TW201726163A - 用於治療龐培氏病的增強的酸性α-葡糖苷酶 - Google Patents

Abstract

提供了一種用於治療龐培氏病之方法，該方法包括將具有帶有甘露糖-6-磷酸殘基的最優糖基化的重組人酸性α-葡糖苷酶與一定量的麥格司他組合給予，有效最大化重組人酸性α-葡糖苷酶的組織攝取，同時最小化重組人酸性α-葡糖苷酶的酶活性的抑制。

Description

用於治療龐培氏病的增強的酸性α-葡糖苷酶

本發明提供了一種用於治療龐培氏病之方法，該方法包括將酸性α-葡糖苷酶及其藥物分子伴侶的組合給予個體。更具體地說，本發明提供了用於治療龐培氏病之方法，該方法包括將重組人酸性α-葡糖苷酶和麥格司他的組合給予個體。

龐培氏病，又稱為酸性麥芽糖酶缺乏症或肝糖貯積症II型，係若干種胞溶體貯積症之一。胞溶體貯積症係常染色體隱性遺傳疾病的一個類群，其特徵在於細胞的醣神經鞘脂質、肝糖或黏多糖在細胞內的區室（稱為溶酶體）內的積累。具有該等疾病的個體攜帶編碼對於催化一種或多種該等物質的水解中有缺陷的酶的突變基因，隨後該等物質積累在溶酶體中。溶酶體失調的其他實例包括高歇氏病、G_M1 -神經節苷脂貯積病、岩藻糖沉積症、黏多糖貯積症、胡爾勒-施埃爾症候群（Hurler-Scheie disease）、尼曼-皮克A和B病（Niemann-Pick A和B）以及法布裡氏病（Fabry disease）。龐培氏病亦被分類為神經肌肉疾病或代謝性肌病。

龐培氏病的發病率被估計為在40,000人中約1例，並且是由GAA基因的突變引起的，該GAA基因編碼溶酶體的α-葡糖苷酶（EC:3.2.1.20），該酶也常被稱為酸性α-葡糖苷酶。酸性α-葡糖苷酶藉由在溶酶體內將肝糖催化水解為葡萄糖，參與肝糖（分枝的聚糖，係動物中葡萄糖的主要儲存形式）的代謝。因為患有龐培氏病的個體產生的突變的、缺陷的酸性α-葡糖苷酶係非活性的或具有減少的活性，肝糖分解發生緩慢或一點也不分解，並且肝糖累積在不同組織的溶酶體中（特別是在橫紋肌中），導致了包括進行性肌無力和呼吸功能不全的廣範圍臨床表現。組織（例如，心臟和骨骼肌）係特別受影響的。

龐培氏病可以在酶的缺乏程度、嚴重程度和發病年齡方面廣泛變化，並且已經鑒定在GAA基因中的超過500種不同的突變，它們中的許多引起不同嚴重程度的疾病症狀。該疾病已經被分類為以下廣泛類型：早發型或嬰兒型，以及晚發型。早發型的疾病和更低的酶活性通常與更嚴重的臨床病程相關。嬰兒型龐培氏病係最嚴重的，係由完全的或接近完全的酸性α-葡糖苷酶缺乏引起，並且出現包括嚴重肌肉緊張缺乏、虛弱、肝臟和心臟增大以及心肌病的症狀。舌頭可能變得增大和突出，並且吞咽可能變得困難。多數染病的兒童在兩歲之前死於呼吸併發症或心臟併發症。晚發型龐培氏病可以出現在大於12個月的任何年齡，並且其特徵在於缺乏心臟損害和更好的短期預後。症狀與進行性骨骼肌功能障礙相關，並且涉及全身性肌無力以及在軀幹、近端下肢和隔膜中的呼吸肌的消耗。一些成年患者缺乏主要症狀或運動限制。預後通常取決於呼吸肌受累的程度。大多數患有龐培氏病的受試者最終發展為需要使用輪椅和輔助通氣的身體衰弱的狀態，其中由於呼吸衰竭而經常發生過早死亡。

針對龐培氏病的目前的治療選項包括用重組人酸性α-葡糖苷酶（rhGAA）進行的酶替代療法（ERT）。常規的rhGAA產品在阿葡糖苷酶α名下係已知的：美爾贊®(Myozyme®)或Lumizyme®（健贊公司（Genzyme,Inc.））。ERT係貫穿患者一生所必需的慢性治療，並且藉由靜脈輸注參與替代酶的給予。該替代酶隨後在循環中轉運，並且進入細胞內的溶酶體，在溶酶體中該替代酶的作用係分解積累的肝糖，補償內源性缺損突變體酶缺乏的活性，並且從而緩解該疾病症狀。在患有嬰兒發作型龐培氏病的受試者中，相比歷史對照，已經用阿葡糖苷酶α的治療顯著提高存活率，並且在晚發型龐培氏病中，與安慰劑相比，阿葡糖苷酶α已經展示出對6分鐘步行測試（6MWT）和用力肺活量（FVC）的影響具有統計學顯著性（若適度的話）。

然而，在經歷阿葡糖苷酶α的治療時，大多數受試者保持穩定抑或繼續惡化。用阿葡糖苷酶α的ERT的明顯次優效應的原因尚不清楚，但是部分可以歸因於潛在肌肉病理的進行性性質，或當前ERT的差的組織靶向。例如，輸注的酶在中性pH（包括在血漿的pH（約pH 7.4））下不穩定，並且會在循環內不可逆地失活。此外，輸注的阿葡糖苷酶α在關鍵的疾病相關肌肉中展示出不足的攝取，可能歸因於與甘露糖-6-磷酸（M6P）殘基的不足的糖基化。此類殘基在細胞表面結合陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR），允許該酶進入細胞及其內的溶酶體。因此，高劑量的該酶對於有效的治療係必需的，以便充足量的活性酶可以到達溶酶體，使得此種治療昂貴並且費時。

另外，抗-重組人酸性α-葡糖苷酶中和抗體的發展通常在龐培氏病患者中發展，歸因於重複暴露於治療。此類的免疫反應會嚴重降低患者對治療的耐受性。用於阿葡糖苷酶α的美國產品標籤包括帶有關於超敏反應的潛在風險的資訊的黑盒警告。已經在用阿葡糖苷酶α治療的受試者中觀察到危及生命的過敏反應，包括過敏性休克。

正在開發下一代ERT來解決該等缺陷。在一種策略中，重組酶可以與藥物分子伴侶共同給予，該等藥物分子伴侶可以誘導或穩定酶的適當構象，以防止或減少該酶的降解，和/或它在體外（例如，在給予前儲存）或體內的解折疊為無活性形式。此種策略在國際專利申請公開案號WO 2004/069190、WO 2006/125141、WO 2013/166249和WO 2014/014938中進行了描述。

已經描述了將阿葡糖苷酶α與麥格司他共同給予患有龐培氏病的患者的臨床實驗的結果。在義大利的4個治療中心，在患有龐培氏病的13個受試者（3例早發型（嬰兒型）和10例晚發型）上進行的臨床實驗中，將20至40 mg/kg的阿葡糖苷酶α單獨給予，隨後與4個劑量的80 mg的麥格司共同給予。本研究的結果顯示，相比單獨給予阿葡糖苷酶α，對於共同給予的酸性α-葡糖苷酶活性暴露（根據藥物動力學參數AUC（在濃度對比時間曲線下的面積）量測的）平均增加6.8倍（帕倫蒂，G（Parenti, G.）、G.安德里亞（G.Andria）等人，(2015)，「溶酶體貯存病:從病理生理學到治療」（「Lysosomal Storage Diseases:From Pathophysiology to Therapy.」）醫藥學年評（Annu. Rev. Med.）66 (1): 471-486）。此外，在佛羅裡達大學進行的研究評估了當與阿葡糖苷酶α靜脈輸注共同給予至患有龐培氏病的受試者時的血漿麥格司他的藥物代謝動力學（PK），（多弗勒，P. A.（Doerfler, P. A.）、J. S.凱利（J. S. Kelley）等人，(2014)，「藥物分子伴侶在酶替代療法期間藉由抗-GAA抗體阻止rhGAA的沉澱」（「Pharmacological chaperones prevent the precipitation of rhGAA by anti-GAA antibodies during enzyme replacement therapy.」）分子遺傳與代謝（Mol. Genet. Metab.）111 (2): S38）。

然而，針對治療龐培氏病，亦需要進一步改進酶替代療法。例如，新的重組人酸性α-葡糖苷酶係有希望的，它可以具有一種或多種超越現有酶的優點，包括但不限於改進組織攝取、改進酶活性、改進穩定性或降低免疫原性。

本發明提供了一種用於在對其有需要的患者中治療龐培氏病之方法，該方法包括將麥格司他與重組人酸性α-葡糖苷酶（rhGAA）組合給予患者，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且相比帶有阿葡糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量，該重組人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。在至少一個實施方式中，將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約20 mg/kg的劑量實施靜脈給予，並且將麥格司他以約260 mg的劑量口服給予。

在另一態樣中，本發明提供了一種麥格司他與如本文所定義的重組人酸性α-葡糖苷酶之組合，用於在對其有需要的患者中治療龐培氏病。

在另一態樣中，本發明提供了麥格司他和如本文所定義的重組人酸性α-葡糖苷酶組合用於在對其有需要的患者中治療龐培氏病的藥劑製備之用途。

本發明的另一態樣提供了在對其有需要的患者中用於龐培氏病的聯合治療的套組（kit），該套組包括：包含麥格司他的藥學上可接受的劑型，包含如本文定義的重組人酸性α-葡糖苷酶的藥學上可接受的劑型，以及用於將包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型和包含重組酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型給予至對其有需要的患者的說明。

定義：在本發明的上下文中以及在每個術語使用的特定上下文中，在本說明書中使用的術語通常具有其在本領域中的一般含義。某些術語在下文或在本說明書中的其他地方進行了論述，以向從業者提供另外的指導。

在本說明書中，除非上下文需要，否則歸因於表現語言或必要的含義，詞語「包括（comprises）」，或變化形式例如「包含（comprises）」或「包含（comprising）」用於包括的意義，亦即用於指明所述特徵的存在，但是不排除在本發明的不同實施方式中存在或增加的其他特徵。

如本文中所使用，術語「龐培氏病」亦稱為酸性麥芽糖酶缺乏、肝糖貯積症II型（GSDII）和肝糖貯積病II型，意欲意指遺傳性的胞溶體貯積症，其特徵在於在編碼人酸性α-葡糖苷酶的GAA 基因中的突變。術語包括但不限於該疾病的早發型和晚發型形式，包括但不限於嬰兒型、青年型和成年型龐培氏病。

如本文中所使用，術語「酸性α-葡糖苷酶」意欲意指水解肝糖、麥芽糖和異麥芽糖的D-葡萄糖單元之間的α-1,4鍵的溶酶體酶。替代名包括但不限於溶酶體的α-葡糖苷酶（EC:3.2.1.20）、糖化酶、1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶、澱粉葡糖苷酶、γ-澱粉酶和外切-1,4-α-葡糖苷酶。人酸性α-葡糖苷酶係由GAA 基因（美國國家生物技術資訊中心（NCBI）基因ID 2548）編碼的，該基因已經被定位至染色體17的長臂上（位置17q25.2-q25.3）。目前已經在人類GAA基因中鑒定了超過500個突變，其中的許多突變與龐培氏病有關。導致該酸性α-葡糖苷酶的折疊或錯加工的突變包括T1064C（Leu355Pro）和C2104T（Arg702Cys）。另外，影響酶的成熟和加工的GAA 突變包括Leu405Pro和Met519Thr。在胺基酸殘基516-521處的保守六肽WIDMNE對於酸性α-葡糖苷酶蛋白的活性係必需的。如本文中所使用，縮寫「GAA」意欲意指該酸性α-葡糖苷酶，然而斜體縮寫「GAA 」意欲意指編碼人酸性α-葡糖苷酶的人類基因。斜體縮寫「Gaa 」意欲意指編碼非人酸性α-葡糖苷酶類的非人類基因，包括但不限於大鼠或小鼠基因，並且縮寫「Gaa」意欲意指非人酸性α-葡糖苷酶類。因此，縮寫「rhGAA」意欲意指該重組人酸性α-葡糖苷酶。

如本文中所使用，術語「阿葡糖苷酶α」意欲意指被鑒定為[199-精胺酸,223-組胺酸]先質原-α-葡糖苷酶（人）的重組人酸性α-葡糖苷酶；化學文摘登記號420794-05-0。阿葡糖苷酶α被批准在美國由健贊公司（Genzyme）在2014年10月1日作為產品Lumizyme®和美爾贊®進行市場行銷。

如本文中所使用，術語「ATB200」意欲意指描述於共同未決的專利申請PCT/US 2015/053252中的重組人酸性α-葡糖苷酶，該專利申請的揭露內容藉由引用結合在此。

如本文中所使用，術語「聚糖」意欲意指共價結合至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。如本文中所使用，術語「N-聚糖」或「N-聯聚糖」意欲意指藉由共價結合至胺基酸殘基的氮原子而附接至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。例如，N-聚糖可以共價結合至天冬醯胺殘基的側鏈氮原子上。聚糖可以包含一個或若干個單糖單元，並且該單糖單元可以共價連接以形成直鏈或支鏈。在至少一個實施方式中，附接至ATB200的N-聚糖單元可以包括每一獨立地選自N-乙醯葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一個或多個單糖單元。蛋白質上的該N-聚糖單元可以藉由任何適當的分析技術（例如，質譜分析法）確定。在一些實施方式中，N-聚糖單元可以藉由液相層析-串聯質譜分析法（LC-MS/MS），利用儀器，例如Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro^TM 質譜儀、Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM 質譜儀或Waters Xevo®G2-XS QTof質譜儀進行確定。

如本文中所使用，術語「高-甘露糖N-聚糖」意欲意指具有一個至六個或更多個甘露糖單元的N-聚糖。在至少一個實施方式中，高甘露糖N-聚糖單元可以包含結合至天冬醯胺殘基，並且進一步結合至分枝的聚甘露糖鏈的雙(N-乙醯胺基葡萄糖)鏈。如在本文可互換地使用，術語「M6P」或「甘露糖-6-磷酸」意欲意指在位置6處磷酸化的甘露糖單元；亦即，具有與位置6處的羥基基團結合的磷酸基。在至少一個實施方式中，一個或多個N-聚糖單元的一個或多個甘露糖單元係在位置6處磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸單元。在至少一個實施方式中，術語「M6P」或「甘露糖-6-磷酸」意指具有在磷酸基團上作為「帽」的N-乙醯胺基葡萄糖（GlcNAc）的甘露糖磷酸二酯，連同具有缺少GlcNAc帽的暴露的磷酸基團的甘露糖單元。在至少一個實施方式中，蛋白質的N-聚糖可以具有多種M6P基團，其中至少一個M6P基團具有GlcNAc帽，並且至少一個其他的M6P基團缺少GlcNAc帽。

如本文中所使用，術語「複合物N-聚糖」意欲意指包含一個或多個半乳糖和/或唾液酸單元的N-聚糖。在至少一個實施方式中，複合物N-聚糖可以是高-甘露糖N-聚糖，其中一個或多個甘露糖單元進一步結合至各自獨立地選自N-乙醯胺基葡萄糖、半乳糖和唾液酸的一個或多個單糖單元。

如本文中所使用，化合物麥格司他，也稱為N-丁基-1-去氧野尻黴素（N-butyl-1-deoxynojirimycin）或NB-DNJ或(2R,3R,4R,5S)-1-丁基-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，係具有以下化學式的化合物：。

麥格司他的一種配製物作為針對I型高歇氏病的單一療法在商品名Zavesca®下進行商業銷售。

如下論述，麥格司他的藥學上可接受的鹽也可以用於本發明。當使用麥格司他的鹽時，該鹽的劑量將進行調整，此使得由患者接受的麥格司他的該劑量與使用麥格司他游離鹼時接受的量係相當的。

如本文中所使用，化合物去氧野尻黴素（duvoglustat），又稱為1-去氧野尻黴素或DNJ或(2R,3R,4R,5S)-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，係具有以下化學式的化合物：。

如本文中所使用，術語「藥物分子伴侶」或有時簡稱為術語「分子伴侶」意欲意指特異性結合酸性α-葡糖苷酶，並且具有一個或多個以下的效果的分子： ● 增強蛋白質的穩定分子構象的形成； ● 增強蛋白質從內質網到另一個細胞位置，較佳的是天然的細胞位置的適當運輸，以便於防止蛋白質的內質網-相關降解； ● 防止構象不穩定或錯誤折疊的蛋白質的聚集； ● 恢復和/或增強蛋白質的至少部分的野生型功能、穩定性和/或活性；和/或 ● 改進具有酸性α-葡糖苷酶的細胞的表型或功能。

因此，用於酸性α-葡糖苷酶的藥物分子伴侶係結合酸性α-葡糖苷酶，導致酸性α-葡糖苷酶的適當的折疊、運輸、非聚集和活性的分子。如本文中所使用，該術語包括但不限於結合在酶、抑制劑或拮抗劑和激動劑的活性位點的活性位點特異性分子伴侶（ASSC）。在至少一個實施方式中，該藥物分子伴侶可以是酸性α-葡糖苷酶的抑制劑或拮抗劑。如本文中所使用，術語「拮抗劑」意欲意指結合酸性α-葡糖苷酶，並且部分地抑或完全地阻斷、抑制、降低或中和酸性α-葡糖苷酶活性的任何分子。在至少一個實施方式中，該藥物分子伴侶係麥格司他。用於酸性α-葡糖苷酶的藥物分子伴侶的另一個非限制性實例係去氧野尻黴素（duvoglustat）。

如本文中所使用，術語「活性位點」意欲意指與蛋白質的特定生物活性相關的以及蛋白質的特定生物活性必需的蛋白質區域。在至少一個實施方式中，該活性位元點可以是結合基質或其他結合配偶體的，並且有助於直接參與化學鍵的形成和斷裂的胺基酸殘基的位點。本發明中的活性位點可以涵蓋酶的催化位點、抗體的抗原結合位點、受體的配位基結合域、調節劑的結合域或分泌性蛋白的受體結合域。該等活性位點亦可以涵蓋轉錄啟動、蛋白質間相互作用或轉錄因數和調節子之DNA結合域。

如本文中所使用，術語「AUC」意欲意指用於評估身體對給定藥物的總暴露量隨時間的數學計算。在繪製給藥後，給予藥物的受試者的血液中的濃度如何隨時間而變化的圖中，藥物濃度變數位於y軸上，時間位於x軸上。對於指定時間間隔的藥物濃度曲線和x軸之間的面積係AUC（「曲線下面積」）。AUC用作給藥方案的指導，並且用於比較不同藥物在體內的可用性的生體可用率。

如本文中所使用，術語「C_最大 」意欲意指給予受試者後，藥物達到的最高血漿濃度。

如本文中所使用，術語「分佈體積」或「V」意欲意指在與在血漿中觀察到的相同濃度下，包含所給予的藥物的總量所必需的理論體積，並且表示藥物分佈在身體組織而不是血漿中的程度。V的更高值表明較大程度的組織分佈。「中心分佈體積」或「V_c 」意欲意指由血液高度灌流的血液和組織內的分佈體積。「外周分佈體積」或「V2」意欲意指外周組織內的分佈體積。

如在此可互換地使用，術語「清除率」、「系統清除率」或「CL」意欲意指每單位時間給予的藥物完全被清除的血漿體積。「外周清除率」意欲意指每單位時間給予的藥物被清除的外周組織的體積。

如本文中所使用，該「治療有效劑量」和「有效量」意欲意指足夠導致受試者治療反應的酸性α-葡糖苷酶的量，和/或麥格司他的量，和/或其組合的量。治療反應可以是使用者（例如，臨床醫生）將會識別為對治療的有效反應的任何反應，包括本文所述和本領域已知的任何替代性臨床標記物或症狀。因此，在至少一個實施方式中，治療反應可以是改進或抑制龐培氏病的一個或多個症狀或標記物，例如本領域已知的彼等。龐培氏病的症狀或標記物包括但不限於降低的酸性α-葡糖苷酶組織活性；心肌病；心臟肥大；進行性肌無力（尤其在軀幹或下肢）；深度低張症；巨舌（並且在一些病例中，舌突出）；吞咽、吮吸和/或攝食困難；呼吸功能不全；肝腫大（中等的）；面肌鬆弛；無反射；運動不耐受；運動性呼吸困難；端坐呼吸；睡眠呼吸中止；晨間頭痛；嗜眠症；脊柱前凸和/或脊柱側彎；減少的深腱反射；下背痛；以及不滿足發展性的動作發展指標。應當注意的是，出於本發明的目的，對酸性α-葡糖苷酶具有抑制作用的麥格司他的濃度可以構成「有效量」，係因為在體內給予時，麥格司他的稀釋（以及由於平衡變化導致的結合隨之轉變）、生體可用率和代謝。

如本文中所使用，術語「酶替代療法」或「ERT」意欲意指將非天然的、經純化的酶引入具有此種酶缺陷的個體中。給予的蛋白質可以從自然來源或藉由重組表現而獲得。該術語也指將經純化的酶引入個體，該個體在其他情況下需要或受益於給予的經純化的酶。在至少一個實施方式中，此類個體患有酶不足。該引入的酶可以是在體外產生的經純化的重組酶，或從離體組織或體液例如像胎盤或動物奶，或從植物純化的蛋白質。

如本文中所使用，術語「聯合治療」意欲意指同時地或連續地給予兩個或更多個個體化治療的任何療法。在至少一個實施方式中，與單獨進行每種治療時的效果相比，聯合治療的結果係增強的。增強可以包括，與藉由單獨進行治療時所實現的結果相比，可以產生有利的結果的不同治療的效果的任何改進。增強的效果或結果可以包括協同增強，其中增強的效果大於每種療法自身進行時的加和效應；加和增強，其中該增強效果係基本上等於每種治療自身進行時的加和效應；或小於協同效應，其中該增強的效果低於每種治療自身進行時的加和效應，但仍優於每種治療自身進行時的效果。增強的效果可以藉由本領域已知的可以量測的治療功效或結果的任何手段來量測。

如本文中所使用，術語「藥學上可接受的」意欲意指當給予人類時，生理上可耐受的，並且不會典型地產生不良反應的分子實體以及組成物。較佳的是，如本文中所使用，術語「藥學上可接受的」係指由聯邦或州政府的管理機構批准的或者在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的，用於在動物體內並且更具體地在人體內的使用。

如本文中所使用，術語「載體」意欲意指與化合物一起給予的稀釋劑、助劑、賦形劑或運載體。適合的藥物載體係本領域已知的，且在至少一個實施方式中，其描述於「雷明頓藥物科學」（「Remington's Pharmaceutical Sciences」），E. W.馬丁（E. W. Martin）著，第18版，或其他版本。

如本文中所使用，術語「受試者」或「患者」係意欲意指人類或非人類動物。在至少一個實施方式中，受試者係哺乳動物。在至少一個實施方式中，受試者係人類。

如本文中所使用，術語「抗藥物抗體」意欲意指特異性結合給予受試者的藥物並且由受試者產生的抗體，該抗體作為向受試者給予藥物的體液免疫反應的至少一部分。在至少一個實施方式中，該藥物係治療性蛋白質藥物產品。抗藥物抗體在受試者中的存在可以引起範圍從輕微到嚴重的免疫反應，包括但不限於危及生命的免疫反應，包括但不限於過敏反應、細胞介素釋放綜合症以及介導關鍵功能的內源性蛋白質的中和交叉反應。另外或可替代地，抗藥物抗體在受試者中的存在會降低該藥物的功效。

如本文中所使用，術語「中和抗體」意欲意指作用係中和藥物功能的抗藥物抗體。在至少一個實施方式中，該治療性蛋白質藥物產品係內源性蛋白質的對應物，其在受試者中表現減少或缺失。在至少一個實施方式中，該中和抗體可以作用以中和內源性蛋白質的功能。

如本文中所使用，術語「約」和「大約」係意欲意指對於給定量測的性質或精度的量測的量，可接受程度的誤差。例如，如本領域中所理解的，誤差的程度可以由為量測提供的有效數字的數量來指示，並且包括但不限於對於量測報告的最精確的有效數字中±1的變化。典型的示例性誤差程度係在給定值或值範圍的20%（%）內，較佳的是在10%內，並且更較佳的是在5%內。可替代地，並且特別是在生物系統中，術語「約」和「大約」可以意指係在給定值的一個數量級內，較佳的是在5倍以內，並且更較佳的是在2倍以內的值。除非另有說明，本文給出的數字量係大約的，意指當沒有明確說明時，可以推斷出術語「約」或「大約」。

如熟習該項技術者將理解的，如本文中使用的術語「同時地」意欲意指同時或在合理地短時段之前或之後內。例如，若用彼此同時給予兩種治療，一種治療可以在另一種治療之前或之後被給予，以允許需要的時間來準備該兩種治療的後者。因此，兩種治療的「同時給予」包括但不限於一種治療在另一種治療之後20分鐘或更短，約20分鐘、約15分鐘、約10分鐘、約5分鐘、約2分鐘、約1分鐘或比1分鐘更短。

如本文中使用的術語「藥學上可接受的鹽」意欲意指在合理醫學判斷的範圍內，適合與人類和低等動物的組織接觸使用而無不當毒性、刺激、過敏反應等，與合理的效益/風險比相稱的，通常是水或油可溶的或可分散的，並且對於它們的預期用途有效的鹽。術語包括藥學上可接受的酸加成鹽以及藥學上可接受的鹼加成鹽。適合的鹽的列表發現於，例如，S. M.伯奇（S. M. Birge）等人，藥物科學雜誌（J. Pharm. Sci.），1977, 66, 1-19頁，藉由引用結合在此。

如本文中使用的術語「藥學上可接受的酸加成鹽」意欲意指彼等保持生物有效性和游離鹼特性的，並且不是生物學或其他方面不希望的鹽，該等鹽用以下項形成：無機酸，包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、胺基磺酸、硝酸、磷酸等，以及有機酸，包括但不限於乙酸、三氟乙酸、己二酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟腦酸、樟腦磺酸、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙磺酸、麩胺酸、乙醇酸、甘油磷酸、半硫酸、己酸、甲酸、富馬酸、2-羥乙基磺酸（羥基乙磺酸）、乳酸、羥基馬來酸、蘋果酸、丙二酸、苯乙醇酸、均三甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、菸鹼酸、2-萘磺酸、草酸、撲酸、果膠酯酸、苯乙酸、3-苯丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、對甲苯磺酸、十一烷酸等。

如本文中使用的術語「藥學上可接受的鹼加成鹽」意欲意指彼等保持生物有效性和游離酸特性的，並且不是生物學或其他方面不希望的鹽，該等鹽用以下項形成：無機鹼，包括但不限於氨或銨或金屬陽離子，例如鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁等的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽。來源於藥學上可接受的有機無毒鹼的鹽包括但不限於以下項的鹽：一級、二級和三級胺、季胺化合物，取代胺包括天然存在的取代胺、環胺和鹼性離子交換樹脂，例如甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、異丙胺、三丙胺、三丁胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基乙醇胺、2-二乙胺基乙醇、二環己基胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、海巴明、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、胺基葡萄糖、甲葡糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪(piperazine)、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉(N-methylmorpholine)、二環己基胺、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羥甲胺、N,N'-二苄基乙二胺、聚胺樹脂等。

本發明提供了一種在對其有需要的患者中治療龐培氏病之方法，該方法包括將麥格司他或其藥學上可接受的鹽與重組人酸性α-葡糖苷酶組合給予患者，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且相比帶有阿葡糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量，該重組人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶具有低水平的具有末端半乳糖的複合多糖。在另一態樣中，本發明提供了麥格司他和該重組人酸性α-葡糖苷酶組合地用於在對其有需要的患者中治療龐培氏病的用途。

在至少一個實施方式中，將麥格司他口服給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他按以下口服劑量給予：約200 mg至約600 mg，或以口服劑量約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg、約400 mg、約450 mg、約500 mg、約550 mg或約600 mg。在至少一個實施方式中，將麥格司他以約233 mg至約400 mg的口服劑量給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他按以下口服劑量給予：約250至約270 mg，或按以下口服劑量給予：約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg。在至少一個實施方式中，將麥格司他按約260 mg的口服劑量給予。

熟習該項技術者將理解，麥格司他的口服劑量係在約200 mg至600 mg的範圍中，或在其中可適用於平均體重為約70 kg的成年患者的任何更小範圍中。對於體重顯著低於約70 kg的患者，包括但不限於嬰兒、兒童或體重不足的成人，醫生認為更小的劑量係適合的。因此，在至少一個實施方式中，將麥格司他按以下口服劑量給予：從約50 mg至約200 mg，或按以下口服劑量給予：約50 mg、約75 mg、約100 mg、125 mg、約150 mg、約175 mg或約200 mg。在至少一個實施方式中，將麥格司他按以下口服劑量給予：從約65 mg至約195 mg，或按以下口服劑量給予：約65 mg、約130 mg或約195 mg。

在至少一個實施方式中，將麥格司他按適合口服給予的藥學上可接受的劑型給予，並且包括但不限於片劑、膠囊、珠粒劑（ovule）、酏劑、溶液或混懸劑、凝膠劑、糖漿劑、漱口劑，或在使用前用水或其他適合的運載體復水的乾粉，視情況具有用於速釋、延遲釋放、改性釋放、持續釋放、脈衝釋放或控制釋放應用的調味劑和著色劑。亦可以使用固體組成物，例如片劑、膠囊、錠劑、軟錠劑、丸劑、大丸劑、粉劑、糊劑、顆粒劑、子彈劑、糖衣丸或預混製劑。在至少一個實施方式中，將麥格司他作為片劑給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他作為膠囊給予。在至少一個實施方式中，該劑型包含從約50 mg至約300 mg的麥格司他。在至少一個實施方式中，該劑型包含約65 mg的麥格司他。在至少一個實施方式中，該劑型包含約130 mg的麥格司他。在至少一個實施方式中，該劑型包含約260 mg的麥格司他。預期當該劑型包含約65 mg的麥格司他時，麥格司他可以按四種劑型，或總劑量260 mg的麥格司他給予。然而，對於具有體重顯著低於平均成年人的70 kg體重的患者，包括但不限於嬰兒、兒童或體重不足的成人，將麥格司他可以按以下劑型的劑量給予：一個劑型（總劑量65 mg的麥格司他）、兩個劑型（總劑量130 mg的麥格司他）或三個劑型（總劑量195 mg的麥格司他）。

可以根據本領域已知的方法來製備用於口服使用的固體和液體組成物。此類組成物亦可以包含一種或多種藥學上可接受的、可以是固體或液體形式的載體和賦形劑。片劑或膠囊可以藉由常規手段與藥學上可接受的賦形劑（包括但不限於黏合劑、填充劑、潤滑劑、崩散劑或潤濕劑）一起來製備。適合的藥學上可接受的賦形劑係本領域已知的，並且包括但不限於預膠化澱粉、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、羥丙基甲基纖維素（HPMC）、羥丙基乙基纖維素（HPEC）、羥丙基纖維素（HPC）、蔗糖、明膠、阿拉伯樹膠、乳糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣、硬脂酸鎂、硬脂酸、二十二酸甘油酯、滑石、矽石、玉米、馬鈴薯或木薯澱粉、澱粉乙醇酸鈉、十二烷基硫酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸鈣、二鹼式磷酸鈣、甘胺酸交聯羧甲基纖維素鈉以及矽酸鹽複合物。片劑可以藉由本領域熟知的方法來包衣。在至少一個實施方式中，將麥格司他作為可商購的配製物，如Zavesca®（Actelion Pharmaceuticals公司）給予。

在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且相比帶有阿葡糖苷酶α的一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量，該重組人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。在至少一個實施方式中，該酸性α-葡糖苷酶係如本文所稱為ATB200的重組人酸性α-葡糖苷酶，如在共同未決的國際專利申請案PCT/US2015/053252中描述。ATB200已經展示出以高親和力結合陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CIMPR)（K_D ~ 2-4 nM），並且由龐培氏纖維母細胞和骨骼肌成肌細胞（K _攝取 ~ 7-14 nM）有效內化。ATB200在體內表徵，並且展示出具有比阿葡糖苷酶α（t_1/2 ~ 60 min）更短的表觀血漿半衰期（t_1/2 ~ 45 min）。

在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶係具有如在以下項中所示的胺基酸序列的酶：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2（或如由SEQ ID NO: 2編碼的）、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5。

在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 1中所示的野生型GAA胺基酸序列，如在美國專利案第8,592,362號中進行了描述，並且具有基因庫登錄號AHE24104.1（GI:568760974）。在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 2編碼的野生型GAA胺基酸序列，該mRNA序列具有基因庫登錄號Y00839.1。在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 3中所示的野生型GAA胺基酸序列。在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 4中所示的GAA胺基酸序列，並且具有國家生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information）（NCBI）登錄號NP_000143.2。在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶係葡糖苷酶α，由最主要的九個觀察到的GAA基因的單倍型編碼的人酸性α-葡糖苷酶。

在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶最初表現為具有在如SEQ ID NO: 1中所示的野生型GAA的全長952胺基酸序列，並且該重組人酸性α-葡糖苷酶經歷去除一部分胺基酸，例如，前56個胺基酸的細胞內加工。因此，由宿主細胞分泌的該重組人酸性α-葡糖苷酶可以具有相比在細胞內最初表現的重組人酸性α-葡糖苷酶更短的胺基酸序列。在至少一個實施方式中，該更短的蛋白質可以具有在SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列，其僅與SEQ ID NO: 1不同在於最初的56個胺基酸包括已經被去除的信號肽和先質肽，因此產生具有896個胺基酸的蛋白質。胺基酸數目的其他變化也是可能的，例如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5描述的胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。在一些實施方式中，該rhGAA產物包括具有不同胺基酸長度的重組人酸性α-葡糖苷酶分子的混合物。

在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶在蛋白質的一個或多個胺基酸殘基處經歷翻譯後修飾和/或化學修飾。例如，甲硫胺酸和色胺酸殘基可以經歷氧化反應。作為另一個實例，N-端麩胺醯胺可以形成焦麩胺酸。作為另一個實例，天冬醯胺殘基可以經歷脫醯胺作用以形成天冬胺酸。作為又另一個實例，天冬胺酸殘基可以經歷異構化作用以形成異天冬胺酸。作為又另一個實例，蛋白質中未配對的半胱胺酸殘基可以與游離麩胱甘肽和/或半胱胺酸形成二硫鍵。因此，在一些實施方式中，該酶最初表現為具有如在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO：2（或如由SEQ ID NO: 2編碼的）、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5中所示的胺基酸序列，並且該酶經歷一個或多個該等翻譯後修飾和/或化學修飾。此類修飾也在本揭露的範圍內。

也考慮編碼GAA和此類變體人GAA的多核苷酸序列，並且可以根據本發明用於重組表現rhGAA。

較佳的是，不多於70%、65%、60%、55%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的總重組人酸性α-葡糖苷酶分子缺少帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，或缺少結合陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）的能力。可替代地，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、＜ 100%或更多的該重組人酸性α-葡糖苷酶分子包括帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的至少一個N-聚糖單元，或具有結合CIMPR的能力。

該重組人酸性α-葡糖苷酶分子在它們的聚糖上可以具有1、2、3或4個甘露糖-6-磷酸（M6P）基團。例如，在重組人酸性α-葡糖苷酶分子上的唯一一個N-聚糖可以帶有M6P（單-磷酸化的），單個N-聚糖可以帶有兩個M6P基團（雙-磷酸化的），或相同的重組人酸性α-葡糖苷酶分子上的兩個不同的N-聚糖可以各自帶有單個M6P基團。重組人酸性α-葡糖苷酶分子亦可以具有不帶有M6P基團的N-聚糖。在另一個實施方式中，平均來說，N-聚糖包含大於2.5 mol/mol的M6P和大於4 mol/mol的唾液酸，此使得該重組人酸性α-葡糖苷酶包括平均至少2.5莫耳的甘露糖-6-磷酸殘基/莫耳的重組人酸性α-葡糖苷酶，以及至少4莫耳的唾液酸/莫耳重組人酸性α-葡糖苷酶。平均來說，在重組人酸性α-葡糖苷酶上的至少約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的總聚糖可以處於單-M6P聚糖形式，例如，約6.25%的總聚糖可以攜帶單個M6P基團，並且平均來說，在重組人酸性α-葡糖苷酶上的總聚糖的至少約0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%係處於雙-M6P聚糖形式，並且平均來說，少於25%的總重組人酸性α-葡糖苷酶不包含結合CIMPR的經磷酸化的聚糖。

該重組人酸性α-葡糖苷酶可以具有攜帶M6P的N-聚糖的平均含量從0.5至7.0 mol/mol範圍的重組人酸性α-葡糖苷酶，或子範圍的任意中間值，包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0 mol/mol重組人酸性α-葡糖苷酶。可以將該重組人酸性α-葡糖苷酶分級以提供具有不同平均數量的帶有M6P或帶有雙M6P的聚糖的重組人酸性α-葡糖苷酶製劑，從而藉由選擇特定級分或藉由選擇性組合不同級分以允許進一步客製化靶向在目標群組織中的溶酶體的重組人酸性α-葡糖苷酶。

在重組人酸性α-葡糖苷酶上高達60%的N-聚糖可以被完全地唾液酸化，例如，高達10%、20%、30%、40%、50%或60%的該N-聚糖可以被完全地唾液酸化。在一些實施方式中，從4%至20%的總N-聚糖被完全地唾液酸化。在其他實施方式中，在重組人酸性α-葡糖苷酶上不多於5%、10%、20%或30%的N-聚糖攜帶唾液酸和末端的半乳糖殘基（Gal）。此範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在重組人酸性α-葡糖苷酶上7%至30%的總N-聚糖可以攜帶唾液酸和末端半乳糖。在又其他實施方式中，在重組人酸性α-葡糖苷酶上不多於5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的N-聚糖僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。此範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在組成物中重組人酸性α-葡糖苷酶上從8%至19%的總N-聚糖可以僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。

在本發明的其他實施方式中，在重組人酸性α-葡糖苷酶上的40%、45%、50%、55%至60%的總N-聚糖係複合物型N-聚糖；或重組人酸性α-葡糖苷酶上不多於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的總N-聚糖係混合型N-聚糖；在重組人酸性α-葡糖苷酶上不多於5%、10%或15%的高甘露糖型N-聚糖係非-磷酸化的；在重組人酸性α-葡糖苷酶上至少5%或10%的高甘露糖型N-聚糖係單-M6P磷酸化的；和/或在重組人酸性α-葡糖苷酶上至少1%或2%的高甘露糖型N-聚糖係雙-M6P磷酸化的。該等值包括所有的中間值和子範圍。重組人酸性α-葡糖苷酶可以滿足上述描述的一個或多個含量範圍。

在一些實施方式中，平均來說，該重組人酸性α-葡糖苷酶將帶有2.0至8.0莫耳的唾液酸殘基/莫耳重組人酸性α-葡糖苷酶。此範圍包括所有的中間值和子範圍，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0 mol殘基/mol重組人酸性α-葡糖苷酶。不受理論的約束，據信帶有唾液酸殘基的N-聚糖單元的存在可以藉由脫唾液酸蛋白受體來防止重組人酸性α-葡糖苷酶的非產生性清除。

在一個或多個實施方式中，在重組人溶酶體蛋白質的某些N-糖基化位點處該rhGAA具有M6P和/或唾液酸單元。例如，在rhGAA上存在七個潛在的N-聯糖基化位點。該等潛在的糖基化位點在SEQ ID NO: 5的以下位置處：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。相似地，對於SEQ ID NO: 1的全長胺基酸序列，該等潛在的糖基化位點係在以下位置處：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。取決於天冬醯胺殘基的位置，rhGAA的其他變體可以具有相似的糖基化位點。通常，除了X不能是HIS或PRO，在蛋白質胺基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潛在的糖基化位點。

在不同的實施方式中，該rhGAA具有某一N-糖基化特性。在一個或多個實施方式中，在第一N-糖基化位點處至少20%的該rhGAA係經磷酸化的（例如，SEQ ID NO: 5的N84以及SEQ ID NO: 1的N140）。例如，在第一N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施方式中，在第一N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施方式中，在第一N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。

在一個或多個實施方式中，在第二N-糖基化位點處(例如，SEQ ID NO: 5的N177，以及SEQ ID NO: 1的N223），至少20%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，在第二N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施方式中，在第二N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施方式中，在第二N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。在一個或多個實施方式中，在第三N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 5的N334，以及SEQ ID NO: 1的N390）至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施方式中，在第三N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係磷酸化的。例如，該第三N-糖基化位點可以具有作為主要種類的非-磷酸化的高甘露糖聚糖、二-、三-和四-觸角複合聚糖，以及混合聚糖的混合物。在一些實施方式中，在第三N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施方式中，在第四N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 5的N414，以及SEQ ID NO: 1的N470），至少20%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，在第四N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施方式中，在第四N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施方式中，在第四N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。在一些實施方式中，在第四N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施方式中，在第五N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 5的N596，以及SEQ ID NO: 1的N692），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施方式中，在第五N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，該第五N-糖基化位點可以具有作為主要種類的岩藻糖化的二-觸角複合聚糖。在一些實施方式中，在第五N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施方式中，在第六N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 5的N826，以及SEQ ID NO: 1的N882），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施方式中，在第六N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，該第六N-糖基化位點可以具有作為主要種類的二-、三-和四-觸角複合聚糖的混合物。在一些實施方式中，在第六N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施方式中，在第七N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 5的N869，以及SEQ ID NO: 1的N925），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施方式中，在第七N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。在一些實施方式中，在第七N-糖基化位點處，少於40%、45%、50%、55%、60%或65%的該rhGAA具有任何聚糖。在一些實施方式中，在第七N-糖基化位點處，至少30%、35%或40%的該rhGAA具有一個聚糖。

較佳的是，該重組人酸性α-葡糖苷酶係由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，例如CHO細胞系GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或由此類CHO細胞培養的繼代培養物或衍生物產生的。表現酸性α-葡糖苷酶的等位變體或其他變體酸性α-葡糖苷酶胺基酸序列（例如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5至少90%、95%、98%或99%一致的那些）的DNA構建體可以在CHO細胞中構建和表現。該等變體酸性α-葡糖苷酶胺基酸序列相對SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5可以包含缺失、取代和/或插入，例如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5描述的胺基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。熟習該項技術者可以選擇適合於轉化CHO細胞以產生此類DNA構建體的替代載體。

可以使用不同比對演算法和/或程式來計算兩個序列之間的一致性，包括可用作GCG序列分析包（威斯康辛大學，麥迪森市，威斯康辛州）的一部分的FASTA或BLAST，並且可以使用例如，默認設置。例如，預期與本文所述的特定多肽具有至少90%、95%、98%或99%一致性，並且較佳的是表現出基本相同功能的多肽，連同編碼此類多肽的多核苷酸。除非另有說明，相似性分數將基於BLOSUM62的使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性得分，並且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性得分。BLASTP「一致性」展示出相同的高分序列對中總殘基的數量和分數；並且BLASTP「陽性」展示出具有正值的比對分數並且彼此相似的殘基的數量和分數。本揭露預期和涵蓋與本文揭露的胺基酸序列具有該等程度的一致性或相似性或任何中間程度的一致性或相似性的胺基酸序列。使用遺傳密碼推導出的相似多肽的多核苷酸序列，並且可以藉由常規手段獲得，特別是藉由使用遺傳密碼來逆轉錄其胺基酸序列。

本發明的諸位發明人已經發現，可以使用中國倉鼠卵巢（CHO）細胞產生重組人酸性α-葡糖苷酶以及糖基化模式，該重組人酸性α-葡糖苷酶具有靶向陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）和細胞的溶酶體的優異能力，該糖基化模式降低其體內非產生性清除。相比常規的重組人酸性α-葡糖苷酶產物（例如阿葡糖苷酶α）可以用顯著更高水平的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元來誘導該等細胞表現重組人酸性α-葡糖苷酶。相比常規的酸性α-葡糖苷酶（例如Lumizyme®），由該等細胞產生的該重組人酸性α-葡糖苷酶，例如，如由ATB200例證的，具有顯著更多的肌細胞靶標甘露糖-6-磷酸（單-M6P）和雙-甘露糖-6-磷酸（雙-M6P）N-聚糖殘基。不受理論的約束，據信此種廣泛的糖基化允許ATB200酶被更有效地吸收到靶細胞中，並且因此相比其他重組人酸性α-葡糖苷酶（例如例如，具有遠遠更低的M6P和雙-M6P含量的阿葡糖苷酶α）更有效地從循環中清除。已經展示出ATB200有效地結合CIMPR，並且被骨骼肌和心肌有效吸收，並且具有提供有利的藥代動力學曲線和減少體內非產生性清除的糖基化模式。

相比例如阿葡糖苷酶α，亦預期ATB200的廣泛糖基化可以有助於ATB200免疫原性的降低。如熟習該項技術者將理解的，具有保守的哺乳動物糖的蛋白質的糖基化通常增強產物溶解度，並且減少產物的聚集和免疫原性。糖基化藉由最小化蛋白質聚集連同藉由從免疫系統中遮罩免疫原性蛋白質表位來間接改變蛋白質免疫原性（用於治療性蛋白質產物的工業-免疫原性的指導（Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products），美國衛生和人類服務部，食品與藥品管理局，藥物評估和研究中心，生物製劑評估和研究中心，2014年8月）。因此，在至少一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶的給予不會引起抗藥物抗體。在至少一個實施方式中，相比藉由給予阿葡糖苷酶α引起的抗藥物抗體的水平，該重組人酸性α-葡糖苷酶的給予引起更低發生率的受試者中的抗藥物抗體。

如在共同未決的國際專利申請案PCT/US2015/053252中所述，可以使用細胞（例如，CHO細胞）來產生其中所述的rhGAA，並且該rhGAA可以用於本發明。此類CHO細胞系的實例係產生如其中所述的rhGAA組成物的GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14，或其繼代培養物。此類CHO細胞系可以包含編碼GAA的多核苷酸的基因的多個拷貝，例如5、10、15或20或更多個拷貝。

該高M6P和雙-M6P rhGAA（例如ATB200 rhGAA）可以藉由用編碼GAA的DNA構建體轉化CHO細胞來產生。儘管以前CHO細胞已用於製備rhGAA，但是不認為轉化的CHO細胞可以按產生具有高含量的靶向CIMPR的M6P的rhGAA和雙-M6P聚糖的rhGAA的方式進行培養和選擇。

出人意料地，發現可能轉化CHO細胞系，選擇產生包含高含量的帶有靶向CIMPR的M6P或雙-M6P的聚糖的rhGAA，並穩定表現該高-M6P rhGAA的轉化體。因此，用於製備該等CHO細胞系的方法亦描述在共同未決的國際專利申請案PCT/US2015/053252中。該方法涉及用編碼GAA或GAA變體的DNA轉化CHO細胞，選擇將編碼GAA的DNA穩定整合到其一個或多個染色體中並穩定表現GAA的CHO細胞，並且選擇表現具有高含量的帶有M6P或雙-M6P的聚糖的GAA的CHO細胞，以及視情況選擇具有高唾液酸含量的N-聚糖和/或具有低非磷酸化的高甘露糖含量的N-聚糖的CHO細胞。

在至少一個實施方式中，GAA具有低水平的具有末端半乳糖的複合聚糖。

藉由培養該CHO細胞系，並且從CHO細胞培養中回收所述的組成物，該等CHO細胞系可以用於產生rhGAA和rhGAA組成物。

該重組人酸性α-葡糖苷酶或其藥學上可接受的鹽可以根據常規程序配製為適合給予人的藥物組成物。例如，在一個較佳的實施方式中，用於靜脈內給予的組成物係在無菌等滲水緩衝液中的溶液。必要時，該組成物亦可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位的疼痛。通常，將成分分開或混合在一起以單位劑型提供，例如，作為在氣密封容器中的乾燥凍乾粉或無水濃縮劑，氣密封容器例如係指明活性劑的量的安瓿或小藥囊。在藉由輸注給予組成物時，可以用包含無菌藥用級的水、鹽水或右旋糖/水的輸液瓶分配。在藉由注射給予組成物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，使得可以在給予前將該等成分混合。

藉由適當的途徑給予重組人酸性α-葡糖苷酶（或包含重組人酸性α-葡糖苷酶的組成物或藥物）。在一個實施方式中，該重組人酸性α-葡糖苷酶係靜脈給予的。在其他實施方式中，藉由直接給予靶標組織（例如至心臟或骨骼肌（例如，肌內））或神經系統（例如，直接注射到腦中；腦室內；鞘內）來給予重組人酸性α-葡糖苷酶。必要時，可以同時使用多於一個途徑。

將該重組人酸性α-葡糖苷酶（或包含重組人酸性α-葡糖苷酶的組成物或藥物）以治療有效量給予（例如，當以規律的間隔給予時，足以治療疾病的劑量，例如藉由減輕與疾病相關的症狀，預防或延遲疾病的發作，和/或減小疾病的症狀的嚴重性或頻率）。在治療疾病中將是治療有效的量將取決於疾病效果的性質和程度，並且可以藉由標準臨床技術來確定。另外，可以視情況採用體外或體內測定來幫助鑒定最佳劑量範圍。要採用的確切劑量亦取決於給予途徑和疾病的嚴重程度，並且應根據醫生的判斷和每個患者的情況來決定。有效劑量可以從源自體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推。在至少一個實施方式中，將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約5 mg/kg至約30 mg/kg，典型地約5 mg/kg至約20 mg/kg的劑量藉由靜脈輸注給予。在至少一個實施方式中，將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg或約20 mg/kg的劑量藉由靜脈輸注給予。在至少一個實施方式中，將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約20 mg/kg的劑量藉由靜脈輸注給予。對具體個體的有效劑量可以是隨著時間變化的（例如，增加的或減少的），取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或壓力的時候，或若抗-酸性α-葡糖苷酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，該量可以增加。

以規律的間隔給予的重組人酸性α-葡糖苷酶（或包含重組人酸性α-葡糖苷酶的組成物或藥物）的治療有效量取決於疾病效果的性質和程度，以及正在進行中的基礎。如本文中所使用，以「規律的間隔」給予表示，將該治療有效量定期地給予（如區別於一次性劑量）。該間隔可以藉由標準臨床技術來確定。在較佳的實施方式中，將重組人酸性α-葡糖苷酶以每月、雙月；每週；每週兩次；或每日給予。對於單個個體的給藥間隔不需要是固定的間隔，但是可以是隨時間變化的，其取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或壓力的時候，若抗-重組人酸性α-葡糖苷酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，劑量之間的該間隔可以是減少的。在一些實施方式中，將5、10、20、50、100或200 mg酶/kg體重的治療有效量以每週兩次、每月或每隔一週，伴有或不伴有分子伴侶給予。

本發明的該重組人酸性α-葡糖苷酶可以製備用於以後使用，例如在單位劑量小瓶或注射器中，或在用於靜脈給予的瓶或袋中。包含重組人酸性α-葡糖苷酶的套組連同視情況賦形劑或其他活性成分，例如分子伴侶或其他藥物，可以封裝在包裝材料中，並且附有用於復水、稀釋或定量給藥的說明書，用於治療對其有需要的受試者，例如患有龐培氏病的患者。

在至少一個實施方式中，將麥格司他和該重組人酸性α-葡糖苷酶同時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他和該重組人酸性α-葡糖苷酶順序給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前少於三小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約兩小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前少於兩小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約1.5小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約一小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約50分鐘至約70分鐘給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約55分鐘至約65分鐘給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約30分鐘給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約25分鐘至約35分鐘給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前約27分鐘至約33分鐘給予。

在至少一個實施方式中，將麥格司他與該重組人酸性α-葡糖苷酶的給予同時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予20分鐘之前或之後給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予15分鐘之前或之後給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予10分鐘之前或之後給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予5分鐘之前或之後給予。

在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之後給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之後高達2小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之後約30分鐘給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之後約一小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之後約1.5小時給予。在至少一個實施方式中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之後約2小時給予。

本發明的另一態樣提供了用於在對其有需要的患者中用於聯合治療龐培氏病的一種套組。該套組包括包含麥格司他的藥學上可接受的劑型，包含如本文定義的重組人酸性α-葡糖苷酶的藥學上可接受的劑型，以及用於將包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型和包含重組酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型給予至對其有需要的患者的說明。在至少一個實施方式中，包含麥格司他的藥學上可接受的劑型係如本文所描述的口服製劑，包括但不限於片劑或膠囊。在至少一個實施方式中，包含重組人酸性α-葡糖苷酶的藥學上可接受的劑型係如本文所描述的適合注射的無菌溶液。在至少一個實施方式中，用於給予該等劑型的說明包括將包含麥格司他的藥學上可接受的劑型在藉由靜脈輸注包含如本文所描述的重組人酸性α-葡糖苷酶的藥學上可接受的劑型之前口服給予的說明。

不受理論束縛，據信麥格司他充當該重組人酸性α-葡糖苷酶ATB200的藥物分子伴侶，並且結合其活性位點。因此，如圖1所示，已發現麥格司他降低了解折疊的ATB200蛋白的百分比，並且穩定了ATB200的活性構象，防止在血漿的中性pH下變性和不可逆的失活，並且允許其在循環中存活條件足夠長以到達組織，並且被組織吸收。然而，麥格司他結合至ATB200活性位點，藉由防止天然基質肝糖接近該活性位點亦可以導致ATB200酶活性的抑制。據信當在本文所描述的條件下將麥格司他和該重組人酸性α-葡糖苷酶給予患者時，在血漿和組織中的麥格司他和ATB200的濃度係如此以使得ATB200穩定，直到它可以被吸收到組織中並且靶向溶酶體，但是由於麥格司他的快速清除，ATB200在溶酶體中的肝糖水解不是藉由麥格司他的存在而過度地抑制，並且該酶保留足夠的活性係治療有用的。

上述所有實施方式可以進行組合。此包括在具體實施方式中涉及： 藥物分子伴侶，例如，麥格司他的性質；以及其特異性針對的活性位點； 藥物分子伴侶（麥格司他）的劑量、給予途徑和包括載體性質的藥物組成物的類型以及市售組成物的用途； 該藥物的性質，例如，治療性蛋白質藥物產品可以是在受試者中用來表現的內源性蛋白質的對應物減少或缺失，適合地是重組人酸性α-葡糖苷酶，例如該重組人酸性α-葡糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比帶有阿葡糖苷酶α的一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量，該重組人酸性α-葡糖苷酶包括含量增加的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元；並且適合地具有如在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2（或如由SEQ ID NO: 2編碼的）、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所展示的胺基酸序列； 在重組人酸性α-葡糖苷酶上的N-聚糖單元，例如，附接至該重組人酸性α-葡糖苷酶的N-乙醯胺基葡萄糖、半乳糖、唾液酸或由該等組合而形成的複合物N-聚糖的數目和類型； 在重組人酸性α-葡糖苷酶上的甘露糖單元形成甘露糖-6-磷酸和/或雙-甘露糖-6-磷酸的磷酸化作用的程度； 該替代酶（重組人酸性α-葡糖苷酶）的劑量和給予途徑（例如，靜脈給予，尤其是靜脈輸注，或直接給予該靶組織）以及包括載體的配製物的類型和治療有效量； 該藥物分子伴侶（麥格司他）和該重組人酸性α-葡糖苷酶的劑量間隔； 治療反應的性質和聯合治療的結果（例如，與單獨進行的每種治療的效果相比有增強的結果）； 聯合治療的給予時間，例如，將麥格司他和該重組人酸性α-葡糖苷酶同時給予或順序給予，例如其中將麥格司他在該重組人酸性α-葡糖苷酶之前或在該重組人酸性α-葡糖苷酶之後或在該重組人酸性α-葡糖苷酶給予之前或之後某一時間內給予；以及 所治療的患者（例如，哺乳動物，例如人）的性質以及個體所患有的病症（例如，酶不足）。

以上清單中的任何實施方式可以與清單中的一個或多個其他實施方式進行組合。實例：

本發明的其他特徵將從以下非限制性實施中變得明顯，藉由實例的方式說明本發明的原理。 實例1：現有美爾贊®和Lumizyme® rhGAA產品的限制

為了評估在美爾贊®和Lumizyme®中的rhGAA在目前僅有的針對龐培氏病的批准的治療中的能力，將該等rhGAA製劑注射到CIMPR柱（其結合具有M6P基團的rhGAA）上，並且隨後用游離M6梯度進行洗提。將級分在96孔板中收集，並且藉由4MU-α-葡萄糖基質測定GAA活性。結合和未結合的rhGAA的相對量基於GAA活性來確定，並且報告為總酶的分數。

圖2A-B描述了與常規的ERT（美爾贊®和Lumizyme®）相關的問題：在美爾贊®中73%的rhGAA（圖2B）和Lumizyme®中78%的rhGAA（圖2A）未結合至CIMPR，參見在每個圖中最左側的峰。在美爾贊®中只有27%的rhGAA和在Lumizyme®中的22%的rhGAA包含M6P，該M6P可以有效地靶向它至肌細胞上的CIMPR。

美爾贊®和Lumizyme®的有效劑量對應於包含M6P的rhGAA的量，該M6P靶向肌細胞上的CIMPR。然而，在此類兩種常規的產品中大部分的rhGAA不靶向目標肌細胞上的CIMPR受體。常規rhGAA的給予中大部分的rhGAA不靶向肌肉細胞，增加了對非靶向rhGAA的過敏反應或誘導免疫的風險。 實例2：產生具有高含量的帶有單-或雙-M6P的N-聚糖的ATB200 rhGAA的CHO細胞的製備。

用表現rhGAA的DNA轉染CHO細胞，隨後選擇產生rhGAA的轉化體。用於用編碼rhGAA的DNA轉化CHO細胞的DNA構建體在圖3中圖示。用表現rhGAA的DNA轉染CHO細胞，隨後選擇產生rhGAA的轉化體。

轉染後，用次黃嘌呤/胸苷缺陷（-HT）培養基來選擇包含穩定整合的GAA基因的DG44 CHO（DHFR-）細胞。藉由甲胺喋呤處理（MTX，500 nM）來誘導在該等細胞中的GAA表現的擴增。

藉由GAA酶活性測定來鑒定大量表現的GAA的細胞池，並且用於建立產生rhGAA的單個殖株。在半固體培養基平板上產生單個殖株，藉由ClonePix系統挑選，並且轉移至24深孔板。針對GAA酶活性測定單個殖株，以鑒定表現高水平GAA的殖株。用於確定GAA活性的條件培養基使用4-MU-α-葡哌喃糖苷α-葡糖苷酶(4-MU-α-glucopyranoside α-glucosidase)基質。針對生存力、生長能力、GAA生產率、N-聚糖結構和穩定的蛋白質表現來進一步評估如藉由GAA酶測定量測的產生更高水平的GAA的殖株。使用此程序分離CHO細胞系，包括表現具有增強的單-M6P或雙-M6P N-聚糖的rhGAA的CHO細胞系GA-ATB-200。 實例3：ATB200 rhGAA的捕獲和純化

根據本發明的多批次的rhGAA在搖瓶中產生，並且在灌注生物反應器中使用CHO細胞系GA-ATB-200和CIMPR結合進行量測。針對來自不同生產批次的經純化的ATB200 rhGAA，觀察到與在圖4B和圖5A中所示彼等相似的CIMPR受體結合（大約70%），表明ATB200 rhGAA可以一致地產生。如圖2A、2B、4A和4B所示，與ATB200 rhGAA相比，美爾贊®和Lumizyme® rhGAA顯示出顯著少的CIMPR結合。 實例4：ATB200與Lumizyme®的分析比較

使用弱陰離子交換（「WAX」）液相色譜法，根據末端磷酸根進行ATB200 rhGAA的分級。藉由用遞增量的鹽洗提ERT來產生洗提圖。藉由UV（A280 nm）監測該圖。從CHO細胞獲得ATB200 rhGAA，並且進行純化。Lumizyme®獲得自商業來源。Lumizyme®在其洗提圖的左側顯示出一個高峰。ATB200 rhGAA顯示洗提在Lumizyme®右側的四個顯著的峰（圖6）。此證實ATB200 rhGAA被磷酸化到比Lumizyme®更大的程度，因為此種評估係藉由末端電荷而不是CIMPR親和力。 實例5：ATB200 rhGAA的寡糖表徵

藉由MALDI-TOF來評估經純化的ATB200 rhGAA和Lumizyme®聚糖，以確定在每個ERT上發現的單個聚糖結構（圖7）。相比Lumizyme®，發現ATB200樣品包含更少量的非-磷酸化的高-甘露糖型N-聚糖。相比在Lumizyme®，在ATB200中更高含量的M6P聚糖更有效地靶向ATB200 rhGAA至肌細胞。由MALDI確定的高百分比的單-磷酸化和雙-磷酸化的結構與CIMPR圖一致，其說明ATB200與CIMPR受體的顯著更大的結合。經由MALDI-TOF質譜分析法的N-聚糖分析證實了平均每個ATB200分子包含至少一個中性的雙-M6P N-聚糖結構。ATB200 rhGAA上的此種更高的雙-M6P N-聚糖含量與M6P受體板結合測定中的高親和力結合CIMPR正相關（KD約2-4 nM）（圖9A）。

使用兩種不同的LC-MS/MS分析技術，針對位點特異性N-聚糖圖亦分析了ATB200 rhGAA。在第一次分析中，在LC-MS/MS分析之前，將該蛋白質變性、還原、烷基化和消化。蛋白質變性和還原期間，將200 µg的蛋白質樣品、5 μL 1 mol/L tris-HCl（終濃度50 mM）、75 μL 8 mol/L胍HCl（終濃度6 M）、1 μL 0.5 mol/L EDTA（終濃度5 mM）、2 μL 1 mol/L DTT（終濃度20 mM）以及Milli-Q®水添加至1.5 mL試管中，以提供100 µL的總體積。在乾浴中，將該樣品混合，並且在56℃下培養30分鐘。烷基化作用期間，將該變性的和還原的蛋白質樣品與5 μL 1 mol/L碘乙醯胺（IAM，終濃度50 mM）混合，隨後在黑暗中10℃-30℃下培養30分鐘。烷基化作用之後，將400 μL預冷的丙酮添加至該樣品中，並且將該混合物在-80℃製冷中冷凍4小時。隨後將該樣品在4℃，在13000 rpm下離心5 min，並且將上清液去除。將400 μL的預冷的丙酮添加至球粒，隨後將其在4℃，在13000 rpm下離心5 min，並且將上清液去除。隨後將該樣品在黑暗中，在冰上風乾以去除丙酮殘餘。將40 μL的8 M尿素和160 μL的100 mM NH4HCO3添加至該樣品，以溶解該蛋白質。胰蛋白酶消化期間，隨後將50 μg的該蛋白質與胰蛋白酶消化緩衝液添加至100 μL終體積，並且添加5 μL 0.5 mg/mL胰蛋白酶（20/1 w/w的蛋白與酶的比率）。將該溶液混合良好，並且在37℃下培養過夜（16 ± 2小時）。添加2.5 μL 20% TFA（終濃度0.5%）以中止該反應。隨後使用Thermo Scientific Orbitrap Velos ProTM質譜儀來分析該樣品。

在第二LC-MS/MS分析中，根據相似的變性、還原、烷基化和消化程序來製備ATB200樣品，除了使用碘乙酸（IAA）代替IAM作為烷基化試劑，並且隨後使用Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos TribidTM質譜儀進行分析。

在第三LC-MS/MS分析中，根據相似的變性、還原、烷基化和消化程序來製備ATB200樣品，使用碘乙醯胺（IAM）作為烷基化試劑，並且隨後使用Thermo Scientific Orbitrap Fusion質譜儀進行分析。

第一和第二分析的結果在圖8B-8H中圖示，並且第三分析的結果在圖8A中圖示。在圖8B-8H中，第一分析的結果由左條（深灰色）表示，並且來自第二分析的結果由右條（淺灰色）表示。在圖8B-8H中，用於聚糖表現的符號命名法根據瓦爾基 A（Varki, A.）、卡明斯，R.D.（Cummings, R.D.）、艾斯克J.D.（Esko J.D.）等人，糖生物學要領（Essentials of Glycobiology），第2版（2009）。在圖8A-8H中，給定該等潛在的糖基化位點相對於SEQ ID NO: 5：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。對於SEQ ID NO: 1的全長胺基酸序列，該等潛在的糖基化位點係在以下位置處：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。

從圖8B-8H可以看出，初始的兩個分析提供了相似的結果，儘管在結果之間存在一些變化。該變化可以歸因於多個因素，包括使用的儀器和N-聚糖分析的完整性。例如，若一些種類的磷酸化的聚糖未被鑒定和/或未被定量，則磷酸化的聚糖的總數可能是未被充分表示的，並且在該位點帶有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是未被充分表示的。作為另一個實例，若一些種類的非-磷酸化的聚糖未被鑒定和/或未被定量，則非-磷酸化的聚糖的總數可能是未被充分表示的，並且在該位點帶有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是過度表示的。

圖8A圖示了ATB200的N-糖基化位點佔有率。從圖8A可以看出，第一、第二、第三、第四、第五和第六N-糖基化位點大部分被佔據，其中大約90%且高達約100%的具有在每個潛在位點處偵測到的聚糖的ATB200酶。然而，該第七潛在的N-糖基化位點在大約一半的時間被糖基化。

圖8B圖示了第一位點N84處的N-糖基化圖。從圖8B可以看出，主要的聚糖種類係雙-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測超過75%的該ATB200在第一位點處具有雙-M6P聚糖。

圖8C圖示了在第二位點N177處的N-糖基化圖。從圖8C可以看出，主要的聚糖種類係單-M6P聚糖和非-磷酸化的高甘露糖聚糖。第一和第二分析二者偵測超過40%的該ATB200在第二位點處具有單-M6P聚糖。

圖8D圖示了在第三位點N334處的N-糖基化圖。從圖8D可以看出，該主要的聚糖種類係非-磷酸化的高甘露糖聚糖，二-、三-和四-觸角複合聚糖，和混合聚糖。第一和第二分析二者偵測超過20%的該ATB200在第三位點處具有唾液酸殘基。

圖8E圖示了在第四位點N414處的N-糖基化圖。從圖8E可以看出，該主要的聚糖種類係雙-M6P和單-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測超過40%的該ATB200在第四位點處具有雙-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測超過25%的該ATB200在第四位點具有單-M6P聚糖。

圖8F圖示了在第五位點N596處的N-糖基化圖。從圖8F可以看出，該主要的聚糖種類係岩藻糖化的二-觸角複合聚糖。第一和第二分析二者偵測超過70%的該ATB200在第五位點處具有唾液酸殘基。

圖8G圖示了在第六位點N826處的N-糖基化圖。從圖8G可以看出，該主要的聚糖種類係二-、三-和四-觸角複合聚糖。第一和第二分析二者偵測超過80%的該ATB200在第六位點處具有唾液酸殘基。

圖8H圖示了在六個潛在的N-糖基化位點中的每個位點處的磷酸化作用的概括。從圖8H可以看出，第一和第二分析二者偵測在第一、第二和第四位點處的高磷酸化作用水平。兩個分析偵測超過80%的該ATB200係在第一位點處的單-或二-磷酸化的，超過40%的該ATB200在第二位點處係單-磷酸化的，並且超過80%的該ATB200在第四位點出係單-或二-磷酸化的。 實例6：ATB200的CIMPR親和力的表徵

除了具有可以結合CIMPR的更大百分比的rhGAA之外，重要的是理解該相互作用的品質。使用CIMPR板結合測定來確定Lumizyme®和ATB200 rhGAA受體結合。簡言之，使用CIMPR-包被的板來捕獲GAA。將不同濃度的rhGAA應用於固定的受體，並且洗去未結合的rhGAA。藉由GAA活性來確定剩餘rhGAA的量。如圖9A所示，ATB200 rhGAA結合至CIMPR顯著優於Lumizyme®。

圖9B圖示了Lumizyme®、常規rhGAA和根據本發明的ATB200中的雙-M6P聚糖的相對含量。對於Lumizyme®，平均只有10%的分子具有雙-磷酸化的聚糖。與ATB200成對比，其中平均每個rhGAA分子具有至少一個雙-磷酸化的聚糖。 實例7：ATB200 rhGAA比Lumizyme®更有效地被成纖維細胞內化

使用正常的和龐培氏成纖維細胞細胞系來比較ATB200和Lumizyme® rhGAA的相對細胞攝取。比較涉及5-100 nM的根據本發明的ATB200 rhGAA與10-500 nM常規rhGAA Lumizyme®。16-hr培養之後，用TRIS鹼將外部rhGAA滅活，並且在收穫細胞之前用PBS將細胞洗滌3次。藉由4MU-α-葡萄糖苷水解量測的內化GAA，並且相對於總細胞的蛋白質作圖，並且結果出現在圖10A-B中。

ATB200 rhGAA也展示出有效內化到細胞中（圖10A和10B），分別地展示ATB200 rhGAA內化到正常的和龐培氏成纖維細胞中，並且其比常規的Lumizyme® rhGAA內化到更大的程度。ATB200 rhGAA在約20 nM處使細胞受體飽和，然而需要約250 nM的Lumizyme®。從該等結果外推的攝取效率常數（K_攝取 ）對於ATB200為2-3 nm，對於Lumizyme®為56 nM，如圖10C所圖示。該等結果表明ATB200 rhGAA係針對龐培氏病的靶向良好的治療。 實例8：針對ATB200和麥格司他的群體藥動學（PK）模式化

酸性α-葡糖苷酶（ATB200）藥物代謝動力學資料，包括取樣時間、服藥歷史和酸性α-葡糖苷酶的血漿濃度，該等資料係從藉由靜脈注射給予ATB200的小鼠、大鼠和猴子中獲得。血漿和組織中的麥格司他和去氧野尻黴素（duvoglustat）的藥物代謝動力學資料係從人或從小鼠中收集的。

使用Phoenix® NLME^TM v1.3進行模式化與模擬。構建區室PK模型來評估血漿中的ATB200的PK。該模型包括： ● 血漿濃度和時間之間關係的描述； ● 在模型參數中表徵動物之間的和動物內的變異性的方差分量；和 ● 描述關於關鍵模型分量的知識狀態的不確定性的分量。 非-線性混合效應（NLME）模型具有以下形式：其中C_pij 係動物i 在第j 個收集時間（t_j ）的濃度，D_i 代表動物i 的服藥歷史，θ _i 係動物i 的PK參數的向量，並且ε _ij 係與動物i 的第j 個濃度相關的隨機誤差。

將在參數中的受試者之間的變異性（BSV）模式化為對數正態分佈：θ _in = θ _TVn exp (η _in ) (η ₁ ,…,η _m ) ~MVN (0,Ω) 其中θ _TVn 係第n 個PK參數（例如，清除率）的群體典型值，並且η _in 係對動物i 的第n 個參數的隨機動物內效應。隨機效應(η ₁ ,…,η _m )係正態分佈的，具有包括在OMEGA（Ω）矩陣中的均值0和估計方差ω² 。

假定PK係物種獨立的，並且根據一般的戴德里克（Dedrick）方法縮放，該方法根據動物體重的權重來縮放該處置： CL_{(p) i} = a_(p) BW_i ^b V_{(p) i} = c_(p) BW_i ^d 其中CL=系統清除率，V=分佈體積，BW=體重，p=外周的，b和d=異速生長指數，以及a和c=對於BW=1的典型值。在此種情況下，指數b和d可以與文獻中接受的更一般化的值進行比較（b=0.75和d=1.0）。在分析中使用標稱的BW（0.025、0.25和2.5 kg）。

基線酸性α-葡糖苷酶濃度被模式化為C_基線 =酸性α-葡糖苷酶合成/CL的比率，並且可以外推至人，因為C_基線 係物種特異性的，不依賴於ATB200的濃度，並且在患有龐培氏病的人中已知。使用Phoenix® FOCE-ELS來確定基礎模型，以評估1或2區室模型是否最優以擬合資料。亦藉由視覺搜尋和藉由搜尋對PK的不同野生型/種類/劑量相關的效應來探索酸性α-葡糖苷酶的PK中的變異性的來源。

對於ATB200，具有線性消除的二室模型充分地表徵了跨動物物種的所有劑量水平的酸性α-葡糖苷酶活性的濃度-時間曲線。該模型包括考慮跨動物物種體重在清除率（CL）和分佈體積（Vc）上的差異的理論異速生長分量。ATB200的群體PK模型的擬合優度在圖11中圖示。在非臨床的研究中，ATB200的群體PK參數在表1中呈現。表 1 ： BW：體重

將龐培氏病患者中麥格司他（200 mg）的濃度-時間曲線與在正常健康志願者（劑量範圍：50、100、250、600和1000 mg）中給予去氧野尻黴素（duvoglustat）後獲得的彼等濃度-時間曲線進行比較。麥格司他和去氧野尻黴素（duvoglustat）的劑量標準化的血漿濃度-時間曲線在圖12中圖示。因為在患有龐培氏病的患者中的麥格司他的濃度-時間曲線與觀察到的在健康受試者中給予去氧野尻黴素（duvoglustat）超過24 h的彼等濃度-時間曲線係相似的，將外周組織中的去氧野尻黴素（duvoglustat）的PK資料收集，用作暴露於麥格司他的模型的替代物。具有線性消除的二室模型用於表徵組織中的去氧野尻黴素（duvoglustat）的濃度-時間曲線。

去氧野尻黴素（duvoglustat）的PK模型的擬合優度在圖13A和13B中圖示。在血漿和組織中的去氧野尻黴素（duvoglustat）的終模型PK參數在表2中展示。表 2 ： CV：變異係數

麥格司他的群體PK模型係基於在Gaa 基因敲除（KO）小鼠中口服給藥構建的。在Gaa KO小鼠中的麥格司他的群體PK參數在表3中呈現。在圖14中圖示了擬合優度。該模型具有0.475 ng/mL的剩餘附加誤差（residual additive error）。表 3 ： BSV：受試者之間的變異性 實例9：在人類中的重組酸性α-葡糖苷酶（ATB200）藥物代謝動力學（PK）參數的模式化

使用藥物代謝動力學模型（實例8）來進行類比，並且用來預測在ATB200給藥後，在患有晚期龐培氏病的人類受試者中的酸性α-葡糖苷酶的濃度-時間曲線。異速生長函數允許體重與清除率和分佈體積的連接，並且因此允許在具有體重為70 kg的典型人類受試者中預測PK參數。藉由包括在人類中酸性α-葡糖苷酶的內源性合成速率來客製化該模型（尤馬帕西西瓦 K（Umapathysivam K）、霍普伍德 JJ（Hopwood Jj）、美克勒 PJ（Meikle PJ.），血斑中的酸性α-葡糖苷酶活性的確定作為龐培氏病的診斷測試（Determination of acid alpha-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease.），臨床化學（Clin Chem .）(2001) 8月；47(8): 1378-83)。

預測經4 h輸注，在人類中單次20 mg/kg IV劑量的ATB200導致圖15中呈現的濃度-時間曲線。在典型的70 kg的人中的PK參數和經4小時的ATB200的20 mg/kg IV輸注後得到的暴露參數呈現在表4中。表 4 ：

在典型的70-kg患者中的預測的ATB200的系統清除率（CL）和分佈體積（V）分別是0.768 L/h和2.41 L。

根據Lumizyme®（阿葡糖苷酶α）的產品標籤，在患有晚期龐培氏病的患者中重複Lumizyme®給藥後，在52週酸性α-葡糖苷酶的該系統清除率係601 mL/h（0.601 L/h），並且Lumizyme®的半衰期係2.4 h。基於上述模型，在患有龐培氏病的成年受試者中ATB200的系統清除率被預期係比針對Lumizyme®報導的系統清除率快大約28%。另外，給予20 mg/kg劑量的ATB200之後，在人類中預測的AUC被預期係比給予20 mg/kg劑量的Lumizyme®（大約2700 µg· h/mL）後報導的AUC低約25%（AUC_0-inf ：1822 mg· h/L）。 實例10：針對肝糖還原的暴露反應模型

Gaa 基因敲除小鼠以5、10和20 mg/kg的劑量靜脈給予酸性α-葡糖苷酶（ATB200），升高的口服劑量的麥格司他（1、3和10 mg/kg）與靜脈內的5或10 mg/kg劑量的ATB200同時給予或升高的口服劑量的麥格司他（1、3、5、10、20，和30 mg/kg）與靜脈內的20 mg/kg的劑量的ATB200同時給予。如前所述量測肝糖水平（卡納 R（Khanna, R）、弗拉納根JJ（Flanagan, JJ）、馮 J（Feng, J）、索斯卡 R（Soska, R）、弗拉謝拉（Frascella, M）、佩萊格裡諾 LJ（Pellegrino, LJ）等人(2012)，藥物分子伴侶AT2220增加了龐培氏病的小鼠模型中的重組人酸性α-葡糖苷酶攝取和肝糖還原。（「The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid α-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease.）公共科學圖書館期刊（PLoS One）7(7): e40776）。計算每次聯合治療後觀察到的肝糖水平與單一療法後觀察到的肝糖水平的比率（肝糖比率）。結果提供在表5中。表 5 ：

另外，圖15A至15C圖示了在Gaa 基因敲除小鼠中給予阿葡糖苷酶α（Lumizyme®）和ATB200對肝糖清除的影響。給予動物兩次IV推注給藥（每隔一週）；將組織在最後一次劑量後兩週收穫，並且分析酸性α-葡糖苷酶活性和肝糖含量。

從在表5的結果可以看出，發現ATB200以劑量依賴性方式在酸性α-葡糖苷酶（Gaa ）基因敲除小鼠中耗盡組織肝糖。在Gaa 基因敲除小鼠中，20 mg/kg劑量的ATB200一致地去除了比5和10 mg/kg劑量水平更大比例的存儲的肝糖。然而，如在圖15A至15C看出，在小鼠心臟和骨骼肌（四頭肌和三頭肌）中，以5 mg/kg給予ATB200展示出與以20 mg/kg給予Lumizyme®相似的肝糖減少，然而在骨骼肌中，ATB200劑量在10和20 mg/kg展示出比Lumizyme®顯著更好的肝糖水平減少。

此外，10和20 mg/kg劑量的麥格司他與以20 mg/kg的ATB200共同給予分別導致肝糖水平分別減少至118和122 µg/mg蛋白質。劑量為30 mg/kg的麥格司他引起肝糖的更少減少。不受理論束縛，據信在更高濃度的麥格司他下，溶酶體中的酸性α-葡糖苷酶的抑制可以超過有益的分子伴侶效應，從而減少溶酶體中肝糖的降解。

使用藥物代謝動力學模型（實例8）來預測暴露於酸性α-葡糖苷酶和麥格司他，時間匹配於在表5中的組織溶酶體肝糖水平的值。針對所測試的每種治療組合，得到麥格司他/ATB200穩定狀態暴露（AUC）比率（平均暴露超過24小時），其相對於相應的肝糖比率繪製（表5），並且擬合數學函數。該暴露-反應曲線在圖17中圖示。

從圖17的結果可以看出，10和20 mg/kg劑量的麥格司他與20 mg/kg劑量的ATB200的共同給予提供了血漿中的酸性α-葡糖苷酶活性的良好穩定性，同時最大化了肝糖減少。更低劑量的麥格司他（1、3和5 mg/kg）被認為導致酸性α-葡糖苷酶活性的次優的穩定，然而最高劑量的麥格司他（30 mg/kg）被認為導致α-葡糖苷酶活性在溶酶體內過度抑制。

基於藥物代謝動力學模型（實例8），預期觀察到0.01159的麥格司他/ATB200 AUC比率（10 mg/kg麥格司他與20 mg/kgATB200共同給予）對應於將約270 mg劑量的麥格司他與20 mg/kg ATB200共同給予在典型的70-kg的人中。0.01和0.02的AUC比率將分別對應於233和466 mg的麥格司他劑量，與20 mg/kg ATB200共同給予在典型的70-kg的受試者中。 實例11：在人體中麥格司他/去氧野尻黴素（duvoglustat）濃度的模式化

使用藥物代謝動力學模型（實例8）來預測去氧野尻黴素（duvoglustat）（麥格司他的替代物）的血漿或組織濃度將保持在血漿和溶酶體中的麥格司他的IC₅₀ （該濃度給出酸性α-葡糖苷酶活性的50%的最大抑制）以上的時間長度。藉由先前描述的方法確定酸性α-葡糖苷酶活性的抑制（弗拉納根 JJ（Flanagan JJ）、羅西 B（Rossi B）、唐 K（Tang K）、吳 X（Wu X）、麥西奧利 K（Mascioli K）等人，(2009)「藥物分子伴侶1-去氧野尻黴素增加酸性α-葡糖苷酶的多種突變體形式的活性和溶酶體運輸」（「The pharmacological chaperone 1-deoxynojirimycin increases the activity and lysosomal trafficking of multiple mutant forms of acid alpha-glucosidase.」）人類突變（Hum Mutat）30: 1683-1692）。將在血漿pH（pH 7.0）下的麥格司他的IC₅₀ 值確定為170 µg/L，然而在溶酶體區室的pH（pH 5.2）下該IC₅₀ 值確定為377 µg/L。

模型預測的結果呈現在表6中。重複給藥後，在血漿和溶酶體中的麥格司他的預測的濃度-時間曲線在圖17和18中分別圖示。表 6:

基於呈現在表6與圖17和18的結果，預期260 mg劑量的麥格司他結合並且穩定在血漿中的ATB200高達18小時，然而預期在溶酶體中的酸性α-葡糖苷酶活性的抑制僅持續4小時。 實例12：在Gaa -基因敲除小鼠中的肌肉生理學和形態學

給予Gaa 基因敲除小鼠兩個IV推注給予的重組人酸性α-葡糖苷酶（阿葡糖苷酶α或ATB200），以20 mg/kg每隔一週給予。將麥格司他以10 mg/kg的劑量口服給予在給予ATB200之前30 min用ATB200處理的動物亞群。單獨用運載體處理對照小鼠。重組人酸性α-葡糖苷酶的最後一次給藥後兩週，收穫比目魚肌、四頭肌和隔膜組織。藉由用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色針對比目魚肌和隔膜組織來分析肝糖水平，並且對溶酶體增殖，藉由量測溶酶體相關膜蛋白（LAMP1）標記物的水平，該水平在龐培氏病中係上調的。將包埋入環氧樹脂（Epon）的四頭肌的半薄切片用亞甲基藍染色，並且藉由電子顯微鏡（1000x）觀察以確定囊泡存在的程度。用免疫組織化學來分析四頭肌肌肉樣品，以確定自噬標記物微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3磷脂醯乙醇胺綴合物（LC3A II）和p62，胰島素依賴性葡萄糖轉運蛋白GLUT4和胰島素非依賴性葡萄糖轉運蛋白GLUT1的水平。

在相似的研究中，給予Gaa 基因敲除小鼠四個IV推注給予的重組人酸性α-葡糖苷酶（阿葡糖苷酶α或ATB200），以20 mg/kg每隔一週給予。將麥格司他以10 mg/kg的劑量口服給予在給予ATB200之前30 min用ATB200處理的動物亞群。單獨用運載體處理對照小鼠。重組人酸性α-葡糖苷酶最後一次給藥後兩週收穫心肌組織，並且藉由用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色來分析肝糖水平，並且對於溶酶體增殖，藉由量測LAMP1的水平。

如圖20所示，與用阿葡糖苷酶α的常規治療相比，ATB200的給予展示出在心臟、隔膜和骨骼肌（比目魚肌）組織中的溶酶體增殖減少，並且麥格司他與ATB200的共同給予展示出溶酶體增殖的顯著進一步減少，接近在野生型（WT）小鼠中所見的水平。此外，如圖21所示，與用阿葡糖苷酶α的常規治療相比，ATB200的給予展示出在心臟和骨骼肌（比目魚肌）組織中的點狀肝糖水平的降低，並且麥格司他與ATB200的共同給予展示出顯著進一步降低，再次接近在野生型（WT）小鼠中所見的水平。

同樣地，如圖22所示，與未處理的小鼠和用阿葡糖苷酶α處理的小鼠相比，麥格司他與ATB200的共同給予顯著減少了Gaa 基因敲除小鼠的四頭肌肌纖維中的囊泡數目。如圖23所示，與野生型小鼠相比，在Gaa 基因敲除小鼠中LC3 II和p62的水平均增加，但是在用ATB200和麥格司他處理時顯著降低，表明與酸性α-葡糖苷酶缺陷相關的自噬的增加係在ATB200和麥格司他的共同給予時減少。另外，與野生型小鼠相比，在Gaa 基因敲除小鼠中胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT4和該胰島素非依賴性葡萄糖轉運體GLUT1的水平係增加的，但是又在用ATB200和麥格司他處理時顯著減少。升高的與酸性α-葡糖苷酶缺陷相關的GLUT4和GLUT1水平可以有助於增加葡萄糖攝取到肌纖維中並且增加基礎的和食物攝取後的肝糖合成。因此，在龐培氏病的小鼠模型中已經發現用ATB200和麥格司他的聯合治療改進骨骼肌形態學和生理學。 實例13：在食蟹猴中，ATB200與麥格司他共同給予的毒性

將柬埔寨來源的未實驗的食蟹猴分配到如表7所示的劑量組中。使動物適應研究室18（雌性）至19（雄性）天。在適應的最後一天，動物重量在2.243 kg和5.413 kg之間，並且是2至3歲。表 7 ： NG：鼻飼

基於先前在非人類靈長動物上的研究，選擇測試劑量水平以提供暴露（AUC）相似於或略高於（對於25 mg/kg麥格司他和50 mg/kg ATB200的組）或大約10-和3-倍高於（對於175 mg/kg麥格司他和/或100 mg/kg ATB200的組）在給予如從實例8的藥物代謝動力學模型預測的（分別地是大約20.9 hr·μg/mL和大約1822 hr·μg/mL）260 mg劑量的麥格司他和20 mg/kg ATB200的人類中預期的臨床AUC值。在非人類靈長動物上的先前的研究中，發現100 mg/kg的ATB200的IV劑量導致5330 hr·μg/mL的AUC，並且外推175 mg/kg的麥格司他的口服劑量導致196 hr·μg/mL的AUC。

將ATB200配製於包含2.92 mg/mL氯化鈉、20 mg/mL甘露醇和0.5 mg/mL聚山梨醇酯80（配製物緩衝液）的25 mM磷酸鈉緩衝液中（pH6）。將測試品（ATB200或麥格司他）和對照品/運載體（配製物緩衝液）每隔一週給予一次，持續13週，從第1天開始，並且在第85天結束。藉由以0 mg/kg（組1，對照品）、50 mg/kg（組2）或100 mg/kg（組3和5）2小時（±10分鐘）靜脈內的（IV）輸注，給予ATB200和該對照品/運載體。當以組合給予時，在對ATB200的輸注開始之前將麥格司他在滅菌注射用水中，USP，以25 mg/kg（組2）或175 mg/kg（組3和4），30分鐘（±2分鐘）鼻飼給予。在所有組中的給藥體積係10 mL/kg。

在該研究的生命期期間評估的參數包括體重，食物消耗，臨床觀察，詳細的臨床觀察，體格檢查，心電圖，眼科評估，臨床病理學（血液學、凝固、血清化學），抗藥物抗體（ADA）評估，中和ADA評估，尿液分析，以及針對麥格司他和ATB200活性和總蛋白質的血漿毒物動力學（TK）。在第99天進行動物的末次屍檢（最後一次給藥後14天）。在屍檢時，記錄總觀察和器官重量，並且將組織收集用於顯微鏡檢查。

所有動物均存活到預定的安樂死，並且在體格檢查期間或在食物消耗、臨床觀察、詳細的臨床觀察、體重、眼科或ECG參數的評估期間，沒有歸因於ATB200、麥格司他的給予或ATB200和麥格司他的共同給予的變化。另外，在尿液分析、血清化學、血液學或凝固參數上，或在總觀察、器官重量或組織病理學評估期間，沒有與ATB200、麥格司他或ATB200/麥格司他相關的變化。總的抗藥物抗體（ ADA ）和中和抗體（ NAb ）

在血漿中量測總的抗藥物抗體（ADA）和中和抗體（NAb）水平。適應期間，給藥前（麥格司他的給予之前），和在第1、85和99天從所有動物中收集一次血樣（大約1.6 mL）於K₂ EDTA試管中。將樣品維持於濕冰上直至處理該樣品。藉由在2℃至8℃下離心，從血液採集品中獲得血漿，並且將等分試樣（大約0.2 mL）轉移至聚丙烯小瓶中，並且在-60℃至-86℃下、在一小時內冷凍儲存。在從組1、2、3和5（只有麥格司他的樣品不作分析）中收集的樣品上進行針對ADA的樣品分析。使用酶測定法，用螢光基質4-甲基傘形酮基-α-D-哌喃葡萄糖苷（4MU-Glc）來對中和抗體進行分析。

在第85和99天（100%發病率），在ATB200給藥組（組2、3和5）中的所有動物係抗藥物抗體（ADA）陽性的。在第85天，效價範圍係從25600至409600，並且在第99天係從51200至819200。隨著ATB200劑量水平的增加，沒有明顯的效價增加趨勢。在第85和99天，在組2（50 mg/kg ATB200與25 mg/kg 麥格司他組合），8個動物中的五個係中和抗體（NAb）陽性的。在組3（100 mg/kg ATB200與175 mg/kg 麥格司他組合）中，在第85天，8個動物中的兩個係NAb陽性的，並且在第99天，8個動物中的4個係NAb陽性的。在組5（100 mg/kg ATB200單一療法）中，在第85天，8個動物中的兩個係NAb陽性的，並且在第99天，8個動物中的3個係NAb陽性的。ADA對ATB200暴露或其他的TK參數沒有明顯的影響。ATB200 毒物動力學

在第1天和第85天，在以下時間點在來自動物的K2EDTA試管中收集的血液樣品中量測ATB200毒性動力學： 對於組1、2、3和5：給藥前（在給予麥格司他之前）；從輸注開始1小時；從輸注開始2小時；從輸注開始2.5小時；從輸注開始3小時；從輸注開始4小時；從輸注開始6小時；從輸注開始12小時；從輸注開始26小時；從輸注開始168小時；和從輸注開始336小時（在第15天給藥之前收集）；和 對於組4：給藥前（在給予麥格司他之前）；給予麥格司他後1.5小時；給予麥格司他後2.5小時；給予麥格司他後3.5小時；給予麥格司他後4.5小時；給予麥格司他後6.5小時；給予麥格司他後12.5小時；給予麥格司他後26.5小時；給予麥格司他後168.5小時；和給予麥格司他後336.5小時（在第15天給藥之前收集）。

藉由在2℃至8℃下離心而獲得血漿，並且將等分試樣（大約0.1 mL）轉移至聚丙烯小瓶中，並且在-60℃至-86℃下冷凍儲存。在來自組1動物的2小時給藥後的樣品和從在組2、3和5的動物中收集的所有樣品上，進行ATB200酸性α-葡糖苷酶活性和ATB200總蛋白的分析。藉由偶聯液相層析法到串聯質譜分析法（LC-MS/MS）來量測總ATB200蛋白。使用兩種特徵肽（TTPTFFPK和VTSEGAGLQLQK）作為ATB200的量測。此兩種肽的結果係一致的，表明在分析的血漿樣品中存在完整的ATB200。使用螢光基質4-甲基傘形酮基-α-D-哌喃葡萄糖苷（4MU-Glc）來測定酸性α-葡糖苷酶活性。使用WinNonlin Phoenix，6.1版軟體（法賽特（Pharsight）公司），對來自組2、3和5中的動物的經審核/驗證的資料集（濃度和時間）進行毒物動力學（TK）資料的分析。使用個體受試者的血漿濃度資料的非隔室分析來估計在IV輸注之後，酸性α-葡糖苷酶活性和ATB200總蛋白（基於該兩種特徵肽TTPTFFPK和VTSEGAGLQLQK）的TK參數。輸入劑量水平作為實際的ATB200劑量（以mg計），基於每個個體動物的劑量體積、體重以及平均劑量濃度來計算。對於給藥方案中的所有圖，將每次給藥的開始時間（ATB200的輸注開始）設定為零。標稱樣品的收集時間用於所有的分析。藉由對數-線性梯形法則估計ATB200（總蛋白質和活性測定資料集）產生的血漿-濃度-時間-曲線下面積（AUC_0-t ）。用於估計λ_z 的回歸係基於均勻加權的濃度資料。

針對每個ATB200資料集（由總ATB200測定中的和ATB200活性測定中的兩種特徵肽而產生的）計算以下參數： ● R² -用於估計λ_{z a} 的線性回歸的相關係數的平方。當一定數量的點用於定義濃度對比時間曲線的末期（或特定時間範圍）時使用； ● R² adj-用於估計λ_z 的線性回歸的相關係數的平方，針對在λ_{z b} 的估計中使用的點的數目進行調整。當用於定義濃度對比時間曲線的末期時的點的數目可以是變數時使用； ● 點數λ_z -針對線性回歸分析中用於估計λ_z 的點的數目； ● λ_{z a} -t_最大 後前三個時間點的消除速率常數； ● λ_{z b} -末端消除速率常數； ● t_{1/2 a} -基於t_最大 後的前三個時間點的半衰期； ● t_{1/2 b} -基於λ_z （0.693/λ_z ）的末端消除半衰期； ● t_最大 -血漿中分析物的最大濃度的時間； ● C_最大 -血漿中分析物的最大觀察到的濃度； ● AUC_0-t -從時間0（給藥前）到具有最後可量測濃度的時間點量測的血漿中濃度-時間曲線下面積（AUC）； ● AUC_{0- ¥ -} AUC外推至時間無窮大； ● AUC_ext -AUC外推至時間無窮大的部分，其呈現為總AUC_{0- ¥} 的%； ● CL_T -總清除率（基於λ_{z b} ）；基於來自實際體重的以mg計的總劑量； ● CL_T /F-總清除率（基於λ_{z b} ）；基於來自實際體重的以mg計的總劑量除以生物可利用分數； ● V_ss -處於平衡狀態的表觀分佈體積； ● V_z -基於末期（基於λ_{z b} ）的分佈體積；基於來自實際體重的以mg計的總劑量； ● V_z /F-基於末期（基於λ_{z b} ）的分佈體積；基於來自實際體重的以mg計的總劑量除以生物可利用分數；和 ● 累積比率-AR_{C 最大} =在第85至第1天的C_最大 的比率；AR_AUC =在第85至第1天的AUC_0-t 的比率 雄性和雌性之間的ATB200濃度和TK參數係相似的。50 mg/kg 2-小時IV ATB200輸注與25 mg/kg的麥格司他組合給予後的血漿濃度在給藥後12和26小時之間係可量測的。在100 mg/kg劑量水平（具有或沒有175 mg/kg麥格司他），ATB200濃度可量測至給予後26至168小時。針對單次劑量的毒物動力學參數（第1天）在表8中展示。表 8 ： 重複給藥（第85天）的毒物動力學參數在表9中展示。表 9 ：

在所有的三個給藥組中，達到最大ATB200血漿濃度的時間（t_最大 ）係給藥後大約2小時。如藉由總ATB200蛋白測定量測，第1天和第85天ATB200血漿濃度和TK參數在兩種評估的特徵肽（TTPTFFPK和VTSEGAGLQLQK）之間係一致的。當藉由酸性α-葡糖苷酶活性測定法量測時，如藉由C_最大 和AUC_0-t 量測的暴露相對更低。此被預期，因為總蛋白測定法量測活性酶和無活性酶的濃度，然而酸性α-葡糖苷酶活性測定法僅量測活性酶的濃度。ATB200暴露隨著在50和100 mg/kg劑量水平之間的劑量而增加。基於t_最大 後的前三個時間點的平均第1天初始t_{1/2 a} （雄性和雌性組合）的範圍係從1.28至3.07小時。平均第1天末端半衰期（t_{1/2 b} ）的範圍係1.70至11.1小時（更長的t_{1/2 b} 值係受具有直至給藥後168小時可量測的濃度的動物影響的）。第85天給藥後觀察到值的相似範圍。在每隔一週一次的重複給予時觀察到很少或沒有積累。相對於100 mg/kg ATB200單一療法，將175 mg/kg麥格司他添加至100 mg/kg ATB200劑量顯示減少了ATB200清除率和增加了血漿暴露大約2倍。

由於沒有鑒別出不良測試品相關的變化，當藉由2小時輸注，每隔一週一次給予持續13週，有或沒有給予麥格司他時，在食蟹猴中針對ATB200的無觀察到的不良反應水平（No-Observed-Adverse-Effect-Level，NOAEL）係100 mg/kg/輸注（所測試的最高劑量）。在此劑量水平下，在第85天，對於單獨ATB200，平均性別平均化的AUC_0-t 和C_最大 （總蛋白質）分別是7830（TTPTFFPK）和7790（VTSEGAGLQLQK）hr·µg/mL以及2020（TTPTFFPK）或2010（VTSEGAGLQLQK）µg/mL，並且對於與175 mg/kg麥格司他組合，平均性別平均化的AUC_0-t 和C_最大 （總蛋白質）分別是13900（TTPTFFPK）或13800（VTSEGAGLQLQK）hr·µg/mL和2270（兩種肽）µg/mL。麥格司他毒物動力學

在第1天和第85天在以下時間點，在來自動物的K2EDTA管中收集的血樣中量測麥格司他毒物動力學： 對於組1、2、3和5：給藥前（在給予麥格司他之前）；給予麥格司他後15分鐘；0小時（在輸注開始之前）；從輸注開始0.5小時；從輸注開始1小時；從輸注開始2小時；從輸注開始4小時；從輸注開始6小時；從輸注開始12小時；從輸注開始26小時；從輸注開始50小時；和從輸注開始74小時；和 對於組4：給藥前（在給予麥格司他之前）；給予麥格司他後15分鐘；給予麥格司他後30分鐘；給予麥格司他後1小時；給予麥格司他後1.5小時；給予麥格司他後2.5小時；給予麥格司他後4.5小時；給予麥格司他後6.5小時；給予麥格司他後12.5小時；給予麥格司他後26.5小時；給予麥格司他後50.5小時；和給予麥格司他後74.5小時。

藉由在2℃至8℃下離心而獲得血漿，並且將等分試樣（大約0.2 mL）轉移至聚丙烯小瓶中，並且在-60℃至-86℃下冷凍儲存。使用LC-MS/MS方法進行麥格司他濃度的分析類似於由以下出版物中所描述的對去氧野尻黴素（duvoglustat）濃度的分析：由裡奇 卡納（Richie Khanna），艾倫 C. 鮑威 Jr.（Allan C. Powe Jr.），易 倫（Yi Lun），麗蓓嘉 索斯卡（Rebecca Soska），傑西 馮（Jessie Feng），羅西尼 多裡帕拉（Rohini Dhulipala），蜜雪兒 弗拉塞拉（Michelle Frascella），安蒂娜 加西亞（Anadina Garcia），李 J.佩萊格裡諾（Lee J. Pellegrino），蘇 徐（Su Xu），納斯特瑞 布瑞格那（Nastry Brignol），馬修 J.托斯（Matthew J. Toth），亨 V.度（Hung V. Do），大衛 J.勞克哈特（David J. Lockhart），布蘭登 A 伍斯特曼（Brandon A. Wustman），肯尼斯 J.瓦倫紮諾（Kenneth J. Valenzano）.「藥物分子伴侶AT2220增加突變體酸性α-葡糖苷酶的特定活性和溶酶體的遞送，並且促進在龐培氏病的轉基因小鼠模型中的肝糖減少（The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid Alpha-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in Transgenic Mouse Model of Pompe Disease）.」公共科學圖書館期刊（PLOS ONE）（2014年7月1日）9(7): e102092。

使用WinNonlin Phoenix，6.1版軟體（法賽特（Pharsight）公司），對來自組2、3和4中的動物的經審核/驗證的資料集（濃度和時間）進行麥格司他的毒物動力學（TK）資料的分析。使用個體的血漿濃度資料的非隔室分析來估計該TK參數。藉由對數-線性梯形法則來估計麥格司他TK參數。用於估計λ_z 的回歸係基於均勻加權的濃度資料。計算以下參數： ● R² adj-用於估計λ_z 的線性回歸的相關係數的平方，針對在λ_z 的估計中使用的點的數目進行調整。當用於定義濃度對比時間曲線的末期時的點的數目可以是變數時使用； ● 點數λ_z -針對線性回歸分析中用於估計λ_z 的點的數目； ● λ_z -末端消除速率常數； ● t_1/2 -基於λ_z （0.693/λ_z ）的末端消除半衰期； ● t_最大 -血漿中分析物的最大濃度的時間； ● C_最大 -血漿中分析物的最大觀察到的濃度； ● AUC_0-t -從時間0（給藥前）到具有最後可量測濃度的時間點量測的血漿中濃度-時間曲線下面積（AUC）； ● AUC_{0- ¥ -} AUC外推至時間無窮大； ● AUC_ext -AUC外推至時間無窮大的部分，其呈現為總AUC_{0- ¥} 的%； ● CL_T /F-總清除率除以基於來自實際體重的以mg計的總劑量的生物可利用分數； ● V_z /F-基於末期的分佈體積除以基於來自實際體重的以mg計的總劑量的生物可利用分數； ● 累積比率-AR_{C 最大} =在第85至第1天的C_最大 的比率；並且AR_AUC =在第85至第1天的AUC_0-t 的比率。

性別對於麥格司他TK參數沒有一致的影響。在25 mg/kg鼻飼（NG）與50 mg/kg ATB200組合給予，抑或175 mg/kg NG給予（有或沒有100 mg/kg ATB200）後，麥格司他血漿濃度可量測至74.5小時（最後的量測時間點）。單次劑量（第1天）和重複給藥（第85天）的毒物動力學參數在表10中展示。表 10 ：

該t_最大 範圍係在給藥後的從大約2至4小時。隨著在25和175 mg/kg劑量水平之間給藥，麥格司他暴露增加。在第1天和第85天，平均t_1/2 （雄性和雌性組合）係一致的，並且範圍係從6.66至8.23小時。在每隔一週重複一次NG給予時觀察到很少或沒有積累。ATB200共同給予對總體麥格司他暴露（亦即，AUC_0-t ）或TK參數沒有可觀察到的影響。

由於沒有鑒別出不良測試品相關的變化，當藉由鼻飼，每隔一週一次給予持續13週，有或沒有給予ATB200時，在食蟹猴中針對麥格司他的無觀察到的不良反應水平（No-Observed-Adverse-Effect-Level，NOAEL）係175 mg/kg/劑量（所測試的最高劑量）。在此劑量水平下，在第85天，對於單獨麥格司他,平均性別平均化的AUC_0-t 和C_最大 分別是204000 hr·ng/mL和14700 ng/mL，並且對於與100 mg/kg ATB200組合，平均性別平均化的AUC_0-t 和C_最大 分別是216000 hr·ng/mL和22000 ng/mL。 實例14：單獨給予重組酸性α-葡糖苷酶（ATB200）以及與麥格司他共同給予的臨床研究的方案研究設計：

此係一個開放標記、固定順序、遞增劑量、第一次在人類中研究的，以評估單一靜脈（IV）重組酸性α-葡糖苷酶（ATB200，用滅菌注射用水復水，並且用注射用的0.9%的氯化鈉進行稀釋的凍乾粉）和當與口服麥格司他（硬明膠膠囊，65 mg）共同給予時的安全性、耐受性和藥物代謝動力學（PK）。該研究將以兩個階段進行。在階段1中，在ATB200的連續單次遞增劑量（每2週以大約4小時靜脈內輸注給予），以5、10和20 mg/kg的3個給藥時段後，將評估安全性、耐受性和PK。在階段2，安全性、耐受性和PK將在以下單次和多次遞增劑量組合給予後進行評估：將3個劑量的大約4小時ATB200的靜脈輸注之前1小時，每2週共同給予20 mg/kg ATB200與130 mg麥格司他（兩個65 mg的膠囊），口服，隨後在3個劑量的ATB200大約4小時靜脈輸注之前1小時，共同給予20 mg/kg ATB200與260 mg麥格司他（四個65 mg的膠囊），口服。

十二位酶替代療法（ERT）-經歷的患有龐培氏病的受試者（大約6個非臥床的和6個臥床的）將招募到階段1中。彼等相同的受試者將在階段2中繼續該研究。在臥床的受試者招募前，將招募至少4個非臥床的受試者並對其給藥。將經歷ERT的（非臥床的）受試者定義為在招募前已經接受ERT 2至6年，能夠在6分鐘步行測試（6MWT）中行走至少200米，並且具有FVC的30%-80%的預測正常值的彼等。將經歷ERT的（臥床的）受試者定義為係在招募前完全坐輪椅，不能無輔助地行走，並且已經接受ERT≥2年的彼等。在表11中展示治療分配。表 11 ： ERT = 酶替代療法。

受試者將需要在給予口服麥格司他之前至少2小時和之後2小時禁食。口服給予麥格司他之後1小時，應該開始ATB200的IV輸注。研究程序

該研究由篩選、基線、階段1（3個時段、固定順序、單獨ATB200的單次遞增-劑量），以及階段2（2個時段、固定順序、多劑量的20 mg/kg ATB200與多次遞增劑量的麥格司他共同給予）組成。篩選：

所有受試者將提供知情同意書並接受資格標準的審查。對所有受試者的評估包括包含先前的輸注-相關的反應（IARs）和跌倒史的病史；先前的和伴隨的藥物和非藥物治療的審查；生命特徵（心率[HR]、呼吸率[RR]、血壓[BP]和溫度）；身高；體重；綜合體格檢查（PE）；12導聯心電圖（ECG）；臨床安全性實驗室評估（血清化學、血液學和尿液分析）；尿妊娠試驗；針對己糖四糖（Hex4）的尿液樣品；以及GAA 基因分型（針對在篩選中不能提供GAA 基因分型報告的受試者）。亦將獲得的血液樣品用於免疫原性（總的抗體和中和抗體，免疫系統啟動的探究性的細胞介素/其他生物標記物，與阿葡糖苷酶α的交叉反應性，以及免疫球蛋白E[IgE]（若需要））的探究性評估。滿足所有入選標準，並且沒有排除標準的受試者將被分配到如表11中所描述的階段1。基線：

對所有受試者的安全性評估包括對所有受試者進行的資格標準的審查；包含輸注相關的反應（IARs）和跌倒史，不良事件（AE）和嚴重AE（SAE）調查，先前的和伴隨的藥物和非藥物治療的審查的病史；生命特徵（HR、RR、BP和溫度）；體重；簡單的PE；ECG；拉施（Rasch）建立的龐培氏-比活性（R-PAct）度量；鹿特丹障礙（Rotterdam Handicap）度量；和疲勞嚴重性度量；臨床安全性實驗室評估（血清化學、血液學和尿液分析）；尿妊娠試驗；藥效（PD）評估（Hex4和肌酸磷酸激酶[CPK]）；免疫原性評估（總的抗體和中和抗體，與阿葡糖苷酶α交叉反應的抗體，探究性的細胞介素和免疫系統啟動的其他生物標記物，與阿葡糖苷酶α的交叉反應性，和IgE（若需要））；肺功能檢查（PFTs）；運動功能檢查；以及肌肉力量檢查。階段 1 ，時段 1 、 2 和 3 ： 此階段將包括： ● 安全性：AE審查，包括嚴重不良事件（SAE）和IAR；伴隨的藥物和非藥物治療的審查；生命特徵（HR、RR、BP和溫度）；簡單PE；ECG；臨床安全性實驗室評估（血清化學、血液學和尿液分析）；以及尿妊娠試驗 ● PD：尿液Hex4和血清CPK ● 免疫學的：針對抗重組酸性α-葡糖苷酶抗體效價（抗重組酸性α-葡糖苷酶總抗體和中和抗體效價以及與阿葡糖苷酶α的抗體交叉反應性）的血樣，以及針對免疫系統啟動的促炎細胞介素及其他生物標記物的量測的血樣。若需要，亦將進行IgE的量測。 ● 連續的24-小時藥物代謝動力學（PK）：時段1（訪問3，第1天）、時段2（訪問4，第15天）和時段3（訪問5，第29天）期間，針對血漿酸性α-葡糖苷酶活性水平和總酸性α-葡糖苷酶蛋白質濃度的血液取樣將取自所有受試者。階段 2 ，時段 4 和 5 ： ● 安全性：AE審查，包括SAE和IAR；伴隨的藥物和非藥物治療的審查；生命特徵（HR、RR、BP和溫度）；體重；PE；ECG；臨床安全性實驗室評估（血清化學、血液學和尿液分析）；和尿妊娠試驗 ● PD：尿液Hex4和血清CPK ● 免疫學的：針對抗重組酸性α-葡糖苷酶抗體效價（抗重組酸性α-葡糖苷酶總抗體和中和抗體效價，以及與阿葡糖苷酶α的抗體交叉反應性）的血樣，以及針對免疫系統啟動的促炎細胞介素及其他生物標記物的量測的血樣。若需要，亦將進行IgE的量測。 ● 連續24小時PK：時段4（訪問6，第43天和訪問8，第71天）和時段5（訪問9，第85天和訪問11，第113天）期間，針對血漿酸性α-葡糖苷酶活性水平、總酸性α-葡糖苷酶蛋白質濃度和麥格司他濃度的血液取樣將取自所有受試者。 藥物代謝動力學階段的結束： ● 安全性：AE審查，包括SAE和IAR；伴隨的藥物和非藥物治療的審查；生命特徵（HR、RR、BP和溫度）；體重；PE；ECG；臨床安全性實驗室評估（血清化學、血液學和尿液分析）；和尿妊娠試驗 ● PD：尿液Hex4和血清CPK ● 免疫學的：針對抗重組酸性α-葡苷酶抗體效價（抗重組酸性α-葡糖苷酶總抗體和中和抗體效價，以及與阿葡糖苷酶α的抗體交叉反應性）的血樣，以及針對免疫系統啟動的促炎細胞介素及其他生物標記物的量測的血樣。若需要，亦將進行IgE的量測。

過早從該研究退出的受試者將進入早期終止訪問，並且將進行將在PK訪問結束時進行的所有評估。將不會給予研究藥物。若任何前哨受試者過早地從該研究中退出，則該受試者將被參與該研究的下一個非臥床的受試者替換（例如，若受試者1退出，則受試者3[非臥床的]將替換該受試者作為前哨受試者）。

提供給完成此研究的受試者和/或其他有資格的受試者參與長期的延伸研究，並且將繼續針對ATB200與麥格司他共同給予的安全性和耐受性進行評估的機會。另外，將在延伸研究中以規律的間隔進行關於龐培氏病的功能評估。安全性監測

安全性係藉由醫療監護儀和調查人員在持續進行的基礎上監測，以及藉由安全管理委員會（SSC）的定期監測。前哨劑量

本研究中前2名非臥床的受試者將是針對該研究的前哨受試者，並且將是在該研究（時段1至5）的每個時段給藥的前2名受試者。在前哨受試者過早地從該研究中退出的情況下，他/她將被另一個非臥床的受試者替換。注意：在任何至少臥床的受試者可以被給藥之前，至少4名非臥床的受試者將被給予5 mg/kg ATB200。

在階段1（時段1、2和3），受試者將被給予單次遞增劑量的ATB200（5 mg/kg [時段1]、10 mg/kg [時段2]和20 mg/kg [時段3]）。

在階段1的每個研究時段中的2名前哨受試者的給藥後，可用的安全性資料(PE、生命特徵、AE、輸注反應、ECG和當地語系化可用進行的實驗室測試)的評估將藉由醫療監護儀和調查人員在24至48小時內進行。當每個劑量水平處的兩名前哨受試者均可獲得中心實驗室安全性資料時，SSC將召集正式的安全審查。若SSC確定不存在排除以該時期分配的劑量給藥的安全性問題，則將招募10名另外的受試者並且對其給藥。當在所有的3個階段1劑量水平處，對於所有受試者的安全性資料（包括中心實驗室安全性資料）可用時，SSC也將召集安全審查。

在階段2（時段4和5）中，將給予2名前哨受試者，並且將在第一次劑量之後針對階段1中的每個時段進行評估安全性。若SSC確定排除20 mg/kg ATB200與130 mg麥格司他（時段4）共同給予或20 mg/kg ATB200與260 mg麥格司他（時段5）共同給予的另外的劑量給藥沒有安全性問題，則另外的10名受試者將以在該時段分配的劑量接受3個每兩週一次的劑量。當在階段2結束時，針對所有受試者的安全性資料（包括中心實驗室安全性資料）可用時，SSC將再召集。SSC亦將在SAE或鑒別的安全性問題的情況下召開臨時會議。 SSC可以推薦以下任何評論： ● 繼續該研究而無需修改 ● 繼續該研究而需修改（修正） ● 暫時地停止給藥 ● 永久地停止給藥 若SSC認為，在前哨受試者中沒有可能排除的繼續研究劑量給藥的AE或安全性問題，則對該劑量水平的所有剩餘受試者繼續給藥。受試者的安全性將繼續藉由醫療監護儀和研究調查人員在持續進行的基礎上，以及藉由SSC以規律的間隔進行嚴密監測。受試者的數目（計畫的）：

十二名經歷ERT的患有龐培氏病的成年受試者（大約6名非臥床的和6名臥床的）將招募到階段1中。彼等相同的受試者將在階段2中繼續該研究。診斷以及資格標準：

使用下文概述的資格標準，在篩選訪問時，將評估經歷-ERT的患有龐培氏病的成年受試者。每個受試者必須滿足所有的入選標準，並且不滿足排除標準。入選/排除標準的棄權係不被允許的。入選標準 經歷ERT的受試者（非臥床的 ） 1. 年齡介於18和65歲的男性和女性受試者包括在內； 2. 受試者必須在任何研究-相關的程序中提供知情同意書； 3. 潛在生育的受試者必須同意在該研究期間和最後一次共同給予ATB200+麥格司他後30天內使用醫學上可接受的避孕方法； 4. 受試者具有基於酸性α-葡糖苷酶酶活性的記載的缺陷或藉由GAA 基因分型的龐培氏病的診斷； 5. 在先前的2-6年，受試者接受用阿葡糖苷酶α的ERT； 6. 目前，受試者以每隔一週一次的頻率接受阿葡糖苷酶α； 7. 受試者接受並完成最後兩次輸注，沒有藥物相關的不良事件導致的劑量中斷； 8. 受試者必須能夠在6MWT上行走200-500米；並且 9. 直立的用力肺活量（FVC）必須係預測的正常值的30%至80%。 經歷ERT的受試者（臥床的 ） 10. 年齡介於18和65歲的男性和女性受試者包括在內； 11. 受試者必須在任何研究-相關的程序中提供知情同意書； 12. 潛在生育的受試者必須同意在該研究期間和最後一次共同給予ATB200+麥格司他後30天內使用醫學上可接受的避孕方法； 13. 受試者具有基於酸性α-葡糖苷酶酶活性的記載的缺陷或藉由GAA 基因分型的龐培氏病的診斷； 14. 受試者已經接受用阿葡糖苷酶α的ERT≥2年； 15. 目前，受試者以每隔一週一次的頻率接受阿葡糖苷酶α； 16. 受試者已經接受並且完成最後兩次輸注，沒有藥物相關的不良事件導致的劑量中斷；並且 17. 受試者必須係完全坐-輪椅的，並且不能無輔助地行走。 排除標準 經歷ERT的受試者（非臥床的 ） 1. 受試者已經在基線訪問前30天內接受了除了阿葡糖苷酶α之外的針對龐培氏病的任何研究性治療，或者在該研究期間預期這樣做； 2. 在基線訪問的30天內，受試者已經接受用違禁藥物治療（米格列醇（例如，Glyset®）；麥格司他（例如，美格魯特（Zavesca）®）；阿卡波糖（acarbose）（例如，阿卡波糖片劑（Precose）®，拜糖蘋（Glucobay）®）；伏格列波糖（voglibose）（例如，Volix®、Vocarb®和Volibo®）；沙丁胺醇和克侖特羅；或任何調查/實驗藥物）； 3. 受試者，若是女性，在篩選時懷孕或哺乳； 4. 受試者，無論是男性還是女性，都計畫在研究期間懷孕一個孩子； 5. 受試者需要侵入性通氣支援； 6. 清醒時，受試者使用非侵入性通氣支援一天≥6小時； 7. 受試者具有調查人員認為的醫學或任何其他情有可原的對受試者造成不適當的安全風險或損害他/她遵守協定要求的能力的情況或情形； 8. 具有對阿葡糖苷酶α過敏史的受試者； 9. 具有高持久性抗重組酸性α-葡糖苷酶抗體效價的歷史的受試者； 10. 具有對麥格司他或其他亞胺基糖過敏或敏感的歷史的受試者； 11. 具有已知的自身免疫性疾病（包括狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病或類風濕性關節炎）歷史的受試者；和 12. 具有已知的支氣管哮喘史的受試者。 經歷ERT的受試者（臥床的 ） 13. 受試者已經在基線訪問前30天內接受了除了阿葡糖苷酶α之外的針對龐培氏病的任何研究性治療，或者在該研究期間預期這樣做； 14. 在基線訪問的30天內，受試者已經接受用違禁藥物治療（米格列醇（例如，Glyset^® ）；麥格司他（例如，美格魯特^® ）；阿卡波糖（例如，阿卡波糖片劑^® ，拜糖蘋^® ）；伏格列波糖（例如，Volix^® 、Vocarb^® 和Volibo^® ）；沙丁胺醇和克侖特羅；或任何調查/實驗藥物）； 15. 受試者，若是女性，在篩選時懷孕或哺乳； 16. 受試者，無論是男性還是女性，都計畫在研究期間懷孕一個孩子； 17. 受試者具有調查人員認為的醫學或任何其他情有可原的對受試者造成不適當的安全風險或損害他/她遵守協定要求的能力的情況或情形； 18. 具有對阿葡糖苷酶α過敏史的受試者； 19. 具有高持久性抗重組酸性α-葡糖苷酶抗體效價的歷史的受試者； 20. 具有對麥格司他或其他亞胺基糖過敏或敏感的歷史的受試者； 21. 具有已知的自身免疫性疾病（包括狼瘡、自身免疫性甲狀腺炎、硬皮病或類風濕性關節炎）歷史的受試者；和 22. 具有已知的支氣管哮喘史的受試者。研究性產品、劑量和給予方式： 階段1（由3個劑量時段間隔2週組成） ● 時段1：5 mg/kg ATB200單次劑量IV輸注； ● 時段2：對已經完成時段1的所有受試者給予單次劑量IV輸注的10 mg/kg ATB200；和 ● 時段3：對已經完成時段2的所有受試者給予單次劑量IV輸注的20 mg/kg ATB200。 階段2（由2個劑量時段組成，每個劑量時段包括3個研究的藥物劑量，間隔2週） ● 時段4：對已經完成時段3（每2週重複，總共3次給予）的所有受試者給予單次劑量IV輸注的20 mg/kg ATB200之前1小時，將口服給予130 mg的麥格司他；和 ● 時段5：對已經完成時段4（每2週重複，總共3次給予）的所有經歷ERT的受試者給予單次劑量IV輸注的20 mg/kg ATB200之前1小時，將口服給予260 mg的麥格司他。注意 ：受試者需要在給予口服麥格司他之前至少2小時和之後2小時禁食。研究的總持續時間 ：長達22週（長達4週的篩選時段，隨後大約18週的研究治療[階段1和2]）單次劑量 PK 觀察（階段 1 ，時段 1 、 2 和 3 ）的持續時間： 6週多劑量 PK 觀察（階段 2 ，時段 4 和 5 ）的持續時間： 12週安全性、耐受性和免疫原性觀察（時段 1 、 2 、 3 、 4 和 5 ）的持續時間： 18週評估標準： 原發性： 安全性評估： ● PEs ● 生命特徵，包括體溫、RR、HR和BP ● AE，包括IAR ● 12-導聯ECG ● 臨床安全性實驗室評估：血清化學、血液學和尿液分析 血漿ATB200和麥格司他的PK： ● 血漿酸性α-葡糖苷酶活性水平和總酸性α-葡糖苷酶蛋白質濃度PK參數：最大觀察到的血漿濃度（C_最大 ）、達到最大觀察到的血漿濃度的時間（t_最大 ）、從時間0至最後一次可量測的濃度的時間的藥物血漿濃度-時間曲線下面積（AUC_0-t ）、血漿-藥物濃度時間曲線下面積從時間0外推至無窮大（AUC_{0- ∞} ）、半衰期（t_½ ）和IV給予後的總清除（CL_T ） ● 針對所有給藥方案的血漿酸性α-葡糖苷酶活性和總酸性α-葡糖苷酶蛋白質C最大和AUC0-∞的比率 ● 血漿麥格司他PK參數：C_最大 、t_最大 、AUC_0-t 、AUC_{0- ∞} 和t_½ ，口服給予後的藥物的表觀總清除率（CL_T /F），和口服給予後的末期分佈體積（Vz/F），針對每個劑量水平 ● 針對每個劑量水平的血漿麥格司他C_最大 和AUC_{0- ∞} 的比率功能性評估（在基線處進行） 對於非臥床的受試者 ● 運動功能測試 ● 6分鐘步行測試（6MWT） ● 10米步行測試 ● 步態，樓梯，高爾（Gower）和椅子得分 ● 計時起立和行走（TUG） ● 針對上肢和下肢的肌肉力量測試（醫學研究標準[MRC]和手提式肌力計） ● PFT（FVC、MIP、MEP和SNIP） 對於臥床的受試者 ● 肌肉力量測試-只上肢 ● 只針對上肢進行的MRC和手提式肌力計 ● 肺功能檢查（PFT）（用力肺活量[FVC]、最大吸氣壓[MIP]、最大呼氣壓[MEP]和鼻嗅吸入壓[SNIP]） 患者報告的結果（在基線處進行） ● 疲勞嚴重性度量 ● 鹿特丹障礙（Rotterdam Handicap）度量 ● 拉施（Rasch）建立的龐培氏-比活性（R-PAct） 探究性的 ● 抗-ATB200抗體效價（總的和中和的） ● 抗重組酸性α-葡糖苷酶抗體與阿葡糖苷酶α的交叉反應性 ● 促炎細胞介素和免疫系統啟動的其他生物標記物 ● PD標記物（Hex4和CPK）分析方法： 統計方法：

將提供針對PK參數的描述性統計。將提供針對不是PK參數的所有變數的匯總統計。針對單獨的5、10和20 mg/kg ATB200的酸性α-葡糖苷酶活性和總酸性α-葡糖苷酶蛋白質暴露（C_最大 、AUC_0-t 和AUC_{0- ∞} ）比率的劑量比例性評估。對在每個群體和總體內的單獨20 mg/kg ATB200對比20 mg/kg ATB200 + 130 mg麥格司他，以及對比20 mg/kg ATB200 + 260 mg麥格司他的酸性α-葡糖苷酶活性和總酸性α-葡糖苷酶蛋白質暴露（C_最大 、AUC_0-t 和AUC_{0- ∞} ）比率進行的方差分析（ANOVA）。對在非臥床的和臥床的受試者之間，針對20 mg/kg ATB200 + 130 mg麥格司他和20 mg/kg ATB200 + 260 mg麥格司他的酸性α-葡糖苷酶活性和總酸性α-葡糖苷酶蛋白質暴露（C_最大 、AUC_0-t 和AUC_{0- ∞} ）比率進行的ANOVA。針對在每個受試者群體和總體內的130 mg和260 mg麥格司他的暴露比率（C_最大 、AUC_0-t 和AUC_{0- ∞} ）的劑量比例性評估。將評估免疫原性結果對PK、PD和安全性的影響。中期分析：

當至少50%（n=6）的受試者已經完成該研究的階段2時，將進行中期分析。在該研究中，可以進行多達2個另外的中期分析。 初始PK結果：

針對受試者的GAA活性和GAA總蛋白的PK匯總分別在表12和13中展示。

在表12-15和圖24-26中，麥格司他和ATB200的單次給藥之後進行單次劑量（SD）的量測，並且麥格司他和ATB200的第三次每兩週一次給予之後進行多劑量（MD）的量測。表 12 ： ^a 算數平均數（ CV% ） ^b 中位數（最小 - 最大） ^c 幾何平均數（ CV% ） 表 13 ： ^a 算數平均數（ CV% ） ^b 中位數（最小 - 最大） ^c 幾何平均數（ CV% ）

圖24A圖示5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg ATB200的劑量給藥之後，平均血漿GAA活性的濃度-時間曲線。圖24B亦提供了描繪5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg ATB200的劑量給藥之後的平均血漿GAA活性的濃度時間曲線，但是該血漿GAA活性係以對數標度顯示的。從圖24A-24B和表12可以看出，對於血漿GAA活性，證實ATB200比劑量比例性暴露略大。

圖24C圖示的是單獨20 mg/kg ATB200，連同20 mg/kg的ATB200和130或260 mg的麥格司他劑量給藥之後的平均血漿GAA活性的濃度-時間曲線。圖24D亦提供了單獨20 mg/kg ATB200，與130 mg麥格司他或260 mg麥格司他的劑量給藥之後的平均血漿GAA活性，但是該血漿GAA活性係以對數標度顯示的。

圖25A圖示5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg ATB200的劑量給藥之後的平均血漿GAA總蛋白的濃度-時間曲線。圖25B亦提供了描繪5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg ATB200的劑量給藥之後的平均血漿GAA總蛋白的濃度時間曲線，但是該血漿GAA總蛋白係以對數標度顯示的。從圖25A-25B和表13可以看出，對於血漿GAA總蛋白，證實ATB200比劑量比例性暴露略大。

圖25C圖示單獨20 mg/kg ATB200，20 mg/kg 的ATB200和130 mg的麥格司他，以及20 mg/kg的ATB200和260 mg的麥格司他劑量給藥之後的平均血漿GAA總蛋白的濃度-時間曲線。圖25D亦提供了單獨20 mg/kg ATB200，與130 mg麥格司他或260 mg麥格司他劑量給藥之後的平均血漿GAA總蛋白，但是該血漿GAA總蛋白係以對數標度顯示的。

如在表13中所示，相對於ATB200單獨給予，麥格司他的共同給予增加了總GAA蛋白質血漿半衰期大約30%。對於所有處理，分佈體積範圍係從3.5至5.7 L，表明ATB200的糖基化使得實現ATB200至組織的有效分佈。

針對麥格司他的PK匯總在表14中展示。表 14 ^a 算數平均數（ CV% ） ^b 中位數（最小 - 最大） ^c 幾何平均數（ CV% ）

圖26圖示130 mg或260 mg的麥格司他劑量給藥之後，在人類受試者的血漿中的麥格司他的濃度-時間曲線。

從表14和圖26中可以看出，ATB200輸注前1小時口服給予麥格司他，進入輸注，血漿麥格司他達到峰濃度2小時，並且證實了劑量比例性的動力學。

針對GAA活性和總蛋白的血漿濃度曲線的不同部分上進行分析，以確定部分AUC。表15提供了針對GAA活性和總蛋白質的部分AUC從0-t_最大 、t_最大 -6 h、t_最大 -10 h、t_最大 -12 h和t_最大 -24 hr的匯總。表 15 ：

從表15可以看出，相對於單獨20 mg/kg ATB200，20 mg/kg的ATB200加上麥格司他的pAUCt_{最大 -24h} 對於130 mg SD、130 mg MD和260 mg SD的GAA活性百分比平均增加量分別是21.4%、17.8%、40.2%。

相似地，相對於單獨20 mg/kg ATB200，20 mg/kg的ATB200加上麥格司他的pAUCt_{最大 -24h} 對於130 mg SD、130 mg MD和260 mg SD的GAA總蛋白百分比平均增加量分別是12.5%、16.4%、37.5%。

因此，部分AUC分析證實共同給予麥格司他顯著地增加了ATB200的末期部分AUC（t_{最大 -24h} ），對於130 mg劑量的麥格司他增加了大約15%，對於260 mg劑量的麥格司他增加了大約40%。初始生物標記物結果：

在人類患者中從Lumizyme®轉換到ATB200來監測丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天冬胺酸轉胺酶（AST）和肌酸磷酸激酶（CPK）的水平。該患者接受遞增劑量的ATB200（5、10和20 mg/kg），隨後是ATB200 （20 mg/kg）和麥格司他（130和260 mg）的共同給予。高水平的CPK酶可以指示對肌肉組織、心臟或腦的損傷或應激。升高的ALT和AST分別是來自龐培氏病的肝臟和肌肉損傷的標記物。ALT、AST和CPK水平的初始分析圖示在圖38-41中。

從圖38-41可以看出，兩個患者在所有三種生物標記物中展示出朝著改進的早期趨勢，並且兩個患者保持穩定。一個患者在CPK、AST和ALT中分別具有44%、28%和34%降低。另一個患者在CPK、AST和ALT中分別具有31%、22%和11%降低。

到目前為止，亦沒有嚴重的不良事件（SAE）。AE通常是輕度的和短暫的。在所有入選的患者中，在100+輸注後，至今沒有輸注相關的反應。所有患者在基線時具有抗rhGAA抗體，其保持大體穩定。細胞介素在輸注期間保持低和穩定。 實例15：在野生型和龐培氏纖維母細胞中的GAA和LAMP1水平

利用免疫螢光顯微鏡，用常見的剪接突變來偵測野生型纖維母細胞和龐培氏纖維母細胞中的GAA和LAMP1水平。如圖27中所示，在野生型纖維母細胞中，GAA在明顯的溶酶體區室中。圖27亦圖示在龐培氏纖維母細胞中的豐富的GAA信號，而且在龐培氏纖維母細胞中的該GAA和LAMP1信號似乎定位至ER和高基蛋白，而不是遠端的溶酶體。此係改變的GAA蛋白質在龐培氏纖維母細胞中運輸的證據。 實例16：在Gaa -基因敲除小鼠中的細胞功能障礙和肌肉功能的改進

由於GAA缺乏引起的溶酶體肝糖分解代謝的損傷已經展示出引起如顯著證明的實質性細胞功能障礙，持續性自噬，以及由累積的肝糖填充的膜結合的細胞內區室的增殖和積累（N.拉賓（N. Raben）等人）。我們的免疫組織學資料表明，對於許多蛋白質，蛋白質運輸係顯著改變的，該等蛋白質包括若干對肌肉細胞膜穩定性至關重要的關鍵蛋白質，例如肌肉萎縮蛋白，a-和b-營養不良聚糖，包括肌肉萎縮蛋白糖蛋白複合物的不同肌聚糖蛋白及其他，連同參與肌肉修復的蛋白質（例如，戴斯富林蛋白（dysferlin））。該等關鍵的肌肉蛋白質需要適當的蛋白質運輸至它們發揮功能的肌肉細胞膜。如圖28所示，我們的免疫組織學資料揭示了在龐培氏病的Gaa 基因敲除（KO）小鼠模型的肌肉中，該等關鍵的肌肉蛋白質的可感知部分具有細胞內定位。該等資料表明，該等關鍵的肌肉蛋白的錯運輸會誘發最終導致肌無力和失修的假肌肉萎縮症。

在Gaa KO小鼠中，以等價ERT劑量（20 mg/kg）經由每隔一週的給藥方案來評估阿葡糖苷酶α（美爾贊®）和ATB200（具有和不具有10 mg/kg麥格司他）。2種給予之後，如與運載體處理的小鼠相比，阿葡糖苷酶α適度地減少了在骨骼肌中的積累的溶酶體肝糖（圖32A-32C），並且對減少自噬（圖30A-30B）或溶酶體的增殖（圖29A-29B）具有微不足道的影響。相反，在相同條件下，用ATB200/麥格司他觀察到實質上更好的溶酶體肝糖清除率（圖32A-32D）。ATB200/麥格司他亦似乎改進整體的肌肉生理學，如由以下項證明：減少的LC3 II水平（圖30A-30B）、充分確立的自噬生物標記物和用LAMP1染色的積累的細胞內囊泡的清除率（圖29A-29B）、已知的駐留溶酶體膜內在蛋白和戴斯富林蛋白（dysferlin）（圖31A-31B），已知的參與肌肉修復的細胞表面蛋白。此外，ATB200/麥格司他顯著地改進類似野生型小鼠肌纖維的肌肉構造。

而且，圖29-32圖示ATB200的兩個不同的批次（早期代和晚期代製造過程）產生可比較的結果。圖32A-32D中，*表示相比單獨美爾贊®的統計學顯著性。 實例17：在Gaa -基因敲除小鼠中的肌肉功能

在12次每兩週給予的長期研究中，如藉由握力測試和線懸掛測試（圖33A-33B）量測，20 mg/kg ATB200加10 mg/kg麥格司他從基線進行性地增加了Gaa KO小鼠的功能性肌肉力量。在相同的條件下，貫穿大多數的該研究，觀察到接受相同ERT劑量（20 mg/kg）的阿葡糖苷酶α（Lumizyme®）處理的小鼠的功能性肌肉力量係下降的（圖33A-33B）。至於短期研究，相比阿葡糖苷酶α，3個月（圖34A-34C）和6個月（圖34D-G）後，ATB200/麥格司他具有實質更好的肝糖清除率。相比阿葡糖苷酶α，3個月處理後，ATB200/麥格司他亦減少了自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白（dysferlin）的細胞內積累（圖35）。圖33A中，*表示相比單獨Lumizyme®的統計學顯著性（p＜0.05，兩側t檢驗）。在圖34A-34G中，*表示相比單獨Lumizyme®的統計學顯著性（p＜0.05，在單向方差分析下的使用鄧尼特（Dunnett）方法的多重比較）。

總之，該等資料表明ATB200/麥格司他有效地靶向肌肉來逆轉細胞功能障礙並且改進肌肉功能。重要的是，在肌肉構造中的明顯改進以及減少的自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白（dysferlin）的細胞內積累對於與在功能性肌肉力量改進相關的改進的肌肉生理學可以是良好的替代。該等結果表明，監測自噬和該等關鍵的肌肉蛋白可以是對評估Gaa KO小鼠的龐培氏病的有效性治療性治療的合理、實用的方法，其可以證明係來自臨床研究中的肌肉活檢的有用的生物標記物。

圖40圖示在存在或不存在麥格司他的情況下，6個月的ATB200給予降低了Gaa Ko小鼠中肌肉萎縮蛋白的細胞內積累。與用Lumizyme®相比，ATB200±麥格司他的肌肉萎縮蛋白積累存在更大減少。 實例18：在Gaa -基因敲除小鼠中的唾液酸含量對ATB200的影響

針對在Gaa KO小鼠中的藥物代謝動力學和功效，評估具有不同唾液酸含量的ATB200的兩個批次。表16提供了針對兩個批次的特徵的匯總。表 16 ：

從表16可以看出，批次B比批次A具有更高的唾液酸含量，但是比批次A具有略微更低的M6P含量。

圖36圖示ATB200的單次IV推注給藥之後，在Gaa KO小鼠的血漿中的GAA活性的濃度-時間曲線。批次A和B的半衰期在以下表17中提供。表 17 ：

從表17可以看出，批次B比批次A具有更低的半衰期。儘管在半衰期上的減少係適度的，但是在半衰期上的此減少係統計學上顯著的（在兩側t檢驗中，p＜0.05）。

在相關的研究中，將ATB200（批次A和B）和Lumizyme®的IV推注尾靜脈注射給予Gaa KO小鼠，每隔一週共注射2次。最後一次給予後14天，量測組織中的肝糖水平。如圖37A-37D所示，在相似劑量下，批次B比批次A在減少肝糖方面通常更有效。在減少肝糖方面，批次A和批次B均優於Lumizyme®。圖37A-37D中，在相同劑量下，*表示相比Lumizyme®的統計學顯著性（p＜0.05，t檢驗），並且^ 表示相比批次A和批次B的統計學顯著性比較（p＜0.05，t檢驗）。

本文所描述的該實施方式意欲說明本組成物和方法，而並不意欲限制本發明的範疇。意欲包括與作為整體的描述一致的並且對於熟習該項技術者來說容易理解的不同修改和改變。所附申請專利範圍不應受實例中所展示的具體實施方式的限制，但是應當被給予與作為整體的描述一致的最寬泛的解釋。

貫穿本申請案，引用了專利案、專利申請案、出版物、產品描述、基因庫登錄號和實驗方案，出於所有目的，將其揭露內容以其整體藉由引用結合在此。

無

從以下書面描述和附圖中，本發明的其他特徵將變得明顯，其中：

圖1係圖示了在不同pH值以及在麥格司他存在和缺乏的情況下，解折疊的ATB200蛋白對比溫度的百分比之圖；

圖2A和2B分別圖示了Lumizyme®和美爾贊®的CIMPR親和層析法之結果。虛線指的是M6P洗提梯度。用M6P洗提替代GAA分子經由包含M6P的聚糖結合到CIMPR。如在圖2A中所示，Lumizyme®中78%的GAA活性在M6P添加前被洗提。圖2B圖示了73%的GAA美爾贊®活性在M6P添加前被洗提。在Lumizyme®或美爾贊®中只有22%或27%的rhGAA，分別用M6P洗提。該等圖圖示了在此兩種常規的rhGAA產品中，大多數的rhGAA缺乏具有細胞攝取和溶酶體靶向所需要的M6P的聚糖。

圖3圖示了用於用編碼rhGAA的DNA轉化CHO細胞的DNA構建體。用編碼rhGAA的DNA構建體轉化CHO細胞。

圖4A和4B，分別圖示了美爾贊®和ATB200 rhGAA的CIMPR親和層析法之結果。從圖4B可以看出，在ATB200 rhGAA中約70%的rhGAA包含M6P。

圖5A和5B圖示了在陰離子交換（AEX）柱上被捕獲和不被捕獲的ATB200 rhGAA的CIMPR親和層析法之結果。

圖6圖示了Lumizyme®和ATB200 rhGAAs的波利韋克斯（Polywax）洗提圖。

圖7圖示了相比鑒定為BP-rhGAA、ATB200-1和ATB200-2的ATB200 rhGAA的三種不同的製劑，Lumizyme®的N-聚糖結構之概述。

圖8A-8H圖示了ATB200 rhGAA的位點特異性N-糖基化分析之結果。

圖9A比較了ATB200 rhGAA的CIMPR結合親和力（左軌跡線）與Lumizyme®的CIMPR結合親和力（右軌跡線）。

圖9B比較了Lumizyme®和ATB200 rhGAA的雙-M6P含量。

圖10A比較了不同GAA濃度下，在正常纖維母細胞內的ATB200 rhGAA活性（左軌跡線）與Lumizyme® rhGAA活性（右軌跡線）。

圖10B比較了在不同GAA濃度下，來自患有龐培氏病的受試者的纖維母細胞中的ATB200 rhGAA活性（左軌跡線）與Lumizyme® rhGAA活性（右軌跡線）。

圖10C比較了來自正常受試者和患有龐培氏病的受試者的纖維母細胞之（K_攝取 （K_uptake ））。

圖11係圖示ATB200的群體藥動學（PK）模型的擬合優度之圖；

圖12係圖示麥格司他和去氧野尻黴素（duvoglustat）劑量正態化的血漿濃度-時間曲線之圖；

圖13A係圖示在血漿中去氧野尻黴素（duvoglustat）的群體PK模型的擬合優度之圖；

圖13B係圖示在肌組織中的去氧野尻黴素（duvoglustat）的群體PK模型的擬合優度之圖；

圖14係圖示麥格司他的群體PK模型的擬合優度之圖；

圖15係圖示經4 h時段，在人體內輸注單一的20 mg/kg的ATB200的靜脈內的（IV）的劑量得到的預測的濃度-時間曲線之圖；

圖16A係圖示與運載體（陰性對照）、與20 mg/kg的阿葡糖苷酶α（Lumizyme®）或與5、10或20 mg/kg的ATB200接觸後，相對於在小鼠心肌中的重組人酸性α-葡糖苷酶劑量的肝糖量之圖；

圖16B係圖示與運載體（陰性對照）、與20 mg/kg的阿葡糖苷酶α（Lumizyme®）或與5、10或20 mg/kg的ATB200接觸後，相對於在小鼠四頭肌中的重組人酸性α-葡糖苷酶的劑量的肝糖量之圖；

圖16C係圖示與運載體（陰性對照）、與20 mg/kg的阿葡糖苷酶α（Lumizyme®）或與5、10或20 mg/kg的ATB200接觸後，相對於在小鼠三頭肌中的重組人酸性α-葡糖苷酶的劑量的肝糖量之圖；

圖17係繪製在ATB200存在時，用不同劑量的麥格司他處理的小鼠中的肝糖水平與單獨用ATB200處理的小鼠中的肝糖水平的比率對比麥格司他的AUC值與ATB200的AUC值的比率之圖；

圖18係圖示重複給予466 mg、270 mg和233 mg劑量的麥格司他後，血漿中麥格司他的預測濃度-時間曲線之圖；

圖19係圖示重複給予466 mg、270 mg和233 mg劑量的麥格司他後，在組織溶酶體中的麥格司他的預測濃度-時間曲線之圖；

圖20係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理的野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的心臟、隔膜和比目魚肌的一系列顯微照片，展示出溶酶體相關膜蛋白（LAMP1）水平；

圖21係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理的野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的心臟和比目魚肌的一系列顯微照片，展示出用過碘酸-希夫（Schiff）試劑（PAS）染色的肝糖水平；

圖22係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理的野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的四頭肌的一系列顯微照片（1000x），用亞甲藍染色來展示囊泡（用箭頭指示）；

圖23係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理的野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的四頭肌的一系列顯微照片（400x），展示出自噬標記物微管相關蛋白質1A/1B-輕鏈3磷脂醯乙醇胺綴合物（LC3A II）和p62，胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT4和胰島素非依賴性葡萄糖轉運體GLUT1的水平；

圖24A-24D係圖示給予5、10或20 mg/kg ATB200，或20 mg/kg ATB200和130或260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的GAA活性的濃度-時間曲線之圖；

圖25A-25D係圖示給予5、10或20 mg/kg ATB200，20 mg/kg ATB200和130 mg麥格司他，或20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的GAA總蛋白的濃度-時間曲線之圖；

圖26係圖示給予130 mg或260 mg的麥格司他後，在人類受試者血漿中的麥格司他濃度-時間曲線之圖；

圖27係在野生型纖維母細胞和龐培氏纖維母細胞中的GAA水平和LAMP1水平的一系列免疫螢光顯微照片；

圖28係來自野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的肌纖維的一系列顯微照片，展示出肌肉萎縮蛋白肌肉萎縮蛋白、a-和b-營養不良聚糖，以及戴斯富林蛋白（dysferlin）之水平；

圖29A和29B係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的股直肌（RF）和股外側肌/股內側肌（VL/VM）的肌纖維的一系列顯微照片（200x），展示出LAMP1 IHC信號；

圖30A和30B係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的RF和VL/VM的肌纖維的一系列顯微照片（200x），展示出LC3 II IHC信號；

圖31A和31B係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的RF和VL/VM的肌纖維的一系列顯微照片（200x），展示出戴斯富林蛋白（dysferlin）IHC信號；

圖32A-32D係圖示來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的四頭肌、三頭肌、腓腸肌和心臟細胞中的肝糖水平之圖；

圖33A和33B係圖示在麥格司他存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的線懸掛和握力肌資料之圖；

圖34A-34G係圖示來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的四頭肌、三頭肌和心臟細胞中的肝糖水平之圖；

圖35係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的VL/VM的肌纖維的一系列顯微照片，展示出LAMP1、LC3和戴斯富林蛋白（dysferlin）IHC信號；

圖36係圖示將具有不同唾液酸含量的ATB200的兩個批次給予後，在Gaa -基因敲除小鼠的血漿中的GAA活性的濃度-時間曲線之圖；

圖37A-37D係圖示來自用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的四頭肌、三頭肌、腓腸肌和心臟細胞中的肝糖水平之圖；

圖38係圖示在給予遞增劑量的ATB200（5、10和20 mg/kg），隨後共同給予ATB200（20 mg/kg）和麥格司他（130和260 mg）之後，在人類患者中的丙胺酸胺基轉移酶（ALT）水平之圖；

圖39係圖示在給予遞增劑量的ATB200（5、10和20 mg/kg），隨後共同給予ATB200（20 mg/kg）和麥格司他（130和260 mg）之後，在人類患者中的天冬胺酸轉胺酶（AST）水平之圖；

圖40係圖示在給予遞增劑量的ATB200（5、10和20 mg/kg），隨後共同給予ATB200（20 mg/kg）和麥格司他（130和260 mg）之後，在人類患者中的肌酸磷酸激酶（CPK）水平之圖；

圖41係圖示在給予遞增劑量的ATB200（5、10和20 mg/kg），隨後共同給予ATB200（20 mg/kg）和麥格司他（130和260 mg）之後，在人類患者中的平均ALT、AST和CPK水平之圖；和

圖42係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡糖苷酶α和ATB200處理野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的股外側肌（VL）的肌纖維的一系列顯微照片（100x和200x），展示出肌肉萎縮蛋白信號。

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ctgccgcagc tgacggggaa actgaggcac 180 ggagcgggcc tgtaggagct gtccaggcca tctccaacc atg gga gtg agg cac 234 Met Gly Val Arg His 1 5 ccg ccc tgc tcc cac cgg ctc ctg gcc gtc tgc gcc ctc gtg tcc ttg 282 Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys Ala Leu Val Ser Leu 10 15 20 gca acc gct gca ctc ctg ggg cac atc cta ctc cat gat ttc ctg ctg 330 Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu 25 30 35 gtt ccc cga gag ctg agt ggc tcc tcc cca gtc ctg gag gag act cac 378 Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His 40 45 50 cca gct cac cag cag gga gcc agc aga cca ggg ccc cgg gat gcc cag 426 Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln 55 60 65 gca cac ccc ggc cgt ccc aga gca gtg ccc aca cag tgc gac gtc ccc 474 Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro 70 75 80 85 ccc aac agc cgc ttc gat tgc gcc cct gac aag gcc atc acc cag gaa 522 Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu 90 95 100 cag tgc gag gcc cgc 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gag ccc ttc ggg gtg atc gtg cac cgg cag ctg gac ggc cgc 906 Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg 215 220 225 gtg ctg ctg aac acg acg gtg gcg ccc ctg ttc ttt gcg gac cag ttc 954 Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe 230 235 240 245 ctt cag ctg tcc acc tcg ctg ccc tcg cag tat atc aca ggc ctc gcc 1002 Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala 250 255 260 gag cac ctc agt ccc ctg atg ctc agc acc agc tgg acc agg atc acc 1050 Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr 265 270 275 ctg tgg aac cgg gac ctt gcg ccc acg ccc ggt gcg aac ctc tac ggg 1098 Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly 280 285 290 tct cac cct ttc tac ctg gcg ctg gag gac ggc ggg tcg gca cac ggg 1146 Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly 295 300 305 gtg ttc ctg cta aac agc aat gcc atg gat gtg gtc ctg cag ccg agc 1194 Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser 310 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ggc aca tgg tac 2538 Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr 760 765 770 gac ctg cag acg gtg cca ata gag gcc ctt ggc agc ctc cca ccc cca 2586 Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro 775 780 785 cct gca gct ccc cgt gag cca gcc atc cac agc gag ggg cag tgg gtg 2634 Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val 790 795 800 805 acg ctg ccg gcc ccc ctg gac acc atc aac gtc cac ctc cgg gct ggg 2682 Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly 810 815 820 tac atc atc ccc ctg cag ggc cct ggc ctc aca acc aca gag tcc cgc 2730 Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg 825 830 835 cag cag ccc atg gcc ctg gct gtg gcc ctg acc aag ggt gga gag gcc 2778 Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala 840 845 850 cga ggg gag ctg ttc tgg gac gat gga gag agc ctg gaa gtg ctg gag 2826 Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu 855 860 865 cga ggg gcc tac aca cag gtc atc ttc ctg gcc agg aat aac acg atc 2874 Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile 870 875 880 885 gtg aat gag ctg gta cgt gtg acc agt gag gga gct ggc ctg cag ctg 2922 Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu 890 895 900 cag aag gtg act gtc ctg ggc gtg gcc acg gcg ccc cag cag gtc ctc 2970 Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu 905 910 915 tcc aac ggt gtc cct gtc tcc aac ttc acc tac agc ccc gac acc aag 3018 Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys 920 925 930 gtc ctg gac atc tgt gtc tcg ctg ttg atg gga gag cag ttt ctc gtc 3066 Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val 935 940 945 agc tgg tgt tag ccgggcggag tgtgttagtc tctccagagg gaggctggtt 3118 Ser Trp Cys 950 ccccagggaa gcagagcctg tgtgcgggca gcagctgtgt gcgggcctgg gggttgcatg 3178 tgtcacctgg agctgggcac taaccattcc aagccgccgc atcgcttgtt tccacctcct 3238 gggccggggc tctggccccc aacgtgtcta ggagagcttt ctccctagat cgcactgtgg 3298 gccggggcct ggagggctgc tctgtgttaa taagattgta aggtttgccc tcctcacctg 3358 ttgccggcat gcgggtagta ttagccaccc ccctccatct gttcccagca ccggagaagg 3418 gggtgctcag gtggaggtgt ggggtatgca cctgagctcc tgcttcgcgc ctgctgctct 3478 gccccaacgc gaccgcttcc cggctgccca gagggctgga tgcctgccgg tccccgagca 3538 agcctgggaa ctcaggaaaa ttcacaggac ttgggagatt ctaaatctta agtgcaatta 3598 ttttaataaa aggggcattt ggaatc 3624 ＜210＞ 3 ＜211＞ 952 ＜212＞ PRT ＜213＞ 智人 ＜400＞ 3 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln 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Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala 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952 ＜212＞ PRT ＜213＞ 智人 ＜400＞ 4 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 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Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu 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Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950 ＜210＞ 6 ＜211＞ 896 ＜212＞ PRT ＜213＞ 智人 ＜400＞ 6 Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser 20 25 30 Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu 35 40 45 Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala 50 55 60 Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg 100 105 110 Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys 115 120 125 Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val 130 135 140 His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Pro Phe Gly Val Ile Val His 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Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met 370 375 380 Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg 385 390 395 400 Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr 405 410 415 Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro 420 425 430 Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala 435 440 445 Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn 450 455 460 Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn 465 470 475 480 Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu 485 490 495 Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His 500 505 510 Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His 515 520 525 Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg 530 535 540 Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp 545 550 555 560 Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu 565 570 575 Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 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Claims (21)

1. 一種在對其有需要的一患者中治療龐培氏病之方法，該方法包括將麥格司他與一重組酸性α-葡糖苷酶組合給予該患者，其中該重組酸性α-葡糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且相比帶有阿葡糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的一含量，該重組酸性α-葡糖苷酶包括一含量增加的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。
2. 如請求項1所述之方法，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶包括與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5具有至少95%一致性的一序列。
3. 如請求項1所述之方法，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶的至少30%的分子包括帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的一個或多個N-聚糖單元。
4. 如請求項1所述之方法，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶包括每莫耳重組人酸性α-葡糖苷酶中的平均從0.5至7.0莫耳的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。
5. 如請求項1所述之方法，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶包括每莫耳重組人酸性α-葡糖苷酶中的平均至少2.5莫耳的甘露糖-6-磷酸殘基和每莫耳重組人酸性α-葡糖苷酶中的至少4莫耳的唾液酸殘基。
6. 如請求項1所述之方法，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶包括七個潛在的N-糖基化位點，至少50%的該重組人酸性α-葡糖苷酶分子包括帶有在第一位點的兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元；至少30%的該重組人酸性α-葡糖苷酶分子包括帶有在第二位點的一個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元；至少30%的該重組人酸性α-葡糖苷酶分子包括帶有在第四位點的兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元；以及至少20%的該重組人酸性α-葡糖苷酶分子包括帶有在第四位點的一個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。
7. 如請求項1所述之方法，其中該重組人酸性α-葡糖苷酶係藉由中國倉鼠卵巢細胞系GA-ATB-200或ATB-200-001-X5-14或其繼代培養物產生的。
8. 如請求項1所述之方法，其中將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約5 mg/kg至約20 mg/kg的一劑量實施靜脈給予，並且將該麥格司他以約200 mg至約600 mg的一劑量口服給予。
9. 如請求項8所述之方法，其中將該麥格司他在給予該重組人酸性α-葡糖苷酶之前給予。
10. 如請求項9所述之方法，其中將該麥格司他在給予該重組人酸性α-葡糖苷酶約一小時前給予。
11. 如請求項1所述之方法，其中將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約5 mg/kg至約20 mg/kg的一劑量實施靜脈給予，並且將該麥格司他以約233 mg至約500 mg的一劑量口服給予。
12. 如請求項1所述之方法，其中將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約5 mg/kg至約20 mg/kg的一劑量實施靜脈給予，並且將該麥格司他以約50 mg至約200 mg的一劑量口服給予。
13. 如請求項1所述之方法，其中將該重組人酸性α-葡糖苷酶以約20 mg/kg的一劑量實施靜脈給予，並且將該麥格司他以約260 mg的一劑量口服給予。
14. 如請求項13所述之方法，其中將該麥格司他在給予該重組人酸性α-葡糖苷酶之前給予。
15. 如請求項14所述之方法，其中將該麥格司他在給予該重組人酸性α-葡糖苷酶約一小時前給予。
16. 一種在對其有需要的一患者中用於龐培氏病聯合治療之套組，該套組包括：包含麥格司他的一藥學上可接受的劑型，包含一重組人酸性α-葡糖苷酶的一藥學上可接受的劑型，以及用於將包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型和包含該重組酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型給予至對其有需要的一患者的說明； 其中該重組酸性α-葡糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且相比帶有阿葡糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的一含量，該重組酸性α-葡糖苷酶包括一含量增加的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。
17. 如請求項16所述之套組，其中將包含該重組人酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型配置為以約5 mg/kg至約20 mg/kg的一劑量用於靜脈給予，並且包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型包含約200 mg至約600 mg的一劑量，並且被配置為用於口服給予。
18. 如請求項17所述之套組，其中該說明包括將該麥格司他在給予該重組人酸性α-葡糖苷酶約一小時前給予的說明。
19. 如請求項16所述之套組，其中將包含該重組人酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型配置為以約5 mg/kg至約20 mg/kg的一劑量用於靜脈給予，並且包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型包含約50 mg至約200 mg的一劑量，並且被配置為用於口服給予。
20. 如請求項16所述之套組，其中將包含該重組人酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型配置為以約20 mg/kg的一劑量用於靜脈給予，並且包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型包含約260 mg的一劑量，並且被配置為用於口服給予。
21. 如請求項20所述之套組，其中該說明包括將包含麥格司他的該藥學上可接受的劑型在給予包含該重組人酸性α-葡糖苷酶的該藥學上可接受的劑型約一小時前給予的說明。