ES2345874T3 - Uso de glp-2 en combinacion con otro agente terapeutico en problemas relacionados con los huesos. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de pérdida de hueso por la inhibición de resorción ósea que comprende una cantidad efectiva de (a) una molécula GLP-2, que es un péptido-2 tipo glucagón de vertebrado (GLP-2), o un análogo del mismo que constituye un agonista de receptor de GLP-2 donde, en la secuencia de amino ácido de un GLP-2 de vertebrado, uno o más amino ácidos han sido eliminados, o uno o más amino ácidos han sido agregados, o uno o más amino ácidos han sido sustituidos, y (b) otro agente terapéutico.

Description

Uso de GLP-2 en combinación con otro agente terapéutico en problemas relacionados con los huesos.

I. Campo de la invención

La presente invención se relaciona con composiciones para uso en prevención y tratamiento de problemas relacionados con los huesos usando una molécula GLP-2 o análogo de GLP-2 en combinación con otro agente terapéutico.

II. Antecedentes de la invención Glucagón y Péptidos Relacionados

El glucagón es una hormona que es liberada en respuesta a niveles bajos de glucosa y estimula la producción de glucosa. Por lo tanto, juega un papel en contrarrestar la insulina en la homeostasis de la glucosa en sangre (Unger y Ori, Gucagon in Diabetes Melitus, 4th edition, Elsevier p. 104-120). El glucagón surge del procesamiento post-translacional de una molécula precursora mas grande, proglucagón.

El proglucagón es producido en las células \alpha del páncreas como también en las células L enteroendócrinas del intestino. Está sujeto a procesamiento diferencial en los diferentes tejidos en los cuales es expresado. Por ejemplo, el glucagón es selectivamente eliminado del precursor en el páncreas mientras dos péptidos mas pequeños, el péptido-1 tipo glucagón (GLP-1) y el péptido-2 tipo glucagón (GLP-2), son producidos en el intestino. GLP-1 y GLP-2 consisten de residuos de amino ácidos 78-107 y 126-158 de proglucagón respectivamente (Bell et al 1983, Nature 304: 368-371; Buhl et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 8621; Nishi y Steiner, 1990, Mol. Endocrinol. 4:1192-1198; Irwin y Wong, 1995, Mol. Endocrinol. 9:267-277).

El glucagón y el GLP-1 tienen actividades biológicas que compiten. El GLP-1 estimula la secreción de insulina, absorción de glucosa, y formación de cAMP en respuesta a la presencia y absorción de nutrientes en el intestino, mientras que el glucagón aumenta la salida de glucosa del hígado, del tejido de músculo esquelético, y tejido adiposo durante periodos de ayuno (véase, por ejemplo, Mojsov, 1992, Int. J. Pep. Prof. Res. 40: 333-343; Andreasen et al., 1994, Digestion 55:221-229). Receptores específicos de GLP-1 han sido identificados (Thorens, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. 89:8641-8645) que son diferentes del receptor de glucagón (Jelinek et al., 1993, Science 259: 1614-1616).

El GLP-2 es un fragmento de amino ácido 33 de proglucagón. Varias formas vertebradas (incluyendo humana) de GL-2 han sido reveladas. El GLP-2 tiene actividad intestinotrófica (Patente U. S. No. 5,834,428).

Cuando es administrada exógenamente, el GLP-2 puede producir marcado aumento en la proliferación de epitelio de intestino delgado en ratones, sin ningún efecto secundario aparente (Drucker et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:7911-7916). Además, GLP-2 aumenta el índice de transporte máximo de D-glucosa a través de la membrana basolateral intestinal (Cheeseman y Tseng, 1996, Am. J. Phys. 271:G477-G482). GLP-2 puede actuar a través de un receptor G-proteína-emparejado (Munroe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96:1569-1573).

Problemas

La osteoporosis es la forma más común de problema metabólico óseo. Afecta más de 25 millones de personas en los Estados Unidos y causa más de 1.3 millones de fracturas óseas cada año, incluyendo aproximadamente 500,000 fracturas espinales, 250,000 fracturas de cadera y 240,000 fracturas de muñeca. Las fracturas de cadera son la consecuencia más seria de osteoporosis, con 5-20% de los pacientes muriendo dentro de un año de ocurrida la fractura y más del 50% de los sobrevivientes siendo incapacitados.

La osteoporosis es comúnmente observada en mujeres post-menopáusicas, pero también ocurre en individuos viejos y jóvenes. La enfermedad es caracterizada por baja masa ósea y una deterioro del tejido óseo, con un consecuente aumento en la fragilidad ósea y susceptibilidad a fracturas. Aunque la etiología de la osteoporosis no es conocida, su inicio está asociado con varios factores tales como edad avanzada, nivel hormonal disminuido, y niveles de calcio disminuidos. La osteoporosis puede ocurrir en hombres viejos cuando los niveles de andrógenos caen. Los andrógenos juegan un papel importante en la formación/mantenimiento de hueso y promueven la síntesis de colágeno, lo que provee un depósito de calcio y el fósforo. La osteoporosis también puede ser debida a una secreción aumentada de la hormona paratiroides, la que reduce la formación de hueso y aumenta la absorción de hueso. La osteoporosis también puede ser causada por degeneración renal, la cual reduce la actividad de la vitamina D hidroxilasa-activadora, disminuyendo la absorción intestinal de calcio, y precipitando la pérdida de matriz ósea. La movilización de almacenes de nutrientes en el hueso puede ser alcanzada estimulando la resorción osteoclástica de hueso. Igualmente, la actividad de resorción puede ser invertida aumentando la disponibilidad dietética de nutrientes.

Se ha mostrado que la aportación dietética de calcio regula el metabolismo óseo. Se mostró recientemente que la toma oral de glucosa disminuye la resorción de hueso, resultando en una disminución completamente expresada dentro de dos horas después de la administración de glucosa (GB Aplicación de Patente No. 0007492. 2). Ésta respuesta a toma de glucosa es independiente de sexo y edad. Un efecto comparable fue también demostrado después de la administración de proteína (comunicación no publicada).

Los problemas relacionados con los huesos son caracterizados por pérdida ósea resultando de un desbalance entre la resorción de hueso y la formación de hueso. El potencial para la pérdida ósea está directamente relacionado al índice normal óseo de resorción y puede llegar a ser de más de 3% por año en humanos inmediatamente después de la menopausia.

En el momento existen dos tipos principales de tratamiento farmacéutico para osteoporosis, ambos enfocados en reducción de resorción ósea. El primero la administración de un compuesto anti-resorción. Por ejemplo, estrógeno ha sido usado como un agente anti-resorción para reducir fracturas. Sin embargo, el estrógeno falla en restaurar hueso a los niveles de aquel en un esqueleto de un joven adulto. Además, terapia con estrógeno a largo plazo ha sido implicada en una variedad de problemas, incluyendo un aumento en el riesgo de cáncer uterino, cáncer endometrial, y posiblemente cáncer de seno (Persson et al., 1997, "Hormone replacement therapy and the risk of breast cancer. Nested case-control study in a cohort of Swedish women attending mammography screening", Int. J. Can. 72:758-761). Por estas razones, muchas mujeres evitan tratamiento de osteoporosis, con estrógeno.

Un segundo tipo de terapia farmacéutica para tratar osteoporosis usa un agente que inhibe la resorción de hueso como también promueve la formación de hueso y aumenta la masa ósea. Estos agentes, tales como alendronato, típicamente restituyen la cantidad de hueso a aquel de un esqueleto establecido pre menopáusico. Sin embargo, la administración de alendronato puede causar efectos secundarios indeseados, por ejemplo, ulceración gástrica (Graham et al. 1999, Aliment. Pharmacol. Ther. 4: 515-9).

Los riesgos significativos asociados con las terapias farmacéuticas disponibles actualmente (tales como estrógeno y alendronato) resaltan la necesidad de desarrollar terapias más seguras para tratar o prevenir osteoporosis y otros problemas relacionados con el hueso. Por lo tanto, hay una necesidad para métodos para tratar o prevenir un problema óseo, tal como osteoporosis, que no tenga los riesgos anteriormente mencionados.

WO 01/41779 revela administrarle a un paciente de quimioterapia primero un activador de receptor GLP-2 tal como h-[Gly2]-GLP-2 para inhibir la apoptosis inducida por quimioterapia seguida después de aproximadamente una semana por un régimen quimioterapéutico.

WO 96/32414 revela la actividad de GLP-2 como un factor de crecimiento de tejido gastro-intestinal teniendo efectos en el crecimiento de islotes de intestino delgado y páncreas.

WO 97/31943 revela que GLP-2 tiene un efecto supresor de apetito cuando es administrado periféricamente y es por lo tanto identificado como un factor de saciedad.

Francis R.M. "Bisphosphonates is the treatment of osteoporosis in 1997: a review "Current Therapeutic Research, Vol. 58, No. 10, October 1997 (1997-10) G56-678 identifica varios tratamientos de biofosfonato para osteoporosis.

WO 98/52600 revela GLP-2 y compuestos relacionados en combinación con varias hormonas péptidas (IGF-1, IGF-2, GH) para mejorar el crecimiento de tejido gastrointestinal superior.

WO 02/06602 revela el uso de GLP-2 para el tratamiento de enfermedades intestinales y obesidad.

WO 98/24814 revela el uso de GLP-2 para el tratamiento de mucositis.

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3. Resumen de la invención

La presente invención se relaciona con la prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con los huesos para el uso de GLP-2 o un análogo del mismo de acuerdo con la presente reivindicación 1 con uno o más agentes terapéuticos adicionales.

La invención por consiguiente provee en un primer aspecto una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de

(a)

Una molécula GLP-2, la cual es un péptido-2 tipo glucagón de vertebrados (GLP-2), o un análogo del mismo que constituye un receptor GLP-2 agonista donde, en la secuencia de amino ácido de un GLP-2 vertebrado, uno o más amino ácidos han sido eliminados, o uno o más amino ácidos han sido agregados, o uno o más amino ácidos han sido sustituidos, y

(b)

Otro agente terapéutico.

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3.1 Definiciones

Tal como se usa aquí, el término "paciente" es un animal, tal como, pero no limitado a, una vaca, primate, caballo, oveja, cerdo, gallina, pavo, codorniz, gato, perro, ratón, rata, conejo y cobayo, y es mas preferible un mamífero y mas preferible un humano.

Tal como se usa aquí, la frase "terapia" o "agente terapéutico" hace referencia a cualquier molécula, compuesto, o tratamiento que asiste en el tratamiento de una enfermedad, especialmente un problema relacionado con los huesos. Como tal, la terapia incluye, terapia de radiación, quimioterapia, terapia dietética, terapia física y terapia psicológica.

Tal como se usa aquí, la frase "problema relacionado con los huesos" hace referencia a un problema donde la formación de hueso, deposición, o resorción es anormal. Problemas relacionados con los huesos incluyen, a, osteoporosis, hipercalcaemia de malignidad, osteopenia debido a metástasis de hueso, enfermedad periodontal, hiperparatiroidismo, erosiones periarticulares en artritis reumatoidea, enfermedad de Paget, osteodistrofia, miositis ossificans, hipercalcemia maligna, lesiones osteoliticas producidas por metástasis ósea, pérdida de hueso por inmovilización, pérdida de hueso por deficiencia de hormona esteroide sexual, anormalidades óseas por tratamiento con hormona esteroide, anormalidades óseas causadas por terapéuticos para cáncer, osteomalacia, hiperostosis, osteopetrosis, enfermedad metastasica ósea, osteopenia inducida por inmovilización, y osteoporosis inducida por glucocorticoide.

Tal como se usa aquí, la frase "farmacéuticamente aceptable" hace referencia a un agente que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de un ingrediente activo, y que puede ser aprobada por una agencia reguladora del gobierno Federal o un gobierno estatal, o está catalogado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente para uso en humanos. Por consiguiente, vehículos apropiados farmacéuticamente aceptables incluyen agentes que no interfieren con la efectividad de una composición farmacéutica.

Tal como se usa aquí, la frase "sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a sales preparadas de ácidos y bases farmacéuticamente aceptables, preferiblemente no tóxicas, incluyendo ácidos y bases inorgánicas y orgánicas, incluyendo, sales sulfúrica, maléica, acética, oxálica, clorhidrato, hidrobromato, hidroyodato, nitrato, sulfato, bisulfito, fosfato, ácido fosfato, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, ácido citrato, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1, 1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con tres grupos amino tales como, aquellas derivadas de ácido hidroclórico, fosfórico, acético, oxálico y tartárico. Sales farmacéuticamente aceptables también incluyen aquellas formadas con tres grupos carboxil tales como, pero no limitados a, aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, sodio, litio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, y procaina.

Tal como se usa aquí, el término "vehículo" hace referencia a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo. Tales vehículos pueden ser líquidos estériles, tales como soluciones salinas en agua, o aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Una solución salina es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica es administrada intravenosamente. Soluciones salinas y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol pueden ser usadas como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables.

Tal como se usa aquí, el término "mineral" hace referencia a una sustancia, preferiblemente una sustancia natural, que contiene calcio, magnesio o fósforo. Nutrientes y minerales ilustrativos incluyen hueso de res, hueso de pescado, fosfato de calcio, cáscaras de huevo, conchas de mar, conchas de ostra, carbonato de calcio, cloruro de calcio, lactato de calcio, gluconato de calcio y citrato de calcio.

Tal como se usa aquí, el término "muestra biológica" es ampliamente definido para incluir cualquier célula, tejido, órgano u organismo multicelular. Una muestra biológica puede ser derivada, por ejemplo, de células o cultivos de tejido in vitro. Alternativamente, una muestra biológica puede ser derivada de un organismo vivo o de una población de organismos uni celulares. Preferiblemente, la muestra biológica es tejido vivo. Más preferible, la muestra biológica es hueso vivo o tejido adiposo.

Tal como se usa aquí, el término "GIP" hace referencia a polipéptido insulinotrópico glucosa-dependiente. GIP es una incretina que estimula la secreción de insulina directamente de una forma glucosa dependiente.

Tal como se usa aquí, el término "S-CTX" hace referencia a un fragmento de suero C-telopéptido de degradación de colágeno tipo I.

Tal como se usa aquí, la frase "polipéptido aislado o péptido" hace referencia a un polipéptido o péptido que está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de célula o tejido de la cual se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando son sintetizados químicamente. El lenguaje "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína en las cuales la proteína es separada de componentes celulares de las células de las cuales es aislado o recombinantemente producido. Por lo tanto, la proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos que 30%, 20%, 10%, o 5% (por peso seco) de proteína heteróloga (también se hace referencia aquí como una "proteína contaminante"). Cuando la proteína, péptido, o fragmento del mismo es producido recombinantemente, también es preferiblemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparación de proteína. Cuando la proteína es producida por síntesis química, es preferiblemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos, es decir, es separado de precursores químicos u otros químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. Por consiguiente tales preparaciones de la proteína tienen menos que 30%, 20%, 10%, 5% (por peso seco) de precursores químicos o compuestos otros que el polipéptido de interés. En modalidades preferidas, preparaciones purificadas o aisladas van a carecer de cualquier proteína contaminante del mismo animal del cual la proteína es normalmente producida, como puede ser logrado por expresión recombinante de, por ejemplo, una proteína humana en una célula no humana.

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4. Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los niveles de GLP-1, GIP y S-CTX por un periodo de 2-3 horas en respuesta a (A) fructosa oral; (B) ácido graso oral de cadena larga; (C) proteína oral.

La Figura 2 muestra los niveles de GLP-1, GLP-2, y S-CTX por un periodo de 3 horas después de una comida normal. Los sujetos tenían un intestino corto con un colon preservado.

La Figura 3 muestra los niveles de S-CTX y GLP-2 por un periodo de 7 horas seguido de un bolo de inyección subcutánea de 400 pg de GLP-2 sintética humana.

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5. Descripción detallada de la invención 5.1 GLP-2 y problemas relacionados con el hueso

La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento del solicitante que GLP-2 inhibe la resorción ósea. Sin estar atado a ninguna teoría, el solicitante cree que los efectos anti-resorción de GLP-2 podrían resultar de su habilidad para inhibir la secreción de IL-6, oponerse a la acción PTH, y/o crear un estado hipogonadal que contribuye a los efectos anti-resorción de GLP-2.

Por lo tanto, las moléculas GLP-2 reveladas aquí son útiles para tratar o prevenir problemas relacionados al hueso, incluyendo los problemas relacionados a los huesos revelados aquí.

Una molécula GLP-2 o análogo de GLP-2 pueden también activar uno o más receptores presentes en células derivadas de hueso. Sin estar atado por ninguna teoría, la estimulación de éstas células con GLP-2 puede llevar a un aumento en la concentración de calcio intracelular, un aumento en el contenido celular cAMP, una estimulación de síntesis de colágeno tipo I, una inhibición de resorción de hueso estimulada por PTH. De acuerdo con la invención, las presentes composiciones y métodos pueden ser usados para interceder hacia arriba o hacia abajo en la cascada de transducción de la señal involucrada en la acción de GLP-2 para reducir el índice de resorción de hueso.

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5.2 Moléculas GLP-2

Pueden usarse moléculas GLP-2 en la invención, como pueden serlo aclos análogos de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1. La molécula GLP-2 es la proteína de longitud completa. Los análogos de GLP-2 pueden ser fragmentos del mismo, por ejemplo un dominio de enlace de receptor.

Una molécula análoga de GLP-2 adecuada puede contener amino ácidos adicionales o residuos de amino ácidos, o tener amino ácidos eliminados. Adicionalmente, moléculas análogas de GLP-2 de la invención pueden contener amino ácidos sustituidos. El análogo de GLP-2 o variante puede tener actividad mejorada comparado a GLP-2 nativo humano. Por ejemplo, tales análogos de GLP-2 o variantes pueden exhibir estabilidad mejorada en suero, enlace a receptores mejorado, o actividad transductora de señal mejorada. Modificaciones de amino ácidos, sustituciones, adiciones, o recortes que vuelven un péptido GLP-2 resistente a oxidación o degradación son contemplados por la presente invención. En una modalidad preferida, las variantes de GLP-2 son derivadas de secuencias GLP-2 humanas o de rata.

Moléculas contempladas como análogos de GLP-2, de acuerdo con la presente invención son conocidas en la técnica. Por ejemplo la Patente US. No. 5.990.077 revela formas de GLP-2 y las sales ácidas farmacéuticamente aceptables del mismo que se conforman a la fórmula general:

R1-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-aa1-Leu-Ala-aa2-Leu-Ala-aa3-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-aa4-aa5-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X]-n-R2.

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Variantes de GLP-2 son conocidas en la técnica. Ejemplos de variantes de GLP-2 son encontradas en Patentes U.S. 5,990,077 y 6,184,201, e incluyen lo siguiente:

1)

His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Mer-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn- Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp.

2)

R1-[Y]m-His-ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-aa1-Leu-Asp-aa2-Leu-Ala-aa3-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-aa4-aa5-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X] n-R2.

Donde: aa1 es un residuo de amino ácido neutral, polar, grande y no aromático; aa2 es un residuo de amino ácido neutral y polar; aa3 es un residuo de amino ácido neutral; aa4 es un residuo de amino ácido neutral, polar, grande y no aromático; aa5 es un residuo de amino ácido neutral o básico;

X es Arg, Lys, Arg-Lys o Lys-Lys;

Y es Arg o Arg-Arg;

m es 0 o 1; n es 0 o 1;

R1 es H o un grupo bloqueador N-terminal; y R2 es OH o un grupo bloqueador C-terminal.

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3)

R1-[Y]m-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-aa1-Leu-Asp-aa2-Leu-Ala-aa3-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-aa4-aa5-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-[X]n-R2

donde:- aa1 es Ile o Val; aa2 es Asn o Ser; aa3 es Ala o Thr; aa4 es Ile o Leu; aa5 es Gln o His; X es Arg. Lys, Arg-Lys o Lys-Lys; Y es Arg o Arg-Arg; m es 0 o 1; n es 0 o 1;

R1 es H o un grupo bloqueador N-terminal; y

R2 es OH o un grupo bloqueador C-terminal.

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4)

R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-(P1)-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21- Phe22-(P2)-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2,

donde:

X1 es His o Tyr es Ala o un amino ácido Ala de remplazo concediendo en dicha resistencia análoga a la enzima DPP-IV.

X3 es Pro, HPro, Asp o Glu;

X4 es Gly o Ala;

P1 es Glu-X10-Asn-Thr-Ile o Tyr-Ser-Lys-Tyr; X10 es Met o un ácido oxidativamente estable de remplazo Met;

X 19 es Ala o Thr;

X20 es Arg, Lys, His o Ala;

P2 es Ile-Asn, Ile-Ala, o Val-Gln;

P3 es un enlace covalente, o es Ile, Ile-Thr o Ile-Thr-Asn;

R1 es H o un grupo bloqueador N-terminal; y

R2 es OH o un grupo bloqueador C-terminal;

Y1 es uno o dos amino ácidos básicos seleccionados del grupo Arg, Lys, y His; Y2 es uno o dos amino ácidos básicos seleccionados del grupo Arg, Lys, y His; y m y n, independientemente son 0 y 1; y donde por lo menos uno de X1, X2, X3, X4, P1, X10, X19, X20, P2 y P3 es otro que un tipo salvaje, residuo de GLP-2 mamífero.

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En una modalidad, la variante de GLP-2 es resistente a ruptura por dipeptidil peptidasa-IV (DPP-IV).

En otra modalidad, la variante de GLP-2 tiene una secuencia de amino ácidos donde un amino ácido oxidativamente sensible, es remplazado con un residuo de amino ácido oxidativamente estable. En otra modalidad, el amino ácido oxidativamente sensible es metionina ("Met"). Estas variantes pueden ser más estables que el GLP-2 nativo.

En otra modalidad, la variante de GLP-2 tiene una secuencia de amino ácido donde una arginina es remplazada con un amino ácido básico (por ejemplo histidina o lisina).

Otros análogos de GLP-2 actuando como agonistas receptores de GLP-2 incluyen aquellos conocidos en la técnica y catalogados abajo (véase también, por ejemplo, Patente U.S. No. 6, 051,557).

En modalidades específicas de la invención, el análogo de GLP-2 comprende un amino ácido que tiene la secuencia:

His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn- Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp; o

His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn- Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp; o

His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn- Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp.

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En una modalidad particular, análogos de GLP-2 tienen un(os):

Grupo bloqueador N-terminal; y/o

Extensión N-terminal tal como Arg o Arg-Arg; y/o

Grupo bloqueador C-terminal; y/o

Extensión C-terminal tal como Arg o Arg-Arg

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5.3.1 Ensayos de Exploración para Identificar Análogos de GLP-2

Para identificar aquellos análogos de GLP-2 apropiados para uso en la invención se puede usar un método (al que también se hace referencia aquí como "ensayo de exploración") para identificar agonistas receptores GLP-2 de análogos candidatos o de prueba.

Los compuestos de prueba de la presente invención pueden ser obtenidos usando cualquiera de las numerosas modalidades en métodos combinatorios de biblioteca conocidos en la técnica, incluyendo; bibliotecas biológicas; espacialmente fase sólida paralela direccionable o bibliotecas de fase en solución; métodos de biblioteca sintéticos que requieren desconvolución; el método de la biblioteca "una-cuenta un-compuesto"; y métodos de biblioteca sintética; y métodos de biblioteca sintética usando selección por cromatografía de afinidad (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145).

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5.4 Usos de las moléculas GLP-2 y análogos de GLP-2

Las moléculas GLP-2 o análogos de GLP-2 han de ser administrados a un paciente, preferiblemente un mamífero, mas preferiblemente un humano, para el tratamiento o prevención de problemas relacionados a los huesos. Las moléculas GLP-2 o análogos de GLP-2 de la invención pueden ser usados para tratar formas agudas o crónicas de éstas condiciones.

Las composiciones farmacéuticas de la presente aplicación son útiles para la prevención o tratamiento que involucra terapias de combinación que comprenden administrar una cantidad efectiva de una molécula GLP-2 o un análogo de GLP-2 en combinación con otro agente terapéutico o agentes para el tratamiento de pérdida de hueso que resulta de un problema relacionado a los huesos. El otro agente terapéutico o agente puede ser, por ejemplo, un agente anti-osteoporosis. Puede ser una hormona esteroide. Puede ser una hormona no esteroide inhibidor de proteasa. Puede ser un compuesto bisfosfonato.

Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen los de la Tabla 1.

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TABLA 1 Otros Agentes Terapéuticos para ser Administrados con Moléculas GLP-2 o análogos

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Agentes anti-osteoporosis

Alendronato de sodio

L-treonato de calcio (por ejemplo, C8H14O10Ca)

Clodronato

Etidronato

Nitrato de galio

Mitramicina

Acetato de noretindrona (por ejemplo, aquella que está disponible comercialmente como ACTIVELLA)

Osteoprotegerina

Pamidronato

Risedronato de sodio

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Hormonas esteroides

Hormonas estrogénicas (por ejemplo, la que está disponible comercialmente como PREMARIN)

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Hormona no esteroide

Calcitonina

Calcitiol

Hormona de crecimiento (por ejemplo, factor activador de osteoclastos)

Hormona paratiroides

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Factor de crecimiento

Factor de crecimiento de fibroblastos

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Modulador de receptor de estrógeno selectivo

BE-25327

CP-336156

Clometerona

Delmadinona

Droloxifeno

Idixifeno

Nafoxidina

Nitromifeno

Ormeloxifeno

TABLA 1 (continuación)

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Raloxifeno (por ejemplo, aquella que es comercialmente disponible como EVISTA)

Tamoxifeno toemifeno

Trioxifeno [2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxinaftaleno-1-il][4-[2-(1-piperidinil)-etoxi]fenil]-metano

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Hormona de crecimiento secretagoga

Factor de liberación de la hormona de crecimiento

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Inhibidor de proteasa

Inhibidor de cisteína proteasa (por ejemplo, vinil sulfona, peptidilfluorometil quetona, cistatina C, cistatina D, E-64)

DPP IV antagonista

DPP IV inhibidor (por ejemplo, N-(glicil sustituido)-2-cianopirrolidinas, N-ala-Pro-nitrobencil-hidroxilamina, y e-(4-nitro) benzoxicarbonil-Lys-Pro)

Inhibidor Serina-proteasa (por ejemplo, azapéptido, BMS23632, antidolor, leupeptina) compuesto de bisfosfonato

alendronato (por ejemplo, aquel que es comercialmente disponible como FOSOMAX)

aminoalquil bifosfonato (por ejemplo, alendronato, pamidronato (3-amino-1-hidroxipropilideno)

sal de disodio ácido bifosfónico, ácido pamidrónico, risedronato (1-hidroxi-2-(3-piridinil)etilideno) bsfosfonato, YM 175L (cicloheptilamino)metileno-ácido bisfosfónico], piridronato, aminohexanobisfosfonato, tiludronato, BM-210955, CGP-42446, EB-1053)

risedronato (por ejemplo, aquel que es comercialmente disponible como ACTONEL)

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Otros agentes terapéuticos pueden ser hechos y usados a dosis reveladas previamente. Por ejemplo, un agente anti osteoporosis (véase por ejemplo Patente U.S. No. 2,720,483), una hormona no esteroide (véase, por ejemplo, Patente U.S. Nos. 6,121,253; 3,911', 197;6, 124,314), un compuesto bisfosfonato (véase por ejemplo, Patente U.S. No. 5, 409,911)

Alternativamente, otros agentes terapéuticos pueden ser hechos y usados en dosis tal como se determinó empíricamente.

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5.5 Administración terapéutica/profiláctica y composiciones de la invención

Debido a su actividad, las moléculas GLP-2 y análogos de GLP-2 son ventajosamente útiles en medicina humana y veterinaria. Como se describe arriba, los compuestos de la invención son útiles para tratar o prevenir un problema relacionado con los huesos en un paciente.

Cuando se administra a un paciente, una molécula GLP-2 o análogo de GLP-2 es preferiblemente administrado como un componente de una composición que opcionalmente comprende un transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad preferida, éstas composiciones son administradas oralmente.

Composiciones para administración oral pueden requerir una cubierta entérica para proteger la composición(es) de degradación dentro del tracto gastrointestinal. En otro ejemplo, las composiciones pueden ser administradas en una formulación liposomal para proteger las moléculas GLP-2 y análogos de GLP-2 revelados aquí de enzimas degradantes, facilitar el transporte de las moléculas al sistema circulatorio, y ejercer la entrega de la molécula a través de membranas celulares a los sitios intracelulares.

Las moléculas GLP-2 y análogos para administración oral pueden ser cubiertos con o mezclados con un material (por ejemplo, gliceril monostearato o gliceril distearato) que retrasa la desintegración o afecta la absorción de la molécula GLP-2 en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, por ejemplo, la liberación sostenida de una molécula GLP-2 puede ser lograda en varias horas y, si es necesario, la molécula GLP-2 puede ser protegida de ser degradada dentro del tracto gastrointestinal. Tomando ventaja de los varios pHs y condiciones enzimáticas a través del tracto gastrointestinal, composiciones farmacéuticas para administración oral pueden ser formuladas para facilitar la liberación de una molécula GLP-2 en un lugar gastrointestinal particular. Membranas selectivamente permeables que rodean un compuesto conductor osmóticamente activo son también apropiadas para composiciones administradas oralmente. El fluido del ambiente alrededor de la cápsula es embebido por el compuesto conductor, el cual se hincha para desplazar la molécula GLP-2 a través de una apertura, puede proveer un perfil de entrega de esencialmente orden cero en lugar de los perfiles con picos de formulaciones de liberación inmediata. También pueden usarse materiales de retraso de tiempo tales como, glicerol monoestearato o glicerol estearato.

Vehículos agentes farmacéuticos apropiados también incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, salina, goma de acacia, queratina, urea, malta, harina de arroz, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche seca sin grasa, glicerol, propileno, glicol, agua, y etanol. Si se desea, el vehículo también puede contener cantidades mínimas de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores de
pH.

Adicionalmente, pueden ser usados agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes, y colorantes. La composición puede ser formulada como un supositorio, con enlazadores tradicionales y vehículos tales como triglicéridos.

Una composición farmacéutica que comprende una molécula GLP-2 o análogo puede ser administrada a través de una o más rutas tales como, oral, infusión intravenosa, inyección subcutánea, intramuscular, tópica, inyección depo, implante, modalidad de liberación con el tiempo, e intracavital. La composición farmacéutica es formulada para ser compatible con su pretendida ruta de administración. Ejemplos de rutas de administración incluyen parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intratumoral, intranasal, epidural, intra-arterial, intraocular, intraorbital, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo inhalación), transdérmica (tópica particularmente a las orejas, nariz, ojos, o piel), transmucosa (por ejemplo, oral) nasal, rectal, intracerebral, intravaginal, sublingual, submucosa, y transdérmica.

La administración puede ser a través de cualquier ruta conocida de ser efectiva por un doctor de destreza ordinaria. Administración parenteral, es decir, no a través del canal alimentario, puede ser realizada por inyección subcutánea, intramuscular, intra-peritoneal, intramoral, intradérmica, intracapsular, intra-adiposa, o intravenosa de una forma de dosis en el cuerpo por medio de una jeringuilla estéril, óptimamente una jeringa tipo lapicero, u otro tipo de aparato mecánico tal como una bomba de infusión. Una opción adicional es una composición que puede ser un polvo o un líquido para la administración en la forma de un rociador nasal o pulmonar. Como una opción mas adicional, la administración puede ser transdérmica, por ejemplo de un parche. Composiciones apropiadas para administración oral, bucal, rectal, o vaginal pueden ser provistas.

En una modalidad, una composición farmacéutica de la invención es llevada por un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede ser administrada usando una infusión intravenosa, una bomba osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas, u otras formas de administración. En una modalidad, una bomba puede ser usada (Véase por ejemplo, Langer, 1990, Science 249:1527-33; Sefron, 1987, CRC Crit. Ref Biomed.Eng. 14: 201; Buchweald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudck et al., 1989, N. Engl. J. Med.321:574). En otra modalidad, el compuesto puede ser distribuido en una vesícula, en particular un liposoma (Véase por ejemplo, Langer, 1990, Science 249:1527-33; Treat et al., 1989, in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-65; López-Berestein, ibid, pp. 317-27; International Patent Publication No. WO 91/04014;. Patente U. S No. 4,704, 355). En otra modalidad, materiales poliméricos pueden ser usados (Véase por ejemplo, Medical Applications, of Controlled Release, Langer and Wise, (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Perfiormance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger andPeppas, 1953, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol.Chem. 23: 61; Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann.Neurol. 25:351; Howard et al., 1989,J. Neurosurg.
71:105).

En aun otra modalidad, un sistema de liberación controlada puede ser ubicado en proximidad al blanco. Por ejemplo, una microbomba puede distribuir dosis controladas directamente al hueso o tejido adiposo, requiriendo de este modo solamente una fracción de la dosis sistémica (véase por ejemplo, Goodson 1984, en Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp, 115-138). En otro ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede ser formulada con una hidrogel (véase, por ejemplo, Patente U.S. Nos. 5,702,717; 6,117,949; 6,201,072).

En una modalidad, puede ser deseable administrar la composición farmacéutica de la invención localmente, es decir, al área que necesita el tratamiento. La administración local puede ser lograda, por ejemplo, por infusión local durante cirugía, aplicación tópica (por ejemplo, en conjunción con un vendaje de herida después de una cirugía), inyección, catéter, supositorio, o implante. Un implante puede ser de material poroso, no poroso, o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras.

En ciertas modalidades, puede ser deseable introducir las moléculas GLP-2 y análogos en el sistema nervioso central por una ruta adecuada, incluyendo inyección intraventricular, intratecal y epidural. La inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventricular, por ejemplo, unido a un depósito, tal como un depósito Ommaya.

La administración pulmonar puede también ser utilizada, por ejemplo, usando un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente de aplicación por aerosol, o por medio de perfusión en un fluorocarbono o un surfactante sintético pulmonar.

El técnico diestro puede apreciar las ventajas desventajas específicas y por ser consideradas al escoger una forma de administración.

Una composición farmacéutica de la invención puede ser administrada en la mañana, tarde, noche, o diurnamente. En una modalidad, la composición farmacéutica es administrada en fases particulares del ritmo circadiano. En una modalidad específica, la composición farmacéutica es administrada en la mañana. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica es administrada en un estado circadiano inducido artificialmente.

Las presentes composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pastillas, bolitas, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, aspersiones, suspensiones, o cualquier otra forma apropiada para uso. En una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una cápsula (Véase por ejemplo, Patente U.S. No. 5,698,155). Otros ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, PA, 19th ed. 1995, pp. 1447 to1676.

Como corresponde, las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden ser en la forma de por ejemplo tabletas orales, cápsulas, elíxires o jarabes.

Por ejemplo, para administración oral en la forma de una tableta o cápsula, el componente activo del fármaco puede ser combinado con un vehículo inerte, oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, metil celulosa, estearato de magnesio, dicalcio fosfato, sulfato de calcio, manitol, y sorbitol. Para administración oral en forma líquida, los componentes del fármaco oral pueden ser combinados con cualquier vehículo oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como etanol, glicerol, y agua. Además, enlazadores apropiados, lubricantes, agentes desintegradores y agentes colorantes también pueden ser incorporados en la mezcla. Enlazadores adecuados incluyen, almidón, gelatina, azúcares naturales (por ejemplo glucosa, beta-lactosa), endulzantes de maíz, gomas naturales y sintéticas (por ejemplo acacia, tragacanto, alginato de sodio), carboximetilcelulosa, polietileno glicol y ceras. Los lubricantes útiles para cualquier fármaco administrado oralmente incluyen, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de magnesio, acetato de magnesio, y cloruro de sodio. Los desintegradores incluyen, almidón, metil celulosa, agar, bentonita, y goma de xantano.

Las composiciones administradas oralmente pueden contener uno o más agentes, por ejemplo, agentes endulzantes tales como, fructosa, ASPARTAME y sacarina. Las composiciones administradas oralmente pueden también contener agentes saborizantes tales como, menta, aceite de gaulteria, y cereza. Las composiciones administradas oralmente pueden también contener agentes colorantes y/o agentes preservantes.

Las moléculas GLP-2 y análogos también pueden ser administradas en la forma de sistemas de distribución de liposoma, tal como pequeñas vesículas unilamelares, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden ser formados de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. Una variedad de lípidos catiónicos pueden ser usados de acuerdo con la invención incluyendo, pero no limitándose a, N-(1(2,3-dioleiloxi)propil)-N, N, cloruro de N-trimetilamonio ("DOTMA") y dioleilfosfotidiletanolamina ("DOPE"). Tales composiciones favorecen el modo de administración.

Las moléculas GLP-2 y análogos también pueden ser distribuidos por el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los cuales las moléculas GLP-2 y análogos pueden ser emparejados. Las moléculas GLP-2 y análogos también pueden ser emparejados con polímeros solubles como vehículos de fármaco que se pueden objetivizar. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polohidroxipropilmetacrilamida-fenol, polihidroxietilaspartamida-fenol, o polietilenooxidopolilisina sustituido con residuos de palmiotil. Además, las moléculas GLP y activadores de GLP pueden ser emparejados a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr la liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico y poliglicólico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros degradados o de bloque amfifático de
hidrogeles.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen, soluciones y suspensiones acuosas y no acuosas estériles inyectables, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen a las composiciones farmacéuticas sustancialmente isotónicas con la sangre de un receptor previsto. Otros componentes que pueden estar presentes en tales composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, polioles, glicerina y aceites vegetales. Las composiciones adaptadas para administración parenteral pueden ser presentadas en recipientes de dosis por unidad o multi dosis (por ejemplo, ampollas y frascos sellados), y pueden ser almacenados en una condición de liofilización (es decir, liofilizado) que requiere la adición de un vehículo estéril líquido (por ejemplo, solución estéril salina para inyecciones) inmediatamente antes de usar. Las soluciones de inyección extemporánea y suspensiones pueden ser preparadas de polvos estériles, gránulos y
tabletas.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden ser provistas como parches discretos previstos para permanecer en contacto íntimo con la epidermis por un periodo de tiempo prolongado. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica pueden ser provistas como, por ejemplo, pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones en pasta, geles, rocíos, aerosoles o aceites. Una pomada tópica o crema se usa preferiblemente para administración tópica para la piel, boca, ojos u otros tejidos externos. Cuando se formula en pomada, el ingrediente activo puede ser utilizado con, una base de pomada parafínica o soluble en agua. Alternativamente, el ingrediente activo puede ser formulado en una crema; con una base aceite-en-agua o una base agua-en-aceite.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica para el ojo incluyen, por ejemplo, gotas para los ojos o composiciones farmacéuticas inyectables, En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo puede ser disuelto o suspendido en un vehículo apropiado, el cual incluye, por ejemplo, un solvente acuoso con o sin carboximetilcelulosa. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración tópica en la boca incluyen, por ejemplo, grajeas, tabletas, pastillas y enjuagues bucales.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal pueden comprender vehículos sólidos tales como polvos (preferiblemente que tengan un tamaño de partícula en el rango de 20 a 500 micrones). Los polvos pueden ser administrados de la forma en que se toma el rapé, es decir, por inhalación rápida a través de la nariz desde un recipiente con polvo sostenido cerca de la nariz. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal pueden comprender vehículos líquidos tales como, por ejemplo, aspersor nasal o gotas nasales. Éstas composiciones farmacéuticas pueden comprender soluciones acuosas o de aceite de una molécula GLP-2. Las composiciones para administración por inhalación pueden ser suministradas en aparatos especialmente adaptados incluyendo, pero no limitándose a, aerosoles presurizados, nebulizadores o insufladores, que pueden ser construidos para proveer determinadas dosis de la molécula GLP-2 o análogo.

Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden ser provistas como supositorios o enemas. Las composiciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden ser provistas, por ejemplo, como formulaciones en pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o aspersores.

Los supositorios generalmente contienen ingredientes activos en el rango de 0.5% a 10% por peso. Las formulaciones orales contienen preferiblemente 10% a 95% ingrediente activo por peso. En una modalidad preferida, la composición es formulada de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para inyección intratumoral, implantación, inyección subcutánea, o administración intravenosa a humanos.

Típicamente, las composiciones farmacéuticas para inyección o administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso estéril isotónico. Cuando es necesario, la composición puede también incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lidocaína para aminorar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes son suministrados separadamente o mezclados juntos en forma de dosis por unidad, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o sobrecito indicando la cantidad del ingrediente activo.

Cuando la composición ha de ser administrada por infusión, puede ser suministrada con una botella de infusión, bolsa, u otro recipiente aceptable, que contiene agua estéril de grado farmacéutico, solución salina, u otro diluyente aceptable. Donde la composición es administrada por inyección, una ampolla de agua estéril para inyección o salina puede ser provista para que los ingredientes puedan ser mezclados antes de la administración.

Las moléculas GLP-2 y análogos y otro agente terapéutico son administrados a una dosis efectiva. La dosificación y régimen más apropiado para el tratamiento del paciente va a variar con la enfermedad o condición a ser tratada, y de acuerdo con el peso del paciente y con otros parámetros.

Un protocolo de dosis y tratamiento efectivo puede ser determinado por medios convencionales, comprendiendo los pasos de iniciar con una dosis baja en animales de laboratorio, aumentando la dosis mientras se monitorean los efectos (por ejemplo, histología, puntuaciones de actividad de la enfermedad) y variando sistemáticamente el régimen de dosificación. Varios factores pueden ser tomados en consideración por un clínico cuando determina una dosis óptima para dado paciente. Primordial entre éstos es la cantidad de molécula GLP-2 circulando normalmente en el plasma, la cual, en el caso de un péptido de GLP-2, es aproximadamente 150 pmol/ml en el estado de reposo, y aumentando a aproximadamente 225 pmol/ml después de la ingestión de nutrientes para humanos adultos saludables (Orskov and Holst, 1987, Scand J. Clin. Lab. Invest. 47: 165). Factores adicionales incluyen, el tamaño del paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente, la enfermedad particular a ser tratada, la severidad de la enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente, y la actividad in vivo de la molécula GLP-2.

Las dosis de prueba serían elegidas después de consideración de los resultados de estudios animales y literatura clínica. Una persona, de habilidad ordinaria en la técnica puede apreciar que información tal como constantes de enlace y
Ki derivada de ensayos de competencia del enlace GLP-2 in vitro pueden también ser usados en el cálculo de las dosis.

Una dosis típica humana efectiva de una molécula GLP-2 o análogo sería desde aproximadamente 10 \mug/kg peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg/día, preferiblemente desde aproximadamente 50 \mug/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y más preferiblemente aproximadamente 100 \mug/kg/día a 1 mg/kg/día.

Como análogos de las moléculas GLP-2 reveladas aquí pueden ser 2 a 100 veces más potentes que las contrapartes que ocurren naturalmente, una dosis típica efectiva de tal análogo de GLP-2 puede ser más baja, por ejemplo, desde aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a 1 mg/kg/día, preferiblemente 1 \mug/kg/día a 500 \mug/kg/día, y aun mas preferible 1 \mug/kg/día a 100 \mug/kg/día.

En otra modalidad, la dosis efectiva de una molécula GLP-2 o análogo es menos que 10 \mug/kg/día. En aun otra modalidad la dosis efectiva de una molécula análoga GLP-2 es mayor que 10 mg/kg/día.

La dosis específica para un paciente particular, por supuesto, tiene que ser ajustada al grado de respuesta, la vía de administración, el peso del paciente, y la condición general del paciente, y es finalmente dependiente del juicio del doctor encargado.

La efectividad de los métodos de tratamiento de la invención puede ser evaluada por, por ejemplo, determinando el nivel de uno o dos marcadores de resorción de hueso como un indicador de la actividad de GLP-2. Por lo tanto, cambios en el nivel de los marcadores de resorción de hueso después de la administración de la molécula GLP-2 o análogo puede monitorear la efectividad del tratamiento. En una modalidad, el marcador de la resorción de hueso es un telopéptido C-terminal de colágeno tipo I (S-CTX) y/o degradación de productos del mismo (Rosenquist et al., 1998, Clin. Chem. 44:2281-2289; Christgau et al., 1998, Clin. Chem. 44:2290-2300). El nivel de un marcador de resorción de hueso puede ser determinado usando métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA; Serum CrossLapsTM). En una modalidad particular, una disminución en el nivel de S-CTX circulante indica que el tratamiento de GLP-2 de un paciente es efectivo. De acuerdo con los métodos de la invención, la medición de un marcador de resorción de hueso puede ser usada para determinar la dosis óptima de un agente terapéutico para el tratamiento de problemas relacionados con los huesos. La presente invención puede ser mejor entendida por referencia a los siguientes Ejemplos no limitables, los cuales son provistos sólo como ejemplares de la invención. No obstante, éstos no deben de ninguna manera ser interpretados como limitando el enfoque más amplio de la invención. Los Ejemplos sirven para demostrar y explicar los efectos anti resorción de hueso de la GLP-2, en lugar de una combinación con otros agentes
terapéuticos.

6. Ejemplos de referencia

En los ejemplos, el trabajo reportado usando GLP-1 y GIP y componentes dietéticos (por ejemplo en los Ejemplos 1 a 4 y Figuras 1 y 2) no forma parte de la invención pero se presenta para ayudar en el entendimiento de los antecedentes de la invención.

En estos Ejemplos, la hematología y química de suero incluyendo glucosa fueron medidos usando un auto analizador (Vitros), el FSJ-I en suero fue medido por IRMA (Coat-A-Count®, DPC, Los Angeles, CA). Los fragmentos C-telopéptido de suero de degradación de colágeno tipo I (S-CTX) fueron medidos por ELISA, ensayo Serum CrossLaps^{TM} (Osteometer BioTech A/S- Denmark). La osteocalcina en suero fue determinada por ELISA, un ensayo que determina el segmento medio N-terminal de la molécula. Fueron evaluados la insulina en suero y c-péptido por RIA (Coat-A-Count® para insulina y doble anticuerpo C-péptido para c-péptido ambos DPC, Los Angeles, CA).

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6.1 Ejemplo 1

Efecto de fructosa oral en GLP-1, GIP, e índice de resorción ósea

Doce mujeres saludables (edades 30-45) y hombres (30-60) fueron incluidos en un estudio aleatorio controlado cruzado comparando los efectos de la fructosa oral en GLP-1, en GIP y en recambio óseo. El recambio óseo fue ensayado midiendo la cantidad de S-CTX en el suero de un sujeto. Brevemente, se realizó un inmunoensayo usando anticuerpos monoclonales específicos para los fragmentos S-CTX generados exclusivamente de degradación de colágeno tipo I durante la resorción de tejido óseo maduro (Rosenquist et al., 1998, Clin. Chem. 44:2281-2289). Los individuos no tenían historia médica de enfermedades relacionadas a recambio óseo tales como cáncer, artritis reumatoidea o enfermedades que comprometen la absorción del intestino o excreción/re-absorción del riñón, o cualquier otra enfermedad seria que podría influenciar la conducta del estudio. Un examen general de laboratorio incluyendo hematología y química de suero no dieron indicación de disfunción específica de órganos.

Los individuos no habían tomado ningún medicamento que tendría efecto sobre el metabolismo óseo, tal como, calcio, vitamina D, estrógeno o progestina en cualquier forma de administración por más de 3 meses antes del inicio del estudio. Los sujetos nunca habían sido tratados con bisfosfonatos o fluoruro.

Muestreo

Los sujetos ayunaron desde las 10 p.m. de la noche anterior al experimento y recolección de muestras iniciales de sangre entre las 7:30 a.m. y 8.30 a.m. Inmediatamente después, se inició la fructosa oral. Un periodo de lavado de 2 semanas fue instituido entre cada experimento.

Intervenciones

La fructosa oral consistió de 75g de fructosa disuelta en 300 ml de agua agregando el zumo de medio limón. La fructosa oral indujo una reducción de 36% en S-CTX después de 2 horas (Figura 1A) mientras que el nivel de GLP-1 fue duplicado a 220% después de 2 horas, comparado con la línea basal de 100% a T_{o}. Como corresponde, la incidencia de los otros fragmentos de proglucagón se duplicó, como lo hizo GLP-1. El nivel de GIP fue casi mantenido como línea base. Seguido de la administración oral de fructosa, la concentración de GLP-1 se eleva, como S-CTX, un marcador de resorción de hueso, disminuye. GLP-1 puede ser útil para disminuir la resorción de hueso y para tratar o prevenir la osteoporosis.

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6.2 Ejemplo 2

Efecto de ácidos grasos orales de cadena larga en GLP-1, GIP, e índice de resorción ósea

Doce mujeres saludables (edades 30-45) y hombres (30-60) con el mismo criterio de inclusión y exclusión del Ejemplo 1fueron incluidos en un estudio aleatorio, controlado cruzado comparando los efectos de la ácidos grasos de cadena larga (LCFA) orales en GLP-1, en GIP y en recambio óseo. El recambio óseo fue ensayado midiendo la cantidad de S-CTX en el suero de un sujeto. Brevemente, se realizó un inmunoensayo usando anticuerpos monoclonales específicos para los fragmentos S-CTX generados exclusivamente de degradación de colágeno tipo I durante la resorción de tejido óseo maduro (Rosenquist et al., 1998, Clin. Chem. 44:2281-2289).

Muestreo

Los sujetos ayunaron desde las 10 p.m. de la noche anterior al experimento y las muestras iniciales de sangre fueron recolectadas entre las 7:30 a.m. y 8.30 a.m. Inmediatamente después, se administro LCFA oral. Las muestras de sangre fueron recolectadas a precisamente 1, 2, 3, 6 y 9 horas después de que la primera muestra de sangre fue tomada. Un periodo de lavado de 2 semanas fue instituido entre cada experimento.

Intervenciones

La LCFA oral consistió de 70 ml de emulsión de ácidos grasos de cadena larga (Calogen). El LCFA oral indujo una reducción de 37% en S-CTX después de 3 horas (Figura 1B) y la incidencia de GLP-1 fue duplicada al nivel de 230% después de 3 horas comparado con la línea basal de 100% a TO. Estos resultados son muy similares a los datos equivalentes del Ejemplo 1. Sin embargo, la incidencia de GIP fue aumentada significativamente al nivel de 400%. Comparación con el nivel de GIP en el Ejemplo 1, indica que GIP tiene poca o ninguna influencia en la resorción de hueso. Después de la administración de LCFA oral, la concentración de GLP-1 se elevó y S-CTX, un marcador para la resorción de hueso disminuyó. GLP-1 puede ser útil para disminuir la resorción de hueso y para tratar o prevenir la osteoporosis.

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6.3 Ejemplo 3

Efecto de la proteína oral sobre GLP-2, GIP, e índice de resorción ósea

Doce mujeres saludables (edades 30-45) y hombres (30-60) con el mismo criterio de inclusión y exclusión del Ejemplo 1fueron incluidos en un estudio aleatorio, controlado cruzado comparando los efectos proteína oral en GLP-2, en GIP y en recambio óseo. El recambio óseo fue ensayado midiendo la cantidad de S-CTX en el suero de un sujeto. Brevemente, se realizó un inmunoensayo usando anticuerpos monoclonales específicos para los fragmentos S-CTX generados exclusivamente de degradación de colágeno tipo I durante la resorción de tejido óseo maduro (Rosenquist et al., 1998, Clin. Chem. 44:2281-2289).

Muestreo

Los sujetos ayunaron desde las 10 p.m. de la noche anterior al experimento y las muestras iniciales de sangre fueron recolectadas entre las 7:30 a.m. y 8.30 a.m. Inmediatamente después, se administro la proteína. Las muestras de sangre fueron recolectadas a precisamente 1, 2, 3, 6 y 9 horas después de que la primera muestra de sangre fue tomada. Un periodo de lavado de 2 semanas fue instituido entre cada experimento.

Intervenciones

La proteína oral consistió de 40 g de polvo de proteína (Casilan) disuelto en 600 ml de agua. La proteína oral indujo una reducción de 45% en S-CTX después de 2 horas (Figura C) mientras que la incidencia de GLP-2 y GIP fueron aumentadas. El nivel de GIP aumentó desde 8 pM a 17 pM y el nivel de GLP-2 aumentó desde 36 pM a 57 pM después de 1 hora disminuyendo levemente después de 2 horas al nivel de 51 pM. Estos resultados indican que concentraciones en aumento de GLP-1 y/o GLP-2 pueden reducir la resorción de hueso medida por S-CTX.

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6.4 Ejemplo 4

Efecto de una comida mezclada normal en GLP-1, GLP-2 e índice de resorción de hueso

Se reclutaron siete pacientes de intestino corto (<140 cm de intestino delgado). Cuatro hembras y tres machos fueron estudiados comparando los efectos de una comida mezclada normal en GLP-1, en GLP-2 y en recambio óseo. El recambio óseo fue ensayado midiendo la cantidad de S-CTX en el suero de un sujeto. Brevemente, se realizó un inmunoensayo usando anticuerpos monoclonales específicos para los fragmentos S-CTX generados exclusivamente de degradación de colágeno tipo I durante la resorción de tejido óseo maduro (Rosenquist et al., 1998, Clin. Chem. 44:2281-2289). La metodología de la medición de GLP-1 y GLP-2 y la descripción de los sujetos del muestreo fueron como se describe en detalle en Jeppesen et al. (2000, "Elevated plasma glucagón-like peptide 1 and 2 concentrations in ileum resected short bowel patients with a preserved colon", Gut 47:370-376).

Muestreo

Los sujetos ayunaron toda la noche y se recolectó sangre venosa periférica inicial 15 minutos antes de la comida de prueba. La comida de prueba fue completada en 15 minutos. Se recolectó sangre venosa a 10, 20, 30, 45, 60, 120 y 180 minutos después del inicio de la comida de prueba.

Intervenciones

La comida mezclada normal consistió de pan de centeno, tostadas, mantequilla, queso, mermelada, yogur, banano, y jugo de naranja (peso total 755g) con un contenido de energía de 3.92 MJ y una proporción de energía de proteína:carbohidrato:grasa de 10%:52%:37% evaluado de las tablas de comida.

Una comida mezclada normal indujo una reducción de 40% en S-CTX después de 2 horas (Figura 2) mientras que los niveles de GLP-1 y GLP-2 ambos fueron aumentados. El nivel de GLP-1 fue aumentado desde 70 pM a 98 pM después de 3 horas y el nivel de GLP-2 fue aumentado desde 10 pM a 22 pM después de 3 horas. Estos resultados indican que niveles en aumento de GLP-1 y/o GLP-2 pueden reducir la resorción de hueso como es medida por S-CTX.

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6.5 Ejemplo 5

Efecto de inyección de GLP-2 en GLP-2 e índice de resorción de hueso

Seis mujeres saludables y 3 hombres saludables entre las edades de 24 a 53 fueron incluidos en un estudio comparando el efecto de una inyección de GLP-2 en los niveles de expresión de GLP-2 y en el recambio óseo. El recambio óseo fue ensayado midiendo la cantidad de S-CTX en el suero de un sujeto. Brevemente, se realizó un inmunoensayo usando anticuerpos monoclonales específicos para los fragmentos S-CTX generados exclusivamente de degradación de colágeno tipo I durante la resorción de tejido óseo maduro (Rosenquist et al., 1998, Clin. Chem. 44:2281-2289). La descripción de la metodología de medición de GLP-2 de longitud completa y GLP-2 total ( incluyendo productos de degradación por, por ejemplo proteasa DPP IV) y la descripción de las personas de prueba fue como se describe en detalle en Hartmann et al. (2000, "In vivo and in vitro degradation of glucagón-like peptide-2 in humans". J. Clin. Endocrinol. Metab. 85:2884-2888).

Muestreo

Muestras de sangre fueron tomadas a intervalos regulares, antes, durante y después de la inyección.

Intervenciones

Los sujetos de prueba recibieron un bolo de inyección subcutánea de 400 pg de GLP-2 humana sintética. La inyección de GLP-2 indujo una reducción de 35% en S-CTX después de 3 horas, mientras que el nivel de GLP-2 aumentó naturalmente después de la inyección a un pico después de 1 hora indicando que un aumento en GLP-2 resulta en la reducción de la resorción de hueso como medido por el inmunoensayo de S-CTX (Figura 3).

Claims (5)

1. Una composición farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de pérdida de hueso por la inhibición de resorción ósea que comprende una cantidad efectiva de

(a)

una molécula GLP-2, que es un péptido-2 tipo glucagón de vertebrado (GLP-2), o un análogo del mismo que constituye un agonista de receptor de GLP-2 donde, en la secuencia de amino ácido de un GLP-2 de vertebrado, uno o más amino ácidos han sido eliminados, o uno o más amino ácidos han sido agregados, o uno o más amino ácidos han sido sustituidos, y

(b)

otro agente terapéutico.

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2. Una composición como se reivindica en la reivindicación 1, donde el otro agente terapéutico es un agente anti-osteoporosis.

3. Una composición como se reivindica en la Reivindicación 2, donde el otro agente terapéutico es alendronato de sodio, clodronato, etidronato, nitrato de galio, mitramicina, acetato de noretindrona, pamidronato, o risedronato de sodio.

4. Una composición como se reivindica en la reivindicación 1, donde el otro dicho agente terapéutico es un agente para el tratamiento de hiperparatiroidismo, hipercalcaemia maligna, erosiones periarticulares en artritis reumatoidea, enfermedad de Paget, osteodistrofia, miositis ossificans, pérdida de hueso debido a inmovilización, pérdida de hueso debido a deficiencia de hormona sexual, anormalidades óseas debido a tratamiento con hormona esteroide, anormalidades óseas causadas por terapéuticos para el cáncer, osteomalacia, enfermedad ósea metastásica.

5. Una composición como se reivindica en la reivindicación 1, donde el otro agente terapéutico es hormona paratiroides.