ES2244010T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento del dolor. - Google Patents
Metodos y composiciones para el tratamiento del dolor.Info
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Abstract
SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DEL DOLOR QUE COMPRENDEN LA ADMINISTRACION DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UNA AMILINA O DE UN AGONISTA DE LA AMILINA SOLA O EN CONJUNCION CON UN ANALGESICO NARCOTICO, POR EJEMPLO MORFINA O PENTAZOCINA.
Description
Métodos y composiciones para el tratamiento del
dolor.
La presente invención se refiere a la fabricación
de medicamentos para el tratamiento del dolor. Más particularmente,
la invención está relacionada con el empleo de la amilina o de un
análogo agonista de la amilina en la fabricación de medicamentos
para el tratamiento del dolor, tanto solos como en combinación con
un analgésico opiáceo u otro agente para aliviar el dolor.
La estructura y la biología de la amilina han
sido estudiadas previamente. Véase, por ejemplo, Rink et
al., Trends in Pharmaceutical Sciences 14: 113 - 118
(1993) ; Gaeta y Rink, Med. Chem. Res., 3: 483 - 490 (1994);
y, Pittner et al., J. Cell. Biochem., 55S: 19 - 28
(1994). La amilina es una hormona proteica de 37 aminoácidos. Se
aisló, purificó y caracterizó químicamente como el componente
mayoritario de los depósitos amiloides de los islotes de pancreasas
en humanos diabéticos tipo II fallecidos (Cooper et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8628 - 8632 (1987)). La
molécula de amilina presenta dos importantes modificaciones
post-traduccionales: el extremo
C-terminal es amidado, y las cisteínas de las
posiciones 2 y 7 se encuentran enlazadas entre sí para formar un
bucle N-terminal. La secuencia del marco de lectura
abierto del gen de la amilina humana muestra la presencia de la
señal de escisión proteolítica de los aminoácidos dibásicos Lys -
Arg, previo al codón N-terminal para la Lys, y la
Gly previa a la señal proteolítica de Lys - Arg en la posición
C-terminal, una secuencia típica de amidación por
parte de una enzima de amidación proteica, PAM (Cooper et
al., Biochem. Biophys. Acta, 1014: 247 - 258 (1989)). La
amilina es el tema de la patente U. S. nº 5.367.052, publicada el
22 de noviembre de 1995.
En la diabetes de tipo I; se ha demostrado que la
amilina era deficiente y se ha propuesto la sustitución combinada
con insulina como tratamiento preferible al tratamiento con
insulina sola en todas las formas de diabetes. El empleo de la
amilina y de otros agonistas de la amilina para el tratamiento de
la diabetes mellitus es el tema de la patente U. S. nº
5.175.145, publicada el 29 de diciembre de 1992. Las composiciones
farmacéuticas que contiene amilina y amilina más insulina se
describen en la patente U. S. nº 5.124.314, publicada el 23 de
junio de 1992.
Se ha observado que una acción en exceso de la
amilina imita las características clave en la diabetes de tipo II y
se ha propuesto el bloqueo de la amilina como una nueva estrategia
terapéutica. En la patente U. S. nº 5.266.561, publicada el 30 de
noviembre de 1993, se ha dado a conocer que la amilina produce la
reducción la incorporación tanto basal como estimulada por la
insulina de la glucosa marcada en el glucógeno en el músculo.
También se dio a conocer que este último efecto estaba compartido
con el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP)
(véase también Leighton y Cooper, Nature, 335: 632 - 635
(1988). La amilina y el CGRP resultaron aproximadamente
equipotentes, presentando una actividad marcada a unos valores
comprendidos entre 1 y 10 nM. También se ha publicado que la
amilina reduce la absorción de la glucosa estimulada por la insulina
en el músculo esquelético y reduce el contenido en glucógeno (Young
et al., Amer. J. Physiol., 259:
45746-1 (1990)). Se da a conocer el tratamiento de
la diabetes de tipo II y la resistencia a la insulina con
antagonistas de la amilina.
La estructura químicamente de la amilina es
idéntica a la de los CGRP en aproximadamente un 50%, y también a
proteínas de 37 aminoácidos que son neurotransmisores generalizados
que desempeñan diversas acciones biológicas potentes, entre ellas
la vasodilatación. La amilina y el CGRP comparten el puente
disulfuro ^{2}Cys - ^{7}Cys y la amida
C-terminal, siendo ambos esenciales para el
desarrollo de una actividad biológica completa (Cooper et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 857763 - 7766
(1988)). También se ha publicado que la amilina puede ser un miembro
de una familia de péptidos relacionados que comprende el CGRP, la
insulina, los factores de crecimiento insulinoides y las relaxinas
y que comparten una herencia genética común (Cooper et al.,
Prog. Growth Factor Research, 1: 99 - 105 (1989)).
La amilina se sintetiza básicamente en las
células beta pancreáticas y se secreta como respuesta a los
estímulos de nutrientes tales como la glucosa y la arginina. Los
estudios realizados con estirpes de células beta tumorales clonadas
(Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,
179(1) (1991)), islotes aislados (Kanatsuka et al.,
FEBS Letts., 259(1), 199 - 201 (1989)) y pancreasas de
rata perfundidas (Ogawa et al., J. Clin. Invest., 85:
973-976 (1990) han demostrado que impulsos cortos,
de 10 a 20 minutos, de secretagogos de nutrientes tales como la
glucosa y la arginina, estimulan la liberación de la amilina así
como de la insulina. La relación molar amilina : insulina de las
proteínas secretadas varía entre las preparaciones desde
aproximadamente 0,01 hasta 0,4, pero parece que no varía mucho en
cualquier otra preparación. Sin embargo, durante la estimulación
prolongada por un nivel de glucosa elevado, la relación amilina :
insulina puede aumentar progresivamente (Gedulin et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 180(1): 788 – 789
(1991)). De este modo, la amilina y la insulina no se secretan
siempre en una proporción constante.
Se ha descubierto y publicado que determinadas
acciones de la amilina son parecidas a las acciones no metabólicas
del CGRP y de la calcitonina; sin embargo, las acciones metabólicas
de la amilina descubiertas durante las investigaciones de esta
proteína recién identificada ponen de manifiesto su papel biológico
primario. Al menos algunas de dichas acciones metabólicas son
imitadas por el CGRP (véase, por ejemplo, Leighton et al.,
Nature, 335: 632 - 635 (1988); Molina et al.,
Diabetes, 39: 260 - 265 (1990)).
La primera acción descubierta de la amilina fue
la reducción de la incorporación de la glucosa estimulada por la
insulina en el glucógeno en el músculo esquelético de rata
(Leighton et al., Nature, 335: 632 - 635 (1988)); el músculo
se hizo "resistente a la insulina". Los estudios posteriores
con el músculo sóleo de rata ex vivo e in vivo han
indicado que la amilina reduce la actividad de la glucógeno sintasa,
provoca la conversión de la glucógeno fosforilasa a partir de la
forma inactiva b a la forma activa a, provoca la pérdida neta de
glucógeno (en presencia o ausencia de insulina), aumenta los
niveles de glucosa-6-fosfato, y
puede aumentar la producción de lactato (véase, por ejemplo, Deems
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(1):
116 - 120 (1991); Young et al., FEBS Letts,. 281 (1,
2): 149 - 151 (1991)). La amilina no afecta el transporte de la
glucosa por sí misma (por ejemplo, Pittner et al., FEBS
Letts., 365(1): 98 - 100 (1995)). Los estudios sobre las
relaciones de dosis y respuesta de la amilina y la insulina
demuestran que la amilina actúa como antagonista de la insulina de
tipo no competitivo o funcional en el músculo esquelético (Young
et al., Am. J. Physiol., 263(2): E274 - E281
(1992)). No hay indicios de que la amilina interfiera con la unión
de la insulina con sus receptores, o la posterior activación
receptor de la insulina tirosina cinasa (Follett et al.,
Clinical Research, 39(1): 39A (1991)); Koopmans et
al., Diabetologia, 34: 218 - 224 (1991)).
Se cree que la amilina actúa mediante receptores
presentes en las membranas plasmáticas. Los estudios sobre la
amilina y el CGRP, y el efecto de antagonistas selectivos, sugieren
que la amilina actúa vía su propio receptor (Beamon et al.,
Br. J. Phamacol., 115 (5): 713 - 715 (1995); Wang et
al., FEBS Letts., 219: 195 - 198 (1991 b)), en contra de
las conclusiones de otros investigadores según las cuales la amilina
podría actuar primariamente en los receptores del CGRP (por
ejemplo, Chantry et al., Biochem. J., 277: 139 - 143
(1991)); Galeazza et al., Peptides, 12: 585 - 591
(1991)); Zhu et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun.,
177(2): 771 - 776 (1991)). Los receptores de la amilina y su
utilización en métodos de detección sistemática y análisis de los
compuestos agonistas y antagonistas de la amilina se describen en la
patente U. S. 5.264.372 publicada el 23 de noviembre de 1993.
Mientras que la amilina presenta unos marcados
efectos en el metabolismo calórico hepático in vivo, no hay
un acuerdo general en cuales son las acciones de la amilina que se
ven en hepatocitos aislados o en hígado perfundido Los datos
disponibles no respaldan la idea de que la amilina provoque la
glucogenólisis hepática, es decir, no actúa como el glucagón (por
ejemplo, Stephens et al., Diabetes, 40: 395 - 400
(1991); Gomez-Foix et al., Biochem
J., 276: 607 - 610 (1991)). Se ha sugerido que la amilina
podría actuar en el hígado provocando la conversión del lactato en
glucógeno y aumentar la cantidad de glucosa disponible para ser
liberada por el glucagón (véase Roden et al.,
Diabetologia, 35: 116 - 120 (1992)). De este modo, la amilina
podría actuar como una pareja anabólica de la insulina en el
hígado, en contraste con su acción catabólica en el músculo.
En los adipocitos, ocurre la acción contraria a
la que tiene lugar en el músculo y la amilina no presenta acción
detectable alguna en la absorción de la glucosa estimulada por la
insulina, la incorporación en los triglicéridos, la producción de
CO_{2} (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:
7763 - 7766 (1988)), lipólisis estimulada por la adrenalina, o
inhibición de la hidrólisis por la insulina (Lupien y Young,
"Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and
Experimental ("Diabetes, nutrición y metabolismo - clínica y
experimental"," Vol. 6(1), página 1318 (febrero de
1993)). De este modo la amilina ejerce unos efectos específicos en
función de cuál sea el tejido, con una acción directa en el músculo
esquelético, efectos notablemente indirectos (mediante el suministro
del sustrato) y quizá directos en el hígado, mientras que los
adipocitos se manifiestan como "ciegos" ante la presencia o
ausencia de la amilina.
También se ha publicado que la amilina puede
ejercer unos efectos notables en la secreción de la insulina. En
islotes aislados (Ohsawa et al., Biochem. Biophys, Res.
Commun., 160(2): 961 - 967 (1989)), en el páncreas
perfundido (Silvestre et al., Reg. Pept., 31: 23 - 31
(1991)), y en la rata sana (Young et al., Mol. Cell.
Endocrinol., 84: R1 - R5. (1992)), algunos experimentos indican
que la amilina inhibe la secreción de la insulina. Otros
investigadores, sin embargo, han sido incapaces de detectar efectos
de la amilina en células \beta aisladas, en los islotes aislados,
en el animal entero (véase Broderick et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 177: 932 - 938 (1991) y referencias en
el mismo).
La amilina o los agonistas de la amilina
potencialmente inhiben el vaciado gástrico en las ratas (Young
et al., Diabetologia 38(6): 642 - 648 (1995)),
perros (Brown et al., Diabetes 43 (supl. 1): 172A
(1994)) y humanos (Macdonald et al., Diabetologia 38
(supl. 1): A32 (sumario 118) (1995)). Se ha publicado que el vaciado
gástrico se ve acelerado en las ratas BB diabéticas de tipo I
deficientes en amilina (Young et al., Diabetologia,
supra; Nowak et al., J. Lab. Clin. Med.,
123(1):110 - 6 (1994)) y en ratas tratadas con el
antagonista selectivo de la amilina, AC187 (Gedulin et al.,
Diabetologia, 38 (supl. 1): A244 (1995)). El efecto de la amilina
en el vaciado gástrico es fisiológico (funcional a las
concentraciones en las que circula normalmente).
Las acciones no metabólicas de la amilina
comprenden el efecto vasodilatador en el que puede participar
interactuando con los receptores vasculares del CGRP. Ensayos in
vivo publicados sugieren que la amilina es al menos
aproximadamente entre 100 y 1000 veces menos potente que el CGRP
como vasodilatador (Brain et al., Eur. J. Pharmacol.,
183: 2221 (1990); Wang et al., FEBS Letts., 291: 195 -
198 (1991)). Se ha publicado el efecto de la amilina en las
acciones hemodinámicas regionales, que comprenden el flujo
sanguíneo renal, en ratas conscientes (Gardiner et al.,
Diabetes, 40: 948 - 951 (1991)). Los autores señalaron que
la venoclisis de la amilina de rata se encontraba asociada con una
mayor vasodilatación renal y con una menor vasoconstricción
mesentérica que la que se observa con la venoclisis del
\alpha-CGRP humano. Llegaron a la conclusión de
que, al provocar la hiperemia renal hasta un mayor nivel que el
alcanzado con el \alpha-CGRP, la amilina de la
rata puede provocar una estimulación menos notable en el sistema
renino-angiotensínico, y de este modo, menor
vasoconstricción secundaria en la que interviene la angiotensina
II. También se señaló, sin embargo, que durante la
co-venoclisis de
\alpha-^{8-37}CGRP humano y
amilina de rata, se pusieron de manifiesto vasoconstricciones
renales y mesentéricas, supuestamente debidas a los efectos
vasoconstrictores sin oposición de la angiotensina II, y que este
descubrimiento es similar al observado durante la
co-venoclisis de A-CGRP humano y de
\alpha-^{8-37}CGRP humano (íd.
en 951).
Se ha publicado que al realizar la perfusión en
el encéfalo, o al administrarla periféricamente, la amilina
suprimía la ingesta alimenticia, por ejemplo, Chance et al.,
Brain Res., 539: 352 - 354 (1991)), una acción compartida con
el CGRP y la calcitonina. Se desconocen las concentraciones
efectivas en las células que interviene en esta acción. También se
ha publicado que la amilina puede tener efectos en los osteoclastos
tanto aislados en los que provocan la inactividad celular, como
in vivo de los que se ha publicado que la amilina disminuye
el calcio en plasma hasta un 20% en ratas, en conejos y en
pacientes humanos con la enfermedad de Paget (véase, por ejemplo,
Zaidi et al., Trends in. Endocrinal. and Metab., 4:
255 - 259 (1993)). A partir de los datos disponibles, la amilina
parece ser entre 10 y 30 veces menos potente que la calcitonina
humana para dichas acciones. De un modo interesante, se publicó que
la amilina parecía incrementar la producción de AMPc en los
osteoclastos y en cambio no aumentaba el Ca^{2+} del citosol,
mientras que la calcitonina provoca ambos efectos (Alam et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179(1): 134 -
139 (1991). Se sugirió, aunque no se demostró, que la calcitonina
podría actuar vía dos tipos de receptores y que la amilina podría
interactuar con uno de ellos.
También se ha descubierto que, sorprendentemente
en vista de su vasodilatación renal y otras propiedades previamente
descritas, la amilina aumenta notablemente la actividad de la
renina en plasma en ratas sanas cuando se les administra por vía
subcutánea de un modo que evite cualquier perturbación de la tensión
arterial. Éste último aspecto resulta importante ya que una tensión
arterial disminuida constituye un fuerte estímulo para la
liberación de la renina. Los antagonistas de la amilina, tales como
los antagonistas del receptor de la amilina, comprendiendo aquellos
que son selectivos para los receptores de la amilina en comparación
con los receptores del CGRP y/o de la calcitonina, pueden
utilizarse para bloquear el aumento de la actividad de la renina en
plasma provocada por la amilina. El empleo de antagonistas de la
amilina para tratar los trastornos relacionados con la renina se
describe en la patente U. S. nº 5.376.638 publicada el 27 de
diciembre de 1994.
En humanos normales, se han publicado unos
niveles de amilina en ayunas que varían entre 1 y 10 pM y unos
niveles pospandriales o post-glucosa entre 5 y 20
pM (por ejemplo, (Hartter et al., Diabetologia, 34: 52
- 54 (1991); Sanke et al., Diabetologia, 34: 129 -
132 (1991); Koda et al., The Lancet, 339: 1179 - 1180
(1992)). En pacientes obesos, resistentes a la insulina, los
niveles pospandriales de amilina pueden llegar a valores
superiores, alcanzando hasta aproximadamente 50 pM. Para poder
comparar, los valores en ayunas y pospandriales de la insulina se
encuentran entre 20 y 50 pM, y entre 100 y 300 pM respectivamente
en personas sanas, con niveles quizás 3 o 4 veces superiores en las
personas resistentes a la insulina. En la diabetes de tipo I, en la
que se destruyen las células \beta, los niveles de amilina se
encuentran en los mismos niveles o por debajo de los de detección y
no aumentan como respuesta a la glucosa (Koda et al., The
Lancet, 339: 1179 - 1180 (1992)). Se ha publicado que en
ratones y ratas normales, los niveles basales de amilina se
encuentran entre 30 y 100 pM, mientras que se han determinado
valores de hasta 600 pM en determinadas cepas de roedores diabéticos
resistentes a la insulina (por ejemplo, Huang et al.,
Hypertension, 19:
I-101-I-109 (1991);
Gill et al., Life Sciences, 48: 703 - 710 (1991)).
Según la Asociación Internacional para el Estudio
del Dolor (International Association for the study of Pain)
el dolor se define como "una experiencia sensorial y emocional
desagradable asociada a lesiones tisulares reales o potenciales, o
descrita en los términos de dichas lesiones". Merskey,
Pain 6: 249 (1979). Muchos trastornos y procedimientos
médicos se caracterizan por la sensación de dolor que experimenta
el paciente de distintas maneras. Por ejemplo, durante y después de
las intervenciones quirúrgicas, la manifestación del dolor es
elevada. Lo mismo se puede decir en relación con muchos trastornos
que implican traumatismos, tales como las quemaduras. El dolor
también se encuentra presente en la mayoría de inflamaciones y
asociado a trastornos relacionados con los tumores o con el
tratamiento de los mismos. Se han utilizado distintas terapias para
conseguir un efecto analgésico. Fármacos tales como los analgésicos
opiáceos, por ejemplo, la morfina, se utilizan para disminuir el
dolor intenso, como por ejemplo el asociado a intervenciones
quirúrgicas. Otros productos farmacéuticos empleados para reducir
el dolor son los sedantes, que comprenden los barbitúricos y las
benzodiacepinas. Muchos de dichos fármacos presentan efectos
secundarios tales como una acción depresora de la respiración y la
circulación. Bastantes de dichos fármacos también pueden producir
efectos hipnóticos. Los fármacos no esteroides también se utilizan
en el tratamiento del dolor y de las inflamaciones, y actúan
evitando la síntesis de prostaglandinas.
Los dolores crónicos o incurables, tales como
puede ocurrir en enfermedades tales los como trastornos óseos
degenerativos y el cáncer, significan una situación debilitante que
se trata con diversos analgésicos, por ejemplo, los compuestos
analgésicos opiáceos tales como la morfina. El dolor crónico
también puede durar más tiempo que la aparición de cualquier causa
física conocida o sospechada. Puede producirse mucho tiempo después
de una lesión o enfermedad conocida o puede producirse sin ningún
tipo de causa física conocida. También puede ir acompañada de
patologías tisulares conocidas, tales como la inflamación crónica
que se produce en determinados tipos de artritis.
En general, las vías encefálicas que gobiernan la
percepción del dolor se comprenden de un modo incompleto. Se ha
publicado con un cierto detalle sobre las conexiones sinápticas
sensoriales aferentes que se dirigen a la médula espinal, llamadas
"vías nociceptivas". En la primera etapa de estas vías, las
fibras A y C que se extienden desde Las zonas periféricas hasta la
médula espinal transportan las señales nociceptivas. Las uniones
polisinápticas del asta posterior de la médula espinal se ven
implicadas en la trasmisión y modulación de las sensaciones de dolor
a diversas regiones del encéfalo, entre ellas la región gris
periacueductal. McGeer et al., Molecular Neurobiology of
the Mammalian Brain ("Neurobiología molecular del encéfalo de
los mamíferos"), Plenum Press, New York, 1987. La analgesia, o la
ausencia o reducción del dolor como respuesta a un estímulo que
normalmente sería dolorosa, puede efectuarse directamente
disminuyendo la transmisión a lo largo de dichas vías nociceptivas.
Se cree que los opiáceos analgésicos actúan imitando los efectos de
las neuronas que contienen péptidos de endorfina o de encefalina,
que terminan en la zona presináptica de las fibras terminales C o A
y que, cuando se excitan, inhiben la liberación de la sustancia P:
Las vías que descienden desde el encéfalo también son inhibidoras
de la excitación de las fibras C y A.
Los analgésicos opiáceos, es decir, las
sustancias opioides como la morfina, al mismo tiempo que resultan
efectivos en la producción de la analgesia, pueden provocar
tolerancia en el paciente, de manera que se requiere incrementar la
dosificación para conseguir un efecto satisfactorio. A dosis
elevadas, dichos compuestos producen efectos secundarios, entre
ellos la depresión respiratoria, que puede poner en peligro la
vida, y náuseas y vómitos, que son desagradables y que pueden poner
en peligro la vida del paciente si éste se encuentra sedado. Dichos
compuestos también pueden producir una dependencia física en el
paciente. La dependencia está relacionada con la dosis de
analgésico opiáceo que se toma y con el período de tiempo durante el
cual se toma. Por lo tanto, los compuestos que sirven tanto como
sustitutivos del tratamiento con el analgésico opiáceo, así como
los compuestos complementarios a dicho tratamiento, son
útiles en el tratamiento del dolor, particularmente el dolor de tipo crónico, y serán de un valor significativo para ello.
útiles en el tratamiento del dolor, particularmente el dolor de tipo crónico, y serán de un valor significativo para ello.
Azarov et al, (Pharmacology,
Biochemistry and Behaviour, V. 52, p. 595 - 599, 1995)
publicaron los efectos del péptido relacionado con el gen de la
calcitonina en los efectos agudos y crónicos de la morfina.
Encontraron que el CGRP suprimí el desarrollo de la tolerancia
rápida a la morfina pero no realizaba acción alguna en el
desarrollo de la tolerancia crónica a la morfina.
WO 96/32958 da a conocer métodos para el
tratamiento del dolor incurable mediante la administración de
calcitonina.
Ménard et al (J. Neuroscience,
1996, Vol. 16, p. 2342 - 2350) publicaron que el antagonista de la
recepción del CGRP prevenía el desarrollo de la tolerancia a la
analgesia con morfina espinal.
Hemos descubierto ahora, que resulta sorprendente
en vista de las publicaciones en el sentido contrario por parte de
otros autores (véase por ejemplo Boual et al supra),
que la amilina y los agonistas de la amilina por ejemplo, el análogo
agonista de la amilina
^{25,28,29}Pro-h-amilina (conocida
como "pramlintida" y al que previamente nos hemos referido
como "AC-0137"), pueden utilizarse para la
analgesia en mamíferos.
La presente invención se basa en métodos nuevos
para el tratamiento del dolor que comprenden la administración de
la amilina o de un agonista de la amilina, por ejemplo, el análogo
agonista de la amilina
^{25,28,29}Pro-h-amilina siendo el
agonista distinto de la calcitonina. Por "calcitonina" se
entiende la hormona peptídica humana calcitonina y las variaciones
de la misma de distintas especies, tales como la calcitonina de
rata, la calcitonina de salmón y la calcitonina de anguila
(comprendiendo la calcitonina de anguila aminosubérica).
En un aspecto, la invención está orientada al
empleo de la amilina o de un análogo de la amilina que actúa como
agonista de la amilina en la fabricación de un medicamento para
utilizarlo en un método de tratamiento del dolor en los mamíferos.
Específicamente puede utilizarse una cantidad analgésica efectiva,
que es la cantidad efectiva para reducir o eliminar el dolor como
respuesta a un estímulo que normalmente sería doloroso y que de
este modo comprende un efecto analgésico completo (ausencia de
dolor) así como al que a veces se refiere como efecto
"hipoalgésico" o reducción del dolor.
El término "amilina" se entiende
comprendiendo los compuestos tales como los definidos en la patente
U. S. nº 5.234.906 publicada el 10 de agosto de 1993, para
"composiciones hiperglucémicas". Por ejemplo, comprende la
hormona peptídica humana conocida como amilina y secretada por las
células \beta del páncreas, y las variaciones de la misma en
distintas especies.
El término "agonista de la amilina" también
resulta conocido en la especialidad, y se refiere a un compuesto
que imita los efectos de la amilina. Un agonista de la amilina
puede ser un compuesto peptídico o no peptídico, y comprende los
análogos agonistas de la amilina.
El término "análogo agonista de la amilina"
se entiende como referido a los derivados de la familia de una
amilina que actúan como agonistas de la amilina, normalmente, se
cree actualmente, gracias al enlace o de otro modo la interacción
directa o indirectamente con un receptor de la amilina u otro
receptor o receptores con los que la propia amilina puede
interactuar para provocar una respuesta biológica. Los análogos
agonistas de la amilina útiles comprenden aquellos identificados en
la Solicitud Internacional, WPI Acc. nº
93-182488/22, titulada "New Amylin Agonist
Peptides Used for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and
Diabetes Mellitus ("Nuevos péptidos agonistas de la amilina
utilizados en el tratamiento y prevención de la hipoglucemia y la
diabetes mellitus")".
El agonista de la amilina utilizado en la
invención es un análogo agonista de la amilina, preferentemente, la
^{25,28,29}Pro-h-amilina. En otras
formas de realización preferidas, también se administra un
analgésico opiáceo. Por "analgésicos opiáceos" se entienden
los derivados sintéticos y semisintéticos de los alcaloides opiáceos
naturales. Entre los ejemplos de dichos componente encontramos la
morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el
levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina, la
alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la hidrocodona.
Los analgésicos opiáceos preferidos comprenden la morfina y la
pentazocina.
En otro aspecto, la invención está orientada al
empleo de la amilina o de un análogo de la amilina que actúa como
agonista de la amilina en la fabricación de un medicamento para
aumentar la actividad analgésica de un analgésico opiáceo (tal como
la morfina o la pentazocina) en el que la amilina o el análogo de
la amilina se administra en combinación con el analgésico opiáceo.
Esta sinergia permite el empleo de dosificaciones menores de uno de
los fármacos o de ambos con una reducción concomitante en el riego
de posibles efectos secundarios. En una forma de realización
preferida, el análogo agonista de la amilina es la
^{25,28,29}Pro-h-amilina.
En un aspecto relacionado, la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende (1) la
amilina o un agonista de la amilina, preferentemente, el análogo
agonista de la amilina, la
^{25,28,29}Pro-h-amilina, o una
sal de la misma farmacéuticamente aceptable y (2) un analgésico
opiáceo, preferentemente morfina o pentazocina o una sal del mismo
farmacéuticamente aceptable.
Dichas composiciones pueden además comprender un
transportador farmacéuticamente aceptable.
Dichas composiciones pueden comprender sales
farmacéuticamente aceptables de la amilina o un agonista de la
amilina, y/o sales farmacéuticamente aceptables de un analgésico
opiáceo o de cualquier otro agente de alivio del dolor. Dichas
composiciones pueden además comprender un transportador
farmacéuticamente aceptable.
El uso de la amilina o de un agonista de la
amilina, con actividad vasodilatadora, tanto sola como en
combinación con un analgésico opiáceo o otro agente de alivio del
dolor, resultará especialmente útil en el tratamiento de las
cefaleas vasculares, tales como la migraña.
La Figura 1 presenta los resultados de un estudio
de desarrollo cronológico del efecto de la administración de la
amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento
causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la
administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía
intraperitoneal (ip) 0,1 mg/kg de amilina (círculos oscuros) o de
disolución salina (círculos en blanco) 5, 15, 30 y 60 minutos antes
de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error
indican la media \pm el error típico.
La Figura 2 presenta los resultados de un estudio
de desarrollo cronológico del efecto de la administración de la
amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento
causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la
administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía
subcutánea (sc) 0,1 mg/kg de amilina (círculos oscuros) o de
disolución salina (círculos en blanco) 5, 15, 30 y 60 minutos antes
de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error
indican la media \pm el error típico.
La Figura 3 presenta los resultados de un estudio
de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias
dosificaciones (0,001 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg,
1,0 mg/kg y 10,0 mg/kg) de amilina sobre el número de veces que se
produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5
minutos después de la administración de ácido acético cuando se
inyectaron por vía intraperitoneal (ip) 30 minutos antes de la
inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican
la media \pm el error típico.
La Figura 4 presenta los resultados de un estudio
de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias
dosificaciones (0,001 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg,
1,0 mg/kg y 10,0 mg/kg) de amilina sobre el número de veces que se
produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5
minutos después de la administración de ácido acético cuando se
inyectaron por vía subcutánea (sc) 30 minutos antes de la inyección
de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media
\pm el error típico.
La Figura 5 presenta los resultados de un estudio
de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias
dosificaciones (0,001 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg y 3,0
mg/kg) de amilina sobre el número de veces que se produce un
retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos
después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron
por vía subcutánea (sc) 30 minutos antes de la inyección de ácido
acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el
error típico.
La Figura 6 presenta el porcentaje de inhibición
(media \pm el error típico) del número de veces que se produce un
retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos
después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron
por vía subcutánea (sc) con 0,003 mg/kg de amilina (círculos
oscuros) o de disolución salina (círculos en blanco) en animales
tratados con diversas dosificaciones de morfina (0,01 mg/kg, 0,1
mg/kg ó 3,0 mg/kg).
La Figura 7 presenta el porcentaje de inhibición
(media \pm el error típico) del número de veces que se produce un
retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos
después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron
por vía subcutánea (sc) con 0,01 mg/kg de amilina (círculos
oscuros) o de disolución salina (círculos en blanco) en animales
tratados con diversas dosificaciones de morfina (0,01 mg/kg, 0,1
mg/kg ó 3,0 mg/kg).
La Figura 8 es un isobolograma caracterizando el
45% de inhibición de la respuesta en los retorcimientos (número de
veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante
10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético
cuando se ha inyectado 30 minutos antes de la inyección de ácido
acético en ratones). Los datos que se presentan en este diagrama se
han tomado de la Figuras 2, 5, 6 y 7.
La Figura 9 presenta los resultados de un estudio
de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias
dosificaciones (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg) de
naloxona, que actúa de antagonista de la morfina, con morfina (1
mg/kg) sobre el número de veces que se produce un retorcimiento
causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la
administración de ácido acético cuando se inyectaron 30 minutos
antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de
error indican la media \pm el error típico.
La Figura 10 presenta los resultados de un
estudio del efecto de la administración de morfina (1,0 mg/kg) con
o sin naloxona (1 mg/kg) o amilina (0,01 mg/kg ó 0,1 mg/kg) con o
sin naloxona (1 mg/kg) sobre el número de veces que se produce un
retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos
después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron
30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones,
indicando el efecto de la naloxona en la analgesia provocada por la
morfina y la amilina. Las barras de error indican la media \pm el
error típico.
El índice de retorcimientos como respuesta a las
inyecciones intraperitoneales de ácido acético diluido en ratones
es un sistema indirecto de estudio de la analgesia en animales
utilizado frecuentemente. Tal como se describe en el Ejemplo 1, la
amilina de rata, cuando se inyectó en ratones 30 minutos antes de la
inyección de ácido acético (por vía intraperitoneal y por vía
subcutánea), redujo significativamente el número de retorcimientos
en los períodos de 10 minutos que empezaron 5 minutos después de la
inyección de ácido acético en comparación con el control (P <
0,001 para las inyecciones ip; P < 0,01 para las inyecciones
sc). Tal como se indica en las Figuras 1 y 2, el máximo efecto
analgésico de la amilina se producía cuando se administraba 30
minutos antes de la inyección de ácido acético. Sobre la base de
dichos estudios, se seleccionaron los 30 minutos como período de
tiempo para utilizar en los estudios de dosis y respuesta.
El Ejemplo 2 presenta el efecto analgésico de
diversas dosificaciones de amilina. Los resultados presentados en
las Figuras 3 y 4 indican que la menor dosis efectiva de amilina en
dichos experimentos fue de 0,01 mg/kg (P < 0,05 sc; P < 0,01
ip). A una dosis de 0,1 mg/kg la amilina también resultó efectiva
al producir la analgesia (P < 0,01 sc; P < 0,05 ip). A dosis
superiores (1 mg/kg y 10 mg/kg), la amilina no mostró actividad
analgésica significativa en este modelo (P < 0,05). Estos
ejemplos demuestran la eficacia de la amilina, así como de los
agonistas de la amilina entre ellos los análogos agonistas de la
amilina, al prevenir el comportamiento nociceptivo (retorcimientos)
en los ratones a los que se ha inyectado ácido acético. Dichos
resultados también indican que la eficacia analgésica de la amilina
o de los agonistas de la amilina pueden depender de la
dosificación.
El ejemplo 3 describe un experimento en el que
diversas dosis de morfina se analizaron para evaluar su actividad
analgésica, utilizando los mismos procedimientos de ensayo sobre
los retorcimientos causados por el dolor en ratones de los Ejemplos
1 y 2. Tal como se presenta en la Figura 5, las dosificaciones de
0,3 mg/Kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg resultaron efectivas para provocas
la analgesia bajo dichas condiciones experimentales.
El Ejemplo 4 describe los experimentos en que se
examinó la actividad de diversas dosificaciones de amilina y de
morfina, utilizando los mismos procedimientos de ensayo sobre los
retorcimientos causados por el dolor en ratones de los Ejemplos
previos. En un estudio, una dosificación de amilina de rata de la
que se había demostrado su ineficacia (0,003 mg/kg) para provocar
la analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se
combinó con tres dosis de morfina: 0,01 mg/Kg, 0,1 mg/kg y 3,0
mg/kg. En otro estudio, una dosificación de amilina de rata de la
que se había demostrado su eficacia (0,01 mg/kg) para provocar la
analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se
combinó con las mismas tres dosis de morfina. Se demostró que la
combinación de la amilina y la morfina aumentaba la eficacia para
provocar la analgesia en comparación con la morfina sola en
combinaciones de (1) 0,003 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina
(P < 0,05); (2) 0,01 mg/kg de amilina y 0,01 mg/kg de morfina (P
< 0,05); y (3) 0,01 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina (P
< 0,05). Adicionalmente, se demostró que una combinación de una
dosificación no analgésica de amilina (0,003 mg/kg) y una
dosificación no analgésica de morfina (0,1 mg/kg) provocaban un
efecto analgésico. Los datos se presentan en las Figuras 6 y 7.
El Ejemplo 5 describe el análisis de los
resultados de los estudios sobre los retorcimientos causados por el
dolor de los Ejemplos 2 a 4 para caracterizar más la interacción
entre la amilina y la morfina. Los resultados se presentaron en
isobologramas de acuerdo con el método de Berebaum, J. Theor.
Biol. 144: 413 (1985). El isobolograma es un método
cuantitativo para determinar las interacciones entre dosificaciones
equiefectivas de fármacos para indicar sinergia, efecto aditivo o
antagonismo. Tal como se presenta en la Figura 8, la interacción de
la amilina y la morfina en la producción de retorcimientos causados
por el dolor provocados por el ácido acético en ratones es
sinérgico. Es decir, el nivel de actividad que resulta de la
actuación conjunta de la amilina y la morfina es superior a la suma
de las actividades de los componentes individuales
El Ejemplo 6 describe los experimentos en los que
se examinó el efecto del antagonista de la morfina, la naloxona,
para estudiar su capacidad para contrarrestar la analgesia
provocada por la morfina y la analgesia provocada por la amilina en
el ensayo sobre los retorcimientos causados por el dolor descrito
anteriormente. Tal como se ilustra en la Figura 9 y 10, mientras
que 1,0 mg/kg de naloxona resulta efectivo para contrarrestar el
efecto analgésico de 1,0 mg/kg de morfina, resulta ineficaz para
contrarrestar el efecto de la amilina (0,01 mg/kg y 1,0 mg/kg) en la
analgesia, indicando que la morfina y la amilina actúan mediante
mecanismos distintos para provocar la analgesia.
Tal como se describe en el Ejemplo 7, se
analizaron analgésicos opiáceos adicionales siguiendo los métodos de
los Ejemplos 1 a 6.
Los análogos agonistas de la amilina útiles en la
presente invención comprenden los análogos agonistas de la amilina
dados a conocer en WPI Acc. nº 93-182488/22,
"New Amylin Agonist Peptides Used for Treatment and Prevention
of Hypoglycemia and Diabetes Mellitus ("Nuevos péptidos
agonistas de la amilina utilizados en el tratamiento y prevención
de la hipoglucemia y la diabetes mellitus")". Los
análogos agonistas de la amilina preferidos comprenden la
^{25,28,29}Pro-h-amilina, la
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina
y la
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina.
La actividad como agonistas de la amilina puede
confirmarse y cuantificarse realizando diversos análisis de
detección sistemática, entre ellos el análisis de enlace con el
receptor del nucleus accumbens descrito posteriormente en el
Ejemplo 11, y a continuación el ensayo con el músculo sóleo
descrito posteriormente en el Ejemplo 12, un ensayo de vaciado
gástrico descrito posteriormente en los Ejemplos 13 ó 14 o mediante
la capacidad de provocar hipocalcemia o de reducir la hiperglucemia
en mamíferos, tal como se describe en el presente documento.
El análisis de enlace con el receptor, un
análisis de competición que determina la capacidad de los
componentes para unirse específicamente a los receptores de
membrana de la amilina, se describe en la patente U. S. nº
5.264.372, publicada el 23 de noviembre de 1993. El análisis de
enlace con el receptor también se describe posteriormente en el
Ejemplo 11. Una fuente preferida de preparaciones de membrana
utilizada en el análisis es el prosencéfalo basal que comprende las
membranas del nucleus accumbens y de las regiones
circundantes. Los compuestos que se analizan compiten para enlazarse
a dichas preparaciones receptoras con
^{125}I-amilina de rata Bolton Hunter. Las curvas
de competición, en las que la cantidad enlazada (B) se presenta en
el diagrama como función del logaritmo de la concentración de
ligando y se analizan con un ordenador, empleando un análisis de
regresión no lineal para una ecuación logística de 4 parámetros
(programa: GraphPAD Inplot Software, San Diego, California) o el
programa ALLFIT de DeLean et al. (ALLFIT, Versión 2.7 (NIH,
Bethesda, MD 20892)). Munson y Rodbard, Anal. Biochem. 107:
220 - 239 (1980).
Los análisis de la actividad biológica de los
agonistas de la amilina en el músculo sóleo pueden realizarse
utilizando los métodos descritos previamente (Leighton, B. y
Cooper, Nature, 335: 632 - 635 (1988); Cooper, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 7763 - 7766 (1988)), en
los que la actividad del agonista de la amilina puede valorarse
mediante la determinación de la inhibición de la síntesis de
glucógeno estimulada por la insulina. El ensayo con el músculo
sóleo también se describe posteriormente en el Ejemplo 12.
Los métodos de determinación del vaciado gástrico
se dan a conocer en, por ejemplo, Young et al.,
Diabetologia 38(6): 642 - 648 (1995). Utilizando el
método del rojo fenol, que se describe posteriormente en el Ejemplo
13, las ratas conscientes reciben Por sonda nasogástrica un gel
incoloro que contiene hipromelosa y un indicador de rojo fenol.
Veinte minutos después de suministrar el producto por la sonda
nasogástrica, se anestesian los animales utilizando halotano, se
pone al descubierto el estómago y se realiza el pinzamiento en los
esfínteres pilórico y esofágico inferior, se extrae y se abre en
una disolución alcalina. Se puede deducir el contenido del estómago
a partir de la intensidad del rojo fenol en la disolución alcalina,
medido por absorbancia a una longitud de onda de 560 nm. Utilizando
el método de la glucosa tritiada, que se describe posteriormente en
el Ejemplo 14, se administra glucosa tritiada a las ratas
conscientes mediante una sonda nasogástrica. Se sujetaron con
cuidado las ratas por la cola, cuyo extremo se había anestesiado
con lidocaína. El tritio del plasma separado de la sangre de la cola
se recogió en distintos momentos y se detectó con un contador beta.
Los compuestos del ensayo se administran normalmente un minuto
antes de la administración por la sonda nasogástrica.
Los efectos de las amilinas o de los agonistas de
la amilina en el dolor pueden identificarse, analizarse, o
detectarse utilizando los métodos descritos posteriormente en los
Ejemplos 1 a 5, o mediante otras técnicas conocidas o métodos
equivalentes para determinar el efecto analgésico. Véase, por
ejemplo, Tjolsen et al., Handbook of Lab Animal Science
("Manual de ciencias de laboratorio con animales"), Vol. II,
capítulo 12, Animal Models in pain Research (Svendsen, Ed. ,
CRC Press, 1994). Preferentemente los compuestos agonistas de la
amilina presenta una actividad en el ensayo de enlace del orden de
un valor inferior a de 1 a 5 nM, preferentemente menor a 1 nM y más
preferentemente inferior a 50 pm. En el ensayo del músculo sóleo,
los compuestos agonistas de la amilina presentaron unos valores de
CE_{50} inferiores a aproximadamente entre 1 y 10 micromolar. En
los ensayos de vaciado gástrico, los compuesto agonistas preferidos
presentaron unos valores de DE_{50} inferiores a 100
\mug/rata.
La amilina y los péptidos agonistas de la amilina
pueden prepararse utilizando las técnicas estándar de síntesis
peptídica en fase sólida y preferentemente un sintetizador
peptídico automático o semiautomático. Normalmente, empleando dichas
técnicas, un aminoácido protegido por
\alpha-N-carbamoil y un aminoácido
unido a una cadena peptídica en crecimiento en una resina se
enlazan a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como la
dimetilformamida, la N-metilpirrolidinona o cloruro
de metileno en presencia de agentes de adherencia tales como la
diciclohexilcarbodiimida y el hidroxibenzotriazol en presencia de
una base tal como la diisopropiletilamina. Se elimina el grupo
protector \alpha-N-carbamoil de la
resina - péptido resultante empleando un reactivo tal como el ácido
trifluoacético o la piperidina, y la reacción de adherencia se
repite con el siguiente aminoácido protegido en N- para ser añadido
a la cadena peptídica. Los grupos N-protectores
adecuados son bien conocidos en la especialidad, siendo los
preferidos en la presente el t-butiloxicarbonilo
(tBoc) y el fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).
Los disolventes, los derivados de los aminoácidos
y la resina de 4-metilbenzhidrilamina utilizados en
el sintetizador pueden adquirirse en Applied Biosystems Inc.
(Foster City, CA). Los siguientes aminoácidos protegidos de cadena
lateral pueden adquirirse en Applied Biosystems, Inc. :
Boc-Arg (Mts), Fmoc-Arg (Pmc),
Boc-Thr (Bzl), Fmoc-Thr
(t-Bu), Boc-Ser (Bzl),
Fmoc-Ser (t-Bu),
Boc-Tyr (BrZ), Fmoc-Tyr
(t-Bu) , Boc-Lys
(Cl-Z), Fmoc-Lys (Boc),
Boc-Glu (Bzl), Fmoc-Glu
(t-Bu), Fmoc-His (Trt),
Fmc-Asn(Trt), y Fmoc-Gln
(Trt). El Boc-His(BOM) puede adquirirse en
Applied Biosystems, Inc. o en Bachem Inc. (Torrance, CA). El anisol,
el sulfuro de metilo, el fenol, el etanoditiol y el tioanisol
pueden adquirirse en Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Air
Products and Chemicals (Allentown, PA) suministran HF. El éter
etílico, el ácido acético y el metanol pueden adquirirse en Fisher
Scientific (Pittsburgh, PA).
La síntesis peptídica en fase sólida puede
llevarse a cabo con un sintetizador peptídico automático (modelo
430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) utilizando el
sistema NMP/HOBt (Opción 1) y la química de Tboc o Fmoc (véase,
Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide
Synthesizer ("Manual del usuario del sintetizador peptídica
ABI 430A de Applied Biosystems"), versión 1.3B 1 de julio de
1988, sección 6, p. 49 - 70, Applied Biosystems, Inc., Foster
City, CA) con tapón. Las resinas de péptido y Boc pueden disociarse
con HF (-5ºC a 0ºC, 1 hora). El péptido se puede extraer de la
resina con la alternancia de agua y ácido acético, y liofilizando
los filtrados. Las resinas de péptido y Fmoc pueden disociarse de
acuerdo con los métodos estándar (Introduction to Cleavage
Techniques ("Introducción a las técnicas de disociación"),
Applied Biosystems, Inc., 1990, p. 6 - 12). Los péptidos también
pueden ensamblarse empleando un sintetizador de Advanced Chem Tech
(modelo MPS 350, Louisville, Kentucky).
Los péptidos pueden purificarse mediante la
RP-HPLC (preparativa y analítica) empleando un
sistema Waters Delta Prep 3000. Una columna preparativa C4, C8 o
C18 (10 \mu, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) puede utilizarse
para aislar los péptidos, y su pureza puede determinarse empleando
una columna analítica C4, C8 o C18 (5 \mu, 0,46 x 25 cm; Vydac).
Los disolventes (A = 0,1% TFA/agua y B = 0,1% TFA/CH_{3}CN) pueden
llevarse directamente a la columna analítica con un índice de flujo
de 1,0 ml/min y a la columna preparativa a 15 ml/min. Los análisis
de los aminoácidos pueden realizarse en un sistema Waters Pico Tag
y procesarlos empleando el programa Maxima. Los péptidos se pueden
hidrolizar por hidrólisis ácida en fase de vapor (115ºC, 20 - 24
h). Los hidrolizados pueden obtenerse y analizarse mediante métodos
estándar (Cohen, et al., The Pico Tag Method: A Manual of
Advanced Techniques for Amino Acid Analysis ("El método Pico
Tag: un manual de técnicas avanzadas para el análisis de
aminoácidos"), p. 11 - 52, Millipore Corporation, Milford, MA
(1989)). El análisis por bombardeo con átomos rápidos puede ser
realizado por M-Scan, Incorporated (West Chester,
PA). La calibración de masa puede realizarse empleando yoduro de
cesio o yoduro de cesio / glicerina. El análisis de ionización y
desorción del plasma empleando la detección del tiempo de vuelo
puede llevarse a cabo en un espectómetro de masas Applied Biosystems
Bio-Ion 20.
Los compuestos peptídicos útiles en la invención
pueden prepararse utilizando técnicas de ADN recombinante,
empleando métodos hoy en día conocidos en la especialidad. Véase,
por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual ("Clonación molecular: un manual de
laboratorio"), 2ª Ed., Cold Spring Harbor (1989). Los compuestos
no peptídicos útiles en la presente invención pueden prepararse
empleando métodos conocidos en la especialidad.
Los compuestos a los que se ha hecho referencia
anteriormente puede formar sales con distintos ácidos y bases de
tipo inorgánico y orgánico. Dichas sales comprenden las sales
preparadas con ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo el HCl,
el HBr, el H_{2}SO_{4}, el H_{3}PO_{4}, el ácido
trifluoacético, el ácido acético, el ácido metanosulfónico, el
ácido toluenosulfónico, el ácido maleico, el ácido fumárico y el
ácido canforsulfónico. Las sales preparadas con bases comprenden
las sales de amonio, las sales de metales alcalinos, por ejemplo,
las sales de sodio y potasio, y las sales de metales
alcalinotérreos, por ejemplo, las sales de calcio y magnesio. Las
sales preferidas son las sales de acetato, de hidrocloruro y de
trifluoacetato. Las sales pueden formarse por medios convencionales,
como haciendo reaccionar las formas libres de ácido o base del
producto con uno o más equivalentes de la base o ácido apropiados
en un disolvente o medio en el que la sal sea insoluble, o en un
disolvente tal como el agua que a continuación se elimina al vacío o
mediante liofilización o mediante un intercambio de iones de una
sal existente por otro ión de una resina adecuada de intercambio de
iones.
Las composiciones útiles en la invención se
pueden proporcionar oportunamente en la forma de formulaciones
aptas para la administración parenteral (comprendiendo la
intravenosa, la intramuscular y la subcutánea) o nasal u oral. En
algunos casos, resultara conveniente proporcionar un agonista de la
amilina y otro agente analgésico, por ejemplo, un opiáceo, tal como
la morfina, en una única composición o disolución para su
administración conjunta. En otros casos, resultará más ventajoso
administrar otro agente analgésico de forma separada de dicha
amilina o agonista de la amilina. Un formato de administración
adecuado se puede determinar del mejor modo individualmente por el
médico de cabecera de cada paciente. Los transportadores
farmacéuticamente aceptables aptos y su formulación se describen en
los tratados de formulación estándar, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences ("Ciencias farmacéuticas de
Remington") de E.W. Martin. Véase también Wang, Y. J. y Hanson,
M. A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides:
Stability and Stabilizers, ("Formulaciones parenterales de
proteínas y péptidos: estabilidad y estabilizadores")",
Journal of Parenteral Science and Technology, Informe técnico
nº. 10, Supl. 42: 2S (1988).
Los compuestos proporcionados como composiciones
parenterales para su inyección o venoclisis pueden, por ejemplo,
estar suspendidos en un aceite inerte, un aceite vegetal adecuado
como el de sésamo, de cacahuete, de oliva o cualquier otro
transportador aceptable. Preferentemente, se suspenden en un
transportador acuoso, por ejemplo una disolución amortiguadora
isotónica a un pH de aproximadamente entre 5,6 y 7,4. Dichas
composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de
esterilización convencionales, o pueden esterilizarse por
filtración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares
farmacéuticamente aceptables requeridas para aproximarse a las
condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores del pH.
Las disoluciones amortiguadoras del pH útiles comprenden por
ejemplo, las disoluciones amortiguadoras de acetato de sodio /
ácido acético. Una forma de preparación de depósito o de
"almacén" de liberación lenta puede utilizarse de manera que
se distribuyan en el flujo sanguíneo las cantidades de la
preparación que son terapéuticamente eficaces después de muchas
horas o días de inyección o administración transdérmica.
La isotonicidad deseada se puede alcanzar
utilizando cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente
aceptables como la glucosa, el ácido bórico, el tartrato de sodio,
el propilenglicol, los polioles (tales como el manitol y el
sorbitol), u otros solutos inorgánicos u orgánicos. El cloruro de
sodio es particularmente preferido para las soluciones
amortiguadoras que contienen iones de sodio.
Si así se desea, las disoluciones de las
composiciones anteriormente mencionadas pueden espesarse con un
agente espesante tal como la hipromelosa. Pueden preparase en forma
emulsionada, tanto agua en aceite como aceite en agua. Cualquiera de
una amplia gama de agentes emulsionantes farmacéuticamente
aceptables pueden utilizarse entre ellos, por ejemplo, la goma
arábiga, un agente tensoactivo no iónico (tal como el Tween) o un
agente tensoactivo iónico (tal como sulfatos o sulfonatos alcalinos
de poliéter alcohol, por ejemplo, Triton).
Las composiciones útiles en la invención se
preparan mezclando los ingredientes siguiendo los procedimientos
normalmente aceptados. Por ejemplo, los componentes seleccionados
pueden simplemente mezclarse en una licuadora o cualquier otro
dispositivo estándar para producir una mezcla concentrada que a
continuación puede ajustarse hasta la concentración y viscosidad
finales mediante la adición de agua o de un agente espesante y
posiblemente una disolución amortiguadora para controlar el pH o un
soluto adicional para controlar la tonicidad.
Para poder ser utilizadas por el médico, las
composiciones se proveerán en forma de única dosis conteniendo una
cantidad de amilina o de un agonista de la amilina, por ejemplo, un
compuesto análogo agonista de la amilina con o sin otro agente
analgésico que será efectivo en una o múltiples dosis para controlar
el dolor al nivel seleccionado. Las cantidades terapéuticamente
efectivas de amilina o de agonista de la amilina, tal como un
análogo agonista de la amilina, para utilizar en el control del
dolor son aquellas que producen una disminución del dolor. Tal como
reconocerán los expertos en la materia, una cantidad efectiva del
agente terapéutico variará en función de múltiples factores, entre
ellos la edad y el peso del paciente, la condición física del
paciente, la acción que se desea conseguir y otros factores.
Las dosificaciones analgésicas de los compuestos,
únicas, divididas o continuas, por ejemplo, comprendiendo la
^{25,28,29}Pro-h-amilina, la
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina
y la
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina.,
se encontrarán normalmente entre 0,01 ó 0,03 mg/día y 5 mg/día,
preferentemente entre 0,01 ó 0,5 mg/día y 2 mg/día, más
preferentemente entre 0,01 ó 0,1 mg/día y 1 mg/día, para un
paciente de 70 kg, administradas mediante una dosis única dividida
o continua. La dosis exacta a administrar la determina el médico que
atiende al paciente y depende de múltiples factores, entre ellos,
los mencionados anteriormente. La administración ha de iniciarse
cuando se produzcan los primeros signos de dolor. La administración
puede realizarse mediante una inyección o infusión, preferentemente
intravenosa, subcutánea o intramuscular. Los compuestos orales
activos pueden tomarse por vía oral, aunque las dosis han de
aumentarse entre 5 y 10 veces.
Generalmente, en el tratamiento o la prevención
del dolor, los compuestos de la presente administración pueden
administrarse a paciente que necesiten dicho tratamiento en unas
dosificaciones similares a las dadas anteriormente, sin embargo, los
compuestos pueden administrarse con mayor frecuencia, por ejemplo,
una, dos o tres veces al día o de manera continua.
Los machos de ratones suizos Webster (NIH/Sw)
obtenidos en Harlan (Madison, Wisconsin) con un peso de 20 - 35 g
se alojaron agrupados con acceso libre a los alimentos y agua y se
mantuvieron un entorno estable (ciclo luz : oscuridad 12 : 12; 23
\pm 1ºC). Se acostumbró a todos los animales a la sala donde se
realizaban los ensayos durante al menos un día antes de cualquier
experimento, y se analizaron una vez entre las 07:\cdot0 y las
14:00.
La amilina de rata se sintetizó mediante métodos
estándar de síntesis peptídica en fase sólida. La morfina se obtuvo
en los Steris Laboratories (Phoenix, Arizona). Todos los fármacos
se disolvieron en una disolución fisiológica salina, y se
administraron en un volumen de dosis de 10 ml/kg de peso
corporal.
El procedimiento de análisis de los
retorcimientos de los ratones utilizado fue una modificación del
procedimiento dado a conocer en Hendershot y Forsaith, J.
Pharmacol. Expt. Therap., 125: 237 - 240 (1959). Se dejó que
cada ratón se habituara a la caja de observación durante al menos 15
minutos antes de la prueba. SE administró a cada ratón una
inyección intraperitoneal de una disolución de ácido acético al 2%
para provocar una reacción en forma de retorcimientos,
caracterizada por una onda de contracción en la musculatura
abdominal y a continuación la extensión de las extremidades
posteriores. Se contó el número de retorcimientos por animal durante
un intervalo de 10 minutos empezando 5 minutos después de la
inyección con ácido acético.
Se administraron por vía subcutánea (sc) o
intraperitoneal (ip) 0,1 mg/kg de amilina de rata 5, 15, 30 y 60
minutos antes de la inyección con ácido acético a los ratones. Las
inyecciones con la disolución salina se utilizaron como control
negativo.
Los resultados se presentan en las Figuras 1 y 2.
La amilina, cuando se inyecta 30 minutos antes de la inyección con
ácido acético (tanto ip como sc), reduce significativamente el
número de retorcimientos en el período de 10 minutos 5 minutos
después de la inyección con ácido acético en comparación con los
animales tratados con la disolución salina (P < 0,001 para la
inyección ip; P < 0,01 para la inyección sc). El máximo efecto
de la amilina tuvo lugar cuando se administró 30 minutos antes de
la inyección con ácido acético. Se seleccionó el período de 30
minutos para utilizarlo en los estudios de dosis y respuesta
descritos posteriormente en el Ejemplo 2.
En los siguientes estudios de dosis y respuesta
se utilizaron los mismos procedimientos experimentales empleados en
los experimentos descritos en el Ejemplo 1. 30 Minutos antes de la
inyección con ácido acético se administraron inyecciones subcutáneas
y intraperitoneales de amilina de rata (0,001, 0,003, 0,01, 0,1, 1,0
y 10,0 mg/kg). Se utilizó la disolución salina como control
negativo. La morfina (1,0 mg/kg) se utilizó como control positivo.
Los resultados se presentan en las Figuras 3 y 4. La menor
dosificación analgésica efectiva de la amilina en dichos
experimentos fue de 0,01 mg/kg (P < 0,05 sc; P < 0,01 ip).
Una dosis de 0,1 mg/kg resultó también efectiva (P < 0,05 sc; P
< 0,01 ip). En el presente modelo, con mayores dosis
administradas (1 mg/kg y 10 mg/kg), la amilina no presentó una
actividad analgésica significativa (P > 0,05).
En los siguientes estudios de dosis y respuesta
se utilizaron los mismos procedimientos experimentales empleados en
los experimentos descritos en el Ejemplo 1. 30 Minutos antes de la
inyección con ácido acético se administraron inyecciones
intraperitoneales de morfina (0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1,0 y 3,0
mg/kg). Se utilizó la disolución salina como control negativo. La
morfina (1,0 mg/kg) se utilizó como control positivo. Los
resultados se presentan en las Figura 5. La menor dosificación
analgésica efectiva de la amilina en dichos experimentos fue de 0,3
mg/kg (P < 0,05). Las dosis de 1,0 mg/kg y de 3,0 mg/kg
resultaron también efectivas (P < 0,05, P < 0,001
respectivamente).
La capacidad de la amilina para aumentar el
efecto analgésico de la morfina se demuestra en estos experimentos,
empleando los mismos procedimientos experimentales descritos en el
Ejemplo 1. En un experimento, una dosis de amilina de rata que se
había comprobado que era ineficaz (0,03 mg/kg) para producir la
analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se
combinó con 3 dosificaciones de morfina: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y
3,0 mg/kg (Figura 6). En otro experimento, una dosis de amilina de
rata que se había comprobado que era ineficaz (0,01 mg/kg) para
producir la analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo
2 se combinó con las mismas 3 dosificaciones de morfina (Figura
7).
La administración conjunta de la amilina y la
morfina presentó una eficacia aumentada para reducir la analgesia
en comparación con la morfina sola en unas combinaciones de: (1)
0,003 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina, P < 0,05
(Figura 6 ); (2) 0,01 mg/kg de amilina y 0,01 mg/kg de morfina, P
< 0,05 (Figura, 7); y (3) 0,01 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de
morfina, P < 0.05 (Figure 7). Adicionalmente, se demostró que
una combinación de una dosis no analgésica de amilina (0,003 mg/kg)
y una dosis no analgésica de morfina (0,1 mg/kg) producía un efecto
analgésico.
Para caracterizar más la interacción entre la
amilina y la morfina, los resultados de los estudios sobre los
retorcimientos se representaron gráficamente en isobolograma de
acuerdo con el método de Bexebaum, "The expected effect of a
combination of agents: the general solution ("El efecto
esperado de una combinación de agentes: la solución general")",
J. Theor. Biol. 114: 413 (1985). El isobolograma consiste en un
método cuantitativo para determinar las interacciones entre las
dosis de fármacos que son equiefectivas en relación con un criterio
de valoración farmacológico común para indicar sinergia, un efecto
aditivo o antagonismo. En este caso, la prueba de los
retorcimientos se utilizó para realizar el cálculo del nivel común
de la combinación analgésica entre dosis y proporción. El
porcentaje de inhibición para cada componente y la combinación de
la amilina y la morfina se dedujeron a partir de las curvas
sigmoidales de dosis y respuesta de los datos representados en las
figuras 2,5,6 y 7. En un isobolograma, las áreas de dosis
adicional, sinergia y antagonismo se definen claramente en
referencia a una línea recta teórica (adición) que conecta los tres
puntos de cada eje. De acuerdo con la teoría del isobolograma, los
puntos que se sitúan por debajo de la línea de adición representan
una actividad analgésica mejorada y los puntos situados por encima
de dicha línea representan una actividad analgésica disminuida.
La interacción sinérgica entre la amilina y la
morfina en los retorcimientos provocados por el ácido acético en
los ratones se demuestra mediante los datos de la Figura 8, en los
que el efecto analgésico de la amilina sola se presenta en las
ordenadas y el de la morfina sola se presenta en las abscisas. La
interacción sinérgica de la amilina y la morfina al 45% de
inhibición de los retorcimientos presentada en la Figura 8 indica la
existencia de una inesperada actividad analgésica mejorada por
parte de las combinaciones entre la amilina y la morfina. Es decir,
la actividad resultante de la amilina y la morfina juntas resulta
superior a la actividad esperada de la suma de las actividades de
los componentes individuales.
Siguiendo los procedimientos del estudio sobre
los retorcimientos en los ratones de los Ejemplos previos, se
analizó el efecto del antagonista de la morfina, la naloxona, en la
analgesia provocada por la morfina y en la analgesia provocada por
la amilina. En un estudio, se analizó el efecto de diversas
dosificaciones (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg) de
naloxona, administradas conjuntamente con 1,0 mg/kg de morfina. Tal
como se muestra en la Figura 9, las dosis de 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg
resultaron eficaces al contrarrestar la analgesia provocada por la
morfina (como se pone de manifiesto por el número de retorcimientos
por minuto).
En otro estudio, se analizó el efecto de 1,0
mg/kg de naloxona (que se había probado su eficacia al
contrarrestar la analgesia provocada por la morfina en el estudio
anterior) para comprobar su capacidad de contrarrestar la analgesia
provocada por la amilina. Tal como se muestra en la Figura 10, la
respuesta de la morfina (1,0 mg/kg) y la naloxona (1,0 mg/kg)
conjuntamente no resultó significativamente diferente de la
respuesta del control con la disolución salina, indicando que la
naloxona era eficaz al contrarrestar la analgesia provocada por la
morfina. También tal como se muestra en la Figura 10, los
resultados para 0,1 mg/kg ó 1,0 mg/kg de amilina con o sin 1,0 mg/kg
de naloxona son significativamente distintos del control salino,
indicando que la naloxona no resultó eficaz al contrarrestar la
analgesia provocada por la amilina. Dichos resultados indican que
la morfina y la amilina actúan mediante mecanismos distintos para
provocar la analgesia.
Siguiendo los procedimientos de los Ejemplos
previos, el estudio de las características de dosificación de los
analgésicos opiáceos adicionales útiles para aliviar el dolor
cuando se administran con amilina o con agonistas de la amilina se
realiza sustituyendo una cantidad equi-analgésica de
cada uno de: hidromorfona, oximorfona, levorfanol, metadona,
petidina, alfaprodina, fentanol, codeína, oxicodona o hidrocodona
por la morfina de dichos
Ejemplos.
Ejemplos.
La síntesis en fase sólida de
^{25,28,29}Pro-h-amilina empleando
una resina de anclaje - unión de metilbenzhidrilamina y una cadena
de protección lateral de N^{a}-Boc/bencilo se
llevó a cabo mediante métodos estándar de síntesis peptídica. La
resina de ^{2,7}-(disulfuro)amilina-MBHA
se obtuvo tratando las cisteínas protegidas con Acm con
trifluoacetato de talio (III) en ácido trifluoacético. Después de
que se consiguió la ciclización se procedió a la escisión de la
resina y los grupos de protección de la cadena lateral con HF
líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. Se purificó la
^{25,28,29}Pro-h-amilina mediante
HPLC preparativa de fase inversa. Se encontró que el péptido era
homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis capilar y se
confirmó la estructura mediante un análisis de los aminoácidos y un
análisis secuencial. El producto dio la masa iónica deseada.
Espect. de masas FAB : (M + H)* =
3,949.
3,949.
La síntesis en fase sólida de
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina
empleando una resina de anclaje - unión de metilbenzhidrilamina y
una cadena de protección lateral de N-Boc/bencilo
se llevó a cabo mediante métodos estándar de síntesis peptídica. La
resina de ^{2,7}-(disulfuro)amilina-MBHA se
obtuvo tratando las cisteínas protegidas con Acm con trifluoacetato
de talio (III) en ácido trifluoacético. Después de que se consiguió
la ciclización se procedió a la escisión de la resina y los grupos
de protección de la cadena lateral con HF líquido en presencia de
dimetilsulfuro y anisol. Se purificó la
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina
mediante HPLC preparativa de fase inversa. Se encontró que el
péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis
capilar y se confirmó la estructura mediante un análisis de los
aminoácidos y un análisis secuencial. El producto dio la masa
iónica deseada. Espect. de masas FAB : (M + H)* = 3,971.
La síntesis en fase sólida de
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina
empleando una resina de anclaje - unión de metilbenzhidrilamina y
una cadena de protección lateral de N-Boc/bencilo
se llevó a cabo mediante métodos estándar de síntesis peptídica. La
resina de ^{2,7}-(disulfuro)amilina-MBHA
se obtuvo tratando las cisteínas protegidas con Acm con
trifluoacetato de talio (III) en ácido trifluoacético. Después de
que se consiguió la ciclización se procedió a la escisión de la
resina y los grupos de protección de la cadena lateral con HF
líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. Se purificó la
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina
mediante HPLC preparativa de fase inversa. Se encontró que el
péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis
capilar y se confirmó la estructura mediante un análisis de los
aminoácidos y un análisis secuencial. El producto dio la masa
iónica deseada. Espect. de masas FAB : (M + H)* = 3,959.
La valoración del enlace de los componentes a los
receptores de la amilina se llevó a cabo de la siguiente manera. La
^{125}I-amilina de rata (Bolton Hunter marcada en
la lisina N-terminal) se adquirió en Amersham
Corporation (Arlington Heights, IL). Las actividades específicas
durante el tiempo de empleo variaron entre 1950 y 200 Ci/mmol. Los
péptidos sin marcar se adquirieron en BACHEN Inc. (Torrance, CA) y
en los Peninsula Laboratories (Belrnont, CA).
Los machos de rata Sprague Dawley (de 200 - 250
gramos) se sacrificaron por decapitación. Se extrajeron los
encéfalos y se pusieron en una disolución salina amortiguadora de
fosfato (PBS) fría. A partir de la superficie ventral, se
realizaron cortes rostrales hacia el hipotálamo, limitado
lateralmente por los pedúnculos olfativos y se extendieron
internamente en un ángulo de 45º desde dichos pedúnculos. Dicho
tejido del prosencéfalo basal, que contiene el nucleus
accumbens y las regiones circundantes, se pesó y se homogeneizó
en una disolución amortiguadora congelada de 20 mM de HEPES (20 mM
de ácido HEPES, el pH ajustado a 7,4 con NaOH a 23ºC). Las membranas
se lavaron tres veces en la disolución amortiguadora pura durante 15
minutos a 48.000 g. El sedimento membranoso final se
resuspen-
dió en la disolución amortiguadora de 20 mM de HEPES que contenía 0,2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF).
dió en la disolución amortiguadora de 20 mM de HEPES que contenía 0,2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF).
Para determinar el enlace de la
^{125}I-amilina, las membranas desde 4 mg de peso
húmedo original de tejido se incubaron con la
^{125}I-amilina a 12 - 16 pM en la disolución
amortiguadora de 20 mM de HEPES que contenía 0,5 mg/ml de
bacitracina, 0,5 mg/ml de seroalbúmina bovina, y 0,2 mM de PMSF.
Las disoluciones se incubaron durante 60 minutos a 23ºC. Se
finalizaron las incubaciones mediante la filtración a través de
unos filtros de fibra de vidrio GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ) que
se habían empapado previamente durante 4 horas en polietilenimina
al 0,3% a fin de reducir el nivel de enlaces no específicos de los
péptidos radiomarcados. Los filtros se lavaron inmediatamente antes
de la filtración con 5 ml de PBS frío, e inmediatamente después de
la filtración con 15 ml de PBS frío. Se extrajeron los filtros y se
realizó la valoración de la radiactividad en un contador gamma a
una eficiencia de cálculo del 77%. Las curvas de competición se
generaron determinando el enlace en presencia del compuesto de
prueba sin marcar a unas concentraciones entre 10^{-12} y
10^{-6} M y se realizó un análisis de regresión no lineal
empleando una ecuación logística de 4 parámetros (programa:
GraphPAD Inplot Software, San Diego).
En el presente ensayo, la amilina humana
purificada se enlaza con su receptor a una CI_{50} valorada de
aproximadamente 50 pM. Los resultados para los compuestos del
ensayo se presentan en la Tabla I, mostrando que cada uno de los
compuestos presenta una actividad significativa de enlace con el
receptor.
La determinación de la actividad de los
compuestos como agonistas de la amilina se realizó empleando el
ensayo con el músculo sóleo del siguiente modo. Se utilizaron
machos de rata Sprague Dawley de 200 gramos de masa a fin de
mantener la masa en el músculo sóleo escindido inferior a los 40
mg. Se dejó en ayunas a los animales durante las 4 horas previas a
su sacrificio por decapitación. Se quitó la piel a partir de la
extremidad inferior que a continuación se sujetó en un tablero de
corcho. Se cortó el tendón de Aquiles justo por encima del hueso
calcáneo y se podía ver el músculo gastrocnemio en la parte
posterior de la tibia. El músculo sóleo, un músculo pequeño y plano
de 15 - 20 mm de largo y de 0,5 mm de espesor que se encuentra en
la superficie ósea del músculo gastrocnemio, se extirpó limpiamente
y se le quitó el perimisio utilizando unas tijeras finas y unas
pinzas. A continuación se escindió el músculo sóleo en partes
iguales utilizando una cuchilla pasada de modo anteroposterior por
la parte ventral del músculo para obtener un total de 4 fragmentos
musculares de cada animal. Después de diseccionar el músculo del
animal, se mantuvo durante un breve período en una disolución
fisiológica salina. No resultó necesario mantener el músculo en
tensión ya que ello no tiene efectos demostrables en la
incorporación de la radioglucosa en el glucógeno.
Se añadieron los músculos en matraces de
Erlenmeyer de 50 ml que contenían 10 ml de una disolución
amortiguadora de bicarbonato Krebs-Ringer pregaseada
conteniendo (cada litro) 118,5 mmol (6,93 g) de NaCl, 5,94 (443 mg)
mmol de KCl, 2,54 mmol (282 mg) de CaCl_{2}, 1,19 mmol (143 mg)
de MgSO_{4}, 1,19 mmol (162 mg) de KH_{2}PO_{4}, 25 mmol (2,1
g) de NaHCO_{3}, 5,5 mmol (1 g) de glucosa e insulina humana
recombinante (Humulin-R, Eli Lilly, IN) y el
componente del ensayo, tal como se detalla a continuación. Se
comprobó que el pH a 37ºC se encontrase entre 7,1 y 7,4. Los
músculos se asignaron a distintos matraces de manera que los 4
fragmentos musculares de cada animal se distribuyeron
equitativamente entre las distintas condiciones de ensayo. Se
gasearon los medios de incubación haciendo pasar una corriente suave
de carbógeno (95% de O_{2}, 5% de CO_{2}) sobre su superficie
mientras se agitaban continuamente a 37ºC en un baño María que se
hacía oscilar. Después de un período de media hora de
"preincubación", se añadieron a cada matraz 0,5 \muCi de
U-^{14}C-glucosa y se incubaron
durante otros 60 minutos. A continuación se extrajo rápidamente
cada fragmento muscular, se secó y se congeló en N_{2} líquido,
se pesó y se guardó para la posterior determinación del
^{14}C-glucógeno.
Se realizó la determinación del
^{14}C-glucógeno en un frasco de centelleo de 7
ml. Cada muestra muscular congelada se colocó en un frasco y se
digirió en 1 ml de hidróxido de potasio al 60% a 70ºC durante 45
minutos mientras se sometía a agitación continua. El glucógeno
disuelto se precipitó en el frasco añadiendo 3 ml de etanol
absoluto y se enfrió manteniéndolo a -20ºC durante la noche. Se
aspiró suavemente el sobrenadante, se lavó el glucógeno con etanol,
se aspiró y se secó el precipitado al vacío. Se hizo evaporar todo
el etanol para evitar la extinción de la señal durante el recuento
del centelleo. Se redisolvió el glucógeno restante en 1 ml de agua
y 4 ml de fluido de centelleo y se realizó el recuento para el
^{14}C.
El valor de la incorporación de la glucosa en el
glucógeno (expresada en \mumol/g/h) se obtuvo a partir de la
actividad específica de la ^{14}C-glucosa en 5,5
mM de glucosa del medio de incubación, y del recuento total de
^{14}C que permanecía en el glucógeno extraído de cada músculo.
Las curvas de dosis y respuesta se ajustaron a un modelo logístico
de 4 parámetros empleando una rutina iterativa siguiendo el método
de los mínimos cuadrados (ALLFIT, v 2.7, NIH, MD) para deducir las
CE_{50}. Dado que la CE_{50} sigue una distribución logarítmica
normal, se expresa como \pm el error típico del logaritmo. Se
realizaron las comparaciones de datos aparejados empleando las
rutinas basadas en la prueba t de SYSTAT (Wilkinson, "SYSTAT:
the system for statistics ("SYSTAT: el sistema para la
estadística")", SYSTAT Inc., Evanston IL (1989)).
Las curvas de dosis y respuesta se generaron con
los músculos añadidos a los medios que contenían 7,1 nM (1000
\muU/ml) de insulina y cada compuesto de prueba se añadió en unas
concentraciones finales (nominales) de 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 y
1000 nM. Cada ensayo también contenía controles positivos internos
que consistían en un baño simple de amilina de rata archivada,
liofilizada y guardada a -70ºC.
La amilina humana es un péptido hiperglucémico
conocido y las determinaciones de la CE_{50} de las preparaciones
de amilina en el ensayo del músculo sóleo varían normalmente entre
aproximadamente 1 - 10 nM, a pesar de que algunas preparaciones
comerciales que presentan una pureza inferior al 90% tienen unas
CE_{50} superiores debido a la presencia de contaminantes que
provocan que las determinaciones de la actividad sean inferiores.
Los resultados de los compuestos de la prueba se presentan en la
Tabla I.
| Ensayo del enlace con | Ensayo del músculo | |
| el receptor CI_{50} (nM) | sóleo CE_{50} (nM) | |
| 1) ^{28}Pro-h-amilina | 15,0 | 2,64 |
| 2) ^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina | 18,0 | 4,68 |
| 3) ^{2,7}Ciclo-[^{2}Asp,^{7}Lys]-h-amilina | 310,0 | 6,62 |
| 4) ^{2-37}h-amilina | 236,0 | 1,63 |
| 5) ^{1}Ala-h-amilina | 148,0 | 12,78 |
| 6) ^{1}Ser-h-amilina | 33,0 | 8,70 |
| 7) ^{19}Pro-h-amilina | 64,0 | 3,75 |
| 8) ^{25,28}Pro-h-amilina | 26,0 | 13,20 |
| 9) des-^{1}Lys^{25,28}Pro-h-amilina | 85,0 | 7,70 |
| 10) ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina | 32,0 | 2,83 |
| Ensayo del enlace con | Ensayo del músculo | |
| el receptor CI_{50} (nM) | sóleo CE_{50} (nM) | |
| 11) des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina | 82,0 | 3,77 |
| 12) ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina | 21,0 | 1,25 |
| 13) des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina | 21,0 | 1,86 |
| 14) ^{25,28,29}Pro-h-amilina | 10,0 | 3,71 |
| 15) des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina | 14,0 | 4,15 |
El vaciado gástrico se determinó utilizando una
modificación (Plourde et al., Life Sci. 53: 857 - 862
(1993)) del método original de Scarpignato et al. (Arch.
Int. Pharmacodyn. Ther. 246: 286 - 295 (1980). Durante un breve
período, las ratas conscientes recibieron por sonda nasogástrica 1,5
ml de un gel incoloro que contenía hipromelosa al 1,5%
(M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y el
indicador rojo fenol al 0,05%. Veinte minutos después del
suministro por la vía nasogástrica, se anestesiaron las ratas
utilizando halotano al 5%, se puso al descubierto el estómago y se
realizó el pinzamiento de los esfínteres pilórico y esofágico
inferior utilizando pinzas hemostáticas, se extrajo y se abrió en
una disolución alcalina preparada para un volumen fijo. Se pudo
deducir el contenido del estómago a partir de la intensidad del
rojo fenol en la disolución alcalina, medido por absorbancia a una
longitud de onda de 560 nm. En la mayoría de los experimentos el
estómago estaba limpio. En otros experimentos, los contenidos
gástricos particulados se centrifugaron para limpiar la disolución
para las determinaciones de la absorbancia. Allí donde los
contenidos gástricos diluidos permanecieron túrbidos, la absorbancia
espectroscópica debida al rojo fenol se dedujo a partir de la
diferencia entre la presente en la disolución alcalina y la del
diluente acetificado. En unos experimentos separados realizados en 7
ratas, tanto el estómago como el intestino delgado se extirparon y
se vaciaron en una disolución alcalina. La cantidad de rojo fenol
que pudo recuperarse del tracto gastrointestinal superior en 29
minutos de administración nasogástrica fue del 89 \pm 4%; el
tinte que se unió irreversiblemente en la superficie de la luz del
intestino puede haberste tenido en cuenta en el cálculo. Para
compensar esta pequeña pérdida, el porcentaje de los contenidos
restantes del estómago después de 20 minutos se expresó como una
fracción de los contenidos gástricos extraídos de las ratas de
control sacrificadas inmediatamente después de la administración
nasogástrica en el mismo experimento. Porcentaje de los contenidos
restantes del vaciado gástrico = (absorbancia en el minuto 20) /
(absorbancia en el minuto 0). Las curvas de dosis y respuesta para
el vaciado gástrico se ajustaron a un modelo logístico de 4
parámetros empleando una rutina iterativa siguiendo el método de
los mínimos cuadrados (ALLFIT, v 2.7, NIH, MD) para deducir las
DE_{50}. Dado que la DE_{50} sigue una distribución logarítmica
normal, se expresa como \pm el error típico del logaritmo. Se
realizaron las comparaciones de datos aparejados empleando el
análisis unidireccional de la varianza y la prueba de comparaciones
múltiples de Student-Newman-Keuls
(Instat v 2.0, GraphPad Software, San Diego, CA) utilizando un
nivel de significación de P < 0,05.
En los estudios de dosis y respuesta, la amilina
de rata (Bachem, Torrance, CA) se disolvió en una disolución salina
0,15 M, se administró inyección subcutánea rápida de 0,1 ml a dosis
de 0, 0,01, 0,1, 1, 10 ó 100 \mug 5 minutos antes de la
administración nasogástrica en ratas Sprague Dawley (no diabéticas)
que habían ayunado durante 20 horas y en ratas BB diabéticas que
habían ayunado durante 6 horas. Cuando las inyecciones subcutáneas
de amilina se administraron 5 minutos antes de la administración
nasogástrica con el indicador rojo fenol, se produjo una supresión
en función de la dosis del vaciado gástrico (no se presentan los
datos). La supresión del vaciado gástrico fue completa en las ratas
HSD normales a las que se administro 1 \mug de amilina, y en las
ratas diabéticas a las que se administraron 10 \mug (P = 0,22,
0,14). La DE_{50} para la inhibición del vaciado gástrico en
ratas normales fue de 0,43 \mug (0,60 nmol/kg) \pm 0,19 unidades
logarítmicas, y fue de 2,2 \mug (2,3 nmol/kg) \pm 0,18 unidades
logarítmicas en ratas diabéticas.
Se sujetaron las ratas Harlan Sprague Dawley,
conscientes y sin ayunar, por la cola, cuyo extremo se había
anestesiado con lidocaína al 2%. El tritio del plasma separado de
la sangre de la cola se recogió 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos
después de la administración nasogástrica y se detectó con un
contador beta. Se inyectaron las ratas por vía subcutánea con una
disolución salina de 0,1 ml que contenía 0, 0,1, 0,3, 1, 10 ó 100
\mug de amilina de rata 1 minuto antes de la administración
nasogástrica (n = 8, 7, 5, 5, 5, respectivamente). Después de la
administración nasogástrica de la disolución salina las ratas
preinyectadas con la glucosa tritiada, el tritio en el plasma
aumentó rápidamente ( t 1/2 de aproximadamente 8 minutos) hasta una
asíntota que disminuyó lentamente. La inyección con amilina
ralentizó en función de la dosis y/o retardó la absorción del
marcador. La actividad del tritio en el plasma se integró después de
30 minutos para obtener las áreas por debajo de la curva trazada
como función de la dosis de amilina. La DE_{50} que se calculó
con el ajuste logístico fue de 0,35 \mug de amilina.
Claims (20)
1. El uso de la amilina o de un análogo de la
amilina que actúa como agonista de la amilina en la fabricación de
un medicamento para utilizarlo en un método de tratamiento del
dolor en mamíferos.
2. El uso según la reivindicación 1 en el que
dicha amilina o análogo de la amilina se basa en la amilina
humana.
3. El uso según la reivindicación 2 en el que
dicho análogo de la amilina es la
^{25,28,29}Pro-h-amilina.
4. El uso según las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en
el que dicha amilina o análogo de la amilina se administra en
combinación con un analgésico opiáceo.
5. El uso según la reivindicación 4 en el que
dicho analgésico opiáceo se selecciona de entre la morfina, la
pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el levorfanol, la
metadona, la petidina, la anileridina, la alfaprodina, el fentanol,
la codeína, la oxicodona y la hidrocodona.
6. El uso según la reivindicación 5 en el que
dicho analgésico opiáceo es la morfina.
7. El uso según la reivindicación 5 en el que
dicho analgésico opiáceo es la pentazocina.
8. El uso de la amilina o un análogo de la
amilina que actúa como agonista de la amilina en la fabricación de
un medicamento para aumentar la actividad analgésica de un
analgésico opiáceo en el que la amilina o el análogo de la amilina
se administra en combinación con el analgésico opiáceo.
9. El uso según la reivindicación 8 en el que
dicha amilina o análogo de la amilina se basa en la amilina
humana.
10. El uso según la reivindicación 9 en el que
dicho análogo de la amilina es la
^{25,28,29}Pro-h-amilina.
11. El uso según las reivindicaciones 8, 9 ó 10
en el que dicho analgésico opiáceo se selecciona de entre la
morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el
levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina, la
alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la
hidrocodona.
12. El uso según la reivindicación 11 en el que
dicho analgésico opiáceo es la morfina.
13. El uso según la reivindicación 11 en el que
dicho analgésico opiáceo es la pentazocina.
14. Una composición farmacéutica que comprende:
(1) la amilina o un análogo agonista que actúa como agonista de la
amilina o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable; y (2)
un analgésico opiáceo o una sal del mismo farmacéuticamente
aceptable.
15. Una composición según la reivindicación 14
que además comprende un transportador farmacéuticamente
aceptable.
16. Una composición según las reivindicaciones 14
o 15 en la que dicha amilina o análogo de la amilina se basa en la
amilina humana.
17. Una composición según la reivindicación 16
en el que dicho análogo de la amilina es la
^{25,28,29}Pro-h-amilina.
18. Una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17 en la que dicho analgésico opiáceo se
selecciona de entre la morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la
oximorfona, el levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina,
la alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la
hidrocodona.
19. Una composición según la reivindicación 18 en
el que dicho analgésico opiáceo es la morfina.
20. Una composición según la reivindicación 18 en
el que dicho analgésico opiáceo es la pentazocina.
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