CN1750834A - 用于治疗蛋白质缺乏病的联合治疗 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了通过将基因治疗与活性部位特异的陪伴分子(ASSC)结合起来改善基因治疗的方法。ASSC提高了由所施用的重组基因编码的蛋白质的稳定性和功效。

Description

用于治疗蛋白质缺乏病的联合治疗
该申请要求2003年2月18日申请的美国临时申请系列号60/448,073的优先权，其公开于此全文引用作为参考。
发明领域
本发明涉及通过将基因治疗和针对治疗基因所编码蛋白质的活性部位特异的陪伴分子(ASSC)的联合使用来治疗蛋白质缺乏病的方法。本发明进一步涉及包含含有基因编码区的核酸序列和针对所编码基因产物的ASSC的组合物。
发明背景
蛋白质缺乏病
蛋白质是在细胞内根据特定基因的基因组核苷酸序列通过转录、翻译和其它过程合成的。蛋白质缺乏病可以由编码基因的突变引起，该突变导致(i)蛋白质不能合成；(ii)缺乏生物学活性的蛋白质的合成；或(iii)包含正常或部分生物学活性、但不能够适当加工以达到蛋白质的天然区室的蛋白质的合成。源于遗传突变的蛋白质缺乏病也叫做遗传病。某些DNA突变导致氨基酸替代，进而进一步阻止并且在许多情况下排除突变型蛋白质的正确折叠。
除了源于遗传突变的蛋白质缺乏病外，一些蛋白质缺乏病可以由疾病或者疾病治疗(例如化学疗法)的副作用或者营养不量的后果引起。
当前疗法：用于治疗此类病的一种当前疗法是蛋白质替代疗法，该方法一般涉及静脉内、皮下或肌内灌注纯化形式的相应野生型蛋白质，或者植入生物易蚀固体形式的酶以便持续释放。蛋白质替代疗法具有几个限制，例如大规模产生和纯化正确折叠的、糖基化的天然蛋白质上的困难、不能够达到改善缺乏病的足够蛋白质的水平、抗蛋白质免疫反应的产生以及在具有重要中枢神经系统参与的疾病中不能够穿过血-脑屏障。此外，由于所施用的蛋白质在体内的半寿期短，该种疗法一般需要频繁的、昂贵的灌注和植入。
基因治疗涉及通过将一个功能基因导入需要其的个体的体细胞中而替代缺陷或缺少的基因编码。基因治疗可以通过“间接体内(ex vivo)”的方法实现，其中将分化的或成体干细胞从个体的身体中取出，随后使用作为递送工具的病毒载体将缺陷基因的正常拷贝导入所移出的细胞内。此外，为了达到治疗的效果，使用广泛的病毒载体、脂质体、蛋白质DNA复合物、裸DNA和其它方法的体内直接基因转移技术直接在原位将治疗基因导入。
虽然有前途，但是基因治疗因为技术难题也受到限制，例如载体不能感染或转导正在分裂的细胞、靶基因的低表达、以及基因一旦被递送后对表达的调节。为了达到治疗的目的，维持蛋白质高表达水平达到足够时间以得到生理有效量的蛋白质是重要的。此外，保证蛋白质递送进入恰当的组织是重要的。此外，已经表明在昆虫细胞和哺乳动物细胞内过量表达重组蛋白会造成蛋白质在内质网中的积聚(Hsu等，Biotechnol.Prog.1997；13：96-104)，这可能是因为生产过量而超过了内质网质量控制系统的能力，并且这种结果预计在体内也会发生。
虽然在美国基因治疗尚未被批准，但是针对众多疾病的基因治疗(间接体内和直接转移)已经处于研究之中。用于基因治疗的载体和/或宿主细胞和方法已经被开发出来并且处于开发的临床前或临床阶段(见Nelson等的美国专利号6,066,626和Barranger等的美国专利号5,911,983)。斯坦福研究院(SRI International)还开发出使用外源序列的同源重组来纠正遗传病的突变基因的基因治疗(见Zarling等的美国专利号6,255,113)。
第三，治疗酶蛋白质缺乏病的相对较新的方法涉及到小分子抑制剂的使用以降低所缺乏蛋白质的天然底物，从而改善病理学。此种“底物剥夺”的方法已经在称作溶酶体贮积病或鞘糖脂贮积疾病的一类大约40个相关酶疾病中被明确地描述。这些可遗传的“构象”病的特征是缺乏能够催化降解细胞内糖脂的溶酶体酶，导致脂类不正常积累，这打乱了细胞的功能。计划用于治疗的小分子抑制剂对于抑制参与糖脂合成的酶是特异的，该种抑制降低了需要由所缺乏酶降解的细胞内糖脂的量。该方法也受到了限制，因为糖脂对于生物学功能是必需的，并且过度的剥夺会引起副作用。明确地说，糖脂能够被脑用来从神经元的神经节苷脂传递信号到其它神经元。如果糖脂太少或太多，神经元传递信号的能力受到阻碍。
如下讨论的第四种方法使突变型蛋白质免受内质网内的降解。
                蛋白质在内质网内的折叠和加工
蛋白质在细胞质内合成，并且新合成的蛋白质以很大程度上未折叠的状态分泌进入内质网(ER)的腔内。通常，蛋白质折叠受自组装原则的控制。新合成的多肽根据它们的氨基酸序列折叠成它们的天然构象(Anfinsen等，Adv.Protein Chem.1975；29：205-300)。在体内，蛋白质折叠是复杂的，因为环境温度和高蛋白质浓度的结合会刺激聚集过程，在该过程中通常埋于疏水核心内的氨基酸会与它们相邻的氨基酸发生非特异的相互作用。为了避免出现这种问题，通常通过特定的一组称作分子侣伴的蛋白质促进蛋白质的折叠，分子侣伴阻止了初生多肽链的聚集并且能够结合到未折叠的蛋白质上以致于蛋白质以天然构象重折叠(Hartl，Nature 1996；381：571-580)。
分子侣伴实际上存在于所有类型的细胞和大部分细胞区室内。一些参与蛋白质的转运并且允许细胞在诸如热休克和葡萄糖饥饿的应激条件下存活。在分子侣伴中Bip(免疫球蛋白重链结合蛋白，Grp78)是特征最清楚的ER的陪伴分子(Haas，Curr.Top.Microbiol.Immunol.1991；167：71-82)，但是其它的也是知道的(Gething等，Nature 1992；355：33-45；Caplan，Trends Cell.Biol.1999；9：262-268；Lin等，Mol.Biol.Cell.1993；4：109-1119：Bergeron等，Trends Biochem.Sci.1994；19：124-128)。像其它分子侣伴一样，Bip与ER内的许多分泌蛋白和膜蛋白在这些蛋白质的整个成熟过程中发生相互作用，虽然在折叠平稳进行过程中这种相互作用通常很弱并且是短寿命的。一旦完成天然蛋白质的构象，分子侣伴不再与蛋白质相互作用。结合到在折叠、装配或正确糖基化方面失败的蛋白质上后的Bip变得稳定，并且导致了蛋白质通过ER相关途径的降解。该过程作为ER内的“质量控制”系统起作用，保证了只有那些正确折叠和装配的蛋白质能够转运出ER用于进一步的成熟，并且错折叠的蛋白质滞留其中进行随后的降解(Hurtley等，Annu.Rev.Cell.Biol.1989；5：277-307)。
如上所述，某些DNA突变导致氨基酸替代，这种替代进一步阻止并且在许多情况下排除突变型蛋白质的正确折叠。为了纠正这些错折叠，研究人员尝试了使用多种分子。已经表明在一些疾病中高浓度的甘油、二甲基亚砜(DMSO)、三甲胺-N-氧化物(TMAO)或者重水抑制降解途径并增加突变型蛋白质的细胞内转运(Brown等，Cell Stress Chaperones 1996；1：117-125；Burrows等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97：1796-801)。虽然其功能机制还不清楚，但是这些化合物被认为是能够促进一般蛋白质折叠的非特异的化学陪伴分子。虽然它们对于细胞内蛋白质折叠缺陷的生物化学检查是有用处的，但起功效时要求该类化合物的高剂量使得它们在临床上应用困难或不适宜用于临床。这些化合物还缺乏特异性。
                    特异的陪伴分子策略
本发明者先前的专利和出版物描述了拯救内源性酶蛋白质特别是错折叠的溶酶体酶免受通过ER质量控制机制而降解的治疗策略。该策略使用对与特定溶酶体病相关的缺陷溶酶体酶特异的小分子可逆竞争性抑制剂。该策略如下：由于突变型酶蛋白质在ER内不正确折叠(Ishii等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1996；220；812-815)，酶蛋白质被滞留于正常的转运途径(ER→高尔基体→内体→溶酶体)并且被快速地降解。因此，促进突变型蛋白质正确折叠的功能性化合物将作为针对突变型蛋白质的位点特异的陪伴分子而促进从ER质量控制系统内顺利逃脱。由于已知酶的一些抑制剂占据酶的催化中心，导致了体外其构象的稳定。这些特异的陪伴分子可以称作活性部位特异的陪伴分子(ASSC)。
在Fan等的美国专利号6,274,597，6,583,158，6,589,964，和6,599,919和2002年11月26日申请的待决美国申请系列号10/304,396(此处完全引用作为参考)中已经专门阐述了参与溶酶体贮积病的酶的策略。例如，半乳糖的小分子衍生物，1-脱氧半乳糖野艽霉素(1-deoxygalactonojirimycin)(DGJ)，是一种突变型法布里(Fabry)酶α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)的有效的竞争性抑制剂，能够有效提高中性pH下突变型α-Gal A(R301Q)的体外稳定性并且增强从具有R301Q或者Q279E突变的法布里病人中建立的淋巴母细胞中突变型酶的活性。此外，过量表达突变型(R301Q)α-Gal A的转基因小鼠经口施用DGJ会在主要器官大量地提高酶活性(Fan等，Nature Med.1999；5：112-115)。对错折叠蛋白质的成功拯救取决于特异抑制剂在体内达到的浓度，该浓度低于酶的完全抑制浓度，相比之下底物剥夺方法中需要酶的抑制浓度。
除了溶酶体贮积病外，现在认为大量并且多种疾病也是由于采用非天然蛋白质构象所导致的构象疾病，这可能导致蛋白质在ER内滞留并最终导致蛋白质的降解(Kuznetsov等，N.Engl.J.Med.1998；339：1688-1695；Thomas等，Trends Biochem.Sci.1995；20：456-459；Bychkova等，FEBSLett.1995；359：6-8；Brooks，FEBS Lett.1997；409：115-120)。ASSC表现出拯救除了酶外的突变型蛋白质的表达。例如，发现小的合成化合物会稳定突变型形式的肿瘤抑制基因蛋白p53的DNA结合结构域，因此允许蛋白质维持活性构象(Foster等，Science 1999；286：2507-10)。已经表明通过小分子受体拮抗物和配体可以拯救受体的合成(Morello等，J.Clin.Invest.2000；105：887-95；Petaja-Repo等，EMBO J.2002；21：1628-37)。已经证明甚至通过使用通道阻断药物或底物对膜通道蛋白质和其它质膜转运蛋白进行药学拯救(Rajamani等，Circulation 2002；105：2830-5；Zhou等，J.Biol.Chem.1999；274：31123-26；Loo等，J.Biol.Chem 1997；272：709-12)。上述所有文献显示ASSC有能力特异地拯救包括但不限于酶、受体、膜通道蛋白质和DNA转录因子在内的突变型蛋白质。
除了突变型蛋白质以外，ASSC还表现出能够稳定野生型蛋白质，导致它们的产量和稳定性提高。如在一个实例中，已经证明特定ASSC即DGJ能够增加用编码野生型α-Gal A序列的载体转染的COS-7细胞内野生型α-Gal A的数量和活性。ASSC拯救过量表达的野生型酶，否则这些酶会滞留于ER质量控制系统，因为在COS-7细胞中所述酶的过量表达和过量产生超过了该系统的容量并且导致聚集和降解(见03年2月28日申请的美国申请系列号10/377,179)。
然而，虽然ASSC在拯救构象上缺陷蛋白质上是有效的，但ASSC不能够拯救例如由于缺失突变或无义突变导致产生的蛋白质。这些疾病的治疗需要蛋白质的替换(通过蛋白质的替换或基因治疗)或对所积累产物的合成作用的抑制。基因治疗对于长期减轻和缓解不良副作用是有很大希望的。然而，如上所讨论，基因治疗还不能达到足够的功效而不能成为一种普遍的疗法。
总之，当应用基因治疗治疗蛋白质缺乏病或其它疾病时，本领域需要提高基因治疗的生物学效率和成本效率的方法。本发明通过使得经证实提高了基因表达效率的技术适用于体内基因治疗解决了该需求。
发明概述
本发明提供了对患有通过基因治疗可以治疗的疾病的个体进行治疗的方法。该方法包括对个体施用替代基因和针对由所施用基因编码的蛋白质的ASSC。
本发明还提供了用于增强由所施用基因体内编码的蛋白质的稳定性的方法，其包括将蛋白质在体内与ASSC相互接触。
本发明进一步提供了通过施用针对重组蛋白的ASSC而体内增强靶细胞表达由所施用的基因编码的重组蛋白的方法。
本发明还提供了用于提高突变型、由于在ER中缺陷性折叠和加工而变得有缺陷的内源蛋白质的稳定性的方法。内源性蛋白质的稳定性和因此而来的活性会随着所施用基因产生的蛋白质稳定性的增加而同时得到增强。
本发明进一步提供了这样的组合物，其为在可药用载体中包含用于由基因所表达重组蛋白的ASSC。
发明详述
本发明通过联合标准的基因治疗方法和活性部位特异的陪伴分子(ASSC)的方法改进了针对蛋白质缺乏病的基因治疗的疗效，其中所述ASSC即能够引导蛋白质正确/天然折叠构象并且稳定基因所编码蛋白质的试剂。ASSC增强了所表达蛋白质的体内表达、效率和稳定性。本发明进一步提供了含有重组基因和ASSC的制剂，其中所述ASSC对于基因所编码蛋白质的正确/天然折叠构象的引导和稳定性是特异的。本发明是以在遗传病和其它疾病的治疗中ASSC能够作为基因治疗的联合治疗而使用这一发现为基础的。虽然先前的研究证明了ASSC具有增加组织培养中正常的、野生型蛋白质的表达水平的能力，但是从在人工体系中修饰的表达水平不能够确立对于野生型治疗蛋白质在体内能够达到这种结果。现在已经认识到，作为替代，拯救缺陷的错折叠蛋白质的体内方法可如文中所述进行修饰以促进通过基因治疗递送的治疗(野生型)蛋白质的表达效率。
使用本领域已知的方法可以对ASSC进行筛选和鉴定。一旦鉴定出一种对特定疾病有用的ASSC，则该陪伴分子可以被施用于接受基因治疗的病人。在治疗基因的高水平表达过程中，ASSC补充了内源性的分子侣伴以通过抑制在ER内的聚集来提高表达的效率。陪伴分子还可以作为稳定剂阻止所施用基因产生的编码蛋白质的降解。
定义
在每个术语所使用的本发明上下文中和其所使用的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有本领域中其通常的含义。为了在描述发明的组合物和方法以及怎样使用它们方面对实践者提供额外的指导，一些术语在下面讨论，或者在说明书的其它地方讨论。
具体定义.术语“基因治疗”是指通过外源性施用基因改变内源性基因表达的方法。如此处所使用，基因治疗还指通过将对应于缺陷或丢失基因的功能性基因导入需要的个体的体细胞或干细胞的方法而对编码缺陷蛋白质的缺陷基因的替代、或者对缺失基因的替代。基因治疗可以通过“间接体内”的方法实现，其中分化的或成体干细胞从个体的身体中取出，然后使用作为基因递送工具的病毒载体将缺陷基因的正常拷贝导入所移出的细胞内。此外，为了达到治疗的结果，使用广泛的病毒载体、脂质体、蛋白质DNA复合物或裸DNA方法的体内直接基因转移技术在原位将基因转移进入细胞。
术语“稳定正确构象”指化合物或肽或其它分子与在体外例如在制剂中和体内与野生型蛋白质或者能够行使野生型功能的突变型蛋白质结合从而使野生型或突变型蛋白质的结构可以维持其天然或正确形式的能力。这种作用通过(i)蛋白质贮存期限的提高；(ii)每单位量的蛋白质的较高的活性；或者(iii)体内效能更强中的一种或多种实践性地证明了。这通过表达时提高的从ER中的产量、对由于温度提高或离液剂的存在所导致的解折叠的较大的抗性以及通过相似的方法实验性地观察到。
本发明通过提高治疗基因的体内表达水平增强基因治疗的疗效。如此处所使用，“增加表达水平”指同未与ASSC相接触的同种类型细胞内的数值相比，在与ASSC相接触的细胞内重组蛋白的数量、重组蛋白的质量(即功能蛋白质的产量)、蛋白质活性水平、或者前述的任何组合的增加。增加表达的程度并不重要，因为即便适度的增加会具有极大的效果，但通常会高于大约20％，优选地高于大约50％，并且更加优选地至少高于大约100％。
术语“重组蛋白”指由载体携带的治疗基因编码的蛋白质(基因产物)。通常，接受载体的细胞会缺乏对应于重组蛋白的内源性蛋白质的表达，或者即便存在此种内源性蛋白质的表达，它也是突变型的或者水平十分低。在正常个体即蛋白质不缺乏的个体中重组蛋白和野生型蛋白质可能是区分不开的。
术语“通过蛋白质缺乏表征的疾病”指存在由蛋白质缺乏或数量不足导致的出现病理变化的任何疾病。该术语包含导致生物学失活蛋白质产物的蛋白质折叠疾病，即构象疾病。在传染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺问题、放射病、营养缺乏、中毒、或其它环境或外部创伤中可涉及到蛋白质不足。
如此处所使用，术语“构象疾病”或“构象病”指采用的蛋白质构象所导致的疾病，其中所述采用的蛋白质构象不能被具有正常生物学活性的野生型蛋白质在天然条件下正常地形成，这种疾病会导致蛋白质在ER中滞留和破坏。降低的蛋白质水平导致生理性不平衡，其表现为一种疾病或疾病。
如此处所使用，术语“活性部位”指蛋白质执行一些特异生物学功能的区域。例如，它可以是结合底物或其它结合配偶体(partner)的部位和贡献直接参与产生和打断化学键的氨基酸残基的部位。在本发明中活性部位可以包括酶的催化位点、抗体的抗原结合位点、受体的配体结合结构域、调节物的结合结构域或者分泌蛋白质的受体结合结构域。活性部位还可以包含反式激活、蛋白质-蛋白质相互作用、或转录因子和调节物的DNA结合结构域。
如此处所使用，术语“活性部位特异的陪伴分子”指能够特异地与蛋白质活性部位可逆相互作用并且增强稳定的分子构象形成的包括蛋白质、肽、核酸、糖类在内的任何分子。如此处所使用，“活性部位特异的陪伴分子”不包括存在于细胞内ER中的内源性普通陪伴分子如Bip、钙联接蛋白或钙网蛋白，或者通常的非特异化学陪伴分子如重水、DMSO或TMAO。
一般定义.如此处所使用术语“纯化的”指在降低或消除无关材料即污染物存在的条件下被分离的材料，其中所述无关材料包括最终所得材料之来源的天然材料。例如，纯化的蛋白质优选地基本上没有在细胞内与其结合的其它蛋白质或核酸；纯化的核酸优选地基本上没有在细胞内的蛋白质或其它无关核酸。如此处所使用，术语“基本上没有”在材料的分析测试上下文中可以操作性地使用。优选地，基本上不含杂质的纯化的材料为至少95％的纯度；更加优选地，至少97％的纯度，并且更加优选地还可以至少99％的纯度。纯度可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物学鉴定和本领域已知的其它方法估计出来。在一个特定的实施方案中，纯化的意思是指污染物的水平低于施用于人或非人动物的规管局所接受的水平。
在优选的实施方案中，术语“大约”和“约”通常指根据测量的性质和精度而定的测量数量的可接受程度的误差。一般，例证的误差程度在给定数值或数值范围的20％以内，优选的在10％以内，并且更加优选的在5％以内。备选地，并且尤其是在生物学系统中，术语“大约”和“约”可指给定数值的一个数量级内的数值，优选地在10倍或5倍以内，并且更加优选地在2倍以内。除非另外声明，当文中指出数字的量是近似的时，是指不进行表述性的陈述而引用的术语“大约”或“约”。
“基因”是编码功能性“基因产物”的核苷酸序列。通常，基因产物是功能性蛋白质。然而，基因产物还可以是细胞内其它类型的分子，例如RNA(例如tRNA或者rRNA)。为了本发明的目的，基因产物还指在细胞内可以发现的mRNA序列。
术语“表达”意思是指通过活化参与相应基因或DNA序列转录和翻译的细胞内功能而允许或导致基因或DNA序列中的信息变成表现形式，例如产生RNA(例如rRNA或mRNA)或蛋白质。DNA序列由细胞表达以形成诸如RNA(例如mRNA或rRNA)和蛋白质的“表达产物”。表达产物本身例如所得的RNA或蛋白质可以称作被细胞“表达的”。
术语“转染”意思是指将外源核酸导入细胞内。术语“转化”意思是指将“外来的”(即外部的或细胞外的)基因、DNA或RNA序列导入宿主细胞以致于宿主细胞表达导入的基因或序列以产生目的物质，其中所述目的物质在本发明中一般是指被所导入基因或序列编码的RNA，也可以是被所导入基因或序列编码的蛋白质或酶。所导入的基因或序列还可以称作“克隆的”或“外来的”基因或序列，可以包括调节或控制序列(例如被细胞的遗传机制所使用的起始、终止、启动子、信号、分泌或其它序列)。基因或序列可包括非功能性序列或未知功能序列。接受并表达所导入DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化了”并且是一个“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自于许多来源，包括与宿主细胞同一属或种的细胞或不同属或种的细胞。
术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”意思是指运载体，通过该运载体将DNA或RNA序列(例如外来基因)导入宿主细胞从而转化宿主和促进所导入序列的表达(例如转录和翻译)。
术语“表达系统”意思是指在适宜条件下的宿主细胞和相匹配的载体，该适宜条件例如为了表达由载体携带的并已导入宿主细胞的外来DNA所编码的蛋白质。常用的表达系统包括大肠杆菌(E.coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞例如Sf9、Hi5或S2细胞和杆状病毒载体和表达系统、以及哺乳动物宿主细胞和载体。
术语“突变型”和“突变”意思是指遗传物质例如DNA中的任何可检测的变化或此种变化的任何过程、机制或结果。它包括基因结构(例如DNA序列)发生改变的基因突变、源于任何突变过程的基因或DNA、或由修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(如RNA、蛋白质或酶)。
如此处所使用术语“突变型蛋白质”是指从含有能导致蛋白质序列改变的遗传学突变的基因翻译而来的蛋白质。在一个特定的实施方案中，此种突变导致蛋白质在通常存在于ER内的条件下不能达到其天然构象的能力。在实现此种构象上的失败导致了蛋白质被降解，而不是通过蛋白质转运系统中它们的正常途径转运至它们在细胞内的正常位置。其它突变可以导致活性的降低或周转更快。
“野生型基因”指编码在体内具有功能性生物学活性的蛋白质的核酸序列。野生型核酸序列可含有不同于已知公布的、能导致对生物学活性影响很小或没有的保守氨基酸替代的改变的、核苷酸的变化。如此处所使用，术语“野生型”也可包括为了编码相对于内源或天然蛋白质能够提高或增强活性的蛋白质而经过改造的核酸序列。
“野生型蛋白质”指由野生型基因编码的蛋白质，当在体内表达或导入时该蛋白质具有功能性生物学活性。术语“正常的野生型活性”指蛋白质在细胞内的正常的生理功能。蛋白质的功能性可通过已知的用于确定蛋白质功能性的任何方法测试。
术语“正常的野生型活性”指蛋白质在细胞内的正常生理功能。此种功能性可通过已知的用于确定蛋白质功能性的任何方法测试。这种效应可通过(i)每单位/数量蛋白质的较高活性；或(ii)体内更高的功效中的一种或多种实践性地表现出来。这通过表达时提高的从ER中的产量、对由于温度提高或离液剂的存在所导致的解折叠的较大的抗性、以及通过相似的方法实验性地观察到。
术语“经遗传修饰的”指在导入包含编码基因产物的编码序列和控制编码序列表达的调节元件的核酸之后，表达特定基因产物的细胞。核酸的导入可以通过包括基因寻靶和同源重组在内的本领域已知的方法来实现。
“载体”是指当与适当的控制元件结合时能够复制并且能够在不同的细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等等。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
短语“可药用”，不论其是否与本发明的药用组合物联合使用，指当施用于人时能够生理性耐受的并且一般不产生不利反应的分子和组合物。优选地，如此处所使用，术语“可药用”意思是指联邦政府或州政府规管局认可的或者美国药典或其它用于动物的并且更加特定的用于人的一般公认的药典中列出的。术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药用载体可以是无菌液体例如水和油。水或水溶液、盐溶液和水溶右旋糖和甘油溶液优选用作载体，特别是用于可注射溶液。适当的药用运载体在E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”，第18版中进行了描述。
如此处所使用，术语“治疗有效量”和“有效量”意思是不存在抑制时增强ASSC所特异针对的蛋白质活性的ASSC的量，即其增强高于抑制以致于净效应是增强的有效量。例如，以酶为例，当ASSC是酶的特异性抑制剂时，有效量将是有效提高酶的表达水平而实际上没有抑制酶时抑制剂的量。该有效量一般处于低于针对酶的抑制剂的IC50值的某处。对于具有陪伴分子配体的受体、具有陪伴分子受体的激素等等可以确定相似的数值。
值得注意，为了本发明的目的，由于当体内施用时ASSC的稀释(和随后的由于平衡的变化导致的结合转换)、生物利用率和代谢，在纯化的治疗蛋白质的体外产生、运输或贮存过程中呈抑制性效应的ASSC浓度也可构成“有效量”。
                通过蛋白质缺乏所表征的疾病
当前有大约1100种已知的遗传性疾病是以蛋白质缺乏或在特定的组织中丧失功能为特征的。理论上这些疾病可以通过基因治疗来治疗。本发明的方法着眼于对当前适用于基因治疗的蛋白质的共治疗(co-therapy)，该基因治疗可以是现在可得的或者在将来是可得的。在此种疾病中，个体的一些细胞或所有细胞缺乏足够功能的蛋白质、包含失活形式的蛋白质或者包含对于生物学功能而言不足够的蛋白质水平。
更进一步，被鉴定为由能够导致蛋白质缺乏的蛋白质折叠改变的突变和突变型蛋白质在ER滞留所产生的构象性疾病的名单正在增加。它们包括囊性纤维化、α1-抗胰蛋白酶缺乏、家族性高胆固醇血症、阿尔茨海默氏病(Selkoe，Annu.Rev.Neurosci.1994；17：489-517)、成骨不全(Chessler等，J.Biol.Chem.1993；268：18226-18233)、糖类缺乏的糖蛋白综合症(Marquardt等，Eur.J.Cell.Biol.1995；66：268-273)、马-兰综合症(Bradford等，Biochem.J.1999；341：193-201)、遗传性盲(Kaushal等，Biochemistry 1994；33：6121-8)、格兰茨曼血小板无力症(Kato等，Blood1992；79：3212-8)、遗传性凝血因子VII缺乏病(Arbini等，Blood 1996；87：5085-94)、眼皮肤白化病(Halaban等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000；97：5889-94)和蛋白质C缺乏病(Katsumi等，Blood 1996；87：4164-75)。最近，在X-连锁的疾病肾上腺脑白质营养不良(ALD)中一个突变导致缺陷的过氧化物酶体转运蛋白的错折叠，它可以通过低温培养受影响细胞来进行拯救(Walter等，Am.J.Hum.Genet.2001；69：35-48)。一般公认的是突变在基因的整个序列中均匀发生。因此，可以预测来源于蛋白质缺乏的表型会存在于许多其它遗传病中。
                         溶酶体贮积病
许多遗传性蛋白质缺乏疾病是酶的缺乏。如上面所指出，一大类遗传性酶的疾病涉及到溶酶体酶的突变并且称作溶酶体贮积病(LSD)。溶酶体贮积病是一组由鞘糖脂、糖原、粘多糖积累导致的疾病。溶酶体疾病的例子包括戈谢病(Beutler等，遗传病的代谢和分子基础，第8版，2001；Scriver等著，3635-3668页，McGraw-Hill，New York)、GM1神经节苷脂病(同上，3775-3810页)、岩藻糖苷贮积症(遗传病的代谢和分子基础，1995.Scriver，C.R.，Baudet，A.L.，Sly，W.S.和Valle，D.著，2529-2561页，McGraw-Hill，New York)、粘多糖贮积病(同上，3421-3452页)、庞皮病(同上，3389-3420页)、胡-沙综合症(Hurler-Scheie disease)(Weismann等，Science 1970；169，72-74)、尼曼病A和B(遗传病的代谢和分子基础，第5版，2001.Scriver等著，3589-3610页，McGraw-Hill，New York)和法布里病(同上，3733-3774页)。LSD和它们相关的缺乏酶的名单可以从下面的表1中找到。在下面特别讨论了2种疾病。
表1：溶酶体贮积病，与之相关的缺陷酶，以及可逆的活性部位特异的陪伴分子
  疾病     缺陷酶            可逆陪伴分子
庞皮病 α-葡糖苷酶 1-脱氧野艽霉素(DNJ)α-同型野艽霉素澳粟精胺
戈谢病 酸性β-葡糖苷酶(葡糖脑苷脂酶) 异法戈明(isofagomine)N-十二烷基-DNJ打碗花精(calystegines)A3，B1，B2和C1
法布里病 α-半乳糖苷酶A 1-脱氧半乳糖野艽霉素(DGJ)α-异-同型野艽霉素(α-allo-homonojirimycin)α-半乳糖-同型野艽霉素(α-galacto-homonojirimycin)
β-1-C-丁基-脱氧野艽霉素打碗花精A2和B2N-甲基打碗花精A2和B2
GM1神经节苷脂病 酸性β-半乳糖苷酶 4-表-异法戈明1-脱氧半乳糖野艽霉素
克拉伯病 半乳糖脑苷脂酶 4-表-异法戈明1-脱氧半乳糖野艽霉素
莫尔基奥综合症B型 酸性β-半乳糖苷酶 4-表-异法戈明1-脱氧半乳糖野艽霉素
α-甘露糖苷贮积症 酸性α-甘露糖苷酶 1-脱氧甘露野艽霉素苦马豆碱制甘糖酶素A
β-甘露糖苷贮积症 酸性β-甘露糖苷酶 2-羟基-异法戈明
岩藻糖苷贮积症 酸性α-L-岩藻糖苷酶 1-脱氧岩藻野艽霉素β-同型岩藻野艽霉素2，5-亚氨基-1，2，5-三脱氧-L-山梨醇2，5-脱氧-2，5-亚氨基-D-岩藻糖醇2，5-亚氨基-1，2，5-三脱氧-D-阿卓糖醇
三菲立普综合症B(Sanfilippo diseaseB) α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶 1，2-二脱氧-2-N-乙酰氨基-野艽霉素
希尔德病(Schindlerdisease) α-N-乙酰半乳糖胺酶 1，2-二脱氧-2-N-乙酰氨基-半乳糖野艽霉素
泰-萨病 β-氨基己糖苷酶A 2-N-乙酰氨基-异法戈明1，2-二脱氧-2-乙酰氨基-野艽霉素nagstain
桑德霍夫病 β-氨基己糖苷酶B 2-N-乙酰氨基-异法戈明，nagstein1，2-二脱氧-2-乙酰氨基-野艽霉
素
胡-沙综合症(Hurler-Scheiedisease) α-L-艾杜糖醛酸苷酶 1-脱氧艾杜野艽霉素2-羧基-3，4，5-三脱氧哌啶
斯莱综合症(Slydisease) β-葡糖醛酸糖苷酶 6-羧基-异法戈明2-羧基-3，4，5-三脱氧哌啶
唾液酸贮积症 唾液酸酶 2，6-二脱氧-2，6，亚氨基-唾液酸制唾酸酶素B
亨特综合症(Hunterdisease) 艾杜糖醛酸硫酸酯酶 2，5-脱水甘露醇-6-硫酸酯
I-细胞病 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶
尼曼病 酸性鞘磷脂酶 地昔帕明，磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸
法布里病
法布里病是由溶酶体α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)活性缺乏所引起的鞘糖脂代谢的X-连锁的先天性障碍(Desnick等，遗传病的代谢和分子基础，第8版，Scriver等著，3733-3774页，McGraw-Hill，New York 2001；Brady等，N.Engl.J.Med.1967；276，1163-1167)。这种酶的缺陷导致具有α-半乳糖残基的中性鞘糖脂主要是神经酰胺己三糖苷(GL-3)在体液和组织的溶酶体中进行性沉积。发病率估计在男性中为大约1∶40,000，并且在全世界范围内的不同人种群中均有报道。在典型的发病男性中，临床表现形式包括血管角皮瘤、肢端感觉异常、少汗、以及特征性角膜和晶状体浑浊(遗传病的代谢和分子基础，第8版，2001，Scriver等著，3733-3774页，McGraw-Hill，New York)。发病男性的预期寿命缩短了，并且由于心脏、脑和/或肾脏的血管性疾病导致通常在第4个或第5个十年内出现死亡。与此相比，患有温和的“心脏变异”的患者具有正常α-Gal A酶活性的5-15％，并且存在左心室肥大和心肌症。当没有这种心脏变异的人严重发病时而这种心脏变异患者基本上仍没有症状。最近发现在带有不可解释的左心室肥大心肌症的成年男性患者中有11％的人存在心脏变异，这表明法布里病的发病频率比先前估计的要高(Nakao等，N.Engl.J.Med.1995；333，288-293)。α-Gal A基因位于Xq22(Bishop等，Am.J.Hum.Genet.1985；37：A144)并且已经报道了编码α-Gal A的全长cDNA和完整的12-kb基因组序列(Calhoun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985；82；7364-7368；Bishop等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986；83：4859-4863；Tsuji等，Eur.J.Biochem.1987；165；275-280；和Kornreich等，NucleicAcids Res.1989；17：3301-3302)。对导致法布里病的突变的遗传异质性已经进行了标记(遗传病的代谢和分子基础，第8版，2001，Scriver等著，3733-3774页，McGraw-Hill，New York.；Eng等，Am.J.Hum.Genet.1993；53：1186-1197；Eng等，Mol.Med.1997；3：174-182；和Davies等，Eur.J.Hum.Genet.1996；4：219-224)。到目前为止，除了小的缺失和插入和较大的基因重排外，多种错义、无义和剪接突变也已经进行了报道。
戈谢病
戈谢病是能够破坏脂肪葡糖脑苷脂的溶酶体酶β-葡糖脑苷脂酶的缺乏病。于是脂肪主要在肝脏、脾脏和骨髓中积累。戈谢病能够导致痛、疲劳、黄疸、骨损伤、贫血和甚至死亡。戈谢病有三种临床表型。具有在生命的早期或早期成年人出现的1型的患者由于贫血、低血小板数量、肝脏和脾脏的增大、骨骼的弱化和一些情况下的肺脏和肾的损伤，容易碰伤和出现疲劳。没有涉及脑的征兆。在II型中，早期发作，在3个月时出现肝脏和脾脏增大并且广泛涉及到脑。在2岁前的死亡率很高。III型的特征是肝脏和脾脏增大并且脑抽搐。β-葡糖脑苷脂酶基因定位于人1q21染色体。其蛋白质前体包含536个氨基酸并且其成熟的蛋白质长度是497个氨基酸。
虽然来源于任何人种群的个体都可能患此病，但是认为在来源于东欧的犹太人(德系犹太人(Ashkenazi))的后代中戈谢病更加普遍。在德系犹太人的群体中，戈谢病是最常见的遗传病，发病率大约1/450。在一般大众中，大约在100,000人中有一个戈谢病患者。根据国家戈谢病基金(National Gaucher Foundation)，2,500个美国人患有戈谢病。
                      其它酶缺乏疾病
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏病是最常见的X-连锁的人类酶缺乏病。G6PD酶催化对于核糖的产生是必要的氧化还原反应，而核糖是DNA和RNA的主要成分。G6PD还参与维持细胞内NADPH的足够水平。在许多生物合成反应中NADPH是所需要的辅因子。带有该种缺乏病的个体的临床症状包括新生儿黄疸、腹痛和/或背痛、眩晕、头痛、呼吸困难(不规则呼吸)和心悸。
重度联合免疫缺陷症(SCID)的一种形式是由于缺乏由20号染色体上的一个基因编码的腺苷脱氨酶(ADA)引起的。这意味着该酶的底物在细胞内积累。免疫系统中不成熟的淋巴样细胞对这些未使用的底物的毒性效应特别敏感，因此不能够达到成熟。结果，受累个体的免疫系统严重受损或完全丧失。
除了遗传病外，其它的酶缺乏病可以由来源于原发和继发疾病的组织或器官损伤引起。例如，由酒精中毒引起的损伤的胰腺组织或胰腺炎导致缺乏消化中需要的胰酶。
                 使用基因治疗治疗的其它疾病
涉及代谢疾病的酶外的缺陷基因的众多疾病可用基因治疗来治疗。此种疾病包括但不限于重度联合免疫缺损(SCI)、诸如维-奥综合征的吞噬细胞疾病、诸如威尔布兰德血管性血友病和血友病的出血疾病、诸如生长激素缺乏和下丘脑尿崩症的内分泌疾病、视网膜退化、由诸如遗传性非息肉结肠癌(HNPCC)的可遗传的遗传缺陷导致的癌症。此种疾病列于下面的表2。
表2：用基因治疗的疾病
         疾病             参考文献
头颈部癌症中的Ad5p53 Burt等，J Mol Med 1997；75(5)：B28(86).
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肝细胞癌脂质体p53 Habib等，Cancer Detect Prev20(2)：103-7
粘多糖贮积病 Stroncek等，Transfusion 1999；39(4)：343-50.
威尔布兰德血管性血友病 Wilcox等，J Thromb Haemost.2003；1：2300-11
维-奥综合征 Strom等，Blood.2003；102(9)：3108-16
X-连锁重度联合免疫缺损 Marina等，Science 2000；288：669-672.
              蛋白质缺乏病和其它疾病的治疗
通过使用分子生物学技术在个体的适宜细胞(例如干细胞或体组织特异的细胞)内过量表达野生型的蛋白质，在细胞内产生了所丧失或缺少的蛋白质，并且多数情况下是在血液流中循环到达特定的组织。为了达到治疗的目的，维持高表达水平的蛋白质足够长的时间以呈现治疗效果是重要的。此外，保证蛋白质特异地递送进入适当的组织是重要的。
               使用ASSC的共治疗和基因治疗
本发明通过共施用针对所施用基因编码的蛋白质的ASSC以增加合成过程中所施用基因编码的蛋白质的折叠和加工并增加在体内新合成的蛋白质稳定性来提高基因治疗的效果。使用本领域已知的方法，例如在2003年2月28日申请的美国申请系列号10/377,179中所描述，可以实现对靶蛋白的合适ASSC的筛选。
                         基因治疗
使用本发明的方法能够治疗的疾病包括但不限于那些上述提到的和那些表1中所列出的疾病。该方法可以与任何使用基因治疗方法预期可以替代的缺陷基因配合使用。例如该方法可以用来提供分泌蛋白质、膜蛋白质、或细胞内蛋白质。
根据本发明可以使用本领域可得的基因治疗的任何方法。作为例证的方法在下面描述。对于基因治疗方法的概括性综述，参见Goldspiel等，Clinical Pharmacy 1993，12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 1991，3：87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.1993，32：573-596；Mulligan，Science 1993，260：926-932；和Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem1993，62：191-217；May，TEBTECH 1993，11：155-215。可以使用的重组DNA技术领域的公知方法描述于Ausubel等(著者)，1993，分子生物学最新方法，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，基因转移和表达，实验室手册，Stockton Press，NY；和Dracopoli等(著者)，1994，人类遗传学最新方法的第12和13章，John Wiley & Sons，NY；Colosimo等，Biotechniques2000；29(2)：314-8，320-2，324。
适用于本发明方法的可以被施用的基因可以用本领域技术内的普通分子生物学、微生物学、和重组DNA技术进行分离和纯化。例如，可以使用文献中描述的重组DNA表达来分离编码靶蛋白质的核酸。见，例如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆：实验室手册，第二版，(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，New York(在文中为“Sambrook等，1989”)；DNA克隆：实践方法，I和II卷(D.N.Glover编著1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编著1984)；核酸杂交[B.D.Hames和S.J.Ehiggins著(1985)]；转录和翻译[B.D.Hames和S.J.Higgins著(1984)]；动物细胞培养[R.I.Freshney著(1986)]；固定化细胞和酶[IRL Press，(1986)]；B.EPerbal，分子克隆实践指导(1984)；E M.Ausubel等(著)，分子生物学最新方法，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。编码蛋白质的核酸可以是全长或者截短的，只要基因能够编码生物学活性蛋白质即可。例如，在Miyamura等的美国专利号6,210,666中已经描述了法布里病相关缺陷酶α-Gal A的有生物学活性的截短形式。
于是经鉴定和分离的基因可以插入到适当的克隆载体中。适宜用于基因治疗的载体包括病毒，例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘、疱疹病毒、杆状病毒和逆转录病毒、细小病毒、慢病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和其它通常用于本领域的、已经被描述用于在多种真核和原核宿主中进行表达的、并且可用于基因治疗和简单蛋白质表达的重组载体。
在一个优选的实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体，特别是腺病毒载体可以和阳离子亲水脂分子，例如阳离子脂类、多聚L-赖氨酸(PLL)、和二乙氨乙基葡聚糖(DELAE-葡聚糖)形成复合物，这些阳离子亲水脂分子提供了病毒对靶细胞感染的效率(见，例如1997年11月20日申请的PCT/US97/21496，此处引用作为参考)。用于本发明的优选的病毒载体包括从牛痘、疱疹病毒、AAV和逆转录病毒衍生的载体。特别是疱疹病毒，特别是诸如在美国专利号5,672,344所公开(此处公开引用作为参考)的单纯疱疹病毒(HSV)对于将转基因递送进入神经细胞是特别有用的，而这对于那些酶的缺陷表现在神经细胞中的溶酶体贮积病，例如胡-沙综合症(Hurler-Scheie disease)、Hunter疾病和泰-萨病是重要的。诸如在美国专利号5,139,941、5,252,479和5,753,500和PCT公开WO97/09441中(此处将其公开引用)公开的AAV载体也是有用的，因为这些载体整合入宿主染色体，具有对重复施用载体的最低需求。关于基因治疗中的病毒载体的综述见Mah等，Clin.Pharmacokinet.2002；41(12)：901-11；Scott等，Neuromuscul.Disord.2002；12增刊1：S23-9。此外，见美国专利号5,670,488。
欲被递送的基因的编码序列可以有效地连接于表达控制序列，例如指导基因表达的启动子。如此处所使用，短语“有效地连接”指多核苷酸/基因与核苷酸的调节和效应序列例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其它信号序列，的功能性关系。例如，有效地连接核酸到启动子上指多核苷酸和启动子物理性和功能性的关系，以致于DNA的转录被能够特异性的识别和结合到启动子上的RNA聚合酶从启动子处起始，并且其中启动子指导着从多核苷酸进行RNA的转录。
在一个特定的实施方案中，使用了其中编码序列和任何其它目的序列的侧翼是能够促进在基因组的预期部位进行同源重组的区域的载体，从而提供了构件从整合进入基因组的核酸分子的表达(Koller和Smithies，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86：8932-8935；Zijlstra等，Nature 1989，342：435-438；Zarling等的美国专利号6,244,113；和Pati等的美国专利号6,200,812)。
将载体递送入患者可以是直接的，在该情况下患者直接暴露于载体或递送复合物，或者可以是间接的，在该情况下首先用载体在体外将细胞进行转化，然后移植给患者。该两种方法已知分别作为直接体内(in vivo)和间接体内的基因治疗。
直接转移.在一个特定的实施方案中，载体是直接在体内施用的，此时载体进入生物体的细胞并且介导基因的表达。这可以通过本领域已知的和下面描述的多种方法中的任何方法实现，例如通过将其作为适当表达载体的部分进行构建并且对其进行施用以致于使它变成细胞内的，例如使用缺陷型或减毒逆转录病毒或其它病毒载体进行感染(见，美国专利号4,980,286)、或者通过直接注射裸DNA、或者使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)、或者用脂类或细胞表面受体或转染试剂进行包被、用生物聚合物(例如多聚-β-1-64-N-乙酰氨基葡糖多糖；见美国专利号5,635,493)进行包封、用脂质体、微颗粒或微胶囊进行包封、通过连接到已知进入细胞核的肽或其它配体进行施用、通过连接到能够发生受体介导的内吞的配体上而施用(见，例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.1987，62：4429-4432)等等。在另一实施方案中，可以形成核酸和配体复合物，其中配体含有破坏内体的融合病毒肽，从而允许核酸免受溶酶体的降解，或者例如从触角足来源的、可用于转移治疗性DNA进入细胞的阳离子12肽(Mi等，Mol.Therapy 2000，2：339-47)。在另一个实施方案中，通过靶向特异的受体可以将核酸在体内进行靶向用于细胞特异的摄入和表达(见，例如PCT公开号WO92/06180，WO 92/22635，WO 92/20316和WO 93/14188)。最近，一种叫做磁性转染的技术已经用于将载体递送进入哺乳动物。该技术将载体和在磁场的影响下用于递送的超顺磁的纳米颗粒进行结合。这种应用降低了递送时间并且提高了载体的功效(Scherer等，Gene Therapy 2002；9：102-9)。在下面载体的描述中考虑了额外的靶向和递送方法。
在一个特定的实施方案中，可使用脂类载体施用核酸。脂类载体可以和裸核酸(例如，质粒DNA)结合以利于穿过细胞膜。阳离子的、阴离子的或中性的脂类可以应用于该目的。然而，阳离子脂类是优选的，因为它们表现为能够更好地与通常具有负电荷的DNA结合。阳离子脂类还表现为能够介导质粒DNA的在细胞内递送(Felgner和Ringold，Nature 1989；337：387)。已经表明将阳离子脂类-质粒复合物通过静脉内注射进入小鼠体内能够导致DNA在肺内表达(Brigham等，Am.J.Med.Sci.1989；298：278)。还可以见，Osaka等，J.Pharm.Sci.1996；85(6)：612-618；San等，Human Gene Therapy 1993；4：781-788；Senior等，Biochemica etBiophysica Acta 1991；1070：173-179)；Kabanov和Kabanov，BioconjugateChem.1995；6：7-20；Liu等，Pharmaceut.Res.1996；13；Remy等，Bioconjugate Chem.1994；5：647-654；Behr，J-P.，Bioconjugate Chem1994；5：382-389；Wyman等，Biochem.1997；36：3008-3017；Marshal等的美国专利号5,939,401；Scheule等的美国专利号6,331,524。
代表性的阳离子脂类包括在例如美国专利号5,283,185和美国专利号5,767,099中公开的那些，此处公开引用作为参考。在一个优选的实施方案中，阳离子脂类是美国专利号5,767,099中公开的N4-精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-67)。另外的优选的脂类包括N4-亚精胺胆固醇氨基甲酸酯(GL-53)和1-(N4-精胺)-2，3-二月桂基甘油氨基甲酸酯(GL-89)。
优选地，对于病毒载体的体内施用，采用了一种与病毒载体例如腺病毒载体联合使用的适当的免疫抑制治疗以避免病毒载体和所转染细胞的免疫失活。例如，可以施用免疫抑制细胞因子诸如白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)或抗-CD4抗体以阻断对病毒载体的体液或细胞免疫反应。考虑到这种情况，采用经过工程改造以表达最小数量抗原的病毒载体是有利的。
间接转移.可以使用上述的任何方法用编码野生型蛋白质的构建体对来自体内的体细胞进行工程改造，并将体细胞再植入个体。在Selden等的WO 93/09222中概括地描述了该方法。此外，在Payumo等，Clin.Orthopaed.and Related Res.2002；403S：S228-S242中所述的基于细胞递送的专有IMPACT技术中使用了该技术。在此种基因治疗系统中，将体细胞(例如成纤维细胞、肝细胞或内皮细胞)从患者体内取出，体外培养，用治疗目的基因进行转染，特性化，并且再次导入患者体内。可以使用初级细胞(来源于个体或组织并且在传代之前改造的)和次级细胞(在体内导入之前经过体外传代)，还有本领域已知的永生化细胞系。本发明方法使用的体细胞包括但不限于诸如成纤维细胞、角质细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液的有形成分、肌肉细胞、其它能够被培养的体细胞、和体细胞前体。在一个优选的实施方案中，细胞是成纤维细胞或间充质干细胞。
包括外源基因、任选地包括编码选择性标记的核酸、并包括对于外源基因在初级或次级受体细胞表达所必要的额外序列的核酸构建体可以用来转染初级或次级细胞，在该细胞中所编码的产物被产生了。为了本目的可以使用的此种构建体包括但不限于传染性载体，例如逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、腮腺炎病毒和脊髓灰质炎病毒载体。
经皮递送特别适用于使用包括角质细胞、黑色素细胞和树突状细胞的表皮细胞类型的间接转移(Pfutzner等，Expert Opin.Investig.Drugs 2000；9：2069-83)。
间充质干细胞(MSC)是骨髓产生的非造血干细胞。MSC可以分化和增殖成为特定非血液组织。由于干细胞的自我更新的能力，所以用逆转录病毒转染干细胞对于治疗是一个好的选择。这种能力避免了基因治疗中的反复施用。另外一个优点是如果注射的干细胞到达了靶器官并且随后进行分化，那么它们可以替代器官中损伤或畸形的细胞。
溶酶体贮积病的基因治疗.最近，用于治疗溶酶体贮积病的重组基因治疗的方法正处于临床或临床前开发阶段，见，例如1997年8月19日公布的对于法布里病的重组α-半乳糖苷酶A治疗的美国专利号5,658,567；1996年12月3日公布的用于作为融合蛋白而克隆和表达的生物学活性α-半乳糖苷酶A的美国专利号No.5,580,757；2000年5月23日公布的用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法的美国专利号6,066,626；2000年7月4日公布的用于转染的人细胞表达人α-半乳糖苷酶A蛋白质的美国专利号6,083,725；2002年1月1日公布的用于为了治疗溶酶体贮积病使用重组腺伴随病毒病毒体递送DNA到肌肉细胞的方法的美国专利号6,335,011；Bishop，D.E等，Proc.Natl.Acad Sci.，USA.1986；83：4859-4863；Medin，J.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.1996；93：7917-7922；Novo，F.J.，Gene Therapy 1997；4：488-492，；Ohshima，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.1997；94：2540-2544；Sugimoto Y.等，Human Gene Therapy 1995；6：905-915；Sly等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002；99(9)：5760-2；Raben等，Cun.Mol.Med.2002；2(2)：145-66；Eto等，Curr.Mol.Med.2002；2(1)：83-9；Vogler等，Pediatr.Dev.Pathol.2001；4(5)：421-33；Barranger等，Expert Opin.Biol.Ther.2001；1(5)：857-67；Yew等，Curr.Opin.Mol.Ther.2001；3(4)：399-406；Caillaud等，Biomed.Pharmacother.2000；54(10)：505-12和loannu等，J.Am.Soc.Nephrol.2000；11(8)：1542-7。
在2002年，Brooks阐述了用猫白血病毒转移进入MPS VII小鼠模型内的β-葡糖醛酸糖苷酶基因能够校正相关的CNS缺陷(PNAS 2002；99：6216-6221)。已经证明将经过遗传修饰的表达犬α-艾杜糖醛酸苷酶的被包Madin-Darby犬肾细胞并且按照立体定位指导植入狗脑的间接转移对于MPS的狗模型是有效的(Barsoum等，J Lab Clin Med.2003；142(6)：399-413)。
                活性部位特异的陪伴分子
本发明所考虑的ASSC包括但不限于小分子(例如，分子量小于约2kD，更加优选的小于约1kD的有机或无机分子)，包括底物或结合配偶体的模拟物；小的配体衍生肽或它们的模拟物；诸如DNA、RNA的核酸；包括Fv和单链抗体的抗体和Fab片段；其它大分子(例如分子量大于约2kD的分子)和来自于诸如D-和/或L-构型氨基酸分子库的组合化学来源的库的成员；磷酸肽，诸如随机或部分简并的定向磷酸肽库中的成员(见，例如Songyang等，Cell 1993，72：767-778)。
合成库(Needels等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90：10700-4；Ohlmeyer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90：10922-10926；Lam等，PCT公开号WO 92/00252；Kocis等，PCT公开号WO 9428028)等等提供了本发明ASSC的来源。合成化合物库可以商业性地从Maybridge化学品公司(Trevillet，Cornwall，UK)，Comgenex(Princeton，NJ)，BrandonAssociates(Merrimack，NH)，和Microsource(New Milord，CT)得到。稀有化学品库可以从Aldrich(Milwaukee，WI)得到。备选地，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库是可得的，例如，从PanLaboratories(Bothell，WA)或MycoSearch(NC)得到，或者是易于生产的。此外，天然和合成产生的库和化合物可以通过常规的化学、物理和生物化学方法容易地进行修饰(Blondelle等，TIBTech 1996，14：60)。
2003年2月28日申请的美国专利申请系列号10/377,179(此处引用作为参考)描述了用于针对错折叠蛋白质的ASSC的筛选方法。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的小分子是溶酶体酶的抑制剂并且包括在Asano等，J.Med.Chem 1994；37：3701-06；Dale等，Biochemistry 1985；24：3530-39；Goldman等，J.Nat.Prod.1996；59：1137-42；Legler等，Carbohydrate Res.1986；155：119-29；和Okumiya等，Biochem.Biophys.Res.Comm.1995；214：1219-240中描述的葡萄糖和半乳糖的亚氨基糖衍生物。此类衍生物包括但不限于表1中所列出的那些化合物。
其它ASSC可以是上面提到的那些，例如，发现能够稳定突变型形式p53的小的合成化合物(Foster等，Science 1999；286：2507-10)；发现能够稳定受体的小分子受体拮抗物和配体(Morello等，J.Clin.Invest.2000；105：887-95；Petaja-Repo等，EMBO J.2002；21：1628-37)和发现能够稳定通道蛋白质和转运蛋白的药物或底物(Rajamani等，Circulation 2002；105：2830-5；Zhou等，J.Biol.Chem.1999；274：31123-26；Loo等，J.Biol.Chem.1997；272：709-12)。
在另一个实施方案中，对于本发明方法有用的ASSC是囊性纤维化跨膜传导调节蛋白的激活剂并且用物理和生物化学方法进行了鉴定(Blondelle等，TIBTech 1996，14：60)。
在另一个优选的实施方案中，对于本发明方法有用的ASSC是诸如δ阿片样物质受体、V2血管升压素受体和感光色素受体的G蛋白偶联受体的配体，在Petaja-Repo等，EMBO J 2002；21：1628-37；Morello等，J.Clin.Invest.2000；105：887-95；Saliba等，J.Cell Sci.2002；115：2907-18中对它们进行了描述。
在另一优选的实施方案中，对于本发明方法有用的ASSC是离子通道蛋白如人Long QT综合症的HERG钾离子通道、家族性胰岛素分泌过多症中胰ATP敏感的钾离子(KATP)通道的阻断剂，在Zhou等，J Biol.Chem.1999；274：31123-26；Taschenberger等，J.Biol.Chem.2002；277：17139-46中对它们进行了描述。
                       制剂和施用
ASSC：将与重组基因一起施用于个体的ASSC可以制剂为用于通过例如口服、肠胃外的、经皮肤的、经粘膜的途径施用，这取决于陪伴分子是否是小分子、合成化合物、或蛋白质或肽。
对于经口施用，例如对于小分子，药物组合物可为片剂或胶囊形式，其通过常规方法与可药用赋型剂如结合剂(预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉、淀粉羟乙酸钠)或湿润剂(十二烷基硫酸钠)制备而成。使用本领域已知的方法可以将片剂进行包封。用于经口施用的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或混悬液的形式，或者是在使用前用水或其它适当媒介物进行配制的干产品。此种液体制剂可以用常规方法使用可药用添加剂例如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物、氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如杏仁油、油酯类、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)来配制。制剂还可以根据需要包含适当的缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
用于经口施用的制剂可以适当配制成能够控制活性化合物释放的形式。对于口腔含化施用，组合物可以用传统的方法制作成片剂或锭剂。对于吸入法施用，根据本发明使用的陪伴分子可以方便地以存在于加压袋或喷雾器中的喷雾剂的形式，与喷射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体一起进行递送。对于加压的气溶剂，计量单位可以通过使用一个能够递送计量量的阀来决定。在吸入器或吹入器中使用的例如明胶的胶囊和药筒可以制剂成含有化合物和诸如乳糖或淀粉的适当粉末基质的粉末混合物的形式。
ASSC可以制剂成用于通过注射例如大丸剂注射或连续输注而进行肠胃外施用的形式。用于注射的制剂以例如安瓿或多剂量容器的单位计量的形式与添加的防腐剂一起存在。组合物可以采用诸如混悬液、溶液或在油或水媒介物中的乳剂的形式，并且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配方试剂。备选地，活性成分可能是粉末的形式，在使用前用适当的媒介物例如灭菌无热原水进行配制。
化合物还可制剂成直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂，例如它们含有诸如可可脂或其它甘油酯的常规栓剂基质。
除了前面所描述的制剂外，ASSC还能够制剂成贮库制剂(depotpreparation)。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或肌肉注射的方法施用。因此，例如化合物能够与适当的多聚物或疏水材料(例如可接受油中的乳剂)或离子交换树脂制剂，或作为微溶的衍生物例如微溶盐制剂。
重组基因：如上所述，已经有多种本领域已知的用于向个体递送裸DNA的方法，它包括向靶组织直接注射，例如肌肉注射、使用阳离子脂类载体、静脉输注或吸入。见上面公开的基因治疗。
对于已经通过工程改造的过量表达重组基因产物的体细胞的施用，可以通过多种用于施用的标准途径将细胞导入个体，以致于它们会存在于例如肾被膜、皮下腔、中枢神经系统、鞘内腔(intrathecal space)、肝脏、腹腔、或肌肉内。对细胞还可以进行静脉内或动脉内注射，以便细胞在个体的血流中循环。
可以备选地将细胞包埋入基质或凝胶材料，例如Mineau-Hanschke的美国专利号5,965,125中所述，其中描述了杂合基质填埋剂的使用，或Jain等(PCT申请WO 95/19430)的描述，其中描述了在亲水凝胶材料中将分泌细胞进行巨囊包封(其中每一专利在此处引用作为参考)。
经遗传修饰的细胞的数量根据个体的体重、年龄、和临床状态的不同而不同，并且本领域技术人员可以按照常规进行确定。在一个实施方案中，使用大约1×106和1×109细胞/天。
时限：本发明ASSC的施用通常遵循基因的递送而进行，以允许靶细胞/组织表达重组蛋白。由于基因的表达会维持一段时间，所以只要基因是可表达的，ASSC就要有保持陪伴分子的效果并且作为重组蛋白的稳定剂。因此，ASSC的施用有必要维持与基因表达的相同的阶段。
在一个实施方案中，ASSC具有短的循环半寿期(例如小分子)，ASSC将要连续经口施用，例如每日施用，以维持循环中的恒定水平。此种恒定水平是已经测定对患者无毒并且在与蛋白质相互作用方面是最佳的水平，它将是持续产生的，以便呈现出非抑制性的、治疗效果。
在治疗基因补偿内源性突变基因不充足活性的情况下，因为有效量在增强治疗基因的功效时也会增强内源性突变型的活性，因此陪伴分子递送的时限变得不太重要。
体内稳定性：针对所施用基因编码蛋白质的ASSC的存在有利于促进ER内合成过程中的蛋白质加工效率(即通过防止聚集)并延长循环中和组织中蛋白质的半寿期，从而能够在较长的时间阶段内维持有效的蛋白质水平。这会导致临床上受累组织内增强的表达。这会给患者带来如更好地减轻痛苦、减少治疗次数、和/或降低所施用基因的量的有益的效果。它也会减少治疗费用。
除了稳定所表达的蛋白质以外，ASSC还会稳定和增强由于阻止在ER内正确折叠和加工的突变所导致缺乏像诸如LSD的构象疾病中的任一内源性突变型蛋白质的表达。
                           剂量
欲同重组基因一起施用的ASSC的有效量将部分取决于所施用重组基因的递送方法、特定量和典型的表达水平。特定有效量的确定要在个案基础上根据蛋白质和所对应的ASSC由本领域技术人作出。其变化取决于例如患者和所使用的重组基因和ASSC。在确定剂量时要考虑的其它因素有患者的年龄、体重、性别和临床状态。可以通过使用本领域已知的常规方法得到药物代谢动力学和药效动力学如半寿期(t1/2)、血浆浓度峰值(cmax)、达到血浆浓度峰值的时间(tmax)、蛋白质和ASSC的通过曲线下面积(AUC)测量的接触和组织分布、还有对于ASSC-取代蛋白质结合的数据(亲和常数、结合常数和解离常数和效价)以确定能够呈现治疗效应的在剂量形式中所要求的适合的量。
从细胞培养测定和动物研究得到的数据可以用于阐明用于人的剂量范围。本发明治疗方法中使用的化合物的剂量优选地在包括ED50浓度(受试群体的50％有效)但有少许毒性或没有毒性的循环浓度的范围内(例如低于LD50浓度)。在所有应用中所使用的特定剂量会在该范围内有所变化，其变化依赖于诸如采用的特定剂型、采用的施用途径、个体(例如患者)的情况等等因素。
治疗有效量可以从细胞培养测定最初估计并且在动物模型中进行公式计算以便得到包括IC50在内的循环浓度范围。化合物的IC50浓度是实现症状的半数最大抑制的浓度(例如，像从细胞培养测定中确定的那样)。然后使用此种信息可以更精确地确定在特定个体例如人类患者中使用的合适剂量。
通过诸如高效液相层析(HPLC)和气相层析的技术可以常规测定诸如患者的个体血浆中的化合物。
通过标准的药学方法，例如细胞培养测定或使用实验动物以确定LD50和ED50，从而可以确定组合物的毒性和治疗效果。参数LD50和ED50在本领域是熟知的，并且分别指对群体的50％是致死的和对群体的50％是治疗上有效的化合物的剂量。毒性和疗效的剂量比称为治疗指数并且可以表达为LD50/ED50比率。表现为较大治疗指数的陪伴分子化合物是优选的。
ASSC的浓度可以根据稳定组织或循环中体内蛋白质但不阻止其活性所需要的量来决定。例如，当ASSC是酶抑制剂时，可以通过计算针对酶的ASSC的IC50值来确定抑制剂的浓度。然后基于对酶活性的影响对低于IC50值的浓度进行估计，例如增加所施用酶的酶活性的量或延长所施用酶的酶活性所需要的抑制剂的量。用于α-Gal A酶的化合物脱氧半乳糖野艽霉素(DGJ)的IC50值是0.04μM，表明DGJ是一种有效的抑制剂。因此，可以预计α-Gal A的浓度比所施用的α-Gal A低很多。见下面的实施例。
                            实施例
通过下面的实施例对本发明进行进一步的描述。此种实施例的使用只是例证性的并且无论如何也不能限制本发明或者例证性术语的范围和意义。同样，本发明不限于任何此处描述的特别优选的实施方案。的确，在阅读本说明书后，本领域的技术人员显然可对本发明进行许多改变和变化，并且可以在不偏离其精神和范围的情况下进行。因此发明仅由后附的权利要求书和权利要求书所赋予的等同物的全部范围进行限制。
实施例1： 用ASSC胞内增加α-GalA
方法.使用FuGene 6转染试剂根据以前建立的方法(Ishii等，Arch.Biochem.Biophys.2000；377：228-233)用pCNX2-AGA对COS-7细胞进行转染。
野生型的酶在转染的COS-7细胞内表达。转染后，将细胞培养于添加[35S]蛋白质标记混合物(New England Nuclear，Boston，MA)、添加或不添加DGJ的无蛋氨酸和半胱氨酸培养基中培养30分钟。培养基用含有或不含有DGJ的非放射性培养基进行替换，并且将细胞再培养一定的时间阶段。一定时间之后用1％Triton X-100提取[35S]标记的蛋白质。随后通过用抗α-Gal A的IgG和SDS-PAGE进行免疫沉淀来测定α-Gal A的细胞内加工程度和数量。
结果.在与DGJ一起培养的细胞内[35S]标记的α-Gal A的量比不与DGJ一起培养的细胞内所得到的量更大，表明ASSC(DGJ)增加了蛋白质在ER内加工的有效性。在与DGJ一起培养的细胞内[35S]标记的α-GalA也比不与DGJ一起培养的细胞内的保留时间更长，表明ASSC(DGJ)阻止了α-Gal A的细胞内的降解。这些结果表明ASSC在与基因治疗联用上是有效的。
实施例2： 对于用基因疗法治疗的法布里病小鼠共施用DGJ
方法.α-Gal A缺乏的小鼠(Fabry KO小鼠)已经事先产生(Oshima等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997；94：2540-254)并且对这些敲除的小鼠已经进行了基因治疗测试(Takahashi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；99：13777-82；Siatskas等，J.Inherit.Metab.Dis.2001；24：25-41；Ziegler等，Hum.Gene.Ther.2002；13，discussion11-2：935-45)。这些实验表明基因治疗对于治疗法布里病是有用的。对用基因疗法治疗的小鼠共施用DGJ会提高基因治疗的疗效，因为它显著地提高治疗性基因产物的表达，特别是通过防止在靶细胞的ER中聚集。遵循基因治疗方案的KO小鼠接受溶解于饮用水中的DGJ并且在一段时间之后测定包括心脏、肾脏、脾脏、肝脏和肺在内的多种组织和血浆中的α-Gal A活性，并且将其与来源于没有接受DGJ的对照小鼠和接受DGJ但没有接受基因治疗的小鼠的活性进行比较。较高的酶活性和较长的保持时间表明共施用ASSC能够提高基因治疗的疗效。
本发明不限于此处描述的特定实施方案的范围。的确，除了此处所描述的那些，从前面的描述和附图来看，本发明的多种改变对于本领域技术人员是显而易见的。此些改变处于后附的权利要求书的范围之内。
专利、专利申请、公开物、操作程序等等在整个本申请中被引用，此处公开全部引用作为参考。

Claims (40)

1.提高重组蛋白体内在个体细胞中的表达水平的方法，其中蛋白质自已经被导入细胞的表达载体表达，该方法包括将蛋白质的活性部位特异的陪伴分子施与个体。
2.权利要求1的方法，其中载体是病毒载体。
3.权利要求2的方法，其中病毒载体是腺病毒载体。
4.权利要求1的方法，其中蛋白质是酶并且活性部位特异的陪伴分子是酶的可逆竞争性抑制剂。
5.权利要求4的方法，其中酶是α-半乳糖苷酶A。
6.权利要求4的方法，其中酶是β-葡糖脑苷脂酶。
7.权利要求5的方法，其中可逆竞争性抑制剂是下式的化合物：
Figure A2004800044670002C1
或
Figure A2004800044670002C2
其中R0代表H或C1-C12烷链；
R1和R1′独立地代表H，OH，1-4碳烷基、烷氧基或羟烷基；
R2和R2′独立地代表H、OH或C1-C12烷基；
R4和R4′独立地代表H、OH，和
R7代表H或OH。
8.权利要求7的方法，其中可逆竞争性抑制剂是选自1-脱氧半乳糖野艽霉素、α-异-同型野艽霉素、α-半乳糖-同型野艽霉素、α-1-C-丁基-脱氧野艽霉素、打碗花精A3、打碗花精B2、N-甲基-打碗花精A3、和N-甲基-打碗花精B2的化合物。
9.权利要求7的方法，其中可逆竞争性抑制剂是1-脱氧半乳糖野艽霉素。
10.权利要求6的方法，其中可逆竞争性抑制剂是下式的化合物：
Figure A2004800044670003C1
或 或
Figure A2004800044670003C3
其中R0代表H或C1-C12烷链；
R0′代表H，含有1-12个碳原子的、任选地用苯基、羟基或环己基取代的直链或支链饱和碳链；
R1和R1′独立地代表H，OH，1-4碳烷基、烷氧基或羟烷基；和
R2和R2′独立地代表H、OH或C1-C12烷基。
11.权利要求10的方法，其中可逆竞争性抑制剂是选自异法戈明、N-十二烷基-异法戈明、N-壬烷基-异法戈明、N-十二烷基-脱氧野尻霉素、打碗花精A3、打碗花精B2、打碗花精B3和打碗花精C1的化合物。
12.权利要求11的方法，其中可逆竞争性抑制剂是异法戈明。
13.权利要求11的方法，其中可逆竞争性抑制剂是N-十二烷基-异法戈明。
14.提高重组蛋白体内表达水平的方法，其中蛋白质由含有编码该蛋白质的表达载体的宿主细胞表达，该方法包括对个体共施用宿主细胞和有效量的针对该蛋白质的活性部位特异陪伴分子。
15.权利要求14的方法，其中载体是病毒载体。
16.权利要求15的方法，其中病毒载体是腺病毒载体。
17.权利要求15的方法，其中宿主细胞是人初级细胞并且个体是人。
18.权利要求17的方法，其中人细胞是间充质干细胞。
19.权利要求14的方法，其中蛋白质是酶。
20.权利要求19的方法，其中酶是α-半乳糖苷酶A。
21.权利要求19的方法，其中酶是β-葡糖脑苷脂酶。
22.权利要求20的方法，其中可逆竞争性抑制剂是下式的化合物：
或
其中R0代表H或C1-C12烷链；
R1和R1′独立地代表H，OH，1-4碳烷基、烷氧基或羟烷基；
R2和R2′独立地代表H、OH或C1-C12烷基；
R4和R4′独立地代表H、OH，和
R7代表H或OH。
23.权利要求22的方法，其中可逆竞争性抑制剂是选自l-脱氧半乳糖野艽霉素、α-异-同型野艽霉素、α-半乳糖-同型野艽霉素、α-1-C-丁基-脱氧野艽霉素、打碗花精A3、打碗花精B2、N-甲基-打碗花精A3和N-甲基-打碗花精B2的化合物。
24.权利要求23的方法，其中可逆竞争性抑制剂是l-脱氧半乳糖野艽霉素。
25.权利要求21的方法，其中可逆竞争性抑制剂是下式的化合物：
Figure A2004800044670004C3
或
Figure A2004800044670004C4
或
Figure A2004800044670004C5
其中R0代表H或C1-C12烷链；
R0′代表H，含有1-12个碳原子的、任选地用苯基、羟基或环己基取代的直链或支链饱和碳链；
R1和R1′独立地代表H，OH，1-4碳烷基、烷氧基或羟烷基；和
R2和R2′独立地代表H、OH或C1-C12烷基。
26.权利要求25的方法，其中可逆竞争性抑制剂是选自异法戈明、N-十二烷基-异法戈明、N-壬烷基-异法戈明、N-十二烷基-脱氧野尻霉素、打碗花精A3、打碗花精B2、打碗花精B3和打碗花精C1的化合物。
27.权利要求26的方法，其中可逆竞争性抑制剂是异法戈明。
28.权利要求26的方法，其中可逆竞争性抑制剂是N-十二烷基-异法戈明。
29.对患有需要用基因治疗来治疗的疾病的个体进行治疗的方法，其包括将含有编码蛋白质的治疗性载体和针对该蛋白质的活性部位特异陪伴分子的组合物施与个体。
30.权利要求29的方法，其中蛋白质是酶并且活性部位特异陪伴分子是酶的抑制剂。
31.权利要求30的方法，其中酶与溶酶体贮积病相关。
32.权利要求31的方法，其中酶是α-半乳糖苷酶A。
33.权利要求31的方法，其中酶是β-葡糖脑苷脂酶。
34.权利要求32的方法，其中可逆竞争性抑制剂是下式的化合物：
或
Figure A2004800044670005C2
其中R0代表H或C1-C12烷链；
R1和R1′独立地代表H，OH，1-4碳烷基、烷氧基或羟烷基；
R2和R2′独立地代表H、OH或C1-C12烷基；
R4和R4′独立地代表H、OH，和
R7代表H或OH。
35.权利要求34的方法，其中可逆竞争性抑制剂是选自l-脱氧半乳糖野艽霉素、α-异-同型野艽霉素、α-半乳糖-同型野艽霉素、α-1-C-丁基-脱氧野艽霉素、打碗花精A3、打碗花精B2、N-甲基-打碗花精A3和N-甲基-打碗花精B2的化合物。
36.权利要求35的方法，其中可逆竞争性抑制剂是l-脱氧半乳糖野艽霉素。
37.权利要求33的方法，其中可逆竞争性抑制剂是下式的化合物：
Figure A2004800044670006C1
或 或
其中R0代表H或C1-C12烷链；
R0′代表H，含有1-12个碳原子的、任选地用苯基、羟基或环己基取代的直链或支链饱和碳链；
R1和R1′独立地代表H，OH，1-4碳烷基、烷氧基或羟烷基；和
R2和R2′独立地代表H、OH或C1-C12烷基。
38.权利要求37的方法，其中可逆竞争性抑制剂是选自异法戈明、N-十二烷基-异法戈明、N-壬烷基-异法戈明、N-十二烷基-脱氧野尻霉素、打碗花精A3、打碗花精B2、打碗花精B3和打碗花精C1的化合物。
39.权利要求38的方法，其中可逆竞争性抑制剂是异法戈明。
40.权利要求38的方法，其中可逆竞争性抑制剂是N-十二烷基-异法戈明。
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PB01 Publication
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