KR20230155622A

KR20230155622A - 재조합 인간 산성 알파-글루코시다제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20230155622A
Application number: KR1020237031038A
Authority: KR
Inventors: 헝 도; 러셀 갓샬; 힝 찰; 제이 발스
Original assignee: 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2021-02-11
Filing date: 2022-02-11
Publication date: 2023-11-10
Also published as: US20240197839A1; TW202245830A; WO2022174037A1; IL305103A; BR112023016212A2; EP4291225A1; CA3207917A1; AU2022218792A1; JP2024506346A; WO2022174037A9

Abstract

재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자의 집단 또는 이의 약학적 조성물 또는 제형, 및 약리학적 샤페론을 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

Description

재조합 인간 산 알파-글루코시다제 및 이의 용도

관련 출원에 대한 상호-참조

본 출원은 2021년 3월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/162,683호 및 2021년 2월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/148,596호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.

전자 제출된 텍스트 파일의 설명

함께 전자 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 복사본(파일명: AMCS_013_02WO_SeqList_ST25.txt, 기록일: 2022년 2월 11일, 파일 크기 약 45,560 바이트).

기술 분야

본 개시는 재조합 인간 α-글루코시다제(recombinant human α-glucosidase; rhGAA) 및 폼페병의 치료에 관한 것이다.

폼페병은 산 α-글루코시다제(GAA) 활성의 결핍으로부터 초래되는 유전적인 리소좀 저장병이다. 폼페병을 갖는 사람은, 글리코겐을 근육을 위한 주요 에너지원인 글루코스로 분해하는 효소인 산 α-글루코시다제(GAA)를 결여하고 있거나 이의 수준이 감소되어 있다. 이러한 효소 결핍은, 일반적으로는 글리코겐 및 다른 세포 잔해물 또는 폐기물을 분해하는 효소를 함유하는 세포내 소기관인 리소좀에 글리코겐이 과도하게 축적되게 한다. 폼페병을 갖는 대상체의 특정 조직, 특히 근육 내의 글리코겐 축적은 세포가 정상적으로 기능하는 능력을 손상시킨다. 폼페병에서, 글리코겐은 적절하게 대사되지 않고, 리소좀에, 특히 골격근 세포에, 그리고 영아 발병 형태의 질병의 경우에는 심근 세포에 점진적으로 축적된다. 글리코겐의 축적은 근육 및 신경 세포, 뿐만 아니라 다른 영향을 받은 조직 내의 것들을 손상시킨다.

전통적으로, 발병 나이에 따라, 폼페병은 조기 영아 형태 또는 후기 발병 형태로 임상적으로 인식된다. 발병 나이는 폼페병을 야기하는 유전자 돌연변이의 중증도에 필적하는 경향이 있다. 가장 심각한 유전자 돌연변이는 GAA 활성의 완전 상실을 야기하고, 영아기 동안 조기 발병 질병으로서 나타난다. GAA 활성을 줄이지만 이를 제거하지는 않는 유전자 돌연변이는 발병 및 진행이 지연된 형태의 폼페병과 연관되어 있다. 영아 발병 폼페병은 출생 직후에 나타나고, 근력 약화, 호흡 부전 및 심부전을 특징으로 한다. 치료되지 않으면, 이는 일반적으로 2 년 이내에 사망을 초래한다. 소아 및 성인 발병 폼페병은 생애 중 더 나중에 나타나고, 일반적으로 영아 발병 질병보다 더 느리게 진행된다. 이러한 형태의 질병은 또한, 일반적으로 심장에 영향을 미치지는 않지만, 골격근 및 호흡에 수반되는 것들의 약화로 인해 사망을 초래할 수 있다.

폼페병의 현재의 비-완화 치료는 상표 LUMIZYME® 및 MYOZYME® 하에 판매되는 재조합 알글루코시다제 알파 산물을 사용하는 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy; ERT)을 수반한다. 이러한 통상적인 효소 대체 요법은 rhGAA를 투여함으로써 리소좀 내의 결손 GAA를 교체하고, 그에 따라 세포가 리소좀 글리코겐을 분해하는 능력을 복원하는 것에 의해 폼페병을 치료하려 한다. LUMIZYME® 및 MYOZYME®은 Genzyme에 의해 생물 제제로서 생산 또는 시판되고 미국 식품의약품국에 의해 승인된 통상적인 형태의 rhGAA이고, 문헌[Physician's Desk Reference (2014)](이는 본원에 참조로 포함됨)에 참조로 기재되어 있다. 알글루코시다제 알파는 화학명 [199-아르기닌, 223-히스티딘]프리프로-α-글루코시다제(인간); 분자식 C₄₇₅₈H₇₂₆₂N₁₂₇₄O₁₃₆₉S₃₅; CAS 번호 420794-05-0으로 확인된다. 이들 산물은 II형 글리코겐 저장병(glycogen storage disease type II; GSD-II) 또는 산 말타제 결핍병으로도 공지된 폼페병이 있는 대상체에게 투여된다.

그러나, 현재의 ERT는 기껏해야 한정된 지속기간 동안 근육 기능, 근력 및 호흡 기능의 측정에 있어 제한된 개선을 제공한 후 이들 파라미터의 느린 감소를 제공한다(Toscano and Schoser 2013; Wyatt et al 2012).

2012년에는, 후기 발병 폼페병(late-onset Pompe disease; LOPD)이 있는 대상체에서 수행된 모든 연구의 체계적인 검토가 문헌[Toscano and Schoser 2013]에 의해 수행되었다. 검토에는 27 명의 소아 대상체(연령 범위: 2 세 내지 17 세) 및 적어도 지난 2 년 동안 알글루코시다제 알파를 제공받은 251 명의 성인 대상체를 포함하여, 공개된 연구로부터의 LOPD가 있는 368 명의 대상체에 대한 데이터가 포함되었다. 결과는 대상체의 30% 초과가 알글루코시다제 알파를 이용한 치료 동안 초기 개선을 나타내지 않았고, 치료에도 불구하고 근육 및 호흡 기능의 악화를 계속 경험하였음을 나타냈다. 초기에 알글루코시다제 알파 치료에 반응한 대상체의 군에서, 몇몇 추가 장기 연구는 개선이 일반적으로 단지 대략 2 년 동안만 지속된다는 것을 보여주었다. 그 후에, 대상체는 일반적으로 정체 상태를 유지하였고, 이후에는 점진적으로 감소하기 시작하였다.

2012년에, 영국 의료 기술 평가 프로그램(United Kingdom Health Technology Assessment program)은 국립 보건 연구소(National Institute for Health Research)의 일부로서(Wyatt et al 2012), 현재 승인된 ERT 표준 치료인 알글루코시다제 알파를 제공받은 폼페병(영아- 및 후기-발병 형태 포함(아동 및 성인))이 있는 81 명의 환자에 대한 종단적 데이터의 검토로부터 도출된 권고를 공표하였다. 폼페병 진행의 주요 마커(강제 폐활량, 환기 의존성, 이동성, 6 분 보행 검사, 근력, 및 체질량 지수)는 알글루코시다제 알파 요법에 대한 치료 시간을 이용하여 평가되고 모델링되었다. 이러한 평가의 결과는 LOPD가 있는 환자에 의한 FVC, 6 분 보행 거리(6-minute walk distance), 및 근력의 개선이 알글루코시다제 알파로 ERT를 시작한 후 처음 2년 동안 발생하였고, 이 기간을 초과하여 치료를 계속함에 따라 감소가 발생하였음을 나타냈다. 추가적으로, 알글루코시다제 알파를 제공받은 LOPD가 있는 38 명의 대상체에서의 3 년 연구는 대상체가 치료 첫해에 운동 기능의 개선을 나타냈는데, 이는 2 년차에 일반적으로 안정하게 유지되었고 3 년차에 감소하기 시작하였음을 보여주었다(Regnery et al 2012).

또한, 3상 LUMIZYME®(Genzyme Corporation) 연구에 대한 10 년 추적 조사를 제공하는 보고서는 대상체가 치료의 처음 몇 해 동안 운동 및 폐 기능의 약간의 개선을 경험한 후, 치료가 계속 진행됨에 따라 서서히 감소되기 시작하였음을 보여주었다(van der Ploeg et al 2017). 연구에서, 요법의 3 년차부터 6 년차까지, 예측된 기준선 6 분 보행 거리 퍼센트에서 대략 10%의 평균 감소가 있었고, 대상체의 대략 80%가 감소를 경험하였다.

알글루코시다제 알파에 의한 가장 심각한 내약성 문제는 주입-연관 반응(IAR)의 발생인데, 이는 어떤 경우에는 생명을 위협하는 아나필락시스 또는 다른 중증 알레르기 반응을 포함할 수 있다(MYOZYME® Summary of Product Characteristics, 2018년 12월). 이들 사례의 관리는 용량 감소, 주입 속도 감소 및 주입 시간 연장, 및 용량 중단 또는 중지를 포함한다. 항히스타민 및 스테로이드를 이용한 예비투약(주입 전)이 또한 알글루코시다제 알파 주입과 관련된 IAR 및 과민증의 발생 및 중증도를 예방하고 감소시키기 위해 규칙적으로 사용된다. 이들 조치에도 불구하고, 폼페병이 있는 환자는 여전히 IAR을 경험할 수 있고, 일부는 현재 승인된 ERT의 규칙적 주입이 용인되지 않는다.

2017년에는, 문헌의 체계적인 검토가 폼페병 분야의 11 개 유럽 국가의 전문가 네트워크인 유럽 폼페 컨소시엄(European Pompe Consortium)에 의해 착수되었다(van der Ploeg et al 2017). 총 586 명의 개별 성인 대상체를 포함하는 1 개의 임상 연구 및 43 개의 관찰 연구로부터 얻어진 데이터에 기반하여, 군 수준에서 ERT의 효과의 증거가 컨소시엄에 의해 평가되었다. 현재 유럽 폼페 컨소시엄 합의(European Pompe Consortium consensus)는 중증 IAR 또는 질병 증상의 점진적인 임상 악화의 발생, 뿐만 아니라 기존 ERT 치료를 효과적으로 불활성화시키는 고 중화 항체(Ab) 역가의 발생 시 ERT 요법을 중지하는 것이다. 유럽 폼페 컨소시엄의 합의 권고에는 또한 ERT 정지 후 질병 진행 및 임상 악화가 재발하는 경우 ERT 치료의 재개에 대한 고려가 포함되었다.

따라서, 유해 사례가 감소된 폼페병을 치료하는 데 효과적인 개선된 rhGAA 요법을 확인할 필요가 여전히 존재한다.

rhGAA 분자의 세포 흡수는 표적 세포, 예컨대 근육 세포 상에 존재하는 양이온-비의존적 만노스-6-포스페이트 수용체(CIMPR)에 결합하는, 특수 탄수화물인 만노스-6-포스페이트(M6P)에 의해 촉진된다. 결합 시, rhGAA 분자가 표적 세포에 의해 흡수되고, 이어서 세포 내의 리소좀 내로 운반된다. 그러나, 대부분의 통상적인 rhGAA 산물은 모노-M6P- 및 비스-M6P-보유 N-글리칸(즉, 각각 1 개의 M6P 잔기를 보유하는 N-글리칸 또는 2 개의 M6P 잔기를 보유하는 N-글리칸)의 높은 총 함량을 결여하고 있고, 이는 CIMPR을 통한 이의 세포 흡수 및 리소좀 전달을 제한하고, 따라서 통상적인 효소 대체 요법을 불충분하게 효과적인 것으로 만든다. 예를 들어, 20 mg/kg 이상의 용량의 통상적인 rhGAA 산물은 폼페병의 일부 양태를 호전시키지만, 이들은 특히 충분하게 (i) 근원적인 세포 기능장애를 치료하거나, (ii) 근육 구조를 복원하거나, (iii) 다수의 표적 조직, 예컨대, 골격근 내의 축적된 글리코겐을 감소시켜 질병 진행을 역전시킬 수 없다. 추가로, 더 높은 용량은 대상체, 뿐만 아니라 대상체를 치료하는 의료 전문가에게, rhGAA를 정맥내 투여하는 데 필요한 주입 시간의 연장과 같은 추가적인 부담을 지울 수 있다.

M6P 기를 생성하기 위해, Canfield 등의 미국 특허 제6,534,300호에 기재된 포스포트랜스퍼라제 및 노출 효소(uncovering enzyme)에 의해 시험관내에서 GAA 또는 rhGAA의 글리코실화가 효소적으로 변형될 수 있다. 그러나, 효소적 글리코실화는 충분하게 제어될 수 없고, 바람직하지 않은 면역학적 및 약리학적 성질을 갖는 rhGAA를 생산할 수 있다. 효소적으로 변형된 rhGAA는 잠재적으로 모두 포스포트랜스퍼라제 또는 노출 효소로 시험관내에서 효소적으로 인산화될 수 있는 고-만노스 올리고당만을 함유할 수 있다. GAA의 시험관내 효소 처리에 의해 생산된 글리코실화 패턴은 추가적인 말단 만노스 잔기, 특히 비-인산화 말단 만노스 잔기가 변형된 rhGAA의 약동학에 부정적으로 영향을 미치기 때문에 문제가 있다. 이와 같은 효소적으로 변형된 산물이 생체내에서 투여되는 경우, 이들 만노스 기는 GAA의 비-생산적 클리어런스를 증가시키고, 면역 세포에 의한 효소적으로 변형된 GAA의 흡수를 증가시키며, 더 적은 GAA가 표적화된 조직, 예컨대, 골격근 근세포에 도달하는 것으로 인해 rhGAA 치료 효능을 감소시킨다. 예를 들어, 말단 비-인산화 만노스 잔기는 간 및 비장 내의 만노스 수용체에 대한 공지된 리간드이고, 이는 효소적으로 변형된 rhGAA의 급속한 클리어런스 및 표적 조직으로의 rhGAA 표적화 감소를 야기한다. 또한, 말단 비-인산화 만노스 잔기가 있는 고 만노스 N-글리칸을 갖는 효소적으로 변형된 GAA의 글리코실화 패턴은 효모 및 곰팡이에서 생산된 당단백질과 유사하고, 효소적으로 변형된 rhGAA에 대한 면역 또는 알레르기 반응, 예컨대, 생명을 위협하는 중증 알레르기(아나필락시스) 반응 또는 과민 반응을 촉발할 위험을 증가시킨다.

통상적인 재조합 rhGAA 산물 및 시험관내-인산화 rhGAA와 비교하여, 본 개시에 따른 2-성분 요법에 사용되는 rhGAA는 강화된 생체분포 및 리소좀 흡수를 위해 최적화된 N-글리칸 프로파일을 갖고, 그에 의해 일단 투여되면 rhGAA의 비-생산적 클리어런스를 최소화한다. 본 개시는 현재 표준 치료보다 더 효율적으로 리소좀 글리코겐을 제거하는 것을 포함하여, 세포 수준에서 질병 진행을 역전시키는 효과적인 요법을 안정적 또는 쇠퇴성인 폼페 환자(Pompe patient)에게 제공한다. rhGAA 및 약학적 샤페론(예를 들어, 미글루스타트)을 포함하는 본 개시의 2-성분 요법으로 치료된 환자는 임상 연구로부터의 다양한 효능 결과(예를 들어, 실시예 8 및 실시예 9)에서 입증된 바와 같이, 근력, 운동 기능, 및/또는 폐 기능의 개선을 포함하고/하거나 질병 진행의 역전을 포함하는 유의미한 건강 개선을 나타낸다.

재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA) 분자의 집단 및 약리학적 샤페론(예를 들어, 미글루스타트)을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질병 또는 장애, 예컨대, 폼페병을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

본원에 기재된 rhGAA 분자는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현될 수 있고, 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 rhGAA 분자의 집단의 N-글리코실화 프로파일은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 3 mol 내지 4 mol의 만노스-6-포스페이트(M6P) 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자는 평균적으로 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 적어도 0.5 mol의 비스-인산화 N-글리칸 기(비스-M6P)를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자 중 적어도 30%의 분자는 1 개 또는 2 개의 M6P 잔기를 보유하는 하나 이상의 N-글리칸 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 1 개 또는 2 개의 M6P 잔기를 보유하는 약 0.5 mol 내지 약 7.0 mol의 N-글리칸 단위를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 2.0 mol 내지 8.0 mol의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 2.5 몰의 M6P 잔기 및 rhGAA의 mol 당 적어도 4 mol의 시알산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 평균 3 mol 내지 4 mol의 M6P 잔기 및 rhGAA의 mol 당 평균 약 적어도 0.5 mol의 비스-M6P를 포함하는 rhGAA 분자는 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 평균 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 모노-인산화 N-글리칸(모노-M6P), 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 비스-M6P, 및 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.3 mol 내지 약 0.4 mol의 모노-M6P를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자는 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 4 mol 내지 약 7.3 mol의 시알산 잔기(rhGAA의 mol 당 약 0.9 mol 내지 약 1.2 mol의 시알산을 포함함), 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.8 mol 내지 약 0.9 mol의 시알산, 및 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 1.5 mol 내지 약 4.2 mol의 시알산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약학적 조성물에서 제형화된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단을 포함하는 약학적 조성물은 시트레이트, 포스페이트 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충제, 및 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 약 6.0이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 물, 산성화제, 알칼리화제, 또는 이의 조합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 6.0의 pH를 갖고, 약 5 mg/mL 내지 50 mg/mL의 rhGAA 분자의 집단, 약 10 mM 내지 100 mM의 시트르산나트륨 완충제, 약 10 mg/mL 내지 50 mg/mL 만니톨, 약 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 물을 포함하며, 산성화제 및/또는 알칼리화제를 선택적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 6.0의 pH를 갖고, 약 15 mg/mL의 rhGAA 분자의 집단, 약 25 mM의 시트르산나트륨 완충제, 약 20 mg/mL 만니톨, 약 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 물을 포함하며, 산성화제 및/또는 알칼리화제를 선택적으로 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 격월, 매월, 격주, 매주, 주 2 회, 또는 매일, 예를 들어, 격주로 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 정맥내 투여된다.

일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약리학적 샤페론, 예컨대, 미글루스타트(ATAT2221로도 지칭됨) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은, 예를 들어, 약 50 mg 내지 약 200 mg 또는 약 200 mg 내지 약 600 mg, 및 선택적으로 약 130 mg, 약 195 mg, 또는 약 260 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 233 mg 내지 약 500 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 50 mg 내지 약 200 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 260 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일 구현예에서, rhGAA 분자의 집단은 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 195 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 rhGAA 분자의 집단을 투여하기 전에(예를 들어, 약 1 시간 전에) 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체는 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 투여 전 적어도 2 시간 동안 및 투여 후 적어도 2 시간 동안 금식한다.

본 개시의 구현예는 폼페병이 있는 대상체를 치료하고 이러한 대상체에서 질병 진행을 역전시키기 위해 본원에 기재된 2-성분 요법의 효능을 입증한다. 일부 구현예에서, 대상체는 ERT-경험 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체는 ERT-미경험 환자이다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 폼페병이 있는 대상체에서 하나 이상의 질병 증상을 개선한다. 이러한 대조군 치료에서는, 약리학적 샤페론 대신에 위약이 투여되었다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 6 분 보행 검사(6MWT)에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 6 분 보행 거리(6MWD)는 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10 미터, 11 미터, 12 미터, 13 미터, 14 미터, 15 미터, 16 미터, 17 미터, 18 미터, 19 미터, 20 미터, 21 미터, 22 미터, 23 미터, 24 미터, 25 미터, 30 미터, 또는 50 미터 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 증가된다. 일부 구현예에서, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 20 미터 또는 적어도 5% 증가된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 5 미터, 6 미터, 7 미터, 8 미터, 9 미터, 10 미터, 12 미터, 14 미터, 16 미터, 18 미터, 20 미터, 30 미터, 40 미터, 또는 50 미터만큼 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 13 미터만큼 개선된다. 일부 구현예에서, 대상체는 300 미터 미만의 기준선 6MWD를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 300 미터 이상의 기준선 6MWD를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 강제 폐활량(FVC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 폐 기능을 안정화시킨다. 일부 구현예에서, 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 증가되거나, 기준선과 비교하여 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 미만만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 52 주의 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 1% 미만만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 또는 6%만큼 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 적어도 3%만큼 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대상체는 55% 미만의 기준선 FVC를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 55% 이상의 기준선 FVC를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 보행, 계단, 고워, 의자(gait, stair, gower, chair; GSGC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 12 주, 26 주, 38 주 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.1 점, 0.3 점, 0.5 점, 0.7 점, 1.0 점, 1.5 점, 또는 2.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 12 주, 26 주, 38 주 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.3 점, 0.5 점, 0.7 점, 1.0 점, 1.5 점, 2.5 점, 또는 5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1.0 점의 감소로 나타나는 바와 같이 유의미하게 개선된다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 치료 후에 근손상의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 근손상의 적어도 하나의 마커는 크레아틴 키나제(CK)를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50% 감소된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 20% 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%만큼 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30%만큼 유의미하게 감소된다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 치료 후에 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커는 소변 육탄당 사당류(Hex4)를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 감소된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30% 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 60%만큼 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 40%만큼 유의미하게 감소된다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 폼페병이 있는 ERT-경험 환자 대상체에서 하나 이상의 질병 증상을 개선한다.

일부 구현예에서, 폼페병이 있는 ERT-경험 대상체를 위한 2-성분 요법은 6MWT에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 6MWD는 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10 미터, 11 미터, 12 미터, 13 미터, 14 미터, 15 미터, 16 미터, 17 미터, 18 미터, 19 미터, 20 미터, 21 미터, 22 미터, 23 미터, 24 미터, 25 미터, 30 미터, 또는 50 미터 또는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 증가된다. 일부 구현예에서, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 15 미터 또는 적어도 5% 증가된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 치료 후에 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10 미터, 12 미터, 14 미터, 15 미터, 16 미터, 18 미터, 20 미터, 30 미터, 40 미터, 또는 50 미터만큼 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 15 미터만큼 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대상체는 300 미터 미만의 기준선 6MWD를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 300 미터 이상의 기준선 6MWD를 갖는다.

일부 구현예에서, 폼페병이 있는 ERT-경험 대상체를 위한 2-성분 요법은 FVC 검사에 의해 측정 시 대상체의 폐 기능을 개선한다. 일부 구현예에서, 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 또는 5% 증가된다. 일부 구현예에서, 52 주의 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 적어도 0.1% 증가된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 8%, 또는 10%만큼 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 적어도 4%만큼 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대상체는 55% 미만의 기준선 FVC를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 55% 이상의 기준선 FVC를 갖는다.

일부 구현예에서, 폼페병이 있는 ERT-경험 대상체를 위한 2-성분 요법은 GSGC 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 12 주, 26 주, 38 주 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.1 점, 0.3 점, 0.5 점, 0.7 점, 1.0 점, 1.5 점, 또는 2.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 12 주, 26 주, 38 주 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.3 점, 0.5 점, 0.7 점, 1.0 점, 1.5 점, 2.5 점, 또는 5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1.0 점의 감소로 나타나는 바와 같이 유의미하게 개선된다.

일부 구현예에서, 폼페병이 있는 ERT-경험 대상체를 위한 2-성분 요법은 치료 후에 근손상의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 근손상의 적어도 하나의 마커는 CK를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50% 감소된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 15% 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 또는 50%만큼 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30%만큼 유의미하게 감소된다.

일부 구현예에서, 폼페병이 있는 ERT-경험 대상체를 위한 2-성분 요법은 치료 후에 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커는 소변 Hex4를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 60% 감소된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 25% 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 12 주, 26 주, 38 주, 또는 52 주의 치료 후에 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 60%만큼 유의미하게 감소된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 40%만큼 유의미하게 감소된다.

도 1a는 비-인산화 고 만노스 N-글리칸, 모노-M6P N-글리칸, 및 비스-M6P N-글리칸을 보여준다. 도 1b는 M6P 기의 화학 구조를 보여준다. 각각의 정사각형은 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 나타내고, 각각의 원은 만노스를 나타내며, 각각의 P는 포스페이트를 나타낸다.
도 2의 A는 M6P를 보유하는 N-글리칸을 통한 rhGAA의, 표적 조직(예를 들어, 폼페병이 있는 대상체의 근육 조직)으로의 생산적 표적화를 기술한다. 도 2의 B는 비-표적 조직(예를 들어, 간 및 비장)으로의 또는 비-M6P N-글리칸이 비-표적 조직에 결합하는 것에 의한 비-생산적 약물 클리어런스를 기술한다.
도 3은 재조합 리소좀 단백질의 제조, 포획 및 정제를 위한 예시적인 프로세스의 개략도이다.
도 4는 rhGAA를 인코딩하는 DNA로 CHO 세포를 형질전환시키기 위한 DNA 작제물을 보여준다.
도 5는 음이온 교환(AEX) 컬럼 상의 포획의 존재(구현예 2) 및 부재(구현예 1) 하에 ATB200 rhGAA의 CIMPR 친화성 크로마토그래피의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6a 내지 도 6h는 2 개의 상이한 LC-MS/MS 분석 기법을 사용하는, ATB200 rhGAA의 부위-특이적 N-글리코실화 분석의 결과를 보여준다. 도 6a는 ATB200에 대한 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위의 부위 점유율을 보여준다. 도 6b는 ATB200에 대한 제1 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일의 2 개의 분석을 보여준다. 도 6c는 ATB200에 대한 제2 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일의 2 개의 분석을 보여준다. 도 6d는 ATB200에 대한 제3 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일의 2 개의 분석을 보여준다. 도 6e는 ATB200에 대한 제4 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일의 2 개의 분석을 보여준다. 도 6f는 ATB200에 대한 제5 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일의 2 개의 분석을 보여준다. 도 6g는 ATB200에 대한 제6 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일의 2 개의 분석을 보여준다. 도 6h는 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 대한 모노-인산화 및 비스-인산화 종의 상대 퍼센트를 요약한다.
도 7은 LUMIZYME®(가는 선, 좌측에서 용출됨) 및 ATB200(굵은 선, 우측에서 용출됨)의 폴리왁스(Polywax) 용출 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 8은 BP-rhGAA, ATB200-1 및 ATB200-2로 확인된 ATB200 rhGAA의 3 개의 상이한 제제와 비교한 LUMIZYME®의 N-글리칸 구조의 요약을 보여주는 표이다.
도 9a 및 도 9b는 각각 LUMIZYME® 및 MYOZYME®의 CIMPR 친화성 크로마토그래피의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10a는 ATB200 rhGAA의 CIMPR 결합 친화성(좌측 트레이스(left trace))과 LUMIZYME®의 CIMPR 결합 친화성(우측 트레이스(right trace))을 비교하는 그래프이다. 도 10b는 LUMIZYME® 및 ATB200 rhGAA의 비스-M6P 함량을 비교하는 표이다.
도 11a는 다양한 GAA 농도에서 정상 섬유모세포 내부의 ATB200 rhGAA 활성(좌측 트레이스)과 LUMIZYME® rhGAA 활성(우측 트레이스)을 비교하는 그래프이다. 도 11b는 다양한 GAA 농도에서 폼페병을 갖는 대상체로부터의 섬유모세포 내부의 ATB200 rhGAA 활성(좌측 트레이스)과 LUMIZYME® rhGAA 활성(우측 트레이스)을 비교하는 표이다. 도 11c는 정상 대상체 및 폼페병을 갖는 대상체로부터의 섬유모세포의 K_흡수를 비교하는 표이다.
도 12는 단백질이 변성될 때 염료의 형광이 증가함에 따라 SYPRO Orange를 사용하여 열안정성 검정에서 평가된 산성 또는 중성 pH 완충제 중 ATB200의 안정성을 도시한다.
도 13은 아밀로글루코시다제 소화를 사용하여 결정된, 비히클, 알글루코시다제 알파, 또는 ATB200/AT2221로 처리된 WT 마우스 또는 Gaa KO 마우스의 조직 글리코겐 함량을 보여준다. 막대는 7 마리의 마우스/군의 평균 ± SEM을 나타낸다. * p<0.05, 일원배치 ANOVA 분석 하에 던넷 방법을 이용한 다중 비교에서 알글루코시다제 알파 대비.
도 14는 비히클, 알글루코시다제 알파, 또는 ATB200/AT2221로 처리된 Gaa KO 마우스 또는 WT 마우스의 근섬유 내의 LAMP1-양성 소포를 도시한다. 영상은 가쪽넓은근에서 촬영되었고, 군 당 7 마리의 마우스를 대표하는 것이었다. 배율 = 200x(삽도에서는 1,000x).
도 15a는 비히클, 알글루코시다제 알파, 또는 ATB200/AT2221로 처리된 Gaa KO 마우스 또는 WT 마우스의 근섬유 내의 LC3-양성 응집체를 보여준다. 영상은 가쪽넓은근에서 촬영되었고, 군 당 7 마리의 마우스를 대표하는 것이었다. 배율 = 400x. 도 15b는 LC3 II 단백질의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 총 30 mg의 단백질이 각각의 레인에 로딩되었다.
도 16은 비히클, 알글루코시다제 알파, 또는 ATB200/AT2221로 처리된 Gaa KO 마우스 또는 WT 마우스의 근섬유 내의 디스펄린(Dysferlin) 발현을 보여준다. 영상은 가쪽넓은근에서 촬영되었고, 군 당 7 마리의 마우스를 대표하는 것이었다. 배율 = 200x.
도 17은 비히클, 알글루코시다제 알파, 또는 ATB200으로 처리된 Gaa KO 마우스의 백색 비복근으로부터 단리된 단일 섬유에서의 LAMP1(녹색)(예를 들어, "B" 참조) 및 LC3(적색)(예를 들어, "A" 참조)의 공동-면역형광 염색을 도시한다. "C"는 자가포식 잔해물의 클리어런스 및 확대된 리소좀의 부재를 도시한다. 각각의 동물로부터 최소 30 개의 섬유가 검사되었다.
도 18은 ATB200 단독과 비교하여 각각 17 μM의 AT2221 및 170 μM AT2221에 의한 ATB200의 안정화를 도시한다.
도 19a 내지 도 19h는 프로테아제-소화 ATB200의 LC-MS/MS 분석을 사용한, 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 대한 N-글리코실화 프로파일을 포함하는 ATB200 rhGAA의 부위-특이적 N-글리코실화 분석의 결과를 보여준다. 도 19a 내지 도 19h는 상이한 규모로 생산된 10 개의 ATB200 로트에 대한 평균 데이터를 제공한다.
도 19a는 ATB200에 대한 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위의 평균 부위 점유율을 보여준다. N-글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 1에 따라 제공된다. CV = 변동 계수.
도 19b 내지 도 19h는 ATB200에 대한 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위 모두의 부위-특이적 N-글리코실화 분석을 보여주고, 부위 번호는 SEQ ID NO: 5에 따라 제공된다. 막대는 분석된 10 개의 ATB200 로트에 대한 특정 N-글리칸 기로서 확인된 N-글리칸 종의 최대 및 최소 백분율을 나타낸다. 도 19b는 ATB200에 대한 제1 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 19c는 ATB200에 대한 제2 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 19d는 ATB200에 대한 제3 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 19e는 ATB200에 대한 제4 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 19f는 ATB200에 대한 제5 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 19g는 ATB200에 대한 제6 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 19h는 ATB200에 대한 제7 잠재적 N-글리코실화 부위의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다.
도 20a 및 도 20b는 도 19a 내지 도 19h에도 나타난 바와 같이, ATB200의 N-글리코실화 프로파일을 추가로 특징규명하고 요약한다. 도 20a는 ATB200의 2-안트라닐산(2-AA) 글리칸 맵핑 및 LC/MS-MS 분석을 보여주고, 총 형광의 백분율로서 ATB200에서 확인된 N-글리칸 종을 요약한다. 2-AA 글리칸 맵핑 및 LC-MS/MS 분석으로부터의 데이터는 표 5에도 나타나 있다. 도 20b는 ATB200에 대한 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위 모두에 대한, 총 인산화, 모노-인산화, 비스-인산화, 및 실릴화를 포함한 평균 부위 점유율 및 평균 N-글리칸 프로파일을 요약한다. ND = 검출되지 않음.
도 21은 ATB200-03 연구 설계 개략도를 보여준다.
도 22는 ATB200-03 연구에 참여한 122 명의 대상체의 기준선 6 분 보행 거리(6MWD) 및 좌위(sitting) 강제 폐활량(FVC) 특성을 보여준다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 23a는 전체 집단(n=122)에 대한 기준선, 52 주차의 기준선으로부터의 변화("CFBL"), 차이, 및 P-값을 보여주는 6MWD 및 FVC 데이터를 도시한다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 23b는 전체 집단(n=122)에 대한 시간 경과에 따른 기준선으로부터의 변화를 보여주는 6MWD 및 FVC 데이터를 도시한다. 시파글루코시다제 알파/미글루스타트 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파/위약: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 24는 ERT-경험 집단(n=95)에 대한 기준선, 52 주차의 CFBL, 차이, 및 P-값을 보여주는 6MWD 및 FVC 데이터를 도시한다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 25는 ERT-경험 집단(n=95)에 대한 12 주차, 26 주차, 및 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 6MWD 및 FVC 변화를 도시한다.
도 26a는 ERT-미경험 집단(n=27)에 대한 기준선, 52 주차의 CFBL, 차이, 및 P-값을 보여주는 6MWD 및 FVC 데이터를 도시한다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 26b는 ERT-미경험 집단(n=27)에 대한 시간 경과에 따른 기준선으로부터의 변화를 보여주는 6MWD 및 FVC 데이터를 도시한다. 시파글루코시다제 알파/미글루스타트 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파/위약: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 27은 전체 및 ERT-경험 집단에 대한 주요 이차 종점 및 바이오마커에 대한 기준선 특성을 도시한다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 28은 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 12 주차, 26 주차, 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 하지 도수 근력 검사(MMT) 변화를 도시한다.
도 29는 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 12 주차, 26 주차, 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 보행, 계단, 고워, 의자(GSGC) 변화를 도시한다. 시파글루코시다제 알파/미글루스타트 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파/위약: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 30은 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 12 주차, 26 주차, 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 신체 기능 변화에 대한 환자-보고 결과 측정 정보 시스템(PROMIS)을 도시한다.
도 31은 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 12 주차, 26 주차, 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 피로 변화에 대한 PROMIS를 도시한다.
도 32는 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 12 주차, 26 주차, 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 크레아틴 키나제(CK) 바이오마커 변화를 도시한다.
도 33은 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 12 주차, 26 주차, 38 주차, 및 52 주차의 기준선 대비 소변 육탄당 사당류(Hex4) 바이오마커 변화를 도시한다.
도 34는 전체 집단(좌측) 및 ERT-경험 집단(우측)에 대한 일차, 이차 및 바이오마커 종점 히트 맵을 보여준다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체.
도 35는 ATB200-03 연구로부터의 안전성 데이터를 요약한다. AT-GAA 군: ATB200/AT2221 치료를 제공받은 대상체; 알글루코시다제 알파 군: 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받은 대상체. TEAE: 치료 응급 유해 사례(treatment emergent adverse event); IAR: 주입-연관 반응.
도 36은 ATB200-03 연구로부터의 결과를 요약한다.
도 37은 ATB200-03 연구의 연구 목적 및 통계적 방법을 기술한다.
도 38은 ATB200-03 연구의 일차 종점 및 이차 종점을 기술한다.
도 39는 ATB200-03 연구의 환자 배정(patient disposition)을 요약한다.
도 40은 ATB200-03 연구의 기준선 인구통계를 요약한다.
도 41a 및 도 41b는 ATB200-03 연구에서 전체 집단(n=122)(도 41a) 및 ERT-경험 환자(n=95)(도 41b)의 기준선 상태별 6MWD 및 FVC의 기준선으로부터의 변화에 대한 하위군 분석을 보여준다.
도 42는 ATB200-03 연구의 임의의 군에서 10% 이상의 환자의 치료 응급 유해 사례(TEAE) 목록을 보여준다.

본 개시의 몇몇 예시적 구현예를 기술하기 전에, 본 개시가 하기 설명에 기재된 구성 또는 프로세스 단계의 세부사항으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시는 다른 구현예가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.

재조합 인간 α-글루코시다제(rhGAA) 및 약리학적 샤페론을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. rhGAA는 더 높은 총 함량의 만노스-6-포스페이트-보유 N-글리칸을 갖고, 통상적인 rhGAA 산물과 비교하여 우수한 근육 세포 내로의 흡수 및 후속적인 리소좀 내로의 전달을 나타내며, 이를 폼페병을 갖는 대상체의 효소 대체 요법에 특히 효과적이게 만드는 다른 약동학 성질을 지닌다. 따라서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 통상적인 요법과 비교하여 폼페병을 앓고 있는 대상체에서 질병 진행을 치료하고 역전시키는 데 탁월한 효능을 나타낸다.

I. 정의

본 명세서에서 사용된 용어는, 본 개시의 문맥 내에서, 그리고 각각의 용어가 사용된 구체적인 문맥에서, 일반적으로 당업계에서의 그의 통상적인 의미를 갖는다. 본 개시의 조성물 및 방법, 및 어떻게 이를 제조하고 사용하는지를 기술할 시 실행자에게 추가적인 안내를 제공하기 위해 특정 용어가 하기에서 또는 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 단수형(관사 "a" 및 "an")은 1 개 또는 1 개 초과(즉, 적어도 1 개)의, 관사의 문법적 대상을 지칭한다. "또는"이라는 용어는, 문맥상 명백하게 달리 지시되지 않는 한, "및/또는"이라는 용어를 의미하고, 이와 상호교환 가능하게 사용된다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 구체적으로 달리 언급되지 않는 한 복수형을 포함한다. 추가로, 용어 "포함하는(including)", 뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대, "포함하다(includes)" 및 "포함되는(included)"의 사용은 제한적이지 않다. 본원에 기재된 임의의 범위는 종점 및 종점 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서, 표현 언어 또는 필요한 함축으로 인해 문맥적으로 달리 요구되는 경우를 제외하고, 단어 "포함하다(comprise)", 또는 변형, 예컨대 "포함하는(comprising)"은 포괄적인 의미로, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하지만, 본 개시의 다양한 구현예에서 추가 특징의 존재 또는 부가를 배제하지 않는 것으로 사용된다.

용어 "GAA"는 리소좀 글리코겐의 α-1,4- 및 α-l,6-글리코시드 연결의 가수분해를 촉매작용하는 인간 산 α-글루코시다제(GAA) 효소, 뿐만 아니라 효소 활성을 발휘하는, GAA 아미노산 서열의 삽입, 관련 또는 치환 변이체 및 더 긴 GAA 서열의 단편을 지칭한다. 인간 산 α-글루코시다제는 GAA 유전자(미국 국가생물공학센터(NCBI) 유전자 ID 2548)에 의해 인코딩되고, 이는 17 번 염색체의 긴 아암에 맵핑되었다(위치 17q25.2-q25.3). GAA의 예시적인 아미노산 서열은 참조로 포함되는 NP 000143.2이다. 본 개시는 또한 NP 000143.2의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA 서열을 포괄한다. 현재 500 개 초과의 돌연변이가 인간 GAA 유전자에서 확인되었고, 이들 중 다수가 폼페병과 연관되어 있다. 산 α-글루코시다제 효소의 미스폴딩 또는 가공오류(misprocessing)를 초래하는 돌연변이는 T1064C(Leu355Pro) 및 C2104T(Arg702Cys)를 포함한다. 추가로, 효소의 성숙 및 가공에 영향을 미치는 GAA 돌연변이는 Leu405Pro 및 Met519Thr을 포함한다. 산 α-글루코시다제 단백질의 활성을 위해서는 516 번 내지 521 번 아미노산 잔기에서 보존된 헥사펩티드 WIDMNE(SEQ ID NO: 7)가 필요하다. 본원에서 사용되는 "GAA"라는 약어는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도되는 한편, 이탤릭체 약어 "GAA"는 인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도된다. "Gaa"라는 이탤릭체 약어는 래트 또는 마우스 유전자를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 비-인간 산 α-글루코시다제 효소를 코딩하는 비-인간 유전자를 지칭하는 것으로 의도되고, "Gaa"라는 약어는 비-인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭한다.

"rhGAA"라는 용어는 재조합 인간 산 α-글루코시다제 효소를 지칭하는 것으로 의도되고, 내인성 GAA를 합성 또는 재조합-생산 GAA(예를 들어, CHO 세포 또는 GAA를 인코딩하는 DNA로 형질전환된 다른 숙주 세포로부터 생산된 GAA)와 구별하기 위해 사용된다. "rhGAA"라는 용어는 개별적인 rhGAA 분자의 집단을 포괄한다. rhGAA 분자의 집단의 특징이 본원에서 제공된다. "통상적인 rhGAA 산물"이라는 용어는 알글루코시다제 알파를 함유하는 산물, 예컨대, LUMIZYME® 또는 MYOZYME®을 지칭하는 것으로 의도된다.

"유전적으로 변형된" 또는 "재조합"이라는 용어는 코딩 서열의 발현을 제어하는 조절 요소와 함께 유전자 산물을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산의 도입 후에 특정 유전자 산물, 예컨대, rhGAA를 발현하는 세포, 예컨대, CHO 세포를 지칭한다. 핵산의 도입은 유전자 표적화 및 상동성 재조합을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 이러한 용어는, 예를 들어, 유전자 활성화 기술에 의해, 정상적으로는 그러한 세포에서 발현되지 않는 내인성 유전자 또는 유전자 산물을 발현하거나 과발현하도록 조작된 세포도 포함한다.

본원에서 사용되는 "알글루코시다제 알파"라는 용어는 [199-아르기닌,223-히스티딘]프리프로-α-글루코시다제(인간); 화학물질 등록 번호(Chemical Abstracts Registry Number) 420794-05-0로 확인되는 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다. 알글루코시다제 알파는 LUMIZYME® 및 MYOZYME®라는 산물로 Genzyme에 의해 미국에서의 판매가 승인되었다.

본원에서 사용되는 "ATB200"이라는 용어는 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 미국 제10,961,522호에 기재된 재조합 인간 산 α-글루코시다제를 지칭하는 것으로 의도된다. ATB200은 "시파글루코시다제 알파"로도 지칭된다.

본원에서 사용되는 "글리칸"이라는 용어는 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산 잔기에 공유 결합된 올리고당류를 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 "N-글리칸" 또는 "N-연결 글리칸"이라는 용어는 아스파라긴 잔기의 질소 원자에 공유 결합을 통해 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아스파라긴 잔기에 부착된 다당류 사슬을 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, rhGAA에 부착된 N-글리칸 단위는 Thermo Scientific™ Orbitrap Velos Pro™ 질량 분광기, Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™ 질량 분광기, 또는 Waters Xevo® G2-XS QTof 질량 분광기와 같은 기기를 이용하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)에 의해 결정된다.

본원에서 사용되는 강제 폐활량, 또는 "FVC"는 대상체가 가능한 한 가장 깊은 숨을 들이마신 후에 대상체의 폐로부터 강제로 내쉬어질 수 있는 공기의 양이다.

본원에서 사용되는 "6 분 보행 검사"(6MWT)는 개체가 딱딱하고 평평한 표면에서 총 6 분에 걸쳐 걸을 수 있는 거리를 측정하는 검사이다. 검사는 개체가 6 분 안에 가능한 한 멀리 걷게 함으로써 수행된다.

본원에서 사용되는 "10 미터 보행 검사"(10MWT)는 보행화를 신은 개체가 평평한 표면에서 10 미터를 걷는 데 걸리는 시간을 측정하는 검사이다.

N-부틸-1-데옥시노지리마이신 또는 NB-DNJ 또는 (2R,3R,4R,5S)-1-부틸-2-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4,5-트리올로도 공지된 본원에서 사용되는 화합물 미글루스타트는 하기 화학식을 갖는 화합물이다:

하나의 미글루스타트 제형이 1형 고쉐병(type 1 Gaucher disease)에 대한 단독요법으로서 상표명 ZAVESCA®로 상업적으로 판매된다. 일부 구현예에서, 미글루스타트는 AT2221로 지칭된다.

하기 논의된 바와 같이, 미글루스타트의 약학적으로 허용되는 염도 본 개시에서 사용될 수 있다. 미글루스타트의 염이 사용될 때, 환자가 제공받은 미글루스타트의 용량이, 미글루스타트 유리 염기가 사용된 경우에 제공받았을 양과 등가이도록 염의 투여량이 조정될 것이다.

1-데옥시노지리마이신 또는 DNJ 또는 (2R,3R,4R,5S)-2-(하이드록시메틸)피페리딘-3,4,5-트리올로도 공지된 본원에서 사용되는 화합물 두보글루스타트는 하기 화학식을 갖는 화합물이다:

본원에서 사용되는 "약리학적 샤페론"이라는 용어 또는 일부 경우에 간략하게 줄인 "샤페론"이라는 용어는 산 α-글루코시다제에 특이적으로 결합하고 하기 효과 중 하나 이상을 갖는 분자를 지칭하는 것으로 의도된다:

● 단백질의 안정적인 분자 형태(molecular conformation)의 형성을 강화하는 것;

● 단백질이 소포체로부터 또 다른 세포 위치, 바람직하게는 네이티브 세포 위치로 올바르게 트래피킹(trafficking)하는 것을 강화하여, 단백질의 소포체-연관 분해를 강화하는 것;

● 형태적으로 불안정하거나 미스폴딩된 단백질의 응집을 방지하는 것;

● 단백질의 적어도 부분적인 야생형 기능, 안정성, 및/또는 활성을 복원하고/하거나 강화하는 것; 및/또는

● 산 α-글루코시다제를 보유하는 세포의 표현형 또는 기능을 개선하는 것.

따라서, 산 α-글루코시다제에 대한 약리학적 샤페론은 산 α-글루코시다제에 결합하여, 산 α-글루코시다제의 올바른 폴딩, 트래피킹, 비-응집 및 활성을 초래하는 분자이다. 적어도 하나의 구현예에서, 약리학적 샤페론은 미글루스타트이다. 산 α-글루코시다제에 대한 약리학적 샤페론의 또 다른 비제한적인 예는 두보글루스타트이다.

본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 생리적으로 허용 가능하고, 전형적으로 인간에게 투여될 때 유해 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이라는 용어는 동물, 보다 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 나열되어 있음을 의미한다. 본원에서 사용되는 "담체"라는 용어는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제, 또는 비히클을 지칭하는 것으로 의도된다. 적합한 약학적 담체는 당업계에 공지되어 있고, 적어도 하나의 구현예에서, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Edition], 또는 다른 판에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 염"이라는 용어는 건전한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 상응하고, 일반적으로 물 또는 오일에 가용성 또는 분산성이고, 이의 의도되는 용도에 효과적인 염을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 약학적으로 허용되는 산 부가 염 및 약학적으로 허용되는 염기 부가 염을 포함한다. 적합한 염의 목록은, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1-19]에서 발견된다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 산 부가 염"이라는 용어는 무기 산으로 형성된, 유리 염기의 생물학적 유효성 및 성질을 유지하고 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않지 않은 염을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 염기 부가 염"이라는 용어는 무기 염기로 형성된, 유리 산의 생물학적 유효성 및 성질을 유지하고 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않지 않은 염을 의미하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 "완충제"라는 용어는 pH의 변화를 방지하는 것을 돕는 약산 및 이의 짝염기 또는 약염기 및 이의 짝산을 함유하는 용액을 지칭한다.

본원에서 사용되는 "치료적 유효 용량" 및 "유효량"이라는 용어는 대상체에서 치료 반응을 초래하는 데 충분한, 산 α-글루코시다제 및/또는 미글루스타트 및/또는 이의 2-성분 요법의 양을 지칭하는 것으로 의도된다.

치료 반응은 또한 글리코겐 축적, 리소좀 증식, 및 자가포식 구역의 형성과 같은 분자 반응을 포함할 수 있다. 치료 반응은 본원에 기재된 rhGAA를 이용한 치료 전 및 후에 근육 생검체의 생리학적 및 분자 반응을 비교함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 생검 샘플 내에 존재하는 글리코겐의 양이 치료 반응을 결정하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. 또 다른 예는 바이오마커, 예컨대, LAMP-1, LC3, 및 디스펄린을 포함하고, 이는 리소좀 저장 기능장애의 지표로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 rhGAA를 이용한 치료 전 및 후에 수집된 근육 생검체가 바이오마커 중 하나를 인식하는 항체로 염색될 수 있다. 치료 반응은 또한 피로의 감소 또는 다른 환자-보고 결과(예를 들어, 일상 생활 활동성, 웰빙 등)의 개선을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "효소 대체 요법" 또는 "ERT"라는 용어는 비-네이티브 정제 효소를 이러한 효소가 결핍된 개체에 도입하는 것을 지칭하는 것으로 의도된다. 투여된 단백질은 천연 공급원으로부터 또는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 용어는 또한 정제 효소의 투여가 달리 필요하거나 유익한 개체에 정제 효소를 도입하는 것을 지칭한다. 적어도 하나의 구현예에서, 이러한 개체는 효소 부족(enzyme insufficiency)을 앓고 있다. 도입된 효소는 시험관내에서 생산되는 정제된 재조합 효소, 또는 예를 들어 태반 또는 동물 유즙 등과 같은 단리된 조직이나 유체 또는 식물로부터 정제된 단백질일 수 있다.

본원에서 사용되는 "2-성분 요법"이라는 용어는 2 개 이상의 개별 요법이 동시에 또는 순차적으로 투여되는 임의의 요법을 지칭하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 2-성분 요법의 결과는 개별적으로 수행될 때 각각의 요법의 효과와 비교하여 강화된다. 강화는 단독으로 수행될 때 요법에 의해 달성된 결과와 비교하여 유리한 결과를 초래할 수 있는 다양한 요법의 효과의 임의의 개선을 포함할 수 있다. 강화된 효과 또는 결과는 강화된 효과가, 단독으로 수행되었을 때의 각각의 요법의 상가 효과보다 더 큰 상승작용적 강화; 강화된 효과가, 단독으로 수행되었을 때의 각각의 요법의 상가 효과와 실질적으로 같은 부가적 강화; 또는 강화된 효과가, 단독으로 수행되었을 때의 각각의 요법의 상가 효과보다 낮지만, 여전히 단독으로 수행되었을 때의 각각의 요법의 효과보다 우수한 상가 효과 미만의 효과를 포함할 수 있다. 강화된 효과는 치료 효능 또는 결과가 측정될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 측정될 수 있다.

"폼페병"은 리소좀 글리코겐 대사를 손상시키는 결핍성 산 알파 글루코시다제(GAA) 활성을 특징으로 하는 상염색체 열성 LSD를 지칭한다. 효소 결핍은 리소좀 글리코겐 축적을 야기하고, 진행성 골격근 저하, 심장 기능 감소, 호흡 부전, 및/또는 말기 질병에서의 CNS 손상을 초래한다. GAA 유전자에서의 유전자 돌연변이는 더 낮은 발현을 초래하거나, 안정성 및/또는 생물학적 활성이 변경된 돌연변이체 형태의 효소를 생산하여 궁극적으로 질병을 야기한다(일반적으로, 문헌[Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid a-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, New York, 7th ed., pages 2443-2464] 참조). 폼페병의 세 가지 인식된 임상 형태(영아, 소아 및 성인)는 잔류 α-글루코시다제 활성의 수준과 상관관계가 있다(Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). 영아 폼페병(I형 또는 A형)은 가장 일반적이고 가장 중증이며, 생후 2 년 이내의 성장장애, 전신성 저긴장, 심장 비대, 및 심장호흡 부전을 특징으로 한다. 소아 폼페병(II형 또는 B형)은 중증도 면에서 중간이고, 심장비대 없이 근육 증상의 우세를 특징으로 한다. 소아 폼페 개체는 일반적으로 호흡기능상실로 인해 20 세에 이르기 전에 사망한다. 성인 폼페병(III형 또는 C형)은 10 대 또는 느리게는 60 대에 천천히 진행성인 근병증으로서 흔히 존재한다(Felicia K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135). 폼페병에서, α-글루코시다제가 번역 후에 글리코실화, 인산화 및 단백질분해성 가공에 의해 광범위하게 변형되는 것으로 나타났다. 리소좀에서 단백질분해에 의해 110 킬로달톤(kDa)의 전구체가 76 KDa 및 70 KDa의 성숙 형태로 전환되는 것이 최적의 글리코겐 촉매작용에 요구된다. 본원에서 사용되는 "폼페병"이라는 용어는 모든 유형의 폼페병을 지칭한다. 본 출원에 개시된 제형 및 투약 용법(dosing regimen)은, 예를 들어, I형, II형 또는 III형 폼페병을 치료하는 데 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "유의미한"은 통계적 유의성을 지칭한다. 이러한 용어는 2 개의 치료군 간에 차이가 있다는 통계적 증거를 지칭한다. 이는 귀무 가설이 실제로 참일 때 귀무 가설을 기각하기로 결정할 확률로 정의될 수 있다. 결정은 흔히 비교를 위한 적합한 통계 분석으로부터 도출된 0.05 미만의 p-값을 사용하여 이루어진다. 예를 들어, 실시예 9를 참조한다.

"대상체" 또는 "환자"는 바람직하게는 인간이지만, 글리코겐의 축적을 수반하는 장애를 갖는 다른 포유동물 및 비-인간 동물도 치료될 수 있다. 대상체는 폼페병 또는 다른 글리코겐 저장 또는 축적 장애가 있는 태아, 신생아, 아동, 소아 또는 성인일 수 있다. 치료 중인 개체의 일례는 GSD-II(예를 들어, 영아 GSD-II, 소아 GSD-II, 또는 성인-발병 GSD-II)를 갖는 개체(태아, 신생아, 아동, 소아, 청소년, 또는 성인 인간)이다. 개체는 잔여 GAA 활성이 있을 수 있거나, 측정 가능한 활성이 없을 수 있다. 예를 들어, GSD-II를 갖는 개체는 정상 GAA 활성의 약 1% 미만인 GAA 활성(영아 GSD-II), 정상 GAA 활성의 약 1% 내지 10%인 GAA 활성(소아 GSD-II), 또는 정상 GAA 활성의 약 10% 내지 40%인 GAA 활성(성인 GSD-II)을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 환자는 이전에 효소 대체 요법을 제공받은 적이 있는 폼페병 환자를 지칭하는 "ERT-경험" 또는 "ERT-전환" 환자이다. 일부 구현예에서, "ERT-경험" 또는 "ERT-전환" 환자는 24 개월 이상 동안 알글루코시다제 알파를 제공받은 적이 있거나 현재 제공받고 있는 폼페병 환자이다. 일부 구현예에서, 대상체 또는 환자는 이전에 효소 대체 요법을 제공받은 적이 없는 폼페병 환자를 지칭하는 "ERT-미경험" 환자이다. 특정 구현예에서, 대상체 또는 환자는 보행 가능하다(예를 들어, 보행 가능 ERT-전환 환자 또는 보행 가능 ERT-미경험 환자). 특정 구현예에서, 대상체 또는 환자는 보행 가능하지 않다(예를 들어, 보행 불능 ERT-전환 환자). 보행 가능 또는 보행 불능 상태는 6 분 보행 검사(6MWT)에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 보행 가능 환자는 6MWT에서 적어도 200 미터를 걸을 수 있는 폼페병 환자이다. 일부 구현예에서, 보행 불능 환자는 보조 없이 걸을 수 없거나 휠체어에 의존하는 폼페병 환자이다.

본원에서 사용되는 "치료하다" 및 "치료"라는 용어는 질병과 연관된 하나 이상의 증상의 호전, 질병의 하나 이상의 증상의 발병의 지연, 및/또는 질병의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 빈도의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 치료는 심장 상태의 개선(예를 들어, 확장 말기 및/또는 수축 말기 용적의 증가, 또는 GSD-II에서 전형적으로 발견되는 진행성 심근병증의 감소 또는 호전) 또는 폐 기능의 개선(예를 들어, 기준선 폐활량과 비교하여 울음 폐활량(crying vital capacity)의 증가, 및/또는 우는 동안의 산소 불포화도의 정상화); 신경발달 및/또는 운동 능력의 개선(예를 들어, AIMS 점수의 증가); 질병에 영향을 받는 개체의 조직 내의 글리코겐 수준의 감소; 또는 이들 효과의 임의의 조합을 지칭할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 치료는 심장 상태의 개선, 특히 GSD-II-연관 심근병증의 감소에 있어서의 개선을 포함한다.

본원에서 사용되는 "개선하다", "증가시키다" 및 "감소시키다"라는 용어는 기준선 측정치 또는 대조군 치료로부터의 상응하는 값, 예컨대, 본원에 기재된 치료를 시작하기 전의 동일한 개체에서의 측정치, 본원에 기재된 치료의 부재 하의 대조군 개체(또는 다중 대조군 개체)에서의 측정치, 또는 대조군 치료 후 측정치에 비한 값을 나타낸다. 대조군 개체는 (치료된 개체 및 대조군 개체(들)에서의 질병 병기가 비슷하다는 것을 보장하기 위해) 치료 중인 개체와 대략 같은 나이인, 치료 중인 개체와 동일한 형태의 GSD-II(영아, 소아 또는 성인-발병)에 걸린 개체이다. 일부 구현예에서, 대조군 치료는 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함한다(실시예 9 참조).

본원에서 사용되는 "약" 및 "대략"이라는 용어는 측정치의 성질 또는 정밀성을 고려하여 측정된 양에 대한 허용 가능한 정도의 오차를 지칭하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 오차의 정도는, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 측정을 위해 제공된 유효 숫자의 개수에 의해 나타날 수 있고, 측정치에 대해 보고된 가장 정밀한 유효 숫자에서의 ±1의 편차를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 전형적인 예시적 오차 정도는 주어진 값 또는 값의 범위의 20 퍼센트(%) 이내, 바람직하게는 10% 이내, 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 본원에서 제공되는 수량은 달리 언급되지 않는 한 근사치이고, 이는 명백하게 언급되지 않은 경우에 "약" 또는 "대략"이라는 용어가 암시될 수 있다는 것을 의미한다.

본원에 인용된 모든 참고문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공보, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참고문헌, 논문, 간행물, 특허, 특허 공보, 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 종래 기술을 구성하거나 전 세계의 어느 나라의 공통된 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의의 형태의 제안이 아니며, 그러한 것으로 간주되어서도 안 된다.

본원에서 사용된 표제 부문은 단지 조직화 목적을 위한 것이며, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

II. 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)

일부 구현예에서, 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA)는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, 또는 SEQ ID NO: 6에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 효소이다. 일부 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 2에 제시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.

일부 구현예에서, rhGAA는 미국 특허 제8,592,362호에 기재된 바와 같이 SEQ ID NO: 1에 제시된 바와 같은 GAA 아미노산 서열을 갖고, GenBank 수탁 번호 AHE24104.1(GI:568760974)을 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA는 GenBank 수탁 번호 Y00839.1을 갖는 mRNA 서열인, SEQ ID NO: 2로 인코딩된 바와 같은 GAA 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 3에 제시된 바와 같은 GAA 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 4에 기재된 바와 같은 GAA 아미노산 서열을 갖고, 미국 국가생물공학센터(NCBI) 수탁 번호 NP_000143.2 또는 UniProtKB 수탁 번호 P10253을 갖는다.

일부 구현예에서, rhGAA는 초기에는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 4에 제시된 바와 같은 야생형 GAA의 전장 952 개 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되고, rhGAA는 아미노산의 일부, 예를 들어, 처음 56 개의 아미노산을 제거하는 세포내 가공을 거친다. 따라서, 숙주 세포에 의해 분비되는 rhGAA는 초기에 세포 내에서 발현된 rhGAA보다 더 짧은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 더 짧은 단백질은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 이는 신호 펩티드 및 전구체 펩티드를 포함하는 처음 56 개의 아미노산이 제거되어, 896 개의 아미노산을 갖는 단백질을 초래하였다는 점에서만 SEQ ID NO: 1과 상이하다. 일부 구현예에서, 더 짧은 단백질은 SEQ ID NO: 6에 제시된 아미노산 서열을 갖고, 이는 신호 펩티드 및 전구체 펩티드를 포함하는 처음 56 개의 아미노산이 제거되어, 896 개의 아미노산을 갖는 단백질을 초래하였다는 점에서만 SEQ ID NO: 4와 상이하다. 아미노산 수의 다른 편차, 예컨대, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, 또는 SEQ ID NO: 6에 의해 기재된 아미노산 서열에 비해 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개, 7 개, 8 개, 9 개, 10 개, 11 개, 12 개, 13 개, 14 개, 15 개 이상의 결실, 치환, 및/또는 삽입을 갖는 것도 가능하다. 일부 구현예에서, rhGAA 산물은 아미노산 길이가 상이한 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자의 혼합물을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. GCG 서열 분석 패키지(위스콘신 대학, 위스콘신주 매디슨)의 일부로서 이용 가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하여, 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 두 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 디폴트 설정으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 특이적 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 가지며, 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라, 이러한 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 달리 지시되지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용에 기반할 것이다. BLASTP가 사용되는 경우, 유사성 퍼센트는 BLASTP 양의 점수에 기반하며, 서열 동일성 퍼센트는 BLASTP 동일성 점수에 기반한다. BLASTP "동일성"은 동일한 높은 점수의 서열 쌍에서의 총 잔기의 수 및 분율을 나타내고; BLASTP "양성"은, 정렬 점수가 양의 값을 가지며 서로 유사한 잔기의 수 및 분율을 나타낸다. 본원에 개시된 아미노산 서열과 이들 동일성 또는 유사성 정도 또는 임의의 중간 정도의 유사성의 동일성을 갖는 아미노산 서열이 고려되며, 본 개시에 의해 포괄된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 코드를 사용하여 추론되며, 이는 통상적인 수단, 특히, 유전자 코드를 사용한 아미노산 서열의 역번역에 의해 얻어질 수 있다.

일부 구현예에서, rhGAA는 단백질 내의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 번역 후 및/또는 화학적 변형을 겪는다. 예를 들어, 메티오닌 및 트립토판 잔기는 산화를 거칠 수 있다. 또 다른 예로서, SEQ ID NO: 6에서 N-말단 글루타민은 피로-글루타메이트를 형성하도록 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 예로서, 아스파라긴 잔기는 아스파르트산으로의 탈아미드화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 아스파르트산 잔기는 이소-아스파르트산으로의 이성질체화를 거칠 수 있다. 추가의 또 다른 예로서, 단백질에서 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기는 유리 글루타티온 및/또는 시스테인과 이황화 결합을 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이 효소는 초기에는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 제시된 바와 같은 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 2에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 갖는 것으로서 발현되고, 효소는 이들 번역 후 및/또는 화학적 변형 중 하나 이상을 거친다. 이러한 변형은 또한 본 개시의 범위 내에 있다.

III. rhGAA의 N-연결 글리코실화

단일 rhGAA 분자 상에 7 개의 잠재적 N-연결 글리코실화 부위가 있다. 이들 잠재적 글리코실화 부위는 SEQ ID NO: 6의 하기의 위치에 있다: N84, N177, N334, N414, N596, N826, 및 N869. 유사하게, SEQ ID NO: 4의 전장 아미노산 서열의 경우, 이들 잠재적 글리코실화 부위는 하기의 위치에 있다: N140, N233, N390, N470, N652, N882, 및 N925. 아스파라긴 잔기의 위치에 따라, rhGAA의 다른 변이체가 유사한 글리코실화 부위를 가질 수 있다. 일반적으로는, X가 His 또는 Pro일 수 없다는 것을 제외하고, 단백질 아미노산 서열 내의 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr의 서열이 잠재적 글리코실화 부위를 나타낸다.

본원에 기재된 rhGAA 분자는 평균적으로 이의 N-글리칸 상에 1 개, 2 개, 3 개, 또는 4 개의 만노스-6-포스페이트(M6P) 기를 가질 수 있다. 예를 들어, rhGAA 분자 상의 오직 1 개의 N-글리칸만이 M6P(모노-인산화 또는 모노-M6P)를 보유할 수 있거나, 단일 N-글리칸이 2 개의 M6P 기(비스-인산화 또는 비스-M6P)를 보유할 수 있거나, 동일한 rhGAA 분자 상의 2 개의 상이한 N-글리칸이 단일 M6P 기를 각각 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 분자는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 이의 N-글리칸 상에 3 mol 내지 4 mol의 M6P 기를 갖는다. 재조합 인간 산 α-글루코시다제 분자는 또한 M6P 기를 보유하지 않는 N-글리칸을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 평균적으로 rhGAA는 rhGAA의 mol 당 2.5 mol 초과의 M6P, 및 rhGAA의 mol 당 4 mol 초과의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 rhGAA는 rhGAA의 mol 당 약 3 mol 내지 3.5 mol의 M6P를 포함한다. 일부 구현예에서, 평균적으로 rhGAA는 rhGAA의 mol 당 약 4 mol 내지 5.4 mol의 시알산을 포함한다. 평균적으로, rhGAA 상의 총 N-글리칸의 적어도 약 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 또는 20%가 모노-M6P N-글리칸의 형태일 수 있고, 예를 들어, 총 N-글리칸의 약 6.25%가 단일 M6P 기를 보유할 수 있고, 평균적으로, rhGAA 상의 총 N-글리칸의 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%가 비스-M6P N-글리칸의 형태이며, 평균적으로 총 rhGAA의 25% 미만이 CIMPR에 대한 인산화 N-글리칸 결합을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 평균적으로 rhGAA 상의 총 N-글리칸의 약 10% 내지 약 14%가 모노-인산화된다. 일부 구현예에서, 평균적으로 rhGAA 상의 총 N-글리칸의 약 7% 내지 약 25%가 비스-인산화된다. 일부 구현예에서, 평균적으로 rhGAA는 rhGAA의 mol 당 약 1.3 mol의 비스-M6P를 포함한다.

본원에 기재된 rhGAA는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 0.5 mol 내지 7.0 mol의 M6P, 또는 이의 임의의 중간 값 또는 하위범위(rhGAA의 mol 당 0.5 mol, 1.0 mol, 1.5 mol, 2.0 mol, 2.5 mol, 3.0 mol, 3.5 mol, 4.0 mol, 4.5 mol, 5.0 mol, 5.5 mol, 6.0 mol, 6.5 mol, 또는 7.0 mol의 M6P을 포함함)를 가질 수 있다. rhGAA는 모노-M6P-보유 또는 비스-M6P-보유 N-글리칸의 평균 개수가 상이한 rhGAA 제제를 제공하도록 분획화될 수 있고, 그에 따라 특정 분획을 선택함으로써 또는 상이한 분획을 선택적으로 조합함으로써 표적 조직 내의 리소좀으로 표적화하는 rhGAA의 맞춤제작을 추가로 허용한다.

일부 구현예에서, rhGAA 상의 N-글리칸의 최대 60%가 완전히 시알릴화될 수 있고, 예를 들어, N-글리칸의 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60%가 완전히 시알릴화될 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA 상의 N-글리칸의 50% 이하가 완전히 시알릴화된다. 일부 구현예에서, 총 N-글리칸의 4% 내지 20%가 완전히 시알릴화된다. 다른 구현예에서, rhGAA 상의 N-글리칸의 5%, 10%, 20% 또는 30% 이하가 시알산 및 말단 갈락토스 잔기(Gal)를 보유한다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하고, 예를 들어, rhGAA 상의 총 N-글리칸의 7% 내지 30%가 시알산 및 말단 갈락토스를 보유할 수 있다. 추가의 다른 구현예에서, rhGAA 상의 N-글리칸의 5%, 10%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20% 이하가 말단 갈락토스만을 갖고, 시알산은 함유하지 않는다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하고, 예를 들어, 조성물 내의 rhGAA 상의 총 N-글리칸의 8% 내지 19%가 말단 갈락토스만을 가질 수 있고, 시알산은 함유하지 않는다.

일부 구현예에서, rhGAA 상의 총 N-글리칸의 40% 내지 60%, 45% 내지 60%, 50% 내지 60%, 또는 55% 내지 60%가 복합형 N-글리칸이거나; rhGAA 상의 총 N-글리칸의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 또는 7% 이하가 하이브리드형 N-글리칸이고/이거나; rhGAA 상의 고 만노스형 N-글리칸의 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하가 비-인산화되고/되거나; rhGAA 상의 고 만노스형 N-글리칸의 적어도 5% 또는 10%가 모노-인산화되고/되거나; rhGAA 상의 고 만노스형 N-글리칸의 적어도 1% 또는 2%가 비스-인산화된다. 이들 값은 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. rhGAA는 상기 기재된 함량 범위 중 하나 이상을 충족할 수 있다.

일부 구현예에서, rhGAA는 평균적으로 rhGAA의 몰 당 2.0 몰 내지 8.0 몰의 시알산 잔기를 보유할 수 있다. 이러한 범위는 rhGAA의 mol 당 2.0 mol, 2.5 mol, 3.0 mol, 3.5 mol, 4.0 mol, 4.5 mol, 5.0 mol, 5.5 mol, 6.0 mol, 6.5 mol, 7.0 mol, 7.5 mol, 및 8.0 mol의 시알산 잔기를 포함하여, 이의 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 이론으로 국한되지 않으면서, 시알산 잔기를 보유하는 N-글리칸 단위의 존재는 아시알로당단백질 수용체에 의한 rhGAA의 비-생산적 클리어런스를 방지할 수 있는 것으로 사료된다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA는 특정한 잠재적 N-글리코실화 부위에 특정한 N-글리코실화 프로파일을 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 20%가 제1 잠재적 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N84 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N140)에서 인산화된다. 예를 들어, rhGAA의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 모노-M6P 및/또는 비스-M6P 단위로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 모노-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 비스-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 1.4 mol의 M6P(모노-M6P 및 비스-M6P)를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 적어도 0.5 mol의 비스-M6P를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.25 mol의 모노-M6P를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.2 mol 내지 약 0.3 mol의 시알산을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 제1 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 6b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a에 도시된 바와 같은 제1 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19b 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 20%가 제2 잠재적 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N177 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N223)에서 인산화된다. 예를 들어, rhGAA의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제2 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 모노-M6P 및/또는 비스-M6P 단위로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제2 N-글리코실화 부위에 모노-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제2 N-글리코실화 부위에 비스-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.5 mol의 M6P(모노-M6P 및 비스-M6P)를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 모노-M6P를 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 제2 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 6c에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a에 도시된 바와 같은 제2 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19c 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

하나 이상의 구현예에서, rhGAA의 적어도 5%가 제3 잠재적 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N334 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N390)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, rhGAA의 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제3 잠재적 N-글리코실화 부위는 주요 종으로서 비-인산화 고 만노스 N-글리칸, 디-, 트리- 및 테트라-안테나 복합 N-글리칸, 및 하이브리드 N-글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%가 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.9 mol 내지 약 1.2 mol의 시알산을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 제3 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 6d에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a에 도시된 바와 같은 제3 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19d 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 20%가 제4 잠재적 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N414 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N470)에서 인산화된다. 예를 들어, rhGAA의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에서 인산화될 수 있다. 이러한 인산화는 모노-M6P 및/또는 비스-M6P 단위로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 모노-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 비스-M6P 단위를 보유한다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 또는 25%가 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 1.4 mol의 M6P(모노-M6P 및 비스-M6P)를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 비스-M6P를 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.3 mol 내지 약 0.4 mol의 모노-M6P를 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 제4 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 6e에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a에 도시된 바와 같은 제4 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19e 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 5%가 제5 잠재적 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N596 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N692)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, rhGAA의 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제5 잠재적 N-글리코실화 부위는 주요 종으로서 푸코실화 디-안테나 복합 N-글리칸을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.8 mol 내지 약 0.9 mol의 시알산을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 제5 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 6f에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a에 도시된 바와 같은 제5 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19f 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 5%가 제6 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N826 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N882)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, rhGAA의 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제6 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 예를 들어, 제6 N-글리코실화 부위는 주요 종으로서 디-, 트리- 및 테트라-안테나 복합 N-글리칸의 혼합물을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%가 제6 N-글리코실화 부위에서 시알릴화된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 1.5 mol 내지 약 4.2 mol의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.9 mol의 아세틸화된 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 폴리-N-아세틸-D-락토사민(폴리-LacNAc) 잔기를 갖는 평균 적어도 0.05 mol의 글리칸 종을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA의 10% 초과는 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 폴리-LacNAc 잔기를 보유하는 글리칸을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 제6 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 6g에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a에 도시된 바와 같은 제6 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19g 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 5%가 제7 잠재적 N-글리코실화 부위(예를 들어, SEQ ID NO: 6의 경우 N869 및 SEQ ID NO: 4의 경우 N925)에서 인산화된다. 다른 구현예에서, rhGAA의 5%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 미만이 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에서 인산화된다. 일부 구현예에서, rhGAA의 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 또는 65% 미만은 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 임의의 N-글리칸을 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA의 적어도 30%, 35%, 또는 40%는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 N-글리칸을 갖는다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 0.5 mol의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 0.8 mol의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.86 mol의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 폴리-LacNAc 잔기를 보유하는 평균 적어도 0.3 mol의 글리칸 종을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA의 거의 절반이 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 폴리-LacNAc 잔기를 보유하는 글리칸을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에서 확인된 모든 N-글리칸은 복합 N-글리칸이다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a에 도시된 바와 같은 또는 도 19a에 도시된 바와 같은 제7 잠재적 N-글리코실화 부위 점유율 및 도 19h 또는 도 20b에 도시된 바와 같은 N-글리코실화 프로파일을 포함한다.

일부 구현예에서, rhGAA는 평균적으로 rhGAA의 mol 당 3 mol 내지 4 mol의 M6P 잔기 및 rhGAA의 mol 당 약 4 mol 내지 약 7.3 mol의 시알산을 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 평균적으로 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 적어도 약 0.5 mol의 비스-M6P, 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 모노-M6P, 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.9 mol 내지 약 1.2 mol의 시알산, 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 비스-M6P, 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.3 mol 내지 약 0.4 mol의 모노-M6P, 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 0.8 mol 내지 약 0.9 mol의 시알산, 및 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 약 1.5 mol 내지 약 4.2 mol의 시알산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 0.5 mol의 시알산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 0.8 mol의 시알산을 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에 평균적으로 rhGAA의 mol 당 약 0.86 mol의 시알산을 추가로 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 6a 내지 도 6h에 도시된 바와 같은 점유율 및 N-글리코실화 프로파일을 갖는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함한다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA는 도 19a 내지 도 19h, 및 도 20a 및 도 20b에 도시된 바와 같은 점유율 및 N-글리코실화 프로파일을 갖는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함한다.

rhGAA를 제조하는 방법은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 2014년 9월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/057,842호에 개시되어 있다.

리소좀 내부에서는, rhGAA가 축적된 글리코겐을 효소적으로 분해할 수 있다. 그러나, 통상적인 rhGAA 산물은 모노-M6P- 및 비스-M6P 보유 N-글리칸의 총 수준이 낮고, 그에 따라, 근육 세포를 불량하게 표적화하여, 리소좀으로의 rhGAA의 열악한 전달을 초래한다. 이들 통상적인 산물 내의 대부분의 rhGAA 분자는 인산화 N-글리칸을 갖지 않고, 이에 의해 CIMPR에 대한 친화성을 결여한다. 비-인산화 고 만노스 N-글리칸은 또한 만노스 수용체에 의해 제거될 수 있고, 이는 ERT의 비-생산적 클리어런스를 초래한다(도 2의 B). 대조적으로, 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 본원에 기재된 rhGAA는 더 많은 양의 모노-M6P- 및 비스-M6P 보유 N-글리칸을 함유할 수 있고, 이는 특이적 조직, 예컨대, 근육 내로의 rhGAA의 생산적 흡수를 야기한다.

IV. N-연결 글리코실화 rhGAA의 생산 및 정제

그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 제10,961,522호에 기재된 바와 같이, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 세포가 본원에 기재된 rhGAA를 생산하는 데 사용될 수 있다. CHO 세포에서 고 M6P rhGAA를 발현하는 것이 번역 후에 rhGAA의 글리칸 프로파일을 변형시키는 것에 비해 적어도 부분적으로 유리한데, 왜냐하면 전자만이 글리칸 분해에 의해 최적의 글리코겐 가수분해를 갖는 rhGAA 형태로 전환되어 치료 효능을 강화할 수 있기 때문이다.

일부 구현예에서, rhGAA는 바람직하게는 본원에 기재된 rhGAA를 인코딩하는 DNA 작제물로 형질전환된 하나 이상의 CHO 세포주에 의해 생산된다. 이러한 CHO 세포주는 유전자의 다중 카피, 예컨대, GAA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5 개, 10 개, 15 개, 또는 20 개 이상의 카피를 함유할 수 있다. 산 α-글루코시다제의 대립유전자 변이체 또는 다른 변이체 산 α-글루코시다제 아미노산 서열, 예컨대, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일한 것들을 발현하는 DNA 작제물이 작제되고 CHO 세포에서 발현될 수 있다. 당업자는 이러한 DNA 작제물의 생산을 위해 CHO 세포를 형질전환시키는 데 적합한 대안적인 벡터를 선택할 수 있다.

이러한 CHO 세포주를 제조하는 방법은 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 제10,961,522호에 기재되어 있다. 간략하게, 이들 방법은 GAA 또는 GAA 변이체를 인코딩하는 DNA로 CHO 세포를 형질전환시키고, GAA를 인코딩하는 DNA가 이의 염색체(들) 내로 안정적으로 통합되고 GAA를 안정적으로 발현하는 CHO 세포를 선택하고, 모노-M6P 또는 비스-M6P를 보유하는 N-글리칸의 함량이 높은 GAA를 발현하는 CHO 세포를 선택하고, 선택적으로, 시알산 함량이 높은 N-글리칸을 갖고/갖거나 비-인산화 고-만노스 함량이 낮은 N-글리칸을 갖는 CHO 세포를 선택하는 것을 수반한다. CHO 세포주를 배양하고, CHO 세포의 배양물로부터 rhGAA 조성물을 회수함으로써, 선택된 CHO 세포주는 rhGAA 및 rhGAA 조성물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CHO 세포주로부터 생산된 rhGAA는 CIMPR을 표적화하는 모노-M6P 또는 비스-M6P를 보유하는 N-글리칸을 높은 함량으로 함유한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 생산된 rhGAA는 말단 갈락토스를 갖는 복합 N-글리칸의 수준이 낮다. 일부 구현예에서, 선택된 CHO 세포주는 GA-ATB200 또는 ATB200-X5-14로 지칭된다. 일부 구현예에서, 선택된 CHO 세포주는 이러한 CHO 세포 배양물의 계대배양물 또는 유도체를 포괄한다. 일부 구현예에서, 선택된 CHO 세포주로부터 생산된 rhGAA는 ATB200으로 지칭된다.

본원에 기재된 바와 같이 생산된 rhGAA는 미국 제10,227,577호 및 미국 가출원 제62/506,569호(이들 둘 모두는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법을 따름으로써 정제될 수 있다. CHO 세포주로부터 생산된 rhGAA를 생산, 포획 및 정제하기 위한 예시적인 프로세스는 도 3에 나타나 있다.

간략하게, 생물반응기(601)는 rhGAA를 발현하고 주위의 액체 배양 배지 내로 분비하는 세포, 예컨대, CHO 세포의 배양물을 함유한다. 생물반응기(601)는 세포 배양을 위한 임의의 적절한 생물반응기, 예컨대, 관류, 배치(batch) 또는 유가식(fed-batch) 생물반응기일 수 있다. 배양 배지는 세포가 rhGAA를 생산하기에 충분한 기간 후에 생물반응기로부터 제거된다. 이러한 배지 제거는 관류 생물반응기의 경우 연속식일 수 있거나 배치 또는 유가식 반응기의 경우 배치식일 수 있다. 여과 시스템(603)에 의해 배지를 여과하여 세포를 제거할 수 있다. 여과 시스템(603)은 교호 접선 유동 여과(ATF) 시스템, 접선 유동 여과(TFF) 시스템, 및/또는 원심분리 여과 시스템을 포함하는 임의의 적합한 여과 시스템일 수 있다. 다양한 구현예에서, 여과 시스템은 공극 크기가 약 10 나노미터 내지 약 2 마이크로미터인 필터를 이용한다.

여과 후, 여과액을 단백질 포획 시스템(605) 상에 로딩한다. 단백질 포획 시스템(605)은 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다. 하나 초과의 크로마토그래피 컬럼이 사용되는 경우, 제1 컬럼이 로딩되면 다음 컬럼이 로딩을 시작할 수 있도록 컬럼이 직렬로 배치될 수 있다. 대안적으로, 컬럼이 전환되는 시간 동안 배지 제거 프로세스가 정지될 수 있다.

다양한 구현예에서, 단백질 포획 시스템(605)은 rhGAA, 특히 높은 M6P 함량을 갖는 rhGAA의 직접적인 산물 포획을 위해 하나 이상의 음이온 교환(AEX) 컬럼을 포함한다. 단백질 포획 시스템(605)에 의해 포획된 rhGAA는 컬럼 내의 pH 및/또는 염 함량을 변화시킴으로써 컬럼(들)으로부터 용출된다. AEX 컬럼에 대한 예시적인 조건은 표 2에서 제공된다.

용출된 rhGAA는 추가 정제 단계 및/또는 품질 보증 단계를 거칠 수 있다. 예를 들어, 용출된 rhGAA는 바이러스 사멸 단계(607)를 거칠 수 있다. 이러한 바이러스 사멸(607)은 저 pH 사멸, 세제 사멸, 또는 당업계에 공지된 다른 기법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바이러스 사멸 단계(607)로부터의 rhGAA를 제2 크로마토그래피 시스템(609)에 도입하여 rhGAA 산물을 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 단백질 포획 시스템(605)으로부터의 용출된 rhGAA를 제2 크로마토그래피 시스템(609)에 직접적으로 공급할 수 있다. 다양한 구현예에서, 제2 크로마토그래피 시스템(609)은 불순물의 추가 제거를 위한 하나 이상의 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 컬럼을 포함한다. IMAC 컬럼에 대한 예시적인 조건은 하기 표 3에서 제공된다.

rhGAA가 제2 크로마토그래피 시스템(609) 상에 로딩된 후, 재조합 단백질이 컬럼(들)으로부터 용출된다. 용출된 rhGAA는 바이러스 사멸 단계(611)를 거칠 수 있다. 바이러스 사멸(607)과 같이, 바이러스 사멸(611)은 저 pH 사멸, 세제 사멸, 또는 당업계에 공지된 다른 기법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서는, 바이러스 사멸(607 또는 611) 중 단지 하나만 사용되거나, 바이러스 사멸이 정제 프로세스 내의 동일한 단계에서 수행된다.

바이러스 사멸 단계(611)로부터의 rhGAA를 제3 크로마토그래피 시스템(613)에 도입하여 재조합 단백질 산물을 추가로 정제할 수 있다. 대안적으로, 제2 크로마토그래피 시스템(609)으로부터의 용출된 재조합 단백질을 제3 크로마토그래피 시스템(613)에 직접적으로 공급할 수 있다. 다양한 구현예에서, 제3 크로마토그래피 시스템(613)은 불순물의 추가 제거를 위한 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 컬럼 및/또는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 포함한다. 그 후에, rhGAA 산물이 제3 크로마토그래피 시스템(613)으로부터 용출된다. CEX 컬럼에 대한 예시적인 조건은 하기 표 4에서 제공된다.

rhGAA 산물은 또한 추가 가공을 거칠 수 있다. 예를 들어, 또 다른 여과 시스템(615)을 사용하여 바이러스를 제거할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 여과는 5 μm 내지 50 μm의 공극 크기를 갖는 필터를 이용할 수 있다. 다른 산물 가공은 재조합 단백질 산물이 멸균되고/되거나, 여과되고/되거나, 농축되고/되거나, 저장되고/되거나, 최종 산물 제형을 위해 첨가된 추가적인 성분을 갖는 산물 조정 단계(617)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "ATB200"이라는 용어는 GA-ATB200 세포주로부터 생산되고 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된, 모노-M6P 및 비스-M6P를 보유하는 N-글리칸의 함량이 높은 rhGAA를 지칭한다.

V. 약학적 조성물

다양한 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA를 단독으로 또는 다른 치료제 및/또는 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

하나 이상의 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에서 사용된 약학적으로 허용되는 염은 약학적으로 허용되는 산 부가 염이다. 약학적으로 허용되는 산 부가 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 질산, 인산 등, 및 아세트산, 트리플루오로아세트산, 아디프산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 부티르산, 캄포르산, 캄포설폰산, 신남산, 시트르산, 디글루콘산, 에탄설폰산, 글루탐산, 글리콜산, 글리세로인산, 헤미설프산, 헥산산, 포름산, 푸마르산, 2-하이드록시에탄설폰산(이세티온산), 락트산, 하이드록시말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메시틸렌설폰산, 메탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 니코틴산, 2-나프탈렌설폰산, 옥살산, 파모산, 펙틴산, 페닐아세트산, 3-페닐프로피온산, 피발산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 설파닐산, 타르타르산, p-톨루엔설폰산, 운데칸산 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는 유기산을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 본원에서 사용된 약학적으로 허용되는 염은 약학적으로 허용되는 염기 부가 염이다. 약학적으로 허용되는 염기 부가 염은 암모니아, 또는 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등과 같은 금속 양이온 또는 암모늄의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 약학적으로 허용되는 유기 비독성 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 4차 아민 화합물, 천연 발생 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온-교환 수지를 포함하는 치환된 아민, 예컨대, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 이소프로필아민, 트리프로필아민, 트리부틸아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디사이클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카마인, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 테트라메틸암모늄 화합물, 테트라에틸암모늄 화합물, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 폴리아민 수지 등의 염을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, rhGAA 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 정맥내 투여용으로 적합한 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 멸균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에서의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제 및 가용화제도 포함할 수 있다. 약학적 조성물의 성분은 별개로 공급될 수 있거나, 단위 투여형으로, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 밀폐된 밀봉 용기 내의 건식 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 함께 혼합될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여될 경우, 이는 멸균 제약 등급 물(sterile pharmaceutical grade water), 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 일부 구현예에서, 주입은 병원 또는 진료소에서 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 주입은 병원 또는 진료소 환경 외부에서, 예를 들어, 대상체의 거주지에서 일어날 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.

일부 구현예에서, rhGAA 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 경구 투여될 수 있는 조성물은 즉각-, 지연-, 변형-, 지속-, 펄스- 또는 제어-방출 적용을 위해, 선택적으로 착향료 및 착색제와 함께, 정제, 캡슐, 오뷸, 엘릭서, 용액 또는 현탁액, 겔, 시럽, 구강 세정제, 또는 사용 전에 물 또는 다른 적절한 비히클로 재구성하기 위한 건조 분말의 형태로 제형화될 수 있다. 고체 조성물, 예컨대, 정제, 캡슐, 로젠지, 향정, 알약, 볼루스, 분말, 페이스트, 과립, 불릿, 당의정 또는 프리믹스 제제도 사용될 수 있다. 경구 용도의 고체 및 액체 조성물은 당업계에 널리 공지되어 있는 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제도 함유할 수 있다. 정제 또는 캡슐은 결합제, 충전제, 윤활제, 붕해제, 또는 습윤제를 포함하지만 이로 제한되지 않는 약학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 전호화 전분, 폴리비닐피롤리돈, 포비돈, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(HPMC), 하이드록시프로필 에틸셀룰로스(HPEC), 하이드록시프로필 셀룰로스(HPC), 수크로스, 젤라틴, 아카시아, 락토스, 미세결정질 셀룰로스, 인산수소칼슘, 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 글리세릴 베헤네이트, 탈크, 실리카, 옥수수, 감자 또는 타피오카 전분, 전분 글리콜산나트륨, 라우릴황산나트륨, 시트르산나트륨, 탄산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 글리신 크로스카르멜로스 나트륨, 및 복합 실리케이트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 정제는 당업계에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 코팅될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 미국 제10,512,676호 및 미국 가출원 제62/506,574호(둘 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물의 pH는 약 5.0 내지 약 7.0 또는 약 5.0 내지 약 6.0이다. 일부 구현예에서, pH는 약 5.5 내지 약 6.0의 범위이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물의 pH는 6.0이다. 일부 구현예에서, pH는 pH 조정제(예를 들어, 알칼리화제 및 산성화제), 예컨대, 수산화나트륨 및/또는 염산을 사용함으로써 표적 pH로 조정될 수 있다.

본원에 기재된 약학적 조성물은 완충제 시스템(buffer system), 예컨대, 시트레이트 시스템, 포스페이트 시스템 및 이의 조합을 포함할 수 있다. 시트레이트 및/또는 포스페이트는 시트르산나트륨 또는 인산나트륨일 수 있다. 다른 염은 칼륨 및 암모늄 염을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 완충제는 시트레이트를 포함한다. 추가 구현예에서, 완충제는 시트르산나트륨(예를 들어, 시트르산나트륨 탈수화물과 시트르산 일수화물의 혼합물)을 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 시트레이트를 포함하는 완충제 용액은 시트르산나트륨 및 시트르산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 시트레이트 및 포스페이트 완충제 둘 모두가 존재한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 적어도 하나의 부형제를 포함한다. 부형제는 강장제, 벌크화제, 및/또는 안정화제로서 기능할 수 있다. 강장제는 제형이 인간 혈액과 유사하거나 동일한 삼투압을 갖는 것을 보장하도록 돕는 성분이다. 벌크화제는 제형(예를 들어, 동결건조됨)에 질량을 부가하고 케이크에 충분한 구조를 제공하는 성분이다. 안정화제는 소수성 공기-물 계면 표면에서 응집체 형성을 방지 또는 최소화할 수 있는 화합물이다. 하나의 부형제가 강장제 및 벌크화제로서 동시에 기능할 수 있다. 예를 들어, 만니톨은 강장제로서 기능할 수 있고, 벌크화제로서의 이익도 제공할 수 있다.

강장제의 예는 염화나트륨, 만니톨, 수크로스 및 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, 강장제는 만니톨을 포함한다. 일부 구현예에서, 강장제(들)의 총량은 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 양의 범위이다. 추가 구현예에서, 강장제(들)의 총량은 약 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 또는 15 mg/mL 내지 약 16 mg/mL, 20 mg/mL, 25 mg/mL, 30 mg/mL, 35 mg/mL, 40 mg/mL, 45 mg/mL, 또는 50 mg/mL의 양의 범위이다.

일부 구현예에서, 부형제는 안정화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제는 계면활성제이다. 일부 구현예에서, 안정화제는 폴리소르베이트 80이다. 하나 이상의 구현예에서, 안정화제의 총량은 약 0.1 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL의 범위이다. 추가 구현예에서, 안정화제의 총량은 약 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 또는 0.5 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL, 또는 1.0 mg/mL의 범위이다. 또 다른 추가 구현예에서, 안정화제의 총량은 약 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.6 mg/mL, 0.7 mg/mL, 0.8 mg/mL, 0.9 mg/mL, 또는 1.0 mg/mL이다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 (a) rhGAA(예컨대, ATB200), (b) 시트레이트, 포스페이트 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충제, 및 (c) 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함하고, (i) 약 5.0 내지 약 6.0, 또는 (ii) 약 5.0 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 산성화제 및/또는 알칼리화제를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 (a) 약 5 mg/mL 내지 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 30 mg/mL, 또는 약 15 mg/mL의 농도의 rhGAA(예컨대, ATB200), (b) 약 10 mM 내지 100 mM 또는 약 25 mM의 농도의 시트르산나트륨 완충제, (c) 약 10 mg/mL 내지 50 mg/mL, 또는 약 20 mg/mL의 농도의 만니톨, (d) 약 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL, 약 0.2 mg/mL 내지 0.5 mg/mL, 또는 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80, 및 (e) 물을 포함하고, 약 6.0의 pH를 갖는다. 적어도 하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 (a) 15 mg/mL rhGAA(예컨대, ATB200) (b) 25 mM 시트르산나트륨 완충제, (c) 20 mg/mL 만니톨 (d) 0.5 mg/mL 폴리소르베이트 80, 및 (e) 물을 포함하고, 약 6.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 산성화제 및/또는 알칼리화제를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, rhGAA를 포함하는 약학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 전에 희석된다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 샤페론을 포함한다. 일부 구현예에서, 샤페론은 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다. 또 다른 구현예에서, 샤페론은 두보글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA는 하나의 약학적 조성물에서 제형화되는 한편, 샤페론, 예컨대, 미글루스타트는 또 다른 약학적 조성물에서 제형화된다. 일부 구현예에서, 미글루스타트를 포함하는 약학적 조성물은 ZAVESCA®(Actelion Pharmaceuticals)로서 상업적으로 입수 가능한 제형에 기반한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 케이크 또는 분말을 제공하기 위해 동결건조(냉동-건조) 프로세스를 거칠 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 동결건조 후의 rhGAA 조성물에 관한 것이다. 동결건조 혼합물은 본원에 기재된 rhGAA(예를 들어, ATB200), 시트레이트, 포스페이트 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 완충제, 및 트레할로스, 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 성분(예를 들어, 다른 부형제)이 동결건조 혼합물에 첨가될 수 있다. 동결건조 제형을 포함하는 약학적 조성물은 바이알로 제공될 수 있고, 그 후에 보관되고/되거나, 운반되고/되거나, 재구성되고/되거나, 환자에게 투여될 수 있다.

VI. 치료 방법

A. 질병 치료

본 개시의 또 다른 양태는 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물을 투여함으로써 글리코겐 저장 조절장애와 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 질병은 폼페병(산 말타제 결핍(AMD) 및 II형 글리코겐 저장병(GSD II)으로도 공지됨)이다. 일부 구현예에서, rhGAA는 ATB200이다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 ATB200을 포함한다. 또한, 폼페병을 치료하기 위한 rhGAA 또는 ATB200의 용도가 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 치료되는 대상체는 ERT-경험 환자이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 의해 치료되는 대상체는 ERT-미경험 환자이다.

본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 적절한 경로에 의해 투여된다. 일 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물은 정맥내 투여된다. 다른 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물은 표적 조직, 예컨대, 심장 또는 골격근(예를 들어, 근육내), 또는 신경계(예를 들어, 뇌 내로의 직접 주사; 뇌실내; 수막강내)로의 직접적인 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물은 경구 투여된다. 요망되는 경우, 하나 초과의 경로가 동시에 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 치료 효과는 하기 기준 중 하나 이상에 기반하여 평가될 수 있다: (1) 심장 상태(예를 들어, 확장 말기 및/또는 수축 말기 용적의 증가, 또는 GSD-II에서 전형적으로 발견되는 진행성 심근병증의 감소, 호전 또는 예방), (2) 폐 기능(예를 들어, 기준선 폐활량과 비교하여 울음 폐활량의 증가, 및/또는 우는 동안의 산소 불포화도의 정상화), (3) 신경발달 및/또는 운동 능력(예를 들어, AIMS 점수의 증가), 및 (4) 질병에 영향을 받는 개체의 조직 내의 글리코겐 수준의 감소.

일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 심장 상태가 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 개선된다. 확장 말기 및/또는 수축 말기 용적을 측정함으로써 및/또는 심근병증을 임상적으로 평가함으로써 대상체의 심장 상태를 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 폐 기능이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 개선된다. 특정 구현예에서, 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 개선이 달성된다. 특정 구현예에서, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물은 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 대상체의 폐 기능을 개선한다.

일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 폐 기능이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 개선된다. 기준선 폐활량에 비한 울음 폐활량, 및/또는 우는 동안의 산소 불포화도의 정상화에 의해 대상체의 폐 기능을 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 폐 기능이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 개선된다. 특정 구현예에서, 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 개선이 달성된다. 특정 구현예에서, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물은 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 대상체의 폐 기능을 개선한다.

일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 신경발달 및/또는 운동 능력이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 개선된다. 대상체의 신경발달 및/또는 운동 능력은 AIMS 점수를 결정함으로써 평가될 수 있다. AIMS는 임상의가 시행 및 채점하는 12 개 항목의 앵커링 척도(anchored scale)이다(문헌[Rush JA Jr., Handbook of Psychiatric Measures, American Psychiatric Association, 2000, 166-168] 참조). 항목 1 내지 항목 10은 5 점 앵커링 척도로 평가된다. 항목 1 내지 항목 4는 구강안면 운동을 평가한다. 항목 5 내지 항목 7은 사지 및 몸통 운동이상을 다룬다. 항목 8 내지 항목 10은 검사자가 판단한 바와 같은 전반적인 중증도, 및 환자가 운동 및 이와 연관된 고통을 자각하는 것을 다룬다. 항목 11 내지 항목 12는 치아 및/또는 의치의 문제(이러한 문제는 운동이상을 잘못 진단하는 것을 야기할 수 있음)에 관한 예/아니오 질문이다. 일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 신경발달 및/또는 운동 능력이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 개선된다. 특정 구현예에서, 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 개선이 달성된다. 특정 구현예에서, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물은 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 대상체의 신경발달 및/또는 운동 능력을 개선한다.

일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 특정 조직의 글리코겐 수준이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 감소된다. 일부 구현예에서, 조직은 근육, 예컨대, 사두근, 삼두근, 및 비복근이다. 당업계에 공지된 방법을 사용하여 조직의 글리코겐 수준을 분석할 수 있다. 아밀로글루코시다제 소화에 기반한 글리코겐 수준의 결정은 널리 공지되어 있고, 문헌[Amalfitano et al. (1999), "Systemic correction of the muscle disorder glycogen storage disease type ii after hepatic targeting of a modified adenovirus vector encoding human acid-alphaglucosidase," Proc Natl Acad Sci USA, 96:8861-8866]과 같은 간행물에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 대상체의 근육 내 글리코겐 수준이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 감소된다. 특정 구현예에서, 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 감소가 달성된다. 특정 구현예에서, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물은 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 대상체의 근육 내 글리코겐 수준을 감소시킨다.

B. 바이오마커

대상체에서 글리코겐 축적의 바이오마커, 예컨대, 소변 육탄당 사당류(Hex4)를 사용하여, 폼페병이 있는 대상체에서 효소 대체 요법의 치료 효과를 평가 및 비교할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에서 소변 Hex4의 수준을 측정함으로써 글리코겐 축적에 대한 rhGAA 또는 rhGAA를 포함하는 약학적 조성물의 치료 효과가 평가된다.

근육 상해 또는 손상의 바이오마커, 예컨대, 크레아틴 키나제(CK), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)를 사용하여, 폼페병이 있는 대상체에서 효소 대체 요법의 치료 효과를 평가 및 비교할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에서 CK, ALT, 및/또는 AST의 수준을 측정함으로써 근손상에 대한 rhGAA 또는 rhGAA를 포함하는 약학적 조성물의 치료 효과가 평가된다. 적어도 하나의 구현예에서, 대상체에서 CK의 수준을 측정함으로써 근손상에 대한 rhGAA 또는 rhGAA를 포함하는 약학적 조성물의 치료 효과가 평가된다.

LAMP-1, LC3, 및 디스펄린과 같은 바이오마커는 또한, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 치료 효과를 평가 및 비교하기 위해 사용될 수 있다. 폼페병에서, GAA가 리소좀 글리코겐을 가수분해하지 못하면, 일부 조직에서 글리코겐으로 채워진 대형 리소좀이 비정상적으로 축적된다(Raben et al., JBC 273: 19086-19092, 1998.). 폼페병의 마우스 모델에서의 연구에 의해, 골격근 내의 확대된 리소좀이 기계적 수행의 감소의 충분한 원인이 될 수 없다는 것, 및 분해된 근원섬유를 함유하는 대형 봉입체의 존재(즉, 자가포식 증강)가 근육 기능의 손상에 기여하는 것으로 나타났다(Raben et al., Human Mol Genet 17: 3897-3908, 2008.). 손상된 자가포식 플럭스가 폼페 환자에서의 불량한 치료 결과와 연관되어 있다는 것도 보고서에서 시사되었다(Nascimbeni et al., Neuropathology and Applied Neurobiology doi: 10.1111/nan.12214, 2015; Fukuda et al., Mol Ther 14: 831-839, 2006.). 추가적으로, 후기 발병 폼페병은 다양한 중증도의 30가지 초과의 유전적으로 정의된 서브타입을 갖는 유전적으로 이질적인 신경근육 질병의 그룹인 미분류 지대근디스트로피(LGMD)에서 우세하다(Preisler et al., Mol Genet Metab 110: 287-289, 2013). IHC 검사에서, Gaa KO 마우스의 골격근 섬유 내의 디스펄린의 실질적으로 상승된 근형질 존재가 밝혀졌다.

다양한 공지된 방법을 이용하여 이러한 바이오마커의 유전자 발현 수준 및/또는 단백질 수준을 측정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물로 치료된 대상체로부터의 샘플, 예컨대, 조직, 특히 근육의 생검체를 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 대상체 내의 근육의 생검체이다. 일부 구현예에서, 근육은 사두근, 삼두근 및 비복근으로부터 선택된다. 대상체로부터 얻어진 샘플을 이러한 바이오마커를 검출하는 하나 이상의 항체 또는 다른 검출제로 염색할 수 있거나, 질량 분광법에 의해 확인 및 정량화할 수 있다. 샘플은 또한 또는 대안적으로, 예를 들어, RT-qPCR 방법을 통해, 바이오마커를 인코딩하는 핵산, 예컨대, mRNA의 존재를 검출하기 위해 가공될 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 유전자 발현 수준 및/또는 단백질 수준은 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물을 이용한 치료 전 및 후에 개체로부터 얻어진 근육 생검체에서 측정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 바이오마커의 유전자 발현 수준 및/또는 단백질 수준은 비히클로 치료된 개체로부터 얻어진 근육 생검체에서 측정된다. 일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 하나 이상의 바이오마커의 유전자 발현 수준 및/또는 단백질 수준이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 감소된다. 일부 구현예에서, 비히클로 치료된 대상체 또는 치료 전의 대상체와 비교하여, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물의 1 회 이상의 투여량의 투여 후에 하나 이상의 바이오마커의 유전자 발현 수준 및/또는 단백질 수준이 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%(또는 이들 사이의 임의의 백분율) 감소된다. 특정 구현예에서, 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 감소가 달성된다. 특정 구현예에서, ATB200 또는 ATB200을 포함하는 약학적 조성물은 투여로부터 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상(또는 이들 사이의 임의의 기간) 후에 하나 이상의 바이오마커의 유전자 발현 수준 및/또는 단백질 수준을 감소시킨다.

C. rhGAA의 투여량

약학적 제형 또는 재구성된 조성물이 치료적 유효량(예를 들어, 규칙적인 간격으로 투여될 때, 예컨대, 질병과 연관된 증상을 호전시킴으로써, 질병의 발병을 지연시킴으로써, 및/또는 질병의 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시킴으로써, 질병을 치료하는 데 충분한 투여량)으로 투여된다. 질병 치료에서 치료적으로 효과적인 양은 질병 효과의 성질 및 정도에 좌우될 수 있고, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로, 시험관내 또는 생체내 검정은 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 이용될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 rhGAA를 포함하는 약학적 조성물은 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 예컨대, 약 5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg, 전형적으로 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 90 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg, 또는 100 mg/kg의 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물은 약 20 mg/kg의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물은 약리학적 샤페론과 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 약리학적 샤페론은 미글루스타트이다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 260 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 195 mg의 경구 용량으로 투여된다. 특정 개체에 대한 유효 용량은 개체의 요구에 따라, 시간 경과에 따라 변할 수 있다(예를 들어, 증가 또는 감소될 수 있다). 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 있는 시기에, 또는 항-산 α-글루코시다제 항체가 존재하게 되거나 증가되는 경우, 또는 질병 증상이 악화되는 경우, rhGAA 및/또는 미글루스타트의 양이 조정될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 치료적 유효 용량은 통상적인 rhGAA 산물보다 더 낮다. 예를 들어, 통상적인 rhGAA 산물의 치료적 유효 용량이 20 mg/kg이면, 통상적인 rhGAA 산물과 동일하거나 이보다 더 우수한 치료 효과를 내는 데 요구되는 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 용량은 20 mg/kg보다 낮을 수 있다. 상기 논의된 하나 이상의 기준(예를 들어, 심장 상태, 글리코겐 수준, 또는 바이오마커 발현)에 기반하여 치료 효과를 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 치료적 유효 용량은 통상적인 rhGAA 산물보다 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 더 낮다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 치료 효과는 운동 기능의 개선, 근력(상체, 하체 또는 전신)의 개선, 폐 기능의 개선, 피로의 감소, 근육 상해의 적어도 하나의 바이오마커의 수준 감소, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 바이오마커의 수준 감소, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 치료 효과는 근섬유 내의 리소좀 병리의 역전, 근섬유 내의 글리코겐 함량의 더 신속하고/하거나 더 효과적인 감소, 6 분 보행 검사 거리의 증가, 일어나 걷기 검사 시간의 감소, 4 계단 오르기 검사 시간의 감소, 10 미터 보행 검사 시간의 감소, 보행-계단-고워-의자 점수의 감소, 상지 힘의 증가, 어깨 내전의 개선, 어깨 외전의 개선, 팔꿈치 굽힘의 개선, 팔꿈치 폄의 개선, 상체 힘의 개선, 하체 힘의 개선, 전신 힘의 개선, 직립(좌위) 강제 폐활량의 개선, 최대 호기압의 개선, 최대 흡기압의 개선, 피로 중증도 척도 점수의 감소, 소변 육탄당 사당류 수준의 감소, 크레아틴 키나제 수준의 감소, 알라닌 아미노트랜스퍼라제 수준의 감소, 아스파레이트 아미노트랜스퍼라제 수준의 감소, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 동일한 용량으로 투여될 때 통상적인 rhGAA 산물보다 더 신속하게 요망되는 치료 효과를 달성한다. 상기 논의된 하나 이상의 기준(예를 들어, 심장 상태, 글리코겐 수준, 또는 바이오마커 발현)에 기반하여 치료 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 단일 용량의 통상적인 rhGAA 산물이 치료된 개체의 조직 내의 글리코겐 수준을 1 주일 내에 10% 감소시키면, 동일한 용량의 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물이 투여될 때 1 주일 미만 내에 동일한 정도의 감소가 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 용량으로 투여될 때, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 통상적인 rhGAA 산물보다 적어도 약 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 3.0 이상 더 신속하게 요망되는 치료 효과를 달성할 수 있다.

일부 구현예에서, 치료적 유효량의 rhGAA(또는 rhGAA를 포함하는 조성물 또는 약제)가 1 회 넘게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 질병 효과의 성질 및 정도에 따라, 그리고 지속적으로 규칙적인 간격으로 투여된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "규칙적인 간격"의 투여는 치료적 유효량이 (1 회 용량과는 구별되는 바와 같이) 주기적으로 투여된다는 것을 나타낸다. 간격은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, rhGAA는 격월, 매월, 격주, 매주, 주 2 회, 또는 매일 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 주 2 회, 매주, 또는 격주로 정맥내 투여된다. 단일 개체에 대한 투여 간격은 고정된 간격일 필요는 없고, 개체의 필요에 따라, 시간 경과에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 신체적 병 또는 스트레스가 있는 시기에, 항-rhGAA 항체가 존재하게 되거나 증가되는 경우, 또는 질병 증상이 악화되는 경우, 용량 사이의 간격이 감소될 수 있다.

일부 구현예에서, 동일한 용량으로 사용되는 경우, 본원에 기재된 바와 같은 rhGAA 또는 약학적 조성물은 통상적인 rhGAA 산물보다 덜 빈번하게 투여될 수 있지만, 통상적인 rhGAA 산물과 동일하거나 이보다 더 우수한 치료 효과를 낼 수 있다. 예를 들어, 통상적인 rhGAA 산물이 매주 20 mg/kg으로 투여되면, 본원에 기재된 바와 같은 rhGAA 또는 약학적 조성물은, 덜 빈번하게, 예를 들어, 격주 또는 매월 투여되더라도, 20 mg/kg으로 투여될 때의 통상적인 rhGAA 산물과 동일하거나 이보다 더 우수한 치료 효과를 낼 수 있다. 상기 논의된 하나 이상의 기준(예를 들어, 심장 상태, 글리코겐 수준, 또는 바이오마커 발현)에 기반하여 치료 효과를 평가할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물의 2 회 용량 사이의 간격은 통상적인 rhGAA 산물보다 더 길다. 일부 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물의 2 회 용량 사이의 간격은 통상적인 rhGAA 산물보다 적어도 약 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 3.0 이상 더 길다.

일부 구현예에서, 동일한 치료 조건(예를 들어, 동일한 간격으로 투여된 동일한 용량) 하에, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 통상적인 rhGAA 산물에 의해 제공되는 것보다 더 우수한 정도의 치료 효과를 제공한다. 상기 논의된 하나 이상의 기준(예를 들어, 심장 상태, 글리코겐 수준, 또는 바이오마커 발현)에 기반하여 치료 효과를 평가할 수 있다. 예를 들어, 매주 20 mg/kg으로 투여된 통상적인 rhGAA 산물과 비교할 경우, 매주 20 mg/kg으로 투여된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 치료된 개체의 조직 내의 글리코겐 수준을 더 높은 정도로 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 치료 조건 하에 투여될 때, 본원에 기재된 rhGAA 또는 약학적 조성물은 통상적인 rhGAA 산물보다 적어도 약 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 3.0 이상 더 큰 치료 효과를 제공한다.

D. 2-성분 요법

하나 이상의 구현예에서, 본원에 기재된 rhGAA 또는 rhGAA를 포함하는 약학적 조성물은 약리학적 샤페론과 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA 또는 약학적 조성물은 약리학적 샤페론과 비교하여 상이한 경로를 통해 투여된다. 예를 들어, 약리학적 샤페론은 경구 투여될 수 있는 반면, rhGAA 또는 약학적 조성물은 정맥내 투여된다.

다양한 구현예에서, 약리학적 샤페론은 미글루스타트이다. 임의의 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 공동 투여될 때, 미글루스타트는 ATB200을 체순환에서의 변성으로부터 안정화시켜, 리소좀으로의 활성 성분 ATB200의 전달을 강화하는 것으로 사료된다.

일부 구현예에서, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 600 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 600 mg의 경구 용량, 또는 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg, 또는 약 600 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 233 mg 내지 약 500 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 250 내지 약 270 mg의 경구 용량, 또는 약 250 mg, 약 255 mg, 약 260 mg, 약 265 mg 또는 약 270 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 260 mg의 경구 용량으로 투여된다.

당업자는 성인 환자에게 환자의 체중에 따라 약 200 mg 내지 600 mg의 범위 또는 그 사이의 임의의 더 작은 범위의 미글루스타트의 경구 용량이 적합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 영아, 아동, 또는 저체중 성인을 포함하지만 이로 제한되지 않는, 약 70 kg 미만의 유의미하게 더 낮은 체중을 갖는 환자의 경우, 의사는 더 작은 용량을 적합한 것으로 간주할 수 있다. 따라서, 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 200 mg의 경구 용량, 또는 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 125 mg, 약 130 mg, 약 150 mg, 약 175 mg, 약 195 mg, 약 200 mg, 또는 약 260 mg의 경구 용량으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 약 65 mg 내지 약 195 mg의 경구 용량으로, 또는 약 65 mg, 약 130 mg, 또는 약 195 mg의 경구 용량으로 투여된다.

일부 구현예에서, rhGAA는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 600 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 50 mg 내지 약 200 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 600 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 200 mg 내지 약 500 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일 구현예에서, rhGAA는 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 260 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일부 구현예에서, rhGAA는 약 5 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 130 mg 내지 약 200 mg의 용량으로 경구 투여된다. 일 구현예에서, rhGAA는 약 20 mg/kg의 용량으로 정맥내 투여되고, 미글루스타트는 약 195 mg의 용량으로 경구 투여된다.

일부 구현예에서, 미글루스타트 및 rhGAA는 동시에 투여된다. 예를 들어, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 전 또는 후 10 분, 9 분, 8 분, 7 분, 6 분, 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 또는 1 분 이내에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 전 또는 후 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 또는 1 분 이내에 투여된다.

일부 구현예에서, 미글루스타트 및 rhGAA는 순차적으로 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 3 시간 미만 전에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 약 2 시간 전에 투여된다. 예를 들어, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 약 1.5 시간, 약 1 시간, 약 50 분, 약 30 분, 또는 약 20 분 전에 투여될 수 있다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 약 1 시간 전에 투여된다.

일부 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 후에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 후 3 시간 이내에 투여된다. 적어도 하나의 구현예에서, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 후 2 시간 이내에 투여된다. 예를 들어, 미글루스타트는 rhGAA의 투여 후 약 1.5 시간, 약 1 시간, 약 50 분, 약 30 분, 또는 약 20 분 이내에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 대상체는 미글루스타트의 투여 전 적어도 2 시간 동안 및 투여 후 적어도 2 시간 동안 금식한다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 폼페병이 있는 대상체에서 하나 이상의 질병 증상을 개선한다. 이러한 대조군 치료에서는, 약리학적 샤페론 대신에 위약이 투여되었다. 일부 구현예에서, 2-성분 요법으로 치료되는 대상체는 ERT-경험 환자이다. 일부 구현예에서, 2-성분 요법으로 치료되는 대상체는 ERT-미경험 환자이다.

일부 구현예에서, 본 개시에 따른 2-성분 요법은 보행, 계단, 고워, 의자(GSGC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선한다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 12 주, 26 주, 38 주 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.1 점, 0.3 점, 0.5 점, 0.7 점, 1.0 점, 1.5 점, 또는 2.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선된다. 일부 구현예에서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 12 주, 26 주, 38 주 또는 52 주의 치료 후에 적어도 0.3 점, 0.5 점, 0.7 점, 1.0 점, 1.5 점, 2.5 점, 또는 5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 유의미하게 개선된다. 일부 구현예에서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1.0 점의 감소로 나타나는 바와 같이 유의미하게 개선된다.

E. 키트

본 개시의 또 다른 양태는 본원에 기재된 rhGAA 요법을 수행하기에 적합한 키트에 관한 것이다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 rhGAA 또는 약학적 조성물(동결건조 전 또는 후)을 포함하는 용기(예를 들어, 바이알, 튜브, 백 등), 및 재구성, 희석 및 투여에 대한 설명서를 포함한다. 하나 이상의 구현예에서, 키트는 약리학적 샤페론(예를 들어, 미글루스타트) 및 rhGAA를 포함하는 약학적 조성물(동결건조 전 또는 후)을 포함하는 용기(예를 들어, 바이알, 튜브, 백 등), 및 약리학적 샤페론과 함께 rhGAA의 재구성, 희석, 및 투여에 대한 설명서를 포함한다.

실시예

실시예 1: 모노- 또는 비스-M6P-보유 N-글리칸의 함량이 높은 rhGAA를 생산하는 CHO 세포의 제조.

DG44 CHO(DHFR-) 세포를 rhGAA를 발현하는 DNA 작제물로 형질감염시켰다. DNA 작제물은 도 4에 나타나 있다. 형질감염 후, 안정적으로 통합된 GAA 유전자를 함유하는 CHO 세포를 하이포크산틴/티미딘 결핍(-HT) 배지를 사용하여 선택하였다. 메토트렉세이트 처리(MTX, 500 nM)에 의해 이들 세포에서의 GAA 발현을 유도하였다.

다량의 GAA를 발현한 세포 풀(cell pool)을 GAA 효소 활성 검정에 의해 확인하고, rhGAA를 생산하는 개별적인 클론을 확립하는 데 사용하였다. 개별적인 클론을 반고체 배지 플레이트 상에서 생성하고, ClonePix 시스템에 의해 피킹하고, 24-딥 웰 플레이트로 옮겼다. 개별적인 클론을 GAA 효소 활성에 대해 검정하여, 높은 수준의 GAA를 발현하는 클론을 확인하였다. GAA 활성을 결정하기 위한 컨디셔닝된 배지는 4-MU-α-글루코시다제 기질을 사용하였다. GAA 효소 검정에 의해 측정 시 더 높은 수준의 GAA를 생산하는 클론을 생존력, 성장 능력, GAA 생산성, N-글리칸 구조 및 안정적인 단백질 발현에 대해 추가로 평가하였다. 강화된 모노-M6P 또는 비스-M6P N-글리칸을 갖는 rhGAA를 발현하는, CHO 세포주 GA-ATB200을 포함하는 CHO 세포주를 이러한 절차를 사용하여 단리하였다.

실시예 2: rhGAA의 정제

본 개시에 따른 rhGAA의 다중 배치를 CHO 세포주 GA-ATB200을 사용하여 진탕 플라스크 및 관류 생물반응기에서 생산하였고, 이의 산물은 "ATB200"으로 지칭된다. 약한 음이온 교환("WAX") 액체 크로마토그래피를 사용하여 말단 포스페이트 및 시알산에 따라 ATB200 rhGAA를 분획화하였다. 염의 양을 증가시키면서 ERT를 용출시킴으로써 용출 프로파일을 생성하였다. 프로파일을 UV(A280 nm)에 의해 모니터링하였다. 유사한 CIMPR 수용체 결합(적어도 약 70%) 프로파일이 상이한 생산 배치로부터의 정제된 ATB200 rhGAA에 대해 관찰되었는데(도 5), 이는 ATB200 rhGAA가 일관되게 생산될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3: ATB200 rhGAA의 올리고당류 특징규명

ATB200 rhGAA를 상이한 LC-MS/MS 분석 기법을 사용하여 부위-특이적 N-글리칸 프로파일에 대해 분석하였다. 처음 2 개의 LC-MS/MS 방법의 결과는 도 6a 내지 도 6h에 나타나 있다. 2-AA 글리칸 맵핑과 제3 LC-MS/MS 방법의 결과는 도 19a 내지 도 19h, 도 20a 및 도 20b, 및 표 5에 나타나 있다.

제1 LC-MS/MS 분석에서, LC-MS/MS 분석 전에 단백질이 변성, 환원, 알킬화 및 소화되었다. 단백질 변성 및 환원 동안, 100 μL의 총 부피를 제공하도록 200 μg의 단백질 샘플, 5 μL의 1 mol/L 트리스-HCl(최종 농도 50 mM), 75 μL의 8 mol/L 구아니딘 HCl(최종 농도 6 M), 1 μL의 0.5 mol/L EDTA(최종 농도 5 mM), 2 μL의 1 mol/L DTT(최종 농도 20 mM), 및 Milli-Q® 수를 1.5 mL 튜브에 첨가하였다. 샘플을 혼합하고, 56℃에서 30 분 동안 건조 배쓰에서 인큐베이션시켰다. 알킬화 동안, 변성 및 환원된 단백질 샘플을 5 μL의 1 mol/L 아이오도아세트아미드(IAM, 최종 농도 50 mM)와 혼합한 후, 암소에서 30 분 동안 10℃ 내지 30℃에서 인큐베이션시켰다. 알킬화 후, 400 μL의 사전냉각된 아세톤을 샘플에 첨가하고, 혼합물을 4 시간 동안 -80℃ 냉동에서 동결시켰다. 그 후에, 샘플을 4℃에서 5 min 동안 13000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 400 μl의 사전냉각된 아세톤을 펠릿에 첨가한 후, 이를 4℃에서 5 min 동안 13000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 그 후에, 샘플을 암소에서 얼음 위에서 공기 건조시켜 아세톤 잔기를 제거하였다. 40 마이크로리터의 8 M 요소 및 160 μL의 100 mM NH₄HCO₃를 샘플에 첨가하여 단백질을 용해시켰다. 그 후에, 트립신 소화 동안, 50 μg의 단백질에 트립신 소화 완충제를 100 μL의 최종 부피까지 첨가하고, 5 μL의 0.5 mg/mL 트립신(20/1 w/w의 단백질 대 효소 비)을 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고, 37℃에서 밤새(16 ± 2 시간) 인큐베이션시켰다. 2.5 마이크로리터의 20% TFA(최종 농도 0.5%)를 첨가하여 반응물을 켄칭시켰다. 그 후에, 샘플을 Thermo Scientific™ Orbitrap Velos Pro™ 질량 분광기를 사용하여 분석하였다.

제2 LC-MS/MS 분석에서, 아이오도아세트산(IAA)이 IAM 대신 알킬화 시약으로 사용된 것을 제외하고는 유사한 변성, 환원, 알킬화 및 소화 절차에 따라 ATB200 샘플을 제조한 후, Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™ 질량 분광기를 사용하여 분석하였다.

제1 및 제2 분석의 결과는 도 6a 내지 도 6h에 나타나 있다. 도 6a 내지 도 6h에서, 제1 분석의 결과는 좌측 막대(진회색)로 표시되고, 제2 분석으로부터의 결과는 우측 막대(연회색)로 표시된다. 글리칸 표현에 대한 기호 명명법은 문헌[Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009)]에 따른다.

도 6a 내지 도 6h로부터 알 수 있는 바와 같이, 두 분석이 유사한 결과를 제공하였지만, 결과 사이에는 약간의 편차가 있었다. 이러한 편차는 사용된 기구 및 N-글리칸 분석의 완전성을 포함하는 다수의 요인들에 기인할 수 있다. 예를 들어, 인산화 N-글리칸의 일부 종이 확인되지 않았고/않았거나 정량화되지 않은 경우, 인산화 N-글리칸의 총 개수가 과소표시될 수 있고, 이러한 부위에 인산화 N-글리칸을 보유하는 rhGAA의 백분율이 과소표시될 수 있다. 또 다른 예로서, 비-인산화 N-글리칸의 일부 종이 확인되지 않았고/않았거나 정량화되지 않은 경우, 비-인산화 N-글리칸의 총 개수가 과소표시될 수 있고, 이러한 부위에 인산화 N-글리칸을 보유하는 rhGAA의 백분율이 과대표시될 수 있다.

도 6a는 ATB200의 N-글리코실화 부위 점유율을 보여준다. 도 6a로부터 알 수 있는 바와 같이, 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 N-글리코실화 부위는 대부분 점유되어 있고, 이때 두 분석 모두에서 ATB200 효소의 대략 90% 또는 90% 초과 및 최대 약 100%가 각각의 잠재적 N-글리코실화 부위에서 검출된 N-글리칸을 갖는 것이 검출된다. 그러나, 제7 잠재적 N-글리코실화 부위는 약 절반의 시간으로 N-글리코실화된다.

도 6b는 제1 잠재적 N-글리코실화 부위인 N84의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 6b로부터 알 수 있는 바와 같이, 주요 N-글리칸 종은 비스-M6P N-글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 75% 초과의 ATB200이 제1 부위에 비스-M6P를 갖는 것이 검출되었고, 이는 제1 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 0.8 mol의 비스-M6P에 상응한다.

도 6c는 제2 잠재적 N-글리코실화 부위인 N177의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 6c로부터 알 수 있는 바와 같이, 주요 N-글리칸 종은 모노-M6P N-글리칸 및 비-인산화 고 만노스 N-글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 40% 초과의 ATB200이 제2 부위에 모노-M6P를 갖는 것이 검출되었고, 이는 제2 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 모노-M6P에 상응한다.

도 6d는 제3 잠재적 N-글리코실화 부위인 N334의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 6d로부터 알 수 있는 바와 같이, 주요 N-글리칸 종은 비-인산화 고 만노스 N-글리칸, 디-, 트리-, 및 테트라-안테나 복합 N-글리칸, 및 하이브리드 N-글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 20% 초과의 ATB200이 제3 부위에 시알산 잔기를 갖는 것이 검출되었고, 이는 제3 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 0.9 mol 내지 약 1.2 mol의 시알산에 상응한다.

도 6e는 제4 잠재적 N-글리코실화 부위인 N414의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 6e로부터 알 수 있는 바와 같이, 주요 N-글리칸 종은 비스-M6P 및 모노-M6P N-글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 40% 초과의 ATB200이 제4 부위에 비스-M6P를 갖는 것이 검출되었고, 이는 제4 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 0.4 mol 내지 약 0.6 mol의 비스-M6P에 상응한다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 25% 초과의 ATB200이 제4 부위에 모노-M6P를 갖는 것도 검출하였고, 이는 제4 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 0.3 mol 내지 약 0.4 mol의 모노-M6P에 상응한다.

도 6f는 제5 잠재적 N-글리코실화 부위인 N596의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 6f로부터 알 수 있는 바와 같이, 주요 N-글리칸 종은 푸코실화 디-안테나 복합 N-글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 70% 초과의 ATB200이 제5 부위에 시알산 잔기를 갖는 것이 검출되었고, 이는 제5 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 0.8 mol 내지 약 0.9 mol의 시알산에 상응한다.

도 6g는 제6 잠재적 N-글리코실화 부위인 N826의 N-글리코실화 프로파일을 보여준다. 도 6g로부터 알 수 있는 바와 같이, 주요 N-글리칸 종은 디-, 트리-, 및 테트라-안테나 복합 N-글리칸이다. 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 80% 초과의 ATB200이 제6 부위에 시알산 잔기를 갖는 것이 검출되었고, 이는 제6 부위에서 ATB200의 mol 당 평균 약 1.5 mol 내지 약 1.8 mol의 시알산에 상응한다.

제7 부위인 N869에서의 N-글리코실화의 분석은 대략 40% N-글리코실화를 나타냈고, 이때 가장 일반적인 N-글리칸은 A4S3S3GF(12%), A5S3G2F(10%), A4S2G2F(8%) 및 A6S3G3F(8%)였다.

도 6h는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위 각각에서의 인산화의 요약을 보여준다. 도 6h로부터 알 수 있는 바와 같이, 제1 및 제2 분석 둘 모두에서 제1, 제2 및 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에서 높은 인산화 수준을 검출하였다. 두 분석 모두에서 ATB200의 80% 초과가 제1 부위에서 모노- 또는 비스-인산화되었고, ATB200의 40% 초과가 제2 부위에서 모노-인산화되었으며, ATB200의 80% 초과가 제4 부위에서 모노- 또는 비스-인산화된 것을 검출하였다.

ATB200의 또 다른 N-글리코실화 분석을 하기 기재된 바와 같은 LC-MS/MS 방법에 따라 수행하였다. 이러한 분석에서 10 개의 ATB200 로트에 걸쳐 평균 N-글리코실화 프로파일이 산출되었다(도 19a 내지 도 19h, 도 20a 및 도 20b).

ATB200으로부터의 N-연결 글리칸을 PNGase-F로 효소적으로 방출시키고, 2-안트라닐산(2-AA)으로 표지하였다. 2-AA 표지 N-글리칸을 고체상 추출(SPE)에 의해 추가로 가공하여 과량의 염 및 다른 오염물을 제거하였다. 정제된 2-AA N-글리칸을 아세토니트릴/물(20/80; v/v)에 용해시키고, 10 마이크로그램을, 형광 검출을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-FLD) 및 고분해능 질량 분광법(HRMS) 분석을 위해 아미노-폴리머 분석 컬럼(apHera™, Supelco) 상에 로딩하였다.

이동상 A(아세토니트릴 중 2% 아세트산) 및 이동상 B(5% 아세트산; 수산화암모늄을 이용하여 pH 4.3으로 조정된 물 중 20 밀리몰 아세트산암모늄)를 갖는 구배 용출 모드로 순상 조건 하에 액체 크로마토그래피(LC) 분리를 수행하였다. 초기 이동상 조성은 70% A/30% B였다. 형광 검출을 위해, 검출기(RF-20Axs, Shimadzu)에 대한 파라미터는 여기(Ex):320 nm; 방출(Em):420 nm였다. 독립적 데이터 획득(IDA) 모드로 작동되는 사중극자 비행 시간 질량 분광기(Sciex X500B QTOF)를 사용하여 HRMS 분석을 수행하였다. 획득된 데이터파일을 ProteoWizard로부터의 MSConvert를 사용하여 mzML 파일로 변환한 후, 글리칸 데이터베이스를 검색하고, 이어서 확인된 N-글리칸에 주석을 달기 위해 GRITS 툴박스 1.2 모닝 블렌드 소프트웨어(GRITS Toolbox 1.2 Morning Blend software)(UGA)를 이용하였다. 전구체 단일동위원소 질량(m/z)과 산물 이온 m/z 둘 모두를 사용하여 N-글리칸을 확인하였다. 글리코워크벤치(GlycoWorkbench) 2 어플리케이션을 사용하여 실험 산물 이온 및 단편화 패턴을 인-실리코로 확인하였다.

ATB200으로부터의 N-연결 글리칸의 상대적 정량화를 결정하기 위해, HPLC-FLD-QTOF MS/MS 실험으로부터 획득된 데이터를 하기와 같이 가공하였다. FLD 크로마토그램 내의 모든 N-글리칸 피크를 통합하고, 각각의 피크에 FLD 크로마토그램 내의 모든 피크의 총 면적의 백분율을 할당하였다. 피크 면적으로 표현된 형광 신호는 샘플 내의 각각의 N-글리칸의 양의 정량적 척도이다. 그러나, 대부분의 경우에, 다중 N-글리칸 종을 동일한 FLD 피크 내에 포함시켰다. 따라서, 각각의 N-글리칸 종의 상대적 정량화(표 5)를 얻기 위해 질량 분광기 데이터도 필요하였다. 각각의 N-글리칸에 대한 이온 강도 신호를 데이터로부터 "추출"하여, 추출 이온 크로마토그램(XIC)으로 불리는 크로마토그래피 피크를 생성하였다. XIC는 FLD 크로마토그래피 피크와 정렬되었고, 오직 하나의 N-글리칸 종에 대해 특이적이었다. 그 후에, 이온 강도 신호로부터 생성된 XIC 피크를 통합하였고, 이러한 피크 면적은 존재하는 글리칸의 양의 상대적인 정량적 척도이다. FLD 피크 면적 및 질량 분광기 XIC 피크 면적 둘 모두를 사용하여, 본원에서 보고된 ATB200의 모든 N-연결 글리칸 종의 상대적 정량화를 가능하게 하였다.

이러한 LC-MS/MS 분석의 결과는 하기 표 5에서 제공된다. 글리칸 표시를 위한 기호 명명법은 문헌[Wopereis W, et al. 2006. Abnormal glycosylation with hypersialylated O-glycans in patients with Sialuria. Biochimica et Biophysica Acta. 1762:598-607; Gornik O, et al. 2007. Changes of serum glycans during sepsis and acute pancreatitis. Glycobiology. 17:1321-1332; Kattla JJ, et al. 2011. Biologic protein glycosylation. In: Murray Moo-Young (ed.), Comprehensive Biotechnology, Second Edition, 3:467-486; Tharmalingam-Jaikaran T, et al. N-glycan profiling of bovine follicular fluid at key dominant follicle developmental stages. 2014. Reproduction. 148:569-580; Clerc F, et al. Human plasma protein N-glycosylation. 2015. Glycoconj J. DOI 10.1007/s10719-015-9626-2; 및 Blackler RJ, et al. 2016. Single-chain antibody-fragment M6P-1 possesses a mannose 6-phosphate monosaccharide-specific binding pocket that distinguishes N-glycan phosphorylation in a branch-specific manner. Glycobiology. 26-2:181-192]을 따른다.

이러한 2-AA 및 LC-MS/MS 분석에 기반하여, 그리고 추가로 요약된 바와 같이, 시험된 ATB200는 평균 M6P 함량이 ATB200의 mol 당 3 mol 내지 5 mol이고(모노-M6P 및 비스-M6P 둘 모두를 고려함), 시알산 함량이 ATB200의 mol 당 4 mol 내지 7 mol이다.

도 19a 내지 도 19h에 나타나 있고 도 20b에 요약된 바와 같이, ATB200의 제1 잠재적 N-글리코실화 부위는, 약 0.25 mol 모노-M6P/mol ATB200의 평균 모노-M6P 함량 및 약 0.56 mol 비스-M6P/mol ATB200의 평균 비스-M6P 함량을 고려하여, 평균 M6P 함량이 약 1.4 mol M6P/mol ATB200이고; ATB200의 제2 잠재적 N-글리코실화 부위는, 주요 인산화 N-글리칸 종이 모노-M6P N-글리칸이면서, 평균 M6P 함량이 약 0.5 mol M6P/mol ATB200이고; ATB200의 제3 잠재적 N-글리코실화 부위는 평균 시알산 함량이 약 1 mol 시알산/mol ATB200이고; ATB200의 제4 잠재적 N-글리코실화 부위는, 약 0.35 mol 모노-M6P/mol ATB200의 평균 모노-M6P 함량 및 약 0.52 mol 비스-M6P/mol ATB200의 평균 비스-M6P 함량을 고려하여, 평균 M6P 함량이 약 1.4 mol M6P/mol ATB200이고; ATB200의 제5 잠재적 N-글리코실화 부위는 평균 시알산 함량이 약 0.86 mol 시알산/mol ATB200이고; ATB200의 제6 잠재적 N-글리코실화 부위는 평균 시알산 함량이 약 4.2 mol 시알산/mol ATB200이며; ATB200의 제7 잠재적 N-글리코실화 부위는 평균 시알산 함량이 약 0.86 mol 시알산/mol ATB200이다.

또한 이러한 2-AA 및 LC-MS/MS 분석 기법에 따르면, ATB200의 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 평균 약 65%가 고 만노스 N-글리칸이고, ATB200의 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 89%가 고 만노스 N-글리칸이고, ATB200의 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 절반 초과가 시알릴화되고(거의 20%가 완전히 시알릴화됨), ATB200의 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 85%가 복합 N-글리칸이고, ATB200의 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 84%가 고 만노스 N-글리칸이고, ATB200의 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 70%가 시알릴화되고(약 26%가 완전히 시알릴화됨), ATB200의 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 100%가 복합 N-글리칸이고, ATB200의 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 85%가 시알릴화되고(거의 27%가 완전히 시알릴화됨), ATB200의 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 98%가 복합 N-글리칸이고, ATB200의 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 87%가 시알릴화되며(거의 8%가 완전히 시알릴화됨), ATB200의 제7 잠재적 N-글리코실화 부위에서 N-글리칸의 약 100%가 복합 N-글리칸이다.

실시예 4: ATB200 및 MYOZYME®/ LUMIZYME®의 분석적 비교

정제된 ATB200 및 LUMIZYME® N-글리칸을 MALDI-TOF에 의해 평가하여, 각각의 ERT 상에서 발견되는 개별적인 N-글리칸 구조를 결정하였다. LUMIZYME®는 상업적 공급원으로부터 입수되었다. 도 7에 나타나 있는 바와 같이, ATB200은 LUMIZYME®의 우측에서 용출되는 4 개의 우세한 피크를 나타냈다. 이는 ATB200이 LUMIZYME®보다 더 큰 정도로 인산화되었음을 확인시켜 주는데, 그 이유는 이러한 평가가 CIMPR 친화성보다는 말단 전하에 의한 것이기 때문이다. 도 8에 요약된 바와 같이, ATB200 샘플은 LUMIZYME®보다 더 작은 양의 비-인산화 고-만노스형 N-글리칸을 함유하는 것으로 밝혀졌다.

MYOZYME® 및 LUMIZYME®에서의 통상적인 rhGAA가 CIMPR과 상호작용하는 능력을 평가하기 위해, 2 개의 통상적인 rhGAA 제제를 CIMPR 친화성 컬럼(M6P 기를 갖는 rhGAA에 결합함) 상에 주입하고, 관류물을 수집하였다. 결합된 물질을 유리 M6 구배로 용출시켰다. 분획을 96-웰 플레이트에 수집하고, 4MU-α-글루코시다제 기질에 의해 GAA 활성을 검정하였다. 미결합(관류) 및 결합(M6P 용출) rhGAA의 상대량을 GAA 활성을 기준으로 결정하고, 총 효소의 분율로서 보고하였다. 도 9a 및 도 9b는 MYOZYME® 및 LUMIZYME® 내의 rhGAA의 결합 프로파일을 보여준다: MYOZYME® 내의 rhGAA의 73%(도 9b) 및 LUMIZYME® 내의 rhGAA의 78%(도 9a)가 CIMPR에 결합하지 않았다. 실제로, MYOZYME® 내의 rhGAA의 27% 및 LUMIZYME® 내의 rhGAA의 22%만이 이를 근육 세포 상의 CIMPR에 표적화하도록 생산적일 수 있는 M6P를 함유하였다. 대조적으로, 도 5에 나타나 있는 바와 같이, 동일한 조건 하에, ATB200 내의 rhGAA의 70% 초과가 CIMPR에 결합하는 것으로 밝혀졌다.

CIMPR에 결합할 수 있는 rhGAA의 더 큰 백분율을 갖는 것 외에도, 이러한 상호작용의 특질을 이해하는 것이 중요하다. LUMIZYME® 및 ATB200 수용체 결합을 CIMPR 플레이트 결합 검정을 사용하여 결정하였다. 간략하게, CIMPR-코팅 플레이트를 사용하여 GAA를 포획하였다. 다양한 농도의 rhGAA를 고정된 수용체에 적용하였고, 미결합 rhGAA를 세정하여 제거하였다. 남아 있는 rhGAA의 양을 GAA 활성에 의해 결정하였다. 도 10a에 나타나 있는 바와 같이, ATB200이 LUMIZYME®보다 유의미하게 더 우수하게 CIMPR에 결합하였다. 도 10b는 LUMIZYME®(통상적인 rhGAA 산물) 및 본 발명에 따른 ATB200 내의 비스-M6P N-글리칸의 상대적인 함량을 보여준다. LUMIZYME®의 경우, 평균적으로 분자의 10%만 비스-인산화 N-글리칸을 갖는다. 대조적으로, 평균적으로 ATB200 내의 모든 rhGAA 분자에 적어도 하나의 비스-인산화 N-글리칸을 갖는다.

전반적으로, LUMIZYME®보다 더 높은 ATB200 내 M6P N-글리칸 함량은 ATB200 내의 더 높은 부분의 rhGAA 분자가 근육 세포를 표적화할 수 있다는 것을 나타낸다. 상기에 나타나 있는 바와 같이, MALDI에 의해 결정된 모노-인산화 및 비스-인산화 구조의 높은 백분율은 ATB200이 CIMPR 수용체에 유의미하게 더 크게 결합하는 것을 예시한 CIMPR 프로파일과 일치한다. MALDI-TOF 질량 분광법을 통한 N-글리칸 분석에서, 평균적으로 각각의 ATB200 분자가 적어도 하나의 천연 비스-M6P N-글리칸 구조를 함유한다는 것을 확인하였다. ATB200 상에서의 이러한 더 높은 비스-M6P N-글리칸 함량은 M6P 수용체 플레이트 결합 검정에서 CIMPR에 대한 고-친화성 결합(K_D약 2 nM 내지 4 nM)과 직접적으로 상관관계가 있다.

ATB200 및 LUMIZYME® rhGAA의 상대적 세포 흡수를 정상 및 폼페 섬유모세포 세포주를 사용하여 비교하였다. 비교는 5 nM 내지 100 nM의 본 개시에 따른 ATB200과 10 nM 내지 500 nM의 통상적인 rhGAA 산물인 LUMIZYME®을 수반하였다. 16-hr 인큐베이션 후, 외부 rhGAA를 TRIS 염기로 불활성화시키고, 세포를 PBS로 3 회 세정한 후 수확하였다. 4MU-α-글루코시드 가수분해에 의해 측정된 내재화된 GAA를 총 세포 단백질에 대해 그래프화하였으며, 결과는 도 11a 내지 도 11c에서 나타나 있다.

ATB200은 또한 세포 내로 효율적으로 내재화되는 것으로 나타났다. 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, ATB200은 정상 및 폼페 섬유모세포 둘 모두 내로 내재화되고, 통상적인 rhGAA 산물인 LUMIZYME®보다 더 큰 정도로 내재화된다. ATB200은 약 20 nM에서 세포 수용체를 포화시키는 한편, LUMIZYME®®이 세포 수용체를 포화시키는 데는 약 250 nM이 필요하다. 도 11c에 나타나 있는 바와 같이, 이들 결과로부터 외삽된 흡수 효율 상수(K_흡수)는 ATB200의 경우 2 nm 내지 3 nm, 및 LUMIZYME®의 경우 56 nM이다. 이들 결과는 ATB200이 폼페병에 대한 잘 표적화된 치료라는 것을 시사한다.

실시예 5: ATB200 및 약리학적 샤페론

산성 또는 중성 pH 완충제 중 ATB200의 안정성을 단백질이 변성될 때 염료의 형광이 증가함에 따라 SYPRO Orange를 사용하여 열안정성 검정에서 평가하였다. 도 12에 나타나 있는 바와 같이, AT2221 첨가는 리소좀의 산성 환경을 모방하는 조건인 pH 5.2에서의 ATB200의 안정성과 유사하게, pH 7.4에서 농도-의존적 방식으로 ATB200을 안정화시켰다. 표 6에 요약된 바와 같이, AT2221 첨가는 ATB200의 용융 온도(T _m )를 거의 10℃ 증가시켰다.

실시예 6: Gaa KO 마우스에서의 ATB200 및 AT2221의 공동-투여

Gaa KO 마우스에서 ATB200 및 AT2221의 치료 효과를 평가하고, 알글루코시다제 알파와 비교하였다. 연구를 위해, 수컷 Gaa KO 마우스(3 개월령 내지 4 개월령) 및 연령-매칭 야생형(WT) 마우스를 사용하였다. 알글루코시다제 알파를 볼루스 꼬리 정맥 정맥내(IV) 주사를 통해 투여하였다. 공동-투여 용법에서, ATB200의 IV 주사 30 분 전에 AT2221을 경구 위관영양(PO)을 통해 투여하였다. 격주로 처리를 제공하였다. 처리된 마우스를 마지막 투여로부터 14 일 후에 희생시키고, 추가 분석을 위해 다양한 조직을 수집하였다. 표 7은 연구 설계를 요약한 것이다:

조직 샘플 내의 조직 글리코겐 함량을 상기 논의된 바와 같이 아밀로글루코시다제 소화를 사용하여 결정하였다. 도 13에 나타나 있는 바와 같이, 20 mg/kg ATB200과 10 mg/kg AT2221의 조합이 동일한 투여량의 알글루코시다제 알파와 비교하여 4 가지 상이한 조직(사두근, 삼두근, 비복근 및 심장)에서 글리코겐 함량을 유의미하게 감소시켰다.

조직 샘플을 또한 문헌[Khanna R, et al. (2012), "The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease," Plos One 7(7): e40776; 및 Khanna, R et al. (2014), "The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid α-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in a Transgenic Mouse Model of Pompe Disease," PLoS ONE 9(7): e102092]에 논의된 방법에 따라 바이오마커 변화에 대해 분석하였다. 도 14에 나타나 있는 바와 같이, WT와 비교하여 LAMP1-양성 소포의 지대한 증가 및 확대가 Gaa KO 동물의 근섬유에서 나타났는데, 이는 리소좀 증식을 나타낸다. ATB200 / AT2221의 공동-투여는 정상화된 LAMP1 수준을 갖는 섬유가 더 많아지게 한 한편, 남아 있는 LAMP1-양성 소포는 크기 면에서도 감소하였다(삽도).

유사하게, 미처리 Gaa KO 마우스의 근섬유에서의 강한 LC3-양성 응집체는 자가포식 구역 및 자가포식 증강의 존재를 의미한다. LC3-양성 응집체(적색)는 알글루코시다제 알파로 처리된 마우스와 비교하여 ATB200 / AT2221 공동-투여로 처리된 마우스에서 우선적으로 감소되었다(도 15a). LC3의 발현을 웨스턴 블롯을 사용하여 평가했을 때 유사한 관찰이 이루어졌다. 도 15b에 나타나 있는 바와 같이, ATB200 / AT2221로 처리된 동물의 대다수가 자가포식소체와 연관된 지질화 형태인 LC3 II의 수준의 유의미한 감소를 나타냈는데, 이는 개선된 자가포식 플럭스를 시사한다. 이와 비교하여, 자가포식에 대한 알글루코시다제 알파의 효과는 그다지 크지 않았다.

막 복구에 수반되고 결핍/미스트래피킹이 다수의 근디스트로피와 연관된 단백질인 디스펄린도 평가하였다. 도 16에 나타나 있는 바와 같이, 디스펄린(갈색)이 Gaa KO 마우스의 근형질에 다량으로 축적되었다. 알글루코시다제 알파와 비교하여, ATB200 / AT2221은 더 많은 수의 근섬유에서 디스펄린을 근초로 복원할 수 있었다.

이들 데이터는 폼페병의 효과적인 치료뿐만 아니라 질병 진행의 역전을 야기한 ATB200 및 미글루스타트로 치료된 인간 폼페병 환자에서 입증된 세포 수준에서의 개선(예를 들어, 환자가 글리코겐 축적 및 근육 상해의 바이오마커의 감소된 수준을 나타냄)과 일관된다. 인간 폼페병 환자에서의 임상 데이터는 하기 실시예 8 및 실시예 9에서 요약된다.

실시예 7: 단일 섬유 분석

도 17에 나타나 있는 바와 같이, 대다수의 비히클-처리 마우스는 총체적으로 확대된 리소좀(녹색)(예를 들어, "B" 참조) 및 대규모의 자가포식 증강의 존재(적색)(예를 들어, "A" 참조)를 나타냈다. MYOZYME®-처리 마우스는 비히클-처리 마우스와 비교하여 어떠한 유의미한 차이도 나타내지 않았다. 대조적으로, ATB200으로 처리된 마우스로부터 단리된 대부분의 섬유는 극적으로 감소된 리소좀 크기를 나타냈다(예를 들어, "C" 참조). 또한, 자가포식 증강이 있는 면적도 다양한 정도로 감소되었다(예를 들어, "C" 참조). 결과적으로, ATB200-처리 마우스로부터 분석된 근섬유의 유의미한 부분(36% 내지 60%)이 정상이거나 거의 정상인 것으로 나타났다. 하기 표 8은 도 17에 나타나 있는 단일 섬유 분석을 요약한 것이다.

이는 자가포식 증강이 다양한 정도로 감소된 섬유를 포함하였다. 전반적으로, 비히클- 또는 알글루코시다제 알파-처리군과 비교하여 ATB200-처리군에서 증강의 정도가 더 작았다.

전반적으로, 데이터는 M6P 함량이 더 높은 ATB200이, 단독으로 및 중성 pH의 혈액에서 약리학적 샤페론 AT2221에 의해 추가로 안정된 경우 둘 모두에서, Gaa KO 마우스에 투여될 때 알글루코시다제 알파와 비교하여 조직 표적화 및 리소좀 트래피킹에서 더욱 효율적이라는 것을 나타내고, 이는 도 18에 도시된 바와 같은 AT2221에 의한 ATB200의 안정화와 일관된다. 결과적으로, ATB200의 투여 및 ATB200/AT2221의 공동-투여는 질병-관련 병리 중 일부, 예컨대, 글리코겐 축적, 리소좀 증식, 및 자가포식 구역의 형성을 수정할 시 알글루코시다제 알파보다 더욱 효과적이었다. 이들 양성 치료 효과로 인해, ATB200의 투여 및 ATB200/AT2221 공동-투여는 근섬유를 손상으로부터 회복시킬 기회를 개선하고, 심지어 최적 GAA 활성의 결여로 인해 세포 내에 축적된 글리코겐을 제거함으로써 손상을 역전시키는 것으로 나타났다. 실시예 6과 같이, 이들 데이터는 또한 ATB200 및 미글루스타트의 투여 후 폼페병의 효과적인 치료 및 질병 진행의 역전 둘 모두를 야기한 인간 폼페병 환자에서 입증된 세포 수준에서의 개선과 일관된다. 인간 폼페병 환자에서의 임상 데이터는 하기 실시예 8 및 실시예 9에서 요약된다.

실시예 8: ATB200-02 시험

폼페병이 있는 성인 대상체에서 AT2221과 ATB200의 IV 주입의 안전성, 내약성, 약동학, 약력학, 및 중간 효능을 평가하기 위해 1/2상(ATB200-02, NCT-02675465) 공개-표지, 고정된-순서, 상승-용량 임상 연구를 수행하였다. 데이터는 그 개시가 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 제WO 2020/163480호에 보고되어 있다.

실시예 9: ATB200-03 시험: 폼페병이 있는 환자에서 ATB200/AT2221의 3상 인간-연구

ATB200-03 시험은 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 알글루코시다제 알파로 효소 대체 요법을 제공받은 적이 있는(즉, ERT-경험) 또는 ERT를 전혀 제공받은 적이 없는(즉, ERT 미경험) 후기 발병 폼페병(LOPD)이 있는 성인 대상체에서 ATB200/AT2221의 3상 이중 맹검, 무작위, 다기관, 국제 연구였다.

연구 설계

도 21에 나타나 있는 바와 같이, 시험은 최대 30 일의 스크리닝 기간, 12 개월 치료 기간, 및 30 일 안전성 추적 조사 기간으로 이루어졌다. 적격인 대상체를 ATB200/AT2221 또는 알글루코시다제 알파/위약을 제공받도록 2:1 비로 무작위 할당하였고, ERT 상태(ERT-경험, ERT-미경험) 및 기준선 6 분 보행 거리(6MWD)(75 미터 내지 150 미터 미만, 150 미터 내지 400 미터 미만, 400 미터 이상)에 의해 계층화하였다.

효능 평가(즉, 기능 평가)는 보행 기능(6MWT), 운동 기능 검사(보행, 계단, 고워, 및 의자에서 일어나기(Chair maneuver)(GSGC) 검사 및 일어서서 걷기(TUG) 검사), 근력(도수 근력 검사 및 정량적 근력 검사), 및 폐 기능 검사(FVC, SVC, MIP, MEP, 및 SNIP)의 평가를 포함하였다. 환자 보고 결과(래쉬-빌트 폼페-특이적 활성(Rasch-built Pompe-specific Activity; R Pact) 척도, EuroQol 5 차원 5 수준 도구(EQ-5D-5L), 신체 기능, 피로, 호흡곤란, 및 상지에 대한 환자-보고 결과 측정 정보 시스템(PROMIS®) 도구 및 변화에 대한 대상체의 전반적 인상)를 기록하였다. 변화에 대한 의사의 전반적 인상(Physician's Global Impression of Change)도 수행하였다.

약력학적 평가는 근육 상해의 바이오마커(크레아틴 키나제(CK) 및 질병 기질(소변 육탄당 사당류(Hex4))의 측정을 포함하였다. ERT-경험 대상체에서 집단 PK 분석용으로 혈장 중 총 GAA 단백질 수준 및 AT2221 농도의 결정을 위해 희박 혈액 샘플을 수집하였다. 총 GAA 단백질 및 AT2221의 PK 프로파일의 특징규명을 위한 연속 혈액 샘플링을 ERT-미경험 대상체에서 수행하였다.

안전성 평가는 주입-연관 반응(IAR)을 포함한 유해 사례(AE), 임상 실험실 검사(화학, 혈액학, 및 소변검사), 활력 징후, 체중을 포함한 신체 검사, 심전도(ECG), 및 면역원성의 모니터링을 포함하였다. 병용 약물 및 비약물 요법도 기록되었다.

대상체 선택

연구에 참여한 대상체는 하기 포함 기준을 모두 충족하고 배제 기준은 충족하지 않았다. 총 122 명의 대상체가 ATB200-03 시험에 참여하였다. 이들 중에서, 85 명의 대상체(ERT-경험: 65 명; ERT-미경험: 20 명)는 ATB200/AT2221 치료를 제공받았고, 37 명의 대상체(ERT-경험: 30 명; ERT-미경험: 7 명)는 알글루코시다제 알파/위약 치료를 제공받았다. 도 22에 나타나 있는 바와 같이, 기준선 6MWD 및 FVC 데이터는 집단을 대표하였고, 일반적으로 두 치료 아암에서 유사하였다.

포함 기준:

1. 대상체는 임의의 연구-관련 절차가 수행되기 전에 서명된 사전 동의서를 제공하였음.

2. 남성 및 여성 대상체는 스크리닝 시 18 세 이상이고 체중이 40 kg 이상이었음.

3. 가임기 여성 대상체 및 남성 대상체는 연구 동안 및 연구 약물의 마지막 투여 후 90 일 동안 의학적으로 허용되는 피임 방법을 사용하는 데 동의하였음.

4. 대상체는 하기 중 하나의 문서에 기반하여 LOPD 진단을 받았음:

a. GAA 효소의 결핍

b. GAA 유전자형

5. 대상체는 ERT 상태와 관련하여 하기 중 하나로 분류되었음:

a. ERT-경험, 24 개월 이상 동안 권장 용량 및 용법(즉, 2 주마다 20 mg/kg 용량)으로 표준 치료 ERT(알글루코시다제 알파)를 제공받은 적이 있는 것으로 정의됨

호주에 특정된, ERT-경험, 2 주마다 제지방 체중 또는 이상 체중을 기준으로 하여 20 mg/kg의 용량으로 권장 용량 및 용법에서 표준 치료 ERT(알글루코시다제 알파)를 제공받은 적이 있는 것으로 정의됨

b. ERT-미경험, 연구용 또는 상업적으로 입수 가능한 ERT를 전혀 제공받은 적이 없는 것으로 정의됨

6. 대상체는 스크리닝 시 건강한 성인에 대한 예측 값의 30% 이상의 좌위 FVC를 가졌음(국민 건강 및 영양 검사 조사 III(National Health and Nutrition Examination Survey III)).

7. 대상체는, 임상 평가자에 의해 결정 시 유효하였으며 하기 기준 모두를 충족한, 2 회의 6MWT를 스크리닝 시 수행하였음:

a. 6MWD의 두 스크리닝 값 모두가 75 미터 이상이었음

b. 6MWD의 두 스크리닝 값 모두가 건강한 성인의 경우 예측 값의 90% 이하였음

c. 6MWD의 보다 낮은 값이 6MWD의 보다 높은 값의 20% 이내였음

배제 기준:

1. 1 일차 전, 대상체는 요법 또는 치료 30 일째 또는 그의 5 반감기 중 더 긴 기간 내에 알글루코시다제 알파 이외의 폼페병에 대한 임의의 연구용 요법 또는 약리학적 치료를 제공받은 적이 있거나, 연구 동안 그러할 것으로 예상되었음.

2. 대상체는 폼페병에 대한 유전자 요법을 제공받은 적이 있음.

3. 1 일차 전, 대상체는 30 일 이내에 하기 금기 약물 중 임의의 것을 복용하고 있었음:

● 미글리톨

● 미글루스타트

● 아카보스

● 보글리보스

4. 대상체는 깨어 있는 동안 하루에 6 시간 초과 동안 침습적 또는 비침습적 환기 보조의 사용을 필요로 하였음.

5. 대상체는 ATB200, 알글루코시다제 알파, 또는 AT2221 중 임의의 부형제에 과민증을 가졌음.

6. 대상체에게는 조사자 또는 의료 모니터의 의견에 따르면, 대상체에게 과도한 안전 위험을 제기하거나 프로토콜 요건을 준수하는 대상체의 능력이 손상되거나 프로토콜 요건에 부정적인 영향을 미치는 의학적 질환 또는 임의의 다른 참작 가능한 상황이 있었음. 이는 조절되지 않거나 불량하게 조절되는 증상과 함께 임상 우울증(정신과 의사 또는 다른 정신 건강 전문가에 의해 진단 시)을 포함하였음.

7. 대상체는 여성인 경우 스크리닝 시 임신 중이거나 모유 수유 중이었음.

8. 대상체는, 남성이든 여성이든, 연구 동안 아이를 임신할 계획이 있었음.

9. 대상체는 유전자 검사를 받는 것을 거부하였음.

연구용 산물, 투여량, 및 투여 방식

대상체를 ATB200/AT2221 또는 알글루코시다제 알파/위약을 제공받도록 적어도 2:1의 무작위화 비로 무작위화하였다. 하기 표 9는 등록된 대상체의 치료를 요약한 것이다.

약어: IV = 정맥내

a 주: 대상체는 AT2221 또는 위약 투여 전 적어도 2 시간 및 투여 후 2 시간 동안 금식할 필요가 있었음.

데이터 평가 및 통계적 고려사항

일차 효능 종점은 6MWD의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화였다. 일차 종점은 반복 측정을 위한 혼합-효과 모델(MMRM) 및 정상 상태에서 벗어난 경우 사전-지정된 비모수적 검정을 사용하여 알글루코시다제 알파/위약 대비 ATB200/AT2221의 우수성에 대하여 시험되었다.

사전-지정된 계층분포 중요도 순의 주요 이차 효능 종점은 하기와 같았다. 이들 이차 종점을 마지막 관측값 선행 대체법으로 공변량 분석(ANCOVA) 모델(ITT LOCF)을 사용하여 분석하였다.

● 좌위 FVC의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화(예측 %)

● 하지에 대한 도수 근력 검사 점수의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화

● PROMIS - 신체 기능에 대한 총점의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화

● PROMIS - 피로에 대한 총점의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화

● GSGC 총점의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화

다른 이차 효능 종점은 하기와 같았다:

● 운동 기능과 관련된 하기 변수의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화:

- GSGC 검사의 10 미터 걷기(즉, 보행 평가)를 완료할 때까지의 시간

- GSGC 검사의 4-계단 오르기를 완료할 때까지의 시간

- GSGC 검사의 고워 행동(Gower's maneuver)을 완료할 때까지의 시간

- GSGC 검사의 일부로서 의자에서 일어날 때까지의 시간

- TUG 검사를 완료할 때까지의 시간

● 근력과 관련된 하기 변수의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화:

- 상지에 대한 도수 근력 검사 점수

- 도수 근력 검사 총점

- 상지에 대한 정량적 근육 검사 값(kg)

- 하지에 대한 정량적 근육 검사 값(kg)

- 정량적 근육 검사 총 값(kg)

● 환자-보고 결과 측정으로부터의 하기 변수의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화:

- PROMIS - 호흡곤란에 대한 총점

- PROMIS - 상지에 대한 총점

- R-PAct 척도 총점

- EQ-5D-5L 건강 상태

● 변화에 대한 대상체의 전반적 인상에 의해 측정 시, 52 주차에 하기 생활 부문에서 연구 약물의 효과에 관한 대상체의 기능 상태(개선, 안정, 또는 감소)의 실제 값

- 전반적인 신체적 웰빙

- 호흡 시도

- 근력

- 근육 기능

- 돌아다닐 수 있는 능력

- 일상 생활의 활동성

- 에너지 수준

- 근육통의 수준

● 변화에 대한 의사의 전반적 인상에 의해 측정 시, 52 주차에 대상체의 기능 상태(개선, 안정, 또는 감소)의 실제 값

● 하기와 같은 폐 기능의 하기 측정에서 기준선으로부터 52 주차까지의 변화:

- 좌위 FVC(예측 %)

- MIP(cmH₂O)

- MIP(예측 %)

- MEP(cmH₂O)

- MEP(예측 %)

- SNIP(cmH₂O)

약력학적 종점은 하기와 같았다:

● 혈청 CK 수준의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화

● 소변 Hex4 수준의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화

ERT-경험 대상체의 경우, 총 GAA 단백질 수준 및 AT2221 농도의 집단 PK 분석으로부터 약동학적 종점을 수집하였다. ERT-미경험 대상체의 경우, 혈장 총 GAA 단백질 농도 및 AT2221에 대한 PK 파라미터를 계산하였다.

치료 응급 유해 사례(TEAE), 심각한 유해 사례(SAE), 및 연구 약물의 중지를 야기하는 AE, 즉각적 및 후기 IAR의 빈도 및 중증도, 및 다른 안전성 평가에서 주목된 임의의 이상의 발생률을 이용하여 ATB200/AT2221의 안전성 프로파일을 특징규명하였다. 안전성 및 효능에 대한, ATB200 및 알글루코시다제 알파에 대한 면역원성의 영향도 평가하였다.

통계적 방법은 샘플 무작위화, 샘플 크기 계산, 효능 분석, 및 안전성 분석에 대한 하기 고려사항을 포함하였다.

무작위화. 하기 2 개의 인자가 설계 계층화 변수로 확인되었다: 1. 기준선 6MWD(75 미터 내지 150 미터 미만, 150 미터 내지 400 미터 미만, 400 미터 이상); 및 2. ERT 상태(ERT-경험, ERT-미경험). 이러한 2 개의 인자는 6 개의 인자 조합(즉, 수준, 계층)을 형성하였다. 상기 위험 인자의 균형을 맞추기 위해 중앙 집중식 블록 무작위화 절차를 이용하여, 1) 편향을 감소시키고 통계적 추론의 정밀성을 증가시키고, 2) 다양한 계획된 및 계획되지 않은 서브세트 분석을 가능하게 하였다. 6 개의 계층 각각에 대해 블록 무작위화 방식을 수행하였다. 무작위화 비는 2:1의 ATB200/AT2221 대 알글루코시다제 알파/위약(고정)이었다.

샘플 크기 계산. 0.05의 양측 유의 수준 및 2:1 무작위화 방식(99 명 대상체의 총 샘플 크기의 경우 ATB200/AT2221 군에서 66 명의 대상체 및 알글루코시다제 알파/위약 군에서 33 명의 대상체)을 갖는 2-군 t-검정은 우수성 시험에서 2 개의 군 사이에 0.7의 표준화된 효과 크기를 검출하기 위해 대략 90%의 검정력을 갖는 것으로 결정하였다. 이 계산은 Nquery 8ⓒ®을 사용하여 수행하였다. 중도탈락률을 10%로 가정하면, 샘플 크기는 대략 110 명의 대상체일 것이다.

효능 분석. 일차 효능 종점(즉, 6MWD의 기준선으로부터 52 주차까지의 변화)을, 새로운 치료와 대조군을 비교하기 위해 모수적 공변량 분석(ANCOVA) 모델을 사용하여 분석하였다. 이 모델은 전형적으로 기준선 6MWD(연속 공변량으로서), 및 무작위화를 계층화하는 데 사용되는 2 개의 인자: ERT 상태(ERT 미경험 대 ERT-경험) 및 기준선 6MWD(75 미터 내지 150 미터 미만, 150 미터 내지 400 미터 미만, 400 미터 이상)에 대해 조정할 것이다. 그러나, 기준선 6MWD는 이들 사이의 예상되는 높은 점 이연 상관으로 인해 모델에서 두 번(연속형 변수와 범주형 변수 둘 모두로서) 사용할 수 없었다. 따라서, 6MWD 연속형 변수는 모델에 남아 있었지만 범주형 6MWD는 제거하였다. 이후, ANCOVA 모델은 치료, 기준선 6MWD(연속형), 및 ERT 상태(범주형)에 대한 항을 가졌다.

추가적으로, 잠재적인 공변량별 치료 상호작용(즉, ERT 상태별 치료 및 기준선별 치료 6MWD 연속형)을 검사하였다. 상호작용 항이 통계적으로 유의미하고(예를 들어, p < 0.10, 양측), 논리적인 생물학적 해석이 있는 경우, 상호작용 항을 일차 종점 분석에 사용될 마지막 ANCOVA 모델에 잠재적으로 추가할 수 있었다. 이후, 데이터를 ANCOVA 모델에 기반하여 분석하였고, 모든 관련 추정치(예를 들어, 각각의 치료군에 대한 LS 평균, LS 평균차, LS 평균차에 대한 95% 신뢰 구간(CI), 및 2 개의 치료군 사이의 비교를 위한 p-값)를 제공하였다.

임상적 이익의 해석을 뒷받침하기 위해, 치료 결과 데이터 전체에 기반하여 복합 대상체-수준 반응을 규정하였다. 대상체를 치료 결과에 기반하여 유의미한 개선, 중등도 개선, 또는 경미한 개선/개선 없음으로 이루어진 순서 반응 변수에 의해 분류하였다.

I형 오류율을 제어하기 위해 단계적 폐쇄 시험 절차를 사용하여, 계층적 순서에 따라 주요 이차 종점을 분석하였다. 주요 이차 및 다른 이차 종점을 일차 종점 분석에 이용된 유사한 방법을 이용하여 별도로 분석하였다.

안전성 분석. 안전성 데이터를, 범주형 데이터의 경우 카운트 및 백분율을 사용하고 연속형 데이터의 경우 기술 통계(평균, 표준 편차, 중앙값, 최소값, 최대값)를 사용하여 요약하였다.

ATB200-03 시험으로부터의 효능 결과

전체 집단에서, ATB200/AT2221 치료는 52 주차에(도 23a) 및 시간 경과에 따라(도 23b) 기준선 대비 6MWD의 개선 및 예측 FVC 퍼센트의 안정화를 나타냈다. 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여, ATB200/AT2221 치료는 52 주차에 전체 집단에서 6MWD의 더 큰 개선을 나타냈다(도 23a). 또한, 도 23a에 나타나 있는 바와 같이, ATB200/AT2221 치료는 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 52 주차에 전체 집단에서 예측 FVC 퍼센트의 임상적으로 유의미한 개선을 나타냈다.

ERT-경험 집단에서, ATB200/AT2221 치료는 52 주차에 기준선 대비 6MWD의 개선 및 예측 FVC 퍼센트의 안정화를 나타냈다(도 24). 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여, ATB200/AT2221 치료는 ERT-경험 집단에서 6MWD의 시간 경과에 따른 개선 및 예측 FVC 퍼센트에서 시간 경과에 따른 안정화를 나타냈다(도 25). 또한, 도 24에 나타나 있는 바와 같이, ATB200/AT2221 치료는 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 52 주차에 ERT-경험 집단에서 6MWD 및 예측 FVC 퍼센트 둘 모두의 임상적으로 유의미한 개선을 나타냈다.

도 26a 및 도 26b에 나타나 있는 바와 같이, 더 작은 ERT-미경험 집단(n=27)에서, ATB200/AT2221 치료는 52 주차에(도 26a) 및 시간 경과에 따라(도 26b) 기준선 대비 6MWD의 개선 및 예측 FVC 퍼센트의 안정화를 나타냈다. 두 치료군 사이의 변동성은 더 컸고, 6MWD 또는 예측 FVC 퍼센트의 임상적으로 유의미한 개선이 관찰되지 않았다(도 26a).

도 28에 나타나 있는 바와 같이, 전체 집단 ERT-경험 집단에서, 하지 MMT는 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 수치적으로 ATB200/AT2221 치료가 유리하다는 것을 보여주었다.

도 29에 나타나 있는 바와 같이, 전체 및 ERT-경험 집단에서, ATB200/AT2221 치료는 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 52 주차에 GSGC의 임상적으로 유의미한 개선을 나타냈다.

도 30에 나타나 있는 바와 같이, 전체 및 ERT-경험 집단에서, PROMIS 신체 기능은 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 수치적으로 ATB200/AT2221 치료가 유리하다는 것을 보여주었다.

도 31에 나타나 있는 바와 같이, 전체 및 ERT 경험 집단에서, PROMIS 피로는 두 치료군 사이에 유사하게 개선되었다.

ATB200-03 시험으로부터의 바이오마커 결과

전체 및 ERT-경험 집단에서, ATB200/AT2221 치료는 시간 경과에 따라 근손상(CK) 및 질병 기질(Hex4)의 바이오마커의 개선을 나타냈다(도 32 및 도 33). 또한, 도 32 및 도 33에 나타나 있는 바와 같이, 전체 및 ERT-경험 집단에서, CK 및 소변 Hex4의 감소는 알글루코시다제 알파/위약과 비교하여 52 주차에 ATB200/AT2221 치료를 이용할 시 유의미하게 더 컸다.

도 34에 요약된 바와 같이, 전체 및 ERT-경험 집단에서, 운동 기능, 폐 기능, 근력, 환자-보고 결과(PRO) 및 바이오마커에 걸쳐 종점은 일관되게 알글루코시다제 알파/위약보다 ATB200/AT2221 치료가 유리하다는 것을 보여주었다. 또한, 평가된 17 개의 효능 및 바이오마커 종점 중 16 개가 알글루코시다제 알파/위약보다 ATB200/AT2221 치료가 유리하다는 것을 보여주었다.

ATB200-03 시험으로부터의 안전성 결과

도 35에 나타나 있는 바와 같이, ATB200/AT2221 치료군의 전체 안전성 프로파일은 알글루코시다제 알파/위약 군과 유사하였다.

도 36 내지 도 40은 ATB200-03 시험의 추가 양태를 설명한다.

실시예 10: PROPEL 3상 임상 시험의 결과

AT-GAA는 중추적인 3상 PROPEL 연구에서 표준 치료와 비교하여 후기 발병 폼페병에서 근골격 및 호흡 측정 둘 모두에 있어 임상적으로 의미 있고 유의미한 개선을 나타냈다. PROPEL은 "ATB200-03"으로도 지칭된다(실시예 9 참조).

승인된 표준 치료 ERT(알글루코시다제 알파)로부터 AT-GAA로 전환한 환자는 평균적으로 17 미터를 더 걸었다(p=0.046).

AT-GAA로 전환한 환자는 또한 알글루코시다제 알파로 치료된 환자에서의 감소와 비교하여 폼페병에서 호흡 기능의 가장 중요한 척도인 예측 강제 폐활량(FVC) 퍼센트의 개선을 나타냈다(FVC Diff. 4.1%; p=0.006).

AT-GAA는 알글루코시다제 알파로 치료된 환자와 비교하여 FVC의 제1 주요 이차 종점에서 우수성에 대해 명목상 통계적으로 유의미하고 임상적으로 의미 있는 차이를 나타냈다(FVC Diff. 3.0%; p=0.023).

ERT 전환 및 ERT 미경험 환자의 조합된 연구 집단에서, AT-GAA는 일차 종점에서 알글루코시다제 알파를 14 미터만큼 능가하였는데(7 m외 비교하여 21 m), 우수성에 대해 통계적으로 유의미하지 않았다(p=0.072).

조합된 연구 집단에 대한 폼페병의 2 개의 중요한 바이오마커(Hex-4 및 CK)의 개선은 알글루코시다제 알파와 비교하여 AT-GAA가 유의미하게 유리하다는 것을 보여주었다(p<0.001).

PROPEL은 현재 표준 치료이자 효소 대체 요법(ERT)인 알글루코시다제 알파와 비교하여 AT-GAA의 효능, 안전성 및 내약성을 평가하기 위해 설계된 52 주 이중 맹검 무작위화 글로벌 연구였다. 연구에는 기계적 환기 없이 여전히 걷고 호흡할 능력이 있는 123 명의 성인 폼페 환자가 등록되었고, 연구는 5 개 대륙의 24 개국에서 62 개의 임상 현장에서 수행되었다. 이는 지금까지 리소좀 장애에서 수행된 가장 큰 대조 임상 연구였다.

PROPEL에 등록된 환자를 2:1로 무작위화하여, 2 명의 환자 모두를 AT-GAA로 치료되도록 무작위화하고 1 명을 알글루코시다제 알파로 치료되도록 무작위화하였다. PROPEL에 등록된 폼페 환자 중 77%는 등록 직전에 알글루코시다제 알파로 치료를 받은 적이 있었고(n=95), 23%는 임의의 ERT로도 전혀 치료를 받은 적이 없었다(n=28). 117 명의 환자가 PROPEL 연구를 완료하였고, 117 명 모두가 장기 연장 연구에 자발적으로 등록하였고, 현재는 이들의 폼페병에 대해 AT-GAA로만 치료를 받고 있다.

조합된 ERT 전환 및 ERT 미경험 연구 집단에서 6 분 보행 거리(6MWD) 및 예측 강제 폐활량(FVC) 퍼센트의 사전-지정된 분석 :

연구의 일차 종점은 조합된 ERT 전환 및 ERT 미경험 환자 집단에 걸쳐 52 주째에 기준선 측정치와 비교한 6 분 보행 거리의 평균 변화였다. 이러한 조합된 집단에서, AT-GAA를 복용한 환자(n=85)는 알글루코시다제 알파로 치료된 환자(n=37)의 7 미터와 비교하여 52 주째에 평균적으로 21 미터를 더 걸었다(표 10). 조합된 집단에서 이러한 일차 종점은 우수성에 대해 평가되었고, 수치적으로 더 크지만, 이러한 조합된 집단에서 우수성에 대한 통계적 유의성은 알글루코시다제 알파 아암과 비교하여 AT-GAA 아암의 경우에는 달성되지 않았다(p=0.072).

통계 분석 계획의 계층에 따라, 연구의 첫 번째 주요 이차 종점은 조합된 집단에 걸쳐 52 주째에 예측 FVC 퍼센트의 평균 변화였다. 이러한 조합된 집단에서, AT-GAA를 복용한 환자는 알글루코시다제 알파로 치료된 환자에 비해 우수성에 대해 명목상 통계적으로 유의미하고 임상적으로 의미 있는 차이를 나타냈다. AT-GAA는 52 주 후에 환자에서 호흡 감소 속도를 유의미하게 늦췄다. AT-GAA로 치료된 환자는 알글루코시다제 알파 아암에서의 4.0% 절대 감소와 비교하여 예측 FVC 퍼센트에서 0.9% 절대 감소를 나타냈다(p=0.023)(표 11). 예측 FVC 퍼센트는 폼페병에서 호흡근 기능의 가장 중요한 척도이며, 알글루코시다제 알파에 대한 승인의 기준이었다.

ERT 전환 연구 집단(n=95)에서 6 분 보행 거리(6MWD) 및 예측 강제 폐활량(FVC) 퍼센트의 사전-지정된 분석:

PROPEL 전환 환자는 최소 2 년 동안 알글루코시다제 알파로 치료를 받는 연구에 들어갔다. 이들 환자의 2/3 초과(67%+)는 PROPEL 연구에 들어가기 전에 5 년 초과 동안 ERT 치료를 받은 적이 있었다(평균 7.4 년).

6 분 보행 거리에 알글루코시다제 알파로부터 전환하는 환자의 사전-지정된 분석은, 전환으로부터 52 주 후에, 알글루코시다제 알파에 남아 있도록 무작위화된 환자(n=30)의 경우의 0.0 미터와 비교하여 AT-GAA 치료 환자(n=65)가 이들의 기준선보다 16.9 미터를 더 걸은 것을 보여주었다(p=0.046)(표 12).

예측 FVC 퍼센트에 대한 알글루코시다제 알파로부터 전환하는 환자의 사전-지정된 분석은 AT-GAA 치료 환자가 이러한 중요한 측정에서 이들의 호흡 기능을 안정화시키고 약간 개선한 반면, 알글루코시다제 알파에 남아 있는 해당 환자는 호흡근 기능이 계속 유의미하게 감소하였음을 보여주었다. AT-GAA 환자는 예측 FVC 퍼센트의 0.1% 절대 증가를 나타낸 반면, 알글루코시다제 알파 환자는 일년의 기간에 걸쳐 4.0% 절대 감소를 나타냈다(p=0.006)(표 13).

ERT 치료 미경험 집단(n=28)에서 6 분 보행 거리(6MWD) 및 예측 강제 폐활량(FVC) 퍼센트의 사전-지정된 분석:

6 분 보행 거리에 대한 임의의 ERT로 이전에 전혀 치료를 받은 적이 없는 환자의 사전-지정된 분석은 52 주 후 AT-GAA 치료 환자(n=20)가 이들의 기준선보다 33 미터를 더 걸은 것을 보여주었다. 알글루코시다제 알파 치료 환자(n=7)는 이들의 기준선보다 38 미터를 더 걸었다. 두 군 사이의 차이는 통계적으로 유의미하지 않았다(p=0.60)(표 14).

임의의 ERT로 이전에 전혀 치료를 받은 적이 없는 환자의 사전-지정된 분석은 52 주째에 AT-GAA 치료 환자의 경우 -4.1% 및 알글루코시다제 알파 치료 환자의 경우 -3.6%의 예측 강제 폐활량(FVC) 퍼센트의 유사한 감소를 보여주었다(표 15). 두 군 사이의 차이는 통계적으로 유의미하지 않았다(p=0.57).

주: 알글루코시다제 알파 아암 내의 1 명의 환자는 그의 기준선 수행에 영향을 미친 연구용 동화형 스테로이드(investigational anabolic like steroid)의 사용으로 인해 연구 분석으로부터 배제되었음.

전체 ERT 전환 및 ERT 미경험 연구 집단에 걸친 다른 주요 이차 및 바이오마커 종점의 사전-지정된 분석:

근골격 및 다른 주요 이차 종점:

GSGC(보행, 계단, 고워 의자): GSGC는 힘, 조정 및 이동성을 포착하는 폼페병에서 중요하고 일반적으로 사용되는 종점이다. AT-GAA 치료 환자는 전체 집단에서 알글루코시다제 알파 치료 환자의 악화와 비교하여 이러한 중요한 평가에서 점수의 통계적으로 유의미한 개선을 나타냈다(p<0.05).

하지 MMT(도수 근력 검사), PROMIS 신체 기능: 근력의 이들 검증된 척도 및 환자 보고된 결과 둘 모두에서, AT-GAA 치료 환자는 알글루코시다제 알파 치료 환자보다 수치적으로 더 많이 개선되었지만, 결과는 통계적으로 유의미하지 않았다.

PROMIS 피로: 이 척도에 의해 측정 시 피로는 알글루코시다제 알파 치료 환자보다 AT-GAA 치료 환자가 약간 더 유리하다는 것을 보여주었다.

질병에 대한 치료 효과의 바이오마커:

소변 Hex-4: ERT 전환 및 ERT 미경험 환자 둘 모두의 조합된 연구 집단의 경우, AT-GAA를 제공받은 해당 환자는 이러한 바이오마커에 대해 상당한 개선을 나타냈으며, 52 주 후에 알글루코시다제 알파 치료 환자에서의 Hex-4의 +11.0% 증가(즉, 악화)와 비교하여 -31.5%의 Hex-4의 평균 감소가 있었다(p=<0.001). 소변 Hex-4는 폼페병에서 일반적인 바이오마커이며, ERT를 제공받은 폼페 환자에서 골격 글리코겐 클리어런스 정도의 간접적인 척도로서 사용된다. 글리코겐은 폼페 환자의 근육의 리소좀에 축적되는 기질이다.

CK(크레아틴 키나제): 52 주 후, AT-GAA 치료 환자는 이 바이오마커에 대해서도 마찬가지로 상당한 개선을 나타냈으며, 알글루코시다제 알파 치료 환자에서의 +15.6%의 증가(즉, 악화)와 비교하여 CK의 평균 -22.4% 감소가 있었다(p<0.001). CK는 손상된 근육 세포로부터 유출되고 폼페 환자에서 상승되는 효소이다.

AT-GAA는 알글루코시다제 알파와 유사한 안전성 프로파일을 입증하였다. AT-GAA를 제공받은 2 명의 환자(2.4%)는 치료와 관련이 없는 알글루코시다제 알파의 경우 1 명(2.6%)과 비교하여 유해 사례로 인해 치료를 중지하였다. 주사 연관 반응(IAR)은 AT-GAA 참가자의 25% 및 알글루코시다제 알파 환자의 26%에서 보고되었다.

사후 하위군 분석:

기준선 6MWD 및 FVC 범주: ERT-미경험 집단(n=27): 3 명의 환자는 300 m 미만의 기준선 6MWD를 가졌고 3 명은 55% 미만의 기준선 FVC를 가졌고; CFBL의 분석은 환자 수가 적기 때문에 이들 하위군에서 수행되지 않았다. 300 m 이상의 기준선 6MWD: 시파글루코시다제 알파/미글루스타트(AT-GAA)(n=18) 및 알글루코시다제 알파/위약(n=6) 군 둘 모두에서, 시간 경과에 따라 유사한 개선이 있었다(52 주차까지의 평균 [SE] CFBL: 각각 +34.4 [12.1] m 및 +30.8 [9.6] m). 55% 이상의 기준선 FVC: 시파글루코시다제 알파/미글루스타트(n=19)와 알글루코시다제 알파/위약(n=5) 군 둘 모두는 시간 경과에 따라 감소하였다(52 주차까지의 평균 [SE] CFBL: 각각 -3.7 [1.5] % 및 -3.3 [2.6] %). 결과는 도 41a 및 도 41b에 나타나 있는 바와 같이, 기준선 6MWD가 300 m 미만 및 300 m 이상이고, FVC가 55% 미만 및 55% 이상인 환자의 전체 및 ERT-경험 집단에서 시파글루코시다제 알파/미글루스타트가 일관되게 유리하다는 것을 보여주었다.

ERT-미경험 및 ERT-경험 환자를 포함하는 전체 연구 집단에서, 시파글루코시다제 알파/미글루스타트는 기준선 6MWD 및 FVC % 평가에 관계없이, 그리고 사전 지정된 및 사후 하위군 분석 둘 모두에 걸쳐, 승인된 ERT와 비교하여 운동 및 호흡 기능에 대해 긍정적인 경향 또는 임상적으로 의미 있는 개선을 보여주었다.

시파글루코시다제 알파/미글루스타트는 알글루코시다제 알파/위약과 유사한 안전성 프로파일을 입증하였다(도 42).

AT-GAA에 관하여

AT-GAA는 시파글루코시다제 알파의 안정화제인 미글루스타트(AT2221)와 함께 투여되는, 세포로의 흡수를 강화하는, 최적화된 탄수화물 구조, 특히 비스-인산화 만노스-6 포스페이트(비스-M6P) 글리칸을 갖는 독특한 재조합 인간 산 알파-글루코시다제(rhGAA) 효소인 시파글루코시다제 알파(ATB200)로 이루어진 연구용 2-성분 요법이다. 전임상 연구에서, AT-GAA는 GAA의 성숙한 리소좀 형태의 수준 증가 및 근육 내 글리코겐 수준 감소, 자가포식 결함의 경감 및 근력의 개선과 연관되어 있었다.

폼페병에 관하여

폼페병은 효소 산 알파-글루코시다제(GAA)의 결핍으로 인해 야기된 유전성 리소좀 장애이다. GAA 수준의 감소 또는 부재 수준은 세포에서 글리코겐의 축적을 야기하는데, 이는 폼페병의 임상 증상을 초래하는 것으로 사료된다. 이 질병은 쇠약해질 수 있고, 시간 경과에 따라 악화되는 중증 근력 저하를 특징으로 한다. 폼페병은 심장 기능에 유의미한 영향을 미쳐 급속하게 사망을 초래하는 영아 형태로부터, 주로 골격근에 영향을 미치며 서서히 진행되는 후기-발병 형태에 이르기까지 다양하다. 폼페병은 전 세계적으로 대략 5,000 명 내지 10,000 명의 사람에서 발병한 것으로 추정된다.

번호가 매겨진 구현예

청구범위도 첨부되어 있으나, 본 개시는 하기 번호가 매겨진 구현예를 제시한다:

1. 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA) 분자의 집단을 약리학적 샤페론과 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법으로서,

rhGAA 분자는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고;

rhGAA 분자 상의 N-글리칸의 40% 내지 60%는 복합형 N-글리칸이고;

rhGAA 분자는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)을 사용하여 결정 시 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 적어도 0.5 mol의 비스-만노스-6-포스페이트(비스-M6P)를 포함하고;

방법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 대상체에서 하나 이상의 질병 결과를 개선하는, 방법.

2. 구현예 1에 있어서, 6 분 보행 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.

3. 구현예 2에 있어서, 6 분 보행 거리(6MWD)의 기준선으로부터의 변화는 적어도 20 미터인, 방법.

4. 구현예 3에 있어서, 6MWD의 기준선으로부터의 변화는 52 주의 치료 후에 적어도 20 미터인, 방법.

5. 구현예 2에 있어서, 대상체의 6MWD는 대조군 치료와 비교하여 적어도 10만큼 증가되는, 방법.

6. 구현예 5에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 13 미터만큼 개선되는, 방법.

7. 구현예 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 300 미터 미만의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.

8. 구현예 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 300 미터 이상의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.

9. 구현예 1에 있어서, 강제 폐활량(FVC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 폐 기능을 개선하는, 방법.

10. 구현예 9에 있어서, 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 증가되거나, 기준선과 비교하여 3% 미만만큼 감소되는, 방법.

11. 구현예 10에 있어서, 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 1% 미만만큼 감소되는, 방법.

12. 구현예 10 또는 구현예 11에 있어서, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 기준선과 비교하여 1% 미만만큼 감소되는, 방법.

13. 구현예 9에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 유의미하게 개선되거나 안정화되는, 방법.

14. 구현예 13에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 적어도 3% 개선되는, 방법.

15. 구현예 12 또는 구현예 13에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 적어도 3% 개선되는, 방법.

16. 구현예 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 55% 미만의 기준선 FVC를 갖는, 방법.

17. 구현예 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 55% 이상의 기준선 FVC를 갖는, 방법.

18. 구현예 1에 있어서, 보행, 계단, 고워, 의자(GSGC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.

19. 구현예 18에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

20. 구현예 19에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

21. 구현예 18에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.

22. 구현예 21에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

23. 구현예 21 또는 구현예 22에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

24. 구현예 1에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커 및/또는 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시키는, 방법.

25. 구현예 24에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커는 크레아틴 키나제(CK)를 포함하고/하거나, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커는 소변 육탄당 사당류(Hex4)를 포함하는, 방법.

26. 구현예 25에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 20% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되는, 방법.

27. 구현예 26에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 20% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30% 감소되는, 방법.

28. 구현예 25에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 및/또는 소변 Hex4 수준은 치료 후에 유의미하게 감소되는, 방법.

29. 구현예 28에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.

30. 구현예 28 또는 구현예 29에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.

31. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 ERT-경험 환자인, 방법.

32. 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 ERT-미경험 환자인, 방법.

33. 재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA) 분자의 집단을 약리학적 샤페론과 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법으로서,

rhGAA 분자는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고;

방법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 대상체에서 하나 이상의 질병 증상을 개선하고,

대상체는 ERT-경험 환자인, 방법.

34. 구현예 33에 있어서, 6 분 보행 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.

35. 구현예 34에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 6 분 보행 거리(6MWD)는 치료 후에 적어도 15 미터 또는 적어도 5% 증가되는, 방법.

36. 구현예 35에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 6 분 보행 거리(6MWD)는 52 주의 치료 후에 적어도 15 미터 또는 적어도 4% 증가되는, 방법.

37. 구현예 33에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.

38. 구현예 37에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 치료 후에 적어도 15 미터만큼 개선되는, 방법.

39. 구현예 37 또는 구현예 38에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 15 미터만큼 개선되는, 방법.

40. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 300 미터 미만의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.

41. 구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 300 미터 이상의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.

42. 구현예 33에 있어서, 강제 폐활량(FVC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 폐 기능을 개선하는, 방법.

43. 구현예 42에 있어서, 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 적어도 0.1% 증가되는, 방법.

44. 구현예 43에 있어서, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 기준선과 비교하여 적어도 0.1% 증가되는, 방법.

45. 구현예 42에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.

46. 구현예 45에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 적어도 4% 개선되는, 방법.

47. 구현예 45 또는 구현예 46에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 적어도 4% 개선되는, 방법.

48. 구현예 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 55% 미만의 기준선 FVC를 갖는, 방법.

49. 구현예 42 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 대상체는 55% 이상의 기준선 FVC를 갖는, 방법.

50. 구현예 33에 있어서, 보행, 계단, 고워, 의자(GSGC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.

51. 구현예 50에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

52. 구현예 51에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

53. 구현예 50에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.

54. 구현예 53에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

55. 구현예 53 또는 구현예 54에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.

56. 구현예 33에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커 및/또는 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시키는, 방법.

57. 구현예 56에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커는 크레아틴 키나제(CK)를 포함하고/하거나, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커는 소변 육탄당 사당류(Hex4)를 포함하는, 방법.

58. 구현예 57에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 15% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 25% 감소되는, 방법.

59. 구현예 58에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 15% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 25% 감소되는, 방법.

60. 구현예 57에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 및/또는 소변 Hex4 수준은 치료 후에 유의미하게 감소되는, 방법.

61. 구현예 60에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.

62. 구현예 60 또는 구현예 61에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.

63. 구현예 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 5 mg/kg 내지 20 mg/kg, 선택적으로 20 mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.

64. 구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 격주로 투여되는, 방법.

65. 구현예 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 정맥내 투여되는, 방법.

66. 구현예 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 약리학적 샤페론은 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고, 추가로 선택적으로 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 경구 투여되는, 방법.

67. 구현예 66에 있어서, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 195 mg 또는 260 mg의 용량으로 투여되는, 방법.

68. 구현예 66 또는 구현예 67에 있어서, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 rhGAA 분자의 집단의 투여 전에, 선택적으로 rhGAA 분자의 집단의 투여 1 시간 전에 투여되는, 방법.

69. 구현예 68에 있어서, 대상체는 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 투여 전 적어도 2 시간 동안 및 투여 후 적어도 2 시간 동안 금식하는, 방법.

70. 구현예 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

71. 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

72. 구현예 1 내지 71 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자의 적어도 30%는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 하나의 만노스-6-포스페이트 잔기(모노-M6P) 또는 비스-M6P를 보유하는 하나 이상의 N-글리칸 단위를 포함하는, 방법.

73. 구현예 1 내지 72 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 평균적으로 rhGAA의 mol 당 0.5 mol 내지 7.0 mol의 모노-M6P 또는 비스-M6P를 포함하는, 방법.

74. 구현예 1 내지 73 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, rhGAA의 평균적으로 mol 당 2.0 mol 내지 8.0 mol의 시알산을 포함하는, 방법.

75. 구현예 1 내지 73 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 2.5 mol의 M6P 및 rhGAA의 mol 당 적어도 4 mol의 시알산을 포함하는, 방법.

76. 구현예 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, rhGAA의 mol 당, rhGAA 분자는 평균적으로

(a) 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.4 mol 내지 0.6 mol의 모노-M6P;

(b) 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.4 mol 내지 0.6 mol의 비스-M6P; 또는

(c) 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.3 mol 내지 0.4 mol의 모노-M6P를 포함하고;

(a) 내지 (c)는 LC-MS/MS를 사용하여 결정되는, 방법.

77. 구현예 76에 있어서, rhGAA의 mol 당, rhGAA 분자는 4 mol 내지 7.3 mol의 시알산을 추가로 포함하고;

rhGAA의 mol 당, rhGAA 분자는 평균적으로

(a) 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.9 mol 내지 1.2 mol의 시알산;

(b) 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.8 mol 내지 0.9 mol의 시알산; 또는

(c) 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 1.5 mol 내지 4.2 mol의 시알산을 포함하고;

(a) 내지 (c)는 LC-MS/MS를 사용하여 결정되는, 방법.

78. 구현예 1 내지 77 중 어느 하나에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 약학적 조성물에서 제형화되는, 방법.

79. 구현예 78에 있어서, 약학적 조성물은 시트레이트, 포스페이트 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충제, 및 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 추가로 포함하고; 약학적 조성물은 5.0 내지 7.0의 pH를 갖는, 방법.

80. 구현예 79에 있어서, 약학적 조성물은 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는, 방법.

81. 구현예 78 또는 구현예 79에 있어서, 약학적 조성물은 물, 산성화제, 알칼리화제, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 방법.

82. 구현예 81에 있어서, 약학적 조성물에서, rhGAA 분자의 집단은 5 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도로 존재하고, 적어도 하나의 완충제는 10 mM 내지 100 mM의 농도로 존재하는 시트르산나트륨 완충제이고, 적어도 하나의 부형제는 10 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도로 존재하는 만니톨 및 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80이고, 약학적 조성물은 물을 추가로 포함하고, 산성화제 및/또는 알칼리화제를 선택적으로 포함하고; 약학적 조성물은 6.0의 pH를 갖는, 방법.

83. 구현예 82에 있어서, 약학적 조성물에서, rhGAA 분자의 집단은 15 mg/mL의 농도로 존재하고, 시트르산나트륨 완충제는 25 mM의 농도로 존재하고, 만니톨은 20 mg/mL의 농도로 존재하고, 폴리소르베이트 80은 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는, 방법.

84. 구현예 1 내지 83 중 어느 하나에 있어서, rhGAA는 중국 햄스터 난소 세포로부터 생산되는, 방법.

Claims

재조합 인간 산 α-글루코시다제(recombinant human α-glucosidase; rhGAA) 분자의 집단을 약리학적 샤페론과 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법으로서,
rhGAA 분자는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고;
rhGAA 분자 상의 N-글리칸의 40% 내지 60%는 복합형 N-글리칸이고;
rhGAA 분자는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)을 사용하여 결정 시 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 적어도 0.5 mol의 비스-만노스-6-포스페이트(비스-M6P)를 포함하고;
방법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 대상체에서 하나 이상의 질병 결과를 개선하는, 방법.
제1항에 있어서, 6 분 보행 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.
제2항에 있어서, 6 분 보행 거리(6-minute walk distance; 6MWD)의 기준선으로부터의 변화는 적어도 20 미터인, 방법.
제3항에 있어서, 6MWD의 기준선으로부터의 변화는 52 주의 치료 후에 적어도 20 미터인, 방법.
제2항에 있어서, 대상체의 6MWD는 대조군 치료와 비교하여 적어도 10만큼 증가되는, 방법.
제5항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 13 미터만큼 개선되는, 방법.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 300 미터 미만의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 300 미터 이상의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.
제1항에 있어서, 강제 폐활량(FVC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 폐 기능을 개선하는, 방법.
제9항에 있어서, 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 증가되거나, 기준선과 비교하여 3% 미만만큼 감소되는, 방법.
제10항에 있어서, 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 1% 미만만큼 감소되는, 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 기준선과 비교하여 1% 미만만큼 감소되는, 방법.
제9항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 유의미하게 개선되거나 안정화되는, 방법.
제13항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 적어도 3% 개선되는, 방법.
제12항 또는 제13항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 적어도 3% 개선되는, 방법.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 55% 미만의 기준선 FVC를 갖는, 방법.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 55% 이상의 기준선 FVC를 갖는, 방법.
제1항에 있어서, 보행, 계단, 고워, 의자(gait, stair, gower, chair; GSGC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.
제18항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제19항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제18항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.
제21항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제1항에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커 및/또는 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시키는, 방법.
제24항에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커는 크레아틴 키나제(CK)를 포함하고/하거나, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커는 소변 육탄당 사당류(Hex4)를 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 20% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되는, 방법.
제26항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 20% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30% 감소되는, 방법.
제25항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 및/또는 소변 Hex4 수준은 치료 후에 유의미하게 감소되는, 방법.
제28항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 ERT-경험 환자인, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 ERT-미경험 환자인, 방법.
재조합 인간 산 α-글루코시다제(rhGAA) 분자의 집단을 약리학적 샤페론과 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상체에서 폼페병을 치료하는 방법으로서,
rhGAA 분자는 7 개의 잠재적 N-글리코실화 부위를 포함하고;
rhGAA 분자 상의 N-글리칸의 40% 내지 60%는 복합형 N-글리칸이고;
rhGAA 분자는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법(LC-MS/MS)을 사용하여 결정 시 제1 잠재적 N-글리코실화 부위에 rhGAA의 mol 당 적어도 0.5 mol의 비스-만노스-6-포스페이트(비스-M6P)를 포함하고;
방법은 (1) 기준선, 또는 (2) 약리학적 샤페론에 대해 알글루코시다제 알파 및 위약을 투여하는 것을 포함하는 대조군 치료와 비교하여 대상체에서 하나 이상의 질병 증상을 개선하고,
대상체는 ERT-경험 환자인, 방법.
제33항에 있어서, 6 분 보행 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.
제34항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 6 분 보행 거리(6MWD)는 치료 후에 적어도 15 미터 또는 적어도 5% 증가되는, 방법.
제35항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 6 분 보행 거리(6MWD)는 52 주의 치료 후에 적어도 15 미터 또는 적어도 4% 증가되는, 방법.
제33항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.
제37항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 치료 후에 적어도 15 미터만큼 개선되는, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 6MWD는 52 주의 치료 후에 적어도 15 미터만큼 개선되는, 방법.
제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 300 미터 미만의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.
제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 300 미터 이상의 기준선 6MWD를 갖는, 방법.
제33항에 있어서, 강제 폐활량(FVC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 폐 기능을 개선하는, 방법.
제42항에 있어서, 치료 후, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 기준선과 비교하여 적어도 0.1% 증가되는, 방법.
제43항에 있어서, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 기준선과 비교하여 적어도 0.1% 증가되는, 방법.
제42항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.
제45항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 치료 후에 적어도 4% 개선되는, 방법.
제45항 또는 제46항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 예측 FVC 퍼센트는 52 주의 치료 후에 적어도 4% 개선되는, 방법.
제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 55% 미만의 기준선 FVC를 갖는, 방법.
제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 55% 이상의 기준선 FVC를 갖는, 방법.
제33항에 있어서, 보행, 계단, 고워, 의자(GSGC) 검사에 의해 측정 시 대상체의 운동 기능을 개선하는, 방법.
제50항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제51항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 0.5 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제50항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 유의미하게 개선되는, 방법.
제53항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제53항 또는 제54항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 GSGC 점수는 52 주의 치료 후에 적어도 1 점의 감소로 나타나는 바와 같이 개선되는, 방법.
제33항에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커 및/또는 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커의 수준을 감소시키는, 방법.
제56항에 있어서, 근손상의 적어도 하나의 마커는 크레아틴 키나제(CK)를 포함하고/하거나, 글리코겐 축적의 적어도 하나의 마커는 소변 육탄당 사당류(Hex4)를 포함하는, 방법.
제57항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 15% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 25% 감소되는, 방법.
제58항에 있어서, 기준선과 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 15% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 25% 감소되는, 방법.
제57항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 및/또는 소변 Hex4 수준은 치료 후에 유의미하게 감소되는, 방법.
제60항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.
제60항 또는 제61항에 있어서, 대조군 치료와 비교하여, 대상체의 CK 수준은 치료 후에 적어도 30% 감소되고/되거나, 대상체의 소변 Hex4 수준은 52 주의 치료 후에 적어도 40% 감소되는, 방법.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 5 mg/kg 내지 20 mg/kg, 선택적으로 20 mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 격주로 투여되는, 방법.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 정맥내 투여되는, 방법.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 약리학적 샤페론은 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이고, 추가로 선택적으로 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 경구 투여되는, 방법.
제66항에 있어서, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 195 mg 또는 260 mg의 용량으로 투여되는, 방법.
제66항 또는 제67항에 있어서, 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 rhGAA 분자의 집단의 투여 전에, 선택적으로 rhGAA 분자의 집단의 투여 1 시간 전에 투여되는, 방법.
제68항에 있어서, 대상체는 미글루스타트 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 투여 전 적어도 2 시간 동안 및 투여 후 적어도 2 시간 동안 금식하는, 방법.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자의 적어도 30%는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 하나의 만노스-6-포스페이트 잔기(모노-M6P) 또는 비스-M6P를 보유하는 하나 이상의 N-글리칸 단위를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 평균적으로 rhGAA의 mol 당 0.5 mol 내지 7.0 mol의 모노-M6P 또는 비스-M6P를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 평균적으로 rhGAA의 mol 당 2.0 mol 내지 8.0 mol의 시알산을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자는, LC-MS/MS를 사용하여 결정 시, 평균적으로 rhGAA의 mol 당 적어도 2.5 mol의 M6P 및 rhGAA의 mol 당 적어도 4 mol의 시알산을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA의 mol 당, rhGAA 분자는 평균적으로
(a) 제2 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.4 mol 내지 0.6 mol의 모노-M6P;
(b) 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.4 mol 내지 0.6 mol의 비스-M6P; 또는
(c) 제4 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.3 mol 내지 0.4 mol의 모노-M6P를 포함하고;
(a) 내지 (c)는 LC-MS/MS를 사용하여 결정되는, 방법.
제76항에 있어서, rhGAA의 mol 당, rhGAA 분자는 4 mol 내지 7.3 mol의 시알산을 추가로 포함하고;
rhGAA의 mol 당, rhGAA 분자는 평균적으로
(a) 제3 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.9 mol 내지 1.2 mol의 시알산;
(b) 제5 잠재적 N-글리코실화 부위에 0.8 mol 내지 0.9 mol의 시알산; 또는
(c) 제6 잠재적 N-글리코실화 부위에 1.5 mol 내지 4.2 mol의 시알산을 포함하고;
(a) 내지 (c)는 LC-MS/MS를 사용하여 결정되는, 방법.
제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA 분자의 집단은 약학적 조성물에서 제형화되는, 방법.
제78항에 있어서, 약학적 조성물은 시트레이트, 포스페이트 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 완충제, 및 만니톨, 폴리소르베이트 80, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 추가로 포함하고; 약학적 조성물은 5.0 내지 7.0의 pH를 갖는, 방법.
제79항에 있어서, 약학적 조성물은 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는, 방법.
제78항 또는 제79항에 있어서, 약학적 조성물은 물, 산성화제, 알칼리화제, 또는 이의 조합을 추가로 포함하는, 방법.
제81항에 있어서, 약학적 조성물에서, rhGAA 분자의 집단은 5 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도로 존재하고, 적어도 하나의 완충제는 10 mM 내지 100 mM의 농도로 존재하는 시트르산나트륨 완충제이고, 적어도 하나의 부형제는 10 mg/mL 내지 50 mg/mL의 농도로 존재하는 만니톨 및 0.1 mg/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 80이고, 약학적 조성물은 물을 추가로 포함하고, 산성화제 및/또는 알칼리화제를 선택적으로 포함하고; 약학적 조성물은 6.0의 pH를 갖는, 방법.
제82항에 있어서, 약학적 조성물에서, rhGAA 분자의 집단은 15 mg/mL의 농도로 존재하고, 시트르산나트륨 완충제는 25 mM의 농도로 존재하고, 만니톨은 20 mg/mL의 농도로 존재하고, 폴리소르베이트 80은 0.5 mg/mL의 농도로 존재하는, 방법.
제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, rhGAA는 중국 햄스터 난소 세포로부터 생산되는, 방법.