种或多种副产物(例如，明串珠菌二糖)的水解酶。本文中的有用的水解酶的实例包括α-葡糖苷酶例如转葡糖苷酶(EC2.4.1.24)(“EC”是指酶委员会编号)和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)。用这些酶中的任一种处理葡糖基转移酶反应的可溶性级分的方法公开于美国专利申请公开号2015/0240278和2015/0240279中，其通过引用并入本文中。
如果需要，本文中的可溶性级分可以是未处理的。未处理的可溶性级分是如下：其中所述级分(或级分的一部分)从葡糖基转移酶反应中分离并且在所公开的方法中使用，而在分离所述可溶性级分之后，不经任何类型的修饰/处理。未处理的可溶性级分的实例包括纯的滤液和纯的上清液。
在本公开的某些优选的实施例中，可溶性级分来自α-1，3-葡聚糖合成反应；此类的可溶性级分任选地是滤液。本文的α-1，3-葡聚糖合成反应的可溶性级分至少包含水、果糖和一种或多种类型的糖类(明串珠菌二糖和/或葡萄糖-低聚糖例如DP2-DP7)。可在此类型的可溶性级分中存在的其他组分包括例如蔗糖(即，在葡糖基转移酶反应中未消耗的残余的蔗糖)、一种或多种葡糖基转移酶、葡萄糖、缓冲液、盐、
硼酸盐、氢氧化钠、盐酸、细胞裂解液组分、蛋白质和/或核酸。最少地，来自本文的α-1，3-葡聚糖合成反应的可溶性级分的组分包括例如水、果糖、葡萄糖、和一种或多种类型的低聚糖(明串珠菌二糖和/或葡萄糖-低聚糖例如DP2-DP7，任选地蔗糖)。
应当理解，在葡糖基转移酶反应的可溶性级分中的糖类和其他材料的准确组成不被认为对于用作本文的方法中的低聚糖的来源是关键的。还应当理解的是糖类与水(即，wt％干固体)的比率(其可以通过用初始糖类的质量除以总初始反应溶液重量来计算)可以通过蒸发水，优选地在低于50℃的温度下在真空中或添加水来调节，而对葡糖基转移酶反应的可溶性级分中的糖类的相对分布没有显著的影响。也可以通过将pH降低至葡糖基转移酶的活性范围以下，或通过葡糖基转移酶的热灭活以在实现完成转化(为葡聚糖)之前停止葡糖基转移酶反应，来提高可溶性级分中蔗糖的百分比。
本文的方法的步骤(b)体现了葡糖基转移酶反应。在步骤(b)之前进行提供低聚糖的步骤(a)。因此，步骤(a)的低聚糖不是借助在步骤(b)期间其可能的原位合成提供的。换言之，仅进行其中产生了作为副产物的低聚糖的葡糖基转移酶反应不完全构成进行步骤(a)和(b)；低聚糖必须被实质地(手工地和/或机械地)添加至步骤(b)的葡糖基转移酶反应从而进行步骤(a)。所以，步骤(b)体现的葡糖基转移酶反应产生的低聚糖可以从反应(纯化的或未纯化的、处理的或未处理的，如上；例如，作为滤液)中除去并且作为步骤(a)的低聚糖提供。在此类的实施例中，步骤(a)和(b)可以重复一次或多次，使得在每个重复的步骤(a)中，所述低聚糖从产生自每次紧接着进行的步骤(b)中的产物中提供。例如，步骤(a)和(b)可以重复1、2、3、4、5、6、或更多次。因为这样的重复，根据这些实施例的方法可任选地称为连续反应工艺和/或低聚糖再循环工艺。鉴于前述内容，清楚的是，在本文的一些方法中，步骤(a)(ii)的葡糖基转移酶反应可以是步骤(b)体现的葡糖基转移酶反应。
可替代地，在本文的方法中，步骤(a)(ii)的葡糖基转移酶反应可以是与步骤(b)体现的葡糖基转移酶反应不同的(有区别的)。例如，可以从第一α-1，3-葡聚糖合成反应(例如，收集的滤液)中获得低聚糖，其后将低聚糖添加至与第一反应有区别的第二α-1，3-葡聚糖合成反应。
葡糖基转移酶至少与水、蔗糖和在本文的方法的步骤(b)中添加的低聚糖接触。合适的葡糖基转移酶的实例在以下实例中提供，和/或公开于美国专利号7000000和美国专利申请公开号2013/0244288、2013/0244287、2014/0087431、2017/0002335和2018/0072998(其全部通过引用并入本文)。
在本公开的某些实施例中葡糖基转移酶包含以下或由以下组成：例如，与SEQ IDNO：2、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、或16(或任选地任一不具有起始甲硫氨酸的这些序列)是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一、或100％同一的氨基酸序列，其中所述葡糖基转移酶具有活性。全部这些葡糖基转移酶产生具有高α-1，3糖苷键百分比(≥95％)的α-1，3-葡聚糖(参考例如，美国申请公开号2014/0087431，其通过引用并入本文)。
SEQ ID NO：16(GTF 7527-短)、SEQ ID NO：14(GTF 2678)、SEQ ID NO：9(GTF6855)、SEQ ID NO：13(GTF 2919)、和SEQ ID NO：11(GTF 2765)各自表示一种葡糖基转移酶，这些葡糖基转移酶与其各自的野生型对应物相比，缺少信号肽结构域以及全部或大部分可变结构域。因此，这些葡糖基转移酶中的每一个具有催化结构域，之后是葡聚糖结合结构域。催化结构域序列在这些酶中的大致位置如下：7527-短(SEQ ID NO：16的残基54-957)、2678(SEQ ID NO：14的残基55-960)、6855(SEQ ID NO：9的残基55-960)、2919(SEQ IDNO：13的残基55-960)、2765(SEQ ID NO：11的残基55-960)。GTF 2678、6855、2919和2765的大致催化结构域的氨基酸序列分别与GTF 7527-短的大致催化结构域序列(即，SEQ ID NO：16的氨基酸54-957)具有约94.9％、99.0％、95.5％和96.4％的同一性。所有这五种葡糖基转移酶可产生具有约100％α-1，3键和至少400的DPw的α-1，3-葡聚糖(数据未示出，参考美国专利申请公开号2017/0002335的表4，其通过引用并入本文)。因此，在某些实施例中，葡糖基转移酶可包含以下或由以下组成：与GTF 7527-短、2678、6855、2919、或2765的催化结构域的氨基酸序列(例如，如上所列出)至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、或99.5％同一或100％同一的葡糖基转移酶催化结构域。
尽管据信本文中的葡糖基转移酶仅需要具有催化结构域序列，例如上述的序列，但葡糖基转移酶可以包含在更大的氨基酸序列中。例如，可以将催化结构域在其C-末端连接至葡聚糖结合结构域，和/或在其N-末端连接至可变结构域和/或信号肽。
葡糖基转移酶的仍进一步的实例可以是如本文公开的任何酶并且包括在N-末端和/或C-末端的1-300(或在[例如10、15、20、25、30、35、40、45、或50]之间的任何整数)个残基。这样的另外的残基可以来自衍生出葡糖基转移酶的相应的野生型序列，或可以是异源序列例如像表位标签(在N-或C-末端)或异源信号肽(在N-末端)。本文中葡糖基转移酶典型地缺少N-末端信号肽。
在某些实施例中，葡糖基转移酶在自然界中不存在(即，非天然的)。例如，本文的酶不被认为是从微生物(可能从其衍生出本文的葡糖基转移酶)中天然分泌的(即，成熟形式)。在某些方面，与其天然对应物相比，非天然酶包含至少一个、两个或三个修饰的/取代的氨基酸。在某些方面，已经修饰葡糖基转移酶的氨基酸序列使得所述酶从给定量的蔗糖底物中产生更多产物(α-1，3-葡聚糖和果糖)、和更少的副产物(例如，葡萄糖、低聚糖例如明串珠菌二糖)。例如，可以修饰或取代本文的葡糖基转移酶的催化结构域的一个、两个、三个或更多个氨基酸残基以获得产生更多产物(α-1，3-葡聚糖和果糖)的酶。此类的修饰的葡糖基转移酶的合适的实例公开于美国专利申请公开号2018/0072998，该申请通过引用并入本文。
本文中葡糖基转移酶可以衍生自任何微生物来源，例如细菌。细菌葡糖基转移酶的实例是衍生自链球菌属物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种或乳杆菌属(Lactobacillus)物种的那些。链球菌属物种的实例包括唾液链球菌、表兄链球菌、牙链球菌、汗毛链球菌、变异链球菌、口腔链球菌、解没食子酸链球菌和血链球菌。明串珠菌属物种的实例包括肠膜明串珠菌、阿米巴氏明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、肉明串珠菌(L.carnosum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum)。乳杆菌属物种的实例包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、短乳杆菌(L.brevis)、布赫内氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentumm)和罗伊氏乳杆菌。
葡糖基转移酶可产生如本文公开的α-1，3-葡聚糖。例如，葡糖基转移酶可产生具有至少50％α-1，3糖苷键和至少100的DPw的α-1，3-葡聚糖。在某些实施例中，所述葡糖基转移酶不具有或具有非常低的(例如，小于1％)的葡聚糖蔗糖酶、罗伊氏蔗糖酶(reuteransucrase)、或交替蔗糖酶活性。
本文的葡糖基转移酶可以通过例如适当工程化的微生物菌株的发酵来制备。通过发酵的重组酶生产是本领域众所周知的，使用微生物菌株如大肠杆菌、芽孢杆菌菌株(例如枯草芽孢杆菌)、富养罗尔斯通氏菌、荧光假单胞菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母、和曲霉属(例如泡盛曲霉)和木霉属(例如，里氏木霉)的物种(例如，参见Adrio和Demain，生物分子(Biomolecules)4：117-139，将其通过引用结合在此。编码葡糖基转移酶氨基酸序列的核苷酸序列典型地与异源启动子序列连接以产生该酶的表达盒。可以使用本领域公知的方法将这样的表达盒并入到合适的质粒上或整合到微生物宿主染色体中。表达盒可以包括在氨基酸编码序列之后的转录终止子核苷酸序列。表达盒还可以在启动子序列和氨基酸编码序列之间包括编码信号肽的核苷酸序列，该信号肽被设计用于指导葡糖基转移酶的分泌。在发酵结束时，细胞可能相应地破裂，并且可以使用例如沉淀、过滤和/或浓缩的方法分离葡糖基转移酶。可替代地，可以使用包含葡糖基转移酶的裂解物而无需进一步分离。葡糖基转移酶的活性可以通过生物化学测定来确认，例如测量其将蔗糖转化成葡聚糖聚合物。
本文中的葡糖基转移酶可以是不依赖引物或依赖引物的。不依赖引物的葡糖基转移酶不需要引物的存在来进行葡聚糖合成。依赖引物的葡糖基转移酶需要在反应溶液中存在起始分子以作为葡聚糖聚合物合成中酶的引物。如本文使用的术语“引物”是指可以作为葡糖基转移酶的引发剂的任何分子。可用于某些实施例中的引物(除了如本文中所述的添加的低聚糖，其被认为充当引物)包括右旋糖酐。可用作引物的右旋糖酐可以是例如右旋糖酐T10(即，具有10kD的分子量的右旋糖酐)。
本文中的葡糖基转移酶的活性可以使用本领域已知的任何方法确定。例如，葡糖基转移酶活性可以通过测量在含有蔗糖(约50g/L)、右旋糖酐T10(约1mg/mL)和磷酸钾缓冲液(约pH 6.5，50mM)的反应溶液中还原糖(果糖和葡萄糖)的产生来测定，其中溶液在约22℃-25℃保持约24-30小时。可以通过向含有1N NaOH和约0.1％三苯基四氮唑氯化物的混合物中添加0.01mL的反应溶液，并且然后监测在OD480nm下持续约5分钟吸光度的增加来测量还原糖。
在本公开的方法/反应中产生了不溶性α-1，3-葡聚糖。在某些方面，α-1，3-葡聚糖具有至少50％α-1，3糖苷键和至少100的DPw。
本文中的α-1，3-葡聚糖典型地包含至少50％α-1，3-糖苷键。在某些实施例中，α-1，3-葡聚糖的组成糖苷键的至少约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、或100％(或50％和100％之间的任意整数)是α-1，3键。在一些实施例中，因此α-1，3-葡聚糖具有小于约50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、或0％(或0％和50％之间的任意整数)的不是α-1，3的糖苷键。典型地，不是α-1，3的键大部分是或全部是α-1，6。应当理解的是，在α-1，3-葡聚糖中存在的α-1，3键的百分比越高，α-1，3-葡聚糖是线性的可能性也越高，因为在聚合物中形成分支点的某些键发生率较低。因此，具有100％的α-1，3键的α-1，3-葡聚糖据信是完全线性的。在某些实施例中，作为聚合物中糖苷键的百分比，α-1，3-葡聚糖不具有分支点或具有小于约5％、4％、3％、2％、或1％的分支点。分支点的实例包括α-1，6、-1，2和-1，4分支点。
在一些方面，本文中的α-1，3-葡聚糖可具有DPw或DPn为至少约100的分子量。在一些实施例中，DPw或DPn可以是至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、或1200(或100和1200之间的任意整数)。
本文中的α-1，3-葡聚糖在非苛性水性系统中是不溶性的，例如本文的葡糖基转移酶反应中的那些条件(例如，pH 4-8，参见以下)。通常，在本文的水性环境中葡聚糖聚合物的溶解度与其键谱图、分子量、和/或支化度相关。例如，在DPw为8及以上，在水性条件下，在20℃，具有≥95％1，3键的α-1，3-葡聚糖通常是不溶性的。通常，随着分子量增加，α-1，3-葡聚糖不溶性要求的α-1，3键的百分比降低。
在一些其他的实施例中，不溶性α-1，3-葡聚糖可以包含至少约30％的α-1，3键和一定百分比的α-1，6键，这使得α-1，3键和α-1，6键两者在α-1，3-葡聚糖中的总和达到100％。例如，α-1，3键和α-1，6键的百分比可以分别是约30％-40％和60％-70％。用于生产此类α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶公开于美国专利申请公开号2015/0232819，该申请通过引用并入本文。这些实施例中的α-1，3-葡聚糖不包含交替键(交替的1，3键和1，6键)。
所公开的方法包括：在步骤(b)中，至少接触水、蔗糖、葡糖基转移酶、和低聚糖(如在步骤[a]中提供)。这一接触步骤可任选地表征为提供包含水、蔗糖、葡糖基转移酶、和低聚糖的葡糖基转移酶反应组合物。所公开的方法的接触步骤能以任何数量的方式进行。例如，可以首先将所希望的量的蔗糖以及添加的低聚糖在水中溶解或混合(任选地，还可在这一制备阶段添加其他的组分，例如缓冲液组分)，随后添加葡糖基转移酶。溶液可以保持静止，或经由例如搅拌或轨道振摇而搅动。
如果需要，可以控制本文的反应组合物的温度，并且可以是例如约5℃-50℃、20℃-40℃、20℃-30℃、20℃-25℃。在一些方面，该温度可以是约5℃-15℃(例如，约8℃-12℃、约9℃-11℃、约10℃)、15℃-25℃(例如，约20℃)、或25℃-35℃(例如，约30℃)。
可以提供本文中的低聚糖使得在步骤(b)中设置的葡糖基转移酶反应中的其初始浓度是例如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、5-10、或5-15g/L。可以使用纯化的或未纯化的(例如，滤液)低聚糖组合物提供前述的浓度。本文中的低聚糖的“初始浓度”可以例如是指在已经刚刚添加或组合最小组的反应组分(至少水、蔗糖、葡糖基转移酶、任选地低聚糖)之后，葡糖基转移酶反应中的低聚糖浓度。可以按分批或补料分批模式，将低聚糖添加至葡糖基转移酶反应。在分批模式下，在反应的开始，或者在开始反应的约10-15分钟内，将低聚糖全部添加(全部存在)，而在补料分批模式下，在整个反应过程中添加低聚糖。例如，补料分批可包括在整个反应期间和/或在反应的一段时间(例如，前6小时)中以连续或增量的方式(例如，每30或60分钟给料)添加低聚糖。在补料分批模式反应中提供的低聚糖的总量可以是与通过上述列出的任一初始浓度提供的量相同的。在一些实施例中，在反应开始时或在反应开始的前1-2小时内，将低聚糖添加至葡糖基转移酶反应。
本文的反应组合物中蔗糖的初始浓度可以是例如约20-400g/L、75-175g/L或50-150g/L。在一些方面，初始蔗糖浓度是至少约50、75、100、150或200g/L，或是约50-600g/L、100-500g/L、50-100g/L、100-200g/L、150-450g/L、200-450g/L或250-600g/L。“蔗糖的初始浓度”是指已经刚刚添加/组合全部的反应溶液组分(至少水、蔗糖、葡糖基转移酶、任选地添加的低聚糖)之后葡糖基转移酶反应组合物中的蔗糖浓度。
用于葡糖基转移酶反应溶液的蔗糖可以是高纯度的(≥99.5％)或具有任何其他纯度或等级。例如，蔗糖可以具有至少99.0％的纯度，或可以是试剂级蔗糖。作为另一个实例，可以使用不完全精制的蔗糖。本文的不完全精制的蔗糖是指还未加工成白色精制蔗糖的蔗糖。因此，不完全精制的蔗糖可以是完全未精制的或部分精制的。未精制的蔗糖的实例是“未加工的蔗糖”(“原糖”)及其溶液。部分精制的蔗糖的实例还没有经历一个、两个、三个或更多个结晶步骤。本文的蔗糖可以衍生自任何可再生糖源，例如甘蔗、甜菜、木薯、甜高粱或玉米。用于本文的蔗糖的合适的形式是结晶形式或非结晶形式(例如，糖浆、甘蔗汁、甜菜汁)。不完全精制的蔗糖的另外的合适的形式公开于美国专利申请公开号2015/0275256，其通过引用并入本文。例如，本文的不完全精制的蔗糖的ICUMSA(国际食糖统一分析法委员会(International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis))可以大于150。确定蔗糖的ICUMSA值的方法由国际食糖统一分析法委员会公开于：例如，ICUMSA Methods of Sugar Analysis：Official and Tentative Methods Recommended by the International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis(ICUMSA)[食糖分 析的ICUMSA方法：由国际食糖统一分析法委员会(ICUMSA)推荐的官方和暂行方法](H.C.S.de Whalley编辑，Elsevier Pub.Co.[爱思唯尔出版公司]，1964)，其通过引用并入本文。在某些方面，ICUMSA可以通过ICUMSA方法GS1/3-7测量，如由R.J.McCowage、R.M.Urquhart和M.L.Burge(Determination of the Solution Colour of Raw Sugars， .Brown Sugars andColoured Svrups at pH 7.0-Offficial[原糖、红糖和有色糖浆在pH 7.0的溶液色度的确定-官方])，艾伯特·巴滕施(Albert Bartens)博士出版社，2011年版)描述的，该文献通过引用并入本文。
在某些实施例中，反应组合物的pH可以是约4.0-9.0、4.0-8.5、4.0-8.0、5.0-8.0、5.5-7.5、或5.5-6.5。在一些方面，pH可以是约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。可以通过添加或掺入适合的缓冲液来调节或控制pH，该缓冲液包括但不限于：磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、乙酸盐、柠檬酸盐、或其组合。在本文的反应组合物中的缓冲液浓度可以是例如约0.1-300mM、0.1-100mM、10-100mM、10mM、20mM或50mM。可任选地将合适的量的DTT(二硫苏糖醇，例如，约1.0mM)添加至反应溶液。
葡糖基转移酶反应可以包含在适合用于应用本文公开的一种或多种反应条件的任何容器(例如，惰性容器/器皿)中。在一些方面，惰性容器可以是不锈钢、塑料、或玻璃(或包含这些组分中的两种或更多种)并且具有适合于含有特定反应的大小。例如，惰性容器的体积/容量(和/或本文中的反应组合物的体积)可以是约或至少约1、10、50、100、500、1000、2500、5000、10000、12500、15000、或20000升。惰性容器可以任选地配备有搅拌装置。
本文中的反应组合物可以含有例如一种、两种、或更多种葡糖基转移酶。在一些实施例中，仅一种或两种葡糖基转移酶包含在反应组合物中。本文的葡糖基转移酶反应可以是并且典型地是不含细胞的(例如，无全细胞存在)。
在某些实施例中，反应的完成可以目视地(例如，无更多的不溶性葡聚糖积累)，和/或通过测量溶液中剩余的蔗糖的量(残余的蔗糖)来确定，其中至少约90％、95％或99％的蔗糖消耗百分比可以表示反应完成。在一些方面，当其蔗糖含量是或低于约5g/L时，反应可被视为完成。例如，可以将所公开方法的反应进行约1小时至约2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72、96、120、144或168小时。可通过将其加热至至少约65℃持续至少约30-60分钟，将反应任选地终止和/或以其他的方式处理以中止葡糖基转移酶活性。
在本文中的葡糖基转移酶反应中产生的α-1，3-葡聚糖的产率可以例如，基于在反应中转化的蔗糖的重量或摩尔，或基于反应的葡糖基组分，是约，至少约，或高达约7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或85％。在一些方面，在进行约16-24小时(例如，约20小时)的反应中，实现了此类的产率，和/或此类的产率是如使用HPLC或NIR光谱学所测量的。
可以任选地分离在某些实施例中的方法中产生的α-1，3-葡聚糖。在某些实施例中，分离不溶性α-1，3-葡聚糖至少可包括进行离心和/或过滤的步骤。分离可以任选地进一步包括用水或其他水性液体洗涤α-1，3-葡聚糖一次、两次或更多次，和/或干燥所述α-葡聚糖产物。
本文中的分离的α-1，3-葡聚糖产物，如以干的形式提供的，可包含例如不超过2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05、或0.01wt％水。在一些方面，α-1，3-葡聚糖产物以至少1克的量(例如，至少约2.5、5、10、25、50、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500、10000、25000、50000、或100000g)提供；此类的量可以是例如干的量。
用于合成本文中的不溶性α-1，3-葡聚糖的合适的条件和/或组分的实例公开于美国专利号7000000、和美国专利申请公开号2013/0244288、2013/0244287、2013/0196384、2013/0157316、2015/0275256、2015/0240278、2015/0240279、2014/0087431、2017/0002335和2018/0072998，其全部通过引用并入本文。
可以将用于合成不溶性α-1，3-葡聚糖的任何公开的条件(例如前述或在以下实例中描述的那些)应用于实践如目前公开的反应组合物(并且反之亦然)。
本公开还涉及一种用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的反应组合物。这一反应组合物至少包含水、蔗糖、合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶、和低聚糖。在制备反应组合物期间添加这些低聚糖，并且这些低聚糖：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)衍生自葡糖基转移酶反应。
不溶性α-1，3-葡聚糖在反应组合物中产生。
本文中的反应组合物可例如根据本文所公开的任一实施例或以下关于产生不溶性α-1，3-葡聚糖的方法的实例来实践。因此，此类实施例的任一特征可表征本文中的反应组合物的实施例。
在某些实施例中，相比于如果在不添加低聚糖(即，无步骤[a]的低聚糖)的情况下进行步骤(b)时产生的α-1，3-葡聚糖的产率，可以提高通过葡糖基转移酶反应产生的α-1，3-葡聚糖的产率。例如，相比于如果步骤(b)缺少添加的低聚糖时产生的α-1，3-葡聚糖的产率，产生的α-1，3-葡聚糖的产率可以提高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、或120％。应当理解的是，如果需要，可以相对于合适的对照葡糖基转移酶反应(例如，具有与步骤[b]相同的参数的反应，除了添加低聚糖)测量在本文的方法中的α-1，3-葡聚糖产物产率的提高百分比。在一些方面，产率的提高表征以下反应，所述反应包含相比于其相应的天然氨基酸序列，不具有任何催化结构域氨基酸取代的葡糖基转移酶。
在某些实施例中，相比于如果在没有步骤(a)提供的低聚糖的情况下进行步骤(b)时会观察到的反应速率，可以提高步骤(b)的葡糖基转移酶反应的相对反应速率。例如，相对于合适的对照葡糖基转移酶反应的反应速率，步骤(b)的葡糖基转移酶反应的相对反应速率可以是至少约1.025、1.05、1.075、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.40、1.50、1.60、1.70、1.80、1.90、2.00、或2.10。为了说明，如果相对于对照反应，本文中的反应的相对反应速率是至少约1.25，则这一反应的反应速率比对照反应的反应速率高至少约25％。反应的反应速率可以根据每单位时间每单位活性葡糖基转移酶浓度下一种或多种反应物(例如，蔗糖)的浓度/量的变化和/或一种或多种产物(例如，α-1，3-葡聚糖)的浓度/量的变化来表达。可以例如，以每升每小时(g L-1h-1)产生的α-1，3-葡聚糖克数来测量反应速率。
相比于如果步骤(b)在不具有步骤(a)中提供的低聚糖的情况下进行时会观察到的副产物形成，在本文中的产生不溶性α-1，3-葡聚糖的方法的步骤(b)的葡糖基转移酶反应中，副产物形成可任选地被降低。例如，相比于合适的对照葡糖基转移酶反应，在步骤(b)中形成的葡萄糖、明串珠菌二糖、和/或葡萄糖-低聚糖副产物的量可被降低。此类降低可以是例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、或60％。
在某些实施例中，相比于如果在不添加低聚糖(即，无步骤[a]的低聚糖)的情况下进行步骤(b)时产生的α-1，3-葡聚糖的粘度，可以降低通过葡糖基转移酶反应产生的α-1，3-葡聚糖的粘度。可以测定在液体中混合或溶解的α-1，3-葡聚糖的这一粘度。本文中的α-1，3-葡聚糖产物的粘度可以比例如，如果步骤(b)缺少添加的低聚糖时会产生的α-1，3-葡聚糖的粘度低至少约5％、10％、15％、20％、或25％。应当理解的是，如果需要，可以相对于合适的对照葡糖基转移酶反应(例如，具有与步骤[b]相同的参数的反应，除了添加低聚糖)测量在本文的方法中的α-1，3-葡聚糖产物粘度的降低百分比。
可以测定在液体中混合或溶解的本文中的α-1，3-葡聚糖的粘度。在某些方面，此类的测定可以用在水性液体(例如不是苛性的水或水性溶液)(例如，非苛性水性液体可具有约4-10、5-9、6-8、或7的pH)中混合的α-1，3-葡聚糖来进行；因为本文中的α-1，3-葡聚糖在此类水性条件下典型地是不溶性的，所以混合是推荐的。这一混合可以使用例如用于在非苛性水性液体中有效混合α-1，3-葡聚糖的任何合适的方法，例如均质化或微流化(例如，如在以下任一项中所公开：国际专利申请公开号WO2016/126685或美国专利申请公开号2015/0167243、2005/0249853、2003/0153746和2018/0021238，其各项全部通过引用并入本文)来进行。典型地可以进行α-1，3-葡聚糖在非苛性水性液体中的混合以制备葡聚糖的水性浆液和/或分散体(胶体分散体)。此类水性组合物的粘度可任选地测量为在约5-250s-1(例如，7-200s-1)的剪切速率下，在约15-25℃(例如，约20℃)的温度下，和/或以2-10wt％(例如，约4-5wt％)α-1，3-葡聚糖水性混合物的浆液粘度，单位为cP。
在某些方面，粘度测定可以用在液体中溶解的α-1，3-葡聚糖进行。此类的液体可以是例如具有至少约11的pH的苛性水性溶液。苛性水性溶液可至少包含氢氧化物(例如，NaOH、KOH、四乙基氢氧化铵)，和/或可以例如以下文献中所公开：国际专利申请公开号WO2015/200612或WO 2015/200590、或美国专利申请公开号2017/0208823或2017/0204203(其各项全部通过引用并入)。在一些方面，用于测量粘度的用于溶解本文中的α-1，3-葡聚糖的液体可以是非水性的，例如包含有机溶剂的液体(例如，有机离子液体)。本文中的合适的有机溶剂的实例可包含N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)(任选地具有约0.5％-5％LiCl)、二甲亚砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶、SO2/二乙胺(DEA)/DMSO、LiCl/1，3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMI)、DMSO/四丁基-氟化铵三水合物(TBAF)、N-甲基吡咯烷酮、和/或N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)。在一些方面，α-1，3-葡聚糖可以在合适的有机溶剂例如DMAc/0.5％LiCl中溶解至约5-15mg/mL(例如，10mg/mL)的浓度用于测量粘度。在一些实施例中，本文中的溶解的α-1，3-葡聚糖粘度可以测量为本征粘度(IV，符号为“η”，以mL/g的单位提供)。例如，使用任何合适的方法例如以下文献中公开的方法：美国专利申请公开号2017/0002335和2017/0002336，Weaver等人(J.Appl.Polym.Sci.[应用聚合物科学杂志]35：1631-1637)，或Chun和Park(Macromol.Chem.Phys.[高分子化学与物理]195：701-711)，可以获得本文中的IV测量值，这些文献全部通过引用并入本文。
本公开还涉及包含不溶性α-1，3-葡聚糖的组合物，所述不溶性α-1，3-葡聚糖根据生产不溶性α-1，3-葡聚糖的任何本文中的方法产生。在某些实施例中，此类组合物可以是水性组合物或非水性组合物。在一些方面，本文中的不溶性α-1，3-葡聚糖产物的粘度小于如果所述低聚糖在方法/反应中不提供时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖(对照葡聚糖)的粘度。相对于在液体中混合或溶液的α-1，3-葡聚糖，可用上述任何方法测量粘度。本发明的α-1，3-葡聚糖产物的粘度可以比例如对照葡聚糖的粘度小至少约5％、10％、15％、20％、或25％。本发明的α-1，3-葡聚糖产物的粘度/DPw关系可是例如，如以下实例所公开的，所述实例示出向葡糖基转移酶反应添加葡萄糖-低聚糖降低了粘度。
本文公开的组合物和方法的非限制性实例包括：
1.一种用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：
(a)提供低聚糖，所述低聚糖：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)产生自葡糖基转移酶反应；
(b)至少接触水、蔗糖、合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶、和低聚糖，其中产生了不溶性α-1，3-葡聚糖；以及
(c)任选地，分离在步骤(b)中产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖。
2.如实施例1所述的方法，其中所述低聚糖包含约60％-99％的α-1，3糖苷键和约1％-40％的α-1，6糖苷键。
3.如实施例1或2所述的方法，其中所述低聚糖具有2至10的聚合度(DP)。
4.如实施例1、2、或3所述的方法，其中所述低聚糖是纯化的或未纯化的。
5.如实施例4所述的方法，其中所述低聚糖产生自(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应。
6.如实施例5所述的方法，其中(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应合成不溶性α-1，3-葡聚糖。
7.如实施例5或6所述的方法，其中所述低聚糖提供为(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应的可溶性级分，并且其中所述可溶性级分是处理的或未处理的。
8.如实施例7所述的方法，其中所述可溶性级分是(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应的一部分或全部滤液。
9.如实施例1、2、3、4、5、6、7、或8所述的方法，其中所述低聚糖在步骤(b)中以至少约1g/L的初始浓度提供。
10.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8或9所述的方法，其中相比于如果步骤(b)缺少所述低聚糖时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率，产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率提高。
11.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9或10所述的方法，其中相比于如果步骤(b)缺少所述低聚糖时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度，产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度降低，其中粘度用在液体中混合或溶解的α-1，3-葡聚糖来测量。
12.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11所述的方法，其中产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)。
13.如实施例1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或13所述的方法，其中步骤(a)和(b)重复一次或多次，并且其中在每个重复的步骤(a)中，所述低聚糖从产生自每个紧接着的前述步骤(b)的产物(副产物)提供。
14.一种用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的反应组合物，所述反应组合物至少包含水、蔗糖、合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶、和低聚糖，其中所述低聚糖在所述反应组合物的制备期间添加并且：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)产生自葡糖基转移酶反应，
其中不溶性α-1，3-葡聚糖在所述反应组合物产生，任选地其中所述反应组合物的特征是由如实施例2-13中任一项所述的任何特征。
15.一种包含不溶性α-1，3-葡聚糖的组合物，所述不溶性α-1，3-葡聚糖如实施例1-13中任一项所述的方法产生，或在实施例14的反应组合物中产生。
16.如实施例15所述的组合物，其中所述不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度是小于如果所述低聚糖不在方法或反应组合物中提供时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度，其中粘度用在液体中混合或溶解的α-1，3-葡聚糖来测量。
实例
本公开在以下实例中进一步举例说明。应当理解，这些实例尽管说明了本文的某些优选方面，但仅是以例证的方式给出的。从上述论述和这些实例中，本领域的技术人员可确定所公开的实施例的必要特性，并且在不脱离所公开的实施例的精神和范围的情况下，可进行各种变化和修改以使所公开的实施例适应多种用途和条件。
一般方法
除非另外说明，全部试剂获得自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)。蔗糖获得自VWR公司(宾夕法尼亚州拉德纳)。
葡糖基转移酶(GTF)的粗提物的制备
在某些以下的实例中使用的唾液链球菌(Streptococcus salivarius)GTFJ酶(SEQ ID NO：2)在大肠杆菌菌株DH10B中使用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)-诱导的表达系统表达。相比于GENBANK识别号47527中的唾液链球菌GTFJ氨基酸序列，SEQ ID NO：2具有N-末端42个残基的缺失。简而言之，将大肠杆菌DH10B细胞转化以从密码子优化以在大肠杆菌中表达的DNA序列(SEQ ID NO：1)表达SEQ ID NO：2。这一DNA序列包含在表达载体，
(DNA 2.0，加利福尼亚州门洛帕克)中。将转化细胞接种到LB培养基(10g/L胰蛋白胨；5g/L酵母提取物，10g/L NaCl)中的0.025的初始光密度(在600m下的OD)，并且允许其在培养箱中在37℃生长伴随在250rpm下的振荡。当它们达到0.8-1.0的OD600时，通过添加1mM IPTG，诱导培养物。将诱导的培养基留在摇床上并且在诱导后3小时收集。
通过在
离心机中离心培养的细胞(25℃，16,000rpm)，在5.0mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中重悬所述细胞并且在冰上冷却至4℃来收集GTFJ酶(SEQ ID NO：2)。使用具有0.1-mm二氧化硅珠粒的珠粒打浆机将细胞破碎，并且然后在16,000rpm在4℃离心以沉淀未破碎的细胞和细胞碎片。将粗提取物(含有可溶性GTFJ酶，SEQ ID NO：2)从沉淀物中分离并且通过Bradford蛋白质测定分析以测定蛋白质浓度(mg/mL)。
以如下方式制备实例5中使用的GTF酶。将大肠杆菌
细胞(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)用含有特定GTF编码的DNA序列的基于
的构建体转化。将每个序列进行密码子优化以在大肠杆菌中表达GTF酶。将表达特定GTF酶的个体大肠杆菌菌株在具有氨苄青霉素(100mg/mL)的LB培养基中在37℃下生长，伴随振荡至OD600＝0.4-0.5，在此时将IPTG添加至0.5mM的最终浓度。将这些培养物在37℃孵育2-4小时，随后进行IPTG诱导。通过在5,000xg下离心15分钟来收获细胞并将细胞重悬(20％w/v)于补充有DTT(1.0mM)的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中。使重悬浮的细胞穿过弗氏压碎器(French Pressure Cell)(SLM仪器公司(SLM Instruments)，纽约州罗切斯特)两次以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000x g在4℃离心30分钟。通过BCA蛋白质测定和SDS-PAGE分析所得的上清液以证实GTF酶的表达，并将该上清液储存在-20℃。
反应谱图的分析
取反应的周期性样品并且使用配备有折射率检测器的
1260HPLC分析。使用在0.6mL/min的流速和85℃下具有去离子水的
HPX-87C柱(伯乐公司(BioEad)，加利福尼亚州赫拉克勒斯)来定量在反应混合物中的蔗糖、葡萄糖、明串珠菌二糖和果糖的水平。使用在0.6mL/min的流速和85℃下具有去离子水的HPX-42A柱(伯乐公司(BioRad))来定量可溶性低聚糖副产物。
葡聚糖分子量的分析
将从葡糖基转移酶反应中分离的不溶性葡聚糖聚合物用具有5％氯化锂(LiCl)的N，N-二甲基乙酰胺(DMAc)在100℃处理16小时以形成葡聚糖聚合物溶液。然后将这一溶液(100μL)注射到在50℃下运行的配备有差示折光计检测器的AllianceTM 2695HPLC(沃特世公司(Waters Corporation)，马萨诸塞州米尔福德)中。流动相(含有0.11wt％LiCl的DMAc)以0.5mL/min的流速经过串联的四个苯乙烯-二乙烯基苯柱；具体地，一个KD-802、一个KD-801、和两个线性KD-806M柱(昭和公司(Shodex)，日本)。通过将保持时间与广泛的葡聚糖标准比较来测定葡聚糖聚合物样品的分子量分布。
实例1
使用GTFJ酶(SEQ ID NO：2)的葡聚糖聚合反应
这一实例公开了关于将蔗糖转化为不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物和可溶性糖类的信息，并且详述了如何产生实例2中使用的原材料。
将蔗糖(3000g)添加至干净的5加仑聚乙烯桶中。向桶中添加水(18.1L)和FermasureTM(10mL)，并且通过添加5vol％的NaOH和5vol％的H2SO4将pH调节至7.0。最终体积为约20L，并且通过HPLC测量的蔗糖的初始浓度为152.5g/L。通过添加如一般方法部分中所述制备的0.3vol％的粗制GTFJ酶(SEQ ID NO：2)提取物来引发葡聚糖聚合反应。这一提取物含有约2.9mg/mL的蛋白质。使用配备有玻璃轴和PTFE刀片的顶置式机械马达提供反应溶液的搅动。
48小时后，HPLC分析显示96％的蔗糖已经消耗并且反应被认为完成。通过过滤除去不溶性α-1，3-葡聚糖，并且然后使用旋转蒸发器(40℃-50℃的浴温度)，将母液(滤液)浓缩至320g/L糖类的总糖浓度。表2中提供了浓缩的糖溶液的组成。
表2
葡聚糖合成反应的浓缩的滤液的组成
a重量百分比是相对于测量的糖类组分。
表2表明在上述葡聚糖合成反应完成时获得的浓缩的滤液含有糖类，其中其约14-15wt％是低聚糖(DP2-DP7)副产物。在实例2中使用这一浓缩的滤液以进行低聚糖的色谱分离。
实例2
使用离子交换树脂的低聚糖分离和分析
这一实例公开了如何通过色谱分离从葡聚糖合成反应的浓缩的滤液中分离低聚糖，以及如何分析其糖苷键谱图。在实例3、5和7中使用了这些分离的低聚糖。
使用强酸性阳离子交换树脂的色谱分离被用于分离实例1制备的浓缩的滤液的低聚糖级分。表3中示出了用于此分离的柱的物理参数。
表3
用于色谱分离的柱的物理参数
在实例1中制备的所述浓缩的糖溶液(即，浓缩的滤液)被过滤并且使用自来水稀释至25g干固体/100g溶液。在将糖溶液添加到柱树脂中之前，用六个床体积(BV)的氯化钠溶液(在10wt％氯化钠的情况下三个BV然后在5wt％氯化钠的情况下三个BV)洗涤树脂，以将树脂转化为钠的形式。然后将糖溶液(0.6L)进料到柱中，然后使用水以50mL/min的流速洗脱该柱。表4中总结了色谱分离的运行条件。
表4
色谱分离运行条件
在11分钟和21分钟之间洗脱低聚糖溶液。同时洗脱了少量的盐-由电导率的提高指示。通过HPLC分析如此制备的低聚糖级分以确定其产物分布。总之，所述级分含有＞89％的含有三个或更多个己糖单元和小于1.5％的可鉴定的单糖和双糖的低聚糖。使用薄膜蒸发器(LCI公司(LCI Corporation)，北卡罗来纳州夏洛特)，随后进行使用ROTAVAPOR(R-151；步琪公司(Buchi)，特拉华州纽卡斯尔)的旋转蒸发，将这一级分浓缩至总干重为317g/L。表5中为如通过HPLC测量的浓缩的级分的产物分布。
表5
浓缩的低聚糖级分的产物分布
a重量百分比是相对于测量的糖类组分。
表5的浓缩的低聚糖溶液使用1H NMR来分析。NMR数据是使用5-mm低温三共振脉冲场梯度(PFG)探头，以500MHz使用1H操作的
DD2光谱仪上获得的。通过在“presat”实验中小心地将观测发射器频率设置在残余水信号共振上获得水抑制，并且然后使用具有全相周期(32的倍数)和混合时间为10ms的NOESY实验的第一切片。以谱宽6410Hz，采集时间5.1s，65536个数据点，4s预饱和及5.85μs的90度脉冲，获得了一维1H谱。样品温度保持在25℃。不同端基异构体键的化学位移分配取自Goffin等人(2009，BullKorean Chem.Soc.[韩国化学会公报]30：2535-2541)。图1中所示的这一样品的谱分析显示低聚糖包含约78％α-1，3糖苷键和约22％α-1，6糖苷键。
因此，分离并分析来自葡聚糖合成反应的浓缩的滤液的低聚糖。在实例3、5和7中，使用了以上浓缩的低聚糖溶液。
实例3
缺少或含有添加的低聚糖的葡糖基转移酶反应的比较
这一实例公开了相比于缺少此类添加的低聚糖的反应，将含有显著的DP2+材料级分的纯化的低聚糖(实例2)添加至α-1，3-葡聚糖合成反应导致提高的不溶性α-1，3-葡聚糖产物产率。这一实例还示出这一益处(提高的葡聚糖产物产率)在多种反应条件和低聚糖载量中都具备。
以如下方式制备葡聚糖合成反应。将蔗糖(10g)、0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)、94mL水、和50微升FermasureTM添加至配备有聚丙烯盖的125-mL干净的玻璃瓶中。在对比实例3A(表6)的制剂中不添加低聚糖。在实例3.1和3.2(表6)中，将在实例2(表5)中制备的一定量的低聚糖溶液添加至各个对应的制剂中；添加至各个对应的制剂中的水的量减小了相当的体积。各个制剂含有主要来自蔗糖组分的微量葡萄糖；不向任一制剂中添加另外的葡萄糖。将各个制剂在培养箱振荡器(控制温度为25℃)中搅动直到溶液形成，此时使用5wt％水性氢氧化钠或5wt％水性硫酸将每个制剂的pH调节至5.5。取每个制剂的样品用于通过HPLC分析，其后将如在一般方法部分所述制备的0.3vol％的粗制GTFJ酶(SEQ ID NO：2)提取物添加至每个制剂中以引发聚合反应。随着反应进行，定期取每个反应的样品并且通过HPLC进行分析。通过在聚合作用的前两个小时中消耗的蔗糖的量来计算反应的初始速率。一旦每个反应被认为完成，通过过滤将不溶性聚合物产物从反应中分离，用200mL水洗涤，用100mL丙酮洗涤，并且然后干燥。
表6中示出了每个反应的结果，其示出当将低聚糖添加至反应中时，不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物产物的产率提高(将实例3.1和3.2与实例3A比较)。这些结果还示出在添加另外量的低聚糖时获得的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率进一步改善(将实例3.2与3.1比较)。
表6
缺少或含有添加的低聚糖的葡糖基转移酶反应的谱图
| 实例 | 3A | 3.1 | 3.2 |
| 标称蔗糖(g/L) | 100 | 100 | 100 |
| 实际蔗糖(g/L) | 97.2 | 104.6 | 107.1 |
| 初始低聚糖，DP2+(g/L) | 0.0 | 5.3 | 22.0 |
| 初始葡萄糖(g/L) | 1.3 | 1.1 | 1.6 |
| 初始速率(g消耗的蔗糖/L-hr) | 5.3 | 14.1 | 12.3 |
| 反应的蔗糖％ | 94.3 | 96.4 | 98.1 |
| 产生聚合物(g/L) | 15.4 | 24.6 | 27.5 |
| 产生葡萄糖(g/L) | 8.1 | 5.9 | 4.9 |
| 产生低聚物(g/L) | 8.2 | 8.9 | 24.6 |
| 产生聚合物(g/g反应的蔗糖) | 0.17 | 0.24 | 0.26 |
| 产生葡萄糖(g/g反应的蔗糖) | 0.075 | 0.048 | 0.031 |
| 产生低聚物(g/g反应的蔗糖) | 0.090 | 0.035 | 0.025 |
在一些温度和蔗糖载量上获得向α-1，3-葡聚糖合成反应中添加低聚糖时赋予的益处。制备实例3.3-3.5的反应并且以如上所述的相同方式进行，除了初始蔗糖浓度或温度有改变。表7中总结了这些反应的结果以及不添加任何低聚糖的对比实例3B、3C和3D(分别为实例3.3、3.4和3.5的对照)的反应的那些结果。
表7
在不同的蔗糖或温度条件下进行的缺少或含有添加的低聚糖的葡糖基转移酶反
应的谱图
因此，将α-1，3-葡聚糖合成反应的低聚糖副产物添加至新的α-1，3-葡聚糖合成反应可提高由新反应产生的α-1，3-葡聚糖的产率，并且提高聚合作用的速率而且同时降低了不希望的低聚物和葡萄糖的产率。反应调节出现在各种条件中。
实例4
不溶性α-1，3-葡聚糖产率在其中添加了葡萄糖而非低聚糖的葡糖基转移酶反应
降低
这一实例公开了向葡糖基转移酶反应中添加葡萄糖(量等同与实例3中使用的低聚糖的量)对于通过葡糖基转移酶反应产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率是不利的。
以如下方式制备葡聚糖合成反应。称出蔗糖(75g)并且用去离子水在连接有LAUDARK20循环冷却器的1-L无挡板有夹套的烧瓶中稀释至0.75L。然后添加FermasureTM(0.5mL/L反应)，并且使用5wt％水性氢氧化钠或5wt％水性硫酸将pH调节至5.5。在对比实例4A(表8)中，微量的葡萄糖主要来自蔗糖组分；不向制剂中添加另外的葡萄糖。在实例4.1(表8)中，除了存在来自蔗糖组分的微量的葡萄糖，还将葡萄糖(18.8g)添加至制剂中。通过添加0.3vol％粗制GTFJ酶(SEQ ID NO：2)提取物，在每个制剂中引发聚合反应。使用附接到4刀片PTFE刀片的顶置式机械马达来提供对每个反应的搅动，并且将温度控制在25℃。在通过HPLC测定反应完成后，通过过滤分离每个反应的不溶性聚合物产物。然后将聚合物产物用水(1.5L)洗涤，然后用丙酮(0.5L)洗涤，并且然后在真空烘箱下干燥。记录干α-1，3-葡聚糖产物的质量。
表8中示出了每个反应的结果，其示出当向反应添加葡萄糖时，葡糖基转移酶反应中获得的不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物的产率降低。
表8
含有各种量的葡萄糖的葡糖基转移酶反应的谱图
因此，向葡糖基转移酶反应添加葡萄糖对于通过葡糖基转移酶反应产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率是不利的。值得注意的是，在实例4.1的反应中的葡萄糖的量等同与在实例3中的某些反应中添加的低聚糖的量。因此实例4.1中的阴性结果表明实例3中使用的低聚糖的低聚性质对于观察到的葡聚糖聚合物产率提高作用是必须的(即，低聚糖的单体组分-葡萄糖很可能需要低聚化才能提高反应中的葡聚糖产物产率)。
实例5
在含有添加的低聚糖和不同的GTF酶的反应中的不溶性α-1，3-葡聚糖产率
这一实例公开了，添加纯化的低聚糖(来自实例2)至葡糖基转移酶反应的葡聚糖聚合物产率提高作用通常适用于含有除GTFJ之外的产生不溶性α-1，3-葡聚糖的酶的反应。
在这一实例中使用的不同类型的GTF酶是GTF 0874(SEQ ID NO：4)、GTF 1724-T1(SEQ ID NO：7)和GTFJ-T1(SEQ ID NO：8)。这些葡糖基转移酶中的每一种可合成，或预期能够合成具有约100％α-1，3糖苷键的不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物(例如，参考美国专利申请号2014/0087431和2016/0002693，其通过引用并入本文)。
以如下方式制备葡聚糖合成反应。将蔗糖(10g)、0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)和94mL水添加至配备有聚丙烯盖的125-mL干净的玻璃瓶中。在对比实例5A、5B、和5C(表9)中的制剂中不添加低聚糖。在实例5.1、5.2、和5.3中，将在实例2(表5)中制备的一定量的低聚糖溶液添加至各个对应的制剂中；添加至各个对应的制剂中的水的量减小了相当的体积。各个制剂含有主要来自蔗糖组分的微量葡萄糖；不向任一制剂中添加另外的葡萄糖。将各个制剂在培养箱振荡器(控制温度为℃)中搅动直到溶液形成，此时使用5wt％水性氢氧化钠或5wt％水性硫酸将pH调节至5.5。取每个制剂的样品用于通过HPLC分析，其后将如在一般方法部分所述制备的0.3vol％的粗制GTF酶提取物添加至每个制剂中以引发聚合反应。随着反应进行，定期取每个反应的样品并且通过HPLC进行分析。一旦每个反应被认为完成，通过过滤将不溶性聚合物产物从反应中分离，用200mL水洗涤，用100mL丙酮洗涤，并且然后干燥。
表9中示出了每个反应的结果，其示出当将低聚糖添加至反应中时，不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物产物的产率提高。这一产率提高发生在使用不同类型的葡糖基转移酶的反应中。值得注意的是，每个GTF 1724-T1和GTF 0874的各自的大致催化结构域与GTFJ的大致催化结构域大约共享仅仅50％的氨基酸序列同一性(参考美国专利申请号2017/0002335，其通过引用并入本文)。尽管在序列同一性上有这一显著的差异，但每种酶仍示出不溶性α-1，3-葡聚糖产物产率提高。
表9
含有不同类型的GTF酶、和缺少或含有添加的低聚糖的反应的谱图
a对比实例5C在pH 7.0而不是pH 5.5中进行。
因此，将α-1，3-葡聚糖合成反应的低聚糖副产物添加至新的α-1，3-葡聚糖合成反应可提高由新反应产生的α-1，3-葡聚糖的产率。这一产率提高发生在使用不同类型的葡糖基转移酶的反应中。
实例6
在含有其他类型的添加的低聚糖的反应中不溶性α-1，3-葡聚糖的产率
这一实例公开了低聚糖可能必须含有α-1，3葡糖苷键才能带来葡糖基转移酶反应对不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物的选择性的变化。将不同于实例2(表5)中产生的那些的低聚糖添加至葡糖基转移酶反应以测定它们是否影响α-1，3-葡聚糖产率。
不经进一步纯化，在α-1，3-葡聚糖聚合反应中使用麦芽糊精(5.5、15、或18右旋糖当量；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))(其具有100％α-1，4键并且典型地主要含有低聚糖(约DP2-DP20))。右旋糖酐(右旋糖酐T-10，平均分子量为10000道尔顿，西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))(其是含有＞95％α-1，6键的多糖)和水解的右旋糖酐也在聚合反应中使用。通过在pH 1.0，加热在141mL水中的含有15g右旋糖酐的T-10的溶液至90℃制备水解的右旋糖酐。表10中示出了在水解的右旋糖酐制剂中的低聚糖的分布。
表10
水解的右旋糖酐制剂的组成
| 葡萄糖 | DP2 | DP3 | DP4 | DP5 | DP6 | DP7 | DP8-10 | DP10+ | 总计 | |
| g/L | 3.8 | 13.2 | 14.3 | 11.7 | 10.2 | 16.6 | 7.7 | 26.2 | 10.2 | 113.9 |
| wt％<sup>a</sup> | 3.4 | 11.6 | 12.5 | 10.3 | 8.9 | 14.6 | 6.8 | 23.0 | 8.9 | 100.0 |
a重量百分比是相对于测量的糖类组分。
遵循实例3中所述的方案进行GTFJ反应，除了使用麦芽糊精、右旋糖酐、或水解的右旋糖酐而不是实例2(表5)中产生的低聚糖。表11提供了这些反应的结果。在使用水解的右旋糖酐(实例6.1和6.2)和具有各种右旋糖当量的麦芽糊精(实例6.3-6.5)的反应中的不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物的产率不受添加这些不同类型的低聚糖的影响或者仅受到略微的影响(表11，将实例6.1-6.5与实例6A比较)。
表11
含有不同类型的添加的低聚糖或多糖的葡糖基转移酶反应的谱图
a存在于每个反应的蔗糖组分中的微量葡萄糖。
bDE，右旋糖当量。
表11中的结果说明主要地含有α-1，6键(水解的右旋糖酐，实例6.1和6.2)或α-1，4键(麦芽糊精，实例6.3-6.5)的低聚糖，当添加至葡糖基转移酶反应中时，不显著提高不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物的产率。另外，似乎为了使α-1，6-连接的糖类分子提高葡聚糖产物产率，此类的糖类分子必须处于较大的多糖(约10000道尔顿)的形式，因为右旋糖酐T-10(实例6.6-6.7)提高了不溶性α-1，3-葡聚糖产物的产率，而其低聚糖对应物(实例6.1-6.2)不是如此。
另一方面，表6、7(实例3)、和9(实例5)说明包含α-1，3键和α-1，6键的低聚糖能够显著地提高在葡糖基转移酶反应中不溶性α-1，3-葡聚糖的产率。基于这些数据，以及仅具有α-1，6键的低聚糖不显著地影响α-1，3-葡聚糖产物的产率(表11)，似乎表5中的低聚糖的α-1，3键组分是提高不溶性α-1，3-葡聚糖产物的产率所必须的。
因此，低聚糖可能必须至少含有一部分的α-1，3糖苷键才能提高葡糖基转移酶反应中不溶性α-1，3-葡聚糖的产率。
实例7
α-1，3-葡聚糖合成反应中低聚糖的分离和再循环
这一实例公开了，从葡聚糖聚合反应分离的低聚糖可用于在运行聚合反应多个循环之后获得一致的葡聚糖产物产率提高。
以如下方式制备第一葡聚糖合成反应。称出蔗糖(75g)并且用去离子水在连接有LAUDA RK20循环冷却器的1-L无挡板有夹套的烧瓶中稀释至0.75L。然后添加FermasureTM(0.5mL/L反应)，并且使用5wt％水性氢氧化钠或5wt％水性硫酸将pH调节至5.5。将从葡聚糖聚合反应中获得纯化的低聚糖(表5，实例2)添加到制剂中至DP2+的总浓度为约5g/L。使附接到四刀片PTFE刀片的顶置式机械马达来提供对制剂的搅动，并且将温度控制在25℃。通过添加0.3vol％粗制GTFJ酶(SEQ ID NO：2)提取物引发聚合反应。在通过HPLC测定反应完成后，通过过滤分离不溶性聚合物产物。然后将聚合物产物用水(1.5L)洗涤，然后用丙酮(0.5L)洗涤，并且然后在真空烘箱下干燥。记录干α-1，3-葡聚糖产物的质量。
使用旋转蒸发器将反应的滤液浓缩至约30wt％干固体。将这一滤液的25-mL级分通过柱色谱法使用
EXPLORER系统(美国通用电气公司(General Electric)，康涅狄格州费尔菲尔德)纯化。表12中总结了色谱纯化的运行条件。
表12
色谱纯化运行条件
| 树脂类型 | BioRad BIO-GEL P-2凝胶 |
| 粒度(微米) | 45-90 |
| 床长度(cm) | 100 |
| 柱直径(m) | 0.026 |
| 原料量(mL) | 25 |
| 大致原料干固体(g/100g) | 30 |
| 柱温度(℃) | 50 |
| 流速(mL/min) | 50 |
将从色谱分离的级分收集在10-mL部分中并且通过HPLC进行分析。将含有低聚糖的级分合并并且通过旋转蒸发在40℃浓缩。
然后使用这些纯化的低聚糖在新的葡聚糖合成反应(实例7.1，表13)中作为低聚糖来源，遵循第一反应的方案(见上文)；将约5g/L的低聚糖提供到反应中。在这一反应完成后，将低聚糖(DP2+)通过上述方案由此纯化并且用于后续的反应中。将运行包含刚从前一反应中纯化的低聚糖(DP2+)葡聚糖的聚合反应的这一循环重复另外四次：将来自实例7.1的反应的低聚糖添加至实例7.2的反应中，将来自实例7.2的反应的低聚糖添加至实例7.3的反应中，将来自实例7.3的反应的低聚糖添加至实例7.4的反应中，将来自实例7.4的反应的低聚糖添加至实例7.5的反应。表13中总结了来自这些实验的数据，其示出相比于对比实例7A的提高的α-1，3-葡聚糖产率，对比实例7A中没有在反应中添加任何低聚糖。
表13
使用从先前反应中回收的低聚糖的葡糖基转移酶反应的谱图
因此，基于表13中示出的结果，产生自葡聚糖聚合反应的低聚糖(DP2+)可用于在运行聚合反应多个循环之后获得相当一致的葡聚糖产物产率提高。
实例8
使用改进的GTF酶的葡聚糖聚合反应
这一实例公开了在α-1，3-葡聚糖合成反应中产生的滤液的低聚糖组合物，所述反应由改进的葡糖基转移酶来催化。
产生具有约100％α-1，3键的α-1，3-葡聚糖的唾液链球菌葡糖基转移酶的氨基酸序列经过对其催化结构域的修饰使得所述酶，如相比于所述酶的未修饰的对应物，可从蔗糖底物中产生更多产物(α-1，3-葡聚糖和果糖)、以及更少的副产物(例如，葡萄糖、低聚糖例如明串珠菌二糖和DP2-7葡萄糖-低聚糖)(参考美国专利申请公开号2018/0072998，其通过引用并入本文)。
使用改进的葡糖基转移酶的α-1，3-葡聚糖合成反应在包含溶于水中的94g/L的白色结晶蔗糖的5000-gal不锈钢容器中进行。使用10mM磷酸钾作为缓冲液保持反应的pH并使用2N H2SO4将其调节至5.5。在100ppmv添加抗微生物剂，XL，以防止在反应过程中的污染。该反应器含有三个设置为33rpm的倾斜叶片叶轮，并使用流入反应器夹套中的冷却水将其控制在23℃。通过添加30磅改进的葡糖基转移酶引发反应，并且在14小时后认为反应完成，此时蔗糖浓度达到小于2g/L。在反应结束时，通过使用外部热交换器将反应内容物加热至65℃持续30分钟将葡糖基转移酶灭活。
使用压滤机将反应中产生的不溶性α-1，3-葡聚糖聚合物(即，不溶性级分)从可溶性级分分离，由此提供滤液。表14提供了滤液中的碳水化合物含量(dwb)。
表14
滤液的碳水化合物组成(wt％-以干重计)
a除了DP2葡萄糖-低聚糖，至少包括蔗糖。
使用强酸性阳离子交换树脂的色谱分离被用于分离滤液的低聚糖级分。表15中是用于此分离的柱的物理参数。
表15
用于色谱分离的柱的物理参数
因此，使用离子交换的自来水将滤液改变为30g干固体/100g溶液。在将这一改变的滤液添加到柱树脂中之前，用六个床体积(BV)的氯化钠溶液(在10wt％氯化钠的情况下三个BV然后在5wt％氯化钠的情况下三个BV)洗涤树脂，以将树脂转化为钠的形式。然后将改变的滤液(15L)进料到柱上，之后使用离子交换的水，在30L/h的流速和70℃的柱温度下，将柱洗脱。
在140分钟和185分钟之间洗脱低聚糖溶液并回收。通过HPLC分析如此制备的低聚糖级分以确定其产物分布。简而言之，使用配备有折射率检测器的Agilent 1260HPLC测量了低聚糖级分的组成。使用BioRad AMINEX HPX-42A柱，使用水作为洗脱液，以85℃和0.6mL/min的流速实现低聚糖的分离。表16中提供了低聚糖的组成谱图。
表16
通过分馏回收的低聚糖的组成(wt％-以干重计)
| DP2 | DP3 | DP4 | DP5 | DP6 | DP7+ |
| 11 | 23 | 28 | 21 | 12 | 5 |
使表16中描述的低聚糖级分经受部分甲基化的糖醇乙酸酯(PMAA)分析(按照Pettolino等人，Nature Protocols[自然试验方案]7：1590-1607中的方法)并将其通过GC-MS进行分析。简而言之，用DMSO阴离子和碘甲烷处理样品以使羟基甲基化，并且然后将其用三氟乙酸水解。然后用乙酸酐将从断裂的糖苷键中产生的羟基乙酰化，并通过GC/MS分析所得的葡萄糖醇。发现低聚糖具有表17中所述的分布(其中所有键被认为是α)。主要的键是α-1，3。在该低聚糖级分中未检测到末端果糖。
表17
低聚糖的键分布
| 键 | 键％ |
| 1→3 | 87.5 |
| 1→6 | 7.3 |
| 1→3，6 | 2.8 |
| 1→4 | 1.0 |
| 1→2，3 | 0.7 |
| 1→2 | 0.6 |
| 1→3，4 | 0.3 |
因此，表征了使用来自改进的葡糖基转移酶的葡聚糖合成反应的滤液中存在的DP2+低聚糖。此类低聚糖或例如包含此类低聚糖的滤液可用作添加的低聚糖的来源用于进行如本文公开的葡糖基转移酶反应。
实例9
葡萄糖、明串珠菌二糖、果糖、或葡萄糖-低聚糖添加剂对α-1，3-葡聚糖合成反应
的作用
这一实例公开了比较各种糖类或低聚糖对用于合成α-1，3-葡聚糖的酶促反应的个体作用。与上述数据(例如，实例3、5、7)一致，这一实例示出向α-1，3-葡聚糖合成反应中添加某些低聚糖可提高产物产率。此外，这一更高产率反应的α-1，3-葡聚糖产物具有显著降低的本征粘度。
将100g/L蔗糖/10mM KH2PO4溶液(500mL，用氢氧化钠或硫酸将pH调节至5.5)添加至伴有顶置式搅动的独立的500-mL树脂釜中。然后添加以下材料：葡萄糖至10g/L，明串珠菌二糖至10g/L，纯化的葡萄糖-低聚糖至10g/L(以实例8中相似的方法产生)，果糖至5g/L，果糖至10g/L，果糖至15g/L，或果糖至30g/L。一个釜不接受任何另外的材料并且设置为对照。将每个釜的温度调节至25℃。然后通过添加一等分试样(610μL)的在实例8中使用的葡糖基转移酶引发每个反应并且允许反应在25℃伴随适度的搅动运行持续约16小时。然后取每个反应的样品，离心并且通过HPLC进行液体分析以获得糖含量。然后将在每个反应中产生的不溶性α-1，3-葡聚糖过滤，用约1L的水洗涤，然后在真空烘箱中在45℃干燥若干天。弃去反应滤液。
在每个反应中大于99％的蔗糖被转化。表18提供了以HPLC计(葡糖基消耗不同)并以干固体重计的每个反应的α-1，3-葡聚糖产率。这些产率测量值均与彼此相当一致。
表18
葡糖基转移酶反应添加剂对α-1，3-葡聚糖产率的作用
表18示出，在添加葡萄糖(与实例4一致)或提高量的果糖时，α-1，3-葡聚糖产率降低，后者可用于提高明串珠菌二糖副产物的产率(数据未示出)。尽管添加明串珠菌二糖没有作用，但添加从单独的葡糖基转移酶反应纯化的葡萄糖-低聚糖提高了α-1，3-葡聚糖的产率。
测量了在一些上述反应中产生的α-1，3-葡聚糖的分子量(DPw)和本征粘度(η，以mL/g提供)(简称“IV”)并且在表19中示出。根据美国专利申请公开号2017/0002335，获得了本实例的IV测量值，该申请通过引用并入本文。
表19
葡糖基转移酶反应添加剂对α-1，3-葡聚糖产物IV和DPw的作用
a与如上所述(表18)相同的对照反应。这一反应的α-1，3-葡聚糖产物的IV没有测量。
b以与对照-1反应相似的方式进行的单独的对照反应。
表19示出，在添加从单独的葡糖基转移酶反应纯化的葡萄糖-低聚糖后，α-1，3-葡聚糖的IV显著地降低。尽管这一α-1，3-葡聚糖的DPw也降低了，但并不认为这一变化解释了IV的降低，因为其他的添加剂也降低了DPw，但是没有显著地降低IV。这在例如果糖添加(30g/L)上是很明显的，果糖添加实质上产生了α-1，3-葡聚糖DPw的相同的降低，但是对于IV没有可观察的作用。
因此，添加α-1，3-葡聚糖合成反应的葡萄糖-低聚糖副产物到新的α-1，3-葡聚糖合成反应中可(i)提高通过新反应产生的α-1，3-葡聚糖的产率，并且(ii)降低通过新反应产生的α-1，3-葡聚糖的IV。
实例10
在缺少或含有添加的葡萄糖-低聚糖的葡糖基转移酶反应中产生的α-1，3-葡聚糖
的比较
这一实例公开了，添加产生自α-1，3-葡聚糖聚合反应的葡萄糖-低聚糖可用于获得与不具有添加的葡萄糖-低聚糖的反应中产生的α-1，3-葡聚糖相比，具有更低的水性浆液粘度和更低的溶解聚合物溶液粘度的α-1，3-葡聚糖产物。
在这一实例中制备的每个反应中使用了实例8中使用的葡糖基转移酶。
不添加葡萄糖-低聚糖的第一α-1，3-葡聚糖反应在具有顶置式搅拌和外部冷却器/加热器以维持恒定温度的4-L有夹套的玻璃反应器中制备。通过如下步骤制备反应介质：添加299g的蔗糖至2412g的水中，随后添加3.54g的磷酸钾和130μL的
然后使用氢氧化钠或硫酸将溶液pH调节至5.5。将反应器维持在20℃的恒定温度伴随使用三个45°倾斜叶片叶轮以250rpm搅拌的恒定搅拌。通过将0.1vol％葡糖基转移酶溶液添加至搅拌的溶液中来引发所述反应。当蔗糖低于5g/L时，反应完成，随后将整个反应器加热至高于65℃持续最少1小时，随后冷却至室温。
将在第一反应中产生的α-1，3-葡聚糖在带有滤纸的真空布氏漏斗中过滤，并且将滤液(其含有葡萄糖-低聚糖)收集以用于后续的反应。然后洗涤α-1，3-葡聚糖饼并且用超过8L水过滤以从α-1，3-葡聚糖中分离糖类，从而提供具有大于10wt％固体的饼(相应地测量固体百分比)。
在相同的反应器容器中，通过添加299g的蔗糖至780g的来自第一反应的滤液和1632g的水中，制备第二反应。因为所述滤液含有1.03g的磷酸钾，将2.51g的磷酸钾添加至第二反应。将溶液混合并且将温度控制在20℃，随后添加130μL的
和0.1vol％葡糖基转移酶溶液。在第二反应中重复第一反应的加热和过滤步骤。
将第三反应设置为第二反应的重复，但是使用从第二反应中收集的滤液。表20总结了第一至第三反应中每一个的组分(分别为反应1-3)。
表20
反应1-3的糖类组分
| 组分 | 反应1 | 反应2 | 反应3 |
| 初始蔗糖(g/L) | 114 | 115 | 116 |
| 初始明串珠菌二糖(g/L) | 0.0 | 4.9 | 9.0 |
| 初始葡萄糖(g/L) | 0.5 | 2.0 | 1.4 |
| 初始果糖(g/L) | 0.3 | 16.0 | 19.6 |
| 初始葡萄糖-低聚糖(g/L) | 0.0 | 3.5 | 3.9 |
第一、第二和第三反应的每一个的α-1，3-葡聚糖产物的水性浆液粘度通过首先向葡聚糖饼添加足够的水以制备4wt％水性混合物并且然后将所述混合物均质化来测量。然后在流变仪上在20℃下测量每个混合物的粘度，将剪切速率从7s-1升至200s-1并且以厘泊(cP)测量粘度。图2示出了测量值，其示出如在第一至第三反应中连续制备的α-1，3-葡聚糖产物的水性浆液粘度的降低。
在DMAc/0.5％LiCl中溶解至浓度为10mg/mL以后，测量了第一至第三反应中的α-1，3-葡聚糖产物的每一个的分子量(DPw)和本征粘度(IV)(表21，分别为反应1-3)。
表21
反应1-3的α-1，3-葡聚糖产物的分子量和IV
| 反应1 | 反应2 | 反应3 | |
| DPw | 773 | 753 | 736 |
| IV(mL/g) | 292 | 262 | 248 |
因此，与上述实例9的结果一致，将α-1，3-葡聚糖合成反应的葡萄糖-低聚糖副产物添加至新的α-1，3-葡聚糖合成反应可降低通过新反应产生的α-1，3-葡聚糖的粘度(如以水性浆液和溶解聚合物形式两者测量的)。
实例11
其中以分批或补料分批方式添加葡萄糖-低聚糖的葡糖基转移酶反应中产生的α-
1，3-葡聚糖聚合物的比较
这一实例公开了，添加产生自α-1，3-葡聚糖聚合反应的葡萄糖-低聚糖可以分批或补料分批模式用于进一步的反应。具体地，这一实例公开了，在α-1，3-葡聚糖聚合反应(补料分批添加)过程中添加葡萄糖-低聚糖降低了随反应时间产生的葡聚糖聚合物的粘度。然而，在反应最后产生的最终α-1，3-葡聚糖聚合物比在反应开始时分批提供全部的添加的葡萄糖-低聚糖(分批添加)的反应中产生的α-1，3-葡聚糖聚合物具有更高的粘度。相比于分批反应，补料分批模式反应的聚合物产物的更高的最终本征粘度(IV)很可能是由于反应的更低的初始葡萄糖-低聚糖浓度。
在这一实例中制备的每个反应中使用了实例8中使用的葡糖基转移酶。在这些反应中使用的葡萄糖-低聚糖以例如实例10中制备的葡糖基转移酶反应滤液的形式提供。
在具有顶置式搅拌和外部冷却器/加热器以维持恒定温度的4-L有夹套的玻璃反应器中制备补料分批反应。通过如下步骤制备反应介质：添加260g的蔗糖至1656g的水中，随后添加2.51g的磷酸钾和130μL的
然后使用氢氧化钠或硫酸将溶液pH调节至5.5。将反应器维持在23℃的恒定温度伴随使用三个45°倾斜叶片叶轮以200rpm的恒定搅拌。通过将0.1vol％葡糖基转移酶溶液添加至搅拌的溶液中来引发所述反应。在反应开始之后，以78mL/hr的速率，添加葡萄糖-低聚糖。在最初的六个小时里，每小时从反应器中除去样品；将每个样品中的α-1，3-葡聚糖产物通过过滤从液体中分离并且然后用水洗涤三次。当蔗糖低于5g/L(约22小时)时，反应完成，随后将整个反应器加热至高于65℃持续最少1小时，随后冷却至室温。
在相同的反应器容器中，以260g的蔗糖混合1656g的水和780g的含有葡萄糖-低聚糖的液体，制备分批反应。将溶液混合并且将温度控制在20℃，随后添加130μL的
和0.1vol％葡糖基转移酶溶液。获得并处理样品，并且以与完成补料分批反应相同的方式来终止所述反应。
表22示出在补料分批和分批反应期间葡萄糖-低聚糖浓度的变化，并且确认了初始葡萄糖-低聚糖浓度最初在分批反应中比在补料分批反应更高。
表22
在补料分批和分批反应期间的葡萄糖-低聚糖浓度
在DMAc/0.5％LiCl中溶解至浓度为10mg/mL以后，测量了补料分批和分批反应的各自的α-1，3-葡聚糖产物的分子量(MW)和本征粘度(IV)(表23和24)。
表23
补料分批和分批反应的α-1，3-葡聚糖产物的粘度
表23示出，在补料分批反应中，α-1，3-葡聚糖聚合物粘度随时间降低。然而，补料分批最终α-1，3-葡聚糖粘度高于分批最终α-1，3-葡聚糖粘度(均在22-小时时间点上测量，表23)。
表24
补料分批和分批反应的α-1，3-葡聚糖产物的分子量
因此，与上述实例9-10的结果一致，以分批或补料分批模式添加α-1，3-葡聚糖合成反应的葡萄糖-低聚糖副产物到新的α-1，3-葡聚糖合成反应中可降低通过新反应产生的α-1，3-葡聚糖的粘度。不过，值得注意的是，此类的分批模式的添加对于降低聚合物粘度作用更大。
实例12
在各种温度下添加葡萄糖-低聚糖的葡糖基转移酶反应中产生的α-1，3-葡聚糖聚
合物的比较
这一实例公开了，在不同的温度下，将产生自α-1，3-葡聚糖聚合反应的葡萄糖-低聚糖添加至其他的α-1，3-葡聚糖聚合反应降低了后一些反应的葡聚糖聚合物产物的粘度。在更低的反应温度下，这一粘度的变化显著地更高。
在这一实例中制备的每个反应中使用了实例8中使用的葡糖基转移酶。在这些反应中使用的葡萄糖-低聚糖以例如实例10中制备的葡糖基转移酶反应滤液的形式提供。
在具有顶置式搅拌和外部冷却器/加热器以维持恒定温度的500-mL有夹套的玻璃反应器中进行反应。通过如下步骤制备反应介质：添加50g的蔗糖至469g的水中，随后添加0.68g的磷酸钾和25μL的
然后使用氢氧化钠或硫酸将溶液pH调节至5.5。将反应器维持在恒定温度伴随使用三个45°倾斜叶片叶轮以200rpm的恒定搅拌。通过将0.1vol％葡糖基转移酶溶液添加至搅拌的溶液中来引发每个反应。当蔗糖低于5g/L时，每个反应完成，随后将整个反应器加热至高于65℃持续最少1小时，随后冷却至室温。
以三个温度和三个葡萄糖-低聚糖浓度来运行反应(1-9)。通过添加适当量的来自前述α-1，3-葡聚糖聚合作用的滤液，改变所述葡萄糖-低聚糖浓度。添加至每个反应中的液体是水和滤液的适当的混合物。表25示出反应1-9的反应温度和初始葡萄糖-低聚糖浓度。在全部反应完成后，将α-1，3-葡聚糖产物过滤并且用超过1L的水洗涤以制备具有大于10wt％固体的葡聚糖湿饼。将每个饼在DMAc/0.5％LiCl中溶解至10mg/mL的浓度，随后测量葡聚糖聚合物产物的分子量和本征粘度(表25)。
表25
在具有不同的温度和初始葡萄糖-低聚糖浓度的反应中产生的α-1，3-葡聚糖的分
子量和粘度
表25示出，在具有更高的初始葡萄糖-低聚糖浓度的反应(维持在相同的温度下)α-1，3-葡聚糖产物粘度更低，这与上述结果一致。显然这一粘度变化在维持在更低温度中的反应中更显著(从百分比来看)。
实例13
在延迟添加葡萄糖-低聚糖的葡糖基转移酶反应中产生的α-1，3-葡聚糖聚合物
这一实例公开了，相比于不添加葡萄糖-低聚糖的α-1，3-葡聚糖聚合反应，添加产生自α-1，3-葡聚糖聚合反应的葡萄糖-低聚糖至反应开始四小时后的另一α-1，3-葡聚糖聚合反应(通过添加葡糖基转移酶引发)产生了具有相似粘度的葡聚糖聚合物。
在这一实例中制备的反应中使用了实例8中使用的葡糖基转移酶。在这一反应中使用的葡萄糖-低聚糖以例如实例10中制备的葡糖基转移酶反应滤液的形式提供。
在具有顶置式搅拌和外部冷却器/加热器以维持恒定温度的500-mL有夹套的玻璃反应器中制备反应。通过如下步骤制备反应介质：添加46g的蔗糖至364g的水中，随后添加0.44g的磷酸钾和20μL的
然后使用氢氧化钠或硫酸将溶液pH调节至5.5。将反应器维持在19℃的恒定温度伴随使用三个45°倾斜叶片叶轮以150rpm的恒定搅拌。通过将0.1vol％葡糖基转移酶溶液添加至搅拌的溶液中来引发所述反应。反应引发四小时后，将含有11.5g的蔗糖、0.11g磷酸钾、和100g具有葡萄糖-低聚糖的液体的液体添加至反应。当蔗糖低于5g/L时，反应完成，随后将整个反应器加热至高于65℃持续最少1小时，随后冷却至室温。
在反应完成后，将α-1，3-葡聚糖产物过滤并且用超过1L的水洗涤以制备具有大于10wt％固体的葡聚糖湿饼。将饼在DMAc/0.5％LiCl中溶解至10mg/mL的浓度，随后测量葡聚糖聚合物产物的分子量和本征粘度(表26)。
表26
在具有延迟的葡萄糖-低聚糖添加的反应中产生的α-1，3-葡聚糖的分子量和粘度
从表26中显然可见，相比于仅具有适量的添加的葡萄糖-低聚糖的α-1，3-葡聚糖聚合反应，添加产生自α-1，3-葡聚糖聚合反应的葡萄糖-低聚糖至反应开始一段时间的另一α-1，3-葡聚糖聚合反应产生了具有相似粘度的葡聚糖聚合物。
Claims (16)
1.一种用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：
(a)提供低聚糖，所述低聚糖：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)产生自葡糖基转移酶反应；
(b)至少接触水、蔗糖、所述低聚糖、和合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶，
其中产生了不溶性α-1，3-葡聚糖；以及
(c)任选地，分离在步骤(b)中产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述低聚糖包含约60％-99％的α-1，3糖苷键和约1％-40％的α-1，6糖苷键。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述低聚糖具有2至10的聚合度(DP)。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述低聚糖是纯化的或未纯化的。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述低聚糖产生自(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应。
6.如权利要求5所述的方法，其中(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应合成不溶性α-1，3-葡聚糖。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述低聚糖提供为(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应的可溶性级分，并且其中所述可溶性级分是处理的或未处理的。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述可溶性级分是(a)(ii)的所述葡糖基转移酶反应的一部分或全部滤液。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述低聚糖在步骤(b)中以至少约1g/L的初始浓度提供。
10.如权利要求1所述的方法，其中相比于如果步骤(b)缺少所述低聚糖时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的产率，产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖的产率提高。
11.如权利要求1所述的方法，其中相比于如果步骤(b)缺少所述低聚糖时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度，产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度降低，其中粘度用在液体中混合或溶解的α-1，3-葡聚糖来测量。
12.如权利要求1所述的方法，其中产生的所述不溶性α-1，3-葡聚糖具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)。
13.如权利要求1所述的方法，其中将步骤(a)和(b)重复一次或多次，并且其中在每个重复的步骤(a)中，所述低聚糖从产生自每个紧接着的前述步骤(b)的产物提供。
14.一种用于生产不溶性α-1，3-葡聚糖的反应组合物，所述反应组合物至少包含水、蔗糖、合成不溶性α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶、和低聚糖，其中所述低聚糖在所述反应组合物的制备期间添加并且：
(i)包含α-1，3和α-1，6糖苷键，和/或
(ii)产生自葡糖基转移酶反应，
其中不溶性α-1，3-葡聚糖在所述反应组合物中产生。
15.一种包含不溶性α-1，3-葡聚糖的组合物，所述不溶性α-1，3-葡聚糖是如权利要求1所述的方法产生的。
16.如权利要求15所述的组合物，其中，所述不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度是小于如果所述低聚糖不在所述方法或反应组合物中提供时会产生的不溶性α-1，3-葡聚糖的粘度，其中粘度用在液体中混合或溶解的α-1，3-葡聚糖来测量。
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