JP2021514681A - 遺伝子操作されたグルコシルトランスフェラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
配列表の正式な写しは、約315キロバイトのサイズを有して本明細書と同時に提出される、2019年3月6日に作成された20190306_CL6607WOPCT_SequenceListing.txtのファイル名を有するASCIIフォーマットの配列表としてEFS−Webを介して電子的に提出される。このASCIIフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(a)(i)配列番号4又は配列番号4の55〜960位と少なくとも約40%同一であるアミノ酸配列を含み、且つ(ii)α−1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定すること;及び
(b)工程(a)で同定されたポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号62のアミノ酸残基Leu−513、Pro−550、Ser−553、Asn−557、Asn−558、Trp−571、Asn−573、Asp−575、Lys−578、Asn−581、Thr−585、又はGln−616に対応する位置において親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのアミノ酸を置換し、それにより、α−1,3−グリコシド結合を含み且つ親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい分子量を有する不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む。
1.配列番号62のアミノ酸残基Leu−513、Pro−550、Ser−553、Asn−557、Asn−558、Trp−571、Asn−573、Asp−575、Lys−578、Asn−581、Thr−585、又はGln−616に対応する位置で少なくとも1つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、非天然グルコシルトランスフェラーゼが、α−1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成し、且つ不溶性α−グルカンの分子量が、置換位置で非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なるのみの第2のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい、非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
グルコシルトランスフェラーゼα−グルカン生成物の分子量に影響を及ぼすアミノ酸部位の分析
本実施例は、分子量が減少したα−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼバリアントに関するスクリーニングについて記載する。
グルコシルトランスフェラーゼによる不溶性α−グルカン合成に対するアミノ酸置換の組合せの効果の分析
この実施例は、グルコシルトランスフェラーゼに対する複数のアミノ酸置換の導入の効果及びその不溶性α−グルカン合成機能におけるそれらの効果を決定することについて記載する。この分析は、例えば、不溶性α−グルカン生成物の分子量を減少させるために上記で同定されたアミノ酸置換が、同様にこの分子量効果を付与する置換の組合せに含まれ得ることを示す。
18.6%のα−1,2分枝を有するデキストラン及び低分子量のα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼを含有する反応
この実施例は、18.6%のα−1,2分枝を有するように予め改変されたデキストランプライマーを含有するグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるα−1,3−グルカンの合成について記載する。これらの反応で使用されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、酵素の未改変の対応物によって作られたグルカン生成物と比較してより小さい分子量のα−1,3−グルカンを生成するように改変された(上記実施例において開示されるとおり)。デキストラン主鎖及びα−1,3−グルカンアームを含むグラフトコポリマーを合成した。
9.7%のα−1,2分枝を有するデキストラン及び低分子量のα−1,3−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼを含有する反応
この実施例は、9.7%のα−1,2分枝を有するように予め改変されたデキストランプライマーを含有するグルコシルトランスフェラーゼ反応におけるα−1,3−グルカンの合成について記載する。これらの反応で使用されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、酵素の未改変の対応物によって生成されたグルカン生成物と比較してより小さい分子量のα−1,3−グルカンを生成するように改変された(上記実施例において開示されるとおり)。デキストラン主鎖及びα−1,3−グルカンアームを含むグラフトコポリマーを合成した。
Claims (18)
- 配列番号62のアミノ酸残基Leu−513、Pro−550、Ser−553、Asn−557、Asn−558、Trp−571、Asn−573、Asp−575、Lys−578、Asn−581、Thr−585、又はGln−616に対応する位置で少なくとも1つのアミノ酸置換を含む非天然グルコシルトランスフェラーゼであって、
前記非天然グルコシルトランスフェラーゼが、1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成し、且つ前記不溶性α−グルカンの分子量が、前記置換位置で前記非天然グルコシルトランスフェラーゼと異なるのみの第2のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい、非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 配列番号62のアミノ酸残基Leu−513、Ser−553、Asn−573、Asp−575、Lys−578、又はGln−616に対応する位置で、少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- (i)アミノ酸残基Leu−513に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、又はTyr残基によるものであり;
(ii)アミノ酸残基Pro−550に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Leu、Val、又はIle残基によるものであり;
(iii)アミノ酸残基Ser−553に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ala、Cys、Glu、Phe、His、Ile、Met、Asn、Arg、Thr、Val、又はTyr残基によるものであり;
(iv)アミノ酸残基Asn−557に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Glu、Gln、Ile、Thr、Asp、Asn、Leu、Val、又はSer残基によるものであり;
(v)アミノ酸残基Asn−558に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Asp又はGlu残基によるものであり;
(vi)アミノ酸残基Trp−571に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Val、Asp、Cys、Ile、Leu、Glu、又はSer残基によるものであり;
(vii)アミノ酸残基Asn−573に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ala、Asp、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Thr、Val、又はTrp残基によるものであり;
(viii)アミノ酸残基Asp−575に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ala、Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp、又はTyr残基によるものであり;
(ix)アミノ酸残基Lys−578に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、又はTyr残基によるものであり;
(x)アミノ酸残基Asn−581に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Pro又はGly残基によるものであり;
(xi)アミノ酸残基Thr−585に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Pro又はGly残基によるものであり;且つ/又は
(xii)アミノ酸残基Gln−616に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、又はTyr残基によるものである、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 2つ以上のアミノ酸置換を含み、前記置換の少なくとも1つが、配列番号62のアミノ酸残基Leu−513、Pro−550、Ser−553、Asn−557、Asn−558、Trp−571、Asn−573、Asp−575、Lys−578、Asn−581、Thr−585、又はGln−616に対応する位置におけるものである、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号62のアミノ酸残基Pro−550、Asn−557、Asn−558、Asn−581、又はThr−585に対応する位置で、少なくとも1つのアミノ酸置を含み;
任意選択的に:
(i)アミノ酸残基Pro−550に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Leu、Val、又はIle残基によるものであり;
(ii)アミノ酸残基Asn−557に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Glu、Gln、Ile、Thr、Asp、Asn、Leu、Val、又はSer残基によるものであり;
(iii)アミノ酸残基Asn−558に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Asp又はGlu残基によるものであり;
(iv)アミノ酸残基Asn−581に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Pro又はGly残基によるものであり;且つ/又は
(v)アミノ酸残基Thr−585に対応する位置での前記アミノ酸置換が、Pro又はGly残基によるものである、請求項4に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。 - 前記不溶性α−グルカンが、少なくとも約50%のα−1,3グリコシド結合を含む、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α−グルカンが、少なくとも約90%のα−1,3グリコシド結合を含む、請求項6に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α−グルカンが、約300未満の重量平均重合度(DPw)を有する、請求項6に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α−グルカンが、約150未満のDPwを有する、請求項8に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α−グルカンが、約75未満のDPwを有する、請求項9に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4の残基55〜960、配列番号65の残基54〜957、配列番号30の残基55〜960、配列番号28の残基55〜960、又は配列番号20の残基55〜960と少なくとも約90%同一である触媒ドメインを含む、請求項6に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 配列番号4、配列番号65、配列番号30、配列番号28、又は配列番号20と少なくとも約90%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項11に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 前記不溶性α−グルカンの分子量が、前記第2のグルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも少なくとも約10%小さい、請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ。
- 請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、任意選択的に、1つ以上の調節配列が前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結し、且つ好ましくは、前記1つ以上の調節配列がプロモーター配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 水、スクロース、及び請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼを含む反応組成物。
- 1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを生成する方法であって、
(a)少なくとも水、スクロース、及び請求項1に記載の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることであって、それにより、1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンが生成される、接触させること;及び
(b)任意選択的に、工程(a)で生成された前記不溶性α−グルカンを単離すること
を含む、方法。 - 非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、前記方法が:
(a)(i)配列番号4又は配列番号4の55〜960位と少なくとも約40%同一であるアミノ酸配列を含み、且つ(ii)1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する親グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を同定すること;
及び
(b)工程(a)で同定された前記ポリヌクレオチド配列を改変して、配列番号62のアミノ酸残基Leu−513、Pro−550、Ser−553、Asn−557、Asn−558、Trp−571、Asn−573、Asp−575、Lys−578、Asn−581、Thr−585、又はGln−616に対応する位置において前記親グルコシルトランスフェラーゼの少なくとも1つのアミノ酸を置換し、
それにより、前記不溶性α−グルカンの分子量が、前記親グルコシルトランスフェラーゼによって合成される不溶性α−グルカンの分子量よりも小さい1,3−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を提供すること
を含む、方法。 - 前記同定する工程が、
(a)in silicoで、
(b)核酸ハイブリダイゼーション工程を含む方法を用いて、
(c)タンパク質配列決定工程を含む方法を用いて、及び/若しくは
(d)タンパク質結合工程を含む方法を用いて実施され、
且つ/又は前記改変する工程が、
(e)in silicoで実施され、その後前記非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列の合成が行われるか、若しくは
(f)前記親グルコシルトランスフェラーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列の物理的なコピーを使用して実施される、
請求項17に記載の方法。
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