JP5189723B2 - 骨関連疾患及び栄養関連疾患の治療、予防、診断及び予後のためにｇｌｐを使用する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明が属する分野】
本発明は、同時係属中である，２，０００年９月１８日出願の英国特許出願第ＧＢ００２２８４４．５号及び同時係属中である，２，０００年１２月７日出願の英国特許出願第ＧＢ００２９９２０．６号に優先権を主張するものであり、前記出願のそれぞれの内容全てをそのまま参考文献により本明細書に合体するものである。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、ＧＬＰ−２分子又はＧＬＰ−２活性化剤をそれぞれ単独で又は他の治療薬と組み合わせて使用することによって、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を予防するか又は 治療するための方法に係わる。また本発明は、疾患の進行を診断するか又はモニターする方法をも包含する。また本発明は、本発明の治療法の有効性をモニターする 方法をも包含する。
【０００３】
２．発明の背景
【０００４】
グルカゴン及び関連疾患
グルカゴンは、低グルコーズ値に応答して放出され、グルコース産生を刺激するホルモンの一種である。即ち、血糖ホメオスタシスにおいてインシュリンに拮抗する上で一定の役割を果たしているのである（Ｕｎｇｅｒ ａｎｄ Ｏｒｃｉ，１９９０， Ｇｌｕｃａｇｏｎ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐ．１０４−１２０）。グルカゴンは、よりサイズの大きい前駆分子であるプログルカゴンの翻訳後プロセシングから生じる。
【０００５】
プログルカゴンは、膵臓のα―細胞及び小腸の腸内分泌性Ｌ−細胞において産生され、発現した異なる組織内で異なった分化プロセッシングを受ける。例えば、グルカゴンは、膵臓内において前駆体から選択的に切り出され、二種類の小型のペプチドである、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及びグルカゴン様ペプチドー２（ＧＬＰ−２）が、小腸内で産生される。ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２は、プログルカゴンのアミノ酸残基７８−１０７及び１２６−１５８からそれぞれ構成される（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ， ３０４： ３６８−３７１； Ｂｕｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：８６２１； Ｎｉｓｈｉ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｅｒ， １９９０， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ４：１１９２−１１９８； Ｉｒｗｉｎ ａｎｄ Ｗｏｎｇ，１９９５， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ９：２６７−２７７）。
【０００６】
グルカゴン及びＧＬＰ−１は、競合する生物学的活性を有する。ＧＬＰ−１は、腸内での栄養素の存在と吸収に応答してインシュリン分泌、グルコース吸収、及びｃ−ＡＭＰ生成を刺激するが、一方グルカゴンは、絶食時に肝臓、骨格筋組織、脂肪細胞によるグルコース産出を増大させる（例えば、Ｍｏｊｓｏｖ， １９９２， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ． ４０：３３３−３４３； Ａｎｄｒｅａｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ５５：２２１−２２８を参照）。また特異的なＧＬＰ−１受容体も同定されている（Ｔｈｏｒｅｎｓ， １９９２， Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ８９： ８６４１−８６４５）が、これら受容体は、グルカゴン受容体とは明白に異なる（ｊｅｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １６４１−１６１６）。
【０００７】
ＧＬＰ−２は、プログルカゴンの３３個のアミノ酸の断片であり、種々の脊椎動物（ヒトを含む）タイプのＧＬＰ−２が報告されている。ＧＬＰ−２は、小腸栄養活性を有する（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８３４，４２８）。
【０００８】
生体外から投与した場合、ＧＬＰ−２は、マウスにおいて小腸上皮細胞の増殖を顕著に増大させ、しかも明白な副作用は認められない（Ｄｒｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：７９１１−７９１６）。更に、ＧＬＰ−２は、小腸の基底側膜を通過するＤ−グルコースの最大輸送速度を増大させる（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ ａｎｄ Ｔｓｅｎｇ， １９９６， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓ． ２７１：Ｇ４７７−Ｇ４８２）。ＧＬＰ−２は、Ｇ−タンパク質結合受容体を介して作用する可能性がある（Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９６：１５６９−１５７３）。
【０００９】
疾患
【００１０】
肥満は、アメリカの人口のほぼ４０％が罹患する、最もありふれた医学的疾患の一つである。アメリカ合衆国における肥満による致死率は、一年当り３００，０００乃至４００，０００であると推定される。肥満の病因は、完全に理解されているわけではないが、エネルギー摂取がエネルギー消費を上まわる場合肥満が生じるのである。視床下部構造は、辺縁系及びその他の脳構造と複雑な交差結合を有しており、食欲を制御している。そのうえ、人体の脂肪の量とその分布は、遺伝的に予め決められており、ホルモンによって影響を受ける。食欲制御に関与するものと知られている作用物質としては、レプチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２及びニューロペプチド−Ｙが挙げられる。
【００１１】
骨粗しょう症は、最も多い代謝性骨疾患である。アメリカ合衆国内では２５００万人以上が罹患しており、ほぼ５００，０００件の脊椎骨折、２５０，０００件の股関節骨折や２４０，０００件の手首骨折を含め、毎年１３０万件の骨折の原因となっている。股関節骨折は、骨粗しょう症の最も深刻な結果であり、患者の５乃至２０％が、骨折後１年以内に死亡しまた生存者の５０％以上が運動不能となっている。
【００１２】
骨粗しょう症は、通常閉経後の婦人に認められるが、また老齢者や若年者にも生起する。この疾患の特徴は、骨質量が低いこと及び骨組織の劣化であり、その結果骨時弱性と骨折受傷性が増大することでなる。骨粗しょう症の病因は知られていないが、その罹患初期は、例えば高齢、ホルモン量の低下やカルシウム量の低下など幾つかの要因と関連している。骨粗しょう症は、アンドロゲン量が低下するにつれて、若年者においても発生する可能性がある。アンドロゲンは、骨形成／骨維持において重要な役割を演じており、カルシウムとリンとの貯蔵庫であるコラーゲンの合成を促進する。骨粗しょう症はまた、副甲状腺ホルモン分泌の増加に起因するが、この甲状腺ホルモンは、骨形成を減少させまた骨吸収を増大させる。骨粗しょう症は、腎臓の退化によっても生起するが、かかる腎臓退化は、ヒドロキシラーゼ活性化ビタミンＤの活性を低下させ、小腸内でのカルシウム吸収を減少させ、また骨マトリックスの損失を急減させる。骨中での栄養素貯蔵庫の動員は、破骨細胞による骨吸収を刺激することによって行なうことが出来る。また吸収活性は、栄養素の食事による利用可能性を増加させることによって逆転させることが出来る。
【００１３】
カルシウムの食事による摂取は、骨代謝を調節することが判っている。経口グルコース摂取は、最近骨吸収を減少させ、その結果グルコース投与後二時間以内に明瞭な低下をもたらすことが示された（ＧＢ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ０００７４９２．２）。グルコース摂取に対するこのような応答は、性及び年齢に無関係である。相当する効果が、タンパク質投与後にも証明されている（未発表の連絡）。
【００１４】
骨関連疾患の特徴は、骨吸収と骨形成との間の不均衡から生じる骨損失である。骨損失の可能性は、通常の骨吸収速度に直接関連づけられており、閉経直後のヒトでは年間５％以上に達する。
【００１５】
骨粗しょう症には現在のところ二種類の主要な治療法があり、何れも骨吸収を低下させることを意図したもの第一の治療法は、抗骨吸収化合物を投与することである。例えば、エストロゲンが、骨折を減らすために抗骨吸収剤として使用されてきている。しかしながら、エストロゲンは、骨を若者の骨格におけるレベルにまで修復させることは出来ない。さらには、長期のエストロゲン治療は、子宮ガン、子宮内膜ガンや恐らくは乳ガンのリスク増大を含む種々の疾患の原因となるものである（Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，“Ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎｅｓｔｅｄ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ａ ｃｏｈｏｒｔ Ｓｗｅｄｉｓｈ ｗｏｍａｎ ａｔｔｅｎｄｉｎｇ ｍａｍｍｏｇｒａｐｈｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ”， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎ．７２：７５８−７６１）。これらの理由により、多くの補正はエストロゲンによる骨粗しょう症の治療を回避している。
【００１６】
骨粗しょう症を治療するための第二の医薬による治療法は、骨吸収を抑制・阻害しまた骨形成を促進し且つ骨質量を増加させる薬剤を使用するものである。例えば、アレンドロネートなどのかかる薬剤は、典型的には骨量を定着した閉経後骨格の量にまで修復させるのである。しかしながら、アレンドロネート投与は、例えば胃潰瘍などの望ましくない副作用を惹起する可能性がある（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．４：５１５−９）。
【００１７】
現在利用可能である医薬治療法（例えばエストロゲンやアレンドロネート）に関連して重大なリスクが存在するため、骨粗しょう症及びその他骨関連疾患を治療するか又は予防するためのより安全な治療法の開発に対する要求が強くなっている。従って、例えば骨粗しょう症などの骨疾患を治療するか又は予防するための方法であって、前記したリスクを持たない治療法に対する要求が強いのである。
【００１８】
３．発明の概要
本発明は、ＧＬＰ−２活性を増大せしめる組成物を患者に投与することから成る骨関連疾患又は栄養素関連疾患の予防又は治療に係わる。本発明の組成物は、ＧＬＰ−２分子又はＧＬＰ−２活性化剤を含んで成る。一種又はそれ以上の治療薬剤を本発明の組成物と組み合わせて投与することが出来る。
【００１９】
本発明がまた意図するのは、下記を含んで成る患者の骨関連疾患又は栄養素関連疾患を診断するための方法である：
（ａ）健常組織及び試験組織において発現したＧＬＰ−２分子の濃度を測定すること；及び
（ｂ）前記二種の組織において発現したＧＬＰ−２分子の濃度を比較すること−なお、この際前記組織において発現されたＧＬＰ−２分子の前記濃度の低下が、骨関連疾患の存在を示すものである−。
【００２０】
また本発明が意図するのは、下記を含んで成る患者における骨関連疾患の進行をモニターする方法である：
（ａ）第一の罹患組織において発現されたＧＬＰ−２分子の濃度を測定すること；
（ｂ）第二の罹患組織において発現されたＧＬＰ−２分子の濃度を求めること−なお、前記第二の罹患組織が、前記第一の罹患組織と同じ患者から後刻採取されるものである−；及び
（ｃ）前記第一及び第二の罹患組織において発現されたＧＬＰ−２分子の濃度を比較すること−なおこの際、前記第二の罹患組織において発現されたＧＬＰ−２分子の濃度・前記数値の低下が、骨関連疾患の進行を示すものである−。
【００２１】
また本発明が意図するところは、下記を含んで成る患者におけるＧＬＰ−２分子又はＧＬＰ活性化剤による治療の有効性を決定するための方法である：
（ａ）治療前の第一の患者組織標本からまた治療後の第二の患者組織標本から骨吸収の一つ又はそれ以上のマーカーの濃度を求めること；及び
（ｂ）前記組織中の一つ又はそれ以上のマーカーの濃度を比較すること−なお、この際前記第二組織標本におけるマーカー濃度の低下が、有効な治療であることを示すものである−。
【００２２】
また本発明が意図するところは、下記を含んで成る、患者におけるＧＬＰ−２分子又はＧＬＰ活性化剤による治療の有効性を決定するための方法である：
（ａ）治療前の第一の患者組織標本からまた治療後の第二の患者組織標本から栄養関連疾患の一つ又はそれ以上のマーカーの濃度を求めること；及び
（ｂ）前記組織中の一つ又はそれ以上のマーカーの濃度を比較すること−なお、この際前記第二組織標本におけるマーカー濃度の変動が、有効な治療であることを示すものである−。
【００２３】
３．１ 定義
【００２４】
本明細書において使用する、“ＧＬＰ”なる用語は、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２を言うものである。
【００２５】
本明細書において使用する、“ＧＬＰ分子”なる用語は、ＧＬＰペプチド、ＧＬＰペプチドの断片、ＧＬＰペプチド又は断片をコードする核酸又はその変異体を言うものである。
【００２６】
本明細書において使用する、“変異体”又は“複数の変異体”なる用語は、ＧＬＰ分子の核酸配列又はアミノ酸配列に係わる変異体を言うものである。本発明に係わるＧＬＰ分子の同族体及び類縁体も意図される。“変異体（複数）”なる用語には、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２分子の核酸及びアミノ酸配列における置換体、付加体又は欠失体が包含される。変異体（複数）”なる用語には、ＧＬＰ−１又はＧＬＰ−２分子を化学的に変成させた天然物及び合成物をも包含される。
本明細書において使用する、“同族体”又は“類縁体”なる用語は、ＧＬＰポリペプチドの断片又はＧＬＰポリペプチド断片に類似した又は同一の機能を有するポリペプチドを言うものであるが、ＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片の類似した又は同一であるアミノ酸配列を必ずしも含んで成るものではなく、又はＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片の類似した又は同一である構造を必ずしも有するものではない。類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドは、下記する条件の少なくとも一つを満たすポリペプチドを言うものである：（ａ）本明細書において記載するＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド；（ｂ）少なくとも１０のアミノ酸残基、少なくとも１５のアミノ酸残基、少なくとも２０のアミノ酸残基、少なくとも２５のアミノ酸残基又は少なくとも３０のアミノ酸残基を有する、本明細書において記載するＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；及び（ｃ）本明細書において記載するＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド。本明細書において記載するＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片に類似した構造を有するポリペプチドとは、本明細書において記載するＧＬＰポリペプチド又はＧＬＰポリペプチド断片の二次構造、三次構造又は四次構造と類似した構造を有するポリペプチドを言うものである。ポリペプチドの構造は、当業者に公知である方法、例えばＸ線結晶学、核磁気共鳴や結晶学的電子顕微鏡を含む−但し、これらに限定されない−方法を用いて決定することが出来る。
【００２７】
二種のアミノ酸配列又は二種の核酸配列の１００分率での同等性を決定するために、これらの配列を最適比較の目的のためにアラインメントさせる（例えば、第一のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入して、第二のアミノ酸配列又は核酸配列と最適アラインメントさせる）。次いで、かかるアミノ酸位置又は相当するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較するのである。第一の配列における一つの位置が、第二の配列における相当する位置において同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合は、当該分子は、その位置において同等である。これら二つの配列間における百分率同等性は、これら二つの配列によって共有される同等位置の数の函数である（即ち、％同等性＝同等で、重なる位置の数／位置の全数ｘ１００％）。一つの実施態様においては、これら二つの配列は、鎖長が同一である。
【００２８】
二つの配列間の百分率同等性を決定することは、また数学アルゴリズムを用いても実行することが出来る。二つの配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムの一つの好ましい、但し限定されない例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７：２２６４−２２８６、その後Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０：５８７３−５８７７で修正されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００， ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とした，ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラム変数により実行して、本発明の核酸分子に相同であるヌクレオチド配列を得ることが出来る。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０， ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とした，ＸＢＬＡＳＴプログラム変数により実行して、本発明のタンパク質分子に相同であるアミノ酸配列を得ることが出来る。比較の目的でギャップさせたアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２において記述されたようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することが出来る。又はその代わりに、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用して、分子間の僅かな関係を検出する反復サーチを実行してもよい。ＢＬＡＳＴ，Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合は、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴの）のデフォールト変数を使用すればよい（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。配列の比較をおこうために利用される数学アルゴリズムの別の好ましい、但し限定的ではない一例は、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ， １９８８， ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ，ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙとして２０またｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙとして４を使用すればよい。
【００２９】
二つの配列間の百分率同等性は、上記した技法と類似した種々の技法を用いて、ギャップを設けるか設けないで、決定することが出来る。百分率同等性を産出するに際しては、典型的には正確なマッチを数えるのである。
【００３０】
本明細書において使用する、“断片”又は“断片類”なる用語は、ＧＬＰポリペプチドのアミノ酸配列のうちの少なくとも１０個の連続したアミの酸残基、少なくとも１５個の連続したアミの酸残基、少なくとも２０個の連続したアミの酸残基、少なくとも２５個の連続したアミの酸残基、又は少なくとも１０個の連続したアミの酸残基、少なくとも３０個の連続したアミの酸残基から成るアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドを言うものである。
【００３１】
本明細書において使用する、“ＧＬＰ活性化剤”又は“ＧＬＰ活性化剤類”なる用語は、患者においてＧＬＰの活性を増大させる如何なる分子又は化合物を言うものである。本発明は、例えばＧＬＰアゴニスト類、ＧＬＰ受容体アゴニスト類、ＧＬＰシグナル伝達カスケードのアゴニスト類、内因性ＧＬＰの合成又は発現を刺激する化合物類、内因性ＧＬＰの放出を刺激する化合物類、及びＧＬＰ活性の阻害剤を阻害・抑制する化合物類（即ち、ＧＬＰアンタゴ二ストの阻害剤）を包含する。
【００３２】
本明細書において使用する、“患者”なる用語は、例えば−但しこれに限定されない−、ウシ、サル、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギやモルモットなどの動物であり、更に好ましくは哺乳動物であり、又、最も好ましくはヒトである。
【００３３】
本明細書において使用する、“治療”又は“治療薬剤”なる用語は、疾患、特に骨関連疾患及び栄養素関連疾患の治療を推進・援助する如何なる分子、化合物又は治療を言うものである。そのため、治療としては、以下に限定されるものではないが、放射線療法、化学療法、食事療法、理学療法及び心理療法が挙げられる。
【００３４】
本明細書において使用する、“骨関連疾患”なる用語は、骨の形成、沈着又は吸収が異常となった疾患を言うものである。骨関連疾患としては、以下に限定されるものではないが、骨粗しょう症、悪性過カルシウム血症、骨転移による骨軟化症、歯周病、副甲状腺機能亢進症、リューマチ性関節炎における関節周囲糜爛、ページェット病、骨形成異常症、骨化性筋炎、べクテレフ病、悪性過カルシウム血症、骨転移により発症する骨分解性傷害、不動化又は性ホルモン不足による骨損失、ガン治療により発症する骨異常、骨軟化症、ベーチェット病、骨軟化症、過骨形成症及び骨化石症、転移性骨疾患、不動化による誘発される骨減少症、及びグルココルチコイド誘発骨粗しょう症が挙げられる。
【００３５】
本明細書において使用する、“栄養素関連疾患”なる用語は、異常な水準の食物摂取又は体重増／減により特徴づけられる疾患及びかかる疾患による合併症を言うものである。栄養素関連疾患としては、下記に限らないが、肥満、食欲不振、悪液質、食欲亢進、及びその他の、食欲不振、食事摂取減少又は体重減などを特徴とする衰弱性疾患が挙げられる。合併症としては、以下に限定されないが、インシュリン抵抗性、糖尿病、高血圧、心血管系疾患、偽脳腫瘍、高脂血症、睡眠時無呼吸症、ガン、肺性高血圧症、心血管系疾患、胆嚢炎及び骨関節炎が挙げられる。
【００３６】
本明細書において使用する、“薬学的に許容可能な”なる用語は、有効成分の持つ生物学的活性の有効性を妨害することがなくまた連邦政府又は州政府の規制官庁によって承認され得るか又はアメリカ合衆国薬局方又はその他の一般的に認められた薬局方に収載され、特にヒトに使用可能である薬剤を言うものである。従って、薬学的に許容可能な担体としては、医薬組成物の有効性を妨害しない薬剤が挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用する、“薬学的に許容可能な塩”なる用語は、薬学的に許容可能な、好ましくは無毒性の酸類及び塩類、例えば無機の及び有機の酸類及び塩類を言うものであり、例えば−但しこれらに限定されないが−硫酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩、フマール酸縁、グルコン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモエート（即ち、１，１‘−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎａｐｈｔｈｏａｔｅ））が挙げられる。薬学的に許容可能な塩としては、遊離のアミノ基と形成される塩類、例えば−但し、これらに限定されないが−塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸及び酒石酸から誘導される塩類が挙げられる。薬学的に許容可能な塩としてはたた、遊離のカルボン酸と形成される塩、例えば−但し、これらに限定されないが−ナトリウム、カリウム、アンモニウム、リチウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２―エチルアミノエタノール、ヒスチジン及びプロカインから誘導される塩が挙げられる。
【００３８】
本明細書において使用する、“担体”なる用語は、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを言うものである。かかる担体は、無菌の液体、例えば水性食塩液又は石油、動物、植物由来油や合成油、例えばピ―ナッツオイル、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油などの油中食塩溶液であればよい。食塩溶液は、当該医薬組成物を静脈内投与する場合好ましい担体である。食塩溶液及び水性できストロースやグリセリン溶液も、特に注射溶液に対して液体担体として使用することが出来る。
【００３９】
本明細書において使用する、“ミネラル”なる用語は、カルシウム、マグネシウム又はリンを含有する物質、好ましくは天然の物質を言うものである。具体的な栄養素及びミネラルとしては、ウシ骨、魚骨、リン酸カルシウム、卵殻、貝類、牡蠣殻、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム及びクエン酸カルシウムが挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用する、“生物学的試料”なる用語は、細胞、組織、器官、又は多細胞生物を包含するよう広く定義される。生物学的試料は、例えばインビトロでの細胞又は組織の培養物か由来するものであってもよい。その代わりに、生物学的試料は、生きている生物又は単細胞生物の集団から由来するものであってもよい。好ましくは、かかる生物学的試料は、生きている組織である。更に好ましくは、かかる生物学的試料は、生きている骨又は脂肪細胞である。
【００４１】
本明細書において使用する、“ＧＩＰ”なる用語は、グルコース依存性インシュリン分泌刺激ポリペプチドを言うものである。ＧＩＰは、直接的にグルコース依存態様でインシュリン分泌を刺激するインクレチンである。
【００４２】
本明細書において使用する、“Ｓ−ＣＴＸ”なる用語は、Ｉ型コラーゲン分解の血清中Ｃ−テロペプチド断片を言うものである。
【００４３】
本明細書において使用する、“単離されたポリペプチド又はペプチド”なる用語は、当該タンパク質が由来した細胞又は組織から由来する細胞物質又はその他の混入・汚染タンパク質を実質的に含まない又は化学的に合成したものである場合は化学的前駆体又はその他の化学薬品を実質的に含まないポリペプチド又はペプチドを言うものである。“細胞物質を実質的に含まない”なる表現は、当該タンパク質が、タンパク質を分離したか又は遺伝子組換えにより産生させた細胞の細胞物質から単離されたものであるタンパク質製剤を包含する。即ち、細胞物質を実質的に含まないタンパク質としては、異種タンパク質（また“混入・汚染タンパク質”とも称する）をほぼ３０％、２０％、１０％又は５％以下含むタンパク質製剤が挙げられる。当該タンパク質、ペプチド又はそれらの断片が遺伝子組み替え技法で産生された場合は、これらもまた、培地を実質的に含まないものが好ましい、即ち、培地は、当該タンパク質製剤のほぼ２０％、１０％、又は５％以下を占めるものである。当該タンパク質が化学的合成法により製造された場合は、化学的前駆体又はその他の化学薬品を実質的に含まないのが好ましい。即ち、当該タンパク質の合成に関与した化学的前駆体又はその他の化学薬品から分離されるのである。従ってかかるタンパク質製剤品は、対象となるポリペプチド以外の化学的前駆体又はその他の化学薬品をほぼ３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量％）以下含むものである。好ましい実施態様においては、生成された又は単離された製剤品は、例えばヒトタンパク質をヒトでない細胞において遺伝子組み替えにより発現させることによって得た場合と同様に、当該タンパク質の製造原料となった動物に由来する混入・汚染タンパク質を一切含まないのである。
【００４４】
本明細書において使用する、“単離された核酸分子”なる用語は、天然の核酸分子供給源の存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を言うものである。好ましくは、単離された核酸分子は、当該核酸分子由来源である生物のゲノムＤＮＡ中において該核酸の側面に隣接する配列（即ち、該核酸分子の５‘及び３’末端に位置する配列）を一切含まない。その他の実施態様に於いて、かくして単離された核酸は、イントロン配列を一切含まない。例えば、種々の態様においては、該単離核酸分子は、当該核酸分子由来源である細胞のゲノムＤＮＡ中において該核酸の側面に隣接するヌクレオチド配列をほぼ５ｋＢ，４ｋＢ，３ｋＢ，２ｋＢ，１ｋＢ，０．５ｋＢ又は０．１ｋＢ以下しか含有しなければよい。さらには、例えばｃＤＮＡ分子などの単離核酸分子は、遺伝子組換え法で製造した場合はＴの細胞物質又は培地を実質的に含まなければよく、また化学的に合成された場合は化学的前駆体又はその他の化学薬品を実質的に含まなければよい。一つの実施態様に於いては、本発明の核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードする相接するオープンリーディングフレームを含む。
【００４５】
本明細書において使用する、“ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする”なる表現は、ハイブリダイゼーション及びウオッシングの条件であって、少なとも６０％（６５％、７０％、７５％、８０％、又は好ましくは８５％又はそれ以上）相互に同等であるヌクレオチド配列が、相互にハイブリダイズしたままの状態であるような前記条件を記述することを意図する。かかるストリンジェントな条件は、当業者には公知であって、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６において見出すことが出来るのであり、該成書においては水性及び非水性法が記載されており、その何れでも使用することが出来る。ストリンジェントな条件のもう一つの好ましい、これに限定されない例は、ほぼ４５℃における６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行い、次いで５０℃にて０．２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で一回又は二回の洗浄を行なうことである。ストリンジェントな条件のまた別の例は、ほぼ４５℃にて６Ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行い、次いで５５℃にて２．０ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で一回又は二回の洗浄を行なうことである．ストリンジェントな条件の更なる別の例は、ほぼ４５℃にて６Ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行い、次いで６０℃にて２．０ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で一回又は二回の洗浄を行なうことである。好ましくは、ストリンジェントな条件は、ほぼ４５℃にて６Ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションを行い、次いで６５℃にて２．０ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で一回又は二回の洗浄を行なうことである。特に好ましいストリンジェンシー（及び実行者が、ある分子が、本発明のハイブリダイゼーション限界内にあるか否かを決定するために如何なる条件を適用するべきかについて自信がない場合に使用するべき条件）は、ほぼ６５℃にて０．５Ｍ リン酸ナトリウム、７％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを行い、次いで６５℃にて２．０ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で一回又は二回の洗浄を行うことである。一つの実施態様においては、ストリンジェントな条件下でＧＬＰ核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズする単離核酸分子は、天然の核酸分子に相当するものである。本明細書において使用する、“天然の”核酸分子は、自然界において存在する核酸配列（例えば、天然のタンパク質をコードする）を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を言うものである。
【００４６】
５．詳細な発明の説明
【００４７】
５．１ ＧＬＰ及び骨関連疾患又は栄養素関連疾患
本発明は、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２が、骨吸収を抑制・阻害しまた骨形成を促進するという本出願人が見出した知見に一部基くものである。如何なる理論にも束縛されることはなく、本出願人は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）やプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）について認められているように、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２も特にｃＡＭＰを増大させることによって骨同化作用を発揮するものと確信している。ＧＬＰの抗骨吸収効果は、ＩＬ−６分泌を抑制・阻害し、ＰＴＨ作用に拮抗し及び／又はＧＬＰの抗骨吸収効果に寄与する性機能不全状態を造出する能力に起因している。
【００４８】
従って、本明細書において開示されるＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤は、本明細書において開示される骨関連疾患を含む、骨関連疾患を治療し又は予防するために有用である。
【００４９】
本明細書において開示されるＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤は、栄養素関連疾患及び前記栄養素関連疾患に起因した合併症を治療し又は予防するためにも有用である。ＧＬＰ分子は、血中ブドウ糖濃度を左右し、且つ胃腸機能を維持又は回復させる。
【００５０】
ＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤はまた、骨由来細胞中に存在する一つ又はそれ以上の受容体を活性化させることが出来る。如何なる理論にも束縛されることはなく、これらの細胞をＧＬＰで刺激すれば、細胞内カルシウム濃度が増加し、細胞ｃＡＭＰ含量が増大し、Ｉ型コラーゲン合成が刺激されまたＰＴＨにより刺激された骨吸収が抑制・阻害されることになる。
【００５１】
本発明に従えば、本発明の組成物及び方法は、骨吸収速度を低減させ及び／又は骨形成速度を促進させるＧＬＰの作用に関与したシグナル伝達カスケードに上流又は下流において調節関与させるために使用することが出来る。ある一つの実施態様においては、内因性ＧＬＰの合成又は放出を刺激・促進させることが出来るのである。別の実施態様においては、ＧＬＰの下流で当該カスケードにおいて活性を有する他の分子（例えば、ＧＬＰの受容体への結合に応答して産生される分子）の内因性合成又は放出を刺激・促進することが出来る。
【００５２】
従って、本発明の組成物及び方法は、本明細書において開示された骨関連疾患を含む骨関連疾患を予防し、治療し、診断し又はその進行をモニターするために有用である。
【００５３】
５．２ＧＬＰ分子
かかるＧＬＰ分子は、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療するか又は予防するための本発明の方法及び組成物に有用である。
【００５４】
ある一つの実施態様においては、かかるＧＬＰ分子は、ＧＬＰポリペプチド、ペプチド又はこれらの断片をコードするＧＬＰ核酸である。ＧＬＰ核酸は、例えば、全長ｃＤＮＡ、タンパク質コード領域に相当するｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ，オリゴヌクレオチド、コンセンサス配列、モチーフ、制限断片、アンチセンス分子、リボザイム、又はあるタンパク質領域をコードする分子である。
【００５５】
別の実施態様においては、かかるＧＬＰ分子は、ＧＬＰポリペプチド又はペプチド又はこれらの断片である。かかるＧＬＰポリペプチド又はペプチドは、例えば全長タンパク質、受容体結合領域、摂食領域、シグナル配列又はタンパク質モチーフである。
【００５６】
さらには、ＧＬＰ分子であって、付加的な核酸若しくは核酸残基を含むか又は核酸若しくはアミノ酸を欠失したＧＬＰ分子も本発明の方法及び組成物に使用することが出来る。しかも、本発明のＧＬＰ分子は、置換された核酸又はアミノ酸を含有していてもよい。ある一つの実施態様においては、かかるＧＬＰ変異体は、ネイティブなヒトＧＬＰ−２と比較して高い活性を有するものである。例えば、かかるＧＬＰ変異体は、血清内安定性が高く、また受容体結合性が高く、又はシグナル伝達活性も高い。アミノ酸の修飾、置換、付加又は切断は、ＧＬＰペプチドの酸化又は劣化に対する抵抗性を高めるものであり、本発明によって意図される。一つの好ましい実施態様においては、かかるＧＬＰ変異体は、ヒト又はラットＧＬＰ配列から誘導される。
【００５７】
本発明に従ってＧＬＰペプチドとして意図される分子は、当業界において公知である（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，９９０、０７７、国際特許出願ＷＯ ００／３４３３１及びＷＯ ００／３４３３２を参照のこと）。例えば、国際特許出願ＷＯ ００／３４３３１及びＷＯ ００／３４３３２においては、例えば（Ａｉｂ^８．３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２及び（Ａｉｂ^８、β―Ａｌａ^３５）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２などのＧＬＰ−１の類縁体が開示されている。またＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，９９０，０７７においては、下記する一般式と合致する種々の種類のＰＧＬ−２及びこれらの薬学的に許容可能な酸塩類が開示されている：
【００５８】
Ｒ１−［Ｙ］ｍ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ａａ１−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ａａ２−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ａａ３−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ａａ４−ａａ５−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−［Ｘ］ｎ−Ｒ２
【００５９】
ＧＬＰ−１の変異体は、多くのものが当業界において公知となっており、例えば、ＷＯ９１／１１４５７において列挙されているＧｌｎ９−ＧＬＰ−１、Ｄ−Ｇｌｎ９−ＧＬＰ−１，ａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ９−ＧＬＰ−１，Ｔｈｒ１６−Ｌｙｓ１８−ＧＬＰ−１，及びＬｙｓ１８−ＧＬＰ−１などがある。ＧＬＰ−１変異体の酸付加塩類、カルボン酸塩類、低級アルキルエステル類及びアミド類のうち多くのものが、当業界において開示されており、本発明によっても包含され意図される。
【００６０】
ＧＬＰ−１の変異体は、天然の配列を断片化することにより得ることができ又ネイティブのＧＬＰ−１のＤＮＡ，ＲＮＡ又はアミノ酸に関する知識に基いて合成することが出来る。かかる変異体を調製する方法は、当業者には公知となっている（例えば、ＷＯ９１／１１４５７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，１１８，６６６； ５，１２０，７１２及び５，５１２，５４９を参照のこと）。たとえば、変異体は、ペプチド類合成のための固相法を用いて調製することが出来る。通常知られているように、必要鎖長のペプチド類は、市販の装置及び試薬を用いて、干渉する基をブロックし、反応するアミノ酸を保護し、カップリングさせ、脱保護し且つ未反応残基をキャップするためのメーカーの指示に従って合成することが出来る。適当な装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ − Ｆｏｓｔｅｒ ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ− 又はＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ − Ｓａｎ Ｒａｐｈａｅｌ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−から購入・入手することが出来る。また、例えばタンパク質分解酵素等を用いて天然のアミノ酸配列を断片化することによってＧＬＰ−１の断片を得ることが可能である。さらには、組み替えＤＮＡ技術を使用することによってもＧＬＰ−１の所望とする断片を得ることが可能である。遺伝子組み替え製造の基本的な工程は、以下のようである：
ａ）ＧＬＰ−１をコードする天然ＤＮＡ配列を単離するか又はＧＬＰ−１をコードする合成又は半合成ＤＮＡ配列を構築すること、
ｂ）タンパク質を単独又は融合タンパク質として発現するに適当である態様でかかる配列を発現ベクター内に挿入する、
ｃ）この発現ベクターを用いて適当な真核又は原核のホスト細胞を形質変換すること
ｄ）ＧＬＰ−１中間体を発現させることが可能である条件下でかかる形質変換細胞を培養すること、及び
ｅ）遺伝子組み替えにより産生したタンパク質を回収し且つ精製すること。
【００６１】
ある一つの実施態様においては、かかるＧＬＰ分子は、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５４５，６１８において開示されているようにインシュリン分泌刺激作用が高いＧＬＰ−１変異体である。かかる変異体は、ＧＬＰ−１（７−３４）；（７−３５）；（７−３６）又は（７−３７）ヒトペプチド又はこれらのＣ―末端アミド化体であってもよい。かかるネイティブのペプチドは、下記するアミノ酸配列を有する（本式において、下記第一のアミノ酸（即ちＨｉｓ）は、７位にある）：
【００６２】
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−（Ｇｌｙ）−（Ａｒｇ）−（Ｇｌｙ）；なお本式において、（Ｇｌｙ）、（Ａｒｇ）及び（Ｇｌｙ）は、示される鎖長に依存して存在するか又は存在しない。
【００６３】
なお、本式において（Ｇｌｙ），（Ａｒｇ）及び（Ｇｌｙ）は、指示した鎖長に依存して存在するか又は存在しない。
【００６４】
該変異体は、前記配列又はそのＣ末端アミドを有するが、少なくとも一つの修飾例は、下記から成る群から選択される：
（ａ）位置２６及び／又は３４におけるリジンに代えて中性アミノ酸であるアルギニン又はＤ型リジンを置換巣か及び／又は位置３６におけるＤ型アルギニン又はアルギニンに代えて中性アミノ酸であるリジン又はＤ型アルギニンを置換したもの；
（ｂ）位置３１におけるトリプトファンに代えて抗酸化性のアミノ酸を置換したもの；
（ｃ）下記のうちの少なくとも一つに従って置換したもの；
位置１６におけるＶａｌの代わりにＴｙｒ；
位置１８におけるＳｅｒの代わりにＬｙｓ；
位置２１におけるＧｌｎの代わりにＡｓｐ；
位置２２におけるＧｌｙの代わりにＳｅｒ；
位置２３におけるＧｌｕの代わりにＡｒｇ；
位置２４におけるＡｌａの代わりにＡｒｇ；
位置２６におけるＬｙｓの代わりにＧｌｕ；
（ｄ）下記のうちの少なくとも一つから成る置換したもの；
位置８におけるＡの代わりに代替した小型の中性アミノ酸；
位置９におけるＧｌｕの代わりに代替した酸性アミノ酸又は中性アミノ酸；
位置１０におけるＧｌｙの代わりに代替した中性アミノ酸；及び
位置１５におけるＡｓｐの代わりに代替した酸性アミノ酸；並びに
（ｅ）位置７におけるヒスチジンの代わりに代替した小型の中性アミノ酸又はヒスチジンのＤ−若しくはＮ−アシル化若しくはアルキル化物で置換したもの；
【００６５】
また別の実施態様においては、かかるＧＬＰ分子は、天然のＧＬＰ−１に比較して耐劣化性が高くなったＧＬＰ−１変異体である。耐劣化性が高いことは、生物学的利用可能性がより長くなることになる。ある一つの具体的な実施態様においては、かかるＧＬＰ−１変異体は、インシュリン分泌刺激性もまた安定性も高いものである。
【００６６】
また別の実施態様においては、かかるＧＬＰ分子は、ＧＬＰ−２変異体である．種々のＧＬＰ−２変異体は、当業界において公知である。ＧＬＰ−２変異体の例としては、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，９９０，０７７及び６，１８４，２０１において認められるものがあり、以下のものが挙げられる：
【００６７】
１）
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ。
【００６８】
２）
Ｒ１−［Ｙ］ｍ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−ａａ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ａａ２−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ａａ３−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ａａ４−ａａ５−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−［Ｘ］ｎ−Ｒ２。
なお上式において：
ａａｌは、中性で、極性の、大型で且つ非芳香族性のアミノ酸残基である；
ａａ２は、中性且つ極性のアミノ酸残基である；
ａａ３は、中性のアミノ酸残基である；
ａａ４は、中性で、極性の、大型で且つ非芳香族性のアミノ酸残基である；
ａａ５は、中性又は塩基性のアミノ酸残基である；
Ｘは、Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ―Ｌｙｓ，又はＬｙｓ−Ｌｙｓである；
Ｙは、Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇである；
ｍは、０又は１である；
ｎは、０又は１である；
Ｒ１は、Ｈ又はＮ―末端保護基である；
Ｒ２は、ＯＨ又はＣ―末端保護基である；
【００６９】
３）
Ｒ１−［Ｙ］ｍ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ａａ１−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ａａ２−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ａａ３−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−ａａ４−ａａ５−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−［Ｘ］ｎ−Ｒ２。
上式において：
ａａｌは、Ｉｌｅ又はＶａｌである；
ａａ２は、Ａｓｎ又はＳｅｒである；
ａａ３は、Ａｌａ又はＴｈｒである；
ａａ４は、Ｉｌｅ又はＬｅｕである；
ａａ５は、Ｇｌｎ又はＨｉｓである；
Ｘは、Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ―Ｌｙｓ，又はＬｙｓ−Ｌｙｓである；
Ｙは、Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇである；
ｍは、０又は１である；
ｎは、０又は１である；
Ｒ１は、Ｈ又はＮ―末端保護基である；
Ｒ２は、ＯＨ又はＣ―末端保護基である；
【００７０】
４）
Ｒ１−（Ｙ１）ｍ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｓｅｒ５−Ｐｈｅ６−Ｓｅｒ７−Ａｓｐ８−（Ｐ１）−Ｌｅｕ１４−Ａｓｐ１５−Ａｓｎ１６−Ｌｅｕ１７−Ａｌａ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ａｓｐ２１−Ｐｈｅ２２−（Ｐ２）−Ｔｒｐ２５−Ｌｅｕ２６−Ｉｌｅ２７−Ｇｌｎ２８−Ｔｈｒ２９−Ｌｙｓ３０（Ｐ３）−（Ｙ２）ｎ−Ｒ２。
上式において：
Ｘ１は、Ｈｉｓ又はＴｙｒである；
Ｘ２は、Ａｌａ又はＤＰＰ−ＩＶ酵素に対する抵抗性を前記類縁体に付与するＡｌａ置換アミノ酸である；
Ｘ３は、Ｐｒｏ，ＨＰｒｏ、Ａｓｐ又はＧｌｕである；
Ｘ４は、Ｇｌｙ又はＡｌａである；
Ｐ１は、Ｇｌｕ−Ｘ１０−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−又はＴｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒである；
Ｘ１９は、Ａｌａ又はＴｈｒである；
Ｘ２０は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ，Ｈｉｓ又はＡｌａである；
Ｐ２は、Ｉｌｅ−Ａｓｎ，Ｉｌｅ−ａｌａ、又はＶａｌ−Ｇｌｎである；
Ｐ３は、共有結合であるか、又はＩｌｅ、Ｉｌｅ−Ｔｈｒ又はＩｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎである；
Ｒ１は、Ｈ又はＮ−末端保護基である；
Ｒ２は、ＯＨ又はＣ―末端保護基である；
Ｙ１は、Ａｒｇ，Ｌｙｓ及びＨｉｓの群から選択される一つ又は二つの塩基性アミノ酸である；
ｍ及びｎは、独立して０又は１である；及び
上記において、Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３、Ｘ４，Ｐ１，Ｘ１０，Ｘ１９、Ｘ２０，Ｐ２及びＰ３は、天然型の、哺乳動物のＧＬＰ−２残基である。
【００７１】
ある一つの実施態様においては、かかるＧＬＰ−２変異体は、ジペプチジルペプチダーゼーＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対して抵抗性を有する。
【００７２】
また別の実施態様においては、かかるＧＬＰ−２変異体は、酸化に対して感受性があるアミノ酸が酸化に対して安定であるアミノ酸により置換されているアミノ酸配列である。また更なる別の実施態様においては、かかる酸化に対して感受性があるアミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）である。これらの変異体は、天然のＧＬＰ−２よりも安定性が高い可能性がある。
【００７３】
また別の実施態様においては、かかるＧＬＰ−２変異体は、アルギニンが塩基性のアミノ酸（即ち、ヒスチジン又はリジンである）で置換されているアミノ酸配列である。
【００７４】
５．３ ＧＬＰ活性化剤
本発明はまた、骨関連疾患及び栄養素関連疾患を予防するか又は治療するためＧＬＰ活性を増大せしめる分子類をも包含する。例えば、ＧＬＰアゴニスト、ＧＬＰ受容体アゴニスト、ＧＬＰシグナルトランスダクションカスケードのアゴニスト、内因性ＧＬＰの合成又は発現を刺激する化合物、内因性ＧＬＰの放出を刺激する化合物及びＧＬＰ活性の阻害剤を抑制・阻害する化合物（即ち、ＧＬＰアンタゴニスト）をも意図され包含される。ある一つの実施態様においては、かかるＧＬＰ活性化剤は、ＧＬＰ−２アゴニストである。ＧＬＰ−２アゴニストは、当業界では公知となっており、以下に列挙する（また、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，０５１，５５７を参照）：
【００７５】
本発明の具体的な実施態様においては、かかるＧＬＰ−２アゴニストは、下記する配列を有するアミノ酸を含んで成る：
【００７６】
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ。
又は
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ。
又は
Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ。
【００７７】
ある特別な実施態様においては、ＧＬＰアゴニストは下記を有する：
Ｎ末端保護基；及び／又は
Ｎ末端伸張基、例えばＡｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇ；及び／又は
Ｃ末端保護基；及び／又は
Ｃ末端伸張基、例えばＡｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇ。
【００７８】
また別の実施態様においては、かかる本発明に有用なＧＬＰ分子は、ＧＬＰアンタゴニストの阻害剤であり、また特別な実施態様では、かかるＧＬＰアンタゴニストは、プロテアーゼである。ある具体的な実施態様においては、かかるプロテアーゼは、ＤＰＰ−ＩＶである。
【００７９】
ＧＬＰアンタゴニストであるＤＰＰ−ＩＶの有用な阻害剤としては−但し、これらに限定されないが−、Ｎ−（置換グリシル）−２−シアノピロリジン、Ｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏ−（ニトロベンジル）―ヒドロキシルアミン及びε―（―ニトロ）ベンゾキシカルボニル−Ｌｙｓ−Ｐｒｏが挙げられる。その他の有用なＤＰＰ―ＩＶの阻害剤は、当業界において公知となっている（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４６２，９２８（２−４欄）、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５４３，３９６（２欄）及びＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，１２４，３０５（１，２欄）を参照）。幾つかの例は以下の通り：Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ−ｂｏｒｏＰｒｏ−なおここにおいて、Ｘ及びＹは、全てのアミノ酸残基から選択され、またｂｏｒｏＰｒｏは、プロリンのα―アミノボロン酸類縁体であって、プロリンのカルボキシル基がＢ（ＯＨ）_２基で置換されたもの；α―アミのアルキルホスホン酸の芳香族ジエステルのペプチジル誘導体；及びＮ−（置換グリシル）−２−シアノピロリジンを示すために使用する。
【００８０】
又は別の実施態様においては、ＧＬＰアンタゴニスト阻害剤は、ＧＬＰアンタゴニストに対して産生された抗体である。また更に別の実施態様においては、かかる阻害剤は、ＤＰＰ−ＩＶに対して産生された抗体である（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，２６５、５５１を参照）。例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，２６５，５５１は、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６の１０５ｋＤａ型ではなく、１７５ｋＤａ型に特異的に結合する抗体である。
【００８１】
本発明によって包含されるのは、ポリペプチドであるＧＬＰ活性化剤をコードする核酸分子である。かかる核酸は、好ましくは腫瘍特異的、組織特異的及び／又は誘導可能な転写調節配列を含んで成る哺乳動物の発現ベクター中において存在し、認められる。
【００８２】
５．３．１ＧＬＰ活性化剤を同定するための検索定量法
本発明は、例えば本発明のＧＬＰ分子の発現又は活性に対して調節的（刺激的又は抑制的）作用を及ぼす候補若しくは試験化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、小型分子又は他の医薬）からＧＬＰ活性化剤を同定する方法を提供する。
【００８３】
本発明の試験化合物は、当業界において公知であるコンビナトリアルライブラリ法における数多くのアプローチ法の如何なるもの、例えばｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｏｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ；ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ；“ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ―ｃｏｍｐｏｕｎｄ”ｌｉｂｒａｒｙ ｍｅｔｈｏｄ；及びアフィニティークロマトグラフィセレクションを用いたｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓなどを用いても得ることが出来る。生物学的ライブラリアプローチは、ペプチドライブラリに限定され、一方他の四つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小型分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ， １９９９， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ ＤｅＳ． １２：１４５）。
【００８４】
分子ライブラリの合成を行なう方法の例は、例えば以下において認められる：ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９； Ｅｒｂ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１； １１４２２； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８； Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．３３：２０５９； Ｃａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ． ３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７：１２３３。
【００８５】
化合物のライブラリは、溶液として（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， １９９２， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）。又はビーズとして（Ｌａｍ， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５４３：８２−８４）、チップとして（Ｆｏｄｏｒ， １９９３， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、バクテリアにおいて（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，２２３，４０９）、胞子において（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ５，５７１，６９８； ５，４０３，４８４；及び５，２２３，４０９）、プラスミドにおいて（Ｃｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）又はファージにおいて（Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０； Ｄｅｖｉｎ， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９： ４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３７８−６３８２；及びＦｅｌｉｃｉ、１９９１、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０）。
【００８６】
一つの実施態様において、検定定量法は、細胞を用いた検定定量法であって、かかる方法においてＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分を発現する細胞を試験化合物に接触させ、当該ＧＬＰ分子に結合する該試験化合物の能力を測定するのである。かかる細胞は、例えば酵母細胞又は哺乳動物起源の細胞である。該ＧＬＰ分子に結合できる試験化合物の能力を測定することは、例えば該試験化合物を放射性同位体又は酵素標識と結合させるに際して、該試験化合物とＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分との結合が、複合体中における標識化した化合物を検出することによって測定決定出来るように結合させることにより実施することが出来る。例えば、該試験化合物を直接的に又は間接的に^１２５Ｉ，^３５Ｓ，^１４Ｃ，又は^３Ｈで標識化させることが出来、放射線を直接カウントするか又はシンチレーションカウンティングによって当該放射性同位体を検出することが出来る。またはその代りに、試験化合物を酵素により例えば、ワサビペルオキシダ―ゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼを用いて標識化し、次いでかかる酵素標識を適当な基質の生成物への変換を定量することによって検出することが出来る。一つの好ましい実施態様においては、かかる検定定量法は、ＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分を発現する細胞を当該ポリペプチドと結合して検定定量混合物を生成する既知の化合物と接触させ、該検定定量混合物を試験化合物と接触させ、次いで該試験化合物がＧＬＰ分子と相互作用する能力を測定することから成るが、その際該試験化合物がＧＬＰ分子と相互作用する能力の測定が、当該既知化合物と比較して、該試験化合物がＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分と優先的に結合する能力を測定することから成るものである。
【００８７】
また別の実施態様においては、当該検定定量法は、ＧＬＰ分子に特徴的な活性を判定評価するに際して、当該試験化合物がＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分と結合することによって、ＧＬＰ分子の活性を変化させる（即ち、増大又は減少させる）ことを特徴とする前記方法である。
【００８８】
また別の実施態様においては、検定定量法は、ＧＬＰ分子又は生物学的活性部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、該試験化合物が当該ＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分の活性を調節する（即ち、刺激するか又は抑制・阻害する）能力を測定することから成る細胞を用いた検定定量法である。該試験化合物が当該ＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分の活性を調節する能力は、例えば当該ＧＬＰ分子が目標分子と結合するか又は相互作用する能力を測定することによって行なうことが出来る。
【００８９】
あるＧＬＰ分子が目標分子と結合するか又は相互作用する能力を測定することは、上記した、直接結合を測定するための種々の方法の一つによって行なうことが出来る。本明細書において使用する、“目標分子”成る用語は、選択したＧＬＰ分子が自然において結合するか又は相互作用する分子である。例えば、目標分子は、シグナル伝達経路の一成分であって、細胞外シグナルの細胞膜を経由した伝達及びその細胞内への伝達を容易にさせる成分、又は接触活性を有する第二の細胞内タンパク質、又は下流シグナル伝達分子とＧＬＰ分子との会合を容易にさせるタンパク質であってもよい。あるＧＬＰ分子が目標分子と結合するか又は相互作用する能力を測定することは、当該目標分子の活性を測定することによって行なうことが出来る。例えば、当該目標分子の活性は、当該目標の細胞性第二メッセンジャー（例えば、細胞内Ｃａ^２＋、ジアシルグリセリン、ＩＰ_３など）誘導を検出すること、適当な基質上での該目標の接触的／酵素的活性を検出すること、レポーター遺伝子（即ち、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸と作動可能に結合した本発明のポリペプチドに応答する調節要素）の誘導を検出すること又は例えば細胞分化又は細胞増殖など細胞応答を検出することによって測定することが出来る。
【００９０】
更なる別の実施態様においては、本発明の検定定量法は、あるＧＬＰ分子又は生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、次いで当該試験化合物がＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分と結合する能力を測定することから成る細胞を含まない検定定量法である。当該試験化合物とＧＬＰ分子との結合は、上記したように直接的又は間接的のいずれかで測定することが出来る。一つの好ましい実施態様においては、当該検定定量法は、ＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分を当該ＧＬＰ分子と結合して検定定量混合物を生成する既知の化合物と接触させ、この検定定量混合物を試験化合物と接触させ、次いで当該試験化合物が当該ＧＬＰ分子と相互作用する能力を測定することから成るに際して、該試験化合物が該ＧＬＰ分子と相互作用する能力の測定が、該試験化合物が該既知化合物と比較して優先的にＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分と結合する能力を測定することから成るものである前記検定定量法である。
【００９１】
別の実施態様においては、本発明の検定定量法は、あるＧＬＰ分子又は生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、次いで当該試験化合物がＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分の活性を調節する（例えば、刺激するか又は抑制・阻害する）能力を測定することから成る細胞を含まない検定定量法である。当該試験化合物がＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分の活性を調節する能力の測定は、例えば上記下、直接結合を測定するための方法の一つによって当該ポリペプチドが目標分子と結合する能力を測定することによって行なうことが出来る。またこれに代わる別の実施態様においては、当該試験化合物がＧＬＰ分子の活性を調節する能力の測定は、本発明のポリペプチドが更に目標分子を調節する能力を測定することによって行うことが出来る。例えば、適当な基質上における該目標分子の接触的／酵素的活性は、上記したように測定することが出来る。
【００９２】
更なる別の実施態様においては、かかる細胞を含まない検定定量法は、ＧＬＰ分子又はその生物学的活性部分を当該ＧＬＰ分子と結合して検定定量混合物を生成する既知の化合物と接触させ、この検定定量混合物を試験化合物と接触させ、次いで当該試験化合物が当該ＧＬＰ分子と相互作用する能力を測定することから成るに際して、該試験化合物が該ＧＬＰ分子と相互作用する能力の測定が、該ポリペプチドが、目標分子と結合するか又は目標分子の活性を調節する能力を測定することから成るものである前記検定定量法である。
【００９３】
本発明の上記した検定定量法に係わる一つ以上の実施態様において、該ＧＬＰ分子又は該目標分子のいずれかを固定化して、これら分子の一つ又は二つから成る複合型化合物から複合しないものを分離することを容易ならしめまた同時に当該検定定量法の自動化を容易ならしめることが望ましいであろう。候補化合物の存在下又は非存在下において試験化合物が該ＧＬＰ分子に結合すること又は該ＧＬＰ分子が目標分子と相互作用することは、かかる反応物を収容するのに適した容器において行えばよい。かかる容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管やマイクロ遠心分離管などが挙げられる。一つの実施態様においては、当該タンパク質の一つ又は二つを一つのマトリックスに結合させるような領域を付加させた融合タンパク質が提供される。例えば、グルタチオンーＳ−トランスフェラ―ゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレートに吸着させ、次いでこれを試験化合物と又は試験化合物と非吸着目標分子又はＧＬＰ分子のいずれかと併せ、次いで得られた混合物を複合物生成にいたる条件下で培養するのである（例えば、塩及びｐＨに関して生理学的条件）。培養を行った後、ビーズ又はマイクロタイタープレートウエル洗浄して、結合しない成分を全て除去し、該複合体形成を例えば上記したように直接的又は間接的に測定するのである。またはその代わりに、当該複合物をマトリックスから解離させ、結合度又は本発明のポリペプチドの活性を標準的操作法を用いて測定すればよい。
【００９４】
タンパク質を種々のマトリックスに固定化するための他の方法も本発明の検索検定定量法において使用することが出来る。例えば、ＧＬＰ分子又は目標分子のいずれかをビオチン又はストレプタブジンの共役・結合を用いて固定化することが出来る。ビオチニル化した本発明のポリペプチド又は目標分子は、ビオチンーＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシースクシンイミド）から当業界において公知である方法を用いて（例えば、ビオチニレーションキット−Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ ）調製し、次いでストレプタビジンをコートした９６ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）のウエル内に固定することが出来る。又はその代りに、該ＧＬＰ分子又は目標分子と反応性を有するが、但し本発明のポリペプチドとその目標分子との結合には妨害しない抗体をプレートのウエルに誘導化させ、次いで未結合の目標分子又は本発明のポリペプチドを抗体接合によってウエル内にトラップさせることが出来る。かかる複合物を検出するための方法は、上記したＧＳＴ固定化複合物のための方法以外に、本発明のポリペプチドに反応性を有する抗体又は目標分子を使用した複合体の免疫検出法、及び本発明のポリペプチド又は目標分子に関連した酵素活性の検出に依拠した酵素結合検定定量法がある。
【００９５】
また別の実施態様においては、本発明のＧＬＰ分子発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させて、この細胞内における選定ｍＲＮＡ又はタンパク質（即ち、ＧＬＰ分子に対応したｍＲＮＡ又はタンパク質）の発現を測定する方法によって同定するのである。候補化合物の存在下における当該選定ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを候補化合物の不存在下での該選定ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較するのである。候補化合物は、このような比較結果に基いて当該ＧＬＰ分子の発現モジュレーターとして同定することが出来る。例えば、選定ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが候補化合物の不存在下よりもその存在下において大きい（統計的に有意に大きい）場合、当該候補化合物は、選定ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激因子として同定される。又はその代わりに、選定ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが候補化合物の不存在下よりもその存在下において小さい（統計的に有意に小さい）場合、当該候補化合物は、選定ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害因子として同定される。細胞内における選定ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルは、本明細書において記載した方法によって測定される。
【００９６】
本発明のまた更に別の局面においては、ＧＬＰ分子は、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ又はｔｈｒｅｅ−ｈｙｂｒｉｄ ａｓｓａｙ（例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２３８，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；及びＰＣＴ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． ＷＯ９４／１０３００を参照）におけるＢａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎとして使用して、ＧＬＰ分子に結合するか、若しくはこれと相互作用するか又はＧＬＰ分子の活性を調節するその他のタンパク質を同定することが出来る。かかる結合性タンパク質もまた、本発明のポリペプチドによるシグナル伝播において、例えばＧＬＰ分子を含むシグナル伝達経路の上流又は下流要素として関与している可能性が高い。
【００９７】
本発明は、また更に上記した検索検定定量法によって同定された新規薬剤及び上記した種々の治療法へのその使用方法にも係わる。
【００９８】
５．４ ＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤を使用する方法
ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤は、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療するか又は予防するために患者、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは人に投与することが出来る。本発明のＧＬＰ分子又はＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤活性化剤は、これら症状の急性又は慢性のものを治療するために使用することが出来る。
【００９９】
また意図され包含されるのは、有効量のＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤を他の治療薬剤の一種又はそれ以上と組み合わせて投与することから成る併合治療法を含む予防法又は治療法である。その他の薬剤としては、例えば抗骨粗しょう症薬、ステロイドホルモン、非ステロイドホルモン、成長因子、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、インシュリン放出薬、グルカゴン分泌阻害剤、グルカゴンアンタゴニスト、概日性リズム調節剤、成長ホルモン分泌促進薬、ＩＧＦ−１濃度を上昇させる薬剤、免疫治療薬、サイトカイン、プロテアーゼ阻害剤、ビトロネクチン受容体アンタゴニスト、ビスホスホネート化合物、キナーゼ阻害剤、インテグリン受容体若しくはそのアンタゴニスト、抗肥満薬、脂質代謝改善薬、ニューロペプチドＹブロッカー、ｋａｉｎａｔｅ／ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト、β―アドレナリン受容体アゴニスト、カロリー摂取減少化合物、抗糖尿病薬、又は食事栄養素であればよい。治療薬の例としては、以下に限定されないが、表１に示すものが挙げられる。
【０１００】
表１：ＧＬＰ分子又は活性化剤と共に投与されるべきその他の治療薬：
抗骨粗しょう症薬
ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ
ｃａｌｃｉｕｍ Ｌ―ｔｈｒｅｏｎａｔｅ（例えばＣ_８Ｈ_１４Ｏ_１０Ｃａ）
ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ
ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ
ｇａｌｌｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ
ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ
ｎｏｒｅｔｈｉｎｄｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ（例えばＡＣＴＩＶＥＬＬＡとして市販されているもの）
ｏｅｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ
ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ
ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ
ステロイドホルモン
アンドロゲン（例えば、アンドロステネジオン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、ジヒドロテストステロン、７−アルファ―メチルー１９−ノルテストステロン酢酸塩、メタンドロイル、オキシメトロン、オキシメステロン、ノルドロロンフェニルプロピオン酸塩、ノルエタンドロロン）
グルココルチコイド
エストロゲン性ホルモン（例えばＰＲＥＭＡＲＩＮとして市販されているもの）
プロジェスチン
非ステロイドホルモン
カルシトニン
カルシトリオール
成長ホルモン（例えば破骨細胞活性化因子）
メラトニン
副甲状腺ホルモン
プロスタグランジン
甲状腺ホルモン
成長因子：
上皮成長因子
線維芽細胞成長因子
インシュリン様成長因子Ｉ
インシュリン様成長因子ＩＩ
血小板由来成長因子
血管内非成長因子
選択的エストロゲン受容体モジュレーター：
ＢＥ−２５３２７
ＣＰ−３３６１５６
ｃｌｏｍｅｔｈｅｒｏｎｅ
ｄｅｌａｍａｄｉｎｏｎｅ
ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ
ｉｄｏｘｉｆｅｎｅ
ｎａｆｏｘｉｄｉｎｅ
ｎｉｔｒｏｍｉｆｅｎｅ
ｏｒｍｅｌｏｘｉｆｅｎｅ
ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ（例えばＥＶＩＳＴＡとして市販されているもの）
ｔａｍｏｘｉｆｅｎｅ
ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ
ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ
［２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−ヒドロキシナフタレンー１―イル］［４−［２―（１−ピぺリジニル）―エトキシ］フェニル］メタン
インシュリン放出薬：
ＧＬＰ−１
ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ
ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ（例えばＰＲＡＮＤＩＮＥとして市販されているもの）
スルホニル尿素（例えば、ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ，ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ，ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）
バゾプレッシン
グルカゴン分泌阻害剤：
ソマトスタチン
グルカゴンアンタゴニスト：
位置１，２、３−５、９−１１、２１又は２９においてアラニン残基を有する置換グルカゴン
ｄｅｓ−Ｈｉｓ^１−Ａｌａ^２グルカゴン
ｄｅｓ−Ｈｉｓ^１−［Ａｌａ^２、１１ −Ｇｌｕ ^２１ ］グルカゴン
概日性リズム調節薬：
アルキレンジオキシベンゼンアゴニスト
メラトニン
ニューロペプチドＹ
タキキニンアゴニスト
可視光線治療
成長ホルモン分泌促進薬：
シクロアルカノ［ｂ］チエン−４−イル尿素
ＧＨＲＰ−１
ＧＨＲＰ−６
成長ホルモン放出因子
ｈｅｘａｒｅｌｉｎ
チオ尿素
Ｂ−ＨＴ９２０
ベンゾ融合ラクタム（例えば、Ｎ−ビフェニル−３―アミド置換ベンゾラクタム）
ベンゾ融合マクロサイクル（例えば、２−置換ピペリジン類、２−置換ピロリジン類、２−置換ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン類、ジ置換ピペリジン類、ジ置換ピロリジン類、ジ置換ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン類、トリ置換ピペリジン、トリ置換ピロリジン類、トリ置換ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン類、Ｌ−ピログルタミル−ピリジルアラニル−Ｌ−プロリンアミド）
ＩＧＦ−１濃度を増加させる薬剤：
Ｌ−アセチルカルニチン
Ｌ−イソバレリルカルニチン
Ｌ−プロピオニルカルニチン
免疫治療薬剤：
抗体
免疫修飾物質
サイトカイン：
内皮単球活性化タンパク質
顆粒球コロニー刺激因子
インターフェロン（例えば、ＩＦＮ―γ）
インターロイキン（例えば、ＩＬ―６）
リンホカイン
リンホトキシンーα
リンホトキシンーβ
腫瘍壊死因子
腫瘍壊死因子様サイトカイン
マクロファージ炎症タンパク質
単球コロニー刺激因子
４−ＩＢＢＬ
ＣＤ２７リガンド
ＣＤ３０リガンド
ＣＤ４０リガンド
ＣＤ１３７リガンド
Ｆａｓリガンド
ＯＸ４０リガンド
プロテアーゼ阻害剤：
システインプロテアーゼ阻害剤（例えば、ビニルスルホン、ペプチジルフルオロメチルケトン、シスタチンＣ，）シスタチンＤ，Ｅ−６４）
ＤＰＰＩＶアンタゴニスト
ＤＰＰＩＶ阻害剤（例えば、Ｎ−（置換グリシル）−２−シアノピロリジン類、Ｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｏ−ニトロベンジルーヒドロキシルアミン及びε―（４−ニトロ）ベンゾキシカルボニル）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ）
セリンプロテアーゼ阻害剤（例えば、アザペプチド、ＢＭＳ２３２６３２、ａｎｔｉｐａｉｎ，ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）
ビトロネクチン受容体アンタゴニスト：
抗ビトロネクチン受容体抗体（例えば２３Ｃ６）
シクローＳ，Ｓ−Ｎ α―アセチルーシステニル−Ｎアルファ−メチル−アルギニル−グリシル−アスパルチル−ペニシラミン
ＲＧＤ−含有ペプチド（例えばｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ）
ビスホスホネート化合物：
ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ（例えばＦＯＳＡＭＡＸとして市販されているもの）
アミノアルキルビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ，ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ（３−ａｍｉｎｏ−１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌｉｄｏｎｅ）ｂｉｓｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｓｏｉｄｕｍ，ｐａｍｉｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ（１−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−（３−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ，ＹＭ１７５［（ｃｙｃｌｏｈｅｐｔｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ］，ｐｉｒｉｄｒｏｎａｔｅ，ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｅｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ，ｔｉｌｕｄｒｏｎａｔｅ，ＢＭ−２１０９５５，ＣＧＰ−４２４４６，ＥＢ−１０５３）
ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ（例えばＡＣＴＯＮＥＬとして市販されているもの）
キナーゼ阻害剤：
ローキナーゼ阻害剤（例えば、（（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−１−（４−ｐｙｒｉｄｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ，ｔｒａｎｓ−Ｎ−（１Ｈ−ｐｙｒｒｏ［２，３−ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ）−４−ｇｕａｎｉｄｉｎｏｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ，１−（５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒｉｚｉｎｅ，１−（５−ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）
インテグリン受容体：
α ｓｕｂｕｎｉｔ（例えば、ｓｕｂｔｙｐｅ １−９，Ｄ，Ｍ，Ｌ，Ｘ，Ｖ，ＩＩｂ，ＩＥＬｂ）
β ｓｕｂｕｎｉｔ（例えば、ｓａｕｂｔｙｐｅ １−８）
インテグリン受容体アアンゴニスト：
ｅｔｈｙｌ ３（Ｓ）−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−６−ｙｌ）−３−｛２−ｏｘｏ−３−［３−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ］−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ―１−ｙｌ｝−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ； ｅｔｈｙｌ ３（Ｓ）−（３−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２−ｏｘｏ−３−（Ｓ ｏｒ Ｒ）−［３−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ］−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；ｅｔｈｙｌ ３（Ｓ）−（３−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２−ｏｘｏ−３−Ｒ ｏｒ Ｓ）−［３−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ］−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ； ３（Ｓ）−（２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ−６−ｙｌ）−３−｛２−ｏｘｏ−３−［３−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ］−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ―１−ｙｌ｝−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ； ３（Ｓ）−（３−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２−ｏｘｏ−３−（Ｓ ｏｒ Ｒ）−［３−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ］−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ；３（Ｓ）−（３−ｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（２−ｏｘｏ−３Ｒ ｏｒ Ｓ）−［３−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−［１，８］ｎａｐｈｔｈｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−ｐｒｏｐｙｌ］−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ。
抗肥満薬：
ベンズフェタミン（例えばＤＩＤＲＥＸとして市販されているもの）
ベンジルイソプロピルアミン（例えばＩＯＮＡＭＩＮＥとして市販されているもの）
ブプロピオン
デクスフェンフルラミン（例えばＲＥＤＥＸとして市販されているもの）
デクストロアンフェタミン（例えばＤＥＸＥＤＲＩＮＥとして市販されているもの）
ジエチルプロピオン（例えばＴＥＮＵＡＴＥとして市販されているもの）
ジメチルフェネチルアミン（例えばＡＤＩＰＥＸ又はＤＥＳＯＸＹＮとして市販されているもの）
エボダミン
フェンフルラミン（例えばＰＯＮＳＩＭＩＮとして市販されているもの）
フルオキセチン
マジンドール（例えばＳＡＮＯＲＥＸ又はＭＡＺＡＮＯＲとして市販されているもの）
メタンフェタミン
ナルトレクソン
オーリスタット（例えばＸＥＮＩＣＡＬとして市販されているもの）
フェンジメトラジン（例えばＢＯＮＴＲＩＬ又はＰＬＥＧＩＮＥとして市販されているもの）
フェンテンミン（例えばＦＡＳＴＩＮとして市販されているもの）
シブトラミン（例えばＭＥＲＩＤＩＡとして市販されているもの）
脂質代謝改善薬：
カプサイシン
ニューロペプチドＹブロッカー：
ＮＧＤ−９５−１
ｋａｉｎａｔｅ／ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト：
β―アドレナリン受容体アゴニスト：
カロリー摂取を低減させる薬剤：
脂肪代替物（例えばＯＬＥＳＴＲＡとして市販されているもの）
スクロース代替物（例えばＡＳＰＡＲＴＡＭＥとして市販されているもの）
抗糖尿病薬：
ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｌａｒｇｉｎｅ（例えばＬＡＮＴＵＳとして市販されているもの）
ｐｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ（例えばＡＣＴＯＳとして市販されているもの）
ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ ｍａｌｅｔｅ（例えばＡＶＡＮＤＩＡとして市販されているもの）
食事栄養素：
スクロース
食事中脂肪酸
トリグリセライド
オリゴサッカライド類（例えば、フラクトーオリゴサッカライド類、ラフィノース、ガラクト―オリゴサッカライド類、キシローサッカライド類、ビートシュガーや大豆）
タンパク質
ビタミン（例えばビタミンＤ）
ミネラル（例えばカルシウム、マグネシウム、リンや鉄）
【０１０１】
その他の治療薬剤も既に開示されているように製造され且つ種々の用量で使用することが出来る。例えば、抗骨粗しょう症薬（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ２，５６５，１１５及び２，７２０，４８３を参照），非ステロイドホルモン（例えばＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ６，１２１，２５３； ３，９２７，１９７； ６，１２４，３１４を参照）、グルカゴンアンタゴニスト（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，５１０，４５９を参照）、成長ホルモン分泌促進薬（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．３，２３９，３４５； ４，０３６，９７９； ４，４１１，８９０； ５，２０６，３２５； ５，２８３，２４１； ５，２８４，８４１； ５，３１７，０１７； ５，３７４，７２１； ５，４３０，１４４； ５，４３４，２６１； ５，４３８，１３６； ５，４９４，９１９； ５，４９４，９２０；及び５，４９２，９１６； Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．１４４，２３０及び５１３，９７４， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｉｔｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ８９／０７１１０； ＷＯ８９／０７１１１； ＷＯ９３／０４０８１； ＷＯ９４／０７４８６； ＷＯ９４／０８５８３； ＷＯ９４／１１０１２； ＷＯ９４／１３６９６； ＷＯ９４／１９３６７； ＷＯ９５／０３２８９； ＷＯ９５／０３２９０； ＷＯ９５／０８５８３； ＷＯ９５／１１０２９； ＷＯ９５／１２５９８； ＷＯ９５／１３０６９； ＷＯ９５／１４６６６； ＷＯ９５／１６６７５； ＷＯ９５／１６６９２； ＷＯ９５／１７４２２； ＷＯ９５／１７４２３； ＷＯ９５／３４３１１；及びＷＯ９６／０２５３０を参照）、ＩＧＦ−１濃度を増加させる薬剤（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，１６６，０７７を参照）、サイトカイン（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９２１，６９７を参照）、ビトロネクチン受容体アンタゴニスト（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２３９，１３８及びＨｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９５：３６８を参照）、ビスホスホネート化合物（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，４０９，９１１を参照）、キナーゼ阻害剤（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１８，４１０を参照）、及びインテグリン受容体又はそのアンタゴニスト（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，２１１，１９１を参照）などである。
【０１０２】
又はその代りに、他の治療薬剤は、経験的に決定されたように製造され且つ種々の用量で使用することが出来る。
【０１０３】
５．５ 本発明の組成物の治療的／予防的投与
ＧＬＰ分子及びＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤活性化剤は、ヒト及び家畜用医薬において有利に有用である。上記したように、本発明の化合物は、患者における骨関連疾患及び栄養素関連疾患を治療するか又は予防するために有用である。
【０１０４】
ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤は、患者に投与する場合好ましくは、選択的には薬学的に許容可能な担体又はヒヒクルを含んで成る組成物の一成分として投与する。好ましい実施態様においては、かかる組成物は、経口投与される。
【０１０５】
経口投与のための組成物は、胃腸管内での劣化から当該組成物を保護するために腸溶コーティングを必要とする可能性がある。別の例においては、当該組成物は、腸内で暴露されたＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤を分解酵素から防止し、当該分子の循環系内への輸送を容易にし且つ当該分子の細胞膜を経由した細胞内部位へのデリバリーを行うためにリポソーム製剤として投与することが出来る。
【０１０６】
経口投与のためのＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤は、崩壊を遅延させるか又は当該ＧＬＰ分子の胃腸管内での吸収を行わせる物質（例えば、グリセリンモノステアレート又はグリセリンジステアレート）でコーティングするか又は混合する。即ち、例えば、ＧＬＰ分子の徐放は、数時間に渉って行うことが出来るのであり、必要ならば、当該ＧＬＰ分子は、胃腸管内での劣化。分解から保護することが出来る。胃腸管に沿ってｐＨや酵素条件が変動することを利用して、経口投与のための医薬組成物は、胃腸管の特定の部位においてＧＬＰ分子の遊離・放出を容易ならしめるように処方・製剤化することが出来る。
【０１０７】
浸透圧によるアクティブ駆動性のある化合物を囲む選択的透過性膜も、経口投与される組成物に適している。カプセルを囲む環境からの流体は、かかるアクティブ駆動性化合物によって吸収され、その結果膨潤して開口部からＧＬＰ分子を排置して、直接放出製剤が持つスパイク上のプロファイルではなく実質的にゼロ次元のデリバリープロファイルを賦与することになる。以下に限定されないが、例えばグリセリンモノステアレートのような時間遅延物質もまた使用することが出来る。
【０１０８】
適当な医薬担体としては、デンプン、グルコース、乳糖、スクロース、ゼラチン、食塩水、ガムアカシア、タルク、ケラチン、尿素、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレングリコール、水及びエタノールが挙げられる。所望ならば、かかる担体は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。更に、補助剤として安定化剤、粘着剤、滑剤や着色剤も使用してもよい。かかる組成物は、伝統的なバインダーやトリグリセライドなどの担体とともに坐薬に製剤化することも出来る。
【０１０９】
ＧＬＰ分子又はＧＫＰ活性化剤を含んで成る医薬組成物は、以下に限定されないが例えば経口、静脈内注入、皮下注射、筋肉内、局所的、デポ注射、インプラント、徐放モードや腔内投与など一つ又はそれ以上の経路を介してとうよすることが出来る。かかる医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるように製剤化される。投与経路の例としては、非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、被膜内、脊椎内、胸骨内、腫瘍内、鼻腔内、硬膜外、動脈内、眼内、眼窩内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（特に耳、鼻、目又は皮膚への局所）、経粘膜（例えば経口）、鼻腔内、直腸内、脳内、膣内、舌下、粘膜下や経皮膚などの投与が挙げられる。
【０１１０】
投与は、当業界の医師によって有効であると知られている経路であれば如何なる経路によっても行うことが出来る。非経口投与、例えば、栄養経路によらない投与は、滅菌注射器、選択的にはペン状注射器、又は注入ポンプなどのその他の機械装置を用いて、製剤を体内に皮下、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、皮内、被膜内、脂肪内又は静脈内投与することによって行うことが出来る。更なる選択肢は、鼻腔内又は肺内噴霧剤としての投与に適した粉剤又は液剤である組成物である。また更なる選択肢としては、かかる投与は、経皮により、例えばパッチから行ってよい。経口、口内又は膣内投与に適した組成物もまた提供することが出来る。
【０１１１】
一つの実施態様においては、本発明の医薬組成物は、徐放性システムによって送達される。例えば、かかる医薬組成物は、静脈内注入、インプラント可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム又はその他の投与様式により投与することが出来る。一つの実施態様に於いては、ポンプを使用することが出来る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３； Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ．１４：２０１； Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０， Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７； Ｓａｕｄｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｎ， Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照）。また別の実施態様においては、当該化合物は、小のうによって、特にリポソーム内にて送達することも出来る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−３３； Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９， ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｋｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ）， Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ３５３−６５； Ｌｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、 ｉｂｉｄ， ｐｐ３１７−２７； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１／０４０１４； Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，７０４，３５５を参照）。別の実施態様においては、ポリマー材料を使用することが出来る（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）， ＣＲＣＰｒｅｓｓ： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４； Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｃｎｅ， Ｓｍｏｌｅ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．）， Ｗｉｌｅｙ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４）； Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ， １９５３， Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１； Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０； Ｄｕｒｉｎｇｅｔ ａｌ．，１９８９， Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｌ．， ２５：３５１； Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５を参照）。
【０１１２】
更なる別の実施態様においては、徐放システムが、目標の近傍に設置することが出来る。例えば、マイクロポンプが、徐放性製剤を骨又は脂肪組織内に直接送達し、かくして全身用量の一部分しか必要でなくすることが出来るのである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４， ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｔｎｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ｖｏｌ．２， ｐｐ．１１５−１３８を参照）。また別の例においては、本発明の医薬組成物は、ヒドロゲルと共に製剤化できる（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ．５，７０２，７１７； ６，１１７，９４９； ６，２０１，０７２を参照）。
【０１１３】
一つの実施態様においては、本発明の医薬組成物を局所的に、即ち治療を必要とする領域に投与することが出来る。局所投与は、例えば手術中に局所注入、局所投与（例えば、種々後の創傷包帯と組み合わせてなど）、注射、カテーテル、坐薬、又はインプラントにより行うことが出来る。インプラントは、多孔質、非多孔質又はゼラチン質材料製であり、例えば唾液分泌性膜などの膜又は繊維を含む。
【０１１４】
幾つかの実施態様においては、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤を適当な経路で、例えば心室内、鞘内又は硬膜外注射などにより中枢神経系内に導入することも望ましい。心室内注射は、心室内カテーテルを例えばＯｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒなどの貯蔵容器に接続することによって簡便容易にすることが出来る。
【０１１５】
肺内投与もまた、例えば吸入器又は噴霧装置を用いて、またエアロゾル化剤を用いた製剤により又はフルオロカーボン若しくは合成肺界面活性剤中での灌流によっても用いることが出来る。
【０１１６】
一つの実施態様においては、本発明は、インビトロ又はインビボで増殖するように再生されたか又は刺激された移植細胞で、その後にレシピエントに再移植又は異種移植する移植細胞を用いて患者を治療する方法を提供する。生体外での細胞のコンディショニング・調整は、移植するべき細胞又は組織を成長促進量の調合物を添加するか又はかかる細胞の培養に適したものである培地において増殖させることによって行うことが出来る。かかる細胞は、適当なコンディショニング期間経過の後直接患者の体内に移植するか又は確立されている細胞カプセル化技術を用いてカプセル化し、その後移植することが出来る。
【０１１７】
通常の技術に通暁した技術者ならば、投与法を選択する際の具体的な利点及び不利を理解できるはずである。多重の投与法も本発明によって包含される。例えば、本発明のＧＬＰ分子は、皮下注射によって投与することが出来るが、他の治療薬剤は、静脈内注入によって投与することが出来る。更には、一種又はそれ以上のＧＬＰを、他の治療薬剤と併用又は使用することなく、同時に投与する（即ち、共投与）か又は経時的に投与することが出来る。別の実施態様においては、他の治療薬剤を併用するか使用しない場合のＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の投与期間は、重なりあってもよい。例えば、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤は、７日間投与し、別の治療薬剤は、ＧＬＰ治療の５日目に開始して導入することも出来る。他の治療薬による治療は、ＧＬＰ治療の７日目を過ぎても継続することが出来る。
【０１１８】
ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の医薬組成物は、一つ又はそれ以上の治療薬剤の投与の前、投与中及び／又は投与後においても投与することが出来る。一つの実施態様においては、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤は、先ずインシュリンの発現を刺激するために投与し、次いでこれによって治療薬剤によるその後の作用に対して感受性が高まる。また別の実施態様においては、治療薬剤の投与の後でＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤を投与することが出来る。更なる別の実施態様では、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の投与と一つ又はそれ以上の治療薬剤の投与との間に重複期間が存在してもよい。
【０１１９】
本発明の医薬組成物は、午前、午後、夕方又は一日中投与することが出来る。ある一つの実施態様においては、該医薬組成物は、概日性リズムの特定のフェーズにおいて投与することが出来る。一つの具体的な実施態様においては、該医薬組成物は、午前中に投与することが出来る。別の具体的な実施態様においては、該医薬組成物は、人工的に誘導させた一定の概日性リズム状態で投与される。
【０１２０】
本発明の組成物は、溶液、分散液、乳化液、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体含有カプセル、粉剤、徐放性製剤、坐薬、エアゾル、噴霧剤、又はその他如何なる使用に適した剤型の形状とすることが出来る。一つの実施態様においては、薬学的に許容可能なビヒクルはカプセルである（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６９８，１５５を参照）。適当な薬学的担体のその他の例は、参照文献として本明細書に合体する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａｌｆｏｎｓｏ，Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐ．Ａ．，１９^ｔｈ ｅｄ．， １９９５， ｐｐ． １４４７ ｔｏ １６７６において記載されている。
【０１２１】
従って、本明細書において記載された医薬組成物は、経口投与錠剤、カプセル、エリキシジル、シロップなどの形状とすることが出来る。
【０１２２】
例えば、錠剤又はカプセルの形状の経口投与を行うことについては、有効成分は、経口投与の、無毒性で、薬学的に許容可能で、不活性な担体、例えば−但し以下に限定されないが−乳糖、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸ジカルシウム、硫酸カルシウム、マンニトールやソルビトールなどと混合合体することが出来る。液体形状での経口投与については、かかる経口投与医薬成分を経口投与の、無毒性で、薬学的に許容可能で、不活性な担体、例えば−但し以下に限定されないが−エタノール、グリセリンや水などと混合合体することが出来る。更には、適当な結合剤、滑剤、崩壊剤や着色剤もかかる混合物中に混入することが出来る。適当な結合剤としては−但し以下に限定されないが−、デンプン、ゼラチン、天然砂糖（例えば、グルコース、ベーターラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成のガム類（例えば、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール及びワックス類が挙げられる。経口投与される医薬に適した滑剤は、例えば−但し、以下に限定されないが−オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化］ナトリウムが挙げられる。崩壊剤としては、例えば−但し、以下に限定されないが−デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト及びキサンタンガムが挙げられる。
【０１２３】
経口投与に適合せしめられた医薬組成物は、例えばカプセル又は錠剤；粉剤又は顆粒剤；溶液；シロップ又は分散液（水性又は非水性液体中における）；可食可能泡沫又はホイップ；又は乳化液として提供することが出来る。錠剤又はカプセル形状での経口投与については、有効医薬成分は、経口投与の、無毒性で、薬学的に許容可能で、不活性な担体、例えば−但し以下に限定されないが−乳糖、デンプン、スクロース、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸ジカルシウム、硫酸カルシウム、マンニトールやソルビトールなどと混合合体することが出来る。ソフトカプセル形状での経口投与については、有効医薬成分は、経口投与の、無毒性で、薬学的に許容可能で、不活性な担体、例えば−但し以下に限定されないが−植物油、ワックス類、脂肪、半固体及び液体のポリオールと混合合体することが出来る。液状での経口投与については、経口投与の、無毒性で、薬学的に許容可能で、不活性な担体、例えば−但し以下に限定されないが−エタノール、グリセリン、ポリオールや水などと混合合体することが出来る。更には、適当な結合剤、滑剤、崩壊剤及び着色剤も掛かる混合物中に混入することが出来る。適当な結合剤としては−但し以下に限定されないが−、デンプン、ゼラチン、天然砂糖（例えば、グルコース、ベーターラクトース）、コーン甘味剤、天然及び合成のガム類（例えば、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール及びワックス類が挙げられる。経口投与される医薬に有用な滑剤は、例えば−但し、以下に限定されないが−オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナと折りウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムが挙げられる。崩壊剤としては、例えば−但し、以下に限定されないが−デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト及びキサンタンガムが挙げられる。
【０１２４】
経口投与される組成物は一種又はそれ以上の、例えば−但し以下に限定されないが−フルクトース、アスパルテームやサッカリンなどの甘味剤を含有してもよい。経口投与される組成物は一種又はそれ以上の、例えば−但し以下に限定されないが−ペッパーミント、ウインターグリーンの油やチェリーなどの芳香剤を含有してもよい。経口投与される組成物はまた、着色剤及び／又は保存剤を含有してもよい。
【０１２５】
ＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤は、リポソームデリバリー系．例えば小型のユニラメラー小胞、大型のユニラメラー小胞やマルチラメラー小胞などとして投与する事も出来る。リポソームは、種々のリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンなどから形成することが出来る。種々のカチオン性脂質、例えば−但し、以下に限定されない−塩化Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）―Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（“ＤＯＴＭＡ”）や−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（“ＤＯＰＥ”）―Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムを本発明に従って使用することが出来る。かかる組成物は、かかる投与形式に適合するものである。
【０１２６】
ＧＬＰ分子およびＧＬＰ活性化剤もまた、当該ＧＬＰ分子やＧＬＰ活性化剤を結合することが出来る個別の担体としてモノクローナル抗体とを用いて送達することが出来る。該ＧＬＰ分子およびＧＬＰ活性化剤はまた、ターゲッティング可能であるか要請ポリマーと結合させることが出来る。かかるポリマーとしては例えばポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミドーフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドーフェノール又はパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドーポリリジンが挙げられる。更には、かかるＧＬＰ分子およびＧＬＰ活性化剤は、薬物の徐放を行ううえで有用である一群の生分解性ポリマー、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、ポリーイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリルエステルやヒドロゲルの架橋又は両性ブロックコポリマーに結合させることも出来る。
【０１２７】
非経口投与に適合せしめた医薬組成物としては、例えば−但し、以下に限定されないが−抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および当該医薬組成物を意図したレシピエントの血液と実質的に等張性とする溶解質を含有する水性および非水性の無菌の注射溶液又は懸濁液が挙げられる。かかる医薬組成物中において存在してもよいその他の成分としては、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物性油が挙げられる。非経口投与に適合せしめられた組成物は、単回投与又は多回投与容器（例えば、密封アンプルやバイアル）に充填して提供するこが出来、また使用直前に無菌の液体担体の添加を必要とする凍結乾燥した（例えばリオフィライズした）状態で保存することが出来る。即時注射溶液は、無菌粉剤、顆粒剤や錠剤から調製することが出来る。
【０１２８】
経皮投与に適合せしめられた医薬組成物は、長期間表皮と密着した状態に留まるものとした離散的パッチとして提供することが出来る。局所投与に適合せしめられた医薬組成物は、例えば、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉剤。溶液剤、ペースト、ゲル、噴霧剤、エアロゾル又は油剤として提供することが出来る。局所投与軟膏又はクリームは、好ましくは皮膚、口、目又はその他の外部組織に局所投与するために使用する。軟膏に製剤化した場合、有効成分は、パラフィン性又は水混合性軟膏基剤と共に使用することが出来る。又はその代りに、水中油型又は油中水型の基剤を用いてクリームに製剤化することが出来る。
【０１２９】
目への局所投与に適合せしめられた医薬組成物は、例えば目薬又は注射可能な医薬組成物である。これらの医薬組成物においては、有効成分は、適当な担体、例えばカルボキシメチルセルロースを含むか又は含まない水性溶媒などに溶解するか又は懸濁させることが出来る。口内への局所投与に適合せしめられた医薬組成物としては、例えばトローチ、香剤やマウスウオッシュが挙げられる。
【０１３０】
経鼻投与に適合せしめられた医薬組成物は、固体担体、例えば粉末（好ましくは粒径が２０乃至２００ミクロンである）を含んで成っていてもよい。粉剤は、例えば鼻の近傍に保持した容器から鼻を経由した急速吸入など吸薬が摂取される態様で投与することが出来る。又はその代わりに、経鼻投与に適合せしめられた医薬組成物は、例えば、鼻腔噴霧剤又は経鼻薬など液体担体を含んで成っていてもよい。かかる医薬組成物は、ＧＬＰ分子の水溶液又は油溶液を含んで成っていてもよい。吸入投与組成物は、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の規定用量を供与尾するような構造とした、特別に適合した容器、例えば−但し、以下に限定されない−加圧エアロゾル、噴霧器又は吸入器などに入れて供給される。
【０１３１】
直腸投与に適合せしめられた医薬組成物は、坐薬又は浣腸として提供することが出来る。膣内投与に適合せしめられた医薬組成物は、例えばペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム剤又は噴霧剤として提供することが出来る。
【０１３２】
坐薬は通常は、有効成分を０．５乃至１０重量％の範囲で含有する。経口組成物は好ましくは、１０乃至９５重量％の有効成分を含有する。好ましい実施態様においては、当該組成物は、ヒトに対して腫瘍内注入、皮下注射又は静脈内投与するに適合せしめられた医薬組成物としての常法に従って製剤化する。
【０１３３】
典型的には、注射又は静脈内投与に適合せしめられた医薬組成物は、無菌の等張性水性緩衝液を用いた溶液である。必要に応じて、該組成物は、可溶化剤や注射部位における痛覚を和らげる局所麻酔剤、例えばリドカインを含む。通常は、かかる配合成分は、単位投与剤形中に別々に又は一緒に混合して、例えばアンプルや小型袋など気密容器内に入れた乾燥凍結粉末又は無水濃縮・濃厚剤として提供される。
【０１３４】
当該組成物を注入により投与する場合は、無菌の医薬グレードの水、食塩水、又はその他受容可能な希釈剤を含有する点滴ビン、袋又はその他の受容可能な容器と共に処方される。該組成物を注射により投与する場合は、注射用の無菌水又は食塩水のアンプルを提供して、投与前にこれらの成分を混合するようにすることが出来る。
【０１３５】
ＧＬＰ分子、ＧＬＰ活性化剤及び選択的な他の治療薬剤は、有効投与量を投与する。患者治療に最も適した用量設定及び治療法は、治療するべき疾患及び症状並びに患者の体重やその他にパラメータによっても変わる。
【０１３６】
有効な用量設定及び治療プロトコールは、従来公知の手段、例えば実験動物での低用量での開始、効果（例えば、組織学、疾患活性度スコアーなど）のモニターを伴なう用量の増加及び用量設定の全身的な変更などの段階を含んで成る手段によって決定することが出来る。特定の患者への最適用量を決定するに際しては、幾つかの要因が臨床家により考慮される。かかる要因の中でも主要な要因は、血漿中で通常循環するＧＬＰ分子の量であり、ＧＬＰペプチドの場合、安静時においてはほぼ１５０ｐｍ／ｍｌであり、また健常な成人の場合食事摂取後では２２５ｐｍｏｌ／ｍｌにまで上昇する（Ｏｒｓｋｏｖ ａｎｄ Ｈｏｌｓｔ， １９８７， Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．４７：１６５）。
【０１３７】
その他の要因としては、例えば−但し以下に限定されないが−患者の体形、患者の年齢、患者の全身症状、治療するべき特定の疾患、疾患の重篤度、患者体内での他の医薬の存在やインビボでのＧＬＰ分子の活性度などが挙げられる。
【０１３８】
テスト用量は、動物実験及び臨床実験文献の結果を考慮して選択される。当業者ならば、インビトロＧＬＰ結合競争試験から得られる結合定数及びＫｉなどの乗法も用量を算定するうえで有用であることが理解出来るであろう。
【０１３９】
ＧＬＰ分子又はＧＬＰ分活性化剤の典型的なヒトの有効投与量は、ほぼ１０μｇ／ｋｇ体重／日からほぼ１０ｍｇ／ｋｇ体重／日まで、好ましくはほぼ５０μｇ／ｋｇ体重／日からほぼ５ｍｇ／ｋｇ体重／日まで、また最も好ましくはほぼ１００μｇ／ｋｇ体重／日からほぼ１ｍｇ／ｋｇ体重／日までとなるであろう。本明細書において開示されたＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤の類縁体は、天然型のものよりも２乃至１００倍強力であるので、かかるＧＬＰ類縁体の投与量は、これよりも低くてよく、例えばほぼ１００ｎｇ／ｋｇ体重／日からほぼ１ｍｇ／ｋｇ体重／日まで、好ましく１μｇ／ｋｇ体重／日から５００μｇ／ｋｇ体重／日まで、またさらにより好ましくは１μｇ／ｋｇ体重／日から１００μｇ／ｋｇ体重／日までであればよい。
【０１４０】
別の実施態様においては、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の有効投与量は、１０μｇ／ｋｇ体重／日以下であり、さらに別の実施態様においては、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の有効投与量は、１０μｇ／ｋｇ体重／日以上である。
【０１４１】
特定の患者の具体的投与量は勿論のことながら、応答度、投与経路、患者の体重や患者の全身症状に対して調節されねばならず、最終的には治療担当医師の判断に依存する。
【０１４２】
５．６遺伝子治療
遺伝子治療アプローチもまた、本発明に従って用いて、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の発現を調節し又従った、骨関連疾患及び栄養素関連疾患を治療することが出来る。
【０１４３】
遺伝子治療の方法として当業界において利用可能な如何なる方法をも、本発明に従って使用することが出来る（例えば、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ． １２：４８８−５０５； Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏ．， ３：１１０−１１４； Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒ， １９９３， Ｈｕｍ．Ｇｅｇｅ Ｔｈｅｒ．４：１２９−１４１； Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９３， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６； ａｎｄ Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９３：６４４−６５１； Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．１９９４， Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３などを参照。なおこれらは全て、本明細書に参考文献として合体される）。
【０１４４】
大型哺乳類動物における疾患を改善するために遺伝子治療ベクターの長期にわたる有効な使用が、既に実証されている。例えば、網膜色素上皮における遺伝子（ＲＰＦ６５）の変異に起因して盲目を招来する症状であるＬｅｂｅｒ先天性黒内症障に罹患したイヌに天然型遺伝子を含有するＡＡＶを投与したところ、遺伝子障害が成功裡に修復されている（Ａｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２）。天然型ＲＰＥ６５遺伝子の発現は、ＲＴ ＰＣＲによって確かめられており、機能の修復は、網膜の電気生理学的研究並びに治療を受けてイヌの公平な観察実験によって実証されている。かかる治療が、少なくとも４ヶ月間は有効であったことが判っている。
【０１４５】
血友病に罹患したイヌを治療するために第ＩＸ因子をコードするＡＡＶを筋肉内投与したことについて報告されている（Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：５６）。第ＩＸ因子をコードするＡＡＶの投与は、治療を受けたイヌにおいて１７ヶ月間血液凝固時間を有意に低下させることが判明している。即ちかかる実例によって、遺伝子治療が、当業界において公知である治療法を使用することによって大型動物モデルにおいて失われた遺伝子機能を修復させるのに使用することが出来ることが判っているのである。
【０１４６】
遺伝子治療とは、患者に発現した又は発現可能な核酸を投与することによって行われる治療を言う。遺伝子治療は、遺伝子構築物を組織培養の細胞又はインビボ細胞に導入することから成る。
【０１４７】
レシピエントの細胞又は異種細胞をＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤一種以上又はＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤と他の治療薬剤との組み合わせを発現させるように操作することが出来る。ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤をコードする核酸配列をインビとロで細胞に導入するための方法（例えば、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：５９２４を参照）は、例えば−但し、以下に限定されないが−エレクトロポレーション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リン酸カルシウム−介在トランスフェクション、リポソーム介在トランスファーやウイルス感染などがある。
【０１４８】
かかる体外治療実験計画書は、ＤＮＡを種々の異なる細胞型、例えば−但し、以下に限定されないが−表皮細胞（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，８６８，１１６： Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， ＷＯ８７／００２０１； Ｍｏｒｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１４７６−１４７９； Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９８０，２８６），上皮細胞（ＷＯ８９／０５３４５）、線維芽細胞（Ｐａｌｍｅｒｅｔ ａｌ，１９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８４：１０５５−１０５９； Ａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．４：１１−０； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１５７５−１５７８； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，９６３，４８９），リンパ球（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３９９，３４６； Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０）及び造血幹細胞（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８６：８８９２−８８９６； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３９９，３４６）などにトランスファーさせるために使用することが出来る。
【０１４９】
従って、如何なるＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤を産生する細胞株を創製するために遺伝子治療を使用することが出来るのである。更には、細胞を操作して、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤を単独で又は他の治療薬剤、例えば−但し、以下に限定されないが−ペプチドホルモン（例えば、ＩＧＦ―１、ＩＧＦ―２又は成長ホルモン）などと組み合わせて産生させることが出来る。かかる細胞は、実験動物体内においてインプラントとして増殖させるか又は組織培養中で増殖させることが出来る。例えば遺伝子情報をヒト体内に導入するのに適したウイルスベクターを含む種々のウイルス性ベクターを用いて、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤及び／又は他の治療薬剤をコードする構築物を導入することが出来る。一旦遺伝学的に変異させると、かかる操作細胞は、当業界において公知である操作法を用いて被験者に投与することが出来ることになる。
【０１５０】
又はその代わりに、遺伝子治療を用いて、レシピエントの細胞をインビボでトランスフェクトさせることが出来る。インビボで細胞をトランスフェクトさせるベクターを投与するための方法は、当業界において公知となっている。かかるインビボの方法のための核酸処方は、例えば−但し、以下に限定されないが−ネイキドＤＮＡ；リポソーム又はウイルス包膜受容体タンパク質と組み合わせたリポソームにカプセル化した核酸（Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８０：１０６８），ポリリジンーグリコプロテインキャリヤー複合体に結合したＤＮＡ及び核酸沈殿物が挙げられる。
【０１５１】
核酸製剤は、当業界において公知である技法、例えばダイレクトインジェクション、エレクトロポレーションや粒子照射などを用いてインビボで導入することが出来る。更には、“遺伝子ガン”が細胞内への遺伝子送達に使用されている（オーストラリア特許第９０６８３８９号）。
【０１５２】
合成遺伝子であって、インビトロ又はインビボ何れかでの転写及び翻訳後にＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤を産生させるものは、当業界において公知である技法を用いて構築することが出来る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐ．８．２．８乃至８．２．１３； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｐ．８．８−８．９， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．を参照）。
【０１５３】
ＧＬＰアンタゴニストは、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、リボザイム、三重へリックス分子及び／又は組換え抗体）を用いるとＧＬＰ分活性化剤によって（例えばＧＬＰアンタゴニストの阻害剤）抑制・阻害することが出来る。かかる実施態様においては、ＧＬＰ活性化剤を患者の体内に導入することによって、ＧＬＰアンタゴニスト遺伝子発現及び／又はＧＬＰアンタゴニストタンパク質レベルがそれぞれ低下することになる。アンチセンス、リボザイム及び／又は三重へリックスの産生及び使用にかかわる方法は、当業者には公知となっておりまた本発明に従えば可能である。
【０１５４】
本発明は、本発明に係わるポリペプチド又はペプチドＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤をコードする核酸を含んで成るベクターをも包含する。ある実施態様においては、遺伝子治療のために導入するべきＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤をコードする核酸は、該核酸が、適当なインジューサー又は転写阻害剤を用いて制御できるようにコード領域に動作可能に結合された誘導可能なプロモータを含んで成る。別の実施態様においては、該ベクターは、クローンした構築物を構成的に発現するプロモーターを含有する。また別の実施態様においては、該プロモーターは、抑制分子を用いて下流制御することが出来るものである。またはその代わりに、該ベクターは、誘導分子がクローンされた核酸の発現を開始するか又は増大させるようなプロモーターを含有する。ある好ましい実施態様においては、該ベクターは、細胞特異的プロモーターである。また別の好ましい実施態様においては、該ベクターは、疾患特異的プロモーターを含有し、その結果発現が大半病変組織又は病変組織を囲む組織に限定されることになる。
【０１５５】
通常は、細胞導入方法はまた、選択可能なマーカーを細胞にトランスファーし、その後当該細胞を選別下にてトランスファーした遺伝子を取り込み勝つ発現する細胞を単離することから成る。かかるトランスファーされた細胞を患者に投与することが出来る。
【０１５６】
核酸分子をターゲット細胞又はターゲット組織に送達するために幾つかの方法が開発されている。従って、当該核酸分子をインビボ又はインビトロでターゲット細胞に送達することが出来る。ある実施態様においては、発現構築物は、直接患者の体内に送達することが出来る。ある特定の実施態様においては、ＧＬＰ分子又はＧＬＰ活性化剤の核酸分子を直接ターゲット組織又は細胞の誘導部位に注入することが出来る。又はその代わりに、患者の細胞を先ずインビトロで発現構築物でトランスフェクトしその後にトランスフェクトされた細胞を被験者に投与して戻すのである（即ち、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療である）。
【０１５７】
ある実施態様においては、べクターをインビボで導入して、細胞に取り込ませ、本発明の核酸の転写を指示させるのである。かかるベクターは、エピソームであってもよく又は染色体に合体されてもよい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルス性又はその当業界に公知で、ターゲット哺乳動物細胞中においてＧＬＰ核酸をコードするクローンされたヌクレオチド配列を複製するか及び／又は発現するために使用することが出来るものであればよい。かかる拡散分子を細胞内に導入するために有用である種々の発現ベクターは、当業界においてよく知られている（例えば、ｐＣＩ，ｐＶＰａｃｋ、ｐＣＭＶ、ｐＳＧＳなど）。発現構築物は、例えばリポソームなどＤＮＡを細胞内に導入する他の粒子物に加えて、例えば−但し、以下に限定されないが−アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルスやヘルペスウイルスのベクターなどのベクターを用いて被験者のターゲット細胞及び／又は組織に導入することが出来る。
【０１５８】
ある特定の実施態様においては、かかる核酸分子は、例えばポリマー製剤中のインプラントとして細胞内に導入することが出来る（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７０２，７１７を参照）。別の実施態様においては、該核酸分子は、所望とする細胞又は組織をターゲットとすることが出来る。
【０１５９】
核酸配列は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞において発現できる、当業界において公知である如何なるプロモーターを用いても発現させるｋとおが出来る。かかるプロモーターは、誘導性又は構成製のいずれかであればよい。かかるプロモーターは、例えば−但し、以下に限定されないが−ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｍｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０），ラウスサルコーマウイルスの３‘末端反復配列に含有されたプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，７８：１４４１−１４４５）及びメタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２， Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）などが挙げられる。組織特異的プロモーターとしては、オステオカルシンのプロモーター領域が挙げられる。
【０１６０】
遺伝子組み替え細胞を遺伝子治療に使用する一つの実施態様においては、本発明のポリペプチドをコードする核酸を細胞内に導入するに際して、該核酸が当該細胞又はその子孫細胞によって発現可能であるように導入するのであり、次いでかる組換え細胞が、治療効果を発揮するためにインビボで投与される。あるグ叩いてきな実施態様においては、幹細胞又は子細胞が使用される。単離してその後インビトロで保持可能である幹細胞及び／又は子細胞であれば如何なるものでも、例えば−但し、以下に限定されないが−造血細胞、ニューロナル祖先細胞、肝祖先細胞、骨芽細胞及び胎性癇細胞などを本発明のかかる実施態様に従って潜在的に使用することが出来る（例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｉｔｏｎ ＷＯ９４／０８５９８； Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２， Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５； Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９８６， Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．，６１：７７１； Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０， Ｍｅｔｈ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２１Ａ：２２９を参照）。
【０１６１】
また別の実施態様においては、本発明の核酸は、他の付属群、たとえばペプチド類（例えば、インビボでホストセル受容体をターゲットするための）、又は細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ８６：６５５３−６５５６； Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８４：６４８−６５２； ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８９／１０１３４を参照）又は脳血液関門（例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８９／１０１３４を参照）を通過する輸送を容易にする薬剤などであってもよい。例えば、ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８８／０９８１０は、相対的に短いオリゴヌクレオチド配列、結合群、及び水性・油性バランスを修正して、細胞膜を貫通した複合物の輸送を促進する両性生成物を提供する群を含んで成る核酸複合物を開示している。また別の例であるＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ８９／１０１３４は、キメラペプチドであって、輸送可能なペプチドと共役して神経医薬剤を脳血液関門を通過して脳内に送達するよう適合せしめられたキメラペプチドを開示している。更には、オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションの引き金を引く切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８， ＢｉｏＴｅｃｈ， ６：９５８−９７６）又はインターカレーション化剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ５：５３９−５４９を参照）で修飾することが出来る。この目的のために、かかるオリゴヌクレオチドは、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション引き金を引く架橋剤、輸送剤又はハイブリダイゼーション引き金を引く切断剤などに複合・共役させる。
【０１６２】
かかる核酸分子をベクター内に挿入して、遺伝子治療のベクターとして使用することが出来る。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，３２８，４７０）又はＳｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，９１：３０５４−３０５７を参照）によって被験者に送達させることが出来る。かかる遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、薬学的に許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターであってもよく、又はベクターを内部に埋没させた徐放性マトリックスを含んで成っていてもよい。又はその代わりに、かかるベクターが組換え細胞から無傷で産生させられる場合は、該医薬製剤は、かかるベクターを産生する一種又はそれ以上の細胞を含んでなっていておよい。
【０１６３】
如何なるタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルス性ベクターも組換え構築物を製造するために使用することが出来る。又はその代わりに、選択的に組織又は細胞のタイプをターゲットにするベクター、例えば骨細胞に感染するウイルスを使用することが出来る。更なる特異性は、組織特異的又は細胞特異的プロモーターを発現ベクター内に使用することによって実現することが出来る。
【０１６４】
ある具体的な実施態様においては、発現ベクターを直接インビボで投与し、そこで当該ベクターを発現させてコードされた生産物を製造することが出来る。このことは、当業界において公知である多数の方法のうちの何れかによって、例えば、本発明の核酸を適当な発現ベクター内に挿入するに際して、投与したら直ちに当該ベクターが、細胞内物質となり、本発明の核酸を発現するように挿入することによって行うことが出来る。
【０１６５】
かかるベクターは、例えば欠陥のある又は弱毒化したレトロウイルスベクター又はその他の、哺乳動物細胞に感染可能であるウイルスベクターを使用することによって内部化させることが出来る（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，９８０，２８６を参照）。
【０１６６】
又はその代わりに、本発明の核酸を含有する発現構築物を直接ターゲット組織内にネイキドＤＮＡとして注入することが出来る。別の実施態様においては、本発明の核酸を含有する発現構築物を、例えばＢｉｏｌｉｓｔｉｃ遺伝子ガンを使用してマイクロパーティクル照射ターゲットにより組織内に導入することが出来る。また別の実施態様においては、本発明の核酸を含有する発現構築物を脂質又は細胞表面受容体又はトランスフェクティング剤を用いてコートし、その結果リポソーム、マイクロパーティクル又はマイクロカプセル内にカプセル化することによって、タ―ゲット組織への接近及び／又はターゲット細胞アニへの侵入を容易ならしめるようすることが出来る。
【０１６７】
また更なる別の実施態様においては、本発明の核酸を含有する発現構築物は、細胞のサブセット内で内部化されるポリペプチドに結合するか又は特定の細胞室をターゲットとすることが出来る。また更なる別の実施態様においては、かかる結合ポリペプチドは、細胞核に対して該ベクターをターゲットさせる核ターゲット配列である。またさらに別の実施態様においては、該結合ポリペプチドは当該リガンドの受容体を発現する細胞内において受容体仲介エンドサイトーシスにより内部化させるリガンドである（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２）。
【０１６８】
また別の実施態様においては、核酸―リガンド複合体は、リガンドが、エンドソームを破壊してその結果当該核酸をしてリソソームでの分解を回避せしめるに到るｆｕｓｏｇｅｎｉｃウイルス性ペプチドを含んで成る用に形成させることが出来る。又別の実施態様においては、本発明の核酸は、細胞特異的受容体を経由してターゲットとし、その結果細胞特異的取り込み及び発現を起こさせることが出来る（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｕｂｕｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＷＯ９２／０６１８０、ＷＯ９２／２２６３５、ＷＯ９２／２０３１６及びＷＯ９３／１４１８８）。例えば、ＷＯ９２／０６１８０は、ウイルス又は細胞の一種が、受容体特異的分子を掛かるウイルス又は細胞の表面に導入して、かくしてターゲット細胞表面上の受容体に結合し、その結果ターゲット細胞による内部化を行わせることによって、ターゲット細胞に対してターゲット化されてインビボでの内部化が行われる。別の例であるＷＯ９３／１４１８８は、遺伝子工学的に操作したレトロウイルスをパッケージした細胞株であって、当該ウイルスの包膜を変化させて、遺伝子情報をトランスファーするためにターゲット細胞の膜上のある分子に結合するペプチドを含有するようにした細胞株の使用方法を開示している。また更なる別の例であるＷＯ９２／２２６３５及びＷＯ９２／２０３１６は、アル遺伝子をインビボで特異的細胞に対してターゲットさせる分子複合体であって、遺伝子結合剤と細胞特異的結合剤との接合体でしかもエンドサイトーシスによる結合リガンドの内部化を注記する受容体に特異的である単体に発現可能な遺伝子を複合化させてなる分子複合体を開示している。
【０１６９】
また更なる別の実施態様においては、本発明の核酸は、細胞内に投入して、次いで相同組換えによって一時的に又は安定にホスト細胞のＤＮＡ内に組み込み、その後その発現を行わしめることが出来る（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８６：８９３２−８９３５； Ｚｉｊｓｔｒａ ｅｔａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８）。
【０１７０】
一つの実施態様においては、ウイルスベクターであて、サイトカイン受容体を活性化させる化合物（即ちサイトカイン類又は抗体）又は活性化免疫細胞で発現した分子を活性化させる化合物（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：５８１−５９９を参照）をコードする核酸を含有するウイルスベクターを使用する。ある具体的な実施態様においては、４−１ＢＢリガンド、抗―４−１ＢＢイムノグロブリン及び／又はＩＬ−１２をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターであって、ウイルスゲノムパーケージング及びホスト細胞ＤＮＡ内への組み込みに必要ではない配列を欠失させたスベクターを使用し、４−１ＢＢリガンド、抗―４−１ＢＢイムノグロブリン及び／又はＩＬ−１２をコードする核酸配列をこのベクター内にクローンし、かくしてトランスジーンを被験者に送達することを容易にするのである。ウイルスベクターに関する更なる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ６：２９１−３０２において利用可能であり、ｍｄｒｌ遺伝子を造血性幹細胞に送達するためにレトロウイルスベクターの使用する方法が記載されている。
【０１７１】
その他のウイルスベクターも本発明に従った遺伝子治療法に使用することが出来る。例えば、アデノウイルスは、遺伝子構築物を呼吸系上皮細胞に送達するのに有用である。アデノウイルスを用いた送達システムのためのその他ターゲットとしては、肝臓、中枢神経系、内皮細胞及び筋肉細胞が挙げられる（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５２：４３１−４３４； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２， Ｃｅｌｌ６８：１４３−１５５； Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３， Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９１：２２５−２３４； Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ， １９９３， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：４９９−５０３； Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３―１０； ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ９４／１２６４９； 及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３を参照）。
【０１７２】
従って、アデノ関連ウイルスもまた、本発明の遺伝子治療方法にしようすることが出来る（例えば、Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ２０４：２８９−３００；Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ，．５，４３６，１４６を参照）。
【０１７３】
かかる実施態様においては、当該核酸は、得えられる組換え細胞をインビボで投与する前に細胞内に投入される。かかる導入は、当業界において公知である如何なる方法によっても、例えば例えば−但し、以下に限定されないが−トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、当該核酸配列を含有するウイルスベクター又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体仲介遺伝子トランスファー、マイクロセル仲介遺伝子トランスファーやＳｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ融合によって行うことが出来る。外来遺伝子を細胞に導入するために多くの技法が、当業界において公知となっており（ｔａｔｏｅｂａ， Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９； Ｃｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２０００； Ｌｏｅｆｆｅｒ ａｎｄ Ｂｅｈｒ，１９９３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２１７：５９９−６１８； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：６１８−６４４； Ｃｌｉｎｅ， １９８５， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２を参照）、本発明に従って使用することが出来る。ある好ましい実施態様においては、かかる技法によれば、本発明の核酸を安定的にターゲット細胞にトランスファーして、該核酸が当該細胞の子孫細胞によって受け継がれる。
【０１７４】
得られた組換え細胞は、当業界において公知である種々の方法で被験者体内に送達することが出来、当業者ならば、適当な投与方法を理解できるであろう。例えば、静脈内注射は、組換え造血幹細胞について好ましい投与方法であり得る。保険者に投与するべき組換え細胞の数は、当業者によって決定可能であり、例えば所望とする効果、疾患症状や投与方法などの種々のファクターを考慮することが含まれる。
【０１７５】
本発明の核酸を遺伝子治療の目的のために導入する細胞としては、例えば−但し、以下に限定されないが−上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、血液細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好酸球、顆粒球、マクロファージ、巨核細胞、単球、好中球など）、幹細胞又は祖先細胞（例えば、脂肪細胞、骨髄、血液、胎児肝臓や臍帯から得られる未分化細胞）などが挙げられる（例えば、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ ，１９８０， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ．， ２１Ａ：２２９； Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ９４／０８５９８； Ｐｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， １９８６， Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ． ６１：７７１； ａｎｄ Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ ａｎｄｅｒｓｏｎ， １９９２， Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５を参照）。本発明の核酸を導入するために使用される細胞は、自己又は非自己であってもよい。一つの好ましい実施態様においては、遺伝子治療に使用される細胞は、被験者にとって自己のものである。
【０１７６】
当業者ならば、多くの異なるプロモーターが、本発明の核酸の発現を推進するための使用することが出来ることを理解するであろう。一つの別の実施態様においては、かかるプロモーターは、ホルモン感受性エレメントを含んでなる。例えば、アンドロゲン感受性エンハンサーを含有するプロモーターは、アンドロゲン産生細胞又は隣接組織において大幅に活性化されるであろう。かかる発現構築物は、以上に高いレベルのアンドロゲンを分泌する組織をターゲットにするうえで有益である。別の実施態様においては、かかるプロモーターは、線維芽細胞特異的プロモーターの種々のエレメントを含んで成る。またある特別な実施態様においては、かかる線維芽細胞特異的プロモーターは、滑膜線維芽細胞由来のプロモーターエレメントを含んで成る。又はその代わりに、かかるプロモーターは、侵襲性の強いリューマチ性関節炎の滑膜線維芽細胞において活性化されるエレメントを含んで成る。ある特別の別の実施態様においては、当該プロモーターは、プログルカゴンプロモーターの一部を含んで成る。限定されない実施例の一つにおいては、ウイルスベクターであって、ウイルスプロモーターが完全に又は部分的にプログルカゴンプロモーターの少なくとも一部分で置換されているものが、使用される。かかる発現構築物は、プログルカゴン発現細胞中においてはさらに特異的に発現されるであろう。
【０１７７】
遺伝子治療方法はまた、本発明に従えばＧＬＰアンタゴニスト、特にＤＰＰ−ＩＶを抑制阻害するために使用される。例えば、リボザイム及びトリプルへリックス分子が、ＧＬＰ阻害剤又は異常ＧＬＰ遺伝子の遺伝子産物をターゲットとし、その結果ＧＬＰ阻害剤タンパク質又は異常ＧＬＰタンパク質の低下を招来させるために使用することが出来る。アンチセンスリボザイム及び／又はトリプルへリックスの産生及び使用にかかわる技法は、当業者にとって公知であり、ターゲット遺伝子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドに関して設計することも出来るのであり、これも当業界において公知である。
【０１７８】
別の実施態様においては、ＧＬＰ受容体をコードする遺伝子に変異を導入して、その結果当該受容体を活性化してＧＬＰ受容体結合を促進させるような配列変化を招来させることも出来る（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，０７７，９４９）。自動化遺伝子合成方法を適用することによって、天然のＧＬＰ受容体遺伝子の配列変異体を生成させる機会が得られる。当業者は、かかるＧＬＰ受容体の変異体をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において記載された天然型ポリヌクレオチドを表わす遺伝子の暗号を置換することによって生成せしめられることを理解することが出来る。更には、本明細書において記載されたＧＬＰ分子及びＧＬＰ活性化剤受容体の合成変異体をコードするポリヌクレオチドであって、１乃至２０、例えば１乃至５のアミノ酸置換又は欠失若しくは付加を導入したポリヌクレオチドを生成させることが出来る。かかる修飾ＧＬＰ受容体は、発現ベクター内に挿入し、治療を必要とする被験者に投与して、所望とする組織内での受容体活性を増大させることが出来る。
【０１７９】
５．６．１アンチセンス治療
一つの実施態様においては、遺伝子治療に対するアンチセンス方法を使用して、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療することが出来る。遺伝子治療に対するアンチセンス方法は、ターゲットｍＲＮＡの一部分とハイブリダイゼーションすることが出来るリボプローブを使用することからなる。その他に、非リボースアンチセンス構築物、例えば−但し、以下に限定されないが−ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬＮＡ、ホスフィン類縁体、ホスホチオネート、及びＰＥＧＡ変成アンチセンス構築物なども本発明において意図される。ＧＬＰアンタゴニストの転写を防止することによって、ＧＬＰ活性が高められるであろう。当業者ならば、ミスマッチの度合い若干でもあれば、少なくとも一時的な二重らせんが形成されるというような絶対的な相補性は必要ではないことを理解するであろう。一つの限定されない実施例においては、かかるアンチセンスプローブは、ターゲットｍＲＮＡ転写産物に結合し、その翻訳を防止する。一つの実施態においては、ターゲットｍＲＮＡは、ＧＬＰアンタゴニストをコードする。また別の実施態様においては、かかるターゲットｍＲＮＡは、異常ＧＬＰｍＲＮＡである。
【０１８０】
リボプローブは、５‘未翻訳配列に対してはＡＵＧ開始コドンに到るまで及びこれを含んで相補的であり、ＧＬＰｍＲＮＡの翻訳を阻害・抑制するのに効率的に使用することが出来る。ｍＲＮＡの３’未翻訳配列に相補的であるリボプローブもまた、ＧＬＰｍＲＮＡの翻訳を阻害／抑制するのに効果的である（例えば、Ｗａｇｎｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ，３７２：３３３−３３５を参照）。更には、ｍＲＮＡコード領域に相補的であるアンチセンスリボプローブは、本発明に従って使用することが出来る。
【０１８１】
好ましくは、インビトロ試験・研究が、アルアンチセンスリボプローブが遺伝子発現を阻害する能力を評価するために行われる。これらの試験研究は、典型的には遺伝子発現のアンチセンス仲介阻害とリボプローブの非特異的生物学的効果とを区別する対照を使用する。好ましくは、かかる試験研究は、ターゲットＲＮＡ又はターゲットタンパク質のレベルにおけるアンチセンス仲介された変化を内部対照ＲＮＡ又はタンパク質レベルと比較するのである。
【０１８２】
一つの実施態様においては、アンチセンスリボプローブをｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモーターの制御下において含んで成る組換えＤＮＡ構築物を使用して、細胞内においてアンチセンスリボプローブを生成させる。被験者のターゲット細胞をトランスフェクトさせるためにリボプローブを使用することは、十分な量のリボプローブを転写させて、その結果ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現を低減させるか及び／又は阻害することになり得る。一つの実施態様においては，ｍＲＮＡは、ＧＬＰ阻害剤ｍＲＮＡである。別の実施態様においては、ｍＲＮＡは、異常ｍＲＮＡである。しかしながら、かかるＤＮＡ構築物の低い転写速度又は低い転写活性は、臨床効果を実証するに充分なアンチセンス分子を生成させる。
【０１８３】
別の実施態様においては、ＧＬＰ阻害剤アンチセンス核酸配列又は異常ＧＬＰアンチセンス核酸配列を発現ベクター内に、好ましくは哺乳動物発現ベクター内にクローンさせるのである。
【０１８４】
別の実施態様においては、本発明の異常ＧＬＰ又はＧＬＰ阻害剤アンチセンス核酸分子は、ベクター内にクローンされるのであるが、これによってかかるベクターを（及び従ってアンチセンスリボプローブのターゲット発現）特異的組織又は細胞型にターゲットさせるように設計される。例えば、アンチセンスリボプローブは、ターゲット細胞表面にて発現させた受容体又は抗体を結合し、その結果当該ベクターを細胞にターゲットさせるペプチド又は抗体に結合させることが出来る。
【０１８５】
別の実施態様においては、かかるベクターは、健常細胞又は組織と比較して病変した細胞又は組織においてはさらに高度に活性化されるプロモーターを含んで成る。
【０１８６】
５．６．２リボザイム治療
リボザイム治療は、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療するために使用することが出来る。
【０１８７】
リボザイムは、例えばｍＲＮＡなどの単鎖核酸の特異的な切断を接触する能力を有する酵素性ＲＮＡ分子である（例えば、Ｒｏｓｓｉ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４：４６９−４７１を参照）。リボザイム作用機構は、当該リボザイム分子が相補的ターゲットＲＮＡに配列特異的にハイブリダイゼーションし、次いでヌクレオチド内部結合切断による切断を行うことから成る。リボザイム分子の所望は、一つ又はそれ以上のターゲット遺伝子ｍＲＮＡに双方的な一つ又はそれ以上の配列及びｍＲＮＡ切断に関与する接触配列とを包含するものである（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，０９３，２４６を参照―なおこれはその全体を、参考文献として合体する）。即ち、リボザイム類（例えば、ハンマーヘッドリボザイム）は、ｍＲＮＡ転写産物を接触的に切断して、その結果特定のｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の発現を阻害するために使用することが出来る：（例えば、Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ ａｎｄ ｇｅｒｌａｃｈ， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１を参照）。本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に対して特異性を有するあるリボザイムは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列に基いて設計することが出来る。従って、ある実施態様においては、遺伝子操作したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、特異的に且つ効率的に本発明のＧＬＰアンタゴニストをコードするＲＮＡ配列のヌクレオチド内部結合切断による切断を接触する。
【０１８８】
別の実施態様においては、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子をプールしたものから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する接触的ＲＮＡを選別するため使用される（例えば、Ｂａｒｔｅｌ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照）。
【０１８９】
潜在的ＲＮＡターゲット内部の特異的なリボザイム切断部位は、対象となる分子をリボザイム切断部位−ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣ配列を包含する−について走査することによって同定される。一旦同定されると、ターゲット遺伝子の切断部位に相当するほぼ１５乃至２０のリボヌクレオチドから成る短鎖ＲＮＡ配列を、例えば二次構造など当該オリゴヌクレオチドを適合したものとする予測構造的特長について評価する。候補となる配列の適合性もまた、例えばリボヌクレアーゼ保護検定試験を使用して相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする能力を試験することによって評価することが出来る。
【０１９０】
５．６．３トリプルへリックス治療
一つの別の実施態様においては、トリプルへリックス構造を形成する核酸分子が、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療するために使用される。例えば、本発明のポリペプチドの発現は、当該ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域の相補的なヌクレオチド配列をターゲットととし、かくしてターゲット細胞内における当該遺伝子の発現を防止するトリプルへリックス構造を形成することによって阻害することが出来る（例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１， Ａｎｔｉｃａｎ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． ６：５６９−５８４； Ｈｅｌｅｎｅ，１９９２， Ｎ．Ｙ． Ａｃａｓ． Ｓｃｉ． ６６０：２７−３６； Ｍａｈｅｒ， １９９２， Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７−８１５）。
【０１９１】
トリプルへリックス形成により転写を阻害するために使用される核酸分子は、単鎖オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基ペアリング規則により、好ましくは二重鎖の内の一つの単鎖上のプリン又はピリミジンの長いストレッチを用いてトリプルへリックス形成を促進するように設計することが出来る。ヌクレオチド配列は、ピリミジンを用いて、得られるトリプルへリックスの三本の関連した鎖の全体に渉ってＴＡＴ及びＣＧＣ＋三重鎖が得られるようにすることが出来る。このようなピリミジンリッチな分子は、当該鎖に平行な方向で二重鎖のうちの単鎖のプリンリッチな領域に相補的な塩基を提供する。例えばグアニジン残基のストレッチを含有するプリンリッチな核酸分子もまた選択することが出来る。これらの分子は、ＧＣペアーが多いＤＮＡ二重鎖とトリプルへリックスを形成し、該トリプルへリックスにおいて、プリン残基の大半は、ターゲットとした二重鎖の単鎖上に位置し、その結果三重鎖の内の三本鎖の全体に渉ってＧＧＣトリプレットが形成される。
【０１９２】
さらに、トリプルへリックス形成のためにターゲットとされ得る潜在的配列の数は、“Ｓｗｉｔｒｃｈｂａｃｋ”核酸分子を創製することによって増やことが出来る。Ｓｗｉｔｃｈｂａｃｋ分子は、５‘−３’，３‘−５’の交互の態様で合成され、その結果当該分子は先ず、二重鎖の内の一本鎖とハイブリダイズし、その後もう一つの鎖とハイブリダイゼーションし、かくして二重鎖のうちの一本鎖上でのプリン又はピリミジンのストレッチを必要とする要件を排除することが出来る。
【０１９３】
本発明のリボザイム及びトリプルへリックス分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド又はオリゴリボヌクレオチド）合成のための、当業界において公知である如何なる方法によっても製造することが出来る。
【０１９４】
これらのオリゴヌクレオチドは、例えば注射によってそのまま投与することが出来る。 又はその代わりに、ＲＮＡ分子は、ＤＮＡ配列を転写することによってインビトロ又は インビボで生成させることが出来る。かかるＤＮＡ配列は、適当なＲＮＡポリメラーゼ プロモーター、例えばＴ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどを特徴づける、当 業界において公知である宿のベクター内に組み込むことが出来る。ある好ましい実施態 様においては、骨細胞特異的プロモーターを使用して、本発明の核酸配列を含んで成る 発現ベクターを産生させるのである。また別の好ましい実施態様においては、骨特異的 プロモーターは、本発明の核酸配列を含んで成る発現ベクターを産生させるために使用 する。
【０１９５】
５．６．３抗体治療
本発明は、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療するために抗体治療穂を利用することを包含する。ある実施態様においては、ＧＬＰアンタゴニストに結合する抗体をコードする配列を含んで成る核酸分子を遺伝子治療法により投与する。ある特定の実施態様においては、本発明のＧＬＰアンタゴニストポリペプチドに対する抗体をコードする核酸配列を含有した組換え細胞を使用するのである。かかる遺伝子構築物は、組換え抗体が分泌されるか又は当該細胞表面にて発現されるように発現させるのである。かかる組換え細胞を次に治療効果を目的としてインビボで投与する。
【０１９６】
治療薬部分に接合した抗体を含む、本発明のＧＬＰ抗体は、個体に対して単独で又は抗骨粗しょう症薬、抗肥満薬、成長因子又はホルモンと組み合わせて投与することが出来る。ある別の実施態様においては、ＧＬＰ阻害剤ポリペプチドに対する抗体を先ず投与し、次に抗骨粗しょう症薬、抗肥満薬、成長因子又はホルモンを２４時間以内に投与する。かかる治療サイクルは、患者の臨床応答により保証される限り反復繰り返す。更には、かかる抗体、抗骨粗しょう症薬、成長因子又はホルモンは、例えば静脈内や筋肉内投与など別々の経路で投与することが出来る。
【０１９７】
本発明のさらに別の局面は、本発明のポリペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含んで成る医薬組成物である。好ましい実施態様においては、該医薬組成物は、本発明の抗体、ＧＬＰ分子及び薬学的に許容可能な担体を含有する。
【０１９８】
５．６．５ ワクチン治療
ワクチン治療は、骨関連疾患又は栄養素関連疾患を治療するために使用される。ワクチンは、かかる治療を必要とする被験者、例えば異常ＧＬＰ変異体又はＧＬＰカスケードにおいて異常中間体を発現している被験者に投与する。本発明のヌクレオチドは、変異体及び誘導体を含めて、ワクチンとして、例えば遺伝子免疫化によって使用することが可能となる。遺伝子免疫化は、細胞障害性Ｔ細胞応答を刺激するにも係わらず、病原性型に転化して、ホストに感染して予防を目的とする感染症そのものを惹起する可能がある弱毒化生ワクチンを使用しないので、特に有利である。本明細書において使用する遺伝子免疫化とは、本発明のヌクレオチドをホスト体内に挿入するに際して、当該ヌクレオチドがホスト細胞によって取り込まれ当該ヌクレオチドによりコードされたタンパク質が翻訳されるようにすることである。これらの翻訳タンパク質は、次に当該ホスト細胞によって分泌されるか又は修飾処理されて、免疫細胞に提示され、かくして免疫反応が刺激されるのである。好ましくは、かかる免疫反応は、細胞障害性Ｔ細胞応答である；しかしながら、体液性応答であるマクロファージ刺激もまた、将来の感染症を予防するうで有用である。当業者ならば、例えば本発明のタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを無菌食塩水溶液中で安定化したもののほぼ５０ｍｇを適当なアジュバントと共に筋肉内注射することによって、外来ヌクレオチドをホスト動物体内に、次いで遺伝子免疫化のために細胞内に導入するための方法として種々のものがあることを理解するであろう（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｄｙ， １９９９， Ｓｃｉ． Ａｍ．７：５０−５７； Ｌｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９， Ｎａｔｕｒｅ ４００：２６９−２７１を参照）。
【０１９９】
５．７キット
本発明はまた、生物学的試料（試験試料）中における本発明のポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットをも包含する。かかるキットは、被験者が、例えば上記において本発明の医薬組成物の使用法に係わる段落において述べたように、本発明のポリペプチドの異常発現に関連した疾患に罹患しているか又はかかる疾患を発症する危険性が高いかを決定するために使用することが出来る。
【０２００】
例えば、かかるキットは、被験者が、骨関連疾患又は栄養素関連疾患に罹患しているか又はかかる疾患を発症する危険性が高いかを決定するために使用することが出来る。
【０２０１】
また別の実施例においては、キットは、被験者が、本発明のポリペプチドの異常発現に関連した疾患に罹患しているか又はかかる疾患を発症する危険性が高いかを決定するために使用することが出来る。
【０２０２】
かかるキットは、例えば当該ポリペプチド又は害ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを生物学的試料中において検出する能力を有する標識化化合物又は薬剤及び該し領空における該ポリペプチド又はｍＲＮＡの量を定量するための手段（例えば、当該ポリペプチドに結合する抗体又は当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）とを含んで成る。キットはまた、試験を受けた被験者が、当該ポリペプチド又は当該ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量が通常レベル以上又はそれ以下である場合、当該ポリペプチドの異常発現に関連した疾患に罹患しているか又は発症する危険性が高いことを述べた使用法を含んでいてもよい。
【０２０３】
抗体を用いたキットについては、当該キットは、例えば（１）ＧＬＰポリペプチドに結合する第一の抗体（例えば、固体支持体に結合させた）、（２）当該ポリペプチド又は第一の抗体のいずれかに結合し且つ検出可能薬剤に接合された第二の、異なる抗体を含んで成る。
【０２０４】
オリゴヌクレオチドを用いたキットについては、かかるキットは、（１）例えば本発明のポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする検出可能に標識化されたオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチド又は（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を増幅するのに有用である一対のプロモーターとを含んで成る。かかるキットはまた、緩衝液、保存剤又はタンパク質安定化剤とを含んでいてもよい。かかるキットはまた、検出可能薬剤（例えば、酵素又は基質）を検出するために必要な成分を含んで成っていてもよい。かかるキットはまた、検定可能であり且つ含まれた試験試料と比較する参照試料又は一連の参照試料を含有していてもよい。かかるキットの各成分は通常は、それぞれ個別の容器内に封入して、これら異なる容器の全てを、当該ポリペプチドの異常発現に関連した疾患に罹患しているか又は発症する危険性が高いことを述べた使用法と共に単一の容器内に収めるのである。
【０２０５】
本発明は、検出可能物質と結合させた本発明の抗体及び使用法とを含んでいるキットを提供する。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、容器、パック又はディスペンサー内に服用方法と共に入れてもよい。
【０２０７】
５．８診断及びモニターのための検定定量法
本明細書において記述する方法は更に、診断のための測定定量法又は疾患の進行又は治療の有効性をモニターするための測定定量法として利用することが出来る。例えば本明細書に記載した測定定量法は、ＧＬＰ分子の異常な発現又は異常な活性に関連した疾患に罹患しているか又は発症する危険性がある被験者を同定するために利用することが出来る。又はその代わりに、これらの測定定量法は、かかる疾病又は疾患に罹患しているか又は発症する危険性がある被検者を同定するために利用することが出来る。即ち、本発明は、試験用組織試料を被験者から採取し、次いでＧＬＰ分子を検出するに際して、ＧＬＰ分子の存在が、ＧＬＰ分子の異常な発現又は異常な活性に関連した疾患に罹患しているか又は発症する危険性がある被験者のための診断剤とする方法を提供するものである。本明細書において使用する“試験用組織試料”なる用語は、対象とする被験者から採取したし生物学的試料を言う。例えば、試験用試料は、生物学的液体（例えば、血清）、細胞試料又は組織（例えば、骨又は脂肪細胞）であってもよい。
さらには、本明細書において記載する測定定量法は、ＧＬＰ分子の異常な発現又は異常な活性に関連した疾患を治療するための薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティク、タンパク質、ペプチド、核酸、小型分子、又はその他の医薬候補物質）を被験者に投与するか否かを決定するためにりようすることが出来る。例えば、掛かる］方法は、被験者が、特異的薬剤又は一群の薬剤（例えば、ＧＬＰ分子の活性を増大させる型の薬剤）で有効に治療されているか否かを決定するために利用することが出来る。即ち、本発明は、ＧＬＰ分子の異常な発現又は異常なレベルに関連した疾患のための薬剤で被験者が有効に治療されているか否かを決定する方法であって、試験用組織試料を採取し、次いでＧＬＰ分子を検出する（ここにおいて、当該ポリペプチド又は核酸の存在が、ＧＬＰ分子の異常な発現又は異常なレベルに関連した疾患を治療するための薬剤を投与されている被験者のための診断剤となる）ことから成る前記方法を提供するものである。
【０２０８】
本発明の方法はまた、ＧＬＰ分子をコードする遺伝子における遺伝子病変又は変異を検出し、かくして遺伝子病変を有する被験者が、ＧＬＰ分子の異常な発現又は異常な活性で特徴づけられる疾患を発症する危険性を有するか否かを、決定するために使用することが出来る。好ましい実施態様において、かかる方法は、当該被験者から採取した細胞の試料中において、ＧＬＰ分子をコードオする遺伝子の完全さに影響を及ぼす少なくとも一つの変化、又はＧＬＰ分子をコードする遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝子病変又は変異の存在又は不存在を検出することから成る。例えば、かかる遺伝子病変又は変異は、以下のうちの少なくとも一つの存在を確認することによって堅守することが出来る：１）当該遺伝子からの一つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失；２）当該遺伝子の一つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換；４）当該遺伝子の染色体での再配列；５）当該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物のレベルにおける変化；６）当該遺伝子の異常な修飾、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な修飾；７）当該遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物での非野生型のスプライシングパターンの存在；８）当該遺伝子がコードするタンパク質の非野生型レべル；９）当該遺伝子の対立遺伝子での欠失；及び１０）当該遺伝子がコードするタンパク質の不適切な翻訳後修飾。上記したように、遺伝子内の病変を検出するためにしようすることが出来る、当業界で公知となっている方法は数多くある。
【０２０９】
幾つかの実施態様においては、当該病変の検出は、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．４，６８３，１９５を参照）、例えばアンカーＰＣＲ又はＰＡＧＥ ＰＣＲなど、又はその代りにライゲーションチェーンリアクション（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１： １０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：３６０−３６４を参照）においてプローブ／プライマーを使用することからなるが、なお後者が特に遺伝子における点変異を検出するのに特に有用である（例えば、Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ２３：６７５−６８２を参照）。この方法は、患者から細胞試料を採取する工程、かかる試料の細胞から核酸（ゲノム、ｍＲＮＡ又はその双方）を単離する工程、当該遺伝子（存在すれば）のハイブリダイゼーション及び増幅が生起する条件下で選択遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つ又はそれ以上のプライマーに該核酸試料を接触させる工程、及び増幅産物の存在を検出するか又は増幅産物のサイズを検出して、その長さを対照試料と比較する工程とからなっていてもよい。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲが、本明細書において記載した変異を検出するために使用する技法の如何なるものとも組み合わせて予備的増幅工程として使用するのに望ましいことが予測される。
【０２１０】
また別の増幅方法は、下記から成る：自己維持型の配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４−１８７８）、転写型増幅システム（Ｋｗｏｈ， ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、又は他の全ての核酸増幅法、その後当業者に公知である技法を用いた増幅分子の検出。これらの検出スキームは、核酸分子が極めて少ない数存在する場合はかかる分子の研修に特に有用である。
【０２１１】
又はその代わりの実施態様では、試料細胞から選別した遺伝子の変異は、セ減酵素切断パターンにおける変化によって同定することが出来る。例えば、試料及び対照ＤＮＡを単離氏、増幅し（選択的に）、一つ又はそれ以上の制限酵素で消化し、断片長のサイズをゲル電気泳動法で測定し、次いで比較するのである。試料と対照ＤＮＡとの間における断片長のサイズの差異は、試料ＤＮＡ中の変異を示すものである。さらには、配列特異的リボザイム（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４９８，５３１を参照）の使用は、リボザイム切断サイトの生成又は喪失により特異的変異の存在についてスコアー化するのにこれをもちいることが出来る。
【０２１２】
本発明の治療法の患者に対する有効性は、例えば、ＧＬＰ活性を示すものとしての骨吸収の一つ又はそれ以上のマーカーのレベルを測定することによって評価することが出来る。即ち、ＧＬＰ分子又は活性化剤を投与した後での骨吸収マーカーレベルの変動によって、治療の有効性をモニターすることが出来る。ある実施態様においては、骨吸収マーカーは、Ｉ型コラーゲンのＣ―末端テロペプチド（Ｓ−ＣＴＸ）及び／又はその分解生成物である（Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４：２２８１−２２８９； Ｃｈｒｉｓｔｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．４４：２２９０−２３００）。骨吸収マーカーのレベルは、当業界において公知である種々の方法を用いて決定することが出来る（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｓｅｒｕｍ ＣｒｏｓｓＬａｐｓ^ＴＭ）。ある特定の実施態様においては、循環Ｓ−ＣＴＸレベルの低下は、患者のＧＬＰ治療が有効であることを示す。本発明の方法に従えば、骨吸収マーカーの測定は、骨関連疾患を治療するための治療薬剤の最適用量を決定するのに用いることが出来る。
【０２１３】
本発明を、本発明の実例としてのみ記載する、制限するものではない下記実施例を参照することによって更によく理解されるであろう。下記実施例は、本発明の好ましい実施態様を更に完全に説明するために提示されるものであり、本発明のより広範な権利範囲を制限するものと決して理解されるべきではない。
【０２１４】
６．実施例
【実施例】
これらの実施例においては、グルコースを含む血液学及び血清化学数値は、オートアナライザー（Ｖｉｔｒｏｓ）を用いて測定した。血清中ＦＳＨ―Ｉは、ＩＲＭＡ （Ｃｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ^（Ｒ）， ＤＰＣ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ， ＣＡ）によって測定した。Ｉ型コラーゲン分解の血清中Ｃ―テロペプチド断片（Ｓ−ＣＴＸ）は、ＥＬＩＳＡである血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓ^ＴＭ検定分析法（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｅｒ ＢｉｏＴｅｃｈ Ａ／Ｓ − Ｄｅｎｍａｒｋ）によって測定した。血清中オステオカルシンは、分子のＮ末端中間部を決定する、ＥＬＩＳＡ検定分析法によって求めた。血清中のインシュリン及びＣ−テロペプチドは何れも、ＲＩＡ（インシュリン用及びＣ−ペプチドに対する二重抗体Ｃ−ペプチド用のＣｏａｔ−Ａ−Ｃｏｕｎｔ^（Ｒ）、何れもＤＰＣ、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ、 ＣＡ）によって分析した。
【０２１５】
６．１ 実施例１：経口投与果糖（フルクト―ス）がＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び骨吸収速度に及ぼす影響
１２人の健常な女性（３０−４５才）と男性（３０−６０才）を、無作為化対照比較交差試験に参入させて、経口投与果糖がＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び骨代謝回転に及ぼす影響を比較した。骨代謝回転は、被験者の血清中のＳ―ＣＴＸを測定することによって検定分析した。要言すれば、成熟骨組織の吸収過程においてＩ型コラーゲン分解のみにより産生させたＳ―ＣＴＸ断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行った（Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４： ２２８１−２２８９）。これらの個人は、例えばガン、リューマチ性関節炎など骨代謝回転に関連した疾患又は消化管からの吸収若しくは腎臓からの分泌／再吸収を妨害する疾患に罹患についての病歴を一切有していなかった。血液学及び血清化学を含む一般的検査スクリーニングを行なったところ、特異的な臓器機能不全の徴候は全くなかった。これらの個人は、カルシウム、ビタミンＤ、エストロゲン又はプロゲスチンなどの骨代謝に影響を及ぼす医薬品を、如何なる投与形態においても本試験開始前三ヶ月以上服用していなかった。これらの被験者は、ビスホスホネート又はフッ化物によって治療を受けたことはなかった。
【０２１６】
試料採取
実験に先立つ晩午後１０時から被験者に絶食させた後、最初の血液試料を午前７時３０分と８時３０分の間に採取した。その後直ちに経口果糖投与を開始した。第一回目の採血の後正確に１、２、３、６及び９時間後に、採血を行なった。２週間のウォッシュアウト期間を各実験の間に設けた。
【０２１７】
介入
経口投与果糖は、半分のレモンジュースを添加した３００ｍｌの水に７５ｇの果糖を溶解したものであった。経口投与果糖は、２時間後にＳ―ＣＴＸを３６％低下させたが、一方ＧＬＰ−１数値は、２時間後にＴ_０におけるベースライン１００％と比較して２２０％にまで倍加した。従って、プログルカゴンの他の断片の生成も、ＧＬＰ−１と同様に倍加した。ＧＩＰの数値は、ベースラインに殆ど維持された。果糖の経口投与後、骨吸収の一つのマーカーであるＳ−ＣＴＸが減少するに応じて、ＧＬＰ−１の濃度は上昇する。ＧＬＰ−１は骨吸収を減少させるのにまた骨粗しょう症を治療し又は予防するのに有用である。
【０２１８】
６．２ 実施例２：経口投与長鎖脂肪酸、ＬＣＦＡがＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び骨吸収速度に及ぼす影響
１２人の健常な女性（３０−４５才）と男性（３０−６０才）を、実施例１における同一の臨床試験参入・排除基準に従って無作為化対照比較交差試験に参入させて、経口投与長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）がＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び骨代謝回転に及ぼす影響を比較した。骨代謝回転は、被験者の血清中のＳ―ＣＴＸを測定することによって検定分析した。要言すれば、成熟骨組織の吸収過程においてＩ型コラーゲン分解のみにより産生させたＳ―ＣＴＸ断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行った（Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４： ２２８１−２２８９）。
【０２１９】
試料採取
実験に先立つ晩午後１０時から被験者に絶食させた後、最初の採血を午前７時３０分と８時３０分との間で行なった。その後直ちに経口ＬＣＦＡ投与を開始した。第一回目の採血の後正確に１、２、３、６及び９時間後に、採血を行なった。２週間のウォッシュアウト期間を各実験間に設けた。
【０２２０】
介入
経口投与ＬＣＦＡは、長鎖脂肪酸の乳化液７０ｍｌ（Ｃａｓｉｌａｎ）から成るものであった。経口投与ＬＣＦＡは、３時間後にＳ−ＣＴＸを３７％低下させ（図１Ｂ）、またＧＬＰ−１数値は、３時間後にＴ_０におけるベースライン１００％と比較して２３０％の数値にまで倍加した。これらの結果は、実施例１の相当するデータと極めて類似している。しかしながら、ＧＩＰの数値は、有意に４００％の数値にまで増大した。実施例１におけるＧＩＰの数値と比較すれば、ＧＩｐは、骨吸収には殆ど又は全く影響を及ぼさないことが判る。ＬＣＦＡの経口投与後、ＧＬＰ−１の濃度は、骨吸収の一つのマーカーであるＳ−ＣＴＸが減少するに応じて、上昇する。ＧＬＰ−１は骨吸収を減少させるのにまた骨粗しょう症を治療し又は予防するのに有用である。
【０２２１】
６．３ 実施例３：経口投与タンパク質がＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び骨吸収速度に及ぼす影響
１２人の健常な女性（３０−４５才）と男性（３０−６０才）を、実施例１における同一の臨床試験参入・排除基準に従って無作為化対照比較交差試験に参入させて、経口投与タンパク質がＧＬＰ−１、ＧＩＰ及び骨代謝回転に及ぼす影響を比較した。骨代謝回転は、被験者の血清中のＳ―ＣＴＸを測定することによって検定分析した。要言すれば、成熟骨組織の吸収過程においてＩ型コラーゲン分解のみにより産生させたＳ―ＣＴＸ断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行った（Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４： ２２８１−２２８９）。
【０２２２】
試料採取
実験に先立つ晩午後１０時から被験者に絶食させた後、最初の採血を午前７時３０分と８時３０分との間で行なった。その後直ちにタンパク質投与を開始した。第一回目の採血の後正確に１、２、３、６及び９時間後に、採血を行なった。２週間のウォッシュアウト期間を各実験間に設けた。
【０２２３】
介入
経口投与タンパク質は、４０ｇのタンパク質粉末（Ｃａｓｉｌａｎ）を６００ｍｌの水に溶解したものから成るものであった。経口投与タンパク質は、２時間後にＳ−ＣＴＸを４５％低下させたが（図１Ｃ）、一方ＧＬＰ−２及びＧＩＰの数値はいずれも増加した。ＧＩＰの数値は、８ｐＭから１７ｐＭにまで増加しまたＧＬＰ−２の数値は、３６ｐＭから５７ｐＭにまで増加した。これらの結果は、ＧＬＰ−１及び／又はＧＬＰ−２の濃度が増加することによって、Ｓ−ＣＴＸにより測定した骨吸収を減少させることが出来ることを示している。
【０２２４】
６．４ 実施例４：通常の混合食がＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２及び骨吸収速度に及ぼす影響
７人の腸の短い患者（＜１４０ｍｍ残留小腸）を加入させた。４人の女性及び３人の男性を検討対象として、通常の混合食がＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２及び骨代謝回転に及ぼす影響を比較した。骨代謝回転は、被験者の血清中のＳ―ＣＴＸを測定することによって検定分析した。要言すれば、成熟骨組織の吸収過程においてＩ型コラーゲン分解のみにより産生させたＳ―ＣＴＸ断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行った（Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４： ２２８１−２２８９）。ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の測定法及び試験対象者の叙述は、Ｊｅｐｐｅｓｅｎ， Ｐ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．（２０００，“Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｐｌａｓｍａ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｐｔｉｄｅ １ ａｎｄ ２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｌｅｕｍ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｓｈｏｒｔ ｂｏｗｅｌ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｃｏｌｏｎ”， Ｇｕｔ ４７：３７０−３７６）において詳細に記載した通りである。
【０２２５】
試料採取
被験者は一晩絶食させた後、試験食の前１５分に最初の末梢静脈血を採取した。試験食は、１５分で終了した。試験食開始後１０、２０、３０、４５、６０、１２０及び１８０分に末梢静脈血を採取した。
【０２２６】
介入
通常混合食は、ライ麦パン、トースト、バター、チーズ、ジャム、ヨーグルト、バナナ及びオレンジジュースから成り（全量７５５ｇ）、そのエネルギー量は３．９ＭＪでありまたタンパク質：炭水化物：脂肪のエネルギー比率は、１０％：５２％：３７％であることが食品分析表から推定された。
【０２２７】
通常の混合食は、２時間後にＳ―ＣＴＸを４０％低下させた（図２）が、他方ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の数値は何れも増加した。ＧＬＰ−１の数値は、３時間後に７０ｐＭから９８ｐＭにまで増加し、またＧＬＰ−２の数値は、３時間後に１０ｐＭから２２ｐＭにまで増加した。これらの結果は、ＧＬＰ−１及び／又はＧＬＰ−２の増加によって、Ｓ−ＣＴＸによって測定した骨吸収を減少させることが出来ることを示す。
【０２２８】
６．５ 実施例５：ＧＬＰ−２注射がＧＬＰ−２及び骨吸収速度に及ぼす影響
年齢が２４乃至５３歳との間である、６人の健常な女性及び３人の健常な男性を試験に加入させ、ＧＬＰ−２注射がＧＬＰ−２発現レベル及び骨代謝回転に及ぼす影響を比較した。骨代謝回転は、被験者の血清中のＳ―ＣＴＸを測定することによって検定分析した。要言すれば、成熟骨組織の吸収過程においてＩ型コラーゲン分解のみにより産生させたＳ―ＣＴＸ断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、免疫測定を行った（Ｒｏｓｅｎｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４４：２２８１−２２８９）。全長ＧＬＰ−２及びＧＬＰ−２（例えば、ＤＰＰ ＩＶ プロテアーゼによる分解生成物を含む）の測定法及び試験対象者の叙述は、Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ． （２０００，“Ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ−２ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ”， Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ８５： ２８８４−２８８８において詳細に記載した通りである。
【０２２９】
試料採取
採血は、注射の前、その過程及び終了後に定期的に行なった。
【０２３０】
介入
被験者は、４００ｐｇの合成ヒトＧＬＰ−２の濃縮塊静脈内注射を受けた。かかる静脈内注射を行なうことによって、２時間後にＳ―ＣＴＸは３３％低下したが、他方ＧＬＰ−２の数値は当然ながら注射の後１時間後にピークにまで増加し、その結果ＧＬＰ−２が増大することによって、Ｓ−ＣＴＸで測定した骨吸収が低下することが示された（図３）。
【０２３１】
本明細書において記載した全ての文献は、その全体として及び刊行物又は特許若しくは特許出願のそれぞれが全ての目的のために全体として参考文献として合体される旨具体的に且つ個別に示されている程度において全ての目的のために参考文献として本願に合体されるものである。
【０２３２】
本発明は、本発明の幾つかの局面に係わる具体的説明として意図されたものである、実施例において開示された具体的実施態様及び本発明の権利範囲内において機能的に均等であるあらゆる実施態様によってその権利範囲が制限されるものではない。事実、本明細書において示され且つ記載されたものに加えて、本発明の種々の変更態様が、当業者にとっては明らかとなるのであり、従って頭書記載したクレームの範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】（Ａ）経口投与グルコース経口投与タンパク質に応答した２−３時間に時間に渉るＧＬＰ−１、ＧＩＰ及びＳ−ＣＴＸの濃度を示す。
【図１Ｂ】（Ｂ）経口投与長鎖脂肪酸に応答した２−３時間に時間に渉るＧＬＰ−１、ＧＩＰ及びＳ−ＣＴＸの濃度を示す。
【図１Ｃ】（Ｃ）経口投与タンパク質に応答した２−３時間に時間に渉るＧＬＰ−１、ＧＩＰ及びＳ−ＣＴＸの濃度を示す。
【図２】通常の食事後３時間の期間に及ぶＳ−ＣＴＸ、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２の濃度を示す。
【図３】合成したヒトＧＬＰ−２４００ｐｇの皮下注射後７時間の期間に及ぶＳ−ＣＴＸ及びＧＬＰ−２の濃度を示す。

Claims (2)

1. 脊椎動物のグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）であるＧＬＰ−２分子、又はＧＬＰ受容体アゴニストを構成するその類縁体であって、脊椎動物のＧＬＰ−２のアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が欠失され、又は１つ以上のアミノ酸が付加され、又は１つ以上のアミノ酸が置換されており、前記類縁体が脊椎動物のＧＬＰ−２分子のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列からなる類縁体と
   他の治療薬剤と
   を含む、骨損失に至る骨吸収と骨形成との間の不均衡を特徴とする骨関連疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、前記他の治療薬剤が、
   抗骨粗しょう症剤であるナトリウムアレンドロネート、クロンドロネート、エチドロネート、硝酸ガリウム、ミトラマイシン、酢酸ノレチンドロン、パミドロネートもしくはナトリウムリセドロネート、又は
   インシュリン放出薬剤であるＧＬＰ−１、ナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）、レパグリニド（Ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）、スルホニル尿素、もしくはバゾプレッシン、又は
   グルカゴン阻害薬剤である位置１、２、３−５、９−１１、２１又は２９においてアラニン残基を有する置換グルカゴン、ｄｅｓ−Ｈｉｓ^１−Ａｌａ^２−グルカゴン、もしくはｄｅｓ−Ｈｉｓ^１−［Ａｌａ^２，１１−Ｇｌｕ^２１］グルカゴン、又は
   概日性リズム調節薬剤であるアルキレンジオキシベンゼンアゴニスト、メラトニン、ニューロペプチドＹ、タキキニンアゴニスト、もしくは可視光線治療、又は
   ステロイドホルモンであるアンドロゲン、グルココルチコイド、エストロゲン性ホルモン、もしくはプロジェスチン、又は
   非ステロイドホルモンであるカルシトニン、カルシトリオール、成長ホルモン、メラトニン、副甲状腺ホルモン、プロスタグランジン、もしくは甲状腺ホルモン、又は
   内皮単球活性化因子、顆粒球単球コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、リンホトキシンーα、リンホトキシンーβ、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子様サイトカイン、マクロファージ炎症性タンパク質、単球コロニー刺激因子、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ１３７リガンド、Ｆａｓリガンド、もしくはＯＸ４０リガンドであるサイトカイン、又は
   抗肥満薬剤であるベンズファタミン、ベンジルイソプロピルアミン、ブプロピオン、デキスフェンフルラミン、デキストロアンフェタミン、ジエチルプロピオン、ジメチルフェネチルアミン、エボダミン、フェンフルラミン、フルキセチン、マジンドール、メタンフェタミン、ナルトレキソン、オーリスタット、フェンジメトラジン、フェンテルミンもしくはシブトラミンである医薬組成物。
2. 前記類縁体が、脊椎動物のＧＬＰ−２分子のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の医薬組成物。

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