JP2018518179A - 直鎖状ポリα−1,3−グルカンを生成するためのグルコシルトランスフェラーゼアミノ酸配列モチーフ - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、どちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第62/180,779号明細書(2015年6月17日出願)および同第62/180,788号明細書(2015年6月17日出願)の利益を主張するものである。
配列表の正式な写しは、2016年6月14日作成の20160615_CL6452USNPSequenceListing_ST25_ExtraLinesRemoved.txtのファイル名を備え、704キロバイトのサイズを有するASCIIフォーマットの配列表としてEFS−Webを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このASCIIフォーマットの文書内に含有される配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960または配列番号20の残基55〜960を含まず、およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成する反応溶液に関する。
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960または配列番号20の残基55〜960を含んでおらず;これにより少なくとも95%のα−1,3グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンが生成される工程、およびb)任意選択的に、工程(a)で生成されたポリα−1,3−グルカンを単離する工程を含む。
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフからなる群から選択され;
これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む。
所定のアミノ酸が相互に類似の構造的特徴および/または荷電特徴を共有する(すなわち、保存されている)ことを前提にすると、本明細書のタンパク質の各位置でのアミノ酸は、本明細書に開示した配列で提供されるようなアミノ酸であってよい、または以下のように、保存アミノ酸残基で置換されていてもよい(「保存的アミノ酸置換」):
1.次の小さな脂肪族の非極性もしくは弱極性の残基は、相互に置換することができる:Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、Gly(G);
2.次の極性の負荷電残基およびそれらのアミドは、相互に置換することができる:Asp(D)、Asn(N)、Glu(E)、Gln(Q);
3.次の極性の正荷電残基は、相互に置換することができる:His(H)、Arg(R)、Lys(K);
4.次の脂肪族の非極性残基は、相互に置換することができる:Ala(A)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V)、Cys(C)、Met(M);および
5.次の大きな芳香族残基は、相互に置換することができる:Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)。
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、20、28、30、65、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の55〜960、配列番号28の残基55〜960、配列番号20の55〜960を含んでいない反応溶液に関する。重要にも、そのような反応溶液中のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成する。大部分もしくは完全に直鎖状であるそのようなグルカンは、紡糸および他の産業用途において使用するために好適である。
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含むグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含む可能性がある。
モチーフ(i)は、「モチーフ1a」と一致する(図3)。モチーフ(ii)は、「モチーフ2」と一致する(図5)。モチーフ(iii)は、「モチーフ3a」と一致する(図7)。
(A)グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸231〜243位と整列する;
(B)グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸396〜425位と整列する;および/または
(C)グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸549〜567位と整列する。
(a)少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の3つのモチーフ:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(iii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、20、28、30、65、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960または配列番号20の残基55〜960を含んでおらず、
これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンが生成される工程;および
b)任意選択的に、工程(a)で生成されたポリα−1,3−グルカンを単離する工程を含む方法。重要にも、そのような方法で生成されたポリα−1,3−グルカンは、大部分もしくは完全に直鎖状である。したがってこの方法は、任意選択的に直鎖状(または大部分が直鎖状)ポリα−1,3−グルカンを生成する方法として特徴できることができる。
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフからなる群から選択され、
これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む。本方法において生成されたポリα−1,3−グルカンは大部分もしくは完全に直鎖状であるので、本方法は、任意選択的に直鎖状ポリα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する方法であると特徴付けることができる。
(A)グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸231〜243位と整列する;
(B)グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸396〜425位と整列する;および/または
(C)グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸549〜567位と整列する。
1.水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の3つのモチーフ:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここでグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、20、28、30、65、または配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960もしくは配列番号20の残基55〜960を含んでおらず;およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成する反応溶液。
(A)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸231〜243位と整列する;
(B)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸396〜425位と整列する;および/または
(C)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸549〜567位と整列する反応溶液。
(a)少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の3つのモチーフ:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(iii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
およびグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、20、28、30、65、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960または配列番号20の残基55〜960を含んでおらず、これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンが生成される工程;および
b)任意選択的に、工程(a)で生成されたポリα−1,3−グルカンを単離する工程を含む方法。
(1)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸231〜243位と整列する;
(2)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸396〜425位と整列する;および/または
(3)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸549〜567位と整列する方法。
グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の少なくとも1つのモチーフの存在を検出する工程であって、少なくとも1つのモチーフは:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフからなる群から選択され、
これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む方法。
(a)in silicoで、
(b)核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
(c)タンパク質シークエンシング工程を含む方法を用いて、および/または
(d)タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施される方法。
本明細書で使用する略語の一部の意味は、次のとおりである:「g」はグラムを指し、「h」は時間を指し、「mL」はミリリットルを指し、「psi」は毎平方インチ当たりポンドを指し、「wt%」は重量%(パーセント)を指し、「μm」はマイクロメートルを指し、「℃」は摂氏温度を指し、「mg」はミリグラムを指し、「mm」はミリメートルを指し、「μL」はマイクロリットルを指し、「mmol」はミリモルを指し、「min」は分間を指し、「mol%」はモル%を指し、「M」はモルを指し、「rpm」は毎分回転数を指し、「MPa」はメガパスカルを指し、「IV」は固有粘度を指し、「g’」は分岐比を指す。
グルコシルトランスフェラーゼ(GTF)酵素の粗抽出物の調製
GTF酵素は、次のように調製した。E.コリ(coli)TOP10(登録商標)細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)は、特定のGTFコーディングDNA配列を含有するpJexpress404(登録商標)をベースとする構築物により形質転換させた。各配列は、E.コリ(coli)内でGTF酵素を発現させるためにコドン最適化された。特定のGTF酵素を発現する個々のE.コリ(coli)菌株は、振とうしながら37℃でアンピシリン(100μg/mL)を用いてLB(Luriaブロス)培地(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ)中でOD600=0.4〜0.5となるまで増殖させ、その時点にIPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド、製品番号I6758,Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を最終濃度が0.5mMとなるまで加えた。この培養をIPTG誘導後に37℃で2〜4時間にわたりインキュベートした。細胞は15分間にわたる5,000×gでの遠心分離によって採取し、ジチオスレイトール(DTT、1.0mM)が補給された50mMのリン酸バッファー(pH7.0)中に再懸濁させた(20(w/v)%)。再懸濁細胞は、>95%の細胞溶解を保証するために、Frenchプレッシャーセル(SLM Instruments,Rochester,NY)を2回通過させた。溶解細胞は、4℃、12,000×gで30分間遠心分離した。結果として生じた上清は、GTF酵素の発現を確証するためにBCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイ(Sigma−Aldrich)およびSDS−PAGEによって分析し、上清を−20℃で保管した。
GTF酵素活性は、GTF反応溶液中で還元糖(フルクトースおよびグルコース)の生成を測定することによって確証した。反応溶液は、GTF抽出物(上記のように調製した)を、スクロース(50もしくは150g/L)、リン酸カリウムバッファー(pH6.5、50mM)および任意選択的にデキストラン(1mg/mL、デキストランT10、製品番号D9260、Sigma−Aldrich)を含有する混合物に加えることによって調製した;GTF抽出物は2.5体積%〜5体積%まで加えた。次に反応溶液を22〜25℃で24〜30時間にわたりインキュベートし、その後に反応溶液を遠心分離した。1NのNaOHおよび0.1%の塩化トリフェニルテトラゾリウム(Sigma−Aldrich)を含有する混合物に上清(0.01mL)を加えた。この混合物を5分間インキュベートし、その後に還元糖であるフルクトースおよびグルコースの存在を測定するためにULTROSPEC分光光度計(Pharmacia LKB,New York,NY)を使用してOD480を決定した。
GTF酵素によって合成されたグルカン生成物中のグリコシド結合は、13CNMR(核磁気共鳴)によって決定した。乾燥グルカンポリマー(25〜30mg)は、50℃で攪拌しながら3重量%のLiClを含有する1mLの重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO)中に溶解させた。ガラスピペットを使用して、0.8mLの溶液を5mmのNMRチューブ内に移した。26,041.7Hzのスペクトル窓を使用して、スペクトル周波数125.76MHzにあるCPDULクライオプローブを備えたBruker Avance 500−MHz NMR分光計(Billerica,MA)を使用して定量的な13CNMRスペクトルを入手した。waltzデカップリングを使用する逆ゲーテッドデカップリングパルスシーケンスを、0.629秒間のデータ取得時間、5秒間のパルス間遅延時間および6,000パルスで使用した。時間ドメインのデータは2.0Hzの指数関数的乗算を使用して変換した。
GTF酵素により合成されたグルカン生成物のDPnは、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定した。乾燥グルカンポリマーは、N,N−ジメチル−アセトアミド(DMAc)および5%のLiCl中に5mg/mLで溶解させ、100℃で一晩振とうした。使用したSECシステムは、3基のオンライン検出器:Waters製の示差屈折計2410、Wyatt Technologies(Santa Barbara,CA)製のマルチアングル光散乱測光計Heleos(商標)8+およびWyatt製の示差毛細管式粘度計ViscoStar(商標)と結合したWaters Corporation(Milford,MA)製のAlliance(商標)2695分離モジュールであった。SECのために使用したカラムは、Shodex(日本)製の4本のスチレン−ジビニルベンゼンカラムと、ポリマー分散の低分子量領域での解像度を改良するための2本のKD−806M、KD−802およびKD−801リニアカラムであった。移動相は0.11%のLiClを含むDMAcであった。使用したクロマトグラフィーの条件は、カラムおよび検出器区画で50℃、試料および注入器区画で40℃、流量0.5mL/minおよび注入量100μLであった。データ整理のために使用したソフトウエアパッケージは、Waters製のEmpower(商標)バージョン3(広域グルカンポリマー標準物質を用いて較正)およびWyatt製のAstra(登録商標)バージョン6(カラム較正を用いる三重検出法)であった。
マルチ検出器サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、光散乱(LS)光度計および示差屈折計(DR)の組み合わせを使用したモル質量分布(MMD)の測定を許容した。ポリマー分布全体に及ぶ分離分画のモル質量(M)は、2つの検出基応答の比率:
M〜LS/DR(任意のカラム較正を伴わない)
として測定した。
類似の方法で、インライン示差粘度計(DV)は、分離分画の固有粘度(IV):
IV〜DV/DR
の測定を可能にした。
対数−対数スケール内のMの関数としてIVをプロットすることによって、試験したサンプルについていわゆるマーク・ハウィンクプロットを入手した。
マーク・ハウィンク(MH)プロットは、モル質量の関数としてそれらのサイズを測定することを通してポリマー内の分岐度を推定するために有用であった。したがって、希釈液中の高分子の流体力学的サイズ(H)はH=IV×Mであると決定されたので、MHプロットを使用すると、ポリマー鎖のサイズがそのモル質量に伴ってどのように変化をするのかを見ることができよう。分岐状ポリマーは溶液中で同一モル質量を備えるその直鎖状対応物より小さいサイズを有し、MHプロットの位置は、ポリマーの分岐度を示す。
GTF酵素の生成
本実施例では、本試験で使用されるグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)酵素の末端短縮バージョンの調製について記載する。
GTF酵素を使用したグルカンポリマーの生成
本実施例では、グルカンポリマーを合成するために実施例1で調製されたGTF酵素を使用する工程について記載する。
GTF配列において観察された構造/機能の関係
本実施例では、数種のGTF酵素のアミノ酸配列が任意の構造を共有するかどうかを決定するためにアラインメントする工程について記載する。
高分子量α−1,3−グルカンを合成するGTF酵素内の配列モチーフ
図2においてそれらの配列が整列させられたGTF酵素がグルカンポリマーを生成する能力について、100%のα−1,3−グリコシド結合を備えるグルカンを生成するそれらの酵素に焦点を当てて詳細に評価した(表4)。
モチーフ1a(配列番号78):
D/N−K−S−I/V−L−D−E−Q−S−D−P−N−H
モチーフ2(配列番号79):
N−K−D−G−S−K/T−A−Y−N−E−D−G−T−V/A−K−Q/K−S−T−I−G−K−Y−N−E−K−Y−G−D−A−S
モチーフ3a(配列番号80):
L−P−T−D−G−K−M−D−N/K−S−D−V−E−L−Y−R−T−N/S−E
低分子量α−1,3−グルカンを合成するGTF酵素内の配列モチーフ
4種のGTF酵素は、100%のα−1,3−グリコシド結合を有する低分子量グルカンを生成した(表4)。詳細には、これらの酵素は、5926(配列番号14)、0427(配列番号26)、0874(配列番号2)および1724(配列番号10)であった。これらの酵素のそれぞれの配列は、図2において「+−」を付して示した。2つの配列モチーフは、これらのGTF酵素のアミノ酸配列内で見いだされ、公知のGTF構造の触媒ドメインの周囲に位置する2つの異なる「挿入」として出現する。手短には、これらの配列モチーフは、下記と指定した:
モチーフ1b(配列番号81):D−S/P−R−F−T−Y/F−N−A/Q/P−N−D−Pモチーフ3b(配列番号82):I−G−N−G−E
配列モチーフ1aが欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ1a(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP101であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS1a(配列番号85)をコードする核酸生成物(配列番号84)をpJexpress404(登録商標)(DNA2.0,Menlo Park,CA))内にサブクローニングした。TOP10/pMP101であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP101を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列は、配列番号85のアミノ酸54〜941位(近く)に所在することが認められる。
配列モチーフ2が欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ2(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP102であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS2(配列番号87)をコードする核酸生成物(配列番号86)をpJexpress404(登録商標)内にサブクローニングした。TOP10/pMP102であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP102を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列が配列番号87のアミノ酸54〜927位(近くに)に所在することが認められる。
配列モチーフ3aが欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ3a(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP103であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS3a(配列番号89)をコードする核酸生成物(配列番号88)をpJexpress404(登録商標)内にサブクローニングした。TOP10/pMP103であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP103を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列が配列番号89のアミノ酸54〜935位(近く)に所在すると認められる。
配列モチーフ1aおよび2が欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ1aおよび2(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP104であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS1a、2(配列番号91)をコードする核酸生成物(配列番号90)をpJexpress404(登録商標)内にサブクローニングした。TOP10/pMP104であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP104を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列は、配列番号91のアミノ酸54〜911位(近く)に所在することが認められる。
配列モチーフ1aおよび3aが欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ1aおよび3a(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP105であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS1a,3a(配列番号93)をコードする核酸生成物(配列番号92)をpJexpress404(登録商標)内にサブクローニングした。TOP10/pMP105であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP105を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列は、配列番号93のアミノ酸54〜919位(近く)に所在することが認められる。
配列モチーフ2および3aが欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ2および3a(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP106であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS2,3a(配列番号95)をコードする核酸生成物(配列番号94)をpJexpress404(登録商標)内にサブクローニングした。TOP10/pMP106であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP106を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列は、配列番号95のアミノ酸54〜905位(近く)に所在することが認められる。
配列モチーフ1a、2および3aが欠如するGTF酵素の生成
E.コリ(coli)内で発現させるために最適化されたコドン(DNA2.0,Menlo Park,CA))を使用して、配列番号65の7527GTFに類似するポリペプチドをコードするがモチーフ1a、2および3a(実施例4)の欠失を備えるヌクレオチド配列を合成した。pMP107であると同定されたプラスミドを生成するために、GTFタンパク質7527−NT−dlS1a,2,3a(配列番号97)をコードする核酸生成物(配列番号96)をpJexpress404(登録商標)内にサブクローニングした。TOP10/pMP107であると同定された菌株を生成する目的で、プラスミドpMP107を使用してE.コリ(coli)TOP10細胞を形質転換させた。GTF触媒ドメイン配列は、配列番号97のアミノ酸54〜889位(近く)に所在することが認められる。
GTF酵素によって合成されたグルカン生成物の固有粘度および分岐の分析
本実施例では、実施例6〜12において調製した欠失含有GTF酵素のそれぞれによって合成されたグルカンポリマーの固有粘度(IV)および分岐(g’)を測定する工程について説明する。これらの測定値を、モチーフ1a、2および/または3aの任意の内部欠失を有していない配列番号65の7527GTFによって生成されたグルカンポリマーを用いて得られた測定値と比較した。
GTF触媒ドメイン活性
本実施例では、不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成する能力について所定のGTFの触媒ドメイン配列を試験する方法について記載する。詳細には、GTF7527(配列番号65)および5926(配列番号14)の触媒ドメイン配列を活性について試験した。
Claims (15)
- 水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む反応溶液であって、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の3つのモチーフ:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここで前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960または配列番号20の残基55〜960を含んでおらず;
ここで前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成する反応溶液。 - 前記触媒ドメインは、配列番号65のアミノ酸54〜957位と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の反応溶液。
- (A)配列番号78と少なくとも90%同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸231〜243位と整列する;
(B)配列番号79と少なくとも90%同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸396〜425位と整列する;および/または
(C)配列番号80と少なくとも90%同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸549〜567位と整列する、請求項2に記載の反応溶液。 - モチーフ(i)は配列番号78を含み、モチーフ(ii)は配列番号79を含み、およびモチーフ(iii)は配列番号80を含む、請求項1に記載の反応溶液。
- 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、100%のα−1,3グリコシド結合を有するポリα−1,3−グルカンを合成する、請求項1に記載の反応溶液。
- 前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも400のDPwを有するポリα−1,3−グルカンを合成する、請求項1に記載の反応溶液。
- 不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成する方法であって:
(a)少なくとも水、スクロースおよびグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、下記の3つのモチーフ:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフを含む触媒ドメインを含み、
ここで前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号4の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960または配列番号20の残基55〜960を含んでおらず;
これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンが生成される工程;
および
b)任意選択的に、工程(a)で生成された前記ポリα−1,3−グルカンを単離する工程を含む方法。 - 前記触媒ドメインは、配列番号65のアミノ酸54〜957位と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の方法。
- 式中、
(1)配列番号78と少なくとも90%同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸231〜243位と整列する;
(2)配列番号79と少なくとも90%同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸396〜425位と整列する;および/または
(3)配列番号80と少なくとも90%同一である前記アミノ酸配列の位置は、配列番号65のアミノ酸549〜567位と整列する、請求項8に記載の方法。 - モチーフ(i)は配列番号78を含み、モチーフ(ii)は配列番号79を含み、およびモチーフ(iii)は配列番号80を含む、請求項7に記載の方法。
- 工程(a)において100%のα−1,3−グリコシド結合を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンが生成される、請求項7に記載の方法。
- 工程(a)において少なくとも400のDPwを有する不溶性ポリα−1,3−グルカンが生成される、請求項7に記載の方法。
- グルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定するための方法であって::
グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン内の少なくとも1つのモチーフの存在を検出する工程であって、前記少なくとも1つのモチーフは:
(i)配列番号78と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、
(ii)配列番号79と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフ、および
(iii)配列番号80と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む1つのモチーフからなる群から選択され、
これにより少なくとも95%のα−1,3−グリコシド結合および少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定する工程を含む方法。 - 前記検出する工程は:
(a)in silicoで、
(b)核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
(c)タンパク質シークエンシング工程を含む方法を用いて、および/または
(d)タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施される、請求項13に記載の方法。 - 前記検出する工程は、前記触媒ドメイン内のモチーフ(i)、(ii)および(iii)のそれぞれの存在を検出する工程を含む、請求項13に記載の方法。
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