JPH09509430A

JPH09509430A - 部分的成長ホルモン不感受性症候群の治療

Info

Publication number: JPH09509430A
Application number: JP7526356A
Authority: JP
Inventors: アティー，ケネス; エム．エス．カールッソン，レナ; ゲサンドハイト，ネイル; ゴッダード，オードリー
Original assignee: ジェネンテックインコーポレイテッド
Priority date: 1994-04-07
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 1997-09-22
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: EP0754048A1; ES2160704T3; DE69521796T2; EP0754048B1; MX9604635A; JP3366644B2; GR3036901T3; PT754048E; WO1995027495A2; JP2000226334A; ATE203165T1; CA2187274A1; US5646113A; CA2187274C; MX9701916A; DE69521796D1; DK0754048T3; WO1995027495A3

Abstract

(57)【要約】部分的成長ホルモン不感受性症候群を伴うが、ラロン症候群を伴わないヒト患者の成長速度を増す方法が記載される。一つのこのような方法は、Ｎ末端メチオニンを含むまたは含まない成長ホルモン、好ましくは天然のヒト配列を有する成長ホルモン、を有効な量で前記患者に投与することからなる。この患者は、身長が年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満低く、高親和性の成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの血清レベルが少なくとも標準であることにより特徴づけられる。もう一つの方法は同一の患者集団を有効量のＩＧＦ−Ｉで治療するものであり、その際ＩＧＦ−Ｉは単独で、またはＩＧＦ−Ｉと組み合せて有効な量の成長ホルモンとの併用で投与される。

Description

【発明の詳細な説明】部分的成長ホルモン不感受性症候群の治療発明の背景発明の分野本発明は、ヒトの部分的成長ホルモン不感受性症候群の患者の成長速度を向上させるための方法に関する。背景の記載および先行技術有意に背の低い多くの子供達は、誘発的な刺激に対する成長ホルモン（ＧＨ）の応答によって古典的に定義される成長ホルモン（ＧＨ）欠損症ではない。背の低さの原因としてかつて知られていたものは排除され、これらの患者は、背の低い家系であること、体質的に成長が遅れていること、または「特発性」で背が低いこと（ＩＳＳ）を含む様々な用語で分類される。こうした子供達のうちの何人かは、大規模な長期的な研究の結果には報告されないが、彼らの遺伝的に潜在する身長に達しないかもしれない。正常な成長と発達に寄与する非常に多くの因子があるので、ＩＳＳの患者は、背が低いことの原因論に関しては一様ではない。古典的なＧＨ欠損症ではないにもかかわらず、多くのＩＳＳの子供達は、ＧＨ欠損症と同様な応答ではないが、ＧＨの治療に応答する。多くの調査者が、この患者の仲間（セット）において自然発生的なＧＨ分泌障害を調査した。ある仮説は、これらの患者のうちの幾人かは、生理的条件下では内因性のＧＨの分泌が不十分であるが、伝統的なＧＨ刺激試験でのように、薬理的刺激に応答してＧＨが上昇することが証明される可能性があるということを示唆した。この障害は、「ＧＨ神経分泌機能不全」と言われ、診断は、長期間の血清のサンプリングにおける異常なＧＨのパターンの証明に基づく。非常に多くの調査者がこうした研究の結果を報告し、時折存在するにすぎないこの異常を発見した。他の調査者は、これらの患者が「生物学的に不活性なＧＨ」を有していることを仮定したが、このことは、未だ決定的には証明されていない。ＧＨ受容体（ＧＨＲ）がクローニングされたとき、血中における主要なＧＨ結合活性は、ＧＨＲと同じ遺伝子に由来するタンパク質によるものであり、ＧＨＲ全長の細胞外ドメインに対応することが示された。成長ホルモン不感受性（またはラロン(Laron)）症候群（ＧＨＩＳ）の患者の多くは、成長ホルモン受容体結合活性を欠いており、血中のＧＨ−結合タンパク（ＧＨＢＰ）活性がないか、あるいは活性が非常に低い。このような患者は、約５〜６の平均身長標準偏差スコア（ＳＤＳ）を有し、ＧＨ治療に抵抗性であり、血清ＧＨ濃度が上昇しており、血清インシュリン様成長ホルモン（ＩＧＦ−Ｉ）濃度は低い。彼らは、ＩＧＦ− Ｉの治療には応答する。ＧＨＲの細胞外ドメインに欠損を有する患者では、循環中における機能的なＧＨＢＰの不足がＧＨ不感受性のためのマーカーとして役に立つ。血中ＧＨＢＰが低いＩＳＳ患者にはサブクラスがあり、彼らは完全なＧＨＩＳ（ラロン症候群）と正常な子供達との中間にある平均身長ＳＤＳを有し、幾分かはＧＨ治療に応答するが、完全には応答しない。このクラスの患者は、部分的ＧＨＩＳの患者として特徴付けられる。本発明の目的は、部分的ＧＨＩＳを示し、完全ＧＨＩＳまたはラロン症候群ではないISSの患者のサブセットを同定することである。本発明の別の目的は、この同定された患者のサブセットを治療して、中間親(m id-parental)目標身長として定義される彼らの遺伝的な素質と矛盾しない最終的な身長に到達させることである。これらおよび他の目的は、当業者には自明であろう。発明の概要したがって、１つの局面においては、本発明は、有効量のＧＨを患者に投与することからなる部分的ＧＨＩＳのヒト患者の成長速度を高める方法を提供する。当該患者は、年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満の身長であり、高親和性ＧＨＢＰの血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして平均または最大刺激ＧＨの血清レベルが少なくとも標準であり、またラロン症候群ではない。好ましくは、上記ＧＨは、ヒト組換えＧＨである。他の局面においては、本発明は、有効量のＩＧＦ−Ｉ（好ましくは、ヒト組換えＩＧＦ−Ｉ）を患者に投与することからなる部分的ＧＨＩＳのヒト患者の成長速度を高める方法を提供する。当該患者は、年齢および性別のわりに標準より約 −２標準偏差未満の身長であり、高親和性ＧＨＢＰの血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、ＧＨの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であり、またラロン症候群ではない。さらに別の局面においては、本発明は、ＩＧＦ−ＩとＧＨとを有効量で組み合わせて患者に投与することからなる部分的ＧＨＩＳのヒト患者の成長速度を高める方法を提供する。当該患者は年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満の身長であり、高親和性ＧＨＢＰの血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、ＧＨの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であり、またラロン症候群ではない。図面の簡単な説明図１は、成長ホルモン欠損症（ＧＨＤ）、ＩＳＳ、およびターナー症候群（ＴＳ）であるGenentech National Growth Study，NCGSの子供たちの年齢および性別について標準化し、ＳＤＳとして表される血清ＧＨＢＰ濃度を本研究に登録した時の年齢ごとに示す。影をつけた部分は、それぞれの性別にとっての正常範囲（−２ＳＤ〜＋２ＳＤ）を表す。実線は、年齢および性別にとっての正常値を示す。２人またはそれ以上の患者が重複している点は、１つの点として表した。図２は、ＮＣＧＳに登録し、種々の用量のＧＨを毎日注射によって投与されたＩＳＳ患者の成長速度をcm／年で示したものである。図３Ａは、年齢および性別について標準化し、ＳＤＳとして表されるＩＧＦ− Ｉ濃度をＧＨＢＰのＳＤＳ（平均±ＳＤ）ごとに示したものである。図３Ｂは、図２を作製するために使用された研究に登録された患者から、20分おきに12時間、終夜サンプリングして得た平均12時間ＧＨ濃度をＧＨＢＰのＳＤＳ（平均±ＳＤ）ごとに示したものである。図４は、ヒトＧＨ（ｈＧＨ）で治療された患者の初年度の年間の成長速度（cm ／年）をＧＨＢＰのＳＤＳごとに示したものである。これらの患者は、ＧＨ療法の初年度の間、思春期前であった（n=166）。影をつけた部分は、ＧＨＢＰの正常範囲（−２ＳＤ〜＋２ＳＤ）を示す。図５は、前治療、一年目の治療、二年目の治療の患者の成長速度のグラフである。これらの患者のデータは、実施例IIIの表VIIに示されているが、以下のようにＧＨＢＰのＳＤＳ−２（n=14）（四角）またはＧＨＢＰのＳＤＳ＞−２（n=29 ）（丸）で示した。図６Ａおよび６Ｂは、棒グラフとしたが、図５の作製に使用した患者についてＧＨＢＰのＳＤＳごとに、前治療（図６Ａ）、一年目の治療（図６Ｂ）の成長速度を示した。図７は、ＧＨ分泌の測定（例えば、刺激されたＧＨ濃度または内因性ＧＨ濃度）対ＧＨ応答性（例えば、ＧＨＢＰ濃度）により予測される成長状態を示す。図８は、ＩＳＳ患者４の２つのＧＨＲ対立遺伝子（エクソン４−６）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列番号１および２）と予測されるアミノ酸配列（各々配列表の配列番号３および４）を示す。対立遺伝子１および２における突然変異を、四角で囲んだ。縦の棒は、cDNA配列中のエクソンの境界を示す。図９は、ＩＳＳ患者２の２つのＧＨＲ対立遺伝子（エクソン５）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列番号５および６）と予測されるアミノ酸配列（各々配列表の配列番号７および８）を示す。対立遺伝子２における突然変異を、四角で囲んだ。図10は、ＩＳＳ患者１の２つのＧＨＲ対立遺伝子（エクソン７）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列番号９および10）と予測されるアミノ酸配列（各々配列表の配列番号11および12）を示す。対立遺伝子２における突然変異を、四角で囲んだ。イントロン配列を小文字で表し、エキソン配列を大文字で表す。縦の棒は、ＤＮＡ配列中のエクソンの境界を示す。図11は、ＩＳＳ患者７の２つの対立遺伝子（エクソン７）のＤＮＡ配列（各々配列表の配列番号13および14）および予測されるアミノ酸配列（各々配列表の配列番号15および16）を示す。対立遺伝子２における突然変異を、四角で囲んだ。イントロン配列を小文字で、また、エキソン配列を大文字で表す。縦の棒は、ＤＮＡ配列中のエクソンの境界を示す。好適な実施態様定義本発明によって治療された患者の母集団には、「ラロン症候群」患者、別に言えばＧＨＲ機能の完全な欠損を伴う人々または完全なＧＨＩＳとして知られ、ここで定義される患者は含まれていない。これらの患者は、成人の身長が110〜130 cmに達するにすぎない。別の共通の症状は、顔と顎とが小さく、鼻梁橋が低く、前頭部が隆起しており、肥満、甲高い声、および幼少期における低血糖症を含む。生化学的には、彼らは、血清ＧＨ濃度が上がっているものの血清ＩＧＦ−Ｉ濃度が低いことで特徴づけられる。「ヒト患者の成長速度の向上」は、上記の患者が、ＧＨで治療されたＧＨ−欠損患者（例えば、ＧＨＤと診断された患者）と少なくとも同じ最終的身長に達する状態のみならず、ＧＨで治療されたＧＨ−欠損患者と同様の成長速度で上記患者が身長において追いつく状態、または目標とする身長の範囲、すなわち、中間親(mid-parental)目標身長で決定される彼らの遺伝的素質と矛盾しない最終的な身長の範囲にある身長に達するという状態をいう。「部分的成長ホルモン不感受性症候群」または「部分的ＧＨＩＳ」とは、その患者が、ＧＨ−欠損患者に投与したのと同じ用量のＧＨに対して応答するが、ＧＨ−欠損患者と同様の応答はしない症候群をいう。この症候群は、さらに、その患者が、年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満の身長であり、好ましくは、年齢および性別のわりに標準より約−２〜約−４標準偏差未満の範囲内の身長であり、高親和性ＧＨＢＰの血清レベルがヒト標準レベルより少なくとも２標準偏差（典型的には２〜４標準偏差）低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルがヒト標準平均レベルより低く、そしてＧＨの平均または最大刺激血清レベルが少なくともヒトの標準であることで特徴付けられる。平均血清レベルは、患者における測定の平均値である。ここで使用されるように、「非−ＧＨ−欠損低身長」は、年齢および性別のわりには少なくとも約≦２ＳＤの身長ＳＤＳを有し、（古典的には最少閾レベル以下のＧＨ分泌レベルに基づいて定義される）ＧＨＤを有さない患者をいう。ここで使用されるように、「成長ホルモン」または「ＧＨ」は、本来の配列の成長ホルモンまたはそれらの変異型の成長ホルモンをいい、天然、合成または組換えのいかなるソース（材料）から得られたものでもよい。実施例はヒトの成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む。これはヒトの本来の配列を有する天然型ＧＨまたは組換え型のＧＨ（ソマトトロピンまたはソマトロピン）であり、そして組換え型成長ホルモン（ｒＧＨ）は、組換えＤＮＡ技術によって産生されたいかなるＧＨまたはＧＨ変異体をもいい、ソマトレム、ソマトトロピン、ソマトロピンを含む。ここでヒトへの使用に好適なものは、組換え型のヒト本来の配列の成熟ＧＨであり、N-末端にメチオニンを有していてもいなくてもよい。より好適なものは、大腸菌で、例えば、1988年７月５日に発行された米国特許番号第4,755,465号およびGoeddel et al.，Nature，282:544(1979)中に記載された方法によって産生されたメチオニル−ヒト成長ホルモン（met-ｈＧＨ）である。Met-ｈＧＨはプロトＮ−末端にメチオニン残基が存在している点を除いて天然のポリペプチドと同一である。この付加されたアミノ酸は、細菌のタンパク合成過程によって生じたも名でGenentech，Inc.,より市販されている。後者のヒトｈＧＨは、このメチオニン残基を欠いており、天然型のホルモンと同一のアミノ酸配列を有している。Gr ayらの論文（Gray et al.,Biotechnology，２：161(1984)）を参照せよ。メチオニルｈＧＨとｈＧＨとはいずれも、等価な有効性と薬物動力学値とを有している。Mooreらの論文（Moore et al.，Endocrinology，122: 2920-2926(1988)）を参照せよ。別の適当なｈＧＨの候補は、1987年６月２日に発行された米国特許番号第4,670,393号に記載されたように、純粋なソマトゲン活性を有し、ラクトゲン活性を有しない胎盤型のＧＨであるｈＧＨ変異体である。1990年５月３日に公開されたWO 90/04788および1992年６月11日に公開されたWO 92/09690に記載されたＧＨの変異体もまた含まれる。ここで使用されるように、「ＩＧＦ−Ｉ」は、ウシ、ブタ、ウマ、トリを含むいかなる種、好適にはヒトから、本来の配列または変異体で得られるインシュリン様成長ホルモン−Ｉであり、これは、天然、合成、組換えといういかなるソースから得られるものでもよい。ＩＧＦ−Ｉは、ヒト血清から単離され、遺伝子組換えによって産生された。例えば、EP 123,228および128,733を参照せよ。ここで、ヒトに好適に使用されるものは、ヒトの本来の配列の成熟ＩＧＦ−Ｉであり、より好適には、例えば、1987年８月５日に公開されたEP 230,869；1984 年12月19日に公開されたEP 128,733；または1988年10月26日に公開されたEP 288 ,451に記載された方法によって製造された、Ｎ−末端にメチオニンを有しないＩＧＦ−Ｉである。より好ましくは、この本来の配列のＩＧＦ−Ｉを遺伝子組換えで産生したものであり、臨床試験のためにGenentech，Inc.,、South San Franci sco，CAから市販されている。好適なＩＧＦ−Ｉ変異体は、1991年12月31日に発行された米国特許番号第5,07 7,276号、1987年２月26日に公開されたPCT WO 87/01038、1989年６月29日に公開されたPCT WO 89/05822中に記載されるもの、すなわち、少なくともグルタミン酸残基が成熟分子のＮ−末端から３番目の位置にないか、Ｎ−末端で５個までのアミノ酸が欠失しているものである。最も好ましい変異体は、Ｎ−末端から最初の３個のアミノ酸が欠失したものである（脳ＩＧＦ、ｔＩＧＦ−Ｉ、des(1-3)− ＩＧＦ−Ｉ、またはdes-ＩＧＦ−Ｉ）と種々に称されている）。「高親和性成長ホルモン結合タンパク質」または「高親和性ＧＨＢＰ」は、ヒトを含めた幾つかの種において血中で循環し、ＧＨＢＰとして機能するＧＨＲの細胞外ドメインをいう。（Ymer and Herington，Mol．Cell．Endocrino.，41: 1 53(1985)；Smith and Talamantes，Endocrinology，123: 1489-1494(1988)；Emt ner and Roos,Acta Endocrinologica(Copenh.)，122: 296-302(1990)）。Bauman n et al.，J．Clin．Endocrinol．Metab.(J.C.E.M.)，62: 134-141(1986)；1990 年５月９日に公開されたEP 366,710；Herington et al.，J．Clin．Invest.,77: 1817-1823(1986)；Leung et al.，Nature，330: 537-543(1987)を参照せよ。ＧＨに対して低い親和性を有する第二のＢＰもまた、ＧＨＲに構造的に関連しないらしいということが記載されている。Baumann and Shaw，J.C.E.M.，70: 680-68 6(1990)。Carlsson et al.，J.C.E.M，73: 1216（1991）及び米国特許番号第5,2 10,017号に記載された、好適なリガンド−媒介免疫蛍光アッセイ（LIFA）法を用いた、血清中で機能するＧＨＢＰを測定するための種々の方法がある。発明の実施の形態本発明による治療の標的となる患者のサブ集団は先に定義したような部分的ＧＨＩＳを有する患者からなる。こうした患者は本発明の方法により治療可能であるとされた、それぞれの臨床的徴候を示さなければならない。ＧＨおよび／またはＩＧＦ−Ｉは非経口、鼻腔内、肺内、経口を含む適当な経路で、あるいは皮膚からの吸収により患者に直接投与される。それらを一緒に投与する場合、同一の経路で投与する必要はない。それらは局所的または全身的に投与することができる。非経口投与の例として、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内投与などがある。それらは皮下注射により毎日投与することが好ましい。治療に用いるＧＨおよび／またはＩＧＦ−Ｉは、個々の患者の臨床状態（特にＧＨまたはＩＧＦ−Ｉ単独による治療の副作用）、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ組成物の送達部位、投与方法、投与計画、医師に知られた他の要因を考慮に入れて、治療しやすい形態に製剤化され、そして投薬されるだろう。かくして、ここで用いる各成分の「有効量」はこうした考慮すべき要件により決定されるもので、患者の成長速度を高める量である。ＧＨを単独で投与する場合、約０．２ｍｇ／ｋｇ／週より多い投薬量を用いることが好ましく、約０．２５ｍｇ／ｋｇ／週より多くすることがより好ましく、約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に等しいか、それより多くすることがより一層好ましい。一つの実施態様において、ＧＨの投薬量は約０．３〜１．０ｍｇ／ｋｇ／週の範囲であり、他の実施態様では、０．３５〜１．０ｍｇ／ｋｇ／週である。有利には、ＧＨを１日１回皮下投与する。ＧＨは連続投与または非連続投与に適しており、例えば、特定の投薬量の注入形態で一定の回数（例：１日１回）投与される。その場合、注入時に血漿ＧＨ濃度の上昇が見られ、その後は次回の注入時まで血漿ＧＨ濃度の低下が見られる。別の非連続投与法は、初期の集中投薬とその後の遅滞投薬といった、有効成分の断続的な放出をもたらす、入手可能な多くのインプラント器具およびＰＬＧＡマイクロスフェアを使用するものである。例えば、米国特許第4,767,628号明細書の第２欄第19-37行を参照のこと。また、ＧＨを血液中に連続的に存在させて、それをＧＨ投与の間中維持するように投与することもできる。これは最も好ましくは連続注入によって、例えば浸透圧ミニポンプのようなミニポンプを使って行われる。また、ＧＨの頻繁な注射（すなわち、１日に１回より多い、例えば２または３回の注射）により行うことも適している。さらに別の実施態様において、血液からのＧＨのクリアランスを遅らせるか、または、例えば注入部位からのＧＨの徐放を起こさせる、長時間作用性のＧＨ製剤を用いてＧＨを投与することができる。ＧＨ血漿クリアランスを長引かせる長時間作用性製剤は、１種以上の結合タンパク質(1992年５月29日に公開されたWO9 2/08985)のような巨大分子、またはＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマーおよびポリオキシエチレンポリオール（すなわち、室温で水に溶解するもの）から選ばれた水溶性ポリマーに複合体化または（可逆的もしくは不可逆的結合により）共有結合させたＧＨの形態でありうる。また、ＧＨの循環半減期を引き延ばすためにＧＨをポリマーに複合体化または共有結合させてもよい。この目的にかなうポリエチレンポリオールおよびポリオキシエチレンポリオールの例としては、ポリオキシエチレングリセロール、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ポリオキシエチレングルコースなどがある。ポリオキシエチレングリセロールのグリセロール骨格は、例えばモノ−、ジ−およびトリグリセリドとして動物やヒトに存在するものと同じ骨格である。ポリマーは特定の分子量をもつ必要はないが、好ましくは約３５００〜１００，０００の分子量であり、５０００〜４０，０００がより好ましいものである。ＰＥＧホモポリマーは非置換であることが好ましいが、一端がアルキル基で置換されていてもよい。アルキル基は好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。最適には、ポリマーは非置換のＰＥＧホモポリマー、モノメチル置換のＰＥＧホモポリマー（ｍＰＥＧ）またはポリオキシエチレングリセロール（ＰＯＧ）であって、分子量が約５０００〜４０，０００のものである。ＧＨは、主に反応条件、ポリマーの分子量などに応じて、ＧＨの１以上のアミノ酸残基を介してポリマーの末端反応性基に共有結合させる。１個以上の反応性基をもつポリマーをここでは活性型ポリマーと呼ぶことにする。この反応性基がＧＨの遊離アミノ基または他の反応性基と選択的に反応する。しかし、最適な結果を得るために選ばれる反応性基のタイプおよび量、ならびに用いるポリマーのタイプは、その反応性基がＧＨのあまりに多くの活性基と反応するのを回避するため、用いる特定のＧＨに左右されることが理解されよう。完全に回避することは不可能かもしれないが、一般には、タンパク質の濃度に応じて、タンパク質１モルにつき約０．１〜１０００モル、好ましくは２〜２００モルの活性型ポリマーを用いることが提案される。タンパク質１モルあたりの活性型ポリマーの最終量は、最適活性を維持すると同時に、可能ならば、そのタンパク質の循環半減期を最適化するようにバランスのとれた量である。アミノ酸残基は１もしくは２個のシステインまたはＮ末端アミノ酸基のような任意の反応性アミノ酸でありうるが、好ましくは、反応性アミノ酸はリシン（その遊離ε−アミノ基を介して活性型ポリマーの反応性基に連結される）またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸（アミド結合を介して該ポリマーに連結される）である。共有結合修飾反応は、生物活性物質を不活性ポリマーと反応させるために常用されるどのような適当な反応で行ってもよく、ＧＨの反応性基がリシン基である場合はｐＨ５〜９で行うことが好ましく、ｐＨ７〜９がより好ましい。一般に、この方法は活性型ポリマー（少なくとも１個の末端ヒドロキシル基をもつ）を製造し、このポリマーから活性基体を作製し、その後ＧＨと活性基体とを反応させて製剤化に適したＧＨを製造することを含む。上記の修飾反応は１以上の工程を含むいくつかの方法により行うことができる。１工程反応で活性型ポリマーを製造するために用いられる修飾試薬の例には、シアヌル酸塩化物（2,4,6-トリクロロ-S-トリアジン）とシアヌル酸フッ化物がある。一つの実施態様では、修飾反応は２工程で行われ、その場合、最初にポリマーを酸無水物（例えば、無水コハク酸、無水グルタル酸）と反応させてカルボン酸を製造し、次にこのカルボン酸を、該カルボン酸と反応しうる化合物と反応させて、ＧＨと反応可能な反応性エステル基をもつ活性型ポリマーを形成させる。このような化合物の例を挙げると、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸などであり、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたは４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸を用いる。例えば、モノメチル置換ＰＥＧと無水グルタル酸とを高温で、好ましくは約１００〜１１０℃で、４時間反応させる。次に、このように製造されたモノメチルＰＥＧ−グルタル酸を、ジシクロヘキシルまたはイソプロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド試薬の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、活性型ポリマーのメトキシポリエチレングリコリル−Ｎ−スクシンイミジルグルタレートを製造し、その後ＧＨと反応させることができる。この方法はAbuchows kiら，Cancer Biochem．Biophys.，7:175-186(1984)に詳述されている。もう一つの例として、モノメチル置換ＰＥＧを無水グルタル酸と反応させ、続いてジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で４−ヒドロキシ−３−ニトロベンゼンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させて活性型ポリマーを製造することができる。ＨＮＳＡはBhatnagarら，Peptides: Synthesis-Structure-Function，Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium，Richら（編）(Pierce Chemical Co.，Rockford IL，1981)，p.97-100、およびNiteckiら，High-Technology Rou te to Virus Vaccines(American Society for Microbiology: 1986),標題“Nove l Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications ”(合成ペプチドをキャリアーに結合させるための新規な試薬およびその応用)に記載されている。ＰＥＧに結合させたＧＨを製造するための特定の方法として、ＰＥＧ−ＧＨに関する米国特許第4,179,337号および可逆的にしかし共有結合でＧＨに結合されたＰＥＧを開示する米国特許第4,935,465号に記載された方法がある。ＰＥＧ− ＧＨの他の製造方法には以下のものが含まれる。メトキシポリエチレングリコールアルデヒド（Ｍｅ−ＰＥＧアルデヒド）を用いる還元的アルキル化によるＰＥＧ化および精製を行うため、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中の２ｍｇ／ｍＬのＧＨに、５ｍＭのＭｅ−ＰＥＧアルデヒド−５０００（分子量５０００ダルトン）および２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ₃を加え、室温で３時間穏やかに混合する。次にエタノールアミンを加えて５０ｍＭにし、残存する未反応Ｍｅ−ＰＥＧを還元的にアミド化する。この混合物をアニオン交換カラムＦＰＬＣＭｏｎｏＱで分離する。過剰の未反応Ｍｅ−ＰＥＧはカラムに結合せず、混合物から分離できる。未反応ＧＨの分子量が２０Ｋであるのに対し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３０Ｋおよび４０Ｋの見かけ分子量を有する２つの主要なＰＥＧ化ＧＨ画分が得られる。同様にしてＧＨ−ＧＨＢＰ複合体をＰＥＧ化すると、ゲル濾過により１５０Ｋの誘導体が得られる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ）によるＰＥＧ化および精製を行うため、５０ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）またはＰＢＳ（ｐＨ７）中に２ｍｇ／ｍＬのＧＨを含む溶液に、ＧＨの総リシン濃度の５倍過剰モル量のＮＨＳ−ＰＥＧを加え、室温で１時間混合する。Superose 12 分離用カラムおよび／またはＦＰＬＣのＭｏｎｏＱで生成物を分離する。ＰＥＧ化ＧＨは、ゲル濾過で測定すると、ｐＨ８．５で実施した反応より得られる約３００ＫからｐＨ７．０の反応より得られる４０Ｋまでの範囲で反応のｐＨに応じて大きさが変化する。ＧＨ−ＧＨＢＰ複合体も同様にＰＥＧ化され、この場合に得られる分子量はゲル濾過により４００〜６００Ｋｄである。ＰＥＧ−マレイミドによるＧＨのシステイン変異体のＰＥＧ化を行うためには、部位特異的突然変異誘発によりＧＨの単一システイン変異体を製造し、それを大腸菌１６Ｃ９株（deoCタンパク質を産生しないW3110 △tonA phoA △E15 △(a rgF-lac)169 deoC2）から分泌させ、アニオン交換カラムにかけて精製する。１６Ｃ９株は、ＣＧＳＣ＃６０９２株（E．coli Genetic Stock Center［New Haven，Conn.］から入手可能で、Markら，Molec．Gen．Genet.，155: 145-152（ 1977）に記載されている、遺伝子型trxA1 recA1 ilvE720::tn5 metE70 deoC2 la cZ53 rha5 malB45 rpsL151を有するNo．6092）由来のdeoC2対立遺伝子を７Ｃ１と呼ばれる菌株に移入することにより遺伝的に作製されたものである。７Ｃ１株［遺伝子型W3110 △tonA phoA △E15 △(argF-lac)169を有する］は、Ｐ１から誘導されたファージＰｌｋｃ（J．Miller，Experiments in Molecula r Genetics[Cold Spring Harbor，N.Y.：Cold Spring Harbor Laboratory，1972 ]）による形質導入、およびトランスポゾン遺伝学（Klecknerら，J．Mol．Biol. ，116: 125-159[1977]）を用いる技術により数段階で作製されたものである。F- 、λ-のＫ１２株（野生型はF+、λ+）である大腸菌K12 W3110（Bachmann，Bact ．Rev.，36: 525-557[1972]）を出発宿主として用いた。最初に、tonA遺伝子へのTn10トランスポゾンの挿入とその後の不明確な切り出しによりtonA遺伝子（fhuA）（Kadnerら，J．Bact.，143: 256-264[1980]；Bach mann，Microbiol．Rev.，47: 180-230[1983]）を欠失させた。この操作手順の第一段階において、大腸菌W3110にλ::Tn10を導入して大腸菌W 3110のTn10ホッププール(hop pool)を形成させた（Klecknerら，J．Mol．Biol., 前掲）。大腸菌W3110::Tn10ホッププールをＬ培地で３７℃にて増殖させ、約１×１０⁹ ／ｍＬの細胞密度とした。合計０．５ｍＬの培養物を遠心分離し、ペレットを７．０×１０⁹ｐｆｕを含むλphi80溶解物０．２ｍＬ中に再懸濁した。ファージを３７℃で３０分間吸着させた。次に、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を添加したＥＭＢ平板上に懸濁液を広げた。３７℃で一夜のインキュベーション後、コロニーを３ｍＬのＬ培地中に集め、３７℃で一夜増殖させ、２回洗浄してＬ培地に再懸濁した。バクテリオファージＰｌｋｃの溶解物をこの培養物上で調製した(Miller，J.H.，Experiments in Molecular Biology，前掲，p.304)。このＰｌＫｃ溶解物により大腸菌ＡＴ９８２（E．coli Genetic Stock Center ,New Haven，Conn.）に形質導入を生じさせてテトラサイクリン耐性に変えた。テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）と４０ｐｇ／ｍＬのジアミノピメリン酸（ｄａｐ）を添加したＬ培地上で形質導入体を選択した。得られた形質導入体をテトラサイクリン耐性およびdap遺伝子の再生(dap⁺，tet^R)についてスクリーニングした。その後dap⁺，tet^R形質導入体をλphi80耐性について試験した。次いで、Ｐｌｋｃ溶解物をいくつかのdap⁺，tet^R，λphi80-耐性株上で調製した。この溶解物を用いて大腸菌W3110をテトラサイクリン耐性に変えた。形質導入体をスクリーニングし、λphi80耐性を選択した。 W3110 tonA::Tn10-λphi80R形質導入体からテトラサイクリン感受性分離株を選択した。Maloy and Nunn，J．Bacteriol.，145: 1110（1981）参照。単一コロニーの精製後、これらの分離株をλphi80耐性およびテトラサイクリン感受性について調べた。テトラサイクリン感受性でλphi80-耐性のいくつかの変異体からＤＮＡを単離しSstIIで消化した。Tn10が切り出されたかどうかを判定するため、プローブとして放射性標識したSstII-消化λ::Tn10 DNAを用いてサザンブロット法により SstII-消化DNAの特性付けを行った。Davisら，Advanced Bacterial Genetics(Co ld Spring Harbor Laboratory，New York，1980)参照。λ::Tn10由来のＤＮＡと親W3110 tonA::Tn10-λphi80R由来のＤＮＡとのハイブリダイゼーションに比べて、テトラサイクリン感受性分離株の１つがTn10ハイブリダイゼーションバンドのうち２つを失っていたことがわかった。３つ目のハイブリダイゼーションバンドは移動度が変化しており、これはTn10の不明確な切り出しが原因で欠失が起こったことを示している。不明確なTn10切り出しを有する菌株からの外膜調製物のＳＤＳゲル電気泳動から、TonAタンパク質と思われたバンドは、野生型TonAタンパク質と比べて、電気泳動移動度が変化することが明らかになった。得られたタンパク質はλphi80ファージ受容体タンパク質として機能しなかった。やはりTn10の不明確な切り出しを受けた第２の独立した菌株は、ＳＤＳゲル上にTonAタンパク質を全然示さなかった。これらの菌株はどちらもテトラサイクリン耐性またはλphi80感受性への復帰を示さず、このことはtonA遺伝子の部分または完全欠失とともにTn10トランスポゾンの全部または一部の不明確な切り出しがあったことを示している。こうして、TonAタンパク質(MW 78,000)が外膜から除かれ、W3110 tonA株はいくつかのバクテリオファージに対して耐性となった。その後、２以上の欠失変異、phoA△E15(Sarthyら，J．Bact.，145: 288-292[1 981])および△(argF-lac)-169(Schweizerら，Mol．Gen．Genet.，192: 293-294[ 1983])を同時に、プロリン生合成遺伝子に挿入したカナマイシン耐性トランスポゾン(proC::Tn5)への遺伝子連鎖によりW3110 tonAに導入した。グルコース最少寒天平板で自然原栄養(pro⁺)復帰変異体を選択することによりトランスポゾンを除いた。phoA変異の導入は、０．２ｍＭのリン酸塩および２０ｍｇ／Ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートを加えたグルコース最少寒天平板上に白色コロニーを形成する形質導入体として認められた。同様に、△(argF-lac)-169変異はβ-ガラクトシダーゼ酵素の欠損を起こさせ、M acConkey-1%ラクトース寒天平板上に白色コロニーを形成する細胞をもたらす。この結果が７Ｃ１株であった。最後に、ファージＰｌｋｃを用いる多段階の形質導入法により、アルドラーゼを除くdeoC変異（Bachmann，前掲）を７Ｃ１株に導入した。標準的な形質導入法を採用した。最初に、トレオニン栄養要求性を７Ｃ１株に導入し、以下のとおりにしてdeoC遺伝子の領域に導入した染色体セグメントの陽性選択のための手段を得た。Ｐｌｋｃをトレオニン栄養要求株上で増殖させた。このような栄養要求株はCl are N．Berg and Douglas E．Berg，Microbiology-1981，“Bacterial Transpos ons”，pp．107-116（Amer．Soc．for Microbiology，Washington，DC，1981）に記載されている。得られた溶解物により７Ｃ１株に形質導入を生じさせてテトラサイクリン耐性に変え、２５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むＬＢ平板で形質導入体を選択した。得られた１４Ａ９と名づけた菌株（tonA△，phoA△E15，△(argF-lac)-16 9 thr::tn10）は高頻度で原栄養株に自然に復帰したので、１６Ｃ４株と称する安定したテトラサイクリン感受性トレオニン栄養要求株を選択するためにフザリン酸平板（J．Bact.，145: 1110[1981]）を用いた。Ｐｌｋｃを上記のＣＧＳＣ＃６０９２株上で増殖させた。得られた溶解物を用いて１６Ｃ４株に形質導入を生じさせて原栄養株に変え、グルコース最少寒天平板上での増殖について選択した。高頻度形質導入溶解物を２Ｄ４株から得るためには、Ｐｌｋｃをこの宿主上で２回繰り返し増殖させる必要があった。１６Ｃ４株の５個の原栄養形質導入体を単離し、精製してチミジン最少寒天平板上での増殖について試験した。５個の分離株のうち４個はチミジン上で増殖できなかった。それゆえ、これらはdeoCタンパク質の合成を排除するde oC2変異を受け取っていたことになる。これら４個の分離株のうち１個を取っておき、１６Ｃ９株（△tonA，phoA，△E15，△(argF-lac)169，deoC2）と名づけた。ＰＥＧ−マレイミドは、モノメトキシＰＥＧアミンとスルホ−ＭＢとを０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）中で室温にて１時間反応させて製造し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．２）への緩衝液交換を行った。次に、余分の遊離システインを有するＧＨを加えて１時間混合し、Ｍｅ−ＰＥＧアルデヒドＰＥＧ化ＧＨと同様にして最終混合物をＭｏｎｏＱカラムにかけて分離した。エステル結合は化学的にも生理学的にも不安定であるので、結合反応にはエステル官能基を含まないＰＥＧ試薬を使用することが好ましいかもしれない。例えば、ＰＥＧ−モノメチルエーテルをホスゲンと反応させてＰＥＧ−クロロホルメートを得ることによりカルバメート結合を製造することができる。次に、この試薬をＮＨＳエステルと同様に使用することによりリシンの側鎖アミンを官能化することができる。別の例では、アミノ−ＰＥＧ−モノメチルエーテルをホスゲンと反応させて尿素結合を形成させる。これはリシンアミンと反応しうるＰＥＧ− イソシアネートを生成させるだろう。ＰＥＧ試薬中に開裂可能なエステルを含まないＰＥＧ−ＧＨの好適な製造方法は次のとおりである。Buckmannら，Macromol．Chem.，182: 1379-1384(1981)に記載されるように、メトキシポリ（エチレングリコール）をナフタリンナトリウムで滴定してカルボン酸に変換してアルコキシドを生成し、続いて酢酸ブロモエチルで処理してエチルエステルを形成し、その後水酸化ナトリウムと水で処理して対応するカルボン酸に加水分解する。得られたカルボン酸を次いで酢酸エチル中でジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮＨＳと反応させて、ＧＨのアシル化に適するＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに変換する。得られたＮＨＳ−ＰＥＧ試薬を、ＧＨに対して３０倍過剰モル量を用いて、ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中室温で１時間１２ｍｇ／ｍＬのＧＨと反応させ、TRIS緩衝液でQ Sepharoseカラムにかけ、塩勾配で溶出する。次に、０．３Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で平衡化した第２のカラム（フェニルToyopearl）にかける。ＰＥＧ化されたＧＨを逆塩勾配で溶出し、プールし、Ｇ２５脱塩カラムを使ってマンニトール、グリシンおよびリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液交換して適当に製剤化されたＰＥＧ７−ＧＨを得る。ＰＥＧ化ＧＨ分子およびＧＨ−ＧＨＢＰ複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、トリプシンマッピング、液体クロマトグラフィー−質量スペクトル分析およびin vitro生物学的アッセイにより特性付けすることができる。まず初めに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとゲル濾過によってＰＥＧ化の程度を知り、その後ＮＭＲで分析してＰＥＧのメチレン水素に特有の共鳴ピークを確認する。各分子のＰＥＧ基の数はＮＭＲスペクトルまたは質量スペクトルから算出できる。適当には、１０％ＳＤＳでのポリアクリルアミドゲル電気泳動は溶離緩衝液として10mM Tris-HC l pH8.0、100mM NaClを用いて行う。どの残基がＰＥＧ化されているかを証明するために、トリプシンマッピングを行うことができる。そのために、ＰＥＧ化ＧＨをタンパク質／酵素比１００対１（mg基準）でトリプシンを用いて100mM酢酸ナトリウム、10mM Tris-HCl、1mM塩化カルシウム、pH8.3中37℃で４時間消化し、ｐＨ＜４に酸性化して消化を停止させ、その後ＨＰＬＣ（Nucleosil C-18; 4. 6mm×150mm，５μ，100Å）で分離する。クロマトグラムをＰＥＧ化されていない出発物質のものと比較する。次いで各ピークを質量スペクトルで分析してそのピークのフラグメントの大きさを確認する。通常、ＰＥＧ基をもつフラグメントは注入後ＨＰＬＣカラムに保持されず、クロマトグラフから消えてなくなる。このようなクロマトグラフからの消失は、少なくとも１個のリシン残基を含む特定フラグメントへのＰＥＧ化を示すものである。その後、ＰＥＧ化ＧＨは慣用方法によりＧＨＢＰへのその結合能についてアッセイされる。様々なＰＥＧ化を用いることにより、サイズ排除クロマトグラフィーで測定して３５Ｋ、５１Ｋ、２５０Ｋおよび３００Ｋの見かけ分子量（それらの天然流体力学的容積に近似するだろう）を有する種々のＰＥＧ化野生型ＧＨが得られた。これらをそれぞれＰＥＧ１−ＧＨ、ＰＥＧ２−ＧＨ、ＰＥＧ３−ＧＨおよびＰＥＧ７−ＧＨと名づけた。トリプシンマッピングの結果より、ＰＥＧ１−ＧＨとＰＥＧ２−ＧＨは両方とも、クロマトグラムから失われるため恐らくＰＥＧ化された（これは液体クロマトグラフの通り抜け画分中に存在する大型分子種の質量スペクトル分析により確認できる）Ｎ末端の９アミノ酸フラグメントを有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量から、ＰＥＧ１−ＧＨはＮ末端アミン上に１つのＰＥＧを有し、そしてＰＥＧ２−ＧＨはＮ末端アミン上に２つのＰＥＧ分子を有して第三級アミドを形成しているだろう。ＰＥＧ３−ＧＨはＮＭＲの結果に基づくと１分子あたり約５個のＰＥＧ基を有し、トリプシンマッピングでは少なくとも５つのペプチドフラグメントが失われた。このことはそれらがＰＥＧ化されていることを示唆している。ＰＥＧ７−ＧＨは質量スペクトル分析に基づくと１分子あたり６〜７個のＰＥＧ基をもつと考えられる。ＰＥＧ基をＧＨに付加させる部位およびこうした結合に適する残基はＮ末端のメチオニンまたはフェニルアラニン、リシン３８、リシン４１、リシン７０、リシン１４０、リシン１４５、リシン１５８およびリシン１６８である。ＰＥＧ化されないらしい２つのリシンはリシン１１５とリシン１７２であった。また、ＧＨは持続放出性システムで適切に投与しうる。ここで有用な持続放出性組成物の例として、例えばフィルムやマイクロカプセルのような成形品の形をした半透性ポリマーマトリックスがある。持続放出性マトリックスにはポリアクチド（米国特許第3,773,919号、ヨーロッパ特許第58,481号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー(Sidmanら，Biopolymers，22，547-556[ 1983])、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langerら，J．Biomed ．Mater．Res.，15: 167-277[1981]; Langer，Chem．Tech.，12: 98-105[1982] ）、エチレンビニルアセテート（Langerら，前掲）もしくはポリ−Ｄ−（−）− ３−ヒドロキシ酪酸（ヨーロッパ特許第133,988号）、またはＰＬＧＡマイクロスフェアが含まれる。さらに、持続放出性ＧＨ組成物はリポソームに保持させたＧＨを含む。ＧＨ保持リポソームはそれ自体公知の方法で調製される。例えば、DE 3,218,121; Epst einら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82: 3688-3692(1985); Hwangら，Proc．N atl．Acad．Sci．USA，77: 4030-4034(1980); EP52,322; EP 36,676; EP 88,046 ; EP 143,949; EP 142,641;日本特許出願第83-118008号; 米国特許第4,485,045 号および第4,544,545号; およびEP 102,324を参照のこと。通常、リポソームは小型（約２００〜８００Å）の単ラメラ型のもので、リピド含量が約３０モル％より多いコレステロールであり、所与の割合が最適治療のために調整される。さらに、生物学的に活性な持続放出性製剤は、1989年８月15日付けの米国特許第4, 857,505号に記載されるような、活性化多糖に共有結合されたＧＨの付加物から製造することができる。さらに、米国特許第4,837,381号は脂肪またはワックスまたはそれらの混合物とＧＨとの徐放性マイクロスフェア組成物を記述している。別の実施態様において、上記で確認された患者は有効量のＩＧＦ−Ｉで治療される。一般的な提案として、１回あたりに非経口投与されるＩＧＦ−Ｉの薬学的に有効な総量は、患者の体重の約５０〜２４０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは１００〜２００μｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の裁量で決定されるだろう。また、ＩＧＦ−Ｉを皮下注射により１日に１または２回投与することも好ましい。ＩＧＦ−Ｉは注射（１回または複数回、例えば１日に１〜４回）または輸液を含めて任意の手段で投与しうる。ＧＨと同様に、ＩＧＦ−Ｉもまた、ＧＨについて上述したように、治療期間中ずっと血中に存在するように製剤化することができる。こうして、ＩＧＦ−Ｉをポリマーに共有結合させたり、上記のような持続放出性製剤にしてもよい。さらに、ＩＧＦ−Ｉを１種以上のその結合タンパク質、例えば現在知られているもの、すなわちＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５またはＩＧＦＢＰ−６と一緒に投与することも適している。投与のためにＩＧＦ−Ｉを受容体または抗体もしくは抗体フラグメントに結合させてもよい。ここでＩＧＦ−Ｉに好適な結合タンパク質はＩＧＦＢＰ−３であり、これは米国特許第5,258,287号およびMartin and Baxter，J．Biol.Chem. ，261: 8754-8760（1986）に記載されている。このグリコシル化ＩＧＦＢＰ−３タンパク質は、大部分の内因性ＩＧＦを保持していて、やはりＧＨにより調節される、ヒト血漿中に存在する１２５〜１５０Ｋｄの糖タンパク質複合体の、酸に安定な成分（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約５３Ｋｄ）である。ＩＧＦ−ＩとＩＧＦ結合タンパク質との同時投与は米国特許第5,187,151号に記載の方法により行われる。簡単に説明すると、ＩＧＦ−ＩとＩＧＦＢＰを約０．５：１〜約３：１のモル比で、好ましくは約１：１のモル比で皮下ボーラス注射により有効量で投与する。更なる実施態様において、ＩＧＦ−ＩとＧＨの両方をそれぞれ有効量で、またはそれぞれの最適量より少ないが一緒になると有効な量で、患者に投与することができる。好ましくは、このような量は約５０〜１００ｐｇ／ｋｇ／日のＩＧＦ −Ｉおよび約０．３ｍｇ／ｋｇ／週のＧＨである。例えば静脈内または皮下手段を使って、注射によりＩＧＦ−ＩとＧＨの両方を投与することが好ましい。皮下注射によりＩＧＦ−ＩとＧＨの両方を投与することがより好ましく、毎日注射することが最も好ましい。ＩＧＦ−ＩとＧＨの両方の用量を決める医師の注意すべき点は、これらのホルモンによる治療において知られている副作用を考慮することである。ＧＨの副作用としては、ナトリウムの保持および細胞外容積の増加（Ikkosら，Acta Endocr inol．(Copenhagen)，32: 341-361[1959]; Biglieriら，J.C.E.M.，21: 361-370 [1961]）、そして高インスリン症と高血糖症が挙げられる。ＩＧＦ−Ｉの主な副作用は低血糖症である。Gulerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86: 2868-2872 (1989)。実際、ＩＧＦ−ＩとＧＨの併用は両薬剤の望ましくない副作用（例えば、ＩＧＦ−Ｉの低血糖症およびＧＨの高インスリン症）の低減、ＧＨの血中濃度の回復（ＧＨの分泌がＩＧＦ−Ｉにより抑制される）をもたらす可能性がある。非経口投与のために、一つの実施態様において、ＩＧＦ−ＩとＧＨの一般的な製剤化は、それぞれを所望の純度で、１回量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、製剤学的に許容される担体（すなわち、用いる投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、その製剤の他の成分と適合性であるもの）と混合することにより行われる。例えば、製剤は酸化剤およびポリペプチドに有害であることが知られている他の化合物を含まないことが好ましい。一般に、製剤を調製するには、ＩＧＦ−ＩとＧＨのそれぞれを液状担体または微細な固形担体または両者と均質に接触させる。次に、必要ならば、生成物を所望の製剤に成形する。好ましくは担体は非経口用の担体であり、より好ましくはレシピエントの血液と等張の溶液である。このような担体ビヒクルの例には、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などがある。不揮発性油やオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルも、ここではリポソームと同様に有用である。担体は少量の添加剤例えば等浸透圧や化学的安定性を高める物質を含むことが好ましい。この種の物質は用いる投与量および濃度でレシピエントに無毒性のものであり、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、例えばポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；単糖、二糖および他の炭水化物、例えばセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン界面活性剤、例えばポリソルベート、ポロクサマーまたはＰＥＧ、などが含まれる。ＩＧＦ−ＩおよびＧＨはそれぞれ個々に上記のようなビヒクル中に約０．１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、約４．５〜８のｐＨに調合する。全長ＩＧＦ−Ｉは約５〜６のｐＨに、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ −Ｉは約３．２〜５のｐＨに調合することが好ましい。ＧＨは７．４〜７．８のｐＨにすることが好ましい。上記のある種の賦形剤、担体または安定剤を使用すると、ＩＧＦ−ＩまたはＧＨ塩の製剤が得られることが理解されるだろう。ＧＨはどのような適当な方法で製剤化してもよいが、好適なＧＨ製剤は次のとク溶液が２．０ｍｇ／ｍＬのｍｅｔ−ＧＨ、１６．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．１４ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム、および１．６ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム（一塩基の一水和物）、ｐＨ７．８を含む。ｍｅｔ−ＧＨの５ｍｇバイアルは５ｍｇのｍｅｔ−ＧＨ、４０ｍｇのマンニトール、および合計１．７ｍｇのリン酸ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）、ｐＨ７．８を含む。１０ｍｇバイアルは１０ｍｇのｍｅｔ−ＧＨ、８０ｍｇのマンニトール、および合計３．４ｍｇのリン酸ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）、ｐＨ７．８を含む。０ｍｇ／ｍＬのＧＨ、１８．０ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．６８ｍｇ／ｍＬのグリシン、０．４５ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム、および１．３ｍｇ／ｍＬのリン酸ナトリウム（一塩基の一水和物）、ｐＨ７．４を含む。５ｍｇバイアルは５ｍｇのＧＨ、４５ｍｇのマンニトール、１．７ｍｇのグリシン、および合計１．７ｍｇのリン酸ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）、ｐＨ７．４を含む。１０ｍｇバイアルは１０ｍｇのＧＨ、９０ｍｇのマンニトール、３．４ｍｇのグリシン、および合計３．４ｍｇのリン酸ナトリウム（乾燥重量）（二塩基の無水物）を含む。 ±０．５ｍｇ／ｍＬのｒｈＧＨ；８．８±０．９ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム；２．０±０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０；２．５±０．３ｍｇ／ｍＬのフェノール；２．６８±０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウムニ水和物；および０．１７±０．０２ｍｇ／ｍＬの無水クエン酸（無水クエン酸ナトリウム／クエン酸の合計量は２．５ｍｇ／ｍＬ、つまり１０ｍＭ）；ｐＨ６．０±０．３を含む。この製剤は３ｃｃのガラスバイアル中に上記製剤を２．０ｍＬ充填してある１０ｍｇバイアルとすることが好ましい。また、上記製剤を含む１０ｍｇ（２．０ｍＬ）カートリッジを患者への液体ＧＨ注入用のペンの中に配置することができる。ＩＧＦ−Ｉは投与に適するどのような方法で製剤化してもよいが、好適な製剤は約２〜２０ｍｇ／ｍＬのＩＧＦ−Ｉ、約２〜５０ｍｇ／ｍＬの浸透圧調節剤（ osmolyte）、約１〜１５ｍｇ／ｍＬの安定剤、および約ｐＨ５〜５．５の緩衝液を含むものである。好ましくは、浸透圧調節剤は約２〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の無機塩または約４０〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度の糖アルコールであり、安定剤はベンジルアルコールまたはフェノールまたは両者であり、そして緩衝液は酢酸塩緩衝液である。最も好ましくは、浸透圧調節剤が塩化ナトリウムで、酢酸塩が酢酸ナトリウムである。さらにより好ましくは、ＩＧＦ−Ｉの量を約８〜１２ｍｇ／ｍＬに、塩化ナトリウムの量を約５〜６ｍｇ／ｍＬに、ベンジルアルコールの量を約８〜１０ｍｇ／ｍＬに、フェノールの量を約２〜３ｍｇ／ｍＬに、そしてｐＨが約５．４となるように酢酸ナトリウムの量を約５０ｍＭとする。さらに、この製剤は約１〜５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤、好ましくは約１〜３ｍｇ／ｍＬの量のポリソルベートまたはポロクサマーを含むことができる。さらに、ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ、好ましくは全長ＩＧＦ−Ｉ、を適当な担体ビヒクル中に一緒に調合して医薬組成物（細胞を含まないものが好ましい）を調製することもできる。一つの実施態様において、製剤化に用いる緩衝液はその組成物を混合直後に用いるか、それとも後で使用するために保存するのかによって決まるだろう。混合直後に用いるのであれば、全長ＩＧＦ−ＩとＧＨの混合物をマンニトール、グリシンおよびリン酸塩、ｐＨ７．４中に調合することができる。その混合物を保存するのであれば、クエン酸塩のような約ｐＨ６の緩衝液中に調合し、このｐＨでのＧＨの溶解性を高める界面活性剤、例えば０．１％のポリソルベート２０またはポロクサマー１８８を添加する。最終製剤は安定した液体または凍結乾燥固体でありうる。好適な組合せ組成物はＩＧＦ−Ｉ：ＧＨの重量比が約１：１〜１００：１（ｗ／ｗ）のＩＧＦ−ＩおよびＧＨ、約０．０５〜０．３ｍＭの浸透圧調節剤、約０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの安定剤、約１〜５ｍｇ／ｍＬの界面活性剤、および約５〜１００ｍＭの緩衝液（約ｐＨ５〜６）を含むものである。好ましくは浸透圧調節剤は無機塩であり、界面活性剤は非イオン性である。より好ましくは、無機塩が塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであり、安定剤がフェノールまたはベンジルアルコールであり、界面活性剤がポリソルベートまたはポロクサマーであり、緩衝剤が酢酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムまたは両者であり、そしてＩＧＦ−ＩおよびＧＨの量がそれぞれ約２〜２０ｍｇ／ｍＬおよび約０．２〜１０ｍｇ／ｍＬであり、ＩＧＦ−Ｉ：ＧＨの重量比が約１：１〜５０：１である。さらに好ましくは、ＩＧＦ−Ｉの量を約５〜１０ｍｇ／ｍＬに、ＧＨの量を約１〜５ｍｇ／ｍＬに、ＩＧＦ−Ｉ：ＧＨの重量比を約１：１〜４：１に、塩化ナトリウムの量を約５〜７ｍｇ／ｍＬに、フェノールの量を約０．１〜３ｍｇ／ｍＬに、ベンジルアルコールの量を約６〜１０ｍｇ／ｍＬに、界面活性剤を約１〜３ｍｇ／ｍＬの量のポリソルベートに、酢酸ナトリウムの量を約２．５〜４ｍｇ／ｍＬに、そしてクエン酸ナトリウムの量を約０．１〜１ｍｇ／ｍＬにする。治療に用いるＩＧＦ−ＩおよびＧＨは無菌であることが好ましい。滅菌は無菌の濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通して濾過することにより簡単に行える。治療用のＩＧＦ−ＩおよびＧＨ組成物は一般に、無菌のアクセス口を備えた容器、例えば皮下注射針で突き刺すことのできるストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルの中に入れる。ＩＧＦ−ＩおよびＧＨは通常、１回量容器または多数回量容器、例えば密閉されたアンプルまたはバイアルの中に、水溶液あるいは用時調製のための凍結乾燥製剤として保存されるだろう。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬバイアルに滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）ＩＧＦ−ＩおよびＧＨ水溶液５ｍＬを充填し、この混合物を凍結乾燥する。注入用の溶液は静菌性の注射用水を用いて凍結乾燥ＩＧＦ −ＩおよびＧＨを用時調製することにより得られる。本発明は以下の実施例を参考とすることにより一層理解しやすくなるだろう。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきでない。引用文献および特許はすべて参考としてここに組み入れるものとする。実施例１本実施例では、ＧＨＢＰの血清濃度を、成長不全（ＧＨＤもしくはＴＳ）またはＩＳＳという一定の病因を有する背の低い子供から得た多数のサンプルで測定し、正常な対照群のＧＨＢＰレベルと比較した。対照被検者血清中のＧＨＢＰの正常範囲を確立するために、773人の子供（女子366人および男子407人）のサンプルを分析した。年齢範囲は３歳〜16歳であり、いくつかの場合は、被検者の年齢は最も近い年齢として報告された。サンプルの大部分は、膵臓のβ−細胞に対する抗体を検出するためのスクリーニングプログラム（Pa sco Co．School System，Florida）によって、就学年齢の正常な集団から得たものであり、他のサンプルは一般に、Dr．Juan Sotos of Children's Hospital of Columbus，OhioおよびDr．Rebecca Kirkland of Baylor College of Meicine， Houston，Texasから提供された。子供たちは健康であり、身長に関してはアメリカの人口のある断面を代表していると考えられる。成長が遅れている被検者成長が遅れている子供たち（１歳〜17歳）の血清サンプルは、NCGSの市販開始後の監視プロジェクト(Post-marketing surveillance project)に登録された776 人の被検者のベースライン評価で集めた。サンプルは、この研究に関係する106 のセンターから提供された。分析に含めたＧＨＤおよびＩＳＳの子供たちは全員、年齢および性別の平均より身長が２ＳＤＳ以上低かった。被検者は、彼らの登録医によりＧＨＤであると分類された。ＧＨＤの子供たちで、最大刺激または内因性ＧＨレベルが10μg/Ｌ以上であることが治療医によって報告された者（不特定の方法を用いて）、またはGenentech Inc．でダブルモノクローナルイムノラジオメトリックアッセイ（T andem-R HGH，Hybritech，San Diego，CA）を使用して10μg/L以上と測定された者はいなかった。中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍など、ＧＨＤに器質的原因がある被検者は除外された。ＮＣＧＳデータベースにＩＳＳとして分類された患者は、登録医により（種々の用語を使用して）それとして示されるか、身長の低さが器質的病因ではないと示されると共に、10μg/Lより高い、刺激されたＧＨレベルまたは内因性ＧＨレベルを有していた。ＴＳの患者は、かれらの登録医によってそのように特定され、種々の形態のモザイク現象を有する患者を含んでいる。被検者として含まれる者で、以前に何らかの形でＧＨ治療を受けた者はいなかった。ＧＨＢＰ測定ＧＨＢＰは、上述したようにＬＩＦＡによって測定した。簡単に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレート（Corning Glass Works，Corning，New York ）を、50m mol/Lの炭酸緩衝液（ｐＨ9.6）中10μg/mLの抗体100μL/ウェルとともに４℃で一夜インキュベートすることにより、ＧＨＢＰに対するモノクローナル抗体（MAb 263，Agen，Australia）で被覆した。その被覆したウェルを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(5g/L)を含む150μLのＰＢＳ（ｐＨ7.2）でブロックし、洗浄した。標準物質（組換えｈＧＨＢＰ）またはサンプル（50μL/ウェル）を、50μL/ウェルの組換えｈＧＨ（200μg/L; Genentech，Inc.）およびマウス免疫グロブリンＧ（10g/L; Fitzgerald Industries，Chelmsford，MA）とともに被覆ウェルに分注した。プレートを密閉し、おだやかに攪拌しながら室温で２時間インキュベートし、洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合させたモノクローナル抗−ＧＨ抗体（MAb MCB，Genentech，Inc.）（100μL/ウェル）を添加した。さらに室温で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄用緩衝液で６回洗浄した。新しく調製した基質溶液（0.4ｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩／１ＬのＰＢＳ＋0.4mLの30%過酸化水素）をプレートに添加し（100μL/ウェル）、インキュベーションを遮光して15分間、室温で行なった。100μLの2.25モル/Lの硫酸を添加することにより反応を停止し、490 nmでの吸光度を測定した。ＬＩＦＡの検出範囲は、15.6〜1000ピコモル/Lであった。アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は各々、約７%および11%であった。サンプルは全て、ｎ＝２で測定した。ＧＨ測定異なる群における自発的ＧＨ分泌を評価するために、851人の子供たちから２０分間隔で12時間（午後８時〜午前８時）にわたって採血した血清サンプル中のＧＨ濃度を測定した。各被検者に対して平均値を計算した。検出限界が0.5μg /Lであるモノクローナル抗体ベースのイムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ（Tandem-R HGH，Hybritech））を用いて、ＧＨ濃度を測定した。ＩＧＦ−Ｉ測定一夜ＧＨサンプリングの際に、子供858人から採取した血清サンプル中のＩＧＦ−Ｉ濃度を、ＲＩＡ、続いて酸エタノール抽出を使用してベースラインで測定した（IGF-I RIAキット，Nichols Institute，San Juan Capistrano，CA）。統計的分析標準化した身長（ＳＤＳ）を年齢および性別特異的平均値から計算し、標準偏差は、アメリカの子供たちのNational Center for Health Statistics（ＮＣＨＳ）標準データから得た。Hamillら、Am．J．Clin．Nutrition，32: 607-629(19 79)。ボディ・マス指数（ＢＭＩ）は、体重（kg）／〔身長（ｍ）〕²という式を使用して計算した。成長が遅れている子供達の年齢、身長ＳＤＳ、およびＢＭＩの平均値とＳＤ値を、ＮＣＧＳ登録用紙に報告されたデータから計算した。ＧＨＢＰ濃度（表ＩおよびIII）の平均並びに標準偏差、および12時間ＧＨ濃度平均（表IV）に対する平均並びに標準偏差は、データが非対称性であるため、対数変換した後に計算した。次いで、平均の真数、平均±２ＳＤ（ＧＨＢＰ、表Ｉ）および平均±１ＳＤ（ＧＨＢＰ、表IIIおよび平均12時間ＧＨ平均、表IV）を計算して、表に挙げた値を得た。対称群のＧＨＢＰ濃度の対数に対する年齢および性別の影響を分散分析（ＡＮＯＶＡ）により評価した。標準化したＧＨＢＰレベル（ＳＤＳ）の計算は、下記式を利用して、性別および年齢によりグループ分けした対照群のデータから得た平均および関連したＳＤに基づいて行なった。３〜15歳（対照サンプルが利用できた年齢範囲）の個々のＧＨＢＰ濃度に対しては、［式中、平均（log（ＧＨＢＰ）｜年齢、性別）は、個々と同じ年齢および性別の対照被検者に対するＧＨＢＰの平均対数値であり、ＳＤ（log（ＧＨＢＰ）｜年齢、性別）は関連するＳＤである。］である。ＳＤＳに変換した後、ＧＨＤ、ＩＳＳおよびＴＳと診断された子供の血清ＧＨＢＰ濃度を、ＡＮＯＶＡによって互いに比較し、および同性の対照と比較した。また、ＧＨＢＰＳＤＳは、暦年齢よりもむしろ骨年齢に基づいて計算した。どの変数に対しても群間で多重比較したとき、統計的に有意なｐ−値にボンフェローニ調整(Bonferroni adjustments)を施して、テストの有意水準レベルを全体で0.05に維持した。本明細書では、有意な統計比較のための名目ｐ−値を含める。結果３〜15歳の子供の血清ＧＨＢＰ濃度の正常な範囲（平均±２ＳＤ）を表Ｉに示す。技術的な問題により、５歳児の子供に対する結果は使用できない。年齢および性別ともに、ＧＨＢＰ濃度に対して有意な影響を及ぼした。女子は男子よりもＧＨＢＰ濃度が高かった（ｐ＜0.0001）。男女とも、ＧＨＢＰ濃度は年齢とともに増加した（ｐ＜0.0001）。表IIは、各被検者群に対する年齢、身長ＳＤＳおよびＢＭＩの平均（±ＳＤ）を示す（身長およびＢＭＩデータは、対照被検者全員について入手できたわけではなかった。）。平均年齢は全部の群で同様であった（約11歳）。平均身長ＳＤＳ値は、ＧＨＤ、ＩＳＳおよびＴＳについて女子の間で、またはＧＨＤおよびＩＳＳについて男子の間では統計的相違はなかった。平均ＢＭＩ値は、女子（ｐ＜ 0.0137）および男子（ｐ＜0.0001）のどちらも、他の成長が遅れている群と比較して、ＩＳＳ群がかなり低かった。図１Ａ〜１Ｅは、ＧＨＤ、ＩＳＳおよびＴＳの子供各個人の血清ＧＨＢＰ濃度を同性の正常範囲（−２ＳＤ〜＋２ＳＤ）と比較して示す。全群の対応する平均ＧＨＢＰ濃度および平均ＳＤＳ値を表IIIに示す。ＧＨＤまたはＩＳＳの男子の場合、平均ＧＨＢＰＳＤＳは対照の男子より低く（共に、ｐ＜0.0001）、ＩＳＳの男子の平均ＳＤＳはＧＨＤの男子より低かった（ｐ＜0.0001）。ＩＳＳおよびＧＨＤの女子の平均ＳＤＳは、対照の女子より低かった（各々、ｐ＜0.0001およびｐ＝0.0046）。さらに、ＩＳＳの女子の平均ＳＤＳはＧＨＤの女子より低かった（ｐ＝0.0039）。ＧＨＤ群を、最大刺激ＧＨレベル＜5μg/L(n=23)の被検者に限ると、ＧＨＢＰＳＤＳは対照の平均と有意な差はなかった。ＧＨＤ群とＩＳＳ群との間でＢＭＩが相違し、ＢＭＩレベルとＧＨＢＰレベルとの間に関係が認められるため、ＧＨＢＰにおける群間の相違がＢＭＩにおける相違に依存しない場合に、共変量としてＢＭＩを使用して共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を行なった。男子および女子ともに、ＧＨＤおよびＩＳＳ群のＧＨＢＰの相違は有意のままであった（ｐ＜0.02）。男子のＩＳＳ被検者の91%および女子のＩＳＳ被検者の92%においてのＧＨＢＰ濃度は、年齢および性別が同じ対照群の平均以下であった。ＩＳＳの被験者およびＧＨＤの被検者の間の相違は男子で特に顕著であり、ＧＨＤの男子は６９人中わずか６人(8.7%)が平均より２ＳＤＳ低い値であったのに対して、ＩＳＳの男子は394人中79人（20.1%）が平均より２ＳＤＳ以上低い値であった。ＧＨＤまたはＩＳＳの女子と対照的に、ＴＳの子供の平均のＧＨＢＰＳＤＳは、対照の女子と有意な差はなかった。成長が遅れている群全てに対して、暦年齢よりも骨年齢を使用して算出したＧＨＢＰＳＤＳでは、ほとんど差はなかった（表III）。 12時間一晩中ＧＨをサンプリングする間に得られた平均ＧＨ濃度の場合（表IV ）、病因、性別および年齢によるＡＮＣＯＶＡは、病因のみが12時間平均ＧＨレベルに対して有意な影響を与えることを示した。予期されたように、ＧＨＤの子供の平均値は対照よりもかなり小さかった（ｐ＜0.0001）。ＴＳの少女の値はＧＨＤの女子の値よりも大きく（ｐ＜0.0001）、ＩＳＳまたは対照の女子の値より小さかった（共にｐ＜0.002）。ＩＳＳの被検者の12時間平均ＧＨ濃度は、対照における濃度と統計的に差がなかった。しかし、ＧＨＢＰレベルが平均より２ＳＤ以上低いＩＳＳ被検者は、ＧＨＢＰレベルが正常な被検者より平均12時間ＧＨ値が高かった（2.8対2.3μg/L、ｐ＜0.005）。平均ＩＧＦ−ＩレベルはＧＨＤ患者が最も低く、ＩＳＳおよびＴＳ患者の場合は対照より低かった。ＩＳＳの子供の何人かの血清ＧＨＢＰ濃度は、同年齢の対照の子供より低かった。対照の被検者と比較して、ＧＨＤの子供はＧＨＢＰ濃度が低かったが、その減少差は、ＩＳＳの子供の場合よりも顕著ではなかった。診断が染色体異常の存在に基づき、従って完全な症状のＴＳの少女では、ＧＨＢＰレベルは対照群と差がなかった。このことは、ＧＨＢＰレベルが身長の低さと単純には相関しないことを示している。ラロン症候群の患者およびアフリカピグミーなどの末梢ＧＨ作用を害された、地理的および遺伝的によく定義された母集団の他に、おそらく多様な分子欠損を表す、よりとらえにくい形態のＧＨ不感受性の被検者もいるかもしれない。ＩＳＳの子供の成長が遅れるの原因がおそらく一様でないにもかかわらず、上記の結果は、ＩＳＳの子供たちの血清ＧＨＢＰ濃度は群としては減少し、有意な部分集合（20%）は年齢および性別による正常な平均より２ＳＤ以上低いＧＨＢＰレベルを有することを示す。調査したＩＳＳの子供たちは、ＧＨ分泌に関しては対照群と差がなく、ＧＨＢＰ濃度はＧＨＤ群より有意に低かった。最大ＧＨ＜10μg/Lの任意のカットオフに基づいてＧＨＤと定義された患者のＧＨＢＰレベルは対照より低かった。しかし、最大ＧＨ＜５μg/LのＧＨＤ患者では、平均ＧＨＢＰＳＤＳがＧＨ＞５μg /LのＧＨＤ群より大きく、対照と差がなかった。実施例II 市販開始後の監視調査であるthe National Cooperative Growth Study（ＮＣＧＳ）で追跡した患者を調査して、ＧＨＤ患者の成長速度を、ＧＨを種々の用量で投与して治療したＩＳＳ患者と比較した。ＩＳＳ患者は、ＧＨＢＰレベルが正常な患者およびＧＨＢＰレベルが低い患者の両方を含む。図２に示すＩＳＳ患者の結果は、0.25±0.025mg/kg/週のＧＨで治療した子供たちは、0.20mg/kg/週以下のＧＨで治療した場合と比較して、十分に速い成長速度が得られたことを示す。ＧＨＤ患者との比較より、ＧＨＤ患者で認められたのに近い平均成長速度の範囲を患者にもたらすためには、0.20mg/kg/週までの通常の用量のＧＨでは十分でないが、0.25±0.025mg/kg/週の用量にすると、ＧＨＤ患者で認められた範囲により近い平均成長速度（約10cm/年）となることが明らかになった。従って、約0 .20mg/kg/週より多いＧＨ用量が、本発明で特定された少なくとも何人かの患者には適する。実施例III ＩＳＳ患者（最大ＧＨレベル＞10μg/Lおよび身長ＳＤＳ＜−２によって定義された）のＧＨＢＰレベルは、ＬＩＦＡによって測定すると、正常な対照と比較して低い。これは、ＧＨＤまたはＴＳの背の低い子供には当てはまらなかった。身長の低い子供の評価におけるＧＨＢＰアッセイの有用性を評価するために、ＩＳＳ患者を彼らのＧＨＢＰＳＤＳに従って群分けした。ＧＨＢＰＳＤＳの低い患者（＜−２と定義された）をＧＨＢＰレベルが正常な患者（ＧＨＢＰＳＤＳ＞−２）と比較して、前者の群に、ＧＨ治療に対する感受性障害の証拠があるかどうかを調べた。患者の集団ＩＳＳの子供511人から96箇所で血清サンプルを集め、彼らは次いで、Prot の平均±ＳＤ用量は0.26±0.07mg/kg/週（非経口的な注入）であり、ＧＨの特定の用量およびスケジュールは、個々の臨床的な調査者の裁量である）、ＮＣＧＳに登録した。この調査に含まれるためには、患者が最大刺激ＧＨ＞10μg/Lおよび身長ＳＤＳ＜−２を有し、他に報告された身長の低さの病因がないことが必要である。ＧＨＢＰの測定の結果は、ＧＨ治療の開始前には未知であった。ＧＨ治療中の成長反応を含む分析のために、思春期前の患者のみを含めた。測定法ＧＨＢＰは、Carlssonら（前出）に記載されているように、ＬＩＦＡを使用してアッセイした。ＧＨＢＰおよびＧＨに対するモノクローナル抗体（各々、MAb2 63およびMAb MCB）を使用した。ＧＨＢＰ値は、Dr．Thomas Merimee at Univers ity of Florida，Division of Endocrionology and Metabolism，Health Scienc e Center，P.O．Box 100226，Gainesville，Florida 32610-0226およびDrs．Sot os and Kirkland（上述）から提供されたサンプルに基づくＬＩＦＡに対する標準を定めるデータを使用して、年齢および性別に対する標準化を行なった。これらの値は先に報告した。Carlssonら、J.C.E.M.，78: 1325-1330(1994)。ＧＨに対する終夜サンプルは、二重モノクローナルイムノラジオメトリックアッセイ（Tandem-R HGH，Hybritech，San Diego，CA）を使用して測定した。ＧＨ刺激テストに対して報告された値は、種々のＧＨ測定法を使用して測定した。ＩＧＦ−Ｉは、酸−エタノール抽出（抽出によるＩＧＦ−Ｉ、Nichols Instit ute，San Juan Capistrano，CA）の後にラジオイムノアッセイにより測定し、提供された標準を定めるデータを使用して年齢および性別に対する標準化を行なった。統計手法身長は年齢および性別に対して標準化し、体重は、北アメリカの子供について公表されたデータから得られた標準を使用して、身長および性別に対して標準化した。Hamillら、Am．J．Clin．Nutrition，32: 607-629(1979)。母親および父親の身長ＳＤＳを、正常な成人に対する身長の百分位数(percentiles)に基づいて計算した。Hamillら（前出）。多重直線回帰法を使用して、どの実験変数がＧＨＢＰＳＤＳと一次的な関係にあるかどうかを調べた。さらに、被検者をＧＨＢＰＳＤＳに基づいて二つの群に分け（＜−２ＳＤおよび＞−２ＳＤ）、正常範囲以下であるＧＨＢＰ値の有意性があるかどうかを求めた。二つの群を、いくつかの共変量の平均またはメジアンに関して互いに比較した（表VI参照）。グループ間の有意性の一変量検定は、以下の三つの検定のうち一つを使用して行なった。すなわち、ｔ−検定（ガウス分布変数の場合）、ウィルコクソン検定（非ガウス分布変数の場合）、または χ²検定（無条件(categorical)変数の場合）である。多重比較に適合させる(a djust)ためには、ｐ−値＜0.005が統計的に有意であると考えられた。他の有意な変数をコントロール(control)した後、ＡＮＣＯＶＡを使用して二つのＧＨＢＰ群の間の差を検定した。結果ＧＨＢＰが低い群の患者はより若く、体重対身長ＳＤＳ(weight-for-height S DS)およびＢＭＩが正常なＧＨＢＰ群より低かった（表Ｖ）。平均身長ＳＤＳは両方のグループで-2.9であり、値の範囲は-5.8〜-2.0であった。患者の約４分の３は男子であり、同様の性分布がＮＣＧＳデータベース全体において見られる。 Augustら、J．Pedatr.，116: 899-903（1990）。患者の72％はベースラインで思春期前であった。ＧＨＢＰＳＤＳ＜−２（平均-2.5）である患者101例およびＧＨＢＰＳＤＳ＞−２（平均-0.9）である患者410例であった。二つのグループの中央値の最大ＧＨレベルは比較できるものであったが、これらの値は、種々のＧＨアッセイを使用したため評価が困難である。平均12時間ＧＨ濃度の平均値（Hybritechアッセイを使用）はＧＨＢＰの低いグループで有意に高かったが、ＩＧＦ−ＩＳＤＳは有意に低かった（共にｐ＝0.0001、表VI）。図３は、ＧＨＢＰＳＤＳの低い患者は、ＩＧＦ−ＩＳＤＳがより低く（図３Ａ）、平均12時間ＧＨレベルがより高い（図３Ｂ）ことを示す。全ＩＳＳ患者の間では、ＧＨＢＰＳＤＳはＩＧＦ−ＩＳＤＳと正の相関関係を有し（ｒ＝ 0.285、ｐ＝0.0001）、平均12時間ＧＨと負の相関関係を有した（ｒ＝-0.17、ｐ＝0.0001）。年齢、体重対身長ＳＤＳおよび平均12時間ＧＨの差をコントロールするＡＮＣＯＶＡは、ＧＨＢＰＳＤＳ＜−２である患者は、未だ、ＧＨＢＰＳＤＳ＞− ２（ｐ＝0.0001）である患者よりＩＧＦ−ＩＳＤＳが有意に低いことを示した。同様に、ＧＨＢＰが低いグループは、年齢、体重対身長ＳＤＳおよびＩＧＦ− ＩＳＤＳをコントロールした後、ＧＨＢＰが正常なグループより平均12時間ＧＨが有意に高かった。成長速度の分析は、考慮した治療期間中、思春期前であった患者に限定した。治療の最初の３年間の各年には、ＧＨＢＰＳＤＳと成長速度または身長ＳＤＳ変化のいずれかとの有意な一次相関は見られなかった。治療前の成長速度平均は、ＧＨＢＰＳＤＳに関係なく、約４cm/年であった。ＧＨ治療の最初の１年の平均成長速度は約８cm/年であった。図４は、ＧＨ治療を行なった思春期前の患者の最初の１年の成長速度をＧＨＢＰＳＤＳに対してプロットして示す。二つの間に統計的に有意な相関関係は認められなかった（ｒ＝0.047、ｐ＝0.55、ｎ＝166）。その図は、本発明によって治療することができる患者は、このサブ集団で必要であると記載したＧＨ、ＩＧＦ−Ｉおよび身長の要件を有するとすれば、影をつけた部分以下の患者であることを示す。その結果は、ＧＨＢＰＳＤＳレベルが低く、本発明の判定規準を有する患者がＧＨの薬理的投与に応答することを示す。図５および６は、患者の治療前と１年目の成長速度とを比較したものである（図５では、２年目の成長速度も比較している。）。これらの図は、特定の患者のＧＨＢＰＳＤＳが−２または＞−２であるかどうかにかかわらず、ＧＨ治療患者に明らかに成長の増加がみられることを示す。表VIIは、ＧＨＢＰＳＤＳが低い群の成長応答データを、ＧＨＢＰＳＤＳが正常な群と比較して示す。二つの群は、治療の最初の１年間、平均ＧＨ用量および注射スケジュールは同じであった。治療前の成長速度またはＧＨ治療の最初の４年間の成長速度については、それらの群間に有意な差はなかった。身長ＳＤＳの平均変化も、二つの群間で統計的に差はなかった。４年間追跡した患者の平均増加は、ＧＨＢＰが低い群では1.5±0.6（ｎ＝13）であり、ＧＨＢＰが正常な群では1.7±0.6（ｎ＝21）であった。低身長は、種々の方法、例えば標準身長水準の一定のパーセンタイル以下であるなどの方法で定義することができるが、この調査における患者は、より選別されたグループを代表している。これらの患者は皆、ＧＨ治療の処方を受け、登録医師によるスクリーニングおよび選抜を通過した。さらに、身長ＳＤＳが−２以上である患者はこの調査に含めなかった。その結果得られたグループは、平均身長ＳＤＳが-2.9であり、平均骨年齢遅延が2.4歳であり、平均成長速度は4.2cm/ 年であった。これらは、他の報告によるＧＨで治療したＩＳＳ患者と類似していた。Hopwoodら、J．Pediatr.，123: 215-222(1993); Albertsson-Wikland, Acta Paediatr．Scand．Suppl.，343: 77-84(1988)。この選抜グループでは、年齢および性別に対して標準化した後、および骨年齢に対して調整した後に、血清ＧＨＢＰレベルが低い患者が何人かいることが分かった。Carlssonら、J.C.E.M. ，78，前出。ＧＨＢＰは、ＧＨＲと同じ遺伝子から誘導され、その細胞外ドメインと配列相同性を共有することが示された。Leungら、Nature，330: 537-543（1987）。機能性アッセイを使用して測定した血清ＧＨＢＰレベルは、完全ＧＨＩＳの患者では、低いか検出できなかった。Fielderら、J.C.E.M.，74: 743-750(1992)。この実施例では、子供の正常な範囲のＧＨＢＰレベルを年齢および性別によって測定し、ＩＳＳ患者に見られる低いＧＨＢＰレベルは、正常もしくはＧＨ欠損患者またはターナー症候群に見られるＧＨＢＰレベルよりもかなり低いことが分かった。Carlssonら、J.C.E.M.，78，前出。この調査の子供たち全員に対して、ＧＨに対する12時間一晩中の血清サンプリングを行なうと、平均レベルは正常であった。これは、理論に縛られないならば、神経分泌機能不全がほとんどの患者になかったことを示唆する。12時間ＧＨレベル平均は、正常なヒトで述べられているのと同様に、平均ＧＨＢＰＳＤＳと負の相関関係を示した。Marthsら、J.C.E.M.，73: 175-181 (1991)。しかし、ＩＧＦ−ＩＳＤＳは、ＧＨＢＰＳＤＳと正の相関関係にあつた。すなわち、ＧＨＢＰレベルの低い患者は、ＧＨは高いがＩＧＦ−Ｉレベルは低く、これはＧＨ無感覚と一致した。ＧＨＢＰ濃度の有意な予報値は体組成物であり、それは、身長および年齢に対して標準化したＢＭＩおよび体重の両方を使用して評価した。ＡＮＣＯＶＡでは、年齢および体重／身長ＳＤＳに対して調節すると、ＧＨＢＰが12時間ＧＨ平均およびＩＧＦ−ＩＳＤＳの有意な予報値のままであることが分かった。ＮＣＧＳデータベースに登録した思春期前の患者に対して利用できる成長データは、ベースラインＧＨＢＰＳＤＳと、治療前の成長速度またはベースライン身長ＳＤＳとの間に有意な一次相関関係を示さなかった。理論に縛られないならば、考えられる一つの説明は、成長速度および身長がＧＨで治療すべき患者を選別するために通常使用され、従ってこの患者集団では一様に低いということである。興味深い知見は、ＧＨＢＰＳＤＳとＧＨ治療に対する成長反応との相関関係がないことである。ＧＨ分泌およびＧＨＢＰレベルは、正常に成長している子供では負の相関関係があると考えられるので（Marthaら、前出）、正常な範囲は図７に示すように提案することができる。ＧＨＢＰレベルに対して過剰ＧＨを有する患者は過剰成長すると予想され、ＧＨレベルがＧＨＢＰレベルに対して低すぎる患者は成長が不十分であろう。現在、ＧＨＤは任意に定義され、ＧＨ分泌の度合にのみ基づく。この任意の閾値以上（および本発明の範囲内）のＧＨレベルを有する何人かの患者は、低いＧＨＢＰレベルに関して不十分な量のＧＨを有する可能性があり、その結果、成長が不十分となる。この部分集団の患者（正常な人と比較してＧＨＢＰおよびＩＧＦ−Ｉレベルが低く、12時間ＧＨレベル平均が高く、部分的ＧＨ無感覚を示唆している）に外因性ＧＨを投与すると、循環ＧＨが低いＧＨＢＰレベルに対してより適したレベルに上がることが予想され、従って、部分的な抵抗状態が克服される。実施例IV 序論ＧＨＤでない低身長の子供（非ＧＨ欠損低身長の子供）の大部分における成長不全の病因は十分定義されていない。これらの、身長が低くなければＩＳＳの正常な子供である彼らは、薬学的刺激に反応して正常な量のＧＨをつくり出すが、正常な成長パターンを示すことができない。LippeおよびNakamoto，Rec．Prog.H orm．Res.，48: 179-235(1993)。彼らの成長不全を説明するために、多くのＧＨ関連欠損症が提案されている。例えば、神経分泌機能不全（Spiliotisら、J．Am ．Med．Assoc.，251: 2223-2230(1984); Zadikら、Pediatrics，76: 355-360(19 85)）および免疫学的には反応するが生物学的には不活性なＧＨであるなど。Kow arskiら、J.C.E.M.，47: 461-464(1978); Valentaら、N．Eng．J．Med.，31: 21 4-217（1985）。これらの機構は、何人かのＩＳＳ患者では正常に成長できないことを説明できるが、大部分は、ＧＨ分泌または機能に明白な欠損はないと思われる。Lanes，Am．J．Dis．Child.，143: 1284-1286(1989);Ilondoら、J.C.E.M. ，70: 1445-1451(1990)。別の可能性は、ＩＳＳ患者は生物活性なＧＨの正常な分泌パターンを有し、欠損は、ＧＨに反応する標的細胞の能力にあるということである。そのような欠損は、ＧＨＲまたはＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−Ｉ受容体などのＧＨシグナル媒介物質のレベルにある可能性がある。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子における変化は、成長障害では滅多にない。Lajaraら、J.C.E.M.，70: 687-692(1990)。ＧＨに対する耐性は、ＧＨＲのＧＨに対する親和性の低下、結合ＧＨに反応する信号の伝播能力の損傷、または細胞表面の受容体数の減少を招く欠陥によると考えられる。ヒト血清に存在する親和性の高いＧＨＢＰは、ＧＨＲの細胞外ドメインと同一であり、受容体から蛋白分解切断により産生されると考えられる。Sotiropoulosら、Endo crinol.，132: 1863-1865(1993)。免疫機能ＧＨＢＰレベル（Carlssonら、J.C.E .M.，73，前出）は、ＩＳＳ患者の90%が平均以下であり、これらの子供の20%は、平均より２ＳＤ以上低い（Carlssonら、J.C.E.M.，73，前出; Maurasら、Meta bolism，43: 357-359(1994)）。理論に縛られないならば、機能性ＧＨＢＰの量を低下させるＧＨＲにおける異常性が、ＩＳＳ患者に存在すると考えられる。ＩＳＳにおける部分ＧＨＩＳの表現型は、ＧＨＢＰレベルの低いＩＳＳ患者はＧＨＢＰレベルが正常な人と比較して、ＩＧＦ−Ｉレベルが低く、12時間ＧＨレベル平均が高いという実施例IIIの知見を前提とする。理論に縛られないならば、これは、ＧＨＲを介したシグナル伝達に欠陥があり、その結果、ＩＧＦ−Ｉ産生の低下およびＧＨ分泌に対するＩＧＦ−Ｉの負のフィードバックの低下を招くことを示唆している。ほとんどのＩＳＳの子供は、組換えＧＨ治療に反応して成長速度が増加する（Hopwoodら、前出）。しかし、この反応は、同じＧＨ用量で治療したＧＨＤ患者（ＧＨ欠損患者）の場合よりも小さい。このことからもやはり、一つの理論として、ＩＳＳ患者におけるＧＨに対する部分的無感覚が示唆される。完全ＧＨＩＳまたはラロン症候群（ＬＳ）のＧＨＲ遺伝子における不活性化突然変異の頻度が高いことは、完全ＧＨＩＳのほとんどの場合が、機能性ＧＨＲの欠損によって説明できることを示している。ほとんどのＬＳ患者は、血液中の検出可能なＧＨＢＰ活性に欠けており（Baumannら、J.C.E.M.，65: 814-816(1987) ; Daughadayら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，84: 4636-4640(1987)）、測定すると、肝ミクロソームに結合する特異的ＧＨレベルがゼロまたは非常に低い。 Eshetら、Isr．J．Med．Sci.，20: 8-11(1984)。タンパク質の細胞外ドメインに集まるＬＳと関連する特徴的なＧＨＲ突然変異は17個ある（Rosenfeldら、Endoc rinol．Rev.，15: 369-390(1994)）。部分的ＧＨＩＳのより軽い表現型が、ＧＨＲにおけるあまり破壊的でない突然変異によって引き起こされるかどうか、また、ＩＳＳ集団における循環ＧＨＢＰレベルの低下が部分的ＧＨＩＳのマーカーとしての役割を果たし、ＧＨＲにおける突然変異を示すことができることを調べるために、ＧＨＢＰレベルが平均より２ＳＤ以上低いＩＳＳ患者から成る部分集団を選別し、ＧＨＲ遺伝子のコード領域の突然変異を分析した。一本鎖コンホメーション分析（ＳＳＣＡ）およびＰＣＲ産物の電気泳動移動度を変えることによる配列分析を使用して、14人中4人の患者の受容体の細胞外ドメインに突然変異を検出した。被検者ＮＣＧＳの二つのサブ実験から、以下の規準のいくつかまたは全てを有する１４人のＩＳＳ患者を選別した。すなわち、１）身長ＳＤＳ＜-2.5；２）血清ＩＧＦ−Ｉレベルが正常な平均レベル以下（酸−エタノール抽出により測定、Nichol s Institute）；３）１種以上の誘発試験時の血清ＧＨ＞10μg/L；４）最大血清ＧＨＢＰＳＤＳ＜-2（Carlssonら、J.C.E.M.，73，前出に記載されたＬＩＦＡによって測定、または患者１の場合は、Amitら、J.C.E.M.，71: 474-479(1990) に記載された木炭分離によって測定）；５）治療前の成長速度＜４cm/年；および６）根元的な全身病がないことである。12時間ＧＨ平均（Hybritechアッセイ）、ＧＨ治療１年目の成長速度およびＩＧＦＢＰ−３レベル（Endocrine Scienc es）などの他の情報も、利用できる場合は考慮した。ＮＣＧＳデータベースから患者を選別するために使用した得点表を表VIIIに示す。最高得点12のうち、患者の得点は4〜10であり、ＧＨＢＰＳＤＳは全員-2以下であった。二人の患者（＃２および＃４）の関係項目を調べて、突然変異の遺伝可能性を確認した。身長ＳＤＳが正常な範囲（-2.0〜＋3.5ＳＤＳ）内またはそれ以上である24人の正常な成人ボランティアを対照とした。集団の違いの統計的有意性をFischer Exact テストによって計算した。ｈＧＨで治療した患者（表IXの「ＧＨ反応性」の欄で「na」と表示していない患者）にProtropinという商標のＧＨ（患者２を除く全員に治療した）およびNut ropinという商標のＧＨ（患者２）を、約0.3mg/kg/週で少なくとも６ヵ月間皮下注射した。サンプルの調製およびＰＣＲ増幅各患者の1.5〜10mLの血液から、LeucoPREP細胞分離管（Becton Dickenson）またはLSMリンパ球分離媒体（Organon Teknika）を使用してリンパ球を単離し、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）によって形質転換した。Katzら、J．I nfect．Dis.，160: 589-598(1989)。QIAamp血液キット（Qiagen Inc．）を使用して、ＥＢＶ−形質転換したリンパ球から、または新鮮リンパ球から直接、ＤＮＡを単離した。コードするエキソン２〜９およびそれらの隣のスプライス部位に対して特異的なＧＨＲのゲノム断片を、イントロンプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。エキソン10のコード部分は、その断片の大きさを400bp未満に制限するために、３つの重複する断片で増幅した。イントロンプライマーの位置および配列は以下の通りである。ＤＮＡ（100ng）を、0.2mMのｄＮＴＰ、２単位のＴａｑポリメラーセ（Perk i n Elmer Corp.）、1.5mMのＭｇＣｌ₂、７μCiの³³Ｐ−α−ｄＡＴＰ（duPont Ne w England Nuclear）および40サイクル（94℃で１分、55℃で１分、72℃で１分で、各サイクルにつき５秒加える。）に対する15ngの各プライマーを含む50μL 中で増幅した。最終サイクルの後に、94℃で１分おき、30分かけて22℃に冷却した。ＰＣＲ産物を２%アガロースゲルで電気泳動にかけて不純物混入のチェックをし、断片の大きさを確認した。全ＲＮＡ（５〜10μg）を、酸フェノール法（ChomczynskiおよびSacchi，Anal ．Biochem.，162: 156-159(1987)）によりＥＢＶ−形質転換リンパ球から調製し、ランダムプライマー（Promega Corp．）を使用して逆転写（Perkin Elmer Cor p.，RTキット）を行なった。ＧＨＲｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、ネスティッド(n ested)ＰＣＲ法により行なった。エキソン３〜10は、３つの断片で増幅した。ネスティッドプライマーを使用して、より小さい断片（220〜415bp）を作った。サイクル条件は以下の通りであった。すなわち、95℃で３分間変性した後、95℃で１分、55℃で１分、72℃で１分を30サイクル、最後に72℃で10分であった。ネスティングプライマー法で使用したプライマーの配列は以下の通りであった。３個のＲＴ−ＰＣＲ断片（５’→３’）内部ネスティッドＰＣＲ産物：内部ネスティッドＰＣＲ産物：一本鎖コンホメーション分析ＳＳＣＡを、各ＰＣＲ反応で得た産物に対して行なった。２〜４μLの反応混合物を同量の充填緩衝液と混合し、100℃で２分間変性し、氷上に置いた。サンプルを室温で、0.5 x MDEゲル（AT Biochem Inc．）中、１%または10%のグリセロールを使用し、製造者の指示に従って電気泳動にかけた。ゲルを濾紙上で脱水し、オートラジオグラフィーにかけた。ＤＮＡ配列分析ＳＳＣＡにより異常バンドとして検出された突然変異を配列分析により確認した。ＰＣＲ産物の直接サイクル配列分析を、標準プロトコールに従って増幅プライマーまたは上述した内部（ネスティッド）プライマーおよびABI 373配列分析機（Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corp．）での色素−ターミネーター化学を用いて、あるいは、Ampli-Cycleキット（Perkin Elmer Corp.）および³³Ｐ−α−ｄＡＴＰ（duPont New England Nuclear）を使用して行なった。さらに、突然変異を含む疑いのある各断片からの多重サブクローンをM13mp19 またはpBluescript KS＋で得て、M13-21色素−プライマーでシークエンシングを行い、ABI 373配列分析機で分析した。ＧＨ結合アッセイＧＨの突然変異体受容体への結合を調べるために、突然変異を含んでいる組換えＧＨＲ細胞外ドメインを操作した。これは、オリゴヌクレオチド仲介による部位特異的突然変異誘発、大腸菌での発現および精製を使用して行なった。Clacks onおよびWells，Science，267: 383-386(1995); Fuhら、J．Biol．Chem.，265: 3111-3115(1990); Bassら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88: 4498-4502(1991) 。ＧＨに対する親和性を、トレーサーとして放射性−ヨード化ＧＨを使用し、突然変異体受容体からのＧＨの競合置換によって測定した。Spencerら、J．Biol． Chem.，263: 7862-7867（1988）。解離定数(Kds)は、スキャッチャード分析により計算した。抗−ＧＨＲモノクローナル抗体(Mab)５（Barnardら、Endocrinolog y，115: 1805(1984); Cunninghamら、Science，254:821（1991））を使用してＧＨＲ：ＧＨ複合体を沈殿させた。Mab５は、受容体のホモ二量化を防ぎ、その結果、最初の1:1相互作用に対するKdを、二量化の影響を受けることなく測定することができる。ClacksonおよびWells、前出; Cunninghamら、前出。結果選択規準のコア得点が４以上であるＩＳＳの子供14人を選別した（表VIII）。これらの患者の臨床データを表IXに示す。これらの患者の機能性血清ＧＨＢＰが低いために、ＰＣＲ増幅およびＳＳＣＡを組み合わせることにより、ＧＨＲ遺伝子の微妙な突然変異の研究を行なった。移動度を変えると移動する断片は、４人の患者：１、２、４および７で認められたが、24人の正常な対照のＧＨＲ遺伝子座では、エキソン６および10の既知の多形性を除いて、異常は検出されなかった（Leungら、Nature，330: 537-543(1987 ); Godowkskiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86: 8083-8087(1989)）。すなわち、ＧＨＢＰが減少したＩＳＳ患者のＧＨＲ遺伝子における変化が、正常な集団と比較してかなり増加した（ｐ＝0.014）。突然変異を有する疑いのあるゲノムＰＣＲ断片の各々をシークエンシングして、異常バンドを引き起こす変化を解析した。図８〜11参照。また、患者１〜９をＲＴ−ＰＣＲによって分析すると（エキソン３〜10）、全断片は、スプライシングの変化を除いて、予測した大きさであった患者４は、エキソン４および６またはこの領域をカバーするＲＴ−ＰＣＲ断片を分析すると、ＳＳＣＡゲル上に異常バンドを示した。ＤＮＡをシークエンシングすると、その子供は成熟タンパク質の44番目の位置でグルタミン酸の代わりにリジンが導入される（E44K）、エキソン４でのグアノシン−アデノシン変異（図８、対立遺伝子２および表Ｘ）、および、残基161でアルギニン−システイン置換を引き起こす（R161C）、エキソン６でのシトシン−チミジン変異（図８、対立遺伝子１および表Ｘ）に対する複合ヘテロ接合体であることが分かった。エキソン４〜エキソン６に及ぶＲＴ−ＰＣＲ産物をサブクローン化し、シークエンシングした。二つの突然変異が種々のサブクローンで見いだされた。すなわち、二つの対立遺伝子の各々に一つの突然変異が見いだされた。さらに、家族の遺伝子分析は、エキソン４の変化がその家族の父側から受け継がれ、エキソン６の変異は母側から受け継がれたものであることを示した。父親および父方祖母はともに、エキソン４に対して祖先と同じＳＳＣＡバンドシフトを示し、シークエンシングから、彼らはともに同一のE44K突然変異を有することが確認された。同様に、ＳＳＣＡおよびシークエンシングから、母親および母方のおじに、R161C変化を引き起こすエキソン６の変異が存在することが確認された。患者４は、成長速度のかなりの増加を伴う外因性ＧＨには反応しなかった。彼の治療前の成長速度は 5.5cm/年であり、ＧＨ治療時の成長速度は5.8cm/年であった。 1:1複合体における受容体のＧＨ結合能に対するこれらのアミノ酸置換の影響を、大腸菌で発現させた突然変異体受容体細胞外ドメインを使用して調べた。残基E44は、ＧＨとの直接接触に関与し（deVosら、Science，255: 306-312(1992) ）、アラニンへの突然変異はリガンド結合を低下させる（Kd_MUT／Kd_WT＝17.4）。ClacksonおよびWells，前出。44番目にリジンが導入されると、野生型受容体細胞外ドメインに関して、結合が330倍低下することが分かった（表Ｘ）。これに対して、残基161は、ヒトＧＨ：ＧＨＲ複合体のどの分子間の界面にもなく（D eVosら、前出）、そのシステインへの突然変異は、結合の2.1倍の減少を引き起こした（表Ｘ）。患者２のＤＮＡは、エキソン５ゲノムＰＣＲ断片により、ＳＳＣＡバンドシフトを示した。ＤＮＡシークエンシングにより、ｃＤＮＡの418番目のチミジン− アデノシン変異が確認され、その変異により、システイン122の場所に停止コドンが導入された（C122X）。図９参照。患者２の全エキソンからの多重ゲノムＰＣＲ産物のサブクローン化およびシークエンシングにより、ゲノムＰＣＲ断片の直接シークエンシングと同様、野生型配列のみが得られた。この患者が別の突然変異を有するという可能性は、検出することができなかったので、低い。患者２の母親および父親の両方のＤＮＡを分析すると、その患者は、停止コドン突然変異を母親から受け継いだことが示された。治療１年目に彼の成長速度は4.1cm/年から5.7cm/年に増加した（表IX）。これは、外因性ＧＨに反応したことを示す。外因性ＧＨによる２年目の治療で、10.3cm/年という思春期に関連する急成長が生じた。患者１および７はともに、ヘテロ接合体の１個の塩基対変化を有し、これは、一方の対立遺伝子のＧＨＲにアミノ酸変化を引き起こす。患者１では、エキソン７ゲノムＰＣＲ断片に異常バンドが認められた。塩基対686のグアノシンからアデノシンへの変異により、アミノ酸211のアルギニン残基がヒスチジンに置き換わった（R211H）。図10、対立遺伝子２を参照。患者２はＧＨに反応した。彼はＩＧＦ−Ｉ発生テストで陽性であった（ＩＧＦ−Ｉのベースラインは56μg/Lであり、１回の注射で0.1単位ＧＨ／kgを投与する治療を４日間行なった後のピークは179μg/Lに上昇した。）さらに、彼の成長速度は、0.03mgＧＨ/kg/日の投与で2.0cm/年から3.0cm/年に増加し、0.05mg ＧＨ/kg/日の投与で6.0cm/年に増加した（表IX）。患者７は、同様に、１個の対立遺伝子の変化により影響を受ける。塩基対726 のグアノシンからシトシンへの変異により、アミノ酸224の野生型グルタミン酸の場所にアスパラギン酸が導入される(E224D)。図11、対立遺伝子２を参照。患者７はＧＨによる治療を行なわなかった。ＧＨＲの細胞外ドメインのＳＳＣＡでも直接シークエンシングでも、これらの患者では、第二の変化は検出されなかった。残基R211をどの分子の界面からも離れた受容体表面でさらすと（DeVosら、前出）、ヒスチジン突然変異体が、野生型受容体に匹敵する親和力（Kd_MUT／Kd_WT ＝1.4）でタンパク質を産生した。しかし、突然変異体タンパク質の発現レベルは著しく減少し、発現レベルは、野生型の約10^-4倍であった。Amselemら、Hum． Mol．Genet.，２: 355-359（1993）により報告されたアルギニン211がグリシンＬＳ−関連突然変異では、検出できないレベルでの発現となる。ＧＨに対する受容体親和性に対する同様の影響は、R224D置換に対しても認められた（表Ｘ）。保存性E224D置換は、ＧＨ結合を乱さないと予想された。実際、アスパラギン酸による置換（Kd_MUT／Kd_WT＝1.6）は、親和性にほとんど影響を及ぼさないことが分かった。結論ＩＳＳの子供のサブグループは、低身長の病因に部分的ＧＨＩＳを関連させる表現型を有する。ＩＧＦ−Ｉレベルがより低くてＧＨ濃度がより高いとともにＧＨＢＰレベルはより低いということによって例証されるように、ＧＨＲシグナル伝達の低下という本発明で主張した仮説は、低ＧＨＢＰおよび低ＩＧＦ−Ｉに対して選別されたＧＨ欠損のない低身長の患者におけるＧＨＲ突然変異の同定によって確認された。正常な24人の対照は、誰もＳＳＣＡによって検出できる配列変化を示さなかったが、選別された24人のＩＳＳ患者のうち４人は、１個の塩基対変化が確認された（ｐ＝0.014）。ＳＳＣＡは、モデルシステムの既知突然変異を約80%検出することができるので（Vidal-PuigおよびMoller，Biotechniques， 17: 490-496(1994); Ravnik-Glavacら、Hum．Mol．Genet.，３: 801-807（1994 ））、変化が確認されなかったこれらのＩＳＳ患者に別の突然変異が存在する可能性がある。ＧＨＲ突然変異のある４人のＩＳＳ患者のうち２人は、外因性ＧＨに反応した（表IXの患者１および２）。突然変異の存在およびＧＨに対する反応は、これらの患者が機能障害ＧＨＲにより部分的にＧＨ無感覚である可能性を示唆している。理論に縛られないならば、患者４がＧＨに反応できないことは、恐らく、ＧＨＲ対立遺伝子に含まれる二つの突然変異の性質を反映していると考えられる。一つの変化はＧＨに対する受容体の親和性を330倍低下させ、これは恐らく、この受容体を生理学的または薬理学的レベルのＧＨに対して無感覚にしている。第二の変化であるR161Cの影響は分からないが、この突然変異は苛酷であり、ホモ接合体状態では完全なＧＨＩＳを引き起こす。Amselemら、前出。４番目の患者（患者７）はＧＨによる治療を行なわなかったが、ＧＨ反応性が、ＬＳに見られる完全ＧＨＩＳから、ＬＳ症候群の表現型の特徴はないが標準用量のＧＨには反応しない、かなり無感覚なＩＳＳ患者、次いで、標準的なＧＨ治療に反応する部分的にＧＨＩＳのあるＩＳＳ患者を通って、最後に正常な表現型まで連続して伸びているという本発明の結果から明らかである。患者４は、E44KおよびR161C置換に対して複合ヘテロ接合体であり、両親は各々、二つの突然変異の一方に対してヘテロ接合体である。両親および祖父母の身長は皆、成人集団の正常な範囲内にあるが、１個の突然変異を保有していることが分かっている人の身長は平均以下である。患者２は、122番目の突然変異を停止するためのシステインに対してヘテロ接合体であり、従って、恐らく不安定な末端切断型タンパク質を産生する一つの対立遺伝子を有する。彼の母親は同じ突然変異を保有する。患者２は現在19歳であり、この突然変異の存在により、母親（身長ＳＤＳ-1.4）よりも厳しい影響を受ける（身長ＳＤＳ-3.2）。理論に縛られないならば、祖先は、構造的に正常なＧＨＲ対立遺伝子の発現、またはＧＨ軸における別の工程に影響を及ぼすまだ不確定の突然変異を、その父親（身長ＳＤＳ-1.4）から受け継いだかもしれない。家族２は、ともにＧＨＲ遺伝子座の一つの対立遺伝子に二つの突然変異を有した、疑似ＬＳ患者および影響を受けなかった母親に似ている。Kouら、J.C.E.M.，76:54-59(1993)。この患者と患者２との類似性は、一つの理論において、両者は、第二の不確定な突然変異保有者である可能性を示唆しており、それは、いずれかのエキソンに突然変異が欠けているにもかかわらず、インシュリン受容体ｍＲＮＡレベルの減少が認められている何人かのインシュリン無感覚患者に類似している（Taylorら、Endocrine Rev.，13: 566-595(1992)）。他の二人の患者は、アミノ酸置換（患者１のR211Hおよび患者７のE224D）をもたらすヘテロ接合体突然変異を有する。患者１の両親の身長は、ともに成人集団の正常な範囲内であった。Hamillら、Am．J．Clin．Nutrition，32: 607-629(19 79)。同様に、患者７の父親の身長ＳＤＳは-0.43であり、母親の身長ＳＤＳは+1 .4であった。ＬＳは、常染色体劣性症である。影響を受けた人は通常、血族の両親から同じ突然変異を受け継いでいる。ＧＨＲ突然変異に対するヘテロ接合体（ＬＳ患者の両親および兄弟）は、成長異常が少しある可能性がある。Laron，The Endocrino logist，３: 21-28(1993); Rosenbloomら、Acta Paediatr.，Suppl．399: 125-1 27(1994)。ヘテロ接合体の約半分は、ＧＨＢＰレベルが年齢別平均より２ＳＤ以上低い。Aguirreら、Horm．Res.，34: 4-8(1990); Laronら、Acta Endocrinol. ，121: 603-608（1989）。さらに、Laron，The Endocrinologist（前出）は、ＬＳ患者の両親および臨床的に正常な兄弟の身長が、典型的には、性別および種族別50%パーセンタイル以下であると報告した。理論に縛られないならば、身長ＳＤＳが-2未満となる部分的ＧＨＩＳは、まだ不確定の修飾因子遺伝子座で特定の遺伝子型の影響を受けるＧＨＲのヘテロ接合体突然変異保有者で発生し、あるいは、何人かのインシュリン無感覚患者のヘテロ接合体インシュリン受容体突然変異に対して提案されているように、変化が負の優性表現型を付与する場合に発生すると考えられる。４人の患者で確認された５個の突然変異（E44K、C122X、R161C、R211H、E224D ）は、受容体の細胞外ドメインに限られる。E44K置換は、ＧＨに対する親和性を 330倍低下させ、R161，R211またはE224残基の変化はリガンド結合に関して微妙な影響を示した（表Ｘ）。残基R211は、ＧＨＲのリガンド結合部位および二量化部位の両方に対して遠位である。しかし、サイトカイン受容体スーパーファミリー全体にわたって保存される「WS−様」モチーフには隣接している。WS−様モチーフの残基は、R211 および他のアミノ酸側鎖でぎっしり詰まっており、芳香族および塩基性の側鎖が交互に積み重なっている。残基E224は、WS−様モチーフの可変残基に対応する。R211と同様、ＧＨＲ分子上の既知結合部位の外側にあり、ＧＨ結合は突然変異によってあまり変わらない（表Ｘ）。培養中に哺乳類の細胞で発現したE224A置換は、細胞レベル以下の局在化を変えた。Baumgartnerら、J．Biol．Chem.，269:29094-29101（1994）。全受容体画分の増加が、核に近接する位置で認められた。これが、新しく合成された受容体の蓄積または受容体のインターナリゼーションの増加を意味するかどうかは分からない。理論に縛られないならば、E224D突然変異が同様の影響を引き起こすとすると、誤った処理によって、細胞表面上の受容体数が減少し、血清ＧＨＢＰレベルが付随して減少する可能性がある。この研究により、ＧＨに対して部分的に無感覚であることを示唆する臨床パラメーターによりＩＳＳの子供のサブグループを選別すると、ＧＨＲ機能に影響を及ぼすと考えられるＧＨＲ突然変異を保有する患者と一致することが分かる。調査した患者は、循環する機能性ＧＨＢＰの減少に基づいて選別したので、突然変異は、リガンド結合に直接影響を及ぼし（E44K）、または細胞表面の受容体の利用性の低下を引き起こし（R161C、R211HおよびE224D）、それらが部分的なＧＨＩＳ症候群の一因となるにちがいない。実際、ＧＨＲ突然変異を有する、外因性ＧＨで治療した３人のＩＳＳ患者のうち２人は、ＧＨに反応する部分的ＧＨＩＳであった。実施例Ｖ平均身長が正常な身長の−２ＳＤより低く、ＧＨＢＰレベルが正常レベルより少なくとも２ＳＤ少なく、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが正常な平均レベル以下であり、ＧＨの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも正常値であると診断された、５〜12歳の80人の思春期前の子供たちを以下のように治療した。20人はＩＧＦ−Ｉのみで、20人はＧＨのみで、20人はＧＨおよびＩＧＦ−Ｉで、20人はプラシーボで治療した。薬物を単独投与する場合、ＩＧＦ−Ｉは、150μg/kg/日の用量で皮下注射により１日に１回投与し、ＧＨは、0.70mg/kg/週の用量で皮下注射により１日に１回投与する。薬物を併用する場合、ＩＧＦ−Ｉは、75μ g/kg/日の用量で皮下注射により１日に１回投与し、ＧＨは、0.35mg/kg/週の用量で皮下注射により１日に１回投与する。ＩＧＦ−Ｉ組成物は、（ａ）20mMの酢酸ナトリウム緩衝液、2.5mg/mL(0.25％)のフェノール、45mg/mLのマンニトール、ｐＨ5.0中に10mg/mLのＩＧＦ−Ｉ；または（ｂ）50mMの酢酸ナトリウム緩衝液、2.5mg/mLのフェノール、5.84mg/mLのＮａＣｌ、および９mg/mLのベンジルアルコール、ｐＨ5.4中に10mg/mLのＩＧＦ−Ｉのいずれかである。ＧＨ組成物は、Ge nentech，Inc．から市販されているNutropinまたはProtropinという商標のＧＨである。患者をこのプロトコールによって６ヵ月間治療する。各患者の身長の増加を測定する。この調査では、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＨまたはその併用により、全ての患者の成長速度が、プラシーボにより治療した患者と比較して、増加すると予想される。臨床試験の別の計画は次の通りである。同じ子供たちのグループおよびサブグループを0.35mg/kg/週または0.70mg/kg/ 週のＧＨのみで、または75、100、150または200μg/kg/日のＩＧＦ−Ｉのみで、同じ方法により治療する。併用治療に対しては、比較のためのプラシーボを使用し、または使用しないで、ＧＨを0.35mg/kg/週で使用し、ＩＧＦ−Ｉを75または 100μg/kg/日で使用する。

【手続補正書】【提出日】１９９６年１１月１５日【補正内容】請求の範囲１．身長が年齢および性別のわりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群(Laron syndrome)ではないヒト患者の成長速度を高めるための、有効量の成長ホルモンおよび製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。２．成長ホルモンの有効量が約０．２ｍｇ／ｋｇ／週より高いものである、請求項１に記載の医薬組成物。３．成長ホルモンの有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ／週より高いものである、請求項１に記載の医薬組成物。４．成長ホルモンの有効量が約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に等しいかまたはそれより高いものである、請求項１に記載の医薬組成物。５．１日に１回投与する、請求項１に記載の医薬組成物。６．皮下注射により投与する、請求項５に記載の医薬組成物。７．ｐＨ７．４〜７．８で製剤化する、請求項１に記載の医薬組成物。８．身長が年齢および性別のわりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群ではないヒト患者の成長速度を高めるための、有効量のＩＧＦ−Ｉおよび製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物。９．ＩＧＦ−Ｉの投与量が５０〜２４０μｇ／ｋｇ／日の用量である、請求項８に記載の医薬組成物。 10．１日に１回または２回投与する、請求項９に記載の医薬組成物。 11．皮下注射により投与する、請求項１０に記載の医薬組成物。 12．ｐＨ５〜６で製剤化する、請求項８に記載の医薬組成物。 13．身長が年齢および性別のわりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群ではないヒト患者の成長速度を高めるための、有効量のＩＧＦ−Ｉおよび成長ホルモンを製剤学的に許容される担体と共に含んでなる医薬組成物。 14．皮下注射により投与する、請求項１３に記載の医薬組成物。 15．前記患者が異質ＧＨＲ遺伝子欠損を有する、請求項１、８または１３に記載の医薬組成物。 16．身長が年齢および性別のわりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群ではないヒト患者に使用するというラベルを付した、有効量の成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの組合せおよび製剤学的に許容される担体を含んでなる、前記患者の成長速度を高めるための医薬品。 17．身長が年齢および性別のわりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群ではないヒト患者の成長速度を高めるための、有効量の成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの組合せおよび製剤学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物の製造における成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの組合せの使用。 18．(a)有効量の成長ホルモン、ＩＧＦ−Ｉまたはそれらの組合せおよび製剤学的に許容される担体、および(b)身長が年齢および性別のわりに標準より−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であることを特徴とする部分的成長ホルモン不感受性症候群を有するが、ラロン症候群ではないヒト患者に使用することを明記したラベル、を含んでなる、前記患者の成長速度を高めるための医薬品の製造における成長ホルモン、ＩＧＦ− Ｉまたはそれらの組合せの使用。【図１】【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ゲサンドハイト，ネイルアメリカ合衆国 94022 カリフォルニア州ロスアルトス，ポートラコート 250番地 (72)発明者ゴッダード，オードリーアメリカ合衆国 94133 カリフォルニア州サンフランシスコ，メイソンストリート 1920番地

Claims

【特許請求の範囲】１．部分的成長ホルモン不感受性症候群を伴うが、ラロン症候群(Laron syndrom e)を伴わないヒト患者であって、身長が年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準である前記患者に、有効量の成長ホルモンを投与することを含んでなる前記患者の成長速度を増す方法。２．成長ホルモンの有効量が約０．２ｍｇ／ｋｇ／週より高いものである、請求項１に記載の方法。３．成長ホルモンの有効量が約０．２５ｍｇ／ｋｇ／週より高いものである、請求項１に記載の方法。４．成長ホルモンの有効量が約０．３ｍｇ／ｋｇ／週に等しいかまたはそれより高いものである、請求項１に記載の方法。５．成長ホルモンを１日に１回投与する、請求項１に記載の方法。６．成長ホルモンを皮下注射により投与する、請求項５に記載の方法。７．成長ホルモンを約７．４〜７．８のｐＨで製剤化する、請求項１に記載の方法。８．部分的成長ホルモン不感受性症候群を伴うが、ラロン症候群を伴わないヒト患者であって、身長が年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準である前記患者に、有効量のＩＧＦ−Ｉを投与することを含んでなる前記患者の成長速度を増す方法。９．ＩＧＦ−Ｉの投与量が約５０〜２４０μｇ／ｋｇ／日の用量である、請求項８に記載の方法。 10．ＩＧＦ−Ｉを１日に１回または２回投与する、請求項９に記載の方法。 11．ＩＧＦ−Ｉを皮下注射により投与する、請求項１０に記載の方法。 12．ＩＧＦ−Ｉを約５〜６のｐＨで製剤化する、請求項８に記載の方法。 13．部分的成長ホルモン不感受性症候群を伴うが、ラロン症候群を伴わないヒト患者であって、身長が年齢および性別のわりに標準より約−２標準偏差未満低く、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低く、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低く、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準である前記患者に、ＩＧＦ−Ｉおよび成長ホルモンを有効な組合せ量で投与することを含んでなる前記患者の成長速度を増す方法。 14．ＩＧＦ−Ｉおよび成長ホルモンを皮下注射により一緒に投与する、請求項１３に記載の方法。 15．非ＧＨ欠損性の低身長を伴うが、ラロン症候群を伴わないヒト患者の成長速度を増す方法であって、前記患者の身長が年齢および性別のわりに標準より約− ２標準偏差未満低いか、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低いか、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低いか、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であるかを検査し、もしそうであれば、前記患者の成長速度を高めるのに有効な量の成長ホルモンを前記患者に投与することを含んでなる方法。 16．非ＧＨ欠損性の低身長を伴うが、ラロン症候群を伴わないヒト患者の成長速度を増す方法であって、前記患者の身長が年齢および性別のわりに標準より約− ２標準偏差未満低いか、高親和性成長ホルモン結合タンパク質の血清レベルが標準レベルより少なくとも２標準偏差低いか、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルが標準平均レベルより低いか、そして成長ホルモンの平均または最大刺激血清レベルが少なくとも標準であるかを検査し、もしそうであれば、前記患者に有効量の成長ホルモンを投与することを含んでなる方法。