ES2345113T3 - Peptidos de la familia amilina y metodos para su obtencion y utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Péptido de la familia amilina, en el que el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de SEC ID nº: 137 que incluye una sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, en el que el péptido reduce la ingesta de alimentos.
Description
Péptidos de la familia amilina y métodos para su
obtención y utilización.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos y métodos para su obtención y utilización. Estos
compuestos pueden ser útiles para tratar o prevenir afecciones
tales como trastornos metabólicos, trastornos vasculares,
trastornos renales, y/o trastornos gastrointestinales. Una afección
ejemplar puede ser aquella en la que es valiosa la reducción de la
ingesta alimentaria o ingesta calórica, por ejemplo,
obesidad, diabetes Tipo II, trastornos de la alimentación, síndrome
metabólico y síndrome de resistencia a insulina.
Se ha llevado a cabo mucho trabajo hasta la
fecha sobre amilina, calcitonina, y péptido relacionado con el gen
de calcitonina (CGRP), para comprender su estructura y función. La
Tabla 1 proporciona un resumen de algunos efectos biológicos de
CGRP, calcitonina y amilina según se publica en Wimalawansa, S.J.
(1997) Critical Reviews in Neurobiology, 11;
167-239.
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Se ha dado a conocer que la amilina regula el
vaciamiento gástrico y suprime la secreción de glucagón y la
ingesta de alimentos, regulando así la velocidad de aparición de la
glucosa en la circulación. Parece que complementa las acciones de
la insulina, que regula la velocidad de desaparición de la glucosa
de la circulación y su captación por tejidos periféricos. Estas
acciones están apoyadas por hallazgos experimentales en roedores y
seres humanos, que indican que la anilina complementa los efectos de
insulina en el control de la glucosa postprandial mediante por lo
menos tres mecanismos independientes, todos los cuales afectan a la
velocidad de aparición de la glucosa. En primer lugar, la amilina
suprime la secreción de glucagón postprandial, en comparación con
adultos sanos, los pacientes con diabetes tipo 1 no tienen amilina
en circulación, y los pacientes con diabetes tipo 2 tienen
concentraciones reducidas de amilina postprandial. Además, la
infusión de un anticuerpo monoclonal específico para amilina, que
se une a la amilina en circulación, dio nuevamente como resultado
concentraciones enormemente elevadas de glucagón con relación a los
controles. Estos resultados señalan un papel fisiológico de amilina
endógena en la regulación de la secreción de glucagón postprandial.
En segundo lugar, la amilina ralentiza la movilidad
gastrointestinal y el vaciamiento gástrico. Finalmente, se demostró
que inyecciones intrahipotalámicas de amilina de rata reducen la
alimentación en ratas y alteran el metabolismo de neurotransmisores
en el hipotálamo. En ciertos estudios, la ingesta de alimentos se
redujo significativamente durante hasta ocho horas tras la
inyección intrahipotalámica de amilina de rata y CGRP de rata. En
ensayos con humanos, se ha demostrado que un análogo de amilina,
pramlintida, reduce el peso o la ganancia de peso. La amilina puede
ser beneficiosa tratando afecciones metabólicas tales como diabetes
y obesidad. La amilina también se puede usar para tratar dolor,
trastornos óseos, gastritis, para modular lípidos, en particular
triglicéridos, o para afectar a la composición corporal tal como la
pérdida preferente de grasa y racionamiento de tejido magro.
La hormona calcitonina (CT) se denominó por su
secreción en respuesta a hipercalcemia inducida y su rápido efecto
hipocalcémico. Es producida en y segregada a partir de células
neuroendocrinas en el tiroide, que desde entonces se ha denominado
células C. La acción mejor estudiada de
CT(1-32) es su efecto sobre el osteoclasto.
Los efectos in vitro de CT incluyen la pérdida rápida de
bordes desordenados y la liberación reducida de enzimas
lisosómicas. Finalmente, la inhibición de las funciones del
osteoclasto mediante CT da como resultado una disminución en la
resorción ósea. Sin embargo, parece que ni una reducción crónica de
CT sérica en el caso de tiroidectomía ni la CT sérica aumentada
encontrada en el cáncer de tiroides medular están asociadas con
cambios en el calcio sérico o masa ósea. De este modo, es muy
probable que una función principal de
CT(1-32) sea combatir la hipercalcemia aguda
en situaciones de emergencia y/o proteger el esqueleto durante
períodos de "estrés cálcico" tales como crecimiento, embarazo
y lactancia (repasado en Becker, JCEM, 89(4):
1512-1525 (2004) y Sexton, Current Medicinal
Chemistry 6: 1067- 093 (1999)). Consistente con esto están los datos
recientes procedentes del ratón al que se le ha suprimido el gen de
calcitonina, que elimina tanto la calcitonina como los péptidos de
CGRP-I, que revelaron que el ratón tuvo niveles
normales de valores relacionados con calcio basal, pero una
respuesta calcémica incrementada (Kurihara H, et al,
Hypertens Res., febrero de 2003; 26 Supl: S
105-8).
CT tiene un efecto sobre los niveles de calcio
plasmático, e inhibe la función de osteoclastos y se usa ampliamente
para el tratamiento de osteoporosis. Terapéuticamente, parece que
la CT de salmón incrementa la densidad ósea y disminuye las tasas
de fractura, con efectos adversos mínimos. CT también se ha usado
con éxito durante los últimos 25 años como una terapia para la
enfermedad ósea de Paget, que es un trastorno esquelético crónico
que puede dar como resultado huesos alargados o deformados en una o
más regiones del esqueleto. CT también se usa ampliamente por su
efecto analgésico sobre dolor óseo experimentado durante la
osteoporosis, aunque el mecanismo para este efecto no está
claramente entendido.
El péptido relacionado con el gen de calcitonina
(CGRP) es un neuropéptido cuyos receptores están ampliamente
distribuidos en el cuerpo, incluyendo el sistema nervioso y el
sistema cardiovascular. Parece que este péptido modula la
neurotransmisión sensorial, y es uno de los péptidos vasodilatadores
endógenos más potentes descubierto hasta la fecha. Los efectos
biológicos dados a conocer para CGRP incluyen: modulación de la
sustancia P en inflamación, actividad del receptor nicotínico en la
unión neuromuscular, estimulación de la secreción de enzimas
pancreáticas, una reducción de la secreción de ácidos gástricos,
vasodilatación periférica, aceleración cardíaca, neuromodulación,
regulación del metabolismo de calcio, estimulación osteogénica,
secreción de insulina, un incremento en la temperatura corporal, y
una disminución en la ingesta de alimentos (Wimalawansa, Amylin,
calcitonin gene-related peptide, calcitonin and ADM:
a peptide superfamily. Crit Rev Neurobiol. 1997;
11(2-3): 167-239). Un papel
importante de CGRP es controlar el flujo sanguíneo a diversos
órganos mediante sus potentes acciones vasodilatadoras, como se
evidencia por un incremento de la presión arterial media tras la
administración intravenosa de CGRP. Las acciones vasodilatadoras
están también apoyadas por análisis recientes de ratones
homocigóticos a los que se les ha suprimido CGRP, que demostraron
una elevada resistencia vascular periférica y una elevada tensión
arterial provocada por un incremento de la actividad simpática
periférica ((Kurihara H, et al, Targeted disruption of ADM
and alphaCG RP genes reveals their distinct biological roles.
Hypertens Res. febrero de 2003; 26 SuppliS 105-8).
De este modo, parece que CGRP provoca efectos vasodilatadores,
efectos hipotensivos, y un incremento en la frecuencia cardíaca,
entre otras acciones.
La infusión prolongada de CGRP en pacientes con
insuficiencia cardíaca congestiva ha demostrado un efecto
beneficioso sostenido sobre funciones hemodinámicas sin efectos
adversos, sugiriendo un uso en insuficiencia cardíaca. Otras
indicaciones de uso de CGRP incluyen insuficiencia renal, isquemia
de la arteria coronaria crónica, tratamiento de arritmia cardíaca,
otra enfermedad vascular periférica tal como el fenómeno de Raynaud,
hemorragia subaracnoidea, hipertensión, e hipertensión pulmonar.
También se puede tratar potencialmente la eclampsia de embarazo y
parto prematuro (Wimalawansa, 1997). Usos terapéuticos recientes
incluyen el uso de antagonistas de CGRP para el tratamiento de
migrañas.
Hay muchas propiedades beneficiosas de cada
péptido que se pueden usar solas o en combinación para tratar o
prevenir una variedad de afecciones. Sería útil crear péptidos
nuevos y útiles que tengan múltiples acciones que proporcionen
características mejoradas no poseídas por los péptidos existentes.
Por ejemplo, en ensayos de ingesta de alimentos, se ha demostrado
que la amilina tiene un comienzo rápido, en 30 minutos, pero su
efecto disminuye después de 60 minutos.
Por el contrario, se ha demostrado que la
calcitonina de salmón tiene un efecto retrasado, con niveles pico
mantenidos todavía a los 240 minutos. Los nuevos compuestos que
pueden imitar los efectos de amilina y/o calcitonina y que tienen
un rápido comienzo de actividad como amilina con la actividad
sostenida de calcitonina pueden incrementar la potencia y eficacia
de cualquier compuesto solo.
Además, la combinación de ciertas
características fisicoquímicas de amilina, calcitonina, y/o CGRP en
una sola modalidad puede facilitar la intervención en diferentes
puntos en un circuito metabólico disfuncional. Estos nuevos
compuestos combinan actividades o propiedades deseables para una
terapéutica superior, lo que puede dar como resultado compuestos
que tengan por lo menos una característica deseable tal como mayor
eficacia, mayor potencia, mayor biodisponibilidad, menores efectos
secundarios, facilidad en la fabricación, estabilidad, y/o
solubilidad.
La presente invención se refiere, por lo menos
en parte, a nuevos péptidos de la familia amilina, en los que el
péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de
SEC ID nº: 137 incluyendo una sustitución, inserción o supresión de
aminoácidos, en los que el péptido reduce la ingesta de alimentos.
En un aspecto general, estos nuevos compuestos (también denominados
como compuestos de la invención) tienen por lo menos una región de
bucle de amilina o calcitonina y sus análogos; una región hélice
\alpha de por lo menos una porción de una región hélice \alpha
de calcitonina o sus análogos o una región hélice \alpha que tiene
una porción de una región hélice \alpha de amilina y una región
hélice \alpha de calcitonina; o sus análogos respectivos; y una
cola C-terminal de amilina o calcitonina o sus
análogos, con la condición de que la cola
C-terminal de calcitonina o un análogo de
calcitonina no sea prolina (Pro), hidroxiprolina (Hyp), homoserina
(Hse) o derivados de Hse.
Como se usa aquí, un "análogo" se refiere a
un péptido cuya secuencia derivó de la de un péptido de referencia
base, por ejemplo, amilina y calcitonina, e incluye
inserciones, sustituciones, extensiones, y/o supresiones de la
secuencia de aminoácidos de referencia, que tiene preferentemente
por lo menos 50 ó 55% de identidad de secuencias de aminoácidos con
el péptido base, más preferentemente que tiene por lo menos 70%,
80%, 90%, o 95% de identidad de secuencias de aminoácidos con el
péptido base. En una realización, tales análogos pueden comprender
sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos
(incluyendo aminoácidos no naturales y formas L y D). Los análogos
incluyen compuestos que tienen actividad agonista y compuestos que
tienen actividad antagonista. Los análogos, como se definen aquí,
también incluyen derivados.
Un "derivado" se define como péptido de
referencia o análogos, descritos anteriormente, que tienen una
modificación química de uno o más de sus grupos laterales de
aminoácidos, átomos de carbono en \alpha, grupo amino terminal, o
grupo ácido carboxílico terminal. Una modificación química incluye,
pero no se limita a, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces,
y eliminar restos químicos. Las modificaciones en los grupos
laterales de los aminoácidos incluyen, sin limitación, acilación de
grupos \varepsilon-amino de lisina,
N-alquilación de arginina, histidina, o lisina,
alquilación de grupos de ácidos carboxílicos de ácido glutámico o
ácido aspártico, y desaminación de glutamina o asparagina. Las
modificaciones del amino terminal incluyen, sin limitación, las
modificaciones de desaminación, N-alquilo inferior,
N-dialquilo inferior, y N-acilo. Las
modificaciones del amino terminal incluyen, sin limitación, la
desaminación, modificaciones de N-alquilo inferior,
N-dialquilo inferior, y N-acilo,
tales como alquilacilos, alquilacilos ramificados, alquilarilacilos.
Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin
limitación, las modificaciones amídicas, de alquilamida inferior, de
dialquilamida, arilamida, alquilarilamida y éster de alquilo
inferior. Alquilo inferior es alquilo de C1-C4.
Además, uno o más grupos laterales, o grupos terminales, se pueden
proteger mediante grupos protectores conocidos por el químico
sintético experto normalmente. El carbono en \alpha de un
aminoácido puede estar mono- o
dimetilado.
dimetilado.
Se describen compuestos que tienen una región de
bucle de amilina o análogo de amilina, por lo menos una porción de
una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de
calcitonina, y una cola C-terminal de amilina o
análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una región de
bucle de calcitonina o análogo de calcitonina, por lo menos una
porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de
calcitonina, y una cola C-terminal de amilina o
análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una región de
bucle de amilina o análogo de amilina, por lo menos una porción de
una región de hélice \alpha de amilina o análogo de amilina y por
lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina
o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de
amilina o análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una
región de bucle de calcitonina o análogo de calcitonina, por lo
menos una porción de una región de hélice \alpha de amilina o
análogo de amilina y por lo menos una porción de una región de
hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina, y una cola
C-terminal de amilina o análogo de amilina. Se
describen compuestos que tienen una región de bucle de amilina o
análogo de amilina, una porción de una región de hélice \alpha de
calcitonina o análogo de calcitonina o por lo menos una porción de
una región de hélice \alpha de amilina o análogo de amilina y por
lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina
o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de
calcitonina o análogo de calcitonina.
La región de bucle de los nuevos compuestos
puede comprender además no más de una modificación, incluyendo
sustituciones, inserciones, o supresiones del bucle de amilina o
calcitonina, y sus análogos. Se contempla además que los nuevos
compuestos pueden tener modificaciones adicionales en la porción
N-terminal del bucle que comprende una región
N-cobertura, que puede tener características
hidrófobas o hidrófilas tales como acetilo, isocaproílo, ácido
3,6-dioxioctanoico, o ácido
1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminsuccinímico.
Las modificaciones pueden incluir además un aminoácido adicional.
Esta es un área que permite muchas modificaciones muy numerosas de
mencionar, pero se entenderá por el experto en la materia basándose
en lo que se ejemplifica posteriormente en la presente
solicitud.
En general, con respecto a la secuencia de
aminoácidos, el término "modificación" incluye sustituciones,
inserciones, alargamientos, supresiones y derivatizaciones, solas o
en combinación. Los nuevos compuestos de la invención pueden
incluir una modificación de un resto de aminoácido "no
esencial". En el contexto de la invención, un resto de
aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar, es
decir, suprimir o sustituir, en la nueva secuencia de aminoácidos
sin suprimir o sustancialmente reducir la actividad agonista del
polipéptido análogo.
Las sustituciones incluyen sustituciones de
aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácidos
conservativa" es aquella en la que el resto de aminoácido se
sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral
similar, o características fisicoquímicas similares (por
ejemplo, características electrostáticas, de enlace de
hidrógeno, isostérica, hidrófoba). Los aminoácidos pueden ser de
origen natural, o no naturales (innaturales). En la técnica se
conocen familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas
laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con
cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina,
histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido
aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas
(por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina,
treonina, tirosina, metionina, cisteína), cadenas laterales no
polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,
prolina, fenilalanina, triptófano), cadenas laterales
\beta-ramificadas (por ejemplo, treonina,
valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por
ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Las
sustituciones también pueden incluir cambios no conservativos.
Los compuestos de la invención también se pueden
derivatizar adicionalmente mediante alteraciones químicas tales
como amidación, glucosilación, acilación, sulfatación,
fosforilación, acetilación, y ciclación. Tales alteraciones
químicas se pueden obtener a través de metodologías químicas o
bioquímicas, así como a través de procesos in vivo, o
cualquier combinación de los mismos. Los derivados de los compuestos
de la invención también pueden incluir conjugación a uno o más
polímeros o sustituyentes de moléculas pequeñas. Un tipo de
conjugación polimérica es la unión o enlazamiento de polímeros de
polietilenglicol ("PEG"), poliaminoácidos (por ejemplo,
poly-his, poly-arg,
poly-lys, etc.) y/o cadenas de ácidos grasos de
diversas longitudes a los términos N o C o cadenas laterales de
restos de aminoácidos de un análogo de AFT-6. Los
sustituyentes de pequeñas moléculas incluyen alquilos cortos y
alquilos restringidos (por ejemplo, ramificados, cíclicos,
condensados, adamantilo), y grupos aromáticos. Además, los restos
básicos tales como R y K se pueden sustituir por homoR y homoK,
citrulina, u ornitina, para mejorar la estabilidad metabólica del
péptido. Los compuestos de la invención también incluyen formas
ácidas así como formas amídicas de los péptidos.
Se describe que la región de hélice \alpha de
los nuevos compuestos puede comprender por lo menos cuatro
aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha de
calcitonina o análogo de calcitonina. La región de hélice \alpha
puede comprender por lo menos 5, 6, 7 u 8 aminoácidos consecutivos
de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de
calcitonina. La región de hélice \alpha puede comprender por lo
menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más
aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha de
calcitonina o análogo de calcitonina. Cuando el número de
aminoácidos consecutivos es menor que 8, se contempla que la región
de hélice \alpha comprenda además por lo menos 4, 5, 6, 7, 9, 10,
11, o más aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha
de amilina o análogo de amilina. Se prevé que cuantos menos
aminoácidos de calcitonina o análogo de calcitonina, mayor número
de aminoácidos de amilina o análogo de amilina se pueden encontrar
en la región de hélice \alpha de los nuevos compuestos. El número
de aminoácidos que comprende la región de hélice \alpha puede ser
de aproximadamante 10 a 23 aminoácidos. En consecuencia, la región
de hélice \alpha puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos. Además, los
aminoácidos deberían proporcionar aproximadamante tres hasta
aproximadamante seis vueltas de la hélice alfa. Se contempla además
que la región de hélice \alpha de los nuevos compuestos puede
comprender además no más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis,
siete, ocho o 10 modificaciones, incluyendo sustituciones,
inserciones, o supresiones de la región de hélice \alpha de
calcitonina y/o amilina, y sus análogos.
Se describe que la cola
C-terminal de los nuevos compuestos puede comprender
por lo menos seis, cinco, o cuatro aminoácidos de amilina o
calcitonina, y sus análogos. La cola C-terminal de
los nuevos compuestos puede comprender por lo menos una porción del
extremo C-terminal que tiene una vuelta \alpha
\beta. La vuelta \beta se puede introducir mediante la
combinación de aminoácidos de Gly-Ser. En
consecuencia, los nuevos compuestos pueden tener un extremo
C-terminal que comprende una porción de una cola
C-terminal de amilina o calcitonina (y sus
análogos) que tiene Gly-Ser o que comienza en
Gly-Ser.
La cola C-terminal de los nuevos
compuestos puede comprender además no más de uno, dos, o tres
modificaciones, incluyendo sustituciones, inserciones o supresiones
del bucle de amilina o calcitonina, y sus análogos. Se contempla
además que los nuevos compuestos pueden tener modificaciones
adicionales en la porción C-terminal de la cola
C-terminal que puede incluir
L-octilglicina, 4ABU (ácido
4-aminobutírico), 9Anc (ácido
9-aminononanoico), ácido
3,6-dioxioctanoico o ácido
1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminsuccinímico.
La modificación puede incluir además uno, aminoácidos adicionales.
Los tipos de modificación contemplados en esta área serán
comprendidos por el experto en la materia basándose en lo que se
ejemplifica adicionalmente en la presente solicitud.
En un aspecto, una región de bucle se define
como aquella región encontrada en el extremo
N-terminal que comprende por lo menos 5 a 8
aminoácidos, en la que el primer y el último aminoácidos son capaces
de crear un enlace, por ejemplo restos en posiciones
2-7 de amilina o restos en posiciones
1-7 de calcitonina y sus regiones correspondientes
en sus análogos respectivos. En otro aspecto, una región de hélice
\alpha se define como la porción interna de amilina o calcitonina
flanqueada por la región de bucle y la cola
C-terminal que forma estructuralmente una hélice
\alpha, por ejemplo restos en las posiciones 8-23
de amilina o restos en las posiciones 8-27 de
calcitonina y sus regiones correspondientes en sus análogos
respectivos. En todavía otro aspecto, una cola
C-terminal se define como aquella región después de
la hélice \alpha, por ejemplo restos en las posiciones
33-37 de amilina o más lejos, tales como restos en
las posiciones 27-37 o restos en las posiciones 27 ó
28 a 32 de calcitonina. Se incluyen en los compuestos de la
invención tanto las formas de amida como de ácido de los compuestos
descritos.
\newpage
Amilina y calcitonina, como se define aquí,
incluye todas las especies nativas y variaciones. Los ejemplos de
amilina y calcitonina incluyen, pero no se limitan a:
| amilina humana (hAmilina) | KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY | (SEC ID nº 1) |
| amilina de rata (rAmilina) | KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY | (SEC ID nº 2) |
| calcitonina de salmón (sCT) | CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP | (SEC ID nº 3) |
| calcitonina humana (hCT) | CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP | (SEC ID nº 4). |
Por "aminoácido" y "resto de
aminoácido" se quiere decir aminoácidos naturales, aminoácidos no
naturales, y aminoácidos modificados. Excepto que se señale de otro
modo, cualquier referencia a un aminoácido, general o
específicamente por el nombre, incluye la referencia tanto a los
estereoisómeros D como L si su estructura permite tales formas
estereoisómeras. Los aminoácidos naturales incluyen alanina (Ala),
arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína
(Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly),
histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), Lisina (Lys),
metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser),
treonina (Thr); triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val). Los
aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a,
homolisina, homoarginina, homoserina, ácido acetidincarboxílico,
ácido 2-aminoadípico, ácido
3-aminoadípico, beta-alanina, ácido
aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido
4-aminobutírico, ácido
6-aminocaproico, ácido
2-aminoheptanoico, ácido
2-aminoisobutírico, ácido
3-aminoisobutírico, ácido
2-aminopimélico, terc-butilglicina,
ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido
2,2'-diaminopimélico, ácido
2,3-diaminopropiónico,
N-etilglicina, N-etilasparagina,
homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina,
3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina,
isodesmosina, alo-isoleucina,
N-metilalanina, N-metilglicina,
N-metilisoleucina,
N-metilpentilglicina, N-metilvalina,
naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido
pipecólico y tioprolina. Los aminoácidos no naturales adicionales
incluyen restos de aminoácidos modificados que están químicamente
bloqueados, reversible o irreversiblemente, o químicamente
modificados en su grupo amino N-terminal o sus
grupos de cadena lateral, como por ejemplo aminoácidos D y L
N-metilados o restos en los que los grupos
funcionales de cadena lateral están químicamente modificados por
otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoácidos modificados
incluyen sulfóxido de metionina; metionina sulfona; éster
beta-metílico de ácido aspártico, un aminoácido
modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, un
aminoácido modificado de glicina; o alanincarboxamida, un aminoácido
modificado de alanina. Los restos adicionales que se pueden
incorporar se describen en Sandberg et al., J. Med. Chem.
41: 2481-91, 1998. Como se señala previamente, se
contempla además que se puede realizar en la región de bucle no más
de una modificación, tal como sustitución, inserción, supresión y/o
derivatización.
La región de bucle de los nuevos compuestos
puede comprender además modificaciones o aminoácidos adicionales en
el extremo N-terminal. Tales modificaciones incluyen
la adición de compuestos tales como Lys, Ala, Phe, Ile, Ser,
octilglicina, isocap, ácido
Fmoc-3,6-dioxaoctanoico, ácido
Fmoc-1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminsuccinímico,
acetilo, y/o grupos para solubilidad, suministro, señalización.
Bucles modificados ejemplares incluyen la adición de Lys a la
secuencia de Xaa1 o la adición de Ile a la secuencia de Xaa1.
En toda la solicitud, las secuencias de
aminoácidos se pueden referir como aminoácidos en la posición a a
la posición b adyacente a un péptido de referencia. En la presente
solicitud, el péptido de referencia es amilina y calcitonina, cuyas
secuencias se proporcionan en SEC ID nºS:1-4. Por
ejemplo, 1-7 hAmilina se refiere a la secuencia de
aminoácidos desde la posición 1 a la posición 7, inclusive, de
amilina humana (SEC ID nº:1). La modificación al péptido de
referencia se puede mostrar como: posición de modificación adyacente
a la modificación. Por ejemplo, (2Asp 7Lys) 1-7
hAmilina representa la secuencia de aminoácidos en posiciones 1 a 7
de amilina humana con una modificación de una Cys por Asp en la
posición 2 y una modificación de Cys por Lys en la posición 7.
La región de hélice \alpha del nuevo compuesto
puede tener una longitud de aproximadamante 8 a 23 aminoácidos. En
ciertas formas de realización, la región de hélice \alpha es
anfipática. La región de hélice \alpha puede comprender
aproximadamante 3 a 6 vueltas helicoidales. La región de hélice
\alpha puede comprender 3, 4, 5 ó 6 vueltas helicoidales. La
región de hélice \alpha puede ser una estructura rígida
equivalente a aproximadamante 3, 4, 5 ó 6 vueltas helicoidales. Un
ejemplo de una hélice idealizada es LLQQLQKLLQKLKQY (SEC ID nº:28).
En ciertas formas de realización, la hélice \alpha es una
estructura anfipática. En consecuencia, se pueden seleccionar
características de aminoácidos deseables que podrían proporcionar
este tipo de estructura.
Se ha encontrado que la región de hélice
\alpha de calcitonina, una combinación de una región de hélice
\alpha de amilina y una calcitonina, o sus partes, y/o algunos
elementos de CGRP son deseables en la región de hélice \alpha de
los nuevos compuestos. Se contempla que, al igual que con la región
del bucle, la región de hélice \alpha puede ser a partir de
cualquier amilina o calcitonina, y sus análogos. En consecuencia,
en ciertas formas de realización, la región de hélice \alpha es
por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de
calcitonina o análogo de calcitonina. La región de hélice \alpha
puede ser por lo menos una porción de una región de hélice \alpha
de calcitonina o análogo de calcitonina y por lo menos una porción
de una hélice \alpha de una amilina o análogo de amilina. La
región de hélice \alpha de los nuevos compuestos puede contener
elementos de CGRP. Se contempla además que los nuevos compuestos
pueden tener no más de una modificación, tales como sustituciones,
inserciones, supresiones, y/o derivatizaciones.
La región de hélice \alpha de la invención
puede comprender aminoácidos desde la posición 8 de sCT hasta la
posición 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ó 27 de sCT. Además, la
región de hélice \alpha puede comprender más de una porción de
una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de
calcitonina de la misma especie o de diferente especie, por ejemplo
8-21 sCT 19-27 sCT;
8-21 sCT 18-27 sCT; u
8-16 hCT 17-27 sCT; o (11Arg)
8-16 hCT (18are) 17-27 sCT. Como
alternativa o adicionalmente, la hélice \alpha descrita
anteriormente de 8-18 sCT a 8-27
sCT puede comprender además las sustituciones de uno o más de
(10Aib), (11art), (110m), (11hArg), (11Cit), (11hLys),
(11Lys(for)), (17Aib), (18Arg), (18Om), (18hArg), (18Cit),
(18hLys), (18Lys(for)), (18Lys(PEG5000)), (22Leu),
(24Pro) o cualquier combinación de los mismos.
Se describen compuestos que incluyen:
- SEC ID nº 40
- KCNTATCVLGKLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 41
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 42
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPPTNTGSNTY
- SEC ID nº 43
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTY
- SEC ID nº 44
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPPTNVGSNTY
- SEC ID nº 45
- KCNTATCVLGRLANFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 46
- ACNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 47
- KCNAATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 48
- KCNTAACVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 49
- CANLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 50
- Isocaproil-STAVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 51
- CSNASTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 52
- CSNLATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 53
- CSNLSACVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 54
- KCNTATCVLGRLSQELHKLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 55
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSGTP
- SEC ID nº 56
- CSALSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 57
- Ac-(Agy)SNLST(Agy)VLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 58
- Ac-K(Agy)NTAT(Agy)VLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 59
- Isocaproil-STAVL(Aib)RLSQELRLQTYPRTNTGSGTP
- SEC ID nº 60
- Isocaproil-STAVLG[K(For)]LSOELH[K(For)]LQTYPRTNTGSGTP
- SEC ID nº 61
- Isocaproil-STAVL(Aib)[K(For)]LSOEL(Aib)[K(For)]LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 62
- Isocaproil-STAVL(Aib)[K(For)]LSQEL(Aib)[K(For)]LQTYPRTNVGSNTY
- SEC ID nº 63
- KCNTATCLLQQLQKLLQKLKQYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 64
- KCNTASCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 65
- KCNTAVCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 66
- KCNTATCVLGRLSQELHRYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 67
- KCNTATCVLGK(For)LSQELHK(For)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 68
- KCNTA(d-Thr)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 69
- KCNTA(dAh)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 70
- Ac-ACNTATCVLGRLSQELHK(PEG5000)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 71
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 72
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 73
- KCNTATCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 74
- KCNTSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 75
- KCNTATCATQRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 76
- KCNTATCATQRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTY
- SEC ID nº 77
- KCNTSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY
- SEC ID nº 78
- KCNTA(Hse)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 79
- KCNTA(Ahb)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 80
- KCNTA(Ahp)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 81
- KCNTAT(0P03H2)CVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 82
- KCNTATCVLG(Orn)LSQELH(Orn)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 83
- KCNTATCVLG(Cit)LSOELH(Cit)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 84
- KCNTATCVLG(homoK)LSQELH(homoK)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 85
- L-Octilglicina-KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 86
- N-3,6-dioxaoctanoil-CNTATCVLGRLSQELHRLQTVPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 87
- KCNTATCMLGRYTQDFHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 88
- DSNLSTKVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 89
- KDNTATKVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 90
- CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 91
- KCNTATCVLGRLSOELHRLQTYPRTNTGSNTY(9Anc)
- SEC ID nº 92
- KCNTATCVLGRLSOELHRLQTYPRTNTGSNTY(L-octilglicina)
- SEC ID nº 93
- N-isocaproil-KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 94
- KCNTATCVLG(homoR)LSQELH(homoR)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 95
- FCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 96
- KCNTATCVLGRLSOELH(Cit)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 97
- KCNTATCVLGRLSOELH(Orn)LQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 98
- ICNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 99
- 1-Octilglicina-CNTATCVLG RLSQELH RLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 100
- Isocaproil-CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRINTGSNTY
- SEC ID nº 101
- KCNTATCVLG(Cit)LSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 102
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(4ABU)
- SEC ID nº 103
- Isocaproil-KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY(4ABU)
- SEC ID nº 104
- KCNTSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSEAF
- SEC ID nº 105
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPTNVGSEAF
- SEC ID nº 106
- KCNTATCVLGRLSRSLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 107
- KCNTATCVTHRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 108
- KCNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 109
- CNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNT
- SEC ID nº 110
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQNFVPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 111
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSETF
- SEC ID nº 112
- ACDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 113
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSKAF
- SEC ID nº 114
- KCDTATCVTHRLAGLLSRSQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 115
- KCNTATCVLGRLADALHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 116
- KCNTATCVLGRLAAFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 117
- SCNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 118
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTMPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 119
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTVPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 120
- KCNTATCVLGRLNEYLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 121
- SCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 122
- KCNTATCVLGRLTEFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 123
- KCNTATCVLGRLAEFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 124
- KCNTATCVLGRLTDYLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 125
- KCNTATCVLGRLAQFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 126
- KCNTATCVLGRLADFLHRFQTFPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 127
- KCNTATCVLGRLADFLHRFHTFPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 128
- KCNTATCVLGRLADFLHRFQTFPRTNTGSGTP
- SEC ID nº 129
- CNTATCVLGRLADFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 130
- KCDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 131
- KCNTATCVLGRLFDFLHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 132
- KCNTATCVLGRLAAALHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 133
- TCDTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 134
- CSNLSTCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY
- SEC ID nº 135
- KCNTATCATQRLANELVRLQTYPRTNVGSNTY
- SEC ID nº 136
- CSNLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
- SEC ID nº 137
- KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY
En todavía otro aspecto, se describen fragmentos
biológicamente activos de SEC ID nºS:40 a 137. Los fragmentos
biológicamente activos pueden comprender supresiones de 1
aminoácido. En ciertas formas de realización, las secuencias de
aminoácidos comprenden por lo menos una modificación, tal como
sustituciones, inserciones, supresiones, y/o derivatizaciones.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención pueden actuar como un agonista para por lo menos un
efecto biológico de calcitonina, amilina y/o CGRP aquí descritos, o
se pueden unir a por lo menos uno de los receptores de amilina,
calcitonina, o CGRP.
En todavía otro aspecto general, los compuestos
de la invención pueden ser útiles para reducir la ingesta de
alimentos, reducir el apetito, inducir la saciedad, reducir la
disponibilidad de los nutrientes, provocar pérdida de peso, afectar
a la composición corporal, alterar el contenido de energía corporal
o gasto de energía, mejorar el perfil lipídico (incluyendo reducir
los niveles de colesterol LDL y triglicéridos y/o cambiar los
niveles de colesterol HDL), ralentizar la movilidad
gastrointestinal, retrasar el vaciamiento gástrico, moderar las
excursiones de glucosa sanguínea postprandial, prevenir o inhibir la
secreción de glucagón, y reducir la tensión arterial.
De este modo, en ciertas formas de realización,
los métodos de la invención son útiles para tratar o prevenir
afecciones o trastornos que se pueden aliviar reduciendo la
disponibilidad de los nutrientes, que comprenden administrar a
dicho sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de
un compuesto de la invención. Tales afecciones y trastornos
incluyen, pero no se limitan a, trastornos alimentarios, resistencia
a insulina, obesidad, hiperglucemia postprandial anormal, diabetes
de cualquier tipo, incluyendo Tipo I, Tipo II y diabetes gravídica,
síndrome metabólico, síndrome de evacuación gástrica rápida,
hipertensión, dislipidemia, enfermedad cardiovascular,
hiperlipidemia, apnea del sueño, cáncer, hipertensión pulmonar,
colecistitis, y osteoartritis.
Los ejemplos no limitantes de una afección o
enfermedad cardiovascular son hipertensión, isquemia del miocardio,
y reperfusión del miocardio. Los compuestos de la invención también
pueden ser útiles para tratar o prevenir otras afecciones asociadas
con obesidad, incluyendo apoplejía, cáncer (por ejemplo,
cáncer endometrial, de mama, de próstata, y de colon),
colecistopatía, apnea del sueño, fertilidad reducida, y
osteoartritis (véase Lyznicki et al, Am. Fam. Phys.
63:2185, 2001). En otras formas de realización, los compuestos de la
invención se pueden usar para alterar la composición corporal por
razones estéticas, para potenciar las capacidades físicas, o para
producir una fuente de carne más magra.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención se pueden usar para inhibir la secreción de grelina. En
consecuencia, los compuestos de la invención pueden utilizar este
mecanismo para tratar o prevenir trastornos relacionados con
grelina, tales como síndrome de Prader-Willi,
diabetes de todos los tipos y sus complicaciones, obesidad,
hiperfagia, hiperlipidemia, y otros trastornos asociados con
hipernutrición.
En otro aspecto general, ahora se reconoce que
la amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la
invención, pueden ser útiles para tratar o prevenir el esófago de
Barrett, la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) y
afecciones asociadas con ella. Tales afecciones pueden incluir, pero
no se limitan a, pirosis, pirosis acompañada de regurgitación de
los contenidos gástricos/intestinal a la boca o los pulmones,
dificultad para tragar, tos, sibilancia intermitente e inflamación
de las cuerdas vocales (afecciones asociadas con GERD), erosión
esofágica, úlcera esofágica, estenosis esofágica, metaplasia de
Barrett (sustitución del epitelio esofágico normal por epitelio
anormal), adenocarcinoma de Barrett, y aspiración pulmonar. La
amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la
invención, tienen propiedades antisecretoras, tales como la
inhibición de ácidos gástricos, la inhibición de ácidos biliares, y
la inhibición de enzimas pancreáticas. Además, se ha encontrado que
la amilina tiene un efecto gastroprotector. En consecuencia, estas
propiedades de amilina, agonistas de amilina y compuestos de la
invención pueden hacerlos particularmente útiles en el tratamiento
o prevención de esófago de Barrett, y/o GERD y afecciones
relacionadas o asociadas como se describe aquí.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención pueden ser útiles además para tratar o prevenir
pancreatitis, carcinoma pancreático, y gastritis. Además, los
compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento y
prevención de pancreatitis en pacientes que han sufrido
colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (ERCP). Además se ha
descubierto que amilina y agonistas de amilina, incluyendo
compuestos de la invención, pueden tener un efecto terapéutico
sorprendentemente superior cuando se combinan con somatostatina. En
consecuencia, en ciertas formas de realización, los métodos para
tratar o prevenir pancreatitis comprenden administrar amilina, y
agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, y
administrar somatostatina y agonistas de somatostatina a un sujeto.
En otras formas de realización, los métodos para tratar o prevenir
pancreatitis comprenden administrar compuestos de la invención y
administrar somatostatina y agonistas de somatostatina.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención también pueden ser útiles para disminuir la resorción
ósea, disminuir el calcio plasmático, e inducir un efecto
analgésico. En consecuencia, los compuestos de la invención pueden
ser útiles para tratar trastorno óseo tal como osteopenia y
osteoporosis. Todavía en otras formas de realización, los
compuestos de la invención pueden ser útiles para tratar dolor y
neuropatía dolorosa.
Todavía en otro aspecto general, los compuestos
de la invención se pueden usar como parte de una terapia de
combinación. En ciertas formas de realización, los compuestos de la
invención se pueden usar con otros auxiliares de la dieta
comercialmente disponibles u otros agentes contra la obesidad, tales
como, a título de ejemplo, PYY y agonistas de PYY,
GLP-1 y agonistas de GLP-1, un
inhibidor de DPPIV, CCK y agonistas de CCK, exendina y agonistas de
exendina, y leptina y agonistas de leptina. En otras formas de
realización, los compuestos de la invención se pueden usar con
otros analgésicos, supresores inmunitarios, u otros agentes
antiinflamatorios.
Todavía en otro aspecto general, se describen
nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de
la invención así como métodos para usarlos. En ciertas formas de
realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender por
lo menos 0,01% a 5% p/v. En ciertas formas de realización, el pH de
la composición puede ser de aproximadamante 3,0 a aproximadamante
6,0. En ciertas formas de realización, el tampón puede ser acetato,
fosfato, citrato, o glutamato. En ciertas formas de realización, la
composición puede comprender un hidrato de carbono o un tonificador
de tipo alcohol polihidroxilado. En ciertas formas de realización,
la composición comprende además un conservante seleccionado del
grupo que consiste en m-cresol, alcohol bencílico,
parabenos y fenol. Todavía en otras formas de realización, la
administración de los compuestos en una dosis en el intervalo de
aproximadamante 0,05 mg/kg a aproximadamante 2 mg/kg. Por ejemplo,
una dosis diaria puede ser 1 \mug a aproximadamante 5 mg por día.
En ciertas formas de realización, los modos ejemplares de suministro
pueden ser inyección, infusión, absorción (mucosal), e inhalación.
Las vías de administración pueden ser intramuscular, intravenosa,
subcutánea, transdérmica, transmucosal, oral, nasal, o mediante
inhalación pulmonar.
También se contemplan nucleótidos que codifican
la secuencia de aminoácidos descrita aquí, vectores que contienen
los nucleótidos, células hospedantes para propagar nucleótidos y/o
expresar los polipéptidos codificados por los nucleótidos,
anticuerpos dirigidos a los nuevos compuestos, y sus usos para
cribar o detectar/diagnosticar una afección tal como las descritas
aquí, en un sujeto.
Estos y otros aspectos se pondrán más claramente
de manifiesto haciendo referencia a las siguientes formas de
realización preferidas y descripción detallada.
La Figura 1 muestra una reducción dependiente de
la dosis en el consumo de alimento en ratones que ayunaron toda la
noche a dosis de un compuesto ejemplar de la invención (ensayo de
ingesta de alimento).
La Figura 2A ilustra una ingesta calórica
reducida en ratas engordadas (obesas inducidas por dieta, o DIO)
con infusión periférica continua de un vehículo de compuestos
ejemplares de la invención durante un período de dos semanas.
La Figura 2B ilustra una reducción en el peso
corporal durante el período de tiempo correspondiente.
La Figura 3 representa los efectos sobre la
composición corporal por un compuesto ejemplar de la invención.
La Figura 4A representa efectos sobre el
vaciamiento gástrico mediante un compuesto ejemplar de la
invención.
La Figura 4B representa el efecto de
hipocalcemia por un compuesto ejemplar de la invención.
La Figura 5 representa efectos sobre los
triglicéridos por un compuesto ejemplar de la invención.
La Figura 6A-6B representa el
efecto sobre los triglicéridos a lo largo del tiempo por un
compuesto ejemplar de la invención.
Las Figuras 7A-7E representan el
efecto de la dosis sobre los triglicéridos a lo largo del tiempo por
un compuesto ejemplar de la invención.
La Figura 8A representa el efecto sobre grelina
por amilina.
Las Figuras 8B-8C representan el
efecto sobre grelina por amilina.
La Figura 9A representa el efecto sobre un
marcador de la función pancreática por un compuesto ejemplar de la
invención.
La Figura 9B representa el efecto sobre un
marcador de la función pancreática por un compuesto ejemplar de la
invención.
La Figura 10A representa el efecto sobre la
secreción de ácido gástrico por amilina.
La Figura 10B representa el efecto de la
respuesta a la dosis sobre la secreción de ácido gástrico por
amilina.
La Figura 11A representa el efecto
gastroprotector de amilina.
La Figura 11B representa el efecto
gastroprotector de amilina.
La Figura 11C representa la curva de dosis
frente a respuesta de amilina.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos o agonistas de la familia amilina, en los que el péptido
comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de SEC ID
nº: 137 que incluye una sustitución, inserción o supresión de
aminoácidos, en los que el péptido reduce la ingesta de alimentos
(también denominados como nuevos compuestos y compuestos de la
invención). Estos nuevos compuestos pueden ser útiles para tratar o
prevenir afecciones tales como trastornos metabólicos, trastornos
vasculares, trastornos renales, y/o trastornos gastrointestinales.
La sección previa proporciona la estructura de los compuestos. Los
nuevos compuestos se pueden describir además por tener
características deseables tales como actividad comparable y más
elevada en el tratamiento y/o prevención de afecciones y trastornos
metabólicos y aquellas citadas anteriormente, según se comparan con
amilina, calcitonina, y/o CGRP. En otras formas de realización, los
compuestos de la invención pueden no tener actividad comparable o
más elevada, pero pueden tener una mayor estabilidad o solubilidad,
menores efectos secundarios, combinación de actividades biológicas,
comienzo más rápido de actividad, duración más prolongada de
actividad, y/o facilidad en la fabricación, formulación, o uso que
amilina, calcitonina o CGRP.
Mediante una actividad de amilina se quiere
decir que un compuesto demuestra características fisiológicas
similares a la amilina, tales como las descritas en la presente
memoria descriptiva, por ejemplo reduciendo la ingesta de
alimentos. Los compuestos de la presente invención pueden ser
capaces de unirse a o interaccionar de otro modo directa o
indirectamente con un receptor de amilina, u otro receptor o
receptores con los cuales la propia amilina puede interaccionar
para provocar una respuesta biológica, por ejemplo reduciendo
la ingesta de alimentos.
Por una actividad de calcitonina se quiere decir
que un compuesto demuestra características fisiológicas similares a
calcitonina, tales como las descritas en la presente memoria
descriptiva, por ejemplo inhibiendo la función de osteoclastos. Los
compuestos de la presente invención pueden ser capaces de unirse a o
interaccionar de otro modo directa o indirectamente con un receptor
de CT, u otro receptor o receptores con los que la propia
calcitonina puede interaccionar para provocar una respuesta
biológica, por ejemplo inhibiendo la función de
osteoclastos.
Por una actividad de CGRP se quiere decir que un
compuesto demuestra características fisiológicas similares a CGRP,
tales como las descritas en la presente memoria descriptiva, por
ejemplo provocando un efecto vasodilatador. Los compuestos de la
presente invención pueden ser capaces de unirse a o interaccionar de
otro modo directa o indirectamente con un receptor de CGRP, u otro
receptor o receptores con los cuales el propio CGRP pueda
interactuar para provocar una respuesta biológica, por
ejemplo provocando un efecto vasodilatador.
Los compuestos de la invención también pueden
incluir fragmentos biológicamente activos de los péptidos más
grandes descritos aquí que retienen actividad. Por lo tanto, los
ejemplos de actividades deseables poseídas por los compuestos de la
invención incluyen (1) tener actividad en un ensayo de ingesta de
alimentos, vaciamiento gástrico, secreción pancreática, tensión
arterial, frecuencia cardíaca o pérdida de peso, similar a amilina,
calcitonina, o CGRP, y/o (2) unirse en un ensayo de unión al
receptor para amilina, calcitonina, o CGRP. En el Ejemplo 1 se
proporcionan algunos ensayos ejemplares.
Los compuestos de la invención pueden tener
además un perfil de unión particular. Por ejemplo, se ha dado a
conocer que las acciones biológicas de amilina, calcitonina, y CGRP
están mediadas vía la unión a dos receptores acoplados a proteínas
G tipo II estrechamente relacionados (GPCR), el receptor de
calcitonina (CTR) y el receptor similar al receptor de calcitonina
(CRLR). Estudios de clonación y funcionales han demostrado que CGRP
y la amilina interaccionan con diferentes combinaciones de CTR o el
CRLR y la proteína modificadora de la actividad del receptor
(RAMP). Muchas células expresan múltiples RAMP. Se cree que la
coexpresión de las RAMP y el CTR o CRLR es requerida para generar
receptores funcionales para calcitonina, CGRP, y amilina. La familia
RAMP comprende tres miembros RAMP1, -2 y -3), que comparten menos
de 30% de identidad de secuencia, pero tienen una organización
topológica común. La coexpresión de CRLR y RAMP1 conduce a la
formación de un receptor para CGRP, como lo hace la coexpresión de
CRKR y RAMP3. La coexpresión de hCTR2 y RAMP1 conduce a la formación
de un receptor para amilina y CGRP. La coexpresión de hCTR2 y RAMP3
conduce a la formación de un receptor para
amilina.
amilina.
En consecuencia, los compuestos de la invención
para uso en los métodos de la presente invención pueden demostrar
afinidad por receptores de amilina, CGRP, y calcitonina en la
familia amilina. Los compuestos de la invención pueden mostrar una
afinidad significativa por la unión al receptor de amilina, así como
la capacidad para unirse a otros receptores tales como los
receptores de calcitonina y CGRP. Los compuestos de la invención se
pueden unir a un receptor de amilina con una afinidad mayor de 20
nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, y más preferentemente con una afinidad mayor
de 0,10 nM. Además, los compuestos de la presente invención también
se pueden unir con afinidades similares a los receptores de
calcitonina y CGRP, pero con una afinidad menor en el receptor de
CGRP. En otras formas de realización, los compuestos de la invención
se pueden unir a un receptor de calcitonina con una afinidad mayor
de 20 nM, 10 nM, o 1 nM. En todavía otras formas de realización, los
compuestos de la invención se pueden unir a un receptor de CGRP con
una afinidad mayor de aproximadamante 1 \muM, 700 nM, o 500 nM.
Los compuestos de la invención también se pueden unir a los tres
receptores en grados variables. En consecuencia, se contempla que
los compuestos de la invención pueden tener un perfil de unión con
una afinidad de unión particular para cada receptor de los
descritos aquí.
Los compuestos de la invención pueden retener
por lo menos aproximadamante 25%, preferentemente aproximadamante
30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% por ciento de la
actividad biológica de amilina, calcitonina, CGRP o compuestos que
tienen la secuencia de SEC ID nºS:40 a 137, o Compuestos
1-137 en el Ejemplo 3, con respecto a la reducción
de la ingesta de alimentos o una de las otras actividades descritas
aquí, por ejemplo, Tabla 1. En otra forma de realización,
los compuestos de la invención muestran actividad biológica
mejorada. Preferentemente, los nuevos compuestos presentan
aproximadamante 110%, 125%, 130%, 140%, 150%, 200%, o más de la
actividad biológica de amilina, calcitonina, CGRP o los compuestos
que tienen la secuencia de SEC ID nºS:40 a 137, o Compuestos
1-137 en el Ejemplo 3, con respecto a la reducción
de la ingesta de alimentos o una de las otras actividades descritas
aquí, por ejemplo, Tabla 1. Por ejemplo, un compuesto
deseable de la invención es aquel que tiene una actividad en uno de
los ensayos descritos aquí (ingesta de alimento, ensayo de
reducción del peso, vaciamiento gástrico, triglicéridos,
pancreatitis, grelina, o calcio) que es mayor que la actividad de
amilina, calcitonina, o CGRP en ese mismo ensayo.
A título únicamente ilustrativo, los compuestos
deseables de la invención pueden demostrar una capacidad para
reducir la ingesta de alimentos acumulativa más de 5% con respecto a
la administración del vehículo, preferentemente más de 15%, más
preferentemente más de 25%, incluso preferentemente más de 35% o
40%, lo más preferible más de 50% con respecto al vehículo.
En todavía otro aspecto general, los compuestos
de la invención pueden ser útiles para reducir la ingesta de
alimentos, reducir el apetito, inducir saciedad, reducir la
disponibilidad de los nutrientes, provocar pérdida de peso, afectar
a la composición corporal, alterar el contenido energético del
organismo o gasto de energía, mejorar el perfil lipídico
(incluyendo reducir los niveles de colesterol LDL y de triglicéridos
y/o cambiar los niveles de colesterol HDL), ralentizar la movilidad
gastrointestinal, retrasar el vaciamiento gástrico, moderar las
excursiones de glucosa sanguínea postprandial, prevenir o inhibir la
secreción de glucagón, y disminuir la tensión arterial. Los ensayos
ejemplares para los efectos sobre la ingesta de alimentos, reducción
del peso, vaciamiento gástrico, triglicéridos, y composición
corporal se describen en por lo menos los Ejemplos 3, 4, 5, 6, y
7.
De este modo, en ciertas formas de realización,
los métodos de la invención son útiles para tratar o prevenir
afecciones o trastornos que se pueden aliviar reduciendo la
disponibilidad de los nutrientes, que comprenden administrar a
dicho sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de
un compuesto de la invención. Tales afecciones y trastornos
incluyen, pero no se limitan a, trastornos alimentarios, resistencia
a insulina, obesidad, hiperglucemia postprandial anormal, diabetes
de cualquier tipo, incluyendo Tipo I, Tipo II y diabetes gravídica,
síndrome metabólico, síndrome de evacuación gástrica rápida,
hipertensión, dislipidemia, enfermedad cardiovascular,
hiperlipidemia, apnea del sueño, cáncer, hipertensión pulmonar,
colecistitis, y osteoartritis.
Los ejemplos no limitativos de una afección o
enfermedad cardiovascular son hipertensión, isquemia del miocardio,
y reperfusión del miocardio. Los compuestos de la invención también
pueden ser útiles para tratar o prevenir otras afecciones asociadas
con obesidad, incluyendo apoplejía, cáncer (por ejemplo,
cáncer endometrial, de mama, de próstata, y de colon),
colecistopatía, apnea del sueño, fertilidad reducida, y
osteoartritis (véase Lyznicki et al, Am. Fam.
Phys. 63:2185, 2001). En otras formas de realización, los
compuestos de la invención se pueden usar para alterar la
composición corporal por razones estéticas, para potenciar las
capacidades físicas, o para producir una fuente de carne más
magra.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención se pueden usar para inhibir la secreción de grelina. En
consecuencia, los compuestos de la invención pueden utilizar este
mecanismo para tratar o prevenir trastornos relacionados con
grelina, tales como síndrome de Prader-Willi,
diabetes de todos los tipos y sus complicaciones, obesidad,
hiperfagia, hiperlipidemia, y otros trastornos asociados con
hipernutrición. En el Ejemplo 8 se describe un ensayo ejemplar para
los efectos sobre la grelina.
En otro aspecto general, ahora se reconoce que
la amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la
invención, pueden ser útiles para tratar o prevenir el esófago de
Barrett, la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) y
afecciones asociadas con ella. Tales afecciones pueden incluir, pero
no se limitan a, pirosis, pirosis acompañada de regurgitación de
los contenidos gástricos/intestinal a la boca o los pulmones,
dificultad para tragar, tos, sibilancia intermitente e inflamación
de las cuerdas vocales (afecciones asociadas con GERD), erosión
esofágica, úlcera esofágica, estenosis esofágica, metaplasia de
Barrett (sustitución del epitelio esofágico normal por epitelio
anormal), adenocarcinoma de Barrett, y aspiración pulmonar. La
amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la
invención, tienen propiedades antisecretoras, tales como la
inhibición de ácidos gástricos, la inhibición de ácidos biliares, y
la inhibición de enzimas pancreáticas. En consecuencia, estas
propiedades de amilina, agonistas de amilina y compuestos de la
invención pueden hacerlos particularmente útiles en el tratamiento
o prevención de esófago de Barrett, y/o GERD y afecciones
relacionadas o asociadas como se describe aquí. En Los Ejemplos 10
y 11 se describen ensayos ejemplares que muestran los efectos sobre
la secreción de ácido gástrico y el efecto gastroprotector.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención pueden ser útiles además para tratar o prevenir
pancreatitis, carcinoma pancreático, y gastritis. Además, los
compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento y
prevención de pancreatitis en pacientes que han sufrido
colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (ERCP). Además se ha
descubierto que amilina y agonistas de amilina, incluyendo
compuestos de la invención, pueden tener un efecto terapéutico
sorprendentemente superior cuando se combinan con somatostatina. En
consecuencia, en ciertas formas de realización, los métodos para
tratar o prevenir pancreatitis comprenden administrar amilina, y
agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, y
administrar somatostatina y agonistas de somatostatina a un sujeto.
En otras formas de realización, los métodos para tratar o prevenir
pancreatitis comprenden administrar compuestos de la invención y
administrar somatostatina y agonistas de somatostatina. En el
Ejemplo 9 se describe un ensayo ejemplar que muestra los efectos
sobre la función pancreática.
En otro aspecto general, los compuestos de la
invención también pueden ser útiles para disminuir la resorción
ósea, disminuir el calcio plasmático, e inducir un efecto
analgésico. En consecuencia, los compuestos de la invención pueden
ser útiles para tratar trastorno óseo tal como osteopenia y
osteoporosis. Todavía en otras formas de realización, los
compuestos de la invención pueden ser útiles para tratar dolor y
neuropatía dolorosa. En el Ejemplo 6 se proporciona un ensayo
ejemplar que muestra los efectos sobre los niveles de calcio.
En los métodos de la presente invención, los
polipéptidos se pueden administrar separadamente o juntos con uno o
más compuestos diferentes y composiciones que muestran una acción a
largo plazo o a corto plazo para reducir la disponibilidad de
nutrientes, incluyendo, pero sin limitarse a, otros compuestos y
composiciones que comprenden un agonista de amilina o de análogo de
amilina, calcitonina de salmón, una colecistocinina (CKK) o
agonista de CKK, una leptina (proteína OB) o agonista de leptina,
una exendina o agonista de análogo de exendina, un
GLP-1 o agonista de análogo de
GLP-1, un inhibidor de DPPIV, un PYY o análogo de
PYY, AFP-6 (intermedina) o agonista de
AFP-6, urocortina o agonista de urocortina, o
adrenomedulina o agonista de adrenomedulina. Los agonistas de
amilina incluyen, por ejemplo,
[25,28,29Pro-]-amilina humana (también conocida como
"pramlintida", y se describe en las patentes U.S. n^{os}
5.686.511 y 5.998.367). La CKK usada es preferentemente el
octopéptido de CKK (CKK-8). La leptina se explica
en, por ejemplo, (Pelleymounter, Cullen et al., Science 269:
540-543 (1995); Halaas, Gajiwala et al.,
Science 269: 543-6 (1995); Campfield, Smith et
al., Science 269: 546-549 (1995)). Las
exendinas adecuadas incluyen exendina-3 y
exendina-4, y los compuestos de agonistas de
exendina incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones
PCT WO 99/07404, WO 99/25727, y WO 99/25728. Los polipéptidos y
análogos de PYY adecuados incluyen los descritos en la solicitud US
nº: [números de caso 18528.662 y 18528.663].
Mientras que la "obesidad" se define
generalmente como un índice de masa corporal de aproximadamante 30,
para los fines de esta descripción, cualquier sujeto, incluyendo
aquellos con un índice de masa corporal menor de 30, que necesite o
desee reducir el peso corporal está incluido en el alcance de
"obeso".
Los compuestos de la invención descritos aquí se
pueden preparar usando técnicas recombinantes estándar o técnicas
de síntesis peptídica química conocidas en la técnica, por ejemplo
usando un sintetizador de péptidos automatizado o semiautomatizado,
o ambas. Igualmente, los derivados de los polipéptidos de la
invención se pueden producir usando metodologías químicas,
bioquímicas, o in vivo estándar.
Los compuestos de la invención se pueden
sintetizar en disolución o sobre un soporte sólido según técnicas
convencionales. Existen comercialmente diversos sintetizadores
automáticos, y se pueden usar según protocolos conocidos.
Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase
Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et
al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science
232: 341-7(1986); y Barany y Merrifield, The
Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York,
1-284 (1979). La síntesis peptídica en fase sólida
se puede llevar a cabo con un sintetizador de péptidos automático
(por ejemplo, Modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster
City, California) usando el sistema NMP/HOBt (Opción 1) y química
de tBoc o Fmoc (véase, Manual de Usuario de Applied
Biosystems para el sintetizador peptídico ABI 430A, Versión 1.3B, 1
de julio de 1988, sección 6, p. 49-70, Applied
Biosystems, Inc., Foster City, California) con protección en los
extremos. Los péptidos también se pueden ensamblar usando un
Advanced ChemTech Synthesizer (Modelo MPS 350, Louisville,
Kentucky). Los péptidos se pueden purificar mediante
RP-HPLC (preparativa y analítica) usando, por
ejemplo un sistema Waters Delta Prep 3000 y una columna preparativa
C4, C8, o C18 (10 \mu, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, California).
La proteína activa se puede sintetizar fácilmente y después se puede
identificar en ensayos de identificación sistemática diseñados para
identificar péptidos reactivos.
Además de la síntesis clásica de etapa por
etapa, se ha desarrollado la síntesis peptídica en fase sólida
convergente (también conocida como enfoque híbrido o como método de
condensación de fragmentos) para la preparación de péptidos
complejos y difíciles y pequeñas proteínas. Según este método, los
fragmentos peptídicos adecuadamente protegidos que abarcan toda la
secuencia peptídica y preparados en fase sólida se condensan, ya sea
sobre soporte sólido o en disolución, al péptido diana. La
disponibilidad de nuevas resinas y asas de resinas ha abierto la
posibilidad de sintetizar rápidamente mediante técnica en fase
sólida segmentos peptídicos completamente protegidos. El enfoque es
particularmente atractivo para la fabricación de grandes moléculas,
puesto que combina las ventajas tanto de los métodos en fase sólida
como en fase de disolución. Los tiempos de los ciclos de producción
son cortos, en comparación con las metodologías en fase de
disolución, y los rendimientos y purezas son a menudo superiores.
Adicionalmente, el aumento a mayor escala es mucho más fácil, y
evita muchos de los problemas de agregación encontrados a menudo en
la síntesis en fase sólida de péptidos largos.
En otra forma de realización, la estrategia
sintética usa condensación de fragmentos convergente. La
condensación de fragmentos convergente es un método superior para
producir grandes péptidos de alta calidad con respecto a la
síntesis en fase sólida estándar o en fase líquida estándar. Con
tales métodos se puede sintetizar un fragmento en paralelo cortando
en el momento para sintetizar así como para asegurar la calidad. A
medida que los péptidos crecen con mayor tamaño, hay más riesgo de
reacciones laterales y de síntesis incompleta. Se ha reconocido que
las secuencias peptídicas de la invención pueden tener localizadas
de forma ideal glicina y prolina que promueven un enfoque de
fragmentos debido a que esos dos aminoácidos no son capaces de
racemizarse durante el acoplamiento de los fragmentos y muestras
velocidades de condensación muy eficaces. Además del hecho de que
una síntesis en fase sólida directa presenta problemas importantes
de aumento de escala y por lo tanto probablemente no es adecuada
para la síntesis a gran escala, un enfoque con fragmentos es mucho
más controlable y proporciona la oportunidad de purificar
intermedios. El puente de disulfuro está localizado en el primer
fragmento solo, y por lo tanto se puede formar en la etapa de
fragmento con el precursor totalmente protegido. Puesto que este
enfoque presenta un montón de ventajas en términos de estrategia y
escala, acortará el tiempo de síntesis debido a que todos los
fragmentos se pueden sintetizar simultáneamente. Esta es una gran
herramienta para minimizar el riesgo y reducir costes. Los
siguientes fragmentos se representan para mostrar una estructura
esquelética de fragmentos deseables en los que permitirían la
implementación de esta estrategia:
- Fragmento 1: Boc-X (Boc)-X-X (Trt)-X (tBu)-X-X(tBu)-X-X-X-Gly-OH
- Cíclico (la ciclación tendría lugar antes del acoplamiento de los fragmentos)
- Fragmento 2: Fmoc-K(Pbf)-X-X(tBu)-X(Trt)-X(OtBu)-X-X(Trt)-X(Pbf)-X-X(Trt)-X(tBu)-X(tBu)-Pro-OH
- Fragmento 3: Fmoc-X(Pbf)-X(tBu)-X(Trt)-X(tBu)-X-X(tBu)-X(Trt)-Thr(tBu)-OH
- Fragmento 4: H-Tyr(tBu)-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
Basándose en estas enseñanzas, sería
comprensible para un experto en la materia qué compuestos de la
invención serían ideales para tal síntesis. La tecnología de
evolución puede hacer posible tener sólo tres fragmentos, es decir,
no es necesario crear separadamente el 4º fragmento del 3º.
Los compuestos de la presente invención se
pueden producir alternativamente mediante técnicas recombinantes
bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
ed., Cold Spring Harbor (1989). Estos polipéptidos producidos
mediante tecnologías recombinantes se pueden expresar a partir de
un polinucleótido. Estas secuencias polinucleotídicas pueden
incorporar codones que facilitan la transcripción y traducción de
ARNm en hospedantes microbianos. Tales secuencias de fabricación se
pueden construir fácilmente según métodos bien conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO
83/04053. Los polinucleótidos anteriores también pueden codificar
opcionalmente un resto metionílico N-terminal. Los
compuestos no peptídicos útiles en la presente invención se pueden
preparar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los
aminoácidos que contienen fosfato y los péptidos que contienen tales
aminoácidos se pueden preparar usando métodos conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Bartlett y Landen,
Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986).
Se puede utilizar una variedad de sistemas de
vectores de expresión/hospedantes para contener y expresar la
secuencia codificante de los nuevos compuestos. Aquellos incluyen
pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias
transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos,
plásmidos o cósmidos recombinantes; levaduras transformadas con
vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insectos
infectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo,
vaculovirus); sistemas de células vegetales transfectados con
vectores de expresión víricos (por ejemplo, virus del mosaico
de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o
transformados con vectores de expresión bacterianos (por
ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células de
animales. Las células de mamíferos que son útiles en las
producciones de proteína recombinante incluyen pero no se limitan a
células VERO, células HeLa, estirpes celulares de ovario de hámster
chino (CHO), células COS (tales como COS-7), células
WI 38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MOCK, A549, PC12, K562 y 293. Más
abajo se describen aquí protocolos ejemplares para la expresión
recombinante de la proteína.
Como tales, las secuencias polinucleotídicas son
útiles para generar nuevos y útiles vectores de ADN vírico y
plasmídico, nuevas y útiles células hospedantes procariotas y
eucariotas transformadas y transfectadas (incluyendo células
bacterianas, de levaduras, y de mamíferos, que se hacen crecer en
cultivo), y nuevos y útiles métodos para el crecimiento en cultivo
de tales células hospedantes capaces de la expresión de los
presentes polipéptidos. Las secuencias polinucleotídicas que
codifican los nuevos compuestos aquí también pueden ser útiles para
la terapia
génica.
génica.
Se describen procedimientos para la producción
de ADN recombinante de los nuevos compuestos. Se describe un
procedimiento para producir los péptidos a partir de una célula
hospedante que contienen ácidos nucleicos que codifican los nuevos
compuestos, que comprende: (a) cultivar dicha célula hospedante que
contiene polinucleótidos que codifican tales polipéptidos en
condiciones que facilitan la expresión de tal molécula de ADN; y (b)
obtener los nuevos compuestos.
Las células hospedantes pueden ser procariotas o
eucariotas, e incluyen bacterias, células de mamíferos (tales como
células de ovario de hámster chino (CHO), células de monos, células
de riñón de hámster recién nacido, células de cáncer u otras
células), células de levaduras, y células de insectos.
Los sistemas de hospedantes mamíferos para la
expresión de la proteína recombinante también son bien conocidos
por los expertos en la materia. Las cepas de células hospedantes se
pueden escoger en busca de una habilidad particular para procesar
la proteína expresada o producir ciertas modificaciones
post-traducción que serán útiles para proporcionar
actividad proteica. Tales modificaciones del polipéptido incluyen,
pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación,
fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento
post-traduccional, que escinde una forma
"prepro" de la proteína, también puede ser importante para la
inserción, plegamiento y/o función correctas. Las diferentes
células hospedantes, tales como as CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, y
similares, tienen una maquinaria celular específica y mecanismos
característicos para tales actividades
post-traduccionales, y se pueden escoger para
asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína
extraña introducida.
Como alternativa, se puede utilizar un sistema
de levadura para generar los nuevos compuestos de la invención. La
región codificante del ADN que codifica el nuevo compuesto se
amplifica mediante PCR. Un ADN que codifica la secuencia líder
pre-pro-alfa de levadura se
amplifica a partir de ADN genómico de levadura en una reacción de
PCR usando un cebador que contiene nucleótidos 1-20
del gen del factor de emparejamiento alfa y otro cebador
complementario a los nucleótidos 255-235 de este gen
(Kurjan y Herskowitz, Cell, 30: 933-43 (1982)). La
secuencia codificante líder
pre-pro-alfa y los fragmentos de la
secuencia codificante del nuevo compuesto se ligan en un plásmido
que contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH2) de
levadura, de forma que el promotor dirige la expresión de una
proteína de fusión que consiste en el factor
pre-pro-alfa fusionado al nuevo
compuesto maduro. Como enseñan Rose y Broach, Meth. Enz. 185:
234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San
Diego, California (1990), el vector incluye además un terminador de
la transcripción de ADH2 en dirección 3' del sitio de clonación, el
origen de replicación "2-micrón" de levadura,
el gen leu-2d de levadura, los genes REP1 y REP2 de
levadura, el gen de \beta-lactamasa de E.
coli, y un origen de replicación de E. coli. Los genes
de \beta-lactamasa y leu-2d
proporcionan selección en bacterias y levaduras, respectivamente. El
gen leu-2d también facilita un aumento del número
de copia del plásmido en la levadura para inducir mayores niveles
de expresión. Los genes REP1 y REP2 codifican proteínas implicadas
en la regulación del número de copias plasmídicas.
El constructo de ADN descrito en el párrafo
anterior se transforma en células de levadura usando un método
conocido, por ejemplo tratamiento con acetato de litio (Steams et
al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990)). El
promotor de ADH2 es inducido al agotarse la glucosa en el medio de
crecimiento (Price et al., Gene 55: 287 (1987)). La
secuencia de pre-pro-alfa efectúa la
secreción de la proteína de fusión a partir de las células.
Concomitantemente, la proteína KEX2 de levadura escinde la secuencia
de pre-pro de los compuestos maduros de la
invención (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
5330-4 (1984)).
Los compuestos de la invención también se pueden
expresar recombinantemente en levadura usando un sistema de
expresión comercialmente disponible, por ejemplo, el Sistema
de Expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, California),
siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se
basa en la secuencia de
pre-pro-alfa para dirigir la
secreción, pero la transcripción del inserto es dirigida por el
promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) con la inducción mediante
metanol. El nuevo compuesto segregado se purifica del medio de
crecimiento de levadura, por ejemplo, mediante los métodos
usados para purificar el nuevo compuesto a partir de sobrenadantes
de células bacterianas y de mamíferos.
Como alternativa, el ADN que codifica los nuevos
compuestos se puede clonar en el vector de expresión de baculovirus
pVL1393 (PharMingen, San Diego, California). Este nuevo vector que
contiene el compuesto se usa entonces según las direcciones del
fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera
frugiperda en medio libre de proteína de sF9 y producir
proteína recombinante. La proteína se purifica y se concentra a
partir del medio usando una columna de
heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, New
Jersey) y columnas de exclusión molecular secuenciales (Amicon,
Beverly, Massachusetts), y se resuspende en PBS. El análisis
mediante SDS-PAGE muestra una única banda y
confirma el tamaño de la proteína, y la secuenciación de Edman en un
secuenciador de péptidos Proton 2090 confirma su secuencia
N-terminal.
Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el
nuevo compuesto deseado se puede clonar en un plásmido que contiene
un promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia líder
(véase, por ejemplo, Better et al., Science
240: 1041-3 (1988)). La secuencia de este constructo
se puede confirmar mediante secuenciación automática. El plásmido
se transforma entonces en la cepa MC1061 de E. coli usando
procedimientos estándares que emplean incubación con CaCl_{2} y
tratamiento de choque térmico de la bacteria (Sambrook et
al., más arriba). Las bacterias transformadas se hacen
crecer entonces en medio LB suplementado con carbenicilina, y la
producción de la proteína expresada es inducida mediante crecimiento
en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia líder afectará
a la secreción del nuevo compuesto maduro y se escindirá durante la
secreción. La proteína recombinante segregada se purifica del medio
de cultivo bacteriano mediante el método descrito aquí más
abajo.
Como alternativa, los polipéptidos de la
presente invención se pueden expresar en un sistema de insectos.
Los sistemas de insectos para la expresión proteica son bien
conocidos por los expertos en la materia. En uno de tales sistemas,
se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica
(AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de
Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia
codificante del nuevo compuesto se clona en una región no esencial
del virus, tal como el gen de la polihedrina, y se coloca bajo el
control del promotor de la polihedrina. La inserción con éxito del
nuevo compuesto hará inactivo el gen de la polihedrina y producirá
un virus que carece de recubrimiento proteico. Los virus
recombinantes se usan entonces para infectar células de S.
frugiperda o larvas de Trichoplusia, en las que se expresa el
polipéptido (Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983);
Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
3224-7 (1994)).
En otro ejemplo, la secuencia de ADN que
codifica el nuevo compuesto se puede amplificar mediante PCR y se
puede clonar en un vector apropiado, por ejemplo
pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). El
vector pGEX se diseña para producir una proteína de fusión que
comprende glutationa-S-transferasa
(GST), codificada por el vector, y una proteína codificada por un
fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los
cebadores para la PCR se pueden generar para incluir, por ejemplo,
un sitio de escisión apropiado. La proteína de fusión recombinante
se puede escindir entonces de la porción de GST de la proteína de
fusión. El constructo polipeptídico del análogo de
pGEX-3X/PYY se transforma en células de E.
coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla,
California), y los transformantes individuales se aíslan y se hacen
crecer a 37ºC en medio LB (suplementado con carbenicilina) hasta
una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm de 0,4, seguido
de la incubación adicional durante 4 horas en presencia de 0,5 mM
de \beta-D-tiogalactopiranósido de
isopropilo (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). El ADN
plasmídico procedente de los transformantes individuales se purifica
y se secuencia parcialmente usando un secuenciador automático para
confirmar la presencia del inserto génico deseado en la orientación
apropiada.
La proteína de fusión, que se espera que sea
producida como un cuerpo de inclusión insoluble en la bacteria, se
puede purificar según lo siguiente. Las células se cosechan mediante
centrifugación; se lavan en 0,15 M de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8, 1
mM de EDTA; y se tratan con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma Chemical
Co.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se aclara
mediante ultrasonidos, y el desecho celular se peletiza mediante
centrifugación durante 10 minutos a 12.000xg. El pelete que contiene
la proteína de fusión se resuspende en 50 mM de Tris, pH 8, y 10 mM
de EDTA, se estratifica sobre glicerol al 50%, y se centrifuga
durante 30 minutos a 6000xg. El pelete se resuspende en disolución
salina tamponada con fosfato (PBS) estándar libre de Mg^{++} y
Ca^{++}.
La proteína de fusión se purifica adicionalmente
mediante fraccionamiento del pelete resuspendido en un gel de
SDS-poliacrilamida desnaturalizante (Sambrook et
al., más arriba). El gel se empapa en 0,4 M de KCl para
visualizar la proteína, que se corta y electroeluye en un tampón que
corre en gel que carece de SDS. Si la proteína de fusión de
GST/nuevo compuesto se produce en bacterias como una proteína
soluble, se puede purificar usando el Módulo de Purificación de GST
(Pharmacia Biotech).
La proteína de fusión se puede someter a
digestión para escindir la GST de la nueva proteína madura. La
reacción de digestión (20-40 \mug de proteína de
fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg
(Sigma) en 0,5 ml de PBS) se incuba 16-48 h a
temperatura ambiente y se carga en un gel de
SDS-PAGE desnaturalizante para fraccionar los
productos de reacción. El gel se empapa en 0,4 M de KCl para
visualizar las bandas de las proteínas. La identidad de la banda de
la proteína que corresponde al peso molecular esperado del nuevo
compuesto se puede confirmar mediante análisis de secuencias de
aminoácidos parcial usando un secuenciador automático (Applied
Biosystems Modelo 473A, Foster City, California).
En un método particularmente preferido de
expresión recombinante de los nuevos compuestos, se pueden
cotransfectar células 293 con plásmidos que contienen el ADN del
nuevo compuesto en el vector pCMV (promotor 5' de CMV, secuencia
poly A de 3' HGH) y pSV2neo (que contiene el gen de resistencia a
neo) mediante el método de fosfato de calcio.
Preferentemente, los vectores se deberían de
linealizar con ScaI antes de la transfección. De forma similar, se
puede usar un constructo alternativo que usa un vector pCMV similar
con el gen neo incorporado. Las estirpes celulares estables se
seleccionan de clones celulares individuales limitando la dilución
en medio de crecimiento que contiene 0,5 mg/ml de G418 (antibiótico
similar a neomicina) durante 10-14 días. Las
estirpes celulares se identifican en busca de la expresión del
nuevo compuesto mediante ELISA o transferencia Western, y las
estirpes celulares que se expresan en gran cantidad se expanden para
el crecimiento a gran escala.
Es preferible que las células transformadas se
usen para la producción a largo plazo de proteínas con rendimiento
elevado, y como tal es deseable la expresión estable. Una vez que
tales células se transforman con vectores que contienen marcadores
seleccionables junto con el casete de expresión deseado, se puede
dejar que las células crezcan durante 1-2 días en
un medio enriquecido antes de que se cambien al medio selectivo. El
marcador seleccionable se diseña para conferir resistencia a la
selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de
células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Grupos
resistentes de células transformadas de forma estable se pueden
hacer proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas
para la célula.
Para recuperar las células que se han
transformado en busca de la producción de proteína recombinante, se
puede usar un número de sistemas de selección. Tales sistemas de
selección incluyen, pero no se limitan a, genes de HSV timidina
cinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa
y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt,
respectivamente. También, se puede usar la resistencia
antimetabolítica como la base de selección para dhfr, que confiere
resistencia a metotrexato; gpt, que confiere resistencia a ácido
micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido, G418;
también, que confiere resistencia a clorosulfurón; e higro, que
confiere resistencia a higromicina.
Los genes seleccionables adicionales que pueden
ser útiles incluyen trpB, que permite a las células utilizar indol
en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar
histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan una
indicación visual para la identificación de transformantes incluyen
antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato,
GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferina.
Muchos de los nuevos compuestos de la presente
invención se pueden producir usando una combinación tanto de
síntesis peptídica automática como técnicas recombinantes. Por
ejemplo, un compuesto de la invención puede contener una
combinación de modificaciones que incluyen supresión, sustitución, e
inserción mediante PEGilación. Tal compuesto se puede producir en
etapas. En la primera etapa, una forma intermedia del nuevo
compuesto que contiene las modificaciones de supresión,
sustitución, inserción, y cualquier combinación de las mismas, se
puede producir mediante técnicas recombinantes como se describe.
Después, tras una etapa de purificación opcional como se describe
más abajo, el polipéptido intermedio se somete a PEGilación a través
de modificación química con un reactivo PEGilante apropiado (por
ejemplo, de Nectar Transforming Therapeutics, San Carlos,
California) para producir el compuesto deseado. Un experto en la
materia apreciará que el procedimiento descrito anteriormente se
puede generalizar para aplicarlo al nuevo compuesto que contiene una
combinación de modificaciones seleccionadas de supresión,
sustitución, inserción, derivatización, u otro medio de modificación
bien conocido en la técnica y contemplado por la presente
invención.
Puede ser deseable purificar los nuevos
compuestos generados por la presente invención. Los expertos en la
materia conocen bien técnicas de purificación de péptidos. Estas
técnicas implican, en un nivel, el fraccionamiento bruto del medio
celular en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. Habiendo
separado el polipéptido de otras proteínas, el polipéptido de
interés se puede purificar adicionalmente usando técnicas
cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación
parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Los métodos
analíticos particularmente adecuados para la preparación de un
péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía
de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida, y enfoque
isoeléctrico. Un método particularmente eficaz de purificar
péptidos es HPLC de fase inversa, seguida de la caracterización del
producto purificado mediante cromatografía de
líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) y espectrometría de masas
de ionización de desorción por láser asistida por matriz (MALDI).
La confirmación adicional de la pureza se obtiene mediante
determinación por análisis de aminoácidos.
Ciertos aspectos de la presente invención se
refieren a la purificación y, en formas de realización particulares,
la purificación sustancial, de una proteína o péptido codificado.
Diversas técnicas adecuadas para uso en la purificación de péptidos
serán conocidas por los expertos en la materia. Estas incluyen, por
ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos, y
similares; desnaturalización por calor, seguido de centrifugación;
etapas de cromatografía tales como cromatografía de intercambio
iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatito y
cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en
gel; y combinaciones de tales otras técnicas. Como se conoce
generalmente en la técnica, se cree que el orden de llevar a cabo
las diversas etapas de purificación se pueden cambiar, o que se
pueden omitir ciertas etapas, y todavía da como resultado un método
adecuado para la preparación de una proteína o péptido
sustancialmente puro. En la patente US nº 5.849.883 se pueden
encontrar métodos para purificar un polipéptido. Estos documentos
describen métodos ejemplares específicos para el aislamiento y
purificación de composiciones de G-CSF que pueden
ser útiles en aislar y purificar los nuevos compuestos de la
invención. Dada la descripción de estas patentes, es evidente que un
experto en la materia estará bien al tanto de las numerosas
técnicas de purificación que se pueden usar para purificar
polipéptidos a partir de una fuente dada. También se contempla que
se puede emplear una combinación de cromatografía de intercambio
aniónico e inmunoafinidad para producir compuestos purificados de la
invención.
En consecuencia, la expresión "polipéptido o
péptido aislado" se refiere a un polipéptido o péptido que está
sustancialmente libre de material celular u otras proteínas
contaminantes procedentes de la célula o fuente tisular de la que
deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos
u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. La
expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye
preparaciones de proteína en las que la proteína se separa de los
componentes celulares de las células a partir de las que se aísla o
se produce recombinantemente. De este modo, proteína que está
sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de
proteína que tienen menos de aproximadamante 30%, 20%, 10% o 5% (en
peso seco) de proteína heteróloga (también denominada aquí como
"proteína contaminante"). Cuando la proteína, péptido, o su
fragmento se produce recombinantemente, también preferentemente está
sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de
cultivo representa menos de aproximadamante 20%, 10%, o 5% del
volumen de la preparación proteica. Cuando la proteína se produce
mediante síntesis química, preferentemente está sustancialmente
libre de precursores químicos u otros compuestos químicos, es decir,
está separada de precursores químicos u otros compuestos químicos
que están implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia,
tales preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamante
30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores o compuestos
químicos distintos del polipéptido de interés. En formas de
realización preferidas, las preparaciones purificadas o aisladas
carecerán de cualesquiera proteínas contaminantes procedentes del
mismo animal a partir del cual se produce normalmente la proteína,
como se puede lograr mediante expresión recombinante de, por
ejemplo, una proteína humana en una célula no humana.
Ciertos métodos preferidos para la síntesis se
describen en la solicitud de patente nº de serie 454.533 (presentada
el 6 de diciembre de 1999) cedida en común.
\newpage
Para todas las indicaciones, los nuevos
compuestos se pueden administrar periféricamente a una dosis de
aproximadamante 1 \mug a aproximadamante 5 mg por día en dosis
individuales o divididas o liberación continua controlada, o a
aproximadamante 0,01 \mug/kg a aproximadamante 500 \mug/kg por
dosis, más preferentemente aproximadamante 0,05 \mug/kg a
aproximadamante 250 \mug/kg, lo más preferible por debajo de
aproximadamante 50 \mug/kg. Las dosis se pueden administrar una,
dos, tres o cuatro veces al día. Las dosis en estos intervalos
variarán con la potencia de cada análogo o derivado, por supuesto,
y se pueden determinar por un experto en la materia.
En los métodos de la presente descripción, los
polipéptidos se pueden administrar separadamente o junto con uno o
más compuestos y composiciones diferentes que muestren una acción a
largo plazo o a corto plazo para reducir la disponibilidad de
nutrientes, incluyendo, pero sin limitarse a, otros compuestos y
composiciones que comprenden una amilina o agonista de análogo de
amilina, calcitonina de salmón o agonista de calcitonina de salmón,
una colecistocinina (CKK) o agonista de CKK, una leptina (proteína
OB) o agonista de leptina, una exendina o agonista de análogo de
exendina, o un GLP-1 o agonista de análogo de
GLP-1 o un PYY o análogo de PYY, o un polipéptido
relacionado con PYY. Los agonistas de amilina adecuados incluyen,
por ejemplo, [25,28,29Pro-]-amilina humana (también
conocida como "pramlintida", y descrita en las patentes U.S.
n^{os} 5.686.511 y 5.998.367). La CKK usada es preferentemente
octopéptido de CKK (CKK-8). La leptina se explica
en, por ejemplo, (Pelleymounter, Cullen et al., Science 269:
540-543 (1995); Halaas, Gajiwala et al.,
Science 269: 543-6 (1995); Campfield, Smith et
al., Science 269: 546-549 (1995)). Las exendinas
adecuadas incluyen exendina-3 y
exendina-4, y los compuestos de agonistas de
exendina incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones
PCT WO 99/07404, WO 99/25727, y WO 99/25728. Los
polipéptidos de PYY y análogos adecuados incluyen los descritos en
la solicitud US nº: [números de casos 18528.740 y 18528.723].
La presente invención también se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéutica
o profilácticamente eficaz de por lo menos un compuesto de la
invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto
con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes,
adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables útiles en el
suministro de los nuevos compuestos. Tales composiciones pueden
incluir diluyentes de diverso contenido de tampón (por
ejemplo, acetato, citrato, tartrato, fosfato, TRIS), pH y fuerza
iónica; aditivos tales como tensioactivos y agentes solubilizantes
(por ejemplo, monooleato de sorbitán, lecitina, Pluronics,
Tween 20 y 80, Polisorbate 20 y 80, propilenglicol, etanol,
PEG-40, dodecilsulfato de sodio), antioxidantes
(por ejemplo, monotioglicerol, ácido ascórbico,
acetilcisteína, sales de ácidos azufrados (bisulfito y
metabisulfito), conservantes (por ejemplo, fenol,
meta-cresol, alcohol bencílico, parabenos (metílico,
propílico, butílico), cloruro de benzalconio, clorobutanol,
timersol, sales fenilmercúricas (acetato, borato, nitrato), y
agentes para dar tonicidad/para dar volumen (glicerina, cloruro de
sodio, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrosa), incorporación del
material en preparaciones en partículas de compuestos poliméricos,
tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en
asociación con liposomas. Tales composiciones influirán el estado
físico, la estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y
velocidad de aclaramiento in vivo de los presentes
compuestos. Véase, por ejemplo, Remington's
Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18ª ed., Mack
Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990).
En general, los presentes compuestos serán
útiles de la misma manera que la amilina es útil en vista de sus
propiedades farmacológicas. Un uso preferido es administrar
periféricamente tales nuevos compuestos para el tratamiento o
prevención de afecciones y trastornos metabólicos. En particular,
los compuestos de la invención poseen actividad como agentes para
reducir la disponibilidad de los nutrientes, reducir la ingesta de
alimentos, y llevar a cabo una pérdida de peso.
Los nuevos compuestos se pueden formular para la
administración periférica, incluyendo la formulación para
inyección, administración oral, administración nasal, administración
pulmonar, administración tópica, u otros tipos de administración
como reconocerá un experto en la materia. En la patente US nº
6.410.511 y en la solicitud de patente nº 10/159.779 se pueden
encontrar ejemplos de formulaciones.
Más particularmente, la administración de las
composiciones farmacéuticas según la presente invención puede ser
vía cualquier ruta habitual en tanto que el tejido diana esté
disponible vía esa ruta. En una realización preferida, las
composiciones farmacéuticas se pueden introducir en el sujeto
mediante cualquier método periférico convencional, por
ejemplo, intravenoso, intradérmico, intramuscular, intramamario,
intraperitoneal, intratecal, retrovulvar, intrapulmonar (por
ejemplo, liberación a largo plazo); mediante suministro oral,
sublingual, nasal, anal, vaginal, o transdérmico, o mediante
implantación quirúrgica en un sitio particular. El tratamiento
puede consistir en una sola dosis o en una pluralidad de dosis a lo
largo de un período de tiempo. También se contempla la liberación
continua controlada de las composiciones de la presente invención.
En la patente US nº 6.458.387 y en la patente US nº 5.578.708 se
pueden encontrar ejemplos de tecnología de microesferas.
La formulación puede ser líquida o puede ser
sólida, tal como liofilizada, para reconstitución. Las composiciones
acuosas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de
los nuevos compuestos, disueltos o dispersos en un vehículo o medio
acuoso farmacéuticamente aceptable. La frase "farmacéutica o
farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares
y composiciones que no produzcan reacciones adversas, alérgicas o de
otro modo indeseadas cuando se administran a un animal o a un ser
humano. Como se usa aquí, "vehículo farmacéuticamente
aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de
dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos,
agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares. El uso
de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas
es bien conocido en la técnica. Se contempla su uso en composiciones
terapéuticas excepto en cuanto a que cualquier medio o agente
convencional sea incompatible con el ingrediente activo. También se
pueden incorporar en las composiciones ingredientes activos
suplementarios. En algunos casos, será conveniente proporcionar un
compuesto de la invención y otro agente que reduzca la ingesta de
alimentos, que reduzca la glucosa en plasma o que altere los lípidos
en plasma, tal como una amilina, un análogo de un agonista de
amilina, una CCK o agonista de CCK, o una leptina o agonista de
leptina, o una exendina o análogo de agonista de exendina, o un PYY
o un análogo de PYY, en una única composición o disolución para la
administración conjunta. En otros casos, puede ser ventajoso
administrar separadamente el agente adicional del nuevo
compuesto.
Los compuestos de la invención se pueden
preparar para administración como disoluciones de base libre, o
sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas adecuadamente
con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Como se usa
aquí, la frase "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere
a sales preparadas a partir de ácidos y bases farmacéuticamente
aceptables, preferentemente no tóxicos, que incluyen ácidos y bases
inorgánicos y orgánicos, incluyendo, pero sin limitarse a, sales
sulfúrica, cítrica, maleica, acética, oxálica, hidrocloruro,
hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato, bisulfito, fosfato,
fosfato ácido, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato,
citrato, citrato ácido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato,
bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato,
gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato,
metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato,
p-toluenosulfonato y pamoato (es decir,
1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)).
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas
con grupos amino libres, tales como, pero sin limitarse a, las
derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, y
tartárico. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen
las formadas con grupos carboxílicos libres tales como, pero sin
limitarse a, las derivadas de sodio, potasio, amonio, sodio litio,
calcio, hidróxidos férrico, isopropilamina, trietilamina,
2-etilaminoetanol, histidina, y procaína.
En condiciones normales de almacenamiento y uso,
estas preparaciones contienen un conservante para evitar el
crecimiento de microorganismos.
En una realización, las composiciones
farmacéuticas de la presente invención se formulan para ser
adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, vía
inyección o infusión. Preferentemente, el nuevo compuesto se
suspende en un vehículo acuoso, por ejemplo en una disolución de
tampón isotónica a un pH de aproximadamante 3,0 a aproximadamante
8,0, preferentemente un pH de aproximadamante 3,0 a aproximadamante
7,4, 3,5 a 6,0, o 3,5 a aproximadamante 5,0. Tampones útiles
incluyen acetato de sodio/ácido acético, lactato de sodio/ácido
láctico, ácido ascórbico, citrato de sodio-ácido cítrico,
bicarbonato de sodio/ácido carbónico, succinato de sodio/ácido
succínico, histidina, benzoato de sodio/ácido benzoico, y fosfatos
de sodio, y tris(hidroximetil)aminometano. Se puede
usar una forma de preparación de reposición o de liberación lenta de
"depósito", de forma que se suministran cantidades
terapéuticamente eficaces de la preparación en el torrente sanguíneo
durante muchas horas o días tras la inyección o suministro
transdérmico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas
estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de
disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los
casos, la forma debería de ser estéril y debería de ser fluida de
forma que sea fácilmente inyectable. También es deseable que el
polipéptido de PPF de la invención sea estable en las condiciones de
fabricación y almacenamiento, y se debe de conservar frente a la
acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y
hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión
que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo,
sorbitol, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y
similares), dimetilacetamida, cremophor EL, mezclas adecuadas de
los mismos, y aceites (por ejemplo, de haba de soja, de sésamo, de
ricino, de semilla de algodón, oleato de etilo, miristato de
isopropilo, glicofurol, maíz). La fluidez apropiada se puede
mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como
lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de
partículas en el caso de dispersión, y mediante el uso de
tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se
puede producir mediante diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo metacresol, alcohol bencílico, parabenos
(metílico, propílico, butílico), clorobutanol, fenol, sales
fenilmercúricas (acetato, borato, nitrato), ácido sórbico,
timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir
agentes de tonicidad (por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio). La
absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede
producir mediante el uso en las composiciones de agentes que
retrasen la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio y
gelatina). Una composición farmacéutica ejemplar puede ser 0,1 a 5%
de compuesto de la invención en un sistema acuoso junto con
aproximadamente 0,02 a aproximadamante 0,5% (p/v) de un tampón de
acetato, de fosfato, de citrato, o de glutamato a un pH de la
composición final de aproximadamente 3,0 a aproximadamante 6,0, así
como aproximadamente 1,0 a 10% (p/v) de un hidrato de carbono o un
tonificante de alcohol polihidroxilado; y, opcionalmente,
aproximadamente 0,005 a 1,0% (p/v) de un conservante seleccionado
de un grupo que consiste en m-cresol, alcohol
bencílico, parabenos y
fenol.
fenol.
Las disoluciones inyectables estériles se pueden
preparar incorporando los compuestos activos en la cantidad
requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros
ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido
de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones
se preparan incorporando los diversos ingredientes activos
esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de
dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de
los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para
la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos
preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y
liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más
cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolución
previamente filtrada de forma estéril del mismo.
Generalmente, una cantidad terapéutica o
profilácticamente eficaz de los presentes nuevos compuestos se
determinará por la edad, peso, y estado o gravedad de las
enfermedades o afecciones o trastornos metabólicos del receptor.
Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences 697-773. Véase también Wang y
Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability
and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology,
Technical Report nº 10, Sup. 42:25 (1988). Típicamente, se puede
usar una dosis entre aproximadamante 0,001 \mug/kg de peso
corporal/día y aproximadamante 1000 \mug/kg de peso corporal/día,
pero se puede usar más o menos, según reconocerá un practicante
experto. La dosificación se puede hacer una o más veces al día, o
menos frecuentemente, y puede ser conjuntamente con otras
composiciones como se describe aquí. Se debería observar que la
presente invención no está limitada a las dosificaciones citadas
aquí.
Las dosis apropiadas se pueden averiguar
mediante el uso de ensayos consolidados para determinar el nivel de
afecciones o trastornos metabólicos conjuntamente con datos
pertinentes de dosis frente a respuesta. El régimen de dosificación
final se determinará por el médico considerando factores que
modifican la acción de fármacos, por ejemplo la actividad
específica del fármaco, la gravedad del daño y la sensibilidad del
paciente, la edad, estado, peso corporal, sexo y dieta del
paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de
administración y otros factores clínicos. A medida que se realicen
estudios, aparecerá información adicional con respecto a los
niveles de dosificación apropiados y la duración del tratamiento
para enfermedades y afecciones específicas.
Una dosis eficaz estará típicamente en el
intervalo de aproximadamante 1 a 30 \mug a aproximadamante 5
mg/día, preferentemente aproximadamante 10 a 30 \mug a
aproximadamante 2 mg/día, y más preferentemente aproximadamante 5 a
100 \mug a aproximadamante 1 mg/día, lo más preferible
aproximadamante 5 \mug a aproximadamante 500 \mug/día,
administrada en dosis individuales o divididas. Las dosificaciones
pueden estar entre aproximadamante 0,01 y aproximadamante 500
\mug/dosis. Se contempla que los compuestos de la invención se
pueden administrar 1, 2, 3, 4 o más veces al día. En consecuencia,
las dosis ejemplares se pueden derivar de la cantidad total de
fármaco a administrar en el día y el número de dosis administrado al
día. Por ejemplo, las dosis ejemplares pueden oscilar desde
aproximadamante 125 \mug/dosis (0,5 \mug dada cuatro veces al
día) a aproximadamante 5 mg/dosis (5 mg dada una vez al día). Otras
dosis pueden estar entre aproximadamante 0,01 y aproximadamante 100
\mug/kg dosis. Todavía otras dosis ejemplares pueden ser 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170,
180, 190, ó 200 \mug/dosis. La dosis exacta a administrar se puede
determinar por un experto en la materia, y depende de la potencia
del compuesto en particular, así como de la edad, peso y estado del
individuo. La administración debería de comenzar siempre que se
desee la supresión de la disponibilidad de nutrientes, la ingesta
de alimentos, reducir el peso, la glucosa en sangre o el lípido en
plasma, por ejemplo al primer signo de síntomas o poco después tras
el diagnóstico de obesidad, diabetes mellitus, o síndrome de
resistencia a insulina. La administración se puede realizar mediante
cualquier ruta, por ejemplo, inyección, preferentemente
subcutánea o intramuscular, oral, nasal, transdérmica, etc. Las
dosis para ciertas rutas, por ejemplo administración oral, se
pueden incrementar para dar cuenta de la biodisponibilidad reducida,
por ejemplo en aproximadamante 5-100 veces.
En una realización, cuando la formulación
farmacéutica se va a administrar parenteralmente, la composición es
una formulación para suministrar una dosis de los nuevos compuestos
que oscila desde 0,1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso
corporal/día, preferentemente a dosis que oscilan desde 10 \mug/kg
hasta aproximadamante 50 mg/kg de peso corporal/día. La
administración parenteral se puede llevar a cabo con un bolo
inicial, seguido de la infusión continua para mantener los niveles
circulantes terapéuticos de producto farmacéutico. Los expertos
normales en la técnica optimizarán fácilmente las dosificaciones
eficaces y regímenes de administración según se determina mediante
la práctica médica y el estado clínico del paciente individual.
La frecuencia de la dosificación dependerá de
los parámetros farmacocinéticos de los agentes y las rutas de
administración. La formulación farmacéutica óptima se determinará
por el experto en la materia dependiendo de la ruta de
administración y la dosis deseada. Véase, por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Sciences, más arriba, páginas
1435-1712. Tales formulaciones pueden influir en el
estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo
y velocidad de aclaramiento in vivo de los agentes
administrados. Dependiendo de la ruta de administración, se puede
calcular una dosis adecuada según el peso corporal, áreas
superficiales corporales o tamaño del órgano. Un refinamiento
adicional de los cálculos necesario para determinar la dosis de
tratamiento apropiada se realiza de forma normal por los expertos
normales en la técnica sin experimentación excesiva, especialmente
a la luz de la información de la dosificación y ensayos descritos
aquí, así como los datos farmacocinéticos observados en ensayos
clínicos con animales o seres humanos.
Se apreciará que las composiciones farmacéuticas
de la invención pueden ser útiles en campos de medicina humana y
medicina veterinaria. De este modo, el sujeto a tratar puede ser un
mamífero, preferentemente un ser humano u otro animal. Para fines
veterinarios, los sujetos incluyen, por ejemplo, animales de granja
que incluyen vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, animales de
compañía tales como perros y gatos, animales exóticos y/o de
zoológicos, animales de laboratorio, que incluyen ratones, ratas,
conejos, cobayas y hámsters; y aves de corral tales como pollos,
pavos, patos y gansos.
Para ayudar a comprender la presente invención,
se incluyen los siguientes Ejemplos. Por supuesto, los experimentos
que se refieren a esta invención no se deberían de interpretar como
específicamente limitantes de la invención.
Los siguientes polipéptidos se pueden sintetizar
usando métodos de síntesis de polipéptidos estándar. Tales métodos
se describen más abajo y en las patentes US 6.610.824 y US 5.686.411
y en la Solicitud de patente serie nº 454.533 (presentada el 6 de
diciembre de 1999), cuyas totalidades se incorporan aquí como
referencia.
Los polipéptidos se ensamblan en una resina de
4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc
aminometil fenoxi acetamida norleucina MBHA (Novabiochem, 0,55
mmoles/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied
Biosystems, Inc.). En general, se usan ciclos de acoplamiento
individuales durante la síntesis, y se emplea la química de Fast Moc
(activación con HBTU). Sin embargo, en algunas posiciones el
acoplamiento puede ser menos eficaz que el esperado, y se requieren
acoplamientos dobles. La desprotección (eliminación del grupo Fmoc)
de la cadena peptídica reciente usando piperidina igualmente puede
no ser siempre eficaz, y requiere una doble desprotección. La
desprotección final de la resina peptídica completa se logra usando
una mezcla de trietilsilano (0,2 ml), etanoditiol (0,2 ml), anisol
(0,2 ml), agua (0,2 ml) y ácido trifluoroacético (15 ml) según
métodos estándar (Introduction to Cleavage Techniques, Applied
Biosystems, Inc.). Los péptidos se precipitan en éter/agua (50 ml) y
se centrifugan. El precipitado se reconstituye en ácido acético
glacial y se liofiliza. Los péptidos liofilizados se disuelven en
agua. Entonces se determina la pureza bruta.
En las etapas de purificación y análisis se usan
el Disolvente A (0,1% de TFA en agua) y el Disolvente B (0,1% de
TFA en ACN).
Disoluciones que contienen los diversos
polipéptidos se aplican a una columna C-18
preparativa y se purifican (10% a 40% de Disolvente B en Disolvente
A durante 40 minutos). La pureza de las fracciones se determina
isocráticamente usando una columna analítica C-18.
Las fracciones puras se reúnen dando el péptido identificado
anteriormente. La RP-HPLC analítica (gradiente 30%
a 60% de Disolvente B en Disolvente A durante 30 minutos) del
péptido liofilizado determina el tiempo de retención.
Inicialmente, los polipéptidos se pueden usar en
ensayos para determinar la capacidad de unión a receptores de
amilina, calcitonina y CGRP. Los ensayos de unión para determinar
las interacciones con el receptor de amilina, el receptor de
calcitonina y el receptor de CGRP se describen, por ejemplo, en la
patente US nº 5.264.372, cuya totalidad se incorpora aquí como
referencia.
Con más detalle, la evaluación de la unión de
los compuestos de la invención a receptores de amilina se puede
llevar a cabo según lo siguiente. La
^{125}I-amilina de rata
(Bolton-Hunter marcado en la lisina
N-terminal) se adquiere de Amersham Corporation
(Arlington Heights, III.). Los péptidos no marcados se obtienen de
BACHEM Inc. (Torrance, Calif.) y Peninsula Laboratories (Belmont,
Calif.).
Ratas macho Sprague-Dawley® de
(200-250) gramos se sacrifican por decapitación. Los
cerebros se retiran en disolución salina tamponada con fosfato
(PBS) fría. De la superficie ventral, se realizan cortes rostrales
al hipotálamo, unidos lateralmente mediante los tubos olfativos que
se extienden medialmente un ángulo de 45 desde estos tubos. Este
tejido prosencefálico basal, que contiene el nucleus accumbens y
regiones circundantes, se pesa y se homogeneiza en tampón HEPES 20
mM (ácido HEPES 20 mM, pH ajustado hasta 7,4 con NaOH a 23C)
enfriado con hielo. Las membranas se lavan tres veces en tampón
reciente mediante centrifugación durante 15 minutos a 48.000 veces
g. El pelete de membrana final se resuspende en tampón de HEPES 20
mM que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,2 mM.
Para unir la unión a
^{125}I-amilina, se incuban membranas de 4 mg de
peso en húmedo original de tejido con
^{125}I-amilina a 12-16 pM en
tampón HEPES 20 mM que contiene 0,5 mg/ml de bacitracina, 0,5 mg/ml
de seroalbúmina bovina, y 0,2 mM de PMSF. Las disoluciones se
incuban durante 60 minutos a 2C. Las incubaciones se terminan
mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio GF/B
(Whatman Inc., Clifton, N.J.) que se habían empapado previamente
durante 4 horas en polietilenimina al 0,3% a fin de reducir la unión
no específica de péptidos radiomarcados. Los filtros se lavaron
inmediatamente antes de la filtración con 5 ml de PBS fría, e
inmediatamente tras la filtración con 15 ml de PBS fría. Los filtros
se eliminaron y la radioactividad se evaluó en un contador gamma a
una eficacia de recuento de 77%. Se generaron curvas de competición
midiendo la unión en presencia de 10^{-12} a 10^{-6} M de
compuesto de ensayo sin marcar y se analizaron mediante regresión
no lineal usando una ecuación logística de 4 parámetros (programa
Inplot; GraphPAD Software, San Diego).
En este ensayo, la amilina humana purificada se
une a su receptor a una IC_{50} medida de aproximadamante 50 pM.
Los resultados para los compuestos de ensayo de la invención se
exponen en la tabla más abajo, mostrando que cada uno de los
compuestos tiene una actividad de unión al receptor
significativa.
La evaluación de la unión de los compuestos de
la invención a los receptores de CGRP fue esencialmente como se
describe para amilina, excepto que se usó 125I hCGRP y membranas
preparadas a partir de células
SK-N-MC, que se sabe que expresan
receptores de CGRP (Muff, R. et al. Ann NY Acad. Sci. 1992:
657, 106-16). Los ensayos de unión se llevaron a
cabo como se describe para amilina, excepto que se usó 13.500 cpm de
125I-hCGRP/pocillo o 21,7 pM/pocillo
(Amersham).
La unión al receptor de calcitonina se puede
investigar usando células CHO o células T47D, que también expresan
el receptor de calcitonina (Muff, R. et al. Ann NY Acad. Sci.
1992, 657: 106-16 y Kuestner R.E. et al. Mol
Pharmacol. 1994, 46:246-55), como es conocido en la
técnica.
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Ratones hembra NIH/Swiss (8-14
semanas) se enjaularon en grupos con un ciclo de luz:oscuridad de
12:12 horas. El agua y una dieta de comida para ratón peletizada
estándar están disponibles a voluntad, excepto según se señale. Los
animales ayunan comenzando a aproximadamente 1500 horas, 1 día antes
del experimento.
En el momento = 0 min., a todos los animales se
les administra una inyección intraperitoneal de vehículo o
polipéptido en un velocidad de 200 ul/ratón e inmediatamente se les
da una cantidad pesada previamente (10-15 g) del
pienso estándar. El alimento se retira y se pesan a los 30, 60, 120
y 180 minutos, para determinar la cantidad de alimento consumido.
Los efectos del tratamiento sobre la ingesta de alimento se expresan
como % de cambio con relación al control.
Como se puede ver en la Figura 1, el Compuesto
2, a dosis de 25-300 nmoles/kg, redujo de forma
dependiente de la dosis la ingesta de alimentos a 30 minutos
después de la inyección. La tabla a continuación presenta la
ingesta reducida de alimentos con polipéptidos administrados
periféricamente (inyección intraperitoneal) a dosis de 25
nmoles/kg. Los datos en los puntos de tiempo 30, 60, 120 y 180
minutos representan el porcentaje de disminución en la ingesta
acumulativa de alimentos en comparación con el vehículo.
Ratas Sprague-Dawley® macho
enjauladas individualmente (350 g; ciclo de luz/oscuridad de 12 h)
se mantuvieron en una dieta rica en grasas (50% de kcal de grasa)
durante 4 semanas. Al final del período de engorde, se implantaron
interescapularmente bajo anestesia bombas osmóticas de 14 días
(Durect Corp.). Las ratas recibieron bombas que suministran
continuamente vehículo (50% de DMSO) o un polipéptido a una dosis de
2,9 nmoles/kg/día. Las medidas de ingesta de alimentos y de peso
corporal se obtuvieron semanalmente. Las Figuras 2A y 2B muestran
que los polipéptidos Compuesto 3, Compuesto 4, o Compuesto 5
produjeron una disminución en la ingesta calórica y ganancia de
peso corporal a lo largo del período de ensayo de 14 días.
La tabla a continuación presenta el porcentaje
de pérdida de peso corporal en la semana 1 y 2 para varios
compuestos.
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Ratas Sprague-Dawley® macho
enjauladas individualmente (420 g; ciclo de 12 h de luz/oscuridad)
se mantuvieron en una dieta rica en grasas (58% kcal de grasa)
durante 4 semanas. Al final del período de engorde, se implantaron
interescapularmente bajo anestesia bombas osmóticas de 14 días
(Durect Corp.). Las ratas recibieron bombas que suministraron
continuamente vehículo (50% de DMSO) o Compuesto 1 a una dosis de 70
nmoles/kg/día. Los animales se sacrificaron en el Día 12. Las
carcasas se congelaron inmediatamente y la composición corporal
(grasa y proteína) se midió mediante análisis químico (Covance
Laboratories, Madison, WI). La Figura 3 muestra que, como
porcentaje de masa corporal total, el contenido de grasa se redujo
en ratas tratadas con Compuesto 1 en comparación con los controles.
Además, el Compuesto 1 incrementó el porcentaje de contenido de masa
magra.
El vaciamiento gástrico se monitorizó midiendo
el aspecto en plasma de glucosa tritiada alimentada por sonda. Los
sujetos fueron ratas macho Sprague-Dawley®
conscientes (7-9 semanas, ciclo de luz:oscuridad
12:12 h) con acceso a voluntad a alimento y agua hasta el comienzo
del experimento. Antes de la dosificación, la comida y el agua se
retiraron. A t = -5 min., se administró subcutáneamente péptido o
vehículo (200 \mul de disolución salina). A t = 0 min., se
proporcionó mediante tubo orofaríngeo una disolución de 1 ml de agua
estéril que contiene 5 \muCi de
D-[3-3H]glucosa (Dupont, Wilmington, DE,
USA). A t = 20 min., se aplicó a la punta de la cola un anestésico
tópico (Hurricaine®, 20% de benzocaína líquida). A t = 40 min., la
punta de la cola se ligó con un escalpelo y se recogieron \sim250
\mul de sangre en tubos heparinizados. El plasma se estudió
entonces inmediatamente para determinar el calcio ionizado usando un
analizador Ciba/Corning 634 Ca/pH (Ciba/Corning, Inc., Medfield,
MA). Se pipeteó una muestra de plasma de 10 \mul en viales de
centelleo preparados (0,5 ml de agua + 2 ml de cóctel de centelleo
(cóctel de centelleo Ecolite ICN, Costa Mesa, CA)), se sometió a
vórtex y se contó en un contador \beta (1209
Rack-beta; LKB-Wallac, Gaithersburg,
MD) durante 1 minuto/vial.
En la Figura 4A, los puntos representan media
\pm sd de 6 ratas SD (alimentadas, conscientes). La dosis
indicada de péptido se inyectó subcutáneamente a t = 0. Se recogió
sangre 35 minutos después para el análisis de cpm. *Todos los
puntos p < 0,001 frente a control salino; ANOVA, prueba de
Dunnett. De la regresión no lineal: ED50 = 2,3 \mug/kg. Inferior
= 25 cpm/10 \mul; superior = 328 cpm/10 \mul. Disminución máxima
en cpm del plasma: -92%. Bondad del ajuste: r2 = 0,9992.
En la Figura 4B, los puntos representan media
\pm sd de 6 ratas SD (alimentadas, conscientes). La dosis
indicada de péptido se inyectó subcutáneamente a t = 0. Se recogió
sangre 35 minutos después para el análisis de cpm. *P < 0,001
frente a control salino; ANOVA, prueba de Dunnett. De la regresión
no lineal: ED50 = 1,1 \mug/kg. Inferior = 1,2 mmoles/l; superior
= 1,3 mmoles/l. Disminución máxima en iCa plasmático: -14%. Bondad
del ajuste: r2 = 0,9936.
En el estudio 1, ratas
Sprague-Dawley® de Harlan hembras (HSD;
HarlanTeklad, Indianápolis, IN) retiradas de la crianza se
alimentaron en una dieta rica en grasas (40% de calorías procedentes
de la grasa; dieta #TD95217, HarlanTeklad) durante 9 semanas antes
del inicio del estudio, continuando con esta dieta durante el
período experimental. Un grupo de ratas se alimentó a
voluntad durante el estudio para examinar los efectos
metabólicos del Compuesto 1, un compuesto representativo de la
invención, tratamiento (n = 10) con relación a ratas del control,
no tratadas (n = 10).
Para determinar los efectos metabólicos del
Compuesto 1 en el marco de la restricción del alimento
("dieta"), a un segundo grupo de ratas se les administró 75%
de su ingesta de alimento de referencia antes del estudio cada día
durante 10 días antes del inicio del tratamiento con el Compuesto 1
(n = 10) o vehículo (n = 10) (\sim5% de pérdida de peso corporal
frente a peso corporal previo a la restricción). En ese momento,
todas las ratas recibieron bombas osmóticas Alzet® (Durect,
Cupertino, CA) implantadas quirúrgicamente en la región
intraescapular subcutáneamente con anestesia con isoflurano. Las
bombas se prepararon para suministrar continuamente Compuesto 1
(101 \mug/kg/día) o vehículo (50% de dimetilsulfóxido [DMSO] en
agua) durante 21 días. Las ratas a las que se les restringió el
alimento continuaron recibiendo 75% de su ingesta de alimento de
referencia cada día. Después de 21 días de tratamiento, se
obtuvieron muestras de sangre en jeringuillas heparinizadas vía
punción cardíaca de ratas postabsortivas anestesiadas con isoflurano
(\sim2-4 h en ayunas en a.m.) y plasma obtenido
para el análisis de analitos. Los triglicéridos plasmáticos se
determinaron usando el análisis automatizado estándar para química
clínica (LabCorp, Inc., San Diego, CA).
En el estudio 2, ratas macho de la raza Levin
que tienden a la obesidad de ratas HSD (Charles River, Wilmington,
MA) se alimentaron con una dieta rica en grasas (32% de calorías
procedente de la grasa; dieta #12266B, Research Diets, Inc., New
Brunswick, NJ) durante 6 semanas antes del inicio del estudio, y
continuaron con esta dieta durante el experimento. El inicio del
tratamiento comenzó con la colocación de bombas osmóticas
subcutáneas que contienen Compuesto 1 o vehículo DMSO como en el
Estudio 1, y continuó durante 3 semanas (21 días). Los parámetros
metabólicos se compararon entre ratas tratadas con el Compuesto 1
(303 \mug/kg/día; n = 10), controles tratados con el vehículo (n
= 10), y un grupo alimentado por parejas (n = 10) que recibió
diariamente la cantidad de alimento comido por las ratas tratadas
con el Compuesto 1. La recogida de sangre y el análisis de la
concentración de triglicéridos en plasma se realizó como en el
Estudio 1, pero usando una recolección de la vena de la cola en los
puntos de la 1ª semana y la 2ª semana.
El Estudio 3 se llevó a cabo como el Estudio 2,
excepto que los animales se trataron durante 8 semanas (56 días) y
a diferentes dosis de Compuesto 1. A los 28 días de tratamiento, las
bombas osmóticas recientes sustituyeron a las bombas usadas. Las
bombas se prepararon para suministrar Compuesto 1 a las dosis de 1,
3, 10 ó 100 \mug/kg/día (n = 10/grupo) o vehículo DMSO
(controles, n = 10). Un grupo adicional alimentado por pares (n =
10) recibió vehículo y se alimentó diariamente la cantidad de
alimento comido por el grupo de 100 \mug/kg/día de Compuesto 1.
La recogida de sangre y el análisis de la concentración de
triglicéridos en plasma para los puntos de referencia, 2, 4 y 6
semanas se obtuvieron de ratas alimentadas conscientes vía la
recogida de la vena de la cola en tubos heparinizados; la recogida
de sangre y el análisis de la concentración de triglicéridos en
plasma para el punto de la 8ª semana se obtuvo a partir de ratas
alimentadas anestesiadas con isoflurano en jeringuillas
heparinizadas vía punción cardíaca, empleando un ensayo de
triglicéridos estándar (Cobas Mira Plus, Roche Diagnostics).
Las diferencias entre los niveles medios de
triglicérido en plasma a lo largo de los tratamientos para un punto
de tiempo dado del estudio se evaluaron en un análisis de una vía de
varianza (ANOVA), seguido del Ensayo de Comparación de Múltiples de
Dunnett (Prism v. 4.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Las
diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p
< 0,05.
Como se indica en las Figuras 5 a 7E, los
estudios 1, 2, y 3, respectivamente, el tratamiento con Compuesto 1
durante 1-8 semanas dio como resultado
concentraciones significativamente menores de triglicéridos. La
Figura 5 muestra la concentración de triglicéridos en plasma en
ratas de criador retiradas hembras tras un tratamiento de 21 días
con el Compuesto 1 vía infusión continua subcutánea (s.c.). Las
ratas a las que se les administró Compuesto 1 presentaron niveles
de triglicéridos significativamente menores en comparación con los
controles alimentados a voluntad: este efecto se observó
independientemente de si el Compuesto 1 se administró en
condiciones de alimentación a voluntad o en condiciones de
alimento restringido. *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación
con los controles tratados con vehículo, a voluntad.
Las Figuras 6A-6C representan la
concentración plasmática de triglicéridos en ratas Levin machos de
obesidad inducida por la dieta (DIO) durante un tratamiento de 3
semanas con Compuesto 1 vía infusión s.c. continua. Las gráficas
representan valores derivados de muestras de sangre recogidas a (A)
1 semana, (B) 2 semanas, y (C) 3 semanas de tratamiento. *p <
0,05, **p < 0,01 en comparación con los controles tratados con
el vehículo.
Las Figuras 7A-7E muestran un
estudio de respuesta frente a la dosis del Compuesto 1, en el que
las dosis tan bajas como 1 \mug/kg/día dieron como resultado una
reducción de las concentraciones plasmáticas de triglicérido cuando
se compara con los controles del vehículo en los puntos de 2, 4, 6 y
8 semanas (Figura 7B, C, D, y E, respectivamente). *p < 0,05,
**p < 0,01 comparadas con los controles tratados con vehículo. En
la leyenda se indican los grupos de tratamiento.
Este ejemplo proporciona un ensayo ejemplar para
detectar el efecto de los compuestos de la invención sobre
grelina.
Ratas macho Harlan Sprague Dawley® (HSD) se
enjaularon a 22,8 +/- 0,8ºC en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12
horas. Todos los experimentos se llevaron a cabo en el ciclo de luz.
Los animales ayunaron durante aproximadamente 20 horas antes del
experimento. A todos los animales se les dio acceso libre al agua
hasta el comienzo del experimento. Las colas de los animales se
anestesiaron con benzocaína al 20% (Hurricaine, Beutlich
Pharmaceutical, Waukegan, IL), y las muestras de sangre se
recogieron de la vena de la cola. Las concentraciones totales y
activas de grelina se midieron usando Linco RIA kits
GHRA-89HK y GHRA-88HK,
respectivamente.
En el Estudio 1, las ratas HSD se sometieron a
toma periódica de muestra de sangre a partir de la cola anestesiada
tópicamente, y se evaluaron los niveles de grelina. A t = 0, a las
ratas (n = 6) se les inyectó s.c. con 125 \mug/kg de
pentagastrina (Sigma) para estimular la secreción de ácido gástrico
(PG = 0 min. en la Figura 1), y 20 minutos más tarde se les inyectó
subcutáneamente (s.c.) con 10 \mug de amilina de rata. Las
muestras de sangre se analizaron para determinar la grelina total y
activa (acilada) (Linco). Como se muestra en la Figura 8A, la
amilina redujo grelina activa en \sim50% en 1 hora.
El Estudio 2 se llevó a cabo para examinar si la
amilina exógena inhibe la secreción de grelina independiente de la
estimulación con pentagastrina. A ratas en ayunas se les administró
una inyección subcutánea de disolución salina o de amilina de rata
30 \mug/kg, o inyección subcutánea de disolución salina o
pentagastrina 125 \mug/kg (Sigma, Lote #050K1525) en el momento =
0 min. Se administró mediante inyección subcutánea en el momento 20
min. amilina de rata (AC0128, lote #AR2081-42A,
Amylin Pharmaceuticals), a una dosis de 30 \mug/kg en 100 \mul
de disolución salina, o vehículo salino solo (n = 5,5
respectivamente). Se recogieron muestras plasmáticas de sangre por
lo menos en los tiempos 0, 10, 20, 30, 60, y 90 min. Tanto las
Figuras 8B como 8C muestran una reducción en grelina plasmática
total con la administración de amilina en comparación con el
control salino, y la Figura 8B confirma que la grelina plasmática se
redujo en comparación con el control en presencia de amilina sola,
es decir, sin pentagastrina. Parece que la pentagastrina potencia el
efecto reductor de la grelina de amilina.
Se llevaron a cabo canulaciones de la arteria y
vena femorales en ratas HSD anestesiadas en ayunas (peso
320-350 g), y se dejó que se estabilizaran durante
90 minutos. A t = -30, se comenzó una infusión de disolución salina
(1 ml/h) o Compuesto 1 (1 ml/h). A t = 0, las ratas recibieron una
inyección ip de caeruleína, 10 \mug/kg. Se recogieron muestras
para amilasa y lipasa plasmáticas en diversos puntos de tiempo desde
t = -30 hasta t = 240.
Como se muestra en las Figuras 9A y 9B, el
tratamiento con el Compuesto 1 atenuó los incrementos en las
actividades de enzimas pancreáticas en la sangre en el modelo de
rata de pancreatitis aguda, sugiriendo que los agonistas de amilina
pueden ser candidatos farmacéuticos objetivos para la prevención y
tratamiento de pancreatitis.
Ratas macho Harlan Sprague Dawley® se enjaularon
a 22,8 \pm 0,8ºC en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas. Los
experimentos se llevaron a cabo durante el ciclo diurno. Las ratas,
alimentadas con pienso para ratas (Teklad LM 485, Madison, WI),
ayunaron durante aproximadamente20 horas antes del experimento. Se
les dio agua a voluntad hasta el comienzo del
experimento.
A las ratas (9-14 semanas, masa
corporal 264-395 g) se les instaló quirúrgicamente
fístulas gástricas dobles por el proveedor (Zivic Miller, número de
Catálogo SCA03.00). Durante la laparotomía bajo anestesia con
halotano, un tarugo de luz doble con forma de ojal se suturó en la
pared del estómago. Se hicieron pasar a través de la pared
abdominal, subcutáneamente a la región interescapular en la que se
exteriorizaron separadamente dos cánulas silásticas de 2,3 mm de
diámetro interno (entrada y salida) conectadas al tarugo y que
comunican con la luz gástrica. La herida de la laparotomía se cerró
con grapas, la rata se colocó en una jaula de recuperación
calentada durante un día con acceso libre a agua. Después, las ratas
se enjaularon individualmente con acceso libre a agua y a pienso
para ratas hasta que se sometieron a ayuno durante toda la noche
para los experimentos, que se llevaron a cabo sobre ratas
conscientes, aproximadamante 10-15 días tras la
cirugía.
Los catéteres gástricos se destaparon y se
unieron a un tubo de PE240 flexible para inyección y toma de
muestras. Para asegurar la permeabilidad de los catéteres, se
inyectaron 2-3 ml de disolución salina a temperatura
ambiente e inmediatamente se retiraron del estómago. Esto se
repitió hasta que el flujo fue fácil y el efluente era claro. La
secreción de ácido gástrico se midió a intervalos de 10 min.
inyectando 5 ml de disolución salina y 2 ml de aire vía un catéter,
retirando entonces inmediatamente esto mismo vía el otro catéter. De
esta manera se pudieron minimizar los errores debido a la
aspiración incompleta del pequeño volumen segregado. Se valoraron
tres ml de cada aspirado gástrico a pH 7,0 con hidróxido sódico 0,01
N usando un pHmetro (modelo número PHI34 de Beckman, Fullerton,
CA). La cantidad de base requerida para cada valoración, corregida
para el volumen total aspirado, se usó para calcular los moles de
ácido en cada muestra.
Después de que se recogió una muestra de
referencia y se registró el volumen recuperado, a los animales se
les suministró una inyección subcutánea de pentagastrina 125
\mug/kg (Peninsula Laboratories número de lote 019945 y 034686),
y la toma de muestra gástrica a los 10 min. continuó durante otras 2
horas. A cuarenta minutos después de la inyección de pentagastrina,
en cuyo momento se observó una meseta estable de secreción de ácido
gástrico, a las ratas se les inyectó subcutáneamente con disolución
salina (n = 6) o con amilina de rata (lote número
AR905-80, Amylin Pharmaceuticals Inc., San Diego,
CA) a dosis de 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 ó 100 \mug (n = 3, 3, 4, 5,
5, respectivamente).
Como se muestra en la Figura 10A, la
pentagastrina estimuló la secreción de ácido gástrico 4,6 veces con
respecto a una velocidad basal de aproximadamante 13,8 \pm 2,2
\mumoles/10 min. hasta aproximadamante 63,4 \pm 3,3
\mumoles/10 min., 40 minutos después de la inyección de
pentagastrina (media grande; P < 0,0001). La amilina inyectada
40 minutos después de la pentagastrina inhibió, de forma dependiente
de la dosis, la producción de ácido gástrico con semividas para el
comienzo de acción de 8,6, 10,4, 5,8 y 6,3 minutos para las dosis
de 0,1, 1, 10 y 100 \mug, respectivamente. Con la dosis más
elevada (100 \mug) de amilina, la secreción de ácido estimulada
por pentagastrina se redujo en 93,4 + 2,6% una hora después de la
inyección de amilina (P < 0,001 para dosis de
0,1-100 \mug). Esta velocidad de secreción fue
sólo 32% de la velocidad basal que precedió a la inyección de
pentagastrina (P < 0,01, prueba de la t, corrección de Welch). En
la Figura 10B se muestra la respuesta frente a la dosis para la
inhibición por amilina de la secreción de ácido estimulada por
pentagastrina. La ED_{50} para el efecto supresor de ácido de
amilina fue 0,05 \mug/rata \pm0,15 unidades logarítmicas (41
pmoles/kg).
A ratas macho en ayunas, peso corporal
163-196 g, se les inyectó subcutáneamente 0,1 ml de
disolución salina (n = 12) o el mismo volumen que contiene amilina
de rata a dosis de 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 ó 10 \mug (n = 5,
5, 5, 9, 9, 5, 6 respectivamente) 20 minutos antes de la
alimentación por sonda nasogástrica con 1 ml de etanol absoluto
(alcohol etílico-alcohol deshidratado prueba 200,
USP, Spectrum Quality Products, Inc. Gardena, CA). Treinta minutos
después de la alimentación por sonda, cada rata se anestesió con 5%
de halotano, se cortó el estómago, se abrió a lo largo de la
curvatura más pequeña y se volteó para extraer la mucosa. Los
estómagos volteados se enjuagaron suavemente con disolución salina e
inmediatamente se clasificaron para determinar el daño de la mucosa
por cada uno de los 10 observadores que no conocían el tratamiento
experimental. La escala de clasificación se restringió entre cero
(sin daño observable) y 5 (100% de la superficie de la mucosa
cubierta con hiperemia, ulceración, o tejido necrótico), comparable
con el sistema de puntuación de 0-5 usado por
otros, por ejemplo, Guidobono F. et al. Br J Pharmacol
120:581-586 (1997). La Figura 11A muestra los
resultados de la puntuación de la lesión como un porcentaje de la
lesión inducida por etanol.
Para determinar si el efecto gastroprotector de
amilina fue atribuible a un mecanismo específico de amilina, se
inyectaron a 4 ratas intravenosamente con 3,0 mg del antagonista de
amilina selectivo, AC187 (Amylin Pharmaceuticals, Inc. San Diego,
CA), 25 minutos antes de la alimentación nasogástrica de etanol,
seguido 5 minutos más tarde (a t = -20 min. desde la alimentación
nasogástrica) con 0,3 \mug de amilina de rata inyectada
subcutáneamente. Los estómagos se cortaron y se clasificaron para
la lesión 30 minutos después de la alimentación nasogástrica de
etanol, como se describe anteriormente. El resultado se proporciona
seguidamente a la última barra de la Figura 11A. La última barra
muestra los resultados de la inyección de 3,0 mg de AC187 sin
inyección de amilina de rata. En la Figura 11B se muestra una vista
más selectiva de los resultados.
La Figura 11C muestra que la amilina,
suministrada como una inyección subcutánea 5 minutos antes de la
alimentación nasogástrica con etanol, protegió de forma dependiente
de la dosis al estómago de la lesión mucosal (P < 0,05
con dosis de 0,1 \mug y superiores). La amilina redujo la
puntuación de lesión un 67% con dosis de 0,3 \mug y superiores.
La ED_{50} para el efecto gastroprotector de amilina en este
sistema experimental fue 0,036 \mug (31 pmoles/kg) \pm 0,40
unidades logarítmicas.
Para explorar adicionalmente si se podría
producir un efecto gastroprotector de amilina en respuesta a la
secreción de amilina endógena estimulada por glucosa, se comparó el
efecto de la gastritis inducida por etanol de la administración de
glucosa intraperitoneal previa (250 mg/0,5 ml de
D-glucosa; t = -30 minutos desde la alimentación
nasogástrica; n = 9) con la lesión observada en ratas tratadas con
el vehículo (n = 23). Los estómagos se cortaron y se clasificaron
para determinar la lesión 30 minutos después de la alimentación
nasogástrica de etanol, como se describe anteriormente, y se tomó
sangre para la medida de la glucosa plasmática. La respuesta de la
lesión también se midió en ratas tratadas con glucosa a las que se
les coadministró un bolo intravenoso de 3 mg de AC187 (n = 9).
Antes de la administración de
D-glucosa, que incrementó la glucosa plasmática a t
= +30 minutos más tarde hasta 123 mg/dl (frente a 76 mg/dl en
controles), y que previamente se había demostrado que incrementa las
concentraciones de amilina plasmática endógena en ratas Sprague
Dawley en ayunas hasta 4,8 \pm 0,6 pM, la puntuación de la lesión
gástrica disminuyó significativamente en 18,5 \pm 4,6% (P
< 0,0005). Sin embargo, la inyección previa de AC187 no tuvo
ningún efecto sobre las puntuaciones de la lesión en ratas tratadas
con glucosa.
Todas las publicaciones y solicitudes de
patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del
nivel de pericia de los expertos en la materia a la que pertenece la
presente invención.
<110> AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PÉPTIDOS DE LA FAMILIA AMILINA Y
MÉTODOS PARA SU OBTENCIÓN Y UTILIZACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 18528.835
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US05/004631
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2005-02-11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/550.447
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-03-03
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/543.275
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-02-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 138
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus sp.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oncorhynchus sp.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: motivo de péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido o no presente;
véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la
descripción detallada de sustituciones y formas de realización
preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido o no presente;
véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la
descripción detallada de sustituciones y formas de realización
preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido o no presente;
véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la
descripción detallada de sustituciones y formas de realización
preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido, véase la
memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción
detallada de sustituciones y formas de realización preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido, véase la
memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción
detallada de sustituciones y formas de realización preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cualquier aminoácido, véase la
memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción
detallada de sustituciones y formas de realización preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr(OPO3H2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hse
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ahb
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ahp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región puede englobar
1-4 aminoácidos variables
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly o Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, Orn, hArg, Cit, hLys, o
Lys(for)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glu o Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His o Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, Orn, hArg, Cit, hLys,
Lys(for), o Lys(PEG5000)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tyr o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Arg o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región puede englobar
1-4 aminoácidos variables
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región puede englobar
1-4 aminoácidos variables residuales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Met, o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gln, Gly, o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Thr, Asn, Phe, Tyr, Ser, o
Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asn, Arg, Ala, Asp, Glu, Gln, Thr, o
Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Ser, Glu, Ala, Asp, o
Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Val, His, Ser, Phe, o Aib
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Arg, Lys, Orn, hArg, Cit, hLys,
Lys(for), o Lys(PEG5000)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu, Ser, o Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gln o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tyr, Val, Phe, Leu, o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Arg o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Esta región puede englobar
1-4 aminoácido variable residues
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia sintética de aminoácidos
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Tyr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ser, Pro, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ser, Pro, Arg, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asn o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Val, Thr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ser o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asn, Lys, o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Phe, o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tyr, Phe, Pro, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia sintética de aminoácidos
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia sintética de aminoácidos
C-terminal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácido variable, hCys, hLys,
hArg, Hse, Hyp, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácido variable o no presente;
véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la
descripción detallada de sustituciones y formas de realización
preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Gly, Val,
Arg, Lys, hLys, hArg, His, Ile, Leu, Met, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Ile, Leu, Ser, Hse, Thr, Val,
Met, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Ser, Thr, Hse, Tyr, Val, Ile,
Leu, o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Ala, Ser, Hse, Tyr, Val, Ile,
Leu, o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácido variable o no presente;
véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la
descripción detallada de sustituciones y formas de realización
preferidas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Val, Ile, Leu, Phe, o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu, Thr, Ser, Hse, Val, Ile, o
Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly, His, Gln, Lys, Arg, Asn, hLys,
o hArg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, Gln, Asn, hLys, hArg, o
His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu, He, Val, Phe, Met, Trp, o
Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Phe, Tyr, Asn, Gln, Ser, Hse, o
Thr
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Lys, Gln,
Arg, His, hArg, o hLys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Phe, Leu, Ser, Tyr,
He, Val, o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu, Phe, Met, Val, Tyr, o He
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Gln, Asn, Ser, Hse, Thr, o
Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, hLys, Arg, hArg, His, Cit, o
Orn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Ser, Hse; Val, Ile, Thr, o
no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Arg, Lys, hArg, hLys, Asn, Gln,
o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Ser, Hse, Val, Ile, Leu, Gln,
Asn, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Met, Val, Tyr, o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pro o Hyp
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pro, Hyp, Arg, Lys, hArg, hlys, o
His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Ser, Hse, Val, Ile, Leu, Phe, o
Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Asn, Gln, Asp, o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Val, Ser, Phe, Ile, o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ser, Hse, Thr, Val, Ile, Leu, o
Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glu, Gly, Lys, Asn, Asp, Arg, hArg,
hLys, His, o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Thr, Ser, Hse, Val, Ile Leu,
Phe, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Pro, Tyr, Hse, Ser, Thr, o
Hyp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Cys, Asp, Phe, Ile, Lys, Ser,
Thr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys, Asp, Ser, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Asn, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Leu Thr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Ala, Ser, o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys, Lys, o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Val, Leu, o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Thr
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly, His, o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, Gln, o hArg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
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<223> Leu, Trp, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Phe, Asn, Gln, Ser, o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Lys, Gln, o
Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Phe, Leu, Ser, o
Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Hie, Gln, Ser, o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, hArg, Cit, o Orn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Ser, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Gln, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr, Asn, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Met, Val, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (24)
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<223> Pro o Arg
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<222> (27)
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<223> Ala o Thr
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)
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<223> Phe, Pro, o Tyr
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
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<210> 36
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Cys, Phe, Ile, Lys, Ser, o no
presente
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (2)
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<223> Cys, Asp, o Ser
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<222> (3)
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<223> Ala, Asp, o Asn
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<220>
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<222> (4)
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<223> Ala, Leu, o Thr
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<221> MOD_RES
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<222> (5)
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<223> Ala o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cys o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly, His, o Gln
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, o hArg
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Phe, Asn, Ser, o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Gln, o
Arg
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Glu, Phe, Leu, Ser, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Ser, o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Arg, hArg, Cit, o Orn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Met, Val, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pro o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glu, Gly, Lys, o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Pro, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Cys, Asp, Phe, Lys, Thr, o no
presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Cys, Asp, Ser, o no
presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Asn, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Leu Thr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Ser, Thr, o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Cys, o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Leu, Met, o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gly, His, o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys, Gln, o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Leu, Trp, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asn, Gln, Ser, o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Gln, o
Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Asp, Glu, Phe, Leu, Ser, o
Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Gln, Ser, o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, Ser, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (20)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> His, Lys, Gln, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gln, Thr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Leu, o Tyr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (24)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pro o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Thr o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glu, Lys, o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (32)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe, Tyr, o no presente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211>32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Isocaproil-Ser
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<221> MOD_RES
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<222> (7)
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<223> Agy
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<222> (1)
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<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Agy
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<211> 27
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (1)
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<223> Isocaproil-Ser
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
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<222> (6)
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<220>
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<222> (7)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (1)
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<223> Isocaproil-Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
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<220>
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<222> (7)
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<222> (13)
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<223> Aib
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (14)
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\hskip1cm
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<223> Lys(For)
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Thr
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<400> 68
\hskip1cm
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<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)
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<223> dAh
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<400> 69
\hskip1cm
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<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ac-Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Lys(PEG5000)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
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<400> 78
\hskip1cm
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<210> 79
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (6)
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (6)
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<223> Ahp
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<400> 80
\hskip1cm
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\newpage
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (6)
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<223> Thr(OPO3H2)
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\hskip1cm
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<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
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<221> MOD_RES
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (18)
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<223> Orn
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (11)
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<223> Cit
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (18)
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<223> Cit
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (11)
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<223> homoK
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> homoK
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (1)
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<223> L-Octilglicina
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (1)
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<223>
N-3,6-dioxaoctarioil-Cys
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 9Anc
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> L-octilglicina
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
N-isocaproil-Lys
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> homoR
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> homoR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cit
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<400> 96
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
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<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Orn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1-Octilglicina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Isocaproil-Cys
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cit
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (33)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 4ABU
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Isocaproil-Lys
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<220>
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<221> MOD_RES
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<212> PRT
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 136
\hskip1cm
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Secuencia de aminoácidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 137
\hskip1cm
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<210> 138
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<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> MOD RES
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<222> (1)
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<223> Aminoácido variable; véase la
memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción
detallada de sustituciones y formas de realización preferidas
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (2)
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<223> Aminoácido variable o no
presente
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (3)
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<223> Ala, Gly, Ser, Asp, o no
presente
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
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<222> (4)
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<223> Asn, Ala, Asp, Gly, o no
presente
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Leu, Thr, o Ser
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (6)
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<223> Ala, Ser, o Thr
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ala, Ser, Val, Hse, Ahb, Ahp,
D-thr, Thr, o un derivado del mismo
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> MOD_RES
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<222> (8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Aminoácido variable; véase la
memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción
detallada de sustituciones y formas de realización preferidas
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<400> 138
\hskip1cm
Claims (5)
1. Péptido de la familia amilina, en el que el
péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de
SEC ID nº: 137 que incluye una sustitución, inserción o supresión de
aminoácidos, en el que el péptido reduce la ingesta de
alimentos.
2. Péptido según la reivindicación 1, en el que
el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 43.
3. Uso de un péptido según la reivindicación 1 ó
2 para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de trastornos alimentarios, resistencia a insulina,
obesidad, hiperglucemia postprandial anormal, diabetes de cualquier
tipo, incluyendo Tipo I, Tipo II y diabetes gravídica, síndrome
metabólico, síndrome de evacuación gástrica rápida, hipertensión,
dislipidemia, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, apnea del
sueño, cáncer, hipertensión pulmonar, colecistitis, y
osteoartritis.
4. Uso según la reivindicación 3, en el que la
composición farmacéutica es para el tratamiento de obesidad.
5. Péptido según la reivindicación 1 ó 2 para
uso como un medicamento.
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