TW202245830A - 重組人類酸性α-葡萄糖苷酶及其用途 - Google Patents

重組人類酸性α-葡萄糖苷酶及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供治療龐貝症之方法，其包含投與重組人類酸性α-葡萄糖苷酶分子群或其醫藥組合物或調配物，及藥理伴護子。

Description

重組人類酸性α-葡萄糖苷酶及其用途
本發明係關於重組人類α-葡糖苷酶（rhGAA）及用於龐貝症之處理。
龐貝症為由酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）活性缺乏而產生之遺傳性溶酶體貯積病。患有龐貝症之個體缺乏或具有降低含量之酸性α-葡萄糖苷酶（GAA），該酶將肝糖分解成葡萄糖，為肌肉之主要能量來源。此酶缺乏造成過量肝醣累積於溶酶體中，溶酶體為含有通常分解肝醣之酶及其他細胞碎片或廢棄物的細胞內的細胞器。肝醣在患有龐貝症之個體的某些組織（尤其肌肉）中累積削弱細胞發揮正常功能之能力。在龐貝症下，肝醣並未適當代謝且逐漸累積於溶酶體中，尤其累積於骨骼肌細胞，且在該疾病之嬰兒發病形式下，心臟肌細胞之溶酶體中。肝醣累積損害肌肉及神經細胞以及其他受影響組織中之肌肉及神經細胞。
龐貝症視發病年齡而定在傳統上臨床識別為早期嬰兒形式或晚期發病形式。發病年齡往往會平行於引起龐貝症之遺傳突變的嚴重程度。最嚴重的遺傳突變引起GAA活性完全喪失，且在嬰兒期期間表現為早期發作疾病。降低GAA活性但未消除其之基因突變係與延遲發病及進展之龐貝症形式相關。嬰兒發病型龐貝症在出生後不久顯示，且其特徵為肌肉無力、呼吸功能不全及心臟衰竭。未經治療，其通常在兩年內致命。青少年及成人發病型龐貝症在生命後期顯示，且通常比嬰兒發病型疾病進展更緩慢。雖然此形式之疾病一般不影響心臟，但其亦可引起死亡，因為骨胳肌及參與呼吸之骨胳肌弱化。
龐貝症之當前非緩解性治療涉及使用在商標LUMIZYME®及MYOZYME®下出售之重組阿糖苷酶α產物進行之酶替代療法（ERT）。此習知酶替代療法試圖藉由投與rhGAA替換溶酶體中之缺失的GAA來治療龐貝症，因此恢復細胞分解溶酶體肝糖之能力。LUMIZYME®及MYOZYME®為習知形式之rhGAA，由Genzyme作為生物製劑產生或出售，且由美國食品藥物管理局核准，且由參考《醫師桌上手冊（ Physician's Desk Reference）》（2014）描述（其以引用的方式併入本文中）。阿糖苷酶α經鑑別為化學名稱[199-精胺酸，223-組胺酸]前原-α-葡糖苷酶（人類）；分子式，C 4758H 7262N 1274O 1369S 35；CAS編號420794-05-0。向患有龐貝症之個體投與此等產物，亦稱為II型肝糖貯積病（GSD-II）或酸性麥芽糖酵素缺乏症。
然而，當前ERT充其量在有限的時間內對肌肉功能、力量及呼吸功能之量測提供有限的改善，接著此等參數緩慢下降（Toscano and Schoser 2013；Wyatt等人2012）。
2012年，在患有遲發性龐貝症（LOPD）之個體中進行之所有研究的系統回顧藉由Toscano及Schoser 2013進行。審查包括來自公開研究之患有LOPD之368名個體的資料，包括接受阿糖苷酶α持續至少2年的27名青少年個體（年齡範圍：2至17歲）及251名成年個體。結果指示，＞30%之個體在經阿糖苷酶α處理期間未展現出初始改善且儘管接受處理，亦持續經歷肌肉及呼吸道功能退化。在最初對阿糖苷酶α處理反應之個體組中，若干額外長期研究顯示改善通常持續僅約2年。其後，個體通常在開始逐漸下降之前達到平穩。
2012年，作為英國國家衛生研究院之一部分（Wyatt等人2012），英國健康技術評價方案發佈了對81名接受當前經核准ERT標準照護阿糖苷酶α之患有龐貝症之患者（包括嬰兒發病型及遲發性形式（兒童及成年人））的追蹤資料審查中得出的建議。評定用於龐貝症進展（用力肺活量、呼吸器依賴、活動性、6分鐘步行測試、肌肉強度及身體質量指數）之關鍵標記物且使用對阿糖苷酶α治療之處理時間進行建模。此評估結果指示，LOPD患者之FVC、6分鐘步行測試及肌肉強度之改善在開始用阿糖苷酶α進行ERT之後前2年出現，且在超出此時間範圍之持續性處理下出現減退。另外，38名患有接受阿糖苷酶α之LOPD的個體中之3年研究顯示，個體在處理第一年展現出運動功能改善，第二年通常保持穩定，且第三年開始減退（Regnery等人2012）。
此外，對3期LUMIZYME® （Genzyme Corporation）研究之10年追蹤的報導顯示，在處理之前幾年經歷運動及肺部功能之一些改善之後，個體開始隨著進行中的處理而緩慢下降（van der Ploeg等人2017）。在該研究中，自接受治療第3年及第6年，預測基線6分鐘步行距離之百分比平均下降約10%，其中約80%個體經歷下降。
對於阿糖苷酶α之最嚴重耐受性問題為發生輸注相關反應（IAR），其在一些情況下可包括危及生命的全身性過敏反應或其他嚴重過敏反應（MYOZYME® Summary of Product Characteristics, December 2018）。此等事件之管理包括劑量降低、降低之輸注速率及延長之輸注時間及劑量中斷或停止。使用抗組織胺及類固醇之術前用藥（在輸注之前）亦經常用於預防或降低IAR及與阿糖苷酶α輸注相關之過敏反應的發生率及嚴重程度。儘管採取此等量測，患有龐貝症之患者仍可能經歷IAR，且一些患者無法耐受當前核准之ERT的常規輸注。
2017年，藉由歐洲龐貝氏聯盟（來自龐貝症領域之11個歐洲國家的專家網絡）進行之文獻的系統回顧（van der Ploeg等人2017）。基於自一個臨床研究及43個所觀測研究獲得之資料，其覆蓋總共586個個別成年個體，藉由聯盟評定在群組層面下ERT作用之證據。當前歐洲龐貝聯盟共識為在出現嚴重IAR或疾病症狀之進行性臨床惡化，以及出現高中和抗體（Ab）效價時停止ERT治療，從而有效地不活化現有ERT處理。歐洲龐貝聯盟共識建議亦包括在已停止ERT之後疾病進展及臨床惡化再現之情況下考慮再起始ERT處理。
因此，仍需要鑑別可有效治療龐貝症且減少不良事件的改善之rhGAA療法。
rhGAA分子之細胞吸收係藉由專用碳水化合物甘露糖-6-磷酸鹽（M6P）促進，其結合至存在於諸如肌肉細胞之目標細胞上的陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸鹽受體（CIMPR）。在結合之後，rhGAA分子藉由目標細胞吸收且隨後轉移至細胞內之溶酶體中。然而，大部分習知rhGAA產物缺乏較高總含量之攜帶單M6P及雙M6P的N-聚醣（亦即，分別攜帶一個M6P殘基之N-聚醣或攜帶兩個M6P殘基之N-聚醣），其限制其經由CIMPR及溶酶體遞送之細胞吸收，由此使習知酶替代療法不夠有效。舉例而言，雖然在20 mg/kg或更高劑量下之習知rhGAA產物確實改善龐貝症之一些態樣，但其未能充分（尤其） （i）治療潛在細胞功能障礙，（ii）恢復肌肉結構，或（iii）降低許多目標組織，諸如骨骼肌中之肝糖積聚，以逆轉疾病進展。此外，更高劑量可對個體以及治療個體之醫療專業人員施加額外負擔，諸如延長靜脈內投與rhGAA所需之輸液時間。
GAA或rhGAA之醣基化可經酶，諸如Canfield等人之美國專利第6,534,300號所述之磷酸轉移酶及未覆蓋酶活體外修飾，以產生M6P組。然而，酶醣基化無法充分受控制，且可產生具有非所需免疫學及藥理學特性之rhGAA。經酶修飾之rhGAA可能僅含有高甘露糖寡醣，其全部可潛在地用磷酸轉移酶或未覆蓋酶活體外以酶方式磷酸化。由活體外酶處理GAA產生之醣基化模式存在問題，因為額外末端甘露糖殘基，尤其非磷酸化末端甘露糖殘基負面影響經修飾之rhGAA的藥物動力學。當活體內投與此類以酶方式修飾之產物時，此等甘露糖基團增加GAA之非有效清除，增加免疫細胞對以酶促方式修飾之GAA的吸收及由於較少GAA到達所靶向組織（諸如心臟或骨骼肌肌細胞）而減少rhGAA治療功效。舉例而言，末端非磷酸化甘露糖殘基為肝及脾中甘露糖受體之已知配位體，其引起快速清除以酶促方式修飾之rhGAA且減少rhGAA靶向目標組織。此外，具有含末端非磷酸化甘露糖殘基的高甘露糖N-聚醣之以酶促方式修飾之GAA之糖基化模式在以酵母及黴菌生成之醣蛋白，及增加觸發免疫或過敏反應（諸如危及生命之嚴重過敏（allergic/anaphylactic）或超敏反應）的風險方面類似於以酶促方式修飾之rhGAA。
與習知重組rhGAA產物及活體外磷酸化之rhGAA相比，用於根據本發明之雙組分治療的rhGAA具有用於增加之生物分佈及溶酶體吸收之最佳化N-聚醣型式，藉此使rhGAA在投與後之非生產性清除降至最低。本揭露內容為穩定或下降的龐貝患者提供在細胞層面下逆轉疾病進展之有效治療——包括比當前標準照護更有效地清除溶酶體肝糖。經包含rhGAA及藥理伴護子（例如，美格魯特）的本揭露內容之雙組分處理之患者展現出顯著健康改善，包括肌肉強度、運動功能及/或肺部功能改善，及/或包括疾病進展之逆轉，如來自臨床研究之各種功效結果（例如，實例8及9）所證明。
本文提供一種治療個體之諸如龐貝症之疾病或病症的方法，其包含投與重組人類酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）分子群及藥理伴護子（例如，美格魯特）。
本文所描述之rhGAA分子可在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現且包含七個潛在的N-醣基化位點。在一些實施例中，如本文所描述之rhGAA分子群的N-醣基化型式係使用液相層析串聯質譜分析（LC-MS/MS）確定。在一些實施例中，rhGAA分子平均包含每莫耳rhGAA之3-4莫耳的甘露糖-6-磷酸鹽（M6P）殘基。在一些實施例中，rhGAA分子平均包含在第一潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA之約至少0.5莫耳雙磷酸化N-聚醣基團（雙M6P）。在一些實施例中，rhGAA包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6具有至少95%之一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，rhGAA包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6一致之胺基酸序列。在一些實施例中，rhGAA分子之至少30%分子包含攜帶一或兩個M6P殘基之一或多個N-聚醣單元。在一些實施例中，rhGAA分子包含平均每莫耳rhGAA約0.5莫耳至約7.0莫耳之攜帶一或兩個M6P殘基之N-聚醣單元。在一些實施例中，rhGAA分子包含每莫耳rhGAA平均2.0至8.0莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA分子包含每莫耳rhGAA平均至少2.5莫耳M6P殘基及每莫耳rhGAA至少4莫耳唾液酸殘基。在一些實施例中，在第一潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均3-4莫耳M6P殘基及每莫耳rhGAA平均約至少0.5莫耳雙M6P的rhGAA分子進一步包含在第二潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA平均約0.4至約0.6莫耳單磷酸化N-聚醣（單M6P），在第四潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.4至約0.6莫耳雙M6P及在第四潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.3至約0.4莫耳單M6P。在一些實施例中，rhGAA分子進一步包含每莫耳rhGAA平均約4莫耳至約7.3莫耳唾液酸殘基，包括在第三潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.9至約1.2莫耳唾液酸，在第五潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.8至約0.9莫耳唾液酸，及在第六潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約1.5至約4.2莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA分子群係在醫藥組合物中調配。在一些實施例中，包含rhGAA分子群之醫藥組合物進一步包含至少一種選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合組成之群的緩衝液，及至少一種選自由甘露糖醇、聚山梨醇酯80及其組合組成之群的賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物之pH為約5.0至約7.0、約5.0至約6.0或約6.0。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含水、酸化劑、鹼化劑或其組合。在一些實施例中，醫藥組合物之pH為6.0且包含約5-50 mg/mL之rhGAA分子群、約10-100 mM之檸檬酸鈉緩衝液、約10-50 mg/mL甘露糖醇、約0.1-1 mg/mL聚山梨醇酯80及水，且視情況包含酸化劑及/或鹼化劑。在一些實施例中，醫藥組合物之pH為6.0且包含約15 mg/mL之rhGAA分子群、約25 mM檸檬酸鈉緩衝液、約20 mg/mL甘露糖醇、約0.5 mg/mL聚山梨醇酯80及水，且視情況包含酸化劑及/或鹼化劑。
在一些實施例中，rhGAA分子群係以約1 mg/kg至約100 mg/kg或約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子群係以約20 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA分子群係兩月一次、每月、每兩週、每週、每週兩次或每日，例如每兩週投與。在一些實施例中，rhGAA分子群經靜脈內投與。
在一些實施例中，rhGAA分子群係與藥理伴護子，諸如美格魯特（亦稱為AT2221），或其醫藥學上可接受之鹽同時或依序投與。在一些實施例中，美格魯特(miglustat)或其醫藥學上可接受之鹽係例如以約50 mg至約200 mg或約200 mg至約600 mg，及任擇地約130 mg、約195 mg或約260 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA分子群係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係以約233 mg至約500 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA分子群係以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係以約50 mg至約200 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA分子群係以約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係以約260 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA分子群係以約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係以約195 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係在投與rhGAA分子群之前（例如，在投與rhGAA分子群之前約一小時）投與。在至少一個實施例中，個體在投與該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽之前至少兩小時及在投與該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽之後至少兩小時禁食。
本發明之實施例展現出本文所描述之雙組分療法治療且逆轉患有龐貝症之個體之疾病進展的功效。在一些實施例中，該個體經歷過ERT之患者。在一些實施例中，該個體為未經ERT處理之患者。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療與（1）基線，或（2）包含投與阿糖苷酶α及用於藥理伴護子之安慰劑之對照處理相比改善具有龐貝症之個體的一或多個疾病症狀。在此類對照處理中，投與安慰劑而非藥理伴護子。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由6分鐘步行測試（6MWT）所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之6分鐘步行距離（6MWD）在12、26、38或52週處理之後增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或50公尺或至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中，該個體之6MWD在52週處理之後增加至少20公尺或至少5%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在12、26、38或52週處理之後改善至少5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40或50公尺。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在52週處理之後改善至少13公尺。在一些實施例中，該個體具有低於300公尺之基線6MWD。在一些實施例中，該個體具有大於或等於300公尺之基線6MWD。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療使該個體之肺部功能穩定，如藉由用力肺活量（FVC）測試所量測。在一些實施例中，在12、26、38或52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加，或與基線相比降低不到0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中，在52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比降低不到1%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在12、26、38或52週處理之後顯著改善至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%或6%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在52週處理後顯著改善至少3%。在一些實施例中，該個體具有低於55%之基線FVC。在一些實施例中，該個體具有大於或等於55%之基線FVC。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由步態、樓梯、高爾、椅子（GSGC）測試所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分改善，如藉由在12、26、38或52週處理之後降低至少0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5或2.5點指示。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分得到改善，如藉由在52週處理之後降低至少0.5點所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在12、26、38或52週處理之後降低至少0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.5或5點所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在52週處理之後降低至少1.0點所指示。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療在處理後降低至少一種肌肉損傷標記物含量。在一些實施例中，至少一種肌肉損傷標記物包含肌酸激酶（CK）。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在52週處理之後降低至少20%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在12、26、38、或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在52週處理之後顯著降低至少30%。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療在處理後降低至少一種肝糖累積標記物含量。在一些實施例中，至少一種肝糖累積標記物包含尿液己醣四醣（Hex4）。在一些實施例中，與基線相比，該個體之泌尿Hex4含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少30%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後顯著降低至少40%。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療與（1）基線，或（2）包含投與阿糖苷酶α及用於藥理伴護子之安慰劑的對照處理相比改善患有龐貝症之經歷過ERT的患者個體之一或多個疾病症狀。
在一些實施例中，對於患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由6MWT所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之6MWD在12、26、38或52週處理之後增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或50公尺或至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中，該個體之6MWD在52週處理之後增加至少15公尺或至少5%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在12、26、38或52週處理之後顯著改善至少10、12、14、15、16、18、20、30、40或50公尺。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在52週處理之後改善至少15公尺。在一些實施例中，該個體具有低於300公尺之基線6MWD。在一些實施例中，該個體具有大於或等於300公尺之基線6MWD。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療改善該個體之肺部功能，如藉由FVC測試所量測。在一些實施例中，在12、26、38或52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5%。在一些實施例中，在52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加至少0.1%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在12、26、38或52週處理之後顯著改善至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%或10%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在52週處理後顯著改善至少4%。在一些實施例中，該個體具有低於55%之基線FVC。在一些實施例中，該個體具有大於或等於55%之基線FVC。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由GSGC測試所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分在12、26、38或52週處理之後得到改善，如藉由至少0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5或2.5點降低所指示。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分在52週處理之後得到改善，如藉由至少0.5點降低所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在12、26、38或52週處理之後降低至少0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.5或5點所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在52週處理之後降低至少1.0點所指示。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療在處理後降低至少一種肌肉損傷標記物含量。在一些實施例中，至少一種肌肉損傷標記物包含CK。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在52週處理之後降低至少15%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在12、26、38、或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在52週處理之後顯著降低至少30%。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療在處理後降低至少一種肝糖累積標記物含量。在一些實施例中，至少一種肝糖累積標記物包含尿液Hex4。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少25%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後顯著降低至少40%。
相關申請之交叉引用
本申請案主張2021年3月18日申請之美國臨時專利申請案第63/162,683號及2021年2月11日申請之美國臨時專利申請案第63/148,596號之益處，該等申請案中之每一者的揭示內容特此以全文引用之方式併入。
在描述本發明之數種例示性實施例之前，應理解本發明不限於闡述於以下描述中之建構或方法步驟的細節。本發明能夠具有其他實施例且能夠以各種方式實踐或進行。
本文提供一種用於治療龐貝症的方法，其包含向個體投與重組人類α-葡糖苷酶（rhGAA）及藥理伴護子。rhGAA與習知rhGAA產物相比具有更高總含量之攜帶甘露糖-6-磷酸鹽的N-聚醣，展現出優良吸收至肌肉細胞中及隨後遞送至溶酶體中，且具有使其尤其有效用於具有龐貝症之個體的酶替代療法的其他藥物動力學特性。因此，與習知療法相比，根據本發明之雙組分治療在患有龐貝症之個體中展現出治療且逆轉疾病進展之優良功效。 I. 定 義
本說明書中所用之術語在本揭示內容之上下文內及在使用各術語之特定上下文中一般具有其在所屬技術領域中之普通含義。某些術語在下文或本說明書別處論述，以在描述本發明之組合物及方法以及如何製造且使用其時向從業者提供額外指導。冠詞「一（a）及（an）」可在本文中用於指該冠詞之一個或超過一個（亦即至少一個）文法對象。除非上下文另有明確說明，術語「或」意謂術語「及/或」且可與該術語互換使用。在本申請案中，除非另外明確陳述，否則單數之使用包括複數。此外，使用術語「包括（including）」以及其他形式（諸如「包括（include/includes/included」））不具限制性。本文所描述之任何範圍應理解為包括端點及端點之間的所有值。在本說明書中，除上下文由於表述語言或必要暗示而另有要求外，字語「包含（comprise）」或其諸如「包含（comprises/comprising）」之變體以包括性含義使用，亦即，指明存在所陳述特徵，但並不排除在本發明之各種實施例中存在或增加其他特徵。
術語「GAA」係指人類酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）酶，其為催化溶酶體肝醣之α-1,4-醣苷鍵及α-1,6-醣苷鍵之水解的酶；以及GAA胺基酸序列之插入、相關或取代型變體及發揮酶活性之較長GAA序列的片段。人類酸性α-葡萄糖苷酶係由GAA基因（國家生物技術資訊中心（NCBI）基因ID 2548）編碼，其已映射至染色體17（位置17q25.2-q25.3）之長臂。GAA之例示性胺基酸序列為NP 000143.2，其以引用的方式併入。本發明亦涵蓋編碼胺基酸序列NP 000143.2之DNA序列。當前已在人類GAA基因中鑑別出超過500種突變，其中許多與龐貝症相關。引起酸性α-葡萄糖苷酶錯誤摺疊或錯誤處理之突變包括T1064C（Leu355Pro）及C2104T（Arg702Cys）。另外，影響酶成熟及加工之GAA突變包括Leu405Pro及Met519Thr。在胺基酸殘基516-521處之守恆六肽WIDMNE（SEQ ID NO: 7）為酸性α-葡萄糖苷酶蛋白質之活性所需。如本文中所用，縮寫「GAA」欲係指人類酸性α-葡萄糖苷酶，而斜體縮寫「 GAA」欲係指編碼人類酸性α-葡萄糖苷酶之人類基因。斜體縮寫「 Gaa」欲係指編碼非人類酸性α-葡萄糖苷酶之非人類基因，包括（但不限於）大鼠或小鼠基因，且縮寫「Gaa」欲係指非人類酸性α-葡萄糖苷酶。
術語「rhGAA」欲係指重組人類酸性α-葡萄糖苷酶，且用於區分來自合成或重組產生之GAA（例如由CHO細胞或經編碼GAA之DNA轉型之其他宿主細胞產生的GAA）之內源性GAA。術語「rhGAA」涵蓋個別rhGAA分子群。rhGAA分子群之特性提供於本文中。術語「習知rhGAA產物」欲係指含有阿糖苷酶α之產物，諸如LUMIZYME®或MYOZYME®。
術語「遺傳修飾」或「重組」係指在引入包含編碼基因產物之編碼序列的核酸以及控制編碼序列表現之調節元件之後表現特定基因產物（諸如rhGAA）之細胞，諸如CHO細胞。核酸之引入可藉由此項技術中已知之任何方法實現，包括基因靶向及同源重組。如本文所用，該術語亦包括已例如藉由基因活化技術經工程改造以表現或過度表現不由該細胞正常表現之內源性基因或基因產品的細胞。
如本文所使用，術語「阿糖苷酶α」欲係指經鑑別為[199-精胺酸，223-組胺酸]前原-α-葡糖苷酶（human）；化學摘要登記號420794-05-0之重組人類酸性α-葡萄糖苷酶。阿糖苷酶α經批准用於藉由Genzyme作為產物LUMIZYME®及MYOZYME®在美國銷售。
如本文所使用，術語「ATB200」欲係指U.S. 10,961,522中所描述之重組人類酸性α-葡萄糖苷酶，其揭示內容以引用的方式併入本文中。ATB200亦稱為「西帕葡糖苷酶α」。
如本文所使用，術語「聚醣」欲係指共價結合於蛋白質或多肽上之胺基酸殘基的寡醣。如本文所使用，術語「N-聚醣」或「N連接之聚醣」欲係指連接至蛋白質上之天冬醯胺殘基的多醣鏈或共價結合至天冬醯胺殘基之氮原子的多肽。在一些實施例中，連接至rhGAA之N-聚醣單元係藉由液相層析串聯質譜分析（LC-MS/MS）確定，其使用諸如Thermo Scientific TMOrbitrap Velos Pro™質譜儀、Thermo Scientific TMOrbitrap Fusion TMLumos Tribid™質譜儀或Waters Xevo® G2-XS QTof質譜儀之儀器。
如本文中所用，用力肺活量或「FVC」為在個體進行儘可能的深呼吸之後可強制性地自個體肺中呼出之空氣量。
如本文所使用，「六分鐘步行測試」（6MWT）為用於量測給人體在堅硬平坦表面總共能夠步行六分鐘之距離的測試。測試係進行使個體在六分鐘內走得儘可能遠。
如本文中所用，「十公尺步行測試」（10MWT）為用於量測個體穿著步行鞋在平坦表面上行走十公尺所需時間的測試。
如本文中所用，化合物美格魯特，亦稱為正丁基-1-脫氧野尻黴素或NB- DNJ或(2R,3R,4R,5S)-1-丁基-2-(羥基甲基)哌啶-3,4,5-三醇，為具有以下化學式之化合物：
Figure 02_image001
美格魯特之一種調配物係作為用於1型高歇氏病之單一療法以商標名ZAVESCA®商業上出售。在一些實施例中，美格魯特被稱為AT2221。
如下文所論述，美格魯特之醫藥學上可接受之鹽亦可用於本發明中。當使用美格魯特之鹽時，調節鹽之劑量以使得患者所接受之美格魯特之劑量等效於其已接受所使用之美格魯特游離鹼之量。
如本文中所用，化合物杜格魯特，亦稱為1-脫氧野尻黴素或DNJ或(2R,3R,4R,5S)-2-(羥基甲基)哌啶-3,4,5-三醇，為具有以下化學式之化合物：
Figure 02_image003
如本文所使用，術語「藥理伴護子(pharmacological chaperone)」或有時僅術語「伴護子(chaperone)」欲係指特異性結合至酸性α-葡萄糖苷酶且具有以下作用中之一或多者的分子： ● 增強蛋白質之穩定構形的形成； ● 增強蛋白質自內質網向另一細胞位置，較佳原生細胞位置之適當運輸，以便防止蛋白質之內質網相關降解； ● 防止構形上不穩定或錯誤摺疊之蛋白質的聚集； ● 恢復及/或增強蛋白質之至少部分野生型功能、穩定性及/或活性；及/或 ● 改善攜帶酸性α-葡萄糖苷酶之細胞的表現型或功能。
因此，用於酸性α-葡萄糖苷酶之藥理伴護子為結合至酸性α-葡萄糖苷酶，引起酸性α-葡萄糖苷酶之適當摺疊、運輸、非聚集及活性的分子。在至少一個實施例中，藥理伴護子為美格魯特。用於酸性α-葡萄糖苷酶之藥理伴護子的另一非限制性實例為杜格魯特。
如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」意欲指生理學上可耐受且當向人類投與時通常未產生不良反應之分子實體及組合物。較佳地，如本文所使用，術語「醫藥學上可接受」意謂聯邦或州政府之監管機構批准或列於美國藥典（U.S. Pharmacopeia）或其他公認藥典中用於動物，且更特定言之用於人類。如本文所使用，術語「載劑」意欲指與化合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。適合之醫藥載劑為此項技術中已知的，且在至少一個實施例中，描述於E. W. Martin之《雷明頓氏醫藥科學（Remington's Pharmaceutical Sciences）》第18版或其他版本中。
如本文所使用之術語「醫藥學上可接受之鹽」意謂一種鹽，其在可靠醫學判斷之範疇內、適用於與人類及低等動物之組織接觸而無不當毒性、刺激、過敏反應及其類似情況，與合理利益/風險比率相匹配，通常為水溶性或油溶性或水可分散性或油可分散性，且有效用於其預定用途。術語包括醫藥學上可接受之酸加成鹽及醫藥學上可接受之鹼加成鹽。適合鹽之清單見於S. M. Berge等人., 《醫藥科學雜誌（J. Pharm. Sci.）》, 1977, 66, 第1-19頁中，其以引用的方式併入本文中。如本文所用之術語「醫藥學上可接受之酸加成鹽」意欲意謂保留游離鹼之生物有效性及特性且在生物學上或以其他方式為非所需的，由無機酸形成的彼等鹽。如本文所用之術語「醫藥學上可接受之鹼加成鹽」意欲意謂保留游離鹼之生物有效性及特性且在生物學上或以其他方式為非所需的，由無機鹼形成的彼等鹽。
如本文所使用，術語「緩衝液」係指含有弱酸及其共軛鹼或弱鹼及其共軛酸之溶液，其有助於防止pH變化。
如本文中所用，術語「治療有效劑量」及「有效量」意欲指足以在個體中引起治療反應之酸性α-葡萄糖苷酶及/或美格魯特及/或其雙組分治療的量。
治療反應亦可包括分子反應，諸如肝醣累積、溶酶體增殖及自噬區之形成。治療反應可藉由比較用本文所描述之rhGAA處理之前及之後肌肉活體組織切片的生理及分子反應來評估。舉例而言，存在於活體組織切片樣品中之肝醣之量可用作確定治療反應之標記物。另一實例包括生物標記物，諸如LAMP-1、LC3及質膜修復蛋白，其可用作溶小體貯積症之指標。舉例而言，在用本文所描述之rhGAA處理之前及之後收集的肌肉活體組織切片可用識別生物標記物中之一者的抗體染色。治療反應亦可包括疲勞減少或其他患者報導之結果（例如日常生活活動、健康等）改善。
如本文所使用，術語「酶替代療法」或「ERT」意欲指將非天然純化酶引入至在此類酶中具有缺陷之個體中。所投與之蛋白質可獲自天然來源或藉由重組表現。該術語亦指在以其他方式需要投與純化酶或自投與純化酶受益之個體中引入純化酶。在至少一個實施例中，此類個體罹患酶不足。所引入之酶可為在活體外產生之純化重組酶，或自分離組織或流體，諸如胎盤或動物乳汁或自植物純化之蛋白質。
如本文所用，術語「雙組分療法」意欲指其中兩種或更多種個別療法同時或依序投與的任何療法。在一些實施例中，雙組分療法之結果與各療法在單獨進行時之作用相比增強。增強可包括各種療法之效應之任何改善，其相比於單獨進行時藉由療法達成之結果可產生有利結果。增強之效應或結果可包括協同增強，其中增強之效應超過在單獨執行時每一療法之累加效應；累加增強，其中該增強效應實質上等於每一療法在由自身執行時的相加效應；或低於累加效應，其中增強效應低於每一療法在自身執行時的累加效應，但仍比每一療法在單獨執行時的效果好。增強之效應可藉由可量測治療功效或結果之此項技術中已知之任何方式量測。
「龐貝症」係指常染色體隱性LSD，其特徵為缺乏酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）活性，削弱溶酶體肝醣代謝。酶缺乏導致溶酶體肝醣累積且導致在疾病晚期進行性骨骼肌無力、心臟功能降低、呼吸功能不全及/或CNS損傷。GAA基因中之基因突變導致較低表現或產生具有改變之穩定性及/或生物活性的酶突變形式，最終引起疾病（通常參見Hirschhorn R, 1995, II型肝糖貯積病：酸性葡糖苷酶（酸性麥芽糖酶）缺乏, 遺傳性疾病之代謝及分子基礎, Scriver等人, eds., McGraw-Hill, New York, 第7版., 第2443-2464頁）。龐貝症之三種經鑑別臨床形式（嬰兒、青少年及成人）與殘餘α-葡糖苷酶活性含量相關（Reuser A J等人., 1995, II型肝醣病（酸性麥芽糖酶缺乏）, Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69）。嬰兒龐貝症（I型或A）為最常見且最嚴重的，其特徵為在壽命第二年內無法茁壯成長、廣義低滲、心臟肥大及心肺衰竭。青少年龐貝症（II型或B）之嚴重程度為中等的，且其特徵為肌肉症狀突出而無心肥大。青少年龐培氏個體通常由於呼吸衰竭而在達到20歲年齡之前死亡。成人龐貝症（III或C型）通常在青少年時期或遲至第六個十年呈現為緩慢進行性肌病（Felicia K J等人., 1995, 成人酸性麥芽糖酶缺乏之臨床變化：受影響SIB之報導及文獻評述，藥學74, 131-135）。在龐貝症方面，已顯示α-葡糖苷酶藉由醣基化、磷酸化及蛋白水解處理轉譯後經廣泛修飾。需要在溶酶體中藉由蛋白分解將110千道爾頓（kDa）前驅體轉化為76及70 KDa成熟形式以用於最佳肝醣催化。如本文所用，術語「龐貝症」係指所有類型之龐貝症。本申請案中所揭示之調配物及給藥方案可用於治療例如I型、II型或III型龐貝症。
如本文所用，「顯著」係指統計顯著性。該術語係指兩個處理組之間存在差異之統計學證據。其定義為當虛無假設實際上為真時，作出拒絕虛無假設之決定的機率。通常使用p值＜0.05自用於比較之適合之統計分析得出決策。參見例如實例9。
「個體」或「患者」較佳為人類，而患有涉及肝醣累積之病症的其他哺乳動物及非人類動物亦可經治療。個體可為患有龐貝症或其他肝醣貯積或累積病症之胎兒、新生兒、兒童、青少年或成人。經治療個體之一個實例為患有GSD-II（例如，嬰兒GSD-II、青少年GSD-II或成人發病型GSD-II）之個體（胎兒、新生兒、兒童、青少年、青年或成人人類）。個體可具有殘餘GAA活性或無可量測活性。舉例而言，患有GSD-II之個體可具有小於正常GAA活性之約1%的GAA活性（嬰兒GSD-II）、正常GAA活性之約1-10%的GAA活性（青少年GSD-II）或正常GAA活性之約10-40%的GAA活性（成人GSD-II）。在一些實施例中，個體或患者為「經歷過ERT」或「ERT轉換」之患者，係指先前已接受酶替代療法之龐貝症患者。在一些實施例中，「經歷過ERT」或「ERT轉換」之患者為已接受或當前正接受阿糖苷酶α大於或等於24個月之龐貝症患者。在一些實施例中，個體或患者為「未經歷過ERT」患者，係指先前尚未接受酶替代療法之龐貝症患者。在某些實施例中，個體或患者為可走動的（例如可走動的ERT轉換患者或可走動的未經歷過ERT之患者）。在某些實施例中，個體或患者為不可走動的（例如不可走動的ERT轉換患者）。可走動或不可走動狀態可藉由六分鐘步行測試（6MWT）確定。在一些實施例中，可走動患者為能夠在6MWT中步行至少200公尺之龐貝症患者。在一些實施例中，不可走動患者為在無需幫助之情況下無法步行或坐輪椅之龐貝症患者。
如本文所用之術語「治療（treat/treatment）」係指改善與疾病相關之一或多種症狀、延遲疾病之一或多種症狀的發病及/或降低疾病之一或多種症狀的嚴重程度或頻率。舉例而言，治療可指改善心臟狀態（例如，增加末端舒張及/或末端收縮體積，或減輕或改善通常見於GSD-II中之進行性心肌病）或肺部功能（例如，增加哭肺活量超過基線能力及/或氧氣不飽和在哭期間標準化）；改善神經發育及/或運動技能（例如，增加AIMS評分）；感染疾病之個體之組織中之肝醣含量減少；或此等效果之任何組合。在一個較佳實施例中，治療包括改善心臟狀態，尤其降低GSD-II相關心肌病。
如本文所使用，術語「改善」、「增加」及「降低」指示相對於基線量測結果之值或來自對照處理之相應值，該基線量測結果諸如在開始本文所描述之處理之前同一個體中的量測結果或在不存在本文所描述之處理的情況下對照個體（或多個對照個體）中的量測結果或對照處理之後的量測結果。對照個體為罹患與經處理個體相同形式之GSD-II之個體（嬰兒、青少年抑或成人發病型），其與經處理個體之年齡約相同（以確保經處理個體與對照個體之疾病階段相當）。在一些實施例中，對照治療包含投與阿糖苷酶α及安慰劑用於藥理伴護子（參見實例9）。
如本文所用，術語「約」及「大致」一般應意謂鑒於量測之性質或精確度，所量測量之可接受的誤差程度。舉例而言，誤差程度可由針對量測所提供之有效數字之數目指示，如此項技術中所理解，且在針對量測所報導之最精確有效數中包括但不限於±1之變化。典型例示性誤差程度在指定值或值範圍之20百分比（%）內，較佳地在10%內，且更佳地在5%內。除非另外說明，否則本文中既定之數值量為近似值，意謂當未明確陳述時可推斷術語「約」或「近似」。
本文中所引用之所有參考文獻、論文、公開案、專利、專利公開案及專利申請案皆出於所有目的以全文引用的方式併入。然而，本文所引用之任何參考文獻、文章、公開案、專利、專利公開案及專利申請案之提及並非且不應視為承認或以任何形式表明其構成有效的先前技術或形成全球任何國家之公共常識之一部分。
本文所用之章節標題僅用於組織目的而不應理解為限制所描述之主題。 II. 重 組人類酸性 α- 葡萄糖苷酶（ rhGAA ）
在一些實施例中，重組人類酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）為具有如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6中所闡述之胺基酸序列的酶。在一些實施例中，rhGAA係由如SEQ ID NO: 2中所闡述之核苷酸序列編碼。 表 1. 核苷酸序列及蛋白質序 列
SEQ ID NO: 序列
1 MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGA SRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLH FTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLF FADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLA LEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGY PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDG FRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKV WPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELEN PPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVR WTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAG ETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPI EALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQP MALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQ LQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
2 cagttgggaaagctgaggttgtcgccggggccgcgggtggaggtcggggatgaggcagcaggtaggacagtgacctcggtgacgcgaaggaccccggccacctctaggttctcctcgtccgcccgttgttcagcgagggaggctctgggcctgccgcagctgacggggaaactgaggcacggagcgggcctgtaggagctgtccaggccatctccaaccatgggagtgaggcacccgccctgctcccaccggctcctggccgtctgcgccctcgtgtccttggcaaccgctgcactcctggggcacatcctactccatgatttcctgctggttccccgagagctgagtggctcctccccagtcctggaggagactcacccagctcaccagcagggagccagcagaccagggccccgggatgcccaggcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctccgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcagaggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggccaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacactgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagccgggcggagtgtgttagtctctccagagggaggctggttccccagggaagcagagcctgtgtgcgggcagcagctgtgtgcgggcctgggggttgcatgtgtcacctggagctgggcactaaccattccaagccgccgcatcgcttgtttccacctcctgggccggggctctggcccccaacgtgtctaggagagctttctccctagatcgcactgtgggccggggcctggagggctgctctgtgttaataagattgtaaggtttgccctcctcacctgttgccggcatgcgggtagtattagccacccccctccatctgttcccagcaccggagaagggggtgctcaggtggaggtgtggggtatgcacctgagctcctgcttcgcgcctgctgctctgccccaacgcgaccgcttcccggctgcccagagggctggatgcctgccggtccccgagcaagcctgggaactcaggaaaattcacaggacttgggagattctaaatcttaagtgcaattattttaataaaaggggcatttggaatc
3 MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGA SRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLH FTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLF FADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLA LEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGY PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDG FRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKV WPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELEN PPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVR WTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAG ETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPI EALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQP MALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQ LQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
4 MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGA SRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLH FTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLF FADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLA LEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGY PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDG FRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKV WPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELEN PPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVR WTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAG ETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPV EALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQP MALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQ LQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
5 QQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQG LQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETE NRLHFTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTV APLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHP FYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLD VVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTF NKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPL IGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNN ELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPF VISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEE LCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQA HVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQ TVPIEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTES RQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEG AGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
6 QQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPVEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 1中所闡述之GAA胺基酸序列，如美國專利案第8,592,362號中所描述，且具有GenBank寄存編號AHE24104.1（GI:568760974）。在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 2中所編碼之GAA胺基酸序列，mRNA序列具有GenBank寄存編號Y00839.1。在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 3中所闡述之GAA胺基酸序列。在一些實施例中，rhGAA具有如SEQ ID NO: 4中所闡述之GAA胺基酸序列，且具有國家生物技術資訊中心（NCBI）寄存編號NP_000143.2或UniProtKB寄存編號P10253。
在一些實施例中，rhGAA最初表現為具有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4中所闡述之野生型GAA之全長952胺基酸序列，且rhGAA經歷移除一部分胺基酸（例如前56個胺基酸）之胞內加工。因此，宿主細胞分泌之rhGAA的胺基酸序列比最初在細胞內表現之rhGAA短。在一些實施例中，較短蛋白質具有SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列，其僅不同於SEQ ID NO: 1，因為已移除包含訊號肽及前驅肽之前56個胺基酸，因此產生具有896個胺基酸之蛋白質。在一些實施例中，較短蛋白質具有SEQ ID NO: 6中所闡述之胺基酸序列，其僅不同於SEQ ID NO: 4，因為已移除包含訊號肽及前驅肽之前56個胺基酸，因此產生具有896個胺基酸之蛋白質。胺基酸數目之其他變化亦為可能的，諸如相對於由SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6所描述之胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代及/或插入。在一些實施例中，rhGAA產物包括具有不同胺基酸長度之重組人類酸性α-葡萄糖苷酶分子之混合物。
在一些實施例中，rhGAA包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6至少90%、95%、98%或99%一致之胺基酸序列。可使用各種比對演算法及/或程式來計算兩個序列之間的一致性，包括FASTA或BLAST，其可作為GCG序列分析包（University of Wisconsin, Madison, Wis.）之一部分獲得，且可以例如預設設置使用。舉例而言，涵蓋與本文所描述之特定多肽具有至少90%、95%、98%或99%一致性且較佳展現實質上相同功能之多肽以及編碼此類多肽之聚核苷酸。除非另外指示，否則相似性評分將基於BLOSUM62之使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性分數且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性分數。BLASTP「一致性」展示相同高得分序列中之總殘基之數目及部分；且BLASTP「正數」展示比對得分具有正值且彼此相似之殘基之數目及部分。與本文所揭示之胺基酸序列具有此等程度之一致性或相似性或任何中等程度之一致性或相似性的胺基酸序列涵蓋在內且由本發明包涵。使用基因密碼推論相似多肽之聚核苷酸序列，且可藉由習知手段，特定言之藉由使用基因密碼反向轉譯其胺基酸序列來獲得。
在一些實施例中，rhGAA在蛋白質中之一或多個胺基酸殘基處經歷轉譯後及/或化學修飾。舉例而言，甲硫胺酸及色胺酸殘基可經歷氧化。作為另一實例，SEQ ID NO: 6中之N端麩醯胺可進一步經修飾以形成焦麩胺酸鹽。作為另一實例，天冬醯胺殘基可經歷去醯胺化為天冬胺酸。作為又另一實例，天冬胺酸殘基可經歷異構化成異天冬胺酸。作為另一實例，蛋白質中之不成對半胱胺酸殘基可與游離麩胱甘肽及/或半胱胺酸形成二硫鍵。因此，在一些實施例中，酶最初表現為具有如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所闡述之胺基酸序列或由SEQ ID NO: 2編碼之胺基酸序列，且酶經歷此等轉譯後及/或化學修飾中之一或多者。此類修飾亦屬於本揭示案之範疇內。 III.  rhGAA 之 N 連接醣基化
在單一rhGAA分子上存在七個潛在N連接醣基化位點。此等潛在醣基化位點係在SEQ ID NO: 6之以下位置處：N84、N177、N334、N414、N596、N826及N869。類似地，對於SEQ ID NO: 4之全長胺基酸序列，此等潛在醣基化位點係在以下位置處：N140、N233、N390、N470、N652、N882及N925。視天冬醯胺殘基之位置而定，rhGAA之其他變異體可具有類似醣基化位點。通常，蛋白質胺基酸序列中之Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列指示潛在醣基化位點，但X不可為His或Pro。
本文所描述之rhGAA分子可在其N-聚醣上具有平均1、2、3或4個甘露糖-6-磷酸鹽（M6P）基團。舉例而言，rhGAA分子上之僅一個N-聚醣可攜帶M6P（單磷酸化或單M6P），單個N-聚醣可具有兩個M6P基團（雙磷酸化或雙M6P），或同一rhGAA分子上之兩個不同N-聚醣可各自具有單個M6P基團。在一些實施例中，本文所描述之rhGAA分子在其N-聚醣/莫耳rhGAA上平均具有3-4 mol M6P基團。重組人類酸性α-葡萄糖苷酶分子亦可具有不含M6P基團的N-聚醣。在另一實施例中，rhGAA平均包含每莫耳rhGAA大於2.5 mol M6P及每莫耳rhGAA大於4 mol唾液酸。在一些實施例中，rhGAA平均包含每莫耳rhGAA約3-3.5 mol M6P。在一些實施例中，rhGAA平均包含每莫耳rhGAA約4-5.4 mol唾液酸。rhGAA上之平均至少約3、4、5、6、7、8、9、10%或20%之總N-聚醣可呈單M6P N-聚醣形式，例如約6.25%之總N-聚醣可攜帶單M6P基團，且平均而言rhGAA上之至少約0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0%之總N-聚醣呈雙M6P N-聚醣形式，且平均低於25%之總rhGAA不含與CIMPR結合之磷酸化N-聚醣。在一些實施例中，rhGAA上之平均約10%至約14%之總N-聚醣為單磷酸化的。在一些實施例中，rhGAA上之平均約7%至約25%之總N-聚醣為雙磷酸化的。在一些實施例中，rhGAA平均包含每莫耳rhGAA約1.3 mol雙M6P。
本文所描述之rhGAA平均可為每莫耳rhGAA 0.5至7.0莫耳M6P或其任何中間值或子範圍，包括每莫耳rhGAA之0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0莫耳M6P。rhGAA可分級分離以提供具有不同平均數目之含單M6P或含雙M6P的N-聚醣之rhGAA製劑，因此准許藉由選擇特定部分或藉由選擇性組合不同部分使rhGAA進一步定製靶向至目標組織中之溶酶體。
在一些實施例中，rhGAA上至多60%之N-聚醣可經完全唾液酸化，例如，至多10%、20%、30%、40%、50%或60%之N-聚醣可完全唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA上不超過50%之N-聚醣經完全唾液酸化。在一些實施例中，總N-聚醣之4%至20%經完全唾液酸化。在其他實施例中，rhGAA上之不超過5%、10%、20%或30% N-聚醣攜帶唾液酸及末端半乳糖殘基（Gal）。此範圍包括所有中間值及子範圍，例如rhGAA上之7%至30%之總N-聚醣可攜帶唾液酸及末端半乳糖。在其他實施例中，rhGAA上之不超過5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%或20%之N-聚醣僅具有末端半乳糖且不含唾液酸。此範圍包括所有中間值及子範圍，例如組合物中rhGAA上之8%至19%之總N-聚醣可僅具有末端半乳糖且不含唾液酸。
在一些實施例中，rhGAA上之40%至60%、45%至60%、50%至60%或55%至60%之總N-聚醣為複合型N-聚醣；或rhGAA上之不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、或7%之總N-聚醣為雜合型N-聚醣；rhGAA上不超過5%、10%、15%、20%或25%之高甘露糖型N-聚醣為非磷酸化的；rhGAA上至少5%或10%之高甘露糖型N-聚醣為單磷酸化的；及/或rhGAA上至少1%或2%之高甘露糖型N-聚醣為雙磷酸化的。此等值包括所有中間值及子範圍。rhGAA可滿足上文所描述之含量範圍中之一或多者。
在一些實施例中，rhGAA可具有每莫耳rhGAA平均2.0至8.0莫耳唾液酸殘基。此範圍包括其所有中間值及子範圍，包括每莫耳rhGAA 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5及8.0 mol唾液酸殘基。在不受理論束縛之情況下，咸信存在帶有唾液酸殘基之N-聚醣單元可防止藉由去唾液酸醣蛋白受體之非有效清除rhGAA。
在一或多個實施例中，rhGAA在某些潛在N-醣基化位點處具有某一N-醣基化概況。在一些實施例中，rhGAA具有七個潛在N-醣基化位點。在一些實施例中，至少20% rhGAA在第一潛在N-醣基化位點（例如對於SEQ ID NO: 6為N84且對於SEQ ID NO: 4為N140）處磷酸化。舉例而言，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA可在第一潛在N-醣基化位點處經磷酸化。此磷酸化可為單M6P及/或雙M6P單元之結果。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處攜帶單M6P單元。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處攜帶雙M6P單元。在一些實施例中，rhGAA在第一潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約1.4莫耳M6P（單M6P及雙M6P）。在一些實施例中，rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均約至少0.5 mol雙M6P。在一些實施例中，rhGAA在第一潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均約0.25莫耳單M6P。在一些實施例中，rhGAA在第一潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約0.2莫耳至約0.3 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪之第一潛在N-醣基化位點佔有率及如圖6B中所描繪之N-醣基化型態。在至少一個實施例中rhGAA包含如圖19A中所描繪之第一潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19B或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一些實施例中，至少20% rhGAA在第二潛在N-醣基化位點處磷酸化（例如，對於SEQ ID NO: 6為N177且對於SEQ ID NO: 4為N223）。舉例而言，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA可在第二N-醣基化位點處經磷酸化。此磷酸化可為單M6P及/或雙M6P單元之結果。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA在第二N-醣基化位點處攜帶單M6P單元。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA在第二N-醣基化位點具有雙M6P單元。在一些實施例中，rhGAA在第二潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約0.5 mol M6P（單-M6P及雙M6P）。在一些實施例中，rhGAA在第二潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均約0.4至約0.6莫耳單M6P。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪之第二潛在N-醣基化位點佔有率及如圖6C中所描繪之N-醣基化型態。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖19A中所描繪之第二潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19C或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一或多個實施例中，至少5%之rhGAA在第三潛在N-醣基化位點處磷酸化（例如，對於SEQ ID NO: 6為N334，且對於SEQ ID NO: 4為N390）。在其他實施例中，低於5%、10%、15%、20%或25%之rhGAA在第三潛在N-醣基化位點處經磷酸化。舉例而言，第三潛在N-醣基化位點可具有非磷酸化高甘露糖N-聚醣、二觸角、三觸角及四觸角複合N-聚醣及雜合N-聚醣之混合物作為主要種類。在一些實施例中，rhGAA之至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%在第三潛在N-醣基化位點經唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第三潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約0.9至約1.2 mol唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪之第三潛在N-醣基化位點佔有率及如圖6D中所描繪之N-醣基化型態。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖19A中所描繪之第三潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19D或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一些實施例中，至少20%之rhGAA在第四潛在N-糖基化位點（例如，SEQ ID NO: 6之N414及SEQ ID NO: 4之N470）處磷酸化。舉例而言，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA可在第四潛在N-醣基化位點處經磷酸化。此磷酸化可為單M6P及/或雙M6P單元之結果。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處攜帶單M6P單元。在一些實施例中，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95% rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處攜帶雙M6P單元。在一些實施例中，rhGAA之至少3%、5%、8%、10%、15%、20%或25%在第四潛在N-醣基化位點經唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第四潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約1.4莫耳M6P（單M6P及雙M6P）。在一些實施例中，rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均約0.4至約0.6莫耳雙M6P。在一些實施例中，rhGAA在第四潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均約0.3至約0.4莫耳單M6P。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪之第四潛在N-醣基化位點佔有率及如圖6E中所描繪之N-醣基化型態。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖19A中所描繪之第四潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19E或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一些實施例中，至少5% rhGAA在第五潛在N-醣基化位點（例如，對於SEQ ID NO: 6為N596及對於SEQ ID NO: 4為N692）處經磷酸化。在其他實施例中，低於5%、10%、15%、20%或25%之rhGAA在第五潛在N-醣基化位點處經磷酸化。舉例而言，第五潛在N-醣基化位點可具有岩藻糖基化雙觸角複合N-聚醣作為主要種類。在一些實施例中，rhGAA之至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%在第五潛在N-醣基化位點處經唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第五潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約0.8至約0.9莫耳唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪之第五潛在N-醣基化位點佔有率及如圖6F中所描繪之N-醣基化型態。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖19A中所描繪之第五潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19F或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一些實施例中，至少5% rhGAA在第六N-醣基化位點（例如，對於SEQ ID NO: 6為N826，且對於SEQ ID NO: 4為N882）經磷酸化。在其他實施例中，低於5%、10%、15%、20%或25%之rhGAA在第六N-醣基化位點處磷酸化。舉例而言，第六N-醣基化位點可具有二觸角、三觸角及四觸角複合N-聚醣作為主要物質之混合物。在一些實施例中，rhGAA之至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%在第六N-醣基化位點處經唾液酸化。在一些實施例中，rhGAA在第六潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約1.5至約4.2莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第六潛在N-醣基化位點包含每莫耳rhGAA平均約0.9莫耳乙醯化唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第六潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均至少0.05莫耳聚醣物質，其具有聚-N-乙醯基-D-乳糖胺（聚-LacNAc）殘基。在一些實施例中，超過10%之rhGAA包含在第六潛在N-醣基化位點處攜帶聚LacNAc殘基的聚醣。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪之第六潛在N-醣基化位點佔有率及如圖6G中所描繪之N-醣基化型態。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖19A中所描繪之第六潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19G或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一些實施例中，至少5% rhGAA在第七潛在N-醣基化位點（例如對於SEQ ID NO: 6為N869且對於SEQ ID NO: 4為N925）處磷酸化。在其他實施例中，低於5%、10%、15%、20%或25%之rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處經磷酸化。在一些實施例中，低於40%、45%、50%、55%、60%或65%之rhGAA在第七潛在N-醣基化位點具有任何N-聚醣。在一些實施例中，至少30%、35%或40% rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處具有N-聚醣。在一些實施例中，rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均至少0.5莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均至少0.8莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均約0.86莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均至少0.3莫耳攜帶聚LacNAc殘基之聚醣物質。在一些實施例中，幾乎一半rhGAA包含在第七潛在N-醣基化位點處攜帶聚LacNAc殘基的N-聚醣。在至少一個實施例中，在第七潛在N-醣基化位點處鑑別之所有N-聚醣為複合N-聚醣。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A中所描繪或如圖19A中所描繪之第七潛在N-醣基化位點佔有率及如圖19H或圖20B中所描繪之N-醣基化型態。
在一些實施例中，rhGAA包含平均每莫耳rhGAA 3-4莫耳M6P殘基及每莫耳rhGAA約4至約7.3莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA進一步包含在第一潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA平均至少約0.5莫耳雙M6P、在第二潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.4至約0.6莫耳單M6P、在第三潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.9至約1.2莫耳唾液酸、在第四潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.4至約0.6莫耳雙M6P、在第四潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.3至約0.4莫耳單M6P、在第五潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA約0.8至約0.9莫耳唾液酸及在第六潛在N-糖基化位點處之每莫耳rhGAA約1.5至約4.2莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA進一步包含在第七潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA平均約至少0.5莫耳唾液酸。在一些實施例中，rhGAA在第七潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA平均至少0.8莫耳唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA進一步包含在第七潛在N-醣基化位點處之每莫耳rhGAA平均約0.86莫耳唾液酸。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖6A至6H中所描繪之七個潛在N-醣基化位點佔有率及N-醣基化特徵。在至少一個實施例中，rhGAA包含如圖19A至19H及圖20A至20B中所描繪之七個潛在N-醣基化位點佔有率及N-醣基化特徵。
製備rhGAA之方法揭示於2014年9月30日申請之美國臨時專利申請案第62/057,842號中，其全部內容以引用之方式併入本文中。
一旦處於溶酶體內，rhGAA可以酶促降解累積肝醣。然而，習知rhGAA產品具有低總含量之攜帶單M6P及雙M6P之N-聚醣，且因此靶向肌細胞不良，使得rhGAA較差遞送至溶酶體。此等習知產物中大多數rhGAA分子不具有磷酸化N-聚醣，由此缺乏對CIMPR之親和力。非磷酸化高甘露糖N-聚醣亦可藉由甘露糖受體清除，此導致ERT之非有效清除（圖2B）。相比之下，如圖2A中所繪示，本文所描述之rhGAA可含有更高量之攜帶單M6P及雙M6P的N-聚醣，使得將rhGAA有效吸收至諸如肌肉之特定組織中。 IV.  N 連接醣基化 rhGAA 之產生及純化
如美國10,961,522（其全部以引用的方式併入本文中）中所描述，細胞（諸如中國倉鼠卵巢（CHO）細胞）可用以產生其中所描述之rhGAA。在CHO細胞中表現高M6P rhGAA優於在轉譯後修飾rhGAA之聚醣型態，至少部分因為僅前者可藉由聚醣降解轉化為具有最佳肝醣水解之rhGAA形式，因此增強治療功效。
在一些實施例中，rhGAA較佳由一或多個用編碼本文所描述之rhGAA之DNA構築體轉型的CHO細胞株產生。此類CHO細胞株可含有多個基因複本，諸如5、10、15或20個或更多個編碼GAA的聚核苷酸之複本。表現酸性α-葡萄糖苷酶或其他變異酸性α-葡萄糖苷酶胺基酸序列（諸如與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6至少90%、95%、98%或99%一致之彼等胺基酸序列）之對偶基因變異體的DNA構築體可構築且表現於CHO細胞中。熟習此項技術者可選擇適合於轉型CHO細胞用以生產此類DNA構築體之替代性載體。
製備此類CHO細胞株之方法描述於美國10,961,522中，其全部以引用的方式併入本文中。簡言之，此等方法涉及用編碼GAA或GAA變異體之DNA轉型CHO細胞，選擇將編碼GAA之DNA穩定整合至其染色體中且穩定表現GAA之CHO細胞，且選擇表現具有高含量之攜帶單M6P或雙M6P的N-聚醣之GAA的CHO細胞，且視情況選擇具有含有高唾液酸含量之N-聚醣及/或具有含有低非磷酸化高甘露糖含量之N-聚醣的CHO細胞。所選擇之CHO細胞株可用於藉由培養CHO細胞株及自CHO細胞之培養物回收該組合物來產生rhGAA及rhGAA組合物。在一些實施例中，自所選CHO細胞株產生之rhGAA含有較高含量之靶向CIMPR的攜帶單M6P或雙M6P的N-聚醣。在一些實施例中，如本文中所描述產生之rhGAA具有低含量之具有末端半乳糖之複合N-聚醣。在一些實施例中，所選擇之CHO細胞株稱為GA-ATB200或ATB200-X5-14。在一些實施例中，所選擇之CHO細胞株涵蓋此類CHO細胞培養物之子培養物或衍生物。在一些實施例中，自所選擇之CHO細胞株產生之rhGAA稱為ATB200。
如本文中所描述產生之rhGAA可藉由U.S. 10,227,577及美國臨時申請案第62/506,569號中所描述之以下方法純化，兩者以全文引用之方式併入本文中。用於產生、捕獲及純化由CHO細胞株產生之rhGAA的例示性方法展示於圖3中。
簡言之，生物反應器601含有表現rhGAA且將rhGAA分泌至周圍液體培養基中之細胞，諸如CHO細胞之培養物。生物反應器601可為用於培養細胞之任何適當的生物反應器，諸如灌注、分批或分批進料生物反應器。在細胞產生rhGAA之足夠時間段後，自生物反應器中移除培養基。此類培養基移除對於灌注生物反應器可為連續的或對於分批或分批進料反應器可為分批的。培養基可藉由過濾系統603過濾以移除細胞。過濾系統603可為任何適合之過濾系統，包括交替切向流過濾（ATF）系統、切向流過濾（TFF）系統及/或離心過濾系統。在各種實施例中，過濾系統利用孔徑在約10奈米及約2微米之間的過濾器。
過濾之後，將濾液裝載至蛋白質捕獲系統605上。蛋白質捕獲系統605可包括一或多個層析管柱。若使用超過一個層析管柱，則管柱可串聯置放以使得下一個管柱可在負載第一管柱後開始負載。替代地，培養基移除過程可在切換柱之時間期間停止。
在各種實施例中，蛋白質捕獲系統605包括用於直接捕獲rhGAA之一或多個陰離子交換（AEX）柱，尤其具有高M6P含量之rhGAA。藉由改變管柱中之pH及/或鹽含量，自管柱中溶離由蛋白質捕獲系統605捕獲之rhGAA。針對AEX管柱之例示性條件提供於表2中。 表 2. 針對 AEX 管柱之例示性條件
程序 緩衝液 流速（公分 / 小時） 體積（ CV ） 溫度（ ℃ ）
預先使用之衛生處理 0.1-10 M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-3 （≥ 10-120 min） 15 - 25
預先平衡 20-2000磷酸鹽緩衝液（PB），pH 6.9-7.3 ≤ 25-2500 ≥ 1-5 15 - 25
平衡 4-400 mM PB，pH 6.9-7.3 ≤ 25-2500 ≥ 1-5 2 - 15
負載 NA ≤ 10-1000 NA 2 - 15
洗滌1 4-400 mM PB，pH 6.9-7.3 ≤ 25-2500 ≥ 2-10 2 - 15
洗滌2 4-400 mM PB，pH 6.9-7.3 ≤ 25-2500 ≥ 2-10 15 - 25
溶離 4-400 mM PB，20-2000 mM NaCl，pH 6.1-6.5 ≤ 25-2500 NA 15 - 25
帶 4-400 mM PB，0.1-10 M NaCl，pH 6.1-6.5 ≤ 25-2500 ≥ 1-5 15 - 25
使用後之衛生處理 0.1-10 M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-3 （≥ 10-120 min） 15 - 25
儲存 0.01-1.0 M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-5 15 - 25
溶離之rhGAA可經歷其他純化步驟及/或品質保證步驟。舉例而言，溶離rhGAA可經歷病毒殺滅步驟607。此類病毒殺滅607可包括低pH殺滅、清潔劑殺滅或此項技術中已知之其他技術中之一或多者。來自病毒殺滅步驟607之rhGAA可引入至第二層析系統609中以進一步純化rhGAA產物。或者，來自蛋白質捕獲系統605之溶離rhGAA可直接進料至第二層析系統609。在各種實施例中，第二層析系統609包括一或多個固定金屬親和層析（IMAC）管柱以進一步移除雜質。針對IMAC管柱之例示性條件提供於下表3中。 表 3. 針對 IMAC 管柱之例示性條件
程序 緩衝液 流速 （公分 / 小時） 體積 （ CV ）
沖洗 4-400 mM PB，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
預先使用之衛生處理 0.01-1.0 M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-3 （10 – 30 min）
平衡 4-400 mM PB，pH 6.5 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
用WFI洗滌 注射用水（WFI） ≤ 25-2500 ≥ 1-3
螯合劑 0.01-1.0 M乙酸銅 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
用WFI洗滌 WFI ≤ 25-2500 ≥ 2-10
用酸性緩衝液洗滌 2-200 mM乙酸鈉，0.05-5 M NaCl，pH 3.5-4.5 ≤ 25-2500 ≥ 2-10
平衡 4-400 mM PB，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
使用溶離緩衝液之空白操作 4-400 mM PB，15-1500 mM甘胺酸，pH 6.1-6.5 ≤ 25-2500 ≥ 2-20
平衡 4-400 mM PB，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
負載 NA ≤ 25-2500 ≥ 1-5
洗滌1 4-400 mM PB，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 2-10
洗滌2 4-400 mM PB，0.1-10 M NaCl，5-30%丙二醇，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 2-10
洗滌3 4-400 mM PB，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 2-10
溶離 4-400 mM PB，15-1500 mM甘胺酸，pH 6.1-6.5 ≤ 25-2500 NA
帶 4-400 mM PB，50-5000 mM咪唑，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
使用後之衛生處理 0.01-1M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-3 （10 – 30 min）
沖洗 4-400 mM PB，pH 6.3-6.7 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
儲存 5-30%乙醇 ≤ 25-2500 ≥ 1-5
在rhGAA負載至第二層析系統609上之後，將重組蛋白自管柱中溶離。溶離之rhGAA可經歷病毒殺滅步驟611。如同病毒殺滅607，病毒殺滅611可包括低pH殺滅、清潔劑殺滅或此項技術中已知的其他技術中的一或多者。在一些實施例中，僅使用病毒殺滅607或611中之一者，或在純化過程中在同一階段進行病毒殺滅。
來自病毒殺滅步驟611之rhGAA可引入第三層析系統613中以進一步純化重組蛋白質產物。或者，來自第二層析系統609之經溶離重組蛋白質可直接進料至第三層析系統613。在各種實施例中，第三層析系統613包括一或多個陽離子交換層析（CEX）管柱及/或尺寸排阻層析（SEC）管柱用於進一步移除雜質。rhGAA產物隨後自第三層析系統613溶離。CEX管柱之例示性條件提供於下表4中。 表 4.CEX 管柱之例示性條件
程序 緩衝液 流速 （公分 / 小時） 體積 （ CV ）
預先使用之衛生處理 0.1-10 M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-3 （≥ 10-120 min）
平衡 2-200 mM檸檬酸鈉，pH 4.0-5.0 ≤ 30-3000 ≥ 2-10
負載 NA ≤ 30-3000 NA
洗滌 2-200 mM檸檬酸鈉，pH 4.0-5.0 ≤ 30-3000 ≥ 2-10
溶離 2-200 mM檸檬酸鈉，15-1500 mM NaCl，pH 4.0-5.0 ≤ 30-3000 ≥ 2-10
帶 2-200 mM檸檬酸鈉，0.1-10 M NaCl，pH 4.0-5.0 ≤ 30-3000 ≥ 1-5
使用後之衛生處理 0.1-10 M NaOH ≤ 25-2500 ≥ 1-3 （≥ 10-120 min）
儲存 0.01-1.0 M NaOH ≤ 30-3000 ≥ 1-5
rhGAA產物亦可經歷進一步處理。舉例而言，另一過濾系統615可用於移除病毒。在一些實施例中，此類過濾可利用孔徑在5與50 µm之間的過濾器。其他產物處理可包括產物調節步驟617，其中重組蛋白質產物可經滅菌、過濾、濃縮、儲存及/或具有用於添加以用於最終產物調配物之額外組分。
如本文所使用，術語「ATB200」係指具有較高含量之攜帶單M6P及雙M6P之N-聚醣的rhGAA，其由GA-ATB200細胞株產生且使用本文所描述之方法純化。 V. 醫 藥組合物
在各種實施例中，提供一種醫藥組合物，其包含本文所描述之rhGAA（單獨或與其他治療劑組合）及/或醫藥學上可接受之載劑。
在一或多個實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本文所使用之醫藥學上可接受之鹽為醫藥學上可接受之酸加成鹽。醫藥學上可接受之酸加成鹽可包括（但不限於）鹽酸、氫溴酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸、磷酸及其類似物，及包括（但不限於）以下之有機酸：乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟腦酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、麩胺酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、己酸、甲酸、反丁烯二酸、2-羥基乙磺酸（羥乙基磺酸）、乳酸、羥基順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、杏仁酸、均三甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、菸鹼酸、2-萘磺酸、草酸、雙羥萘酸、果膠酯酸、苯乙酸、3-苯基丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、柳酸、硬脂酸、丁二酸、對胺基苯磺酸、酒石酸、對甲苯磺酸、十一酸及其類似物。
在一些實施例中，本文所使用之醫藥學上可接受之鹽為醫藥學上可接受之鹼加成鹽。醫藥學上可接受之鹼加成鹽可包括（但不限於）氨或氫氧化物、銨或諸如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁及其類似物之金屬陽離子的碳酸鹽或碳酸氫鹽。衍生自醫藥學上可接受之有機無毒性鹼的鹽包括（但不限於）一級、二級及三級胺、四級胺化合物之鹽、包括天然存在之經取代胺的經取代胺、環胺及鹼性離子交換樹脂，諸如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、異丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、離胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡鹼、海卓胺、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡糖胺、甲基還原葡糖胺、可可豆鹼、嘌呤、哌
Figure 02_image005
、哌啶、N-乙基哌啶、四甲銨化合物、四乙銨化合物、吡啶、Ν,Ν-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基
Figure 02_image007
啉、二環己胺、二苯甲基胺、Ν,Ν-二苯甲基苯乙基胺、1-安非胺、Ν,Ν'-二苯甲基乙二胺、多元胺樹脂及其類似物。
在一些實施例中，rhGAA或其醫藥學上可接受之鹽可調配為適用於靜脈內投與之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物為無菌等張緩衝液水溶液。必要時，組合物亦可包括助溶劑及用於減弱注射部位處之疼痛之局部麻醉劑。醫藥組合物之成分可分開供應或混合在一起以單位劑型提供，例如以乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式於指示活性劑之量之氣密密封式容器（諸如安瓿或藥囊）中供應。當藉由輸注投與組合物時，其可用含有無菌醫藥級水、生理食鹽水或右旋糖/水之輸液瓶來施配。在一些實施例中，輸注可在醫院或診所進行。在一些實施例中，輸注可在醫院或臨床環境外出現，例如在個體之居住處。當藉由注射投與組合物時，可提供注射用無菌水或生理食鹽水之安瓿，使得該等成分可在投與前混合。
在一些實施例中，rhGAA或其醫藥學上可接受之鹽可經調配以用於經口投與。可經口投與之組合物可調配成以下形式：錠劑、膠囊、珠劑、酏劑、溶液或懸浮液、凝膠、糖漿、漱口水或在使用之前用水或其他適合之媒劑復原的乾粉、視情況與調味劑及著色劑一起用於立即釋放、延遲釋放、修飾釋放、持續釋放、脈衝釋放或控制釋放一起。亦可使用固體組合物，諸如錠劑、膠囊、錠劑、片劑、丸劑、大丸劑、粉末、糊劑、顆粒劑、彈劑、糖衣藥丸或預混合製劑。用於經口使用之固體及液體組合物可根據此項技術中熟知之方法製備。此類組合物亦可含有一或多種醫藥學上可接受之載劑及賦形劑，其可呈固體或液體形式。錠劑或膠囊可藉由習知手段與醫藥學上可接受之賦形劑來製備，該等賦形劑包括（但不限於）黏合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑。適合之醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中已知的且包括（但不限於）預膠凝化澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、羥丙基甲基纖維素（HPMC）、羥基丙基乙基纖維素（HPEC）、羥丙基纖維素（HPC）、蔗糖、明膠、阿拉伯膠、乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸、二十二烷酸甘油酯、滑石、二氧化矽、玉米、馬鈴薯或木薯澱粉、乙醇酸澱粉鈉、月桂基硫酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫二鈣、甘胺酸交聯羧甲基纖維素鈉及複合矽酸鹽。錠劑可藉由此項技術中熟知之方法包覆包衣。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物可根據美國10,512,676及美國臨時申請案第62/506,574號進行調配，兩者以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物的pH為約5.0至約7.0或約5.0至約6.0。在一些實施例中，pH值在約5.5至約6.0範圍內。在一些實施例中，醫藥組合物之pH為6.0。在一些實施例中，可藉由使用pH調節劑（例如鹼化劑及酸化劑），諸如氫氧化鈉及/或鹽酸將pH調節至目標pH。
本文所描述之醫藥組合物可包含緩衝系統，諸如檸檬酸鹽系統、磷酸鹽系統及其組合。檸檬酸鹽及/或磷酸鹽可為檸檬酸鈉或磷酸鈉。其他鹽包括鉀鹽及銨鹽。在一或多個實施例中，緩衝液包含檸檬酸鹽。在其他實施例中，緩衝液包含檸檬酸鈉（例如檸檬酸鈉脫水物與單水合檸檬酸之混合物）。在一或多個實施例中，包含檸檬酸鹽之緩衝溶液可包含檸檬酸鈉及檸檬酸。在一些實施例中，存在檸檬酸鹽及磷酸鹽緩衝液兩者。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含至少一種賦形劑。賦形劑可充當張力劑、膨化劑及/或穩定劑。張力劑為有助於確保調配物具有與人類血液類似或相同之滲透壓的組分。增積劑為添加物質至調配物（例如凍乾）且為餅提供適當結構之成分。穩定劑為可防止或最小化疏水性空氣-水界面表面處之聚集體形成的化合物。一種賦形劑可同時充當張力劑及膨化劑。舉例而言，甘露糖醇可充當張力劑且亦提供作為膨化劑之益處。
張力劑之實例包括氯化鈉、甘露糖醇、蔗糖及海藻糖。在一些實施例中，張力劑包含甘露糖醇。在一些實施例中，張力劑之總量在約10 mg/mL至約50 mg/mL之量範圍內。在其他實施例中，張力劑之總量在約10、11、12、13、14或15 mg/mL至約16、20、25、30、35、40、45或50 mg/mL之量範圍內。
在一些實施例中，賦形劑包含安定劑。在一些實施例中，穩定劑為界面活性劑。在一些實施例中，穩定劑為聚山梨醇酯80。在一或多個實施例中，穩定劑之總量在約0.1 mg/mL至約1.0 mg/mL範圍內。在其他實施例中，穩定劑之總量在約0.1、0.2、0.3、0.4或0.5 mg/mL至約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0 mg/mL範圍內。在其他實施例中，穩定劑之總量為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0 mg/mL。
在一些實施例中，醫藥組合物包含（a）rhGAA（諸如ATB200），（b）至少一種選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合組成之群的緩衝液，及（c）至少一種選自由甘露糖醇、聚山梨醇酯80及其組合組成之群的賦形劑，且pH為（i）約5.0至約6.0，或（ii）約5.0至約7.0。在一些實施例中，組合物進一步包含水。在一些實施例中，組合物可進一步包含酸化劑及/或鹼化劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含（a）在約5-50 mg/mL、約5-30 mg/mL或約15 mg/mL之濃度下之rhGAA（諸如ATB200），（b）在約10-100 mM或約25 mM之濃度下之檸檬酸鈉緩衝液，（c）在約10-50 mg/mL或約20 mg/mL之濃度下之甘露糖醇，（d）以約0.1-1 mg/mL、約0.2-0.5 mg/mL或約0.5 mg/mL之濃度存在的聚山梨醇酯80，及（e）水，且pH為約6.0。在至少一個實施例中醫藥組合物包含（a）15 mg/mL rhGAA（諸如ATB200），（b）25 mM檸檬酸鈉緩衝液，（c）20 mg/mL甘露糖醇，（d）0.5 mg/mL聚山梨醇酯80，及（e）水，且pH為約6.0。在一些實施例中，組合物可進一步包含酸化劑及/或鹼化劑。
在一些實施例中，在向有需要之個體投與之前對包含rhGAA之醫藥組合物進行稀釋。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物包含伴護子。在一些實施例中，伴護子為美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽。在另一實施例中，伴護子為杜格魯特或其醫藥學上可接受之鹽。
在一些實施例中，本文所描述之rhGAA調配於一種醫藥組合物中，而諸如美格魯特之伴護子調配於另一醫藥組合物中。在一些實施例中，包含美格魯特之醫藥組合物係基於作為ZAVESCA®（Actelion Pharmaceuticals）之調配物市售。
在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物可經歷冷凍乾燥（冷凍乾燥）製程以提供餅狀物或散劑。因此，在一些實施例中，本文所描述之醫藥組合物係關於在凍乾之後的rhGAA組合物。凍乾混合物可包含本文所描述之rhGAA（例如，ATB200）、選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合組成之群的緩衝液及至少一種選自由海藻糖、甘露糖醇、聚山梨醇酯80及其組合組成之群的賦形劑。在一些實施例中，可向凍乾混合物中添加其他成分（例如，其他賦形劑）。可提供包含凍乾調配物之醫藥組合物小瓶，其隨後可儲存、運輸、復原及/或向患者投與。 VI. 治 療方法 A. 疾 病治療
本發明之另一態樣係關於一種藉由投與本文所描述之rhGAA或醫藥組合物治療與肝醣貯積失調相關之疾病或病症的方法。在一些實施例中，疾病為龐貝症（亦稱為酸性麥芽糖酶缺乏（AMD）及II型肝糖貯積病（GSD II））。在一些實施例中，rhGAA為ATB200。在一些實施例中，醫藥組合物包含ATB200。本文亦提供rhGAA或ATB200用於治療龐貝症之用途。
在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法治療之個體為經歷過ERT之患者。在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法治療之個體係未經ERT處理之患者。
本文所描述之rhGAA或醫藥組合物係藉由適當途徑投與。在一個實施例中，rhGAA或醫藥組合物係靜脈內投與。在其他實施例中，rhGAA或醫藥組合物藉由直接投與至目標組織，諸如心臟或骨骼肌（例如，肌肉內）或神經系統（例如，直接注射至大腦中；腦室內；鞘內）來投與。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物係經口投與。若需要，可同時使用一種以上途徑。
在一些實施例中，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之治療效果可基於以下準則中之一或多者評估：（1）心臟狀態（例如，增加末端舒張及/或末端收縮體積，或降低、改善或預防通常見於GSD-II中之進行性心肌病），（2）肺部功能（例如，增加哭肺活量超過基線能力，及/或氧氣不飽和在哭期間標準化）；（3）神經發育及/或運動技能（例如，增加AIMS評分），及（4）感染疾病之個體之組織中之肝醣含量降低。
在一些實施例中，在投與一或多個劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之後，個體之心肌狀況相較於用媒劑處理之個體或處理之前個體之心肌狀況改善10%、20%、30%、40%或50%（或之間的任何百分比）。個體之心肌狀態可藉由量測舒張末期及/或收縮末期體積及/或藉由臨床上評估心肌症來評定。在一些實施例中，個體之肺部功能在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於用媒劑處理之個體或在處理之前個體之肺部功能改善10%、20%、30%、40%或50%（或之間的任何百分比）。在某些實施例中，改善在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或之間的任何時間段）之後達成。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或其間的任何時段）之後改善個體之肺部功能。
在一些實施例中，在投與一或多個劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之後，個體之肺部功能相比於經媒劑處理之個體或處理之前個體之肺部功能改善10%、20%、30%、40%或50%（或之間的任何百分比）。個體之肺部功能可藉由相對於基線能力之哭肺活量及/或在哭期間之氧氣飽和度的標準化來評定。在一些實施例中，個體之肺部功能在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後相較於用媒劑處理之個體或在處理之前個體之肺部功能改善10%、20%、30%、40%或50%（或之間的任何百分比）。在某些實施例中，改善在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或之間的任何時間段）之後達成。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或其間的任何時段）之後改善個體之肺部功能。
在一些實施例中，與用媒劑處理之個體或在處理之前個體之神經發育及/或運動技能相比，在投與一或多個劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之後，個體之神經發育及/或運動技能改善10%、20%、30%、40%或50%（或其間之任何百分比）。個體之神經發育及/或運動技能可藉由確定AIMS評分評估。AIMS為臨床上投與及評分之12項錨定量表（參見Rush JA Jr., Handbook of Psychiatric Measures, 美國精神病協會, 2000, 166-168）。項目1-10按5點錨定量表來評級。項目1至4評定口頜面移動。項目5至7處理肢體及軀幹運動困難。項目8至10處理如由審查員判定之整體嚴重程度，及患者之運動意識及與其相關之痛苦。項目11至12為關於牙齒及/或假牙問題之是/非問題（此等問題可引起運動困難之誤認診斷）。在一些實施例中，與用媒劑處理之個體或在處理之前個體之神經發育及/或運動技能相比，在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後，個體之神經發育及/或運動技能改善10%、20%、30%、40%或50%（或其間的任何百分比）。在某些實施例中，改善在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或之間的任何時間段）之後達成。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或之間的任何時間段）之後改善個體之神經產生及/或運動技能。
在一些實施例中，相較於用媒劑處理之個體或在處理之前個體之肝醣含量，在投與一或多個劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之後，個體之某一組織之肝醣含量降低10%、20%、30%、40%或50%（或之間的任何百分比）。在一些實施例中，組織為肌肉，諸如四頭肌、三頭肌及腓腸肌。組織之肝醣含量可使用此項技術中已知之方法分析。肝醣含量之確定基於澱粉葡糖苷酶消化已熟知，且描述於公開案中，諸如：Amalfitano等人（1999）,「在肝靶向編碼人類酸α-葡萄糖苷酶之經修飾腺病毒載體之後肌肉病症II型肝糖貯積病之全身性校正」, 《美國國家科學院院刊》, 96:8861-8866。在一些實施例中，與用媒劑處理之個體或在處理之前個體之肌肉肝糖含量相比，在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後，個體之肌肉肝糖含量降低10%、20%、30%、40%或50%（或其間的任何百分比）。在某些實施例中，在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或其間的任何時段）之後實現減少。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更久（或其間之任何時段）之後減少個體之肌肉中的肝醣含量。 B. 生 物標記物
個體之肝醣累積的生物標記物（諸如尿液己醣四醣（Hex4））可用於評定及比較患有龐貝症之個體的酶替代療法之治療作用。在一些實施例中，rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物對肝醣累積的治療效果係藉由量測個體之尿液Hex4含量評估。
肌肉損傷或損害之生物標記物，諸如肌酸激酶（CK）、丙胺酸轉胺酶（ALT）及天冬胺酸轉胺酶（AST）可用於評估及且比較患有龐貝症之個體之酶替代療法的治療作用。在一些實施例中，rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物對肌肉損傷之治療效果係藉由量測個體中之CK、ALT及/或AST含量來評估。在至少一個實施例中，rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物對肌肉損傷之治療效果係藉由量測個體中之CK含量來評估。
諸如LAMP-1、LC3及質膜修復蛋白之生物標記物亦可用於評估且比較本文所描述之rhGAA或醫藥組合物的治療效果。在龐貝症中，GAA無法水解溶酶體肝糖引起在一些組織中填充有肝醣之大溶酶體的異常積聚。（Raben等人., JBC 273: 19086-19092, 1998.）龐貝症之小鼠模型中之研究已展示，骨胳肌肉中之擴增溶酶體無法充分解釋機械效能之降低，且含有降解肌原纖維之大夾雜物（亦即，自噬積聚）之存在促成肌肉功能之損傷。（Raben等人., 《人類分子基因（Human Mol Genet）》17: 3897-3908, 2008）。報導亦表明，自體吞噬通量受損與龐貝症患者之治療不良結果相關。（Nascimbeni等人., 神經病理學及應用神經生物學doi：10.1111/nan.12214, 2015；Fukuda等人., 《分子治療》（Mol Ther）14: 831-839, 2006）。另外，遲發性龐貝症普遍發生於未分類的遠肢肌營養不良（LGMD）（Preisler等人., Mol Genet Metab 110: 287-289, 2013）中，其為一組具有變化之嚴重程度的超過30種遺傳限定亞型的遺傳異質神經肌肉疾病。IHC檢驗揭示在 GaaKO小鼠之骨胳肌纖維中存在質膜修復蛋白。
各種已知方法可用於量測此類生物標記物之基因表現量及/或蛋白質含量。舉例而言，可獲得來自用本文所描述之rhGAA或醫藥組合物治療之個體的樣品，諸如組織（尤其肌肉）之活體組織切片。在一些實施例中，樣品為個體之活體組織切片。在一些實施例中，肌肉選自四頭肌、三頭肌及腓腸肌。獲自個體之樣品可用一或多個偵測此類生物標記物或藉由質譜分析鑑別及定量之抗體或其他偵測劑染色。樣品亦可或替代地經處理以經由例如RT-qPCR方法偵測編碼生物標記物之核酸（諸如mRNA）的存在。
在一些實施例中，在用本文所描述之rhGAA或醫藥組合物治療之前及之後，在自個體獲得之肌肉活體組織切片中量測一或多種生物標記物之基因表現量及/或蛋白質含量。在一些實施例中，在獲自經媒劑處理之個體的肌肉活體組織切片中量測一或多種生物標記物之基因表現量及/或蛋白質含量。在一些實施例中，相比於用媒劑處理之個體或處理之前個體之基因表現量及/或蛋白質含量，在投與一或多個劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之後一種或多種生物標記物之基因表現量及/或蛋白質含量降低10%、20%、30%、40%或50%（或其間之任何百分比）。在一些實施例中，相比於用媒劑處理之個體或處理之前個體之一種或多種生物標記物的基因表現量及/或蛋白質含量，一或多種生物標記物之基因表現量及/或蛋白質含量在投與一或多個劑量之ATB200或包含ATB200之醫藥組合物之後降低10%、20%、30%、40%或50%（或其間的任何百分比）。在某些實施例中，在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或其間的任何時段）之後實現減少。在某些實施例中，ATB200或包含ATB200之醫藥組合物在投與1週、2週、3週、1個月、2個月或更長時間（或其間的任何時間段）之後減少一或多種生物標記物之基因表現量及/或蛋白質含量。 C.  rhGAA 之劑量
醫藥調配物或復原組合物以治療有效量（例如當以規律的時間間隔投與時足以治療疾病之劑量，諸如藉由改善與疾病相關之症狀、延遲疾病發作及/或減輕疾病之症狀嚴重程度或頻率）來投與。治療疾病之治療有效的量可視疾病作用之性質及程度而定，且可以藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體內分析來幫助鑑別最佳劑量範圍。在至少一個實施例中，本文所描述之rhGAA或包含rhGAA之醫藥組合物以約1 mg/kg至約100 mg/kg，諸如約5 mg/kg至約30 mg/kg，通常約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量投與。在至少一個實施例中，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物係以約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg或約100 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA係以5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、50 mg/kg、75 mg/kg或100 mg/kg之劑量投與。在至少一個實施例中，rhGAA或醫藥組合物以約20 mg/kg之劑量投與。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物與藥理伴護子同時或依序投與。在一些實施例中，藥理伴護子為美格魯特。在至少一個實施例中，美格魯特以約260 mg之口服劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特以約195 mg之口服劑量投與。用於特定個體之有效劑量可隨時間推移視個體需求而變化（例如，增加或減少）。舉例而言，在身體疾病或壓力之時，或在抗酸性α-葡萄糖苷酶抗體變得存在或增加時，或在疾病症狀惡化時，可調節rhGAA及/或美格魯特之量。
在一些實施例中，治療有效劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物低於習知rhGAA產物。舉例而言，若習知rhGAA產物之治療有效劑量為20 mg/kg，則產生相同或優於習知rhGAA產物之治療效果所需的本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之劑量可低於20 mg/kg。可基於上文所論述之一或多種準則（例如，心肌狀態、肝醣含量或生物標記物表現）評定治療效果。在一些實施例中，治療有效劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物比習知rhGAA產物之治療有效劑量低至少約5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。
在一些實施例中，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之治療效果包含運動功能改善、肌肉強度改善（上半身、下半身或全身）、肺部功能改善、疲勞減少、至少一種肌肉損傷生物標記物之含量減少、至少一種肝醣累積生物標記物之含量減少或其組合。在一些實施例中，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之治療效果包含肌纖維中溶酶體病理學之逆轉、肌肉纖維中肝醣含量更快及/或更有效減少、六分鐘步行測試距離之增加、起立-行走計時測試時間之減少、四層爬升測試時間之減少、十公尺步行測試時間之減少、步態-樓梯-高爾-椅子之減少、上肢力量之增加、肩內收之改善、肩外展之改善、肘部彎曲之改善、肘部延伸之改善、上半身力量之改善、下半身力量之改善、全身力量之改善、直立（坐著的）用力肺活量之改善、最大呼氣壓之改善、最大吸氣壓之改善、疲勞嚴重程度量表評分之降低、尿液己醣四醣含量之降低、肌酸激酶含量之降低、丙胺酸轉胺酶含量之降低、天冬胺酸轉胺酶含量之降低或其任何組合。
在一些實施例中，當以相同劑量投與時，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物與習知rhGAA產物相比更快地實現所需治療效果。可基於上文所論述之一或多種準則（例如，心肌狀態、肝醣含量或生物標記物表現）評定治療效果。舉例而言，若單次劑量之習知rhGAA產物使所治療個體之組織中之肝醣含量在一週減少10%，則當投與相同劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物時，可在低於一週內實現相同程度之減少。在一些實施例中，當以相同劑量投與時，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物比習知rhGAA產物快至少約1.25、1.5、1.75、2.0、3.0或更快達成所需治療效果。
在一些實施例中，治療有效量之rhGAA（或包含rhGAA之組合物或藥物）投與超過一次。在一些實施例中，視疾病之作用的性質及程度而定，以規則時間間隔投與本文所描述之rhGAA或醫藥組合物，且持續進行。如本文所用之以「規則時間間隔」投與指示週期性投與治療有效量（區別於一次劑量）。時間間隔可藉由標準臨床技術來確定。在某些實施例中，rhGAA係每月、每月、每週、每週兩次或每天投與。在一些實施例中，rhGAA係每週兩次、每週一次或每隔一週靜脈內投與。單個個體之投與時間間隔不必為固定時間間隔，但可視個體需求而定隨時間推移而變化。舉例而言，在身體疾病或壓力之時，或在抗rhGAA抗體變得存在或增加時，或在疾病症狀惡化時，劑量之間的時間間隔可減小。
在一些實施例中，當以相同劑量使用時，如本文所描述之rhGAA或醫藥組合物比習知rhGAA產物更不頻繁地投與，且仍能夠與習知rhGAA產物產生相同或比習知rhGAA產物更佳的治療效果。舉例而言，若習知rhGAA產物每週投與20 mg/kg，則如本文所描述之rhGAA或醫藥組合物可產生與習知rhGAA產物在以20 mg/kg投與時相同或比其更佳的治療效果，儘管rhGAA或醫藥組合物頻率較低（例如兩週一次或每月一次）投與。可基於上文所論述之一或多種準則（例如，心肌狀態、肝醣含量或生物標記物表現）評定治療效果。在一些實施例中，兩個劑量之本文所描述之rhGAA或醫藥組合物之間的時間間隔比習知rhGAA產物之間的時間間隔長。在一些實施例中，兩個劑量之rhGAA或醫藥組合物之間的時間間隔比習知rhGAA產物之時間間隔長至少約1.25、1.5、1.75、2.0、3.0或更長。
在一些實施例中，在相同處理條件（例如，以相同時間間隔投與之相同劑量）下，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物以優於習知rhGAA產物所提供之程度的程度提供治療效果。可基於上文所論述之一或多種準則（例如，心肌狀態、肝醣含量或生物標記物表現）評定治療效果。舉例而言，當與每週以20 mg/kg投與之習知rhGAA產物相比時，以每週20 mg/kg投與之rhGAA或醫藥組合物可以較高程度降低所治療個體之組織中的肝醣含量。在一些實施例中，當在相同處理條件下投與時，本文所描述之rhGAA或醫藥組合物提供比習知rhGAA產物之治療效果至少約1.25、1.5、1.75、2.0、3.0或更大的治療效果。 D. 雙 組分治療
在一或多個實施例中，rhGAA或包含本文所描述之rhGAA的醫藥組合物與藥理伴護子同時或依序投與。在一些實施例中，rhGAA或醫藥組合物經由與藥理伴護子相比不同之途徑投與。舉例而言，藥理伴護子可經口投與，而rhGAA或醫藥組合物係靜脈內投與。
在各種實施例中，藥理伴護子為美格魯特。不希望受任何理論束縛，咸信當共投與時，美格魯特使ATB200在全身性循環中變性而穩定，此增強活性組分ATB200至溶酶體之遞送。
在一些實施例中，美格魯特係以約50 mg至約600 mg之口服劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特以約200 mg至約600 mg之口服劑量，或以約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg或約600 mg之口服劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特以約233 mg至約500 mg之口服劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特以約250至約270 mg之口服劑量，或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg之口服劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特以約260 mg之口服劑量投與。
熟習此項技術者應理解，在約200 mg至600 mg範圍內或與其之任何較小範圍內之美格魯特的口服劑量可視他/她的體重而定適用於成年患者。舉例而言，對於體重顯著低於約70 kg之患者，包括（但不限於）嬰兒、兒童或體重不足成人，較小劑量可由醫師認為適合。因此，在至少一個實施例中，美格魯特以約50 mg至約200 mg之口服劑量，或以約50 mg、約75 mg、約100 mg、約125 mg、約130 mg、約150 mg、約175 mg、約195 mg、約200 mg或約260 mg之口服劑量投與。在至少一個實施例中，美格魯特係以約65 mg至約195 mg之口服劑量，或以約65 mg、約130 mg或約195 mg之口服劑量投與。
在一些實施例中，rhGAA以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約50 mg至約600 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約50 mg至約200 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約200 mg至約600 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約200 mg至約500 mg之劑量經口投與。在一個實施例中，rhGAA以約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約260 mg之劑量經口投與。在一些實施例中，rhGAA以約5 mg/kg至約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約130 mg至約200 mg之劑量經口投與。在一個實施例中，rhGAA以約20 mg/kg之劑量靜脈內投與，且美格魯特以約195 mg之劑量經口投與。
在一些實施例中，美格魯特及rhGAA係同時投與。舉例而言，美格魯特可在投與rhGAA之前或之後10、9、8、7、6、5、4、3、2或1分鐘內投與。在一些實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之前或之後5、4、3、2或1分鐘內投與。
在一些實施例中，美格魯特及rhGAA係依序投與。在至少一個實施例中，美格魯特在rhGAA投與之前投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之前低於三小時投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之前約兩小時投與。舉例而言，美格魯特係在投與rhGAA之前約1.5小時、約1小時、約50分鐘、約30分鐘或約20分鐘投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之前約一小時投與。
在一些實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之後投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之後三小時內投與。在至少一個實施例中，美格魯特係在投與rhGAA之後兩小時內投與。舉例而言，美格魯特可在投與rhGAA之後約1.5小時、約1小時、約50分鐘、約30分鐘或約20分鐘內投與。
在一些實施例中，個體在投與美格魯特之前至少兩小時及之後至少兩小時禁食。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療與（1）基線，或（2）包含投與阿糖苷酶α及用於藥理伴護子之安慰劑之對照處理相比改善具有龐貝症之個體的一或多個疾病症狀。在此類對照處理中，投與安慰劑而非藥理伴護子。在一些實施例中，藉由雙組分療法治療之個體為經歷過ERT之患者。在一些實施例中，藉由雙組分療法治療之個體係未經ERT處理之患者。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由6分鐘步行測試（6MWT）所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之6分鐘步行距離（6MWD）在12、26、38或52週處理之後增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或50公尺或至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中，該個體之6MWD在52週處理之後增加至少20公尺或至少5%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在12、26、38或52週處理之後改善至少5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、30、40或50公尺。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在52週處理之後改善至少13公尺。在一些實施例中，該個體具有低於300公尺之基線6MWD。在一些實施例中，該個體具有大於或等於300公尺之基線6MWD。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療使該個體之肺部功能穩定，如藉由用力肺活量（FVC）測試所量測。在一些實施例中，在12、26、38或52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加，或與基線相比降低不到0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中，在52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比降低不到1%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在12、26、38或52週處理之後顯著改善至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%或6%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在52週處理後顯著改善至少3%。在一些實施例中，該個體具有低於55%之基線FVC。在一些實施例中，該個體具有大於或等於55%之基線FVC。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由步態、樓梯、高爾、椅子（GSGC）測試所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分在12、26、38或52週處理之後得到改善，如藉由至少0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5或2.5點降低所指示。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分在52週處理之後得到改善，如藉由至少0.5點降低所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在12、26、38或52週處理之後降低至少0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.5或5點所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在52週處理之後降低至少1.0點所指示。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療在處理後降低至少一種肌肉損傷標記物含量。在一些實施例中，至少一種肌肉損傷標記物包含肌酸激酶（CK）。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在52週處理之後降低至少20%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在12、26、38、或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在52週處理之後顯著降低至少30%。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療在處理後降低至少一種肝糖累積標記物含量。在一些實施例中，至少一種肝糖累積標記物包含尿液己醣四醣（Hex4）。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少30%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後顯著降低至少40%。
在一些實施例中，根據本發明之雙組分治療與（1）基線，或（2）包含投與阿糖苷酶α及用於藥理伴護子之安慰劑的對照處理相比改善患有龐貝症之經歷過ERT的患者個體之一或多個疾病症狀。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由6MWT所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之6MWD在12、26、38或52週處理之後增加至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或50公尺或至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。在一些實施例中，該個體之6MWD在52週處理之後增加至少15公尺或至少5%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在12、26、38或52週處理之後顯著改善至少10、12、14、15、16、18、20、30、40或50公尺。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之6MWD在52週處理之後改善至少15公尺。在一些實施例中，該個體具有低於300公尺之基線6MWD。在一些實施例中，該個體具有大於或等於300公尺之基線6MWD。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療改善該個體之肺部功能，如藉由FVC測試所量測。在一些實施例中，在12、26、38或52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加至少0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1%、2%、3%、4%或5%。在一些實施例中，在52週處理之後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加至少0.1%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在12、26、38或52週處理之後顯著改善至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%或10%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在52週處理後顯著改善至少4%。在一些實施例中，該個體具有低於55%之基線FVC。在一些實施例中，該個體具有大於或等於55%之基線FVC。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療改善該個體之運動功能，如藉由GSGC測試所量測。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分在12、26、38或52週處理之後得到改善，如藉由至少0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5或2.5點降低所指示。在一些實施例中，與基線相比，該個體之GSGC評分在52週處理之後得到改善，如藉由至少0.5點降低所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分在處理後顯著改善。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在12、26、38或52週處理之後降低至少0.3、0.5、0.7、1.0、1.5、2.5或5點所指示。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之GSGC評分顯著改善，如藉由在52週處理之後降低至少1.0點所指示。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療在處理後降低至少一種肌肉損傷標記物含量。在一些實施例中，至少一種肌肉損傷標記物包含CK。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之CK含量在52週處理之後降低至少15%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在12、26、38、或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之CK含量在52週處理之後顯著降低至少30%。
在一些實施例中，針對患有龐貝症之經歷過ERT的個體之雙組分治療在處理後降低至少一種肝糖累積標記物含量。在一些實施例中，至少一種肝糖累積標記物包含尿液Hex4。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與基線相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少25%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在處理後顯著降低。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在12、26、38或52週處理之後顯著降低至少10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%或60%。在一些實施例中，與對照處理相比，該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後顯著降低至少40%。 E. 套 組
本發明之另一態樣係關於適用於進行本文所描述之rhGAA療法的套組。在一或多個實施例中，套組包含容器（例如，小瓶、管、袋等），其包含rhGAA或醫藥組合物（在凍乾之前或之後）及用於復原、稀釋及投與之說明書。在一或多個實施例中，套組包含容器（例如，小瓶、管、袋等），其包含藥理伴護子（例如，美格魯特）及包含rhGAA之醫藥組合物（在凍乾之前或之後）及用於用藥理伴護子復原、稀釋及投與rhGAA之說明書。 實例 實例 1 ：製備具有較高含量之攜帶單或雙 M6P 之 N- 聚醣的產生 rhGAA 之 CHO 細胞 .
DG44 CHO（DHFR-）細胞經表現rhGAA之DNA構築體轉染。DNA構築體展示於圖4中。轉染後，藉由缺乏次黃嘌呤/胸苷（-HT）之介質選擇含有穩定整合之GAA基因的CHO細胞。此等細胞中之GAA表現係藉由甲胺喋呤治療（MTX，500 nM）誘導。
表現高量GAA之細胞池係藉由GAA酶活性分析鑑別且用於建立產生rhGAA之個體純系。在半固體培養瓶上產生個別純系，藉由ClonePix系統提取，且轉移至24深孔盤。分析該等個別純系之GAA酶活性以鑑別表現高含量GAA之純系。用於確定GAA活性之改良性培養基使用4-MU-α-葡糖苷酶基質。進一步評估如藉由GAA酶分析所量測之產生更高含量GAA之純系的存活力、生長能力、GAA生產率、N-聚醣結構及穩定的蛋白質表現。使用此程序分離表現具有增加之單M6P或雙M6P N-聚醣之rhGAA的包括CHO細胞株GA-ATB200之CHO細胞株。 實例 2 ： rhGAA 之純化
使用CHO細胞株GA-ATB200在搖瓶及灌注生物反應器中產生多個批次的本發明之rhGAA，其產物被稱為「ATB200」。使用弱陰離子交換（「WAX」）液相層析根據末端磷酸鹽及唾液酸對ATB200 rhGAA進行分級分離。溶離概況係由使用增加量之鹽溶離ERT產生。藉由UV監測概況（A280nm）。對於來自不同生產批次之經純化ATB200 rhGAA觀測到類似CIMPR受體結合（至少~70%）概況（圖5），指示ATB200 rhGAA可持續地產生。 實例 3 ： ATB200 rhGAA 之寡醣表徵
使用不同LC-MS/MS分析技術分析ATB200 rhGAA之位點特異性N-聚醣概況。前兩種LC-MS/MS方法之結果展示於圖6A-6H中。使用2-AA聚醣定位之第三LC-MS/MS方法的結果展示於圖19A-19H、圖20A-20B及表5中。
在第一LC-MS/MS分析中，在LC-MS/MS分析之前使蛋白質變性、還原、烷基化及消化。在蛋白質變性及還原期間，將200 µg蛋白質樣品、5 μL之1 mol/L tris-HCl（最終濃度50 mM）、75 μL之8 mol/L胍HCl（最終濃度6 M）、1 μL之0.5 mol/L EDTA（最終濃度5 mM）、2 μL之1 mol/L DTT（最終濃度20 mM）及Milli-Q®水添加至1.5 mL管，以提供總體積為100 µL。混合樣品且在56℃下在乾浴中培育30分鐘。在烷化期間，將變性及還原之蛋白質樣品與5 μL之1 mol/L碘乙醯胺（IAM，最終濃度50 mM）混合，隨後在10-30℃下在暗處培育30分鐘。在烷基化之後，將400 μL預冷卻丙酮添加至樣品中，且使混合物在-80℃冷藏下冷凍4小時。隨後使樣品在13000 rpm下在4℃下離心5 min且移除上清液。將400 μL預冷卻丙酮添加至丸粒中，隨後在13000 rpm下在4℃下使其離心5 min，且移除上清液。樣品隨後在冰上在暗處風乾，以移除丙酮殘餘物。將四十微升8M脲及160 μL之100 mM NH 4HCO 3添加至樣品中以溶解蛋白質。在胰蛋白酶消化期間，隨後用胰蛋白酶消化緩衝液添加50 μg蛋白質至100 μL最終體積，且添加5 μl 0.5 mg/mL胰蛋白酶（蛋白質與酶之比率為20/1 w/w）。充分混合溶液且在37℃下培育隔夜（16±2小時）。添加二點五微升20% TFA（最終濃度0.5%）以淬滅反應物。隨後使用Thermo Scientific TMOrbitrap Velos Pro TM質譜儀分析該樣品。
在第二LC-MS/MS分析中，除了碘乙酸（IAA）用作烷基化試劑代替IAM之外，根據類似變性、還原、烷基化及消化程序製備ATB200樣品，且隨後使用Thermo Scientific TMOrbitrap Fusion TMLumos Tribid TM質譜儀進行分析。
第一及第二分析之結果展示於圖6A-6H中。在圖6A-6H中，第一分析之結果係由左條（深灰色）表示，且來自第二分析之結果係由右條（淺灰色）表示。聚醣表示之符號命名法係根據Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D.,等人., 糖生物學基礎, 第2版（2009）。
如自圖6A-6H可見，兩個分析提供類似結果，但結果之間存在一定變化。此變化可歸因於多種因素，包括所用儀器及N-聚醣分析之完整性。舉例而言，若未鑑別及/或未定量一些磷酸化N-聚醣物質，則在該位點處磷酸化N-聚醣之總數目可能被低估，且攜帶磷酸化N-聚醣之rhGAA的百分比可能被低估。作為另一實例，若未鑑別及/或未定量一些非磷酸化N-聚醣物質，則在該位點處非磷酸化N-聚醣之總數目可能被低估，且攜帶磷酸化N-聚醣之rhGAA的百分比可能被低估。
圖6A顯示ATB200之N-醣基化位點佔有率。如自圖6A可見，第一、第二、第三、第四、第五及第六N-醣基化位點被大部分佔據，其中兩種分析偵測到約90%或以上及至多約100%之ATB200酶，在各潛在N-醣基化位點處偵測到N-聚醣。然而，第七潛在N-醣基化位點約一半時間經N-醣基化。
圖6B展示第一潛在N-醣基化位點N84之N-醣基化型態。如自圖6B可見，主要N-聚醣物質為雙M6P N-聚醣。第一及第二分析均在第一位點處偵測到超過75%具有雙M6P之ATB200，對應於在第一位點處每莫耳ATB200平均約0.8莫耳雙M6P。
圖6C展示第二潛在N-醣基化位點N177之N-醣基化型態。如自圖6C可見，主要N-聚醣物質為單M6P N-聚醣及非磷酸化較高甘露糖N-聚醣。第一及第二分析均在第二位點處偵測到超過40%具有單M6P之ATB200，對應於在第二位點處每莫耳ATB200平均約0.4至約0.6莫耳單M6P。
圖6D展示第三潛在N-醣基化位點N334之N-醣基化型態。如自圖6D可見，主要N-聚醣物質為非磷酸化高甘露糖N-聚醣、二觸角、三觸角及四觸角複合N-聚醣及雜合N-聚醣。第一及第二分析均在第三位點處偵測到超過20%具有唾液酸殘基之ATB200，對應於在第三位點處每莫耳ATB200平均約0.9至約1.2莫耳唾液酸。
圖6E展示第四潛在N-醣基化位點N414之N-醣基化型態。如自圖6E可見，主要N-聚醣物質為雙M6P及單M6P N-聚醣。第一及第二分析均在第四位點處偵測到超過40%具有雙M6P之ATB200，對應於在第四位點處每莫耳ATB200平均約0.4至約0.6莫耳雙M6P。第一及第二分析均在第四位點處偵測到超過25%具有單M6P之ATB200，對應於在第四位點處每莫耳ATB200平均約0.3至約0.4莫耳單M6P。
圖6F展示第五潛在N-醣基化位點N596之N-醣基化型態。如自圖6F可見，主要N-聚醣物質為岩藻糖基化二觸角複合N-聚醣。第一及第二分析均在第五位點處偵測到超過70%具有唾液酸殘基之ATB200，對應於在第五位點處每莫耳ATB200平均約0.8至約0.9莫耳唾液酸。
圖6G展示第六潛在N-醣基化位點N826之N-醣基化型態。如自圖6G可見，主要N-聚醣物質為二觸角、三觸角及四觸角複合N-聚醣。第一及第二分析均在第六位點處偵測到超過80%具有唾液酸殘基之ATB200，對應於在第六位點處每莫耳ATB200平均約1.5至約1.8莫耳唾液酸。
在第七位點N869處之N-醣基化的分析展現出約40% N-醣基化，其中最常見N-聚醣為A4S3S3GF（12%）、A5S3G2F（10%）、A4S2G2F（8%）及A6S3G3F（8%）。
圖6H展示七個潛在N-醣基化位點中之每一者處之磷酸化的概述。如自圖6H可見，第一及第二分析偵測到第一、第二及第四潛在N-醣基化位點處之較高磷酸化含量。在第一位點處偵測到超過80% ATB200之分析均為單磷酸化或雙磷酸化，在第二位點處超過40% ATB200為單磷酸化，且在第四位點處超過80% ATB200為單磷酸化或雙磷酸化。
根據LC‐MS/MS方法如下所述進行ATB200之另一N-醣基化分析。此分析在十批ATB200上產生平均N-醣基化型態（圖19A-19H，圖20A-20B）。
來自ATB200之N連接聚醣用PNGase-F以酶方式釋放且經2-鄰胺基苯甲酸（2-AA）標記。經2-AA標記之N-聚醣進一步由固相萃取（SPE）處理以移除過量鹽及其他污染物。將純化的2-AA N-聚醣溶解於乙腈/水（20/80；v/v）中，且將10微克負載於胺基聚合物分析管柱（apHera TM，Supelco）上用於使用螢光偵測之高效液相層析（HPLC-FLD）及高解析度質譜分析（HRMS）分析。
在正常相條件下以梯度溶離模式用移動相A（2%乙酸/乙腈）及移動相B（5%乙酸；20毫莫耳乙酸銨/水，用氫氧化銨調節至pH 4.3）進行液相層析（LC）分離。初始移動相組合物為70% A/30% B。對於螢光偵測，偵測器之參數（RF-20Axs，島津）為激發（Ex）：320 nm；發射（Em）：420 nm。使用在獨立資料獲取（IDA）模式下操作之四極飛行時間質譜儀（Sciex X500B QTOF）進行HRMS分析。使用來自ProteoWizard之MSConvert將獲取在資料檔案轉換為mzML檔案，且隨後將GRITS Toolbox 1.2晨間混合軟體（UGA）用於聚醣資料庫搜尋及所鑑別之N-聚醣的後續標註。使用前驅單同位素質量（m/z）及產物離子m/z鑑別出N-聚醣。實驗產物離子及片段化模式使用GlycoWorkbench 2應用經電腦模擬證實。
為了確定來自ATB200之N連接聚糖之相對定量，自HPLC-FLD-QTOF MS/MS實驗獲取之資料處理如下。FLD層析圖中之所有N-聚醣峰值經整合，且各峰指定為FLD層析圖中所有峰之總面積的百分比。表示為峰面積之螢光信號為樣品中之各N-聚醣之量的定量量度。然而，在大多數情況下，相同FLD峰值中含有多個N-聚醣物質。因此，亦需要質譜儀以獲得各N-聚醣物質之相對定量（表5）。各N-聚醣之離子強度訊號係自資料中「獲取」，以創建稱為提取之離子層析圖（XIC）之層析峰。XIC與FLD層析峰對準且對僅一種N-聚醣物質具有特異性。隨後整合由離子強度訊號產生之XIC峰值，且此峰值面積為所存在聚醣之量的相對定量量度。FLD峰面積及質譜儀XIC峰面積均用於實現本文所報導之ATB200之所有N連接聚醣物質的相對定量。
此LC-MS/MS分析之結果提供於下表5中。聚醣表示之符號命名法係根據Wopereis W等人. 2006。Sialuria患者中之經超唾液酸化O-聚糖異常醣基化. Biochimica et Biophysica Acta. 1762:598-607；Gornik O,等人. 2007。在敗血症及急性胰臟炎期間血清聚醣之變化。《糖生物學》.17:1321-1332; Kattla JJ,等人. 2011.《生物蛋白質醣基化》.In: Murray Moo-Young（ed.）, 綜合生物技術, 第二版, 3:467-486；Tharmalingam-Jaikaran T,等人.關鍵主要濾泡發育階段下牛卵泡流體的N-聚醣分析.2014.繁殖.148:569-580; Clerc F,等人. 人類血漿蛋白質N-醣基化。2015.Glycoconj J. DOI 10.1007/s10719-015-9626-2；及Blackler RJ,等人. 2016。單鏈抗體-片段M6P-1具有以分支特異性方式區別N-聚醣磷酸化的甘露糖6-磷酸鹽單醣-特異性結合袋。《糖生物學》.26-2:181-192. 表 5 ：基於 2-AA 聚醣定位及 LC-MS/MS 識別之在 ATB200 上鑑別的寡糖之類型及發生率
高甘露糖 N- 聚醣 % 總 複合 N- 聚醣 % 總 複合 N- 聚醣 % 總 複合 N- 聚醣 % 總
2P-M7 11.39 FA2G2S1 3.89 A3G3S1+1Ac 0.65 FA2G2S1+1Ac 0.29
P-M7 7.97 FA2G2S2 3.42 A3G2S2+1Ac 0.64 A4G3 0.29
M6 6.89 A2G2S2 3.32 A1G1S1 0.63 A4G4+3KDN 0.29
P-M6 3.42 FA2G2 2.77 A4G3S1 0.61 A4G4S3 0.28
M5 2.06 FA4G4S3 2.26 FA3G3 0.61 FA5G4 0.24
P-M5 1.67 A2G2S1 2.25 A1G1 0.6 A4G3S2 0.21
2P-M8 1.27 FA3G3S1 2.12 FA2G2S2+1Ac 0.57 FA1 0.21
P-M8 1.17 A3G3S2 1.8 A3G2S1 0.57 FA4G4 0.21
BP-M6 0.9 FA2G1 1.66 A3G2S1 0.56 A3G1 0.21
M7 0.81 A2G2 1.46 A2G2S2+1Ac 0.5 FA4G3S2 0.21
BP-M7 0.69 FA3G3S1 1.42 FA3G2 0.45 FA3G2S2 0.21
M4 0.14 A4G4S1 1.28 A3G3+3KDN 0.45 A1 0.2
BP2-M5 0.04 FA3G3S2 1.25 A4G3S1 0.45 A4G2 0.19
BP2-M6 0.01 FA4G4(1LN)S3 1.1 A2G1S1 0.41 FA4G3 0.19
雜合 N- 聚醣 % 總 FA4G4S1 1.08 A3G2 0.4 FA3 0.18
FA1P-M6 2.16 A3G3 1.08 FA4G4S1+LN 0.4 A1G1S1 0.18
M5A1G1S1 1.56 FA4G4S4 1.07 FA3G2S1 0.39 A4G1S1 0.16
FP-M6A1G1S1 0.42 FA3G3S3 1.04 FA2 0.38 FA1G1 0.15
A1M5 0.36 FA4G4S2 0.94 FA4G4S2+LN 0.38 FA3G1 0.14
A1G1M5 0.32 A2G1 0.94 A3G2S2 0.37 FA5G4S2 0.12
P-M6A1G1S1 0.17 FA2G1S1 0.94 A2 0.34 A3G1S1 0.11
概述 總 A4G4 0.91 FA4G4(2LN)S3 0.33 A3 0.11
高甘露糖 N- 聚醣 38% FA1G1S1 0.91 FA2G2Sg1 0.32 FA3G3S3+1Ac 0.1
雜合 N- 聚醣 5% FA2G2S2+2Ac 0.76 FA4G4(1LN)S4 0.31 A2G2S1+1Ac 0.09
複合 N- 聚醣 57% A4G4S2 0.69 A3G3S3 0.29 FA3G1S1 0.06
基於此2-AA及LC-MS/MS分析，且如進一步概括，所測試之ATB200具有每莫耳ATB200之3-5莫耳平均M6P含量（考慮到單M6P及雙M6P）及每莫耳ATB200之4-7莫耳唾液酸含量。
如圖19A-19H中所示且概述於圖20B中，ATB200之第一潛在N-醣基化位點之平均M6P含量為約1.4莫耳M6P/莫耳ATB200，平均單M6P含量為約0.25莫耳單-M6P/莫耳ATB200及平均雙M6P含量為約0.56莫耳雙M6P/莫耳ATB200；ATB200之第二潛在N-醣基化位點的平均M6P含量為約0.5莫耳M6P/莫耳ATB200，其中主要磷酸化N-聚醣物質為單M6P N-聚醣；ATB200之第三潛在N-醣基化位點的平均唾液酸含量為約1莫耳唾液酸/莫耳ATB200；ATB200之第四潛在N-醣基化位點的平均M6P含量為約1.4莫耳M6P/莫耳ATB200，平均單M6P含量為約0.35莫耳單M6P/莫耳ATB200，且平均雙M6P含量為約0.52莫耳雙M6P/莫耳ATB200；ATB200之第五潛在N-醣基化位點的平均唾液酸含量為約0.86莫耳唾液酸/ATB200；ATB200之第六潛在N-醣基化位點的平均唾液酸含量為約4.2莫耳唾液酸/莫耳ATB200；且ATB200之第七潛在N-醣基化位點的平均唾液酸含量為約0.86莫耳唾液酸/莫耳ATB200。
亦根據此2-AA及LC-MS/MS分析技術，ATB200之第一潛在N-醣基化位點處平均約65% N-聚醣為高甘露糖N-聚醣，ATB200之第二潛在N-醣基化位點處約89%之N-聚醣為高甘露糖N-聚醣，ATB200之第三潛在N-醣基化位點處超過一半N-聚醣經唾液酸化（其中幾乎20%經完全唾液酸化），且ATB200之第三潛在N-醣基化位點處之約85% N-聚醣為複合N-聚醣，ATB200之第四潛在N-醣基化位點處之約84% N-聚醣為高甘露糖N-聚醣，ATB200之第五潛在N-醣基化位點處之約70% N-聚醣經唾液酸化（其中約26%完全唾液酸化），及ATB200之第五潛在N-醣基化位點處之約100% N-聚醣為複合N-聚醣，ATB200之第六潛在N-醣基化位點處之約85% N-聚醣經唾液酸化（其中約27%完全唾液酸化），及ATB200之第六潛在N-醣基化位點處之約98% N-聚醣為複合N-聚醣，及ATB200之第七潛在N-醣基化位點處之約87% N-聚醣經唾液酸化（其中約8%完全唾液酸化），及ATB200之第七潛在N-醣基化位點處之約100% N-聚醣為複合N-聚醣。 實例 4 ： ATB200 及 MYOZYME®/ LUMIZYME® 之分析型比較
經純化ATB200及LUMIZYME® N-聚醣係藉由MALDI-TOF評估，以確定在各ERT上發現之個別N-聚醣結構。LUMIZYME®係自商業來源獲得。如圖7中所繪示，ATB200在LUMIZYME®右側呈現出四個主峰溶離。此證實ATB200之磷酸化程度高於LUMIZYME®，因為此評估係藉由末端電荷而非CIMPR親和力進行。如圖8中所概述，發現ATB200樣品含有低於LUMIZYME®之量的非磷酸化高甘露糖型N-聚醣。
為了評估MYOZYME®及LUMIZYME®中習知rhGAA與CIMPR相互作用的能力，將兩個習知rhGAA製劑注射至CIMPR親和管柱（其結合具有M6P基團之rhGAA）上且收集流過物。用自由M6梯度溶離所結合之材料。將溶離份收集於96孔盤中，且藉由4MU-α-葡萄糖基質分析GAA活性。未結合（流過）與結合（溶離之M6P）rhGAA之相對量係基於GAA活性確定且報導為總酶之分數。圖9A及圖9B展示在MYOZYME®及LUMIZYME®中之rhGAA的結合概況：MYOZYME®（圖9B）中之73% rhGAA及LUMIZYME®（圖9A）中之78% rhGAA未結合至CIMPR。實際上，MYOZYME®中之僅27% rhGAA及LUMIZYME®中之22% rhGAA含有M6P，其可有效地將其靶向肌肉細胞上之CIMPR。相比之下，如圖5中所繪示，在相同條件下，發現ATB200中超過70% rhGAA結合至CIMPR。
除具有較大百分比之可結合至CIMPR的rhGAA之外，重要的是理解該相互作用之品質。LUMIZYME®及ATB200受體結合使用CIMPR盤結合分析確定。簡言之，經CIMPR塗佈之盤用於捕獲GAA。將不同濃度之rhGAA塗覆至固定受體且洗掉未結合之rhGAA。剩餘rhGAA之量係藉由GAA活性確定。如圖10A中所繪示，ATB200與LUMIZYME®相比顯著更佳結合至CIMPR。圖10B展示LUMIZYME®（習知rhGAA產物）及根據本發明之ATB200中之雙M6P N-聚醣的相對含量。對於LUMIZYME®，平均僅10%分子具有雙磷酸化N-聚醣。相比之下，ATB200中之平均每一rhGAA分子具有至少一個雙磷酸化N-聚醣。
總體而言，與LUMIZYME®相比，ATB200中更高含量之M6P N-聚醣指示ATB200中更高部分之rhGAA分子可靶向肌肉細胞。如上文所示，藉由MALDI確定之單磷酸化及雙磷酸化結構之高百分比與CIMPR概況一致，其說明ATB200與CIMPR受體之顯著更大的結合。經由MALDI-TOF質譜分析之N-聚醣分析證實平均各ATB200分子含有至少一個天然雙M6P N-聚醣結構。ATB200之此更高雙M6P N-聚醣含量與M6P受體盤結合分析中結合至CIMPR之高親和力（K D約2-4 nM）直接相關。
使用正常及龐貝成纖維細胞細胞株比較ATB200及LUMIZYME® rhGAA之相對細胞吸收。比較涉及本發明之5-100 nM之ATB200與10-500 nM習知rhGAA產物LUMIZYME®。培育16 hr後，用TRIS鹼使外部rhGAA不活化，且細胞在收穫前用PBS洗滌3次。藉由4MU-α-葡糖苷水解量測之內化GAA且相對於總細胞蛋白質圖示，且結果呈現於圖11A-11C中。
亦展示ATB200有效內化至細胞中。如圖11A-11B中所描繪，ATB200內化至正常及龐貝成纖維細胞二者中，且比習知rhGAA產物LUMIZYME®內化程度更高。ATB200在約20 nM下使細胞受體飽和，同時需要約250 nM LUMIZYME®以使細胞受體飽和。如圖11C所示，由此等結果外推出的吸收效率常數（K 吸收）為ATB200：2-3 nm及LUMIZYME®：56 nM。此等結果表明ATB200為用於龐貝症之很好靶向處理。 實例 5 ： ATB200 及藥理學伴隨蛋白
使用SYPRO橙色在熱穩定性分析中評估ATB200在酸性或中性pH緩衝液中之穩定性，因為染料之螢光當蛋白質變性時增加。如圖12中所繪示，添加AT2221以濃度依賴性方式在pH 7.4下使ATB200穩定，與ATB200在pH 5.2下之穩定性類似，模仿溶酶體之酸性環境的條件。如表6中所概述，添加AT2221使ATB200之熔融溫度（ T m ）增加幾乎10℃。 表 6.ATB200 與 AT2221 之穩定性
測試條件 溫度（ ℃ ）
pH 7.4 56.2
pH 7.4 + 10 µM AT2221 61.6
pH 7.4 + 30 µM AT2221 62.9
pH 7.4 + 100 µM AT2221 66.0
pH 5.2 67.3
實例 6 ： Gaa KO 小鼠中共同投與 ATB200 及 AT2221
評估ATB200及AT2221之治療效果，且針對 GaaKO小鼠中之阿糖苷酶α之治療效果進行比較。為進行研究，使用雄性 GaaKO（3至4個月大）及年齡匹配的野生型（WT）小鼠。經由彈丸注射尾部靜脈靜脈內（IV）注射投與阿糖苷酶α。在共同投與方案中，經由經口管飼（PO）在IV注射ATB200之前30分鐘投與AT2221。兩週一次給予處理。在最後投與14天之後處死經處理小鼠，且收集各種組織用於進一步分析。表7概述該研究設計： 表 7. 共同投與研究設計
基因型 處理 每次投與之藥物劑量 （每兩週） 投與數目
GaaKO 媒劑 N/A 6
GaaKO 阿糖苷酶α 20 mg/kg 6
GaaKO ATB200/AT2221 20 mg/kg（ATB200） 10 mg/kg（AT2221） 6
WT（Sve 129） 未處理 N/A N/A
如上文所論述，使用澱粉葡糖苷酶消化確定組織樣品中之組織肝醣含量。如圖13中所繪示，20 mg/kg ATB200與10 mg/kg AT2221之組合與相同劑量之阿糖苷酶α相比顯著降低四種不同組織（四頭肌、三頭肌、腓腸肌及心臟）中之肝糖含量。
亦根據以下中論述之方法分析組織樣品之生物標記物變化：Khanna R,等人.（2012）, 「藥理學伴隨蛋白AT2220在龐貝症小鼠模型中增加重組人類酸性α葡萄糖苷酶吸收及肝糖還原」, Plos One 7(7): e40776；及Khanna, R等人.（2014), 「藥理學伴隨蛋白AT2220增加突變體酸性α葡萄糖苷酶之特異活性及溶酶體遞送，且促進龐貝症基因轉殖小鼠模型中之肝糖還原」, PLoS ONE 9(7): e102092。如圖14中所繪示，與WT相比，在 GaaKO動物中之肌纖維中觀測到LAMP1陽性囊泡之顯著增加及擴大，指示溶酶體增殖。ATB200/AT2221之共同投與引起在標準化LAMP1含量下之更多纖維，而剩餘LAMP1陽性囊泡之尺寸亦降低（插圖）。
類似地，未處理 GaaKO小鼠之肌纖維中之劇烈LC3陽性凝集物表明存在自噬區及自體吞噬積聚。與經阿糖苷酶α處理之小鼠相比，LC3陽性凝集物（紅色）較佳地在經ATB200/AT2221共同投與處理之小鼠中降低（圖15A）。當使用西方墨點法評定LC3之表現時進行類似觀測。如圖15B中所繪示，經ATB200/AT2221處理之大部分動物展現出LC3 II（與自噬小體相關之脂化形式）之顯著降低，表明自體吞噬通量之改善。相比之下，阿糖苷酶α對自體吞噬之影響為適度的。
亦評定質膜修復蛋白，一種涉及膜修復且缺陷/錯誤運輸與多個肌肉失養症相關。如圖16中所繪示，質膜修復蛋白（棕色）大量地積聚於 GaaKO小鼠之肌漿中。與阿糖苷酶α相比，ATB200/AT2221能夠在更多數目之肌纖維中使質膜修復蛋白恢復至肌纖維膜。
此等資料與用ATB200及美格魯特處理之人類龐貝症患者中展現出之細胞水準下的改善一致（例如患者展現肝醣累積及肌肉損傷之生物標記物含量降低），不僅引起龐貝症之有效治療且亦引起疾病進展之逆轉。人類龐貝症患者中之臨床資料概述於以下實例8及9中。 實例 7 ：單纖維分析
如圖17中所繪示，大部分經媒劑處理之小鼠展現出溶酶體大體上放大（綠色）（參見例如「B」）及呈現大規模自噬積聚（紅色）（參見例如「A」）。經MYOZYME®處理之小鼠未展現出與經媒劑處理之小鼠相比之任何顯著差異。相比之下，自經ATB200處理之小鼠中分離之大部分纖維展現出顯著降低之溶酶體尺寸（參見例如「C」）。此外，自噬積聚之面積亦不同程度地減少（參見例如「C」）。因此，自ATB200處理之小鼠中分析之大部分肌纖維（36-60%）看起來正常或接近正常。下表8概述圖17中所示之單個纖維分析。 表 8. 單纖維分 析
處理 所分析之動物 所分析之纖維總數目（ n ） 溶酶體增大 具有自體吞噬積聚之纖 維 具有正常或接近正常外觀之纖維
WT 2 65 - - 100%
媒劑 2 65 + ＞90% ＜10%
阿糖苷酶α 4 150 + ＞90% ＜10%
ATB200 5 188 大部分纖維之尺寸嚴重降低 40-64%* 36-60%
*此包括具有自噬性積聚不同程度降低之纖維。總體而言，與經媒劑或阿糖苷酶α處理組相比，在ATB200處理組中之積聚程度較小。
總體而言，資料表明，具有更高M6P含量之ATB200，單獨及在血液之中性pH下藉由藥理學伴隨蛋白AT2221進一步穩定，與阿糖苷酶α相比，當向 GaaKO小鼠投與時，在組織靶向及溶酶體運輸中更高效，與如圖18中所描繪之AT2221對ATB200之穩定性一致。因此，投與ATB200及共投與ATB200/AT2221在校正一些疾病相關病變（諸如肝醣累積、溶酶體增殖及自噬區形成）方面比阿糖苷酶α更有效。歸因於此等積極治療作用，顯示投與ATB200及ATB200/AT2221共投與以改善因破壞所致之肌纖維恢復的機率，且甚至提高由於缺乏最佳GAA活性而積聚於細胞中之清除肝醣引起的逆轉損害。如同實例6，此等資料亦與在投與ATB200及美格魯特之後引起龐貝症之有效治療及疾病進展逆轉兩者之人類龐貝症患者中證實之細胞含量下的改善一致。人類龐貝症患者中之臨床資料概述於以下實例8及9中。 實例 8 ： ATB200-02 試驗
進行1/2期（ATB200-02，NCT-02675465）開放標示、固定順序、劑量遞增臨床研究，以評定靜脈內輸注ATB200與AT2221在患有龐貝症之成年個體中之安全性、耐受性、藥物動力學、藥力學及臨時功效。資料報導於國際公開案第WO 2020/163480號中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。 實例 9 ： ATB200-03 試驗：患有龐貝症之患者中之 ATB200/AT2221 的 3 期人類中研究
ATB200-03試驗為在患有遲發性龐貝症（LOPD）之成年個體中之ATB200/AT2221與阿糖苷酶α/安慰劑相比之3期雙盲、隨機化、多中心、國際研究，該等個體已接受使用阿糖苷酶α之酶替代療法（亦即，經歷過ERT）或從未接受過ERT（亦即，未經ERT處理）。 研究設計
如圖21中所繪示，試驗由至多30天之篩選期、12個月處理期及30天安全追蹤期組成。符合條件的個體以2:1比率隨機分配以接受ATB200/AT2221或阿糖苷酶α/安慰劑且藉由ERT狀態（經歷過ERT）、未經ERT處理及基線6分鐘步行距離（6MWD）分級（75至＜ 150公尺，150至＜ 400公尺，≥ 400公尺）。
有效性評定（亦即，功能性評定）包括評估行走功能（6MWT）、運動功能測試（步態、樓梯、高爾、椅子操縱（GSGC）測試及起立-行走計時（TUG）測試）、肌肉強度（徒手肌力測試及定量肌力測試）及肺部功能測試（FVC、SVC、MIP、MEP及SNIP）。記錄患者報導之結果（Rasch創建之龐貝特異性活性（R Pact）量表、EuroQol 5維5水平儀（EQ-5D-5L）、針對身體功能、疲乏、呼吸困難及上肢之患者報導之結果量測資訊系統（PROMIS®）儀器，及個體對變化之整體印象）。亦進行醫師對變化之整體印象。
藥力學評定包括肌肉損傷（肌酸激酶（CK））及疾病底物（尿液己醣四醣（Hex4））之生物標記物的量測。收集稀少血液樣品用於確定經歷過ERT之個體中之群體PK分析的血漿之總GAA蛋白質含量及AT2221濃度。在未經ERT處理之個體中進行用於表徵總GAA蛋白及AT2221之PK概況的連續血液取樣。
安全性評估包括監測不良事件（AE），包括輸注相關反應（IAR）、臨床實驗室測試（化學、血液學及尿樣分析）、生命跡象、身體檢查，包括體重、心電圖（ECG）及免疫原性。亦記錄伴隨藥物治療及非藥物療法。
個體選擇
參與研究之個體符合所有以下入選標準及無排除標準。總共，122位個體參與ATB200-03試驗。其中，85名個體（經歷過ERT：65；未經ERT處理：20）接受ATB200/AT2221處理，且37名個體（經歷過ERT：30；未經ERT處理：7）接受阿糖苷酶α/安慰劑處理。如圖22中所示，基線6MWD及FVC資料代表該群體且兩個處理組中通常類似。
入選標準： 1. 在進行任何研究之相關程序之前，個體提供簽署的知情同意書。 2. 男性及女性個體≥18歲且在篩選時稱重≥40 kg。 3. 具有生育潛力之女性個體及男性個體同意在研究期間使用醫學上公認之避孕方法且持續在最後一次劑量之研究藥物之後90天。 4. 個體基於以下中之一者的文獻診斷為LOPD： a. GAA酶缺乏 b. GAA基因分型 5. 個體在ERT狀態方面歸類為以下中之一者： a. 經歷過ERT，定義為在建議劑量及方案（亦即，每2週20 mg/kg劑量）下接受標準照護ERT（阿糖苷酶α）持續≥24個月。 特定於澳大利亞，經歷過ERT，定義為在建議劑量及方案下以20 mg/kg之劑量接受標準照護ERT（阿糖苷酶α），基於偏瘦或理想體重，每2週 b. 未經ERT處理，定義為從未接受研究性或可商購ERT 6. 個體在篩選時之坐著的FVC≥30%之針對健康成人之預測值（全國健康及營養檢查調查III） 7. 個體在篩選時進行兩個6MWT，如藉由臨床評估器所確定為有效的，且滿足所有以下標準： a. 6MWD之兩種篩選值≥75公尺 b. 6MWD之兩種篩選值≤90%之針對健康成人之預測值 c. 6MWD之下限值在20%之6MWD上限值內
排除準則： 1. 個體在治療或處理之30天或5倍半衰期內（以較長者為準）、在第1天之前已接受對龐貝症（除阿糖苷酶α以外）之任何研究性療法或藥理學處理或預計在研究期間亦如此。 2. 個體已接受龐貝症之基因療法。 3. 個體在第1天之前30天內服用以下禁止藥劑中之任一者： ● 米格列醇 ● 美格魯特 ● 阿卡波糖（acarbose） ● 伏格列波糖（voglibose） 4. 個體在蘇醒時每天需要使用侵入性或非侵入性通風支持＞6小時。 5. 個體對ATB200、阿糖苷酶α或AT2221中之賦形劑中之任一者具有超敏性。 6. 個體具有醫學病況或任何其他情有可原的情形，就研究者或醫學監測者而言，其對個體造成不恰當的安全風險或損害他/她遵守協定要求或對協定要求產生不利影響的能力。此包括具有不可控或控制不佳之症狀的臨床抑鬱症（如由精神病學或其他精神健康專業人士診斷）。 7. 在篩選時，個體（若為女性）為懷孕或哺乳。 8. 個體（無論男性或女性）在研究期間規劃懷孕兒童。 9. 個體拒絕進行基因測試。
研究產品、劑量及投與模式
個體以至少2:1之隨機化比率隨機化以接受ATB200/AT2221或阿糖苷酶α/安慰劑。下表9概述入選個體之治療。 表 9. 治療分配及方案
治療分配 治療 方案
ATB200/AT2221 AT2221 a 個體≥ 50 kg：260 mg（4 × 65-mg口服膠囊）在ATB200輸注之前1小時，每2週 個體≥ 40 kg至＜ 50 kg：195 mg（3 × 65‑mg口服膠囊）在ATB200輸注之前1小時，每2週
ATB200 每2週在4小時持續時間內20 mg/kg靜脈內輸注
阿糖苷酶α/安慰劑 安慰劑 個體≥ 50 kg：安慰劑（4口服膠囊）在阿糖苷酶α輸注之前1小時，每2週 個體≥ 40 kg至＜ 50 kg：安慰劑（3口服膠囊）在阿糖苷酶α輸注之前1小時，每2週
阿糖苷酶α 每2週在4小時持續時間內20 mg/kg靜脈內輸注
縮寫：IV=靜脈內 注意：要求個體在投與AT2221或安慰劑之前至少2小時及在投與AT2221或安慰劑之後2小時禁食。
資料評估及統計考慮
主要功效終點為6MWD截至第52週相對於基線的變化。使用在違反正態性的情況下重複量測（MMRM）之混合作用模型及預先指定非參數測試，針對ATB200/AT2221相對於阿糖苷酶α/安慰劑之優越性測試主要終點。
呈預先指定之分層次序之重要次要功效終點如下。使用共變數分析（ANCOVA）模型以及末次觀測值轉結法（ITT LOCF）分析此等次要終點。 ● 坐著的FVC截至第52週之相對於基線的變化（預測%） ● 下肢之徒手肌力測試評分截至第52週之相對於基線的變化 ● PROMIS-實體功能之總分截至第52週之相對於基線的變化 ● PROMIS-疲乏之總分截至第52週之相對於基線的變化 ● GSGC總分截至第52週之相對於基線的變化
其他次要功效終點如下： ● 與運動功能相關之以下變數截至第52週之相對於基線的變化： - 完成GSGC測試之10公尺步行（即，步態評定）之時間 - 完成GSGC測試之爬4級樓梯時間 - 完成GSGC測試之高爾操作時間 - 作為GSGC測試之一部分自椅子上站起的時間 - 完成TUG測試之時間 ● 與肌肉強度相關之以下變數截至第52週之相對於基線的變化： - 上肢之徒手肌力測試評分 - 徒手肌力測試總評分 - 上肢之定量肌力測試值（Kg） - 下肢之定量肌力測試值（Kg） - 定量肌力測試總值（Kg） ● 來自患者報導之結果量測的以下變量截至第52週之相對於基線的變化： - PROMIS-呼吸困難之總分 - PROMIS-上肢之總分 - R-PAct量表總評分 - EQ-5D-5L正常狀態 ● 在第52週時，個體之身體狀態（改善、穩定或下降）關於以下生活領域中研究藥物之作用的實際值，如藉由個體對變化之整體印象所量測 - 整體物理健康 - 呼吸運作 - 肌肉強度 - 肌肉功能 - 自由行走能力 - 日常生活活動 - 能量位準 - 肌肉疼痛位準 ● 在第52週時，個體之身體狀態（改善、穩定或下降）的實際值，如藉由醫師對變化之整體印象所量測 ● 在以下肺部功能量測中截至第52週之相對於基線的變化，如下： - 坐著的FVC（預測%） - MIP（cmH 2O） - MIP（預測%） - MEP（cmH 2O） - MEP（預測%） - SNIP（cmH 2O）
藥力學終點如下： ● 血清CK含量截至第52週之相對於基線的變化 ● 尿液Hex4含量截至第52週之相對於基線的變化
對於經歷RTT之個體，收集來自總GAA蛋白質位準及AT2221濃度之群體PK分析的藥物動力學終點。對於未經ERT處理之個體，計算血漿總GAA蛋白質濃度及AT2221之PK參數。
ATB200/AT2221之安全概況係使用治療引發不良事件（TEAE）、嚴重不良事件（SAE）及引起研究藥物中斷之AE的發生率、即刻及晚期IAR之頻率及嚴重程度以及其他安全性評估中提及之任何異常表徵。亦評估免疫原性對ATB200及阿糖苷酶α對安全性及有效性之影響。
統計方法包括以下關於樣品隨機化、樣品大小計算、功效分析及安全性分析之考慮因素。
隨機化.以下兩個因素被確定為設計分層變量：1.基線6MWD（75至＜ 150公尺, 150至＜ 400公尺，≥ 400公尺）；及2. ERT狀態（經歷過ERT，未經ERT處理）。此等兩個因素形成六個因素組合（亦即，水準，層）。集中式區塊隨機化程序用以平衡上述風險因素，1）減小偏差且增大統計分析之精確度，及2）允許各種計劃及計劃外的子集分析。對6個層中之每一者進行區塊隨機化程序。隨機化比率為2:1 ATB200/AT2221比阿糖苷酶α/安慰劑，固定。
樣品大小計算.在優越性測試中，確定2邊顯著含量為0.05及2:1隨機化方案（ATB200/AT2221組中之66名個體及阿糖苷酶α/安慰劑組中之33名個體，總樣品大小為99個體）之2組t測試具有約90%能力偵測2組之間的0.7之標準化效應大小。使用Nquery 8©®進行此計算。假定10%丟棄速率，則樣品大小將約為110名個體。
功效分析.使用共變異（ANCOVA）模型之參數分析分析主要功效終點（亦即，6MWD之截至第52週之相對於基線的變化）以比較新治療與對照。此模型將通常調節基線6MWD（作為連續共變數），且2因子用於對隨機化進行分層：ERT狀態（未經ERT處理相對於經歷過ERT）及基線6MWD（75至＜ 150公尺，150至＜ 400公尺，≥ 400公尺）。然而，基線6MWD由於其之間預期的高點雙連續相關性而不可用於模型兩次（均為連續及分類變數）。因此，模型中保持6MWD連續變數，但移除分類6MWD。ANCOVA模型隨後具有用於治療、基線6MWD（連續）及ERT狀態（類別）之術語。
另外，偵測潛在的治療與共變量相互作用（亦即，藉由ERT狀態處理及治療與基線6MWD連續）。若相互作用術語在統計上顯著（例如，p ＜ 0.10，2邊），且存在邏輯生物解釋，則相互作用術語可潛在地添加於將用於主要終點分析之最終ANCOVA模型中。接著基於ANCOVA模型分析資料，且提供所有相關評估（例如各處理組之LS平均值、LS平均值差異、LS平均值差異之95%信賴區間（CI）及2個處理組之間比較之p值）。
為了支持臨床益處之解釋，基於處理結果資料之總體性定義複合型個體-含量反應。基於處理結果，個體藉由由顯著改善、中度改善或輕微/無改善組成之順序反應變數進行分類。
關鍵次要終點根據分級次序使用逐步閉合測試程序分析，以控制I型錯誤率。關鍵次要終點及其他次要終點分別使用用於主要終點分析之類似方法來分析。
安全性分析.使用分類資料之計數及百分比及連續資料之描述性統計（平均值、標準差、中值、最小值、最大值）來概述安全性資料。
來自 ATB200-03 試驗之功效結果
在總群體中，ATB200/AT2221處理展示相對於第52週時之基線（圖23A）及隨時間推移（圖23B）之預測FVC百分比的6MWD及穩定性改善。與阿糖苷酶α/安慰劑相比，ATB200/AT2221處理在第52週時展現出總群體中之6MWD的更大改善（圖23A）。此外，如圖23A中所繪示，與阿糖苷酶α/安慰劑相比，ATB200/AT2221處理在第52週時展現出總群體中之預測FVC百分比的臨床顯著改善。
在經歷過ERT之群體中，ATB200/AT2221處理相對於基線在第52週時展現出預測FVC百分比之6MWD及穩定性的改善（圖24）。與阿糖苷酶α/安慰劑相比，ATB200/AT2221在經歷過ERT之群體中展現出6MWD隨時間推移之改善及預測FVC百分比隨時間推移之改善（圖25）。此外，如圖24中所繪示，與阿糖苷酶α/安慰劑相比，ATB200/AT2221處理在第52週時展現出經歷過ERT之群體中之6MWD及預測FVC百分比二者的臨床顯著改善。
如圖26A及26B中所示，在較小未經ERT處理之群體（n=27）中，ATB200/AT2221處理展現出在第52週（圖26A）相對於基線及隨時間推移（圖26B）6MWD之改善及預測FVC百分比之穩定性。兩個處理組之間的差異更大，且在6MWD或預測FVC百分比中未觀測到臨床顯著改善（圖26A）。
如圖28中所示，在總群體經歷過ERT之群體中，相較於阿糖苷酶α/安慰劑，下肢MMT在數值上有利於ATB200/AT2221處理。
如圖29中所示，與阿糖苷酶α/安慰劑相比，在總體及經歷過ERT之群體中，ATB200/AT2221處理在第52週時展現出GSGC之臨床顯著改善。
如圖30中所示，在總群體及經歷過ERT之群體中，相較於阿糖苷酶α/安慰劑，PROMIS身體功能在數值上有利於ATB200/AT2221處理。
如圖31中所繪示，在總群體及經歷過ERT之群體中，在兩個處理組之間，PROMIS疲乏類似地改善。
來自 ATB200-03 試驗之生物標記物結果
在總群體及經歷過ERT之群體中，ATB200/AT2221處理展現出肌肉損傷（CK）及疾病底物（Hex4）之生物標記物隨時間推移的改善（圖32及33）。此外，如圖32及33中所繪示，在總群體及經歷過ERT之群體中，與阿糖苷酶α/安慰劑相比，在第52週時CK及尿液Hex4之降低在ATB200/AT2221處理下顯著更大。
如圖34中所概述，在總群體及經歷過ERT之群體中，運動功能、肺部功能、肌肉強度、患者報導之結果（PRO）及生物標記物之間的終點始終有利於ATB200/AT2221而非阿糖苷酶α/安慰劑。此外，在所評定之17個功效及生物標記物終點中，16個有利於ATB200/AT2221處理而非阿糖苷酶α/安慰劑。
來自 ATB200-03 試驗之安全性結果
如圖35中所繪示，ATB200/AT2221處理組之總體安全概況與阿糖苷酶α/安慰劑組之安全概況類似。
圖36-圖40描述ATB200-03試驗之額外態樣。 實例 10 ： PROPEL 3 期臨床試驗之結果
AT-GAA顯示肌肉骨胳與呼吸量測在遲發性龐貝症方面與關鍵3期PROPEL研究中之標準照護相比的臨床上有意義且顯著改善。PROPEL亦稱為「ATB200-03」，參見實例9。
患者由經批准標準照護ERT（阿糖苷酶α）轉向AT-GAA遠步行平均17公尺（p=0.046）。
與用阿糖苷酶α（FVC差異4.1%；p=0.006）處理之患者的下降相比，轉向AT-GAA之患者亦顯示百分比預測之用力肺活量（FVC）改善，其為龐貝症之呼吸功能的最重要的量度。
與用阿糖苷酶α（FVC差異3.0%；p=0.023）處理之患者的下降相比，AT-GAA在第一關鍵次要終點上展現出標稱統計顯著及臨床上有意義的優勢差異。
在轉向ERT及未經ERT處理之患者的組合研究群體中，主要終點上AT-GAA勝過阿糖苷酶α 14公尺（21m相比於7m），且對於優越性無統計學意義（p=0.072）。
對組合研究群體之龐貝症（Hex-4及CK）之兩個重要生物標記物的改善明顯地有利於AT-GAA（相較於阿糖苷酶α（p＜0.001））。
PROPEL為經設計以評估AT-GAA相較於當前標準照護（阿糖苷酶α，一種酶替代療法（ERT））之有效性、安全性及耐受性的52週雙盲隨機化整體研究。該研究招募123位成年龐培患者，其仍能夠行走且在無機械通氣之情況下呼吸且5大洲24個國家的62個臨床中心進行。其為曾在溶酶體病症中進行之最大受控臨床研究。
將參與PROPEL之患者隨機分組為2:1，以使得每兩個患者隨機化成經AT-GAA處理，一個隨機化成經阿糖苷酶α處理。在參與PROPEL之龐貝症患者中，77%在參與之前立即用阿糖苷酶α（n=95）處理，且23%從未用任何ERT（n=28）處理。117名患者完成PROPEL研究，且所有117已自願參與長期擴展研究，且現僅用AT-GAA治療其龐貝症。
在組合之轉向 ERT 及未經 ERT 處理之研究群體中之 6 分鐘步行距離（ 6MWD ）及百分比預測用力肺活量（ FVC ）的預先指定分析 :
研究之主要終點為與在整個組合轉向ERT及未經ERT處理之患者群體中在52週時之基線量測值相比，6分鐘步行距離之平均變化。在此組合群體中，相比於經阿糖苷酶α處理之彼等患者的7公尺（n=37），使用AT-GAA之患者（n=85）在52週時平均步行遠21公尺（表10）。評估組合群體中之此主要終點之優越性且儘管數值上更大，與阿糖苷酶α臂（p=0.072）相比，對於AT-GAA臂，未實現對此組合群體之優越性的統計顯著性。
根據統計分析計劃之層次，研究之第一關鍵次要終點為在整個組合群體中在52週時經預測FVC百分比之平均變化。在此組合群體中，使用AT-GAA之患者證實優於經阿糖苷酶α處理之彼等患者的標稱統計顯著及臨床上有意義的優勢差異。AT-GAA在52週之後顯著減緩患者之呼吸減退速率。經AT-GAA處理之患者展現出與阿糖苷酶α臂（p=0.023）（表11）中之4.0%絕對下降相比，預測FVC百分比之0.9%絕對下降。預測FVC百分比為龐貝症之呼吸道肌肉功能之最重要量度，且為阿糖苷酶α之批准基礎。 表 10. 總體轉向 ERT 及未經 ERT 處理之研究群體中之 6MWD （ m ）
處理 基線 在第 52 週時之 CFBL 差異 p 值
AT-GAA（n=85） 357.9（111.8） +20.8（4.6） +13.6（8.3） p=0.072
阿糖苷酶α（n=37） 351.0（121.3） +7.2（6.6）
表 11. 總體轉向 ERT 及未經 ERT 處理之研究群體中之 FVC （預測 % ）
處理 基線 在第 52 週時之 CFBL 差異 p 值
AT-GAA（n=85） 70.7（19.6） -0.9（0.7） +3.0（1.2） p=0.023
阿糖苷酶α（n=37） 69.7（21.5） -4.0（0.8）
在轉向 ERT 之研究群體中之 6 分鐘步行距離（ 6MWD ）及百分比預測用力肺活量（ FVC ）的預先指定分析（ n=95 ）：
轉向PROPEL之患者進入研究時已經阿糖苷酶α處理持續最少兩年。在進入PROPEL研究之前超過三分之二（67%+）之彼等患者已進行ERT處理超過五年（平均值7.4年）。
6分鐘步行距離上自阿糖苷酶α切換之患者的預先指定分析展示，相比於隨機分組停留於阿糖苷酶α上（n=30）之彼等患者的0.0公尺，在52週自切換之後AT-GAA處理之患者（n=65）比其基線多走16.9公尺（p=0.046）（表12）。
根據預測FVC百分比自阿糖苷酶α轉換之患者的預先指定分析顯示，經AT-GAA治療之患者根據此重要量度穩定且略微改善其呼吸功能，而剩餘留在阿糖苷酶α之彼等患者持續呼吸肌肉功能顯著下降。AT-GAA患者顯示預測FVC百分比之0.1%絕對增加，而阿糖苷酶α患者顯示一年過程內4.0%絕對下降（p=0.006）（表13）。 表 12. 轉向 ERT 研究群體中之 6MWD （ m ）
處理 基線 在第 52 週時之 CFBL 差異 p 值
AT-GAA（n=65） 346.9（110.2） +16.9（5.0） +16.9（8.8） p=0.046
阿糖苷酶α（n=30） 334.6（114.0） 0.0（7.2）
表 13. 轉向 ERT 研究群體中之 FVC （經預測 % ）
處理 基線 在第 52 週時之 CFBL 差異 p 值
AT-GAA（n=65） 67.9（19.1） +0.1（0.7） +4.1（1.2） p=0.006
阿糖苷酶α（n=30） 67.5（21.0） -4.0（0.9）
在未經 ERT 處理之群體中之 6 分鐘步行距離（ 6MWD ）及百分比預測用力肺活量（ FVC ）的預先指定分析（ n=28 ）：
對先前從未以6分鐘步行距離用任何ERT處理之患者的預先指定分析顯示，在52週之後經AT-GAA處理之患者（n=20）步行比其基線遠33公尺。阿糖苷酶α處理之患者（n=7）比其基線遠38公尺。兩組之間的差異在統計學上不顯著（p=0.60）（表14）。
預先用任何ERT處理之患者之預先指定分析在52週時從未預先用任何ERT處理之患者展現出類似百分比預測用力肺活量（FVC），對於AT-GAA處理之患者而言為-4.1%，且對於阿糖苷酶α處理之患者為-3.6%（表15）。兩組之間的差異在統計學上不顯著（p=0.57）。 表 14. 未經 ERT 處理之群體的 6MWD （ m ）
處理 基線 在第 52 週時之 CFBL 差異 p 值
AT-GAA（n=20） 393.6（112.4） +33.4（10.9） -4.9（19.7） p=0.60
阿糖苷酶α（n=7） 420.9（135.7） +38.3（11.1）
表 15. 未經 ERT 處理之群體中之 FVC （經預測 % ）
處理 基線 在第 52 週時之 CFBL 差異 p 值
AT-GAA（n=20） 80.2（18.7） -4.1（1.5） -0.5（2.7） p=0.57
阿糖苷酶α（n=7） 79.1（22.6） -3.6（1.8）
注意：歸因於使用影響其基線效能之研究性合成代謝類類固醇，自研究分析中排除阿糖苷酶α臂中之一名患者。
在總體轉向 ERT 及未經 ERT 處理之研究群體之間的其他關鍵次要終點及生物標記物終點的預先指定分析：
肌骨胳及其他關鍵次要終點：
GSGC （步態、樓梯、高爾、椅子）：GSGC為龐貝症中重要且通用的終點，用於捕獲力量、協作及活動性。經AT-GAA處理之患者證實在此重要評定中，相比於在總群體中經阿糖苷酶α治療之患者的惡化，對評分之統計學上顯著之改善（p＜0.05）。
下肢 MMT （徒手肌力測試）、 PROMIS 身體功能：在肌肉強度及患者報導之結果的此等經驗證量測的兩者中，經AT-GAA處理之患者比經阿糖苷酶α處理之患者在數值上改善更多，但結果在統計學上不顯著。
PROMIS 疲乏：如藉由此量表所量測之疲乏略微有利於AT-GAA處理之患者，而非阿糖苷酶α處理之患者。
處理對疾病之作用的生物標記物：
尿液Hex-4：對於轉向ERT及未經ERT處理之患者的組合研究群體，接受AT-GAA之患者在該生物標記物上表現出實質性改善，52週後Hex-4平均減少-31.5%，而阿糖苷酶α處理之患者中Hex-4增加+11.0%（亦即，惡化）（p=＜0.001）。尿液Hex-4為龐貝症中之常見生物標記物且用作接受ERT之龐貝症患者中之骨骼肝醣清除程度之間接量度。肝醣係積聚在龐貝症患者之肌肉之溶酶體中的底物。
CK （肌酸激酶）：在52週之後，經AT-GAA處理之患者與在阿糖苷酶α處理之患者中之+15.6%增加（亦即，惡化）相比，展現出此生物標記物之實質性改善以及CK之平均降低-22.4% 。（p＜0.001）。CK為滲漏至受損肌肉細胞之外且在龐貝症患者中升高的酶。
AT-GAA顯示出與阿糖苷酶α之類似安全性概況。兩名接受AT-GAA（2.4%）之患者由於不良事件而中斷處理，而對於阿糖苷酶α之一名（2.6%）與處理無關而中斷。在25%之AT-GAA參與者及26%之阿糖苷酶α患者中報導注射相關反應（IAR）。
事後分析小組分析：
基線 6MWD 及 FVC類別：未經ERT處理之群體（n=27）：三名患者之基線6MWD為＜300 m且FVC三名患者之基線＜55%；由於患者數目較少，未在此等亞組中進行CFBL分析。基線6MWD ≥300 m：西帕葡糖苷酶α/美格魯特（AT-GAA）（n=18）及阿糖苷酶α/安慰劑（n=6）組隨時間推移具有類似的改善（至第52週之平均[SE] CFBL分別為：+34.4 [12.1] m及+30.8 [9.6] m）。基線FVC ≥55%：西帕葡糖苷酶α/美格魯特（n=19）及阿糖苷酶α/安慰劑（n=5）組隨時間推移下降（至第52週之平均[SE] CFBL分別為：−3.7 [1.5] %及−3.3 [2.6] %）。在基線6MWD為＜300 m且≥ 300 m，且FVC為＜55%及≥55%之患者中，結果始終有利於總群體及經歷過ERT之群體中之西帕葡糖苷酶α/美格魯特之患者中，如圖41A及圖41B中所繪示。
在包括未經ERT處理及經歷過ERT之患者的總體研究人群中，與經核准ERT相比，西帕葡糖苷酶α/美格魯特展現出對運動及呼吸功能的積極趨勢或臨床上有意義的改善，與基線6MWD及FVC評定%無關，且在預定及事後子組分析中。
西帕葡糖苷酶α/美格魯特展現出與對於阿糖苷酶α/安慰劑類似的安全概況（圖42）。
關於 AT-GAA
AT-GAA為與美格魯特（AT2221），一種，西帕葡糖苷酶α之安定劑結合投與之由西帕葡糖苷酶α（ATB200），一種具有經最佳化碳水化合物結構之獨特重組人類酸α-葡萄糖苷酶（rhGAA），尤其雙磷酸化甘露糖-6磷酸鹽（雙M6P）聚醣組成之研究性雙組分治療，以增強吸收至細胞中。在臨床前研究中，AT-GAA與GAA之成熟溶酶體形式之量增加及肌肉中肝醣含量降低、自噬缺陷緩解及肌肉強度改善相關聯。
關於龐貝症
龐貝症為由酶酸性α-葡萄糖苷酶（GAA）缺乏引起之遺傳性溶酶體病症。GAA含量之降低或不存在引起肝醣累積於細胞中，咸信其引起龐貝症之臨床表現。該疾病可為致衰弱的且以隨時間推移惡化之嚴重肌無力為特徵。龐貝症之範圍從自心臟功能有重大影響的迅速致命性嬰兒形式至主要影響骨骼肌的更緩慢進展的遲發形式。據估計，龐貝症影響全世界約5,000至10,000人。
601:生物反應器 603:過濾系統 605:蛋白質捕獲系統 607:病毒殺滅 609:第二層析系統 611:病毒殺滅 613:第三層析系統 615:過濾系統 617:調節步驟
圖1A展示非磷酸化較高甘露糖N-聚醣、單M6P N-聚醣及雙M6P N-聚醣。圖1B展示M6P基團之化學結構。各方塊表示N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc），各圓形表示甘露糖，且各P表示磷酸鹽。
圖2A描述rhGAA經由攜帶M6P之N-聚醣產生性靶向至目標組織（例如，患有龐貝症之個體的肌肉組織）。圖2B描述對非目標組織（例如，肝臟及脾臟）之非產生性藥物清除或藉由非M6P N-聚醣結合至非目標組織。
圖3為用於製造、捕獲及純化重組溶酶體蛋白之例示性製程的示意圖。
圖4展示用於使用編碼rhGAA之DNA轉型CHO細胞之DNA構築體。
圖5為展示在陰離子交換（AEX）管柱上具有（實施例2）及不具有（實施例1）捕獲之ATB200 rhGAA的CIMPR親和力層析結果的圖。
圖6A-6H展示使用兩種不同LC-MS/MS分析技術進行之ATB200 rhGAA之位點特異性N-醣基化分析結果。圖6A展示ATB200之七個潛在N-醣基化位點的位點佔有率。圖6B展示對ATB200之第一潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態的兩個分析。圖6C展示對ATB200之第二潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態的兩個分析。圖6D展示對ATB200之第三潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態的兩個分析。圖6E展示對ATB200之第四潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態的兩個分析。圖6F展示對ATB200之第五潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態的兩個分析。圖6G展示對ATB200之第六潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態的兩個分析。圖6H概述用於第一、第二、第三、第四、第五及第六潛在N-醣基化位點之單磷酸化及雙磷酸化物質的相對百分比。
圖7為展示LUMIZYME®（細線，向左溶離）及ATB200（粗線，向右溶離）之Polywax溶離特徵的圖。
圖8為展示LUMIZYME®之N-聚醣結構之概述與三種不同ATB200 rhGAA製劑（經鑑別為BP-rhGAA、ATB200-1及ATB200-2）相比之表。
圖9A及圖9B為展示分別LUMIZYME®及MYOZYME®之CIMPR親和力層析法結果的圖。
圖10A為用於比較ATB200 rhGAA之CIMPR結合親和力（左圖）與LUMIZYME®之CIMPR結合親和力（右圖）的圖。圖10B為用於比較LUMIZYME®及ATB200 rhGAA之雙M6P含量的表。
圖11A為用於比較處於各種GAA濃度下之在正常成纖維細胞內部的ATB200 rhGAA活性（左圖）與LUMIZYME® rhGAA活性（右圖）之圖。圖11B為用於比較處於各種GAA濃度下之在來自具有龐貝症之個體之成纖維細胞內部的ATB200 rhGAA活性（左圖）與LUMIZYME® rhGAA活性（右圖）的表。圖11C為用於比較來自正常個體及具有龐貝症之個體的成纖維細胞之K 吸收的表。
圖12描繪ATB200在使用SYPRO橙色進行之熱穩定性分析中評估之酸性或中性pH緩衝液中之穩定性，因為染料之螢光當蛋白質變性時增加。
圖13展示使用澱粉葡糖苷酶消化確定之WT小鼠或經媒劑、阿糖苷酶α或ATB200/AT2221處理之 GaaKO小鼠的組織肝糖含量。條表示7隻小鼠/組之平均值±SEM。* p＜0.05，與使用在單向ANOVA分析下之鄧尼特方法進行之多個比較中之阿糖苷酶α相比。
圖14描繪經媒劑、阿糖苷酶α或ATB200/AT2221處理之 GaaKO小鼠或WT小鼠之肌纖維中的LAMP1陽性囊泡。影像係獲自股外側肌，且表示7隻小鼠/組。放大率= 200x（插圖中的1,000x）。
圖15A展示經媒劑、阿糖苷酶α或ATB200/AT2221處理之 GaaKO小鼠或WT小鼠之肌纖維中的LC3陽性凝集物。影像係獲自股外側肌，且表示7隻小鼠/組。放大率=400x。圖15B展示LC3 II蛋白質之西方墨點分析。在各通路中負載總共30 mg蛋白質。
圖16展示經媒劑、阿糖苷酶α或ATB200/AT2221處理之 GaaKO小鼠或WT小鼠之肌纖維中的質膜修復蛋白表現。影像係獲自股外側肌，且表示7隻小鼠/組。放大率=200x。
圖17描繪自經媒劑、阿糖苷酶α或ATB200處理之 GaaKO小鼠之白色腓腸肌中分離的單個纖維中LAMP1（綠色）（參見例如，「B」）及LC3（紅色）（參見例如，「A」）之共免疫螢光染色。「C」描繪自噬性碎屑之清除及不存在放大的溶酶體。自各動物中偵測到最少30種纖維。
圖18描繪與單獨ATB200相比分別在17 μM及170 μM AT2221下之AT2221對ATB200之穩定。
圖19A-19H展示使用經蛋白酶消化之ATB200的LC-MS/MS分析進行之第七潛在N-醣基化位點之ATB200 rhGAA（包括N-醣基化型態）之位點特異性N-醣基化分析的結果。圖19A-19H提供以不同規模產生之十批ATB200之平均資料。
圖19A展示ATB200之七個潛在N-醣基化位點的平均位點佔有率。N-醣基化位點係根據SEQ ID NO: 1提供。CV=變化係數。
圖19B-19H展示ATB200之所有七個潛在N-醣基化位點的位點特異性N-醣基化分析，其中根據SEQ ID NO: 5提供位點編號。條表示鑑別為所分析之十批ATB200之特定N-聚醣基團的N-聚醣物質之最大及最小百分比。圖19B展示ATB200之第一潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。圖19C展示ATB200之第二潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。圖19D展示ATB200之第三潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。圖19E展示ATB200之第四潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。圖19F展示ATB200之第五潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。圖19G展示ATB200之第六潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。圖19H展示ATB200之第七潛在N-醣基化位點的N-醣基化型態。
圖20A至20B進一步表徵及概述ATB200之N-醣基化型態，亦如圖19A-19H中所示。圖20A展示2-鄰胺基苯甲酸（2-AA）聚醣定位及ATB200之LC/MS-MS分析且概述在ATB200中鑑別為總螢光百分比之N-聚醣物質。來自2-AA聚醣定位之資料及LC-MS/MS分析亦描繪於表5中。圖20B概述ATB200之所有七個潛在N-醣基化位點的平均位點佔有率及平均N-聚醣型態，包括總磷酸化、單磷酸化、雙磷酸化及唾液酸化。ND =未偵測到。
圖21展示ATB200-03研究設計示意圖。
圖22展示參與ATB200-03研究之122名個體之基線6分鐘步行距離（6MWD）及坐著的用力肺活量（FVC）特性。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖23A描繪6MWD及FVC資料，其展示總群體之基線、第52週時之相對於基線之變化（「CFBL」）、差異及p值（n=122）。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖23B描繪展示針對總群體（n=122）之隨時間推移的相對於基線之變化的6MWD及FVC資料。西帕葡糖苷酶α/美格魯特組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖24描繪展示針對經歷過ERT之群體（n=95）之6MWD及FVC資料，其展示基線、在第52週之CFBL、差異及p值。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖25描繪針對經歷過ERT之群體（n=95）在第12週、第26週及第38週及第52週時相對於基線的6MWD及FVC變化。
圖26A描繪展示針對未經ERT處理之群體（n=27）之6MWD及FVC資料，其展示基線、在第52週之CFBL、差異及p值。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖26B描繪展示針對未經ERT處理之群體（n=27）之隨時間推移的相對於基線之變化的6MWD及FVC資料。西帕葡糖苷酶α/美格魯特組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖27描繪針對總群體及經歷過ERT之群體的關鍵次要終點及生物標記物之基線特徵。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖28描繪針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之在第12週、第26週、第38週及第52週時相對於基線之下肢徒手肌力測試（MMT）變化。
圖29描繪針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之在第12週、第26週、第38週及第52週時相對於基線之步態、樓梯、高爾、椅子（GSGC）變化。西帕葡糖苷酶α/美格魯特組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖30描繪針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之在第12週、第26週、第38週及第52週時患者報導之結果量測資訊系統（PROMIS）相對於基線之物理功能變化。
圖31描繪針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之在第12週、第26週、第38週及第52週時相對於基線之PROMIS疲乏變化。
圖32描繪針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之在第12週、第26週、第38週及第52週時相對於基線之肌酸激酶（CK）生物標誌物變化。
圖33描繪針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之在第12週、第26週、第38週及第52週時相對於基線之尿液己醣四醣（Hex4）生物標誌物變化。
圖34展示針對總群體（左側）及經歷過ERT之群體（右側）之主要、次要及生物標記物終點熱圖。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。
圖35概述來自ATB200-03研究之安全性資料。AT-GAA組：接受ATB200/AT2221處理之個體；阿糖苷酶α組：接受阿糖苷酶α/安慰劑處理之個體。TEAE：治療引發之不良事件；IAR：輸注相關反應。
圖36概述來自ATB200-03研究之結果。
圖37描述ATB200-03研究之研究目標及統計方法。
圖38描述ATB200-03研究之主要終點及次要終點。
圖39概述ATB200-03研究之患者安排。
圖40概述ATB200-03研究之基線人口統計資料。
圖41A-41B展示在ATB200-03研究中之總群體（n=122）（圖41A）及經歷過ERT之患者（n=95）（圖41B）中在基線狀態下6MWD及FVC相對於基線之變化之小組分析。
圖42展示在ATB200-03研究中任何組織中≥10%患者的治療引發之不良事件（TEAE）的清單。
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Claims (84)

  1. 一種治療有需要之個體之龐貝症之方法，包含：將重組人類酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）分子群與藥理伴護子同時或依序投與該個體； 其中該等rhGAA分子包含七個潛在N-醣基化位點； 其中該等rhGAA分子上之40%至60%之N-聚醣為複合型N-聚醣； 其中由使用液相層析串聯質譜分析（LC-MS/MS）所確定，該等rhGAA分子在第一潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA至少0.5莫耳雙甘露糖-6-磷酸鹽（雙M6P）；且 其中與（1）基線、或（2）包含投與阿糖苷酶α及針對該藥理伴護子之安慰劑的對照處理相比，該方法改善該個體之一或多個疾病結果。
  2. 如請求項1之方法，其中藉由6分鐘步行測試所量測，該方法改善該個體之運動功能。
  3. 如請求項2之方法，其中6分鐘步行距離（6-minute walk distance; 6MWD）相對於基線之變化為至少20公尺。
  4. 如請求項3之方法，其中在52週處理之後，6MWD相對於基線之變化為至少20公尺。
  5. 如請求項2之方法，其中與該對照處理相比，該個體之6MWD增加至少10。
  6. 如請求項5之方法，其中與該對照處理相比，該個體之6MWD在52週處理之後改善至少13公尺。
  7. 如請求項2至6中任一項之方法，其中該個體具有低於300公尺之基線6MWD。
  8. 如請求項2至6中任一項之方法，其中該個體具有大於或等於300公尺之基線6MWD。
  9. 如請求項1之方法，其中藉由用力肺活量（forced vital capacity; FVC）測試所量測，該方法改善該個體之肺部功能。
  10. 如請求項9之方法，其中在處理後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加或與基線相比降低不到3%。
  11. 如請求項10之方法，其中在處理後，該個體之預測FVC百分比與基線相比降低不到1%。
  12. 如請求項10或請求項11之方法，其中在52週處理後，該個體之預測FVC百分比與基線相比降低不到1%。
  13. 如請求項9之方法，其中與該對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後顯著改善或穩定。
  14. 如請求項13之方法，其中與該對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後改善至少3%。
  15. 如請求項12或請求項13之方法，其中與該對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在52週處理之後改善至少3%。
  16. 如請求項9至15中任一項之方法，其中該個體具有低於55%之基線FVC。
  17. 如請求項9至15中任一項之方法，其中該個體具有大於或等於55%之基線FVC。
  18. 如請求項1之方法，其中藉由步態、樓梯、高爾、椅子（gait, stair, gower, chair; GSGC）測試所量測，該方法改善該個體之運動功能。
  19. 如請求項18之方法，其中與基線相比，藉由降低至少0.5分所指示，該個體之GSGC評分在處理後得到改善。
  20. 如請求項19之方法，其中與基線相比，藉由降低至少0.5分所指示，該個體之GSGC評分在52週處理後得到改善。
  21. 如請求項18之方法，其中與該對照處理相比，該個體之GSGC評分在處理後顯著改善。
  22. 如請求項21之方法，其中與該對照處理相比，藉由降低至少1分所指示，該個體之GSGC評分在處理後得到改善。
  23. 如請求項21或請求項22之方法，其中與該對照處理相比，藉由降低至少1分所指示，該個體之GSGC評分在52週處理後得到改善。
  24. 如請求項1之方法，其中該方法降低至少一種肌肉損傷標記物及/或至少一種肝糖累積標記物之含量。
  25. 如請求項24之方法，其中該至少一種肌肉損傷標記物包含肌酸激酶（creatine kinase; CK），及/或該至少一種肝糖累積標記物包含尿液己醣四醣（hexose tetrasaccharide; Hex4）。
  26. 如請求項25之方法，其中與基線相比，該個體之CK含量在處理後降低至少20%，及/或該個體之尿液Hex4含量在處理後降低至少30%。
  27. 如請求項26之方法，其中與基線相比，該個體之CK含量在52週處理之後降低至少20%，及/或該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少30%。
  28. 如請求項25之方法，其中與該對照處理相比，該個體之CK及/或尿液Hex4含量在處理後顯著降低。
  29. 如請求項28之方法，其中與該對照處理相比，該個體之CK含量在處理後降低至少30%，及/或該個體之尿液Hex4含量在處理後降低至少40%。
  30. 如請求項28或請求項29之方法，其中與該對照處理相比，該個體之CK含量在52週處理後降低至少30%，及/或該個體之尿液Hex4含量在52週處理後降低至少40%。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該個體為經歷過ERT之患者。
  32. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該個體為未經ERT處理之患者。
  33. 一種治療有需要之個體之龐貝症之方法，包含：將重組人類酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）分子群與藥理伴護子同時或依序投與該個體； 其中該等rhGAA分子包含七個潛在N-醣基化位點； 其中該等rhGAA分子上之40%至60%之N-聚醣為複合型N-聚醣； 其中由使用液相層析串聯質譜分析（LC-MS/MS）所確定，該等rhGAA分子在第一潛在N-醣基化位點處包含每莫耳rhGAA至少0.5莫耳雙甘露糖-6-磷酸鹽（雙M6P）； 其中與（1）基線、或（2）包含投與阿糖苷酶α及針對該藥理伴護子之安慰劑的對照處理相比，該方法改善該個體之一或多個疾病症狀，且 其中該個體為經歷過ERT之患者。
  34. 如請求項33之方法，其中藉由6分鐘步行測試所量測，該方法改善該個體之運動功能。
  35. 如請求項34之方法，其中與基線相比，該個體之6分鐘步行距離（6-minute walk distance; 6MWD）在處理後增加至少15公尺或至少5%。
  36. 如請求項35之方法，其中與基線相比，該個體之6分鐘步行距離（6MWD）在52週處理後增加至少15公尺或至少4%。
  37. 如請求項33之方法，其中與該對照處理相比，該個體之6MWD在處理後顯著改善。
  38. 如請求項37之方法，其中與該對照處理相比，該個體之6MWD在處理後改善至少15公尺。
  39. 如請求項37或請求項38之方法，其中與該對照處理相比，該個體之6MWD在52週處理之後改善至少15公尺。
  40. 如請求項34至39中任一項之方法，其中該個體具有低於300公尺之基線6MWD。
  41. 如請求項34至39中任一項之方法，其中該個體具有大於或等於300公尺之基線6MWD。
  42. 如請求項33之方法，其中藉由用力肺活量（forced vital capacity; FVC）測試所量測，該方法改善該個體之肺部功能。
  43. 如請求項42之方法，其中在處理後，該個體之預測FVC百分比與基線相比增加至少0.1%。
  44. 如請求項43之方法，其中該個體之預測FVC百分比在52週處理之後與基線相比增加至少0.1%。
  45. 如請求項42之方法，其中與該對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後顯著改善。
  46. 如請求項45之方法，其中與該對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在處理後改善至少4%。
  47. 如請求項45或請求項46之方法，其中與該對照處理相比，該個體之預測FVC百分比在52週處理之後改善至少4%。
  48. 如請求項42至47中任一項之方法，其中該個體具有低於55%之基線FVC。
  49. 如請求項42至47中任一項之方法，其中該個體具有大於或等於55%之基線FVC。
  50. 如請求項33之方法，其中藉由步態、樓梯、高爾、椅子（gait, stair, gower, chair; GSGC）測試所量測，該方法改善該個體之運動功能。
  51. 如請求項50之方法，其中與基線相比，藉由降低至少0.5分所指示，該個體之GSGC評分在處理後得到改善。
  52. 如請求項51之方法，其中與基線相比，藉由降低至少0.5分所指示，該個體之GSGC評分在52週處理後得到改善。
  53. 如請求項50之方法，其中與該對照處理相比，該個體之GSGC評分在處理後顯著改善。
  54. 如請求項53之方法，其中與該對照處理相比，藉由降低至少1分所指示，該個體之GSGC評分在處理後得到改善。
  55. 如請求項53或請求項54之方法，其中與該對照處理相比，藉由降低至少1分所指示，該個體之GSGC評分在52週處理後得到改善。
  56. 如請求項33之方法，其中該方法降低至少一種肌肉損傷標記物及/或至少一種肝糖累積標記物之含量。
  57. 如請求項56之方法，其中該至少一種肌肉損傷標記物包含肌酸激酶（creatine kinase; CK），及/或該至少一種肝糖累積標記物包含尿液己醣四醣（hexose tetrasaccharide; Hex4）。
  58. 如請求項57之方法，其中與基線相比，該個體之CK含量在處理後降低至少15%，及/或該個體之尿液Hex4含量在處理後降低至少25%。
  59. 如請求項58之方法，其中與基線相比，該個體之CK含量在處理後降低至少15%，及/或該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少25%。
  60. 如請求項57之方法，其中與該對照處理相比，該個體之CK及/或尿液Hex4含量在處理後顯著降低。
  61. 如請求項60之方法，其中與該對照處理相比，該個體之CK含量在處理後降低至少30%，及/或該個體之尿液Hex4含量在處理後降低至少40%。
  62. 如請求項60或請求項61之方法，其中與該對照處理相比，該個體之CK含量在處理後降低至少30%，及/或該個體之尿液Hex4含量在52週處理之後降低至少40%。
  63. 如請求項1至62中任一項之方法，其中該rhGAA分子群係以5 mg/kg至20 mg/kg，視情況20 mg/kg之劑量投與。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該rhGAA分子群係每兩週投與。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中該rhGAA分子群係靜脈內投與。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該藥理伴護子為美格魯特(miglustat)或其醫藥學上可接受之鹽，其中進一步視情況，經口投與該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽。
  67. 如請求項66之方法，其中該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係以195 mg或260 mg之劑量投與。
  68. 如請求項66或請求項67之方法，其中該美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽係在投與該rhGAA分子群之前投與，視情況在投與該rhGAA分子群之前一小時投與。
  69. 如請求項68之方法，其中該個體在投與美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽前禁食至少兩小時，且在投與美格魯特或其醫藥學上可接受之鹽後禁食至少兩小時。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中該等rhGAA分子包含與SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6具有至少95%的一致性之胺基酸序列。
  71. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該等rhGAA分子包含SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。
  72. 如請求項1至71中任一項之方法，其中藉由使用LC-MS/MS所確定，該等rhGAA分子之至少30%包含攜帶一個甘露糖-6-磷酸鹽殘基（單M6P）或雙M6P之一或多個N-聚醣單元。
  73. 如請求項1至72中任一項之方法，其中藉由使用LC-MS/MS所確定，該等rhGAA分子包含平均每莫耳rhGAA 0.5莫耳至7.0莫耳之單M6P或雙M6P。
  74. 如請求項1至73中任一項之方法，其中藉由使用LC-MS/MS所確定，該等rhGAA分子包含平均每莫耳rhGAA 2.0至8.0莫耳之唾液酸。
  75. 如請求項1至73中任一項之方法，其中藉由使用LC-MS/MS所確定，該等rhGAA分子包含平均每莫耳rhGAA至少2.5 mol M6P及每莫耳rhGAA至少4莫耳唾液酸。
  76. 如請求項1至75中任一項之方法，其中每莫耳rhGAA，該等rhGAA分子包含平均： （a）在第二潛在N-醣基化位點處之0.4至0.6莫耳單-M6P； （b）在第四潛在N-醣基化位點處之0.4至0.6莫耳雙-M6P；或 （c）在第四潛在N-醣基化位點處之0.3至0.4莫耳單-M6P； 其中使用LC-MS/MS確定（a）-（c）。
  77. 如請求項76之方法，其中每莫耳rhGAA，該等rhGAA分子進一步包含4莫耳至7.3莫耳唾液酸；且 其中每莫耳rhGAA，該等rhGAA分子包含平均： （a）在第三潛在N-醣基化位點處之0.9至1.2莫耳唾液酸； （b）在第五潛在N-醣基化位點處之0.8至0.9莫耳唾液酸；或 （c）在第六潛在N-醣基化位點處之1.5至4.2莫耳唾液酸； 其中使用LC-MS/MS確定（a）-（c）。
  78. 如請求項1至77中任一項之方法，其中該rhGAA分子群係調配成一醫藥組合物。
  79. 如請求項78之方法，其中該醫藥組合物進一步包含選自由檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合組成之群組中之至少一種緩衝液，及選自由甘露糖醇、聚山梨醇酯80及其組合組成之群組中之至少一種賦形劑；其中該醫藥組合物具有5.0至7.0之pH。
  80. 如請求項79之方法，其中該醫藥組合物具有5.0至6.0之pH。
  81. 如請求項78或請求項79之方法，其中該醫藥組合物進一步包含水、酸化劑、鹼化劑或其組合。
  82. 如請求項81之方法，其中在該醫藥組合物中，該rhGAA分子群係以5-50 mg/mL之濃度存在，該至少一種緩衝液為以10-100 mM之濃度存在之檸檬酸鈉緩衝液，該至少一種賦形劑為以10-50 mg/mL之濃度存在之甘露糖醇及以0.1-1 mg/mL之濃度存在之聚山梨醇酯80，且該醫藥組合物進一步包含水，且視情況包含酸化劑及/或鹼化劑；其中該醫藥組合物具有6.0之pH。
  83. 如請求項82之方法，其中在該醫藥組合物中，該rhGAA分子群係以15 mg/mL之濃度存在，該檸檬酸鈉緩衝液係以25 mM之濃度存在，該甘露糖醇係以20 mg/mL之濃度存在，且該聚山梨醇酯80係以0.5 mg/mL之濃度存在。
  84. 如請求項1至83中任一項之方法，其中該rhGAA係由中國倉鼠卵巢細胞產生。
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