CN108472340A - 用于治疗庞贝氏病的增强的酸性α-葡糖苷酶 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于治疗庞贝氏病的方法，该方法包括将具有带有甘露糖‑6‑磷酸残基的最优糖基化的重组人酸性α‑葡糖苷酶与一定量的麦格司他组合给予，有效最大化重组人酸性α‑葡糖苷酶的组织摄取，同时最小化重组人酸性α‑葡糖苷酶的酶活性的抑制。

Description

用于治疗庞贝氏病的增强的酸性α-葡糖苷酶

发明领域

本发明提供了一种用于治疗庞贝氏病的方法，该方法包括将一种酸性α-葡糖苷酶及其药物分子伴侣的组合给予个体。更具体地说，本发明提供了一种用于治疗庞贝氏病的方法，该方法包括将重组人酸性α-葡糖苷酶和麦格司他的组合给予个体。

背景技术

庞贝氏病，又称为酸性麦芽糖酶缺乏症或糖原贮积症II型，是若干种溶酶体贮积失调之一。溶酶体贮积失调是常染色体隐性遗传疾病的一个类群，其特征在于细胞的糖鞘脂、糖原，或黏多糖在细胞内的区室(称为溶酶体)内的积累。具有这些疾病的个体携带编码对于催化一种或多种这些物质的水解中有缺陷的酶的突变基因，然后这些物质积累在溶酶体中。溶酶体失调的其他实例包括戈谢病、G_M1-神经节苷脂贮积症、岩藻糖苷贮积症、粘多糖贮积症、胡尔勒-施埃尔病(Hurler-Scheie disease)、尼曼-皮克A和B病(Niemann-Pick A和B)，以及法布里氏病(Fabry disease)。庞贝氏病还被分类为神经肌肉疾病或代谢性肌病。

庞贝氏病的发病率被估计为在40,000人中约1例，并且是由GAA基因的突变引起的，该GAA基因编码溶酶体的α-葡糖苷酶(EC:3.2.1.20)，该酶也常被称为酸性α-葡糖苷酶。酸性α-葡糖苷酶通过在溶酶体内将糖原催化水解为葡萄糖，参与糖原(一种分枝的聚糖，是动物中葡萄糖的主要储存形式)的代谢。因为患有庞贝氏病的个体产生的突变的、缺陷的酸性α-葡糖苷酶是非活性的或具有减少的活性，糖原分解发生缓慢或一点也不分解，并且糖原累积在不同组织的溶酶体中(特别是在横纹肌中)，导致了包括进行性肌无力和呼吸功能不全的广谱临床表现。组织(例如，心脏和骨骼肌)是特别受影响的。

庞贝氏病可以在酶的缺乏程度、严重程度和发病年龄方面广泛变化，并且已经鉴定在GAA基因中的超过500种不同的突变，它们中的许多引起不同严重程度的疾病症状。该疾病已经被分类为以下广泛类型：早发型或婴儿型，以及晚发型。早发型的疾病和更低的酶活性通常与更严重的临床病程相关。婴儿型庞贝氏病是最严重的，是由完全的或接近完全的酸性α-葡糖苷酶缺乏引起，并且出现包括严重肌肉紧张缺乏、虚弱、肝脏和心脏增大、和心肌病的症状。舌头可能变得增大和突出，并且吞咽可能变得困难。多数染病的儿童在两岁之前死于呼吸并发症或心脏并发症。晚发型庞贝氏病可以出现在大于12个月的任何年龄，并且其特征在于缺乏心脏损害和更好的短期预后。症状与进行性骨骼肌功能障碍相关，并且涉及全身性肌无力以及在躯干、近端下肢，和隔膜中的呼吸肌的消耗。一些成年患者缺乏主要症状或运动限制。预后通常取决于呼吸肌受累的程度。大多数患有庞贝氏病的受试者最终发展为需要使用轮椅和辅助通气的身体衰弱的状态，其中由于呼吸衰竭而经常发生过早死亡。

针对庞贝氏病的目前的治疗选项包括用重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)进行的酶替代疗法(ERT)。常规的rhGAA产品在阿葡糖苷酶α名下是已知的：或(健赞公司(Genzyme,Inc.))。ERT是贯穿患者一生所必需的慢性治疗，并且通过静脉输注参与替代酶的给予。该替代酶然后在循环中转运，并且进入细胞内的溶酶体，在溶酶体中该替代酶的作用是分解积累的糖原，补偿内源性缺损突变体酶缺乏的活性，并且从而缓解该疾病症状。在患有婴儿发作型示出庞贝氏病的受试者中，相比历史对照，已经用阿葡糖苷酶α的治疗显著提高存活率，并且在晚发型庞贝氏病中，与安慰剂相比，阿葡糖苷酶α已经示出对6分钟步行测试(6MWT)和用力肺活量(FVC)的影响具有统计学显著性(如果适度的话)。

然而，在经历阿葡糖苷酶α的治疗时，大多数受试者保持稳定抑或继续恶化。用阿葡糖苷酶α的ERT的明显次优效应的原因尚不清楚，但是部分可以归因于潜在肌肉病理的进行性性质，或当前ERT的差的组织靶向。例如，输注的酶在中性pH(包括在血浆的pH(约pH7.4))下不稳定，并且会在循环内不可逆地失活。此外，输注的阿葡糖苷酶α在关键的疾病相关肌肉中示出不足的摄取，可能归因于与甘露糖-6-磷酸(M6P)残基的不足的糖基化。这样的残基在细胞表面结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)，允许该酶进入细胞及其内的溶酶体。因此，高剂量的该酶对于有效的治疗是必需的，以便充足量的活性酶可以到达溶酶体，使得此种治疗昂贵并且费时。

另外，抗-重组人酸性α-葡糖苷酶中和抗体的发展通常在庞贝氏病患者中发展，归因于重复暴露于治疗。此类的免疫应答会严重降低患者对治疗的耐受性。用于阿葡糖苷酶α的美国产品标签包括带有关于超敏反应的潜在风险的信息的一个黑盒警告。已经在用阿葡糖苷酶α治疗的受试者中观察到危及生命的过敏反应，包括过敏性休克。

正在开发下一代ERT来解决这些缺陷。在一种策略中，重组酶可以与药物分子伴侣共同给予，这些药物分子伴侣可以诱导或稳定酶的适当构象，以防止或减少该酶的降解，和/或它在体外(例如，在给予前储存)或体内的解折叠为无活性形式。此种策略在国际专利申请公开号WO 2004/069190、WO 2006/125141、WO 2013/166249和WO 2014/014938中进行了描述。

已经描述了将阿葡糖苷酶α与麦格司他共同给予患有庞贝氏病的患者的临床实验的结果。在意大利的4个治疗中心，在患有庞贝氏病的13个受试者(3例早发型(婴儿型)和10例晚发型)上进行的临床实验中，将20至40mg/kg的阿葡糖苷酶α单独给予，然后与4个剂量的80mg的麦格司共同给予。本研究的结果显示，相比单独给予阿葡糖苷酶α，对于共同给予的酸性α-葡糖苷酶活性暴露(根据药物动力学参数AUC(在浓度对比时间曲线下的面积)测量的)平均增加6.8倍(帕伦蒂，G(Parenti,G.)，G.安德里亚(G.Andria)等人，(2015)，“溶酶体贮存病：从病理生理学到治疗”("Lysosomal Storage Diseases:From Pathophysiologyto Therapy.")医药学年评(Annu.Rev.Med.)66(1):471-486)。此外，在佛罗里达大学进行的研究评估了当与阿葡糖苷酶α静脉输注共同给予至患有庞贝氏病的受试者时的血浆麦格司他的药物代谢动力学(PK)，(多弗勒，P.A.(Doerfler,P.A.)，J.S.凯利(J.S.Kelley)，等人，(2014)，“药物分子伴侣在酶替代疗法期间通过抗-GAA抗体阻止rhGAA的沉淀”("Pharmacological chaperones prevent the precipitation of rhGAAby anti-GAAantibodies during enzyme replacement therapy.")分子遗传与代谢 (Mol.Genet.Metab.)111(2):S38)。

然而，针对治疗庞贝氏病，还需要进一步改进酶替代疗法。例如，新的重组人酸性α-葡糖苷酶是有希望的，它可以具有一种或多种超越现有酶的优点，包括但不限于改进组织摄取、改进酶活性、改进稳定性或降低免疫原性。

发明内容

本发明提供了一种用于在对其有需要的患者中治疗庞贝氏病的方法，该方法包括将麦格司他与重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)组合给予患者，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且相比带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量，该重组人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约20mg/kg的剂量实施静脉给予，并且将麦格司他以约260mg的剂量口服给予。

在另一方面，本发明提供了一种麦格司他与如本文所定义的重组人酸性α-葡糖苷酶的组合，用于在对其有需要的患者中治疗庞贝氏病。

在另一方面，本发明提供了麦格司他和如本文所定义的重组人酸性α-葡糖苷酶组合用于在对其有需要的患者中治疗庞贝氏病的药剂制备的用途。

本发明的另一方面提供了在对其有需要的患者中用于庞贝氏病的联合治疗的一种试剂盒，该试剂盒包括：包含麦格司他的药学上可接受的剂型，包含如本文定义的重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型，以及用于将包含麦格司他的该药学上可接受的剂型和包含重组酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型给予至对其有需要的患者的说明。

附图简要说明

从以下书面描述和附图中，本发明的其他特征将变得明显，其中：

图1是示出了在不同pH值以及在麦格司他存在和缺乏的情况下，解折叠的ATB200蛋白对比温度的百分比的图；

图2A和2B分别示出了和的CIMPR亲和色谱法的结果。虚线指的是M6P洗脱梯度。用M6P洗脱替代GAA分子经由包含M6P的聚糖结合到CIMPR。如在图2A中所示，中78％的GAA活性在M6P添加前被洗脱。图2B显示了73％的活性在M6P添加前被洗脱。在或中只有22％或27％的rhGAA，分别用M6P洗脱。这些图示出了在这两种常规的rhGAA产品中，大多数的rhGAA缺乏具有细胞摄取和溶酶体靶向所需要的M6P的聚糖。

图3示出了用于用编码rhGAA的DNA转化CHO细胞的DNA构建体。用编码rhGAA的DNA构建体转化CHO细胞。

图4A和4B，分别示出了和ATB200rhGAA的CIMPR亲和色谱法的结果。从图4B可以看出，在ATB200rhGAA中约70％的rhGAA包含M6P。

图5A和5B示出了在阴离子交换(AEX)柱上被捕获和不被捕获的ATB200rhGAA的CIMPR亲和色谱法的结果。

图6示出了和ATB200rhGAAs的波利韦克斯(Polywax)洗脱图。

图7示出了相比鉴定为BP-rhGAA、ATB200-1和ATB200-2的ATB200rhGAA的三种不同的制剂，的N-聚糖结构的概述。

图8A-8H示出了ATB200rhGAA的位点特异性N-糖基化分析的结果。

图9A比较了ATB200rhGAA的CIMPR结合亲和力(左轨迹线)与的CIMPR结合亲和力(右轨迹线)。

图9B比较了和ATB200rhGAA的双-M6P含量。

图10A比较了不同GAA浓度下，在正常纤维母细胞内的ATB200rhGAA活性(左轨迹线)与rhGAA活性(右轨迹线)。

图10B比较了在不同GAA浓度下，来自患有庞贝氏病的受试者的纤维母细胞中的ATB200rhGAA活性(左轨迹线)与rhGAA活性(右轨迹线)。

图10C比较了来自正常受试者和患有庞贝氏病的受试者的纤维母细胞的(K_摄取(K_uptake))。

图11是示出ATB200的群体药动学(PK)模型的拟合优度的图；

图12是示出麦格司他和脱氧野尻霉素(duvoglustat)剂量正态化的血浆浓度-时间曲线的图；

图13A是示出在血浆中脱氧野尻霉素(duvoglustat)的群体PK模型的拟合优度的图；

图13B是示出在肌组织中的脱氧野尻霉素(duvoglustat)的群体PK模型的拟合优度的图；

图14是示出麦格司他的群体PK模型的拟合优度的图；

图15是示出经4h时段，在人体内输注单一的20mg/kg的ATB200的静脉内的(IV)的剂量得到的预测的浓度-时间曲线的图；

图16A是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/kg的阿葡糖苷酶α或与5、10或20mg/kg的ATB200接触后，相对于在小鼠心肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶剂量的糖原量的图；

图16B是示出与运载体(阴性对照)、与20mg/kg的阿葡糖苷酶α或与5、10或20mg/kg的ATB200接触后，相对于在小鼠四头肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图；

图16C是示出与运载体(阴性对照)、与20mg/kg的阿葡糖苷酶α或与5、10或20mg/kg的ATB200接触后，相对于在小鼠三头肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图；

图17是绘制在ATB200存在时，用不同剂量的麦格司他处理的小鼠中的糖原水平与单独用ATB200处理的小鼠中的糖原水平的比率对比麦格司他的AUC值与ATB200的AUC值的比率的图；

图18是示出重复给予466mg、270mg和233mg剂量的麦格司他后，血浆中麦格司他的预测浓度-时间曲线的图；

图19是示出重复给予466mg、270mg和233mg剂量的麦格司他后，在组织溶酶体中的麦格司他的预测浓度-时间曲线的图；

图20是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心脏、隔膜和比目鱼肌的一系列显微照片，示出溶酶体相关膜蛋白(LAMP1)水平；

图21是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心脏和比目鱼肌的一系列显微照片，示出用过碘酸-希夫(Schiff)试剂(PAS)染色的糖原水平；

图22是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌的一系列显微照片(1000x)，用亚甲蓝染色来示出囊泡(用箭头指示)；

图23是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌的一系列显微照片(400x)，示出自噬标记物微管相关蛋白质1A/1B-轻链3磷脂酰乙醇胺缀合物(LC3AII)和p62，胰岛素依赖性葡萄糖转运体GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运体GLUT1的水平；

图24A-24D是示出给予5、10或20mg/kg ATB200，或20mg/kg ATB200和130或260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的GAA活性的浓度-时间曲线的图；

图25A-25D是示出给予5、10或20mg/kg ATB200，20mg/kg ATB200和130mg麦格司他，或20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的GAA总蛋白的浓度-时间曲线的图；

图26是示出给予130mg或260mg的麦格司他后，在人类受试者血浆中的麦格司他浓度-时间曲线的图；

图27是在野生型纤维母细胞和庞贝氏纤维母细胞中的GAA水平和LAMP1水平的一系列免疫荧光显微照片；

图28是来自野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的肌纤维的一系列显微照片，示出抗肌萎缩蛋白抗肌萎缩蛋白、α-和β-营养不良聚糖，以及戴斯富林蛋白(dysferlin)的水平；

图29A和29B是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的股直肌(RF)和股外侧肌/股内侧肌(VL/VM)的肌纤维的一系列显微照片(200x)，示出LAMP1IHC信号；

图30A和30B是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的RF和VL/VM的肌纤维的一系列显微照片(200x)，示出LC3II IHC信号；

图31A和31B是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的RF和VL/VM的肌纤维的一系列显微照片(200x)，示出戴斯富林蛋白(dysferlin)IHC信号；

图32A-32D是示出来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌、三头肌、腓肠肌和心脏细胞中的糖原水平的图；

图33A和33B是示出在麦格司他存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的线悬挂和握力肌数据的图；

图34A-34G是示出来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌、三头肌和心脏细胞中的糖原水平的图；

图35是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的VL/VM的肌纤维的一系列显微照片，示出LAMP1、LC3和戴斯富林蛋白(dysferlin)IHC信号；

图36是示出将具有不同唾液酸含量的ATB200的两个批次给予后，在Gaa-基因敲除小鼠的血浆中的GAA活性的浓度-时间曲线的图；

图37A-37D是示出来自用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌、三头肌、腓肠肌和心脏细胞中的糖原水平的图；

图38是示出在给予递增剂量的ATB200(5、10和20mg/kg)，随后共同给予ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130和260mg/kg)之后，在人类患者中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的图；

图39是示出在给予递增剂量的ATB200(5、10和20mg/kg)，随后共同给予ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130和260mg/kg)之后，在人类患者中的天冬氨酸转氨酶(AST)水平的图；

图40是示出在给予递增剂量的ATB200(5、10和20mg/kg)，随后共同给予ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130和260mg/kg)之后，在人类患者中的肌酸磷酸激酶(CPK)水平的图；

图41是示出在给予递增剂量的ATB200(5、10和20mg/kg)，随后共同给予ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130和260mg/kg)之后，在人类患者中的平均ALT、AST和CPK水平的图；和

图42是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α和ATB200处理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的股外侧肌(VL)的肌纤维的一系列显微照片(100x和200x)，示出抗肌萎缩蛋白信号。

定义

在本发明的上下文中以及在每个术语使用的特定上下文中，在本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的一般含义。某些术语在下文或在本说明书中的其他地方进行了讨论，以向从业者提供另外的指导。

在本说明书中，除非上下文需要，否则归因于表达语言或必要的含义，词语“包括(comprises)”，或变化形式例如“包含(“comprises)”或“包含(comprising)”用于包括的意义，即用于指明所述特征的存在，但是不排除在本发明的不同实施例中存在或增加的其他特征。

如本文中所使用，术语“庞贝氏病”还称为酸性麦芽糖酶缺乏、糖原贮积症II型(GSDII)，和糖原贮积病II型，旨在意指遗传性的溶酶体贮积失调，其特征在于在编码人酸性α-葡糖苷酶的GAA基因中的突变。术语包括但不限于该疾病的早发型和晚发型形式，包括但不限于婴儿型、青年型和成年型庞贝氏病。

如本文中所使用，术语“酸性α-葡糖苷酶”旨在意指水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖的D-葡萄糖单元之间的α-1,4键的溶酶体酶。替代名包括但不限于溶酶体的α-葡糖苷酶(EC:3.2.1.20)、糖化酶、1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶、淀粉葡糖苷酶、γ-淀粉酶和外切-1,4-α-葡糖苷酶。人酸性α-葡糖苷酶是由GAA基因(美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因ID2548)编码的，该基因已经被定位至染色体17的长臂上(位置17q25.2-q25.3)。目前已经在人类GAA基因中鉴定了超过500个突变，其中的许多突变与庞贝氏病有关。导致该酸性α-葡糖苷酶的折叠或错加工的突变包括T1064C(Leu355Pro)和C2104T(Arg702Cys)。另外，影响酶的成熟和加工的GAA突变包括Leu405Pro和Met519Thr。在氨基酸残基516-521处的保守六肽WIDMNE对于酸性α-葡糖苷酶蛋白的活性是必需的。如本文中所使用，缩写“GAA”旨在意指该酸性α-葡糖苷酶，然而斜体缩写“GAA”旨在意指编码人酸性α-葡糖苷酶的人类基因。斜体缩写“Gaa”旨在意指编码非人酸性α-葡糖苷酶类的非人类基因，包括但不限于大鼠或小鼠基因，并且缩写“Gaa”旨在意指非人酸性α-葡糖苷酶类。因此，缩写“rhGAA”旨在意指该重组人酸性α-葡糖苷酶。

如本文中所使用，术语“阿葡糖苷酶α”旨在意指被鉴定为[199-精氨酸,223-组氨酸]前体原-α-葡糖苷酶(人)的重组人酸性α-葡糖苷酶；化学文摘登记号420794-05-0。阿葡糖苷酶α被批准在美国由健赞公司(Genzyme)在2014年10月1日作为产品和进行市场营销。

如本文中所使用，术语“ATB200”旨在意指描述于共同未决的专利申请PCT/US2015/053252中的重组人酸性α-葡糖苷酶，该专利申请的披露内容通过引用结合在此。

如本文中所使用，术语“聚糖”旨在意指共价结合至蛋白质或多肽上的氨基酸残基的多糖链。如本文中所使用，术语“N-聚糖”或“N-联聚糖”旨在意指通过共价结合至氨基酸残基的氮原子而附接至蛋白质或多肽上的氨基酸残基的多糖链。例如，N-聚糖可以共价结合至天冬酰胺残基的侧链氮原子上。聚糖可以包含一个或若干个单糖单元，并且该单糖单元可以共价连接以形成直链或支链。在至少一个实施例中，附接至ATB200的N-聚糖单元可以包括每一独立地选自N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一个或多个单糖单元。蛋白质上的该N-聚糖单元可以通过任何适当的分析技术(例如，质谱分析法)确定。在一些实施例中，N-聚糖单元可以通过液相色谱-串联质谱分析法(LC-MS/MS)，利用仪器，例如Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro^TM质谱仪、Thermo Scientific Orbitrap FusionLumos Tribid^TM质谱仪或Waters G2-XS QTof质谱仪进行确定。

如本文中所使用，术语“高-甘露糖N-聚糖”旨在意指具有一个至六个或更多个甘露糖单元的N-聚糖。在至少一个实施例中，高甘露糖N-聚糖单元可以包含结合至天冬酰胺残基，并且进一步结合至分枝的聚甘露糖链的一个双(N-乙酰氨基葡萄糖)链。如在本文可互换地使用，术语“M6P”或“甘露糖-6-磷酸”旨在意指在位置6处磷酸化的甘露糖单元；即，具有与位置6处的羟基基团结合的磷酸基。在至少一个实施例中，一个或多个N-聚糖单元的一个或多个甘露糖单元是在位置6处磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸单元。在至少一个实施例中，术语“M6P”或“甘露糖-6-磷酸”意指具有在磷酸基团上作为“帽”的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的甘露糖磷酸二酯，连同具有缺少GlcNAc帽的暴露的磷酸基团的甘露糖单元。在至少一个实施例中，蛋白质的N-聚糖可以具有多种M6P基团，其中至少一个M6P基团具有GlcNAc帽，并且至少一个其他的M6P基团缺少GlcNAc帽。

如本文中所使用，术语“复合物N-聚糖”旨在意指包含一个或多个半乳糖和/或唾液酸单元的N-聚糖。在至少一个实施例中，复合物N-聚糖可以是高-甘露糖N-聚糖，其中一个或多个甘露糖单元进一步结合至各自独立地选自N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖和唾液酸的一个或多个单糖单元。

如本文中所使用，化合物麦格司他，也称为N-丁基-1-脱氧野尻霉素或NB-DNJ或(2R,3R,4R,5S)-1-丁基-2-(羟甲基)哌啶-3,4,5-三醇，是具有以下化学式的化合物：

麦格司他的一种配制品作为针对I型戈谢病的单一疗法在商品名下进行商业销售。

如下讨论，麦格司他的药学上可接受的盐也可以用于本发明。当使用麦格司他的一种盐时，该盐的剂量将进行调整，这样使得由患者接受的麦格司他的该剂量与使用麦格司他游离碱时接受的量是相当的。

如本文中所使用，化合物脱氧野尻霉素(duvoglustat)，又称为1-脱氧野尻霉素或DNJ或(2R,3R,4R,5S)-2-(羟甲基)哌啶-3,4,5-三醇，是具有以下化学式的化合物：

如本文中所使用，术语“药物分子伴侣”或有时简称为术语“分子伴侣”旨在意指特异性结合酸性α-葡糖苷酶，并且具有一个或多个以下的效果的分子：

●增强蛋白质的稳定分子构象的形成；

●增强蛋白质从内质网到另一个细胞位置，优选天然的细胞位置的适当运输，以便于防止蛋白质的内质网-相关降解；

●防止构象不稳定或错误折叠的蛋白质的聚集；

●恢复和/或增强蛋白质的至少部分的野生型功能、稳定性，和/或活性；和/或

●改进具有酸性α-葡糖苷酶的细胞的表型或功能。

因此，用于酸性α-葡糖苷酶的药物分子伴侣是结合酸性α-葡糖苷酶，导致酸性α-葡糖苷酶的适当的折叠、运输、非聚集，和活性的分子。如本文中所使用，该术语包括但不限于结合在酶、抑制剂或拮抗剂，和激动剂的活性位点的活性位点特异性分子伴侣(ASSC)。在至少一个实施例中，该药物分子伴侣可以是酸性α-葡糖苷酶的抑制剂或拮抗剂。如本文中所使用，术语“拮抗剂”旨在意指结合酸性α-葡糖苷酶，并且部分地抑或完全地阻断、抑制、降低、或中和酸性α-葡糖苷酶活性的任何分子。在至少一个实施例中，该药物分子伴侣是麦格司他。用于酸性α-葡糖苷酶的药物分子伴侣的另一个非限制性实例是脱氧野尻霉素(duvoglustat)。

如本文中所使用，术语“活性位点”旨在意指与蛋白质的特定生物活性相关的以及蛋白质的特定生物活性必需的蛋白质区域。在至少一个实施例中，该活性位点可以是结合底物或其他结合配偶体的，并且有助于直接参与化学键的形成和断裂的氨基酸残基的位点。本发明中的活性位点可以涵盖酶的催化位点、抗体的抗原结合位点、受体的配体结合域、调节剂的结合域，或分泌性蛋白的受体结合域。该活性位点还可以涵盖转录激活、蛋白质间相互作用，或转录因子和调节子的DNA结合域。

如本文中所使用，术语“AUC”旨在意指用于评估身体对给定药物的总暴露量随时间的数学计算。在绘制给药后，给予药物的受试者的血液中的浓度如何随的时间而变化的图中，药物浓度变量位于y轴上，时间位于x轴上。对于指定时间间隔的药物浓度曲线和x轴之间的面积是AUC(“曲线下面积”)。AUC用作给药方案的指导，并且用于比较不同药物在体内的可用性的生物利用度。

如本文中所使用，术语“C_最大”旨在意指给予受试者后，药物达到的最高血浆浓度。

如本文中所使用，术语“分布体积”或“V”旨在意指在与在血浆中观察到的相同浓度下，包含所给予的药物的总量所必需的理论体积，并且表示药物分布在身体组织而不是血浆中的程度。V的更高值表明较大程度的组织分布。“中心分布体积”或“V_c”旨在意指由血液高度灌流的血液和组织内的分布体积。“外周分布体积”或“V2”旨在意指外周组织内的分布体积。

如在此可互换地使用，术语“清除率”、“系统清除率”或“CL”旨在意指每单位时间给予的药物完全被清除的血浆体积。“外周清除率”旨在意指每单位时间给予的药物被清除的外周组织的体积。

如本文中所使用，该“治疗有效剂量”和“有效量”旨在意指足够导致受试者治疗反应的酸性α-葡糖苷酶的量、和/或麦格司他的量、和/或其组合的量。治疗反应可以是使用者(例如，临床医生)将会识别为对治疗的有效响应任何反应，包括本文所述和本领域已知的任何替代性临床标记物或症状。因此，在至少一个实施例中，治疗反应可以是改进或抑制庞贝氏病的一个或多个症状或标记物，例如本领域已知的那些。庞贝氏病的症状或标记物包括但不限于降低的酸性α-葡糖苷酶组织活性；心肌病；心脏肥大；进行性肌无力(尤其在躯干或下肢)；深度张力减退；巨舌(并且在一些病例中，舌突出)；吞咽、吮吸，和/或摄食困难；呼吸功能不全；肝肿大(中等的)；面肌松弛；无反射；运动不耐受；劳力性呼吸困难；端坐呼吸；睡眠性呼吸暂停；上午头痛；嗜睡；脊柱前凸和/或脊柱侧弯；减少的深腱反射；下腰痛；以及不满足发展性的动作发展指标。应当注意的是，出于本发明的目的，对酸性α-葡糖苷酶具有抑制作用的麦格司他的浓度可以构成“有效量”，是因为在体内给予时，麦格司他的稀释(以及由于平衡变化导致的结合随之转变)、生物利用度和代谢。

如本文中所使用，术语“酶替代疗法”或“ERT”旨在意指将非天然的，经纯化的酶引入具有这种酶缺陷的个体中。给予的蛋白质可以从自然来源或通过重组表达而获得。该术语也指将经纯化的酶引入个体，该个体在其他情况下需要或受益于给予的经纯化的酶。在至少一个实施例中，这样的个体患有酶不足。该引入的酶可以是在体外产生的经纯化的重组酶，或从离体组织或体液例如像胎盘或动物奶，或从植物纯化的蛋白质。

如本文中所使用，术语“联合治疗”旨在意指同时地或连续地给予两个或多个个体化治疗的任何疗法。在至少一个实施例中，与单独进行每种治疗时的效果相比，联合治疗的结果是增强的。增强可以包括，与通过单独进行治疗时所实现的结果相比，可以产生有利的结果的不同治疗的效果的任何改进。增强的效果或结果可以包括协同增强，其中增强的效果大于每种疗法自身进行时的加和效应；加和增强，其中该增强效果是基本上等于每种治疗自身进行时的加和效应；或小于协同效应，其中该增强的效果低于每种治疗自身进行时的加和效应，但仍优于每种治疗自身进行时的效果。增强的效果可以通过本领域已知的可以测量的治疗功效或结果的任何手段来测量。

如本文中所使用，术语“药学上可接受的”旨在意指当给予人类时，生理上可耐受的，并且不会典型地产生不良反应的分子实体以及组合物。优选地，如本文中所使用，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或者在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更具体地在人体内的使用。

如本文中所使用，术语“载体”旨在意指与化合物一起给予的稀释剂、助剂、赋形剂、或运载体。适合的药物载体是本领域已知的，和在至少一个实施例中，其描述于“雷明顿药物科学”("Remington's Pharmaceutical Sciences")，E.W.马丁(E.W.Martin)著，第18版，或其他版本。

如本文中所使用，术语“受试者”或“患者”是旨在意指人类或非人类动物。在至少一个实施例中，受试者是哺乳动物。在至少一个实施例中，受试者是人类。

如本文中所使用，术语“抗药物抗体”旨在意指特异性结合给予受试者的药物并且由受试者产生的抗体，该抗体作为向受试者给予药物的体液免疫应答的至少一部分。在至少一个实施例中，该药物是治疗性蛋白质药物产品。抗药物抗体在受试者中的存在可以引起范围从轻微到严重的免疫应答，包括但不限于危机生命的免疫应答，包括但不限于过敏反应、细胞因子释放综合征，以及介导关键功能的内源性蛋白质的中和交叉反应。另外或可替代地，抗药物抗体在受试者中的存在会降低该药物的功效。

如本文中所使用，术语“中和抗体”旨在意指作用是中和药物功能的抗药物抗体。在至少一个实施例中，该治疗性蛋白质药物产品是内源性蛋白质的对应物，其在受试者中表达减少或缺失。在至少一个实施例中，该中和抗体可以作用以中和内源性蛋白质的功能。

如本文中所使用，术语“约”和“大约”是旨在意指对于给定测量的性质或精度的测量的量，可接受程度的误差。例如，如本领域中所理解的，误差的程度可以由为测量提供的有效数字的数量来指示，并且包括但不限于对于测量报告的最精确的有效数字中±1的变化。典型的示例性误差程度是在给定值或值范围的20％(％)内，优选在10％内，并且更优选在5％内。可替代地，并且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指是在给定值的一个数量级内，优选在5倍以内，并且更优选在2倍以内的值。除非另有说明，本文给出的数字量是大约的，意指当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。

如本领域普通技术人员将理解的，如本文中使用的术语“同时地”旨在意指同时或在合理地短时段之前或之后内。例如，如果用彼此同时给予两种治疗，一种治疗可以在另一种治疗之前或之后被给予，以允许需要的时间来准备该两种治疗的后者。因此，两种治疗的“同时给予”包括但不限于一种治疗在另一种治疗之后20分钟或更短，约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟、约2分钟、约1分钟或比1分钟更短。

如本文中使用的术语“药学上可接受的盐”旨在意指在合理医学判断的范围内，适合与人类和低等动物的组织接触使用而无不当毒性、刺激、过敏反应等，与合理的效益/风险比相称的，通常是水或油可溶的或可分散的，并且对于它们的预期用途有效的盐。术语包括药学上可接受的酸加成盐以及药学上可接受的碱加成盐。适合的盐的列表发现于，例如，S.M.伯奇(S.M.Birge)等人，药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)，1977,66,1-19页，通过引用结合在此。

如本文中使用的术语“药学上可接受的酸加成盐”旨在意指那些保持生物有效性和游离碱特性的，并且不是生物学或其他方面不希望的盐，这些盐用以下项形成：无机酸，包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸、磷酸等，以及有机酸，包括但不限于乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、谷氨酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、己酸、甲酸、富马酸、2-羟乙基磺酸(羟基乙磺酸)、乳酸、羟基马来酸、苹果酸、丙二酸、苯乙醇酸、均三甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、烟酸、2-萘磺酸、草酸、扑酸、果胶酯酸、苯乙酸、3-苯丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、对甲苯磺酸，十一烷酸等。

如本文中使用的术语“药学上可接受的碱加成盐”旨在意指那些保持生物有效性和游离酸特性的，并且不是生物学或其他方面不希望的盐，这些盐用以下项形成：无机碱，包括但不限于氨或铵或金属阳离子，例如钠、钾、锂、钙、镁、铁、锌、铜、锰，铝等的氢氧化物、碳酸盐、或碳酸氢盐。来源于药学上可接受的有机无毒碱的盐包括但不限于以下项的盐：伯、仲和叔胺、季胺化合物，取代胺包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、异丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、氨基葡萄糖、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基铵化合物、四乙铵化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺、N,N'-二苄基乙二胺，聚胺树脂等。

具体实施方式

本发明提供了一种在对其有需要的患者中治疗庞贝氏病的方法，该方法包括将麦格司他，或其药学上可接受的盐与重组人酸性α-葡糖苷酶组合给予患者，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且相比带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量，该重组人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有低水平的具有末端半乳糖的复合多糖。在另一方面，本发明提供了麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶组合地用于在对其有需要的患者中治疗庞贝氏病的用途。

在至少一个实施例中，将麦格司他口服给予。在至少一个实施例中，将麦格司他按以下口服剂量给予：约200mg至约600mg，或以口服剂量约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg或约600mg。在至少一个实施例中，将麦格司他以约233mg至约400mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他按以下口服剂量给予：约250至约270mg，或按以下口服剂量给予：约250mg、约255mg、约260mg、约265mg或约270mg。在至少一个实施例中，将麦格司他按约260mg的口服剂量给予。

本领域的普通技术人员将理解，麦格司他的口服剂量是在约200mg至600mg的范围中，或在其中可适用于平均体重为约70kg的成年患者的任何更小范围中。对于体重显著低于约70kg的患者，包括但不限于婴儿、儿童或体重不足的成人，医生认为更小的剂量是适合的。因此，在至少一个实施例中，将麦格司他按以下口服剂量给予：从约50mg至约200mg，或按以下口服剂量给予：约50mg、约75mg、约100mg、125mg、约150mg、约175mg或约200mg。在至少一个实施例中，将麦格司他按以下口服剂量给予：从约65mg至约195mg，或按以下口服剂量给予：约65mg、约130mg或约195mg。

在至少一个实施例中，将麦格司他按适合口服给予的药学上可接受的剂型给予，并且包括但不限于片剂、胶囊、珠粒剂(ovule)、酏剂、溶液或混悬剂、凝胶剂、糖浆剂、漱口剂，或在使用前用水或其他适合的运载体复水的干粉，任选地具有用于速释、延迟释放、改性释放、持续释放、脉冲释放或控制释放应用的调味剂和着色剂。还可以使用固体组合物，例如片剂、胶囊、锭剂、软锭剂、丸剂、大丸剂、粉剂、糊剂、颗粒剂、子弹剂、糖衣丸或预混制剂。在至少一个实施例中，将麦格司他作为片剂给予。在至少一个实施例中，将麦格司他作为胶囊给予。在至少一个实施例中，该剂型包含从约50mg至约300mg的麦格司他。在至少一个实施例中，该剂型包含约65mg的麦格司他。在至少一个实施例中，该剂型包含约130mg的麦格司他。在至少一个实施例中，该剂型包含约260mg的麦格司他。预期当该剂型包含约65mg的麦格司他时，麦格司他可以按四种剂型，或总剂量260mg的麦格司他给予。然而，对于具有体重显著低于平均成年人的70kg体重的患者，包括但不限于婴儿、儿童或体重不足的成人，将麦格司他可以按以下剂型的剂量给予：一个剂型(总剂量65mg的麦格司他)、两个剂型(总剂量130mg的麦格司他)，或三个剂型(总剂量195mg的麦格司他)。

可以根据本领域已知的方法来制备用于口服使用的固体和液体组合物。这样的组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的，可以是固体或液体形式的载体和赋形剂。片剂或胶囊可以通过常规手段与药学上可接受的赋形剂(包括但不限于粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或润湿剂)一起来制备。适合的药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，并且包括但不限于预胶化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基乙基纤维素(HPEC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙、硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、滑石、硅石、玉米、马铃薯或木薯淀粉、淀粉乙醇酸钠、十二烷基硫酸钠、柠檬酸钠、碳酸钙、二碱式磷酸钙、甘氨酸交联羧甲基纤维素钠，以及硅酸盐复合物。片剂可以通过本领域熟知的方法来包衣。在至少一个实施例中，将麦格司他作为可商购的配制品，如(Actelion Pharmaceuticals公司)给予。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且相比带有阿葡糖苷酶α的一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量，该重组人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。在至少一个实施例中，该酸性α-葡糖苷酶是如本文所称为ATB200的重组人酸性α-葡糖苷酶，如在共同未决的国际专利申请PCT/US2015/053252中描述。ATB200已经示出以高亲和力结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)(K_D～2-4nM)，并且由庞贝氏纤维母细胞和骨骼肌成肌细胞(K_摄取～7-14nM)有效内化。ATB200在体内表征，并且示出具有比阿葡糖苷酶α(t_1/2～60min)更短的表观血浆半衰期(t_1/2～45min)。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶是具有如在以下项中所示的氨基酸序列的酶：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2(或如由SEQ ID NO:2编码的)、SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或SEQ ID NO:5。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO:1中所示的野生型GAA氨基酸序列，如在美国专利号8,592,362中进行了描述，并且具有基因库登录号AHE24104.1(GI:568760974)。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQID NO:2编码的野生型GAA氨基酸序列，该mRNA序列具有基因库登录号Y00839.1。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO:3中所示的野生型GAA氨基酸序列。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO:4中所示的GAA氨基酸序列，并且具有国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI)登录号NP_000143.2。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶是葡糖苷酶α，由最主要的九个观察到的GAA基因的单倍型编码的人酸性α-葡糖苷酶。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶最初表达为具有在如SEQ ID NO:1中所示的野生型GAA的全长952氨基酸序列，并且该重组人酸性α-葡糖苷酶经历去除一部分氨基酸，例如，前56个氨基酸的细胞内加工。因此，由宿主细胞分泌的该重组人酸性α-葡糖苷酶可以具有相比在细胞内最初表达的重组人酸性α-葡糖苷酶更短的氨基酸序列。在至少一个实施例中，该更短的蛋白质可以具有在SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，其仅与SEQ ID NO:1不同在于最初的56个氨基酸包括已经被去除的信号肽和前体肽，因此产生具有896个氨基酸的蛋白质。氨基酸数目的其他变化也是可能的，例如相对由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5描述的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个缺失、取代和/或插入。在一些实施例中，该rhGAA产物包括具有不同氨基酸长度的重组人酸性α-葡糖苷酶分子的混合物。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶在蛋白质的一个或多个氨基酸残基处经历翻译后修饰和/或化学修饰。例如，甲硫氨酸和色氨酸残基可以经历氧化反应。作为另一个实例，N-端谷氨酰胺可以形成焦谷氨酸。作为另一个实例，天冬酰胺残基可以经历脱酰胺作用以形成天冬氨酸。作为又另一个实例，天冬氨酸残基可以经历异构化作用以形成异天冬氨酸。作为又另一个实例，蛋白质中未配对的半胱氨酸残基可以与游离谷胱甘肽和/或半胱氨酸形成二硫键。因此，在一些实施例中，该酶最初表达为具有如在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO：2(或如由SEQ ID NO:2编码的)、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列，并且该酶经历一个或多个这些翻译后修饰和/或化学修饰。此类修饰也在本披露的范围内。

也考虑编码GAA和此类变体人GAA的多核苷酸序列，并且可以根据本发明用于重组表达rhGAA。

优选地，不多于70％、65％、60％、55％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％，或5％的总重组人酸性α-葡糖苷酶分子缺少带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，或缺少结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)的能力。可替代地，30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、<100％或更多的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的至少一个N-聚糖单元，或具有结合CIMPR的能力。

该重组人酸性α-葡糖苷酶分子在它们的聚糖上可以具有1、2、3或4个甘露糖-6-磷酸(M6P)基团。例如，在重组人酸性α-葡糖苷酶分子上的唯一一个N-聚糖可以带有M6P(单-磷酸化的)，单个N-聚糖可以带有两个M6P基团(双-磷酸化的)，或相同的重组人酸性α-葡糖苷酶分子上的两个不同的N-聚糖可以各自带有单个M6P基团。重组人酸性α-葡糖苷酶分子还可以具有不带有M6P基团的N-聚糖。在另一个实施例中，平均来说，N-聚糖包含大于2.5mol/mol的M6P和大于4mol/mol的唾液酸，这样使得该重组人酸性α-葡糖苷酶包括平均至少2.5摩尔的甘露糖-6-磷酸残基/摩尔的重组人酸性α-葡糖苷酶，以及至少4摩尔的唾液酸/摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶。平均来说，在重组人酸性α-葡糖苷酶上的至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％，或10％的总聚糖可以处于单-M6P聚糖形式，例如，约6.25％的总聚糖可以携带单个M6P基团，并且平均来说，在重组人酸性α-葡糖苷酶上的总聚糖的至少约0.5％、1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％是处于双-M6P聚糖形式，并且平均来说，少于25％的总重组人酸性α-葡糖苷酶不包含结合CIMPR的经磷酸化的聚糖。

该重组人酸性α-葡糖苷酶可以具有携带M6P的N-聚糖的平均含量从0.5至7.0mol/mol范围的重组人酸性α-葡糖苷酶，或子范围的任意中间值，包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0mol/mol重组人酸性α-葡糖苷酶。可以将该重组人酸性α-葡糖苷酶分级以提供具有不同平均数量的带有M6P或带有双M6P的聚糖的重组人酸性α-葡糖苷酶制剂，从而通过选择特定级分或通过选择性组合不同级分以允许进一步定制靶向在目标组织中的溶酶体的重组人酸性α-葡糖苷酶。

在重组人酸性α-葡糖苷酶上高达60％的N-聚糖可以被完全地唾液酸化，例如，高达10％、20％、30％、40％、50％或60％的该N-聚糖可以被完全地唾液酸化。在一些实施例中，从4％至20％的总N-聚糖被完全地唾液酸化。在其他实施例中，在重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于5％、10％、20％或30％的N-聚糖携带唾液酸和末端的半乳糖残基(Gal)。这一范围包括所有的中间值和子范围，例如，在重组人酸性α-葡糖苷酶上7％至30％的总N-聚糖可以携带唾液酸和末端半乳糖。在又其他实施例中，在重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于5％、10％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的N-聚糖仅具有末端半乳糖，并且不包含唾液酸。这一范围包括所有的中间值和子范围，例如，在组合物中重组人酸性α-葡糖苷酶上从8％至19％的总N-聚糖可以仅具有末端半乳糖，并且不包含唾液酸。

在本发明的其他实施例中，在重组人酸性α-葡糖苷酶上的40％、45％、50％、55％至60％的总N-聚糖是复合物型N-聚糖；或重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的总N-聚糖是混合型N-聚糖；在重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于5％、10％，或15％的高甘露糖型N-聚糖是非-磷酸化的；在重组人酸性α-葡糖苷酶上至少5％或10％的高甘露糖型N-聚糖是单-M6P磷酸化的；和/或在重组人酸性α-葡糖苷酶上至少1％或2％的高甘露糖型N-聚糖是双-M6P磷酸化的。这些值包括所有的中间值和子范围。重组人酸性α-葡糖苷酶可以满足上述描述的一个或多个含量范围。

在一些实施例中，平均来说，该重组人酸性α-葡糖苷酶将带有2.0至8.0摩尔的唾液酸残基/摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶。这一范围包括所有的中间值和子范围，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0mol残基/mol重组人酸性α-葡糖苷酶。不受理论的约束，据信带有唾液酸残基的N-聚糖单元的存在可以通过脱唾液酸蛋白受体来防止重组人酸性α--葡糖苷酶的非产生性清除。

在一个或多个实施例中，在重组人溶酶体蛋白质的某些N-糖基化位点处该rhGAA具有M6P和/或唾液酸单元。例如，在rhGAA上存在七个潜在的N-联糖基化位点。这些潜在的糖基化位点在SEQ ID NO:5的以下位置处：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。相似地，对于SEQ ID NO:1的全长氨基酸序列，这些潜在的糖基化位点是在以下位置处：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。取决于天冬酰胺残基的位置，rhGAA的其他变体可以具有相似的糖基化位点。通常，除了X不能是HIS或PRO，在蛋白质氨基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潜在的糖基化位点。

在不同的实施例中，该rhGAA具有某一N-糖基化特性。在一个或多个实施例中，在第一N-糖基化位点处至少20％的该rhGAA是经磷酸化的(例如，SEQ ID NO:5的N84以及SEQID NO:1的N140)。例如，在第一N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第一N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第一N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。

在一个或多个实施例中，在第二N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:5的N177，以及SEQ ID NO:1的N223)，至少20％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，在第二N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第二N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第二N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。在一个或多个实施例中，在第三N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:5的N334，以及SEQ ID NO:1的N390)至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第三N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是磷酸化的。例如，该第三N-糖基化位点可以具有作为主要种类的非-磷酸化的高甘露糖聚糖、二-、三-、和四-触角复合聚糖，以及混合聚糖的混合物。在一些实施例中，在第三N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第四N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:5的N414，以及SEQ ID NO:1的N470)，至少20％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，在第四N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第五N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:5的N596，以及SEQ ID NO:1的N692)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第五N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，该第五N-糖基化位点可以具有作为主要种类的岩藻糖化的二-触角复合聚糖。在一些实施例中，在第五N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第六N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:5的N826，以及SEQ ID NO:1的N882)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第六N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，该第六N-糖基化位点可以具有作为主要种类的二-、三-、和四-触角复合聚糖的混合物。在一些实施例中，在第六N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第七N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:5的N869，以及SEQ ID NO:1的N925)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第七N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。在一些实施例中，在第七N-糖基化位点处，少于40％、45％、50％、55％、60％或65％的该rhGAA具有任何聚糖。在一些实施例中，在第七N-糖基化位点处，至少30％、35％或40％的该rhGAA具有一个聚糖。

优选地，该重组人酸性α-葡糖苷酶是由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如CHO细胞系GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或由此类CHO细胞培养的次代培养物或衍生物产生的。表达酸性α-葡糖苷酶的等位变体或其他变体酸性α-葡糖苷酶氨基酸序列(例如与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5至少90％、95％、98％或99％一致的那些)的DNA构建体可以在CHO细胞中构建和表达。这些变体酸性α-葡糖苷酶氨基酸序列相对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5可以包含缺失、取代，和/或插入，例如相对由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5描述的氨基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个缺失、取代和/或插入。本领域普通技术人员可以选择适合于转化CHO细胞以产生此类DNA构建体的替代载体。

可以使用不同比对算法和/或程序来计算两个序列之间的一致性，包括可用作GCG序列分析包(威斯康辛大学，麦迪逊市，威斯康辛州)的一部分的FASTA或BLAST，并且可以使用例如，默认设置。例如，预期与本文所述的特定多肽具有至少90％、95％、98％或99％一致性，并且优选地表现出基本相同功能的多肽，连同编码此类多肽的多核苷酸。除非另有说明，相似性分数将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比是基于BLASTP阳性得分，并且序列一致性百分比是基于BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”示出相同的高分序列对中总残基的数量和分数；并且BLASTP“阳性”示出具有正值的比对分数并且彼此相似的残基的数量和分数。本披露预期和涵盖具有与本文披露的氨基酸序列具有这些程度的一致性或相似性或任何中间程度的一致性或相似性的氨基酸序列。使用遗传密码推导出的相似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过常规手段获得，特别是通过使用遗传密码来逆转录其氨基酸序列。

本发明的诸位发明人已经发现，重组人酸性α-葡糖苷酶具有靶向阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)和细胞的溶酶体，连同可以使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞降低其体内非产生性清除的糖基化模式的优异的能力。相比常规的重组人酸性α-葡糖苷酶产物(例如阿葡糖苷酶α)可以用显著更高水平的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元来诱导这些细胞表达重组人酸性α-葡糖苷酶。相比常规的酸性α-葡糖苷酶(例如)，由这些细胞产生的该重组人酸性α-葡糖苷酶，例如，如由ATB200例证的，具有显著更多的肌细胞靶标甘露糖-6-磷酸(M6P)和双-甘露糖-6-磷酸N-聚糖残基。不受理论的约束，据信这种广泛的糖基化允许ATB200酶被更有效地吸收到靶细胞中，并且因此相比其他重组人酸性α-葡糖苷酶(例如例如，具有远远更低的M6P和双-M6P含量的阿葡糖苷酶α)更有效地从循环中清除。已经示出ATB200有效地结合CIMPR，并且被骨骼肌和心肌有效吸收，并且具有提供有利的药代动力学曲线并且减少体内非产生性清除的糖基化模式。

相比例如阿葡糖苷酶α，还预期ATB200的广泛糖基化可以有助于ATB200免疫原性的降低。如本领域普通技术人员将理解的，具有保守的哺乳动物糖的蛋白质的糖基化通常增强产物溶解度，并且减少产物的聚集和免疫原性。糖基化通过最小化蛋白质聚集连同通过从免疫系统中屏蔽免疫原性蛋白质表位来间接改变蛋白质免疫原性(用于治疗性蛋白质产物的工业-免疫原性的指导(Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment forTherapeutic Protein Products)，美国卫生和人类服务部，食品与药品管理局，药物评估和研究中心，生物制剂评估和研究中心，2014年8月)。因此，在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予不会引起抗药物抗体。在至少一个实施例中，相比通过给予葡糖苷酶α引起的抗药物抗体的水平，该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予引起更低发生率的受试者中的抗药物抗体。

如在共同未决的国际专利申请PCT/US2015/053252中所述，可以使用细胞(例如，CHO细胞)来产生其中所述的rhGAA，并且该rhGAA可以用于本发明。此类CHO细胞系的实例是产生如其中所述的rhGAA组合物的GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或其次代培养物。此类CHO细胞系可以包含编码GAA的多核苷酸的基因的多个拷贝，例如5、10、15或20或更多个拷贝。

该高M6P和双-M6P rhGAA(例如ATB200rhGAA)可以通过用编码GAA的DNA构建体转化CHO细胞来产生。尽管以前CHO细胞已用于制备rhGAA，但是不认为转化的CHO细胞可以按产生具有高含量的靶向CIMPR的M6P的rhGAA和双-M6P聚糖的rhGAA的方式进行培养和选择。

出人意料地，发现可能转化CHO细胞系，选择产生包含高含量的带有靶向CIMPR的带有M6P或双-M6P的聚糖的rhGAA，并稳定表达该高-M6P rhGAA的转化体。因此，用于制备这些CHO细胞系的方法还描述在共同未决的国际专利申请PCT/US2015/053252中。该方法涉及用编码GAA或GAA变体的DNA转化CHO细胞，选择将编码GAA的DNA稳定整合到其一个或多个染色体中并稳定表达GAA的CHO细胞，并且选择表达具有高含量的带有M6P或双-M6P的聚糖的GAA的CHO细胞，以及任选地选择具有高唾液酸含量的N-聚糖，和/或具有低非磷酸化的高甘露糖含量的N-聚糖的CHO细胞。

在至少一个实施例中，GAA具有低水平的具有末端半乳糖的复合聚糖。

通过培养该CHO细胞系，并且从CHO细胞培养中回收所述的组合物，这些CHO细胞系可以用于产生rhGAA和rhGAA组合物。

该重组人酸性α-葡糖苷酶，或其药学上可接受的盐可以根据常规程序配制为适合给予人的药物组合物。例如，在一个优选的实施例中，用于静脉内给予的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂以缓解注射部位的疼痛。一般地，将成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密封容器中的干燥冻干粉或无水浓缩剂，气密封容器例如是指明活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注给予组合物时，可以用包含无菌药用级的水，盐水或右旋糖/水的输液瓶分配。在通过注射给予组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得可以在给予前将这些成分混合。

通过适当的途径给予重组人酸性α-葡糖苷酶(或包含重组人酸性α-葡糖苷酶的组合物或药物)。在一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶是静脉给予的。在其他实施例中，通过直接给予靶标组织(例如至心脏或骨骼肌(例如，肌内))或神经系统(例如，直接注射到脑中；脑室内；鞘内)来给予重组人酸性α-葡糖苷酶。必要时，可以同时使用多于一个途径。

将该重组人酸性α-葡糖苷酶(或包含重组人酸性α-葡糖苷酶的组合物或药物)以治疗有效量给予(例如，当以规律的间隔给予时，足以治疗疾病的剂量，例如通过减轻与与疾病相关的症状，预防或延迟疾病的发作，和/或减小疾病的症状的严重性或频率)。在治疗疾病中将是治疗有效的量将取决于疾病效果的性质和程度，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。要采用的确切剂量还取决于给予途径和疾病的严重程度，并且应根据医生的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg至约30mg/kg，典型地约5mg/kg至约20mg/kg的剂量通过静脉输注给予。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg或约20mg/kg的剂量通过静脉输注给予。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约20mg/kg的剂量通过静脉输注给予。对具体个体的有效剂量可以是随着时间变化的(例如，增加的或减少的)，取决于该个体的需要。例如，在生理疾病或压力的时候，或如果抗-酸性α-葡糖苷酶抗体存在或增加，或如果疾病症状恶化，该量可以增加。

以规律的间隔给予的重组人酸性α-葡糖苷酶(或包含重组人酸性α-葡糖苷酶的组合物或药物)的治疗有效量取决于疾病效果的性质和程度，以及正在进行中的基础。如本文中所使用，以“规律的间隔，”给予表示，将该治疗有效量定期地给予(如区别于一次性剂量)。该间隔可以通过标准临床技术来确定。在优选的实施例中，将重组人酸性α-葡糖苷酶以每月、双月；每周；每周两次；或每日给予。对于单个个体的给药间隔不需要是固定的间隔，但是可以是随时间变化的，其取决于该个体的需要。例如，在生理疾病或压力的时候，如果抗-重组人酸性α-葡糖苷酶抗体存在或增加，或如果疾病症状恶化，剂量之间的该间隔可以是减少的。在一些实施例中，将5、10、20、50、100，或200mg酶/kg体重的治疗有效量以每周两次、每月或每隔一周，伴有或不伴有分子伴侣给予。

本发明的该重组人酸性α-葡糖苷酶可以制备用于以后使用，例如在单位剂量小瓶或注射器中，或在用于静脉给予的瓶或袋中。包含重组人酸性α-葡糖苷酶的试剂盒连同任选的赋形剂或其他活性成分，例如分子伴侣或或其他药物，可以封装在包装材料中，并且附有用于复水、稀释或定量给药的说明书，用于治疗对其有需要的受试者，例如患有庞贝氏病的患者。

在至少一个实施例中，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶同时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶顺序给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前少于三小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约两小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前少于两小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约1.5小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约一小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约50分钟至约70分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约55分钟至约65分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约30分钟给予在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约25分钟至约35分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约27分钟至约33分钟给予。

在至少一个实施例中，将麦格司他与该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予同时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予20分钟之前或之后给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予15分钟之前或之后给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予10分钟之前或之后给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予5分钟之前或之后给予。

在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后高达2小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约30分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约一小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约1.5小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之后约2小时给予。

本发明的另一方面提供了用于在对其有需要的患者中用于联合治疗庞贝氏病的一种试剂盒。该试剂盒包括包含麦格司他的药学上可接受的剂型，包含如本文定义的重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型，以及用于将包含麦格司他的该药学上可接受的剂型和包含重组酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型给予至对其有需要的患者的说明。在至少一个实施例中，包含麦格司他的药学上可接受的剂型是如本文所描述的口服制剂，包括但不限于片剂或胶囊。在至少一个实施例中，包含重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型是如本文所描述的适合注射的无菌溶液。在至少一个实施例中，用于给予这些剂型的说明包括将包含麦格司他的药学上可接受的剂型在通过静脉输注包含如本文所描述的重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型之前口服给予的说明。

不受理论束缚，据信麦格司他充当该重组人酸性α-葡糖苷酶ATB200的药物分子伴侣，并且结合其活性位点。因此，如图1所示，已发现麦格司他降低了解折叠的ATB200蛋白的百分比，并且稳定了ATB200的活性构象，防止在血浆的中性pH下变性和不可逆的失活，并且允许其在循环中存活条件足够长以到达组织，并且被组织吸收。然而，麦格司他结合至ATB200活性位点，通过防止天然底物，糖原接近该活性位点还可以导致ATB200酶活性的抑制。据信当在本文所描述的条件下将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶给予患者时，在血浆和组织中的麦格司他和ATB200的浓度是这样使得ATB200稳定，直到它可以被吸收到组织中并且靶向溶酶体，但是由于麦格司他的快速清除，ATB200在溶酶体中的糖原水解不是通过麦格司他的存在而过度地抑制，并且该酶保留足够的活性是治疗有用的。

上述所有实施例可以进行组合。这包括在具体实施例中涉及：

药物分子伴侣，例如，麦格司他的性质；以及其特异性针对的活性位点；

药物分子伴侣(麦格司他)的剂量、给予途径和包括载体性质的药物组合物的类型以及市售组合物的用途；

该药物的性质，例如，治疗性蛋白质药物产品可以是在受试者中用来表达的内源性蛋白质的对应物减少或缺失，适合地是重组人酸性α-葡糖苷酶，例如该重组人酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比带有阿葡糖苷酶α的一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量，该重组人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元；并且适合地具有如在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2(或如由SEQ ID NO:2编码的)、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示出的氨基酸序列；

在重组人酸性α-葡糖苷酶上的N-聚糖单元，例如，附接至该重组人酸性α-葡糖苷酶的N-乙酰氨基葡萄糖、半乳糖、唾液酸，或由这些组合而形成的复合物N-聚糖的数目和类型；

在重组人酸性α-葡糖苷酶上的甘露糖单元形成甘露糖-6-磷酸和/或双-甘露糖-6-磷酸的磷酸化作用的程度；

该替代酶(重组人酸性α-葡糖苷酶)的剂量和给予途径(例如，静脉给予，尤其是静脉输注，或直接给予该靶组织)以及包括载体的配制品的类型和治疗有效量；

该药物分子伴侣(麦格司他)和该重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量间隔；

治疗反应的性质和联合治疗的结果(例如，与单独进行的每种治疗的效果相比有增强的结果)；

联合治疗的给予时间，例如，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶同时给予或顺序给予，例如其中将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶之前或在该重组人酸性α-葡糖苷酶之后或在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前或之后某一时间内给予；以及

所治疗的患者(例如，哺乳动物，例如人)的性质以及个体所患有的病症(例如，酶不足)。

以上列表中的任何实施例可以与列表中的一个或多个其他实施例进行组合。

实施例

本发明的其他特征将从以下非限制性实施中变得明显，通过实例的方式说明本发明的原理。

实施例1：现有 和 rhGAA产品的限制

为了评估在和中的rhGAA在目前仅有的针对庞贝氏病的批准的治疗中的能力，将这些rhGAA制剂注射到CIMPR柱(其结合具有M6P基团的rhGAA)上，并且随后用游离M6梯度进行洗脱。将级分在96孔板中收集，并且通过4MU-α-葡萄糖底物测定GAA活性。结合和未结合的rhGAA的相对量基于GAA活性来确定，并且报告为总酶的分数。

图2A-B描述了与常规的ERT(和)相关的问题：在中73％的rhGAA(图2B)和中78％的rhGAA(图2A)未结合至CIMPR，参见在每个图中最左侧的峰。在中只有27％的rhGAA和在中的22％的rhGAA包含M6P，该M6P可以有效地靶向它至肌细胞上的CIMPR。

和的有效剂量对应于包含M6P的rhGAA的量，该M6P靶向肌细胞上的CIMPR。然而，在这样的两种常规的产品中大部分的rhGAA不靶向目标肌细胞上的CIMPR受体。常规rhGAA的给予中大部分的rhGAA不靶向肌肉细胞，增加了对非靶向rhGAA的过敏反应或诱导免疫的风险。

实施例2：产生具有高含量的带有单-或双-M6P的N-聚糖的ATB200rhGAA的CHO细胞 的制备。

用表达rhGAA的DNA转染CHO细胞，随后选择产生rhGAA的转化体。用于用编码rhGAA的DNA转化CHO细胞的DNA构建体在图3中示出。用表达rhGAA的DNA转染CHO细胞，随后选择产生rhGAA的转化体。

转染后，用次黄嘌呤/胸苷缺陷(-HT)培养基来选择包含稳定整合的GAA基因的DG44CHO(DHFR-)细胞。通过甲氨蝶呤处理(MTX，500nM)来诱导在这些细胞中的GAA表达的扩增。

通过GAA酶活性测定来鉴定大量表达的GAA的细胞池，并且用于建立产生rhGAA的单个克隆。在半固体培养基平板上产生单个克隆，通过ClonePix系统挑选，并且转移至24深孔板。针对GAA酶活性测定单个克隆，以鉴定表达高水平GAA的克隆。用于确定GAA活性的条件培养基使用4-MU-α-葡糖苷酶底物。针对生存力、生长能力、GAA生产率、N-聚糖结构和稳定的蛋白质表达来进一步评估如通过GAA酶测定测量的产生更高水平的GAA的克隆。使用这一程序分离CHO细胞系，包括表达具有增强的单-M6P或双-M6P N-聚糖的rhGAA的CHO细胞系GA-ATB-200。

实施例3：ATB200rhGAA的捕获和纯化

根据本发明的多批次的rhGAA在摇瓶中产生，并且在灌注生物反应器中使用CHO细胞系GA-ATB-200和CIMPR结合进行测量。针对来自不同生产批次的经纯化的ATB200rhGAA，观察到与在图4B和图5A中所示那些相似的CIMPR受体结合(大约70％)，表明ATB200rhGAA可以一致地产生。如图2A、2B、4A和4B所示，与ATB200rhGAA相比，和rhGAA显示出显著少的CIMPR结合。

实施例4：ATB200与 的分析比较

使用弱阴离子交换(“WAX”)液相色谱法，根据末端磷酸根进行ATB200rhGAA的分级。通过用递增量的盐洗脱ERT来产生洗脱图。通过UV(A280nm)监测该图。从CHO细胞获得ATB200rhGAA，并且进行纯化。获得自商业来源。在其洗脱图的左侧显示出一个高峰。ATB200rhGAA显示洗脱在右侧的四个显著的峰(图6)。这证实ATB200rhGAA被磷酸化到比更大的程度，因为这种评估是通过末端电荷而不是CIMPR亲和力。

实施例5：ATB200rhGAA的寡糖表征

通过MALDI-TOF来评估经纯化的ATB200rhGAA和聚糖，以确定在每个ERT上发现的单个聚糖结构(图7)。相比发现ATB200样品包含更少量的非-磷酸化的高-甘露糖型N-聚糖。相比在在ATB200中更高含量的M6P聚糖更有效地靶向ATB200rhGAA至肌细胞。由MALDI确定的高百分比的单-磷酸化和双-磷酸化的结构与CIMPR图一致，其说明ATB200与CIMPR受体的显著更大的结合。经由MALDI-TOF质谱分析法的N-聚糖分析证实了平均每个ATB200分子包含至少一个中性的双-M6P N-聚糖结构。ATB200rhGAA上的这种更高的双-M6P N-聚糖含量与M6P受体板结合测定中的高亲和力结合CIMPR正相关(KD约2-4nM)(图9A)。

使用两种不同的LC-MS/MS分析技术，针对位点特异性N-聚糖图还分析了ATB200rhGAA。在第一次分析中，在LC-MS/MS分析之前，将该蛋白质变性、还原、烷基化和消化。蛋白质变性和还原期间，将200μg的蛋白质样品、5μL 1mol/L tris-HCl(终浓度50mM)、75μL 8mol/L胍HCl(终浓度6M)、1μL 0.5mol/L EDTA(终浓度5mM)、2μL 1mol/L DTT(终浓度20mM)以及水添加至1.5mL试管中，以提供100μL的总体积。在干浴中，将该样品混合，并且在56℃下孵育30分钟。烷基化作用期间，将该变性的和还原的蛋白质样品与5μL1mol/L碘乙酰胺(IAM，终浓度50mM)混合，然后在黑暗中10℃-30℃下孵育30分钟。烷基化作用之后，将400μL预冷的丙酮添加至该样品中，并且将该混合物在-80℃制冷中冷冻4小时。然后将该样品在4℃，在13000rpm下离心5min，并且将上清液去除。将400μL的预冷的丙酮添加至球粒，然后将其在4℃，在13000rpm下离心5min，并且将上清液去除。然后将该样品在黑暗中，在冰上风干以去除丙酮残余。将40μL的8M尿素和160μL的100mM NH₄HCO₃添加至该样品，以溶解该蛋白质。胰蛋白酶消化期间，然后将50μg的该蛋白质与胰蛋白酶消化缓冲液添加至100μL终体积，并且添加5μL0.5mg/mL胰蛋白酶(20/1w/w的蛋白与酶的比率)。将该溶液混合良好，并且在37℃下孵育过夜(16±2小时)。添加2.5μL 20％TFA(终浓度0.5％)以淬灭该反应。然后使用Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro^TM质谱仪来分析该样品。

在第二LC-MS/MS分析中，根据相似的变性、还原、烷基化和消化程序来制备ATB200样品，除了使用碘乙酸(IAA)代替IAM作为烷基化试剂，并且然后使用Thermo ScientificOrbitrap Fusion Lumos Tribid^TM质谱仪进行分析。

在第三LC-MS/MS分析中，根据相似的变性、还原、烷基化和消化程序来制备ATB200样品，使用碘乙酰胺(IAM)作为烷基化试剂，并且然后使用Thermo Scientific OrbitrapFusion质谱仪进行分析。

第一和第二分析的结果在图8B-8H中示出，并且第三分析的结果在图8A中示出。在图8B-8H中，第一分析的结果由左条(深灰色)表示，并且来自第二分析的结果由右条(浅灰色)表示。在图8B-8H中，用于聚糖表达的符号命名法根据瓦尔基A(Varki,A.)，卡明斯，R.D.(Cummings,R.D.)，艾斯克J.D.(Esko J.D.)等人,糖生物学要领(Essentials ofGlycobiology)，第2版(2009)。在图8A-8H中，给定这些潜在的糖基化位点相对于SEQ IDNO:5：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。对于SEQ ID NO:1的全长氨基酸序列，这些潜在的糖基化位点是在以下位置处：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。

从图8B-8H可以看出，初始的两个分析提供了相似的结果，尽管在结果之间存在一些变化。该变化可以归因于多个因素，包括使用的仪器和N-聚糖分析的完整性。例如，如果一些种类的磷酸化的聚糖未被鉴定和/或未被定量，则磷酸化的聚糖的总数可能是未被充分表示的，并且在该位点带有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是未被充分表示的。作为另一个实例，如果一些种类的非-磷酸化的聚糖未被鉴定和/或未被定量，则非-磷酸化的聚糖的总数可能是未被充分表示的，并且在该位点带有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是过度表示的。

图8A示出了ATB200的N-糖基化位点占有率。从图8A可以看出，第一、第二、第三、第四、第五和第六N-糖基化位点大部分被占据，其中大约90％且高达约100％的具有在每个潜在位点处检测到的聚糖的ATB200酶。然而，该第七潜在的N-糖基化位点在大约一半的时间被糖基化。

图8B示出了第一位点，N84处的N-糖基化图。从图8B可以看出，主要的聚糖种类是双-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测超过75％的该ATB200在第一位点处具有双-M6P聚糖。

图8C示出了在第二位点，N177处的N-糖基化图。从图8C可以看出，主要的聚糖种类是单-M6P聚糖和非-磷酸化的高甘露糖聚糖。第一和第二分析二者检测超过40％的该ATB200在第二位点处具有单-M6P聚糖。

图8D示出了在第三位点，N334处的N-糖基化图。从图8D可以看出，该主要的聚糖种类是非-磷酸化的高甘露糖聚糖，二-、三-，和四-触角复合聚糖，和混合聚糖。第一和第二分析二者检测超过20％的该ATB200在第三位点处具有唾液酸残基。

图8E示出了在第四位点，N414处的N-糖基化图。从图8E可以看出，该主要的聚糖种类是双-M6P和单-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测超过40％的该ATB200在在第四位点处具有双-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测超过25％的该ATB200在第四位点具有单-M6P聚糖。

图8F示出了在第五位点，N596处的N-糖基化图。从图8F可以看出，该主要的聚糖种类是岩藻糖化的二-触角复合聚糖。第一和第二分析二者检测超过70％的该ATB200在第五位点处具有唾液酸残基。

图8G示出了在第六位点，N826处的N-糖基化图。从图8G可以看出，该主要的聚糖种类是二-、三-，和四-触角复合聚糖。第一和第二分析二者检测超过80％的该ATB200在第六位点处具有唾液酸残基。

图8H示出了在六个潜在的N-糖基化位点中的每个位点处的磷酸化作用的概括。从图8H可以看出，第一和第二分析二者检测在第一、第二、和第四位点处的高磷酸化作用水平。两个分析检测超过80％的该ATB200是在第一位点处的单-或二-磷酸化的，超过40％的该ATB200在第二位点处是单-磷酸化的，并且超过80％的该ATB200在第四位点出是单-或二-磷酸化的。

实施例6：ATB200的CIMPR亲和力的表征

除了具有可以结合CIMPR的更大百分比的rhGAA之外，重要的是理解该相互作用的质量。使用CIMPR板结合测定来确定和ATB200rhGAA受体结合。简言之，使用CIMPR-包被的板来捕获GAA。将不同浓度的rhGAA应用于固定的受体，并且洗去未结合的rhGAA。通过GAA活性来确定剩余rhGAA的量。如图9A所示，ATB200rhGAA结合至CIMPR显著优于

图9B示出了常规rhGAA，和根据本发明的ATB200中的双-M6P聚糖的相对含量。对于平均只有10％的分子具有双-磷酸化的聚糖。与ATB200成对比，其中平均每个rhGAA分子具有至少一个双-磷酸化的聚糖。

实施例7：ATB200rhGAA比 更有效地被成纤维细胞内化

使用正常的和庞贝氏成纤维细胞细胞系来比较ATB200和rhGAA的相对细胞摄取。比较涉及5-100nM的根据本发明的ATB200rhGAA与10-500nM常规rhGAA16-hr孵育之后，用TRIS碱将外部rhGAA灭活，并且在收获细胞之前用PBS将细胞洗涤3次。通过4MU-α-葡萄糖苷水解测量的内化GAA，并且相对于总细胞的蛋白质作图，并且结果出现在图10A-B中。

ATB200rhGAA也示出有效内化到细胞中(图10A和10B)，分别地示出ATB200rhGAA内化到正常的和庞贝氏成纤维细胞中，并且其比常规的rhGAA内化到更大的程度。ATB200rhGAA在约20nM处使细胞受体饱和，然而需要约250nM的从这些结果外推的摄取效率常数(K_摄取)对于ATB200为2-3nm，对于为56nM，如图10C所示出。这些结果表明ATB200rhGAA是针对庞贝氏病的靶向良好的治疗。

实施例8：针对ATB200和麦格司他的群体药动学(PK)建模

酸性α-葡糖苷酶(ATB200)药物代谢动力学数据，包括取样时间、服药历史和酸性α-葡糖苷酶的血浆浓度，这些数据是从通过静脉注射给予ATB200的小鼠、大鼠和猴子中获得。血浆和组织中的麦格司他和脱氧野尻霉素(duvoglustat)的药物代谢动力学数据是从人或从小鼠中收集的。

使用NLME^TMv1.3进行建模与模拟。构建区室PK模型来评估血浆中的ATB200的PK。该模型包括：

●血浆浓度和时间之间关系的描述；

●在模型参数中表征动物之间的和动物内的变异性的方差分量；和

●描述关于关键模型分量的知识状态的不确定性的分量。

非-线性混合效应(NLME)模型具有以下形式：

C_pij＝C(D_i,t_j,θ_i)+ε_ij

θ_i＝(θ_i1,...,θ_im)

其中C_pij是动物i，在j^th收集时间(t_j)的浓度，D_i代表动物i的服药历史，θ_i是动物i的PK参数的向量，并且ε_ij是与动物i的j^th浓度相关的随机误差。

将在参数中的受试者之间的变异性(BSV)建模为对数正态分布：

θ_in＝θ_TVn exp(η_in)

(η₁,…,η_m)～MVN(0,Ω)

其中θ_TVn是n^th PK参数(例如，清除率)的群体典型值，并且η_in是对动物i的第n^th参数的随机动物内效应。随机效应(η₁,…,η_m)是正态分布的，具有包括在OMEGA(Ω)矩阵中的均值0和估计方差ω²。

假定PK是物种独立的，并且根据一般的戴德里克(Dedrick)方法缩放，该方法根据动物体重的权重来缩放该处置：

CL_(p)i＝a_(p)BW_i ^b

V_(p)i＝c_(p)BW_i ^d

其中CL＝系统清除率，V＝分布体积，BW＝体重，p＝外周的，b和d＝异速生长指数，以及a和c＝BW＝1的典型值。在这种情况下，指数b和d可以与文献中接受的更一般化的值进行比较(b＝0.75和d＝1.0)。在分析中使用标称的BW(0.025、0.25和2.5kg)。

基线酸性α-葡糖苷酶浓度被建模为C_基线＝酸性α-葡糖苷酶合成/CL的比率，并且可以外推至人，因为C_基线是物种特异性的，不依赖于ATB200的浓度，并且在患有庞贝氏病病的人中已知。使用FOCE-ELS来确定基础模型，以评估1或2区室模型是否最最优以拟合数据。还通过视觉搜索和通过搜索对PK的不同野生型/种类/剂量相关的效应来探索酸性α-葡糖苷酶的PK中的变异性的来源。

对于ATB200，具有线性消除的二室模型充分地表征了跨动物物种的所有剂量水平的酸性α-葡糖苷酶活性的浓度-时间曲线。该模型包括考虑跨动物物种体重在清除率(CL)和分布体积(Vc)上的差异的理论异速生长分量。ATB200的群体PK模型的拟合优度在图11中示出。在非临床的研究中，ATB200的群体PK参数在表1中呈现。

表1：

BW：体重

将庞贝氏病患者中麦格司他(200mg)的浓度-时间曲线与在正常健康志愿者(剂量范围：50、100、250、600和1000mg)中给予脱氧野尻霉素(duvoglustat)后获得的那些浓度-时间曲线进行比较。麦格司他和脱氧野尻霉素(duvoglustat)的剂量标准化的血浆浓度-时间曲线在图12中示出。因为在患有庞贝氏病的患者中的麦格司他的浓度-时间曲线与观察到的在健康受试者中给予脱氧野尻霉素(duvoglustat)超过24h的那些浓度-时间曲线是相似的，将外周组织中的脱氧野尻霉素(duvoglustat)的PK数据收集，用作暴露于麦格司他的模型的替代物。具有线性消除的二室模型用于表征组织中的脱氧野尻霉素(duvoglustat)的浓度-时间曲线。

脱氧野尻霉素(duvoglustat)的PK模型的拟合优度在图13A和13B中示出。在血浆和组织中的脱氧野尻霉素(duvoglustat)的终模型PK参数在表2中示出。

表2：

PK参数	典型值(CV％)
		分布体积(V；L)	44.5(7.41)
系统清除率(CL；L/h)	9.44(6.99)
		吸收的速率常数(Ka；1/h))	1.10(14.0)
外周分布体积(V2；L)	8.68(19.39)
		中央区室清除率(CL2；L/h)	0.205(23.7)
区室内分布体积(VQ；L)	61.8(21.2)
		消除速率常数(Keo)	0.378(11.1)
中央区室内的区室内分布体积(VQ2；L)	3390
		外周区室清除率(CL3；L/h)	88.0(7.72)
表观区室内清除率(CLQ；L/h)	40.6(10.6)
		延迟时间(h)	0.176(30.7)
中央区室的相对标准误差	0.477(6.56)
		外周区室的相对标准误差	0.368(8.19)

CV：变异系数

麦格司他的群体PK模型是基于在Gaa基因敲除(KO)小鼠中口服给药构建的。在GaaKO小鼠中的麦格司他的群体PK参数在表3中呈现。在图14中示出了拟合优度。该模型具有0.475ng/mL的剩余附加误差(residual additive error)。

表3：

BSV：受试者之间的变异性

实施例9：在人类中的重组酸性α-葡糖苷酶(ATB200)药物代谢动力学(PK)参数的 建模

使用药物代谢动力学模型(实例8)来进行模拟，并且用来预测在ATB200给药后，在患有晚期庞贝氏病的人类受试者中的酸性α-葡糖苷酶的浓度-时间曲线。异速生长函数允许体重与清除率和分布体积的连接，并且因此允许在具有体重为70kg的典型人类受试者中预测PK参数。通过包括在人类中酸性α-葡糖苷酶的内源性合成速率来定制该模型(尤马帕西西瓦K(Umapathysivam K)，霍普伍德JJ(Hopwood Jj)，美克勒PJ(Meikle PJ.)血斑中的酸性α-葡糖苷酶活性的确定作为庞贝氏病的诊断测试(Determination of acid alpha-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease.)。临床化学(Clin Chem.)(2001)8月；47(8):1378-83)。

预测经4h输注，在人类中单次20mg/kg IV剂量的ATB200导致图15中呈现的浓度-时间曲线。在典型的70kg的人中的PK参数和经4小时的ATB200的20mg/kg IV输注后得到的暴露参数呈现在表4中。

表4：

在典型的70-kg患者中的预测的ATB200的系统清除率(CL)和分布体积(V)分别是0.768L/h和2.41L。

根据(阿葡糖苷酶α)的产品标签，在患有晚期庞贝氏病的患者中重复给药后，在52周酸性α-葡糖苷酶的该系统清除率是601mL/h(0.601L/h)，并且的半衰期是2.4h。基于上述模型，在患有庞贝氏病的成年受试者中ATB200的系统清除率被预期是比针对报道的系统清除率快大约28％。另外，给予20mg/kg剂量的ATB200之后，在人类中预测的AUC被预期是比给予20mg/kg剂量的(大约2700μg·h/mL)后报道的AUC低约25％(AUC_0-inf：1822mg·h/L)。

实施例10：针对糖原还原的暴露响应模型

Gaa基因敲除小鼠以5、10和20mg/kg的剂量静脉给予酸性α-葡糖苷酶(ATB200)，升高的口服剂量的麦格司他(1、3和10mg/kg)与静脉内的5或10mg/kg剂量的ATB200同时给予或升高的口服剂量的麦格司他(1、3、5、10、20，和30mg/kg)与静脉内的20mg/kg的剂量的ATB200同时给予。如前所述测量糖原水平(卡纳R(Khanna,R)，弗拉纳根JJ(Flanagan,Jj)，冯J(Feng,J)，索斯卡R(Soska,R)，弗拉谢拉(Frascella,M)，佩莱格里诺LJ(Pellegrino,LJ)等人(2012)，药物分子伴侣AT2220增加了庞贝氏病的小鼠模型中的重组人酸性α-葡糖苷酶摄取和糖原还原。(“The pharmacological chaperone AT2220increasesrecombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mousemodel of Pompe disease.)公共科学图书馆期刊(PLoS One)7(7):e40776)。计算每次联合治疗后观察到的糖原水平与单一疗法后观察到的糖原水平的比率(糖原比率)。结果提供在表5中。

表5：

另外，图15A至15C示出了在Gaa基因敲除小鼠中给予阿葡糖苷酶α和ATB200对糖原清除的影响。给予动物两次IV推注给药(每隔一周)；将组织在最后一次剂量后两周收获，并且分析酸性α-葡糖苷酶活性和糖原含量。

从在表5的结果可以看出，发现ATB200以剂量依赖性方式在酸性α-葡糖苷酶(Gaa)基因敲除小鼠中耗尽组织糖原。在Gaa基因敲除小鼠中，20mg/kg剂量的ATB200一致地去除了比5和10mg/kg剂量水平更大比例的存储的糖原。然而，如在图15A至15C看出，在小鼠心脏和骨骼肌(四头肌和三头肌)中，以5mg/kg给予ATB200示出与以20mg/kg给予相似的糖原减少，然而在骨骼肌中，ATB200剂量在10和20mg/kg示出比显著更好的糖原水平减少。

此外，10和20mg/kg剂量的麦格司他与以20mg/kg的ATB200-共同给予分别导致糖原水平分别减少至118和122μg/mg蛋白质。剂量为30mg/kg的麦格司他引起糖原的更少减少。不受理论束缚，据信在更高浓度的麦格司他下，溶酶体中的酸性α-葡糖苷酶的抑制可以超过有益的分子伴侣效应，从而减少溶酶体中糖原的降解。

使用药物代谢动力学模型(实例8)来预测暴露于酸性α-葡糖苷酶和麦格司他，时间匹配于在表5中的组织溶酶体糖原水平的值。针对所测试的每种治疗组合，得到麦格司他/ATB200稳定状态暴露(AUC)比率(平均暴露超过24小时)，其相对于相应的糖原比率绘制(表5)，并且拟合数学函数。该暴露-响应曲线在图17中示出。

从图17的结果可以看出，10和20mg/kg剂量的麦格司他与20mg/kg剂量的ATB200的共同给予提供了血浆中的酸性α-葡糖苷酶活性的良好稳定性，同时最大化了糖原减少。更低剂量的麦格司他(1、3，和5mg/kg)被认为导致酸性α-葡糖苷酶活性的次优的稳定，然而最高剂量的麦格司他(30mg/kg)被认为导致α-葡糖苷酶活性在溶酶体内过度抑制。

基于药物代谢动力学模型(实例8)，预期观察到0.01159的的麦格司他/ATB200AUC比率(10mg/kg麦格司他与20mg/kgATB200共同给予)对应于将约270mg剂量的麦格司他与20mg/kg ATB200共同给予在典型的70-kg的人中。0.01和0.02的AUC比率将分别对应于233和466mg的麦格司他剂量，与20mg/kg ATB200共同给予在典型的70-kg的受试者中。

实施例11：在人体中麦格司他/脱氧野尻霉素(duvoglustat)浓度的建模

使用药物代谢动力学模型(实例8)来预测脱氧野尻霉素(duvoglustat)(一种麦格司他的替代物)的血浆或组织浓度将保持在血浆和溶酶体中的麦格司他的IC₅₀(该浓度给出酸性α-葡糖苷酶活性的50％的最大抑制)以上的时间长度。通过先前描述的方法确定酸性α-葡糖苷酶活性的抑制(弗拉纳根JJ(Flanagan Jj)，罗西B(Rossi B)，唐K(Tang K)，吴X(Wu X)，麦西奥利K(Mascioli K)，等人，(2009)“药物分子伴侣1-脱氧野尻霉素增加酸性α-葡糖苷酶的多种突变体形式的活性和溶酶体运输”(“The pharmacological chaperone 1-deoxynojirimycin increases the activity and lysosomal trafficking of multiplemutant forms of acid alpha-glucosidase.”)人类突变(Hum Mutat)30:1683-1692)。将在血浆pH(pH 7.0)下的麦格司他的IC₅₀值确定为170μg/L，然而在溶酶体区室的pH(pH 5.2)下该IC₅₀值确定为377μg/L。

模型预测的结果呈现在表6中。重复给药后，在血浆和溶酶体中的麦格司他的预测的浓度-时间曲线在图17和18中分别示出。

表6:

基于呈现在表6与图17和18的结果，预期260mg剂量的麦格司他结合并且稳定在血浆中的ATB200高达18小时，然而预期在溶酶体中的酸性α-葡糖苷酶活性的抑制仅持续4小时。

实施例12：在Gaa-基因敲除小鼠中的肌肉生理学和形态学

给予Gaa基因敲除小鼠两个IV推注给予的重组人酸性α-葡糖苷酶(阿葡糖苷酶α或ATB200)，以20mg/kg每隔一周给予。将麦格司他以10mg/kg的剂量口服给予在给予ATB200之前30min用ATB200处理的动物亚群。单独用运载体处理对照小鼠。重组人酸性α-葡糖苷酶的最后一次给药后两周，收获比目鱼肌、四头肌和隔膜组织。通过用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色针对比目鱼肌和隔膜组织来分析糖原水平，并且对溶酶体增殖，通过测量溶酶体相关膜蛋白(LAMP1)标记物的水平，该水平在庞贝氏病中是上调的。将包埋入环氧树脂(Epon)的四头肌的半薄切片用亚甲基蓝染色，并且通过电子显微镜(1000x)观察以确定囊泡存在的程度。用免疫组织化学来分析四头肌肌肉样品，以确定自噬标记物微管相关蛋白1A/1B-轻链3磷脂酰乙醇胺缀合物(LC3AII)和p62，胰岛素依赖性葡萄糖转运蛋白GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运蛋白GLUT1的水平。

在相似的研究中，给予Gaa基因敲除小鼠四个IV推注给予的重组人酸性α-葡糖苷酶(阿葡糖苷酶α或ATB200)，以20mg/kg每隔一周给予。将麦格司他以10mg/kg的剂量口服给予在给予ATB200之前30min用ATB200处理的动物亚群。单独用运载体处理对照小鼠。重组人酸性α-葡糖苷酶最后一次给药后两周收获心肌组织，并且通过用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色来分析糖原水平，并且对于溶酶体增殖，通过测量LAMP1的水平。

如图20所示，与用阿葡糖苷酶α的常规治疗相比，ATB200的给予示出在心脏、隔膜和骨骼肌(比目鱼肌)组织中的溶酶体增殖减少，并且麦格司他与ATB200的共同给予示出溶酶体增殖的显著进一步减少，接近在野生型(WT)小鼠中所见的水平。此外，如图21所示，与用阿葡糖苷酶α的常规治疗相比，ATB200的给予示出在心脏和骨骼肌(比目鱼肌)组织中的点状糖原水平的降低，并且麦格司他与ATB200的共同给予示出显著进一步降低，再次接近在野生型(WT)小鼠中所见的水平。

同样地，如图22所示，与未处理的小鼠和用阿葡糖苷酶α处理的小鼠相比，麦格司他与ATB200的共同给予显著减少了Gaa基因敲除小鼠的四头肌肌纤维中的囊泡数目。如图23所示，与野生型小鼠相比，在Gaa基因敲除小鼠中LC3II和p62的水平均增加，但是在用ATB200和麦格司他处理时显著降低，表明与酸性α-葡糖苷酶缺陷相关的自噬的增加是在ATB200和麦格司他的共同给予时减少。另外，与野生型小鼠相比，在Gaa基因敲除小鼠中胰岛素依赖性葡萄糖转运体GLUT4和该胰岛素非依赖性葡萄糖转运体GLUT1的水平是增加的，但是又在用ATB200和麦格司他处理时显著减少。升高的与酸性α-葡糖苷酶缺陷相关的GLUT4和GLUT1水平可以有助于增加葡萄糖摄取到肌纤维中并且增加基础的和食物摄取后的糖原合成。因此，在庞贝氏病的小鼠模型中已经发现用ATB200和麦格司他的联合治疗改进骨骼肌形态学和生理学。

实施例13：在食蟹猴中，ATB200与麦格司他共同给予的毒性

将柬埔寨来源的未实验的食蟹猴分配到如表7所示的剂量组中。使动物适应研究室18(雌性)至19(雄性)天。在适应的最后一天，动物重量在2.243kg和5.413kg之间，并且是2至3岁。

表7：

NG：鼻饲

基于先前在非人类灵长动物上的研究，选择测试剂量水平以提供暴露(AUC)相似于或略高于(对于25mg/kg麦格司他和50mg/kg ATB200的组)或大约10-和3-倍高于(对于175mg/kg麦格司他和/或100mg/kg ATB200地组)在给予如从实例8的药物代谢动力学模型预测的(分别地是大约20.9hr·μg/mL和大约1822hr·μg/mL)260mg剂量的麦格司他和20mg/kg ATB200的人类中预期的临床AUC值。在非人类灵长动物上的先前的研究中，发现100mg/kg的ATB200的IV剂量导致5330hr·μg/mL的AUC，并且外推175mg/kg的麦格司他的口服剂量导致196hr·μg/mL的AUC。

将ATB200配制于包含2.92mg/mL氯化钠、20mg/mL甘露醇，和0.5mg/mL聚山梨醇酯80(配制品缓冲液)的25mM磷酸钠缓冲液中(pH 6)。将测试品(ATB200或麦格司他)和对照品/运载体(配制品缓冲液)每隔一周给予一次，持续13周，从第1天开始，并且在第85天结束。通过以0mg/kg(组1，对照品)、50mg/kg(组2)，或100mg/kg(组3和5)2小时(±10分钟)静脉内的(IV)输注，给予ATB200和该对照品/运载体。当以组合给予时，在对ATB200的输注开始之前将麦格司他在灭菌注射用水中，USP，以25mg/kg(组2)或175mg/kg(组3和4)，30分钟(±2分钟)鼻饲给予。在所有组中的给药体积是10mL/kg。

在该研究的生命期期间评估的参数包括体重，食物消耗，临床观察，详细的临床观察，体格检查，心电图，眼科评估，临床病理学(血液学、凝固、血清化学)，抗药物抗体(ADA)评估，中和ADA评估，尿液分析，以及针对麦格司他和ATB200活性和总蛋白质的血浆毒物动力学(TK)。在第99天进行动物的末次尸检(最后一次给药后14天)。在尸检时，记录总观察和器官重量，并且将组织收集用于显微镜检查。

所有动物均存活到预定的安乐死，并且在体格检查期间或在食物消耗、临床观察、详细的临床观察、体重、眼科或ECG参数的评估期间，没有归因于ATB200，麦格司他的给予或ATB200和麦格司他的共同给予的变化。另外，在尿液分析、血清化学、血液学，或凝固参数，或在总观察、器官重量，或组织病理学评估期间，没有与ATB200、麦格司他，或ATB200/麦格司他相关的变化。

总的抗药物抗体(ADA)和中和抗体(Nab)

在血浆中测量总的抗药物抗体(ADA)和中和抗体(Nab)水平。适应期间，给药前(麦格司他的给予之前)，和在第1、85和99天从所有动物中收集一次血样(大约1.6mL)于K₂EDTA试管中。将样品维持于湿冰上直至处理该样品。通过在2℃至8℃下离心，从血液采集品中获得血浆，并且将等分试样(大约0.2mL)转移至聚丙烯小瓶中，并且在-60℃至-86℃下、在一小时内冷冻储存。在从组1、2、3，和5(只有麦格司他的样品不作分析)中收集的样品上进行针对ADA的样品分析。使用酶测定法，用荧光底物4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4MU-Glc)来对中和抗体进行分析。

在第85和99天(100％发病率)，在ATB200给药组(组2、3，和5)中的所有动物是抗药物抗体(ADA)阳性的。在第85天，效价范围是从25600至409600，并且在第99天是从51200至819200。随着ATB200剂量水平的增加，没有明显的效价增加趋势。在第85和99天，在组2(50mg/kg ATB200与25mg/kg麦格司他组合)，8个动物中的五个是中和抗体(Nab)阳性的。在组3(100mg/kg ATB200与175mg/kg麦格司他组合)中，在第85天，8个动物中的两个是NAb阳性的，并且在第99天，8个动物中的4个是NAb阳性的。在组5(100mg/kg ATB200单一疗法)中，在第85天，8个动物中的两个是NAb阳性的，并且在第99天，8个动物中的3个是NAb阳性的。ADA对ATB200暴露或其他的TK参数没有明显的影响。

ATB200毒物动力学

在第1天和第85天，在以下时间点在来自动物的K₂EDTA试管中收集的血液样品中测量ATB200毒性动力学：

对于组1、2、3，和5：给药前(在给予麦格司他之前)；从输注开始1小时；从输注开始2小时；从输注开始2.5小时；从输注开始3小时；从输注开始4小时；从输注开始6小时；从输注开始12小时；从输注开始26小时；从输注开始168小时；和从输注开始336小时(在第15天给药之前收集)；和

对于组4：给药前(在给予麦格司他之前)；给予麦格司他后1.5小时；给予麦格司他后2.5小时；给予麦格司他后3.5小时；给予麦格司他后4.5小时；给予麦格司他后6.5小时；给予麦格司他后12.5小时；给予麦格司他后26.5小时；给予麦格司他后168.5小时；和给予麦格司他后336.5小时(在第15天给药之前收集)。

通过在2℃至8℃下离心而获得血浆，并且将等分试样(大约0.1mL)转移至聚丙烯小瓶中，并且在-60℃至-86℃下冷冻储存。在来自组1动物的2小时给药后的样品和从在组2、3，和5的动物中收集的所有样品上，进行ATB200酸性α-葡糖苷酶活性和ATB200总蛋白的分析。通过偶联液相色谱法到串联质谱分析法(LC-MS/MS)来测量总ATB200蛋白。使用两种特征肽(TTPTFFPK和VTSEGAGLQLQK)作为ATB200的测量。这两种肽的结果是一致的，表明在分析的血浆样品中存在完整的ATB200。使用荧光底物4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4MU-Glc)来测定酸性α-葡糖苷酶活性。使用WinNonlin Phoenix，6.1版软件(法赛特(Pharsight)公司)，对来自组2、3和5中的动物的经审核/验证的数据集(浓度和时间)进行毒物动力学(TK)数据的分析。使用个体受试者的血浆浓度数据的非隔室分析来估计在IV输注之后，酸性α-葡糖苷酶活性和ATB200总蛋白(基于该两种特征肽TTPTFFPK和VTSEGAGLQLQK)的TK参数。输入剂量水平作为实际的ATB200剂量(以mg计)，基于每个个体动物的剂量体积、体重，以及平均剂量浓度来计算。对于给药方案中的所有图，将每次给药的开始时间(ATB200的输注开始)设定为零。标称样品的收集时间用于所有的分析。通过对数-线性梯形法则估计ATB200(总蛋白质和活性测定数据集)产生的血浆-浓度-时间-曲线下面积(AUC_0-t)。用于估计λ_z的回归是基于均匀加权的浓度数据。

针对每个ATB200数据集(由总ATB200测定中的和ATB200活性测定中的两种特征肽而产生的)计算以下参数：

●R²-用于估计λ_zα的线性回归的相关系数的平方。当一定数量的点用于定义浓度对比时间曲线的末期(或特定时间范围)时使用；

●R²adj-用于估计λ_z的线性回归的相关系数的平方，针对在λ_zβ的估计中使用的点的数目进行调整。当用于定义浓度对比时间曲线的末期时的点的数目可以是变量时使用；

●点数λ_z-针对线性回归分析中用于估计λ_z的点的数目；

●λ_zα-t_最大后前三个时间点的消除速率常数；

●λ_zβ-末端消除速率常数；

●t_1/2α-基于t_最大后的前三个时间点的半衰期；

●t_1/2β-基于λ_z(0.693/λ_z)的末端消除半衰期；

●t_最大-血浆中分析物的最大浓度的时间；

●C_最大-血浆中分析物的最大观察到的浓度；

●AUC_0-t-从时间0(给药前)到具有最后可测量浓度的时间点测量的血浆中浓度-时间曲线下面积(AUC)；

●AUC_0-∞-AUC外推至时间无穷大；

●AUC_ext-AUC外推至时间无穷大的部分，其呈现为总AUC_0-∞的％；

●CL_T-总清除率(基于λ_zβ)；基于来自实际体重的以mg计的总剂量；

●CL_T/F-总清除率(基于λ_zβ)；基于来自实际体重的以mg计的总剂量除以生物可利用分数；

●V_ss-处于平衡状态的表观分布体积；

●V_z-基于末期(基于λ_zβ)的分布体积；基于来自实际体重的以mg计的总剂量；

●V_z/F-基于末期(基于λ_zβ)的分布体积；基于来自实际体重的以mg计的总剂量除以生物可利用分数；和

●累积比率-AR_C最大＝在第85至第1天的C_最大的比率；AR_AUC＝在第85至第1天的AUC_0-t的比率

雄性和雌性之间的ATB200浓度和TK参数是相似的。50mg/kg 2-小时IV ATB200输注与25mg/kg的麦格司他组合给予后的血浆浓度在给药后12和26小时之间是可测量的。在100mg/kg剂量水平(具有或没有175mg/kg麦格司他)，ATB200浓度可测量至给予后26至168小时。针对单次剂量的毒物动力学参数(第1天)在表8中示出。

表8：

重复给药(第85天)的毒物动力学参数在表9中示出。

表9：

在所有的三个给药组中，达到最大ATB200血浆浓度的时间(t_最大)是给药后大约2小时。如通过总ATB200蛋白测定测量，第1天和第85天ATB200血浆浓度和TK参数在两种评估的特征肽(TTPTFFPK和VTSEGAGLQLQK)之间是一致的。当通过酸性α-葡糖苷酶活性测定法测量时，如通过C_最大和AUC_0-t测量的暴露相对更低。这被预期，因为总蛋白测定法测量活性酶和无活性酶的浓度，然而酸性α-葡糖苷酶活性测定法仅测量活性酶的浓度。ATB200暴露随着在50和100mg/kg剂量水平之间的剂量而增加。基于t_最大后的前三个时间点的平均第1天初始t_1/2α(雄性和雌性组合)的范围是从1.28至3.07小时。平均第1天末端半衰期(t_1/2β)的范围是1.70至11.1小时(更长的t_1/2β值是受具有直至给药后168小时可测量的浓度的动物影响的)。第85天给药后观察到值的相似范围。在每隔一周一次的重复给予时观察到很少或没有积累。相对于100mg/kg ATB200单一疗法，将175mg/kg麦格司他添加至100mg/kg ATB200剂量显示减少了ATB200清除率和增加了血浆暴露大约2倍。

由于没有鉴别出不良测试品相关的变化，当通过2小时输注，每隔一周一次给予持续13周，有或没有给予麦格司他时，在食蟹猴中针对ATB200的无观察到的不良反应水平(No-Observed-Adverse-Effect-Level，NOAEL)是100mg/kg/输注(所测试的最高剂量)。在这个剂量水平下，在第85天，对于单独ATB200，平均性别平均化的AUC_0-t和C_最大(总蛋白质)分别是7830(TTPTFFPK)和7790(VTSEGAGLQLQK)hr·μg/mL以及2020(TTPTFFPK)或2010(VTSEGAGLQLQK)μg/mL，并且对于与175mg/kg麦格司他组合，平均性别平均化的AUC_0-t和C_最大(总蛋白质)分别是13900(TTPTFFPK)或13800(VTSEGAGLQLQK)hr·μg/mL和2270(两种肽)μg/mL。麦格司他毒物动力学

在第1天和第85天在以下时间点，在来自动物的K₂EDTA管中收集的血样中测量麦格司他毒物动力学：

对于组1、2、3，和5：给药前(在给予麦格司他之前)；给予麦格司他后15分钟；0小时(在输注开始之前)；从输注开始0.5小时；从输注开始1小时；从输注开始2小时；从输注开始4小时；从输注开始6小时；从输注开始12小时；从输注开始26小时；从输注开始50小时；和从输注开始74小时；和

对于组4：给药前(在给予麦格司他之前)；给予麦格司他后15分钟；给予麦格司他后30分钟；给予麦格司他后1小时；给予麦格司他后1.5小时；给予麦格司他后2.5小时；给予麦格司他后4.5小时；给予麦格司他后6.5小时；给予麦格司他后12.5小时；给予麦格司他后26.5小时；给予麦格司他后50.5小时；和给予麦格司他后74.5小时。

通过在2℃至8℃下离心而获得血浆，并且将等分试样(大约0.2mL)转移至聚丙烯小瓶中，并且在-60℃至-86℃下冷冻储存。使用LC-MS/MS方法进行麦格司他浓度的分析类似于由以下出版物中所描述的对脱氧野尻霉素(duvoglustat)浓度的分析：由里奇卡纳(Richie Khanna)，艾伦C.鲍威Jr.(Allan C.Powe Jr.)，易伦(Yi Lun)，丽贝卡索斯卡(Rebecca Soska)，杰西冯(Jessie Feng)，罗西尼多里帕拉(Rohini Dhulipala)，米歇尔弗拉塞拉(Michelle Frascella)，安蒂娜加西亚(Anadina Garcia)，李J.佩莱格里诺(LeeJ.Pellegrino)，苏徐(Su Xu)，纳斯特瑞布瑞格那(Nastry Brignol)，马修J.托斯(MatthewJ.Toth)，亨V.度(Hung V.Do)，大卫J.劳克哈特(David J.Lockhart)，布兰登A伍斯特曼(Brandon A.Wustman)，肯尼斯J.瓦伦扎诺(Kenneth J.Valenzano).“药物分子伴侣AT2220增加突变体酸性α-葡糖苷酶的特定活性和溶酶体的递送，并且促进在庞贝氏病的转基因小鼠模型中的糖原减少(The Pharmacological Chaperone AT2220Increases the SpecificActivity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid Alpha-Glucosidase,and PromotesGlycogen Reduction in Transgenic Mouse Model of Pompe Disease).”公共科学图书馆期刊(PLOS ONE)(2014年7月1日)9(7):e102092。

使用WinNonlin Phoenix，6.1版软件(法赛特(Pharsight)公司)，对来自组2、3和4中的动物的经审核/验证的数据集(浓度和时间)进行麦格司他的毒物动力学(TK)数据的分析。使用个体的血浆浓度数据的非隔室分析来估计该TK参数。通过对数-线性梯形法则来估计麦格司他TK参数。用于估计λ_z的回归是基于均匀加权的浓度数据。计算以下参数：

●R²adj-用于估计λ_z的线性回归的相关系数的平方，针对在λ_z的估计中使用的点的数目进行调整。当用于定义浓度对比时间曲线的末期时的点的数目可以是变量时使用；

●点数λ_z-针对线性回归分析中用于估计λ_z的点的数目；

●λ_z-末端消除速率常数；

●t_1/2-基于λ_z(0.693/λ_z)的末端消除半衰期；

●t_最大-血浆中分析物的最大浓度的时间；

●C_最大-血浆中分析物的最大观察到的浓度；

●AUC_0-t-从时间0(给药前)到具有最后可测量浓度的时间点测量的血浆中浓度-时间曲线下面积(AUC)；

●AUC_0-∞-AUC外推至时间无穷大；

●AUC_ext-AUC外推至时间无穷大的部分，其呈现为总AUC_0-∞的％；

●CL_T/F-总清除率除以基于来自实际体重的以mg计的总剂量的生物可利用分数；

●V_z/F-基于末期的分布体积除以基于来自实际体重的以mg计的总剂量的生物可利用分数；

●累积比率-AR_C最大＝在第85至第1天的C_最大的比率；并且AR_AUC＝在第85至第1天的AUC_0-t的比率。

性别对于麦格司他TK参数没有一致的影响。在25mg/kg鼻饲(NG)与50mg/kgATB200组合给予，抑或175mg/kg NG给予(有或没有100mg/kg ATB200)后，麦格司他血浆浓度可测量至74.5小时(最后的测量时间点)。单次剂量(第1天)和重复给药(第85天)的毒物动力学参数在表10中示出。

表10：

该t_最大范围是在给药后的从大约2至4小时。随着在25和175mg/kg剂量水平之间给药，麦格司他暴露增加。在第1天和第85天，平均t_1/2(雄性和雌性组合)是一致的，并且范围是从6.66至8.23小时。在每隔一周重复一次NG给予时观察到很少或没有积累。ATB200共同给予对总体麦格司他暴露(即，AUC_0-t)或TK参数没有可观察到的影响。

由于没有鉴别出不良测试品相关的变化，当通过鼻饲，每隔一周一次给予持续13周，有或没有给予ATB200时，在食蟹猴中针对麦格司他的无观察到的不良反应水平(No-Observed-Adverse-Effect-Level，NOAEL)是175mg/kg/剂量(所测试的最高剂量)。在这个剂量水平下，在第85天，对于单独麦格司他,平均性别平均化的AUC_0-t和C_最大分别是是204000hr·ng/mL和14700ng/mL，并且对于与100mg/kg ATB200组合，平均性别平均化的AUC_0-t和C_最大分别是216000hr·ng/mL和22000ng/mL。

实施例14：单独给予重组酸性α-葡糖苷酶(ATB200)以及与麦格司他共同给予的临 床研究的方案

研究设计：

这是一个开放标记、固定顺序、递增剂量、第一次在人类中研究的，以评估单一静脉(IV)重组酸性α-葡糖苷酶(ATB200，用灭菌注射用水复水，并且用注射用的0.9％的氯化钠进行稀释的冻干粉)和当与口服麦格司他(硬明胶胶囊，65mg)共同给予时的安全性、耐受性，和药物代谢动力学(PK)。该研究将以两个阶段进行。在阶段1中，在ATB200的连续单次递增剂量(每2周以大约4小时静脉内输注给予)，以5、10和20mg/kg的3个给药时段后，将评估安全性、耐受性和PK。在阶段2，安全性、耐受性，和PK将在以下单次和多次递增剂量组合给予后进行评估：将3个剂量的大约4小时ATB200的静脉输注之前1小时，每2周共同给予20mg/kg ATB200与130mg麦格司他(两个65mg的胶囊)，口服，随后在3个剂量的ATB200大约4小时静脉输注之前1小时，共同给予20mg/kg ATB200与260mg麦格司他(四个65mg的胶囊)，口服。

十二位酶替代疗法(ERT)-经历的患有庞贝氏病的受试者(大约6个非卧床的和6个卧床的)将招募到阶段1中。那些相同的受试者将在阶段2中继续该研究。在卧床的受试者招募前，将招募至少4个非卧床的受试者并对其给药。将经历ERT的(非卧床的)受试者定义为在招募前已经接受ERT 2至6年，能够在6分钟步行测试(6MWT)中行走至少200米，并且具有FVC的30％-80％的预测正常值的那些。将经历ERT的(卧床的)受试者定义为是在招募前完全坐轮椅，不能无辅助地行走，并且已经接受ERT≥2年的那些。在表11中示出治疗分配。

表11：

ERT＝酶替代疗法。

受试者将需要在给予口服麦格司他之前至少2小时和之后2小时禁食。口服给予麦格司他之后1小时，应该开始ATB200的IV输注。

研究程序

该研究由筛选、基线、阶段1(3个时段、固定顺序、单独ATB200的单次递增-剂量)，以及阶段2(2个时段、固定顺序、多剂量的20mg/kg ATB200与多次递增剂量的麦格司他共同给予)组成。

筛选：

所有受试者将提供知情同意书并接受资格标准的审查。对所有受试者的评估包括包含先前的输注-相关的反应(IARs)和跌倒史的病史；先前的和伴随的药物和非药物治疗的审查；生命特征(心率[HR]、呼吸率[RR]、血压[BP]，和温度)；身高；体重；综合体格检查(PE)；12导联心电图(ECG)；临床安全性实验室评估(血清化学、血液学，和尿液分析)；尿妊娠试验；针对己糖四糖(Hex4)的尿液样品；以及GAA基因分型(针对在筛选中不能提供GAA基因分型报告的受试者)。还将获得的血液样品用于免疫原性(总的抗体和中和抗体，免疫系统激活的探究性的细胞因子/其他生物标记物，与阿葡糖苷酶α的交叉反应性，以及免疫球蛋白E[IgE](如果需要))的探究性评估。满足所有入选标准，并且没有排除标准的受试者将被分配到如表11中所描述的阶段1。

基线：

对所有受试者的安全性评估包括对所有受试者进行的资格标准的审查；包含输注相关的反应(IARs)和跌倒史，不良事件(AE)和严重AE(SAE)调查，先前的和伴随的药物和非药物治疗的审查的病史；生命特征(HR、RR、BP，和温度)；体重；简单的PE；ECG；拉施(Rasch)建立的庞贝氏-比活性(R-PAct)度量；鹿特丹障碍(Rotterdam Handicap)度量；和疲劳严重性度量；临床安全性实验室评估(血清化学、血液学，和尿液分析)；尿妊娠试验；药效(PD)评估(Hex4和肌酸磷酸激酶[CPK])；免疫原性评估(总的抗体和中和抗体，与阿葡糖苷酶α交叉反应的抗体，探究性的细胞因子和免疫系统激活的其他生物标记物，与阿葡糖苷酶α的交叉反应性，和IgE(如果需要))；肺功能检查(PFTs)；运动功能检查；以及肌肉力量检查。

阶段1，时段1、2，和3：

这个阶段将包括：

●安全性：AE审查，包括严重不良事件(SAE)和IAR；伴随的药物和非药物治疗的审查；生命特征(HR、RR、BP，和温度)；简单PE；ECG；临床安全性实验室评估(血清化学、血液学，和尿液分析)；以及尿妊娠试验

●PD：尿液Hex4和血清CPK

●免疫学的：针对抗重组酸性α-葡糖苷酶抗体效价(抗重组酸性α-葡糖苷酶总抗体和中和抗体效价以及与阿葡糖苷酶α的抗体交叉反应性)的血样，以及针对免疫系统激活的促炎细胞因子及其他生物标记物的测量的血样。如果需要，还将进行IgE的测量。

●连续的24-小时药物代谢动力学(PK)：时段1(访问3，第天1)、时段2(访问4，第15天)、和时段3(访问5，第29天)期间，针对血浆酸性α-葡糖苷酶活性水平和总酸性α-葡糖苷酶蛋白质浓度的血液取样将取自所有受试者。

阶段2，时段4和5：

●安全性：AE审查，包括SAE和IAR；伴随的药物和非药物治疗的审查；生命特征(HR、RR、BP，和温度)；体重；PE；ECG；临床安全性实验室评估(血清化学、血液学，和尿液分析)；和尿妊娠试验

●PD：尿液Hex4和血清CPK

●免疫学的：针对抗重组酸性α-葡糖苷酶抗体效价(抗重组酸性α-葡糖苷酶总抗体和中和抗体效价，以及与阿葡糖苷酶α的抗体交叉反应性)的血样，以及针对免疫系统激活的促炎细胞因子及其他生物标记物的测量的血样。如果需要，还将进行IgE的测量。

●连续24小时PK：时段4(访问6，第43天和访问8，第71天)和时段5(访问9，第85天和访问11，第113天)期间，针对血浆酸性α-葡糖苷酶活性水平、总酸性α-葡糖苷酶蛋白质浓度，和麦格司他浓度的血液取样将取自所有受试者。

药物代谢动力学阶段的结束：

●安全性：AE审查，包括SAE和IAR；伴随的药物和非药物治疗的审查；生命特征(HR、RR、BP，和温度)；体重；PE；ECG；临床安全性实验室评估(血清化学、血液学，和尿液分析)；和尿妊娠试验

●PD：尿液Hex4和血清CPK

●免疫学的：针对抗重组酸性α-葡糖苷酶抗体效价(抗重组酸性α-葡糖苷酶总抗体和中和抗体效价，以及与阿葡糖苷酶α的抗体交叉反应性)的血样，以及针对免疫系统激活的促炎细胞因子及其他生物标记物的测量的血样。如果需要，还将进行IgE的测量。

过早从该研究退出的受试者将进入早期终止访问，并且将进行将在PK访问结束时进行的所有评估。将不会给予研究药物。如果任何前哨受试者过早地从该研究中退出，则该受试者将被参与该研究的下一个非卧床的受试者替换(例如，如果受试者1退出，则受试者3[非卧床的]将替换该受试者作为前哨受试者)。

提供给完成这个研究的受试者和/或其他有资格的受试者参与长期的延伸研究，并且将继续针对ATB200与麦格司他共同给予的安全性和耐受性进行评估的机会。另外，将在延伸研究中以规律的间隔进行关于庞贝氏病的功能评估。

安全性监测

安全性是通过医疗监护仪和调查人员在持续进行的基础上监测，以及通过安全管理委员会(SSC)的定期监测。

前哨剂量

本研究中前2名非卧床的受试者将是针对该研究的前哨受试者，并且将是在该研究(时段1至5)的每个时段给药的前2名受试者。在前哨受试者过早地从该研究中退出的情况下，他/她将被另一个非卧床的受试者替换。注意：在任何至少卧床的受试者可以被给药之前，至少4名非卧床的受试者将被给予5mg/kg ATB200。

在阶段1(时段1、2，和3)，受试者将被给予单次递增剂量的ATB200(5mg/kg[时段1]、10mg/kg[时段2]，和20mg/kg[时段3])。

在阶段1的每个研究时段中的2名前哨受试者的给药后，可用的安全性数据(PE、生命特征、AE、输注反应、ECG，和本地化可用进行的实验室测试)的评估将通过医疗监护仪和调查人员在24至48小时内进行。当每个剂量水平处的两名前哨受试者均可获得中心实验室安全性数据时，SSC将召集正式的安全审查。如果SSC确定不存在排除以该时期分配的剂量给药的安全性问题，则将招募10名另外的受试者并且对其给药。当在所有的3个阶段1剂量水平处，对于所有受试者的安全性数据(包括中心实验室安全性数据)可用时，SSC也将召集安全审查。

在阶段2(时段4和5)中，将给予2名前哨受试者，并且将在第一次剂量之后针对阶段1中的每个时段进行评估安全性。如果SSC确定排除20mg/kg ATB200与130mg麦格司他(时段4)共同给予或20mg/kg ATB200与260mg麦格司他(时段5)共同给予的另外的剂量给药没有安全性问题，则另外的10名受试者将以在该时段分配的剂量接受3个每两周一次的剂量。当在阶段2结束时，针对所有受试者的安全性数据(包括中心实验室安全性数据)可用时，SSC将再召集。SSC还将在SAE或鉴别的安全性问题的情况下召开临时会议。

SSC可以推荐以下任何评论：

●继续该研究而无需修改

●继续该研究而需修改(修正)

●暂时地停止给药

●永久地停止给药

如果SSC认为，在前哨受试者中没有可能排除的继续研究剂量给药的AE或安全性问题，则对该剂量水平的所有剩余受试者继续给药。受试者的安全性将继续通过医疗监护仪和研究调查人员在持续进行的基础上，以及通过SSC以规律的间隔进行严密监测。

受试者的数目(计划的)：

十二名经历ERT的患有庞贝氏病的成年受试者(大约6名非卧床的和6名卧床的)将招募到阶段1中。那些相同的受试者将在阶段2中继续该研究。

诊断以及资格标准：

使用下文概述的资格标准，在筛选访问时，将评估经历-ERT的患有庞贝氏病的成年受试者。每个受试者必须满足所有的入选标准，并且不满足排除标准。入选/排除标准的弃权是不被允许的。

入选标准

经历ERT的受试者(非卧床的)

1.年龄介于18和65岁的男性和女性受试者包括在内；

2.受试者必须在任何研究-相关的程序中提供知情同意书；

3.潜在生育的受试者必须同意在该研究期间和最后一次共同给予ATB200+麦格司他后30天内使用医学上可接受的避孕方法；

4.受试者具有基于酸性α-葡糖苷酶酶活性的记载的缺陷或通过GAA基因分型的庞贝氏病的诊断；

5.在先前的2-6年，受试者接受用阿葡糖苷酶α的ERT；

6.目前，受试者以每隔一周一次的频率接受阿葡糖苷酶α；

7.受试者接受并完成最后两次输注，没有药物相关的不良事件导致的剂量中断；

8.受试者必须能够在6MWT上行走200-500米；并且

9.直立的用力肺活量(FVC)必须是预测的正常值的30％至80％。

经历ERT的受试者(卧床的)

10.年龄介于18和65岁的男性和女性受试者包括在内；

11.受试者必须在任何研究-相关的程序中提供知情同意书；

12.潜在生育的受试者必须同意在该研究期间和最后一次共同给予ATB200+麦格司他后30天内使用医学上可接受的避孕方法；

13.受试者具有基于酸性α-葡糖苷酶酶活性的记载的缺陷或通过GAA基因分型的庞贝氏病的诊断；

14.受试者已经接受用阿葡糖苷酶α的ERT≥2年；

15.目前，受试者以每隔一周一次的频率接受阿葡糖苷酶α；

16.受试者已经接受并且完成最后两次输注，没有药物相关的不良事件导致的剂量中断；并且

17.受试者必须是完全坐-轮椅的，并且不能无辅助地行走。

排除标准

经历ERT的受试者(非卧床的)

1.受试者已经在基线访问前30天内接受了除了阿葡糖苷酶α之外的针对庞贝氏病的任何研究性治疗，或者在该研究期间预期这样做；

1.在基线访问的30天内，受试者已经接受用违禁药物治疗(米格列醇(例如，)；麦格司他(例如，)；阿卡波糖(例如， )；伏格列波糖(例如，和)；沙丁胺醇和克仑特罗；或任何调查/实验药物)；

2.受试者，如果是女性，在筛选时怀孕或哺乳；

3.受试者，无论是男性还是女性，都计划在研究期间怀孕一个孩子；

4.受试者需要侵入性通气支持；

5.清醒时，受试者使用非侵入性通气支持一天≥6小时；

6.受试者具有调查人员认为的医学或任何其他情有可原的对受试者造成不适当的安全风险或损害他/她遵守协议要求的能力的情况或情形；

7.具有对阿葡糖苷酶α过敏史的受试者；

8.具有高持久性抗重组酸性α-葡糖苷酶抗体效价的历史的受试者；

9.具有对麦格司他或其他亚氨基糖过敏或敏感的历史的受试者；

10.具有已知的自身免疫性疾病(包括狼疮、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病，或类风湿性关节炎)历史的受试者；和

11.具有已知的支气管哮喘史的受试者。

经历ERT的受试者(卧床的)

12.受试者已经在基线访问前30天内接受了除了阿葡糖苷酶α之外的针对庞贝氏病的任何研究性治疗，或者在该研究期间预期这样做；

13.在基线访问的30天内，受试者已经接受用违禁药物治疗(米格列醇(例如，)；麦格司他(例如，)；阿卡波糖(例如， )；伏格列波糖(例如，和)；沙丁胺醇和克仑特罗；或任何调查/实验药物)；

14.受试者，如果是女性，在筛选时怀孕或哺乳；

15.受试者，无论是男性还是女性，都计划在研究期间怀孕一个孩子；

16.受试者具有调查人员认为的医学或任何其他情有可原的对受试者造成不适当的安全风险或损害他/她遵守协议要求的能力的情况或情形；

17.具有对阿葡糖苷酶α过敏史的受试者；

18.具有高持久性抗重组酸性α-葡糖苷酶抗体效价的历史的受试者；

19.具有对麦格司他或其他亚氨基糖过敏或敏感的历史的受试者；

20.具有已知的自身免疫性疾病(包括狼疮、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病，或类风湿性关节炎)历史的受试者；和

21.具有已知的支气管哮喘史的受试者。

研究性产品、剂量，和给予方式：

阶段1(由3个剂量时段间隔2周组成)

●时段1：5mg/kg ATB200单次剂量IV输注；

●时段2：对已经完成时段1的所有受试者给予单次剂量IV输注的10mg/kgATB200；和

●时段3：对已经完成时段2的所有受试者给予单次剂量IV输注的20mg/kgATB200。

阶段2(由2个剂量时段组成，每个剂量时段包括3个研究的药物剂量，间隔2周)

●时段4：对已经完成时段3(每2周重复，总共3次给予)的所有受试者给予单次剂量IV输注的20mg/kg ATB200之前1小时，将口服给予130mg的麦格司他；和

●时段5：对已经完成时段4(每2周重复，总共3次给予)的所有经历ERT的受试者给予单次剂量IV输注的20mg/kg ATB200之前1小时，将口服给予260mg的麦格司他。

注意：受试者需要在给予口服麦格司他之前至少2小时和之后2小时禁食。

研究的总持续时间：长达22周(长达4周的筛选时段，随后大约18周的研究治疗[阶段1和2])

单次剂量PK观察(阶段1，时段1、2，和3)的持续时间：6周

多剂量PK观察(阶段2，时段4和5)的持续时间：12周

安全性、耐受性，和免疫原性观察(时段1、2、3、4，和5)的持续时间：18周评估标准：

原发性：

安全性评估：

●PEs

●生命特征，包括体温、RR、HR，和BP

●AE，包括IAR

●12-导联ECG

●临床安全性实验室评估：血清化学、血液学，和尿液分析

血浆ATB200和麦格司他的PK：

●血浆酸性α-葡糖苷酶活性水平和总酸性α-葡糖苷酶蛋白质浓度PK参数：最大观察到的血浆浓度(C_最大)、达到最大观察到的血浆浓度的时间(t_最大)、从时间0至最后一次可测量的浓度的时间的药物血浆浓度-时间曲线下面积(AUC_0-t)、血浆-药物浓度时间曲线下面积从时间0外推至无穷大(AUC_0-∞)、半衰期(t_1/2)，和IV给予后的总清除(CL_T)

●针对所有给药方案的血浆酸性α-葡糖苷酶活性和总酸性α-葡糖苷酶蛋白质C_最大和AUC_0-∞的比率

●血浆麦格司他PK参数：C_最大、t_最大、AUC_0-t、AUC_0-∞，和t_1/2，口服给予后的药物的表观总清除率(CL_T/F)，和口服给予后的末期分布体积(Vz/F)，针对每个剂量水平

●针对每个剂量水平的血浆麦格司他C_最大和AUC_0-∞的比率

功能性评估(在基线处进行)

对于非卧床的受试者

●运动功能测试

●6分钟步行测试(6MWT)

●10米步行测试

●步态，楼梯，高尔(Gower)和椅子得分

●计时起立和行走(TUG)

●针对上肢和下肢的肌肉力量测试(医学研究标准[MRC]和手提式肌力计)

●PFT(FVC、MIP、MEP，和SNIP)

对于卧床的受试者

●肌肉力量测试-只上肢

●只针对上肢进行的MRC和手提式肌力计

●肺功能检查(PFT)(用力肺活量[FVC]、最大吸气压[MIP]、最大呼气压[MEP]，和鼻嗅吸入压[SNIP])

患者报告的结果(在基线处进行)

●疲劳严重性度量

●鹿特丹障碍(Rotterdam Handicap)度量

●拉施(Rasch)建立的庞贝氏-比活性(R-PAct)

探究性的

●抗-ATB200抗体效价(总的和中和的)

●抗重组酸性α-葡糖苷酶抗体与阿葡糖苷酶α的交叉反应性

●促炎细胞因子和免疫系统激活的其他生物标记物

●PD标记物(Hex4和CPK)

分析方法：

统计方法：

将提供针对PK参数的描述性统计。将提供针对不是PK参数的所有变量的汇总统计。针对单独的5、10，和20mg/kg ATB200的酸性α-葡糖苷酶活性和总酸性α-葡糖苷酶蛋白质暴露(C_最大、AUC_0-t，和AUC_0-∞)比率的剂量比例性评估。对在每个群体和总体内的单独20mg/kg ATB200对比20mg/kg ATB200+130mg麦格司他，以及对比20mg/kg ATB200+260mg麦格司他的酸性α-葡糖苷酶活性和总酸性α-葡糖苷酶蛋白质暴露(C_最大、AUC_0-t，和AUC_0-∞)比率进行的方差分析(ANOVA)。对在非卧床的和卧床的受试者之间，针对20mg/kg ATB200+130mg麦格司他和20mg/kg ATB200+260mg麦格司他的酸性α-葡糖苷酶活性和总酸性α-葡糖苷酶蛋白质暴露(C_最大、AUC_0-t，和AUC_0-∞)比率进行的ANOVA。针对在每个受试者群体和总体内的130mg和260mg麦格司他的暴露比率(C_最大、AUC_0-t，和AUC_0-∞)的剂量比例性评估。将评估免疫原性结果对PK，PD和安全性的影响。

中期分析：

当至少50％(n＝6)的受试者已经完成该研究的阶段2时，将进行中期分析。在该研究中，可以进行多达2个另外的中期分析。

初始PK结果：

针对受试者的GAA活性和GAA总蛋白的PK汇总分别在表12和13中示出。

在表12-15和图24-26中，麦格司他和ATB200的单次给药之后进行单次剂量(SD)的测量，并且麦格司他和ATB200的第三次每两周一次给予之后进行多剂量(MD)的测量。

表12：

^a算数平均数(CV％)

^b中位数(最小-最大)

^c几何平均数(CV％)

表13：

^a算数平均数(CV％)

^b中位数(最小-最大)

^c几何平均数(CV％)

图24A示出5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg ATB200的剂量给药之后，平均血浆GAA活性的浓度-时间曲线。图24B还提供了描绘5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg ATB200的剂量给药之后的平均血浆GAA活性的浓度时间曲线，但是该血浆GAA活性是以对数标度显示的。从图24A-24B和表12可以看出，对于血浆GAA活性，证实ATB200比剂量比例性暴露略大。

图24C示出的是单独20mg/kg ATB200，连同20mg/kg的ATB200和130或260mg的麦格司他剂量给药之后的平均血浆GAA活性的浓度-时间曲线。图24D还提供了单独20mg/kgATB200，与130mg麦格司他或260mg麦格司他的剂量给药之后的平均血浆GAA活性，但是该血浆GAA活性是以对数标度显示的。

图25A示出5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg ATB200的剂量给药之后的平均血浆GAA总蛋白的浓度-时间曲线。图25B还提供了描绘5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg ATB200的剂量给药之后的平均血浆GAA总蛋白的浓度时间曲线，但是该血浆GAA总蛋白是以对数标度显示的。从图25A-25B和表13可以看出，对于血浆GAA总蛋白，证实ATB200比剂量比例性暴露略大。

图25C示出单独20mg/kg ATB200，20mg/kg的ATB200和130mg的麦格司他，以及20mg/kg的ATB200和260mg的麦格司他剂量给药之后的平均血浆GAA总蛋白的浓度-时间曲线。图25D还提供了单独20mg/kg ATB200，与130mg麦格司他或260mg麦格司他剂量给药之后的平均血浆GAA总蛋白，但是该血浆GAA总蛋白是以对数标度显示的。

如在表13中所示，相对于ATB200单独给予，麦格司他的共同给予增加了总GAA蛋白质血浆半衰期大约30％。对于所有处理，分布体积范围是从3.5至5.7L，表明ATB200的糖基化使得实现ATB200至组织的有效分布。

针对麦格司他的PK汇总在表14中示出。

表14

^a算数平均数(CV％)

^b中位数(最小-最大)

^c几何平均数(CV％)

图26示出130mg或260mg的麦格司他剂量给药之后，在人类受试者的血浆中的麦格司他的浓度-时间曲线。

从表14和图26中可以看出，ATB200输注前1小时口服给予麦格司他，进入输注，血浆麦格司他达到峰浓度2小时，并且证实了剂量比例性的动力学。

针对GAA活性和总蛋白的血浆浓度曲线的不同部分上进行分析，以确定部分AUC。表15提供了针对GAA活性和总蛋白质的部分AUC从0-t_最大、t_最大-6h、t_最大-10h、t_最大-12h和t_最大-24hr的汇总。

表15：

从表15可以看出，相对于单独20mg/kg ATB200，20mg/kg的ATB200加上麦格司他的pAUCt_最大-24h对于130mg SD、130mg MD，和260mg SD的GAA活性百分比平均增加量分别是21.4％、17.8％，40.2％。

相似地，相对于单独20mg/kg ATB200，20mg/kg的ATB200加上麦格司他的pAUCt_最大-24h对于130mg SD、130mg MD，和260mg SD的GAA总蛋白百分比平均增加量分别是12.5％、16.4％，37.5％。

因此，部分AUC分析证实共同给予麦格司他显著地增加了ATB200的末期部分AUC(t_最大-24h)，对于130mg剂量的麦格司他增加了大约15％，对于260mg剂量的麦格司他增加了大约40％。

初始生物标记物结果：

在人类患者中从转换到ATB200来监测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和肌酸磷酸激酶(CPK)的水平。该患者接受递增剂量的ATB200(5、10和20mg/kg)，随后是ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130和260mg)的共同给予。高水平的CPK酶可以指示对肌肉组织，心脏或脑的损伤或应激。升高的ALT和AST分别是来自庞贝氏病的肝脏和肌肉损伤的标记物。ALT、AST和CPK水平的初始分析示出在图38-41中。

从图38-41可以看出，两个患者在所有三种生物标记物中示出朝着改进的早期趋势，并且两个患者保持稳定。一个患者在CPK、AST和ALT中分别具有44％、28％和34％降低。另一个患者在CPK、AST和ALT中分别具有31％、22％和11％降低。

到目前为止，还没有严重的不良事件(SAE)。Ae通常是轻度的和短暂的。在所有入选的患者中，在100+输注后，至今没有输注相关的反应。所有患者在基线时具有抗rhGAA抗体，其保持大体稳定。细胞因子在输注期间保持低和稳定。

实施例15：在野生型和庞贝氏纤维母细胞中的GAA和LAMP1水平

利用免疫荧光显微镜，用常见的剪接突变来检测野生型纤维母细胞和庞贝氏纤维母细胞中的GAA和LAMP1水平。如图27中所示，在野生型纤维母细胞中，GAA在明显的溶酶体区室中。图27还示出在庞贝氏纤维母细胞中的丰富的GAA信号，而且在庞贝氏纤维母细胞中的该GAA和LAMP1信号似乎定位至ER和高尔基体，而不是远端的溶酶体。这是改变的GAA蛋白质在庞贝氏纤维母细胞中运输的证据。

实施例16：在Gaa-基因敲除小鼠中的细胞功能障碍和肌肉功能的改进

由于GAA缺乏引起的溶酶体糖原分解代谢的损伤已经示出引起如显著证明的实质性细胞功能障碍，持续性自噬，以及由累积的糖原填充的膜结合的细胞内区室的增殖和积累(N.拉宾(N.Raben)等人)。我们的免疫组织学数据表明，对于许多蛋白质，蛋白质运输是显著改变的，这些蛋白质包括若干对肌肉细胞膜稳定性至关重要的关键蛋白质，例如抗肌萎缩蛋白，α-和β-营养不良聚糖，包括抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物的不同肌聚糖蛋白及其他，连同参与肌肉修复的蛋白质(例如，戴斯富林蛋白(dysferlin))。这些关键的肌肉蛋白质需要适当的蛋白质运输至它们发挥功能的肌肉细胞膜。如图28所示，我们的免疫组织学数据揭示了在庞贝氏病的Gaa基因敲除(KO)小鼠模型的肌肉中，这些关键的肌肉蛋白质的可感知部分具有细胞内定位。这些数据表明，这些关键的肌肉蛋白的错运输会诱发最终导致肌无力和失修的假肌肉萎缩症。

在Gaa KO小鼠中，以等价ERT剂量(20mg/kg)经由每隔一周的给药方案来评估阿葡糖苷酶α和ATB200(具有和不具有10mg/kg麦格司他)。2种给予之后，如与运载体处理的小鼠相比，阿葡糖苷酶α适度地减少了在骨骼肌中的积累的溶酶体糖原(图32A-32C)，并且对减少自噬(图30A-30B)或溶酶体的增殖(图29A-29B)具有微不足道的影响。相反，在相同条件下，用ATB200/麦格司他观察到实质上更好的溶酶体糖原清除率(图32A-32D)。ATB200/麦格司他还似乎改进整体的肌肉生理学，如由以下项证明：减少的LC3II水平(图30A-30B)、充分确立的自噬生物标记物、和用LAMP1染色的积累的细胞内囊泡的清除率(图29A-29B)、已知的驻留溶酶体膜内在蛋白和戴斯富林蛋白(dysferlin)(图31A-31B)，已知的参与肌肉修复的细胞表面蛋白。此外，ATB200/麦格司他显著地改进类似野生型小鼠肌纤维的肌肉构造。

而且，图29-32示出ATB200的两个不同的批次(早期代和晚期代制造过程)产生可比较的结果。图32A-32D中，*表示相比单独的统计学显著性。

实施例17：在Gaa-基因敲除小鼠中的肌肉功能

在12次每两周给予的长期研究中，如通过握力测试和线悬挂测试(图33A-33B)测量，20mg/kg ATB200加10mg/kg麦格司他从基线进行性地增加了Gaa KO小鼠的功能性肌肉力量。在相同的条件下，贯穿大多数的该研究，观察到接受相同ERT剂量(20mg/kg)的阿葡糖苷酶α处理的小鼠的功能性肌肉力量是下降的(图33A-33B)。至于短期研究，相比阿葡糖苷酶α，3个月(图34A-34C)和6个月(图34D-G)后，ATB200/麦格司他具有实质更好的糖原清除率。相比阿葡糖苷酶α，3个月处理后，ATB200/麦格司他还减少了自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白(dysferlin)的细胞内积累(图35)。图33A中，*表示相比单独的统计学显著性(p<0.05，两侧t检验)。在图34A-34G中，*表示相比单独的统计学显著性(p<0.05，在单向方差分析下的使用邓尼特(Dunnett)方法的多重比较)。

总之，这些数据表明ATB200/麦格司他有效地靶向肌肉来逆转细胞功能障碍并且改进肌肉功能。重要的是，在肌肉构造中的明显改进以及减少的自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白(dysferlin)的细胞内积累对于与在功能性肌肉力量改进相关的改进的肌肉生理学可以是良好的替代。这些结果表明，监测自噬和这些关键的肌肉蛋白可以是对评估Gaa KO小鼠的庞贝氏病的有效性治疗性治疗的合理、实用的方法，其可以证明是来自临床研究中的肌肉活检的有用的生物标记物。

图40示出在存在或不存在麦格司他的情况下，6个月的ATB200给予降低了Gaa Ko小鼠中抗肌萎缩蛋白的细胞内积累。与用相比，ATB200±麦格司他的抗肌萎缩蛋白积累存在更大减少。

实施例18：在Gaa-基因敲除小鼠中的唾液酸含量对ATB200的影响

针对在Gaa KO小鼠中的药物代谢动力学和功效，评估具有不同唾液酸含量的ATB200的两个批次。表16提供了针对两个批次的特征的汇总。

表16：

从表16可以看出，批次B比批次A具有更高的唾液酸含量，但是比批次A具有略微更低的M6P含量。

图36示出ATB200的单次IV推注给药之后，在Gaa KO小鼠的血浆中的GAA活性的浓度-时间曲线。批次A和B的半衰期在以下表17中提供。

表17：

半衰期(hr)	平均数±SEM
		批次A	0.50±0.02
批次B	0.60±0.03

从表17可以看出，批次B比批次A具有更低的半衰期。尽管在半衰期上的减少是适度的，但是在半衰期上的这一减少是统计学上显著的(在两侧t检验中，p<0.05)。

在相关的研究中，将ATB200(批次A和B)和的IV推注尾静脉注射给予Gaa KO小鼠，每隔一周共注射2次。最后一次给予后14天，测量组织中的糖原水平。如图37A-37D所示，在相似剂量下，批次B比批次A在减少糖原方面通常更有效。在减少糖原方面，批次A和批次B均优于图37A-37D中，在相同剂量下，*表示相比的统计学显著性(p<0.05，t检验)，并且^表示相比批次A和批次B的统计学显著性比较(p<0.05，t检验)。

本文所描述的该实施例旨在说明本组合物和方法，而并不旨在限制本发明的范围。旨在包括与作为整体的描述一致的并且对于本领域普通技术人员来说容易理解的不同修改和改变。所附权利要求书不应受实例中所示出的具体实施例的限制，但是应当被给予与作为整体的描述一致的最宽泛的解释。

贯穿本申请，引用了专利、专利申请、出版物、产品描述、基因库登录号、和实验方案，出于所有目的，将其披露内容以其整体通过引用结合在此。

序列表

<110> 阿米库斯治疗学公司

<120> 用于治疗庞贝氏病的增强的酸性α-葡糖苷酶

<130> AT-P8500-PCT

<160> 6

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 952

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

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Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

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gcccgttgtt cagcgaggga ggctctgggc ctgccgcagc tgacggggaa actgaggcac 180

ggagcgggcc tgtaggagct gtccaggcca tctccaacc atg gga gtg agg cac 234

Met Gly Val Arg His

1 5

ccg ccc tgc tcc cac cgg ctc ctg gcc gtc tgc gcc ctc gtg tcc ttg 282

Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys Ala Leu Val Ser Leu

10 15 20

gca acc gct gca ctc ctg ggg cac atc cta ctc cat gat ttc ctg ctg 330

Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu

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gtt ccc cga gag ctg agt ggc tcc tcc cca gtc ctg gag gag act cac 378

Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His

40 45 50

cca gct cac cag cag gga gcc agc aga cca ggg ccc cgg gat gcc cag 426

Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln

55 60 65

gca cac ccc ggc cgt ccc aga gca gtg ccc aca cag tgc gac gtc ccc 474

Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro

70 75 80 85

ccc aac agc cgc ttc gat tgc gcc cct gac aag gcc atc acc cag gaa 522

Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu

90 95 100

cag tgc gag gcc cgc ggc tgc tgc tac atc cct gca aag cag ggg ctg 570

Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu

105 110 115

cag gga gcc cag atg ggg cag ccc tgg tgc ttc ttc cca ccc agc tac 618

Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr

120 125 130

ccc agc tac aag ctg gag aac ctg agc tcc tct gaa atg ggc tac acg 666

Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr

135 140 145

gcc acc ctg acc cgt acc acc ccc acc ttc ttc ccc aag gac atc ctg 714

Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu

150 155 160 165

acc ctg cgg ctg gac gtg atg atg gag act gag aac cgc ctc cac ttc 762

Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe

170 175 180

acg atc aaa gat cca gct aac agg cgc tac gag gtg ccc ttg gag acc 810

Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr

185 190 195

ccg cgt gtc cac agc cgg gca ccg tcc cca ctc tac agc gtg gag ttc 858

Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe

200 205 210

tcc gag gag ccc ttc ggg gtg atc gtg cac cgg cag ctg gac ggc cgc 906

Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg

215 220 225

gtg ctg ctg aac acg acg gtg gcg ccc ctg ttc ttt gcg gac cag ttc 954

Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe

230 235 240 245

ctt cag ctg tcc acc tcg ctg ccc tcg cag tat atc aca ggc ctc gcc 1002

Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala

250 255 260

gag cac ctc agt ccc ctg atg ctc agc acc agc tgg acc agg atc acc 1050

Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr

265 270 275

ctg tgg aac cgg gac ctt gcg ccc acg ccc ggt gcg aac ctc tac ggg 1098

Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly

280 285 290

tct cac cct ttc tac ctg gcg ctg gag gac ggc ggg tcg gca cac ggg 1146

Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly

295 300 305

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Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser

310 315 320 325

cct gcc ctt agc tgg agg tcg aca ggt ggg atc ctg gat gtc tac atc 1242

Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile

330 335 340

ttc ctg ggc cca gag ccc aag agc gtg gtg cag cag tac ctg gac gtt 1290

Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val

345 350 355

gtg gga tac ccg ttc atg ccg cca tac tgg ggc ctg ggc ttc cac ctg 1338

Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu

360 365 370

tgc cgc tgg ggc tac tcc tcc acc gct atc acc cgc cag gtg gtg gag 1386

Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu

375 380 385

aac atg acc agg gcc cac ttc ccc ctg gac gtc caa tgg aac gac ctg 1434

Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu

390 395 400 405

gac tac atg gac tcc cgg agg gac ttc acg ttc aac aag gat ggc ttc 1482

Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe

410 415 420

cgg gac ttc ccg gcc atg gtg cag gag ctg cac cag ggc ggc cgg cgc 1530

Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg

425 430 435

tac atg atg atc gtg gat cct gcc atc agc agc tcg ggc cct gcc ggg 1578

Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly

440 445 450

agc tac agg ccc tac gac gag ggt ctg cgg agg ggg gtt ttc atc acc 1626

Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr

455 460 465

aac gag acc ggc cag ccg ctg att ggg aag gta tgg ccc ggg tcc act 1674

Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr

470 475 480 485

gcc ttc ccc gac ttc acc aac ccc aca gcc ctg gcc tgg tgg gag gac 1722

Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp

490 495 500

atg gtg gct gag ttc cat gac cag gtg ccc ttc gac ggc atg tgg att 1770

Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile

505 510 515

gac atg aac gag cct tcc aac ttc atc aga ggc tct gag gac ggc tgc 1818

Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys

520 525 530

ccc aac aat gag ctg gag aac cca ccc tac gtg cct ggg gtg gtt ggg 1866

Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly

535 540 545

ggg acc ctc cag gcg gcc acc atc tgt gcc tcc agc cac cag ttt ctc 1914

Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu

550 555 560 565

tcc aca cac tac aac ctg cac aac ctc tac ggc ctg acc gaa gcc atc 1962

Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile

570 575 580

gcc tcc cac agg gcg ctg gtg aag gct cgg ggg aca cgc cca ttt gtg 2010

Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val

585 590 595

atc tcc cgc tcg acc ttt gct ggc cac ggc cga tac gcc ggc cac tgg 2058

Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp

600 605 610

acg ggg gac gtg tgg agc tcc tgg gag cag ctc gcc tcc tcc gtg cca 2106

Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro

615 620 625

gaa atc ctg cag ttt aac ctg ctg ggg gtg cct ctg gtc ggg gcc gac 2154

Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp

630 635 640 645

gtc tgc ggc ttc ctg ggc aac acc tca gag gag ctg tgt gtg cgc tgg 2202

Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp

650 655 660

acc cag ctg ggg gcc ttc tac ccc ttc atg cgg aac cac aac agc ctg 2250

Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu

665 670 675

ctc agt ctg ccc cag gag ccg tac agc ttc agc gag ccg gcc cag cag 2298

Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln

680 685 690

gcc atg agg aag gcc ctc acc ctg cgc tac gca ctc ctc ccc cac ctc 2346

Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu

695 700 705

tac aca ctg ttc cac cag gcc cac gtc gcg ggg gag acc gtg gcc cgg 2394

Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg

710 715 720 725

ccc ctc ttc ctg gag ttc ccc aag gac tct agc acc tgg act gtg gac 2442

Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp

730 735 740

cac cag ctc ctg tgg ggg gag gcc ctg ctc atc acc cca gtg ctc cag 2490

His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln

745 750 755

gcc ggg aag gcc gaa gtg act ggc tac ttc ccc ttg ggc aca tgg tac 2538

Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr

760 765 770

gac ctg cag acg gtg cca ata gag gcc ctt ggc agc ctc cca ccc cca 2586

Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro

775 780 785

cct gca gct ccc cgt gag cca gcc atc cac agc gag ggg cag tgg gtg 2634

Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val

790 795 800 805

acg ctg ccg gcc ccc ctg gac acc atc aac gtc cac ctc cgg gct ggg 2682

Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly

810 815 820

tac atc atc ccc ctg cag ggc cct ggc ctc aca acc aca gag tcc cgc 2730

Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg

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cag cag ccc atg gcc ctg gct gtg gcc ctg acc aag ggt gga gag gcc 2778

Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala

840 845 850

cga ggg gag ctg ttc tgg gac gat gga gag agc ctg gaa gtg ctg gag 2826

Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu

855 860 865

cga ggg gcc tac aca cag gtc atc ttc ctg gcc agg aat aac acg atc 2874

Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile

870 875 880 885

gtg aat gag ctg gta cgt gtg acc agt gag gga gct ggc ctg cag ctg 2922

Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu

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cag aag gtg act gtc ctg ggc gtg gcc acg gcg ccc cag cag gtc ctc 2970

Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu

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tcc aac ggt gtc cct gtc tcc aac ttc acc tac agc ccc gac acc aag 3018

Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys

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gtc ctg gac atc tgt gtc tcg ctg ttg atg gga gag cag ttt ctc gtc 3066

Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val

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Ser Trp Cys

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tgtcacctgg agctgggcac taaccattcc aagccgccgc atcgcttgtt tccacctcct 3238

gggccggggc tctggccccc aacgtgtcta ggagagcttt ctccctagat cgcactgtgg 3298

gccggggcct ggagggctgc tctgtgttaa taagattgta aggtttgccc tcctcacctg 3358

ttgccggcat gcgggtagta ttagccaccc ccctccatct gttcccagca ccggagaagg 3418

gggtgctcag gtggaggtgt ggggtatgca cctgagctcc tgcttcgcgc ctgctgctct 3478

gccccaacgc gaccgcttcc cggctgccca gagggctgga tgcctgccgg tccccgagca 3538

agcctgggaa ctcaggaaaa ttcacaggac ttgggagatt ctaaatctta agtgcaatta 3598

ttttaataaa aggggcattt ggaatc 3624

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His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

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Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

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Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

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Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

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Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

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Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

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Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

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Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

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Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

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Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

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Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

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Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

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Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

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Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

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Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

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Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

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Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

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Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

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Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

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Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

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Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

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835 840 845

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850 855 860

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865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

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915 920 925

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Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

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130 135 140

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Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

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Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

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Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

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His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

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Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

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Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

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900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950

<210> 5

<211> 952

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

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210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

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Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

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275 280 285

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Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

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545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

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Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

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Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

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Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

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Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

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915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

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<210> 6

<211> 896

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

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1 5 10 15

Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser

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Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu

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Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr

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Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val

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165 170 175

Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu

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275 280 285

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Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp

305 310 315 320

Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr

325 330 335

Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met

340 345 350

Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe

355 360 365

Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met

370 375 380

Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg

385 390 395 400

Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr

405 410 415

Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro

420 425 430

Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala

435 440 445

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450 455 460

Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn

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Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu

485 490 495

Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His

500 505 510

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Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp

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Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu

565 570 575

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595 600 605

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645 650 655

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660 665 670

Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu

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Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

885 890 895

Claims (21)

1.用于在庞贝氏病的治疗中，与麦格司他组合使用的重组酸性α-葡糖苷酶,其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且相比带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元含量，该重组酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

2.用于根据权利要求1使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶包括与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5具有至少95％一致性的序列。

3.用于根据权利要求1或2使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶的至少30％的分子包括带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的一个或多个N-聚糖单元。

4.用于根据权利要求1-3中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶包括每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中的平均从0.5至7.0摩尔的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

5.用于根据权利要求1-4中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶包括每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中的平均至少2.5摩尔的甘露糖-6-磷酸残基和每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中的至少4摩尔的唾液酸残基。

6.用于根据权利要求1-5中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶包括七个潜在的N-糖基化位点，至少50％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有在第一位点的两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元；至少30％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有在第二位点的一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元；至少30％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有在第四位点的两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元；以及至少20％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有在第四位点的一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

7.用于根据权利要求1-6中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶是通过中国仓鼠卵巢细胞系GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14或其次代培养物产生的。

8.用于根据权利要求1-7中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg至约20mg/kg的剂量实施静脉给予，并且将麦格司他以约200mg至约600mg的剂量口服给予。

9.用于根据权利要求1-8中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将麦格司他在给予该重组人酸性α-葡糖苷酶之前给予。

10.用于根据权利要求1-9中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将麦格司他在给予该重组人酸性α-葡糖苷酶约一小时前给予。

11.用于根据权利要求1-10中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg至约20mg/kg的剂量实施静脉给予，并且将麦格司他以约233mg至约500mg的剂量口服给予。

12.用于根据权利要求1-11中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg至约20mg/kg的剂量实施静脉给予，并且将麦格司他以约50mg至约200mg的剂量口服给予。

13.用于根据权利要求1-12中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约20mg/kg的剂量实施静脉给予，并且将麦格司他以约260mg的剂量口服给予。

14.用于根据权利要求1-13中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将麦格司他在给予该重组人酸性α-葡糖苷酶之前给予。

15.用于根据权利要求1-14中任一项使用的重组酸性α-葡糖苷酶，其中将麦格司他在给予该重组人酸性α-葡糖苷酶约一小时前给予。

16.在对其有需要的患者中用于庞贝氏病联合治疗的一种试剂盒，该试剂盒针包括：包含麦格司他的药学上可接受的剂型，包含重组人酸性α-葡糖苷酶的药学上可接受的剂型，以及用于将包含麦格司他的该药学上可接受的剂型和包含该重组酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型给予至对其有需要的患者的说明；

其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且相比带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元含量，该重组酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

17.根据权利要求16中所述的试剂盒，其中将包含该重组人酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型配置为以约5mg/kg至约20mg/kg的剂量用于静脉给予，并且包含麦格司他的该药学上可接受的剂型包含约200mg至约600mg的剂量，并且被配置为用于口服给予。

18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中该说明书包括对给予麦格司他在给予该重组人酸性α-葡糖苷酶约一小时前的说明。

19.根据权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，其中将包含该重组人酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型配置为以约5mg/kg至约20mg/kg的剂量用于静脉给予，并且包含麦格司他的该药学上可接受的剂型包含约50mg至约200mg的剂量，并且被配置为用于口服给予。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的试剂盒，其中将包含该重组人酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型配置为以约20mg/kg的剂量用于静脉给予，并且包含麦格司他的该药学上可接受的剂型包含约260mg的剂量，并且被配置为用于口服给予。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的试剂盒，其中该说明书包括对给予包含麦格司他的该药学上可接受的剂型在给予包含该重组人酸性α-葡糖苷酶的该药学上可接受的剂型约一小时前的说明。