JP2000226334A

JP2000226334A - 部分的成長ホルモン不感受性症候群の治療

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Publication number: JP2000226334A
Application number: JP2000001444A
Authority: JP
Inventors: Kenneth Attie; アティー，ケネス; Lena M S Carlsson; エム．エス．カールッソン，レナ; Neil Gesundheit; ゲサンドハイト，ネイル; Audrey Goddard; ゴッダード，オードリー
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-04-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2000-08-15
Also published as: CA2187274C; MX9604635A; DE69521796D1; MX9701916A; EP0754048A1; PT754048E; EP0754048B1; GR3036901T3; CA2187274A1; JPH09509430A; ES2160704T3; DK0754048T3; JP3366644B2; US5646113A; WO1995027495A2; ATE203165T1; WO1995027495A3; DE69521796T2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトの部分的成長ホルモン不感受性症候群の患
者の成長速度を向上させるための方法の提供。【解決手段】身長が年齢および性別のわりに標準より−
２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパ
ク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏
差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより
低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レ
ベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成
長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群
(Ｌａｒｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ)ではないヒト患者の成長
速度を高めるための、有効量のＩＧＦ−Ｉおよび製剤学
的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、ヒトの部分的成長
ホルモン不感受性症候群の患者の成長速度を向上させる
ための方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】有意に背の低い多くの子供達は、誘発的
な刺激に対する成長ホルモン（ＧＨ）の応答によって古
典的に定義される成長ホルモン（ＧＨ）欠損症ではな
い。背の低さの原因としてかつて知られていたものは排
除され、これらの患者は、背の低い家系であること、体
質的に成長が遅れていること、または「特発性」で背が
低いこと（ＩＳＳ）を含む様々な用語で分類される。こ
うした子供達のうちの何人かは、大規模な長期的な研究
の結果には報告されないが、彼らの遺伝的に潜在する身
長に達しないかもしれない。正常な成長と発達に寄与す
る非常に多くの因子があるので、ＩＳＳの患者は、背が
低いことの原因論に関しては一様ではない。古典的なＧ
Ｈ欠損症ではないにもかかわらず、多くのＩＳＳの子供
達は、ＧＨ欠損症と同様な応答ではないが、ＧＨの治療
に応答する。

【０００３】多くの調査者が、この患者の仲間（セッ
ト）において自然発生的なＧＨ分泌障害を調査した。あ
る仮説は、これらの患者のうちの幾人かは、生理的条件
下では内因性のＧＨの分泌が不十分であるが、伝統的な
ＧＨ刺激試験でのように、薬理的刺激に応答してＧＨが
上昇することが証明される可能性があるということを示
唆した。この障害は、「ＧＨ神経分泌機能不全」と言わ
れ、診断は、長期間の血清のサンプリングにおける異常
なＧＨのパターンの証明に基づく。非常に多くの調査者
がこうした研究の結果を報告し、時折存在するにすぎな
いこの異常を発見した。他の調査者は、これらの患者が
「生物学的に不活性なＧＨ」を有していることを仮定し
たが、このことは、未だ決定的には証明されていない。

【０００４】ＧＨ受容体（ＧＨＲ）がクローニングされ
たとき、血中における主要なＧＨ結合活性は、ＧＨＲと
同じ遺伝子に由来するタンパク質によるものであり、Ｇ
ＨＲ全長の細胞外ドメインに対応することが示された。
成長ホルモン不感受性（またはラロン(Laron) ）症候群
（ＧＨＩＳ）の患者の多くは、成長ホルモン受容体結合
活性を欠いており、血中のＧＨ−結合タンパク（ＧＨＢ
Ｐ）活性がないか、あるいは活性が非常に低い。このよ
うな患者は、約５〜６の平均身長標準偏差スコア（ＳＤ
Ｓ）を有し、ＧＨ治療に抵抗性であり、血清ＧＨ濃度が
上昇しており、血清インシュリン様成長ホルモン（ＩＧ
Ｆ−Ｉ）濃度は低い。彼らは、ＩＧＦ−Ｉの治療には応
答する。ＧＨＲの細胞外ドメインに欠損を有する患者で
は、循環中における機能的なＧＨＢＰの不足がＧＨ不感
受性のためのマーカーとして役に立つ。

【０００５】血中ＧＨＢＰが低いＩＳＳ患者にはサブク
ラスがあり、彼らは完全なＧＨＩＳ（ラロン症候群）と
正常な子供達との中間にある平均身長ＳＤＳを有し、幾
分かはＧＨ治療に応答するが、完全には応答しない。こ
のクラスの患者は、部分的ＧＨＩＳの患者として特徴付
けられる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、部分
的ＧＨＩＳを示し、完全ＧＨＩＳまたはラロン症候群で
はないISSの患者のサブセットを同定することである。

【０００７】本発明の別の目的は、この同定された患者
のサブセットを治療して、中間親(mid-parental)目標身
長として定義される彼らの遺伝的な素質と矛盾しない最
終的な身長に到達させることである。

【０００８】これらおよび他の目的は、当業者には自明
であろう。

【０００９】

【課題を解決するための手段】したがって、１つの局面
においては、本発明は、有効量のＧＨを患者に投与する
ことからなる部分的ＧＨＩＳのヒト患者の成長速度を高
める方法を提供する。当該患者は、年齢および性別のわ
りに標準より約−２標準偏差未満の身長であり、高親和
性ＧＨＢＰの血清レベルが標準レベルより少なくとも２
標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベ
ルより低く、そして平均または最大刺激ＧＨの血清レベ
ルが少なくとも標準であり、またラロン症候群ではな
い。好ましくは、上記ＧＨは、ヒト組換えＧＨである。

【００１０】他の局面においては、本発明は、有効量の
ＩＧＦ−Ｉ（好ましくは、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉ）を患
者に投与することからなる部分的ＧＨＩＳのヒト患者の
成長速度を高める方法を提供する。当該患者は、年齢お
よび性別のわりに標準より約−２標準偏差未満の身長で
あり、高親和性ＧＨＢＰの血清レベルが標準レベルより
少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが
標準平均レベルより低く、ＧＨの平均または最大刺激血
清レベルが少なくとも標準であり、またラロン症候群で
はない。

【００１１】さらに別の局面においては、本発明は、Ｉ
ＧＦ−ＩとＧＨとを有効量で組み合わせて患者に投与す
ることからなる部分的ＧＨＩＳのヒト患者の成長速度を
高める方法を提供する。当該患者は年齢および性別のわ
りに標準より約−２標準偏差未満の身長であり、高親和
性ＧＨＢＰの血清レベルが標準レベルより少なくとも２
標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベ
ルより低く、ＧＨの平均または最大刺激血清レベルが少
なくとも標準であり、またラロン症候群ではない。

【００１２】

【発明の実施の形態】定義本発明によって治療された患者の母集団には、「ラロン
症候群」患者、別に言えばＧＨＲ機能の完全な欠損を伴
う人々または完全なＧＨＩＳとして知られ、ここで定義
される患者は含まれていない。これらの患者は、成人の
身長が110〜130cmに達するにすぎない。別の共通の症状
は、顔と顎とが小さく、鼻梁橋が低く、前頭部が隆起し
ており、肥満、甲高い声、および幼少期における低血糖
症を含む。生化学的には、彼らは、血清ＧＨ濃度が上が
っているものの血清ＩＧＦ−Ｉ濃度が低いことで特徴づ
けられる。

【００１３】「ヒト患者の成長速度の向上」は、上記の
患者が、ＧＨで治療されたＧＨ−欠損患者（例えば、Ｇ
ＨＤと診断された患者）と少なくとも同じ最終的身長に
達する状態のみならず、ＧＨで治療されたＧＨ−欠損患
者と同様の成長速度で上記患者が身長において追いつく
状態、または目標とする身長の範囲、すなわち、中間親
(mid-parental)目標身長で決定される彼らの遺伝的素質
と矛盾しない最終的な身長の範囲にある身長に達すると
いう状態をいう。

【００１４】「部分的成長ホルモン不感受性症候群」ま
たは「部分的ＧＨＩＳ」とは、その患者が、ＧＨ−欠損
患者に投与したのと同じ用量のＧＨに対して応答する
が、ＧＨ−欠損患者と同様の応答はしない症候群をい
う。この症候群は、さらに、その患者が、年齢および性
別のわりに標準より約−２標準偏差未満の身長であり、
好ましくは、年齢および性別のわりに標準より約−２〜
約−４標準偏差未満の範囲内の身長であり、高親和性Ｇ
ＨＢＰの血清レベルがヒト標準レベルより少なくとも２
標準偏差（典型的には２〜４標準偏差）低く、ＩＧＦ−
Ｉの血清レベルがヒト標準平均レベルより低く、そして
ＧＨの平均または最大刺激血清レベルが少なくともヒト
の標準であることで特徴付けられる。平均血清レベル
は、患者における測定の平均値である。

【００１５】ここで使用されるように、「非−ＧＨ−欠
損低身長」は、年齢およびレベル以下のＧＨ分泌レベル
に基づいて定義される）ＧＨＤを有さない患者をいう。

【００１６】ここで使用されるように、「成長ホルモ
ン」または「ＧＨ」は、本来の配列の成長ホルモンまた
はそれらの変異型の成長ホルモンをいい、天然、合成ま
たは組換えのいかなるソース（材料）から得られたもの
でもよい。実施例はヒトの成長ホルモン（ｈＧＨ）を含
む。これはヒトの本来の配列を有する天然型ＧＨまたは
組換え型のＧＨ（ソマトトロピンまたはソマトロピン）
であり、そして組換え型成長ホルモン（ｒＧＨ）は、組
換えＤＮＡ技術によって産生されたいかなるＧＨまたは
ＧＨ変異体をもいい、ソマトレム、ソマトトロピン、ソ
マトロピンを含む。ここでヒトへの使用に好適なもの
は、組換え型のヒト本来の配列の成熟ＧＨであり、N-末
端にメチオニンを有していてもいなくてもよい。より好
適なものは、大腸菌で、例えば、1988年７月５日に発行
された米国特許番号第 4,755,465号およびGoeddel et a
l., Nature, 282:544(1979)中に記載された方法によっ
て産生されたメチオニル−ヒト成長ホルモン（met-ｈＧ
Ｈ）である。Met-ｈＧＨはプロトロピンＲ（Protropin
Ｒ）の商品名でGenentech, Inc.,より販売されている
が、Ｎ−末端にメチオニン残基が存在している点を除い
て天然のポリペプチドと同一である。この付加されたア
ミノ酸は、細菌のタンパク合成過程によって生じたもの
である。好適な組換えｈＧＨもまた、ニュートロピンＲ
（NutropinＲ）の商品名でGenentech, Inc.,より市販さ
れている。後者のヒトｈＧＨは、このメチオニン残基を
欠いており、天然型のホルモンと同一のアミノ酸配列を
有している。Grayらの論文（Gray et al.,Biotechnolog
y, ２: 161(1984)）を参照せよ。メチオニルｈＧＨと
ｈＧＨとはいずれも、等価な有効性と薬物動力学値とを
有している。Mooreらの論文（Moore et al., Endocrino
logy, 122: 2920-2926(1988)）を参照せよ。別の適当
なｈＧＨの候補は、1987年６月２日に発行された米国特
許番号第4,670,393号に記載されたように、純粋なソマ
トゲン活性を有し、ラクトゲン活性を有しない胎盤型の
ＧＨであるｈＧＨ変異体である。1990年５月３日に公開
されたWO 90/04788 および1992年６月11日に公開された
WO92/09690に記載されたＧＨの変異体もまた含まれる。

【００１７】ここで使用されるように、「ＩＧＦ−Ｉ」
は、ウシ、ブタ、ウマ、トリを含むいかなる種、好適に
はヒトから、本来の配列または変異体で得られるインシ
ュリン様成長ホルモン−Ｉであり、これは、天然、合
成、組換えといういかなるソースから得られるものでも
よい。ＩＧＦ−Ｉは、ヒト血清から単離され、遺伝子組
換えによって産生された。例えば、EP 123,228および12
8,733を参照せよ。

【００１８】ここで、ヒトに好適に使用されるものは、
ヒトの本来の配列の成熟ＩＧＦ−Ｉであり、より好適に
は、例えば、1987年８月５日に公開されたEP 230,869；
1984年12月19日に公開されたEP 128,733；または1988年
10月26日に公開されたEP 288,451に記載された方法によ
って製造された、Ｎ−末端にメチオニンを有しないＩＧ
Ｆ−Ｉである。より好ましくは、この本来の配列のＩＧ
Ｆ−Ｉを遺伝子組換えで産生したものであり、臨床試験
のためにGenentech, Inc.,、South San Francisco, CA
から市販されている。

【００１９】好適なＩＧＦ−Ｉ変異体は、1991年12月31
日に発行された米国特許番号第5,077,276号、1987年２
月26日に公開されたPCT WO 87/01038、1989年 6月29日
に公開されたPCT WO 89/05822中に記載されるもの、す
なわち、少なくともグルタミン酸残基が成熟分子のＮ−
末端から３番目の位置にないか、Ｎ−末端で５個までの
アミノ酸が欠失しているものである。最も好ましい変異
体は、Ｎ−末端から最初の３個のアミノ酸が欠失したも
のである（脳ＩＧＦ、ｔＩＧＦ−Ｉ、des(1-3)−ＩＧＦ
−Ｉ、またはdes-ＩＧＦ−Ｉ）と種々に称されてい
る）。

【００２０】「高親和性成長ホルモン結合タンパク質」
または「高親和性ＧＨＢＰ」は、ヒトを含めた幾つかの
種において血中で循環し、ＧＨＢＰとして機能するＧＨ
Ｒの細胞外ドメインをいう。（Ymer and Herington, Mo
l. Cell. Endocrino., 41: 153(1985)；Smith and Tala
mantes, Endocrinology, 123: 1489-1494(1988)；Emtne
r and Roos,Acta Endocrinologica(Copenh.), 122: 296
-302(1990) ）。Baumann et al., J. Clin. Endocrino
l. Metab.(J.C.E.M.), 62: 134-141(1986)； 1990年５
月９日に公開されたEP 366,710；Herington et al., J.
Clin. Invest.,77: 1817-1823(1986) ；Leung et al.,
Nature, 330: 537-543(1987)を参照せよ。

【００２１】ＧＨに対して低い親和性を有する第二のＢ
Ｐもまた、ＧＨＲに構造的に関連しないらしいというこ
とが記載されている。Baumann and Shaw, J.C.E.M., 7
0: 680-686(1990)。Carlsson et al., J.C.E.M, 73: 12
16 (1991) 及び米国特許番号第5,210,017号に記載され
た、好適なリガンド−媒介免疫蛍光アッセイ（LIFA）法
を用いた、血清中で機能するＧＨＢＰを測定するための
種々の方法がある。

【００２２】本発明による治療の標的となる患者のサブ
集団は先に定義したような部分的ＧＨＩＳを有する患者
からなる。こうした患者は本発明の方法により治療可能
であるとされた、それぞれの臨床的徴候を示さなければ
ならない。

【００２３】ＧＨおよび／またはＩＧＦ−Ｉは非経口、
鼻腔内、肺内、経口を含む適当な経路で、あるいは皮膚
からの吸収により患者に直接投与される。それらを一緒
に投与する場合、同一の経路で投与する必要はない。そ
れらは局所的または全身的に投与することができる。非
経口投与の例として、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、
腹腔内投与などがある。それらは皮下注射により毎日投
与することが好ましい。

【００２４】治療に用いるＧＨおよび／またはＩＧＦ−
Ｉは、個々の患者の臨床状態（特にＧＨまたはＩＧＦ−
Ｉ単独による治療の副作用）、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ組
成物の送達部位、投与方法、投与計画、医師に知られた
他の要因を考慮に入れて、治療しやすい形態に製剤化さ
れ、そして投薬されるだろう。かくして、ここで用いる
各成分の「有効量」はこうした考慮すべき要件により決
定されるもので、患者の成長速度を高める量である。

【００２５】ＧＨを単独で投与する場合、約０．２ｍｇ
／ｋｇ／週より多い投薬量を用いることが好ましく、約
０．２５ｍｇ／ｋｇ／週より多くすることがより好まし
く、約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に等しいか、それより多く
することがより一層好ましい。一つの実施態様におい
て、ＧＨの投薬量は約０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ／週の
範囲であり、他の実施態様では、０．３５〜１．０ｍｇ
／ｋｇ／週である。有利には、ＧＨを１日１回皮下投与
する。

【００２６】ＧＨは連続投与または非連続投与に適して
おり、例えば、特定の投薬量の注入形態で一定の回数
（例：１日１回）投与される。その場合、注入時に血漿
ＧＨ濃度の上昇が見られ、その後は次回の注入時まで血
漿ＧＨ濃度の低下が見られる。別の非連続投与法は、初
期の集中投薬とその後の遅滞投薬といった、有効成分の
断続的な放出をもたらす、入手可能な多くのインプラン
ト器具およびＰＬＧＡマイクロスフェアを使用するもの
である。例えば、米国特許第4,767,628 号明細書の第２
欄第19-37 行を参照のこと。

【００２７】また、ＧＨを血液中に連続的に存在させ
て、それをＧＨ投与の間中維持するように投与すること
もできる。これは最も好ましくは連続注入によって、例
えば浸透圧ミニポンプのようなミニポンプを使って行わ
れる。また、ＧＨの頻繁な注射（すなわち、１日に１回
より多い、例えば２または３回の注射）により行うこと
も適している。

【００２８】さらに別の実施態様において、血液からの
ＧＨのクリアランスを遅らせるか、または、例えば注入
部位からのＧＨの徐放を起こさせる、長時間作用性のＧ
Ｈ製剤を用いてＧＨを投与することができる。ＧＨ血漿
クリアランスを長引かせる長時間作用性製剤は、１種以
上の結合タンパク質(1992 年５月29日に公開されたWO92
/08985) のような巨大分子、またはＰＥＧ、ポリプロピ
レングリコールホモポリマーおよびポリオキシエチレン
ポリオール（すなわち、室温で水に溶解するもの）から
選ばれた水溶性ポリマーに複合体化または（可逆的もし
くは不可逆的結合により）共有結合させたＧＨの形態で
ありうる。また、ＧＨの循環半減期を引き延ばすために
ＧＨをポリマーに複合体化または共有結合させてもよ
い。この目的にかなうポリエチレンポリオールおよびポ
リオキシエチレンポリオールの例としては、ポリオキシ
エチレングリセロール、ポリエチレングリコール、ポリ
オキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレングル
コースなどがある。ポリオキシエチレングリセロールの
グリセロール骨格は、例えばモノ−、ジ−およびトリグ
リセリドとして動物やヒトに存在するものと同じ骨格で
ある。

【００２９】ポリマーは特定の分子量をもつ必要はない
が、好ましくは約３５００〜１００，０００の分子量で
あり、５０００〜４０，０００がより好ましいものであ
る。ＰＥＧホモポリマーは非置換であることが好ましい
が、一端がアルキル基で置換されていてもよい。アルキ
ル基は好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましく
はメチル基である。最適には、ポリマーは非置換のＰＥ
Ｇホモポリマー、モノメチル置換のＰＥＧホモポリマー
（ｍＰＥＧ）またはポリオキシエチレングリセロール
（ＰＯＧ）であって、分子量が約５０００〜４０，００
０のものである。

【００３０】ＧＨは、主に反応条件、ポリマーの分子量
などに応じて、ＧＨの１以上のアミノ酸残基を介してポ
リマーの末端反応性基に共有結合させる。１個以上の反
応性基をもつポリマーをここでは活性型ポリマーと呼ぶ
ことにする。この反応性基がＧＨの遊離アミノ基または
他の反応性基と選択的に反応する。しかし、最適な結果
を得るために選ばれる反応性基のタイプおよび量、なら
びに用いるポリマーのタイプは、その反応性基がＧＨの
あまりに多くの活性基と反応するのを回避するため、用
いる特定のＧＨに左右されることが理解されよう。完全
に回避することは不可能かもしれないが、一般には、タ
ンパク質の濃度に応じて、タンパク質１モルにつき約
０．１〜１０００モル、好ましくは２〜２００モルの活
性型ポリマーを用いることが提案される。タンパク質１
モルあたりの活性型ポリマーの最終量は、最適活性を維
持すると同時に、可能ならば、そのタンパク質の循環半
減期を最適化するようにバランスのとれた量である。

【００３１】アミノ酸残基は１もしくは２個のシステイ
ンまたはＮ末端アミノ酸基のような任意の反応性アミノ
酸でありうるが、好ましくは、反応性アミノ酸はリシン
（その遊離ε−アミノ基を介して活性型ポリマーの反応
性基に連結される）またはグルタミン酸もしくはアスパ
ラギン酸（アミド結合を介して該ポリマーに連結され
る）である。

【００３２】共有結合修飾反応は、生物活性物質を不活
性ポリマーと反応させるために常用されるどのような適
当な反応で行ってもよく、ＧＨの反応性基がリシン基で
ある場合はｐＨ５〜９で行うことが好ましく、ｐＨ７〜
９がより好ましい。一般に、この方法は活性型ポリマー
（少なくとも１個の末端ヒドロキシル基をもつ）を製造
し、このポリマーから活性基体を作製し、その後ＧＨと
活性基体とを反応させて製剤化に適したＧＨを製造する
ことを含む。上記の修飾反応は１以上の工程を含むいく
つかの方法により行うことができる。１工程反応で活性
型ポリマーを製造するために用いられる修飾試薬の例に
は、シアヌル酸塩化物（2,4,6-トリクロロ-S- トリアジ
ン）とシアヌル酸フッ化物がある。

【００３３】一つの実施態様では、修飾反応は２工程で
行われ、その場合、最初にポリマーを酸無水物（例え
ば、無水コハク酸、無水グルタル酸）と反応させてカル
ボン酸を製造し、次にこのカルボン酸を、該カルボン酸
と反応しうる化合物と反応させて、ＧＨと反応可能な反
応性エステル基をもつ活性型ポリマーを形成させる。こ
のような化合物の例を挙げると、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホ
ン酸などであり、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドまたは４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホ
ン酸を用いる。例えば、モノメチル置換ＰＥＧと無水グ
ルタル酸とを高温で、好ましくは約１００〜１１０℃
で、４時間反応させる。次に、このように製造されたモ
ノメチルＰＥＧ−グルタル酸を、ジシクロヘキシルまた
はイソプロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド
試薬の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応さ
せて、活性型ポリマーのメトキシポリエチレングリコリ
ル−Ｎ−スクシンイミジルグルタレートを製造し、その
後ＧＨと反応させることができる。この方法は Abuchow
ski ら, Cancer Biochem. Biophys., 7:175-186 (1984)
に詳述されている。もう一つの例として、モノメチル置
換ＰＥＧを無水グルタル酸と反応させ、続いてジシクロ
ヘキシルカルボジイミドの存在下で４−ヒドロキシ−３
−ニトロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させて
活性型ポリマーを製造することができる。ＨＮＳＡは B
hatnagarら, Peptides: Synthesis-Structure-Functio
n, Proceedings of the Seventh American Peptide Sym
posium, Rich ら (編) (Pierce Chemical Co., Rockfor
d IL, 1981), p.97-100、および Niteckiら, High-Tech
nology Route to Virus Vaccines (American Society f
or Microbiology: 1986),標題“Novel Agent for Coupl
ing Synthetic Peptides to Carriers and Its Applica
tions"(合成ペプチドをキャリアーに結合させるための
新規な試薬およびその応用) に記載されている。

【００３４】ＰＥＧに結合させたＧＨを製造するための
特定の方法として、ＰＥＧ−ＧＨに関する米国特許第4,
179,337 号および可逆的にしかし共有結合でＧＨに結合
されたＰＥＧを開示する米国特許第4,935,465 号に記載
された方法がある。ＰＥＧ−ＧＨの他の製造方法には以
下のものが含まれる。

【００３５】メトキシポリエチレングリコールアルデヒ
ド（Ｍｅ−ＰＥＧアルデヒド) を用いる還元的アルキル
化によるＰＥＧ化および精製を行うため、リン酸緩衝溶
液（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中の２ｍｇ／ｍＬのＧＨに、５
ｍＭのＭｅ−ＰＥＧアルデヒド−５０００（分子量５０
００ダルトン）および２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ3 を加
え、室温で３時間穏やかに混合する。次にエタノールア
ミンを加えて５０ｍＭにし、残存する未反応Ｍｅ−ＰＥ
Ｇを還元的にアミド化する。この混合物をアニオン交換
カラムＦＰＬＣＭｏｎｏＱで分離する。過剰の未反応
Ｍｅ−ＰＥＧはカラムに結合せず、混合物から分離でき
る。未反応ＧＨの分子量が２０Ｋであるのに対し、還元
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３０Ｋおよび４０Ｋの見かけ分子量
を有する２つの主要なＰＥＧ化ＧＨ画分が得られる。同
様にしてＧＨ−ＧＨＢＰ複合体をＰＥＧ化すると、ゲル
濾過により１５０Ｋの誘導体が得られる。

【００３６】Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルＰＥＧ
（ＮＨＳ−ＰＥＧ）によるＰＥＧ化および精製を行うた
め、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）
またはＰＢＳ（ｐＨ７）中に２ｍｇ／ｍＬのＧＨを含む
溶液に、ＧＨの総リシン濃度の５倍過剰モル量のＮＨＳ
−ＰＥＧを加え、室温で１時間混合する。Superose 12
分離用カラムおよび／またはＦＰＬＣのＭｏｎｏＱで
生成物を分離する。ＰＥＧ化ＧＨは、ゲル濾過で測定す
ると、ｐＨ８．５で実施した反応より得られる約３００
ＫからｐＨ７．０の反応より得られる４０Ｋまでの範囲
で反応のｐＨに応じて大きさが変化する。ＧＨ−ＧＨＢ
Ｐ複合体も同様にＰＥＧ化され、この場合に得られる分
子量はゲル濾過により４００〜６００Ｋｄである。

【００３７】ＰＥＧ−マレイミドによるＧＨのシステイ
ン変異体のＰＥＧ化を行うためには、部位特異的突然変
異誘発によりＧＨの単一システイン変異体を製造し、そ
れを大腸菌１６Ｃ９株（deoCタンパク質を産生しないW3
110 △tonA phoA △E15 △(argF-lac)169 deoC2 ）から
分泌させ、アニオン交換カラムにかけて精製する。

【００３８】１６Ｃ９株は、ＣＧＳＣ＃６０９２株（E.
coli Genetic Stock Center [NewHaven, Conn.] から
入手可能で、Markら, Molec. Gen. Genet., 155: 145-1
52 (1977) に記載されている、遺伝子型 trxA1 recA1 i
lvE720::tn5 metE70 deoC2 lacZ53 rha5 malB45 rpsL15
1 を有する No. 6092 ）由来のdeoC2 対立遺伝子を７Ｃ
１と呼ばれる菌株に移入することにより遺伝的に作製さ
れたものである。

【００３９】７Ｃ１株 [遺伝子型 W3110 △tonA phoA
△E15 △(argF-lac)169 を有する]は、Ｐｌから誘導さ
れたファージＰｌｋｃ (J. Miller, Experiments in Mo
lecular Genetics [Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold S
pring Harbor Laboratory, 1972]) による形質導入、お
よびトランスポゾン遺伝学 (Klecknerら, J. Mol. Bio
l., 116: 125-159 [1977]) を用いる技術により数段階
で作製されたものである。F-、λ- のＫ１２株（野生型
は F+ 、λ+ ）である大腸菌 K12 W3110 (Bachmann, Ba
ct. Rev., 36: 525-557 [1972]) を出発宿主として用い
た。

【００４０】最初に、tonA遺伝子へのTn10トランスポゾ
ンの挿入とその後の不明確な切り出しによりtonA遺伝子
(fhuA) (Kadnerら, J. Bact., 143: 256-264 [1980]; B
achmann, Microbiol. Rev., 47: 180-230 [1983]) を欠
失させた。

【００４１】この操作手順の第一段階において、大腸菌
W3110にλ::Tn10を導入して大腸菌W3110 のTn10ホップ
プール(hop pool)を形成させた (Klecknerら, J. Mol.
Biol.,前掲) 。大腸菌 W3110::Tn10ホッププールをＬ培
地で３７℃にて増殖させ、約１×１０9／ｍＬの細胞密
度とした。合計０．５ｍＬの培養物を遠心分離し、ペレ
ットを７．０×１０9 ｐｆｕを含むλphi80 溶解物０．
２ｍＬ中に再懸濁した。ファージを３７℃で３０分間吸
着させた。次に、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）
を添加したＥＭＢ平板上に懸濁液を広げた。３７℃で一
夜のインキュベーション後、コロニーを３ｍＬのＬ培地
中に集め、３７℃で一夜増殖させ、２回洗浄してＬ培地
に再懸濁した。バクテリオファージＰｌｋｃの溶解物を
この培養物上で調製した (Miller, J.H., Experiments
in Molecular Biology, 前掲, p.304)。

【００４２】このＰ１Ｋｃ溶解物により大腸菌ＡＴ９８
２（E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Con
n.）に形質導入を生じさせてテトラサイクリン耐性に変
えた。テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）と４０μｇ
／ｍＬのジアミノピメリン酸（ｄａｐ）を添加したＬ培
地上で形質導入体を選択した。得られた形質導入体をテ
トラサイクリン耐性および dap遺伝子の再生(dap+, tet
R) についてスクリーニングした。その後dap+, tetR 形
質導入体をλphi80 耐性について試験した。

【００４３】次いで、Ｐｌｋｃ溶解物をいくつかの dap
+, tetR, λphi80-耐性株上で調製した。この溶解物を
用いて大腸菌 W3110をテトラサイクリン耐性に変えた。
形質導入体をスクリーニングし、λphi80 耐性を選択し
た。

【００４４】W3110 tonA::Tn10-λphi80R形質導入体か
らテトラサイクリン感受性分離株を選択した。Maloy an
d Nunn, J. Bacteriol., 145: 1110 (1981) 参照。単一
コロニーの精製後、これらの分離株をλphi80 耐性およ
びテトラサイクリン感受性について調べた。

【００４５】テトラサイクリン感受性でλphi80-耐性の
いくつかの変異体からＤＮＡを単離しSstII で消化し
た。Tn10が切り出されたかどうかを判定するため、プロ
ーブとして放射性標識したSstII-消化λ::Tn10 DNAを用
いてサザンブロット法によりSstII-消化 DNAの特性付け
を行った。Davis ら, Advanced Bacterial Genetics (C
old Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) 参
照。λ::Tn10由来のＤＮＡと親 W3110 tonA::Tn10-λph
i80R由来のＤＮＡとのハイブリダイゼーションに比べ
て、テトラサイクリン感受性分離株の１つがTn10ハイブ
リダイゼーションバンドのうち２つを失っていたことが
わかった。３つ目のハイブリダイゼーションバンドは移
動度が変化しており、これはTn10の不明確な切り出しが
原因で欠失が起こったことを示している。

【００４６】不明確なTn10切り出しを有する菌株からの
外膜調製物のＳＤＳゲル電気泳動から、TonAタンパク質
と思われたバンドは、野生型TonAタンパク質と比べて、
電気泳動移動度が変化することが明らかになった。得ら
れたタンパク質はλphi80 ファージ受容体タンパク質と
して機能しなかった。やはりTn10の不明確な切り出しを
受けた第２の独立した菌株は、ＳＤＳゲル上にTonAタン
パク質を全然示さなかった。

【００４７】これらの菌株はどちらもテトラサイクリン
耐性またはλphi80 感受性への復帰を示さず、このこと
はtonA遺伝子の部分または完全欠失とともにTn10トラン
スポゾンの全部または一部の不明確な切り出しがあった
ことを示している。こうして、TonAタンパク質(MW 78,0
00) が外膜から除かれ、W3110 tonA株はいくつかのバク
テリオファージに対して耐性となった。

【００４８】その後、２以上の欠失変異、phoA△E15 (S
arthy ら, J. Bact., 145: 288-292[1981])および△(ar
gF-lac)-169 (Schweizer ら, Mol. Gen. Genet., 192:
293-294 [1983])を同時に、プロリン生合成遺伝子に挿
入したカナマイシン耐性トランスポゾン (proC::Tn5)へ
の遺伝子連鎖によりW3110 tonAに導入した。

【００４９】グルコース最少寒天平板で自然原栄養(pro
+ ) 復帰変異体を選択することによりトランスポゾンを
除いた。phoA変異の導入は、０．２ｍＭのリン酸塩およ
び２０ｍｇ／Ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルホスフェートを加えたグルコース最少寒天平板上に
白色コロニーを形成する形質導入体として認められた。
同様に、△(argF-lac)-169変異はβ- ガラクトシダーゼ
酵素の欠損を起こさせ、MacConkey-1%ラクトース寒天平
板上に白色コロニーを形成する細胞をもたらす。この結
果が７Ｃ１株であった。

【００５０】最後に、ファージＰｌｋｃを用いる多段階
の形質導入法により、アルドラーゼを除くdeoC変異 (Ba
chmann, 前掲) を７Ｃ１株に導入した。標準的な形質導
入法を採用した。最初に、トレオニン栄養要求性を７Ｃ
１株に導入し、以下のとおりにしてdeoC遺伝子の領域に
導入した染色体セグメントの陽性選択のための手段を得
た。

【００５１】Ｐｌｋｃをトレオニン栄養要求株上で増殖
させた。このような栄養要求株は Clare N. Berg and D
ouglas E. Berg, Microbiology-1981, “Bacterial Tra
nsposons", pp. 107-116 (Amer. Soc. for Microbiolog
y, Washington, DC, 1981)に記載されている。得られた
溶解物により７Ｃ１株に形質導入を生じさせてテトラサ
イクリン耐性に変え、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリ
ンを含むＬＢ平板で形質導入体を選択した。得られた１
４Ａ９と名づけた菌株 (tonA△, phoA△E15, △(argF-
lac)-169thr::tn10) は高頻度で原栄養株に自然に復帰
したので、１６Ｃ４株と称する安定したテトラサイクリ
ン感受性トレオニン栄養要求株を選択するためにフザリ
ン酸平板 (J. Bact., 145: 1110 [1981]) を用いた。

【００５２】Ｐｌｋｃを上記のＣＧＳＣ＃６０９２株上
で増殖させた。得られた溶解物を用いて１６Ｃ４株に形
質導入を生じさせて原栄養株に変え、グルコース最少寒
天平板上での増殖について選択した。高頻度形質導入溶
解物を２Ｄ４株から得るためには、Ｐｌｋｃをこの宿主
上で２回繰り返し増殖させる必要があった。１６Ｃ４株
の５個の原栄養形質導入体を単離し、精製してチミジン
最少寒天平板上での増殖について試験した。５個の分離
株のうち４個はチミジン上で増殖できなかった。それゆ
え、これらはdeoCタンパク質の合成を排除するdeoC2 変
異を受け取っていたことになる。これら４個の分離株の
うち１個を取っておき、１６Ｃ９株（△tonA, phoA, △
E15, △(argF-lac)169, deoC2）と名づけた。

【００５３】ＰＥＧ−マレイミドは、モノメトキシＰＥ
Ｇアミンとスルホ−ＭＢとを０．１Ｍリン酸ナトリウム
（ｐＨ７．５）中で室温にて１時間反応させて製造し、
リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）への緩衝液交換を行った。
次に、余分の遊離システインを有するＧＨを加えて１時
間混合し、Ｍｅ−ＰＥＧアルデヒドＰＥＧ化ＧＨと同様
にして最終混合物をＭｏｎｏＱカラムにかけて分離し
た。

【００５４】エステル結合は化学的にも生理学的にも不
安定であるので、結合反応にはエステル官能基を含まな
いＰＥＧ試薬を使用することが好ましいかもしれない。
例えば、ＰＥＧ−モノメチルエーテルをホスゲンと反応
させてＰＥＧ−クロロホルメートを得ることによりカル
バメート結合を製造することができる。次に、この試薬
をＮＨＳエステルと同様に使用することによりリシンの
側鎖アミンを官能化することができる。別の例では、ア
ミノ−ＰＥＧ−モノメチルエーテルをホスゲンと反応さ
せて尿素結合を形成させる。これはリシンアミンと反応
しうるＰＥＧ−イソシアネートを生成させるだろう。

【００５５】ＰＥＧ試薬中に開裂可能なエステルを含ま
ないＰＥＧ−ＧＨの好適な製造方法は次のとおりであ
る。Buckmannら, Macromol. Chem., 182: 1379-1384 (1
981)に記載されるように、メトキシポリ（エチレングリ
コール）をナフタリンナトリウムで滴定してカルボン酸
に変換してアルコキシドを生成し、続いて酢酸ブロモエ
チルで処理してエチルエステルを形成し、その後水酸化
ナトリウムと水で処理して対応するカルボン酸に加水分
解する。得られたカルボン酸を次いで酢酸エチル中でジ
シクロヘキシルカルボジイミドおよびＮＨＳと反応させ
て、ＧＨのアシル化に適するＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミジルエステルに変換する。

【００５６】得られたＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を、ＧＨに対
して３０倍過剰モル量を用いて、ホウ酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８．５）中室温で１時間１２ｍｇ／ｍＬのＧＨ
と反応させ、TRIS緩衝液でQ Sepharose カラムにかけ、
塩勾配で溶出する。次に、０．３Ｍクエン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化した第２のカラム（フェ
ニル Toyopearl）にかける。ＰＥＧ化されたＧＨを逆塩
勾配で溶出し、プールし、Ｇ２５脱塩カラムを使ってマ
ンニトール、グリシンおよびリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．４）に緩衝液交換して適当に製剤化されたＰ
ＥＧ７−ＧＨを得る。

【００５７】ＰＥＧ化ＧＨ分子およびＧＨ−ＧＨＢＰ複
合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、トリプシ
ンマッピング、液体クロマトグラフィー−質量スペクト
ル分析およびin vitro生物学的アッセイにより特性付け
することができる。まず初めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとゲ
ル濾過によってＰＥＧ化の程度を知り、その後ＮＭＲで
分析してＰＥＧのメチレン水素に特有の共鳴ピークを確
認する。各分子のＰＥＧ基の数はＮＭＲスペクトルまた
は質量スペクトルから算出できる。適当には、１０％Ｓ
ＤＳでのポリアクリルアミドゲル電気泳動は溶離緩衝液
として10mM Tris-HCl pH8.0 、100mM NaClを用いて行
う。どの残基がＰＥＧ化されているかを証明するため
に、トリプシンマッピングを行うことができる。そのた
めに、ＰＥＧ化ＧＨをタンパク質／酵素比１００対１
（mg基準）でトリプシンを用いて100mM酢酸ナトリウ
ム、10mM Tris-HCl 、1mM 塩化カルシウム、pH8.3 中37
℃で４時間消化し、ｐＨ＜４に酸性化して消化を停止さ
せ、その後ＨＰＬＣ (Nucleosil C-18; 4.6mm ×150mm,
5μ, 100 Å) で分離する。クロマトグラムをＰＥＧ化
されていない出発物質のものと比較する。次いで各ピー
クを質量スペクトルで分析してそのピークのフラグメン
トの大きさを確認する。通常、ＰＥＧ基をもつフラグメ
ントは注入後ＨＰＬＣカラムに保持されず、クロマトグ
ラフから消えてなくなる。このようなクロマトグラフか
らの消失は、少なくとも１個のリシン残基を含む特定フ
ラグメントへのＰＥＧ化を示すものである。その後、Ｐ
ＥＧ化ＧＨは慣用方法によりＧＨＢＰへのその結合能に
ついてアッセイされる。

【００５８】様々なＰＥＧ化を用いることにより、サイ
ズ排除クロマトグラフィーで測定して３５Ｋ、５１Ｋ、
２５０Ｋおよび３００Ｋの見かけ分子量（それらの天然
流体力学的容積に近似するだろう）を有する種々のＰＥ
Ｇ化野生型ＧＨが得られた。これらをそれぞれＰＥＧ１
−ＧＨ、ＰＥＧ２−ＧＨ、ＰＥＧ３−ＧＨおよびＰＥＧ
７−ＧＨと名づけた。トリプシンマッピングの結果よ
り、ＰＥＧ１−ＧＨとＰＥＧ２−ＧＨは両方とも、クロ
マトグラムから失われるため恐らくＰＥＧ化された（こ
れは液体クロマトグラフの通り抜け画分中に存在する大
型分子種の質量スペクトル分析により確認できる）Ｎ末
端の９アミノ酸フラグメントを有していた。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる分子量から、ＰＥＧ１−ＧＨはＮ末端アミ
ン上に１つのＰＥＧを有し、そしてＰＥＧ２−ＧＨはＮ
末端アミン上に２つのＰＥＧ分子を有して第三級アミド
を形成しているだろう。ＰＥＧ３−ＧＨはＮＭＲの結果
に基づくと１分子あたり約５個のＰＥＧ基を有し、トリ
プシンマッピングでは少なくとも５つのペプチドフラグ
メントが失われた。このことはそれらがＰＥＧ化されて
いることを示唆している。ＰＥＧ７−ＧＨは質量スペク
トル分析に基づくと１分子あたり６〜７個のＰＥＧ基を
もつと考えられる。

【００５９】ＰＥＧ基をＧＨに付加させる部位およびこ
うした結合に適する残基はＮ末端のメチオニンまたはフ
ェニルアラニン、リシン３８、リシン４１、リシン７
０、リシン１４０、リシン１４５、リシン１５８および
リシン１６８である。ＰＥＧ化されないらしい２つのリ
シンはリシン１１５とリシン１７２であった。また、Ｇ
Ｈは持続放出性システムで適切に投与しうる。ここで有
用な持続放出性組成物の例として、例えばフィルムやマ
イクロカプセルのような成形品の形をした半透性ポリマ
ーマトリックスがある。持続放出性マトリックスにはポ
リアクチド（米国特許第3,773,919 号、ヨーロッパ特許
第58,481号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グ
ルタメートとのコポリマー (Sidmanら, Biopolymers, 2
2, 547-556[1983])、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタ
クリレート）(Langer ら, J. Biomed. Mater. Res., 1
5: 167-277 [1981]; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105
[1982]) 、エチレンビニルアセテート (Langerら, 前
掲) もしくはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸
（ヨーロッパ特許第133,988 号）、またはＰＬＧＡマイ
クロスフェアが含まれる。

【００６０】さらに、持続放出性ＧＨ組成物はリポソー
ムに保持させたＧＨを含む。ＧＨ保持リポソームはそれ
自体公知の方法で調製される。例えば、DE 3,218,121;
Epstein ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3
692 (1985); Hwang ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,
046; EP 143,949; EP 142,641;日本特許出願第83-11800
8 号; 米国特許第4,485,045 号および第4,544,545 号;
およびEP 102,324を参照のこと。通常、リポソームは小
型（約２００〜８００Å）の単ラメラ型のもので、リピ
ド含量が約３０モル％より多いコレステロールであり、
所与の割合が最適治療のために調整される。さらに、生
物学的に活性な持続放出性製剤は、1989年８月15日付け
の米国特許第4,857,505 号に記載されるような、活性化
多糖に共有結合されたＧＨの付加物から製造することが
できる。さらに、米国特許第4,837,381 号は脂肪または
ワックスまたはそれらの混合物とＧＨとの徐放性マイク
ロスフェア組成物を記述している。

【００６１】別の実施態様において、上記で確認された
患者は有効量のＩＧＦ−Ｉで治療される。一般的な提案
として、１回あたりに非経口投与されるＩＧＦ−Ｉの薬
学的に有効な総量は、患者の体重の約５０〜２４０μｇ
／ｋｇ／日、好ましくは１００〜２００μｇ／ｋｇ／日
の範囲であるが、上記のように、これは治療上の裁量で
決定されるだろう。また、ＩＧＦ−Ｉを皮下注射により
１日に１または２回投与することも好ましい。

【００６２】ＩＧＦ−Ｉは注射（１回または複数回、例
えば１日に１〜４回）または輸液を含めて任意の手段で
投与しうる。ＧＨと同様に、ＩＧＦ−Ｉもまた、ＧＨに
ついて上述したように、治療期間中ずっと血中に存在す
るように製剤化することができる。こうして、ＩＧＦ−
Ｉをポリマーに共有結合させたり、上記のような持続放
出性製剤にしてもよい。

【００６３】さらに、ＩＧＦ−Ｉを１種以上のその結合
タンパク質、例えば現在知られているもの、すなわちＩ
ＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧ
ＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５またはＩＧＦＢＰ−６と一
緒に投与することも適している。投与のためにＩＧＦ−
Ｉを受容体または抗体もしくは抗体フラグメントに結合
させてもよい。ここでＩＧＦ−Ｉに好適な結合タンパク
質はＩＧＦＢＰ−３であり、これは米国特許第5,258,28
7 号および Martin and Baxter, J. Biol. Chem., 261:
8754-8760 (1986) に記載されている。このグリコシル
化ＩＧＦＢＰ−３タンパク質は、大部分の内因性ＩＧＦ
を保持していて、やはりＧＨにより調節される、ヒト血
漿中に存在する１２５〜１５０Ｋｄの糖タンパク質複合
体の、酸に安定な成分（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５
３Ｋｄ）である。

【００６４】ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ結合タンパク質との同
時投与は米国特許第5,187,151 号に記載の方法により行
われる。簡単に説明すると、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰを
約０．５：１〜約３：１のモル比で、好ましくは約１：
１のモル比で皮下ボーラス注射により有効量で投与す
る。

【００６５】更なる実施態様において、ＩＧＦ−ＩとＧ
Ｈの両方をそれぞれ有効量で、またはそれぞれの最適量
より少ないが一緒になると有効な量で、患者に投与する
ことができる。好ましくは、このような量は約５０〜１
００μｇ／ｋｇ／日のＩＧＦ−Ｉおよび約０．３ｍｇ／
ｋｇ／週のＧＨである。例えば静脈内または皮下手段を
使って、注射によりＩＧＦ−ＩとＧＨの両方を投与する
ことが好ましい。皮下注射によりＩＧＦ−ＩとＧＨの両
方を投与することがより好ましく、毎日注射することが
最も好ましい。

【００６６】ＩＧＦ−ＩとＧＨの両方の用量を決める医
師の注意すべき点は、これらのホルモンによる治療にお
いて知られている副作用を考慮することである。ＧＨの
副作用としては、ナトリウムの保持および細胞外容積の
増加 (Ikkos ら, Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32:
341-361 [1959]; Biglieri ら, J.C.E.M., 21: 361-37
0 [1961]) 、そして高インスリン症と高血糖症が挙げら
れる。ＩＧＦ−Ｉの主な副作用は低血糖症である。Gule
r ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1
989)。実際、ＩＧＦ−ＩとＧＨの併用は両薬剤の望まし
くない副作用（例えば、ＩＧＦ−Ｉの低血糖症およびＧ
Ｈの高インスリン症）の低減、ＧＨの血中濃度の回復
（ＧＨの分泌がＩＧＦ−Ｉにより抑制される）をもたら
す可能性がある。

【００６７】非経口投与のために、一つの実施態様にお
いて、ＩＧＦ−ＩとＧＨの一般的な製剤化は、それぞれ
を所望の純度で、１回量の注射可能な形態（溶液、懸濁
液または乳濁液）で、製剤学的に許容される担体（すな
わち、用いる投与量および濃度でレシピエントに無毒性
であり、その製剤の他の成分と適合性であるもの）と混
合することにより行われる。例えば、製剤は酸化剤およ
びポリペプチドに有害であることが知られている他の化
合物を含まないことが好ましい。

【００６８】一般に、製剤を調製するには、ＩＧＦ−Ｉ
とＧＨのそれぞれを液状担体または微細な固形担体また
は両者と均質に接触させる。次に、必要ならば、生成物
を所望の製剤に成形する。好ましくは担体は非経口用の
担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張
の溶液である。このような担体ビヒクルの例には、水、
食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などがある。
不揮発性油やオレイン酸エチルのような非水性ビヒクル
も、ここではリポソームと同様に有用である。

【００６９】担体は少量の添加剤例えば等浸透圧や化学
的安定性を高める物質を含むことが好ましい。この種の
物質は用いる投与量および濃度でレシピエントに無毒性
のものであり、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、コハ
ク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩；抗酸化
剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未
満）のポリペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリ
ペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチ
ンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ
ビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖、二糖
および他の炭水化物、例えばセルロースまたはその誘導
体、グルコース、マンノースまたはデキストリン；キレ
ート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニ
トールまたはソルビトール；対イオン、例えばナトリウ
ム；および／または非イオン界面活性剤、例えばポリソ
ルベート、ポロクサマーまたはＰＥＧ、などが含まれ
る。

【００７０】ＩＧＦ−ＩおよびＧＨはそれぞれ個々に上
記のようなビヒクル中に約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ、
好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、約４．５〜８
のｐＨに調合する。全長ＩＧＦ−Ｉは約５〜６のｐＨ
に、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉは約３．２〜５のｐ
Ｈに調合することが好ましい。ＧＨは７．４〜７．８の
ｐＨにすることが好ましい。上記のある種の賦形剤、担
体または安定剤を使用すると、ＩＧＦ−ＩまたはＧＨ塩
の製剤が得られることが理解されるだろう。

【００７１】ＧＨはどのような適当な方法で製剤化して
もよいが、好適なＧＨ製剤は次のとおりである。ｍｅｔ
−ＧＨ (Protropin Ｒ商標名) の場合は、予備凍結乾燥
バルク溶液が２．０ｍｇ／ｍＬのｍｅｔ−ＧＨ、１６．
０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．１４ｍｇ／ｍＬのリ
ン酸ナトリウム、および１．６ｍｇ／ｍＬのリン酸ナト
リウム（一塩基の一水和物）、ｐＨ７．８を含む。ｍｅ
ｔ−ＧＨの５ｍｇバイアルは５ｍｇのｍｅｔ−ＧＨ、４
０ｍｇのマンニトール、および合計１．７ｍｇのリン酸
ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）、ｐＨ７．
８を含む。１０ｍｇバイアルは１０ｍｇのｍｅｔ−Ｇ
Ｈ、８０ｍｇのマンニトール、および合計３．４ｍｇの
リン酸ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）、ｐ
Ｈ７．８を含む。

【００７２】ｍｅｔ不含ＧＨ (NutropinＲ商標名) の場
合は、予備凍結乾燥バルク溶液が２．０ｍｇ／ｍＬのＧ
Ｈ、１８．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．６８ｍｇ
／ｍＬのグリシン、０．４５ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリ
ウム、および１．３ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム（一
塩基の一水和物）、ｐＨ７．４を含む。５ｍｇバイアル
は５ｍｇのＧＨ、４５ｍｇのマンニトール、１．７ｍｇ
のグリシン、および合計１．７ｍｇのリン酸ナトリウム
（乾燥重量）（二塩基の無水物）、ｐＨ７．４を含む。
１０ｍｇバイアルは１０ｍｇのＧＨ、９０ｍｇのマンニ
トール、３．４ｍｇのグリシン、および合計３．４ｍｇ
のリン酸ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）を
含む。

【００７３】また、商標名をNutropinＲというｈＧＨの
液体製剤も用いられ、例えば５．０±０．５ｍｇ／ｍＬ
のｒｈＧＨ；８．８±０．９ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウ
ム；２．０±０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０；
２．５±０．３ｍｇ／ｍＬのフェノール；２．６８±
０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水和物；およ
び０．１７±０．０２ｍｇ／ｍＬの無水クエン酸（無水
クエン酸ナトリウム／クエン酸の合計量は２．５ｍｇ／
ｍＬ、つまり１０ｍＭ）；ｐＨ６．０±０．３を含む。
この製剤は３ｃｃのガラスバイアル中に上記製剤を２．
０ｍＬ充填してある１０ｍｇバイアルとすることが好ま
しい。また、上記製剤を含む１０ｍｇ（２．０ｍＬ）カ
ートリッジを患者への液体ＧＨ注入用のペンの中に配置
することができる。

【００７４】ＩＧＦ−Ｉは投与に適するどのような方法
で製剤化してもよいが、好適な製剤は約２〜２０ｍｇ／
ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、約２〜５０ｍｇ／ｍＬの浸透圧調節
剤 (osmolyte) 、約１〜１５ｍｇ／ｍＬの安定剤、およ
び約ｐＨ５〜５．５の緩衝液を含むものである。好まし
くは、浸透圧調節剤は約２〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の無
機塩または約４０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度の糖アルコー
ルであり、安定剤はベンジルアルコールまたはフェノー
ルまたは両者であり、そして緩衝液は酢酸塩緩衝液であ
る。最も好ましくは、浸透圧調節剤が塩化ナトリウム
で、酢酸塩が酢酸ナトリウムである。さらにより好まし
くは、ＩＧＦ−Ｉの量を約８〜１２ｍｇ／ｍＬに、塩化
ナトリウムの量を約５〜６ｍｇ／ｍＬに、ベンジルアル
コールの量を約８〜１０ｍｇ／ｍＬに、フェノールの量
を約２〜３ｍｇ／ｍＬに、そしてｐＨが約５．４となる
ように酢酸ナトリウムの量を約５０ｍＭとする。さら
に、この製剤は約１〜５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤、好ま
しくは約１〜３ｍｇ／ｍＬの量のポリソルベートまたは
ポロクサマーを含むことができる。

【００７５】さらに、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ、好ましく
は全長ＩＧＦ−Ｉ、を適当な担体ビヒクル中に一緒に調
合して医薬組成物（細胞を含まないものが好ましい）を
調製することもできる。一つの実施態様において、製剤
化に用いる緩衝液はその組成物を混合直後に用いるか、
それとも後で使用するために保存するのかによって決ま
るだろう。混合直後に用いるのであれば、全長ＩＧＦ−
ＩとＧＨの混合物をマンニトール、グリシンおよびリン
酸塩、ｐＨ７．４中に調合することができる。その混合
物を保存するのであれば、クエン酸塩のような約ｐＨ６
の緩衝液中に調合し、このｐＨでのＧＨの溶解性を高め
る界面活性剤、例えば０．１％のポリソルベート２０ま
たはポロクサマー１８８を添加する。最終製剤は安定し
た液体または凍結乾燥固体でありうる。

【００７６】好適な組合せ組成物はＩＧＦ−Ｉ：ＧＨの
重量比が約１：１〜１００：１（ｗ／ｗ）のＩＧＦ−Ｉ
およびＧＨ、約０．０５〜０．３ｍＭの浸透圧調節剤、
約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの安定剤、約１〜５ｍｇ／ｍ
Ｌの界面活性剤、および約５〜１００ｍＭの緩衝液（約
ｐＨ５〜６）を含むものである。好ましくは浸透圧調節
剤は無機塩であり、界面活性剤は非イオン性である。よ
り好ましくは、無機塩が塩化ナトリウムまたは塩化カリ
ウムであり、安定剤がフェノールまたはベンジルアルコ
ールであり、界面活性剤がポリソルベートまたはポロク
サマーであり、緩衝剤が酢酸ナトリウムまたはクエン酸
ナトリウムまたは両者であり、そしてＩＧＦ−Ｉおよび
ＧＨの量がそれぞれ約２〜２０ｍｇ／ｍＬおよび約０．
２〜１０ｍｇ／ｍＬであり、ＩＧＦ−Ｉ：ＧＨの重量比
が約１：１〜５０：１である。さらに好ましくは、ＩＧ
Ｆ−Ｉの量を約５〜１０ｍｇ／ｍＬに、ＧＨの量を約１
〜５ｍｇ／ｍＬに、ＩＧＦ−Ｉ：ＧＨの重量比を約１：
１〜４：１に、塩化ナトリウムの量を約５〜７ｍｇ／ｍ
Ｌに、フェノールの量を約０．１〜３ｍｇ／ｍＬに、ベ
ンジルアルコールの量を約６〜１０ｍｇ／ｍＬに、界面
活性剤を約１〜３ｍｇ／ｍＬの量のポリソルベートに、
酢酸ナトリウムの量を約２．５〜４ｍｇ／ｍＬに、そし
てクエン酸ナトリウムの量を約０．１〜１ｍｇ／ｍＬに
する。

【００７７】治療に用いるＩＧＦ−ＩおよびＧＨは無菌
であることが好ましい。滅菌は無菌の濾過膜（例えば、
０．２ミクロン膜）を通して濾過することにより簡単に
行える。治療用のＩＧＦ−ＩおよびＧＨ組成物は一般
に、無菌のアクセス口を備えた容器、例えば皮下注射針
で突き刺すことのできるストッパーを有する静脈内溶液
バッグまたはバイアルの中に入れる。

【００７８】ＩＧＦ−ＩおよびＧＨは通常、１回量容器
または多数回量容器、例えば密閉されたアンプルまたは
バイアルの中に、水溶液あるいは用時調製のための凍結
乾燥製剤として保存されるだろう。凍結乾燥製剤の例と
して、１０ｍＬバイアルに滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）
ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ水溶液５ｍＬを充填し、この混合
物を凍結乾燥する。注入用の溶液は静菌性の注射用水を
用いて凍結乾燥ＩＧＦ−ＩおよびＧＨを用時調製するこ
とにより得られる。

【００７９】本発明は以下の実施例を参考とすることに
より一層理解しやすくなるだろう。しかしながら、これ
らの実施例は本発明の範囲を制限するものとして解釈さ
れるべきでない。引用文献および特許はすべて参考とし
てここに組み入れるものとする。

【００８０】

【実施例】実施例Ｉ本実施例では、ＧＨＢＰの血清濃度を、成長不全（ＧＨ
ＤもしくはＴＳ）またはＩＳＳという一定の病因を有す
る背の低い子供から得た多数のサンプルで測定し、正常
な対照群のＧＨＢＰレベルと比較した。対照被検者血清中のＧＨＢＰの正常範囲を確立するために、773 人
の子供（女子 366人および男子 407人）のサンプルを分
析した。年齢範囲は３歳〜16歳であり、いくつかの場合
は、被検者の年齢は最も近い年齢として報告された。サ
ンプルの大部分は、膵臓のβ−細胞に対する抗体を検出
するためのスクリーニングプログラム（Pasco Co. Scho
ol System, Florida）によって、就学年齢の正常な集団
から得たものであり、他のサンプルは一般に、Dr. Juan
Sotos of Children's Hospitalof Columbus, Ohio お
よび Dr. Rebecca Kirkland of Baylor College of Mei
cine, Houston, Texasから提供された。子供たちは健康
であり、身長に関してはアメリカの人口のある断面を代
表していると考えられる。成長が遅れている被検者成長が遅れている子供たち（１歳〜17歳）の血清サンプ
ルは、NCGSの市販開始後の監視プロジェクト（Post-mar
keting surveillance project)に登録された 776人の被
検者のベースライン評価で集めた。サンプルは、この研
究に関係する 106のセンターから提供された。

【００８１】分析に含めたＧＨＤおよびＩＳＳの子供た
ちは全員、年齢および性別の平均より身長が２ＳＤＳ以
上低かった。被検者は、彼らの登録医によりＧＨＤであ
ると分類された。ＧＨＤの子供たちで、最大刺激または
内因性ＧＨレベルが 10 μg/L 以上であることが治療医
によって報告された者 (不特定の方法を用いて) 、また
は Genentech Inc. でダブルモノクローナルイムノラジ
オメトリックアッセイ（Tandem-R HGH, Hybritech, San
Diego, CA）を使用して10μg/L 以上と測定された者は
いなかった。中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍など、ＧＨＤに
器質的原因がある被検者は除外された。

【００８２】ＮＣＧＳデータベースにＩＳＳとして分類
された患者は、登録医により（種々の用語を使用して）
それとして示されるか、身長の低さが器質的病因ではな
いと示されると共に、10μg/L より高い、刺激されたＧ
Ｈレベルまたは内因性ＧＨレベルを有していた。ＴＳの
患者は、かれらの登録医によってそのように特定され、
種々の形態のモザイク現象を有する患者を含んでいる。
被検者として含まれる者で、以前に何らかの形でＧＨ治
療を受けた者はいなかった。ＧＨＢＰ測定ＧＨＢＰは、上述したようにＬＩＦＡによって測定し
た。簡単に述べると、 96 ウェルマイクロタイタープレ
ート（Corning Glass Works, Corning, New York) を、
50m mol/L の炭酸緩衝液（ｐＨ 9.6）中 10 μg/mLの抗
体 100μL/ウェルとともに４℃で一夜インキュベートす
ることにより、ＧＨＢＰに対するモノクローナル抗体
（MAb 263, Agen, Australia) で被覆した。その被覆し
たウェルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（5 g/L)を
含む 150μL のＰＢＳ（ｐＨ 7.2）でブロックし、洗浄
した。標準物質（組換えｈＧＨＢＰ）またはサンプル
（50μL/ウェル）を、50μL/ウェルの組換えｈＧＨ（20
0 μg/L; Genentech, Inc.）およびマウス免疫グロブリ
ンＧ（10 g/L; Fitzgerald Industries, Chelmsford, M
A)とともに被覆ウェルに分注した。

【００８３】プレートを密閉し、おだやかに攪拌しなが
ら室温で２時間インキュベートし、洗浄した後、ホース
ラディッシュペルオキシダーゼと結合させたモノクロー
ナル抗−ＧＨ抗体（MAb MCB, Genentech, Inc.）（100
μL/ウェル）を添加した。さらに室温で２時間インキュ
ベートした後、プレートを洗浄用緩衝液で６回洗浄し
た。新しく調製した基質溶液（0.4 g のｏ−フェニレン
ジアミン二塩酸塩／1 LのＰＢＳ＋ 0.4 mL の 30 % 過
酸化水素）をプレートに添加し（100 μL/ウェル）、イ
ンキュベーションを遮光して 15 分間、室温で行なっ
た。100 μL の 2.25 モル/Lの硫酸を添加することによ
り反応を停止し、490 nmでの吸光度を測定した。ＬＩＦ
Ａの検出範囲は、 15.6 〜 1000 ピコモル/Lであった。
アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は各々、約 7 %
および 11 % であった。サンプルは全て、n ＝２で測定
した。ＧＨ測定異なる群における自発的ＧＨ分泌を評価するために、85
1 人の子供たちから 20 分間隔で 12 時間（午後８時〜
午前８時）にわたって採血した血清サンプル中のＧＨ濃
度を測定した。各被検者に対して平均値を計算した。検
出限界が0.5 μg/L であるモノクローナル抗体ベースの
イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ（Tandem-R
HGH, Hybritech ））を用いて、ＧＨ濃度を測定した。ＩＧＦ−Ｉ測定一夜ＧＨサンプリングの際に、子供 858人から採取した
血清サンプル中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、ＲＩＡ、続いて酸
エタノール抽出を使用してベースラインで測定した（IG
F-I RIA キット, Nichols Institute, San Juan Capist
rano, CA) 。統計的分析標準化した身長（ＳＤＳ）を年齢および性別特異的平均
値から計算し、標準偏差は、アメリカの子供たちの Nat
ional Center for Health Statistics（ＮＣＨＳ）標準
データから得た。Hamillら、Am. J. Clin. Nutrition,
32: 607-629 (1979)。ボディ・マス指数（ＢＭＩ）は、
体重（kg）／〔身長（ｍ）〕2 という式を使用して計算
した。成長が遅れている子供達の年齢、身長ＳＤＳ、お
よびＢＭＩの平均値とＳＤ値を、ＮＣＧＳ登録用紙に報
告されたデータから計算した。ＧＨＢＰ濃度（表１およ
び３）の平均並びに標準偏差、および 12 時間ＧＨ濃
度平均（表４）に対する平均並びに標準偏差は、デー
タが非対称性であるため、対数変換した後に計算した。
次いで、平均の真数、平均±２ＳＤ（ＧＨＢＰ、表１）
および平均±１ＳＤ（ＧＨＢＰ、表３および平均 12 時
間ＧＨ平均、表４）を計算して、表に挙げた値を得
た。対称群のＧＨＢＰ濃度の対数に対する年齢および性
別の影響を分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価した。

【００８４】標準化したＧＨＢＰレベル（ＳＤＳ）の計
算は、下記式を利用して、性別および年齢によりグルー
プ分けした対照群のデータから得た平均および関連した
ＳＤに基づいて行なった。 3〜15歳（対照サンプルが利
用できた年齢範囲）の個々のＧＨＢＰ濃度に対しては、ＳＤＳ＝log（ＧＨＢＰ）−平均（ｌｏｇ（ＧＨＢＰ）
｜年齢、性別）／ＳＤ（ｌｏｇ（ＧＨＢＰ）｜年齢、性
別）［式中、平均（ log（ＧＨＢＰ）｜年齢、性別）は、個
々と同じ年齢および性別の対照被検者に対するＧＨＢＰ
の平均対数値であり、ＳＤ（ log（ＧＨＢＰ）｜年齢、
性別）は関連するＳＤである。］である。ＳＤＳに変換
した後、ＧＨＤ、ＩＳＳおよびＴＳと診断された子供の
血清ＧＨＢＰ濃度を、ＡＮＯＶＡによって互いに比較
し、および同性の対照と比較した。また、ＧＨＢＰＳ
ＤＳは、暦年齢よりもむしろ骨年齢に基づいて計算し
た。

【００８５】どの変数に対しても群間で多重比較したと
き、統計的に有意なｐ−値にボンフェローニ調整(Bonfe
rroni adjustments)を施して、テストの有意水準レベル
を全体で 0.05 に維持した。本明細書では、有意な統計
比較のための名目ｐ−値を含める。結果 3 〜 15 歳の子供の血清ＧＨＢＰ濃度の正常な範囲（平
均±２ＳＤ）を表１に示す。技術的な問題により、５歳
児の子供に対する結果は使用できない。年齢および性別
ともに、ＧＨＢＰ濃度に対して有意な影響を及ぼした。
女子は男子よりもＧＨＢＰ濃度が高かった（ｐ＜0.000
1）。男女とも、ＧＨＢＰ濃度は年齢とともに増加した
（ｐ＜0.0001）。

【００８６】

【表１】

【００８７】表２は、各被検者群に対する年齢、身長Ｓ
ＤＳおよびＢＭＩの平均（±ＳＤ）を示す（身長および
ＢＭＩデータは、対照被検者全員について入手できたわ
けではなかった。）。平均年齢は全部の群で同様であっ
た（約 11 歳）。平均身長ＳＤＳ値は、ＧＨＤ、ＩＳＳ
およびＴＳについて女子の間で、またはＧＨＤおよびＩ
ＳＳについて男子の間では統計的相違はなかった。平均
ＢＭＩ値は、女子（ｐ＜0.0137）および男子（ｐ＜0.00
01）のどちらも、他の成長が遅れている群と比較して、
ＩＳＳ群がかなり低かった。

【００８８】

【表２】

【００８９】図１Ａ〜１Ｅは、ＧＨＤ、ＩＳＳおよびＴ
Ｓの子供各個人の血清ＧＨＢＰ濃度を同性の正常範囲
（−２ＳＤ〜＋２ＳＤ）と比較して示す。全群の対応す
る平均ＧＨＢＰ濃度および平均ＳＤＳ値を表３に示す。
ＧＨＤまたはＩＳＳの男子の場合、平均ＧＨＢＰＳＤ
Ｓは対照の男子より低く（共に、ｐ＜0.0001）、ＩＳＳ
の男子の平均ＳＤＳはＧＨＤの男子より低かった（ｐ＜
0.0001）。ＩＳＳおよびＧＨＤの女子の平均ＳＤＳは、
対照の女子より低かった（各々、ｐ＜0.0001およびｐ＝
0.0046）。さらに、ＩＳＳの女子の平均ＳＤＳはＧＨＤ
の女子より低かった（ｐ＝0.0039）。ＧＨＤ群を、最大
刺激ＧＨレベル＜5 μg/L (n=23)の被検者に限ると、Ｇ
ＨＢＰＳＤＳは対照の平均と有意な差はなかった。

【００９０】ＧＨＤ群とＩＳＳ群との間でＢＭＩが相違
し、ＢＭＩレベルとＧＨＢＰレベルとの間に関係が認め
られるため、ＧＨＢＰにおける群間の相違がＢＭＩにお
ける相違に依存しない場合に、共変量としてＢＭＩを使
用して共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を行なった。男子お
よび女子ともに、ＧＨＤおよびＩＳＳ群のＧＨＢＰの相
違は有意のままであった（ｐ＜0.02）。

【００９１】男子のＩＳＳ被検者の 91 % および女子の
ＩＳＳ被検者の 92 % においてのＧＨＢＰ濃度は、年齢
および性別が同じ対照群の平均以下であった。ＩＳＳの
被験者およびＧＨＤの被検者の間の相違は男子で特に顕
著であり、ＧＨＤの男子は 69 人中わずか 6人（8.7 %)
が平均より２ＳＤＳ低い値であったのに対して、ＩＳＳ
の男子は 394人中 79 人（20.1 %）が平均より２ＳＤＳ
以上低い値であった。

【００９２】ＧＨＤまたはＩＳＳの女子と対照的に、Ｔ
Ｓの子供の平均のＧＨＢＰＳＤＳは、対照の女子と有
意な差はなかった。成長が遅れている群全てに対して、
暦年齢よりも骨年齢を使用して算出したＧＨＢＰＳＤ
Ｓでは、ほとんど差はなかった（表３）。

【００９３】

【表３】

【００９４】12時間一晩中ＧＨをサンプリングする間に
得られた平均ＧＨ濃度の場合（表４）、病因、性別およ
び年齢によるＡＮＣＯＶＡは、病因のみが 12 時間平均
ＧＨレベルに対して有意な影響を与えることを示した。
予期されたように、ＧＨＤの子供の平均値は対照よりも
かなり小さかった（ｐ＜0.0001）。ＴＳの少女の値はＧ
ＨＤの女子の値よりも大きく（ｐ＜0.0001）、ＩＳＳま
たは対照の女子の値より小さかった（共にｐ＜0.002
）。ＩＳＳの被検者の 12 時間平均ＧＨ濃度は、対照
における濃度と統計的に差がなかった。しかし、ＧＨＢ
Ｐレベルが平均より２ＳＤ以上低いＩＳＳ被検者は、Ｇ
ＨＢＰレベルが正常な被検者より平均 12 時間ＧＨ値が
高かった（2.8 対 2.3 μg/L 、ｐ＜0.005 ）。平均Ｉ
ＧＦ−ＩレベルはＧＨＤ患者が最も低く、ＩＳＳおよび
ＴＳ患者の場合は対照より低かった。

【００９５】

【表４】

【００９６】ＩＳＳの子供の何人かの血清ＧＨＢＰ濃度
は、同年齢の対照の子供より低かった。対照の被検者と
比較して、ＧＨＤの子供はＧＨＢＰ濃度が低かったが、
その減少差は、ＩＳＳの子供の場合よりも顕著ではなか
った。診断が染色体異常の存在に基づき、従って完全な
症状のＴＳの少女では、ＧＨＢＰレベルは対照群と差が
なかった。このことは、ＧＨＢＰレベルが身長の低さと
単純には相関しないことを示している。

【００９７】ラロン症候群の患者およびアフリカピグミ
ーなどの末梢ＧＨ作用を害された、地理的および遺伝的
によく定義された母集団の他に、おそらく多様な分子欠
損を表す、よりとらえにくい形態のＧＨ不感受性の被検
者もいるかもしれない。ＩＳＳの子供の成長が遅れるの
原因がおそらく一様でないにもかかわらず、上記の結果
は、ＩＳＳの子供たちの血清ＧＨＢＰ濃度は群としては
減少し、有意な部分集合（20 %）は年齢および性別によ
る正常な平均より２ＳＤ以上低いＧＨＢＰレベルを有す
ることを示す。

【００９８】調査したＩＳＳの子供たちは、ＧＨ分泌に
関しては対照群と差がなく、ＧＨＢＰ濃度はＧＨＤ群よ
り有意に低かった。最大ＧＨ＜ 10 μg/L の任意のカッ
トオフに基づいてＧＨＤと定義された患者のＧＨＢＰレ
ベルは対照より低かった。しかし、最大ＧＨ＜ 5μg/L
のＧＨＤ患者では、平均ＧＨＢＰＳＤＳがＧＨ＞ 5μ
g/L のＧＨＤ群より大きく、対照と差がなかった。実施例ＩＩ市販開始後の監視調査であるthe National Cooperative
Growth Study （ＮＣＧＳ）で追跡した患者を調査し
て、ＧＨＤ患者の成長速度を、ＧＨを種々の用量で投与
して治療したＩＳＳ患者と比較した。ＩＳＳ患者は、Ｇ
ＨＢＰレベルが正常な患者およびＧＨＢＰレベルが低い
患者の両方を含む。図２に示すＩＳＳ患者の結果は、0.
25 ± 0.025 mg/kg/ 週のＧＨで治療した子供たちは、
0.20 mg/kg/ 週以下のＧＨで治療した場合と比較して、
十分に速い成長速度が得られたことを示す。ＧＨＤ患者
との比較より、ＧＨＤ患者で認められたのに近い平均成
長速度の範囲を患者にもたらすためには、0.20 mg/kg/
週までの通常の用量のＧＨでは十分でないが、0.25 ±
0.025 mg/kg/ 週の用量にすると、ＧＨＤ患者で認めら
れた範囲により近い平均成長速度（約 10 cm/ 年）とな
ることが明らかになった。従って、約0.20 mg/kg/ 週よ
り多いＧＨ用量が、本発明で特定された少なくとも何人
かの患者には適する。実施例 III ＩＳＳ患者（最大ＧＨレベル＞ 10 μg/L および身長Ｓ
ＤＳ＜−２によって定義された）のＧＨＢＰレベルは、
ＬＩＦＡによって測定すると、正常な対照と比較して低
い。これは、ＧＨＤまたはＴＳの背の低い子供には当て
はまらなかった。

【００９９】身長の低い子供の評価におけるＧＨＢＰア
ッセイの有用性を評価するために、ＩＳＳ患者を彼らの
ＧＨＢＰＳＤＳに従って群分けした。ＧＨＢＰＳＤ
Ｓの低い患者（＜−２と定義された）をＧＨＢＰレベル
が正常な患者（ＧＨＢＰＳＤＳ＞−２）と比較して、
前者の群に、ＧＨ治療に対する感受性障害の証拠がある
かどうかを調べた。患者の集団ＩＳＳの子供 511人から 96 箇所で血清サンプルを集
め、彼らは次いで、Protropin Ｒという銘柄のｈＧＨで
治療して（１年間の成長データがある患者のＧＨの平均
±ＳＤ用量は 0.26 ± 0.07 mg/kg/週（非経口的な注
入）であり、ＧＨの特定の用量およびスケジュールは、
個々の臨床的な調査者の裁量である）、ＮＣＧＳに登録
した。この調査に含まれるためには、患者が最大刺激Ｇ
Ｈ＞ 10 μg/L および身長ＳＤＳ＜−２を有し、他に報
告された身長の低さの病因がないことが必要である。Ｇ
ＨＢＰの測定の結果は、ＧＨ治療の開始前には未知であ
った。ＧＨ治療中の成長反応を含む分析のために、思春
期前の患者のみを含めた。測定法ＧＨＢＰは、Carlssonら（前出) に記載されているよう
に、ＬＩＦＡを使用してアッセイした。ＧＨＢＰおよび
ＧＨに対するモノクローナル抗体（各々、MAb263 およ
び MAb MCB）を使用した。ＧＨＢＰ値は、Dr. Thomas M
erimee at University of Florida, Division of Endoc
rionology and Metabolism, Health Science Center,
P.O. Box 100226, Gainesville, Florida 32610-0226
および Drs. Sotos and Kirkland（上述）から提供され
たサンプルに基づくＬＩＦＡに対する標準を定めるデー
タを使用して、年齢および性別に対する標準化を行なっ
た。これらの値は先に報告した。Carlssonら、J.C.E.
M., 78: 1325-1330 (1994)。

【０１００】ＧＨに対する終夜サンプルは、二重モノク
ローナルイムノラジオメトリックアッセイ（Tandem-R H
GH, Hybritech, San Diego, CA）を使用して測定した。
ＧＨ刺激テストに対して報告された値は、種々のＧＨ測
定法を使用して測定した。

【０１０１】ＩＧＦ−Ｉは、酸−エタノール抽出（抽出
によるＩＧＦ−Ｉ、Nichols Institute, San Juan Capi
strano, CA）の後にラジオイムノアッセイにより測定
し、提供された標準を定めるデータを使用して年齢およ
び性別に対する標準化を行なった。統計手法身長は年齢および性別に対して標準化し、体重は、北ア
メリカの子供について公表されたデータから得られた標
準を使用して、身長および性別に対して標準化した。Ha
millら、Am. J. Clin. Nutrition, 32: 607-629 (197
9)。母親および父親の身長ＳＤＳを、正常な成人に対す
る身長の百分位数(percentiles) に基づいて計算した。
Hamillら（前出）。

【０１０２】多重直線回帰法を使用して、どの実験変数
がＧＨＢＰＳＤＳと一次的な関係にあるかどうかを調
べた。さらに、被検者をＧＨＢＰＳＤＳに基づいて二
つの群に分け（＜−２ＳＤおよび＞−２ＳＤ）、正常範
囲以下であるＧＨＢＰ値の有意性があるかどうかを求め
た。二つの群を、いくつかの共変量の平均またはメジア
ンに関して互いに比較した（表６参照）。グループ間の
有意性の一変量検定は、以下の三つの検定のうち一つを
使用して行なった。すなわち、ｔ−検定（ガウス分布変
数の場合）、ウィルコクソン検定（非ガウス分布変数の
場合）、またはχ2 検定（無条件(categorical) 変数の
場合）である。多重比較に適合させる(adjust)ために
は、ｐ−値＜0.005 が統計的に有意であると考えられ
た。他の有意な変数をコントロール(control) した後、
ＡＮＣＯＶＡを使用して二つのＧＨＢＰ群の間の差を検
定した。結果ＧＨＢＰが低い群の患者はより若く、体重対身長ＳＤＳ
(weight-for-height SDS) およびＢＭＩが正常なＧＨＢ
Ｐ群より低かった（表５）。平均身長ＳＤＳは両方のグ
ループで -2.9 であり、値の範囲は -5.8 〜 -2.0 であ
った。患者の約４分の３は男子であり、同様の性分布が
ＮＣＧＳデータベース全体において見られる。August
ら、J. Pedatr., 116: 899-903 (1990) 。患者の 72 %
はベースラインで思春期前であった。

【０１０３】

【表５】

【０１０４】ＧＨＢＰＳＤＳ＜−２（平均 -2.5 ）で
ある患者 101例およびＧＨＢＰＳＤＳ＞−２（平均 -
0.9 ）である患者 410例であった。二つのグループの中
央値の最大ＧＨレベルは比較できるものであったが、こ
れらの値は、種々のＧＨアッセイを使用したため評価が
困難である。平均12時間ＧＨ濃度の平均値（Hybritech
アッセイを使用）はＧＨＢＰの低いグループで有意に高
かったが、ＩＧＦ−ＩＳＤＳは有意に低かった（共にｐ
＝0.0001、表６）。

【０１０５】図３は、ＧＨＢＰＳＤＳの低い患者は、
ＩＧＦ−ＩＳＤＳがより低く（図３Ａ）、平均12時間
ＧＨレベルがより高い（図３Ｂ）ことを示す。全ＩＳＳ
患者の間では、ＧＨＢＰＳＤＳはＩＧＦ−ＩＳＤＳ
と正の相関関係を有し（ｒ＝0.285 、ｐ＝0.0001）、平
均12時間ＧＨと負の相関関係を有した（ｒ＝-0.17 、ｐ
＝0.0001）。

【０１０６】年齢、体重対身長ＳＤＳおよび平均12時間
ＧＨの差をコントロールするＡＮＣＯＶＡは、ＧＨＢＰ
ＳＤＳ＜−２である患者は、未だ、ＧＨＢＰＳＤＳ
＞−２（ｐ＝0.0001）である患者よりＩＧＦ−ＩＳＤ
Ｓが有意に低いことを示した。同様に、ＧＨＢＰが低い
グループは、年齢、体重対身長ＳＤＳおよびＩＧＦ−Ｉ
ＳＤＳをコントロールした後、ＧＨＢＰが正常なグル
ープより平均12時間ＧＨが有意に高かった。

【０１０７】

【表６】

【０１０８】成長速度の分析は、考慮した治療期間中、
思春期前であった患者に限定した。治療の最初の３年間
の各年には、ＧＨＢＰＳＤＳと成長速度または身長Ｓ
ＤＳ変化のいずれかとの有意な一次相関は見られなかっ
た。治療前の成長速度平均は、ＧＨＢＰＳＤＳに関係
なく、約 4 cm/年であった。ＧＨ治療の最初の１年の平
均成長速度は約 8 cm/年であった。図４は、ＧＨ治療を
行なった思春期前の患者の最初の１年の成長速度をＧＨ
ＢＰＳＤＳに対してプロットして示す。二つの間に統
計的に有意な相関関係は認められなかった（ｒ＝0.047
、ｐ＝0.55、ｎ＝166 ）。その図は、本発明によって
治療することができる患者は、このサブ集団で必要であ
ると記載したＧＨ、ＩＧＦ−Ｉおよび身長の要件を有す
るとすれば、影をつけた部分以下の患者であることを示
す。その結果は、ＧＨＢＰＳＤＳレベルが低く、本発
明の判定規準を有する患者がＧＨの薬理的投与に応答す
ることを示す。

【０１０９】図５および６は、患者の治療前と１年目の
成長速度とを比較したものである（図５では、２年目の
成長速度も比較している。）。これらの図は、特定の患
者のＧＨＢＰＳＤＳが−２または＞−２であるかどう
かにかかわらず、ＧＨ治療患者に明らかに成長の増加が
みられることを示す。

【０１１０】表７は、ＧＨＢＰＳＤＳが低い群の成長
応答データを、ＧＨＢＰＳＤＳが正常な群と比較して
示す。二つの群は、治療の最初の１年間、平均ＧＨ用量
および注射スケジュールは同じであった。治療前の成長
速度またはＧＨ治療の最初の４年間の成長速度について
は、それらの群間に有意な差はなかった。身長ＳＤＳの
平均変化も、二つの群間で統計的に差はなかった。４年
間追跡した患者の平均増加は、ＧＨＢＰが低い群では
1.5±0.6 （ｎ＝13) であり、ＧＨＢＰが正常な群では
1.7±0.6 （ｎ＝21) であった。

【０１１１】

【表７】

【０１１２】低身長は、種々の方法、例えば標準身長水
準の一定のパーセンタイル以下であるなどの方法で定義
することができるが、この調査における患者は、より選
別されたグループを代表している。これらの患者は皆、
ＧＨ治療の処方を受け、登録医師によるスクリーニング
および選抜を通過した。さらに、身長ＳＤＳが−２以上
である患者はこの調査に含めなかった。その結果得られ
たグループは、平均身長ＳＤＳが -2.9 であり、平均骨
年齢遅延が 2.4歳であり、平均成長速度は 4.2cm/年で
あった。これらは、他の報告によるＧＨで治療したＩＳ
Ｓ患者と類似していた。Hopwood ら、J. Pediatr., 12
3: 215-222 (1993); Albertsson-Wikland, Acta Paedia
tr. Scand. Suppl., 343: 77-84 (1988) 。この選抜グ
ループでは、年齢および性別に対して標準化した後、お
よび骨年齢に対して調整した後に、血清ＧＨＢＰレベル
が低い患者が何人かいることが分かった。Carlssonら、
J.C.E.M., 78, 前出。

【０１１３】ＧＨＢＰは、ＧＨＲと同じ遺伝子から誘導
され、その細胞外ドメインと配列相同性を共有すること
が示された。Leung ら、Nature, 330: 537-543 (1987)
。機能性アッセイを使用して測定した血清ＧＨＢＰレ
ベルは、完全ＧＨＩＳの患者では、低いか検出できなか
った。Fielder ら、J.C.E.M., 74: 743-750 (1992)。こ
の実施例では、子供の正常な範囲のＧＨＢＰレベルを年
齢および性別によって測定し、ＩＳＳ患者に見られる低
いＧＨＢＰレベルは、正常もしくはＧＨ欠損患者または
ターナー症候群に見られるＧＨＢＰレベルよりもかなり
低いことが分かった。Carlssonら、J.C.E.M., 78, 前
出。

【０１１４】この調査の子供たち全員に対して、ＧＨに
対する 12 時間一晩中の血清サンプリングを行なうと、
平均レベルは正常であった。これは、理論に縛られない
ならば、神経分泌機能不全がほとんどの患者になかった
ことを示唆する。12時間ＧＨレベル平均は、正常なヒト
で述べられているのと同様に、平均ＧＨＢＰＳＤＳと
負の相関関係を示した。Marthsら、J.C.E.M., 73: 175-
181 (1991)。しかし、ＩＧＦ−ＩＳＤＳは、ＧＨＢＰ
ＳＤＳと正の相関関係にあつた。すなわち、ＧＨＢＰ
レベルの低い患者は、ＧＨは高いがＩＧＦ−Ｉレベルは
低く、これはＧＨ無感覚と一致した。

【０１１５】ＧＨＢＰ濃度の有意な予報値は体組成物で
あり、それは、身長および年齢に対して標準化したＢＭ
Ｉおよび体重の両方を使用して評価した。ＡＮＣＯＶＡ
では、年齢および体重／身長ＳＤＳに対して調節する
と、ＧＨＢＰが 12 時間ＧＨ平均およびＩＧＦ−ＩＳ
ＤＳの有意な予報値のままであることが分かった。

【０１１６】ＮＣＧＳデータベースに登録した思春期前
の患者に対して利用できる成長データは、ベースライン
ＧＨＢＰＳＤＳと、治療前の成長速度またはベースラ
イン身長ＳＤＳとの間に有意な一次相関関係を示さなか
った。理論に縛られないならば、考えられる一つの説明
は、成長速度および身長がＧＨで治療すべき患者を選別
するために通常使用され、従ってこの患者集団では一様
に低いということである。

【０１１７】興味深い知見は、ＧＨＢＰＳＤＳとＧＨ
治療に対する成長反応との相関関係がないことである。
ＧＨ分泌およびＧＨＢＰレベルは、正常に成長している
子供では負の相関関係があると考えられるので（Martha
ら、前出）、正常な範囲は図７に示すように提案するこ
とができる。ＧＨＢＰレベルに対して過剰ＧＨを有する
患者は過剰成長すると予想され、ＧＨレベルがＧＨＢＰ
レベルに対して低すぎる患者は成長が不十分であろう。
現在、ＧＨＤは任意に定義され、ＧＨ分泌の度合にのみ
基づく。この任意の閾値以上（および本発明の範囲内）
のＧＨレベルを有する何人かの患者は、低いＧＨＢＰレ
ベルに関して不十分な量のＧＨを有する可能性があり、
その結果、成長が不十分となる。この部分集団の患者
（正常な人と比較してＧＨＢＰおよびＩＧＦ−Ｉレベル
が低く、12時間ＧＨレベル平均が高く、部分的ＧＨ無感
覚を示唆している）に外因性ＧＨを投与すると、循環Ｇ
Ｈが低いＧＨＢＰレベルに対してより適したレベルに上
がることが予想され、従って、部分的な抵抗状態が克服
される。実施例 IV 序論ＧＨＤでない低身長の子供（非ＧＨ欠損低身長の子供）
の大部分における成長不全の病因は十分定義されていな
い。これらの、身長が低くなければＩＳＳの正常な子供
である彼らは、薬学的刺激に反応して正常な量のＧＨを
つくり出すが、正常な成長パターンを示すことができな
い。Lippe および Nakamoto, Rec. Prog. Horm. Res.,
48: 179-235 (1993)。彼らの成長不全を説明するため
に、多くのＧＨ関連欠損症が提案されている。例えば、
神経分泌機能不全（Spiliotis ら、J. Am. Med. Asso
c., 251: 2223-2230 (1984); Zadikら、Pediatrics, 7
6: 355-360 (1985)）および免疫学的には反応するが生
物学的には不活性なＧＨであるなど。Kowarskiら、J.C.
E.M., 47: 461-464 (1978); Valenta ら、N. Eng. J. M
ed., 31: 214-217 (1985) 。これらの機構は、何人かの
ＩＳＳ患者では正常に成長できないことを説明できる
が、大部分は、ＧＨ分泌または機能に明白な欠損はない
と思われる。Lanes, Am. J. Dis. Child., 143: 1284-1
286 (1989); Ilondoら、J.C.E.M., 70: 1445-1451 (199
0)。

【０１１８】別の可能性は、ＩＳＳ患者は生物活性なＧ
Ｈの正常な分泌パターンを有し、欠損は、ＧＨに反応す
る標的細胞の能力にあるということである。そのような
欠損は、ＧＨＲまたはＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−Ｉ受
容体などのＧＨシグナル媒介物質のレベルにある可能性
がある。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子における変化は、成長障害で
は滅多にない。Lajaraら、J.C.E.M., 70: 687-692 (199
0)。ＧＨに対する耐性は、ＧＨＲのＧＨに対する親和性
の低下、結合ＧＨに反応する信号の伝播能力の損傷、ま
たは細胞表面の受容体数の減少を招く欠陥によると考え
られる。ヒト血清に存在する親和性の高いＧＨＢＰは、
ＧＨＲの細胞外ドメインと同一であり、受容体から蛋白
分解切断により産生されると考えられる。Sotiropoulos
ら、Endocrinol., 132: 1863-1865 (1993)。免疫機能Ｇ
ＨＢＰレベル（Carlssonら、J.C.E.M., 73, 前出）は、
ＩＳＳ患者の 90 % が平均以下であり、これらの子供の
20%は、平均より２ＳＤ以上低い（Carlssonら、J.C.E.
M., 73, 前出; Maurasら、Metabolism, 43: 357-359 (1
994)）。理論に縛られないならば、機能性ＧＨＢＰの量
を低下させるＧＨＲにおける異常性が、ＩＳＳ患者に存
在すると考えられる。

【０１１９】ＩＳＳにおける部分ＧＨＩＳの表現型は、
ＧＨＢＰレベルの低いＩＳＳ患者はＧＨＢＰレベルが正
常な人と比較して、ＩＧＦ−Ｉレベルが低く、12時間Ｇ
Ｈレベル平均が高いという実施例 IIIの知見を前提とす
る。理論に縛られないならば、これは、ＧＨＲを介した
シグナル伝達に欠陥があり、その結果、ＩＧＦ−Ｉ産生
の低下およびＧＨ分泌に対するＩＧＦ−Ｉの負のフィー
ドバックの低下を招くことを示唆している。ほとんどの
ＩＳＳの子供は、組換えＧＨ治療に反応して成長速度が
増加する（Hopwood ら、前出）。しかし、この反応は、
同じＧＨ用量で治療したＧＨＤ患者（ＧＨ欠損患者）の
場合よりも小さい。このことからもやはり、一つの理論
として、ＩＳＳ患者におけるＧＨに対する部分的無感覚
が示唆される。

【０１２０】完全ＧＨＩＳまたはラロン症候群（ＬＳ）
のＧＨＲ遺伝子における不活性化突然変異の頻度が高い
ことは、完全ＧＨＩＳのほとんどの場合が、機能性ＧＨ
Ｒの欠損によって説明できることを示している。ほとん
どのＬＳ患者は、血液中の検出可能なＧＨＢＰ活性に欠
けており（Baumann ら、J.C.E.M., 65: 814-816 (198
7); Daughaday ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:
4636-4640 (1987)）、測定すると、肝ミクロソームに結
合する特異的ＧＨレベルがゼロまたは非常に低い。Eshe
t ら、Isr. J. Med. Sci., 20: 8-11 (1984)。タンパク
質の細胞外ドメインに集まるＬＳと関連する特徴的なＧ
ＨＲ突然変異は 17 個ある（Rosenfeld ら、Endocrino
l. Rev., 15: 369-390 (1994)）。

【０１２１】部分的ＧＨＩＳのより軽い表現型が、ＧＨ
Ｒにおけるあまり破壊的でない突然変異によって引き起
こされるかどうか、また、ＩＳＳ集団における循環ＧＨ
ＢＰレベルの低下が部分的ＧＨＩＳのマーカーとしての
役割を果たし、ＧＨＲにおける突然変異を示すことがで
きることを調べるために、ＧＨＢＰレベルが平均より２
ＳＤ以上低いＩＳＳ患者から成る部分集団を選別し、Ｇ
ＨＲ遺伝子のコード領域の突然変異を分析した。一本鎖
コンホメーション分析（ＳＳＣＡ）およびＰＣＲ産物の
電気泳動移動度を変えることによる配列分析を使用し
て、14人中 4人の患者の受容体の細胞外ドメインに突然
変異を検出した。被検者ＮＣＧＳの二つのサブ実験から、以下の規準のいくつか
または全てを有する 14 人のＩＳＳ患者を選別した。す
なわち、１）身長ＳＤＳ＜ -2.5 ；２）血清ＩＧＦ−Ｉ
レベルが正常な平均レベル以下（酸−エタノール抽出に
より測定、Nichols Institute ）；３）１種以上の誘発
試験時の血清ＧＨ＞10μg/L ；４）最大血清ＧＨＢＰ
ＳＤＳ＜-2（Carlssonら、J.C.E.M., 73, 前出に記載さ
れたＬＩＦＡによって測定、または患者１の場合は、Am
itら、J.C.E.M., 71: 474-479 (1990)に記載された木炭
分離によって測定）；５）治療前の成長速度＜ 4 cm/
年；および６）根元的な全身病がないことである。12時
間ＧＨ平均（Hybritech アッセイ）、ＧＨ治療１年目の
成長速度およびＩＧＦＢＰ−３レベル（Endocrine Scie
nces）などの他の情報も、利用できる場合は考慮した。
ＮＣＧＳデータベースから患者を選別するために使用し
た得点表を表８に示す。最高得点 12 のうち、患者の得
点は 4〜10であり、ＧＨＢＰＳＤＳは全員 -2 以下で
あった。二人の患者（＃２および＃４）の関係項目を調
べて、突然変異の遺伝可能性を確認した。身長ＳＤＳが
正常な範囲（-2.0〜+3.5ＳＤＳ）内またはそれ以上であ
る 24 人の正常な成人ボランティアを対照とした。集団
の違いの統計的有意性をＦｉｓｃｈｅｒＥｘａｃｔテ
ストによって計算した。

【０１２２】

【表８】

【０１２３】ｈＧＨで治療した患者（表９の「ＧＨ反応
性」の欄で「na」と表示していない患者）に Protropin
という商標のＧＨ（患者２を除く全員に治療した）およ
び Nutropin という商標のＧＨ（患者２）を、約 0.3 m
g/kg/ 週で少なくとも６ヵ月間皮下注射した。サンプルの調製およびＰＣＲ増幅各患者の 1.5〜10 mL の血液から、LeucoPREP 細胞分離
管（Becton Dickenson）または LSMリンパ球分離媒体
（Organon Teknika ）を使用してリンパ球を単離し、エ
プスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）によって形質
転換した。Katzら、J. Infect. Dis., 160: 589-598 (1
989)。QIAamp血液キット（Qiagen Inc. ）を使用して、
ＥＢＶ−形質転換したリンパ球から、または新鮮リンパ
球から直接、ＤＮＡを単離した。コードするエキソン 2
〜9 およびそれらの隣のスプライス部位に対して特異的
なＧＨＲのゲノム断片を、イントロンプライマーを使用
するＰＣＲによって増幅した。エキソン 10 のコード部
分は、その断片の大きさを 400 bp 未満に制限するため
に、３つの重複する断片で増幅した。イントロンプライ
マーの位置および配列は以下の通りである。エキソン断片の名前配列（5′→3′）大きさ(bP） 2 154 101 TCGTGGGCTTTACCTTAC (SEQ ID NO: 17) 102 CAAAACACTGAGGGTGGA (SEQ ID NO: 18) 3 240 154.1 TACACAGGGTCATATCAGATTG (SEQ ID NO: 1 9) 154.2 CTATTCCAGTTACTACCATCCC (SEQ ID NO: 2 0) 4 188 105 CTGATTTCATGCCTTGCC (SEQ ID NO: 21) 106 AGAAAGGCATGATGGTGG (SEQ ID NO: 22) 5 286 107B2 ACTTAAGCTACAACATGATT (SEQ ID NO: 23) 108B1 GCTTCCCCATTTATTTAGT (SEQ ID NO: 24) 6 229 109 ATGCTCTGTTGAATTGCAC (SEQ ID NO: 25) 110 GTGTAAGGTGTAGCAACAT (SEQ ID NO: 26) 7 249 111a GACTCTTTGGCCAATATG (SEQ ID NO: 27) 112a AAGCCAGGTTAGCTACTA (SEQ ID NO: 28) 8 205 113B1 GAAACTGTGCTTCAACTAGTC (SEQ ID NO: 29 ) 114B1 GGTCTAACACAACTGGTACA (SEQ ID NO: 30) 9 179 115 ATGTAGCTTTTAACATCTCAA (SEQ ID NO: 31 ) 116 ATGACAGGAGTCTTCAGG (SEQ ID NO: 32) 10a 311 117B GAGTTTCTTTTCATAGATCTTC (SEQ ID NO: 3 3) 8 TTAACCTCTGTGGCTGAG (SEQ ID NO: 34) 10b 396 9 ACATGAGGGTACCTCAGA (SEQ ID NO: 35) 10 CAGAAGTAGGCATTGTCC (SEQ ID NO: 36) 10c 375 11 GGAAATGGTCTCACTCTG (SEQ ID NO: 37) 12 CCAAAGAAAGGCTAAGGC (SEQ ID NO: 38) ＤＮＡ（100 ng）を、0.2 mMのｄＮＴＰ、2 単位のＴａ
ｑポリメラーゼ（Perkin Elmer Corp.）、1.5 mMのＭｇ
Ｃｌ2 、7 μCiの33Ｐ−α−ｄＡＴＰ（duPontNew Engl
and Nuclear）および 40 サイクル（94℃で１分、55℃
で１分、72℃で１分で、各サイクルにつき 5秒加え
る。）に対する 15 ngの各プライマーを含む50 μL 中
で増幅した。最終サイクルの後に、94℃で１分おき、30
分かけて 22℃に冷却した。ＰＣＲ産物を 2 %アガロー
スゲルで電気泳動にかけて不純物混入のチェックをし、
断片の大きさを確認した。

【０１２４】全ＲＮＡ（5 〜 10 μg ）を、酸フェノー
ル法（Chomczynski および Sacchi,Anal. Biochem., 16
2: 156-159 (1987)）によりＥＢＶ−形質転換リンパ球
から調製し、ランダムプライマー（Promega Corp. ）を
使用して逆転写（Perkin Elmer Corp., RTキット）を行
なった。ＧＨＲｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ネスティッ
ド(nested)ＰＣＲ法により行なった。エキソン 3〜10
は、３つの断片で増幅した。ネスティッドプライマーを
使用して、より小さい断片（220 〜 415 bp ）を作っ
た。サイクル条件は以下の通りであった。すなわち、95
℃で３分間変性した後、95℃で１分、55℃で１分、72℃
で１分を 30 サイクル、最後に 72 ℃で 10分であっ
た。ネスティングプライマー法で使用したプライマーの
配列は以下の通りであった。３個のＲＴ−ＰＣＲ断片（５′→３′） 1. C1.1 - C2.1r C1.1: GTCCTACAGGTATGGATCTCT (SEQ ID NO : 39) C3.1r: GAATATCTGCATTGCGTGGTG (SEQ ID NO : 40) Internal nested PCR products: C1.1 - C1.1r C1.1 : GTCCTACAGGTATGGATCTCT (SEQ ID NO : 39) C1.1r: CTGGTATAGAACAGCTGTATG (SEQ ID NO : 41) ex4 - ex4.r ex4 : ATTCTTCTAAGGAGCCTAAATTCACCA (SEQ ID NO:
42) ex4.r: CCACCATTGCTAGTTAGCTTG (SEQ ID NO: 43) ex5 - C3.1r ex5 : ATGGACTCAAGAATGGAAAGAATG (SEQ ID NO: 44) C3.1r: GAATATCTGCATTGCGTGGTG (SEQ ID NO: 40) 2. C5.1 - C8 C5.1: CACCACGCAATGCAGATATTC (SEQ ID NO: 45) C8: CTCATGGTCACTGCTTAGAAG (SEQ ID NO: 46) 内部ネスティッドＰＣＲ産物： C5.1 - C5.1r C5.1: CACCACGCAATGCAGATATTC (SEQ ID NO: 45) C5.1r: GTTACATAGAGCACCTCACTG (SEQ ID NO: 47) n7 - C6.1 n7: ATGGACCCTATATTGACAACATC (SEQ ID NO: 48) C6.1:CCTTTAATCTTTGGAACTGGAAC (SEQ ID NO: 49) C7 - C7.r C7: GGGCTAACAGTGATGCTATTT (SEQ ID NO: 50) C7.r: GCTTAGAAGTCTGTCTGTGTC (SEQ ID NO: 51) C9 - C14 C9: GCTAGATATTGATGAGCCAGA (SEQ ID NO: 52) C14: GCTAAGGCATGATTTTGTTCA (SEQ ID NO: 53) 内部ネスティッドＰＣＲ産物： C9 - C10 C9: GCTAGATATTGATGAGCCAGA (SEQ ID NO: 52) C10: GTCGATGTTTGACAGTGAACT (SEQ ID NO: 54) C11.1 - C12.1 C11.1: GAAGGAGCTGAGTCAACTCAC (SEQ ID NO: 55) C12.1: GCTTGGCTGTATGTGTGATTC (SEQ ID NO: 56) C13 - C14 C13: TACTTCTGTGAGGCAGATGCC (SEQ ID NO: 57) C14: GCTAAGGCATGATTTTGTTCA (SEQ ID NO: 53)一本鎖コンホメーション分析ＳＳＣＡを、各ＰＣＲ反応で得た産物に対して行なっ
た。2 〜 4μL の反応混合物を同量の充填緩衝液と混合
し、100 ℃で２分間変性し、氷上に置いた。サンプルを
室温で、0.5 x MDE ゲル（AT Biochem Inc. ）中、1 %
または 10 % のグリセロールを使用し、製造者の指示に
従って電気泳動にかけた。ゲルを濾紙上で脱水し、オー
トラジオグラフィーにかけた。ＤＮＡ配列分析ＳＳＣＡにより異常バンドとして検出された突然変異を
配列分析により確認した。ＰＣＲ産物の直接サイクル配
列分析を、標準プロトコールに従って増幅プライマーま
たは上述した内部（ネスティッド）プライマーおよび A
BI 373配列分析機（Applied Biosystems Division of P
erkin Elmer Corp. ）での色素−ターミネーター化学を
用いて、あるいは、Ampli-Cycle キット（Perkin Elmer
Corp.）および33Ｐ−α−ｄＡＴＰ（duPont New Engla
nd Nuclear）を使用して行なった。さらに、突然変異を
含む疑いのある各断片からの多重サブクローンを M13mp
19または pBluescript KS+で得て、 M13-21 色素−プラ
イマーでシークエンシングを行い、ABI 373 配列分析機
で分析した。ＧＨ結合アッセイＧＨの突然変異体受容体への結合を調べるために、突然
変異を含んでいる組換えＧＨＲ細胞外ドメインを操作し
た。これは、オリゴヌクレオチド仲介による部位特異的
突然変異誘発、大腸菌での発現および精製を使用して行
なった。Clacksonおよび Wells, Science, 267: 383-38
6 (1995); Fuh ら、J. Biol. Chem., 265: 3111-3115
(1990); Bass ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4
498-4502(1991)。ＧＨに対する親和性を、トレーサーと
して放射性−ヨード化ＧＨを使用し、突然変異体受容体
からのＧＨの競合置換によって測定した。Spencer ら、
J.Biol. Chem., 263: 7862-7867 (1988) 。解離定数 (K
ds)は、スキャッチャード分析により計算した。抗−Ｇ
ＨＲモノクローナル抗体（Mab ）5 （Barnard ら、Endo
crinology, 115: 1805 (1984); Cunningham ら、Scienc
e, 254:821 (1991)）を使用してＧＨＲ：ＧＨ複合体を
沈殿させた。Mab 5 は、受容体のホモ二量化を防ぎ、そ
の結果、最初の 1:1相互作用に対する Kd を、二量化の
影響を受けることなく測定することができる。Clackson
および Wells、前出; Cunninghamら、前出。結果選択規準のコア得点が４以上であるＩＳＳの子供 14 人
を選別した（表８）。これらの患者の臨床データを表９
に示す。

【０１２５】

【表９】

【０１２６】これらの患者の機能性血清ＧＨＢＰが低い
ために、ＰＣＲ増幅およびＳＳＣＡを組み合わせること
により、ＧＨＲ遺伝子の微妙な突然変異の研究を行なっ
た。移動度を変えると移動する断片は、４人の患者：1
、2 、4 および7 で認められたが、24人の正常な対照
のＧＨＲ遺伝子座では、エキソン 6および 10 の既知の
多形性を除いて、異常は検出されなかった（Leung ら、
Nature, 330: 537-543 (1987); Godowkskiら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 86: 8083-8087 (1989)）。すなわ
ち、ＧＨＢＰが減少したＩＳＳ患者のＧＨＲ遺伝子にお
ける変化が、正常な集団と比較してかなり増加した（ｐ
＝0.014 ）。突然変異を有する疑いのあるゲノムＰＣＲ
断片の各々をシークエンシングして、異常バンドを引き
起こす変化を解析した。図 8〜 11 参照。また、患者 1
〜9 をＲＴ−ＰＣＲによって分析すると（エキソン 3〜
10）、全断片は、スプライシングの変化を除いて、予測
した大きさであった患者４は、エキソン4 および 6また
はこの領域をカバーするＲＴ−ＰＣＲ断片を分析する
と、ＳＳＣＡゲル上に異常バンドを示した。ＤＮＡをシ
ークエンシングすると、その子供は成熟タンパク質の44
番目の位置でグルタミン酸の代わりにリジンが導入され
る（E44K) 、エキソン４でのグアノシン−アデノシン変
異（図８、対立遺伝子２および表１０）、および、残基
161でアルギニン−システイン置換を引き起こす（R161
C ）、エキソン６でのシトシン−チミジン変異（図８、
対立遺伝子１および表１０）に対する複合ヘテロ接合体
であることが分かった。エキソン４〜エキソン６に及ぶ
ＲＴ−ＰＣＲ産物をサブクローン化し、シークエンシン
グした。二つの突然変異が種々のサブクローンで見いだ
された。すなわち、二つの対立遺伝子の各々に一つの突
然変異が見いだされた。さらに、家族の遺伝子分析は、
エキソン４の変化がその家族の父側から受け継がれ、エ
キソン６の変異は母側から受け継がれたものであること
を示した。父親および父方祖母はともに、エキソン４に
対して祖先と同じＳＳＣＡバンドシフトを示し、シーク
エンシングから、彼らはともに同一の E44K 突然変異を
有することが確認された。同様に、ＳＳＣＡおよびシー
クエンシングから、母親および母方のおじに、R161C変
化を引き起こすエキソン６の変異が存在することが確認
された。患者４は、成長速度のかなりの増加を伴う外因
性ＧＨには反応しなかった。彼の治療前の成長速度は
5.5 cm/年であり、ＧＨ治療時の成長速度は 5.8 cm/年
であった。

【０１２７】1:1 複合体における受容体のＧＨ結合能に
対するこれらのアミノ酸置換の影響を、大腸菌で発現さ
せた突然変異体受容体細胞外ドメインを使用して調べ
た。残基 E44は、ＧＨとの直接接触に関与し（deVos
ら、Science, 255: 306-312 (1992)）、アラニンへの突
然変異はリガンド結合を低下させる（KdMUT ／KdWT＝1
7.4）。Clacksonおよび Wells, 前出。44番目にリジン
が導入されると、野生型受容体細胞外ドメインに関し
て、結合が 330倍低下することが分かった（表１０）。
これに対して、残基 161は、ヒトＧＨ：ＧＨＲ複合体の
どの分子間の界面にもなく（DeVos ら、前出）、そのシ
ステインへの突然変異は、結合の 2.1倍の減少を引き起
こした（表１０）。

【０１２８】患者２のＤＮＡは、エキソン５ゲノムＰＣ
Ｒ断片により、ＳＳＣＡバンドシフトを示した。ＤＮＡ
シークエンシングにより、ｃＤＮＡの 418番目のチミジ
ン−アデノシン変異が確認され、その変異により、シス
テイン 122の場所に停止コドンが導入された（C122X
）。図９参照。患者２の全エキソンからの多重ゲノム
ＰＣＲ産物のサブクローン化およびシークエンシングに
より、ゲノムＰＣＲ断片の直接シークエンシングと同
様、野生型配列のみが得られた。この患者が別の突然変
異を有するという可能性は、検出することができなかっ
たので、低い。患者２の母親および父親の両方のＤＮＡ
を分析すると、その患者は、停止コドン突然変異を母親
から受け継いだことが示された。治療１年目に彼の成長
速度は 4.1 cm/年から 5.7 cm/年に増加した（表９）。
これは、外因性ＧＨに反応したことを示す。外因性ＧＨ
による２年目の治療で、10.3 cm/年という思春期に関連
する急成長が生じた。

【０１２９】患者１および７はともに、ヘテロ接合体の
１個の塩基対変化を有し、これは、一方の対立遺伝子の
ＧＨＲにアミノ酸変化を引き起こす。患者１では、エキ
ソン７ゲノムＰＣＲ断片に異常バンドが認められた。塩
基対 686のグアノシンからアデノシンへの変異により、
アミノ酸 211のアルギニン残基がヒスチジンに置き換わ
った（R211H ）。図10、対立遺伝子２を参照。患者１は
ＧＨに反応した。彼はＩＧＦ−Ｉ発生テストで陽性であ
った（ＩＧＦ−Ｉのベースラインは 56 μg/Lであり、
１回の注射で0.1 単位ＧＨ／kgを投与する治療を４日間
行なった後のピークは 179μg/L に上昇した。）さら
に、彼の成長速度は、0.03 mg ＧＨ/kg/日の投与で 2.0
cm/年から 3.0 cm/年に増加し、0.05 mg ＧＨ/kg/日の
投与で 6.0cm/年に増加した（表９）。

【０１３０】患者７は、同様に、１個の対立遺伝子の変
化により影響を受ける。塩基対 726のグアノシンからシ
トシンへの変異により、アミノ酸 224の野生型グルタミ
ン酸の場所にアスパラギン酸が導入される(E224D) 。図
11、対立遺伝子２を参照。患者７はＧＨによる治療を行
なわなかった。ＧＨＲの細胞外ドメインのＳＳＣＡでも
直接シークエンシングでも、これらの患者では、第二の
変化は検出されなかった。

【０１３１】残基 R211 をどの分子の界面からも離れた
受容体表面でさらすと（DeVos ら、前出）、ヒスチジン
突然変異体が、野生型受容体に匹敵する親和力（KdMUT
／KdWT＝1.4 ）でタンパク質を産生した。しかし、突然
変異体タンパク質の発現レベルは著しく減少し、発現レ
ベルは、野生型の約 10 -4倍であった。Amselem ら、Hu
m. Mol. Genet., 2: 355-359 (1993) により報告された
アルギニン 211がグリシンＬＳ−関連突然変異では、検
出できないレベルでの発現となる。ＧＨに対する受容体
親和性に対する同様の影響は、R224D 置換に対しても認
められた（表１０）。保存性 E224D置換は、ＧＨ結合を
乱さないと予想された。実際、アスパラギン酸による置
換（KdMUT ／KdWT＝1.6 ）は、親和性にほとんど影響を
及ぼさないことが分かった。

【０１３２】

【表１０】

【０１３３】結論ＩＳＳの子供のサブグループは、低身長の病因に部分的
ＧＨＩＳを関連させる表現型を有する。ＩＧＦ−Ｉレベ
ルがより低くてＧＨ濃度がより高いとともにＧＨＢＰレ
ベルはより低いということによって例証されるように、
ＧＨＲシグナル伝達の低下という本発明で主張した仮説
は、低ＧＨＢＰおよび低ＩＧＦ−Ｉに対して選別された
ＧＨ欠損のない低身長の患者におけるＧＨＲ突然変異の
同定によって確認された。正常な 24 人の対照は、誰も
ＳＳＣＡによって検出できる配列変化を示さなかった
が、選別された 24 人のＩＳＳ患者のうち４人は、１個
の塩基対変化が確認された（ｐ＝0.014 ）。ＳＳＣＡ
は、モデルシステムの既知突然変異を約 80 % 検出する
ことができるので（Vidal-Puigおよび Moller, Biotech
niques, 17: 490-496 (1994); Ravnik-Glavac ら、Hum.
Mol. Genet., 3: 801-807 (1994) ）、変化が確認され
なかったこれらのＩＳＳ患者に別の突然変異が存在する
可能性がある。

【０１３４】ＧＨＲ突然変異のある４人のＩＳＳ患者の
うち２人は、外因性ＧＨに反応した（表９の患者１およ
び２）。突然変異の存在およびＧＨに対する反応は、こ
れらの患者が機能障害ＧＨＲにより部分的にＧＨ無感覚
である可能性を示唆している。理論に縛られないなら
ば、患者４がＧＨに反応できないことは、恐らく、ＧＨ
Ｒ対立遺伝子に含まれる二つの突然変異の性質を反映し
ていると考えられる。一つの変化はＧＨに対する受容体
の親和性を 330倍低下させ、これは恐らく、この受容体
を生理学的または薬理学的レベルのＧＨに対して無感覚
にしている。第二の変化である R161Cの影響は分からな
いが、この突然変異は苛酷であり、ホモ接合体状態では
完全なＧＨＩＳを引き起こす。Amselem ら、前出。４番
目の患者（患者７）はＧＨによる治療を行なわなかった
が、ＧＨ反応性が、ＬＳに見られる完全ＧＨＩＳから、
ＬＳ症候群の表現型の特徴はないが標準用量のＧＨには
反応しない、かなり無感覚なＩＳＳ患者、次いで、標準
的なＧＨ治療に反応する部分的にＧＨＩＳのあるＩＳＳ
患者を通って、最後に正常な表現型まで連続して伸びて
いるという本発明の結果から明らかである。

【０１３５】患者４は、E44Kおよび R161C置換に対して
複合ヘテロ接合体であり、両親は各々、二つの突然変異
の一方に対してヘテロ接合体である。両親および祖父母
の身長は皆、成人集団の正常な範囲内にあるが、1 個の
突然変異を保有していることが分かっている人の身長は
平均以下である。患者２は、122 番目の突然変異を停止
するためのシステインに対してヘテロ接合体であり、従
って、恐らく不安定な末端切断型タンパク質を産生する
一つの対立遺伝子を有する。彼の母親は同じ突然変異を
保有する。患者２は現在 19 歳であり、この突然変異の
存在により、母親（身長ＳＤＳ -1.4 ）よりも厳しい影
響を受ける（身長ＳＤＳ -3.2 ）。理論に縛られないな
らば、祖先は、構造的に正常なＧＨＲ対立遺伝子の発
現、またはＧＨ軸における別の工程に影響を及ぼすまだ
不確定の突然変異を、その父親（身長ＳＤＳ -1.4 ）か
ら受け継いだかもしれない。家族２は、ともにＧＨＲ遺
伝子座の一つの対立遺伝子に二つの突然変異を有した、
疑似ＬＳ患者および影響を受けなかった母親に似てい
る。Kou ら、J.C.E.M., 76:54-59 (1993) 。この患者と
患者２との類似性は、一つの理論において、両者は、第
二の不確定な突然変異保有者である可能性を示唆してお
り、それは、いずれかのエキソンに突然変異が欠けてい
るにもかかわらず、インシュリン受容体ｍＲＮＡレベル
の減少が認められている何人かのインシュリン無感覚患
者に類似している（Taylorら、EndocrineRev., 13: 566
-595 (1992)）。

【０１３６】他の二人の患者は、アミノ酸置換（患者１
のR211H および患者７の E224D）をもたらすヘテロ接合
体突然変異を有する。患者１の両親の身長は、ともに成
人集団の正常な範囲内であった。Hamillら、Am. J. Cli
n. Nutrition, 32: 607-629(1979)。同様に、患者７の
父親の身長ＳＤＳは -0.43であり、母親の身長ＳＤＳは
+1.4 であった。

【０１３７】ＬＳは、常染色体劣性症である。影響を受
けた人は通常、血族の両親から同じ突然変異を受け継い
でいる。ＧＨＲ突然変異に対するヘテロ接合体（ＬＳ患
者の両親および兄弟）は、成長異常が少しある可能性が
ある。Laron, The Endocrinologist, 3: 21-28 (1993);
Rosenbloom ら、Acta Paediatr., Suppl. 399: 125-12
7 (1994)。ヘテロ接合体の約半分は、ＧＨＢＰレベルが
年齢別平均より２ＳＤ以上低い。Aguirre ら、Horm. Re
s., 34: 4-8 (1990); Laron ら、Acta Endocrinol., 12
1: 603-608 (1989) 。さらに、Laron, The Endocrinolo
gist（前出）は、ＬＳ患者の両親および臨床的に正常な
兄弟の身長が、典型的には、性別および種族別 50 % パ
ーセンタイル以下であると報告した。理論に縛られない
ならば、身長ＳＤＳが -2 未満となる部分的ＧＨＩＳ
は、まだ不確定の修飾因子遺伝子座で特定の遺伝子型の
影響を受けるＧＨＲのヘテロ接合体突然変異保有者で発
生し、あるいは、何人かのインシュリン無感覚患者のヘ
テロ接合体インシュリン受容体突然変異に対して提案さ
れているように、変化が負の優性表現型を付与する場合
に発生すると考えられる。

【０１３８】４人の患者で確認された５個の突然変異
（E44K、C122X 、R161C 、R211H 、E224D ）は、受容体
の細胞外ドメインに限られる。E44K置換は、ＧＨに対す
る親和性を 330倍低下させ、R161、 R211 または E224
残基の変化はリガンド結合に関して微妙な影響を示した
（表１０）。残基 R211 は、ＧＨＲのリガンド結合部位
および二量化部位の両方に対して遠位である。しかし、
サイトカイン受容体スーパーファミリー全体にわたって
保存される「WS−様」モチーフには隣接している。WS−
様モチーフの残基は、 R211 および他のアミノ酸側鎖で
ぎっしり詰まっており、芳香族および塩基性の側鎖が交
互に積み重なっている。

【０１３９】残基 E224 は、WS−様モチーフの可変残基
に対応する。 R211 と同様、ＧＨＲ分子上の既知結合部
位の外側にあり、ＧＨ結合は突然変異によってあまり変
わらない（表Ｘ）。培養中に哺乳類の細胞で発現したE2
24A 置換は、細胞レベル以下の局在化を変えた。Baumga
rtner ら、J. Biol. Chem., 269:29094-29101 (1994)。
全受容体画分の増加が、核に近接する位置で認められ
た。これが、新しく合成された受容体の蓄積または受容
体のインターナリゼーションの増加を意味するかどうか
は分からない。理論に縛られないならば、E224D 突然変
異が同様の影響を引き起こすとすると、誤った処理によ
って、細胞表面上の受容体数が減少し、血清ＧＨＢＰレ
ベルが付随して減少する可能性がある。

【０１４０】この研究により、ＧＨに対して部分的に無
感覚であることを示唆する臨床パラメーターによりＩＳ
Ｓの子供のサブグループを選別すると、ＧＨＲ機能に影
響を及ぼすと考えられるＧＨＲ突然変異を保有する患者
と一致することが分かる。調査した患者は、循環する機
能性ＧＨＢＰの減少に基づいて選別したので、突然変異
は、リガンド結合に直接影響を及ぼし（E44K）、または
細胞表面の受容体の利用性の低下を引き起こし（R161C
、R211H およびE224D ）、それらが部分的なＧＨＩＳ
症候群の一因となるにちがいない。実際、ＧＨＲ突然変
異を有する、外因性ＧＨで治療した３人のＩＳＳ患者の
うち２人は、ＧＨに反応する部分的ＧＨＩＳであった。実施例Ｖ平均身長が正常な身長の−２ＳＤより低く、ＧＨＢＰレ
ベルが正常レベルより少なくとも２ＳＤ少なく、ＩＧＦ
−Ｉの血清レベルが正常な平均レベル以下であり、ＧＨ
の平均または最大刺激血清レベルが少なくとも正常値で
あると診断された、 5〜12歳の 80 人の思春期前の子供
たちを以下のように治療した。20人はＩＧＦ−Ｉのみ
で、20人はＧＨのみで、20人はＧＨおよびＩＧＦ−Ｉ
で、20人はプラシーボで治療した。薬物を単独投与する
場合、ＩＧＦ−Ｉは、150 μg/kg/ 日の用量で皮下注射
により１日に１回投与し、ＧＨは、0.70 mg/kg/ 週の用
量で皮下注射により１日に１回投与する。薬物を併用す
る場合、ＩＧＦ−Ｉは、 75 μg/kg/ 日の用量で皮下注
射により１日に１回投与し、ＧＨは、0.35 mg/kg/ 週の
用量で皮下注射により１日に１回投与する。ＩＧＦ−Ｉ
組成物は、（ａ）20 mMの酢酸ナトリウム緩衝液、2.5 m
g/mL (0.25 %)のフェノール、45 mg/mLのマンニトー
ル、ｐＨ 5.0中に10 mg/mLのＩＧＦ−Ｉ；または（ｂ）
50 mM の酢酸ナトリウム緩衝液、2.5 mg/mL のフェノー
ル、5.84 mg/mLのＮａＣｌ、および 9 mg/mLのベンジル
アルコール、ｐＨ 5.4中に10 mg/mLのＩＧＦ−Ｉのいず
れかである。ＧＨ組成物は、Genentech, Inc. から市販
されている Nutropin または Protropinという商標のＧ
Ｈである。患者をこのプロトコールによって６ヵ月間治
療する。各患者の身長の増加を測定する。

【０１４１】この調査では、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨまたはそ
の併用により、全ての患者の成長速度が、プラシーボに
より治療した患者と比較して、増加すると予想される。

【０１４２】臨床試験の別の計画は次の通りである。

【０１４３】同じ子供たちのグループおよびサブグルー
プを 0.35 mg/kg/週または 0.70 mg/kg/週のＧＨのみ
で、または 75 、100 、150 または 200μg/kg/ 日のＩ
ＧＦ−Ｉのみで、同じ方法により治療する。併用治療に
対しては、比較のためのプラシーボを使用し、または使
用しないで、ＧＨを 0.35 mg/kg/週で使用し、ＩＧＦ−
Ｉを 75 または100 μg/kg/ 日で使用する。

【０１４４】

【発明の効果】本発明によれば、部分的成長ホルモン不
感受性症候群（ＧＨＩＳ）を示し、完全ＧＨＩＳまたは
ラロン症候群ではない、特発性で背が低い（ISS）患者
のサブセットを同定し、この同定された患者のサブセッ
トを治療して、中間親(mid-parental)目標身長として定
義される、該患者の遺伝的な素質と矛盾しない最終的な
身長に到達させることができる。

【０１４５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Genentech Inc. <120> The combination of growth hormone and insulin-like growth factor-1 enhances growth <130> PA96-0123 <140> <141> <150> US90/535,005 <151> 1990-06-07 <160> 57 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 1 atcctctaag gagcctaaat tcaccaagtg ccgttcacct gagcgagaga ctttttcatg 60 ccactggaca gatgaggttc atcatggtac aaagaaccta ggacccatac agctgttcta 120 taccagaagg aacactcaag aatggactca agaatggaaa gaatgccctg attatgtttc 180 tgctggggaa aacagctgtt actttaattc atcgtttacc tccatctgga taccttattg 240 tatcaagcta actagcaatg gtggtacagt ggatgaaaag tgtttctctg ttgatgaaat 300 agtgcaacca gatccaccca ttgccctcaa ctggacttta ctgaacgtca gtttaactgg 360 gattcatgca gatatccaag tgagatggga agcaccatgc aatgcagata ttcagaaagg 420 gtggatggtt ctggagtatg aactt 445 <210> 2 <211> 445 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 2 atcctctaag 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Sequence:synthetic <400> 10 gactctttgg ccaatatgcg tttatatttt gtcttgaaag atggacccta tattgacaac 60 atcagttcca gtgtactcat tgaaagtgga taaggaatat gaagtgcatg tgagatccaa 120 acaacgaaac tctggaaatt atggcgagtt cagtgaggtg ctctatgtaa cacttcctca 180 gatgagccaa tttacatgtg aagaaggtaa aagaaataaa agattaaaat agtagctaac 240 <210> 11 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 11 Met Asp Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val 1 5 10 15 Asp Lys Glu Tyr Glu Val Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn 20 25 30 Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser 35 40 45 Gln Phe Thr Cys Glu Glu 50 <210> 12 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 12 Met Asp Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val 1 5 10 15 Asp Lys Glu Tyr Glu Val His Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly 20 25 30 Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met 35 40 45 Ser Gln Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 <210> 13 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 13 gactctttgg ccaatatgcg tttatatttt gtcttgaaag atggacccta tattgacaac 60 atcagttcca gtgtactcat tgaaagtgga taaggaatat gaagtgcgtg tgagatccaa 120 acaacgaaac tctggaaatt atggcgagtt cagtgaggtg ctctatgtaa cacttcctca 180 gatgagccaa tttacatgtg aagaaggtaa aagaaataaa agattaaaat agtagctaac 240 <210> 14 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 14 gactctttgg ccaatatgcg tttatatttt gtcttgaaag atggacccta tattgacaac 60 atcagttcca gtgtactcat tgaaagtgga taaggaatat gaagtgcgtg tgagatccaa 120 acaacgaaac tctggaaatt atggcgactt cagtgaggtg ctctatgtaa cacttcctca 180 gatgagccaa tttacatgtg aagaaggtaa aagaaataaa agattaaaat agtagctaac 240 <210> 15 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 15 Met Asp Pro Ile Leu Thr Thr Ser 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19 tacacagggt catatcagat tg 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 20 ctattccagt tactaccatc cc 22 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 21 ctgatttcat gccttgcc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 22 agaaaggcat gatggtgg 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 23 acttaagcta caacatgatt 20 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 24 gcttccccat ttatttagt 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 25 atgctctgtt gaattgcac 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 26 gtgtaaggtg tagcaacat 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 27 gactctttgg ccaatatg 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 28 aagccaggtt agctacta 18 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 29 gaaactgtgc ttcaactagt c 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 30 ggtctaacac aactggtaca 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 31 atgtagcttt taacatctca a 21 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 32 atgacaggag tcttcagg 18 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 33 gagtttcttt tcatagatct tc 22 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 34 ttaacctctg tggctgag 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 35 acatgagggt acctcaga 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 36 cagaagtagg cattgtcc 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 37 ggaaatggtc tcactctg 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 38 ccaaagaaag gctaaggc 18 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 39 gtcctacagg tatggatctc t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 40 gaatatctgc attgcgtggt g 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 41 ctggtataga acagctgtat g 21 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 42 attcttctaa ggagcctaaa ttcacca 27 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 43 ccaccattgc tagttagctt g 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 44 atggactcaa gaatggaaag aatg 24 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 45 caccacgcaa tgcagatatt c 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 46 ctcatggtca ctgcttagaa g 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 47 gttacataga gcacctcact g 21 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 48 atggacccta tattgacaac atc 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 49 cctttaatct ttggaactgg aac 23 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 50 gggctaacag tgatgctatt t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 51 gcttagaagt ctgtctgtgt c 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 52 gctagatatt gatgagccag a 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 53 gctaaggcat gattttgttc a 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 54 gtcgatgttt gacagtgaac t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 55 gaaggagctg agtcaactca c 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 56 gcttggctgt atgtgtgatt c 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 57 tacttctgtg aggcagatgc c 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、ＩＳ
Ｓ、およびターナー症候群（ＴＳ）であるGenentech Na
tional Growth Study, NCGSの子供たちの年齢および性
別について標準化し、ＳＤＳとして表される血清ＧＨＢ
Ｐ濃度を本研究に登録した時の年齢ごとに示す。影をつ
けた部分は、それぞれの性別にとっての正常範囲（−２
ＳＤ〜＋２ＳＤ）を表す。実線は、年齢および性別にと
っての正常値を示す。２人またはそれ以上の患者が重複
している点は、１つの点として表した。

【図２】図２は、ＮＣＧＳに登録し、種々の用量のＧＨ
を毎日注射によって投与されたＩＳＳ患者の成長速度を
cm／年で示したものである。

【図３】図３Ａは、年齢および性別について標準化し、
ＳＤＳとして表されるＩＧＦ−Ｉ濃度をＧＨＢＰのＳＤ
Ｓ（平均±ＳＤ）ごとに示したものである。図３Ｂは、
図２を作製するために使用された研究に登録された患者
から、20分おきに12時間、終夜サンプリングして得た平
均12時間ＧＨ濃度をＧＨＢＰＳＤＳ（平均±ＳＤ）ご
とに示したものである。

【図４】図４は、ヒトＧＨ（ｈＧＨ）で治療された患者
の初年度の年間の成長速度（cm／年）をＧＨＢＰのＳＤ
Ｓごとに示したものである。これらの患者は、ＧＨ療法
の初年度の間、思春期前であった（n=166）。影をつけ
た部分は、ＧＨＢＰの正常範囲（−２ＳＤ〜＋２ＳＤ）
を示す。

【図５】図５は、前治療、一年目の治療、二年目の治療
の患者の成長速度のグラフである。これらの患者のデー
タは、実施例IIIの表VIIに示されているが、以下のよう
にＧＨＢＰのＳＤＳ−２（n=14）（四角）またはＧＨＢ
ＰのＳＤＳ＞−２（n=29）（丸）で示した。

【図６】図６Ａおよび６Ｂは、棒グラフとしたが、図５
の作製に使用した患者についてＧＨＢＰのＳＤＳごと
に、前治療（図６Ａ）、一年目の治療（図６Ｂ）の成長
速度を示した。

【図７】図７は、ＧＨ分泌の測定（例えば、刺激された
ＧＨ濃度または内因性ＧＨ濃度）対ＧＨ応答性（例え
ば、ＧＨＢＰ濃度）により予測される成長状態を示す。

【図８】図８は、ＩＳＳ患者４の２つのＧＨＲ対立遺伝
子（エクソン４−６）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列
番号１および２）と予測されるアミノ酸配列（各々配列
表の配列番号３および４）を示す。対立遺伝子１および
２における突然変異を、四角で囲んだ。縦の棒は、cDNA
配列中のエクソンの境界を示す。

【図９】図９は、ＩＳＳ患者２の２つのＧＨＲ対立遺伝
子（エクソン５）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列番号
５および６）と予測されるアミノ酸配列（各々配列表の
配列番号７および８）を示す。対立遺伝子２における突
然変異を、四角で囲んだ。

【図１０】図１０は、ＩＳＳ患者１の２つのＧＨＲ対立
遺伝子（エクソン７）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列
番号９および10）と予測されるアミノ酸配列（各々配列
表の配列番号11および12）を示す。対立遺伝子２におけ
る突然変異を、四角で囲んだ。イントロン配列を小文字
で表し、エキソン配列を大文字で表す。縦の棒は、ＤＮ
Ａ配列中のエクソンの境界を示す。

【図１１】図１１は、ＩＳＳ患者７の２つの対立遺伝子
（エクソン７）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列番号13
および14）および予測されるアミノ酸配列（各々配列表
の配列番号15および16）を示す。対立遺伝子２における
突然変異を、四角で囲んだ。イントロン配列を小文字
で、また、エキソン配列を大文字で表す。縦の棒は、Ｄ
ＮＡ配列中のエクソンの境界を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 596168317 460 ＰｏｉｎｔＳａｎＢｒｕｎｏＢｌｖｄ．，ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者カールッソン，レナエム．エス. スウェーデン国エス−413 10 ゴテボルグ，オリーヴダルスガタン２番地 (72)発明者ゲサンドハイト，ネイルアメリカ合衆国 94022 カリフォルニア州ロスアルトス，ポートラコート 250番地 (72)発明者ゴッダード，オードリーアメリカ合衆国 94133 カリフォルニア州サンフランシスコ，メイソンストリート 1920番地

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】身長が年齢および性別のわりに標準より
−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タン
パク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準
偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルよ
り低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清
レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的
成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群
(Ｌａｒｏｎｓｙｎｄｒｏｍｅ)ではないヒト患者の成
長速度を高めるための、有効量のＩＧＦ−Ｉおよび製剤
学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項２】ＩＧＦ−Ｉの投与量が５０〜２４０μｇ
／ｋｇ／日の用量である、請求項１に記載の医薬組成
物。
【請求項３】１日に１回または２回投与する、請求項
１に記載の医薬組成物。
【請求項４】皮下注射により投与する、請求項１に記
載の医薬組成物。
【請求項５】ｐＨ５〜６で製剤化する、請求項１に記
載の医薬組成物。
【請求項６】前記患者が異質ＧＨＲ遺伝子欠損を有す
る、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】身長が年齢および性別のわりに標準より
−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タン
パク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準
偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルよ
り低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清
レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的
成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群
ではないヒト患者に使用するというラベルを付した、有
効量のＩＧＦ−Ｉおよび製剤学的に許容される担体を含
んでなる、前記患者の成長速度を高めるための医薬品。
【請求項８】身長が年齢および性別のわりに標準より
−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タン
パク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準
偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルよ
り低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清
レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的
成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群
ではないヒト患者の成長速度を高めるための、有効量の
ＩＧＦ−Ｉおよび製剤学的に許容される担体を含んでな
る医薬組成物の製造においてＩＧＦ−Ｉを使用する方
法。
【請求項９】 (a) 有効量のＩＧＦ−Ｉおよび製剤学的
に許容される担体、および(b) 身長が年齢および性別の
わりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホ
ルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少
なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標
準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均また
は最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特
徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有する
が、ラロン症候群ではないヒト患者に使用することを明
記したラベル、を含んでなる、前記患者の成長速度を高
めるための医薬品の製造においてＩＧＦ−Ｉを使用する
方法。