ES2302353T3 - Procedimiento para prevenir gastritis usando amilina o agonistas de amilina. - Google Patents
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Abstract
Uso de una amilina o un análogo de agonista de amilina seleccionado entre el grupo que consiste en: i) Un análogo de agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: 1 A1-X-Asn-Thr- 5 Ala-Thr-Y-Ala-Thr- 10 Gln-Arg-Leu-B 1-Asn- 15 Phe-Leu-C 1-D 1-E 1- 20 F 1-G 1-Asn-H 1-Gly- 25 Pro-I 1- Leu-Pro-J 1- 30 Thr-K 1-Val-Gly-Ser- 35 Asn-Thr-Tyr-Z en la que A 1 es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; B1 es Ala, Ser o Thr; C 1 es Val, Leu o Ile; D1 es His o Arg; E 1 es Ser o Thr; F1 es Ser, Thr, Gln o Asn; G1 es Asn, Gln o His; H 1 es Phe, Leu o Tyr; I1 es Ile, Val, Ala o Leu; J 1 es Ser, Pro o Thr; K1 es Asn, Asp o Gln; X e Y son residuos seleccionados independientemente que tienen cadenas laterales que están químicamente enlazadas entre sí para formar una unión intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que A1 es Lys, B1 es Ala, C1 es Val, D1 es Arg, E1 es Ser, F1 es Ser, G 1 es Asn, H 1 es Leu, I 1 es Val, J 1 es Pro y K 1 es Asn; entonces uno o más de A 1 a K 1 es un aminoácido D y Z se selecciona entre el grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. ii) Un análogo de agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: 1 A1-X-Asn-Thr- 5 Ala-Thr-Y-Ala-Thr- 10 Gln-Arg-Leu-B 1-Asn- 15 Phe-Leu-C 1-D 1-E 1- 20 F 1-G 1-Asn-H 1-Gly- 25 Pro-I 1- Leu-J1-Pro- 30 Thr-K1-Val-Gly-Ser- 35 Asn-Thr-Tyr-Z en la que A1 es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; B1 es Ala, Ser o Thr; C 1 es Val, Leu o Ile; D1 es His o Arg; E 1 es Ser o Thr; F1 es Ser, Thr, Gln o Asn; G 1 es Asn, Gln o His; H1 es Phe, Leu o Tyr; I 1 es Ile, Val, Ala o Leu; J1 es Ser, Pro, Leu, Ile o Thr; 16 null K1 es Asn, Asp o Gln; ES 2 302 353 T3 X e Y son residuos seleccionados independientemente que tienen cadenas laterales que están químicamente enlazadas entre sí para formar una unión intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que (a) A 1 es Lys, B 1 es Ala, C 1 es Val, D 1 es Arg, E 1 es Ser, F 1 es Ser, G 1 es Asn, H 1 es Leu, I 1 es Val, J 1 es Pro y K 1 es Asn; o (b) A1 es Lys, B1 es Ala, C1 es Val, D1 es His, E1 es Ser, F1 es Asn, G1 es Asn, H1 es Leu, I1 es Val, J1 es Ser y K1 es Asn; entonces uno o más de A1 a K1 es un aminoácido D y Z se selecciona entre el grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. iii) Un análogo de agonista de amilina que tiene la secuencia de aminoácidos: 1 A1-X-Asn-Thr- 5 Ala-Thr-Y-Ala-Thr- 10 Gln-Arg-Leu-B1-Asn- 15 Phe-Leu-C1-D1-E1- 20 F1-G1-Asn-H1-Gly- 25 I1-J1- Leu-Pro-Pro- 30 Thr-K1-Val-Gly-Ser- 35 Asn-Thr-Tyr-Z en la que A1 es Lys, Ala, Ser o hidrógeno; B 1 es Ala, Ser o Thr; C1 es Val, Leu o Ile; D1 es His o Arg; E 1 es Ser o Thr; F1 es Ser, Thr, Gln o Asn; G 1 es Asn, Gln o His; H1 es Phe, Leu o Tyr; I 1 es Ala o Pro; J1 es Ile, Val, Ala o Leu; K 1 es Asn, Asp o Gln; X e Y son residuos seleccionados independientemente que tienen cadenas laterales que están químicamente enlazadas entre sí para formar una unión intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que A 1 es Lys, B 1 es Ala, C 1 es Val, D 1 es Arg, E 1 es Ser, F 1 es Ser, G 1 es Asn, H 1 es Leu, I 1 es Pro, J 1 es Val y K 1 es Asn; entonces uno o más de A 1 a K 1 es un aminoácido D y Z se selecciona entre el grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi. o del grupo que consiste en 18 Arg 25,28 Pro-h-amilina, des- 1 Lys 18 Arg 25,28 Pro-h-amilina, 18 Arg 25¿28,29 Pro-h-amilina, des- 1 Lys 18 Arg 25,28,29 Pro-h-amilina, 25,28¿29 Pro-h-amilina, des- 1 Lys 25,28,29 Pro-h-amilina, 25 Pro 26 Val 28,29 Pro-h-amilina, 23 Leu 25 Pro 26 Val 28,29 Pro-h-amilina, 23 Leu 25 Pro 26 Val 28 Pro-h-amilina, des- 1 Lys 23 Leu 25 Pro 26 Val 28 Pro-h-amilina, 18 Arg 23 Leu 25 Pro 26 Val 28 Pro-h-amilina, 18 Arg 23 Leu 25,28,29 Pro-h-amilina, 18 Arg 23 Leu 25,28 Pro-h-amilina, 17 Ile 23 Leu 25,28,29 Pro-h-amilina, 17 Ile 25,28,29 Pro-h-amilina, des- 1 Lys 17 Ile 23 Leu 25,28,29 Pro-h-amilina, 17 Ile 18 Arg 23 Leu-h-amilina, 17 Ile 18 Arg 23 Leu 26 Val 29 Pro-h-amilina, 17 Ile 18 Arg 23 Leu 25 Pro 26 Val 28,29 Pro-h-amilina, 13 Thr 21 His 23 Leu 26 Ala 28 Leu 29 Pro 31 Asp-h-amilina, 13 Thr 21 His 23 Leu 26 Ala 29 Pro 31 Asp-h-amilina, des- 1 Lys 13 Thr 21 His 23 Leu 26 Ala 28 Pro 31 Asp-h-amilina, 13 Thr 18 Arg 21 His 23 Leu 26 Ala 29 Pro 31 Asp-h-amilina, 13 Thr 18 Arg 21 His 23 Leu 28,29 Pro 31 Asp-h-amilina, y 13 Thr 18 Arg 21 His 23 Leu 25 Pro 26 Ala 28,29 Pro 31 Asp-h-amilina para preparación de una composición farmacéutica para tratar o prevenir la gastritis o úlcera gástrica en un sujeto, comprendiendo dicha composición farmacéutica dicha amilina o dicho análogo de agonista de amilina, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en un vehículo y dosis farmacéuticamente aceptables, en el que dicha composición se administra por una ruta seleccionada entre el grupo que consiste en administración subcutánea, intravenosa, nasal, oral, pulmonar, transdérmica y bucal.
Description
Procedimiento para prevenir gastritis usando
amilina o agonistas de amilina.
Esta solicitud es una continuación en parte del
documento de EE.UU. nº de serie 08/851.965, presentado el 6 de mayo
de 1997, correspondiente al documento
US-7.101.853.
La presente invención se refiere a
procedimientos para tratar o prevenir gastritis o lesión gástrica
por administración de una amilina o un agonista de amilina. La
presente invención también se refiere al tratamiento de dolor,
fiebre, inflamación, artritis, hipercoagulabilidad u otras dolencias
para las que estaría indicado un fármaco antiinflamatorio no
esteroideo, que comprende administración de una amilina o un
agonista de amilina en conjunción con un fármaco antiinflamatorio
no esteroideo. También se describen mediante la presente invención
composiciones farmacéuticas que comprenden una amilina o un
agonista de amilina y un agente inflamatorio no esteroideo.
Todas las publicaciones y otros materiales que
incluyen patentes y solicitudes de patentes se usan simplemente
para ilustrar la memoria descriptiva.
La estructura y la biología de la amilina se han
revisado anteriormente. Véase, por ejemplo, Rink y col., Trends
in Pharmaceutical Sciences, 14:113-118 (1993);
Gaeta y Rink, Med. Chem. Res., 3:483-490
(1994); y Pittner y col., J. Cell. Biochem.,
55S:19-28 (1994).
La amilina es una hormona de proteínas de 37
aminoácidos. Fue aislada, purificada y caracterizada químicamente
como el principal componente de depósitos amiloides en los islotes
de páncreas de diabéticos de tipo II humano (Cooper y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU. 84:8628-8632
(1987)). La molécula de amilina tiene dos modificaciones
post-traslacionales importantes: el término C está
amidado, produciendo tirosinamida como el 37º residuo de
aminoácido, y las cisteínas en las posiciones 2 y 7 están
reticuladas para formar un residuo de cistina y, así, un bucle
N-terminal. La secuencia del marco de lectura
abierto del gen de amilina humana muestra la presencia de la señal
de escisión proteolítica de aminoácidos dibásicos
Lys-Arg, antes del codón N-terminal
para Lys, y el Gly antes de la señal proteolítica
Lys-Arg en la posición C-terminal,
una secuencia típica para amidación para enzima de amidación de
proteína, PAM (Cooper y col., Biochem. Biophys. Acta,
1014:247-258 (1989)). La amilina es el objeto de la
solicitud de patente del Reino Unido nº de serie 8.709.871,
presentada el 27 de abril de 1987, y la correspondiente patente de
EE.UU. nº 5.367.052, concedida el 22 de noviembre de 1994, y la
patente EP nº 289.287.
En la diabetes de tipo 1, se ha demostrado que
la amilina es deficiente, y se ha propuesto la sustitución
combinada con insulina como tratamiento preferido por encima de la
insulina en solitario en todas las formas de diabetes. El uso de
amilina y otros agonistas de amilina para el tratamiento de diabetes
mellitus es el objeto de la patente de Estados Unidos nº 5.175.145,
concedida el 29 de diciembre de 1992. Las composiciones
farmacéuticas que contienen amilina y amilina más insulina se
describen en la patente de Estados Unidos nº 5.124.314, concedida
el 23 de junio de 1992.
La amilina se sintetiza principalmente en
células beta pancreáticas y es secretada en respuesta a estímulos
de nutrientes como glucosa y arginina. Los secretagogos de
nutrientes como glucosa y arginina estimulan la liberación de
amilina, así como insulina. La proporción molar amilina:insulina de
las proteínas secretadas varía entre preparados de aproximadamente
0,01 a 0,4, pero parece no variar mucho con estímulos agudos en
cualquier preparado. Sin embargo, durante estimulación prolongada
por glucosa elevada, la proporción amilina:insulina puede aumentar
progresivamente (Gedulin y col., Biochem. Biophys. Res.
Commun., 180(1):782-789 (1991)). Así, la
amilina y la insulina no siempre se secretan en una proporción
constante.
Se ha descubierto y comunicado que ciertas
acciones de la amilina son similares a las acciones no metabólicas
de CGRP y calcitonina; sin embargo, las acciones metabólicas de la
amilina descubiertas durante investigaciones de esta proteína
identificada recientemente parecen reflejar su papel biológico
principal. Al menos algunas de estas acciones metabólicas son
emuladas por CGRP, si bien a dosis que son acusadamente
vasodilatadoras (véase, por ejemplo, Leighton y col.,
Nature, 335:632-635 (1988)); Molina y col.,
Diabetes, 39:260-265 (1990)).
La primera acción descubierta de la amilina fue
la reducción de incorporación estimulada por insulina de glucosa en
glucógeno en músculo esquelético en ratas (Leighton y col.,
Nature, 335:632-635 (1988)); el músculo se
hizo "insulinorresistente". El trabajo posterior con músculo
sóleo de ratas ex vivo e in vitro ha indicado que la
amilina reduce la actividad de glucógeno-sintasa,
promueve la conversión de glucógeno-fosforilasa a
partir de la forma b inactiva en la forma a activa, promueve la
pérdida neta de glucógeno (en presencia o ausencia de insulina),
aumenta los niveles de
glucosa-6-fosfato, y puede aumentar
la producción de lactato (véase, por ejemplo, Deems y col.,
Biochem. Biophys. Res. Commun.,
181(1):116-120 (1991)); Young y col.,
FEBS Letts, 281(1,2):149-151 (1991)).
La amilina no parece afectar al transporte de glucosa en sí (por
ejemplo, Pittner y col., FEBS Letts, 365(1),
98-100 (1995)). Los estudios de relaciones de
respuesta a la dosis de amilina e insulina demuestran que la
amilina actúa como un antagonista no competitivo o funcional de
insulina en músculo esquelético (Young y col., Am. J.
Physiol., 263(2):E274-E281 (1992)). No
existe evidencia de que la amilina interfiera con la unión de
insulina a sus receptores, o la posterior activación de receptor de
insulina tirosincinasa (Follett y col., Clinical Research, 39
(1):39A (1991)); Koopmans y col., Diabetologia,
34:218-224 (1991)).
Se cree que la amilina actúa a través de
receptores presentes en membranas de plasma. Los estudios de amilina
y CGRP, y el efecto de antagonistas selectivos, sugieren que la
amilina actúa por medio de su propio receptor (Beaumont y col.,
Br. J. Pharmacol., 115(5):713-715
(1995); Wang y col., FEBS Letts., 219:195-198
(1991 b)), contrario a la conclusión de otros investigadores de que
la amilina puede actuar principalmente en receptores CGRP (por
ejemplo, Chantry y col., Biochem. J.,
277:139-143 (1991)), Galeazza y col.,
Peptides, 12:585-591 (1991)); Zhu y col.,
Biochem. Biophys. Res. Commun.,
177(2):771-776 (1991)). Los receptores de
amilina y su uso en procedimientos para detección selectiva y ensayo
de compuestos agonistas y antagonistas de amilina se describen en
la patente de Estados Unidos nº 5.264.372, concedida el 23 de
noviembre de 1993.
Mientras la amilina tiene efectos acusados en
metabolismo de combustible hepático in vivo, no existe
acuerdo general sobre qué acciones de la amilina se observan en
hepatocitos aislados o hígado perfundido. Los datos disponibles no
sustentan la idea de que la amilina promueve la glucogenólisis
hepática, es decir, no actúa como glucagón (por ejemplo, Stephens y
col., Diabetes, 40:395-400 (1991);
Gomez-Foix y col., Biochem J.,
276:607-610 (1991)). Se ha sugerido que la amilina
puede actuar sobre el hígado para promover la conversión de lactato
a glucógeno y para potenciar la cantidad de glucosa capaz de ser
liberada por glucagón (véase Roden y col., Diabetologia,
35:116-120 (1992)). Es lo más probable que la
amilina no tenga efecto directo en las células hepáticas (Pittner,
R. A., Eur. J. of Pharm. 325:189-197
(1997)).
En las células grasas, al contrario que su
acción en el músculo, la amilina no tiene acciones detectables en
la captación de glucosa estimulada por insulina, la incorporación de
glucosa en triglicérido, la producción de CO_{2} (Cooper y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7763-7766 (1988)),
la lipólisis estimulada por epinefrina o la inhibición por insulina
de lipólisis (Lupien y Young, "Diabetes Nutrition and Metabolism -
Clinical and Experimental", Vol. 6(1), páginas 1318
(febrero de 1993)). La amilina ejerce así efectos específicos de
tejidos, con acción directa sobre el músculo esquelético, y efectos
indirectos (por medio de suministro de sustrato) sobre el hígado,
mientras los adipocitos parecen "ciegos" a la presencia o
ausencia de amilina.
Se ha comunicado también que la amilina puede
tener efectos acusados en la secreción de insulina (Young y col.,
Mol. Cell. Endocrinol., 84:R1-R5 (1992)).
Otros investigadores, sin embargo, han sido incapaces de detectar
efectos de la amilina en células \beta aisladas, en islotes
aislados, o en todo el animal (véase Broderick y col., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 177:932-938 (1991) y
referencias en el mismo).
La amilina o los agonistas de amilina inhiben
potentemente el vaciado gástrico en ratas (Young y col.,
Diabetologia 38(6):642-648 (1995)),
perros (Brown y col., Diabetes 43 (Supl. 1):172A (1994)) y
seres humanos (Macdonald y col., Diabetologia
38(Supl. 1):A32 (resumen 118) (1995)). Según se informa, el
vaciado gástrico se acelera en ratas BB diabéticas de tipo 1
deficientes en amilina (Young y col., Diabetologia, más
arriba; Nowak y col., J. Lab. Clin. Med.,
123(1):110-6 (1994)) y en ratas tratadas con
el antagonista de amilina selectivo, AC187 (Gedulin y col.
Diabetologia, 38(Supl. 1):A244 (1995). Los
procedimientos para reducir la motilidad gástrica y ralentizar el
vaciado gástrico que comprenden la administración de un agonista de
amilina (incluyendo amilina) son objeto de la solicitud PCT,
Publicación nº WO-95/07.098, publicada el 16 de
marzo de 1995. El efecto de la amilina en el vaciado gástrico
parece ser fisiológico (operativo en concentraciones que circulan
normalmente).
Se han estudiado también los niveles
suprafisiológicos de amilina, según se informa, en lo que respecta a
la inhibición de secreción de ácido gástrico (Guidobono, F., y
col., Peptides 15:699-702 (1995)) y en lo
que respecta a la protección frente a gastritis (Guidobono y col.,
Brit. J. Pharm. 120:581-86 (1997)). Los
últimos autores comunicaron que las inyecciones subcutáneas de
amilina no tenían efecto en gastritis inducidas por etanol o
indometacina en ratas, aunque las inyecciones
intracerebroventriculares sí tuvieron un efecto. Los mismos autores
concluyeron también que todos los efectos gastroprotectores de la
amilina eran distintos de los efectos para inhibir la
secreción
ácida.
ácida.
Las acciones no metabólicas de amilina incluyen
efectos vasodilatadores que pueden estar mediados por la interacción
con receptores vasculares de CGRP. Las pruebas in vivo
comunicadas sugieren que la amilina es al menos de aproximadamente
100 a 1.000 veces menos potente que el CGRP como vasodilatador
(Brain y col., Eur. J. Pharmacol., 183:2221 (1990); Wang y
col., FEBS Letts., 291:195-198 (1991)). Se ha
comunicado el efecto de amilina en acciones hemodinámicas
regionales, incluyendo el flujo sanguíneo renal, en ratas
conscientes (Gardiner y col., Diabetes,
40:948-951 (1991)). Los autores de la invención
observaron que la infusión de amilina en ratas se asoció con mayor
vasodilatación renal y menor vasoconstricción mesentérica que la que
se observa con infusión de \alpha-CGRP humano.
Concluyeron que, promoviendo la hiperemia renal en una mayor medida
que lo hizo el \alpha-CGRP, la amilina en ratas
podría causar menor estimulación acusada que el sistema de
renina-angiotensina, y así, menor vasoconstricción
mediada por angiotensina II secundaria. También se observó, sin
embargo, que durante la coninfusión de
\alpha-^{8,37}CGRP humano y amilina en ratas,
las vasoconstricciones renales y mesentéricas estaban no
enmascaradas, presumiblemente debido a efectos de vasoconstrictor
sin oposición de angiotensina II, y que este hallazgo es similar al
observado durante coinfusión de \alpha-CGRP humano
y \alpha-^{8,37}CGRP humano (id. en 951).
Inyectada en el encéfalo, o administrada
periféricamente, se ha comunicado que la amilina suprime la ingesta
de alimento, por ejemplo, Chance y col., Brain Res.,
539:352-354 (1991)), una acción compartida con CGRP
y calcitonina. Se ha comunicado también que la amilina tiene efectos
tanto en osteoclastos aislados en los que causó quiescencia
celular, como in vivo en lo que se comunicó un descenso en
calcio en el plasma de hasta el 20% en ratas, en conejos y en seres
humanos con enfermedad de Paget (véase, por ejemplo, Zaidi y col.,
Trends in Endocrinol. and Metab., 4:255-259
(1993)). A partir de los datos disponibles, la amilina parece ser
menos potente que la calcitonina humana para estas acciones. De modo
interesante, se comunicó que la amilina parecía aumentar la
producción cAMP de osteoclastos pero sin aumentar el Ca^{2+}
citosólico, mientras la calcitonina hace ambas cosas (Alam y col.,
Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1),
134-139 (1991)). Se sugirió, aunque no se
estableció, que la calcitonina puede actuar por medio de dos tipos
de receptores y que la amilina puede interaccionar con uno de
ellos.
También se ha descubierto que, sorprendentemente
a la vista de sus propiedades vasodilatadores renales y otras
descritas anteriormente, la amilina aumenta acusadamente la
actividad de renina en plasma en ratas intactas cuando se
suministra por vía subcutánea de una manera que evita cualquier
trastorno en la presión arterial. Este último punto es importante
porque la reducción de la presión arterial es un estímulo intenso
para la liberación de renina. Los antagonistas de amilina, como
antagonistas de receptores de amilina, que incluyen los selectivos
para receptores de amilina en comparación con CGRP y/o receptores de
calcitonina, pueden usarse para bloquear el ascenso evocado por
amilina de la actividad de renina en plasma. El uso de antagonistas
de amilinas para tratar trastornos relacionados con la renina se
describe en la patente de Estados Unidos nº 5.376.638, concedida el
27 de diciembre de 1994.
Se ha encontrado también que la amilina y los
agonistas de amilina tienen un efecto analgésico; se describen
procedimientos para tratar el dolor que comprenden la administración
de una amilina o un agonista de amilina con o sin un analgésico
narcótico u otro agente para aliviar el dolor en la patente de
EE.UU. nº 5.677.279, concedida el 14 de octubre de 1997.
En seres humanos normales, se han comunicado
niveles de amilina en ayunas de 1 a 10 pM y niveles posprandiales o
posglucosa de 5 a 20 pM (por ejemplo, Hartter y col.,
Diabetologia, 34:52-54 (1991); Sanke y col.,
Diabetologia, 34:129-132 (1991); Koda y
col., The Lancet, 339:1179-1180 (1992)). En
individuos obesos insulinorresistentes, los niveles de amilina
poscomida pueden elevarse, alcanzando hasta aproximadamente 50 pM.
En comparación, los valores para insulina en ayunas y posprandial
son de 20 a 50 pM, y de 100 a 300 pM respectivamente en personas
sanas, con tal vez de 3 a 4 veces niveles más altos en personas
insulinorresistentes. En diabetes de tipo 1, en la que se destruyen
células beta, los niveles de amilina están en o por debajo de los
niveles de detección y no aumentan en respuesta a glucosa (Koda y
col., The Lancet, 339:1179-1180 (1992)). En
ratones y ratas normales, se han comunicado niveles basales de
amilina de 30 a 100 pM, mientras que se han medido valores de hasta
600 pM en ciertas cepas diabéticas insulinorresistentes de roedores
(por ejemplo, Huang y col., Hypertension,
19:I-101-I-109
(1991); Gill y col., Life Sciences,
48:703-710(1991)).
La gastritis es la inflamación de la mucosa
gástrica. La dolencia no refleja una sola enfermedad. Al contrario,
es común dentro de un grupo de trastornos que tienen cambios
inflamatorios en la mucosa gástrica, pero que pueden tener
diferentes rasgos clínicos, características histológicas y
patogénesis. Las dos formas principales de gastritis, que
constituyen diferentes entidades clínicas, son gastritis aguda y
gastritis crónica. Harrison's Principles of Internal Medicine
(Wilson y col., ed., 12ª ed. 1991, McGraw-Hill,
Inc.) en páginas 1244-1248.
La principal, y ciertamente la más llamativa,
forma de gastritis aguda es la gastritis hemorrágica aguda, que se
refiere también como gastritis erosiva aguda. Estos términos
reflejan el sangrado de la mucosa gástrica encontrado casi
invariablemente en esta forma de gastritis y la pérdida
característica de integridad de la mucosa gástrica (erosión) que
acompaña a la lesión inflamatoria. Se ha estimado que la gastritis
erosiva se produce en asta el 80 al 90% de pacientes hospitalizados
en estado crítico. Se encuentra con la máxima frecuencia en
pacientes en unidades de cuidados intensivos médicos o quirúrgicos
con traumatismo grave, cirugía importante, insuficiencia hepática,
renal o respiratoria, shock, quemaduras masivas o infecciones graves
con septicemia.
Se conocen varios agentes que dañan la mucosa
gástrica. Entre ellos se incluyen la aspirina y otros fármacos
antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), ácidos biliares, enzimas
pancreáticos y etanol. Estos agentes rompen la barrera de la mucosa
gástrica, que en condiciones normales impide la retrodifusión de
iones de hidrógeno desde la luz gástrica a la mucosa (a pesar y en
contra de un enorme gradiente de concentración de H+). La causa más
común y muy importante de gastritis erosiva aguda asociada a
fármacos es la ingestión de aspirina u otros NSAID. Esos fármacos
inhiben la actividad de ciclooxigenasa de la mucosa gástrica,
reduciendo con ello la síntesis y los niveles tisulares de
prostaglandinas de mucosa endógenas, que parecen desempeñar papeles
importantes en la defensa de la mucosa. Se piensa que esta reducción
en las prostaglandinas tisulares es un mecanismo principal, pero
tal vez no el exclusivo, por el que la aspirina y otros NSAID dañan
la mucosa gástrica.
Las dos formas principales de gastritis crónica
se han clasificado como tipo A y B basándose en sus distribuciones
en la mucosa gástrica acoplada con algunas implicaciones relativas a
su patogénesis. La gastritis de tipo A es la forma menos común de
gastritis crónica; implica de modo característico el cuerpo y fondo
del estómago con escasez relativa del antro. La gastritis de tipo B
es la forma más común de gastritis crónica. En pacientes jóvenes,
la gastritis de tipo B implica principalmente el antro, mientras en
los pacientes mayores está afectado todo el estómago.
Los fármacos o agentes antiinflamatorios no
esteroideos (NSAID) son analgésicos útiles, sin embargo, tienen la
propiedad adversa de inducir diversos efectos gástricos en una gran
fracción de pacientes; dichos efectos gástricos incluyen gastritis,
úlcera gástrica, malestar epigástrico, náuseas, vómitos y hemorragia
(Woodbury, D.M. y Fingl, E.
Analgesic-antipyretics,
anti-inflammatory agents, and drugs employed in the
therapy of gout, en The Pharmacological Basis of Therapeutics
(Goodman, L.S., y Gilman, A., ed.) 325-43 (1975)).
El efecto secundario más común de los NSAID es una propensión a
inducir úlceras gástricas o intestinales que a veces pueden
acompañarse de anemia por la pérdida de sangre resultante. Los
pacientes que usan NSAID sobre una base crónica tienen
aproximadamente tres veces más riesgo relativo de sufrir episodios
gastrointestinales adversos serios en comparación con quienes no
los usan (Gabriel y col., "Risk for serious gastrointestinal
complications related to the use of nonsteroidal antiinflammatory
fármacos. A meta analysis", Ann. Intern. Med.
115:1117-1125 (1991)). El daño gástrico por estos
agentes puede desencadenarse al menos por dos mecanismos distintos:
difusión de ácido en la mucosa gástrica que induce daño tisular; e
interferencia con la biosíntesis de prostaglandinas gástricas que
sirven como agentes citoprotectores en la mucosa gástrica. Estos
efectos secundarios son un problema particularmente en pacientes
que deben ingerir NSAID continuamente, como en pacientes con
dolencias inflamatorias crónicas, como artritis reumatoide. Los
NSAID incluyen salicilatos; derivados de
para-aminofenol, como paracetamol; indometacina;
sulindac; etodolac; fenamatos; telmetina; cetorolac; diclofenac;
derivados propiónicos, como ibuprofeno, naproxeno, naproxeno sódico,
fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno y oxaprozina; piroxicam;
derivados de pirazolona, como fenilbutazona; y apazona. Goodman
& Gilman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Capítulo
27 (9ª ed.), McGraw-Hill
1996.
1996.
Los autores de la invención han descubierto que,
inesperadamente, las amilinas y ciertos agonistas de amilina tienen
propiedades gastroprotectoras y pueden prevenir la inducción de
gastritis, y así tratar o prevenir lesión gástrica, como úlceras
gástricas, cuando se administran a un sujeto, por una ruta
seleccionada a partir del grupo que consiste en administración
subcutánea, intravenosa, nasal, oral, pulmonar, transdérmica y
bucal. Se entiende que el término "amilina" incluye compuestos
como los definidos por Young y Cooper en la patente de EE.UU.
5.234.906, concedida el 10 de agosto de 1993 para "composiciones
hiperglucémicas". Por ejemplo, el término incluye amilina humana
y variaciones de especies de ella, referidas como amilina y
secretadas a partir de las células beta del páncreas. "Agonista
de amilina" es también un término conocido en la técnica. El
término se refiere a compuestos que emulan los efectos de la
amilina. Los agonistas de amilina incluyen "análogos de agonistas
de amilina" que son derivados de amilina que actúan como
agonistas de amilina. Los agonistas de amilina pueden actuar
mediante unión u otra interacción directa o indirecta con un
receptor de amilina u otro receptor con el que la amilina en sí
puede interaccionar para provocar efectos biológicos de la amilina.
Además de aquellos agonistas de amilina descritos en la presente
memoria descriptiva, se identifican otros agonistas de amilina
útiles en la patente de EE.UU. nº 5.686.411, concedida el 11 de
noviembre de 1997.
Así, en un primer aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para tratar o prevenir la gastritis o
úlcera gástrica en un sujeto, que comprende la administración a
dicho sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una amilina
o ciertos agonistas de amilina, en el que dicho agonista de amilina
no es una calcitonina y dicha amilina o agonista de amilina se
administra por una ruta seleccionada a partir del grupo que consiste
en administración subcutánea, intravenosa, nasal, oral, pulmonar,
transdérmica y bucal. Por "calcitonina" se entiende la hormona
peptídica humana calcitonina y variaciones de especies de ella, como
calcitonina de rata, calcitonina de salmón y calcitonina de
anguila. En una forma de realización, dicha gastritis o úlcera
gástrica se asocia con la administración de un fármaco
antiinflamatorio no esteroideo.
En los procedimientos de la presente invención,
los efectos gastroprotectores de las amilinas y agonistas de
amilina reducirán la propensión de los NSAID a causar gastritis y
úlceras.
Así, en otro aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una dolencia
para la cual estaría indicado un NSAID que comprende la
administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz
de una amilina o ciertos agonistas de amilina, en el que dicho
agonista de amilina no es una calcitonina y dicha amilina o
agonista de amilina se administra por una ruta seleccionada a partir
del grupo que consiste en administración subcutánea, intravenosa,
nasal, oral, pulmonar, transdérmica y bucal, y una cantidad
terapéuticamente eficaz de un agente antiinflamatorio no
esteroideo. Preferentemente, dicho agente antiinflamatorio no
esteroideo se selecciona entre el grupo que consiste en salicilato,
acetaminofeno, fenacetina, naproxeno, fenilbutazona, indometacina,
ibuprofeno, sulandac, etodolac, fenamatos, telmetina, cetoralac,
diclofenac, fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina,
piroxicam y apazona.
Según los procedimientos de la presente
invención, la amilina o agonista de amilina se administra por vía
oral, intravenosa, subcutánea, nasal, pulmonar, transdérmica o
bucal. En la actualidad se prefieren la administración intravenosa
y subcutánea.
El sujeto puede ser cualquier animal,
preferentemente un mamífero, y más preferentemente un ser
humano.
\newpage
Se describe también una composición farmacéutica
que comprende (1) una amilina o un agonista de amilina o una sal
farmacéuticamente aceptable de los mismos, en el que dicho agonista
de amilina no es una calcitonina, y (2) un agente antiinflamatorio
no esteroideo en un vehículo y dosis farmacéuticamente
aceptables.
El agente inflamatorio no esteroideo se
selecciona entre el grupo que consiste, por ejemplo, en salicilato,
acetaminofeno, fenacetina, naproxeno, fenilbutazona, indometacina,
ibuprofeno, sulandac, etudolac, fenamatos, telmetina, cetoralac,
distofenac, fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina,
piroxicam y apazona.
En formas de realización preferidas de la
presente invención, el agonista de amilina es
^{25,28,29}Pro-h-amilina, también
conocido como pramlintida. La pramlintida se describe y reivindica
en la patente de Estados Unidos nº 5.686.411, concedida el 11 de
noviembre de 1997.
La invención se describirá adicionalmente con
referencia al dibujo adjunto en el que:
la fig. 1 muestra el efecto de dosis subcutáneas
de amilina en ratas para reducir la lesión gástrica inducida por
alimentación por sonda de etanol en ratas.
Los agonistas de amilina pueden identificarse
por actividad en los ensayos de gastroprotección descritos más
adelante. Estos compuestos pueden evaluarse también por ensayos de
unión a receptores y vaciado gástrico descritos más adelante.
La nomenclatura de los diversos compuestos de
agonistas de amilina útiles en la presente invención puede usarse
para indicar tanto el péptido en el que se basa la secuencia como
las modificaciones realizadas a cualquier secuencia de amilina
peptídica básica, como amilina humana. Un aminoácido precedido por
un número en superíndice indica que el aminoácido nombrado
sustituye al aminoácido normalmente presente en la posición de
aminoácido del superíndice en la secuencia de aminoácidos básica.
Por ejemplo,
"^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina"
se refiere a un péptido basado en la secuencia de
"h-amilina" o "amilina humana" que tiene
los siguientes cambios: Arg sustituyendo a His en el residuo 18,
Pro sustituyendo a Ala en el residuo 25 y Pro sustituyendo a Ser en
el residuo 28. El término
"des-^{1}Lys-h-amilina"
se refiere a un péptido basado en la secuencia de amilina humana,
con el primer aminoácido, o N-terminal,
suprimido.
Los agonistas de amilina incluyen los siguientes
análogos de agonistas de amilina:
i) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-
^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}Pro-I_{1}-Leu-Pro-J_{1}-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
J_{1} es Ser, Pro o Thr;
K_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es Val, D_{1} es Arg,
E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es Asn, H_{1} es Leu,
I_{1} es Val, J_{1} es Pro y K_{1} es Asn; entonces uno o más
de A_{1} a K_{1} es un aminoácido D y Z se selecciona entre el
grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino,
arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
ii) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}Pro-I_{1}-
Leu-J_{1}-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
Leu-J_{1}-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
J_{1} es Ser, Pro, Leu, Ile o Thr;
K_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
(a) A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es
Val, D_{1} es Arg, E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es
Asn, H_{1} es Leu, I_{1} es Val, J_{1} es Pro y K_{1} es
Asn; o
(b) A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es
Val, D_{1} es His, E_{1} es Ser, F_{1} es Asn, G_{1} es
Asn, H_{1} es Leu, I_{1} es Val, J_{1} es Ser y K_{1} es
Asn;
entonces uno o más de A_{1} a K_{1} es un
aminoácido D y Z se selecciona entre el grupo que consiste en
alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
iii) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}I_{1}-J_{1}-
Leu-Pro-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
Leu-Pro-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ala o Pro;
J_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
K_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es Val, D_{1} es Arg,
E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es Asn, H_{1} es Leu,
I_{1} es Pro, J_{1} es Val y K_{1} es Asn; entonces uno o más
de A_{1} a K_{1} es un aminoácido D y Z se selecciona entre el
grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino,
arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
iv) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}Pro-I_{1}-
Leu-Pro-Pro-^{30}Thr-J_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
Leu-Pro-Pro-^{30}Thr-J_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
J_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es Val, D_{1} es Arg,
E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es Asn, H_{1} es Leu,
I_{1} es Val y J_{1} es Asn; entonces uno o más de A_{1} a
K_{1} es un aminoácido D y Z se selecciona entre el grupo que
consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
Los compuestos de agonistas de amilina
preferidos,
des-^{1}Lys-h-amilina,
^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina y
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
muestran todos actividad de amilina in vivo en animales de
prueba tratados. Además de los que tienen actividades
características de amilina, se ha encontrado también que ciertos
compuestos preferidos poseen características más deseables de
solubilidad y estabilidad cuando se comparan con amilina humana.
Estos compuestos preferidos incluyen
^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina,
^{25,28,29}Pro-h-amilina y
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina.
Los procedimientos de la presente invención
emplean una amilina o un agonista de amilina, por ejemplo, agonistas
receptores de amilina como
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{25-28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{25,28-29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina
y
^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina
Los ejemplos de otros agonistas de amilina adecuados incluyen:
^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina;
^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28}Pro-h-amilina;
des-^{1}Lys^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28}Pro-h-amilina;
^{18}Arg^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28}Pro-h-amilina;
^{18}Arg^{23}Leu^{25,28,29}Pro-h-amilina;
^{18}Arg^{23}Leu^{25,28}Pro-h-amilina;
^{17}Ile^{23}Leu^{25,28,29}Pro-h-amilina;
^{17}Ile^{25,28,29}Pro-h-amilina;
des-^{1}Lys^{17}Ile^{23}Leu^{25,28,29}Pro-h-amilina;
^{17}Ile^{18}Arg^{23}Leu-h-amilina;
^{17}Ile^{18}Arg^{23}Leu^{26}Val^{29}Pro-h-amilina;
^{17}Ile^{18}Arg^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina;
^{13}Thr^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{28}Leu^{29}Pro^{31}Asp-h-amilina;
^{13}Thr^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{29}Pro^{31}Asp-h-amilina;
des-^{1}Lys^{13}Thr^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{28}Pro^{31}Asp-h-amilina;
^{13}Thr^{18}Arg^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{29}Pro^{31}
Asp-h-amilina;
^{13}Thr^{18}Arg^{21}His^{23}Leu^{28,29}Pro^{31}Asp-h-amilina;
y,
^{13}Thr^{18}Arg^{21}His^{23}Leu^{25}Pro^{26}Ala^{28,29}Pro^{31}
Asp-h-amilina.
Se desvelan todavía más agonistas de amilina,
incluyendo análogos de agonistas de amilina, y se especifican
además procedimientos para preparar y usar agonistas de amilina en
la patente de EE.UU. de propiedad común nº 5.686.411, concedida el
11 de noviembre de 1997.
La actividad de agonistas de amilina puede
evaluarse usando ciertos ensayos biológicos descritos en la presente
memoria descriptiva. El ensayo de unión a receptor puede
identificar agonistas y antagonistas de amilina candidatos y puede
usarse para evaluar la unión, mientras el ensayo de vaciado gástrico
en ratas puede usarse para distinguir entre agonistas y
antagonistas de amilina. Preferentemente, los compuestos agonistas
exhiben en el ensayo de unión a receptor en el orden de menos de
aproximadamente 1 a 5 nM, preferentemente menos de aproximadamente
1 nM y más preferentemente menos de aproximadamente 50 pM. En el
ensayo de vaciado gástrico de ratas in vivo, estos
compuestos muestran preferentemente valores de DE_{50} en el orden
de menos de aproximadamente 100 a
1.000 \mug/rata.
1.000 \mug/rata.
El ensayo de unión a receptor se describe en la
patente de Estados Unidos nº 5.264.372, concedida el 23 de
noviembre de 1993. El ensayo de unión a receptor es un ensayo de
competencia que mide la capacidad de los compuestos de unirse
específicamente a receptores de amilina unidos por membrana. Una
fuente preferida de los preparados de membrana usados en el ensayo
es el prosencéfalo basal que comprende membranas del nucleus
accumbens y regiones circundantes. Los compuestos que se están
sometiendo a ensayo compiten por unirse a estos preparados de
receptor con amilina en ratas ^{125}I Bolton Hunter. Las curvas de
competencia, en las que se representa la cantidad unida (B) en
función del logaritmo de la concentración de ligando, son analizadas
por ordenador usando análisis por regresión no lineal a una
ecuación logística de 4 parámetros (programa Inplot; GraphPAD
Software, San Diego, California) o el programa ALLFIT de DeLean y
col. (ALLFIT, Versión 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson, P. y
Rodbard, D., Anal. Biochem. 107:220-239 (1980).
Las amilinas o agonistas de amilina pueden
identificarse, evaluarse o detectarse selectivamente por su efecto
en el vaciado gástrico usando los procedimientos descritos, por
ejemplo, en la solicitud PCT, Publicación nº
WO-95/07.098 u otros procedimientos conocidos en la
técnica o equivalentes para determinar la motilidad gástrica. Uno
de estos procedimientos para su uso en la identificación o
evaluación de la capacidad de un compuesto por ralentizar la
motilidad gástrica comprende: (a) reunión de una muestra de prueba y
un sistema de prueba, comprendiendo dicha muestra de prueba uno o
más compuestos de prueba, y comprendiendo dicho sistema de prueba
un sistema para evaluar la motilidad gástrica, estando dicho sistema
caracterizado porque exhibe, por ejemplo, una etiqueta de plasma
elevado en respuesta a la introducción intragástrica a dicho sistema
de esa etiqueta; y, (b) determinación de la presencia o cantidad de
un ascenso en la etiqueta de plasma en dicho sistema. Pueden usarse
asimismo controles positivos y/o negativos. Opcionalmente, puede
añadirse al sistema de prueba una cantidad predeterminada de
antagonista de amilina (por ejemplo, ^{8,32}calcitonina de
salmón).
Los agonistas de amilina como los descritos
anteriormente se preparan usando técnicas estándar de síntesis de
péptidos sólidos y preferentemente un sintetizador de péptidos
automatizado o semiautomatizado. Normalmente, se acoplan un
aminoácido protegido con
\alpha-N-carbamoílo y un
aminoácido unido a la cadena de péptidos en crecimiento en una
resina a temperatura ambiente en un disolvente inerte como
dimetilformamida, N-metilpirrolidinona o cloruro de
metileno en presencia de agentes de acoplamiento como
diciclohexilcarbodiimida y 1hidroxibenzotriazol en presencia de una
base como diisopropiletilamina. El grupo protector de
\alpha-N-carbamoílo se elimina de
la resina de péptidos resultante usando un reactivo como ácido
trifluoroacético o piperidina, y la reacción de acoplamiento se
repite con el siguiente aminoácido protegido en N que se añadirá a
la cadena de péptidos. Los grupos protectores en N son bien
conocidos en la técnica, con t-butiloxicarbonilo
(tBoc) y fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) preferidos en la presente
memoria descriptiva.
Los disolventes, derivados de aminoácidos y
resina de 4-metilbenzhidril-amina
usados en el sintetizador de péptidos se adquieren en Applied
Biosystems Inc. (Foster City, CA), salvo que se indique lo
contrario. Los aminoácidos protegidos de cadena lateral se
adquieren en Applied Biosystems, Inc. e incluyen los siguientes:
Boc-Arg(Mts),
Fmoc-Arg(Pmc),
Boc-Tr(Bzl),
Fmoc-Tr(t-Bu),
Boc-Ser(Bzl),
Fmoc-Ser(t-Bu),
Boc-Tir(BrZ),
Fmoc-Tyr(t-Bu),
Boc-Lys(ClZ),
Fmoc-Lys(Boc),
Boc-Glu(Bzl),
Fmoc-Glu(t-Bu),
Fmoc-His (Trt), Fmoc-Asn(Trt)
y Fmoc-Gln(Trt). Boc-His
(BOM) se adquiere en Applied Biosystems, Inc. o Bachem Inc.
(Torrance, CA). Anisol, metilsulfuro, fenol, etanoditiol y
tioanisol se obtienen en Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI).
Air Products and Chemicals (Allentown, PA) suministra HF. El éter
etílico, el ácido acético y el metanol se adquieren en Fisher
Scientific
(Pittsburgh, PA).
(Pittsburgh, PA).
La síntesis de péptidos en fase sólida se
efectúa con un sintetizador de péptidos automático (Modelo 430A,
Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) usando el sistema NMP/HOBt
(opción 1) y la química Tboc o Fmoc (véase Manual de Usuario de
Applied Biosystems para el Sintetizador de Péptidos ABI 430A,
Versión 1.3B 1 de julio de 1988, sección 6, pág. 4970, Applied
Biosystems, Inc., Foster City, CA) con remate. Las resinas de
péptidos Boc se escinden con HF (-5ºC a 0ºC, 1 hora). El péptido se
extrae de la resina alternando agua y ácido acético, y los
filtrados se liofilizan. Las resinas de péptidos Fmoc se escinden
según procedimientos estándar (Introduction to Cleavage
Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pág.
6-12). Algunos péptidos se ensamblan también usando
un Advanced Chem Tech Synthesizer (Modelo MPS 350, Louisville,
Kentucky). Los péptidos se purifican mediante
RP-HPLC (preparatoria y analítica) usando un sistema
Waters Delta Prep 3000. Se usa una columna preparatoria C4, C8 o
C18 (10 \mu, 2,2 \times 25 cm; Vydac, Hesperia, Calif.) para
aislar los péptidos, y se determina la pureza usando una columna
analítica C4, C8 o C18 (5 \mu, 0,46 \times 25 cm; Vydac). Los
disolventes (A = 0,1% TFA/agua y B = 0,1% TFA/CH_{3}CN) se
suministran a la columna analítica a una velocidad de flujo de 1,0
ml/min y a la columna preparatoria a 15 ml/min. Los análisis de
aminoácidos se realizan en el sistema Waters Pico Tag y se procesan
usando el programa Maxima. Los péptidos se hidrolizan por hidrólisis
ácida en fase de vapor (115ºC, 20-24 h). Los
hidrolizados se derivan y analizan mediante procedimientos estándar
(Cohen, S.A., Meys, M., y Tarrin, T.L. (1989), The Pico Tag
Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid
Analysis, pág. 11-52, Millipore Corporation,
Milford, Mass.). El análisis de bombardeo rápido de átomos se
efectúa mediante M-Scan, Incorporated (West Chester,
Pa.). El calibrado de masas se realiza usando yoduro de cesio o
yoduro de cesio/glicerol. El análisis de ionización por desorción de
plasma mediante el uso de detección del tiempo de vuelo se efectúa
en un espectrómetro de masas Bio-Ion 20 de
Applied
Biosystems.
Biosystems.
Los compuestos de péptidos útiles en los
procedimientos reivindicados también pueden prepararse usando
técnicas de ADN recombinante, usando procedimientos conocidos
actualmente en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring
Harbor (1989).
Los compuestos referidos anteriormente forman
sales con varios ácidos inorgánicos y orgánicos y bases. Dichas
sales incluyen las preparadas con ácidos orgánicos e inorgánicos,
por ejemplo, HCl, HBr, H_{2}SO_{4}, H_{3}PO_{4}, ácido
trifluoroacético, ácido acético, ácido fórmico, ácido
metanosulfónico, ácido toluensulfónico, ácido maleico, ácido
fumárico y ácido alcanforsulfónico. Las sales preparadas con bases
incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos, por ejemplo
sales de sodio y potasio, y sales de metales alcalinotérreos, por
ejemplo, sales de calcio y magnesio. Se prefieren sales de acetato,
clorhidrato y trifluoroacetato. Las sales pueden formarse por
medios convencionales, por ejemplo, por reacción formas del ácido
libre o base del producto con uno o más equivalentes de la base o
ácido apropiado en un disolvente o medio en el que la sal es
insoluble, o en un disolvente como agua que a continuación se retira
al vacío o por congelación en seco o por intercambio de los iones
de una sal existente por otro ion en una resina adecuada de
intercambio iónico.
También se describen en la presente memoria
descriptiva composiciones, que pueden proporcionarse
convenientemente en la forma de formulaciones adecuadas para
administración parenteral (incluyendo intravenosa, intramuscular y
subcutánea) o nasal o transdérmica, y/o encapsuladas de forma
adecuada o preparadas de otro modo por otros procedimientos
conocidos para administración oral. El formato de administración
adecuado puede ser determinado de forma óptima por un profesional
médico para cada paciente individualmente. Los vehículos
farmacéuticamente aceptables y su formulación se describen en
tratados estándar de formulación, por ejemplo Remington's
Pharmaceutical Sciences de E.W. Martin. Véase también Wang,
Y.J. y Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and
Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral
Science and Technology, Technical Report nº 10, Sup. 42:2S
(1988). También se describen en la presente memoria descriptiva
compuestos que pueden proporcionarse como composiciones
parenterales para inyección o infusión. Preferentemente, se
describen en un vehículo acuoso, por ejemplo, en una solución
tampón isotónica a un pH de aproximadamente 4,3 a 7,4. Estas
composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas convencionales
de esterilización, o pueden filtrarse estériles. Las composiciones
pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables
según se requiere para estabilizar la formulación, como agentes de
formación de tampón de pH. Los tampones útiles incluyen, por
ejemplo, tampones de acetato de sodio/ácido acético. Puede usarse
una forma de preparado de liberación lenta en repositorio o
"depot" de manera que se suministren cantidades
terapéuticamente eficaces del preparado en el torrente sanguíneo
durante muchas horas o días después de la inyección o suministro
transdérmico.
Preferentemente, estas formas de dosificación
parenteral incluyen de aproximadamente el 0,01 al 0,5% p/v,
respectivamente, de una amilina y/o un agonista de amilina en un
sistema acuoso junto con aproximadamente del 0,02 al 0,5% p/v de un
tampón de acetato, fosfato, citrato o glutamato para obtener un pH
de la composición final de aproximadamente 3,0 a 6,0 (más
preferentemente de 3,0 a 5,5), así como aproximadamente del 1,0 al
10% p/v de un tonificador de carbohidrato o alcohol polihídrico en
una fase continua acuosa. En la formulación preferida del producto
también está presente aproximadamente del 0,005 al 1,0% p/v de un
conservante antimicrobiano seleccionado entre el grupo que consiste
en m-cresol, alcohol bencílico, parabenos de metilo,
etilo, propilo y butilo y fenol diseñados para permitir al paciente
retirar dosis múltiples. En esta formulación no se requiere un
estabilizador. Se usa una cantidad suficiente de agua para inyección
para obtener la concentración deseada de solución. También puede
estar presente cloruro de sodio, así como otros excipientes, si se
desea. Dichos excipientes, sin embargo, deben mantener la
estabilidad global de la amilina, o un agonista de amilina. La
formulación líquida debe ser isotónica. Con la máxima preferencia,
en la formulación de amilina y/o agonista de amilina para
administración parenteral, el alcohol polihídrico es manitol, el
tampón es un tampón de acetato, el conservante es aproximadamente
del 0,1 al 0,3% p/v de m-cresol, y el pH es
aproximadamente de 3,7 a 4,3.
La isotonicidad deseada puede lograrse usando
cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables como
dextrosa, ácido bórico, tartrato de sodio, propilenglicol, polioles
(como manitol y sorbitol), u otros solutos inorgánicos u orgánicos.
Se prefiere particularmente cloruro de sodio para tampones que
contienen iones de so-
dio.
dio.
Si se desea, las soluciones de las composiciones
anteriores pueden espesarse con un agente espesante como
metilcelulosa. Pueden prepararse en forma emulsionada, bien agua en
aceite o aceite en agua. Puede emplearse cualquiera de una amplia
variedad de agentes emulsionantes farmacéuticamente aceptables
incluyendo, por ejemplo, polvo de acacia, un tensioactivo no iónico
(como un Tween) o un tensioactivo iónico (como sulfatos o sulfonatos
de alcoholes de poliéteres alcalinos, por ejemplo, un Triton).
Las composiciones desveladas en la presente
memoria descriptiva que se administran según la presente invención
por una ruta seleccionada a partir del grupo que consiste en
administración subcutánea, intravenosa, nasal, oral, pulmonar,
transdérmica y bucal, se preparan mezclando los ingredientes
siguiendo procedimientos aceptados generalmente. Por ejemplo, los
componentes seleccionados pueden mezclarse simplemente en una
mezcladora u otro dispositivo estándar para producir una mezcla
concentrada que a continuación puede ajustarse a la concentración y
viscosidad finales por la adición de agua o agente espesante y
posiblemente un tampón para controlar el pH o un soluto adicional
para controlar la tonicidad.
Para su uso por el médico, las composiciones se
proporcionarán en forma de unidad de dosificación que contiene una
cantidad de una amilina o agonista de amilina, por ejemplo, un
agonista de amilina con un NSAID que será efectivo en una o
múltiples dosis para controlar el dolor, la inflamación, la
temperatura corporal, la coagulabilidad de la sangre u otra
respuesta biológica objetivo en el nivel seleccionado. Las
cantidades terapéuticamente eficaces de una amilina o agonista de
amilina son aquellas que aliviarán el síntoma objetivo, o que
conseguirán el nivel deseado de control. Como reconocerán los
expertos en la materia, una cantidad eficaz de agente terapéutico
variará con muchos factores que incluyen la edad y el peso del
paciente, la condición física del paciente, la acción que se quiere
obtener y otros factores.
La dosis diaria terapéuticamente eficaz de
amilina o agonista de amilina, para el tratamiento de gastritis y
úlceras que incluye h-amilina,
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg-^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina
y
^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina,
estará normalmente en el intervalo de 0,01 \mug/kg/día a
aproximadamente 10 \mug/kg/día, preferentemente entre
aproximadamente 0,05 \mug/kg/día y aproximadamente 6,0
\mug/kg/día, más preferentemente entre aproximadamente
1-6 \mug/kg/día y más preferentemente todavía
entre aproximadamente 0,5 \mug/kg/día a aproximadamente 4,0
\mug/kg/día administrado en dosis únicas o divididas.
La dosis diaria eficaz de amilina o agonista
amilina en combinación con un NSAID que incluye
h-amilina,
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg-^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina
y
^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina,
estará normalmente en el intervalo de 0,01 \mug/kg/día a
aproximadamente 10 \mug/kg/día, preferentemente entre
aproximadamente 0,05 \mug/kg/día y aproximadamente 6,0
\mug/kg/día, más preferentemente entre aproximadamente 1 y 6
\mug/kg/día y más preferentemente todavía entre aproximadamente
0,5 \mug/kg/día a aproximadamente 4,0 \mug/kg/día administrado
en dosis únicas o divididas. Para estas indicaciones, la dosis
diaria eficaz del NSAID dependería del agente usado, y es
comparable con las dosis cuando se usan NSAID en solitario. Por
ejemplo, las dosis diarias para salicilato (aspirina) son de 150 mg
a 3,5 g al día, para fenilbutazona de 100 mg a 600 mg al día, para
indometacina de 50 mg a 200 mg al día y para acetaminofeno de 3 g a
6 g al día.
\newpage
La dosis diaria eficaz de amilina o agonista de
amilina para reducir los efectos gástricos adversos de la
administración de un NSAID, que incluye h-amilina,
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg-^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina
y ^{25}Pro^{26}Val
^{28,29}Pro-h-amilina, estará
normalmente en el intervalo de 0,01 \mug/kg/día a aproximadamente
10 \mug/kg/día, preferentemente entre aproximadamente 0,05
\mug/kg/día y aproximadamente 6,0 \mug/kg/día, más
preferentemente entre aproximadamente 1-6
\mug/kg/día y más preferentemente todavía entre aproximadamente
0,5 \mug/kg/día y aproximadamente 4,0 \mug/kg/día administrado
en dosis únicas o divididas. Para estas indicaciones, la dosis
diaria eficaz del NSAID dependería del agente usado, y es
comparable a las dosis cuando se usan NSAID en solitario. Por
ejemplo, las dosis diarias para salicilato (aspirina) son de 150 mg
a 3,5 g al día, para fenilbutazona de 100 mg a 600 mg al día, para
indometacina de 50 mg a 200 mg al día y para acetaminofeno de 3 g a
6 g al día.
La dosis exacta que se administrará para cada
indicación es determinada por el médico especialista y depende del
lugar en que el compuesto particular se encuentre dentro del
intervalo mencionado anteriormente, así como de la edad, peso y
condición del individuo. Los expertos en la materia reconocerán que
pueden administrarse también otras dosis no diarias. La
administración debe iniciarse al primer signo de síntomas en el caso
de gastritis o úlceras o en el momento en que se determine que el
sujeto debe iniciar una terapia con NSAID. La administración es
preferentemente por inyección intravenosa, subcutánea o
intramuscular. La administración puede ser también nasal,
transdérmica o bucal. Los compuestos oralmente activos pueden
tomarse oralmente, sin embargo las dosificaciones deben ajustarse
basándose en su potencia y biodisponibilidad, según resulte
apropiado.
Los siguientes Ejemplos son ilustrativos, pero
no limitativos de los procedimientos de la presente invención.
Otras amilinas y agonistas de amilina adecuados que pueden adaptarse
para su uso en los procedimientos reivindicados son también
apropiados y están dentro del espíritu y el ámbito de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo se describen las propiedades
gastroprotectoras de la amilina en un modelo animal para gastritis:
una rata alimentada por sonda con etanol.
Se examinó el efecto de la amilina en la
inducción de daño experimental en la mucosa en ratas por
alimentación por sonda de 1 ml etanol absoluto. El daño en la
mucosa se valoró entre 0 (ausencia de daño) y 5 (100% de estómago
cubierto por hiperemia y úlceras) por investigadores a ciegas en el
tratamiento. Se inyectó amilina en ratas en suero salino por vía
subcutánea en ratas macho
Harlan-Sprague-Dawley conscientes en
ayunas en dosis de 0, 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 o 10 \mug (n =
12, 5, 5, 5, 9, 9, 5, 6 respectivamente) 5 min antes de
alimentación por sonda. El daño en la mucosa, calculado como
porcentaje de valoraciones en controles tratados con suero salino,
fue, con las anteriores dosis subcutáneas en aumento,
respectivamente de: 100,0 \pm 8,3%, 95,3 \pm 15,2%, 76,6 \pm
13,8%, 70,1 \pm 10,7%*, 33,9 \pm 7,7%**, 59,6 \pm 5,8%**, 35,6
\pm 11,5%**, 32,9 \pm 8,3%** (*P < 0,05, ** P < 0,001
frente a control con suero salino). Es decir, la amilina redujo la
valoración de lesión en hasta el 67%, según se observó con dosis de
10 \mug. La DE_{50} para el efecto gastroprotector de la
amilina en este sistema experimental fue de 0,036 \mug/rata \pm
0,4 unidades logarítmicas. Se predijo la dosis gastroprotectora al
50% de amilina en ratas (0,036 \mug/rata) para aumentar las
concentraciones circulantes de amilina en 1,8 \pm 0,4 pM. Esta
predicción se obtuvo aplicando la relación publicada entre dosis
subcutánea inyectada y concentración máxima de plasma en ratas.
Young, A.A. y col., Drug Devel. Res.
37:231-48 (1996). Un cambio en la concentración en
plasma de amilina de 1,8 pM está dentro del intervalo de
fluctuaciones que se comunica que ocurren en roedores normales, lo
que indica que es probable que la amilina circulante endógena
ejerza un efecto gastroprotector tónico. Es improbable que la
emulación de este efecto fisiológico dé como resultado efectos
secundarios no deseados, como es a menudo el caso en administración
de xenobióticos no fisiológicos. La ausencia de efectos secundarios
potencia la utilidad de agonistas de amilina usados para los fines
y de la manera especificada en la presente memoria descriptiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuó la síntesis en fase sólida de
^{25,28,29}Pro-h-amilina usando
resina de unión anclada a metilbenzhidrilamina y protección de
cadena lateral de N^{a}-Boc/bencilo mediante
procedimientos estándar de síntesis de péptidos. La
^{2,7}-[disulfuro]amilin-MBHA-resina
se obtuvo por tratamiento de cisteínas protegidas Acm con
trifluoroacetato de talio (III) en ácido trifluoroacético. Después
de ciclación se consiguió la resina y los grupos protectores de
cadena lateral se escindieron con HF líquido en presencia de
dimetilsulfuro y anisol. La
^{25,28,29}Pro-h-amilina se
purificó mediante HPLC preparatoria de fase inversa. Se encontró que
el péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis
capilar y la estructura se confirmó mediante análisis de aminoácidos
y análisis de secuencias. El producto dio el ion de masa deseada.
Espec. masas FAB: (M+H)^{+} = 3,949.
Se realizó la síntesis de fase sólida de
^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina
usando resina de unión anclada a metilbenzhidrilamina y protección
de cadena lateral de N^{a}-Boc/bencilo mediante
procedimientos estándar de síntesis de péptidos.
La ^{2,7}-[disulfuro]amilin-MBHA-resina se obtuvo por tratamiento de cisteínas protegidas Acm con trifluoroacetato de talio (III) en ácido trifluoroacético. Después de ciclación se consiguió la resina y los grupos protectores de cadena lateral se escindieron con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. La ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina se purificó por HPLC preparatoria de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo por HPLC analítica y electroforesis capilar y la estructura se confirmó por análisis de aminoácidos y análisis de secuencias. El producto dio el ion de masa deseada. Espec. masas FAB: (M+H)^{+} = 3,971.
La ^{2,7}-[disulfuro]amilin-MBHA-resina se obtuvo por tratamiento de cisteínas protegidas Acm con trifluoroacetato de talio (III) en ácido trifluoroacético. Después de ciclación se consiguió la resina y los grupos protectores de cadena lateral se escindieron con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. La ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina se purificó por HPLC preparatoria de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo por HPLC analítica y electroforesis capilar y la estructura se confirmó por análisis de aminoácidos y análisis de secuencias. El producto dio el ion de masa deseada. Espec. masas FAB: (M+H)^{+} = 3,971.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó la síntesis de fase sólida de
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina
usando resina de unión anclada a metilbenzhidrilamina y protección
de cadena lateral de N^{a}-Boc/bencilo mediante
procedimientos estándar de síntesis de péptidos.
La ^{2,7}-[disulfuro]amilin-MBHA-resina se obtuvo por tratamiento de cisteínas protegidas Acm con trifluoroacetato de talio (III) en ácido trifluoroacético. Después de ciclación se consiguió la resina y los grupos protectores de cadena lateral se escindieron con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. La ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina se purificó por HPLC preparatoria de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo por HPLC analítica y electroforesis capilar y la estructura se confirmó por análisis de aminoácidos y análisis de secuencias. El producto dio el ion de masa deseada. Espec. masas FAB: (M+H)^{+} = 3,959.
La ^{2,7}-[disulfuro]amilin-MBHA-resina se obtuvo por tratamiento de cisteínas protegidas Acm con trifluoroacetato de talio (III) en ácido trifluoroacético. Después de ciclación se consiguió la resina y los grupos protectores de cadena lateral se escindieron con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. La ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina se purificó por HPLC preparatoria de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo por HPLC analítica y electroforesis capilar y la estructura se confirmó por análisis de aminoácidos y análisis de secuencias. El producto dio el ion de masa deseada. Espec. masas FAB: (M+H)^{+} = 3,959.
\vskip1.000000\baselineskip
La evaluación de la unión de compuestos a
receptores de amilina se efectuó del modo siguiente. Se adquirió
^{125}I-amilina de ratas
(Bolton-Hunter marcado en lisina
N-terminal) en Amersham Corporation (Arlington
Heights, IL). Las actividades específicas en el momento del uso
estuvieron entre 1.950 y 2.000 Ci/mmol. Los péptidos no marcados se
obtuvieron de BACHEM Inc. (Torrance, CA) y Peninsula Laboratories
(Belmont, CA).
Se sacrificaron por decapitación ratas
Sprague-Dawley macho (200-250)
gramos. Se extrajeron los encéfalos en suero salino con tampón de
fosfato (PBS) en frío. A partir de la superficie ventral, se
realizaron cortes rostrales con el hipotálamo, unidos lateralmente
por los tractos olfativos y que se extendían en un ángulo de 45º
medialmente desde estos tractos. Este tejido de prosencéfalo basal,
que contenía el nucleus accumbens y las regiones circundantes, se
pesó y se homogeneizó en tampón HEPES 20 mM enfriado en hielo (ácido
HEPES 20 mM, pH ajustado a 7,4 con NaOH a 23ºC). Se lavaron las
membranas tres veces en tampón nuevo por centrifugado durante 15
minutos a 48.000 x g. La granza de membrana final se volvió a
suspender en tampón HEPES 20 mM que contenía fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,2 mM.
Para medir la unión a
^{125}I-amilina, se incubaron membranas de 4 mg de
peso en húmedo original de tejido con
^{125}I-amilina a 12-16 pM en
tampón HEPES 20 mM que contenía 0,5 mg/ml de bacitracina, 0,5 mg/ml
de albúmina de suero bovino y 0,2 mM de PMSF. Se incubaron
soluciones durante 60 minutos a 23ºC. Las incubaciones se
terminaron por filtrado a través de filtros de fibra de vidrio GF/B
(Whatman Inc., Clifton, NJ) que se habían prehumedecido durante 4
horas en polietilenimina al 0,3% con el fin de reducir la unión no
específica de péptidos radiomarcados. Los filtros se lavaron
inmediatamente antes de filtrado con 5 ml de PBS en frío, e
inmediatamente después de filtrado con 15 ml de PBS en frío. Se
retiraron los filtros y se evaluó la radioactividad en un contador
gamma con una eficacia de recuento del 77%. Se generaron curvas de
competencia midiendo la unión en presencia de 10^{-12} a
10^{-6} M de compuesto de prueba no marcado y se analizaron
mediante regresión no lineal usando una ecuación logística de 4
parámetros (programa Inplot; GraphPAD Software, San Diego).
En este ensayo, la amilina humana purificada se
une a su receptor a una CI_{50} medida de aproximadamente 50 pM.
Los resultados para compuestos de prueba se exponen en la Tabla I,
que muestra que cada uno de los compuestos tiene actividad de unión
a receptor significativa.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
- 1)
- ^{28}Pro-h-Amilina 15,0
- 2)
- ^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-Amilina 18,0
- 3)
- ^{2,7}Ciclo-[^{2}Asp, ^{7}Lys]-h-Amilina 310,0
- 4)
- ^{2-37}h-Amilina 236,0
- 5)
- ^{1}Ala-h-Amilina 148,0
- 6)
- ^{1}Ser-h-Amilina 33,0
- 7)
- ^{29}Pro-h-Amilina 64,0
- 8)
- ^{25,28}Pro-h-Amilina 26,0
- 9)
- des-^{1}Lys^{25,28}Pro-h-Amilina 85,0
- 10)
- ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-Amilina 32,0
- 11)
- des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-Amilina 82,0
- 12)
- ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-Amilina 21,0
- 13)
- des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-Amilina 21,0
- 14)
- ^{25,28,29}Pro-h-Amilina 10,0
- 15)
- des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-Amilina 14,0
\vskip1.000000\baselineskip
El vaciado gástrico se midió usando una
modificación (Plourde y col., Life Sci. 53:857-862
(1993)) del procedimiento original de Scarpignato y col. (Arch.
Int. Pharmacodyn. Ther. 246; 286-295 (1980)).
Brevemente, las ratas conscientes recibieron por alimentación por
sonda 1,5 mL de un gel sin color que contenía el 1,5% de
metilcelulosa (M-0262, Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO) y el 0,05% de indicador de rojo de fenol. Veinte minutos
después de alimentación por sonda, se anestesió a las ratas usando
halotano al 5%, se expuso el estómago y se pinzó en los esfínteres
pilórico y esofágico inferior usando fórceps arteriales, se retiró y
se abrió en una solución alcalina que se preparó hasta un volumen
fijo. El contenido del estómago se dedujo a partir de la intensidad
del rojo de fenol en la solución alcalina, medida por absorbancia a
una longitud de onda de 560 nm. En la mayoría de los experimentos,
el estómago estaba limpio. En otros experimentos, se centrifugó el
contenido gástrico en partículas para limpiar la solución para
medidas de absorbancia. Cuando el contenido gástrico diluido
permanecía turbio, la absorbancia espectroscópica debida a rojo de
fenol se dedujo como la diferencia entre el diluyente presente en
alcalino frente a acetificado. En experimentos separados en 7 ratas,
se escindieron el estómago y el intestino delgado y se abrieron en
una solución alcalina. La cantidad de rojo de fenol que podría
recuperarse a partir del tracto gastrointestinal superior después de
29 minutos de alimentación por sonda fue del 89 \pm 4%; el tinte
que aparecía para unirse irrecuperablemente a la superficie luminal
del tracto puede haber contado para el equilibrio. Para compensar
esta pequeña pérdida, el porcentaje de contenido del estómago que
quedaba después de 20 minutos se expresó como una fracción del
contenido gástrico recuperado de las ratas de control sacrificadas
inmediatamente después de alimentación por sonda en el mismo
experimento. Porcentaje de contenido de vaciado gástrico restante =
(absorbancia a 20 min)/(absorbancia a 0 min). Las curvas de
dosis-respuesta para vaciado gástrico se ajustaron a
un modelo logístico de 4 parámetros usando una rutina iterativa de
mínimos cuadrados (ALLFIT, v2.7, NIH, Bethesda, MD) para deducir los
DE_{50}. Como el DE_{50} tiene una distribución logarítmica
normal, se expresa \pm error típico del logaritmo. Se realizaron
comparaciones por pares usando análisis unidireccional de variancia
y la prueba de comparaciones múltiples de
Student-Newman-Keuls (Instat v2.0,
GraphPad Software, San Diego, CA) usando P < 0,05 como nivel
de
significación.
significación.
\newpage
En estudios de dosis-respuesta,
la amilina en ratas (Bachem, Torrance, CA) disuelta en suero salino
0,15 M se administró como un bolo subcutáneo de 0,1 mL en dosis de
0, 0,01, 0,1, 1, 10 ó 100 \mug 5 minutos antes de alimentación
por sonda en ratas
Harlan-Sprague-Dawley (no
diabéticas) en ayunas 20 horas y ratas diabéticas BB en ayunas 6
horas. Cuando se administraron inyecciones subcutáneas de amilina 5
minutos antes de alimentación por sonda con indicador de rojo de
fenol, se produjo una supresión dependiente de la dosis de vaciado
gástrico (datos no mostrados). La supresión de vaciado gástrico
estuvo completa en ratas HSD normales con administración de 1
\mug de amilina, y en ratas diabéticas con administración de 10
\mug (P = 0,22, 0,14). El DE_{50} para inhibición de vaciado
gástrico en ratas normales fue de 0,43 \mug (0,60 nmol/kg) \pm
0,19 unidades logarítmicas, y fue de 2,2\mu (2,3 nmol/kg) \pm
0,18 unidades logarítmicas en ratas diabéticas.
Se sujetaron por la cola ratas
Harlan-Sprague-Dawley conscientes no
en ayunas, cuya punta se anestesió usando lidocaína al 2%. El
tritio en plasma separado de la sangre de la cola recogida 0, 15,
30, 60, 90 y 120 minutos después de alimentación por sonda se
detectó en un contador beta. Se inyectó a ratas por vía subcutánea
con 0,1 mL de solución salina que contenía 0, 0,1, 0,3, 1, 10 ó 100
\mug de amilina en ratas 1 minuto antes de alimentación por sonda
(n = 8, 7, 5, 5, 5, respectivamente). Después de alimentación por
sonda de ratas preinyectadas con suero salino con glucosa tritiada,
el tritio en plasma aumentó rápidamente (t_{1/2} de
aproximadamente 8 minutos) a una asíntota que declinó rápidamente.
La inyección subcutánea con amilina se ralentizó de forma
dependiente de la dosis y/o se retrasó la absorción de la etiqueta.
La actividad de tritio en plasma se integró durante 30 minutos para
obtener las áreas bajo la curva representadas en función de dosis
de amilina. El DE_{50} obtenido del ajuste logístico fue de 0,35
\mug de amilina.
Claims (8)
1. Uso de una amilina o un análogo de agonista
de amilina seleccionado entre el grupo que consiste en:
i) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-
^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}Pro-I_{1}-Leu-Pro-J_{1}-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
J_{1} es Ser, Pro o Thr;
K_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es Val, D_{1} es Arg,
E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es Asn, H_{1} es Leu,
I_{1} es Val, J_{1} es Pro y K_{1} es Asn; entonces uno o más
de A_{1} a K_{1} es un aminoácido D y Z se selecciona entre el
grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino,
arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
ii) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}Pro-I_{1}-
Leu-J_{1}-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
Leu-J_{1}-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
J_{1} es Ser, Pro, Leu, Ile o Thr;
K_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
(a) A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es
Val, D_{1} es Arg, E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es
Asn, H_{1} es Leu, I_{1} es Val, J_{1} es Pro y K_{1} es
Asn; o
(b) A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es
Val, D_{1} es His, E_{1} es Ser, F_{1} es Asn, G_{1} es
Asn, H_{1} es Leu, I_{1} es Val, J_{1} es Ser y K_{1} es
Asn;
entonces uno o más de A_{1} a K_{1} es un
aminoácido D y Z se selecciona entre el grupo que consiste en
alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
iii) Un análogo de agonista de amilina que tiene
la secuencia de aminoácidos:
^{1}A_{1}-X-Asn-Thr-^{5}Ala-Thr-Y-Ala-Thr-^{10}Gln-Arg-Leu-B_{1}-Asn-^{15}Phe-Leu-C_{1}-D_{1}-E_{1}-^{20}F_{1}-G_{1}-Asn-H_{1}-Gly-^{25}I_{1}-J_{1}-
Leu-Pro-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
Leu-Pro-Pro-^{30}Thr-K_{1}-Val-Gly-Ser-^{35}Asn-Thr-Tyr-Z
en la que
A_{1} es Lys, Ala, Ser o hidrógeno;
B_{1} es Ala, Ser o Thr;
C_{1} es Val, Leu o Ile;
D_{1} es His o Arg;
E_{1} es Ser o Thr;
F_{1} es Ser, Thr, Gln o Asn;
G_{1} es Asn, Gln o His;
H_{1} es Phe, Leu o Tyr;
I_{1} es Ala o Pro;
J_{1} es Ile, Val, Ala o Leu;
K_{1} es Asn, Asp o Gln;
X e Y son residuos seleccionados
independientemente que tienen cadenas laterales que están
químicamente enlazadas entre sí para formar una unión
intramolecular, en los que dicha unión intramolecular comprende un
enlace de disulfuro, una lactama o una unión de tioéter; y Z es
amino, alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino, arilamino,
aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi; y siempre que
A_{1} es Lys, B_{1} es Ala, C_{1} es Val, D_{1} es Arg,
E_{1} es Ser, F_{1} es Ser, G_{1} es Asn, H_{1} es Leu,
I_{1} es Pro, J_{1} es Val y K_{1} es Asn; entonces uno o más
de A_{1} a K_{1} es un aminoácido D y Z se selecciona entre el
grupo que consiste en alquilamino, dialquilamino, cicloalquilamino,
arilamino, aralquilamino, alquiloxi, ariloxi o aralquiloxi.
o del grupo que consiste en
^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{25-28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{25,28-29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina,
^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina,
^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{23}Leu^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{18}Arg^{23}Leu^{25,28}Pro-h-amilina,
^{17}Ile^{23}Leu^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{17}Ile^{25,28,29}Pro-h-amilina,
des-^{1}Lys^{17}Ile^{23}Leu^{25,28,29}Pro-h-amilina,
^{17}Ile^{18}Arg^{23}Leu-h-amilina,
^{17}Ile^{18}Arg^{23}Leu^{26}Val^{29}Pro-h-amilina,
^{17}Ile^{18}Arg^{23}Leu^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina,
^{13}Thr^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{28}Leu^{29}Pro^{31}Asp-h-amilina,
^{13}Thr^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{29}Pro^{31}Asp-h-amilina,
des-^{1}Lys^{13}Thr^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{28}Pro^{31}Asp-h-amilina,
^{13}Thr^{18}Arg^{21}His^{23}Leu^{26}Ala^{29}Pro^{31}Asp-h-amilina,
^{13}Thr^{18}Arg^{21}His^{23}Leu^{28,29}Pro^{31}Asp-h-amilina,
y
^{13}Thr^{18}Arg^{21}His^{23}Leu^{25}Pro^{26}Ala^{28,29}Pro^{31}Asp-h-amilina
para preparación de una composición farmacéutica
para tratar o prevenir la gastritis o úlcera gástrica en un sujeto,
comprendiendo dicha composición farmacéutica dicha amilina o dicho
análogo de agonista de amilina, o una sal farmacéuticamente
aceptable de los mismos, en un vehículo y dosis farmacéuticamente
aceptables, en el que dicha composición se administra por una ruta
seleccionada entre el grupo que consiste en administración
subcutánea, intravenosa, nasal, oral, pulmonar, transdérmica y
bucal.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicha composición comprende un tampón o un conservante o un agente
espesante.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
dicha composición farmacéutica se usará en conjunción con un agente
antiinflamatorio no esteroideo.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sujeto es humano.
5. El uso según la reivindicación 1 en el que
dicho análogo de agonista de amilina es
^{25,28,29}Pro-h-amilina.
6. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha gastritis está inducida por
la administración de un agente antiinflamatorio no esteroideo.
7. El uso según las reivindicaciones 3 ó 6, en
el que dicho agente antiinflamatorio no esteroideo se selecciona
entre el grupo que consiste en salicilato, fenilbutazona,
indometacina, acetaminofeno, fenacetina, naproxeno, ibuprofeno,
sulandac, etodolac, fenamatos, telmetina, cetoralac, diclofenac,
fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina, piroxicam y
apazona.
8. Uso según las reivindicaciones 1 a 7, en el
que dicho sujeto sufre efectos gástricos inducidos por agente
antiinflamatorio no esteroideo seleccionados entre el grupo que
consiste en gastritis erosiva aguda, úlceras gástricas o
intestinales, molestias epigástricas, náuseas, vómitos y
hemorragia.
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