PT754048E

PT754048E - Tratamento do sindrome de insensibilidade a hormona do crescimento

Info

Publication number: PT754048E
Application number: PT95914872T
Authority: PT
Inventors: Neil Gesundheit; Kenneth Attie; Lena M S Carlsson; Goddard Audrey
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-04-07
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 2002-01-30
Also published as: EP0754048A1; ES2160704T3; DE69521796T2; EP0754048B1; MX9604635A; JP3366644B2; GR3036901T3; WO1995027495A2; JP2000226334A; ATE203165T1; CA2187274A1; US5646113A; CA2187274C; MX9701916A; DE69521796D1; DK0754048T3; WO1995027495A3; JPH09509430A

Description

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DESCRIÇÃO "Tratamento do síndrome de insensibilidade parcial à hormona do crescimento"

Antecedentes da invenção

Campo da invenrãn A presente invenção refere-se à preparação de um medicamento para aumentar as taxas de crescimento de pacientes humanos possuindo síndrome de insensibilidade parcial à hormona do crescimento.

Descrição dos antecedentes e arte relacionada A maioria das crianças com baixa estatura significativa não têm deficiência em hormona do crescimento (GH) como classicamente definida pela resposta da (GH) a estímulos provocadores. Uma vez excluídas as causas conhecidas de baixa estatura, estes pacientes são classificados com vários termos, incluindo baixa estatura hereditária, atraso constitucional do crescimento, ou baixa estatura "idiopática" (ISS - “Idiopatic Short Stature"). Algumas destas crianças podem não atingir o seu potencial genético de altura, embora não tenham sido reportados resultados de estudos longitudinais em larga escala. Uma vez que existem tantos factores que contribuem para o normal crescimento e desenvolvimento, é provável que pacientes com ISS sejam heterógenos em relação à sua etiologia de baixa estatura. Apesar de não serem classicamente deficientes em GH, a maioria das crianças com ISS respondem ao tratamento com GH, embora não tão bem.

Muitos investigadores pesquisaram distúrbios na secreção espontânea de GH neste conjunto de pacientes. Uma hipótese sugere que alguns destes pacientes têm uma secreção imprópria de GH endógena sob condições fisiológicas, mas são capazes de apresentar um aumento na resposta de GH a estímulos farmacológicos, tal como em testes de estimulação de GH tradicionais. Esta desordem foi denominada "disfunção neurossecretora de GH," e o diagnóstico assenta na demonstração de um padrão de GH anormal em amostragem prolongada de soro. Numerosos investigadores reportaram resultados de estudos deste tipo, e verificaram que esta anormalidade apenas está ocasionalmente presente. Outros investigadores postularam que estes 2 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT pacientes têm "GH bio-inactiva”; contudo, isto ainda não foi demonstrado conclusivamente.

Quando o receptor de GH (GHR) foi clonado, mostrou-se que a principal actividade de ligação de GH no sangue se devia a uma proteína que deriva do mesmo gene que o GHR e corresponde ao domínio extracelular do GHR de comprimento completo. A maioria do3 pacientes com síndrome de insensibilidade à hormona do crescimento (ou de Laron) (GHIS) têm falta de actividade de ligação ao receptor da hormona do crescimento e têm ausente, ou muito pouca, actividade de proteína de ligação a GH (GHBP) no sangue. Estes pacientes têm uma classificação de desvio padrão (SDS - “Standard Deviation Score") de altura à média de cerca de -5 a -6, são resistentes a tratamento com GH, e têm concentrações séricas de GH aumentadas e baixas concentrações séricas de factor de crescimento semelhante a insulina (IGF-I). Respondem ao tratamento com IGF-I. Em pacientes com defeitos no domínio extracelular do GHR, a falta de GHBP funcional na circulação pode servir como um marcador para a insensibilidade à GH.

Existe uma subclasse de pacientes com ISS possuindo pouca GHBP no seu sangue que têm uma SDS de altura à média intermédia entre pacientes com GHIS (síndrome de Laron) completo e crianças normais, e que respondem um pouco, mas não completamente, ao tratamento com GH. Esta classe de pacientes pode ser caracterizada como possuindo GHIS parcial. É um objectivo da presente invenção identificar um subconjunto de pacientes com ISS que exiba GHIS parcial e não tenha GHIS ou síndrome de Laron completo. É um outro objectivo tratar este subconjunto identificado de pacientes de modo a que atinjam uma altura final consistente com o seu potencial genético conforme determinado pela altura alvo média dos progenitores.

Estes e outros objectivos serão aparentes aos peritos na arte.

Sumário da invenção

Assim, num aspecto, a presente invenção proporciona a preparação de um medicamento para aumentar a taxa de crescimento de um paciente humano 3 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT possuindo GHIS parcial, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de GH ao referido paciente, através do que o referido paciente tenha uma altura menos que cerca de -2 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, e tenha níveis séricos de GHBP de alta afinidade que sejam pelo menos 2 desvios padrão abaixo dos níveis normais, tenha um nível sérico de IGF-I abaixo dos níveis médios normais, e tenha um nível sérico de GH estimulado, médio ou máximo, que seja pelo menos normal, em que o paciente não tem síndrome de Laron. Preferivelmente, a GH é GH humana recombinante.

Em outro aspecto, a invenção proporciona a preparação de um medicamento para aumentar a taxa de crescimento de um paciente humano possuindo GHIS parcial compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de IGF-I (preferivelmente IGF-I humano recombinante) ao referido paciente, através do que o referido paciente tenha uma altura menos do que cerca de -2 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, e tenha níveis séricos de GHBP de alta afinidade que sejam pelo menos 2 desvios padrão abaixo dos níveis normais, tenha um nível sérico de IGF-I que seja abaixo dos níveis médios normais e tenha um nível sérico de GH estimulado, médio ou máximo, que seja pelo menos normal, em que o paciente não tem síndrome de Laron.

Num aspecto adicional, a invenção proporciona a preparação de um medicamento para aumentar a taxa de crescimento de um paciente humano possuindo GHIS parcial compreendendo a administração de quantidades de IGF-I e GH ao referido paciente, quantidades estas que são eficazes em combinação, através do que o referido paciente tenha uma altura menos do que cerca de -2 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, tenha um nível sérico de GHBP de alta afinidade que sejam pelo menos 2 desvios padrão abaixo dos níveis normais, tenha um nível sérico de IGF-I abaixo dos níveis médios normais e tenha um nível sérico de GH estimulado, médio ou máximo, que seja pelo menos normal, em que o paciente não tem síndrome de Laron.

Breve descricão dos desenhos A figura 1 apresenta concentrações séricas de GHBP em crianças no Genentech National Cooperative Growth Estudo (NCGS) com deficiência em hormona do crescimento (GHD), ISS, e síndrome de Turner (TS), normalizadas para a idade e o sexo e expressas como SDS, por idade no momento da ff ti 7 040 EP 0 754 048 /PT 4 0 Jl· **%)&*«*#**»<*«*

'L admissão no estudo. A área sombreada representa a gama normal (-2 SD a + 2 SD) para cada sexo. A linha contínua indica a média normal para a idade e sexo. Ocasionalmente, os pontos de dois ou mais pacientes sobrepõem-se e aparecem como um ponto único. A figura 2 apresenta a taxa de crescimento em cm/ano de pacientes admitidos no NCGS com ISS, tratados com várias doses de GH administradas por injecção diária. A figura 3A representa concentrações de IGF-I, normalizadas para a idade e sexo e expressas como SDS, em função da SDS de GHBP (média ±SD). A figura 3B representa concentrações de GH médias de 12 h de amostragem durante a noite de 20 em 20 min durante 12 h, em função da SDS de GHBP (média ± SD) para os pacientes admitidos no estudo utilizados para gerar a figura 2.

A figura 4 representa a taxa de crescimento anualizada do primeiro ano (cm/ano) em função da SDS de GHBP para pacientes tratados com GH humana (hGH) que permaneceram na pré-puberdade durante o primeiro ano de terapia com GH (n = 166). A área sombreada representa a gama normal para a GHBP (-2 SDS a +2 SDS). A figura 5 apresenta um gráfico das taxas de crescimento antes do tratamento, primeiro ano de tratamento e segundo ano de tratamento, para pacientes cujos dados estão apresentados na Tabela VII do Exemplo III adiante, possuindo uma SDS de GHBP de -2 (n-14) (quadrados) ou uma SDS de GHBP >-2 (n = 29) (círculos).

As figuras 6A e 6B apresentam, na forma de gráfico de barras, as taxas de crescimento antes do tratamento (Fig. 6A) e no primeiro ano de tratamento (Fig. 6B) em função da SDS de GHBP para os pacientes utilizados para gerar a Fig. 5. A figura 7 apresenta o estado de crescimento conforme previsto por uma medição da secreção de GH (e.g., concentração de GH estimulada ou endógena) vs. uma medida da capacidade de resposta de GH (e.g., concentração de GHBP).

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5 A figura 8 apresenta as sequências de ADN (SEQ ID NO: 1 e 2, respectivamente) e sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 3 e 4, respectivamente) de dois alelos de GHR no Paciente 4 com ISS (exões 4-6). As mutações nos alelos 1 e 2 estão dentro de uma caixa. As barras verticais indicam as fronteiras do exão na sequência de ADNc. A figura 0 apresenta as sequências de ADN (SEQ ID NO: 5 e 6, respectivamente) e sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 7 e 8, respectivamente) de dois alelos de GHR no Paciente 2 com ISS (exão 5). As mutações no alelo 2 estão dentro de uma caixa. A figura 10 apresenta as sequências de ADN SEQ ID NO:9 e 10, respectivamente) e sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO:11 e 1 2, respectivamente) de dois alelos de GHR no Paciente 1 com ISS (exão 7). A mutação no alelo 2 está dentro de uma caixa. A sequência do intrão é dada em letras minúsculas e a sequência do exão em letras maiusculas. As barras verticais indicam as fronteiras do exão na sequência de ADN. A figura 11 apresenta as sequências de ADN (SEQ ID NO: 13 e 14, respectivamente) e sequências de aminoácidos deduzidas (SEQ ID NO: 15 e 16, respectivamente) de dois alelos de GHR no Paciente 7 com ISS (exão 7). A mutação no alelo 2 está dentro de uma caixa. A sequência do intrão é dada em letras minúsculas e a sequência do exão em letras maiúsculas. As barras verticais indicam as fronteiras do exão na sequência de ADN.

Descricão das concretizações preferidas

Definições: A população de pacientes tratada de acordo com a presente invenção exclui pacientes com "síndrome de Laron," de outro modo conhecidos e aqui definidos como pessoas com completa falta de função de GHR ou GHIS completo. Estes pacientes atingem uma altura em adultos de apenas 110-130 cm. Os sintomas comuns adicionais incluem face e maxilar pequenos, ponte nasal deprimida, protuberância frontal, obesidade, voz aguda, e hipoglicemia cedo na infância. Bioquimicamente, são caracterizados como possuindo concentrações séricas de GH aumentadas mas baixas concentrações séricas de IGF-I.

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ΕΡ 0 754 048 /PT "Aumentar a taxa de crescimento de um paciente humano" inclui não apenas a situação em que o paciente atinge pelo menos a mesma altura final que pacientes deficientes em GH tratados com GH (i.e. pacientes diagnosticados com GHD), mas refere-se também à situação em que o paciente chega a acompanhar em altura à mesma taxa de crescimento que pacientes deficientes em GH tratados com GH, ou atinge uma altura em adulto que está denliu da yama de alturas alvo, i.e., uma altura final consistente com o seu potencial genético conforme determinado pela altura alvo média dos progenitores. "Síndrome de insensibilidade parcial à hormona do crescimento" ou "GHIS parcial” referem-se a um síndrome em que o paciente responde às mesmas doses de GH que se dão a pacientes deficientes em GH, mas não responde tão bem. Este síndrome é adicionalmente caracterizado por o paciente ter uma altura inferior a -2 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, preferivelmente na gama de menos de -2 a -4 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, tem um nível sérico de GHBP de alta afinidade que é pelo menos 2 desvios padrão (tipicamente 2-4 desvios padrão) abaixo do nível normal para humanos, tem um nível sérico de IGF-I que é abaixo do nível médio normal para humanos e tem um nível sérico de GH estimulado, médio ou máximo, que é pelo menos normal para humanos. Os níveis séricos médios são a média das medições no paciente.

Tal como aqui se utiliza, "baixa estatura não deficiente em GH" refere-se a um paciente que tem uma SDS de altura cerca de < 2 SD abaixo do normal para a idade e sexo e não tem GHD (como classicamente definida com base nos níveis de secreção de GH abaixo de um nível limiar mínimo).

Tal como aqui se utiliza, "hormona do crescimento" ou "GH" referem-se a hormona do crescimento na sequência nativa ou numa forma variante, e de qualquer fonte, quer natural, sintética ou recombinante. Os exemplos incluem hormona do crescimento humana (hGH), que é GH natural ou recombinante com a sequência nativa humana (somatotropina ou somatropina), e hormona do crescimento recombinante (rGH), que se refere a qualquer GH ou variante de GH produzida por meio de tecnologia de ADN recombinante, incluindo somatrem, somatotropina e somatropina. É aqui preferida para utilização humana a GH madura com a sequência nativa humana recombinante, com ou

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sem uma metionina no seu terminal N. É mais preferida a hormona do crescimento humana com metionilo (met-hGH) produzida em E. coli, e.g., pelo processo descrito em Pat. n° U.S. 4,755,465 concedida em 5 de Julho, 1988 e Goeddel et ai, Nature, 282: 544 (1979). A Met-hGH, que é comercializada com a marca registada Protropin® por Genentech, Inc., é idêntica ao polipéptido natural, com a excepção da presença de um resíduo metionina no terminal N. Este ciriiiiiuáciclo adicionado é um resultado do processo de síntese proteica bacteriana. É também preferida a hGH recombinante disponível de Genentech, Inc. com a marca registada Nutropin®. Esta última hGH não tem este resíduo metionina e tem uma sequência de aminoácidos idêntica à da hormona natural. Veja-se Gray et ai., Biotechnology, 2: 161 (1984). Tanto a metionil-hGH como a hGH têm potências e valores farmacocinéticos equivalentes. Moore et aL, Endocrinology, 122: 2920-2926 (1988). Outra hGH candidata apropriada é uma variante de hGH que é uma forma placentária de GH com actividade somatogénica pura e sem actividade lactogénica como descrito em Pat. n° U.S. 4,670,393 concedida em 2 de Junho, 1987. Estão também incluídas variantes de GH como descritas em WO 90/04788, publicado em 3 de Maio, 1990 e WO 92/09690 publicado em 11 de Junho. 1992.

Tal como aqui se utiliza, "IGF-I" refere-se ao factor de crescimento semelhante a insulina -I de qualquer espécie, incluindo bovina, ovina, porcina, equina, avícola e preferivelmente humana, com a sequência nativa ou numa forma variante, e de qualquer fonte, quer natural, sintética ou recombinante. O IGF-I foi isolado de soro humano e produzido recombinantemente. Veja-se, e.g., EP 123 228 e 128 733. É aqui preferido para utilização humana o IGF-I maduro com a sequência nativa humana, mais preferivelmente sem uma metionina no terminal N, preparado, e.g., pelo processo descrito em EP 230 869 publicada em 5 de Agosto, 1987; EP 128 733 publicada em 19 de Dezembro, 1984; ou EP 288 451 publicada em 16 de Outubro, 1988. Mais preferivelmente, este IGF-I de sequência nativa é produzido recombinantemente e está disponível de Genentech, Inc., South San Francisco, CA para investigação clínica.

As variantes de IGF-I preferidas são as descritas em Pat. n° U.S. 5 077 276 concedida em 31 de Dezembro, 1991, em PCT WO 87/01038 publicado em 26 de Fevereiro, 1987 e em PCT WO 89/05822 publicado em 29 0 '0^·: 8 87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT de Junho, 1989, i.e., aquelas em que pelo menos o resíduo ácido glutâmico está ausente na posição 3 a partir do terminal N da molécula madura ou aquelas que possuem uma deleção de até cinco aminoácidos no terminal N. A variante mais preferida tem os primeiros três aminoácidos do terminal N delecionados (variadamente designada como IGF do cérebro, tIGF-l, des(1 -3HGF-I, ou des-IGF-l). "Proteína de ligação à hormona do crescimento de alta afinidade" ou "GHBP de alta afinidade" referem-se ao domínio extracelular do GHR que circula no sangue e funciona como uma GHBP em várias espécies (Ymer e Herington, Mol. Cell. Endocrino., 4A_: 153 [1985]; Smith e Talamantes, Endocrinology, 123: 1489-1494 [1988]; Emtner e Roos, Acta Endocrinologica (Copenh.), 122: 296-302 [1990]), incluindo o homem. Baumann et a!., J. Clin. Endocrinol. Metab. (JCEM), 62: 134-141 (1986); EP 366 710 publicada em 9 de Maio, 1990; Herington et ai, J. Clin. invest., 77: 1817-1823 (1986); Leung et ai, Nature, 330: 537-543 (1987). Uma segunda BP com menor afinidade para GH foi também descrita que parece não estar estruturalmente relacionada com o GHR. Baumann e Shaw, J.C.E.M., 70: 680-686 (1990). Existem vários métodos para a medição de GHBP funcional no soro, sendo o método preferido um ensaio imunofuncional mediado por ligandos (LIFA) descrito por Carlsson et a!., J.C.E.M., 73: 1216 (1991) e Pat. n° U.S. 5 210 017.

Modos para a realização da invenção: A subpopulação de pacientes indicados para tratamento pela presente invenção consiste em pacientes com GHIS parcial tal como definido atrás. O paciente tem que exibir todos os sinais clínicos estabelecidos para ser tratável pelo método aqui reivindicado. A GH e/ou o IGF-I são directamente administrados ao paciente por qualquer técnica adequada, incluindo por via parentérica, intranasal, intrapulmonar, oral ou por absorção através da pele. Se forem administrados juntamente, não precisam ser administrados pela mesma via. Podem ser administrados localmente ou sistemicamente. Os exemplos de administração parentérica incluem administração subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial e intraperitoneal. Preferivelmente, são administrados por injecção subcutânea diária. Λ*·7

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ΕΡ 0 754 048 /PT 9 A GH e/ou o IGF-I a utilizar na terapia serão formulados e doseados de uma maneira consistente com a boa prática médica, tendo em conta a condição clínica do paciente individual (especialmente os efeitos secundários do tratamento com GH ou IGF-I sozinhos), o local de entrega da composição ou composições de IGF-I e GH, o método de administração, o programa de administração, e outros factores conhecidos dos médicos. As "quantidades eficazes" de cada componente para os fins da invenção são assim determinados por estas considerações e são quantidades que aumentam as taxas de crescimento dos pacientes.

Se a GH é administrada sozinha, emprega-se preferivelmente uma dose superior a 0,2 mg/kg/semana, mais preferivelmente superior a 0,25 mg/kg/semana, e ainda mais preferivelmente superior ou igual a 0,3 mg/kg/semana. Numa concretização, a dose de GH varia de 0,3 a 1,0 mg/kg/semana, e noutra concretização de 0,35 a 1,0 mg/kg/semana. Preferivelmente a GH é administrada uma vez por dia, subcutaneamente. A GH é adequadamente administrada de forma contínua ou descontínua, tal como em tempos particulares (e.g., uma vez por dia) na forma de uma injecção de uma dose particular, onde haverá um aumento da concentração de GH no plasma no momento da injecção, e depois uma queda da concentração de GH no plasma até ao momento da injecção seguinte. Outro método de administração descontínua resulta da utilização de microsferas de PLGA e muitos dispositivos de implante disponíveis que proporcionam uma libertação descontínua do ingrediente activo, tal como uma ruptura inicial, e depois uma espera antes da libertação do ingrediente activo. Veja-se, e.g., Pat. n° U.S. 4 767 628, col. 2, linhas 19-37. A GH pode também ser administrada de modo haver uma presença contínua no sangue que é mantida durante a duração da administração da GH. Isto é mais preferivelmente conseguido por meio de infusão contínua através de, e.g., uma mini-bomba tal como uma mini-bomba osmúlica. Alternativamente, é apropriadamente conseguido através da utilização de injecções frequentes de GH (i.e., mais do que uma vez por dia, por exemplo, duas vezes ou três vezes por dia).

Em ainda outra concretização, a GH pode ser administrada utilizando formulações de GH de longa actuação que ou retardam a depuração de GH a partir do sangue ou causam a libertação lenta de GH a partir de, e.g., um local de injecção. A formulação de longa actuação que prolonga a depuração de GH no plasma pode ser na forma de GH complexada, ou covalentemente conjugada (por ligação reversível ou irreversível) a uma macromolécula tal como uma ou mais das suas proteínas de ligação (WO 92/08985 publicado em 29 Maio, 1992) ou um polímero solúvel em água seleccionado de entre homopolímeros de PEG e de polipropilenoglicol e polioxietilenopoliois, i.e., os que são solúveis em água à temperatura ambiente. Alternativamente, a GH pode ser complexada ou ligada a um polímero para aumentar a sua semivida em circulação. Os exemplos de polietilenopoliois e polioxietilenopoliois úteis para este fim incluem polioxietilenoglicerol, polietilenoglicol, polioxietilenossorbitol, polioxietilenoglucose, ou semelhantes. 0 esqueleto de glicerol de polioxietilenoglicerol é o mesmo esqueleto que ocorre em, por exemplo, animais e humanos em mono-, di-, e triglicéridos. 0 polímero não precisa de ter qualquer peso molecular particular, mas prefere-se que o peso molecular esteja entre cerca de 3500 e 100 000, mais preferivelmente entre 5000 e 40 000. Preferivelmente o homopolímero de PEG não é substituído, mas pode também ser substituído numa extremidade com um grupo alquilo. Preferivelmente, o grupo alquilo é um grupo alquilo C1-C4, e mais preferivelmente um grupo metilo. Mais preferivelmente, o polímero é um homopolímero de PEG não substituído, um homopolímero de PEG monossubstituído com metilo (mPEG) ou polioxietilenoglicerol (POG) e tem um peso molecular de cerca de 5000 a 40 000. A GH é covalentemente ligada através de um ou mais dos resíduos de aminoácido da GH a um grupo terminal reactivo no polímero, dependendo principalmente das condições reaccionais, do peso molecular do polímero, etc. 0 polímero com o grupo ou grupos reactivos é aqui designado por polímero activado. O grupo reactivo reage selectivamente com grupos amino livres ou outros grupos reactivos na GH. Deve entender-se, contudo, que o tipo e a quantidade do grupo reactivo escolhido, bem como o tipo de polímero empregue, para obter resultados óptimos, dependerá da GH particular empregue para evitar que o grupo reactivo reaja com demasiados grupos particularmente activos na GH. Como isto pode não ser possível de evitar completamente,

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ΕΡ 0 754 048 /PT 11 recomenda-se que geralmente se empreguem cerca de 0,1 a 1000 moles, preferivelmente 2 a 200 moles, de polímero activado por mole de proteína, dependendo da concentração de proteína. A quantidade final de polímero activado por mole de proteína é um equilíbrio para manter a actividade óptima, enquanto ao mesmo tempo optimizando, se possível, a semivida em circulação da proteína.

Embora os resíduos possam ser quaisquer aminoácidos reactivos na proteína, tal como uma ou duas cisteínas ou o grupo aminoácido N-terminal, preferivelmente o aminoácido reactivo é lisina, que é ligada ao grupo reactivo do polímero activado através do seu grupo epsilon-amino livre, ou ácido glutâmico ou aspártico, que está ligado ao polímero através de uma ligação peptídica. A reacção de modificação covalente pode ocorrer através de qualquer método apropriado genericamente utilizado para a reacção de materiais biologicamente activos com polímeros inertes, preferivelmente a cerca de pH 5-9, mais preferivelmente 7-9 se os grupos reactivos na GH são grupos lisina. Genericamente, o processo envolve a preparação de um polímero activado (com pelo menos um grupo hidroxilo terminal), a preparação de um substrato activo a partir deste polímero, e depois a reacção da GH com o substrato activo para produzir uma GH adequada para formulação. A reacção de modificação anterior pode ser realizada através de vários métodos, que podem envolver um ou mais passos. Os exemplos de agentes de modificação que podem ser utilizados para produzir o polímero activado numa reacção de um único passo incluem cloreto de ácido cianúrico (2,4,6-tricloro-S-triazina) e fluoreto de ácido cianúrico.

Numa concretização a reacção de modificação ocorre em dois passos em que o polímero reage primeiro com um anidrido de ácido tal como anidrido succínico ou glutárico para formar um ácido carboxílico, e o ácido carboxílico reage depois com um composto capaz de reagir com o ácido carboxílico para formar um polímero activado com um grupo éster reactivo que é capaz de reagir com a GH. Os exemplos destes compostos incluem N-hidroxissuccinimida, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónico e semelhantes, e preferivelmente utiliza-se N-hidroxissuccinimida ou ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónico. Por exemplo, o PEG monossubstituído com metilo pode reagir a temperaturas elevadas, preferivelmente cerca de 100-110°C durante quatro horas, com anidrido glutárico. O monometil-PEG-ácido glutárico assim produzido reage 87 040 ΕΡ 0 754 048/PT ; i 12 , ·’· //.. então com N-hidroxissuccinimida na presença de um reagente de carbodiimida tal como diciclo-hexil- ou isopropilcarbodiimida para produzir o polímero activado, glutarato de metoxipolietilenoglicolil-N-succinimidilo, que pode então reagir com a GH. Este método é descrito em detalhe em Abuchowski et al., Câncer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984). Noutro exemplo, o PEG monossubstituído com metilo pode reagir com anidrido glutárico seguindo-se a reacção com ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzenossulfónicn (HNSA) na presença de diciclo-hexilcarbodiimida para produzir o polímero activado. O HNSA é descrito por Bhatnagar et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich et al. (eds.) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL., 1981), pág. 97-100, e em Nitecki et a!., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) intitulado "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications."

Os métodos específicos para a produção de GH conjugada com PEG incluem os métodos descritos em Pat. n° U.S. 4 179 337 para PEG-GH e Pat. n° U.S. 4 935 465, que descreve PEG reversivelmente mas covalentemente ligado a GH. Outros métodos específicos para a produção de PEG-GH incluem os seguintes: A ligação a PEG com metoxipolietilenoglicolaldeído (Me-PEG aldeído) por alquilação redutora e purificação é realizada adicionando a 2 mg/ml de GH em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,0, 5 mM de Me-PEG aldeído-5000 (peso molecular de 5000 dalton) e 20 mM de NaCNBH3 e misturando suavemente à temperatura ambiente durante 3 horas. É então adicionada etanolamina a 50 mM para amidar de forma redutora o Me-PEG restante que não reagiu. A mistura é separada numa coluna de permuta aniónica, FPLC Mono Q. O Me-PEG restante que não reagiu não se liga à coluna e pode então ser separado da mistura. Obtêm-se duas fracções principais de GH ligada a PEG com pesos moleculares aparentes de 30K e 40K em SDS-PAGE reduzida, vs. 20K da GH que não reagiu. O complexo GH-GHBP é ligado a PEG da mesma maneira para originar um derivado de 1 50K por filtração em gel. A ligação a PEG com N-hidroxisuccinimidil-PEG (NHS-PEG) e purificação são realizadas adicionando NHS-PEG a um excesso molar de 5 vezes da concentração total de lisina da GH a uma solução contendo 2 mg/ml de 13

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EP 0 754 048 /PT GH em 50 mM de tampão de borato de sódio a pH 8,5 ou PBS a pH 7, e misturando à temperatura ambiente durante uma hora. Os produtos são separados numa coluna de exclusão por tamanhos Superose 12 e/ou Mono Q de FPLC. A GH ligada a PEG varia em tamanho dependendo do pH da reacção, de aproximadamente 300 K para a reacção a pH 8,5 a 40K para pH 7,0 conforme medido por filtração em gel. O complexo GH GHBP é também ligado a PEG da mesma maneira com um peso molecular resultante de 400 a 600 Kd a partir de filtração em gel. A ligação a PEG dos mutantes de cisteína da GH com PEG-maleimida é realizada por preparação de um único mutante de cisteína de GH por mutagénese dirigida ao local, sua secreção a partir de uma estirpe 16C9 de E. coli (W3110 AtonA phoA ΔΕ15 A(argF-lac) 169 deoC2 que não produz a proteína deoC) e purificação numa coluna de permuta aniónica. A estirpe 16C9 foi construída geneticamente por transferência do alelo deoC2 da estirpe CGSC#6092 (N° 6092, disponível do E. coli Genetic Center, New Haven, Conn. e descrita em Mark et al., Molec. Gen. Genet., 155: 145-152 (1977), com o genótipo trxA1 recAI HvE720::tn5 metEJO deoC2 lacZ53 rha5 malB45 rpsL151) numa estirpe designada 7C1. A estirpe 7C1 Icom o genótipo W3110 AtonA phoA ΔΕ15 AíargF-lac)169] foi construída em vários passos utilizando técnicas envolvendo transduções com o fago P1 Kc, derivado de P1 (J. Miller, Experimenta in Molecular Genetics [Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972]), e genética de transposões (Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116:1 25-1 59 [1977]). A E. coli K12 W3110, que é uma estirpe K12 que é F-, λ- (o tipo selvagem é F + , λ + ) (Bachmann, Bact. Rev., 36: 525-557 [1972]), foi utilizada como hospedeiro de partida.

Primeiro, o gene tonA (fhuA) (Kadner et al., J. Bact., 143: 256-264 [1980]; Bachmann, Microbiol. Rev., 47: 180-230 [1983]) foi delecionado pela inserção e subsequente excisão imprecisa de um transposão Tn10 no gene tonA.

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 14

No primeiro passo deste procedimento, transduziu-se E. co/ί W3110 com λ::Tn10 para gerar um hop pool Tn10 de E. coli W3110 (Kleckner et a!., J. Mo/. Biol., supra). O hop pool de E. coli W3110::7/7/0 foi crescido em caldo L a 37°C até uma densidade celular de cerca de 1 x 109/ml. Centrifugou-se um total de 0,5 ml da cultura c rcssucpendeu-se a pelete em 0,2 ml de um lisado de 7phi80 contendo 7,0 x 109 ufp. Deixou-se o fago absorver durante 30 minutos a 37°C. Espalhou-se então a suspensão em placas EMB suplementadas com tetraciclina (15 pg/ml). Após uma incubação de um dia para o outro a 37°C, reuniram-se as colónias em 3 ml de caldo L, cresceram-se durante a noite a 37°C, lavaram-se duas vezes e ressuspenderam-se em caldo L. Preparou-se um bacteriófago P1kc nesta cultura (Miller, J.H., Experiments in Molecular Bio/ogy, supra, página 304). A E. coli AT982 (n°4546, E. coli Genetic Stock Center, New Haven, Conn.) foi transduzida para resistência à tetraciclina por este lisado Plkc. Seleccionaram-se os transdutantes em placas de caldo L suplementadas com tetraciclina (15μ9/ηηΙ) e 40 pg/ml de ácido diaminopimélico (dap). Os transdutantes resultantes foram pesquisados quanto a resistência à tetraciclina e a regeneração dos transdutantes dap*, tef do gene dap (dap*, tef), foram então testados quanto a resistência a Àphi80.

Os lisados de Plkc foram então preparados em várias estirpes resistentes a Ãphi80, dap*, tef. Os lisados foram utilizados para a transdução de E. coli W3110 para resistência a tetraciclina. Os transdutantes foram pesquisados e seleccionados quanto a resistência a Àphi80.

Os isolados sensíveis a tetraciclina foram seleccionados a partir dos transdutantes W3110 tonA::Tn10-Áphi80fí. Maloy e Nunn., J. BacterioL, 145: 1110 (1981). Estes isolados foram verificados quanto a resistência a Àphi80 e sensibilidade a tetraciclina após uma única purificação das colónias.

Isolou-se o ADN de vários mutantes resistentes a Áphi80, sensíveis a tetraciclina, e digeriu-se com Ssfll. Caracterizou-se o ADN digerido com Ssfll através do procedimento de transferência de Southern utilizando ADN de 87 040 -·· "r.

EP 0 754 048 /PT 1 5 r ; ;‘ λ::Τη10 digerido com Ssfll e radioactivamente marcado como sonda para determinar se o TnW tinha sido excisado. Davis et at., Advanced Bactéria! Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980). Mostrou-se que um dos isolados sensíveis a tetraciclina perdeu duas das bandas de hibridação de TnW em comparação com a hibridação entre ADN do Â::Tn10 e do W3110 tonA::TnW?phi80R progenitor. Uma terceira banda de hibridação tem uma mobilidade alterada, indicando que ocorreu uma deleção causada pelo cxcisão imprecisa de TnW. A electroforese em gel SDS de preparações da membrana externa a partir da estirpe com uma excisão imprecisa de TnW revelou que a banda que se assumiu como sendo a proteína TonA tinha uma mobilidade electroforética alterada em comparação com a proteína TonA do tipo selvagem. A proteína resultante não era funcional como uma proteína receptora do fago λρΝ80. A segunda estirpe independente que também sofreu uma excisão imprecisa de TnW não apresentou a proteína TonA no gel SDS.

Nenhuma destas estirpes demonstrou reversão para resistência a tetraciclina ou para susceptibilidade a Àphi80, indicando que houve uma excisão imprecisa de todo ou parte do transposão TnW juntamente com uma deleção parcial ou completa do gene tonA. Assim, a proteína TonA (PM de 78 000) foi eliminada da membrana externa, tornando a estirpe W3110tonA resistente a vários bacteriófagos.

Então, mais duas mutações de deleção, phoA Δ £15 (Sarthy et a/., J. Bact., 145: 288-292 [1981]) e Δ (argF-lacl-169 (Schweizer et al., Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 [1983]), foram transferidas simultaneamente para W3110 tonA por ligação genética a um transposão de resistência a canamicina inserido num gene de biossíntese de prolina (proC::Tn5). 0 transposão foi eliminado por selecção quanto a revertentes prototróficos (pro*) espontâneos em placas de ágar mínimo de glucose. A introdução da mutação phoA foi reconhecida como transdutantes que formam colónias brancas em placas de ágar mínimo de glucose com fosfato 0,2 mM e 20 mg/l de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo. Do mesmo modo, a mutação Δ(argF-lac) 169 causa a perda da enzima beta-galactosida3e e resulta cm células

si!

87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT 16 que formam colónias brancas em placas de ágar de lactose a 1 %-MacConkey. O resultado foi a estirpe 7C1.

Finalmente, a mutação deoC (Bachmann, supra), que remove a aldolase, foi introduzida em 7C1 através de um processo de múltiplos passos de transduções utilizando o fago P1kc. Utilizaram-se métodos Standard para a Liansdução. Primeiro, introduziu-se a auxotrofia em relação a treonina em 7C1 para proporcionar um meio para a selecção positiva de segmentos cromossómicos transduzidos na região do gene deoC como se segue.

Cresceu-se P1kc num auxotrofo para treonina, estando tais auxotrofos descritos em Clare N. Berg e Douglas E. Berg. Microbiology-1981, "Bacterial Transposons", pag. 107-116 (Amer. Soc. For Microbiology, Washington, DC, 1981). O lisado resultante foi utilizado para transduzir a estirpe 7C1 para resistência a tetraciclina, seleccionando transdutantes em placas LB contendo 25 pg/ml de tetraciclina. A estirpe resultante, designada 14A9 [tonAA, phoAAE15, A(argF-lac)169 thrr.tnlO), reverteu espontaneamente para prototrofia com uma alta frequência, de modo que se utilizaram placas de ácido fusárico (J. Bact., 145: 1110 [1981]) para seleccionar um auxotrofo para treonina estável sensível a tetraciclina, designado estirpe 16C4. O P1kc foi crescido na estirpe CGSC#6092, supradescrita. O lisado resultante foi utilizado para transduzir a estirpe 16C4 para prototrofia, seleccionando quanto a crescimento em placas de ágar mínimo de glucose. Para obter um lisado de transdução de alta frequência a partir da estirpe 2D4, o fago PTkc teve tem que ser circulado para crescer duas vezes neste hospedeiro. Isolaram-se cinco transdutantes prototróficos da estirpe 16C4, purificaram-se e testaram-se quanto a crescimento em placas de ágar mínimo de timidína. Quatro de cinco destes isolados não conseguiu crescer em timidina e portanto tinham recebido a mutação deoC2 que elimina a síntese da proteína deoC. Um destes quatro isolados foi guardado e foi designado estirpe 16C9 (AtonA, phoA, Ae15, A(argF-fac) 169, deoC2). 17 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT O PEG-maleimida é preparado por reacção de monometoxi-PEG-amina com sulfo-MBs em fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,5, durante uma hora à temperatura ambiente e o tampão foi trocado para tampão fosfato, pH 6,2. Em seguida mistura-se GH com uma cisteína livre extra durante uma hora e separa-se a mistura final sobre uma coluna Mono Q como na GH ligada a PEG com Me-PEG-aldeído.

Como as ligações éster são química e fisiologicamente lábeis, pode ser preferível utilizar na reacção de conjugação um reagente de PEG que não contenha a funcionalidade éster. Por exemplo, uma ligação carbamato pode ser realizada por reacção de PEG-éter monometílico com fosgénio para originar o cloroformato de PEG. Este reagente pode então ser utilizado da mesma maneira que o éster NHS para funcionalizar aminas da cadeia lateral da lisina. Em outro exemplo, a ligação ureia é preparada por reacção de um amino-PEG-éter monometílico com fosgénio. Isto produziria um isocianato de PEG que reagirá as aminas da lisina.

Uma maneira preferida de preparar PEG-GH, que não contenha um éster clivável no reagente de PEG, é descrita como se segue: Metoxipoli(etilenoglicol) é convertido num ácido carboxílico por titulação com naftaleno sódico para gerar o alcóxido, seguindo-se o tratamento com acetato de bromoetilo para formar o éster etílico, seguido de hidrólise no correspondente ácido carboxílico por tratamento com hidróxido de sódio e água, como reportado por Buckmann et al., Macromol. Chem., 182: 1379-1384 (1981). 0 ácido carboxílico resultante é então convertido num éster de PEG-N-hidroxissuccinimidilo adequado para acilação de GH por reacção do ácido carboxílico resultante com diciclo-hexilcarbodiimida e NHS em acetato de etilo.

Faz-se então reagir o reagente de NHS-PEG resultante com 12 mg/ml de GH utilizando um excesso molar de 30 vezes em relação à GH num tampão de borato de sódio, pH 8,5, à temperatura ambiente durante uma hora e aplica-se a uma coluna de Q Sepharose em tampão Tris e elui-se com um gradiente salino. Depois aplica-se a uma segunda coluna (fenil Toyopearl) equilibrada em tampão citrato de sódio 0,3 M, pH 7,8. A GH ligada a PEG é então eluída com um gradiente salino inverso, reunida, e o tampão é trocado utilizando uma coluna de dessalinização G25 para um tampão de fosfato de sódio, manitol e glicina, a pH 7,4, para obter uma PEG7-GH adequada formulada. 18 18 Mf" 87 040

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As moléculas de GH ligada a PEG e de complexo GH-GHBP podem ser caracterizadas por SDS-PAGE, filtração em gel, RMN, mapeamento tríptico, cromatografia líquida - espectrofotometria de massa, e ensaio biológico in vitro. A extensão da ligação a PEG é adequadamente primeiro mostrada por SDS-PAGE e filtração em gel e depois é analisada por RMN, que tem um pico de ressonância específico para os hidrogénios de metileno do PEG. 0 número de grupos PEG em cada molécula pode ser calculado a partir do espectro de RMN ou por espectrometria de massa. A electroforese em gel de poliacrilamida em SDS a 10% é apropriadamente realizada em Tris-HCI 10 mM, pH 8,0, NaCI 100 mM como tampão de eluição. Para demonstrar que resíduo é ligado a PEG, pode-se realizar o mapeamento tríptico. Assim, a GH ligada a PEG é digerida com tripsina com uma razão de proteína/enzima de 100 para 1 numa base de mg a 37°C durante 4 horas em acetato de sódio 100 mM, Tris-HCI 10 mM, cloreto de cálcio 1 mM, pH 8,3, e acidificada a pH<4 para parar a digestão antes da separação em Nucleosil C-18 de HPLC (4,6 mmx150 mm, 5 μ, 100Â). 0 cromatograma é comparado ao de um material de partida não ligado a PEG. Cada pico pode então ser analisado por espectrometria de massa para verificar o tamanho do fragmento no pico. 0(s) fragmento(s) portadores de grupos PEG normalmente não são retidos na coluna de HPLC após injecção e desaparecem do cromatógrafo. Este desaparecimento do cromatógrafo é uma indicação de ligação a PEG nesse fragmento particular que deverá conter pelo menos um resíduo lisina. A GH ligada a PEG pode então ser ensaiada quanto à sua capacidade para se ligar a GHBP por métodos convencionais.

Os vários métodos de ligação a PEG utilizados produziram vários tipos de GH do tipo selvagem ligada a PEG, com pesos moleculares aparentes de 35K, 51K, 250K, e 300K por cromatografia de exclusão por tamanhos, que deverão ter um volume próximo do seu volume hidrodinâmico nativo. Estas foram designadas PEG1-GH, PEG2-GH, PEG3-GH, e PEG7-GH, respectivamente. Dos resultados do mapeamento tríptico, tanto à PEG1-GH como à PEG2-GH faltava o fragmento de 9 aminoácidos do terminal N no cromatograma, que possivelmente estava ligado a PEG, o que podia ser confirmado por espectrometria de massa da espécie molecular grande encontrada no líquido à saída do cromatógrafo. Do peso molecular em SDS-PAGE, a PEG1-GH pode ter um PEG na amina N-terminal, e a PEG2-GH pode ter duas moléculas de PEG na amina N-terminal, formando uma amida terciária. A PEG3-GH tem cerca de 5 grupos PEG por molécula com base no resultado de RMN, e no mapa tríptico 19 19 S }‘X*‘ 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT faltavam pelo menos cinco fragmentos peptídicos, sugerindo que estavam ligados a PEG. Crê-se que a molécula de PEG7-GH tem 6-7 grupos PEG por molécula com base em espectrometria de massa.

Os locais para adição de grupos PEG a GH, e os resíduos preferidos para esta conjugação, são a metionina ou a fenilalanina N-terminais, a lisina 38, a lisina 41, a lisina 70, a lisina 140, a lisina 145, a lisina 158, e a lisina 168. Duas lisinas que parecem não se ligar a PEG foram a lisina 115 e a lisina 172. A GH é também adequadamente administrada através de sistemas de libertação sustentada. Exemplos de composições de libertação sustentada úteis aqui incluem matrizes poliméricas semi-permeáveis na forma de artigos conformados, e.g., filmes ou microcápsulas. As matrizes de libertação sustentada incluem polilactidos (Pat. n° U.S. 3 773 919, EP 58 481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 [1983]), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. fíes., 1_5: 167-277 [1981], e Langer, Chem. Tech., 1_2: 98-105 [1982]), acetato de etilenovinilo (Langer et aL, supra) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133 988), ou microsferas de PLGA.

As composições de libertação sustentada de GH também incluem GH encerrada em lipossomas. Lipossomas contendo GH são preparados por métodos conhecidos per se\ DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4030-4034 (1980); EP 52 322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; Ped. Pat. Japonesa 83-118008; U.S. Pat. N°. 4 485 045 e 4 544 545; e EP 1 02 324. Normalmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 angstroms) em que o teor de lípidos é superior a cerca de 30 porcento molar de colesterol, sendo a proporção seleccionada ajustada para a terapia óptima. Em adição, pode-se preparar uma formulação de libertação sustentada biologicamente activa a partir de um aducto da GH covalentemente ligado a um polissacárido activado como descrito em Pat. n° U.S. 4 857 505 concedida em 15 de Agosto, 1989. Em adição, a Pat. n° U.S. 4 837 381 descreve uma composição de microsferas de gordura ou cera ou uma sua mistura e GH para libertação lenta.

Em outra concretização, os pacientes acima identificados são tratados com uma quantidade eficaz de IGF-I. Como proposta genérica, a quantidade

87 040 EP 0 754 048 /PT âf farmaceuticamente eficaz total de IGF-I administrado parentericamente por dose estará na gama de 50 a 240 pg/kg/dia, preferivelmente 100 a 200 pg/kg/dia, de peso corporal do paciente, embora, tal como atrás notado, esta estará sujeita em grande parte à opinião terapêutica. Também, preferivelmente, o IGF-I é administrado uma vez ou duas vezes por dia por injecção subcutânea. O IGF-I pode ser administrado por qualquer meio, incluindo injecções (únicas ou múltiplas, e.g., 1-4 por dia) ou infusões. Tal como com a GH, o IGF-I pode ser formulado de modo a ter uma presença contínua no sangue durante o decorrer do tratamento, como descrito atrás para a GH. Assim, pode ser covalentemente fixado a um polímero ou formulado como uma formulação de libertação sustentada como descrito atrás.

Em adição, o IGF-I é apropriadamente administrado juntamente com qualquer uma ou mais das suas proteínas de ligação, por exemplo, as actualmente conhecidas, i.e., IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 ou IGFBP-6. O IGF-I pode também ser acoplado a um receptor ou anticorpo ou fragmento de anticorpo para administração. A proteína de ligação aqui preferida para IGF-I é IGFBP-3, que é descrita em Pat. n° U.S. 5 258 287 e por Martin e Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986). Esta proteína IGFBP-3 glicosilada é um componente estável aos ácidos, de cerca de 53 Kd num gel de SDS-PAGE não redutor de um complexo de glicoproteína de 125-150 Kd encontrado em plasma humano que é portador da maioria dos IGF endógenos e é também regulado por GH. A administração da proteína de ligação a IGF com IGF-I pode ser realizada pelo método descrito em Pat. n° U.S. 5 187 151. Resumidamente, o IGF-I e a IGFBP são administrados em quantidades eficazes por injecção de bolo subcutânea numa razão molar de 0,5:1 a 3:1, preferivelmente cerca de 1:1.

Numa concretização adicional, tanto o IGF-I como a GH podem ser administrados ao paciente, cada um em quantidades eficazes, ou cada um em quantidades que são sub-óptimas mas quando combinadas são eficazes. Preferivelmente estas quantidades são de 50 a 100 pg/kg/dia de IGF-I e de 0,3 mg/kg/semana de GH. Preferivelmente, a administração de ambos, IGF-I e GH, ó por injecção utilizando, e.g , meins intravenosos ou subcutâneos. Mais 21 f 8/ 040 ΕΡ 0 754 048 /PT preferivelmente, a administração é por injecção subcutânea tanto para o IGF-I como para a GH, mais preferivelmente injecções diárias.

Note-se que médicos que escolhem doses de ambos, de IGF-I e GH, devem ter em conta os efeitos secundários conhecidos de tratamentos com estas hormonas. Para a GH, os efeitos secundários incluem retenção de sódio e expansão do volume extracelular (Ikkos et aí., Acta Endocrinol. (Copenhagen), 32: 341-361 [1959]; Biglieri et a/., J.C.E.M., 21: 361-370 [1961]), bem como hiperinsulinemia e hiperglicemia. O principal efeito secundário aparente do IGF-I é hipoglicemia. Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86: 2868-2872 (1989). De facto, a combinação de IGF-I e GH pode conduzir a uma redução dos efeitos secundários indesejados de ambos os agentes (e.g., hipoglicemia para IGF-I e hiperinsulinismo para GH) e a um restabelecimento dos níveis sanguíneos de GH, cuja secreção é suprimida peio IGF-I.

Para administração parentérica, numa concretização, o IGF-I e a GH são formulados geralmente por mistura de cada um no grau de pureza desejado, numa forma de dosagem unitária injectável (solução, suspensão ou emulsão), com um transportador farmaceuticamente aceitável, i.e., um que não seja tóxico para os receptores nas dosagens e concentrações empregues e seja compatível com outros ingredientes da formulação. Por exemplo, a formulação preferivelmente não inclui agentes oxidantes e outros compostos que se sabe serem prejudiciais para polipéptidos.

Geralmente, as formulações são preparadas por contacto do IGF-I e da GH, cada um uniforme e intimamente, com transportadores líquidos ou transportadores sólidos finamente divididos ou ambos. Depois, se necessário, o produto é conformado na formulação desejada. Preferivelmente o transportador é um transportador parentérico, mais preferivelmente uma solução que é isotónica com o sangue do receptor. Exemplos destes veículos transportadores incluem água, solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. Os veículos não aquosos tais como óleos fixos e oleato de etilo são também úteis aqui, bem como lipossomas. 0 transportador contém adequadamente menores quantidades de aditivos tais como substâncias que aumentam a isotonicidade e a estabilidade química. Tais materiais não são tóxicos para os receptores nas dosagens e 22 22 Φ 87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, e outros ácidos orgânicos ou seus sais; antioxidantes tais como ácido ascórbico; polipéptidos de baixo peso molecular (inferior a cerca de dez resíduos), e.g., poliarginina ou tripéptidos; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido ocpórtico ou arginina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo celulose ou seus derivados, glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; aldóis tais como manitol ou sorbitol; contra-iões tais como sódio e/ou tensioactivos não iónicos tais como polisorbatos, polioxâmeros ou PEG. 0 IGF-I e a GH são cada um tipicamente formulados individualmente nesses veículos numa concentração de cerca de 0,1 mg/ml a 100 mg/ml, preferivelmente 1-10 mg/ml, a um pH de 4,5 a 8. 0 IGF-I de comprimento completo é preferivelmente formulado a um pH de 5-6, e o des(1-3)-IGF-l é preferivelmente formulado a um pH de 3,2 a 5. A GH preferivelmente está a um pH de 7,4-7,8, Entender-se-á que a utilização de certos dos anteriores excipientes, transportadores ou estabilizantes resultará na formação de sais de IGF-I ou de GH.

Embora a GH possa ser formulada por qualquer método adequado, as formulações preferidas para GH são como se segue: para a met-GH (da marca Protropin®), a solução em bruto pré-liofilizada contém 2,0 mg/ml de met-GH, 16,0 mg/ml de manitol, 0,14 mg/ml de fosfato de sódio, e 1,6 mg/ml de fosfato de sódio (mono-hidrato monobásico), pH 7,8. O frasco de 5 mg de met-GH contém 5 mg de met-GH, 40 mg manitol e 1,7 mg de fosfato de sódio total (peso seco) (anidro, dibásico), pH 7,8. O frasco de 10 mg contém 10 mg de met-GH, 80 mg de manitol e 3,4 mg fosfato de sódio total (peso seco) (anidro, dibásico), pH 7,8.

Para a GH sem met (da marca Nutropin®), a solução em bruto pré-liofilizada contém 2,0 mg/ml de GH, 18,0 mg/ml de manitol, 0,68 mg/ml de glicina, 0,45 mg/ml de fosfato de sódio e 1,3 mg/ml de fosfato de sódio (mono-hidrato, monobásico), pH 7,4. 0 frasco de 5 mg contém 5 mg de GH, 45 mg de manitol, 1,7 mg de glicina e 1,7 mg de fosfatos de sódio totais (peso seco) (anidro, dibásico), pH 7,4. 0 frasco de 10 mg contém 10 mg de GH, 23 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 90 mg de manitol, 3,4 mg de glicina e 3,4 mg de fosfatos de sódio totais (peso seco) (anidro, dibásico).

Alternativamente, pode-se utilizar uma formulação líquida de hGH da marca Nutropin®, por exemplo: 5,0+0,5 mg/ml de rhGH; 8,8+0,9 mg/ml de cloreto de sódio; 2,0+0,2 mg/ml de Polisorbato 20; 2,5+0,3 mg/ml de fenol; 2,68+0,3 mg/ml de di-hidrato de citrato de sódio; e 0,17±Q,02 mg/ml de ácido cítrico anidro (o total de ácido cítrico/citrato de sódio anidros é de 2,5 mg/ml, ou 10 mM); pH 6,0+0,3. Esta formulação é adequadamente colocada num frasco de 10 mg, que é um frasco de vidro de 3 cc cheio com 2,0 ml da formulação anterior. Alternativamente, pode-se colocar um cartucho de 10 mg (2,0 ml) contendo a formulação anterior, numa caneta de injecção para injecção de GH líquida ao paciente.

Embora o IGF-I possa ser formulado de qualquer maneira adequada para administração, a formulação preferida contém 2-20 mg/ml de IGF-I, 2-50 mg/ml de um osmólito, 1-15 mg/ml de um estabilizante, e uma solução tamponada a pH 5-5,5. Preferivelmente, o osmólito é um sal inorgânico numa concentração de 2-10 mg/ml ou um aldol numa concentração de 40-50 mg/ml, o estabilizante é álcool benzílico ou fenol, ou ambos, e a solução tamponada é uma solução tamponada de um sal de ácido acético. Mais preferivelmente, o osmólito é cloreto de sódio e o sal de ácido acético é acetato de sódio. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de IGF-I é de 8-12 mg/ml, a quantidade de cloreto de sódio é de 5-6 mg/ml, a quantidade de álcool benzílico é de 8-10 mg/ml, a quantidade de fenol é de 2-3 mg/ml, e a quantidade de acetato de sódio é de cerca de 50 mM de modo que o pH é de 5,4. Adicionalmente, a formulação pode conter 1-5 mg/ml de um tensioactivo, preferivelmente Polisorbato ou poloxâmero, numa quantidade de 1-3 mg/ml.

Em adição, o IGF-I e a GH, preferivelmente o IGF-I de comprimento completo, podem ser formulados juntamente num veículo transportador apropriado para formar uma composição farmacêutica que preferivelmente não contém células. Numa concretização, o tampão utilizado para a formulação dependerá do facto de a composição ser empregue imediatamente após a mistura ou armazenada para utilização posterior. Se empregue imediatamente após a mistura, a mistura de IGF-I de comprimento completo e GH pode ser .C-Ji 87 04U r EP 0 754 048 /PT ^ 24 ^ ^ formulada em manitol, glicina e fosfato, pH 7,4. Se esta mistura vai ser armazenada, é formulada num tampão a um pH de cerca de 6, tal como citrato, com um tensioactivo que aumente a solubilidade da GH a este pH, tal como Polisorbato 20 ou poloxâmero 188 a 0,1%. A preparação final pode ser um líquido estável ou um sólido iiofilizado. A composição combinada preferida compreende IGF-I e GH numa ra7ãn de pesos de IGF-I:GH entre 1:1 e 100:1 (p/p), 0,05-0,3 mM de um osmólito, 0,1-10 mg/ml de um estabilizante, 1-5 mg/ml de um tensioactivo e 5-100 mM de um tampão a pH 5-6. Preferivelmente, o osmólito é um sal inorgânico e o tensioactivo é não iónico. Mais preferivelmente, o sal inorgânico é cloreto de sódio ou cloreto de potássio, o estabilizante é fenol ou álcool benzílico, o tensioactivo é Polisorbato ou poloxâmero, o tampão é acetato de sódio ou citrato de sódio ou ambos, e as quantidades de IGF-I e GH são de 2-20 mg/ml e 0,2-10 mg/ml, respectivamente, sendo a razão de pesos de IGF-I:GH entre 1:1 e 50:1. Ainda mais preferivelmente, a quantidade de IGF-I é de 5-10 mg/ml, a quantidade de GH é de 1-5 mg/ml, a razão de pesos de IGF-I:GH é de 1:1 a 4:1, a quantidade de cloreto de sódio é de 5-7 mg/ml, a quantidade de fenol é de 0,1-3 mg/ml, a quantidade de álcool benzílico é de 6-10 mg/ml, o tensioactivo é Polisorbato numa quantidade de 1-3 mg/ml, a quantidade de acetato de sódio é de 2,5-4 mg/ml e a quantidade de citrato de sódio é de 0,1-1 mg/ml. O IGF-I e a GH a utilizar para administração terapêutica são preferivelmente estéreis. A esterilidade é prontamente conseguida por filtração através de membranas de filtração estéreis (e.g., membranas de 0,2 micra). As composições terapêuticas de IGF-I e GH geralmente são colocadas num recipiente possuindo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou uma frasco de solução intravenosa possuindo uma tampa perfurável por uma agulha de injecção hípodérmica. O IGF-I e a GH serão vulgarmente armazenados em recipientes de doses única ou múltiplas, por exemplo, ampolas ou frascos selados, na forma de uma solução aquosa, ou na forma de uma formulação liofilizada para reconstituição. Como exemplo de uma formulação liofilizada, frascos de 10 ml são cheios com 5 ml de soluções aquosas esterilizadas por filtração a 1% (p/v) de IGF-I e GH, e a mistura resultante é liofilizada. A solução de infusão é preparada por 25 Μ*?

8/ 04U ΕΡ Ο 754 048 /ΡΤ reconstituição do IGF-I e da GH liofilizados utilizando água para injecção bacteriostática. A invenção será mais completamente entendida por referência aos exemplos que se seguem. Estes não devem, contudo, ser considerados como limitantes do âmbito da invenção.

EXEMPLO I

Neste exemplo, mediram-se as concentrações séricas de GHBP num grande número de amostras de crianças baixas quer com etiologias definidas de insuficiência de crescimento (GHD ou TS) quer com ISS, e compararam-se com os níveis de GHBP em controlos normais.

Indivíduos de controlo

Para estabelecer a gama normal para a GHBP no soro, analisaram-se amostras de 773 crianças, 366 do sexo feminino e 407 do masculino. As idades variavam de 3 a 16 anos; em alguns casos, a idade de um determinado indivíduo foi registada como o ano mais próximo. A maioria das amostras foram obtidas de uma população normal, em idade escolar, através de um programa de rastreio para a detecção de anticorpos para células-β pancreáticas (Pasco Co. School System, Florida), e foram generosamente proporcionadas amostras adicionais pelo Dr. Juan Sotos do Children’s Hospital of Columbus, Ohio e pela Dra. Rebecca Kirkland de Baylor College of Medicine, Houston, Texas. As crianças eram saudáveis e acredita-se que representam um perfil da população americana no que concerne à estatura.

Indivíduos com retardacão de crescimento

Recolheram-se amostras de soro de crianças com crescimento retardado (idade de 1 a 17 anos) para a avaliação de linha de base de 776 indivíduos admitidos num projecto de vigilância após comercialização, o NCGS. As amostras foram proporcionadas por 106 dos centros que participaram neste estudo.

Todas as crianças com GHD e ISS incluídas para análise tinham alturas que eram 2 ou mais SDS abaixo da média para a idade e sexo. Os indivíduos foram classificados como possuindo GHD, pelo seu médico da admissão. 26 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT

Nenhuma das crianças com GHD tinha níveis de GH máximos estimulados ou endógenos acima de 10 pg/l reportados pelo médico assistente (utilizando um ensaio não especificado) ou medidos na Genentech Inc. utilizando um ensaio imunorradiométrico monoclonal duplo (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA). São excluídos os indivíduos com causas orgânicas de GHD, tais como tumores no sistema nervoso central (SNC).

Os pacientes classificados como ISS na base de dados do NCGS foram designados como tal pelo médico da admissão (utilizando vários termos) ou tinham um nível de GH estimulado ou endógeno >10 μ9/Ι sem etiologia orgânica de estatura baixa indicada. Os pacientes com TS foram assim identificados pelos seus médicos da admissão e incluem aqueles que têm várias formas de mosaicismo. Nenhum dos indivíduos incluídos tinha anteriormente recebido qualquer forma de terapia com GH.

Medições de GHBP A GHBP foi medida por LIFA como descrito atrás. Resumidamente, revestiram-se placas de microtítulo de noventa e seis poços (Corning Glass Works, Corning, New York) com um anticorpo monoclonal dirigido contra GHBP (MAb263, Agen, Austrália) por incubação durante a noite a 4°C com 100 μΙ/poço de anticorpo a 10 pg/ml em tampão carbonato 50 mmol/l, pH 9,6. Bloquearam-se os poços revestidos com 150 μΙ de PBS, pH 7,2, contendo albumina sérica bovina (BSA) (5 g/l) e lavaram-se. Distribuíram-se os padrões (hGHBP recombinante) ou as amostras (50 μΙ/poço) nos poços revestidos juntamente com 50 μΙ/poço de hGH recombinante (200 pg/l; Genentech, Inc.) e imunoglobulina G de ratinho (10 g/l; Fitzgerald Industries, Chelmsford, MA).

Selaram-se as placas, incubaram-se à temperatura ambiente durante 2 h com agitação suave, e lavaram-se antes da adição de um anticorpo monoclonal anti-GH (MAb MCB, Genentech, Inc.) conjugado com peroxidase de rábano silvestre (100 μΙ/poço). Após incubação adicional durante 2 horas à temperatura ambiente, lavaram-se as placas seis vezes com tampão de lavagem. Adicionou-se às placas uma solução de substrato recentemente preparada (0,4 g de dicloridrato de o-fenilenodiamina num litro de PBS mais 0,4 ml de peróxido de hidrogénio a 30%) (100 μΙ por poço) e realizou-se a incubação no escuro durante 15 riiinutus à temperatura ambiente. Parou-sc α rcocçõo através 27 87 040

C

ΕΡ 0 754 048 /PT da adição de 100 μΙ de ácido sulfúrico 2,25 mol/l e determinou-se a absorvância a 490 nm. A gama de detecção no UFA foi de 15,6 a 1000 pmol/l. Os coeficientes de variação intra- e inter-ensaios foram de aproximadamente 7% e 11 %, respectivamente. Todas as amostras foram medidas em duplicado.

Medições de GH

Para avaliar a secreção espontânea de GH nos diferentes grupos, mediram se as concentrações de GH em amostras de soro recolhidas com intervalos de 20 minutos durante 12 horas (das 18 h às 8 h) de 851 das crianças. Calcularam-se os valores médios para cada indivíduo. As concentracões de GH foram medidas utilizando um ensaio imunorradiométrico (IRMA) baseado em anticorpos monoclonais, com um limite de detecção de 0,5 pg l (Tandem-R HGH, Hybritech).

Medições de IGF-I

As concentrações de IGF-I foram medidas em amostras de soro recolhidas de 858 das crianças na linha de base no momento da amostragem de GH durante a noite, utilizando RIA após extraeção com ácido-etanol (IGF-I RIA Kit, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA).

Análise estatística

Calculou-se a altura normalizada (SDS) a partir da média e desvios padrão (SD) específicos da idade e do sexo derivados dos dados normativos do National Center for Health Statistics (NCHS) para crianças americanas. Hamill et a/., Am. J. Clin. Nutrítion, 32: 607-629 (1979). O índice de massa corporal (BMI) foi calculado utilizando a fórmula: peso (kg)/[altura (m)]2. Os valores da Média e do SD para a idade, SDS de altura e BMI para crianças com crescimento retardado foram calculados a partir de dados reportados nos formulários de admissão no NCGS.

As médias e os desvios padrão para as concentrações de GHBP (Tabelas I e III) e para as concentrações de GH médias de 12 horas (labela IV) foram calculados após transformação logarítmica devido à natureza enviesada dos dados. Os valores anti-log da média, média ± 2 SD (GHBP, Tabela I) e média ±1 SD (GHBP, Tabela III, e GH média de 12 h. Tabela IV) foram então calculados para proporcionar os valores listados. Os afeitos da idade e do sexo

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT nas concentrações de GHBP logarítmicas e no grupo de controlo foram avaliados por análise de variância (ANCOVA). O cálculo dos níveis de GHBP normalizados (SDS) foi baseado nas médias e SD associados dos dados dos indivíduos de controlo agrupados por sexo e idade utilizando a equação abaixo. Para uma concentração de GHBP num indivíduo dc 3 15 anos de idade (a gama de idades para as quais estavam disponíveis amostras de controlo), log (GHBP) - média (log (GHBP) | idade, sexo) SDS = - SD (log (GHBP) | idade, sexo) onde média (log (GHBP) | idade, sexo) é o valor médio logarítmico de GHBP para indivíduos de controlo da mesma idade e sexo que os do indivíduo, e SD (log (GHBP) | idade, sexo) é o SD associado. Após a conversão em SDS, as concentrações de GHBP no soro em crianças diagnosticadas com GHD, ISS, e TS foram comparadas umas com as outras e com os controlos do mesmo sexo por ANCOVA. A SDS de GHBP foi também calculada com base na idade óssea, em vez da idade cronológica.

Quando estavam realizadas múltiplas comparações entre grupos em relação a qualquer variável, aplicaram-se os ajustamentos de Bonferroni aos valores p para significância estatística para manter um nível global de 0,05 de significância para o teste. Os valores p nominais para as comparações estatísticas significativas estão incluídos no texto.

Resultados A gama normal (média + 2 SD) para as concentrações séricas de GHBP em crianças entre 3 e 1 5 anos de idade é apresentada na Tabela I. Devido a um problema técnico, não há resultados disponíveis para crianças de 5 anos de idade. Tanto a idade como o sexo tinham um efeito significativo nas concentrações de GHBP. O sexo feminino tinha concentrações de GHBP superiores ao sexo masculino (p< 0,0001). Em ambos os sexos, as concentrações de GHBP aumentaram com a idade (p<0,0001). 29 87 040 ΕΡ Ο 754 048 /ΡΤ ih . Ί.*** 4ftf!

TABELA I

Gama normal para a concentração sérica de GHBP (pmol/l)

Sexo Idade N Média - 2SD Média Média + 2SD masculino 3 20 57 127 282 4 21 65 120 224 6 31 60 114 214 7 31 70 138 272 8 31 72 193 519 9 36 60 193 619 10 39 62 221 783 11 37 79 244 751 12 50 69 228 750 13 33 80 242 733 14 40 65 190 558 15 33 52 173 582 feminino 3 15 77 149 288 4 17 62 179 519 6 32 58 144 358 7 32 71 172 419 8 32 92 230 572 9 34 96 214 477 10 35 72 247 844 I 11 32 98 289 849 12 36 86 226 595 13 35 110 306 856 14 34 111 271 660 15 32 103 316 965 A Tabela II apresenta a média (± SD) de idade, SDS de altura, e BMI para cada grupo de indivíduos (os dados de altura e BMI não estavam disponíveis para todos os indivíduos de controlo). A média de idades foi semelhante em todos os grupos (aproximadamente 11 anos). Os valores de SDS de altura à média não foram estatisticamente diferentes entre GHD, ISS, e TS no sexo feminino ou entre GHD e ISS no sexo masculino. Os valores de BMI médios foram significativamente mais baixos nos grupos ISS em comparação com os outros grupos de crescimento retardado tanto no sexo feminino (p<0,0137) como no sexo masculino (p<0,0001). 30 íf^f· 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT

TABELA II

Idade, SDS de altura e BMI (média ± SD)

Etiologia Sexo n Idade (anos) Altura(SDS) BMI Controlo M 47 11,7±2,8 0,3+0,8 18,4+2,9 II F 35 11,6+2,4 0,3+0,8 19,0+3,0 GHD M 80 11,8±3,6 -2,9+0,8 18,3+4,5 " F 27 10,8±2,9 -3,2+0,9 17,8+4,0 TS F 96 11,5±3,3 -3,3+0,9 19,1+4,0 ISS M 449 11,4±3,4 -2,9+0,7 16,6+2,3 F 124 10,8±3,0 -3,1+0,7 16,4+2,4

As figuras 1A-1E apresentam as concentrações séricas de GHBP de crianças individuais com GHD, ISS e TS em comparação com a gama normal para o mesmo sexo (-2 SD a +2SD). Os correspondentes valores de concentrações médias de GHBP e de SDS média em todos os grupos estão listados na Tabela III.

Para o sexo masculino com GHD ou ISS, a SDS de GHBP média foi mais baixa do que a do sexo masculino de controlo (ambos p<0,0001), e a SDS média no sexo masculino com ISS foi inferior à do sexo masculino com GHD (p<0,0001). A SDS média para o sexo feminino com ISS e GHD foi inferior à do sexo feminino de controlo (p< 0,0001 e p = 0,0046, respectivamente). Em adição, a SDS média para o sexo feminino com ISS foi inferior à do sexo feminino com GHD (p= 0,0039). Quando os grupos com GHD foram limitados a indivíduos com níveis de GH estimulada máximos <5 pg/l (n = 23), a SDS de GHBP não foi significativamente diferente da média dos controlos.

Devido a diferenças de BMI entre os grupos GHD e ISS e às reconhecidas relações entre os níveis de BMI e de GHBP, realizou-se uma análise de covariância (ANCOVA) utilizando o BMI como covariado para determinar se a diferença entre grupos na GHBP era independente de diferenças no BMI. Tanto no sexo masculino como no feminino, as diferenças de GHBP entre os grupos GHD e ISS permaneceram significativas (p<0,02).

Em 91% dos indivíduos com ISS do sexo masculino e 92% dos indivíduos com ISS do sexo feminino, as concentrações de GHBP estavam abaixo da média para a idade e sexo dos controlos correspondentes. A

jT 8/ 04(J EP 0 754 048 /PT 31 ".fca J/ s c"'

T diferença entre indivíduos com ISS e com GHD foi particularmente notável no sexo masculino, onde 79 de 394 (20,1%) dos indivíduos do sexo masculino com ISS tinham valores >2 SD abaixo da média, em comparação com apenas 6 de 69 (8,7%) indivíduos do sexo masculino com GHD.

Em contraste com indivíduos do sexo feminino com GHD ou ISS, a SDS de GHBP media em crianças com TS não diferiu significativamente Hns indivíduos do sexo feminino de controlo. As SDS de GHBP calculadas para todos os grupos com crescimento retardado utilizando a idade óssea em vez da idade cronológica apresentaram pouca diferença (Tabela III).

TABELA III

Concentrações séricas de GHBP (pmol/l)

Etiologia Sexo n Média Média -1 SD Média + 1 SD GHBP Média SDS|C (n) GHBP Média SDSio (n) Controlo M 407 183 103 326 0,0 (402) n/d II F 366 228 133 394 0,0 (366) n/d GHD (GH<10) M 80 146 86 250 -0,6 (69) -0,5 (46) " F 27 182 89 372 -0,6 (26) -0,5 (18) GHD (GH < 5) M 15 183 111 302 0,1 (12) -0,2 (5) " F 11 203 117 352 -0,5 (11) 0,1 (8) TS F 96 208 115 378 -0,3 (80) -0,1 (61) ISS M 449 103 63 166 -1,2 (394) -1,1 (244) " F 124 131 81 213 -1,2 (117) -1,1 (67) n/d - não disponível IC - idade cronológica IO - idade óssea

Para as concentrações médias de GH obtidas durante a amostragem de GH durante 12 horas durante a noite (Tabela IV), a ANCOVA com etiologia, sexo e idade revelou que apenas a etiologia tinha um impacto significativo no nível de GH médio de 12 horas. Tal como esperado, o valor médio em crianças com GHD foi significativamente inferior ao dos controlos (p<0,0001). O valor em raparigas com TS foi superior ao dos indivíduos do sexo feminino com GHD (p<0,0001) e inferior ao dos indivíduos do sexo feminino quer com ISS quer de controlo (ambos p<0,002). A concentração de GH média de 12 horas em 32 87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT indivíduos com ISS não foi estatisticamente diferente da dos controlos. Contudo, indivíduos com ISS com níveis de GHBP >2 SD abaixo da média tinham valores de GH média de 12 horas superiores aos que tinham níveis normais de GHBP (2,8 vs. 2,3 pg/l, p<0,005). Os níveis médios de IGF-I foram os menores em pacientes de GHD, e eram inferiores aos dos controlos para pacientes com ISS e TS.

TABELA IV

Concentrações de GH médias de 12 horas e de IGF-I (pg/l) GH média de 12-h (pg/L) IGF-I retraída (pg/|) Etiologia Sexo n Média Média 1 SD Média + 1 SD n Média Média -1 SD Média + 1 SD Controlo M 47 2,1 1,2 3,5 47 217 130 363 " F 35 2,7 1,4 5,1 35 308 178 531 GHD (GH < 10) M 79 1,4 0,9 2,1 80 99 41 238 u F 26 1,2 0,7 2,0 27 84 36 195 GHD (GH<5) M 37 1,2 0,8 1,9 37 73 30 174 II F 15 1,0 0,6 1,6 16 74 31 175 TS F 96 1,8 1,0 3,2 96 141 80 248 ISS M 446 2,2 1,4 3,4 449 108 51 231 " F 122 2,2 1,3 3,5 124 120 56 257

As concentrações séricas de GHBP em algumas crianças com ISS são inferiores às das crianças de controlo com idades correspondentes. Em comparação com indivíduos de controlo, as crianças com GHD também tinham concentrações de GHBP inferiores, mas a redução foi menos pronunciada do que em crianças com ISS. Em raparigas com TS, uma condição em que o diagnóstico é baseado na presença de uma anormalidade cromossómica e portanto é absoluta, os níveis de GHBP não foram diferentes dos do grupo de controlo, indicando que os níveis de GHBP não se correlacionam simplesmente com estatura baixa.

Em adição às populações geográfica e geneticamente bem definidas com acção da GH periférica prejudicada, tais como pacientes com síndrome de Laron e pigmeus africanos, podem existir indivíduos com formas mais subtis de \*i · \*i ·

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 33 insensibilidade á GH, muito provavelmente representando uma variedade de defeitos moleculares. Apesar da provável heterogeneidade das causas de retardação do crescimento em crianças com ISS, os resultados anteriores mostram que, como grupo, têm concentrações séricas de GHBP reduzidas, e um subconjunto significativo (20%) tem níveis de GHBP 2 SD ou mais abaixo da média normal para a idade e sexo.

As crianças com ISS que foram estudadas não diferiram do grupo de controlo em termos de secreção de GH e tinham concentrações de GHBP significativamente inferiores às do grupo com GHD. Os pacientes definidos como GHD, com base no limite de exclusão arbitrário de um máximo de GH<10 pg/l, tinham níveis de GHBP inferiores aos dos controlos. Contudo, em pacientes de GHD com GH máxima <5 pg/l, a SDS média de GHBP era superior à do grupo GHD com GH>5 pg/l e não foi diferente dos controlos.

EXEMPLO II

Pacientes seguidos num estudo de vigilância após comercialização, National Cooperative Growth Study (NCGS), foram estudados para comparar taxas de crescimento para pacientes com GHD com os de pacientes com ISS tratados com várias doses de GH. Os pacientes com ISS incluem tanto os que têm níveis normais de GHBP como os que têm níveis baixos de GHBP. Os resultados para os pacientes com ISS, apresentados na Figura 2, demonstram que se obteve uma taxa de crescimento substancialmente superior para crianças tratadas com 0,25±0,025 mg/kg/semana de GH em comparação com 0,20 mg/kg/semana ou menos. A comparação com os pacientes com GHD revela que as doses normais de GH até 0,20 mg/kg/semana não foram suficientes para permitir que os pacientes tivessem uma gama de taxas de crescimento médias próxima daquela que foi observada em pacientes com GHD; no entanto, doses de 0,25±0,025 mg/kg/semana resultaram numa taxa de crescimento média mais próxima da gama observada em pacientes de GHD (cerca de 10 cm/ano). Portanto, uma dose de GH superior a 0,20 mg/kg/semana é adequada para pelo menos alguns pacientes identificados pela presente invenção. a , 4ψ ..;V . t V' . . 87 040 ν · ' ΕΡ 0 754 048/PT " . 34 .

EXEMPLO III

Os pacientes com ISS (tal como definido por um nível máximo de GH >10 pg/l e SDS de altura <-2) têm baixos níveis de GHBP em comparação com controlos normais como determinados por LIFA. Este não foi o caso de crianças baixas com GHD ou TS.

Para avaliar a utilidade do ensaio à GHBP na avaliação de crianças baixas, agruparam-se pacientes com ISS de acordo com a sua SDS de GHBP. Os pacientes com SDS de GHBP baixa, definido como <-2, foram comparados com pacientes com níveis normais de GHBP (SDS de GHBP >-2) para determinar se existia evidência de sensibilidade prejudicada ao tratamento com de GH no grupo anterior.

População de pacientes

Recolheram-se amostras de soro em 96 locais de 511 crianças com ISS que foram subsequentemente tratadas com hGH da marca Protropin® (sendo a dose média ± SD de GH de 0,26±0,07 mg/kg/semana por injecção parentérica para pacientes com dados de crescimento de ano, sendo a dose e o programa de dosagem particulares de GH à discrição do investigador clínico individual) e admitidos no NCGS. Para serem incluídos neste estudo, os pacientes tinham que ter uma GH estimulada máxima >10 pg/l, SDS de altura <-2, e nenhuma outra etiologia de baixa estatura reportada. Os resultados das medições de GHBP não eram conhecidos antes do início da terapia com GH. Para análises que envolvem resposta de crescimento enquanto no tratamento com GH, apenas foram incluídos pacientes na pré-puberdade. Métodos de ensaio A GHBP foi ensaiada utilizando o ensaio LIFA, como descrito em Carlsson et ai, supra. Utilizaram-se anticorpos monoclonais para GHBP (MAb 263) e GH (Mab MCB). Os valores de GHBP foram normalizados para a idade e sexo utilizando dados normativos para o LIFA com base em amostras proporcionadas pelo Dr. Thomas Merimee da University of Florida, Division of Endocrinology and Metabolism, Health Science Center, P.O. Box 100226, Gainesville, Florida 32610-0226, e pelos Drs. Sotos e Kirkland acima mencionados. Estes valores foram anteriormente reportados. Carlsson et ai, J.C.E.M., 78: 1325-1330 (1994). 35 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT

As amostras recolhidas durante a noite foram ensaiadas quanto a GH utilizando um ensaio imunorradiométrico monoclonal duplo (Tandem-R HGH, Hybritech, San Diego, CA). Os valores reportados para os testes de estimulação de GH foram medidos utilizando vários ensaios de GH. O IGF-I foi medido por radioimunoensaio após extracção com ácido-etanol (IGF-I hy Fxtraction, Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA) e normalizado para a idade e sexo utilizando os dados normativos proporcionados. Métodos estatísticos

Normalizaram-se as alturas para a idade e sexo, e normalizaram-se os pesos para a altura e sexo utilizando normas derivadas de dados publicados para crianças norte-americanas. Hamill et al., Am. J. Clin. Nutrition, 32: 607-629 (1979). Calcularam-se as SDS de altura das mães e dos pais com base em percentis de altura para adultos normais. Hamill et al., supra.

Utilizou-se regressão linear múltipla para determinar que variáveis explicatórias estavam linearmente relacionadas com a SDS de GHBP, se existissem. Em adição, dividiram-se os indivíduos em dois grupos com base nas suas SDS de GHBP (<-2 SD e >-2 SD), para determinar a significância, se existisse, dos valores de GHBP que estão abaixo da gama normal. Os dois grupos foram comparados um com o outro em relação às médias ou medianas de várias co-variáveis (veja-se a Tabela VI). Realizaram-se testes de significância univariados entre grupos utilizando um de três testes: o teste t (para variáveis com distribuição Gaussiana), o teste da soma de classes de Wilcoxon (para variáveis com distribuição não-Gaussiana), ou o teste do Qui quadrado (para variáveis discretas). Para ajustar as comparações múltiplas, consideraram-se valores p <0,005 estatisticamente significativos. Utilizou-se ANCOVA para testar diferenças entre os dois grupos de GHBP após controlo de outras variáveis significativas.

Resultados

Os pacientes no grupo de GHBP baixa eram mais jovens e tinham menor SDS de peso-para-altura e BMI do que o grupo de GHBP normal (Tabela V). A SDS de altura média foi de -2,9 em ambos os grupos, com valores variando de -5,8 a -2,0. Aproximadamente três quartos dos pacientes eram do sexo masculino; observa-se uma distribuição por sexos semelhante na base de dados 36 87 040 .a;

ΕΡ 0 754 048 /PT completa do NCGS. August et ai, J. Pediatr., 116: 899-903 (1990). Setenta e dois porcento dos pacientes estavam na pré-puberdade na linha de base.

TABELA V

Características do paciente na linha de base 1 SDS de GHBP < -2 SDS de GHBP > -2 n média SD n média SD valor p Sexo masculino 80 (79%) 315 (77%) 0,61 Sexo feminino 21 (21%) 95 (23%) Pré-puberdade 75 (78%) 281 (71%) 0,14 Puberdade 21 (22%) 117 (29%) Idade (anos) 101 10,4 3,1 410 11,4 2,8 0,003 Idade óssea (anos) 64 7,8 3,2 245 8,9 3,2 0,015 Atraso de idade óssea (anos) 64 2,4 1,9 245 2,4 1,7 0,54 SDS de idade óssea 64 -2,8 2,1 245 -2,7 1,8 0,73 SDS de altura 101 -2,9 0,7 410 -2,9 0,6 0,65 SDS de peso-para-altura 93 -0,2 0,9 357 0,1 1,1 0,019 índice de massa corporal (kg/m2) 100 15,7 1,6 410 16,6 2,2 0,0006 SDS de altura da mãe 93 -0,9 1,3 365 -1,1 1,1 0,27 SDS de altura do pai 92 -0,7 1,4 361 -0,6 1,2 0,57

Haviam 101 pacientes com SDS de GHBP <-2 (média -2,5) e 410 pacientes com SDS de GHBP >-2 (média -0,9) (Tabela VI). Os dois grupos tinham níveis máximos medianos de GH comparáveis; contudo, estes valores são difíceis de avaliar devido à utilização de vários ensaios à GH. A média para as concentrações de GH médias de 12 horas (utilizando o ensaio de Hybritech) foi significativamente superior no grupo de baixa GHBP enquanto a SDS de IGF-I foi significativamente inferior naquele grupo (ambos p = 0,0001, Tabela VI).

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 37 A Figura 3 mostra que os indivíduos com SDS de GHBP baixas tinham SDS de IGF-I inferior (Fig. 3A) e superiores níveis de GH média de 12 horas (Fig. 3B). Entre todos os pacientes com ISS, a SDS de GHBP estava positivamente correlacionada com a SDS de IGF-i (r = 0,285, p = 0,0001) e negativamente correlacionada com a GH média de 12 horas (r = -0,17, p = 0,0001). ANCOVA, controlo das diferenças de idade, SDS de peso-para-altura e GH média de 1 2 horas, mostraram que pacientes com SDS de GHBP <-2 tinham ainda SDS de IGF-I significativamente inferior aos com SDS de GHBP >-2 (p = 0,0001). De modo semelhante, o grupo de baixa GHBP tinha uma GH média de 12 horas significativamente superior à do grupo de GHBP normal (p = 0,0001) após o controlo para a idade, SDS de peso-para-altura e SDS de IGF-I.

TABELA VI

Concentrações de GHBP, IGF-I e GH na linha de base (média ± SD) SDS de GHBP < -2 SDS de GHBP > -2 Valor p I (n = 101) (n = 410) GHBP (pmol/l) 60 ±14 138 ± 68 0,0001 SDS de GHBP -2,5 ±0,4 -0,9 ± 0,8 0,0001 IGF-I (pg/L) 100 ± 61 149 ±101 0,0001 SDS de IGF-I -3,3 ± 1,1 -2,5 ± 1,4 0,0001 GH média de 1 2 h (pig/l) 2,8 ± 1,1 2,3 ± 1,1 0,0001 GH máxima (pg/l) 15,7 ± 8,2 15.5 ± 10,0 0,309

As análises da taxa de crescimento foram restritas a pacientes que permaneceram na pré-puberdade durante os períodos de tratamento considerados. Não haviam correlações lineares significativas de SDS de GHBP e taxas de crescimento ou alteração da SDS de altura durante cada um dos primeiros très anos de tratamento. A taxa de crescimento média antes do tratamento era de aproximadamente 4 cm/ano independentemente da SDS de GHBP. A taxa de crescimento média durante o primeiro ano de terapia com GH foi de aproximadamente 8 cm/ano. A figura 4 apresenta as taxas de crescimento no primeiro ano para pacientes na pré-puberdade tratados com GH representadas em função da sua SDS de GHBP. Não houve nenhuma correlação ê

87 040 EP 0 754 048 /PT 38 á

estatisticamente significativa entre os dois (r = 0,047, p = 0,55, n = 166). A figura mostra que os pacientes que podem ser tratados com a invenção são aqueles que estão abaixo da área a sombreado, desde que tenham também os requisitos de GH, IGF-I e altura estabelecidos conforme necessários nesta subpopulação. Os resultados indicam que os pacientes com baixos níveis de SDS de GHBP e possuindo os critérios da presente invenção responderam à administração farmacológica de GH.

As Figuras 5 e 6 comparam as taxas de crescimento antes do tratamento e no primeiro ano, em pacientes (e na Fig. 5 também as taxas de crescimento no segundo ano). Estas figuras mostram que existe um claro aumento no crescimento nos pacientes tratados com GH, independentemente de a SDS de GHBP dos pacientes particulares ser -2 ou >-2. A Tabela VII mostra os dados de resposta de crescimento para o grupo com baixa SDS de GHBP em comparação com o grupo com SDS de GHBP normal. Os dois grupos tiveram programas de injecção e dose de GH média semelhantes durante o primeiro ano de terapia. Não haviam diferenças significativas entre os grupos para a taxa de crescimento antes do tratamento ou para as taxas de crescimento durante os primeiros quatro anos de terapia com GH. A alteração média na SDS de altura também não foi estatisticamente diferente entre os dois grupos; o aumento médio nestes seguido durante 4 anos foi de 1,5±0,6 (n = 13) no grupo de baixa GHBP e 1,7±0,6 (n = 21) no grupo de GHBP normal. (segue tabela)

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TABELA VII

Taxa de crescimento e alteração na SDS de altura em relação à linha de base na terapia com GH em pacientes na pré-puberdade SDS de GHBP < -2 SDS de GHBP > -2 N média SD n média SD valor p Dose de GH no 1o ano ímg/kg/semana) 42 0,26 0,07 141 0,25 0,08 0,72 Programa de GH no 1o ano (inj./semana) 42 3,7 1,1 143 3,5 1,1 0,06 Taxa de crescimento {cm/ano) I Antes do tratamento 58 4,0 1,7 197 4,2 1,9 0,47 1o ano 36 7,8 1,1 130 8,0 1,5 0,55 2° ano 22 7,2 1,2 45 7,0 1,1 0,80 3o ano 16 6,8 1,2 22 7,1 1,0 0,29 4o ano 12 5,8 1,1 16 6,3 1,0 0,30 Δ de SDS de altura cumulativa Ano 1 45 0,5 0,2 145 0,5 0,3 0,91 Anos 1,2 28 1,0 0,4 67 0,9 0,4 0,65 Anos 1,2,3 19 1,30 0,5 36 1,3 0,4 0,70 Anosl,2,3,4 13 1,5 0,6 21 1,7 0,6 0,24

Embora a baixa estatura possa ser definida de várias maneiras, tais como estar abaixo de um determinado percentil para normas de altura padrão, os pacientes neste estudo representam um grupo mais seleccionado. Estes pacientes tinham todos prescrita a terapia com GH, e portanto passaram por um processo de rastreio e selecção pelos médicos da admissão. Em adição, os pacientes com SDS de altura acima de -2 não foram incluídos neste estudo. 0 grupo resultante tinha uma SDS de altura média de -2,9, um atraso de idade óssea médio de 2,4 anos e uma taxa de crescimento média de 4,2 cm/ano, semelhante a outros pacientes reportados com ISS tratados com GH. Hopwood et a/., J. Pediatr., 123: 215-222 (1993); Albertsson-Wikland, Acta Paediatr. Scand. SuppL, 343: 77-84 (1988). Neste grupo seleccionado, verificou-se que alguns tinham baixos níveis séricos de GHBP, após normalização para a idade e sexo, e após ajustamento para a idade óssea. Carlsson et ai., J.C.E.M., 78, supra.

87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT 40

Mostrou-se que a GHBP é derivada do mesmo gene que o GHR e partilha homologia de sequência com o seu domínio extracelular. Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987). Os níveis séricos de GHBP medidos utilizando o ensaio funcional eram baixos ou não detectáveis em pacientes com GHIS completa. Fielder et al., J.C.E.M., 74: 743-750 (1992). Neste exemplo a gama normal de níveis de GHBP em crianças foi determinada por idade e sexo e mostrou-se que os níveis baixos de Gl IBP em paciente3 com ISS eram significativamente menos do que os que foram observados em indivíduos normais ou deficientes em GH ou no síndrome de Turner. Carlsson et al., J.C.E.M., ,78: supra.

Os perfis da amostragem em série de 12 horas durante a noite para a GH foram obtidos em todas as crianças deste estudo e os níveis médios eram normais, sugerindo, sem limitação a qualquer teoria, que a disfunção neurossecretora não estava presente na maioria dos pacientes. Os níveis de GH média de 12 horas apresentaram uma correlação negativa com a SDS de GHBP média, como tinha sido descrito em descrito em indivíduos normais. Martha et al., J.C.E.M., 73: 175-181 (1991). Contudo, a SDS de IGF-I estava positivamente correlacionada com a SDS de GHBP. Assim, os pacientes com menores níveis de GHBP tinham níveis maiores de GH ainda que menores de IGF-I, consistentes com a insensibilidade à GH.

Uma previsão significativa da concentração de GHBP é a composição do corpo, que foi avaliada utilizando quer o BMI quer padrões de peso para a altura e idade. Num ANCOVA, verificou-se que a GHBP se mantinha uma previsão significativa da GH média de 12 horas e da SDS de IGF-I após o controlo para a idade e SDS de peso-para-altura.

Os dados de crescimento disponíveis para estes pacientes na pré-puberdade admitidos na base de dados do NCGS não revelaram qualquer correlação linear significativa entre a SDS de GHBP da linha de base e a taxa de crescimento antes do tratamento ou a SDS de altura na linha de base. Sem limitação a qualquer teoria, uma possível explicação é a de que a taxa de crescimento e a altura são normalmente utilizadas para seleccionar pacientes para tratar com GH e portanto são uniformemente baixas nesta população de pacientes. 41 41 (<& 87 040

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Uma observação interessante foi a falta de correlação da SDS de GHBP e da resposta de crescimento à terapia com GH. Como os níveis de secreção de GH e de GHBP parecem estar negativamente correlacionados em crianças com crescimento normal (Martha et ai., supra), pode ser proposta uma gama normal tal como a representada na Figure 7. Seria de esperar que aqueles com GH em excesso em relação aos seus níveis de GHBP tivessem crescimento excessivo, e aqueles cujos níveis de GH são demasiado baixos para os seus níveis de GHRP tivessem um fraco crescimento. Presentemente, a GHD é arbitrariamente definida e baseada somente em medições da secreção de GH; é possível que alguns pacientes com níveis de GH acima deste limiar arbitrário (e dentro do âmbito da presente invenção) tenham quantidades inadequadas de GH em relação aos seus baixos níveis de GHBP, resultando um fraco crescimento. Seria de esperar que a administração de GH exógena a este subconjunto de pacientes (com menores níveis de GHBP e IGF-I e maiores níveis de GH média de 12 horas em comparação com o normal, sugerindo insensibilidade à GH parcial) aumentasse a sua GH em circulação para níveis mais apropriados em relação aos seus baixos níveis de GHBP, ultrapassando assim o seu estado parcialmente resistente. EXEMPLO IV Introdução A etiologia da falha de crescimento na maioria das crianças baixas sem GHD (crianças de baixa estatura não deficientes em GH) é pouco definida. Estas crianças, em tudo o resto normais, com ISS, produzem quantidades normais de GH em resposta a estímulos farmacológicos, mas não conseguem apresentar um padrão de crescimento normal. Lippe e Nakamoto, Rec. Prog. Horm. Res., 48: 179-235 (1993). Foram propostos vários defeitos relacionados com a GH para explicar a sua falha de crescimento, incluindo disfunção neurossecretora (Spiliotis et ai., J. Am. Med. Assoe., 251; 2223-2230 [1984]; Zadik et ai, Pediatrics, 76: 355-360 [1985]), e GH imunologicamente reactiva mas biologicamente não reactiva. Kowarski et ai, J.C.E.M., 47: 461-464 (1978); Valenta et ai, N. Eng. J. Med., 31; 214-217 (1985). Embora estes mecanismos possam ser responsáveis pela falha de crescimento normal em alguns pacientes com ISS, a maioria não parece ter defeitos demonstráveis na secreção ou na função da GH. Lanes, Am. J. Dis. Child., 143:1284-1286 (1989); llondo et ai, J.C.E.M., 70: 1445-1451 (1990).

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Uma possibilidade alternativa é a de que os pacientes com ISS têm padrões de secreção normais de GH bioactiva e que o defeito assenta na capacidade de células alvo responderem a GH. Estes defeitos podem assentar no nível de GHR ou dos mediadores de sinalização de GH, tais como IGF-I ou o receptor de IGF-I. As alterações no gene do IGF-I são pouco comuns em desordens de crescimento. Lajara et ai, J.C.E.M., 70: 687-692 (1990). A resistência a GH pode ser devida a redução na afinidade do GHR para a GH, a defeito na capacidade para propagar um sinal em resposta a ligação de GH, ou a defeitos que causam um número reduzido de receptores na superfície celular. A GHBP de alta afinidade presente no soro humano é idêntica ao domínio extracelular do GHR e pensa-se que é produzida pelo receptor por clivagem proteolítica. Sotiropoulos et ai, Endocrinol., 132: 1863-1865 (1993). Os níveis de GHBP imunofuncional (Carlsson et al., J.C.E.M., 73: supra) estão abaixo da média em 90% dos pacientes com ISS, e estão mais de dois SD abaixo da média em 20% destas crianças (Carlsson et ai, J.C.E.M., 78, supra; Mauras et ai, Metabolism, 43: 357-359 [1994]). Sem limitação a qualquer teoria, note-se que as anormalidades no GHR que reduzem a quantidade de GHBP funcional podem estar presentes em pacientes com ISS.

Postula-se um fenótipo de GHIS parcial em ISS pela observação no Exemplo III de que os pacientes com ISS com baixos níveis de GHBP têm menores níveis de IGF-I e maiores níveis de GH média de 12 horas, em comparação com os que têm níveis de GHBP normais. Sem limitação a qualquer teoria, isto sugere uma deficiência na sinalização através do GHR, que conduz à produção reduzida de IGF-I e reduzida resposta negativa de IGF-I na secreção de GH. A maioria dos pacientes com ISS responde ao tratamento com GH recombinante com um aumento na taxa de crescimento (Hopwood et ai, supra)·, contudo, esta resposta é menor do que a que é aqui observada em pacientes com GHD (pacientes deficientes em GH) tratados com a mesma dose de GH, sugerindo uma vez mais, como teoria, uma insensibilidade parcial à GH nos pacientes com ISS. A alta frequência de mutações de inactivação no gene GHR em GHIS completo ou síndrome de Laron (LS) indica que a maioria dos casos de GHIS completo podem ser explicados por falta de GHR funcional. A maioria dos pacientes com LS não têm actividade de GHBP detectável no seu sangue (Baumann et ai, J.C.E.M., 65: 814-816 [1987]); Daughaday et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 84: 4636-4640 [1987]), e, quando medida, não têm, ou têm níveis muito baixos de ligação específica de GH a microssomas hepáticos. Esther et ai, Isr. J. Med. Sei., 20: 8-11 (1984). Existem 17 mutações de GHR caracterizadas 43

8/ U4U ΕΡ Ο 754 048 /ΡΤ associadas a LS concentradas do domínio extracelular da proteína (revisão por Rosenfield etali, Endocrinol. Rev., 15: 369-390 [1994]).

Para determinar se o fenótipo mais moderado de GHIS parcial pode ser causado por menos mutações disruptivas em GHR, e que os níveis reduzidos de GHBP em circulação na população com ISS podem servir como marcador para GHIS parcial e podem indicar mutações no GHR, seleccionaram-se um subconjunto de pacientes com ISS com níveis de GHBP superiores a 2 SD abaixo da média, e analisou-se a região de codificação do gene GHR quanto a mutações. Utilizando análise conformacional de cadeia simples (SSCA) e sequenciação de produtos de reacção em cadeia com polimerase (PCR) com mobilidade alterada, detectaram-se mutações no domínio extracelular do receptor em 4 de 14 pacientes.

Indivíduos

Seleccionaram-se catorze pacientes com ISS de dois sub-estudos do NCGS com alguns ou todos os seguintes critérios: 1) SDS de altura <-2,5; 2) níveis séricos de IGF-I abaixo dos níveis médios normais (medidos por extracção com ácido-etanol, Nichols Institute); 3) GH sérica >10 pg/l num ou mais testes de provocação; 4) SDS de GHBP sérica máxima < -2 (medida por LIFA como descrito em Carlsson et al., J.C.E.M., 73: supra, ou por separação em carvão activado como descrito em Amit et al., J.C.E.M., ]V. 474-479 [1990]) no caso do Paciente 1); 5) taxa de crescimento antes do tratamento <4cm/ano; e 6) ausência de doença sistémica subjacente. Considerou-se informação adicional quando disponível, incluindo a GH média de 12 horas (ensaio Hybritech), taxa de crescimento no 1o ano de tratamento com GH e níveis de IGFBP-3 (Endocrine Sciences). O sistema de classificação utilizado para seleccionar os pacientes da base de dados do NCGS é apresentado na Tabela VIII. De uma classificação máxima de 12, os pacientes foram classificados de 4-10 e todos tinham SDS de GHBP <-2. Estudaram-se familiares de dois pacientes (#2 e #4) para confirmar a hereditariedade das mutações. Vinte e quatro voluntários adultos normais cujas SDS de altura caiem dentro ou acima da gama normal (SDS de -2,0 a +3,5) serviram como controlos. A significância estatística de diferenças na população foi calculada com um Teste Exacto de Fischer.

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TABELA VIII

Critérios de Selecção dos Pacientes -==—— Parâmetros Classificação = 1 Classificação = 2 Classificação = 3 SDS de altura < -2,5 < 3,5 - SDS de GHBP < -2 < -2,5 < -3 SDS de IGF-I < -2 < -3 < -4 GH max. Estim. (μα/Ι) > 10 > 15 > 20 Taxa de crescimento antes do tratamento (cm/ano) < 4

Os pacientes tratados com hGH (os apresentados na Tabela IX que não estão listados na coluna de "GH responsiva" como "nd") foram injectados por via subcutânea com GH da marca Protropin® (todos os pacientes tratados excepto o Paciente 2) e GH da marca Nutropin® (Paciente 2), a 0,3 mg/kg/semana durante pelo menos 6 meses.

Preparação de amostras e amplificação oor PCR

Isolaram-se linfócitos de 1,5 a 10 ml de sangue de cada paciente utilizando tubos de separação de células LeucoPREP (Becton Dickenson) ou Meio de separação de linfócitos, LSM (Organon Teknika) que foram transformados através do vírus de Epstein Barr (EBV). Katz et a/., J. Infect. Dis., 160: 589-598 (1989). Isolou-se o ADN dos linfócitos transformados com EBV ou directamente a partir de linfócitos frescos utilizando o estojo QIAamp Blood Kit (Qiagen Inc.). Amplificaram-se por PCR fragmentos genómicos do GHR, específicos para os exões de codificação 2 a 9 e seus locais de união flanqueadores, utilizando iniciadores intrónicos. A porção codificante do exão 10 foi amplificada em três fragmentos que se sobrepõem de modo a restringir o tamanho do fragmento a menos de 400 pares de bases (pb). A localização e a sequência dos iniciadores intrónicos são como se segue: 87 040

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ί"· ' - -.*'&·

Tamanho do Exão fraqmento (pb) Nome 2 154 101 102 3 240 154.1 154.2 4 188 105 104 5 286 107B2 108B1 6 229 109 110 7 249 111a 112a 3 205 113B1 114B1 9 179 115 116 10a 311 117B 3 10b 396 9 10

Sequência (5' a 3') TCSIGGGCTTTACCTTAC (SEQ ID HO: 17) CAAAAOICIGAGGGTGGA (SEQ ID 1,0: 181 TACACAGGGTCATATCAGA3TG (SEQ ID HO: 19) CTAVrCCAGTTRCTaCaVTCCC (SEQ ID HO: 20) CTGATTTCftISCCTIGCC (SEQ ID HO: 21) &ea&AGGCA.TGA.TGGTBO (SEO ID HO: 22) ACTTAAGCTACAACATGATT (SEQ ID HO: 23) GCTICCCaxrTTKrrnUST (SEQ ID HO: 24) ATGCrCTSTTSftATTGCaC (SEQ ID HO: 25) 3TGTAAGGTGTAGCAACAT (SEQ ID HO: 26) GACTCTTTGGCCAArATG (SEQ ID HO: 27) AAGCCMGTTAGCTACTA (SEQ Π) HO: 28) aAAACTCTGCTTCAACTASTC (SEQ ID HO: 29) OCTCIAACAaUUCTSeTACA (SEQ ID HO: 30) ATGTAGCTTTTAACATCTCAA (SEQ ED HO: 31) ATGACAGGAGTCTTCAGG (SEQ ID HO: 32) TTMCCTCTGTeGCTGAG ‘(SEQ ID HO: 34) ACATGAGGGTACCTCSGA (SEQ XD HO: 35) CAGAAGTAGGCAITGTCC (SEQ ID NO: 36) 10C 375 11 GGAAATGGTCTCACTCTG (SEQ ΣΒ HO: 37) 12 CCAAAGAAAGGCTAAâSC (SEQ ZX) HO: 39)

Amplificou-se ADN (100 ng) em 50 μΙ contendo dNTP 0,2 mM, 2 unidades de polimerase Taq (Perkin Elmer Corp.), MgCI2 1,5 mM , 33P-a-dATP 7 pCi (duPont New England Nuclear) e 15 ng de cada iniciador em 40 ciclos (1 minuto, 94°C; 1 minuto, 55°C; 1 minuto, 72°C com 5 segundos adicionados por ciclo). Seguiu-se ao ciclo final 1 minuto a 94°C e arrefecimento a 22°C ao longo de 30 minutos. Os produtos da PCR foram submetidos a electroforese em agarose a 2% para verificar a contaminação e verificar o tamanho dos fragmentos.

Preparou-se ARN total (5-10 pg) de linfócitos transformados com EBV pelo método do ácido-fenol (Chomczynski e Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159 [19871) que foi transcrito de forma inversa (Perkin Elmer Corp., estojo de RT) utilizando iniciadores aleatórios (Promega Corp.). A amplificação por PCR do ADNc de GHR foi realizada através de uma estratégia de PCR nidificada. Amplificaram-se os exões 3-10 em 3 fragmentos. Utilizaram-se iniciadores 46 87 040 ΕΡ 0 754 048 /ΡΤ nidifiçados para gerar fragmentos mais pequenos (220-425 pb). As condições dos ciclos foram as seguintes: desnaturação a 95°C durante 3 minutos seguida por 30 ciclos de 95°C, 1 minuto; 55°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto; e finalmente 72°C durante 10 minutos. As sequências dos iniciadores utilizados na estratégia com iniciadores nidificados eram as seguintes:

Três fragmentos de RT-PCR (F>' para 3'): 1. Cl.l - C2.1r d.l: GTCCTACSUSGrATtaaSCTCT (SSQ ID HO: 39) C3.1r: GAftlATCTGCaaTWaTGGTa (SSQ ID NO: 40)

Produtos de PCR nidificados internos:

Cl.l - Cl.Ir

Cl.l: GTCCTACaGSTATGGaTCTCr (SBC ID HO: 39) Cl.lr: CTGGTACASAACaeCTGTRre (SEQ ID HO: 41) tx4 - ex4 . r ex4: ATTCTTCT3UU3SAGCCraAArTCaCC.X (SEQ ID NO: 42) ex4 . r: CCACCXTTGCTAGTTAGCTTG (SEQ ID HO: 43) exS - cl.lr ex5: ATGGACTCAAGAATOGAAAGAATG (SEQ ID HO: 44) C2.1T: GAATATCCGCKrrGCSTGGTG (SEQ ID HO: 40) 2. cs.i - ca CS. 1: CACCACGCAATGCAGATATTC (SEQ ID HO: 45) ca: CTcaTGGTCACrGCrTAGAAG (SEQ ID NO: 46)

Produtos de PCR nidificados internos: cs.i - cs.lies. 1: CACCACGCAATGCAGATACTC (SEQ ID HD: 45) CS.lr: GTTACAXAGAGCACCCCACTG (SEQ ID HO: 47) n7 - C6.1 n7: ATGGACCCTA.TATTGACAACATC (SEQ DD HO: 48) CS.l: CtnTTAATCTTTGGAACTGGAAC (SEQ ID NO: 49) C7 - C7.r C7: GGGCTAACAGTGATGCTATTT (SEQ ID HO: 50) C7.R: GCTEAGAAGTCTGTCTGTGTC (SEQ ID NO: 51) C9 - 0.4 C9: GCTAGAIAXTGATGAGCCAGA (SEQ ID NO: 52) 0.4: SOMGGCAXGAXTTTCTTCA (SEQ ID NO: 53)

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Produtos de PCR nidificados internos: c9 - cio C9: GCTAGATATTGATGAGCCAGA (SSQ ID HO; S2) CIO: GTCGATGTTTGACAGTGAACT (SSQ ID HO: 54) Cll.l - C12.1

Cll.l: GAAGGAfiCTGAGTCAACTCAC (SSQ IS HO: 55) C12.il GCTTGGCTGTATSTCTGATTC (SSQ 1D HO: 56) C13 - C14 C13: TACTTCTCTGAGGCAGATGCC (SSQ ID HO: 57)

Cl4: GCTAAGGCATGATTTTGTrCA (SSQ 33 HO: 53)

Análise de conformação de cadeia simples

Realizou-se a SSCA dos produtos de cada reacção PCR. Misturaram-se 2-4 μΙ da mistura reaccional com um volume igual de tampão de carga, desnaturou-se a 100°C durante 2 minutos e colocou-se em gelo. Realizou-se a electroforese das amostras à temperatura ambiente em géis de MDE 0,5 X (AT Biochem, Inc.) com 1% ou 10% de glicerol, de acordo com as instruções do fabricante. Secaram-se os géis sobre papel de filtro e autorradiografaram-se.

Sequenciação do ADN

As mutações detectadas como bandas aberrantes por SSCA foram confirmadas por sequenciação. Realizou-se a sequenciação directa em ciclos dos produtos da PCR com os iniciadores de amplificação ou iniciadores internos (nidificados) descritos acima e química de terminadores corantes no sequenciador ABI373 (Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corp.) seguindo os protocolos Standard ou utilizando o estojo Ampli-Cycle (Perkin Elmer Corp.) e 33P-a-dATP (duPont New England Nuclear). Em adição, geraram-se múltiplos subclones de cada fragmento que se suspeitava conter uma mutação, em M13mp19 ou pBluescript KS + , sequenciaram-se com o iniciador-corante M13-21 e analisaram-se no sequenciador ABI373.

Ensaio de ligação a GH

Para examinar a ligação de GH aos receptores mutantes, prepararam-se por manipulação domínios extracelulares de GHR recombinante portadores de mutações. Isto foi realizado utilizando mutagénese dirigida ao local, mediada por oligonucleótidos, expressão em E. coli e purificação. Clackson e Wells, Science, 267: 383-386 (1995); Fuh et ai, J. Bioi Chem., 265: 3111-3115 (1990); Bass 48 87 040 " ? · *í*

ΕΡ 0 754 048 /PT et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88: 4498-4502 (1991). A afinidade para GH foi determinada por deslocamento competitivo de GH dos receptores mutantes utilizando GH radio-iodada como traçador. Spencer et al., J. Biol. Chem., 263: 7862-7867 (1988). As constantes de dissociação (Kd) foram calculadas por análise Scatchard. Utilizou-se anticorpo monoclonal anti-GHR (Mab)5 (Barnard et al., Endocrinology, 11 5: 1805 [1984]; Cunningham et a!., Science, 254: 821 [1991]) para precipitar o complexo GHR:GH. O Mab 5 evita a homodimerizaçãn do receptor, permitindo que a Kd para a interaeção 1:1 inicial seja determinada livre dos eleitos de dimerização. Clackson e Wells, supra·, Cunningham et al., supra.

Resultados

Seleccionaram-se catorze crianças com ISS com uma classificação de 4 ou superior nos critérios de selecção (Tabela VIII). Os dados clínicos para estes pacientes estão listados na Tabela IX.

TABELA IX

Dados clínicos para os pacientes incluídos no estudo

Pac . N° Classi ficação s e X o Idade' lanos) SDS de altura SDS de GHBP SDS de IGF-I SDS de IGFBP-3 GH max. Estim. (pg/D Taxa de cresc. Pré-Rx (cm/ano) Taxa de cresc. no 1o ano (cm/ano) GH respon- siva 1 9 M 3,0 -5,1 * * *2 -0,7 nd3 42,0 2.0 3.07-6.0a sim5·6 2 7 M 11,6 -3,1 * * *2 -1,2 Nd 18,8 4.1 5.7 sim6 3 9 M 7,8 -3,3 -2,7 -4,5 Nd 12,5 3.1 7.1 sim6 4 9 M 8,7 -2,9 -2.8 -4,2 -3,9 20,7 5.5 5.8 não6 5 9 M 7,8 -3,4 -2,6 -3,7 Nd 48.9 2.9 nc4 nd 6 10 F 14,6 -5,5 -2,8 -8,2 -5,2 18,0 2.7 7.8 sim6 7 7 F 3,5 -3,2 -2,6 -2,3 -3,5 19,2 7.1 nd nd 8 10 M 9,3 -2,5 -2,8 -6,1 Nd 18,7 2.1 7.2 sim6 9 7 M 10,0 -3,2 -3,0 -2,3 -3,3 20,8 1.2 7.3 sim6 10 6 M 7,9 -3,2 -2,8 -3,0 Nd 15,6 4.4 8.4 sim6 11 4 M 9,8 -1,6 -2,3 -2,0 -1,3 19,3 4.2 9.1 sim6 12 8 F 7,9 -3,1 -2,5 -3,5 Nd 21,6 6.3 9.0 sim6 13 8 M 12,8 -3,4 -2,3 -4,1 Nd 16,3 1.5 nd nd 14 7 M 8,1 -3,5 -2,0 -3,2 Nd 11,7 3.9 8.3 sim6 1 Idade na admissão no estudo; 2 Nível de GHBP no limite ou abaixo do limite de detecção; 3 Não disponível; 4 Não concordante; 5 Teste de produção de IGF-I positivo; 6 resposta de crescimento com tratamento com GH endógena; 7 com uma dose de 0,03 mg/kg/dia; 8 com uma dose de cerca de 0,05 mg/kg/dia. 49

Uma baixa GHBP sérica funcionai nestes pacientes conduziu a uma pesquisa de mutações subtis no gene GHR através de uma combinação de amplificação por PCR e SSCA. Os fragmentos que migram com mobilidade alterada foram observados em quatro pacientes: 1, 2, 4 e 7, enquanto não se detectaram anormalidades no locus de GHR em 24 controlos adultos normais, com a excepção de polimorfismos conhecidos nos exões 6 e 10 (Leung et a!., Nature, 330: 537-543 [1987]; Godowkski et ai, Prnn. Natl. Ar.ad. Sr.i. USA, 86: 8083-8087 [1989]). Assim, houve um aumento significativo de alterações no gene GHR em pacientes com ISS com GHBP reduzida em comparação com uma população normal (p = 0,014). Cada um dos fragmentos genómicos de PCR que se suspeita serem portadores de uma mutação foi sequenciado para caracterizar a alteração que causa a banda aberrante. Vejam-se as Figuras 8-11. Os Pacientes 1 a 9 foram também analisados por RT-PCR (exões 3-10) e todos os fragmentos eram do tamanho previsto, excluindo alterações de união. 0 Paciente 4 exibiu bandas anormais em géis de SSCA quando os exões 4 e 6 ou os fragmentos de RT-PCR que cobrem esta região foram analisados. O ADN foi sequenciado e verificou-se que a criança era um heterozigota composto para uma transição de guanosina para adenosina no exão 4, introdução de uma lisina no lugar de um ácido glutâmico na posição 44 (E44K) na proteína madura (Fig. 8, alelo 2 e Tabela X), e uma transição de citosina para timidina no exão 6, causando uma substituição de arginina por cisteína no resíduo 161 (R161C) (Fig. 8, alelo 1 e Tabela X). Os produtos da RT-PCR que estendem dos exões 4 a 6 foram subclonados e sequenciados. As duas mutações foram encontradas em diferentes subclones; assim, encontrou-se uma mutação em cada um dos dois alelos. Adicionalmente, a análise genética de membros da família indicou que a alteração no exão 4 foi herdada do lado paterno da família e a mutação no exão 6 da linha materna. O pai e a avó paterna exibiam ambos o mesmo desvio de bandas em SSCA para o exão 4 que o probando, e a sequenciação confirmou que ambos eram portadores da mutação E44K idêntica. Do mesmo modo, SSCA e sequenciação afirmaram a presença da mutação pontual do exão 6 que causa a alteração R161C na mãe e num tio materno. O Paciente 4 não respondeu a GH endógena com um aumento significativo na taxa de crescimento; a sua taxa de crescimento antes do tratamento era de 5,5 cm/ano e a sua taxa de crescimento no tratamento com GH foi de 5,8 cm/ano.

87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT 50

Os efeitos destas substituições de aminoácidos na capacidade do receptor para ligar a GH num complexo 1:1 foram investigados utilizando o domínio extracelular do receptor mutante expresso em E. coli. 0 resíduo E44 está envolvido em contactos directos com a GH (deVos et al., Science, 255: 306-312 [1992]) e a mutação para alanina reduziu a ligação de ligando (KdMuT/Kd-TS = 17,4). Clackson e Wells, supra. Verificou-se que a introdução de uma lisina na posição 44 reduz a ligação 330 vezes em relação ao domínio extracelular do receptor do tipo selvagem (Tabela X). Em contraste, o resíduo 161 não está em qualquer interface intermolecular no complexo GH humana:GHR (DeVos et ai., supra) e a sua mutação para cisteína causou uma redução de 2,1 vezes na ligação (Tabela X). 0 ADN do Paciente 2 exibiu um desvio de bandas em SSCA com fragmentos de PCR genómicos do exão 5. A sequenciação do ADN identificou uma transversão de timidina para adenosina na posição 418 no ADNc que introduziu um codão de paragem no lugar da cisteína 122 (C122X). Veja-se a Figura 9. A subclonagem e a sequenciação de múltiplos produtos genómicos de PCR de todos os exões do Paciente 2 originaram apenas a sequência do tipo selvagem, tal como o originaram a sequenciação directa dos fragmentos genómicos de PCR. A probabilidade deste Paciente ser portador de uma segunda mutação que não se tenha detectado é portanto baixa. A análise de ADN tanto da mãe como do pai do Paciente 2 indicou que este tinha herdado a mutação do codão de paragem da sua mãe. Durante o primeiro ano de tratamento com GH a sua taxa de crescimento aumentou de 4,1 cm/ano para 5,7 cm/ano (Tabela IX), indicando uma resposta à GH endógena. Ocorreu um pico de crescimento associado à puberdade de 10,3 cm/ano durante o seu segundo ano de tratamento com GH exógena.

Os Pacientes 1 e 7 são ambos portadores de alterações de pares de bases únicos heterozigotas que causam alterações de aminoácidos no GHR de um alelo. No Paciente 1 observou-se uma banda aberrante com os fragmentos genómicos de PCR do exão /. Uma transição de guanosina para adenosina no par de bases 686 causou a substituição de um resíduo arginina por uma histidina no aminoácido 211 (R211H). Veja-se a Figura 10, alelo 2. O

Paciente 1 respondeu a GH; teve um teste de produção de IGF-I positivo (o IGF-I na linha de base era de 56 pg/l e aumentou para um pico de 179 pg/l após quatro dias de tratamento com 0,1 unidades de GH/kg por injecção).

a / 040

EP 0 754 048 /PT

Adicionalmente, a sua taxa de crescimento aumentou de 2,0 cm/ano para 3,0 cm/ano com 0,03 mg de GH/kg/dia e 6,0 cm/ano com 0,05 mg de GH/kg/dia (Tabela IX). 0 Paciente 7 é do mesmo modo afectado por uma alteração num único alelo. Uma transversão de guanosina para citosina no par de bases 726 introduz um écido aspórtico no lugar do ácido glutâmico no tipo selvagem na posição 224 (E224D). Veja-se a Fig. 11, alelo 2. O Paciente 7 nunca tinha sido tratado com GH. Nem SSCA nem a sequenciação directa do domínio extracelular do GHR detectaram uma segunda alteração em qualquer destes pacientes. O resíduo R211 é exposto à superfície do receptor longe de qualquer interface molecular. DeVos et a/., supra. O mutante de histidina produziu uma proteína com uma afinidade comparável para o receptor do tipo selvagem, KdMUT/KdTS= 1,4. Contudo, houve uma notável redução no nível de expressão da proteína mutante; era expressa a um nível de cerca de 104 do do tipo selvagem. A mutação associada a LS da arginina 211 para glicina reportada por Amselem et a!., Hnm. Mol. Genet., 2: 355-359 (1993), resulta num nível indetectável de expressão. Observou-se um efeito semelhante na afinidade do receptor para GH para a substituição R224D (Tabela X). Não se esperava que a substituição conservativa E224D perturbasse a ligação de GH e, de facto, verificou-se que a substituição por ácido aspártico (KdMUT/KdTS = 1,6) teve pouco efeito sobre a afinidade.

TABELA X

Mutações no gene GHR Paciente Exão Alteração de bases zigocidade Alteração de aminoácidos Kd(Mab5) de ligação de GH (nM) KdMUT/KdTS 1 7 G-»A em 686 Het. R211H 0,5010,021 1,4 2 5 T—»A em 418 Het. C122X nr2 nr 4 4 G-»A em 184 Comp. Het. E44K 112±19 330 4 6 C—>T em 535 Comp. Het. R161C 0,73±0,15 2,1 7 7 G—»C em 726 Het. E224D 0,54+0,0/ 1,6 1 A expressão deste domínio extracelular do receptor mutante foi reduzida aproximadamente quatro ordens de grandeza em comparação com o tipo selvagem. 2 nr = não realizado * «... // . · * 87 040 ...... 52 ΕΡ 0 754 048 /PT Conclusão

Um subgrupo de crianças com ISS tem fenótipos que implicam GHIS parcial na etiologia das suas baixas estaturas. A hipótese aqui apresentada de sinalização de GHR reduzido, como exemplificado por níveis inferiores de IGF-I e concentrações superiores de GH com níveis inferiores de GHBP, foi confirmada através da identificação de mutações do GHR em pacientes baixos, não deficientes em GH, seleccionados quanto a baixa GHBP e baixo IGF-I. Nenhum dos 24 controlos normais exibiu alterações de sequências detectáveis por SSCA, enquanto 4 de 14 pacientes com ISS seleccionados tinham alterações identificáveis de pares de bases únicos (p = 0,014). Uma vez que a SSCA é capaz de detectar aproximadamente 80% das mutações conhecidas em sistemas modelo (Vidal-Puig e Moller, Biotechniques, V7: 490-496 [1994]; Ravnik-Glavac et al.. Hum. Mol. Genet., 3: 801-807 [1994]), podem haver mutações adicionais presentes nestes pacientes com ISS que se perderam.

Dois dos quatro pacientes com ISS com mutações de GHR responderam a GH endógena (Pacientes 1 e 2 da Tabela IX). A presença de mutações e a resposta a GH sugerem que estes pacientes podem ser parcialmente insensíveis a GH devido a GHR disfuncionais. Sem ligação a qualquer teoria, crê-se que a incapacidade do Paciente 4 para responder a GH reflecte mais provavelmente a natureza das duas mutações nestes alelos de GHR. Uma alteração reduz a afinidade do receptor para GH 330 vezes, tornando presumivelmente este receptor insensível a níveis fisiológicos ou farmacológicos de GH. O efeito da segunda alteração, R161C, não é conhecido, mas esta mutação é grave; no estado homozigota causa uma GHIS completa. Amselem et al., supra. 0 quarto paciente (Paciente 7) ainda não tinha sido tratado com GH. É evidente dos resultados que um contínuo de responsividade a GH se estende desde a GHIS completa observada na LS, passando por pacientes com ISS gravemente insensíveis a que faltam as características fenotípicas do síndrome LS mas que podem não responder a doses Standard de GH, passando por pacientes com ISS com GHIS parcial que são responsivos a terapia Standard com GH até, finalmente, ao fenótipo normal. 0 Paciente 4 é um heterozigota composto para as substituições E44K e R161C, e cada progenitor é heterozigota para uma das duas mutações. As alturas dos pais e dos avós estão todas dentro da gama normal para a população adulta; contudo, as alturas de portadores conhecidos de uma única 53 87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT mutação estão abaixo da média. 0 Paciente 2 é heterozigota para a mutação de cisteína para paragem na posição 122 e assim tem um aielo que produz uma proteína truncada, presumivelmente instável. A sua mãe é portadora da mesma mutação. O Paciente 2, agora com 19 anos de idade, é mais gravemente afectado pela presença desta mutação (SDS de altura -3,2) do que a sua mãe (SDS altura -1,4). Sem limitação a qualquer teoria, o probando pode ter herdado uma mutação ainda não definida do seu pai (SDS de altura -1,4) que afecta a expressão do alelo de GHR estruturalmente normal ou outro passo no eixo da GH. A Família 2 é semelhante a um paciente suspeito de LS e a sua mãe não afectada, ambos portadores de duas mutações num alelo do locus GHR. Kou et a/., J.C.E.M., 76: 54-59 (1993). A semelhança entre este paciente e o Paciente 2 sugere, de acordo com uma teoria, que ambos podem ser portadores de uma segunda mutação não identificada, análoga a vários pacientes insensíveis a insulina em que níveis reduzidos de ARNm de receptor de insulina foram observados apesar da falta de mutação em qualquer dos exões (revisto por Taylor et a!., Endocrine Rev., 13: 566-595 [1992]),

Dois outros pacientes são portadores de mutações heterozigotas que conduzem a substituições de aminoácidos (R211H no Paciente 1 e E224D no Paciente 7). Os pais do Paciente 1 têm ambos alturas dentro da gama normal para a população adulta. Hamill et a/., Am. J. Clin. Nutrition, 32: 607-629 (1979). De modo semelhante, o pai do Paciente 7 tem uma SDS de altura de -0,43 e a sua mãe uma SDS de altura de +1,4. O LS é uma condição autossómica recessiva. Os indivíduos afectados herdam usualmente a mesma mutação de pais consanguíneos. Os heterozigotas para mutações de GHR (pais e parentes de pacientes de LS) podem ter anormalidades de crescimento moderadas. Laron, The Endocrínologist, 3:21-28 (1993); Rosenbloom et aJ., Acta Paediatr., Supl. 399: 125-127 (1994). Aproximadamente metade dos portadores heterozigotas têm níveis de GHBP mais do que 2 SD abaixo da média para a idade. Aguirre etal., Horm. Res. 34: 4-8 (1990); Laron et aí.. Acta Endocrinol., 121: 603-608 (1989). Em adição, Laron, The Endocrínologist, supra, reportou que as alturas de progenitores e parentes clinicamente normais de pacientes de LS estão tipicamente abaixo do percentil 50° para o seu sexo e origem étnica. Sem limitação a qualquer teoria, a GHIS parcial resultante em SDS de altura menos de -2 pode surgir em portadores de mutações heterozigotas do GHR sob a influência de genótipos 54 54 Μ 87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT particulares em loci modificadores ainda não identificados, ou quando as alterações conferem um fenótipo negativo dominante, como foi proposto para mutações heterozigotas no receptor de insulina em vários pacientes insensíveis à insulina.

As cinco mutações identificadas nos quatro pacientes (E44K, C122X, R161C, Π211Η, E224D) estão confinadas ao domínio extracelular do receptor. A substituição E44K provoca uma redução de 330 vezes na afinidade para a GH, enquanto a alteração dos resíduos RI 61, R211 ou E224 tinham efeitos subtis na ligação do ligando (Tabela X). O resíduo R211 está distai a ambos os locais, de ligação do ligando e de dimerização, do GHR. Está contudo adjacente ao motivo "semelhante ao TS" conservado em toda a superfamília de receptores de citóquinas. Os resíduos do motivo semelhante ao TS compactam-se firmemente com as cadeias laterais de R211 e de outros aminoácidos para formar uma pilha de cadeias laterais aromáticas e básicas alternadas. 0 resíduo E224 corresponde ao resíduo variável do motivo semelhante ao TS. Tal como o R211, estende-se fora dos locais de ligação conhecidos na molécula de GHR e as mutações não alteram significativamente a ligação de GH (Tabela X). Uma substituição E224A expressa em células de mamífero em cultura alterou a localização subcelular. Baumgartner et a!., J. Biol. Chem., 269: 29094-29101 (1994). Observou-se uma fraeção aumentada do receptor total numa localização nuclear proximal. Não se sabe se isto reflecte a acumulação de receptor recentemente sintetizado ou internalização aumentada do receptor. Sem limitação a qualquer teoria, se a mutação E224D causa um efeito semelhante, o processamento incorrecto poderia resultar em números reduzidos de receptor na superfície celular e numa concomitante redução nos níveis séricos de GHBP.

Neste estudo é mostrado que a selecção de um subconjunto de crianças com ISS com parâmetros clínicos sugestivos de uma insensibilidade parcial a GH identifica pacientes portadores de mutações de GHR que podem afectar a função do GHR. Uma vez que os pacientes estudados foram seleccionados com base em GHBP funcional reduzida na circulação, as mutações têm que afectar directamente a ligação de ligando (E44K) ou causar uma redução na

87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT

55 disponibilidade de receptor na superfície celular (R161C, R211H e R224D), contribuindo assim para um síndrome GHIS parcial. De facto, dois dos três pacientes com ISS com mutações no GHR que foram tratados com GH exógena tinham GHIS parcial responsiva a GH.

EXEMPLO V

Oitenta crianças na pré-puberdade diagnosticadas como possuindo uma altura média inferior a -2 desvios padrão abaixo da altura normal, um nível sérico de GHBP que é pelo menos 2 desvios padrão abaixo do nível normal, um nível sérico de IGF-I que está abaixo do nível médio normal e um nível sérico de GH estimulado, médio ou máximo, que é pelo menos normal, com idades de 5-12, foram tratadas como se segue: 20 com IGF-I sozinho, 20 com GH sozinha, 20 com GH e IGF-I juntamente e 20 com placebo. Quando as drogas são dadas sozinhas, o IGF-I é administrado uma vez por dia por injecção subcutânea numa dose de 1 50 pg/kg/dia e a GH é administrada uma vez por dia por injecção subcutânea numa dose de 0,70 mg/kg/semana. Quando as drogas são combinadas, o IGF-I é administrado uma vez por dia por injecção subcutânea numa dose de 75 pg/kg/dia e a GH é administrada uma vez por dia por injecção subcutânea numa dose de 0,35 mg/kg/semana. A formulação de IGF-I é (a) 10 mg/ml de IGF-I em tampão de acetato de sódio 20 mM, 2,5 mg/ml (0,25%) de fenol, 45 mg/ml de manitol, pH 5,0; ou (b) 10 mg/ml de IGF-I em tampão de acetato de sódio 50 mM, 2,5 mg/ml de fenol, 5,84 mg/ml de NaCI e 9 mg/ml de álcool benzílico, pH 5,4. A formulação de GH é GH da marca Nutropin® ou Protropin® disponíveis de Genentech, Inc. Os pacientes são tratados durante 6 meses com este protocolo. É medido o aumento na altura de cada paciente.

Neste estudo espera-se que o IGF-I, a GH ou a combinação aumentassem as taxas de crescimento de todos os pacientes em comparação com os pacientes tratados com placebo.

Projectos alternativos para ensaios clínicos são como se segue:

Os mesmos grupos e subclasse de crianças são tratados do mesmo modo com GH sozinha a 0,35 mg/kg/semana ou 0,70 mg/kg/semana, ou IGF-I sozinho a 75, 100, 150, ou 200 pg/kg/dia. Para o tratamento com a combinação, a GH 56 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT é utilizada a 0,35 mg/kg/semana e o IGF-I a 75 ou 100 μg/kg/dia utilizando ou não um placebo para comparação.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE : Genentech, Inc. (ii) TÍTULO DO INVENTO: Tratamento de síndrome de insensibilidade parcial à hormona do crescimento (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 57 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Genentech, Inc. (B) RUA: 460 Point San Bruno Blvd (C) CIDADE: South San Francisco (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) ZIP: 94080 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete de 5,25 polegadas, 360 Kb

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: patin (Genentech) (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/224982 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 07-Abril-1 994 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Haaak, Janet E.. 4" 4"

• /' 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 57 (Β) NÚMERO DE REGISTO: 28 616

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/CERTIFICADO: 884P1PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 415/225-1896 (B) TELEFAX: 415/952-9881 (C) TELEX: 910/371-7168 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 445 pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:1: ATCCTCTAAG GAGCCTAAAT TCACCAAGTG CCGTTCACCT GAGCGAGAGA 50 CTTTTTCATG CCACTGGACA GATGAGGTTC ATCATGGTAC AAAGAACCTA 100 GGACCCATAC AGCTGTTCTA TACCAGAAGG AACACTCAAG AATGGACTCA 150 AGAATGGAAA GAATGCCCTG ATTATGTTTC TGCTGGGGAA AACAGCTGTT 200 ACTTTAATTC ATCGTTTACC TCCATCTGGA TACCTTATTG TATCAAGCTA 250 ACTAGCAATG GTGGTACAGT GGATGAAAAG TGTTTCTCTG TTGATGAAAT 300 AGTGCAACCA GATCCACCCA TTGCCCTCAA CTGGACTTTA CTGAACGTCA 350 GTTTAACTGG GATTCATGCA GATATCCAAG TGAGATGGGA AGCACCATGC 400 AATGCAGATA TTCAGAAAGG GTGGATGGTT CTGGAGTATG AACTT 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 445 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (Π) ΤΟΡΩΙ OGIA: linear

87 040ΕΡ 0 754 048 /PT 58 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:2: „S-~>

sS ATCCXCXAAG GAGCCTAAAT tcaccaagtg CCGTTCACCT GAGCGAAAGA 50 CTTTTTCATG CCACTGGACA GATGAGGTTC ATCATGGTAC AAAGAACCTA 100 GGACCCATAC AGCTGTTCTA TACCAGAAGG AACACTCAAG AATGGACTCA 150 AGAATGGAAA GAATGCCCTG ATTATGTTTC TGCTGGGGAA AACAGCTGTT 200 ACTTTAATTC ATCGTTTACC TCCATCTGGA TACCTTATTG TAT CAAGCTA 250 ACTAGCAATG GTGGTACAGT GGATGAAAAC TGTTTCTCTG TTCATCAAAT 300 AGTGCAACCA GATCCACCCA TTGCCCTCAA CTGGACTTTA CTGAACGTCA 350 GTTTAACTGG GATTCATGCA GATATCCAAG TGAGATGGGA AGCACCACGC 400 AA7GCAGATA TTCAGAAAGG GTGGATGGTT CTGGAGTATG AACTT 445 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 148 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:3:

Ser Ser Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg 1 5 10 15 Glu Thr Phe Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Vai His His Gly Thr 20 25 30 Lys Asn Leu Gly Pro Ile Gin Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr 35 40 45 Gin Glu Trp Thr Gin Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Vai Ser 50 55 60 Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile 65 70 75 Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Vai 80 85 90 Asp Glu Lys Cys Phe Ser Vai Asp Glu Ile Vai Gin Pro Asp Pro 95 100 105 Pio Ile Alã Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Vai Ser Leu Thr Gly 110 115 120 Ile His Ala Asp Ile Gin Vai Arg Trp Glu Ala Pro Cys Asn Ala 125 130 135 Asp Ile Gin Lys Gly Trp Met Vai Leu Glu Tyr Glu Leu 1 40 1 4 5 148 59 87 040 * Ή' κ

ΕΡ 0 754 048 /PT (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 148 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:4:

Ser 1 Ser Lys Glu Pro 5 Lys Thr Phe Ser Cys 20 Lys Asn Leu Gly Pro 35 Gin Glu Trp Thr Gin 50 Ala Gly Glu Asn Ser 65 Trp Ile Pro Tyr Cys 80 Asp Glu Lys Cys Phe 95 Pro Ile Ala Leu Asn 110 Ile His Ala Asp Ile 125 Asp Ile Gin Lys Gly 140

Lys Phe Thr Lys Cys 10 His Trp Thr Asp Glu 25 Ile Gin Leu Phe Tyr 40 Glu Trp Lys Glu Cys 55 Cys Tyr Phe Asn Ser 70 Ile Lys Leu Thr Ser 85 Ser Vai Asp Glu ile 100 Trp Thr Leu Leu Asn 115 Gin Vai Arg Trp Glu 130 Trp Met Vai Leu Glu 145

Arg Ser Pro Glu Arg 15 Vai His His Gly Thr 30 Thr Arg Arg Asn Thr 45 Pro Asp Tyr Vai Ser 60 Ser Phe Thr Ser Ile 75 Asn Gly Gly Thr Vai 90 Vai Gin Pro Asp Pro 105 Vai Ser Leu Thr Gly 120 Ala Pro Arg Asn Ala 135 Tyr Glu Leu 148 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 173 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 60 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: GAACACTCAA GAATGGACTC AAGAATGGAA AGAATGCCCT GATTATGTTT 50 CTGCTGGGGA AAACAGCTGT TACTTTAATT CATCGTTTAC CTCCATCTGG 100 ATACCTTATT GTATCAAGCT AACTAGCAAT GGTGGTACAG TGGATGAAAA 150 G7GTTTCTCT GTTGATGAAA TAG 173 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:G: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 173 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:6: GAACACTCAA GAATGGACTC AAGAATGGAA AGAATGCCCT GATTATGTTT 50 CTGCTGGGGA AAACAGCTGT TACTTTAATT CATCGTTTAC CTCCATCTGG 100 ATACCTTATT GTATCAAGCT AACTAGCAAT GGTGGTACAG TGGATGAAAA 150 GTGATTCTCT GTTGATGAAA TAG 173 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 57 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:7:

Asn Thr Gin Glu Trp Thr Gin Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Vai Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr 20 25 30 Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly 35 40 45 Thr Vai Asp Glu Lys Cys Phe Ser Vai Asp Glu Ile 50 55 57 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 61 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:8: (i) CAHAC I ERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:8:

Asn Thr Gin Glu Trp Thr Gin Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr 1 5 10 15 Vai Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr 20 25 30 Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly 35 40 45

Thr Vai Asp Glu Lys 50 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 240bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCGTG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGAGTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear ψ .. íi* 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 62 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GACTCTTTGG CCAATATGCG ΤΤΤΑΤΔΤΤΤΤ GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCATG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGAGTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAC-GTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:11: lil CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 aminoácidos (Bl TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:11:

Met Ar,:» F r ;> I . t- I.vU Thr Thr Ser Vai Pro Vai Tyr Ser Leu Lys 1 10 15 Vai Asp L y 'ó G*u Tyr Glu Vai Arg Vai Arg Ser Lys Gin Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Vai Leu Tyr Vai Thr Leu 35 40 45 Pro Gin Mel Ser Gin Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:12:

Met Asp Pro Ile Leu Thr Thr Ser Vai Pro Vai Tyr Ser Leu Lys 1 5 10 15 Vai Asp Lys Glu Tyr Glu Vai His Vai Arg Ser Lys Gin Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Vai Leu Tyr Vai Thr Leu 35 40 45 Pro Gin Met Ser Gin Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 63 £ 63 £

a/ 040

EP 0 754 048 /PT (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi> DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCGTG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGAGTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 240 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:14: GACTCTTTGG CCAATATGCG TTTATATTTT GTCTTGAAAG ATGGACCCTA 50 TATTGACAAC ATCAGTTCCA GTGTACTCAT TGAAAGTGGA TAAGGAATAT 100 GAAGTGCGTG TGAGATCCAA ACAACGAAAC TCTGGAAATT ATGGCGACTT 150 CAGTGAGGTG CTCTATGTAA CACTTCCTCA GATGAGCCAA TTTACATGTG 200 AAGAAGGTAA AAGAAATAAA AGATTAAAAT AGTAGCTAAC 240 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 64 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15 MC l Asp Pru Ile Leu Tln Thr Ser Vai Pr o Vai Tyr Ser Leu Lys 5 10 15 Vai Asp Lys Glu Tyr Glu Vai Arg Vai Arg Ser Lys Gin Arg Asn 20 25 30 Sc r Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu i—1 > Leu Tyr Vai Thr Leu 35 10 45 Prc Gin Met Ser Gin Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 55 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:16:

Met Asp Pro Ile Leu Thr Thr Ser Vai Pro Vai Tyr Ser Leu Lys 1 5 10 15 Vai Asp Lys Glu Tyr Glu Vai Arg Vai Arg Ser Lys Gin Arg Asn 20 25 30 Ser Gly Asn Tyr Gly Asp Phe Ser Glu Vai Leu Tyr Vai Thr Leu 35 40 45 Pro Gin Met Ser Gin Phe Thr Cys Glu Glu 50 55 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:17: 18

TGCTGGGCTT TACCTTAC 65 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:18: CAAAACACTG AGGGTGGA 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:19: TACACAGGGT CATATCAGAT TG 22 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:20: CTATTCCAGT TAC TAC CAT C CC 22 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases 66 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (Β) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:21: CTGATTTCAT GCCTTGCC 18 12) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:22: AGAAAGGCAT GATGGTGG 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23: ACTTAAGCTA CAACATGATT 20 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 67

8/ U4U ΕΡ Ο 754 048 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:24 GCTTCCCCAT TTATTTAGT 19 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENIO: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:25 ATGCTCTGTT GAATTGCAC 19 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26 GTGTAAGGTG TAGCAACAT 19 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27 18

GACTCTTTGG CCAATATG 68 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28: AAGCCAGGTT AGCTACTA 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29: GAAACTGTGC TTCAACTAGT C 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:30: GGTCTAACAC AACTGGTACA 2 0 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases 69 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (Β) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:31: ATGT.-V'TTT TAACATCTCA A 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:32: |n CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico IC) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32: ATGACAGGAG TCTTCAGC 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:33: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:33: GAGTTTCTTT TCATAGATCT TC 22 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:34: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 70 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34: TTAACCTCTG TGGCTGAG 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35: ACATGAGGGT ACCTCAGA 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:36: CAGAAGTAGG CATTGTCC 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEiA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37: 18

GGAAATGGTC TCACTCTG

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 71 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:38: c •'./•.ag gctaaggc 18 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO; 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39: GTCCTACAGG TATGGATCTC T 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:40: GAATATCTGC ATTGGGTGGT G 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases 72 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (Β) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID N0:41 CTGGTATACA ACAGCTGTAT G 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:42 ATTCTTCTAA GGAGCCTAAA TTCACCA 27 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:43 CCACCATTGC TAGTTAGCTT G 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 73 a/ 040

EP 0 754 048 /PT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:44: ATGGACTCAA GAATGGAAAU AATG 2 4 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMbN I 0: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45: CACCACGCAA TGCAGATATT C 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:46: CTCATGGTCA CTGCTTAGAA G 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:47: 21

GTTACATAGA GCACCTCACT G 74 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:48: (i) UAHACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:48: ATGGACCCTA TATTGACAAC ATC 23 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:49: CCTTTAATCT TTGGAACTGG AAC 23 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:50: GGGCTAACAg Tg^TG^TATT T 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID N0:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO. 21 bases

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 75 (Β) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:51: GCTTAGAAGT CTGTCTGTGT C 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:52: GCTAGATATT GATGAGCCAG A 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53: GCTAAGGCAT GATTTTGTTC A 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT 76 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54: GTCGAToTTT UACAGTGAAC T 21 (2) INF0RMAÇA0 FOR SEQ ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:55: GAAGGAGCTG AGTCAAGTGA C 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:56: GCTTGGCTGT ATGTGTGATT C 21 (2) INFORMAÇÃO FOR SEQ ID NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 77 87 040

ΕΡ 0 754 048 /PT (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA'. SEQ ID NO:57: TACTTCTGTG AGGCAGATGC C 21

Lisboa, ; Por GENENTECH, INC. - 0 AGENTE OFICIAL -

> O I Enc..° AHtQsNÈIQ' íOã 1 DA CUNHA FERREIK Ág. Of. Pr.

Rua das Florss, '74-4/'

Claims

87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade eficaz de hormona do crescimento, de IGF-1 ou de uma combinação de hormona do crescimento e IGF-I na preparação de um medicamento para aumentar a taxa de crescimento de um paciente humano possuindo síndrome de insensibilidade parcial à hormona do crescimento, em que o medicamento se destina à administração a pacientes com uma altura inferior a -2 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, possuindo um nível sérico de proteína de ligação à hormona do crescimento de alta afinidade que é pelo menos 2 desvios padrão abaixo dos níveis normais, possuindo um nível sérico de IGF-I que é abaixo dos níveis médios normais e possuindo um nível sérico de hormona do crescimento estimulado, médio ou máximo, que é pelo menos normal, em que o paciente não sofre de síndrome de Laron, e em que a quantidade eficaz de hormona do crescimento é superior a 0,2 mg/kg/semana.
2. Utilização de uma quantidade eficaz de hormona do crescimento ou de IGF-I na preparação de um medicamento para aumentar a taxa de crescimento de um paciente humano com estatura baixa não deficiente em GH mas não síndrome de Laron, paciente que tem uma altura inferior a -2 desvios padrão abaixo do normal para a idade e sexo, um nível sérico de proteína de ligação à hormona do crescimento de alta afinidade que é pelo menos 2 desvios padrão abaixo dos níveis normais, um nível sérico de IGF-I que é abaixo dos níveis médios normais e um nível sérico de hormona do crescimento estimulado, médio ou máximo, que é pelo menos normal, em que a quantidade eficaz de hormona do crescimento é superior a 0,2 mg/kg/semana.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a quantidade eficaz de hormona do crescimento é superior a 0,25 mg/kg/semana.
4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a quantidade eficaz de hormona do crescimento é superior ou igual a 0,3 mg/kg/semana. 87 040 ΕΡ 0 754 048 /PT 2/2
5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a hormona do crescimento e/ou o IGF-I é adequado para administração por injecções subcutâneas.
6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a hormona do crescimento é formulada a um pH de 7,4 a 7,8.
7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a quantidade de IGF-I no referido medicamento é uma dose de 50 a 240 pg/kg/dia.
8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o IGF-I é adequado para administração uma ou duas vezes por dia.
9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o IGF-I é formulado a um pH de 5-6.
10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o IGF-I e a hormona de crescimento são ambos adequados para administração por injecções subcutâneas.
11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o paciente tem um defeito genético heterógeno em GHR. Lisboa, Por GENENTECH, INC. - 0 AGENTE OFICIAL -