EA043083B1 - Кислая альфа-глюкозидаза усиленного действия для лечения болезни помпе - Google Patents

Description

Область изобретения

В настоящем изобретении предусмотрен способ лечения болезни Помпе, включающий введение индивидууму комбинации кислой α-глюкозидазы и ее фармакологического шаперона. Более конкретно, в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения болезни Помпе, включающий введение индивидууму комбинации рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека и миглустата.

Предпосылки изобретения

Болезнь Помпе, также известная как дефицит кислой мальтазы или болезнь накопления гликогена II типа, представляет собой одно из нескольких лизосомных нарушений накопления. Лизосомные нарушения накопления представляют собой группу аутосомно-рецессивных генетических заболеваний, характеризующихся накоплением клеточных гликосфинголипидов, гликогена или мукополисахаридов во внутриклеточных компартментах, называемых лизосомами. Индивидуумы с этими заболеваниями являются носителями мутантных генов, кодирующих ферменты, которые являются дефектными в отношении катализа гидролиза одного или нескольких этих веществ, которые затем скапливаются в лизосомах. Другие примеры лизосомных нарушений включают болезнь Гоше, G_M1-ганглиозидоз, фукозидоз, формы мукополисахаридоза, болезнь Гурлер-Шейе, болезнь Ниманна-Пика типов A и B и болезнь Фабри. Болезнь Помпе также классифицируют как нервно-мышечное заболевание или метаболическую миопатию.

Болезнь Помпе оценивают как встречающуюся у приблизительно 1 из 40000 новорожденных и вызываемую мутацией в гене GAA, который кодирует фермент лизосомную α-глюкозидазу (EC:3.2.1.20), также общеизвестную как кислая α-глюкозидаза. Кислая α-глюкозидаза вовлечена в метаболизм гликогена, разветвленного полисахарида, который представляет собой основную форму запасания глюкозы у животных, посредством катализа его гидролиза до глюкозы в лизосомах. Поскольку у индивидуумов с болезнью Помпе вырабатывается мутантная, дефектная кислая α-глюкозидаза, которая является неактивной или характеризуется пониженной активностью, расщепление гликогена происходит медленнее или не происходит вовсе, и при этом гликоген накапливается в лизосомах различных тканей, в частности, в поперечно-полосатых мышцах, приводя к широкому спектру клинических проявлений, в том числе к прогрессирующей мышечной слабости и дыхательной недостаточности. В частности, поражаются такие ткани, как сердечные и скелетные мышцы.

Болезнь Помпе может варьироваться в широких пределах в отношении степени дефицита фермента, тяжести и возраста возникновения, и при этом было идентифицировано более 500 различных мутаций в гене GAA, многие из которых вызывают симптомы заболевания различной тяжести. Заболевание классифицировали на основные типы: с ранним возникновением или младенческую форму и с поздним возникновением. Более раннее возникновение заболевания и более низкая ферментативная активность обычно ассоциированы с более тяжелым течением заболевания. Младенческая форма болезни Помпе является наиболее тяжелой, будучи обусловленной полным или практически полным дефицитом кислой α-глюкозидазы, и проявляется в виде симптомов, которые включают тяжелую недостаточность мышечного тонуса, слабость, увеличенные печень и сердце и кардиомиопатию. Язык может стать увеличенным и выступать вперед, а глотание может стать затрудненным. Наиболее сильно пораженные дети умирают от осложнений со стороны дыхательной системы и сердца, не достигнув двухлетнего возраста. Болезнь Помпе с поздним возникновением может проявиться в любом возрасте старше 12 месяцев и характеризуется отсутствием поражения сердца и лучшим краткосрочным прогнозом. Симптомы связаны с прогрессирующей дисфункцией скелетных мышц и включают общую мышечную слабость и атрофию дыхательных мышц в туловище, проксимальных частях нижних конечностей и диафрагме. Некоторые взрослые пациенты не имеют основных симптомов или ограничений в движениях. Прогноз обычно зависит от степени поражения дыхательных мышц. У большинства субъектов с болезнью Помпе в конечном счете развивается физическое истощение, требующее применения инвалидной коляски и вспомогательной вентиляции легких, при этом часто случается преждевременная смерть из-за дыхательной недостаточности.

Современные варианты лечения болезни Помпе включают заместительную ферментную терапию (ERT) с применением рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека (rhGAA). Традиционные продукты на основе rhGAA известны под названиями алглюкозидаза-альфа, Myozyme® или Lumizyme®; Genzyme, Inc. ERT представляет собой длительное лечение, необходимое в течение всей жизни пациента, и включает введение заместительного фермента путем внутривенной инфузии. Затем заместительный фермент переносится в кровоток и проникает в лизосомы внутри клеток, где его действие заключается в расщеплении накопленного гликогена, что компенсирует дефицит активности эндогенного дефектного мутантного фермента и ослабляет таким образом симптомы заболевания. У субъектов с болезнью Помпе с возникновением в младенческом возрасте лечение с помощью алглюкозидазы-альфа, как было показано, значительно улучшает выживаемость в сравнении с историческим контролем, а при болезни Помпе с поздним возникновением, как было показано, алглюкозидаза-альфа характеризуется статистически значимым, хоть и незначительным, эффектом в отношении результата теста с 6-минутной ходьбой (6MWT) и форсированной жизненной емкости легких (FVC) в сравнении с плацебо.

Однако состояние большинства субъектов остается стабильным либо продолжает ухудшаться, несмотря на то, что они подвергаются лечению с помощью алглюкозидазы-альфа. Причина выраженного

- 1 043083 субоптимального эффекта ERT с применением алглюкозидазы-альфа неясна, но это может быть частично обусловлено прогрессирующей природой первопричинной мышечной патологии или слабым целенаправленным воздействием существующей ERT на ткани. Например, введенный посредством инфузии фермент является нестабильным при нейтральном pH, в том числе при pH плазмы крови (приблизительно pH 7,4), и может быть необратимо инактивирован в кровотоке. Кроме того, введенная посредством инфузии алглюкозидаза-альфа демонстрирует недостаточное поглощение основными пораженными заболеванием мышцами, возможно из-за ненадлежащего гликозилирования остатками маннозо-6-фосфата (М6Р). Такие остатки связываются с катион-независимыми рецепторами маннозо-6-фосфата (CIMPR) на поверхности клетки, позволяя ферменту приникать в клетку и лизосомы в ней. Следовательно, для эффективного лечения могут быть необходимы высокие дозы фермента, чтобы надлежащее количество активного фермента могло достичь лизосом, что делает терапию дорогостоящей и времязатратной.

Кроме того, у пациентов с болезнью Помпе часто наблюдается развитие нейтрализующих антител к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека из-за повторного воздействия лечения. Такие иммунные ответы могут существенно снижать переносимость лечения пациентами. Инструкция по медицинскому применению препарата алглюкозидазы-альфа в США включает черную рамку предупреждения с информацией о потенциальном риске реакции гиперчувствительности. У субъектов, получающих лечение с помощью алглюкозидазы-альфа, наблюдали опасные для жизни анафилактические реакции, в том числе анафилактический шок.

Для устранения этих недостатков разрабатывают ERT нового поколения. В одной стратегии рекомбинантные ферменты можно вводить совместно с фармакологическими шаперонами, которые могут индуцировать или стабилизировать надлежащую конформацию фермента для предотвращения или снижения разложения фермента и/или его разворачивания в неактивную форму in vitro (например, при хранении до введения) либо in vivo. Такая стратегия описана в публикациях международных патентных заявок № WO 2004/069190, WO 2006/125141, WO 2013/166249 и WO 2014/014938.

Были описаны результаты клинических испытаний совместного введения алглюкозидазы-альфа и миглустата пациентам с болезнью Помпе. В клинических испытаниях, проводимых с участием 13 субъектов с болезнью Помпе (3 с ранним возникновением (младенческой формой) и 10 с поздним возникновением) в 4 лечебных центрах в Италии, 20-40 мг/кг алглюкозидазы-альфа вводили в отдельности, а затем вводили совместно с 4 дозами по 80 мг миглустата. Результаты исследования демонстрируют увеличение воздействия активной формы кислой α-глюкозидазы в среднем в 6,8 раза (измеренного по фармакокинетическому параметру AUC (площадь под кривой зависимости концентрации от времени)) при совместном введении в сравнении с алглюкозидазой-альфа, вводимой в отдельности (Parenti, G., G. Andria, et al. (2015). Lysosomal Storage Diseases: From Pathophysiology to Therapy. Annu. Rev. Med. 66(1): 471486). Кроме того, в исследовании, проводимом во Флоридском университете, оценивали фармакокинетические параметры (PK) миглустата в плазме крови при совместном введении с алглюкозидазой-альфа посредством внутривенной инфузии субъектам с болезнью Помпе (Doerfler, P. A., J. S. Kelley, et al. (2014). Pharmacological chaperones prevent the precipitation of rhGAA by anti-GAA antibodies during enzyme replacement therapy. Mol. Genet. Metab. 111(2): S38).

Однако, остается необходимость в дополнительных улучшениях заместительной ферментной терапии при лечении болезни Помпе. Например, описаны новые ферменты, представляющие собой рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, которые могут характеризоваться одним или несколькими преимуществами перед ферментами, применяемыми в настоящее время, включающими без ограничения улучшенное поглощение тканями, улучшенную ферментативную активность, улучшенную стабильность или пониженную иммуногенность.

Краткое описание

В настоящем изобретении предусмотрен способ лечения болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение миглустата пациенту в комбинации с рекомбинантной кислой α-глюкозидазой человека (rhGAA), где рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (CHO) и имеет увеличенное содержание N-гликановых звеньев, несущих один или два остатка маннозо-6-фосфата, в сравнении с содержанием N-гликановых звеньев, несущих один или два остатка маннозо-6-фосфата, в алглюкозидазе-альфа. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят внутривенно в дозе, составляющей приблизительно 20 мг/кг, а миглустат вводят перорально в дозе, составляющей приблизительно 260 мг.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрена комбинация миглустата и рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, определенной в данном документе, для лечения болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение комбинации миглустата и рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, определенной в данном документе, в получении средства для лечения болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор для комбинированной терапии бо

- 2 043083 лезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом, при этом набор содержит фармацевтически приемлемую лекарственную форму, содержащую миглустат, фармацевтически приемлемую лекарственную форму, содержащую рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, определенную в данном документе, и инструкции по введению фармацевтически приемлемой лекарственной формы, содержащей миглустат, и фармацевтически приемлемой лекарственной формы, содержащей рекомбинантную кислую αглюкозидазу, пациенту, нуждающемуся в этом.

Краткое описание графических материалов

Дополнительные признаки настоящего изобретения станут очевидны из следующего письменного описания и прилагаемых фигур, на которых показано следующее.

Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий процентную долю развернутого белка ATB200 при различных значениях pH, а также в присутствии и в отсутствие миглустата в зависимости от температуры.

На фиг. 2A и 2B соответственно показаны результаты аффинной хроматографии с CIMPR для Lumizyme® и Myozyme®. Пунктирные линии относятся к градиенту элюирования с помощью М6Р. При элюировании с помощью М6Р вытесняются молекулы GAA, связанные с CIMPR посредством M6Pсодержащего гликана. Как показано на фиг. 2A, 78% активной формы GAA в Lumizyme® элюировалось до добавления М6Р. На фиг. 2B показано, что 73% активной формы GAA в Myozyme® элюировалось до добавления М6Р. Лишь 22% или 27% rhGAA соответственно в Lumizyme® или в Myozyme® элюировалось с помощью М6Р. На этих фигурах показано, что в большинстве молекул rhGAA в этих двух традиционных продуктах на основе rhGAA отсутствуют гликаны, имеющие М6Р, которые необходимы для поглощения клетками и нацеливания на лизосомы.

На фиг. 3 показана ДНК-конструкция для трансформации клеток CHO с помощью ДНК, кодирующей rhGAA. Клетки CHO трансформировали с помощью ДНК-конструкции, кодирующей rhGAA.

На фиг. 4A и 4B соответственно показаны результаты аффинной хроматографии с CIMPR для rhGAA Myozyme® и ATB200. Как очевидно из фиг. 4B, приблизительно 70% молекул rhGAA в rhGAA ATB200 содержат М6Р.

На фиг. 5A и 5B показаны результаты аффинной хроматографии с CIMPR для rhGAA ATB200 с захватом на анионообменной колонке (AEX) и без него.

На фиг. 6 показаны профили элюирования с помощью Polywax для rhGAA Lumizyme® и ATB200.

На фиг. 7 показана сводная информация о структурах N-гликанов Lumizyme® в сравнении с тремя различными препаратами ATB200 на основе rhGAA, обозначенными как BP-rhGAA, ATB200-1 и ATB200-2.

На фиг. 8A-8H показаны результаты анализа сайт-специфического N-гликозилирования rhGAA ATB200.

На фиг. 9A показано сравнение аффинности связывания с CIMPR для rhGAA ATB200 (левая кривая) с аффинностью связывания для Lumizyme® (правая кривая).

На фиг. 9B показано сравнение содержания Bis-M6P в rhGAA Lumizyme® и ATB200.

На фиг. 10A показано сравнение активности rhGAA ATB200 (левая кривая) с активностью rhGAA Lumizyme® (правая кривая) в нормальных фибробластах при различных концентрациях GAA.

На фиг. 10B показано сравнение активности rhGAA ATB200 (левая кривая) с активностью rhGAA Lumizyme® (правая кривая) в фибробластах, полученных от субъекта с болезнью Помпе, при различных концентрациях GAA.

На фиг. 10C показано сравнение (K_nOг_ΛOщенuе) фибробластов, полученных от здоровых субъектов и субъектов с болезнью Помпе.

Фиг. 11 представляет собой график, демонстрирующий точность подбора популяционной фармакокинетической (PK) модели для ATB200.

Фиг. 12 представляет собой график, демонстрирующий нормализованные по дозе профили зависимости концентрации миглустата и дувоглустата в плазме крови от времени.

Фиг. 13A представляет собой график, демонстрирующий точность подбора популяционной PKмодели для дувоглустата в плазме крови.

Фиг. 13B представляет собой график, демонстрирующий точность подбора популяционной PKмодели для дувоглустата в мышечной ткани.

Фиг. 14 представляет собой график, демонстрирующий точность подбора популяционной PKмодели для миглустата.

Фиг. 15 представляет собой график, демонстрирующий предсказанный профиль зависимости концентрации от времени, полученный в результате инфузии людям однократной внутривенной дозы (IV) 20 мг/кг ATB200 в течение 4-часового периода.

Фиг. 16A представляет собой график, демонстрирующий количество гликогена соотносительно с дозой рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека в сердечной мышце мыши после контакта с инертной средой (отрицательный контроль), с 20 мг/кг алглюкозидазы-альфа (Lumizyme®) или с 5, 10 или 20 мг/кг ATB200.

- 3 043083

Фиг. 16B представляет собой график, демонстрирующий количество гликогена соотносительно с дозой рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека в четырехглавой мышце мыши после контакта с инертной средой (отрицательный контроль), с 20 мг/кг алглюкозидазы-альфа (Lumizyme®) или с 5, 10 или 20 мг/кг ATB200.

Фиг. 16C представляет собой график, демонстрирующий количество гликогена соотносительно с дозой рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека в трехглавой мышце мыши после контакта с инертной средой (отрицательный контроль), с 20 мг/кг алглюкозидазы-альфа (Lumizyme®), или с 5, 10 или 20 мг/кг ATB200.

Фиг. 17 представляет собой график, на котором отображено соотношение уровней гликогена у мышей, обработанных с помощью различных доз миглустата в присутствии ATB200, и уровней гликогена у мышей, обработанных с помощью ATB200 в отдельности, в зависимости от соотношения значения AUC миглустата и значения AUC ATB200.

Фиг. 18 представляет собой график, демонстрирующий предсказанный профиль зависимости концентрации миглустата в плазме крови от времени после повторного введения доз 466 мг, 270 мг и 233 мг миглустата.

Фиг. 19 представляет собой график, демонстрирующий предсказанный профиль зависимости концентрации миглустата в лизосомах тканей от времени после повторного введения доз 466 мг, 270 мг и 233 мг миглустата.

Фиг. 20 представляет собой серию микрофотографий сердечных мышц, диафрагм и камбаловидных мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны уровни мембранного белка, ассоциированного с лизосомами (LAMP1).

Фиг. 21 представляет собой серию микрофотографий сердечных и камбаловидных мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны уровни гликогена путем окрашивания реактивом Шиффа и йодной кислотой (PAS).

Фиг. 22 представляет собой серию микрофотографий (1000x) четырехглавых мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, окрашенных с помощью метиленового синего для того, чтобы показать вакуоли (указаны стрелками).

Фиг. 23 представляет собой серию микрофотографий (400x) четырехглавых мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны уровни маркеров аутофагии легкой цепи 3 ассоциированного с микротрубочками белка 1A/1B, конъюгированной с фосфатидилэтаноламином (LC3A II), и p62, инсулинзависимого переносчика глюкозы GLUT4 и инсулиннезависимого переносчика глюкозы GLUT1.

Фиг. 24A-24D представляют собой графики, демонстрирующие профили зависимости концентрации активной формы GAA от времени в плазме крови у субъектов-людей после введения дозы 5, 10 или 20 мг/кг ATB200 или 20 мг/кг ATB200 и 130 или 260 мг миглустата.

Фиг. 25A-25D представляют собой графики, демонстрирующие профили зависимости концентрации общего белка GAA в плазме крови от времени у субъектов-людей после введения дозы 5, 10 или 20 мг/кг ATB200, 20 мг/кг ATB200 и 130 мг миглустата или 20 мг/кг ATB200 и 260 мг миглустата.

Фиг. 26 представляет собой график, демонстрирующий профили зависимости концентрации миглустата в плазме крови от времени у субъектов-людей после введения дозы 130 мг или 260 мг миглустата.

Фиг. 27 представляет собой серию микрофотографий фибробластов дикого типа и фибробластов при болезни Помпе, подвергнутых иммунофлуоресцентному окрашиванию для выявления уровней GAA и LAMP1.

Фиг. 28 представляет собой серию микрофотографий мышечных волокон мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, на которых показаны уровни дистрофина, α- и β-дистрогликанов и дисферлина.

Фиг. 29A и 29B представляют собой серии микрофотографий (200x) мышечных волокон прямой мышцы бедра (RF) и латеральной широкой мышцы бедра/медиальной широкой мышцы бедра (VL/VM) мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны IHC-сигналы от LAMP1.

Фиг. 30A и 30B представляют собой серии микрофотографий (200x) мышечных волокон RF и VL/VM мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны IHC-сигналы от LC3-II.

Фиг. 31A и 31B представляют собой серии микрофотографий (200x) мышечных волокон RF и VL/VM мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны IHC-сигналы

- 4 043083 от дисферлина.

Фиг. 32A-32D представляют собой графики, демонстрирующие уровни гликогена в клетках четырехглавой, трехглавой, икроножной и сердечной мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата.

Фиг. 33A и 33B представляют собой графики, демонстрирующие данные о висе на проволоке и мышечной силе захвата у мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии миглустата.

Фиг. 34A-34G представляют собой графики, демонстрирующие уровни гликогена в клетках четырехглавой, трехглавой и сердечной мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата.

Фиг. 35 представляет собой серию микрофотографий мышечных волокон VL/VM мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны IHC-сигналы от LAMP1, LC3 и дисферлина.

Фиг. 36 представляет собой график, демонстрирующий профили зависимости концентрации активной формы GAA от времени в плазме крови у мышей с нокаутом Gaa после введения двух партий ATB200, имеющих разное содержание сиаловой кислоты.

Фиг. 37A-37D представляют собой графики, демонстрирующие уровни гликогена в клетках четырехглавой, трехглавой, икроножной и сердечной мышц мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200.

Фиг. 38 представляет собой график, демонстрирующий уровни аланинаминотрансферазы (ALT) у пациентов-людей после введения возрастающих доз ATB200 (5, 10 и 20 мг/кг) с последующим совместным введением ATB200 (20 мг/кг) и миглустата (130 и 260 мг).

Фиг. 39 представляет собой график, демонстрирующий уровни аспартатаминотрансферазы (AST) у пациентов-людей после введения возрастающих доз ATB200 (5, 10 и 20 мг/кг) с последующим совместным введением ATB200 (20 мг/кг) и миглустата (130 и 260 мг).

Фиг. 40 представляет собой график, демонстрирующий уровни креатинфосфокиназы (CPK) у пациентов-людей после введения возрастающих доз ATB200 (5, 10 и 20 мг/кг) с последующим совместным введением ATB200 (20 мг/кг) и миглустата (130 и 260 мг).

Фиг. 41 представляет собой график, демонстрирующий средние уровни ALT, AST и CPK у пациентов-людей после введения возрастающих доз ATB200 (5, 10 и 20 мг/кг) с последующим совместным введением ATB200 (20 мг/кг) и миглустата (130 и 260 мг).

Фиг. 42 представляет собой серию микрофотографий (100x и 200x) мышечных волокон латеральной широкой мышцы бедра (VL) мышей дикого типа и мышей с нокаутом Gaa, обработанных с помощью инертной среды, алглюкозидазы-альфа и ATB200 в присутствии и в отсутствие миглустата, на которых показаны сигналы от дистрофина.

Определения

Термины, используемые в данном описании, как правило, имеют их обычные значения в данной области техники, в контексте настоящего изобретения и в конкретном контексте, в котором используется каждый термин. Определенные термины обсуждаются ниже или в других местах в настоящем описании для предоставления дополнительных указаний практикующему специалисту.

В настоящем описании, за исключением случаев, когда контекст требует иного в силу языковых особенностей или необходимого подразумеваемого значения, слово содержать или такие его варианты, как содержит или содержащий, используются во включительном смысле, т.е. для указания присутствия изложенных признаков, но без исключения присутствия или добавления дополнительных признаков в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.

Используемый в данном документе термин болезнь Помпе, также упоминаемый как дефицит кислой мальтазы, болезнь накопления гликогена II типа (GSDII) и гликогеноз II типа, подразумевается как обозначающий генетическое лизосомное нарушение накопления, характеризующееся мутациями в гене GAA, который кодирует фермент кислую α-глюкозидазу человека. Термин включает без ограничений формы заболевания с ранним и поздним возникновением, в том числе без ограничения формы болезни Помпе с возникновением в младенческом, юношеском и взрослом возрасте.

Используемый в данном документе термин кислая α-глюкозидаза подразумевается как обозначающий лизосомный фермент, который гидролизует а-1,4-связи между D-глюкозными звеньями гликогена, мальтозы и изомальтозы. Альтернативные названия включают без ограничения лизосомную αглюкозидазу (EC:3.2.1.20); глюкоамилазу; 1,4-α-D-глюканглюкогидролазу; амилоглюкозидазу; гаммаамилазу и экзо-1,4-а-глюкозидазу. Кислая α-глюкозидаза человека кодируется геном GAA (ID гена 2548 в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI)), который был картирован в длинном плече хромосомы 17 (местоположение 17q25.2-q25.3). К настоящему времени в гене GAA человека было идентифицировано более 500 мутаций, многие из которых ассоциированы с болезнью Помпе. Мутации,

- 5 043083 приводящие к неправильному сворачиванию или неправильному процессингу фермента кислой αглюкозидазы, включают в себя T1064C (Leu355Pro) и C2104T (Arg702Cys). Кроме того, мутации GAA, которые влияют на созревание и процессинг фермента, включают в себя Leu405Pro и Met519Thr. Для осуществления активности белка кислой α-глюкозидазы требуется наличие консервативного гексапептида WIDMNE в аминокислотных остатках 516-521. Используемая в данном документе аббревиатура GAA подразумевается как обозначающая фермент кислую α-глюкозидазу, тогда как выделенная курсивом аббревиатура GAA подразумевается как обозначающая ген человека, кодирующий фермент кислую α-глюкозидазу человека. Выделенная курсивом аббревиатура Gaa подразумевается как обозначающая гены, отличные от человеческих, кодирующие ферменты кислые α-глюкозидазы, отличные от человеческих, в том числе без ограничения гены крыс или мышей, а аббревиатура Gaa подразумевается как обозначающая ферменты кислые α-глюкозидазы, отличные от человеческих. Таким образом, аббревиатура rhGAA подразумевается как обозначающая фермент рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека.

Используемый в данном документе термин алглюкозидаза-альфа подразумевается как обозначающий рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, идентифицированную как [199-аргинин,223гистидин]препро-α-глюкозидаза (человека); регистрационный номер в Chemical Abstracts 420794-05-0. Алглюкозидаза-альфа одобрена Genzyme для реализации в США с 1 октября 2014 года в виде продуктов Lumizyme® и Myozyme®.

Используемый в данном документе термин ATB200 подразумевается как обозначающий рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, описанную в патентной заявке PCT/US2015/053252, одновременно находящейся на рассмотрении патентного ведомства, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки.

Используемый в данном документе термин гликан подразумевается как обозначающий полисахаридную цепь, ковалентно связанную с аминокислотным остатком в белке или полипептиде. Используемый в данном документе термин N-гликан или N-связанный гликан подразумевается как обозначающий полисахаридную цепь, присоединенную к аминокислотному остатку в белке или полипептиде посредством образования ковалентной связи с атомом азота аминокислотного остатка. Например, N-гликан может быть ковалентно связан с атомом азота боковой цепи аспарагинового остатка. Гликаны могут содержать одно или несколько моносахаридных звеньев, и моносахаридные звенья могут быть ковалентно связаны с образованием прямой цепи или разветвленной цепи. По меньшей мере в одном варианте осуществления N-гликановые звенья, присоединенные к ATB200, могут содержать одно или несколько моносахаридных звеньев, каждое из которых независимо выбрано из N-ацетилглюкозамина, маннозы, галактозы или сиаловой кислоты. N-гликановые звенья в белке можно определить с помощью любой подходящей аналитической методики, такой как масс-спектрометрия. В некоторых вариантах осуществления N-гликановые звенья можно определить с помощью жидкостной хроматографии с тандемной массспектрометрией (LC-MS/MS), используя такие приборы, как масс-спектрометр Orbitrap Velos Pro™ от Thermo Scientific, масс-спектрометр Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ от Thermo Scientific или массспектрометр Xevo® G2-XS QTof от Waters.

Используемый в данном документе термин высокоманнозный N-гликан подразумевается как обозначающий N-гликан, имеющий от одного до шести или больше маннозных звеньев. По меньшей мере в одном варианте осуществления высокоманнозное N-гликановое звено может содержать 6uc(Nацетилглюкозаминовую) цепь, связанную с аспарагиновым остатком и дополнительно связанную с разветвленной полиманнозной цепью.

Используемые в данном документе взаимозаменяемые термины М6Р или маннозо-6-фосфат подразумеваются как обозначающие маннозное звено, фосфорилированное в положении 6; т.е. имеющее фосфатную группу, связанную с гидроксильной группой в положении 6. По меньшей мере в одном варианте осуществления одно или несколько маннозных звеньев одного или нескольких N-гликановых звеньев фосфорилированы в положении 6 с образованием маннозо-6-фосфатных звеньев. По меньшей мере в одном варианте осуществления термины М6Р или маннозо-6-фосфат обозначают как сложный фосфодиэфир маннозы, имеющий N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) в качестве кэпа в фосфатной группе, так также и маннозное звено, имеющее доступную фосфатную группу, лишенную кэпа GlcNAc. По меньшей мере в одном варианте осуществления N-гликаны белка могут иметь несколько групп М6Р, при этом по меньшей мере одна группа М6Р имеет кэп GlcNAc и по меньшей мере одна другая группа М6Р лишена кэпа GlcNAc.

Используемый в данном документе термин комплексный N-гликан подразумевается как обозначающий N-гликан, содержащий одно или несколько галактозных звеньев и/или звеньев сиаловой кислоты. По меньшей мере в одном варианте осуществления комплексный N-гликан может представлять собой высокоманнозный N-гликан, в котором одно или несколько маннозных звеньев дополнительно связаны с одним или несколькими моносахаридными звеньями, каждое из которых независимо выбрано из N-ацетилглюкозамина, галактозы и сиаловой кислоты.

Как используется в данном документе, соединение миглустат, также известное как N-бутил-1- 6 043083 дезоксиноджиримицин, или NB-DNJ, или (2R,3R,4R,5S)-1-бутил-2-(гидроксиметил)пиперидин-3,4,5триол, представляет собой соединение, имеющее следующую химическую формулу:

он

он

Один состав на основе миглустата реализуется коммерчески под торговым названием Zavesca® в качестве средства монотерапии при болезни Г оше 1 типа.

Как обсуждается ниже, фармацевтически приемлемые соли миглустата также можно применять в настоящем изобретении. В случае применения соли миглустата дозировку соли корректируют так, чтобы доза миглустата, получаемая пациентом, была эквивалентной количеству, которое было бы получено при применении миглустата в форме свободного основания.

Как используется в данном документе, соединение дувоглустат, также известное как 1дезоксиноджиримицин, или DNJ, или (2R,3R,4R,5S)-2-(гидроксиметил)пиперидин-3,4,5-триол, представляет собой соединение, имеющее следующую химическую формулу:

он

он

Используемый в данном документе термин фармакологический шаперон или иногда просто термин шаперон подразумевается как обозначающий молекулу, которая специфично связывается с кислой α-глюкозидазой и характеризуется одним или несколькими следующими эффектами:

улучшает образование стабильной молекулярной конформации белка;

улучшает надлежащий транспорт белка из эндоплазматической сети в другое местоположение в клетке, предпочтительно нативное местоположение в клетке, для того, чтобы предотвратить разложение белка, ассоциированное с эндоплазматической сетью;

предотвращает агрегацию конформационно нестабильных или неправильно свернутых белков;

по меньшей мере частично восстанавливает и/или улучшает функцию, стабильность и/или активность белка дикого типа и/или улучшает фенотип или функцию клетки, содержащей кислую а-глюкозидазу.

Таким образом, фармакологический шаперон для кислой α-глюкозидазы представляет собой молекулу, которая связывается с кислой α-глюкозидазой, что обуславливает надлежащие сворачивание, транспорт, отсутствие агрегации и активность кислой α-глюкозидазы. Этот термин, используемый в данном документе, включает без ограничения активные сайт-специфические шапероны (ASSC), которые связываются с активным сайтом фермента, ингибиторы или антагонисты и агонисты. По меньшей мере в одном варианте осуществления фармакологический шаперон может представлять собой ингибитор или антагонист кислой α-глюкозидазы. Используемый в данном документе термин антагонист подразумевается как обозначающий любую молекулу, которая связывается с кислой α-глюкозидазой и частично либо полностью блокирует, ингибирует, снижает или нейтрализует активность кислой а-глюкозидазы. По меньшей мере в одном варианте осуществления фармакологический шаперон представляет собой миглустат. Другой неограничивающий пример фармакологического шаперона для кислой аглюкозидазы представляет собой дувоглустат.

Используемый в данном документе термин активный сайт подразумевается как обозначающий участок белка, который ассоциирован с конкретной биологической активностью белка и является необходимым для нее. По меньшей мере в одном варианте осуществления активный сайт может представлять собой сайт, в котором происходит связывание с субстратом или другими партнерами по связыванию и который предоставляет аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в образовании и разрушении химических связей. В настоящем изобретении активные сайты могут включать в себя каталитические сайты ферментов, антигенсвязывающие сайты антител, лигандсвязывающие домены рецепторов, связывающие домены регуляторов или рецепторсвязывающие домены секретируемых белков. Активные сайты также могут охватывать трансактивирующие домены, домены, участвующие в белок-белковых взаимодействиях, или ДНК-связывающие домены факторов транскрипции и регуляторов.

Используемый в данном документе термин AUC подразумевается как обозначающий математический расчет для оценивания общего воздействия указанного лекарственного средства на организм с течением времени. На графике отображено, как концентрация введенного субъекту лекарственного средства в крови изменяется с течением времени после введения дозы, при этом переменная концентрации лекарственного средства отложена по оси y, а время отложено по оси x. Площадь между кривой изменения концентрации лекарственного средства и осью х для заданного временного интервала называется AUC (площадь под кривой). AUC применяют в качестве ориентира для составления схем введения доз и для сравнения биодоступности различных лекарственных средств, определяющей их доступность в

- 7 043083 организме.

Используемый в данном документе термин C_max подразумевается как обозначающий максимальную концентрацию лекарственного средства в плазме крови, достигаемую после введения субъекту.

Используемый в данном документе термин объем распределения или V подразумевается как обозначающий теоретический объем, который будет необходимым для того, чтобы содержать общее количество вводимого лекарственного средства в той же концентрации, которая наблюдается в плазме крови, и представляет степень, в которой лекарственное средство распределяется в тканях организма, а не в плазме крови. Более высокие значения V указывают на более высокую степень распределения в тканях. Центральный объем распределения или V_c подразумевается как обозначающий объем распределения в крови и тканях, хорошо перфузируемых кровью. Периферический объем распределения или V2 подразумевается как обозначающий объем распределения в периферических тканях.

Используемые в данном документе взаимозаменяемые термины клиренс, системный клиренс или CL подразумеваются как обозначающие объем плазмы крови, который полностью очищается от вводимого лекарственного средства за единицу времени. Периферический клиренс подразумевается как обозначающий объем периферической ткани, очищаемый от вводимого лекарственного средства за единицу времени.

Как используется в данном документе, терапевтически эффективная доза и эффективное количество подразумеваются как обозначающие количество кислой α-глюкозидазы и/или миглустата и/или их комбинации, которое является достаточным для того, чтобы вызвать терапевтический ответ у субъекта. Терапевтический ответ может представлять собой любой ответ, который пользователь (например, врачконсультант) распознает как эффективный ответ на терапию, охватывающий любые суррогатные клинические маркеры или симптомы, описанные в данном документе и известные из уровня техники. Таким образом, по меньшей мере в одном варианте осуществления терапевтический ответ может представлять собой уменьшение интенсивности или ингибирование одного или нескольких симптомов или маркеров болезни Помпе, таких как известные из уровня техники. Симптомы или маркеры болезни Помпе включают без ограничения пониженную активность кислой α-глюкозидазы в тканях; кардиомиопатию; кардиомегалию; прогрессирующую мышечную слабость, особенно в туловище или нижних конечностей; глубокую гипотонию; макроглоссию (и в некоторых случаях протрузию языка); затрудненное глотание, сосание и/или кормление; дыхательную недостаточность; гепатомегалию (умеренную); вялость мышц лица; арефлексию; непереносимость физической нагрузки; одышку при физической нагрузке; ортопноэ; апноэ во время сна; утренние головные боли; сонливость; лордоз и/или сколиоз; пониженные глубокие сухожильные рефлексы; боль в пояснице и несоответствие ключевым этапам двигательного развития. Следует отметить, что концентрация миглустата, которая оказывает ингибирующий эффект на кислую αглюкозидазу, может составлять эффективное количество для целей настоящего изобретения ввиду разбавления (и последующего сдвига связывании из-за изменения равновесного состояния), биодоступности и метаболизма миглустата при введении in vivo.

Используемый в данном документе термин заместительная ферментная терапия или ERT подразумевается как обозначающий введение ненативного очищенного фермента индивидууму с дефицитом такого фермента. Вводимый белок может быть получен из природных источников или посредством рекомбинантной экспрессии. Термин также обозначает введение очищенного фермента индивидууму, по другим причинам требующему введения очищенного фермента или получающему пользу от него. По меньшей мере в одном варианте осуществления такой индивидуум страдает от недостаточности фермента. Вводимый фермент может представлять собой очищенный рекомбинантный фермент, полученный in vitro, или белок, очищенный из выделенной ткани или жидкости, такой как, например, плацента или молоко животных, или из растений.

Используемый в данном документе термин комбинированная терапия подразумевается как обозначающий любой вид терапии, при котором два или больше отдельных терапевтических средств вводят одновременно или последовательно. По меньшей мере в одном варианте осуществления результаты комбинированной терапии являются улучшенными в сравнении с эффектом каждого вида терапии, осуществляемого в отдельности. Усиление может включать любое улучшение эффекта различных видов терапии, которое может приводить к благоприятному результату в сравнении с результатами, достигаемыми с помощью данных видов терапии, осуществляемых в отдельности. Усиленные эффект или результаты могут включать синергическое усиление, где усиленный эффект превышает аддитивные эффекты каждого из видов терапии, осуществляемых в отдельности; аддитивное усиление, где усиленный эффект по существу равен аддитивному эффекту каждого из видов терапии, осуществляемых в отдельности; или эффект, меньший синергического, где усиленный эффект является более слабым, чем аддитивный эффект каждого из видов терапии, осуществляемых в отдельности, но все же лучшим, чем эффект каждого из видов терапии, осуществляемых в отдельности. Усиленный эффект можно измерить с помощью любых способов, известных из уровня техники, с помощью которых можно измерить эффективность или результат лечения.

Используемый в данном документе термин фармацевтически приемлемый подразумевается как

- 8 043083 обозначающий молекулярные сущности и композиции, которые являются физиологически переносимыми и обычно не вызывают нежелательные реакции при введении человеку. Используемый в данном документе термин фармацевтически приемлемый предпочтительно означает одобренный регулирующим ведомством федерального правительства или правительства штата или упомянутый в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у людей.

Используемый в данном документе термин носитель подразумевается как обозначающий разбавитель, вспомогательное средство, наполнитель или инертную среду, с которыми вводят соединение. Подходящие фармацевтические носители известны из уровня техники и по меньшей мере в одном варианте осуществления описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences E. W. Martin, 18-е издание или другие издания.

Используемые в данном документе термины субъект или пациент подразумеваются как обозначающие человека или животное, отличное от человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления субъектом является млекопитающее. По меньшей мере в одном варианте осуществления субъектом является человек.

Используемый в данном документе термин антитело к лекарственному средству подразумевается как обозначающий антитело, специфично связывающееся с лекарственным средством, вводимым субъекту, и образуемое субъектом в качестве по меньшей мере части гуморального иммунного ответа на введение субъекту лекарственного средства. По меньшей мере в одном варианте осуществления лекарственное средство представляет собой терапевтический белковый лекарственный препарат. Антитело к лекарственному средству, присутствующее у субъекта, может вызывать иммунные ответы в диапазоне от легких до тяжелых, в том числе без ограничения опасные для жизни иммунные ответы, которые включают без ограничения анафилактическую реакцию, синдром высвобождения цитокинов и перекрестную нейтрализацию эндогенных белков, опосредующих жизненно важные функции. Кроме того или в качестве альтернативы, антитело к лекарственному средству, присутствующее у субъекта, может уменьшать эффективность лекарственного средства.

Используемый в данном документе термин нейтрализующее антитело подразумевается как обозначающий антитело к лекарственному средству, действие которого заключается в нейтрализации функции лекарственного средства. По меньшей мере в одном варианте осуществления терапевтический белковый лекарственный препарат представляет собой аналог эндогенного белка, экспрессия которого у субъекта является пониженной или отсутствует. По меньшей мере в одном варианте осуществления действие нейтрализующих антител может заключаться в нейтрализации функции эндогенного белка.

Используемые в данном документе термины приблизительно и примерно подразумеваются как обозначающие приемлемую степень погрешности для измеряемой величины с учетом природы или точности измерений. Например, степень погрешности может указываться количеством значащих цифр, предусмотренных для измерения, как понимается в данной области техники, и включает без ограничения изменение на ± 1 наиболее точной значащей цифры, представленной для измерения. Типичные приводимые в качестве примера степени погрешности находятся в пределах 20 процентов (%), предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% от указанного значения или диапазона значений. В качестве альтернативы и, в частности, в биологических системах термины примерно и приблизительно могут означать значения, которые находятся в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5-кратного и более предпочтительно в пределах 2-кратного изменения указанного значения. Численные величины, приведенные в данном документе, являются приблизительными, если не указано иное, что означает, что термин приблизительно или примерно может являться предположительным, если не указано точно.

Термин одновременно, используемый в данном документе, подразумевается как обозначающий в то же время, что или в разумно короткий период времени до или после, что будет понятно специалисту в данной области. Например, если два средства для лечения вводят одновременно друг с другом, то одно средство для лечения можно вводить до или после другого средства для лечения, делая поправку на время, необходимое для подготовки последнего из двух средств для лечения. Следовательно, одновременное введение двух средств для лечения включает без ограничения введение одного средства для лечения вслед за другим через 20 мин или меньше, приблизительно 20 мин, приблизительно 15 мин, приблизительно 10 мин, приблизительно 5 мин, приблизительно 2 мин, приблизительно 1 мин или меньше чем 1 мин.

Термин фармацевтически приемлемая соль, используемый в данном документе, подразумевается как обозначающий соль, которая в рамках тщательной медицинской оценки является подходящей для применения в контакте с тканями людей и низших животных без неспецифической токсичности, болезненной чувствительности, аллергической реакции и т.п., соответствует разумному соотношению риска и пользы, обычно является водо-или жирорастворимой или диспергируемой и является эффективной для предполагаемого применения. Термин включает фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты и фармацевтически приемлемые соли присоединения основания. Перечни подходящих солей находятся, например, в S. M. Birge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, p. 1-19, включенном в данный документ посредством ссылки.

- 9 043083

Термин фармацевтически приемлемая соль присоединения кислоты, используемый в данном документе, подразумевается как обозначающий такие соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований и которые не являются нежелательными с биологической точки зрения или в других отношениях, образованных с неорганическими кислотами, в том числе без ограничения с хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, сульфаминовой кислотой, азотной кислотой, фосфорной кислотой и т.п., и органическими кислотами, в том числе без ограничения уксусной кислотой, трифторуксусной кислотой, адипиновой кислотой, аскорбиновой кислотой, аспарагиновой кислотой, бензолсульфоновой кислотой, бензойной кислотой, масляной кислотой, камфорной кислотой, камфорсульфоновой кислотой, коричной кислотой, лимонной кислотой, диглюконовой кислотой, этансульфоновой кислотой, глутаминовой кислотой, гликолевой кислотой, глицерофосфорной кислотой, гемисульфатной кислотой, гексановой кислотой, муравьиной кислотой, фумаровой кислотой, 2-гидроксиэтансульфоновой кислотой (изетионовой кислотой), молочной кислотой, гидроксималеиновой кислотой, яблочной кислотой, малоновой кислотой, миндальной кислотой, мезитиленсульфоновой кислотой, метансульфоновой кислотой, нафталинсульфоновой кислотой, никотиновой кислотой, 2-нафталинсульфоновой кислотой, щавелевой кислотой, памовой кислотой, пектиновой кислотой, фенилуксусной кислотой, 3-фенилпропионовой кислотой, пивалевой кислотой, пропионовой кислотой, пировиноградной кислотой, салициловой кислотой, стеариновой кислотой, янтарной кислотой, сульфаниловой кислотой, винной кислотой, п-толуолсульфоновой кислотой, ундекановой кислотой и т.п.

Термин фармацевтически приемлемая соль присоединения основания, используемый в данном документе, подразумевается как обозначающий такие соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных кислот и которые не являются нежелательными с биологической точки зрения или в других отношениях, образованных с неорганическими основаниями, в том числе без ограничения с аммиаком или гидроксидом, карбонатом или бикарбонатом аммония или катионом металла, такого как натрий, калий, литий, кальций, магний, железо, цинк, медь, марганец, алюминий и т.п. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают в себя без ограничения соли первичных, вторичных и третичных аминов, четвертичные аммониевые соединения, замещенные амины, в том числе встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины и основные ионообменные смолы, такие как метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, диэтиламин, триэтиламин, изопропиламин, трипропиламин, трибутиламин, этаноламин, диэтаноламин, 2диметиламиноэтанол, 2-диэтиламиноэтанол, дициклогексиламин, лизин, аргинин, гистидин, кофеин, гидрабамин, холин, бетаин, этилендиамин, глюкозамин, метилглюкамин, теобромин, пурины, пиперазин, пиперидин, N-этилпиперидин, соединения тетраметиламмония, соединения тетраэтиламмония, пиридин, N,N-диметиланилин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, дициклогексиламин, дибензиламин, N,Nдибензилфенэтиламин, 1-эфенамин, N,N'-дибензилэтилендиамин, полиаминные смолы и т.п.

Подробное описание

В настоящем изобретении предусмотрен способ лечения болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом, при этом способ включает введение пациенту миглустата или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации с рекомбинантной кислой α-глюкозидазой человека, где рекомбинантная кислая аглюкозидаза человека экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (CHO) и имеет увеличенное содержание N-гликановых звеньев, несущих один или два остатка маннозо-6-фосфата, в сравнении с содержанием N-гликановых звеньев, несущих один или два остатка маннозо-6-фосфата, в аглюкозидазе-альфа. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая аглюкозидаза человека имеет низкие уровни содержания комплексных гликанов с концевой галактозой. В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение миглустата и рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека в комбинации для лечения болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом.

По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят перорально. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в пероральной дозе, составляющей от приблизительно 200 мг до приблизительно 600 мг, или в пероральной дозе, составляющей приблизительно 200 мг, приблизительно 250 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 350 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 450 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 550 мг или приблизительно 600 мг. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в пероральной дозе, составляющей от приблизительно 233 мг до приблизительно 400 мг. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в пероральной дозе, составляющей от приблизительно 250 до приблизительно 270 мг, или в пероральной дозе, составляющей приблизительно 250 мг, приблизительно 255 мг, приблизительно 260 мг, приблизительно 265 мг или приблизительно 270 мг. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в пероральной дозе, составляющей приблизительно 260 мг.

Специалистам в данной области будет понятно, что пероральная доза миглустата, находящаяся в диапазоне от приблизительно 200 мг до 600 мг или в любом меньшем диапазоне в его пределах, может являться подходящей для взрослого пациента со средним весом тела, составляющим приблизительно 70 кг. Для пациентов, имеющих значительно более низкий вес тела, чем приблизительно 70 кг, в том числе

- 10 043083 без ограничения младенцев, детей или взрослых с недостаточным весом, лечащий врач может считать подходящей меньшую дозу. Следовательно, по меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в виде пероральной дозы, составляющей от приблизительно 50 мг до приблизительно 200 мг, или в виде пероральной дозы, составляющей приблизительно 50 мг, приблизительно 75 мг, приблизительно 100 мг, 125 мг, приблизительно 150 мг, приблизительно 175 мг или приблизительно 200 мг. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в виде пероральной дозы, составляющей от приблизительно 65 мг до приблизительно 195 мг, или в виде пероральной дозы, составляющей приблизительно 65 мг, приблизительно 130 мг или приблизительно 195 мг.

По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в виде фармацевтически приемлемой лекарственной формы, подходящей для перорального введения, которая включает без ограничения таблетки, капсулы, вагинальные суппозитории, настойки, растворы или суспензии, гели, сиропы, жидкости для полоскания рта или сухой порошок для разведения водой или другой подходящей инертной средой перед применением, необязательно с ароматизирующими и красящими средствами для путей применения с немедленным, отсроченным, модифицированным, замедленным, прерывистым или регулируемым высвобождением. Также можно применять твердые композиции, такие как таблетки, капсулы, леденцы, пастилки, пилюли, болюсы, порошки, пасты, гранулы, суппозитории, драже или препараты в виде предварительно приготовленных смесей. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в виде таблетки. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в виде капсулы. По меньшей мере в одном варианте осуществления лекарственная форма содержит от приблизительно 50 мг до приблизительно 300 мг миглустата. По меньшей мере в одном варианте осуществления лекарственная форма содержит приблизительно 65 мг миглустата. По меньшей мере в одном варианте осуществления лекарственная форма содержит приблизительно 130 мг миглустата. По меньшей мере в одном варианте осуществления лекарственная форма содержит приблизительно 260 мг миглустата. Предполагается, что если лекарственная форма содержит приблизительно 65 мг миглустата, то миглустат можно вводить в виде дозировки из четырех лекарственных форм или в общей дозе 260 мг миглустата. Однако для пациентов, которые имеют значительно более низкий вес, чем средний вес взрослого, составляющий 70 кг, в том числе без ограничения младенцев, детей или взрослых с недостаточным весом, миглустат можно вводить в виде дозировки из одной лекарственной формы (в общей дозе 65 мг миглустата), двух лекарственных форм (в общей дозе 130 мг миглустата) или трех лекарственных форм (в общей дозе 195 мг миглустата).

Твердые и жидкие композиции для перорального применения можно получить в соответствии со способами, хорошо известными из уровня техники. Такие композиции могут также содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и наполнителей, которые могут иметь твердую или жидкую форму. Таблетки и капсулы можно получить посредством традиционных способов с использованием фармацевтически приемлемых наполнителей, в том числе без ограничения связующих средств, заполнителей, смазывающих веществ, разрыхлителей или смачивающих средств. Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители известны из уровня техники и включают без ограничения прежелатинизированный крахмал, поливинилпирролидон, повидон, гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC), гидроксипропилэтилцеллюлозу (HPEC), гидроксипропилцеллюлозу (HPC), сахарозу, желатин, гуммиарабик, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, гидрофосфат кальция, стеарат магния, стеариновую кислоту, глицерилбегенат, тальк, диоксид кремния, кукурузный, картофельный или маниоковый крахмал, крахмалгликолят натрия, лаурилсульфат натрия, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция, глицин, кроскармеллозу натрия и комплексные силикаты. Таблетки можно покрывать посредством способов, хорошо известных из уровня техники. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в виде состава, коммерчески доступного как Zavesca® (Actelion Pharmaceuticals).

По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (CHO) и имеет увеличенное содержание Nгликановых звеньев, несущих один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, в сравнении с содержанием N-гликановых звеньев, несущих один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, в алглюкозидазеальфа. По меньшей мере в одном варианте осуществления кислая α-глюкозидаза представляет собой рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, упоминаемую в данном документе как ATB200, как описано в международной патентной заявке PCT/US2015/053252, одновременно находящейся на рассмотрении патентного ведомства. Как было показано, ATB200 связывается с катион-независимыми рецепторами маннозо-6-фосфата (CIMPR) с высокой аффинностью (KD ~ 2-4 нМ) и эффективно интернализируется фибробластами при болезни Помпе и миобластами скелетных мышц (K_nоглOщ_ен_uе ~ 7-14 нМ). Для ATB200 были получены характеристики in vivo и было показано, что она характеризуется более коротким кажущимся периодом полувыведения из плазмы крови (t_1/2 ~ 45 мин), чем алглюкозидаза-альфа (t_1/2 ~ 60 мин).

По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека представляет собой фермент, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 (или кодируемую SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.

- 11 043083

SEQ ID NO: 1 Met Gly Vai Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Vai Cys Ala Leu Vai Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His He Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Vai Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Vai Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gin Gin Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gin Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Vai Pro Thr Gin Cys Asp Vai Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala He Thr Gin Glu Gin Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr He Pro Ala Lys Gin Gly Leu Gin Gly Ala Gin Met Gly Gin Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp He Leu Thr Leu Arg Leu Asp Vai Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr He Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Vai Pro Leu Glu Thr Pro Arg Vai His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Vai Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Vai He Vai His Arg Gin Leu Asp Gly Arg Vai Leu Leu Asn Thr Thr Vai Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gin Phe Leu Gin Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gin Tyr He Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg lie Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Vai Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Vai Vai Leu Gin Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly He Leu Asp Vai Tyr He Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Vai Vai Gin Gin Tyr Leu Asp Vai Vai Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala He Thr Arg Gin Vai Vai Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Vai Gin Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Vai Gin Glu Leu His Gin Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met He Vai Asp Pro Ala He Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Vai Phe He Thr Asn Glu Thr Gly Gin Pro Leu He Gly Lys Vai Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Vai Ala Glu Phe His Asp Gin Vai Pro Phe Asp Gly Met Trp He Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe He Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Vai Pro Gly Vai Vai Gly Gly Thr Leu Gin Ala Ala Thr He Cys Ala Ser Ser His Gin Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala He Ala Ser His Arg Ala Leu Vai Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Vai He Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Vai Trp Ser Ser Trp Glu Gin Leu Ala Ser Ser Vai Pro Glu He Leu Gin Phe Asn Leu Leu Gly Vai Pro Leu Vai Gly Ala Asp Vai Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Vai Arg Trp Thr Gin Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gin Glu Pro Tyr Ser

- 12 043083

Phe Ser Glu Pro Ala Gin Gin Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gin Ala His Vai Ala Gly Glu Thr Vai Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Vai Asp His Gin Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu He Thr Pro Vai Leu Gin Ala Gly Lys Ala Glu Vai Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gin Thr Vai Pro He Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala He His Ser Glu Gly Gin Trp Vai Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr He Asn Vai His Leu Arg Ala Gly Tyr He He Pro Leu Gin Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gin Gin Pro Met Ala Leu Ala Vai Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Vai Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gin Vai He Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr He Vai Asn Glu Leu Vai Arg Vai Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gin Leu Gin Lys Vai Thr Vai Leu Gly Vai Ala Thr Ala Pro Gin Gin Vai Leu Ser Asn Gly Vai Pro Vai Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Vai Leu Asp He Cys Vai Ser Leu Leu Met Gly Glu Gin Phe Leu Vai Ser Trp Cys

SEQ ID NO: 2 cagttgggaaagctgaggttgtcgccggggccgcgggtggaggtcggggatgaggcagcagg taggacagtgacctcggtgacgcgaaggaccccggccacctctaggttctcctcgtccgcccgtt gttcagcgagggaggctctgggcctgccgcagctgacggggaaactgaggcacggagcgggc ctgtaggagctgtccaggccatctccaaccatgggagtgaggcacccgccctgctcccaccggc tcctggccgtctgcgccctcgtgtccttggcaaccgctgcactcctggggcacatcctactccatg atttcctgctggttccccgagagctgagtggctcctccccagtcctggaggagactcacccagctc accagcagggagccagcagaccagggccccgggatgcccaggcacaccccggccgtcccag agcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggcc atcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcag ggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggaga acctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttcccca aggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatc aaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggca

- 13 043083 ccgtccccactctacagcgtggagttctccgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagct ggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagc tgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctca gcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacc tctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctg ctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacag gtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctg gacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctgggg ctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctgg acgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatgg cttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatc gtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctg cggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccggg tccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctga gttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcag aggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggtt ggggggaccctccaggcggccaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaa cctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgg gggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactg gacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagttta acctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagagga gctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgc tcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccc tcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacactgttccaccaggcccacgtcgcgggg gagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggacca ccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagt gactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggca gcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtga cgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgca gggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgac caagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctgg

- 14 043083 agcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggta cgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacg gcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaa ggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagccgggc ggagtgtgttagtctctccagagggaggctggttccccagggaagcagagcctgtgtgcgggca gcagctgtgtgcgggcctgggggttgcatgtgtcacctggagctgggcactaaccattccaagcc gccgcatcgcttgtttccacctcctgggccggggctctggcccccaacgtgtctaggagagctttc tccctagatcgcactgtgggccggggcctggagggctgctctgtgttaataagattgtaaggtttgc cctcctcacctgttgccggcatgcgggtagtattagccacccccctccatctgttcccagcaccgg agaagggggtgctcaggtggaggtgtggggtatgcacctgagctcctgcttcgcgcctgctgctc tgccccaacgcgaccgcttcccggctgcccagagggctggatgcctgccggtccccgagcaag cctgggaactcaggaaaattcacaggacttgggagattctaaatcttaagtgcaattattttaataaa aggggcatttggaatc

SEQ ID NO: 3 Met Gly Vai Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Vai Cys Ala Leu Vai Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His He Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Vai Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Vai Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gin Gin Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gin Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Vai Pro Thr Gin Cys Asp Vai Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala He Thr Gin Glu Gin Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr He Pro Ala Lys Gin Gly Leu Gin Gly Ala Gin Met Gly Gin Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp He Leu Thr Leu Arg Leu Asp Vai Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr He Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Vai Pro Leu Glu Thr Pro Arg Vai His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Vai Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Vai He Vai His Arg Gin Leu Asp Gly Arg Vai Leu Leu Asn Thr Thr Vai Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gin Phe Leu Gin Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gin Tyr He Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

- 15 043083

Trp Thr Arg He Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gin Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly He Leu Asp Val Tyr He Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gin Gin Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala He Thr Arg Gin Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gin Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gin Glu Leu His Gin Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met He Val Asp Pro Ala He Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe He Thr Asn Glu Thr Gly Gin Pro Leu He Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gin Val Pro Phe Asp Gly Met Trp He Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe He Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gin Ala Ala Thr He Cys Ala Ser Ser His Gin Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala He Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val He Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gin Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu He Leu Gin Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gin Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gin Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gin Gin Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gin Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gin Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu He Thr Pro Val Leu Gin Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr

- 16 043083

Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gin Thr Vai Pro He Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala He His Ser Glu Gly Gin Trp Vai Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr He Asn Vai His Leu Arg Ala Gly Tyr He He Pro Leu Gin Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gin Gin Pro Met Ala Leu Ala Vai Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Vai Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gin Vai He Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr He Vai Asn Glu Leu Vai Arg Vai Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gin Leu Gin Lys Vai Thr Vai Leu Gly Vai Ala Thr Ala Pro Gin Gin Vai Leu Ser Asn Gly Vai Pro Vai Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Vai Leu Asp He Cys Vai Ser Leu Leu Met Gly Glu Gin Phe Leu Vai Ser Trp Cys

Met Gly Vai Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Vai Cys Ala Leu Vai Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His He Leu Leu SEQ ID NO: 4

His Asp Phe Leu Leu Vai Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Vai Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gin Gin Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gin Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Vai Pro Thr Gin Cys Asp Vai Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala He Thr Gin Glu Gin Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr He Pro Ala Lys Gin Gly Leu Gin Gly Ala Gin Met Gly Gin Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp He Leu Thr Leu Arg Leu Asp Vai Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr He Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Vai Pro Leu Glu Thr Pro His Vai His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Vai Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Vai He Vai Arg Arg Gin Leu Asp Gly Arg Vai Leu Leu Asn Thr Thr Vai Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gin Phe Leu Gin Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gin Tyr He Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg He Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

- 17 043083

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Vai Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Vai Vai Leu Gin Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly He Leu Asp Vai Tyr He Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Vai Vai Gin Gin Tyr Leu Asp Vai Vai Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala He Thr Arg Gin Vai Vai Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Vai Gin Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Vai Gin Glu Leu His Gin Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met He Vai Asp Pro Ala He Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Vai Phe He Thr Asn Glu Thr Gly Gin Pro Leu He Gly Lys Vai Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Vai Ala Glu Phe His Asp Gin Vai Pro Phe Asp Gly Met Trp He Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe He Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Vai Pro Gly Vai Vai Gly Gly Thr Leu Gin Ala Ala Thr He Cys Ala Ser Ser His Gin Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala He Ala Ser His Arg Ala Leu Vai Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Vai He Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Vai Trp Ser Ser Trp Glu Gin Leu Ala Ser Ser Vai Pro Glu He Leu Gin Phe Asn Leu Leu Gly Vai Pro Leu Vai Gly Ala Asp Vai Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Vai Arg Trp Thr Gin Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gin Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gin Gin Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gin Ala His Vai Ala Gly Glu Thr Vai Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Vai Asp His Gin Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu He Thr Pro Vai Leu Gin Ala Gly Lys Ala Glu Vai Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gin Thr Vai Pro Vai Glu Ala

- 18 043083

Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala He His Ser Glu Gly Gin Trp Vai Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr He Asn Vai His Leu Arg Ala Gly Tyr He He Pro Leu Gin Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gin Gin Pro Met Ala Leu Ala Vai Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Vai Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gin Vai He Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr He Vai Asn Glu Leu Vai Arg Vai Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gin Leu Gin Lys Vai Thr Vai Leu Gly Vai Ala Thr Ala Pro Gin Gin Vai Leu Ser Asn Gly Vai Pro Vai Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Vai Leu Asp He Cys Vai Ser Leu Leu Met Gly Glu Gin Phe Leu Vai Ser Trp Cys

SEQ ID NO: 5 Gin Gin Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gin Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Vai Pro Thr Gin Cys Asp Vai Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala He Thr Gin Glu Gin Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr He Pro Ala Lys Gin Gly Leu Gin Gly Ala Gin Met Gly Gin Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp He Leu Thr Leu Arg Leu Asp Vai Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr He Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Vai Pro Leu Glu Thr Pro Arg Vai His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Vai Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Vai He Vai His Arg Gin Leu Asp Gly Arg Vai Leu Leu Asn Thr Thr Vai Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gin Phe Leu Gin Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gin Tyr He Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg He Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Vai Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Vai Vai Leu Gin Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly He Leu Asp Vai Tyr He Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Vai Vai Gin Gin Tyr Leu Asp Vai Vai Gly Tyr

- 19 043083

Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala He Thr Arg Gin Vai Vai Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Vai Gin Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Vai Gin Glu Leu His Gin Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met He Vai Asp Pro Ala He Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Vai Phe He Thr Asn Glu Thr Gly Gin Pro Leu He Gly Lys Vai Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Vai Ala Glu Phe His Asp Gin Vai Pro Phe Asp Gly Met Trp He Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe He Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Vai Pro Gly Vai Vai Gly Gly Thr Leu Gin Ala Ala Thr He Cys Ala Ser Ser His Gin Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala He Ala Ser His Arg Ala Leu Vai Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Vai He Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Vai Trp Ser Ser Trp Glu Gin Leu Ala Ser Ser Vai Pro Glu He Leu Gin Phe Asn Leu Leu Gly Vai Pro Leu Vai Gly Ala Asp Vai Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Vai Arg Trp Thr Gin Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gin Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gin Gin Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gin Ala His Vai Ala Gly Glu Thr Vai Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Vai Asp His Gin Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu He Thr Pro Vai Leu Gin Ala Gly Lys Ala Glu Vai Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gin Thr Vai Pro He Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala He His Ser Glu Gly Gin Trp Vai Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr He Asn Vai His Leu Arg Ala Gly Tyr He He Pro Leu Gin Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gin Gin Pro Met Ala Leu Ala Vai Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Vai Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gin Vai He Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr He Vai Asn Glu Leu Vai Arg Vai Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gin Leu Gin Lys Vai Thr Vai Leu Gly Vai Ala Thr Ala Pro Gin Gin Vai Leu Ser Asn Gly Vai Pro Vai Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Vai Leu Asp He Cys Vai Ser Leu Leu Met Gly Glu Gin Phe Leu Vai Ser Trp Cys

По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека имеет аминокислотную последовательность GAA дикого типа, приведенную под SEQ ID NO: 1, как описано в патенте США № 8592362, и имеет номер доступа в GenBank AHE24104.1 (GL568760974). По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека имеет аминокислотную последовательность GAA дикого типа, кодируемую SEQ ID NO: 2, последовательность мРНК для которой имеет номер доступа в GenBank Y00839.1. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека имеет аминокислотную последовательность GAA дикого типа, приведенную под SEQ ID NO: 3. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека имеет аминокислотную последовательность GAA, приведенную под SEQ ID NO: 4, и имеет номер доступа в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) NP_000143.2. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека представляет собой глюкозидазу-альфа, фермент кислую α-глюкозидазу человека, кодируемую наиболее преобладающим из девяти наблюдаемых гаплотипов гена GAA.

- 20 043083

По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека изначально экспрессируется как имеющая полноразмерную 952-аминокислотную последовательность GAA дикого типа, приведенную под SEQ ID NO: 1, и рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека подвергается внутриклеточному процессингу, при котором удаляется часть аминокислот, например, первые 56 аминокислот. Соответственно, рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека, секретируемая клеткой-хозяином, может иметь более короткую аминокислотную последовательность, чем рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека, которая изначально экспрессируется в клетке. По меньшей мере в одном варианте осуществления более короткий белок может иметь аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 5, которая отличается от SEQ ID NO: 1 только тем, что первые 56 аминокислот, содержащие сигнальный пептид и пептид-предшественник, были удалены с получением в результате, таким образом, белка, имеющего 896 аминокислот. Также возможны другие различия в количестве аминокислот, такие как наличие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше делеций, замен и/или вставок по сравнению с аминокислотной последовательностью, описанной под SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления продукт на основе rhGAA содержит смесь молекул рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, имеющих разную длину в аминокислотах.

По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека подвергается посттрансляционным и/или химическим модификациям в одном или нескольких аминокислотных остатках белка. Например, метиониновые и триптофановые остатки могут подвергаться окислению. В качестве другого примера, N-концевой глутамин может образовывать пироглутамат. В качестве другого примера, аспарагиновые остатки могут подвергаться дезамидированию до аспарагиновой кислоты. В качестве еще одного другого примера, остатки аспарагиновой кислоты могут подвергаться изомеризации до изоаспарагиновой кислоты. В качестве еще одного другого примера, непарные пистеиновые остатки в белке могут образовывать дисульфидные связи со свободным глутатионом и/или цистеином. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления фермент изначально экспрессируется как имеющий аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 (или кодируемую SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, и фермент подвергается одной или нескольким этим посттрансляционным и/или химическим модификациям. Такие модификации также входят в объем настоящего изобретения.

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие GAA и такие варианты GAA человека, также предусматриваются и могут применяться для рекомбинантной экспрессии rhGAA в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно, чтобы не больше чем у 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5% от общего количества молекул рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека отсутствовало N-гликановое звено, несущее один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, или отсутствовала способность к связыванию с катион-независимым рецептором маннозо-6-фосфата (CIMPR). В качестве альтернативы, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, <100% или больше молекул рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека содержат по меньшей мере одно N-гликановое звено, несущее один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, или обладают способностью к связыванию с CIMPR.

Молекулы рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека могут иметь 1, 2, 3 или 4 группы маннозо-6-фосфата (М6Р) в своих гликанах. Например, только один N-гликан в молекуле рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека может нести М6Р (монофосфорилированный), отдельный N-гликан может нести две группы М6Р (бисфосфорилированный) или каждый из двух разных N-гликанов в одной и той же молекуле рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека может нести отдельные группы М6Р. Молекулы рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека также могут иметь N-гликаны, не несущие группы М6Р. В другом варианте осуществления N-гликаны в среднем содержат более 2,5 моль/моль М6Р и более 4 моль/моль сиаловой кислоты, так что рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека содержит в среднем по меньшей мере 2,5 моля остатков маннозо-6-фосфата на моль рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека и по меньшей мере 4 моля сиаловой кислоты на моль рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. В среднем по меньшей мере приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10% от общего количества гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека могут находиться в виде моно-M6P-гликана, например, приблизительно 6,25% от общего количества гликанов могут нести одну группу М6Р, и в среднем по меньшей мере приблизительно 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% от общего количества гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека находятся в виде бис-M6P-гликана, и в среднем меньше 25% от общего количества молекул рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека не содержат фосфорилированный гликан, связывающийся с CIMPR.

Рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека может иметь значение среднего содержания Nгликанов, несущих М6Р, в диапазоне от 0,5 до 7,0 моль/моль рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека или любое промежуточное значение в поддиапазоне, в том числе 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 или 7,0 моль/моль рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. Рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека можно фракционировать для получения препаратов на основе

- 21 043083 рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека с разным средним количеством гликанов, несущих

М6Р или несущих 6ис-М6Р, что, таким образом, позволяет осуществлять дополнительную индивидуальную адаптацию рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, нацеливающейся на лизосомы в целевых тканях, посредством осуществления отбора конкретной фракции или посредством избирательного объединения различных фракций.

До 60% N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека могут быть полностью сиалированными, например, до 10, 20, 30, 40, 50 или 60% N-гликанов могут быть полностью сиалированными. В некоторых вариантах осуществления от 4 до 20% от общего количества N-гликанов являются полностью сиалированными. В других вариантах осуществления не больше 5, 10, 20 или 30% N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе несут сиаловую кислоту и концевой остаток галактозы (Gal).

Данный диапазон включает все промежуточные значения и поддиапазоны, например, от 7 до 30% от общего количества N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека могут нести сиаловую кислоту и концевую галактозу. В еще нескольких других вариантах осуществления не больше 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека имеют только концевую галактозу и не содержат сиаловую кислоту. Данный диапазон включает все промежуточные значения и поддиапазоны, например, от 8 до 19% от общего количества N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека в композиции могут иметь только концевую галактозу и не содержат сиаловую кислоту.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения 40, 45, 50, 55-60% от общего количества N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека представляют собой N-гликаны комплексного типа; или не больше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% от общего количества N-гликанов в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека представляют собой N-гликаны гибридного типа; не больше 5, 10 или 15% N-гликанов высокоманнозного типа в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека являются нефосфорилированными; по меньшей мере 5 или 10% N-гликанов высокоманнозного типа в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека являются моно-M6P-фосфорилированными; и/или по меньшей мере 1 или 2% N-гликанов высокоманнозного типа в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека являются бис-M6P-фосфорилированными. Эти значения включают все промежуточные значения и поддиапазоны. Рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека может соответствовать одному или нескольким диапазонам содержания, описанным выше.

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека будет нести в среднем от 2,0 до 8,0 моля остатков сиаловой кислоты на моль рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. Данный диапазон включает все промежуточные значения и поддиапазоны, в том числе 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0 моль остатков/моль рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что присутствие N-гликановых звеньев, несущих остатки сиаловой кислоты, может предотвратить непродуктивное очищение от рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека посредством асиалогликопротеиновых рецепторов.

В одном или нескольких вариантах осуществления rhGAA имеет звенья М6Р и/или сиаловой кислоты в определенных сайтах N-гликозилирования рекомбинантного лизосомного белка человека. Например, существует семь потенциальных сайтов N-связанного гликозилирования в rhGAA. Эти потенциальные сайты гликозилирования находятся в следующих положениях SEQ ID NO: 5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 и N869. Подобным образом, для полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 эти потенциальные сайты гликозилирования находятся в следующих положениях: N140, N233, N390, N470, N652, N882 и N925. Другие варианты rhGAA могут иметь аналогичные сайты гликозилирования в зависимости от местоположения аспарагиновых остатков. Обычно последовательности ASN-XSER или ASN-X-THR в аминокислотной последовательности белка указывают на потенциальные сайты гликозилирования, за исключением того, что X не может представлять собой HIS или PRO.

В различных вариантах осуществления rhGAA имеет определенный профиль N-гликозилирования. В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 20% rhGAA являются фосфорилированными в первом сайте N-гликозилирования (например, N84 в SEQ ID NO: 5 и N140 в SEQ ID NO: 1). Например, по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA могут быть фосфорилированными в первом сайте N-гликозилирования. Данное фосфорилирование может быть обусловлено наличием звеньев моно-М6Р и/или 6ис-М6Р. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA несут звено моно-М6Р в первом сайте N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA несут звено 6ис-М6Р в первом сайте N-гликозилирования.

В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 20% rhGAA являются фосфорилированными во втором сайте N-гликозилирования (например, N177 в SEQ ID NO: 5 и N223 в SEQ ID NO: 1). Например, по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA могут быть фосфорилированными во втором сайте N-гликозилирования. Данное фосфорилирование может быть обусловлено наличием звеньев моно-М6Р и/или 6ис-М6Р. В некоторых вариантах осуществле- 22 043083 ния по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA несут звено моно-М6Р во втором сайте N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 6θ, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA несут звено бисM6P во втором сайте N-гликозилирования. В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 5% rhGAA являются фосфорилированными в третьем сайте N-гликозилирования (например, N334 в SEQ ID NO: 5 и N390 в SEQ ID NO: 1). В других вариантах осуществления меньше 5, 10, 15, 20 или 25% rhGAA являются фосфорилированными в третьем сайте N-гликозилирования. Например, третий сайт N-гликозилирования может иметь комбинацию нефосфорилированных высокоманнозных гликанов, двух-, трех- и четырехантенных комплексных гликанов и гибридных гликанов в качестве основных форм. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45% или 50% rhGAA являются сиалированными в третьем сайте N-гликозилирования.

В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 20% rhGAA являются фосфорилированными в четвертом сайте N-гликозилирования (например, N414 в SEQ ID NO: 5 и N470 в SEQ ID NO: 1). Например, по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA могут быть фосфорилированными в четвертом сайте N-гликозилирования. Данное фосфорилирование может быть обусловлено наличием звеньев моно-М6Р и/или 6ис-М6Р. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA несут звено моно-М6Р в четвертом сайте N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA несут звено 6ис-М6Р в четвертом сайте N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 3, 5, 8, 10, 15, 20% или 25% rhGAA являются сиалированными в четвертом сайте Nгликозилирования.

В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 5% rhGAA являются фосфорилированными в пятом сайте N-гликозилирования (например, N596 в SEQ ID NO: 5 и N692 в SEQ ID NO: 1). В других вариантах осуществления меньше 5, 10, 15, 20% или 25% rhGAA являются фосфорилированными в пятом сайте N-гликозилирования. Например, пятый сайт N-гликозилирования может иметь фукозилированные двухантенные комплексные гликаны в качестве основных форм. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 6θ, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA являются сиалированными в пятом сайте N-гликозилирования.

В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 5% rhGAA являются фосфорилированными в шестом сайте N-гликозилирования (например, N826 в SEQ ID NO: 5 и N882 в SEQ ID NO: 1). В других вариантах осуществления меньше 5, 10, 15, 20 или 25% rhGAA являются фосфорилированными в шестом сайте N-гликозилирования. Например, шестой сайт N-гликозилирования может иметь комбинацию двух-, трех- и четырехантенных комплексных гликанов в качестве основных форм. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 3, 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% rhGAA являются сиалированными в шестом сайте N-гликозилирования.

В одном или нескольких вариантах осуществления по меньшей мере 5% rhGAA являются фосфорилированными в седьмом сайте N-гликозилирования (например, N869 в SEQ ID NO: 5 и N925 в SEQ ID NO: 1). В других вариантах осуществления меньше 5, 10, 15, 20 или 25% rhGAA являются фосфорилированными в седьмом сайте N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления меньше 40, 45, 50, 55, 60 или 65% rhGAA имеют какой-либо гликан в седьмом сайте N-гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 30, 35 или 40% rhGAA имеют гликан в седьмом сайте Nгликозилирования.

Рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека предпочтительно вырабатывается клетками яичника китайского хомячка (CHO), такими как линии клеток CHO GA-ATB-200 или ATB-2OO-OO1-X5-14, или субкультурой или производной такой культуры клеток CHO. ДНК-конструкции, которые экспрессируют аллельные варианты кислой α-глюкозидазы или аминокислотные последовательности других вариантов кислой α-глюкозидазы, как, например, по меньшей мере на 90, 95, 98 или 99% идентичные SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5, можно сконструировать и экспрессировать в клетках CHO. Эти аминокислотные последовательности вариантов кислой α-глюкозидазы могут содержать делеции, замены и/или вставки по сравнению с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5, как, например, иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше делеций, замен и/или вставок по сравнению с аминокислотной последовательностью, описанной под SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5. Специалисты в данной области могут выбрать альтернативные векторы, подходящие для трансформации клеток CHO для получения таких ДНК-конструкций.

Для расчета идентичности между двумя последовательностями можно применять различные алгоритмы и/или программы для выравнивания, в том числе FASTA или BLAST, которые доступны как часть программного пакета для анализа последовательностей GCG (Висконсинский университет, Мэдисон, Висконсин), и их можно применять, например, с настройками по умолчанию.

Например, предусмотрены полипептиды, по меньшей мере на 90, 95, 98 или 99% идентичные конкретным полипептидам, описанным в данном документе, и предпочтительно проявляющие по существу те же функции, а также полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды. Если не указано иное, расчет

- 23 043083 показателя сходства будет основываться на применении BLOSUM62. При применении BLASTP процентное значение сходства основывается на показателе Положительные в BLASTP, а процентное значение идентичности последовательностей основывается на показателе Идентичные в BLASTP. Идентичные в BLASTP демонстрируют число остатков в парах последовательностей с высоким показателем сходства, которые являются идентичными, и их долю от общего количества остатков; а Положительные в BLASTP демонстрируют число и долю остатков, для которых показатели выравнивания имеют положительные значения и которые являются сходными друг с другом. В настоящем изобретении предусмотрены и охватываются аминокислотные последовательности, характеризующиеся этими степенями идентичности или сходства или любой промежуточной степенью идентичности или сходства с аминокислотными последовательностями, раскрытыми в данном документе. Полинуклеотидные последовательности сходных полипептидов выводятся с помощью генетического кода и могут быть получены с помощью традиционных способов, в частности, посредством восстановления по их аминокислотным последовательностям с помощью генетического кода.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, имеющую исключительную способность к нацеливанию на катион-независимые рецепторы маннозо6-фосфата (CIMPR) и клеточные лизосомы, а также паттерны гликозилирования, снижающие непродуктивное очищение от нее in vivo, можно получать с применением клеток яичника китайского хомячка (CHO). В этих клетках можно индуцировать экспрессию рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека со значительно более высокими уровнями содержания N-гликановых звеньев, несущих один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, чем в традиционных продуктах на основе рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, таких как алглюкозидаза-альфа. Рекомбинантная кислая α-глюкозидаза человека, вырабатываемая этими клетками, примером которой является ATB200, имеет значительно большее содержание нацеливающихся на мышечные клетки маннозо-6-фосфатных (моно-М6Р) и бис-маннозо-6фосфатных (6ис-М6Р) N-гликановых остатков, чем традиционная кислая α-глюкозидаза, такая как Lumizyme®. He ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что данное обширное гликозилирование позволяет ферменту ATB200 более эффективно поглощаться целевыми клетками, и следовательно, подвергаться более эффективному очищению из кровотока, чем другим рекомбинантным кислым αглюкозидазам человека, таким как, например, алглюкозидаза-альфа, которая имеет намного более низкое содержание М6Р и 6ис-М6Р. Было показано, что ATB200 эффективно связывается с CIMPR и эффективно поглощается скелетными мышцами и сердечной мышцей и имеет паттерн гликозилирования, который обеспечивает благоприятный фармакокинетический профиль и снижает непродуктивное очищение in vivo.

Также предусматривается, что уникальное гликозилирование ATB200 может способствовать снижению иммуногенности ATB200 в сравнении с, например, алглюкозидазой-альфа. Как признают специалисты в данной области, гликозилирование белков консервативными сахарами млекопитающих обычно улучшает растворимость продукта и ослабляет агрегацию и иммуногенность продукта. Гликозилирование косвенно изменяет иммуногенность белка посредством минимизации агрегации белка, а также посредством экранирования иммуногенных эпитопов белка от воздействия иммунной системы (Guidance for Industry - Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products, Министерство здравоохранения и социальных служб США, Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств, Центр по оценке и исследованию лекарственных средств, Центр по оценке и исследованию биологических препаратов, август 2014 года). Следовательно, по меньшей мере в одном варианте осуществления введение рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека не индуцирует выработку антител к лекарственному средству. По меньшей мере в одном варианте осуществления введение рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека индуцирует выработку антител к лекарственному средству у субъекта с меньшей частотой возникновения, чем при уровне антител к лекарственному средству, выработка которых индуцируется посредством введения алглюкозидазы-альфа.

Как описано в международной патентной заявке PCT/US2015/053252, одновременно находящейся на рассмотрении патентного ведомства, такие клетки, как клетки CHO, можно применять для получения rhGAA, описанной в данном документе, и данную rhGAA можно применять в настоящем изобретении. Примерами таких линий клеток CHO являются GA-ATB-200 или ATB-200-001-X5-14 или их субкультура, которая вырабатывает композицию на основе rhGAA, описанную в данном документе. Такие линии клеток CHO могут содержать несколько копий гена, как, например, 5, 10, 15 или 20 или больше копий полинуклеотида, кодирующего GAA.

rhGAA с высоким содержанием М6Р и 6ис-М6Р, такую как rhGAA ATB200, можно получать путем трансформации клеток CHO с помощью ДНК-конструкции, которая кодирует GAA. Хотя клетки CHO ранее применяли для получения rhGAA, не было признано, что трансформированные клетки CHO можно культивировать и отбирать таким образом, чтобы вырабатывалась rhGAA, имеющая высокое содержание М6Р- и бис-M6P-гликанов, которые нацеливаются на CIMPR.

Неожиданно было обнаружено, что возможно трансформировать линии клеток CHO, отбирать трансформантов, которые вырабатывают rhGAA, имеющую высокое содержание гликанов, несущих М6Р

- 24 043083 или бис-М6Р, которые нацеливаются на CIMPR, и стабильно экспрессировать эту rhGAA с высоким содержанием М6Р. Таким образом, способы получения этих линий клеток CHO также описаны в международной патентной заявке PCT/US2015/053252, одновременно находящейся на рассмотрении патентного ведомства. Данный способ включает трансформацию клетки CHO с помощью ДНК, кодирующей GAA или вариант GAA, отбор клетки CHO, в хромосому(хромосомы) которой стабильно интегрируется ДНК, кодирующая GAA, и которая стабильно экспрессирует GAA, и отбор клетки CHO, которая экспрессирует GAA, имеющую высокое содержание гликанов, несущих М6Р или 6ис-М6Р, и необязательно отбор клетки CHO, имеющей N-гликаны с высоким содержанием сиаловой кислоты и/или имеющей низкое содержание нефосфорилированных высокоманнозных N-гликанов. По меньшей мере в одном варианте осуществления GAA имеет низкие уровни содержания комплексных гликанов с концевой галактозой.

Эти линии клеток CHO можно применять для получения rhGAA и композиций на основе rhGAA посредством культивирования линий клеток CHO и извлечения указанной композиции из культуры клеток CHO.

Рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека или ее фармацевтически приемлемую соль можно составить в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, приспособленной для введения людям. Например, в предпочтительном варианте осуществления композиция для внутривенного введения представляет собой раствор в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты поставляют по отдельности либо смешанными друг с другом в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного средства. Если композиция предназначена для введения посредством инфузии, ее можно вносить в инфузионную бутыль, содержащую стерильную фармацевтически чистую воду, солевой раствор или смесь декстроза/вода. При введении композиции посредством инъекции может предусматриваться ампула со стерильной водой для инъекции или с солевым раствором для того, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.

Рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека (или композицию или лекарственный препарат, содержащие рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека) вводят подходящим путем. В одном варианте осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят внутривенно. В других вариантах осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят путем прямого введения в целевую ткань, такую как сердечная или скелетная мышца (например, внутримышечно), или в нервную систему (например, путем прямой инъекции в мозг; интравентрикулярно; интратекально). В случае необходимости можно одновременно применять больше одного пути.

Рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека (или композицию или лекарственный препарат, содержащие рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека) вводят в терапевтически эффективном количестве (например, при величине дозы, которая при введении с равными интервалами является достаточной для лечения заболевания, как, например, путем уменьшения интенсивности симптомов, ассоциированных с заболеванием, предупреждения или задержки начала проявления заболевания и/или уменьшения тяжести или частоты возникновения симптомов заболевания). Количество, которое будет терапевтически эффективным при лечении заболевания, будет зависеть от природы и степени выраженности эффектов заболевания и может быть определено с помощью стандартных клинических методик. Кроме того, для содействия в определении оптимальных диапазонов дозы можно необязательно использовать анализы in vitro или in vivo. Точная доза, подлежащая использованию, также будет зависеть от пути введения и тяжести заболевания и должна быть определена в соответствии с заключением врача и состоянием каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости доза-ответ, полученных с помощью тестовых систем in vitro или в животных моделях. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят путем внутривенной инфузии в дозе, составляющей от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, обычно от приблизительно 5 мг/кг до приблизительно 20 мг/кг. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят путем внутривенной инфузии в дозе, составляющей приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг или приблизительно 20 мг/кг. По меньшей мере в одном варианте осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят путем внутривенной инфузии в дозе, составляющей приблизительно 20 мг/кг. Эффективная доза для конкретного индивидуума может варьироваться (например, увеличиваться или уменьшаться) с течением времени в зависимости от потребностей индивидуума. Например, количество можно увеличивать во время соматического заболевания или стресса, или в случае появления или увеличения количества антител к кислой α-глюкозидазе, или при ухудшении симптомов заболевания.

Терапевтически эффективное количество рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека (или композиции или лекарственного препарата, содержащих рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека) вводят с равными интервалами в зависимости от природы и степени выраженности эффектов заболевания и на постоянной основе. Введение с равными интервалами, как используется в данном доку

- 25 043083 менте, указывает на то, что терапевтически эффективное количество вводят периодически (в отличие от разовой дозы). Интервал можно определять с помощью стандартных клинических методик. В предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят ежемесячно, два раза в месяц; один раз в неделю; два раза в неделю или ежедневно. Интервал введения для потребности отдельного индивидуума не обязательно должен быть фиксированным интервалом и может варьироваться с течением времени в зависимости от потребностей индивидуума. Например, интервал между дозами можно уменьшать во время соматического заболевания или стресса, или в случае появления или увеличения количества антител к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека, или при ухудшении симптомов заболевания. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество, составляющее 5, 10, 20, 50, 100 или 200 мг фермента/кг веса тела, вводят два раза в неделю, один раз в неделю или один раз в две недели с шапероном или без шаперона.

Рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека по настоящему изобретению можно получать для более позднего применения, как, например, во флаконе или в шприце с однократной дозой или в бутыли или пакете для внутривенного введения. Наборы, содержащие рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, а также необязательно наполнители или другие активные ингредиенты, такие как шапероны или другие лекарственные средства, можно вкладывать в упаковочный материал и снабжать инструкциями по разведению, разбавлению или введению доз для лечения субъекта, нуждающегося в лечении, такого как пациент с болезнью Помпе.

По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат и рекомбинантную кислую αглюкозидазу человека вводят одновременно. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат и рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека вводят последовательно. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят менее чем за 3 ч до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за приблизительно 2 ч до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят менее чем за 2 ч до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за приблизительно 1,5 ч до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за приблизительно один час до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за от приблизительно 50 мин до приблизительно 70 мин до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за от приблизительно 55 мин до приблизительно 65 мин до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за приблизительно 30 мин до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за от приблизительно 25 мин до приблизительно 35 мин до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят за от приблизительно 27 мин до приблизительно 33 мин до введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека.

По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят одновременно с введением рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в течение периода 20 мин до или после введения рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в течение периода 15 мин до или после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в течение периода 10 мин до или после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в течение периода 5 мин до или после введения рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека.

По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят в течение периода до 2 ч после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят через приблизительно 30 мин после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят через приблизительно один час после введения рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят через приблизительно 1,5 ч после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. По меньшей мере в одном варианте осуществления миглустат вводят через приблизительно 2 ч после введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека.

В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен набор для комбинированной терапии болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом. Набор содержит фармацевтически приемлемую лекарст

- 26 043083 венную форму, содержащую миглустат, фармацевтически приемлемую лекарственную форму, содержащую рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, определенную в данном документе, и инструкции по введению фармацевтически приемлемой лекарственной формы, содержащей миглустат, и фармацевтически приемлемой лекарственной формы, содержащей рекомбинантную кислую α-глюкозидазу, пациенту, нуждающемуся в этом. По меньшей мере в одном варианте осуществления фармацевтически приемлемая лекарственная форма, содержащая миглустат, представляет собой лекарственную форму для перорального применения, описанную в данном документе, в том числе без ограничения таблетку или капсулу. По меньшей мере в одном варианте осуществления фармацевтически приемлемая лекарственная форма, содержащая рекомбинантную кислую α-глюкозидазу человека, представляет собой стерильный раствор, подходящий для инъекций, описанный в данном документе. По меньшей мере в одном варианте осуществления инструкции по введению лекарственных форм включают инструкции по введению фармацевтически приемлемой лекарственной формы, содержащей миглустат, перорально до введения фармацевтически приемлемой лекарственной формы, содержащей рекомбинантную кислую αглюкозидазу человека, посредством внутривенной инфузии, как описано в данном документе.

Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что миглустат действует в качестве фармакологического шаперона для рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека ATB200 и связывается с ее активным сайтом. Таким образом, как видно на фиг. 1, было обнаружено, что миглустат снижает процентную долю развернутого белка ATB200 и стабилизирует активную конформацию ATB200, предотвращая его денатурацию и необратимую инактивацию при нейтральном pH плазмы крови и позволяя ему выдерживать условия в кровотоке достаточно долго, чтобы достичь тканей и быть ими поглощенным. Однако связывание миглустата с активным сайтом ATB200 также может приводить к ингибированию ферментативной активности ATB200 посредством препятствования доступу естественного субстрата гликогена к активному сайту. Полагают, что в случаях, когда миглустат и рекомбинантную кислую αглюкозидазу человека вводят пациенту в условиях, описанных в данном документе, концентрации миглустата и ATB200 в плазме крови и тканях являются такими, что ATB200 стабилизируется до тех пор, пока она не сможет быть поглощена тканями и нацелиться на лизосомы, но вследствие быстрого очищения от миглустата гидролиз гликогена с помощью ATB200 в лизосомах чрезмерно не ингибируется присутствием миглустата, и фермент сохраняет достаточную активность для того, чтобы быть терапевтически применимым.

Все варианты осуществления, описанные выше, можно комбинировать. Это охватывает конкретные варианты осуществления, относящиеся к:

природе фармакологического шаперона, например, миглустата; и активного сайта, для которого он является специфичным;

дозированию, пути введения фармакологического шаперона (миглустата) и типу фармацевтической композиции, в том числе к природе носителя и применению коммерчески доступных композиций;

природе лекарственного средства, например, терапевтического белкового лекарственного препарата, который может представлять собой аналог эндогенного белка, экспрессия которого у субъекта является пониженной или отсутствует, в подходящем случае рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, например, рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека, экспрессируемой в клетках яичника китайского хомячка (CHO) и имеющей увеличенное содержание N-гликановых звеньев, несущих один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, в сравнении с содержанием N-гликановых звеньев, несущих один или несколько остатков маннозо-6-фосфата, в алглюкозидазе-альфа; и в подходящем случае имеющей аминокислотную последовательность, приведенную под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 (или кодируемую SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5;

количеству и типу N-гликановых звеньев в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека, например, N-ацетилглюкозамина, галактозы, сиаловой кислоты или комплексных N-гликанов, образованных в результате их объединения, присоединенных к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека;

степени фосфорилирования маннозных звеньев в рекомбинантной кислой α-глюкозидазе человека с образованием маннозо-6-фосфата и/или бис-маннозо-6-фосфата;

дозированию и пути введения (например, внутривенному введению, особенно внутривенной инфузии, или прямому введению в целевую ткань) заместительного фермента (рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека) и типу состава, в том числе к носителям и терапевтически эффективному количеству;

интервалу дозирования фармакологического шаперона (миглустата) и рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека;

природе терапевтического ответа и результатам комбинированной терапии (например, улучшенным результатам в сравнении с эффектом каждого вида терапии, осуществляемого по отдельности);

временным рамкам осуществления комбинированной терапии, например, одновременному введению миглустата и рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека или последовательному введению, например, где миглустат вводят до рекомбинантной кислой α-глюкозидазой человека или после рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека или в определенное время до или после введения рекомби- 27 043083 нантной кислой α-глюкозидазы человека; и природе пациента, подвергаемого лечению (например, млекопитающего, такого как человек), и состоянию, от которого страдает индивидуум (например, недостаточности фермента).

Любой из вариантов осуществления, приведенных в перечне выше, можно комбинировать с одним или несколькими другими вариантами осуществления в перечне.

Примеры

Другие признаки настоящего изобретения станут очевидными из нижеизложенных неограничивающих примеров, которые иллюстрируют на примере принципы настоящего изобретения.

Пример 1. Ограничения существующих в настоящее время продуктов Myozyme® и Lumizyme® на основе rhGAA.

Для оценки возможностей rhGAA в Myozyme® и Lumizyme®, единственных одобренных в настоящее время средств для лечения болезни Помпе, эти препараты на основе rhGAA вводили в колонку с CIMPR (который связывается с rhGAA, имеющей группы М6Р), а затем элюировали в градиенте свободного M6. Фракции собирали в 96-луночный планшет, и активность GAA анализировали на субстрате, представляющем собой 4MU-α-глюкозу. Относительные количества связанной и несвязанной rhGAA определяли на основании активности GAA и регистрировали в виде доли от общего количества фермента.

На фиг. 2A-B описаны проблемы, связанные с традиционными средствами ERT (Myozyme® и Lumizyme®): 73% rhGAA в Myozyme® (фиг. 2B) и 78% rhGAA в Lumizyme® (фиг. 2A) не связывались с CIMPR, см. крайние левые пики на каждой фигуре. Только 27% rhGAA в Myozyme® и 22% rhGAA в Lumizyme® содержали М6Р, который может продуктивно нацеливать ее на CIMPR в мышечных клетках.

Эффективная доза Myozyme® и Lumizyme® соответствует количеству rhGAA, содержащей М6Р, которая нацеливается на CIMPR в мышечных клетках. Однако большая часть rhGAA в этих двух традиционных продуктах не нацеливается на CIMPR-рецептор в целевых мышечных клетках. Введение традиционной rhGAA, где большая часть rhGAA не нацеливается на мышечные клетки, увеличивает риск аллергической реакции или индукции иммунного ответа на ненацеливаемую rhGAA.

Пример 2. Получение клеток CHO, вырабатывающих rhGAA ATB200, имеющую высокое содержание N-гликанов, несущих моно- или 6ис-М6Р.

Клетки CHO трансфицировали с помощью ДНК, которая экспрессирует rhGAA, с последующим отбором трансформантов, вырабатывающих rhGAA. ДНК-конструкция для трансформации клеток CHO с помощью ДНК, кодирующей rhGAA, показана на фиг. 3. Клетки CHO трансфицировали с помощью ДНК, которая экспрессирует rhGAA, с последующим отбором трансформантов, вырабатывающих rhGAA.

После трансфекции клетки CHO-DG44 (DHFR-), содержащие стабильно интегрированный ген GAA, отбирали на среде без гипоксантина/тимидина (-HT). Усилениеэкспрессии GAA в этих клетках индуцировали путем обработки метотрексатом (MTX, 500 нМ). Популяции клеток, которые экспрессировали GAA в больших количествах, идентифицировали с помощью анализов активности фермента GAA и использовали для создания отдельных клонов, вырабатывающих rhGAA. Отдельные клоны получали в культуральных чашках с полутвердой средой, собирали с помощью системы ClonePix и переносили в планшеты с 24 глубокими лунками. Отдельные клоны анализировали в отношении активности фермента GAA для идентификации клонов, экспрессирующих GAA на высоком уровне. В кондиционированных средах для определения активности GAA использовали субстрат α-глюкозидазы, представляющий собой 4-MU-α-глюкопиранозид. Клоны, вырабатывающие GAA на более высоких уровнях, что измеряли с помощью анализов фермента GAA, дополнительно оценивали в отношении жизнеспособности, способности к росту, продуктивности выработки GAA, структуры N-гликанов и стабильной экспрессии белка. Линии клеток CHO, в том числе линию клеток CHO GA-ATB-200, экспрессирующую rhGAA с повышенным содержанием моно-М6Р- или бис-M6P-N-гликанов, выделяли с помощью данной процедуры.

Пример 3. Захват и очистка rhGAA ATB200.

Несколько партий rhGAA в соответствии с настоящим изобретением получали во встряхиваемых колбах и в перфузионных биореакторах с использованием линии клеток CHO GA-ATB-200, и измеряли связывание с CIMPR. Для очищенной rhGAA ATB200 из разных производственных партий наблюдали связывание с CIMPR-рецептором, аналогичное показанному на фиг. 4B и фиг. 5A (~ 70%), что указывает на то, что rhGAA ATB200 можно получать стабильно. Как показано на фиг. 2A, 2B, 4A и 4B, rhGAA Myozyme® и Lumizyme® демонстрировали значительно меньшую степень связывания с CIMPR, чем rhGAA ATB200.

Пример 4. Аналитическое сравнение ATB200 с Lumizyme®.

Жидкостную хроматографию со слабым анионным обменом (WAX) использовали для фракционирования rhGAA ATB200 по концевому фосфату. Профили элюирования получали путем элюирования средства для ERT с помощью увеличивающегося количества соли. Мониторинг профилей осуществляли с помощью UV-облучения (A280 нм). rhGAA ATB200 получали из клеток CHO и очищали. Lumizyme® получали из коммерческого источника. Lumizyme® демонстрировал высокий пик слева на его профиле

- 28 043083 элюирования. rhGAA ATB200 демонстрировала четыре выраженных пика элюирования справа от Lumizyme® (фиг. 6). Это подтверждает, что rhGAA ATB200 была фосфорилирована в большей степени, чем Lumizyme®, поскольку эту оценку проводили по концевому заряду, а не по аффинности к CIMPR.

Пример 5. Получение характеристик олигосахаридов в rhGAA ATB200

Очищенные гликаны rhGAA ATB200 и Lumizyme® оценивали с помощью MALDI-TOF для определения структур отдельных гликанов, обнаруживаемых в каждом средстве для ERT (фиг. 7). Было обнаружено, что образцы ATB200 содержат меньшие количества нефосфорилированных N-гликанов высокоманнозного типа, чем Lumizyme®. Более высокое содержание М6Р-гликанов в ATB200, чем в Lumizyme®, обеспечивает нацеливание rhGAA ATB200 на мышечные клетки с большей эффективностью. Высокая процентная доля монофосфорилированных и бисфосфорилированных структур, определенная с помощью MALDI, согласуется с профилями связывания с CIMPR, которые иллюстрируют значительно большую степень связывания ATB200 с CIMPR-рецептором. Анализ N-гликанов посредством массспектрометрии MALDI-TOF подтвердил, что в среднем каждая молекула ATB200 содержит по меньшей мере одну природную бис-М6Р-N-гликановую структуру. Это более высокое содержание 6uc-M6P-Nгликанов в rhGAA ATB200 напрямую коррелирует со связыванием с CIMPR с высокой аффинностью в анализах связывания с рецептором М6Р на планшетах (KD приблизительно 2-4 нМ), фиг. 9A.

rhGAA ATB200 также анализировали в отношении профилей сайт-специфических N-гликанов с помощью двух разных аналитических методик LC-MS/MS. В первом анализе белок подвергали денатурации, восстановлению, алкилированию и расщеплению перед проведением анализа по методу LCMS/MS. В ходе денатурации и восстановления белка 200 мкг образца белка, 5 мкл 1 моль/л Tris-HCl (конечная концентрация 50 мМ), 75 мкл 8 моль/л гуанидина-HCl (конечная концентрация 6 М), 1 мкл 0,5 моль/л EDTA (конечная концентрация 5 мМ), 2 мкл 1 моль/л DTT (конечная концентрация 20 мМ) и воду Milli-Q® добавляли в пробирку объемом 1,5 мл с получением общего объема 100 мкл. Образец перемешивали и инкубировали при 56°C в течение 30 мин в бане сухого нагрева. В ходе алкилирования денатурированный и восстановленный образец белка смешивали с 5 мкл 1 моль/л йодацетамида (IAM, конечная концентрация 50 мМ), затем инкубировали при 10-30°C в темноте в течение 30 мин. После алкилирования к образцу добавляли 400 мкл предварительно охлажденного ацетона, и смесь подвергали заморозке с охлаждением при -80°C в течение 4 ч. Затем образец центрифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин и 4°C, и надосадочную жидкость удаляли. К осадку добавляли 400 мкл предварительно охлажденного ацетона, который затем центрифугировали в течение 5 мин при 13000 об/мин и 4°C, и надосадочную жидкость удаляли. Затем образец высушивали воздухом на льду в темноте для удаления остаточного ацетона. Для растворения белка к образцу добавляли 40 мкл 8 М мочевины и 160 мкл 100 мМ NH₄HCO₃. В ходе расщепления трипсином к 50 мкг белка затем добавляли буфер для расщепления трипсином до конечного объема 100 мкл и добавляли 5 мкл 0,5 мг/мл трипсина (соотношение белка и фермента 20/1 вес./вес.). Раствор тщательно перемешивали и инкубировали в течение ночи (16±2 ч) при 37°C. Для гашения реакции добавляли 2,5 мкл 20% TFA (конечная концентрация 0,5%). Затем образец анализировали с помощью масс-спектрометра Orbitrap Velos Pro™ от Thermo Scientific.

Во втором анализе по методу LC-MS/MS образец ATB200 получали в соответствии с аналогичной процедурой денатурации, восстановления, алкилирования и расщепления, за исключением того, что в качестве алкилирующего реагента вместо IAM применяли йодуксусную кислоту (IAA), а затем анализировали с помощью масс-спектрометра Orbitrap Fusion Lumos Tribid™ от Thermo Scientific.

В третьем анализе по методу LC-MS/MS образец ATB200 получали в соответствии с аналогичной процедурой денатурации, восстановления, алкилирования и расщепления с применением йодацетамида (IAM) в качестве алкилирующего реагента, а затем анализировали с помощью масс-спектрометра Orbitrap Fusion от Thermo Scientific.

Результаты первого и второго анализов показаны на фиг. 8B-8H, а результат третьего анализа показан на фиг. 8A. На фиг. 8B-8H результаты первого анализа представлены столбиками, расположенными слева (темно-серого цвета), а результаты второго анализа представлены столбиками, расположенными справа (светло-серого цвета). На фиг. 8B-8H номенклатура символов для представления гликанов соответствует Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009). На фиг. 8A-8H сайты гликозилирования указаны по отношению к SEQ ID NO: 5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 и N869. Для полноразмерной аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1 эти потенциальные сайты гликозилирования находятся в следующих положениях: N140, N233, N390, N470, N652, N882 и N925.

Как можно видеть на фиг. 8B-8H, первые два анализа давали сходные результаты, хотя между результатами было некоторое различие. Это различие может быть обусловлено рядом факторов, в том числе используемым прибором и полнотой анализа N-гликанов. Например, если некоторые формы фосфорилированных гликанов не были идентифицированы и/или не были определены количественно, то общее число фосфорилированных гликанов может быть представлено в недостаточной мере, и процентная доля rhGAA, несущей фосфорилированные гликаны в данном сайте, может быть представлена в недостаточной мере. В качестве другого примера, если некоторые формы нефосфорилированных гликанов не были

- 29 043083 идентифицированы и/или не были определены количественно, то общее число нефосфорилированных гликанов может быть представлено в недостаточной мере, и процентная доля rhGAA, несущей фосфорилированные гликаны в данном сайте, может быть представлена чрезмерно большим количеством.

На фиг. 8A показана занятость сайтов N-гликозилирования в ATB200. Как можно видеть на фиг. 8A, первый, второй, третий, четвертый, пятый и шестой сайты N-гликозилирования по большей части были заняты, при этом было выявлено, что в каждом потенциальном сайте от примерно 90% до приблизительно 100% молекул фермента ATB200 имели гликан. Однако седьмой потенциальный сайт Nгликозилирования являлся гликозилированным приблизительно в половине случаев.

На фиг. 8B показан профиль N-гликозилирования для первого сайта - N84. Как можно видеть на фиг. 8B, основной формой гликанов были бис-M6P-гликаны. Как в первом, так и во втором анализах выявили, что более 75% ATB200 имели бис-M6P-гликан в первом сайте.

На фиг. 8C показан профиль N-гликозилирования для второго сайта - N177. Как можно видеть на фиг. 8C, основными формами гликанов были моно-M6P-гликаны и нефосфорилированные высокоманнозные гликаны. Как в первом, так и во втором анализах выявили, что более 40% ATB200 имели моноM6P-гликан во втором сайте.

На фиг. 8D показан профиль N-гликозилирования для третьего сайта - N334. Как можно видеть на фиг. 8D, основными формами гликанов были нефосфорилированные высокоманнозные гликаны, двух-, трех- и четырехантенные комплексные гликаны и гибридные гликаны. Как в первом, так и во втором анализах выявили, что более 20% ATB200 имели остаток сиаловой кислоты в третьем сайте.

На фиг. 8E показан профиль N-гликозилирования для четвертого сайта -N414. Как можно видеть на фиг. 8E, основными формами гликанов были бис-М6Р- и моно-M6P-гликаны. Как в первом, так и во втором анализах выявили, что более 40% ATB200 имели бис-M6P-гликан в четвертом сайте. Как в первом, так и во втором анализах также выявили, что более 25% ATB200 имели моно-M6P-гликан в четвертом сайте.

На фиг. 8F показан профиль N-гликозилирования для пятого сайта - N596. Как можно видеть на фиг. 8F, основными формами гликанов были фукозилированные двухантенные комплексные гликаны. Как в первом, так и во втором анализах выявили, что более 70% ATB200 имели остаток сиаловой кислоты в пятом сайте.

На фиг. 8G показан профиль N-гликозилирования для шестого сайта - N826. Как можно видеть на фиг. 8G, основными формами гликанов были двух-, трех- и четырехантенные комплексные гликаны. Как в первом, так и во втором анализах выявили, что более 80% ATB200 имели остаток сиаловой кислоты в шестом сайте.

На фиг. 8H показана сводная информация о фосфорилировании в каждом из первых шести потенциальных сайтов N-гликозилирования. Как можно видеть на фиг. 8H, как в первом, так и во втором анализах выявляли высокие уровни фосфорилирования в первом, втором и четвертом сайтах. В обоих анализах выявили, что более 80% ATB200 были моно- или дифосфорилированными в первом сайте, более 40% ATB200 были монофосфорилированными во втором сайте, и более 80% ATB200 были моно- или дифосфорилированными в четвертом сайте.

Пример 6. Получение характеристик аффинности ATB200 к CIMPR.

В дополнение к наличию более высокой процентной доли rhGAA, которая может связываться с CIMPR, важно понимать качество такого взаимодействия. Связывание Lumizyme® и rhGAA ATB200 с рецепторами определяли с помощью анализа связывания с CIMPR на планшетах. Вкратце, планшеты, покрытые CIMPR, использовали для захвата GAA. На иммобилизованный рецептор наносили rhGAA в различных концентрациях, и несвязанную rhGAA вымывали. Количество оставшейся rhGAA определяли по активности GAA. Как показано на фиг. 9A, rhGAA ATB200 связывалась с CIMPR значительно лучше, чем Lumizyme®.

На фиг. 9B показано относительное содержание бис-M6P-гликанов в Lumizyme®, традиционной rhGAA, и ATB200 в соответствии с настоящим изобретением. В случае с Lumizyme® в среднем только 10% молекул имеют бисфосфорилированный гликан. В противоположность этому, в случае с ATB200 в среднем каждая молекула rhGAA имеет по меньшей мере один бисфосфорилированный гликан.

Пример 7. rhGAA ATB200 более эффективно интернализировалась фибробластами, чем Lumizyme®.

Сравнивали относительное поглощение клетками rhGAA ATB200 и Lumizyme® с использованием линии нормальных клеток-фибробластов и линии клеток-фибробластов при болезни Помпе. В сравнениях участвовали 5-100 нМ rhGAA ATB200 в соответствии с настоящим изобретением и 10-500 нМ традиционной rhGAA Lumizyme®. После 16-часового инкубирования внешнюю rhGAA инактивировали с помощью основания TRIS, и клетки промывали 3 раза с помощью PBS перед их сбором. Интернализированную GAA измеряли посредством гидролиза 4MU-α-глюкозида, и данные наносили на график относительно уровня общего клеточного белка, и результаты показаны на фиг. 10A-B.

Также было показано, что rhGAA ATB200 эффективно интернализировалась в клетки (фиг. 10A и 10B, на которых соответственно показано, что rhGAA ATB200 интернализируется как в нормальные

- 30 043083 клетки-фибробласты, так и в клетки-фибробласты при болезни Помпе, и что она интернализируется в большей степени, чем традиционная rhGAA Lumizyme®). rhGAA ATB200 насыщает клеточные рецепторы при приблизительно 20 нМ, тогда как в случае с Lumizyme® необходимо приблизительно 250 нМ. Константа эффективности поглощения (K _{поглощение}), экстраполированная из этих результатов, составляет 2-3 нМ для ATB200 и 56 нМ для Lumizyme®, что показано на фиг. 10C. Эти результаты позволяют предположить, что rhGAA ATB200 представляет собой хорошо нацеливаемое средство для лечения болезни Помпе.

Пример 8. Популяционное фармакокинетическое (PK) моделирование для ATB200 и миглустата.

Фармакокинетические данные для кислой α-глюкозидазы (ATB200), в том числе моменты времени отбора образцов, хронологию введения доз и значения концентрации кислой α-глюкозидазы в плазме крови, получали от мышей, крыс и обезьян, которым вводили ATB200 путем внутривенной инъекции. Фармакокинетические данные для миглустата и дувоглустата в плазме крови и ткани собирали у людей или мышей.

Моделирование и имитационные эксперименты осуществляли с помощью Phoenix® NLME™ v1.3. Для оценки PK ATB200 в плазме крови конструировали компартментные PK-модели. Модели включали: описание взаимосвязи между концентрацией в плазме крови и временем;

компонент дисперсии, характеризующий межорганизменную и внутриорганизменную изменчивость параметров модели у животных; и компонент, описывающий неопределенность в уровне знаний о критически важных компонентах модели.

Нелинейные модели со смешанными эффектами (NLME) имеют форму: с_р< =c(D„/,,3) + ¾ 3 =(¾. О , где Cpij представляет собой концентрацию в j-й момент времени сбора (tj) для животного i, Di представляет собой хронологию введения доз для животного i, θ_i представляет собой вектор PK-параметров для животного i, и eij представляет собой случайную погрешность, связанную с j-й концентрацией для животного i.

Межсубъектную изменчивость (BSV) параметров моделировали в виде log-нормального распределения:

θ_ιη = θ_τνη exp {η_ιη\ где θρνη представляет собой типичное значение n^-го PK-параметра (например, клиренса) в популяции, и ni_n представляет собой случайный межорганизменный эффект у животных в отношении п^го параметра для животного i. Случайные эффекты (n1...,nm) имели нормальное распределение со средним значением, составляющим 0, и оцененной дисперсией ω², включенной в матрицу OMEGA (Ω).

Предполагалось, что PK не зависят от вида, и их масштабировали в соответствии с обобщенным подходом Дедрика, согласно которому фармакокинетическое распределение масштабируют в соответствии с мощностью показателя веса тела животного:

СЦр), = а_(р) BW,

V_(p)1 = c_(p)BW,^d, где CL = системный клиренс, V = объем распределения, BW = вес тела, p = периферический, b и d = аллометрические экспоненты, и a и c = типичные значения для BW = 1. В данном случае экспоненты b и d можно сравнивать с более обобщенными значениями, принятыми в литературе (b = 0,75 и d = 1,0). В анализах использовали номинальные значения BW (0,025, 0,25 и 2,5 кг).

Исходную концентрацию кислой α-глюкозидазы моделировали в виде С_{исходная} = скорость синтеза кислой а-глюкозидазы/CL, и ее можно экстраполировать на людей, поскольку С_{исходная} является видоспецифической, не зависит от концентрации ATB200 и известна у людей с болезнью Помпе. Базовую модель определяли с помощью FOCE-ELS на Phoenix® для оценки того, какая из 1- или 2-компартментной модели лучше всего согласуется с данными. Источники изменчивости PK кислой α-глюкозидазы также исследовали визуально и путем выявления влияния различных эффектов, связанных с диким типом/видом/дозой, на PK.

В случае с ATB200 двухкомпартментная модель с линейным выведением надлежащим образом характеризует профили зависимости концентрации активной формы кислой α-глюкозидазы от времени при всех уровнях дозы среди различных видов животных. Модель включала теоретический аллометрический компонент, учитывающий влияние разницы в весе тела среди различных видов животных на клиренс (CL) и объем распределения (Vc). Точность подбора популяционной PK-модели для ATB200 показана на фиг. 11. Популяционные PK-параметры ATB200, полученные в неклинических исследованиях, представ- 31 043083 лены в табл. 1.

Таблица 1

РК-параметр	Типичные значения (относительная среднеквадратическая погрешность (%))	Межсубъектная изменчивость (%)
Системный клиренс (CL; л/ч.)	0,00957 х (BW/0,25)11’78 (5,1) (3,2)	21,0
Центральный объем распределения (Vc; л)	0,0101 х (BW/0,25)0’83 (4,3) (1,7)	5,3
Периферический клиренс (CLd; л/ч.)	0,000290 х (BW/0,25)0’78 (43,2)	NA
Периферический объем распределения (V2; л)	0,000653 х (BW/0,25)0’83 (35,6)	NA
Скорость синтеза эндогенной кислой аглюкозидазы (SYNT; мг/ч.)	Мышь: 0,00401 (8,1) Крыса: 0,0203 (13,3) Обезьяна: 0,00518 (16,9)	NA

BW: вес тела.

Профили зависимости концентрации от времени для миглустата (200 мг) у пациентов с болезнью Помпе сравнивали с профилями, полученными после введения дувоглустата здоровым добровольцам (диапазон доз: 50, 100, 250, 600 и 1000 мг). Нормализованные по дозе профили зависимости концентрации миглустата и дувоглустата в плазме крови от времени показаны на фиг. 12. Поскольку профили зависимости концентрации миглустата от времени у пациентов с болезнью Помпе были сходны с профилями, наблюдаемыми после введения доз дувоглустата здоровым субъектам в течение 24 ч, то PKданные, собранные для дувоглустата в периферических тканях, использовали в качестве суррогатных для моделирования воздействия миглустата. Для получения характеристик профилей зависимости концентрации дувоглустата в тканях от времени использовали двухкомпартментную модель с линейным выведением.

Точность подбора PK-модели для дувоглустата показана на фиг. 13A и 13B. Конечные смоделированные PK-параметры дувоглустата в плазме крови и тканях показаны в табл. 2.

__________________________Таблица 2__________________________

РК-параметр	Типичные значения (CV, %)
Объем распределения (V; л)	44,5 (7,41)
Системный клиренс (CL; л/ч.)	9,44 (6,99)
Константа скорости всасывания (Ка; 1/ч.))	1,10(14,0)
Периферический объем распределения (V2; л)	8,68 (19,39)
Клиренс в центральном компартменте (CL2; л/ч.)	0,205 (23,7)
Межкомпартментный объем распределения (VQ; л)	61,8(21,2)
Константа скорости выведения (Кео)	0,378 (11,1)
Межкомпартментный объем распределения в центральной компартменте (VQ2; л)	3390
Клиренс в периферическом компартменте (CL3; л/ч.)	88,0 (7,72)
Кажущийся межкомпартментный клиренс (CLQ; л/ч.)	40,6 (10,6)
Время запаздывания (ч.)	0,176 (30,7)
Относительная среднеквадратическая погрешность для центрального компартмента	0,477 (6,56)
Относительная среднеквадратическая погрешность для периферического компартмента	0,368 (8,19)

CV: коэффициент изменчивости.

Популяционную PK-модель для миглустата конструировали с учетом перорального введения доз мышам с нокаутом (KO) Gaa. Популяционные PK-параметры миглустата у мышей с KO Gaa представлены в табл. 3. Точность подбора показана на фиг. 14. Модель имела остаточную аддитивную погрешность, составляющую 0,475 нг/мл.

Таблица 3

РК-параметр	Типичные значения (BSV, %)
Константа скорости всасывания (Ка; ч.-1)	2,09 (4,56)
Системный клиренс (CL; мл/ч.)	43,3 (9,61)
Центральный объем распределения (Vc; мл)	4,55 (45,1)
Периферический клиренс (CLd; мл/ч.)	4,57(32,1)
Периферический объем распределения (V2; мл)	19,6(23,3)

BSV: межсубъектная изменчивость.

Пример 9. Моделирование фармакокинетических параметров (PK) рекомбинантной кислой α- 32 043083 глюкозидазы (ATB200) у людей.

Фармакокинетические модели (пример 8) использовали для осуществления имитационных экспериментов и для предсказания профилей зависимости концентрации кислой α-глюкозидазы от времени у субъектов-людей с поздней стадией болезни Помпе после введения доз ATB200. Аллометрическая функция позволяла установить связь веса тела с клиренсом и объемом распределения, и, следовательно, позволяла предсказать PK-параметры у типичных субъектов-людей с весом тела 70 кг. Модель подвергали индивидуальной адаптации путем включения скорости синтеза эндогенной кислой α-глюкозидазы у людей (Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of acid alpha-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease. Clin Chem. (2001) Aug; 47(8): 1378-83).

Было предсказано, что у людей однократная IV доза 20 мг/кг ATB200, вводимая в течение 4 ч путем инфузии, приводит к получению профиля зависимости концентрации от времени, представленного на фиг. 15. PK-параметры у типичного человека весом 70 кг и параметры воздействия, полученные после IV инфузии ATB200 в дозе 20 мг/кг в течение 4 ч, представлены в табл. 4.

Таблица 4

Фармакокинетический параметр	Предсказанное значение
Системный клиренс (CL; л/ч.)	0,768
Центральный объем распределения (Vc; л)	1,09
Площадь под кривой, экстраполированная до бесконечности (AUCo-inf; мг-ч./л)	1822
Максимальная концентрация (Стах; мг/л)	423
Время достижения максимальной концентрации (ТтаХ; ч.)	4
Период полувыведения (Тщ; ч.)	2,17

Предсказанные значения системного клиренса (CL) и объема распределения (V) ATB200 у типичного пациента весом 70 кг составляли соответственно 0,768 л/ч и 2,41 л.

В соответствии с инструкцией по медицинскому применению препарата Lumizyme® (алглюкозидазы-альфа) системный клиренс кислой α-глюкозидазы в неделю 52 после повторного введения доз Lumizyme® у пациентов с поздней стадией болезни Помпе составляет 601 мл/ч. (0,601 л/ч), и период полувыведения Lumizyme® составляет 2,4 ч. Согласно вышеописанной модели ожидается, что системный клиренс ATB200 у взрослых субъектов с болезнью Помпе будет примерно на 28% превышать системный клиренс, о котором сообщается для Lumizyme®. Кроме того, ожидается, что предсказанная AUC у людей после введения ATB200 в дозе 20 мг/кг будет на приблизительно 25% меньшей (AUC_0-inf: 1822 мг-ч/л), чем AUC, о которой сообщается после введения Lumizyme® в дозе 20 мг/кг (~ 2700 мг-ч/мл).

Пример 10. Модели зависимости воздействие-ответ применительно к снижению уровня гликогена

Мышам с нокаутом Gaa вводили кислую α-глюкозидазу (ATB200) внутривенно в дозах 5, 10 и 20 мг/кг, возрастающие пероральные дозы миглустата (1, 3 и 10 мг/кг) одновременно с внутривенными дозами 5 или 10 мг/кг ATB200 или возрастающие пероральные дозы миглустата (1, 3, 5, 10, 20 и 30 мг/кг) одновременно с внутривенными дозами 20 мг/кг ATB200. Уровни гликогена измеряли, как описано ранее (Khanna, R, Flanagan, JJ, Feng, J, Soska, R, Frascella, M, Pellegrino, LJ et al. (2012). The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease. PLoS One 7(7): e40776). Рассчитывали соотношения уровней гликогена, наблюдаемых после каждой обработки в рамках комбинированной терапии, и уровня гликогена, наблюдаемого после монотерапии (соотношение уровней гликогена). Результаты представлены в табл. 5.

- 33 043083

Таблица 5

Средства для лечения	Уровень гликогена (мкг/мг белка)	Соотношение (комбинирова иная терапия/моно терапия)
АТВ200 (мг/кг)	Миг лу стат (мг/кг)	Монотерапия	Комбинированная терапия	Медианное значение (Ν)
Исследование № 1, медианное значение (Ν)	Исследование №2, медианное значение (Ν)	Исследование №3, медианное значение (Ν)
5	ΝΑ	307 (Ν=7)	ΝΑ	ΝΑ	307 (Ν=7)	ΝΑ
10	ΝΑ	259 (Ν=7)	ΝΑ	ΝΑ	259 (Ν=7)	ΝΑ
20	ΝΑ	157 (Ν=7)	ΝΑ	195 (Ν = 14)	181 (Ν=21)	ΝΑ
5	1	ΝΑ	323 (Ν=7)	ΝΑ	323 (Ν=7)	1,05
3	ΝΑ	359 (Ν=6)	ΝΑ	359 (Ν=6)	1,17
10	ΝΑ	352 (Ν=7)	ΝΑ	352 (Ν=7)	1,15
10	1	ΝΑ	273 (Ν=7)	ΝΑ	273 (Ν=7)	1,05
3	ΝΑ	252 (Ν=7)	ΝΑ	252 (Ν=7)	0,973
10	ΝΑ	278 (Ν=7)	ΝΑ	278 (Ν=7)	1,07
20	1	ΝΑ	154 (Ν=7)	ΝΑ	154 (Ν=7)	0,851
3	ΝΑ	175 (Ν=7)	ΝΑ	175 (Ν=7)	0,967
5	ΝΑ	ΝΑ	163 (Ν=14)	163 (Ν=14)	0,900
10	ΝΑ	97 (Ν=6)	145 (Ν=13)	118 (Ν=19)	0,652
20	ΝΑ	ΝΑ	122 (Ν=13)	122 (Ν=13)	0,674
30	ΝΑ	167 (Ν=6)	175 (Ν=14)	170 (Ν=20)	0,939

Кроме того, на фиг. 15A-15C показаны эффекты введения алглюкозидазы-альфа (Lumizyme®) и ATB200 в отношении очищения от гликогена у мышей с нокаутом Gaa. Животным проводили два IV болюсных введения (один раз в две недели); ткани собирали через две недели после введения последней дозы и анализировали в отношении активности кислой α-глюкозидазы и содержания гликогена.

Как видно из результатов, представленных в табл. 5, было обнаружено, что ATB200 дозозависимым образом истощает запасы гликогена в тканях у мышей с нокаутом гена кислой α-глюкозидазы (Gaa). Доза 20 мг/кг ATB200 стабильно обеспечивала удаление большей доли запасенного гликогена у мышей с нокаутом Gaa, чем уровни дозы 5 и 10 мг/кг. Однако, как видно на фиг. 15A - 15C, ATB200, вводимая в дозе 5 мг/кг, демонстрировала снижение уровня гликогена в сердечной и скелетных мышцах (четырехглавой и трехглавой мышцах) мыши, сходное с таковым для Lumizyme®, вводимым в дозе 20 мг/кг, тогда как ATB200, вводимая в дозе 10 и 20 мг/кг, демонстрировала значительно лучшее снижение уровней гликогена в скелетных мышцах, чем Lumizyme®.

Кроме того, дозы 10 и 20 мг/кг миглустата, которые вводили совместно с ATB200 в дозе 20 мг/кг, приводили к снижению уровней гликогена у мышей с нокаутом Gaa соответственно до 118 и 122 мкг/мг белка. Введение миглустата в дозе 30 мг/кг вызывало меньшее снижение уровня гликогена. Не ограничиваясь какой-либо теорией, полагают, что при более высоких концентрациях миглустата ингибирование кислой α-глюкозидазы в лизосомах может превышать благоприятный эффект шаперона, за счет чего уменьшается разложение гликогена в лизосомах.

Фармакокинетические модели (пример 8) использовали для предсказания воздействия кислой αглюкозидазы и миглустата, согласованного во времени со значениями уровней гликогена в лизосомах тканей, представленными в табл. 5. Соотношения воздействий миглустата/ATB200 в равновесном состоянии (AUC) (среднее воздействие в течение 24 ч) получали для каждой тестируемой комбинации средств для лечения, наносили на график в зависимости от соответствующего соотношения уровней гликогена (табл. 5), и эти данные аппроксимировали математической функцией. Кривая зависимости воздействие-ответ показана на фиг. 17.

Как видно из результатов на фиг. 17, совместное введение доз 10 и 20 мг/кг миглустата с дозой 20 мг/кг ATB200 обеспечивает хорошую стабильность активной формы кислой α-глюкозидазы в плазме крови с максимальным снижением при этом уровня гликогена. Более низкие дозы миглустата (1, 3 и 5 мг/кг), как полагают, приводят к субоптимальной стабилизации активной формы кислой α-глюкозидазы, тогда как наиболее высокая доза миглустата (30 мг/кг), как полагают, приводит к чрезмерному ингибированию активной формы α-глюкозидазы в лизосомах.

Согласно фармакокинетическим моделям (пример 8) ожидается, что наблюдаемое соотношение AUC миглустата/ATB200, составляющее 0,01159 (10 мг/кг миглустата при совместном введении с 20

- 34 043083 мг/кг ATB200), будет соответствовать дозе миглустата, составляющей приблизительно 270 мг, при совместном введении с 20 мг/кг ATB200 у типичного человека весом 70 кг. Соотношения AUC, составляющие 0,01 и 0,02, будут соответствовать дозам миглустата 233 и 466 мг соответственно при совместном введении с 20 мг/кг ATB200 у типичного субъекта весом 70 кг.

Пример 11. Моделирование концентраций миглустата/дувоглустата у людей

Фармакокинетические модели (пример 8) использовали для предсказания продолжительности периода, в течение которого концентрации дувоглустата (заменителя миглустата) в плазме крови или ткани будут оставаться на уровне выше IC₅₀ (концентрации, обеспечивающей 50% ингибирование активности кислой α-глюкозидазы от максимально возможного) миглустата в плазме крови и лизосомах. Ингибирование активной формы кислой α-глюкозидазы определяли с помощью способов, описанных ранее (Flanagan JJ, Rossi B, Tang K, Wu X, Mascioli K, et al. (2009) The pharmacological chaperone 1deoxynojirimycin increases the activity and lysosomal trafficking of multiple mutant forms of acid alphaglucosidase. Hum Mutat 30: 1683-1692). Было определено, что значение IC₅₀ миглустата при pH плазмы крови (pH 7,0) составляет 170 мкг/л, тогда как значение IC₅₀ при pH лизосомного компартмента (pH 5,2) было определено как составляющее 377 мкг/л.

Результаты предсказания на основе модели представлены в табл. 6. Предсказанные профили зависимости концентрации миглустата в плазме крови и лизосомах после повторного введения доз от времени показаны соответственно на фиг. 17 и 18.

____________________Таблица 6____________________

Доза миглустата (мг)	Время > IC50 (ч.)
Плазма крови (pH 7,0)	Лизосомы (pH 5,2)
100	13,1	0
150	15,0	0
200	16,4	1,19
233	17,2	2,96
250	17,5	3,58
270	17,9	4,15
300	18,4	4,92
466	20,7	8,04
600	22,0	9,96
699	22,8	И,2

С учетом результатов, представленных в табл. 6 и на фиг. 17 и 18, ожидается, что доза 260 мг миглустата будет обеспечивать связывание и стабилизацию ATB200 в плазме крови в течение периода до 18 ч, тогда как ингибирование активной формы кислой α-глюкозидазы в лизосомах, как ожидается, будет продолжаться только 4 ч.

Пример 12. Физиологические и морфологические характеристики мышц у мышей с нокаутом Gaa.

Мышам с нокаутом Gaa проводили два IV болюсных введения рекомбинантной кислой αглюкозидазы человека (алглюкозидазы-альфа или ATB200) в дозе 20 мг/кг один раз в две недели. Миглустат вводили перорально в дозировке 10 мг/кг подгруппе животных, которых обрабатывали с помощью ATB200, за 30 мин. до введения ATB200. Контрольных мышей обрабатывали только инертной средой. Ткань камбаловидной мышцы, четырехглавой мышцы и диафрагмы собирали через две недели после введения последней дозы рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека. Ткань камбаловидной мышцы и диафрагмы анализировали в отношении уровней гликогена путем окрашивания реактивом Шиффа и йодной кислотой (PAS) и в отношении пролиферации лизосом путем измерения уровней маркерного мембранного белка, ассоциированного с лизосомами (LAMP1), экспрессия которого повышается при болезни Помпе. Полутонкие срезы четырехглавой мышцы, залитые в эпоксидную смолу (Epon), окрашивали метиленовым синим и исследовали с помощью электронной микроскопии (1000x) для определения степени наличия вакуолей. Образцы четырехглавой мышцы анализировали иммуногистохимическим способом для определения уровней маркеров аутофагии легкой цепи 3 ассоциированного с микротрубочками белка 1A/1B, конъюгированной с фосфатидилэтаноламином (LC3A II), и p62, инсулинзависимого переносчика глюкозы GLUT4 и инсулиннезависимого переносчика глюкозы GLUT1.

В аналогичном исследовании мышам с нокаутом Gaa проводили четыре IV болюсных введения рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека (алглюкозидазы-альфа или ATB200) в дозе 20 мг/кг один раз в две недели. Миглустат вводили перорально в дозировке 10 мг/кг подгруппе животных, которых обрабатывали с помощью ATB200, за 30 мин. до введения ATB200. Контрольных мышей обрабатывали только инертной средой. Сердечную мышечную ткань собирали через две недели после введения последней дозы рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека и анализировали в отношении уровней гликогена путем окрашивания реактивом Шиффа и йодной кислотой (PAS) и в отношении пролиферации лизосом путем измерения уровней LAMP1.

Как видно на фиг. 20, при введении ATB200 демонстрировалось снижение пролиферации лизосом в сердечной мышечной ткани, ткани диафрагмы и скелетной мышечной ткани (ткани камбаловидной мышцы) в сравнении с традиционной обработкой алглюкозидазой-альфа, а при совместном введении

- 35 043083 миглустата с ATB200 демонстрировалось значительно большее снижение пролиферации лизосом, приближающееся к уровням, наблюдаемым у мышей дикого типа (WT). Кроме того, как видно на фиг. 21, при введении ATB200 демонстрировалось снижение уровней гликогена в виде точечных отложений в сердечной и скелетной мышечной ткани (ткани камбаловидной мышцы) в сравнении с традиционной обработкой алглюкозидазой-альфа, а при совместном введении миглустата с ATB200 демонстрировалось значительно большее снижение, в этом случае также приближающееся к уровням, наблюдаемым у мышей дикого типа (WT).

Также, как видно на фиг. 22, при совместном введении миглустата с ATB200 значительно снижалось число вакуолей в мышечном волокне четырехглавой мышцы у мышей с нокаутом Gaa в сравнении с необработанными мышами и мышами, обработанными алглюкозидазой-альфа. Как видно на фиг. 23, уровни как LC3 II, так и p62 были увеличены у мышей с нокаутом Gaa в сравнении с мышами дикого типа, однако они значительно снижались при обработке с помощью ATB200 и миглустата, что указывает на то, что увеличение аутофагии, ассоциированной с дефицитом кислой α-глюкозидазы, снижается при совместном введении ATB200 и миглустата. Кроме того, уровни инсулинзависимого переносчика глюкозы GLUT4 и инсулиннезависимого переносчика глюкозы GLUT1 были увеличены у мышей с нокаутом Gaa в сравнении с мышами дикого типа, однако в этом случае также значительно снижались при обработке с помощью ATB200 и миглустата. Повышенные уровни GLUT4 и GLUT1, ассоциированные с дефицитом кислой α-глюкозидазы, могут способствовать увеличению поглощения глюкозы мышечными волокнами и увеличению синтеза гликогена как в базальном состоянии, так и после приема пищи. Таким образом, было обнаружено, что комбинированная обработка с помощью ATB200 и миглустата улучшает морфологические и физиологические характеристики скелетных мышц в мышиной модели болезни Помпе.

Пример 13. Токсичность ATB200, вводимой совместно с миглустатом, у макаков-крабоедов.

Ранее не участвовавших в экспериментах макаков-крабоедов из Камбоджи распределяли в группы дозирования, указанные в табл. 7. Обеспечивали акклиматизацию животных к помещению, где проводили исследование, в течение от 18 (самки) до 19 (самцы) дней. В последний день акклиматизации вес животных составлял от 2,243 кг до 5,413 кг, а их возраст составлял от 2 до 3 лет.

Таблица 7

Группа	Тестируемый препарат	Путь	Уровень дозы (мг/кг)	Концентрация дозы (мг/мл)	Число животных (самцы/ самки)	Аутопсия в день 99 (самцы/ самки)
1	Контроль (буфер для составления)	IV инфузия	0	0	4/4	4/4
2	Миглустат	NG	25	2,5	4/4	4/4
АТВ200	IV инфузия	50	5
3	Миглустат	NG	175	17,5	4/4	4/4
АТВ200	IV инфузия	100	10
4	Миглустат	NG	175	17,5	4/4	4/4
5	АТВ200	IV инфузия	100	10	4/4	4/4

NG: назогастральный.

Тестируемые уровни дозы выбирали с учетом предыдущих исследований на отличных от человека приматах для получения значений воздействия (AUC), сравнимых с ожидаемыми клиническими значениями AUC у людей, которым вводили дозу 260 мг миглустата и 20 мг/кг ATB200, или незначительно превышающих их (для группы введения 25 мг/кг миглустата и 50 мг/кг ATB200), или примерно в 10 и 3 раза превышающих их (для групп введения 175 мг/кг миглустата и/или 100 мг/кг ATB200), предсказанных на основе фармакокинетических моделей из примера 8 (соответственно примерно 20,9 ч.-мкг/мл и примерно 1822 ч.-мкг/мл). В предыдущих исследованиях на отличных от человека приматах было обнаружено, что IV доза 100 мг/кг ATB200 дает в результате AUC, составляющую 5330 ч.-мкг/мл, и пероральную дозу 175 мг/кг миглустата экстраполировали с получением AUC, составляющей 196 ч.-мкг/мл.

ATB200 составляли в 25 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 6, содержащем 2,92 мг/мл хлорида натрия, 20 мг/мл маннита и 0,5 мг/мл полисорбата 80 (буфере для составления). Тестируемый препарат (ATB200 или миглустат) и контрольный препарат/инертную среду (буфер для составления) вводили один раз в две недели в течение 13 недель, начиная с дня 1 и заканчивая днем 85. ATB200 и контрольный препарат/инертную среду вводили посредством 2-часовой (±10 мин) внутривенной (IV) инфузии в дозах 0 мг/кг (группа 1, контрольный препарат), 50 мг/кг (группа 2) или 100 мг/кг (группы 3 и 5). Миглустат вводили назогастрально в стерильной воде для инъекций, соответствующей требованиям USP, в дозах 25 мг/кг (группа 2) или 175 мг/кг (группы 3 и 4) за 30 мин (± 2 мин) до начала инфузии ATB200, если их

- 36 043083 давали в комбинации. Объем вводимой дозы во всех группах составлял 10 мл/кг.

Параметры, оцениваемые в ходе прижизненной фазы исследования, включали показатели веса тела, потребление пищи, данные клинических наблюдений, подробных клинических наблюдений, физикальных осмотров, электрокардиографического исследования, офтальмологических оценок, клинической лабораторной диагностики (общего анализа крови, анализа на свертываемость, биохимического анализа сыворотки крови), оценку уровня антител к лекарственному средству (ADA), оценку уровня нейтрализующих ADA, данные общего анализа мочи, а также токсикокинетические характеристики (TK) миглустата и активной формы и общего белка ATB200 в плазме крови. Посмертную аутопсию животных осуществляли в день 99 (через 14 дней после введения последней дозы). При аутопсии регистрировали макроскопические наблюдения и показатели веса органов, и ткани собирали для микроскопического исследования.

Все животные доживали до момента запланированной эвтаназии, и не наблюдалось изменений, связанных с введением ATB200, миглустата или с совместным введением ATB200 и миглустата, в ходе физикальных осмотров или в ходе оценки потребления пищи, клинических наблюдений, подробных клинических наблюдений, показателей веса тела, офтальмологических показателей или параметров ECG. Кроме того, не наблюдалось связанных с ATB200, миглустатом или комбинацией ATB200/миглустат изменений параметров общего анализа мочи, биохимического анализа сыворотки крови, общего анализа крови или анализа на свертываемость или в ходе оценки макроскопических наблюдений, показателей веса органов или гистопатологических характеристик.

Общие уровни антител к лекарственному средству (ADA) и нейтрализующих антител (NAb)

Общие уровни антител к лекарственному средству (ADA) и нейтрализующих антител (NAb) измеряли в плазме крови. Образцы крови (примерно 1,6 мл) собирали в пробирки с K₂EDTA у всех животных один раз в ходе акклиматизации, перед введением дозы (до введения миглустата) и в дни 1, 85 и 99. Образцы выдерживали в жидком льду до обработки. Плазму крови получали путем центрифугирования при температуре от 2 до 8°C, и аликвоты (примерно 0,2 мл) переносили в полипропиленовые флаконы и хранили в замороженном состоянии при температуре от -60 до -86°C в течение 1 ч с момента взятия крови. Анализ образцов в отношении ADA проводили с использованием образцов, собранных у животных из групп 1, 2, 3 и 5 (образцы, полученные от животных, которым вводили только миглустат, не анализировали). Анализ нейтрализующих антител проводили с помощью ферментного анализа с флуорогенным субстратом 4-метилумбеллиферил-α-D-глюкопиранозидом (4MU-Glc).

Все животные из групп дозирования ATB200 (группы 2, 3 и 5) имели положительные результаты анализа в отношении антител к лекарственному средству (ADA) в дни 85 и 99 (частота возникновения 100%). Титры находились в диапазоне от 25600 до 409600 в день 85 и от 51200 до 819200 в день 99. Явная тенденция к увеличению титров с увеличением уровня дозы ATB200 не наблюдалась. 5 из 8 животных в группе 2 (50 мг/кг ATB200 в комбинации с 25 мг/кг миглустата) имели положительные результаты анализа в отношении нейтрализующих антител (NAb) в дни 85 и 99. Два из 8 в группе 3 (100 мг/кг ATB200 в комбинации с 175 мг/кг миглустата) имели положительные результаты анализа в отношении NAb в день 85, и 4 из 8 имели положительные результаты анализа в день 99. Два из 8 в группе 5 (100 мг/кг ATB200 в качестве монотерапии) имели положительные результаты анализа в отношении NAb в день 85, и 3 из 8 имели положительные результаты анализа в день 99. Явный эффект ADA в отношении воздействия ATB200 или других TK-параметров не наблюдался.

Токсикокинетические характеристики ATB200.

Токсикокинетические характеристики ATB200 измеряли в образцах крови, собранных в пробирки с K₂EDTA у животных в дни 1 и 85, в следующие моменты времени:

для групп 1, 2, 3 и 5: перед введением дозы (до введения миглустата); через 1 ч после начала инфузии; через 2 ч после начала инфузии; через 2,5 ч после начала инфузии; через 3 ча после начала инфузии; через 4 ч после начала инфузии; через 6 ч после начала инфузии; через 12 ч после начала инфузии; через 26 ч после начала инфузии; через 168 ч после начала инфузии и через 336 ч после начала инфузии (собирали до введения дозы в день 15); и для группы 4: перед введением дозы (до введения миглустата); через 1,5 ч после введения миглустата; через 2,5 ч после введения миглустата; через 3,5 ч после введения миглустата; через 4,5 ч после введения миглустата; через 6,5 ч после введения миглустата; через 12,5 ч после введения миглустата; через 26,5 ч после введения миглустата; через 168,5 ч после введения миглустата и через 336,5 ч после введения миглустата (собирали до введения дозы в день 15).

Плазму крови получали путем центрифугирования при температуре от 2 до 8°C, и аликвоты (примерно 0,1 мл) переносили в полипропиленовые флаконы и хранили в замороженном состоянии при температуре от -60 до -86°C. Анализ активной формы кислой α-глюкозидазы ATB200 и общего белка ATB200 проводили с использованием образцов, полученных через 2 ч после введения дозы, от животных из группы 1 и всех образцов, собранных у животных из групп 2, 3 и 5. Уровень общего белка ATB200 измеряли с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LCMS/MS). Два сигнатурных пептида (TTPTFFPK и VTSEGAGLQLQK) использовали в качестве показате- 37 043083 ля наличия ATB200. Результаты для этих двух пептидов были стабильными, что указывает на то, что в анализируемых образцах плазмы крови присутствовала интактная ATB200. Активную форму кислой αглюкозидазы анализировали с использованием флуорогенного субстрата 4-метилумбеллиферил-α-Dглюкопиранозида (4MU-Glc).

Анализ токсикокинетических (TK) данных осуществляли с использованием аудированных/верифицированных наборов данных (концентрация и время) от животных из групп 2, 3 и 5 с помощью программного обеспечения WinNonlin Phoenix версии 6.1 (Pharsight Corporation). Некомпартментный анализ данных о концентрации в плазме крови у отдельных субъектов применяли для оценки TKпараметров активной формы кислой α-глюкозидазы и общего белка ATB200 (по двум сигнатурным пептидам TTPTFFPK и VTSEGAGLQLQK) после IV инфузии. Уровень дозы вводили в виде фактической дозы ATB200 в мг, рассчитанной с учетом объема дозы, веса тела и средней концентрации дозы для каждого отдельного животного. Время начала каждого введения дозы (начало инфузии ATB200) принимали равным нулю для всех профилей в режиме введения доз. Для всех анализов использовали номинальные значения времени сбора образцов. Площадь под кривыми зависимости концентрации в плазме крови от времени (AUC_0-t), полученную для ATB200 (наборы данных анализа уровня общего белка и активной формы), оценивали с помощью линейно-логарифмического метода трапеций. В основе регрессии, применяемой для оценки λ_ζ, лежали равномерно взвешенные данные о концентрации.

Для каждого набора данных о ATB200 (полученного от двух сигнатурных пептидов в анализе общего ATB200 и анализе активной формы ATB200), рассчитывали следующие параметры:

R² - квадрат коэффициента корреляции для линейной регрессии, применяемой для оценки λ_ζα. Применяется в случае, когда для определения конечной фазы (или конкретного диапазона времени) профиля зависимости концентрации от времени используется установленное число точек;

R² скорр. - квадрат коэффициента корреляции для линейной регрессии, применяемой для оценки λ,, скорректированный с учетом числа точек, используемых при оценке λ_ζβ. Применяется в случае, когда число точек, используемых для определения конечной фазы профиля зависимости концентрации от времени, может варьироваться;

число точек λ_ζ - число точек для линейного регрессионного анализа, используемое для оценки λ_ζ;

λ_ζα - константа скорости выведения для первых трех моментов времени после t_max;

λ_ζβ - конечная константа скорости выведения;

t_1/2a - период полувыведения по первым трем моментам времени после t_max;

t_1/2p - конечный период полувыведения из расчета λ_ζ (0,693/λ_ζ);

t_max - время достижения максимальной концентрации аналита в плазме крови;

C_max - максимальная наблюдаемая концентрация аналита в плазме крови;

AUC_0-t - площадь под кривой зависимости концентрации в плазме крови от времени (AUC), измеренная от момента времени 0 (перед введением дозы) до момента времени определения последней поддающейся измерению концентрации;

AUC₀.„ - AUC, экстраполированная до бесконечности времени;

AUC_ext - часть AUC, экстраполированной до бесконечности времени, представленная как % от общей AUCo-,,;

CL_T - общий клиренс (по λ_ζβ); из расчета общей дозы в мг по фактическому весу тела;

CLT/F - общий клиренс (из расчета λ_ζβ); из расчета общей дозы в мг по фактическому весу тела, деленный на биодоступную часть;

V_ss - кажущийся объем распределения в равновесном состоянии;

ν_ζ - объем распределения в конечной фазе (из расчета λ_ζβ); из расчета общей дозы в мг по фактическому весу тела;

У_г/Б - объем распределения в конечной фазе (из расчета λ_ζβ); из расчета общей дозы в мг по фактическому весу тела, деленный на биодоступную часть; и соотношения накопления - ARC_max = соотношение значений C_max в день 85 и день 1;

ARauc = соотношение значений AUC_0-t в день 85 и день 1.

Концентрации ATB200 и TK-параметры были сходными между самцами и самками. Концентрации в плазме крови после 2-часовой IV инфузии ATB200 в дозе 50 мг/кг в комбинации с 25 мг/кг миглустата поддавались измерению в пределах периода до 12-26 ч после введения дозы. При уровне дозы 100 мг/кг (со 175 мг/кг миглустата или без него) концентрации ATB200 поддавались измерению в пределах периода до 26-168 ч после введения дозы. Токсикокинетические параметры для однократной дозы (день 1) показаны в табл. 8.

- 38 043083

Таблица 8

Группа	Обработка	Параметр	Единицы измерения	Анализ общего белка	Анализ активной формы
TTPTFFPK	VTSEGAG LQLQK	АТВ200
2	50 мг/кг АТВ200 + 25 мг/кг миглустата	tmax	ч.	2,00	2,00	2,06
Стах	мкг/мл	890	900	495
AUCo-t	ч.мкг/мл	3060	3080	1700
tl/2a	ч.	1,69	1,69	2,01
ΐ1/2β	ч.	1,70	1,71	1,92
CLT	л/ч.	0,058	0,058	0,106
vss	л	0,145	0,144	0,266
vz	л	0,144	0,143	0,296
3	100 мг/кг АТВ200 + 175 мг/кг миглустата	tmax	ч.	2,00	2,00	2,25
Стах	мкг/мл	1960	1980	1150
AUCo-t	ч.мкг/мл	10400	10400	6130
tl/2a	ч.	2,77	2,77	3,07
ΐ1/2β	ч.	2,72	2,70	2,54
CLT	л/ч.	0,034	0,034	0,057
Vss	л	0,140	0,140	0,231
vz	л	0,133	0,133	0,210
5	100 мг/кг АТВ200 в качестве монотерапи и	tmax	ч.	1,88	1,88	1,94
Стах	мкг/мл	1690	1670	1270
AUCo-t	ч.мкг/мл	5490	5410	3230
tl/2a	ч.	1,56	1,55	1,28
ΐ1/2β	ч.	ИД	6,29	1,71
CLT	л/ч.	0,105	0,105	0,140
Vss	л	0,171	0,149	0,168
vz	л	0,729	0,401	0,383

Токсикокинетические параметры для повторного введения доз (день 85) показаны в табл. 9.

Таблица 9

Группа	Обработка	Параметр	Единицы измерения	Анализ общего белка	Анализ активной формы
TTPTFFPK	VTSEGA GLQLQK	АТВ200
2	50 мг/кг АТВ200 + 25 мг/кг миглустата	tmax	ч.	2,00	2,00	2,13
Стах	мкг/мл	927	921	586
AUCo-t	ч.· мкг/мл	3700	3700	2390
tl/2a	ч.	1,98	1,95	2,35
ΐ1/2β	ч.	2,38	2,40	2,31
CLT	л/ч.	0,049	0,049	0,076
Vss	л	0,147	0,147	0,223
vz	л	0,168	0,168	0,254
3	100 мг/кг АТВ200 + 175 мг/кг миглустата	tmax	ч.	2,13	2,19	2,06
Стах	мкг/мл	2270	2270	1600
AUCo-t	Ч.· мкг/мл	13900	13800	9240
tl/2a	Ч.	3,62	3,72	3,34
ΐ1/2β	Ч.	4,83	4,83	2,90
CLT	л/ч.	0,027	0,027	0,040
Vss	л	0,140	0,140	0,186
vz	л	0,174	0,174	0,165

- 39 043083

5	100 мг/кг ATB200 в качестве монотерапии	tmax	4.	2,13	2,13	2,00
Стах	мкг/мл	2020	2010	1510
AUCo-t	ч.· мкг/мл	7830	7790	4890
tl/2a	ч.	1,93	1,88	1,44
ΐ1/2β	ч.	6,62	2,63	2,03
CLT	л/ч.	0,045	0,045	0,070
vss	л	0,143	0,127	0,159
vz	л	0,396	0,170	0,205

Время достижения максимальной концентрации ATB200 в плазме крови (t_max) составляло примерно 2 ч после введения дозы во всех трех группах дозирования. Концентрации ATB200 в плазме крови и TKпараметры в день 1 и день 85, измеренные в анализе общего белка ATB200, были стабильными для двух оцениваемых сигнатурных пептидов TTPTFFPK и VTSEGAGLQLQK.

Воздействие, измеренное по C_max и AUCo_-t, было относительно более слабым при измерении в анализе активной формы кислой α-глюкозидазы. Этого и следовало ожидать, поскольку в анализе общего белка измеряли концентрацию как активного, так и неактивного фермента, тогда как в анализе активной формы кислой α-глюкозидазы измеряли концентрацию только активного фермента. Воздействие ATB200 увеличивалось с возрастанием дозы при уровнях дозы от 50 до 100 мг/кг. Среднее значение начального t_1/2a в день 1 (объединенные данные от самцов и самок) по первым трем моментам времени после t_max находилось в диапазоне от 1,28 до 3,07 ч. Среднее значение конечного периода полувыведения (t_1/2p) в день 1 находилось в диапазоне от 1,70 до 11,1 ч (на более высокие значения t_1/2p у животных влияли концентрации, поддающиеся измерению в пределах периода до 168 ч после введения дозы). Сходный диапазон значений наблюдали после введения дозы в день 85. При повторном введении один раз в две недели наблюдали накопление в небольшом количестве или его отсутствие. Добавление 175 мг/кг миглустата к дозе 100 мг/кг ATB200, по-видимому, снижает клиренс ATB200 и увеличивает ее воздействие в плазме крови примерно в 2 раза в сравнении со 100 мг/кг ATB200 в качестве монотерапии.

Поскольку нежелательные изменения, связанные с тестируемым препаратом, не были идентифицированы, то уровень дозы, не вызывающей обнаруживаемых нежелательных эффектов (NOAEL), для ATB200, даваемой макакам-крабоедам один раз в две недели в течение 13 недель посредством 2-часовой инфузии при введении миглустата или без него, составлял 100 мг/кг/инфузия, что было наиболее высокой тестируемой дозировкой. При данном уровне дозы усредненные по полу средние значения AUC₀._t и C_max (общий белок) в день 85 составляли соответственно 7830 (TTPTFFPK) и 7790 (VTSEGAGLQLQK) ч.-мкг/мл и 2020 (TTPTFFPK) или 2010 (VTSEGAGLQLQK) мкг/мл для ATB200 в отдельности и соответственно 13900 (TTPTFFPK) или 13800 (VTSEGAGLQLQK) ч.-мкг/мл и 2270 (оба пептида) мкг/мл для комбинации со 175 мг/кг миглустата.

Токсикокинетические характеристики миглустата.

Токсикокинетические характеристики миглустата измеряли в образцах крови, собранных в пробирки с K2EDTA у животных в дни 1 и 85, в следующие моменты времени:

для групп 1, 2, 3 и 5: перед введением дозы (до введения миглустата); через 15 мин после введения миглустата; в 0 ч (до начала инфузии); через 0,5 ч после начала инфузии; через 1 час после начала инфузии; через 2 ч после начала инфузии; через 4 ч после начала инфузии; через 6 ч после начала инфузии; через 12 ч после начала инфузии; через 26 ч после начала инфузии; через 50 ч после начала инфузии и через 74 ч после начала инфузии; и для группы 4: перед введением дозы (до введения миглустата); через 15 мин после введения миглустата; через 30 мин после введения миглустата; через 1 час после введения миглустата; через 1,5 ч после введения миглустата; через 2,5 ч после введения миглустата; через 4,5 ч после введения миглустата; через 6,5 ч после введения миглустата; через 12,5 ч после введения миглустата; через 26,5 ч после введения миглустата; через 50,5 ч после введения миглустата и через 74,5 ч после введения миглустата.

Плазму крови получали путем центрифугирования при температуре от 2°C до 8°C, и аликвоты (примерно 0,2 мл) переносили в полипропиленовые флаконы и хранили в замороженном состоянии при температуре от -60°C до -86°C. Анализ концентрации миглустата проводили с помощью способа LCMS/MS, аналогичного описанному в отношении анализа концентрации дувоглустата в Richie Khanna, Allan C. Powe Jr., Yi Lun, Rebecca Soska, Jessie Feng, Rohini Dhulipala, Michelle Frascella, Anadina Garcia, Lee J. Pellegrino, Su Xu, Nastry Brignol, Matthew J. Toth, Hung V. Do, David J. Lockhart, Brandon A. Wustman, Kenneth J. Valenzano. The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid Alpha-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in Transgenic Mouse Model of Pompe Disease. PLOS ONE (1 July 2014) 9(7): e102092.

Анализ токсикокинетических (TK) данных для миглустата осуществляли с использованием аудированных/верифицированных наборов данных (концентрация и время) от животных из групп 2, 3 и 4 с помощью программного обеспечения WinNonlin Phoenix® версии 6.1 (Pharsight Corporation). Некомпартментный анализ индивидуальных данных о концентрации в плазме крови применяли для оценки TK- 40 043083 параметров. ТК-параметры миглустата оценивали с помощью линейно-логарифмического метода трапеций. В основе регрессии, применяемой для оценки λ_ζ, лежали равномерно взвешенные данные о концентрации. Рассчитывали следующие параметры:

R² скорр. - квадрат коэффициента корреляции для линейной регрессии, применяемой для оценки λ_ζ, скорректированный с учетом числа точек, используемых при оценке λ_ζ. Применяется в случае, когда число точек, используемых для определения конечной фазы профиля зависимости концентрации от времени, может варьироваться;

число точек λ_ζ - число точек для линейного регрессионного анализа, используемое для оценки λ_ζ;

λ_ζ - конечная константа скорости выведения;

ti/2 - конечный период полувыведения из расчета λ_ζ (0,693/λ_ζ);

t_max - время достижения максимальной концентрации аналита в плазме крови;

С_тах - максимальная наблюдаемая концентрация аналита в плазме крови;

AUCo-t - площадь под кривой зависимости концентрации в плазме крови от времени (AUC), измеренная от момента времени 0 (перед введением дозы) до момента времени определения последней поддающейся измерению концентрации;

AUCo-t» - AUC, экстраполированная до бесконечности времени;

AUC_ext - часть AUC, экстраполированной до бесконечности, представленная как % от общей AUC_O._X;

L_T/F - общий клиренс, деленный на биодоступную часть, из расчета общей дозы в мг по фактическому весу тела;

V_z/F - объем распределения в конечной фазе, деленный на биодоступную часть, из расчета общей дозы в мг по фактическому весу тела;

соотношения накопления - AR_Cmax = соотношение значений С_тах в день 85 и день 1; и AR_AUc ⁼ соотношение значений AUC₀-_t в день 85 и день 1.

Стабильный эффект пола в отношении ТК-параметров миглустата не наблюдался. Концентрации миглустата в плазме крови после назогастрального (NG) введения 25 мг/кг в комбинации с 50 мг/кг АТВ200 либо NG введения 175 мг/кг (со 100 мг/кг АТВ200 или без него) поддавались измерению в пределах периода 74,5 ч (последний момент времени измерения). Токсикокинетические параметры для однократной дозы (день 1) и для повторного введения доз (день 85) показаны в табл. 10.

Таблица 10

Группа	Обработка	Параметр	Единицы измерения	Анализ миглустата
День 1	День 85
2	50 мг/кг АТВ200 + 25 мг/кг миглустата	tmax	ч.	2,06	2,88
Стах	нг/мл	7430	7510
AUCo-t	ч. нг/мл	47300	49100
tl/2	ч.	7,44	8,23
CLT/F	л/ч.	1,92	1,99
Vz/F	л	20,5	23,3
3	100 мг/кг АТВ200 +	tmax	ч.	2,69	3,56
Стах	нг/мл	20400	22000
	175 мг/кг миглустата	AUCo-t	ч. нг/мл	182000	216000
tl/2	ч.	6,85	7,86
CLT/F	л/ч.	3,22	3,62
Vz/F	л	32,3	39,1
4	175 мг/кг миглустата в качестве монотерапии	tmax	ч.	3,00	4,13
Стах	нг/мл	16400	14700
AUCo-t	ч. нг/мл	173000	204000
tl/2	ч.	6,86	6,66
CLT/F	л/ч.	3,67	3,49
Vz/F	л	35,9	33,8

Значение t_max находилось в диапазоне от примерно 2 до 4 ч после введения дозы. Воздействие миглустата увеличивалось с возрастанием дозы при уровнях дозы от 25 до 175 мг/кг. Среднее значение t_1/2 (объединенные данные от самцов и самок) было стабильным в дни 1 и 85 и находилось в диапазоне от 6,66 до 8,23 ч. При повторном NG введении один раз в две недели наблюдали накопление в небольшом количестве или его отсутствие. Заметный эффект от совместного введения с АТВ200 в отношении общего воздействия миглустата (т.е. AUC₀._t) или ТК-параметров не наблюдался.

-41 043083

Поскольку нежелательные изменения, связанные с тестируемым препаратом, не были идентифицированы, то уровень дозы, не вызывающей обнаруживаемых нежелательных эффектов (NOAEL), для миглустата, даваемого макакам-крабоедам один раз в две недели в течение 13 недель назогастрально при введении ATB200 или без него, составлял 175 мг/кг/доза, что было наиболее высокой тестируемой дозировкой. При данном уровне дозы усредненные по полу средние значения AUC₀.t и Cmax в день 85 составляли соответственно 204000 ч.-нг/мл и 14700 нг/мл для миглустата в отдельности и соответственно 216000 ч.-нг/мл и 22000 нг/мл для комбинации со 100 мг/кг ATB200.

Пример 14. Протокол клинического исследования рекомбинантной кислой α-глюкозидазы (ATB200), вводимой в отдельности и вводимой совместно с миглустатом.

План исследования.

Это открытое исследование с фиксированной последовательностью приема препаратов с нарастающими дозами, впервые проводимое с участием человека, для оценки безопасности, переносимости и фармакокинетических параметров (PK) рекомбинантной кислой α-глюкозидазы (ATB200, лиофилизированный порошок, разведенный в стерильной воде для инъекций и разбавленный 0,9% хлоридом натрия для инъекций) для внутривенного (IV) введения в отдельности и при совместном введении с миглустатом для перорального применения (твердые желатиновые капсулы по 65 мг). Исследование проводится в 2 стадии. На стадии 1 оценивают безопасность, переносимость и PK после введения последовательных однократных нарастающих доз ATB200 каждые 2 недели в виде примерно 4-часовой внутривенной инфузии в течение 3 периодов введения доз при 5, 10 и 20 мг/кг. На стадии 2 оценивают безопасность, переносимость и PK после введения комбинаций однократных и многократных нарастающих доз: 3 дозы по 20 мг/кг ATB200 при совместном введении каждые 2 недели со 130 мг миглустата (две капсулы по 65 мг), принимаемого перорально за 1 ч до проведения примерно 4-часовой внутривенной инфузии ATB200, а затем 3 дозы по 20 мг/кг ATB200 при совместном введении с 260 мг миглустата (четыре капсулы по 65 мг), принимаемого перорально за 1 ч до проведения примерно 4-часовой внутривенной инфузии ATB200.

В стадию 1 включают двенадцать субъектов с болезнью Помпе (примерно 6 амбулаторных и 6 неамбулаторных), получающих заместительную ферментную терапию (ERT). Эти же субъекты продолжают исследование на стадии 2. До включения неамбулаторных субъектов включают по меньшей мере 4 амбулаторных субъектов и вводят им дозы. Субъекты (амбулаторные), получавшие ERT, определяются как субъекты, которые получали ERT в течение 2-6 лет до включения, способны пройти по меньшей мере 200 метров в тесте с шестиминутной ходьбой (6MWT) и имеют показатель FVC, составляющий 3080% от предсказанного нормального значения. Субъекты (неамбулаторные), получавшие ERT, определяются как субъекты, которые полностью прикованы к инвалидной коляске, неспособны ходить без посторонней помощи и получали ERT в течение > 2 лет до включения. Распределение в группы лечения показано в табл. 11.

Таблица 11

Число субъектов	Популяция: получавшие ERT	Стадия 1	Стадия 2
Период 1 Однокра тная доза	Период 2 Однокра тная доза	Период 3 Однокра тная доза	Период 4 Совместное введение многократных доз	Период 5 Совместное введение многократных доз
12	~6 амбулаторных ,~6 неамбулаторн ых	5 мг/кг АТВ200	10 мг/кг ATB200	20 мг/кг ATB200	20 мг/кг ATB200 + 130 мг миглустата	20 мг/кг ATB200 + 260 мг миглустата

ERT = заместительная ферментная терапия.

Субъектам необходимо воздерживаться от приема пищи в течение по меньшей мере 2 ч до введения миглустата для перорального применения и 2 ч после него. IV введение ATB200 следует начинать через 1 час после перорального введения миглустата.

Процедуры, предусмотренные исследованием.

Исследование состоит из скрининга, определения исходного уровня, стадии 1 (в 3 периодах, с фиксированной последовательностью приема препаратов, с однократной нарастающей дозой ATB200 в отдельности) и стадии 2 (в 2 периодах, с фиксированной последовательностью приема препаратов, с многократными дозами 20 мг/кг ATB200, вводимыми совместно с многократными нарастающими дозами миглустата).

Скрининг.

Все субъекты предоставляют информированное согласие и проходят осмотр для определения соответствия критериям отбора. Оценки для всех субъектов охватывают медицинский анамнез, в том числе предшествующие реакции, связанные с инфузией (IAR), и случаи падения в анамнезе; рассмотрение получаемых ранее и сопутствующих лекарственных препаратов и немедикаментозных видов терапии; показатели жизненно важных функций (частота сердечных сокращений [HR], частота дыхания [RR], кровя

- 42 043083 ное давление [BP] и температура); рост; вес; комплексный физикальный осмотр (PE); электрокардиограмму в 12 отведениях (ECG); клинико-лабораторные оценки безопасности (биохимический анализ сыворотки крови, общий анализ крови и общий анализ мочи); тест для диагностики беременности путем анализа мочи; оценку уровня тетрасахарида гексозы в образце мочи (Hex4) и генотипирование по GAA (для субъектов, для которых на момент скрининга не было возможности получить отчет о генотипировании по GAA). Также при необходимости получают образец крови для оценки иммуногенности путем поискового исследования (общие и нейтрализующие антитела, поисковое исследование уровней цитокинов/других биомаркеров активации иммунной системы, перекрестная реактивность с алглюкозидазойальфа и уровень иммуноглобулина E [IgE]). Субъекта, который соответствует всем критериям включения и ни одному из критериев исключения, переводят на стадию 1, описанную в табл. 11.

Определение исходного уровня.

Оценки безопасности для всех субъектов охватывают рассмотрение критериев отбора; медицинский анамнез, в том числе реакции, связанные с инфузией (IAR), и случаи падения в анамнезе, изучение нежелательных явлений (AE) и серьезных AE (SAE), рассмотрение получаемых ранее и сопутствующих лекарственных препаратов и немедикаментозных видов терапии; показатели жизненно важных функций (HR, RR, BP и температура); вес; беглый PE; ECG; показатель по шкале жизнедеятельности при болезни Помпе, построенной с помощью анализа Раша (R-PAct); показатель по Роттердамской шкале инвалидизации и показатель по шкале оценки выраженности утомляемости; клинико-лабораторные оценки безопасности (биохимический анализ сыворотки крови, общий анализ крови и общий анализ мочи); тест для диагностики беременности путем анализа мочи; оценки фармакодинамических параметров (PD) (Hex4 и креатининфосфокиназа [CPK]); оценки иммуногенности (общие и нейтрализующие антитела, перекрестная реактивность антител с алглюкозидазой-альфа, поисковое исследование уровней цитокинов и других биомаркеров активации иммунной системы, перекрестная реактивность с алглюкозидазой-альфа и при необходимости уровень IgE); тесты легочных функций (PFT); тесты двигательных функций и тесты мышечной силы для всех субъектов.

Стадия 1, периоды 1, 2 и 3.

Данная стадия охватывает следующее.

Безопасность: рассмотрение AE, в том числе серьезных нежелательных явлений (SAE) и IAR; рассмотрение сопутствующих лекарственных препаратов и немедикаментозных видов терапии; показатели жизненно важных функций (HR, RR, BP и температура); беглый PE; ECG; клинико-лабораторные оценки безопасности (биохимический анализ сыворотки крови, общий анализ крови и общий анализ мочи) и тест для диагностики беременности путем анализа мочи

PD: уровень Hex4 в моче и уровень CPK в сыворотке крови.

Иммунологические показатели: образцы крови для определения титров антител к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе (титров общих и нейтрализующих антител к рекомбинантной кислой αглюкозидазе и перекрестной реактивности антител с алглюкозидазой-альфа) и образцы крови для измерения уровней провоспалительных цитокинов и других биомаркеров активации иммунной системы. При необходимости также осуществляют измерения уровня IgE.

24-часовые фармакокинетические параметры (PK) при последовательном отборе образцов: в ходе периода 1 (визит 3, день 1), периода 2 (визит 4, день 15) и периода 3 (визит 5, день 29) отбор образцов крови для оценки уровней активной формы кислой α-глюкозидазы и концентраций общего белка кислой α-глюкозидазы в плазме крови проводят для всех субъектов.

Стадия 2, периоды 4 и 5.

Безопасность: рассмотрение AE, в том числе SAE и IAR; рассмотрение сопутствующих лекарственных препаратов и немедикаментозных видов терапии; показатели жизненно важных функций (HR, RR, BP и температура); вес; PE; ECG; клинико-лабораторные оценки безопасности (биохимический анализ сыворотки крови, общий анализ крови и общий анализ мочи) и тест для диагностики беременности путем анализа мочи

PD: уровень Hex4 в моче и уровень CPK в сыворотке крови.

Иммунологические показатели: образцы крови для определения титров антител к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе (титров общих и нейтрализующих антител к рекомбинантной кислой αглюкозидазе и перекрестной реактивности антител с алглюкозидазой-альфа) и образцы крови для измерения уровней провоспалительных цитокинов и других биомаркеров активации иммунной системы. При необходимости также осуществляют измерения уровня IgE.

24-часовые PK при последовательном отборе образцов: в ходе периода 4 (визит 6, день 43 и визит 8, день 71) и периода 5 (визит 9, день 85 и визит 11, день 113) отбор образцов крови для оценки уровней активной формы кислой α-глюкозидазы, концентраций общего белка кислой α-глюкозидазы и концентраций миглустата в плазме крови проводят для всех субъектов.

Завершение фазы исследования фармакокинетических параметров.

Безопасность: рассмотрение AE, в том числе SAE и IAR; рассмотрение сопутствующих лекарственных препаратов и немедикаментозных видов терапии; показатели жизненно важных функций (HR, RR,

- 43 043083

BP и температура); вес; PE; ECG; клинико-лабораторные оценки безопасности (биохимический анализ сыворотки крови, общий анализ крови и общий анализ мочи) и тест для диагностики беременности путем анализа мочи

PD: уровень Hex4 в моче и уровень CPK в сыворотке крови.

Иммунологические показатели: образцы крови для определения титров антител к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе (титров общих и нейтрализующих антител к рекомбинантной кислой αглюкозидазе и перекрестной реактивности антител с алглюкозидазой-альфа) и образцы крови для измерения уровней провоспалительных цитокинов и других биомаркеров активации иммунной системы. При необходимости также осуществляют измерения уровня IgE.

Субъекты, которые преждевременно прекращают участие в исследовании, приходят для визита досрочного прекращения и подвергаются всем оценкам, которые должны были быть осуществлены во время визита завершения исследования PK. Исследуемое лекарственное средство не вводят. Если любой из субъектов сигнальной когорты преждевременно прекращает участие в исследовании, то данного субъекта заменяет следующий амбулаторный субъект, включенный в исследование (например, если субъект 1 прекращает участие, то данного субъекта заменяет субъект 3 [амбулаторный] в качестве субъекта сигнальной когорты).

Субъектам, которые завершили данное исследование, и/или другим субъектам, которые соответствуют установленным требованиям, предоставляется возможность участия в долгосрочном расширенном исследовании, и у них продолжают оценивать безопасность и переносимость ATB200 при совместном введении с миглустатом. Кроме того, в расширенном исследовании осуществляют функциональные оценки, касающиеся болезни Помпе, через равные интервалы.

Мониторинг безопасности.

Мониторинг безопасности осуществляется медицинским наблюдателем и исследователями на постоянной основе, а также Комитетом по мониторингу безопасности (SSC) на регулярной основе.

Сигнальное введение доз.

Первые 2 амбулаторных субъекта в данном исследовании являются субъектами сигнальной когорты данного исследования и являются первыми 2 субъектами, которым вводят дозу в каждом периоде исследования (периоды 1-5). В случае, если субъект сигнальной когорты преждевременно прекращает участие в исследовании, то его/ее заменяет другой амбулаторный субъект. Примечание: до того, как можно будет вводить дозу каким-либо неамбулаторным субъектам, по меньшей мере 4 амбулаторным субъектам вводят дозу 5 мг/кг ATB200.

На стадии 1 (периоды 1, 2 и 3) субъектам вводят однократные нарастающие дозы ATB200 (5 мг/кг [период 1], 10 мг/кг [период 2] и 20 мг/кг [период 3]).

После введения доз 2 субъектам сигнальной когорты в каждом периоде исследования на стадии 1 оценка доступных данных о безопасности (PE, показатели жизненно важных функций, AE, инфузионные реакции, ECG и доступные данные осуществляемых на местном уровне лабораторных тестов) осуществляется в пределах периода 24-48 ч медицинским наблюдателем и исследователями. SSC собирается для проведения формальной экспертизы безопасности, когда доступны данные о безопасности из центральной лаборатории для обоих субъектов сигнальной когорты при каждом уровне дозы. Если SSC определяет, что проблемы безопасности, которые не позволяют осуществлять введение доз при уровне дозы, соответствующем данному периоду, отсутствуют, то включают 10 дополнительных субъектов и вводят им дозы. SSC также собирается для проведения экспертизы безопасности, когда доступны данные о безопасности (в том числе данные о безопасности из центральной лаборатории) для всех субъектов при всех 3 уровнях дозы на стадии 1.

На стадии 2 (периоды 4 и 5) вводят дозы 2 субъектам сигнальной когорты, и безопасность оценивают после введения первой дозы, как и для каждого периода на стадии 1. Если SSC определяет, что проблемы безопасности, которые не позволяют осуществлять дополнительное введение дозы 20 мг/кг ATB200 при совместном введении со 130 мг миглустата (период 4) или 20 мг/кг ATB200 при совместном введении с 260 мг миглустата (период 5), отсутствуют, то 10 дополнительных субъектов получают 3 дозы один раз в две недели при уровне дозы, соответствующем данному периоду. SSC повторно собирается, когда доступны все данные о безопасности (в том числе данные о безопасности из центральной лаборатории) для всех субъектов на момент завершения стадии 2. SSC также собирается специально в случае наличия SAE или идентифицированной проблемы безопасности.

SSC может рекомендовать любое из следующих заключений:

продолжить исследование без изменений;

продолжить исследование с внесением изменений (поправок);

временно приостановить введение доз;

окончательно прекратить введение доз.

Если, по мнению SSC, у субъектов сигнальной группы отсутствуют AE или проблемы безопасности, которые могут не позволять продолжать введение доз в рамках исследования, то введение доз будут продолжать для всех остальных субъектов при данном уровне дозы. Будет продолжать осуществляться тщательный мониторинг безопасности для субъектов медицинским наблюдателем и исследователями,

- 44 043083 проводящими данное исследование, на постоянной основе и SSC через равные интервалы.

Число субъектов (планируемое).

В стадию 1 включают двенадцать взрослых субъектов с болезнью Помпе (примерно 6 амбулаторных и 6 неамбулаторных), получавших ERT. Эти же субъекты продолжают исследование на стадии 2.

Постановка диагноза и критерии отбора.

Во время скринингового визита взрослых субъектов с болезнью Помпе, получавших ERT, оценивают с применением критериев отбора, изложенных ниже. Каждый субъект должен соответствовать всем критериям включения и ни одному из критериев исключения. Отказ от проверки на соответствие критериям включения/исключения не допускается.

Критерии включения.

Субъекты, получавшие ERT (амбулаторные).

1. Субъекты мужского и женского пола возрастом от 18 до 65 лет включительно.

2. Субъект должен предоставить подписанное информированное согласие до проведения какихлибо процедур, связанных с исследованием.

3. Субъекты репродуктивного возраста должны дать согласие на использование принятых в медицине способов контрацепции в ходе исследования и в течение 30 дней после последнего совместного введения ATB200 + миглустата.

4. У субъекта поставлен диагноз болезни Помпе на основании документально подтвержденного дефицита ферментативной активности кислой α-глюкозидазы или согласно результатам генотипирования GAA.

5. Субъект получал ERT с применением алглюкозидазы-альфа в течение предыдущих 2-6 лет.

6. Субъект в настоящее время получает алглюкозидазу-альфа с частотой один раз в две недели.

7. Субъект получал и завершил две последние инфузии без нежелательных явлений, связанных с приемом лекарственного средства, которые приводят к временному прекращению введения доз.

8. Субъект должен быть способен пройти 200-500 метров в 6MWT; и

9. Форсированная жизненная емкость легких (FVC) в положении стоя должна составлять от 30% до 80% от предсказанного нормального значения.

Субъекты, получавшие ERT (неамбулаторные).

10. Субъекты мужского и женского пола возрастом от 18 до 65 лет включительно.

11. Субъект должен предоставить подписанное информированное согласие до проведения какихлибо процедур, связанных с исследованием.

12. Субъекты репродуктивного возраста должны дать согласие на использование принятых в медицине способов контрацепции в ходе исследования и в течение 30 дней после последнего совместного введения ATB200 + миглустата.

13. У субъекта поставлен диагноз болезни Помпе на основании документально подтвержденного дефицита ферментативной активности кислой α-глюкозидазы или согласно результатам генотипирования GAA.

14. Субъект получал ERT с применением алглюкозидазы-альфа в течение > 2 лет.

15. Субъект в настоящее время получает алглюкозидазу-альфа с частотой один раз в две недели.

16. Субъект получал и завершил две последние инфузии без нежелательных явлений, связанных с приемом лекарственного средства, которые приводят к временному прекращению введения доз; и

17. Субъект должен быть полностью прикован к инвалидной коляске и неспособен ходить без посторонней помощи.

Критерии исключения.

Субъекты, получавшие ERT (амбулаторные).

1. Субъект получал какое-либо исследуемое средство терапии болезни Помпе, отличное от алглюкозидазы-альфа, в пределах периода 30 дней до визита исходного уровня или согласно ожиданиям будет получать его в ходе исследования.

2. Субъект получал лечение с применением запрещенных лекарственных препаратов (миглитола (например, Glyset®); миглустата (например, Zavesca®); акарбозы (например, Precose®, Glucobay®); воглибозы (например, Volix®, Vocarb® и Volibo®); альбутерола и кленбутерола или любого исследуемого/экспериментального лекарственного средства) в пределах периода 30 дней до визита исходного уровня.

3. Для женщин - субъект на момент скрининга находится в состоянии беременности или осуществляет грудное вскармливание.

4. Субъект, будь то мужчина или женщина, планирует зачатие ребенка в ходе исследования.

5. Субъекту необходима инвазивная вспомогательная вентиляция легких.

6. Субъект использует неинвазивную вспомогательную вентиляцию легких > 6 ч в сутки в состоянии бодрствования.

7. У субъекта имеется медицинское или любое другое смягчающее состояние или обстоятельство, которое по мнению исследователя может представлять чрезмерный риск с точки зрения безопасности

- 45 043083 для субъекта или ставит под сомнение его/ее способность соответствовать требованиям протокола.

8. У субъекта имеются случаи анафилактической реакции на алглюкозидазу-альфа в анамнезе.

9. У субъекта имеются случаи высоких устойчивых титров антител к рекомбинантной кислой αглюкозидазе в анамнезе.

10. У субъекта имеются случаи аллергии или чувствительности к миглустату или другим иминосахарам в анамнезе.

11. У субъекта имеются известные случаи аутоиммунного заболевания, в том числе волчанки, аутоиммунного тиреоидита, склеродермии или ревматоидного артрита, в анамнезе; и

12. У субъекта имеются известные случаи бронхиальной астмы в анамнезе. Субъекты, получавшие ERT (неамбулаторные)

13. Субъект получал какое-либо исследуемое средство терапии болезни Помпе, отличное от алглюкозидазы-альфа, в пределах периода 30 дней до визита исходного уровня или согласно ожиданиям будет получать его в ходе исследования.

14. Субъект получал лечение с применением запрещенных лекарственных препаратов (миглитола (например, Glyset®); миглустата (например, Zavesca®); акарбозы (например, Precose®, Glucobay®); воглибозы (например, Volix®, Vocarb® и Volibo®); альбутерола и кленбутерола или любого исследуемого/экспериментального лекарственного средства) в пределах периода 30 дней до визита исходного уровня.

15. Для женщин - субъект на момент скрининга находится в состоянии беременности или осуществляет грудное вскармливание.

16. Субъект, будь то мужчина или женщина, планирует зачатие ребенка в ходе исследования.

17. У субъекта имеется медицинское или любое другое смягчающее состояние или обстоятельство, которое по мнению исследователя может представлять чрезмерный риск с точки зрения безопасности для субъекта или ставит под сомнение его/ее способность соответствовать требованиям протокола.

18. У субъекта имеются случаи анафилактической реакции на алглюкозидазу-альфа в анамнезе.

19. У субъекта имеются случаи высоких устойчивых титров антител к рекомбинантной кислой αглюкозидазе в анамнезе.

20. У субъекта имеются случаи аллергии или чувствительности к миглустату или другим иминосахарам в анамнезе.

21. У субъекта имеются известные случаи аутоиммунного заболевания, в том числе волчанки, аутоиммунного тиреоидита, склеродермии или ревматоидного артрита, в анамнезе; и

22. У субъекта имеются известные случаи бронхиальной астмы в анамнезе. Исследуемый препарат, дозировка и способ введения.

Стадия 1 (состоит из 3 периодов введения доз с интервалом в 2 недели):

период 1: IV инфузия однократной дозы 5 мг/кг ATB200;

период 2: IV инфузия однократной дозы 10 мг/кг ATB200 всем субъектам, которые завершили период 1; и период 3: IV инфузия однократной дозы 20 мг/кг ATB200 всем субъектам, которые завершили период 2.

Стадия 2 (состоит из 2 периодов введения доз, каждый из которых включает введение 3 доз исследуемого лекарственного средства, с интервалом в 2 недели):

период 4: 130 мг миглустата вводят перорально за 1 ч до IV инфузии однократной дозы 20 мг/кг ATB200 всем субъектам, которые завершили период 3 (повторяют каждые 2 недели с осуществлением в общей сложности 3 введений); и период 5: 260 мг миглустата вводят перорально за 1 ч до IV инфузии однократной дозы 20 мг/кг ATB200 всем субъектам, получавшим ERT, которые завершили период 4 (повторяют каждые 2 недели с осуществлением в общей сложности 3 введений).

Примечание: субъектам необходимо воздерживаться от приема пищи в течение по меньшей мере 2 ч до введения миглустата для перорального применения и 2 ч после него.

Общая продолжительность исследования: до 22 недель (до 4 недель скринингового периода с последующими примерно 18 неделями лечения в рамках исследования [стадии 1 и 2]).

Продолжительность наблюдения PK при однократной дозе (стадия 1, периоды 1, 2 и 3): 6 недель.

Продолжительность наблюдения PK при многократных дозах (стадия 2, периоды 4 и 5): 12 недель.

Продолжительность наблюдения безопасности, переносимости и иммуногенности (периоды 1, 2, 3, 4 и 5): 18 недель.

Критерии оценивания.

Основные.

Оценки безопасности:

PE;

показатели жизненно важных функций, в том числе температура тела, RR, HR и BP;

AE, в том числе IAR;

- 46 043083

ECG в 12 отведениях;

клинико-лабораторные оценки безопасности: биохимический анализ сыворотки крови, общий анализ крови и общий анализ мочи.

PK ATB200 и миглустата в плазме крови:

PK-параметры, представляющие собой уровни активной формы кислой α-глюкозидазы и концентрации общего белка кислой α-глюкозидазы в плазме крови: максимальная наблюдаемая концентрация в плазме крови (C_max), время до достижения максимальной наблюдаемой концентрации в плазме крови (t_max), площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства в плазме крови от момента времени 0 до момента времени определения последней поддающейся измерению концентрации (AUC₀._t), площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства в плазме крови от момента времени 0, экстраполированная до бесконечности (AUC₀.„), период полувыведения (t_1/2) и общий клиренс после IV введения (CLT);

соотношения C_max и AUC₀.„ активной формы кислой α-глюкозидазы и общего белка кислой αглюкозидазы в плазме крови для всех режимов введения доз;

PK-параметры миглустата в плазме крови: C_max, t_max, AUC₀__t, AUC₀.„ и t_1/2, кажущийся системный клиренс лекарственного средства после перорального введения (CLT/F) и объем распределения во время конечной фазы после перорального введения (Vz/F) для каждого уровня дозы;

относительные показатели C_max и AUC₀.„ миглустата в плазме крови для каждого уровня дозы.

Функциональные оценки (осуществляемые на исходном уровне).

Для амбулаторных субъектов:

тесты двигательных функций:

тест с шестиминутной ходьбой (6MWT), тест с 10-метровой ходьбой, шкала оценки походки, подъема по лестнице, маневра Гауэра и вставания со стула, тест встань и иди с отсчетом времени (TUG);

тест мышечной силы (с использованием критериев медицинских исследований [MRC] и переносного динамометра) как для верхних, так и для нижних конечностей;

PFT (FVC, MIP, MEP и SNIP).

Для неамбулаторных субъектов:

тест мышечной силы - только для верхних конечностей:

использование MRC и переносного динамометра осуществляется только для верхних конечностей;

тесты легочных функций (PFT) (форсированная жизненная емкость легких [FVC], максимальное давление при вдохе [MIP], максимальное давление при выдохе [MEP] и назальное давление при резком вдохе через нос [SNIP]).

Исходы, сообщаемые пациентами (осуществляется на исходном уровне) показатель по шкале оценки выраженности утомляемости;

показатель по Роттердамской шкале инвалидизации;

показатель по шкале жизнедеятельности при болезни Помпе, построенной с помощью анализа Раша (R-PAct).

Данные поисковых исследований титры антител к ATB200 (общих и нейтрализующих);

перекрестная реактивность антител к рекомбинантной кислой α-глюкозидазе с алглюкозидазойальфа;

уровень провоспалительных цитокинов и других биомаркеров активации иммунной системы;

PD-маркеры (Hex4 и CPK).

Способы анализа.

Статистические способы.

Для PK-параметров представлены данные описательной статистики. Для всех переменных, которые не являются PK-параметрами, представлены сводные статистические данные. Оценка соотношений воздействий активной формы кислой α-глюкозидазы и общего белка кислой α-глюкозидазы (C_max, AUC₀-_t и AUC₀._X) в отношении пропорциональности дозе при 5, 10 и 20 мг/кг ATB200 в отдельности. Дисперсионный анализ (ANOVA) соотношений воздействий активной формы кислой α-глюкозидазы и общего белка кислой α-глюкозидазы (C_max, AUC₀-_t и AUC₀.„) для 20 мг/кг ATB200 в отдельности в сравнении с 20 мг/кг ATB200 + 130 мг миглустата и в сравнении с 20 мг/кг ATB200 + 260 мг миглустата в каждой популяции и в целом. ANOVA соотношений воздействий активной формы кислой α-глюкозидазы и общего белка кислой α-глюкозидазы (C_max, AUC₀-_t и AUC₀.„) между амбулаторными и неамбулаторными субъектами для 20 мг/кг ATB200 + 130 мг миглустата и 20 мг/кг ATB200 + 260 мг миглустата. Оценка относительных показателей воздействия (C_max, AUC₀-_t и AUC₀.„) в отношении пропорциональности дозе между 130 мг и 260 мг миглустата в каждой популяции субъектов и в целом. Согласно результатам изучения иммуногенности оценивают ее эффект в отношении PK, PD и безопасности.

Промежуточные анализы.

- 47 043083

Промежуточный анализ осуществляют, когда по меньшей мере 50% (n=6) субъектов завершат стадию 2 исследования. В рамках исследования можно осуществлять не более 2 дополнительных промежуточных анализов.

Предварительные результаты изучения PK.

Сводная информация в отношении PK активной формы GAA и общего белка GAA для субъектов соответственно показана в табл. 12 и 13.

В табл. 12-15 и на фиг. 24-26 измерения для однократной дозы (SD) проводили после одного введения миглустата и ATB200, а измерения для многократных доз (MD) проводили после третьего введения миглустата и ATB200 с периодичностью один раз в две недели.

Таблица 12

Доза	at/	βν1	t ь Imax	Стах	AUC0-tc	АиС0-ю с	AUCo-®/Dc	CLT a	vss a
мг/кг АТВ200 + мг миглустата	(ч.)	(ч.)	(ч.)	(мкг/ мл)	(ч/мк г/мл)	(ч.*мкг/ мл)	(ч*мкг/мл /мг)	(л/ч.)	(л)
5	1,06 (9,7)	3,15 (5,3)	3,5 (3,5 4,0)	53,7 (20,4)	193 (22,5)	193 (22,5)	0,444 (15,4)	2,27 (15,9)	5,61 (21,2)
10	1,26 (22,2)	2,73 (18,2)	3,75 (3,5 -4,5)	115 (28,3)	447 (30,7)	448 (30,6)	0,523 (17,5)	1,93 (15,0)	5,39 (21,2)
20	1,36 (25,7)	2,16 (Ю,2)	4,0 (3,5 4,0)	256 (30,4)	1020 (37,4)	1021 (37,4)	0,596 (30,1)	1,76 (37,5)	5,01 (28,0)
20 + 130, однократная доза	1,84 (16,0)	2,49 (9,9)	4,5 (4,0 5,0)	234 (36,0)	1209 (29,9)	1211 (29,9)	0,707 (23,7)	1,45 (25,8)	5,32 (24,8)
20 + 130, многократные дозы	1,90 (7,5)	2,53 (11,9)	4,0 (3,5 5,0)	230 (20,2)	1180 (19,1)	1183 (19,0)	0,690 (15,1)	1,46 (14,4)	5,55 (14,2)
20 + 260, однократная доза	2,39 (И,5)	2,70 (Ю,8)	4,0 (4,0 4,5)	228 (26,0)	1251 (17,4)	1256 (17,2)	0,733 (15,8)	1,38 (17,3)	5,71 (20,2)

^a Среднее арифметическое значение (CV, %). ^b Медианное значение (мин.-макс.).

^c Среднее геометрическое значение (CV, %). Таблица 13

Доза	ati/2 a		t ь 1m ах	Стах	AUCot c	AUCo.,c	AUCo-®/Dc	CLT a	vss a
мг/кг АТВ200 + мг миглустата	(ч.)	(ч.)	(ч.)	(мкг/ мл)	(ч.*мк г/мл)	(ч.*мкг/ мл)	(ч* мкг/мл /мг)	(л/ч.)	(л)
5	1,02 (3,0)	1,83 (13,8)	4,0 (3,5 -4,0)	61,1 (20,0)	215 (17,1)	218 (17,0)	0,511 (7,3)	1,97 (7,7)	4,57 (6,8)
10	1,36 (5,3)	1,99 (56,9)	4,0	143 (19,5)	589 (16,6)	594 (16,6)	0,694 (12,3)	1,45 (13,4)	3,90 (14,5)
20	1,65 (12,3)	2,62 (18,5)	4,0	338 (ИД)	1547 (12,1)	1549 (12,1)	0,904 (12,8)	1,11 (14,4)	3,49 (И,6)
20+ 130, однократная доза	1,79 (Ю,7)	2,63 (6,6)	4,0	322 (18,2)	1676 (14,9)	1680 (14,8)	0,980 (15,0)	1,03 (17,6)	3,78 (12,2)
20+ 130, многократные дозы	1,99 (Ю,2)	2,47 (4,2)	4,0 (3,5 -5,0)	355 (16,5)	1800 (12,7)	1804 (12,7)	1,05 (12,9)	0,96 (13,7)	3,70 (Ю,8)
20 + 260, однократная доза	2,35 (13,9)	2,73 (Ю,4)	4,0	350 (14,2)	1945 (15,1)	1953 (15,0)	1,14(15,8)	0,89 (15,7)	3,63 (16,3)

^a Среднее арифметическое значение (CV, %). ^b Медианное значение (мин.-макс.).

^c Среднее геометрическое значение (CV, %).

На фиг. 24A показаны профили зависимости концентрации от времени, демонстрирующие среднее воздействие активной формы GAA в плазме крови после введения доз 5 мг/кг, 10 мг/кг и 20 мг/кг ATB200. На фиг. 24B также представлены профили зависимости концентрации от времени, демонстрирующие среднее воздействие активной формы GAA в плазме крови после введения доз 5 мг/кг, 10 мг/кг и 20 мг/кг ATB200, но при этом активная форма GAA в плазме крови отображена на логарифмической шкале. Как можно видеть из фиг 24A-24B и табл. 12, ATB200 демонстрировала незначительно сверхпропорционально зависимые от дозы воздействия активной формы GAA в плазме крови.

На фиг. 24С показаны профили зависимости концентрации от времени, демонстрирующие среднее воздействие активной формы GAA в плазме крови после введения доз 20 мг/кг ATB200 в отдельности, а также 20 мг/кг ATB200 и 130 или 260 мг миглустата. На фиг. 24D также представлено среднее воздействие активной формы GAA в плазме крови после введения доз 20 мг/кг ATB200 в отдельности, со 130 мг миглустата или 260 мг миглустата, но при этом активная форма GAA в плазме крови отображена на логарифмической шкале.

На фиг. 25A показаны профили зависимости концентрации от времени, демонстрирующие среднее воздействие общего белка GAA в плазме крови после введения доз 5 мг/кг, 10 мг/кг и 20 мг/кг ATB200. На фиг. 25B также представлены профили зависимости концентрации от времени, демонстрирующие среднее воздействие общего белка GAA в плазме крови после введения доз 5 мг/кг, 10 мг/кг и 20 мг/кг ATB200, но при этом общий белок GAA в плазме крови отображен на логарифмической шкале. Как

- 48 043083 можно видеть из фиг. 25A-25B и табл. 13, ATB200 демонстрировала незначительно сверхпропорционально зависимые от дозы воздействия общего белка GAA в плазме крови.

На фиг. 25C показаны профили зависимости концентрации от времени, демонстрирующие среднее воздействие общего белка GAA в плазме крови после введения доз 20 мг/кг ATB200 в отдельности, 20 мг/кг ATB200 и 130 мг миглустата и 20 мг/кг ATB200 и 260 мг миглустата. На фиг. 25D также представлено среднее воздействие общего белка GAA в плазме крови после введения доз 20 мг/кг ATB200 в отдельности, со 130 мг миглустата или 260 мг миглустата, но при этом общий белок GAA в плазме крови отображен на логарифмической шкале.

Как показано в табл. 13, при совместном введении с миглустатом период полувыведения общего белка GAA из плазмы крови увеличивался примерно на 30% в сравнении с введением ATB200 в отдельности. Объем распределения находился в диапазоне от 3,5 до 5,7 л для всех видов обработки, что позволяет предположить, что гликозилирование ATB200 обеспечивает возможность эффективного распределения ATB200 в тканях.

Сводная информация о PK миглустата показана в табл. 14.

Таблица 14

Доза	РЬ/Л	t ь imax	Стах	СщахТВ wc	AUC0-t c	AUCo-ooC	AUCo^/BW6	Vz/Fa	CL/F а
мг	(ч.)	(ч.)	(мкг/мл)	(нг/мл/ кг)	(ч/мкг /мл)	(ч.*мкг /мл)	(ч.*нг/мл/кг)	(л)	(л/ч.)
130, однократная доза	4,5 (37,0)	2,75 (1,5 -3,5)	1647 (22,1)	19,2 (23,9)	12620 (13,1)	13157 (13Д)	154 (29,7)	65,4 (41,9)	9,93 (13,7)
130, многократная доза	5,6 (12,5)	3,0(1,5 3,5)	1393 (36,8)	16,3 (36,4)	11477 (18,0)	12181 (16,4)	142 (26,9)	88,1 (26,1)	10,8 (16,2)
260, однократная доза	5,5 (25,9)	2,75 (1,0 -5,0)	3552 (30,2)	41,5 (33,8)	26631 (25,1)	28050 (22,9)	325 (30,8)	79,2 (55,3)	9,51 (27,6)

^a Среднее арифметическое значение (CV, %). ^b Медианное значение (мин.-макс.).

^c Среднее геометрическое значение (CV, %).

На фиг. 26 показан профиль зависимости концентрации миглустата в плазме крови от времени у субъектов-людей после введения дозы 130 мг или 260 мг миглустата.

Как можно видеть из табл. 14 и фиг. 26, миглустат, вводимый перорально за 1 ч до проведения инфузии ATB200, достигал пиковых концентраций в плазме крови через 2 ч после проведения инфузии и демонстрировал дозопропорциональную зависимость кинетических параметров.

Анализ осуществляли в отношении разных частей кривых концентрации активной формы и общего белка GAA в плазме крови для определения частичных AUC. В табл. 15 представлена сводная информация о частичных AUC 0-t_max, t_max-6 ч, t_max-10 ч, t_max-12 ч и t_max-24 ч для активной формы и общего белка GAA.

Таблица 15

		Среднее (нг*ч./м	; арифметическое л) в период после вве/1	значение (СИНЯ доз Р	; pAUC 1=4)
Аналит	Обработка	0“tmax	tmax-б Ч.	tmax-ΐθ Ч.	tmax-12 ч.	tmax-24 Ч.
Активная форма GAA	20 мг/кг	428	382	606	630	654
Активная форма GAA	20 мг/кг + 130 мг, однократная доза	456	415	722	770	832
Активная	20 мг/кг + 130 мг,
форма GAA	многократные дозы	423	392	689	737	796
Активная форма GAA	20 мг/кг + 260 мг, однократная доза	423	536	924	996	1094
Общий белок	20 мг/кг	621	603	943	981	1040
Общий белок	20 мг/кг + 130 мг, однократная доза	565	614	1041	1106	1189
Общий белок	20 мг/кг + 130 мг, многократные дозы	630	612	1079	1154	1244
Общий белок	20 мг/кг + 260 мг, однократная доза	679	824	1411	1518	1665

Как можно видеть из табл. 15, средние процентные значения увеличения воздействия активной формы GAA в пределах pAUCt_{max-24 ч}. для 20 мг/кг с миглустатом в сравнении с 20 мг/кг ATB200 в отдельности составляли 21,4%, 17,8%, 40,2% для 130 мг SD, 130 мг MD и 260 мг SD соответственно.

- 49 043083

Подобным образом, средние процентные значения увеличения воздействия общего белка GAA в пределах pAUCt_{max-24 ч} для 20 мг/кг с миглустатом в сравнении с 20 мг/кг ATB200 в отдельности составляли 12,5%, 16,4%, 37,5% для 130 мг SD, 130 мг MD и 260 мг SD соответственно.

Таким образом, анализ частичной AUC демонстрирует, что при совместном введении миглустата частичная AUC ATB200 в конечной фазе (t_{max-24 ч}) значительно увеличивается примерно на 15% для доз 130 мг миглустата и примерно на 40% для 260 мг миглустата.

Предварительные результаты изучения уровней биомаркеров.

У пациентов-людей, которых переводили с Lumizyme® на ATB200, осуществляли мониторинг уровней аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и креатинфосфокиназы (CPK). Пациенты получали нарастающие дозы ATB200 (5, 10 и 20 мг/кг) с последующим совместным введением ATB200 (20 мг/кг) и миглустата (130 и 260 мг). Высокие уровни фермента CPK могут указывать на повреждение или напряжение мышечной ткани, сердца или головного мозга. Повышенные уровни ALT и AST являются соответственно маркерами поражения печени и мышц вследствие болезни Помпе. Предварительный анализ уровней ALT, AST и CPK показан на фиг. 38-41.

Как можно видеть из фиг. 38-41, два пациента демонстрировали начальную тенденцию к улучшению уровней всех трех биомаркеров, и у двух пациентов они оставались стабильными. У одного пациента наблюдалось снижение уровней CPK, AST и ALT соответственно на 44%, 28% и 34%. У другого пациента наблюдалось снижение уровней CPK, AST и ALT соответственно на 31%, 22% и 11%.

До сих пор серьезные нежелательные явления (SAE) отсутствовали. AE, как правило, были легкими и временными. До данного момента реакции, связанные с инфузией, после проведения 100+ инфузий у всех включенных пациентов отсутствовали. Все пациенты имели антитела к rhGAA на исходном уровне, который, как правило, оставался стабильным. Уровни цитокинов в ходе инфузий оставались низкими и стабильными.

Пример 15. Уровни GAA и LAMP1 в фибробластах дикого типа и фибробластах при болезни Помпе.

Для выявления уровней GAA и LAMP1 в фибробластах дикого типа и фибробластах при болезни Помпе с распространенной сплайсинговой мутацией использовали иммунофлуоресцентную микроскопию. Как показано на фиг. 27, GAA находится в отдельных лизосомных компартментах в фибробластах дикого типа. На фиг. 27 также показаны обширный сигнал от GAA в фибробластах при болезни Помпе и то, что сигналы как от GAA, так и от LAMP1 в фибробластах при болезни Помпе, по-видимому, локализованы в ER и аппарате Гольджи, а не в дистальных лизосомах. Это свидетельствует об изменении транспорта белка GAA в фибробластах при болезни Помпе.

Пример 16. Улучшение клеточной дисфункции и мышечной функции у мышей с нокаутом Gaa.

Было показано, что нарушение катаболизма гликогена в лизосомах вследствие дефицита GAA вызывает существенную клеточную дисфункцию, о чем свидетельствует выраженная, устойчивая аутофагия, а также пролиферация и накопление мембраносвязанных внутриклеточных компартментов, заполненных накопленным гликогеном (N. Raben et al.). Иммуногистологические данные авторов настоящего изобретения указывают на то, что для многих белков, в том числе нескольких ключевых белков, крайне необходимых для стабильности мембран мышечных клеток, таких как дистрофии, α- и β-дистрогликаны, различные саркогликаны и другие, которые составляют дистрофин-ассоциированный гликопротеиновый комплекс, а также белков, участвующих в восстановлении мышц, таких как дисферлин, транспорт белков значительно изменяется. Для этих ключевых мышечных белков необходим надлежащий транспорт белка в мембрану мышечной клетки, где они функционируют. Как показано на фиг. 28, иммуногистологические данные авторов настоящего изобретения свидетельствуют о том, что значительная доля этих ключевых мышечных белков характеризуется внутриклеточной локализацией в мышцах мышей с нокаутом (KO) Gaa в модели болезни Помпе. Эти данные позволяют предположить, что неправильный транспорт этих ключевых мышечных белков может индуцировать псевдомышечную дистрофию, которая в конечном счете приводит к мышечной слабости и негодному состоянию мышц.

Алглюкозидазу-альфа (Myozyme®) и ATB200 с 10 мг/кг миглустата или без него оценивали у мышей с KO Gaa при эквивалентной дозе средства для ERT (20 мг/кг) по схеме введения доз один раз в две недели. После 2 введений алглюкозидаза-альфа незначительно снижала уровень гликогена, накопленного в лизосомах скелетных мышц (фиг. 32A-32C), и почти не оказывала эффекты в отношении снижения аутофагии (фиг. 30A-30B) или пролиферации лизосом (фиг. 29A-29B) в сравнении с мышами, обработанными инертной средой. В отличие от этого, в случае применения комбинации ATB200/миглустат в идентичных условиях наблюдали существенно лучшее очищение от гликогена в лизосомах (фиг. 32A-32D). Комбинация ATB200/миглустат также, по-видимому, улучшает общее физиологическое состояние мышц, о чем свидетельствуют сниженные уровни LC3 II (фиг. 30A-30B), общепризнанного биомаркера аутофагии, и очищение от накопленных внутриклеточных везикул, окрашенных на LAMP1 (фиг. 29A29B), известный резидентный интегральный мембранный белок лизосом, и дисферлин (фиг. 31A-31B), известный белок клеточной поверхности, участвующий в восстановлении мышц. Кроме того, комбинация ATB200/миглустат значительно улучшала мышечную архитектуру, которая мало чем отличалась от

- 50 043083 мышечных волокон у мышей дикого типа.

Также на фиг. 29-32 показано, что две разные партии ATB200 (полученные в производственных процессах более раннего и более позднего поколения) давали сопоставимые результаты. На фиг. 32A32D * указывает на статистически значимый результат в сравнении с Myozyme® в отдельности.

Пример 17. Мышечная функция у мышей с нокаутом Gaa.

В более долгосрочных исследованиях с 12 введениями один раз в две недели комбинация 20 мг/кг ATB200 с 10 мг/кг миглустата постепенно увеличивала функциональную мышечную силу у мышей с KO Gaa относительно исходного уровня, что измеряли с помощью как тестов силы захвата, так и тестов вис на проволоке (фиг. 33A-33B). У мышей, обработанных алглюкозидазой-альфа (Lumizyme®), которые получали аналогичную дозу средства для ERT (20 мг/кг), наблюдали снижение показателей в идентичных условиях на протяжении большей части исследования (фиг. 33A-33B). Как и в случае более краткосрочного исследования, комбинация ATB200/миглустат характеризовалась существенно лучшим очищением от гликогена после 3 месяцев (фиг. 34A-34C) и 6 месяцев (фиг. 34D-G) обработки, чем алглюкозидаза-альфа. Комбинация ATB200/миглустат также снижала аутофагию и внутриклеточное накопление LAMP1 и дисферлина после 3 месяцев обработки (фиг. 35) в сравнении с алглюкозидазой-альфа. На фиг. 33A * указывает на статистически значимый результат в сравнении с Lumizyme® в отдельности (p < 0,05, 2-сторонний t-критерий). На фиг. 34A-34G * указывает на статистически значимый результат в сравнении с Lumizyme® в отдельности (p < 0,05, множественное сравнение с применением способа Даннетта в рамках однофакторного анализа ANOVA).

В совокупности эти данные указывают на то, что комбинация ATB200/миглустат эффективно нацеливалась на мышцы с устранением клеточной дисфункции и улучшением мышечной функции. Важно отметить, что видимые улучшения мышечной архитектуры, а также снижение аутофагии и внутриклеточного накопления LAMP1 и дисферлина могут быть хорошими суррогатными критериями улучшения физиологического состояния мышц, что коррелирует с улучшениями функциональной мышечной силы. Эти результаты позволяют предположить, что мониторинг аутофагии и уровней этих ключевых мышечных белков, которые могут оказаться полезными биомаркерами в биоптатах мышц в клинических исследованиях, может быть целесообразным практическим способом оценки эффективности терапевтических методов лечения болезни Помпе у мышей с KO Gaa.

На фиг. 40 показано, что введение ATB200 с миглустатом или без него в течение 6 месяцев понижало внутриклеточное накопление дистрофина у мышей с KO Gaa. Для комбинации ATB200 ± миглустат наблюдали более значительное снижение накопления дистрофина, чем в случае применения Lumizyme®.

Пример 18. Эффект содержания сиаловой кислоты в ATB200 у мышей с нокаутом Gaa.

Две партии ATB200 с разным содержанием сиаловой кислоты оценивали в отношении фармакокинетических параметров и эффективности на мышах с KO Gaa. В В табл. 16 представлена сводная информация о характеристиках для двух партий.

Таблица 16

Характеристика	Партия А	Партия В
Сиаловая кислота	4,0 моль/моль белка	5,4 моль/моль белка
Содержание М6Р	3,3 моль/моль белка	2,9 моль/моль белка
Удельная активность	115831 (нмоль 4ти/мг белка/ч.)	120929 (нмоль 4ти/мг белка/ч.)
Связывание с CIMPR	Kd = 2,7 нМ	Kd = 2,9 нМ

Как можно увидеть из табл. 16, партия B имела более высокое содержание сиаловой кислоты, чем партия A, однако немного меньшее содержание М6Р, чем партия A.

На фиг. 36 показаны профили зависимости концентрации активной формы GAA в плазме крови от времени у мышей с KO Gaa после однократного IV болюсного введения дозы ATB200. Значения периода полувыведения для партий A и B представлены в табл. 17 ниже.

Таблица 17

Период полувыведения G-)	Среднее значение ± SEM
Партия А	0,50 ± 0,02
Партия В	0,60 ± 0,03

Как можно увидеть из табл. 17, партия B характеризовалась меньшим периодом полувыведения, чем партия A. Хотя уменьшение периода полувыведения было незначительным, это уменьшение периода полувыведения было статистически значимым (p < 0,05 для 2-стороннего t-критерия).

В связанном исследовании мышам с KO Gaa давали IV болюсные инъекции ATB200 (партии A и B) и Lumizyme® в хвостовую вену один раз в две недели с осуществлением в общей сложности 2 инъекций. Уровни гликогена в тканях измеряли через 14 дней после последнего введения. Как показано на фиг. 37A-37D, партия B в целом была более эффективной в отношении снижения уровня гликогена, чем партия A, при аналогичных дозах. Как партия A, так и партия B превосходили Lumizyme® в отношении снижения уровня гликогена. На фиг. 37A-37D * указывает на статистически значимый результат в срав- 51 043083 нении с Lumizyme® (p < 0,05, t-критерий), а ^л указывает на статистически значимый результат сравнения партии A и партии B при одной и той же дозе (р < 0,05, t-критерий).

Варианты осуществления, описанные в данном документе, подразумеваются как иллюстрирующие композиции и способы по настоящему изобретению и не подразумеваются как ограничивающие объем настоящего изобретения. Различные модификации и изменения, которые согласуются с описанием в целом и очевидны специалисту в данной области, подразумеваются как включенные. Прилагаемая формула изобретения не должна ограничиваться конкретными вариантами осуществления, изложенными в примерах, однако должна обеспечивать наиболее широкую интерпретацию, согласованную с описанием в целом.

Во всему настоящему заявке цитируются патенты, патентные заявки, публикации, описания продуктов, номера доступа в GenBank и протоколы, раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях.

Перечень последовательностей <110> Амикус Терапьютикс, Инк.

<120> КИСЛАЯ АЛЬФА-ГЛЮКОЗИДАЗА УСИЛЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПОМПЕ <130> AT-P8500-PCT <160>6 <170> PatentIn версия 3.5 <210>1 <211>952 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>1

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

5 1015

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

2530

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 4045

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

5560

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 7580

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 9095

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120125

- 52 043083

Phe

Glu 145

Pro

Asn

Val

Tyr

Gln 225

Phe

Ile

Trp

Ala

Gly 305

Val

Leu

Gln

Leu

Pro Pro Ser 130

Met Gly Tyr

Lys Asp Ile

Arg Leu His

180

Pro Leu Glu

195

Ser Val Glu 210

Leu Asp Gly

Ala Asp Gln

Thr Gly Leu

260

Thr Arg Ile

275

Asn Leu Tyr 290

Ser Ala His

Leu Gln Pro

Asp Val Tyr

340

Tyr Leu Asp

355

Gly Phe His

Tyr Pro Ser

135

Thr Ala Thr

150

Leu Thr Leu 165

Phe Thr Ile

Thr Pro Arg

Phe Ser Glu

215

Arg Val Leu

230

Phe Leu Gln 245

Ala Glu His

Thr Leu Trp

Gly Ser His

295

Gly Val Phe

310

Ser Pro Ala 325

Ile Phe Leu

Val Val Gly

Leu Cys Arg

Tyr Lys Leu

Leu Thr Arg

Arg Leu Asp

170

Lys Asp Pro

185

Val His Ser 200

Glu Pro Phe

Leu Asn Thr

Leu Ser Thr

250

Leu Ser Pro

265

Asn Arg Asp 280

Pro Phe Tyr

Leu Leu Asn

Leu Ser Trp

330

Gly Pro Glu

345

Tyr Pro Phe 360

Trp Gly Tyr

Glu Asn Leu

140

Thr Thr Pro 155

Val Met Met

Ala Asn Arg

Arg Ala Pro

205

Gly Val Ile

220

Thr Val Ala 235

Ser Leu Pro

Leu Met Leu

Leu Ala Pro

285

Leu Ala Leu

300

Ser Asn Ala 315

Arg Ser Thr

Pro Lys Ser

Met Pro Pro

365

Ser Ser Thr

Ser Ser Ser

Thr Phe Phe

160

Glu Thr Glu

175

Arg Tyr Glu 190

Ser Pro Leu

Val His Arg

Pro Leu Phe

240

Ser Gln Tyr

255

Ser Thr Ser 270

Thr Pro Gly

Glu Asp Gly

Met Asp Val

320

Gly Gly Ile

335

Val Val Gln 350

Tyr Trp Gly

Ala Ile Thr

- 53 043083

His Phe Pro

395

Leu Asp Val

400

370

375

380

Arg 385

Gln

Asn

Gln

Ser

Gly 465

Trp

Ala

Asp

Ser

Pro 545

Ser

Leu

Thr

Tyr

Gln Val Val

Glu Asn Met

390

Thr Arg Ala

Trp Asn Asp

Leu Asp Tyr 405

Met Asp Ser

410

Arg Arg Asp

Phe Thr Phe

415

Lys Asp Gly

420

Gly Gly Arg

435

Gly Pro Ala 450

Val Phe Ile

Pro Gly Ser

Trp Trp Glu

500

Gly Met Trp

515

Glu Asp Gly 530

Gly Val Val

His Gln Phe

Thr Glu Ala

580

Arg Pro Phe

595

Ala Gly His 610

Phe Arg Asp

Phe Pro Ala

425

Met Val Gln

Glu Leu His 430

Arg Tyr Met

Met Ile Val 440

Asp Pro Ala

445

Ile Ser Ser

Gly Ser Tyr

455

Thr Asn Glu

470

Thr Ala Phe 485

Asp Met Val

Ile Asp Met

Cys Pro Asn

535

Gly Gly Thr

550

Leu Ser Thr 565

Ile Ala Ser

Val Ile Ser

Trp Thr Gly

615

Arg Pro Tyr

Asp Glu Gly

460

Leu Arg Arg

Thr Gly Gln

Pro Leu Ile 475

Gly Lys Val

480

Pro Asp Phe

490

Thr Asn Pro

Thr Ala Leu

495

Ala Glu Phe

505

Asn Glu Pro 520

Asn Glu Leu

Leu Gln Ala

His Tyr Asn

570

His Arg Ala

585

Arg Ser Thr 600

Asp Val Trp

His Asp Gln

Val Pro Phe 510

Ser Asn Phe

525

Glu Asn Pro

540

Ala Thr Ile 555

Leu His Asn

Leu Val Lys

Phe Ala Gly

605

Ser Ser Trp

620

Ile Arg Gly

Pro Tyr Val

Cys Ala Ser

560

Leu Tyr Gly

575

Ala Arg Gly 590

His Gly Arg

Glu Gln Leu

- 54 043083

Ala Ser Ser Val Pro 625

Glu Ile Leu Gln Phe 630

Asn Leu Leu Gly Val 635

Leu Val Gly Ala Asp

645

Val Cys Gly Phe Leu

650

Gly Asn Thr Ser Glu

655

Leu Cys Val Arg Trp

660

Thr Gln Leu Gly Ala 6 65

Phe Tyr Pro Phe Met

670

Asn His Asn Ser Leu

675

Leu Ser Leu Pro Gln

680

Glu Pro Tyr Ser Phe 685

Glu Pro Ala Gln Gln

690

Ala Met Arg Lys Ala

695

Leu Thr Leu Arg Tyr

700

Leu Leu Pro His Leu 705

Tyr Thr Leu Phe His 710

Gln Ala His Val Ala 715

Glu Thr Val Ala Arg

725

Pro Leu Phe Leu Glu

730

Phe Pro Lys Asp Ser

735

Thr Trp Thr Val Asp

740

His Gln Leu Leu Trp 745

Gly Glu Ala Leu Leu

750

Thr Pro Val Leu Gln

755

Ala Gly Lys Ala Glu 760

Val Thr Gly Tyr Phe

765

Leu Gly Thr Trp Tyr

770

Asp Leu Gln Thr Val 775

Pro Ile Glu Ala Leu

780

Ser Leu Pro Pro Pro 785

Pro Ala Ala Pro Arg 790

Glu Pro Ala Ile His 795

Glu Gly Gln Trp Val

805

Thr Leu Pro Ala Pro

810

Leu Asp Thr Ile Asn

815

His Leu Arg Ala Gly

820

Tyr Ile Ile Pro Leu

825

Gln Gly Pro Gly Leu

830

Thr Thr Glu Ser Arg

835

Gln Gln Pro Met Ala

840

Leu Ala Val Ala Leu

845

Lys Gly Gly Glu Ala

850

Arg Gly Glu Leu Phe

855

Trp Asp Asp Gly Glu 860

Leu Glu Val Leu Glu 865

Arg Gly Ala Tyr Thr 870

Gln Val Ile Phe Leu 875

Pro 640

Glu

Arg

Ser

Ala

Gly 720

Ser

Ile

Pro

Gly

Ser 800

Val

Thr

Thr

Ser

Ala 880

- 55 043083

Arg

Asn

Asn

Thr

Ile 885

Val

Asn

Glu

Leu

Val 890

Arg

Val

Thr

Ser

Glu 895

Gly

Ala

Gly

Leu

Gln 900

Leu

Gln

Lys

Val

Thr 905

Val

Leu

Gly

Val

Ala 910

Thr

Ala

Pro

Gln

Gln 915

Val

Leu

Ser

Asn

Gly 920

Val

Pro

Val

Ser

Asn 925

Phe

Thr

Tyr

Ser

Pro 930

Asp

Thr

Lys

Val

Leu 935

Asp

Ile

Cys

Val

Ser 940

Leu

Leu

Met

Gly

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945950 <210>2 <211>3624 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>

< 221> CDS < 222> (220) .. (3078) <220>

< 221> мРНК < 222> (221)..(3075) <400> 2

cagttgggaa agctgaggtt	gtcgccgggg ccgcgggtgg aggtcgggga	tgaggcagca	60
ggtaggacag	tgacctcggt	gacgcgaagg	accccggcca cctctaggtt	ctcctcgtcc	120
gcccgttgtt	cagcgaggga	ggctctgggc	ctgccgcagc tgacggggaa	actgaggcac	180
ggagcgggcc	tgtaggagct	gtccaggcca	tctccaacc atg gga gtg Met Gly Val 1	agg cac Arg His 5	234

ccg Pro

ccc Pro

tgc Cys

tcc Ser

cac His 10

cgg Arg

ctc Leu

ctg Leu

gcc Ala

gtc Val 15

tgc Cys

gcc Ala

ctc Leu

gtg Val

tcc Ser 20

ttg Leu

282

gca

acc

gct

gca

ctc

ctg

ggg

cac

atc

cta

ctc

cat

gat

ttc

ctg

ctg

330

Ala

Thr

Ala

Ala 25

Leu

Leu

Gly

His

Ile 30

Leu

Leu

His

Asp

Phe 35

Leu

Leu

gtt

ccc

cga

gag

ctg

agt

ggc

tcc

tcc

cca

gtc

ctg

gag

gag

act

cac

378

Val

Pro

Arg 40

Glu

Leu

Ser

Gly

Ser 45

Ser

Pro

Val

Leu

Glu 50

Glu

Thr

His

cca

gct

cac

cag

cag

gga

gcc

agc

aga

cca

ggg

ccc

cgg

gat

gcc

cag

426

Pro

Ala 55

His

Gln

Gln

Gly

Ala 60

Ser

Arg

Pro

Gly

Pro 65

Arg

Asp

Ala

Gln

gca

cac

ccc

ggc

cgt

ccc

aga

gca

gtg

ccc

aca

cag

tgc

gac

gtc

ccc

474

- 56 043083

Ala 70 ccc Pro cag

Gln cag

Gln ccc

Pro gcc Ala 150 acc Thr acg

Thr ccg

Pro tcc

Ser gtg Val 230 ctt Leu gag

Glu ctg

Leu tct

Ser gtg Val 310

His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro 75 8085 aac agc cgc ttc gat tgc gcc cct gac aag gcc atc acc cag gaa522

Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr GlnGlu

95100 tgc gag gcc cgc ggc tgc tgc tac atc cct gca aag cag ggg ctg570

Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln GlyLeu

105 110115 gga gcc cag atg ggg cag ccc tgg tgc ttc ttc cca ccc agc tac618

Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro SerTyr

120 125130 agc tac aag ctg gag aac ctg agc tcc tct gaa atg ggc tac acg666

Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly TyrThr

135 140145 acc ctg acc cgt acc acc ccc acc ttc ttc ccc aag gac atc ctg714

Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp IleLeu

155 160165 ctg cgg ctg gac gtg atg atg gag act gag aac cgc ctc cac ttc762

Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu HisPhe

170 175180 atc aaa gat cca gct aac agg cgc tac gag gtg ccc ttg gag acc810

Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu GluThr

185 190195 cgt gtc cac agc cgg gca ccg tcc cca ctc tac agc gtg gag ttc858

Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val GluPhe

200 205210 gag gag ccc ttc ggg gtg atc gtg cac cgg cag ctg gac ggc cgc906

Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp GlyArg

215 220225 ctg ctg aac acg acg gtg gcg ccc ctg ttc ttt gcg gac cag ttc954

Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp GlnPhe

235 240245 cag ctg tcc acc tcg ctg ccc tcg cag tat atc aca ggc ctc gcc1002

Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly LeuAla

250 255260 cac ctc agt ccc ctg atg ctc agc acc agc tgg acc agg atc acc1050

His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg IleThr

265 270275 tgg aac cgg gac ctt gcg ccc acg ccc ggt gcg aac ctc tac ggg1098

Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu TyrGly

280 285290 cac cct ttc tac ctg gcg ctg gag gac ggc ggg tcg gca cac ggg1146

His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala HisGly

295 300305 ttc ctg cta aac agc aat gcc atg gat gtg gtc ctg cag ccg agc1194

Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln ProSer

315 320325

- 57 043083

cct Pro

gcc Ala

ctt Leu

agc Ser

tgg Trp 330

agg Arg

tcg Ser

aca Thr

ggt Gly

ggg Gly 335

atc Ile

ctg Leu

gat Asp

gtc Val

tac Tyr 340

atc Ile

1242

ttc

ctg

ggc

cca

gag

ccc

aag

agc

gtg

gtg

cag

cag

tac

ctg

gac

gtt

1290

Phe

Leu

Gly

Pro 345

Glu

Pro

Lys

Ser

Val 350

Val

Gln

Gln

Tyr

Leu 355

Asp

Val

gtg

gga

tac

ccg

ttc

atg

ccg

cca

tac

tgg

ggc

ctg

ggc

ttc

cac

ctg

1338

Val

Gly

Tyr 360

Pro

Phe

Met

Pro

Pro 365

Tyr

Trp

Gly

Leu

Gly 370

Phe

His

Leu

tgc

cgc

tgg

ggc

tac

tcc

tcc

acc

gct

atc

acc

cgc

cag

gtg

gtg

gag

1386

Cys

Arg 375

Trp

Gly

Tyr

Ser

Ser 380

Thr

Ala

Ile

Thr

Arg 385

Gln

Val

Val

Glu

aac

atg

acc

agg

gcc

cac

ttc

ccc

ctg

gac

gtc

caa

tgg

aac

gac

ctg

1434

Asn 390

Met

Thr

Arg

Ala

His 395

Phe

Pro

Leu

Asp

Val 400

Gln

Trp

Asn

Asp

Leu 405

gac

tac

atg

gac

tcc

cgg

agg

gac

ttc

acg

ttc

aac

aag

gat

ggc

ttc

1482

Asp

Tyr

Met

Asp

Ser 410

Arg

Arg

Asp

Phe

Thr 415

Phe

Asn

Lys

Asp

Gly 420

Phe

cgg

gac

ttc

ccg

gcc

atg

gtg

cag

gag

ctg

cac

cag

ggc

ggc

cgg

cgc

1530

Arg

Asp

Phe

Pro 425

Ala

Met

Val

Gln

Glu 430

Leu

His

Gln

Gly

Gly 435

Arg

Arg

tac

atg

atg

atc

gtg

gat

cct

gcc

atc

agc

agc

tcg

ggc

cct

gcc

ggg

1578

Tyr

Met

Met 440

Ile

Val

Asp

Pro

Ala 445

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly 450

Pro

Ala

Gly

agc

tac

agg

ccc

tac

gac

gag

ggt

ctg

cgg

agg

ggg

gtt

ttc

atc

acc

1626

Ser

Tyr 455

Arg

Pro

Tyr

Asp

Glu 460

Gly

Leu

Arg

Arg

Gly 465

Val

Phe

Ile

Thr

aac

gag

acc

ggc

cag

ccg

ctg

att

ggg

aag

gta

tgg

ccc

ggg

tcc

act

1674

Asn 470

Glu

Thr

Gly

Gln

Pro 475

Leu

Ile

Gly

Lys

Val 480

Trp

Pro

Gly

Ser

Thr 485

gcc

ttc

ccc

gac

ttc

acc

aac

ccc

aca

gcc

ctg

gcc

tgg

tgg

gag

gac

1722

Ala

Phe

Pro

Asp

Phe 490

Thr

Asn

Pro

Thr

Ala 495

Leu

Ala

Trp

Trp

Glu 500

Asp

atg

gtg

gct

gag

ttc

cat

gac

cag

gtg

ccc

ttc

gac

ggc

atg

tgg

att

1770

Met

Val

Ala

Glu 505

Phe

His

Asp

Gln

Val 510

Pro

Phe

Asp

Gly

Met 515

Trp

Ile

gac

atg

aac

gag

cct

tcc

aac

ttc

atc

aga

ggc

tct

gag

gac

ggc

tgc

1818

Asp

Met

Asn 520

Glu

Pro

Ser

Asn

Phe 525

Ile

Arg

Gly

Ser

Glu 530

Asp

Gly

Cys

ccc

aac

aat

gag

ctg

gag

aac

cca

ccc

tac

gtg

cct

ggg

gtg

gtt

ggg

1866

Pro

Asn 535

Asn

Glu

Leu

Glu

Asn 540

Pro

Pro

Tyr

Val

Pro 545

Gly

Val

Val

Gly

ggg

acc

ctc

cag

gcg

gcc

acc

atc

tgt

gcc

tcc

agc

cac

cag

ttt

ctc

1914

Gly 550

Thr

Leu

Gln

Ala

Ala 555

Thr

Ile

Cys

Ala

Ser 560

Ser

His

Gln

Phe

Leu 565

tcc

aca

cac

tac

aac

ctg

cac

aac

ctc

tac

ggc

ctg

acc

gaa

gcc

atc

1962

Ser

Thr

His

Tyr

Asn

Leu

His

Asn

Leu

Tyr

Gly

Leu

Thr

Glu

Ala

Ile

570 575 580

- 58 043083

gcc Ala

tcc Ser

cac His

agg Arg 585

gcg Ala

ctg Leu

gtg Val

aag Lys

gct Ala 590

cgg Arg

ggg Gly

aca Thr

cgc Arg

cca Pro 595

ttt Phe

gtg Val

2010

atc

tcc

cgc

tcg

acc

ttt

gct

ggc

cac

ggc

cga

tac

gcc

ggc

cac

tgg

2058

Ile

Ser

Arg 600

Ser

Thr

Phe

Ala

Gly 605

His

Gly

Arg

Tyr

Ala 610

Gly

His

Trp

acg

ggg

gac

gtg

tgg

agc

tcc

tgg

gag

cag

ctc

gcc

tcc

tcc

gtg

cca

2106

Thr

Gly 615

Asp

Val

Trp

Ser

Ser 620

Trp

Glu

Gln

Leu

Ala 625

Ser

Ser

Val

Pro

gaa

atc

ctg

cag

ttt

aac

ctg

ctg

ggg

gtg

cct

ctg

gtc

ggg

gcc

gac

2154

Glu 630

Ile

Leu

Gln

Phe

Asn 635

Leu

Leu

Gly

Val

Pro 640

Leu

Val

Gly

Ala

Asp 645

gtc

tgc

ggc

ttc

ctg

ggc

aac

acc

tca

gag

gag

ctg

tgt

gtg

cgc

tgg

2202

Val

Cys

Gly

Phe

Leu 650

Gly

Asn

Thr

Ser

Glu 655

Glu

Leu

Cys

Val

Arg 660

Trp

acc

cag

ctg

ggg

gcc

ttc

tac

ccc

ttc

atg

cgg

aac

cac

aac

agc

ctg

2250

Thr

Gln

Leu

Gly 6 65

Ala

Phe

Tyr

Pro

Phe 670

Met

Arg

Asn

His

Asn 675

Ser

Leu

ctc

agt

ctg

ccc

cag

gag

ccg

tac

agc

ttc

agc

gag

ccg

gcc

cag

cag

2298

Leu

Ser

Leu 680

Pro

Gln

Glu

Pro

Tyr 685

Ser

Phe

Ser

Glu

Pro 690

Ala

Gln

Gln

gcc

atg

agg

aag

gcc

ctc

acc

ctg

cgc

tac

gca

ctc

ctc

ccc

cac

ctc

2346

Ala

Met 695

Arg

Lys

Ala

Leu

Thr 700

Leu

Arg

Tyr

Ala

Leu 705

Leu

Pro

His

Leu

tac

aca

ctg

ttc

cac

cag

gcc

cac

gtc

gcg

ggg

gag

acc

gtg

gcc

cgg

2394

Tyr 710

Thr

Leu

Phe

His

Gln 715

Ala

His

Val

Ala

Gly 720

Glu

Thr

Val

Ala

Arg 725

ccc

ctc

ttc

ctg

gag

ttc

ccc

aag

gac

tct

agc

acc

tgg

act

gtg

gac

2442

Pro

Leu

Phe

Leu

Glu 730

Phe

Pro

Lys

Asp

Ser 735

Ser

Thr

Trp

Thr

Val 740

Asp

cac

cag

ctc

ctg

tgg

ggg

gag

gcc

ctg

ctc

atc

acc

cca

gtg

ctc

cag

2490

His

Gln

Leu

Leu 745

Trp

Gly

Glu

Ala

Leu 750

Leu

Ile

Thr

Pro

Val 755

Leu

Gln

gcc

ggg

aag

gcc

gaa

gtg

act

ggc

tac

ttc

ccc

ttg

ggc

aca

tgg

tac

2538

Ala

Gly

Lys 760

Ala

Glu

Val

Thr

Gly 765

Tyr

Phe

Pro

Leu

Gly 770

Thr

Trp

Tyr

gac

ctg

cag

acg

gtg

cca

ata

gag

gcc

ctt

ggc

agc

ctc

cca

ccc

cca

2586

Asp

Leu 775

Gln

Thr

Val

Pro

Ile 780

Glu

Ala

Leu

Gly

Ser 785

Leu

Pro

Pro

Pro

cct

gca

gct

ccc

cgt

gag

cca

gcc

atc

cac

agc

gag

ggg

cag

tgg

gtg

2634

Pro 790

Ala

Ala

Pro

Arg

Glu 795

Pro

Ala

Ile

His

Ser 800

Glu

Gly

Gln

Trp

Val 805

acg

ctg

ccg

gcc

ccc

ctg

gac

acc

atc

aac

gtc

cac

ctc

cgg

gct

ggg

2682

Thr

Leu

Pro

Ala

Pro 810

Leu

Asp

Thr

Ile

Asn 815

Val

His

Leu

Arg

Ala 820

Gly

tac

atc

atc

ccc

ctg

cag

ggc

cct

ggc

ctc

aca

acc

aca

gag

tcc

cgc

2730

Tyr

Ile

Ile

Pro

Leu

Gln

Gly

Pro

Gly

Leu

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser

Arg

- 59 043083

	825	830	835
cag	cag ccc atg gcc ctg	gct gtg gcc ctg acc aag ggt	gga gag gcc 2778
Gln	Gln Pro Met Ala Leu 840	Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly 845 850	Gly Glu Ala
cga	ggg gag ctg ttc tgg	gac gat gga gag agc ctg gaa	gtg ctg gag 2826
Arg	Gly Glu Leu Phe Trp 855	Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu 860 865	Val Leu Glu
cga	ggg gcc tac aca cag	gtc atc ttc ctg gcc agg aat	aac acg atc 2874
Arg 870	Gly Ala Tyr Thr Gln 875	Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn 880	Asn Thr Ile 885
gtg	aat gag ctg gta cgt	gtg acc agt gag gga gct ggc	ctg cag ctg 2922
Val	Asn Glu Leu Val Arg 890	Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly 895	Leu Gln Leu 900
cag	aag gtg act gtc ctg	ggc gtg gcc acg gcg ccc cag	cag gtc ctc 2970
Gln	Lys Val Thr Val Leu 905	Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln 910	Gln Val Leu 915
tcc	aac ggt gtc cct gtc	tcc aac ttc acc tac agc ccc	gac acc aag 3018
Ser	Asn Gly Val Pro Val 920	Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro 925 930	Asp Thr Lys
gtc	ctg gac atc tgt gtc	tcg ctg ttg atg gga gag cag	ttt ctc gtc 3066
Val	Leu Asp Ile Cys Val 935	Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln 940 945	Phe Leu Val

agc tgg tgt tag ccgggcggag tgtgttagtc tctccagagg gaggctggtt3118

Ser Trp Cys 950

ccccagggaa	gcagagcctg	tgtgcgggca	gcagctgtgt	gcgggcctgg	gggttgcatg	3178
tgtcacctgg	agctgggcac	taaccattcc	aagccgccgc	atcgcttgtt	tccacctcct	3238
gggccggggc	tctggccccc	aacgtgtcta	ggagagcttt	ctccctagat	cgcactgtgg	3298
gccggggcct	ggagggctgc	tctgtgttaa	taagattgta	aggtttgccc	tcctcacctg	3358
ttgccggcat	gcgggtagta	ttagccaccc	ccctccatct	gttcccagca	ccggagaagg	3418
gggtgctcag	gtggaggtgt	ggggtatgca	cctgagctcc	tgcttcgcgc	ctgctgctct	3478
gccccaacgc	gaccgcttcc	cggctgccca	gagggctgga	tgcctgccgg	tccccgagca	3538
agcctgggaa	ctcaggaaaa	ttcacaggac	ttgggagatt	ctaaatctta	agtgcaatta	3598
ttttaataaa	aggggcattt	ggaatc				3624

<210>3 <211>952 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>3

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

5 1015

- 60 043083

Ala

His

Leu

Pro 65

Gln

Ala

Ala

Phe

Glu 145

Pro

Asn

Val

Tyr

Gln 225

Phe

Ile

Leu Val

Asp Phe 35

Glu Glu 50

Arg Asp

Cys Asp

Ile Thr

Lys Gln

115

Pro Pro 130

Met Gly

Lys Asp

Arg Leu

Pro Leu

195

Ser Val

210

Leu Asp

Ala Asp

Thr Gly

Ser Leu 20

Leu Leu

Thr His

Ala Gln

Val Pro

Gln Glu 100

Gly Leu

Ser Tyr

Tyr Thr

Ile Leu

165

His Phe 180

Glu Thr

Glu Phe

Gly Arg

Gln Phe

245

Leu Ala

260

Ala Thr

Val Pro

Pro Ala

Ala His 70

Pro Asn

Gln Cys

Gln Gly

Pro Ser

135

Ala Thr 150

Thr Leu

Thr Ile

Pro Arg

Ser Glu

215

Val Leu 230

Leu Gln

Glu His

Ala Ala 25

Arg Glu 40

His Gln

Pro Gly

Ser Arg

Glu Ala

105

Ala Gln 120

Tyr Lys

Leu Thr

Arg Leu

Lys Asp

185

Val His 200

Glu Pro

Leu Asn

Leu Ser

Leu Ser

265

Leu Leu

Leu Ser

Gln Gly

Arg Pro

Phe Asp 90

Arg Gly

Met Gly

Leu Glu

Arg Thr

155

Asp Val 170

Pro Ala

Ser Arg

Phe Gly

Thr Thr

235

Thr Ser

250

Pro Leu

Gly His

Gly Ser 45

Ala Ser 60

Arg Ala

Cys Ala

Cys Cys

Gln Pro

125

Asn Leu

140

Thr Pro

Met Met

Asn Arg

Ala Pro

205

Val Ile 220

Val Ala

Leu Pro

Met Leu

Ile Leu 30

Ser Pro

Arg Pro

Val Pro

Pro Asp 95

Tyr Ile 110

Trp Cys

Ser Ser

Thr Phe

Glu Thr

175

Arg Tyr 190

Ser Pro

Val His

Pro Leu

Ser Gln

255

Ser Thr

270

Leu

Val

Gly

Thr 80

Lys

Pro

Phe

Ser

Phe 160

Glu

Glu

Leu

Arg

Phe 240

Tyr

Ser

- 61 043083

Trp

Ala

Gly 305

Val

Leu

Gln

Leu

Arg 385

Gln

Asn

Gln

Ser

Gly 465

Trp

Ala

Asp

Thr Arg Ile

275

Thr Leu Trp

Asn Arg Asp 280

Leu Ala Pro

285

Thr Pro Gly

Asn Leu Tyr 290

Gly Ser His

295

Pro Phe Tyr

Leu Ala Leu

300

Glu Asp Gly

Ser Ala His

Gly Val Phe

310

Leu Leu Asn

Ser Asn Ala 315

Met Asp Val

320

Leu Gln Pro

Ser Pro Ala 325

Leu Ser Trp

330

Arg Ser Thr

Gly Gly Ile

335

Asp Val Tyr

340

Tyr Leu Asp

355

Gly Phe His 370

Gln Val Val

Trp Asn Asp

Lys Asp Gly

420

Gly Gly Arg

435

Gly Pro Ala 450

Val Phe Ile

Pro Gly Ser

Trp Trp Glu

500

Gly Met Trp

Ile Phe Leu

Gly Pro Glu

345

Pro Lys Ser

Val Val Gln 350

Val Val Gly

Tyr Pro Phe 360

Met Pro Pro

365

Tyr Trp Gly

Leu Cys Arg

375

Glu Asn Met

390

Leu Asp Tyr 405

Phe Arg Asp

Arg Tyr Met

Gly Ser Tyr

455

Thr Asn Glu

470

Thr Ala Phe 485

Asp Met Val

Ile Asp Met

Trp Gly Tyr

Thr Arg Ala

Met Asp Ser

410

Phe Pro Ala

425

Met Ile Val 440

Arg Pro Tyr

Thr Gly Gln

Pro Asp Phe

490

Ala Glu Phe

505

Asn Glu Pro

Ser Ser Thr

380

His Phe Pro 395

Arg Arg Asp

Met Val Gln

Asp Pro Ala

445

Asp Glu Gly

460

Pro Leu Ile 475

Thr Asn Pro

His Asp Gln

Ser Asn Phe

Ala Ile Thr

Leu Asp Val

400

Phe Thr Phe

415

Glu Leu His 430

Ile Ser Ser

Leu Arg Arg

Gly Lys Val

480

Thr Ala Leu

495

Val Pro Phe 510

Ile Arg Gly

- 62 043083

Glu Asn Pro Pro Tyr

540

515

520

525

Ser Glu Asp Gly Cys

530

Pro Asn Asn Glu Leu

535

Pro Gly Val Val Gly 545

Gly Thr Leu Gln Ala 550

Ala Thr Ile Cys Ala 555

Ser His Gln Phe Leu

565

Ser Thr His Tyr Asn

570

Leu His Asn Leu Tyr

575

Leu Thr Glu Ala Ile

580

Ala Ser His Arg Ala

585

Leu Val Lys Ala Arg

590

Thr Arg Pro Phe Val

595

Ile Ser Arg Ser Thr 600

Phe Ala Gly His Gly 605

Tyr Ala Gly His Trp 610

Thr Gly Asp Val Trp

615

Ser Ser Trp Glu Gln 620

Ala Ser Ser Val Pro 625

Glu Ile Leu Gln Phe 630

Asn Leu Leu Gly Val 635

Leu Val Gly Ala Asp

645

Val Cys Gly Phe Leu

650

Gly Asn Thr Ser Glu

655

Leu Cys Val Arg Trp

660

Thr Gln Leu Gly Ala

665

Phe Tyr Pro Phe Met

670

Asn His Asn Ser Leu

675

Leu Ser Leu Pro Gln

680

Glu Pro Tyr Ser Phe

685

Glu Pro Ala Gln Gln

690

Ala Met Arg Lys Ala

695

Leu Thr Leu Arg Tyr

700

Leu Leu Pro His Leu 705

Tyr Thr Leu Phe His 710

Gln Ala His Val Ala 715

Glu Thr Val Ala Arg

725

Pro Leu Phe Leu Glu

730

Phe Pro Lys Asp Ser

735

Thr Trp Thr Val Asp

740

His Gln Leu Leu Trp 745

Gly Glu Ala Leu Leu

750

Thr Pro Val Leu Gln

755

Ala Gly Lys Ala Glu

760

Val Thr Gly Tyr Phe

765

Val

Ser 560

Gly

Gly

Arg

Leu

Pro 640

Glu

Arg

Ser

Ala

Gly 720

Ser

Ile

Pro

- 63 043083

Leu Gly Thr Trp Tyr

770

Asp Leu Gln Thr Val 775

Pro Ile Glu Ala Leu

780

Ser Leu Pro Pro Pro 785

Pro Ala Ala Pro Arg 790

Glu Pro Ala Ile His 795

Glu Gly Gln Trp Val

805

Thr Leu Pro Ala Pro

810

Leu Asp Thr Ile Asn

815

His Leu Arg Ala Gly

820

Tyr Ile Ile Pro Leu

825

Gln Gly Pro Gly Leu

830

Thr Thr Glu Ser Arg

835

Gln Gln Pro Met Ala

840

Leu Ala Val Ala Leu

845

Lys Gly Gly Glu Ala

850

Arg Gly Glu Leu Phe

855

Trp Asp Asp Gly Glu 860

Leu Glu Val Leu Glu 865

Arg Gly Ala Tyr Thr 870

Gln Val Ile Phe Leu 875

Arg Asn Asn Thr Ile

885

Val Asn Glu Leu Val

890

Arg Val Thr Ser Glu

895

Ala Gly Leu Gln Leu

900

Gln Lys Val Thr Val

905

Leu Gly Val Ala Thr

910

Pro Gln Gln Val Leu

915

Ser Asn Gly Val Pro

920

Val Ser Asn Phe Thr

925

Ser Pro Asp Thr Lys 930

Val Leu Asp Ile Cys

935

Val Ser Leu Leu Met

940

Gly

Ser 800

Val

Thr

Thr

Ser

Ala 880

Gly

Ala

Tyr

Gly

Glu Gln Phe Leu Val 945

Ser Trp Cys 950 <210>4 <211>952 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>4

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val 1 5 1015

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu

25 30

Cys

Leu

- 64 043083

His Asp Phe Leu Leu 35

Val Pro Arg Glu Leu 40

Ser Gly Ser Ser Pro 45

Leu Glu Glu Thr His 50

Pro Ala His Gln Gln

Gly Ala Ser Arg Pro 60

Pro Arg Asp Ala Gln 65

Ala His Pro Gly Arg 70

Pro Arg Ala Val Pro 75

Gln Cys Asp Val Pro 85

Pro Asn Ser Arg Phe 90

Asp Cys Ala Pro Asp 95

Ala Ile Thr Gln Glu

100

Gln Cys Glu Ala Arg

105

Gly Cys Cys Tyr Ile

110

Ala Lys Gln Gly Leu 115

Gln Gly Ala Gln Met 120

Gly Gln Pro Trp Cys 125

Phe Pro Pro Ser Tyr

130

Pro Ser Tyr Lys Leu 135

Glu Asn Leu Ser Ser

140

Glu Met Gly Tyr Thr 145

Ala Thr Leu Thr Arg 150

Thr Thr Pro Thr Phe 155

Pro Lys Asp Ile Leu

165

Thr Leu Arg Leu Asp

170

Val Met Met Glu Thr

175

Asn Arg Leu His Phe

180

Thr Ile Lys Asp Pro

185

Ala Asn Arg Arg Tyr

190

Val Pro Leu Glu Thr

195

Pro Arg Val His Ser 200

Arg Ala Pro Ser Pro 205

Tyr Ser Val Glu Phe

210

Ser Glu Glu Pro Phe

215

Gly Val Ile Val His 220

Gln Leu Asp Gly Arg 225

Val Leu Leu Asn Thr 230

Thr Val Ala Pro Leu 235

Phe Ala Asp Gln Phe

245

Leu Gln Leu Ser Thr

250

Ser Leu Pro Ser Gln

255

Ile Thr Gly Leu Ala

260

Glu His Leu Ser Pro

265

Leu Met Leu Ser Thr

270

Val

Gly

Thr 80

Lys

Pro

Phe

Ser

Phe 160

Glu

Glu

Leu

Arg

Phe 240

Tyr

Ser

Gly

Trp Thr Arg Ile Thr

275

Leu Trp Asn Arg Asp 280

Leu Ala Pro Thr Pro

285

- 65 043083

Ala

Gly 305

Val

Leu

Gln

Leu

Arg 385

Gln

Asn

Gln

Ser

Gly 465

Trp

Ala

Asp

Ser

Asn Leu Tyr 290

Ser Ala His

Leu Gln Pro

Asp Val Tyr

340

Tyr Leu Asp

355

Gly Phe His 370

Gln Val Val

Trp Asn Asp

Lys Asp Gly

420

Gly Gly Arg

435

Gly Pro Ala 450

Val Phe Ile

Pro Gly Ser

Trp Trp Glu

500

Gly Met Trp

515

Glu Asp Gly 530

Gly Ser His

295

Gly Val Phe

310

Ser Pro Ala 325

Ile Phe Leu

Val Val Gly

Leu Cys Arg

375

Glu Asn Met

390

Leu Asp Tyr 405

Phe Arg Asp

Arg Tyr Met

Gly Ser Tyr

455

Thr Asn Glu

470

Thr Ala Phe 485

Asp Met Val

Ile Asp Met

Cys Pro Asn

535

Pro Phe Tyr

Leu Leu Asn

Leu Ser Trp

330

Gly Pro Glu

345

Tyr Pro Phe 360

Trp Gly Tyr

Thr Arg Ala

Met Asp Ser

410

Phe Pro Ala

425

Met Ile Val 440

Arg Pro Tyr

Thr Gly Gln

Pro Asp Phe

490

Ala Glu Phe

505

Asn Glu Pro 520

Asn Glu Leu

Leu Ala Leu

300

Glu Asp Gly

Ser Asn Ala 315

Met Asp Val

320

Arg Ser Thr

Pro Lys Ser

Met Pro Pro

365

Ser Ser Thr

380

His Phe Pro 395

Arg Arg Asp

Met Val Gln

Asp Pro Ala

445

Asp Glu Gly

460

Pro Leu Ile 475

Thr Asn Pro

His Asp Gln

Ser Asn Phe

525

Glu Asn Pro

540

Gly Gly Ile

335

Val Val Gln 350

Tyr Trp Gly

Ala Ile Thr

Leu Asp Val

400

Phe Thr Phe

415

Glu Leu His 430

Ile Ser Ser

Leu Arg Arg

Gly Lys Val

480

Thr Ala Leu

495

Val Pro Phe 510

Ile Arg Gly

Pro Tyr Val

- 66 043083

Pro Gly Val Val Gly 545

Gly Thr Leu Gln Ala 550

Ala Thr Ile Cys Ala 555

Ser His Gln Phe Leu

565

Ser Thr His Tyr Asn

570

Leu His Asn Leu Tyr

575

Leu Thr Glu Ala Ile

580

Ala Ser His Arg Ala

585

Leu Val Lys Ala Arg

590

Thr Arg Pro Phe Val

595

Ile Ser Arg Ser Thr 600

Phe Ala Gly His Gly 605

Tyr Ala Gly His Trp 610

Thr Gly Asp Val Trp

615

Ser Ser Trp Glu Gln 620

Ala Ser Ser Val Pro 625

Glu Ile Leu Gln Phe 630

Asn Leu Leu Gly Val 635

Leu Val Gly Ala Asp

645

Val Cys Gly Phe Leu

650

Gly Asn Thr Ser Glu

655

Leu Cys Val Arg Trp

660

Thr Gln Leu Gly Ala

665

Phe Tyr Pro Phe Met

670

Asn His Asn Ser Leu

675

Leu Ser Leu Pro Gln

680

Glu Pro Tyr Ser Phe

685

Glu Pro Ala Gln Gln

690

Ala Met Arg Lys Ala

695

Leu Thr Leu Arg Tyr

700

Leu Leu Pro His Leu 705

Tyr Thr Leu Phe His 710

Gln Ala His Val Ala 715

Glu Thr Val Ala Arg

725

Pro Leu Phe Leu Glu

730

Phe Pro Lys Asp Ser

735

Thr Trp Thr Val Asp

740

His Gln Leu Leu Trp 745

Gly Glu Ala Leu Leu

750

Thr Pro Val Leu Gln

755

Ala Gly Lys Ala Glu

760

Val Thr Gly Tyr Phe

765

Leu Gly Thr Trp Tyr

770

Asp Leu Gln Thr Val 775

Pro Ile Glu Ala Leu

780

Ser Leu Pro Pro Pro

Pro Ala Ala Pro Arg

Glu Pro Ala Ile His

Ser 560

Gly

Gly

Arg

Leu

Pro 640

Glu

Arg

Ser

Ala

Gly 720

Ser

Ile

Pro

Gly

Ser

- 67 043083

Leu Asp Thr Ile Asn

815

785

790

795

Glu Gly Gln Trp Val

805

Thr Leu Pro Ala Pro

810

His Leu Arg Ala Gly

820

Tyr Ile Ile Pro Leu

825

Gln Gly Pro Gly Leu

830

Thr Thr Glu Ser Arg

835

Gln Gln Pro Met Ala

840

Leu Ala Val Ala Leu

845

Lys Gly Gly Glu Ala

850

Arg Gly Glu Leu Phe

855

Trp Asp Asp Gly Glu 860

Leu Glu Val Leu Glu 865

Arg Gly Ala Tyr Thr 870

Gln Val Ile Phe Leu 875

Arg Asn Asn Thr Ile

885

Val Asn Glu Leu Val

890

Arg Val Thr Ser Glu

895

Ala Gly Leu Gln Leu

900

Gln Lys Val Thr Val

905

Leu Gly Val Ala Thr

910

Pro Gln Gln Val Leu

915

Ser Asn Gly Val Pro

920

Val Ser Asn Phe Thr

925

Ser Pro Asp Thr Lys 930

Val Leu Asp Ile Cys

935

Val Ser Leu Leu Met

940

800

Val

Thr

Thr

Ser

Ala 880

Gly

Ala

Tyr

Gly

Glu Gln Phe Leu Val 945

Ser Trp Cys 950 <210>5 <211>952 < 212> БЕЛОК < 213> Homo sapiens < 400>5

Met 1

Gly

Val

Arg

His 5

Pro

Pro

Cys

Ser

His 10

Arg

Leu

Leu

Ala

Val 15

Ala

Leu

Val

Ser 20

Leu

Ala

Thr

Ala

Ala 25

Leu

Leu

Gly

His

Ile 30

Leu

His

Asp

Phe 35

Leu

Leu

Val

Pro

Arg 40

Glu

Leu

Ser

Gly

Ser 45

Ser

Pro

Leu

Glu

Glu

Thr

His

Pro

Ala

His

Gln

Gln

Gly

Ala

Ser

Arg

Pro

Cys

Leu

Val

Gly

- 68 043083

Arg Ala

Val Pro

Pro 65

Gln

Ala

Ala

Phe

Glu 145

Pro

Asn

Val

Tyr

Gln 225

Phe

Ile

Trp

Ala

Arg Asp

Ala Gln

Cys Asp

Ile Thr

Lys Gln

115

Pro Pro 130

Met Gly

Lys Asp

Arg Leu

Pro Leu

195

Ser Val

210

Leu Asp

Ala Asp

Thr Gly

Thr Arg

275

Asn Leu 290

Val Pro

Gln Glu 100

Gly Leu

Ser Tyr

Tyr Thr

Ile Leu

165

His Phe 180

Glu Thr

Glu Phe

Gly Arg

Gln Phe

245

Leu Ala

260

Ile Thr

Tyr Gly

Ala His 70

Pro Asn

Gln Cys

Gln Gly

Pro Ser

135

Ala Thr 150

Thr Leu

Thr Ile

Pro His

Ser Glu

215

Val Leu 230

Leu Gln

Glu His

Leu Trp

Ser His

295

Pro Gly

Arg Pro

Ser Arg

Glu Ala

105

Ala Gln 120

Tyr Lys

Leu Thr

Arg Leu

Lys Asp

185

Val His 200

Glu Pro

Leu Asn

Leu Ser

Leu Ser

265

Asn Arg 280

Pro Phe

Phe Asp 90

Cys Ala

Pro Asp

Arg Gly

Met Gly

Leu Glu

Arg Thr

155

Asp Val 170

Pro Ala

Ser Arg

Phe Gly

Thr Thr

235

Thr Ser

250

Pro Leu

Asp Leu

Tyr Leu

Cys Cys

Tyr Ile 110

Gln Pro

125

Trp Cys

Asn Leu

140

Thr Pro

Met Met

Asn Arg

Ala Pro

205

Val Ile 220

Val Ala

Leu Pro

Met Leu

Ala Pro

285

Ala Leu 300

Ser Ser

Thr Phe

Glu Thr

175

Arg Tyr 190

Ser Pro

Val Arg

Pro Leu

Ser Gln

255

Ser Thr

270

Thr Pro

Glu Asp

Thr 80

Lys

Pro

Phe

Ser

Phe 160

Glu

Glu

Leu

Arg

Phe 240

Tyr

Ser

Gly

Gly

- 69 043083

Gly Ser Ala His Gly 305

Val Phe Leu Leu Asn 310

Ser Asn Ala Met Asp 315

Val Leu Gln Pro Ser

325

Pro Ala Leu Ser Trp

330

Arg Ser Thr Gly Gly

335

Leu Asp Val Tyr Ile

340

Phe Leu Gly Pro Glu

345

Pro Lys Ser Val Val

350

Gln Tyr Leu Asp Val

355

Val Gly Tyr Pro Phe

360

Met Pro Pro Tyr Trp

365

Leu Gly Phe His Leu

370

Cys Arg Trp Gly Tyr

375

Ser Ser Thr Ala Ile

380

Arg Gln Val Val Glu 385

Asn Met Thr Arg Ala 390

His Phe Pro Leu Asp 395

Gln Trp Asn Asp Leu

405

Asp Tyr Met Asp Ser

410

Arg Arg Asp Phe Thr

415

Asn Lys Asp Gly Phe

420

Arg Asp Phe Pro Ala

425

Met Val Gln Glu Leu

430

Gln Gly Gly Arg Arg 435

Tyr Met Met Ile Val

440

Asp Pro Ala Ile Ser 445

Ser Gly Pro Ala Gly

450

Ser Tyr Arg Pro Tyr

455

Asp Glu Gly Leu Arg

460

Gly Val Phe Ile Thr 465

Asn Glu Thr Gly Gln 470

Pro Leu Ile Gly Lys 475

Trp Pro Gly Ser Thr

485

Ala Phe Pro Asp Phe

490

Thr Asn Pro Thr Ala

495

Ala Trp Trp Glu Asp

500

Met Val Ala Glu Phe

505

His Asp Gln Val Pro

510

Asp Gly Met Trp Ile 515

Asp Met Asn Glu Pro 520

Ser Asn Phe Ile Arg

525

Ser Glu Asp Gly Cys

530

Pro Asn Asn Glu Leu

535

Glu Asn Pro Pro Tyr 540

Pro Gly Val Val Gly 545

Gly Thr Leu Gln Ala 550

Ala Thr Ile Cys Ala 555

Val 320

Ile

Gln

Gly

Thr

Val 400

Phe

His

Ser

Arg

Val 480

Leu

Phe

Gly

Val

Ser 560

- 70 043083

Ser

Leu

Thr

Tyr

Ala 625

Leu

Leu

Asn

Glu

Leu 705

Glu

Thr

Thr

Leu

Ser 785

Glu

His Gln Phe

Thr Glu Ala

580

Arg Pro Phe

595

Ala Gly His 610

Ser Ser Val

Val Gly Ala

Cys Val Arg

660

His Asn Ser

675

Pro Ala Gln 690

Leu Pro His

Thr Val Ala

Trp Thr Val

740

Pro Val Leu

755

Gly Thr Trp 770

Leu Pro Pro

Gly Gln Trp

Leu Ser Thr 565

Ile Ala Ser

Val Ile Ser

Trp Thr Gly

615

Pro Glu Ile

630

Asp Val Cys 645

Trp Thr Gln

Leu Leu Ser

Gln Ala Met

695

Leu Tyr Thr

710

Arg Pro Leu 725

Asp His Gln

Gln Ala Gly

Tyr Asp Leu

775

Pro Pro Ala

790

Val Thr Leu 805

His Tyr Asn

570

His Arg Ala

585

Arg Ser Thr 600

Asp Val Trp

Leu Gln Phe

Gly Phe Leu

650

Leu Gly Ala

665

Leu Pro Gln 680

Arg Lys Ala

Leu Phe His

Phe Leu Glu

730

Leu Leu Trp

745

Lys Ala Glu 760

Gln Thr Val

Ala Pro Arg

Pro Ala Pro

810

Leu His Asn

Leu Val Lys

Phe Ala Gly

605

Ser Ser Trp 620

Asn Leu Leu 635

Gly Asn Thr

Phe Tyr Pro

Glu Pro Tyr

685

Leu Thr Leu

700

Gln Ala His 715

Phe Pro Lys

Gly Glu Ala

Val Thr Gly

765

Pro Val Glu

780

Glu Pro Ala 795

Leu Asp Thr

Leu Tyr Gly

575

Ala Arg Gly 590

His Gly Arg

Glu Gln Leu

Gly Val Pro

640

Ser Glu Glu

655

Phe Met Arg 670

Ser Phe Ser

Arg Tyr Ala

Val Ala Gly

720

Asp Ser Ser

735

Leu Leu Ile 750

Tyr Phe Pro

Ala Leu Gly

Ile His Ser

800

Ile Asn Val

815

- 71 043083

His Leu Arg Ala Gly

820

Tyr Ile Ile Pro Leu

825

Gln Gly Pro Gly Leu

830

Thr Thr Glu Ser Arg

835

Gln Gln Pro Met Ala

840

Leu Ala Val Ala Leu

845

Lys Gly Gly Glu Ala

850

Arg Gly Glu Leu Phe

855

Trp Asp Asp Gly Glu 860

Leu Glu Val Leu Glu 865

Arg Gly Ala Tyr Thr 870

Gln Val Ile Phe Leu 875

Arg Asn Asn Thr Ile

885

Val Asn Glu Leu Val

890

Arg Val Thr Ser Glu

895

Ala Gly Leu Gln Leu

900

Gln Lys Val Thr Val

905

Leu Gly Val Ala Thr

910

Pro Gln Gln Val Leu

915

Ser Asn Gly Val Pro

920

Val Ser Asn Phe Thr

925

Ser Pro Asp Thr Lys 930

Val Leu Asp Ile Cys

935

Val Ser Leu Leu Met

940

Thr

Thr

Ser

Ala 880

Gly

Ala

Tyr

Gly

Glu Gln Phe Leu Val 945

Ser Trp Cys 950 <210>6 <211>896 < 212> БЕЛОК < 213> Homo sapiens < 400>6

Gln Gln Gly Ala Ser 15

Arg Pro Gly Pro Arg

Asp Ala Gln Ala His 15

Gly Arg Pro Arg Ala

Val Pro Thr Gln Cys

Asp Val Pro Pro Asn

Arg Phe Asp Cys Ala 35

Pro Asp Lys Ala Ile 40

Thr Gln Glu Gln Cys 45

Ala Arg Gly Cys Cys 50

Tyr Ile Pro Ala Lys 55

Gln Gly Leu Gln Gly 60

Gln Met Gly Gln Pro 65

Trp Cys Phe Phe Pro 70

Pro Ser Tyr Pro Ser 75

Pro

Ser

Glu

Ala

Tyr 80

- 72 043083

Lys Leu Glu Asn Leu 85

Ser Ser Ser Glu Met

Gly Tyr Thr Ala Thr 95

Thr Arg Thr Thr Pro

100

Thr Phe Phe Pro Lys

105

Asp Ile Leu Thr Leu

110

Leu Asp Val Met Met 115

Glu Thr Glu Asn Arg 120

Leu His Phe Thr Ile

125

Asp Pro Ala Asn Arg

130

Arg Tyr Glu Val Pro

135

Leu Glu Thr Pro Arg

140

His Ser Arg Ala Pro 145

Ser Pro Leu Tyr Ser 150

Val Glu Phe Ser Glu 155

Pro Phe Gly Val Ile

165

Val His Arg Gln Leu

170

Asp Gly Arg Val Leu

175

Asn Thr Thr Val Ala

180

Pro Leu Phe Phe Ala

185

Asp Gln Phe Leu Gln

190

Ser Thr Ser Leu Pro

195

Ser Gln Tyr Ile Thr 200

Gly Leu Ala Glu His

205

Ser Pro Leu Met Leu

210

Ser Thr Ser Trp Thr

215

Arg Ile Thr Leu Trp 220

Arg Asp Leu Ala Pro 225

Thr Pro Gly Ala Asn 230

Leu Tyr Gly Ser His 235

Phe Tyr Leu Ala Leu

245

Glu Asp Gly Gly Ser

250

Ala His Gly Val Phe

255

Leu Asn Ser Asn Ala

260

Met Asp Val Val Leu

265

Gln Pro Ser Pro Ala

270

Ser Trp Arg Ser Thr

275

Gly Gly Ile Leu Asp 280

Val Tyr Ile Phe Leu

285

Pro Glu Pro Lys Ser 290

Val Val Gln Gln Tyr

295

Leu Asp Val Val Gly

300

Pro Phe Met Pro Pro 305

Tyr Trp Gly Leu Gly 310

Phe His Leu Cys Arg 315

Gly Tyr Ser Ser Thr

Ala Ile Thr Arg Gln

Val Val Glu Asn Met

Leu

Arg

Lys

Val

Glu 160

Leu

Leu

Leu

Asn

Pro 240

Leu

Leu

Gly

Tyr

Trp 320

Thr

- 73 043083

Asn Asp Leu Asp Tyr

350

325

330

335

Arg Ala His Phe Pro

340

Leu Asp Val Gln Trp

345

Asp Ser Arg Arg Asp 355

Phe Thr Phe Asn Lys 360

Asp Gly Phe Arg Asp 365

Pro Ala Met Val Gln

370

Glu Leu His Gln Gly

375

Gly Arg Arg Tyr Met

380

Ile Val Asp Pro Ala 385

Ile Ser Ser Ser Gly 390

Pro Ala Gly Ser Tyr 395

Pro Tyr Asp Glu Gly

405

Leu Arg Arg Gly Val

410

Phe Ile Thr Asn Glu

415

Gly Gln Pro Leu Ile

420

Gly Lys Val Trp Pro

425

Gly Ser Thr Ala Phe

430

Asp Phe Thr Asn Pro 435

Thr Ala Leu Ala Trp 440

Trp Glu Asp Met Val 445

Glu Phe His Asp Gln 450

Val Pro Phe Asp Gly

455

Met Trp Ile Asp Met 460

Glu Pro Ser Asn Phe 465

Ile Arg Gly Ser Glu 470

Asp Gly Cys Pro Asn 475

Glu Leu Glu Asn Pro

485

Pro Tyr Val Pro Gly

490

Val Val Gly Gly Thr

495

Gln Ala Ala Thr Ile

500

Cys Ala Ser Ser His

505

Gln Phe Leu Ser Thr

510

Tyr Asn Leu His Asn 515

Leu Tyr Gly Leu Thr 520

Glu Ala Ile Ala Ser

525

Arg Ala Leu Val Lys

530

Ala Arg Gly Thr Arg

535

Pro Phe Val Ile Ser

540

Ser Thr Phe Ala Gly 545

His Gly Arg Tyr Ala 550

Gly His Trp Thr Gly 555

Val Trp Ser Ser Trp

565

Glu Gln Leu Ala Ser

570

Ser Val Pro Glu Ile

575

Met

Phe

Met

Arg 400

Thr

Pro

Ala

Asn

Asn 480

Leu

His

His

Arg

Asp 560

Leu

- 74 043083

Gln

Phe

Asn

Leu 580

Leu

Gly

Val

Pro

Leu 585

Val

Gly

Ala

Asp

Val 590

Cys

Gly

Phe

Leu

Gly 595

Asn

Thr

Ser

Glu

Glu 600

Leu

Cys

Val

Arg

Trp 605

Thr

Gln

Leu

Gly

Ala 610

Phe

Tyr

Pro

Phe

Met 615

Arg

Asn

His

Asn

Ser 620

Leu

Leu

Ser

Leu

Pro 625

Gln

Glu

Pro

Tyr

Ser 630

Phe

Ser

Glu

Pro

Ala 635

Gln

Gln

Ala

Met

Arg 640

Lys

Ala

Leu

Thr

Leu 645

Arg

Tyr

Ala

Leu

Leu 650

Pro

His

Leu

Tyr

Thr 655

Leu

Phe

His

Gln

Ala 660

His

Val

Ala

Gly

Glu 665

Thr

Val

Ala

Arg

Pro 670

Leu

Phe

Leu

Glu

Phe 675

Pro

Lys

Asp

Ser

Ser 680

Thr

Trp

Thr

Val

Asp 685

His

Gln

Leu

Leu

Trp 690

Gly

Glu

Ala

Leu

Leu 695

Ile

Thr

Pro

Val

Leu 700

Gln

Ala

Gly

Lys

Ala 705

Glu

Val

Thr

Gly

Tyr 710

Phe

Pro

Leu

Gly

Thr 715

Trp

Tyr

Asp

Leu

Gln 720

Thr

Val

Pro

Ile

Glu 725

Ala

Leu

Gly

Ser

Leu 730

Pro

Pro

Pro

Pro

Ala 735

Ala

Pro

Arg

Glu

Pro 740

Ala

Ile

His

Ser

Glu 745

Gly

Gln

Trp

Val

Thr 750

Leu

Pro

Ala

Pro

Leu 755

Asp

Thr

Ile

Asn

Val 760

His

Leu

Arg

Ala

Gly 765

Tyr

Ile

Ile

Pro

Leu 770

Gln

Gly

Pro

Gly

Leu 775

Thr

Thr

Thr

Glu

Ser 780

Arg

Gln

Gln

Pro

Met 785

Ala

Leu

Ala

Val

Ala 790

Leu

Thr

Lys

Gly

Gly 795

Glu

Ala

Arg

Gly

Glu 800

Leu

Phe

Trp

Asp

Asp 805

Gly

Glu

Ser

Leu

Glu 810

Val

Leu

Glu

Arg

Gly 815

Ala

Tyr

Thr

Gln

Val 820

Ile

Phe

Leu

Ala

Arg 825

Asn

Asn

Thr

Ile

Val 830

Asn

Glu

- 75 043083

Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val 835 840845

Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly 850 855860

Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val LeuAsp

865 870 875880

Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser TrpCys

885 890895

Claims (17)

1. Способ лечения болезни Помпе у пациента, нуждающегося в этом, включающий введение пациенту первой композиции, содержащей молекулы рекомбинантной кислой α-глюкозидазы человека (rhGAA), и второй композиции, содержащей миглустат, где первая композиция вводится внутривенно в дозе, составляющей от 5 до 20 мг/кг, и вторая композиция вводится перорально в дозе, составляющей 260 или 130 мг; и где молекулы rhGAA получают из клеток яичника китайского хомячка (CHO), молекулы rhGAA содержат семь потенциальных сайтов N-гликозилирования в следующих положениях SEQ ID NO: 5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 и N869, 40-60% N-гликанов в молекулах rhGAA представляют собой Nгликаны комплексного типа, и по меньшей мере 50% молекул rhGAA имеют звено бис-маннозо-6фосфата (6ис-М6Р) в первом потенциальном сайте N-гликозилирования.

2. Способ по п.1, где молекулы rhGAA содержат последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 5.

3. Способ по п.1, где молекулы rhGAA экспрессируются как имеющие:

(i) последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 4; или (ii) последовательность SEQ ID NO: 4, где молекулы rhGAA подвергаются посттрансляционной модификации, при которой удаляются первые 56 аминокислот.

4. Способ по любому из пп.1-3, где по меньшей мере 55% молекул rhGAA имеют звено 6ис-М6Р в первом потенциальном сайте N-гликозилирования.

5. Способ по любому из пп.1-4, где по меньшей мере 70% молекул rhGAA являются фосфорилированными в первом потенциальном сайте N-гликозилирования.

6. Способ по любому из пп.1-5, где по меньшей мере 40% молекул rhGAA имеют звено мономаннозо-6-фосфата (моно-М6Р) во втором потенциальном сайте N-гликозилирования.

7. Способ по любому из пп.1-6, где по меньшей мере 40% молекул rhGAA имеют звено 6ис-М6Р в четвертом потенциальном сайте N-гликозилирования.

8. Способ по любому из пп.1-7, где по меньшей мере 25% молекул rhGAA имеют звено моно-М6Р в четвертом потенциальном сайте N-гликозилирования.

9. Способ по любому из пп.1-8, где до 60% N-гликанов в молекулах rhGAA являются полностью сиалированными.

10. Способ по п.9, где от 4 до 20% N-гликанов в молекулах rhGAA являются полностью сиалированными.

11. Способ по п.9 или 10, где по меньшей мере 20% молекул rhGAA имеют сиаловую кислоту в третьем потенциальном сайте N-гликозилирования.

12. Способ по любому из пп.9-11, где по меньшей мере 70% молекул rhGAA имеют сиаловую кислоту в пятом потенциальном сайте N-гликозилирования.

13. Способ по любому из пп.9-12, где по меньшей мере 80% молекул rhGAA имеют сиаловую кислоту в шестом потенциальном сайте N-гликозилирования.

14. Способ по любому из пп.1-3, где:

(a) по меньшей мере 40% молекул rhGAA имеют звено моно-М6Р во втором потенциальном сайте N-гликозилирования;

(b) по меньшей мере 20% молекул rhGAA имеют сиаловую кислоту в третьем потенциальном сайте N-гликозилирования;

(c) по меньшей мере 40% молекул rhGAA имеют звено 6ис-М6Р в четвертом потенциальном сайте N-гликозилирования;

(d) по меньшей мере 25% молекул rhGAA имеют звено моно-М6Р в четвертом потенциальном сайте

- 76 043083

N-гликозилирования и (e) по меньшей мере 70% молекул rhGAA имеют сиаловую кислоту в пятом потенциальном сайте

N-гликозилирования.

15. Способ по п.14, где по меньшей мере 80% молекул rhGAA имеют сиаловую кислоту в шестом потенциальном сайте N-гликозилирования, и где от 4 до 20% N-гликанов в молекулах rhGAA являются полностью сиалированными.

16. Способ по п.14 или 15, где по меньшей мере 55% молекул rhGAA имеют звено 6ис-М6Р в первом потенциальном сайте N-гликозилирования.

17. Способ по любому из пп.1-16, где первая композиция вводится в течение примерно 4 ч.