ES2345113T3

ES2345113T3 - Peptidos de la familia amilina y metodos para su obtencion y utilizacion.

Info

Publication number: ES2345113T3
Application number: ES05723040T
Authority: ES
Inventors: Christopher J. Soares; Michael R. Hanley; Diana Yvonne Lewis; David Geoffrey Parkes; Carolyn Marie Jodka; Kathryn S. Prickett; Soumitra Ghosh; Christine Marie Mack; Qing Lin
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2004-02-11
Filing date: 2005-02-11
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2025-02-11
Also published as: EP1716172A1; KR20070008589A; JP2008500281A; ATE471340T1; WO2006083254A1; IL202795A0; AU2005320351A8; NZ549332A; CA2556226A1; IL177230A0; KR101196122B1; AU2010212468A1; RU2006132293A; RU2385878C2; NZ571824A; DE602005021858D1; US8598120B2; EP2233497A2; US8114958B2; EP1716172B1

Abstract

Péptido de la familia amilina, en el que el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de SEC ID nº: 137 que incluye una sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, en el que el péptido reduce la ingesta de alimentos.

Description

Péptidos de la familia amilina y métodos para su obtención y utilización.

Campo técnico

La presente invención se refiere a nuevos compuestos y métodos para su obtención y utilización. Estos compuestos pueden ser útiles para tratar o prevenir afecciones tales como trastornos metabólicos, trastornos vasculares, trastornos renales, y/o trastornos gastrointestinales. Una afección ejemplar puede ser aquella en la que es valiosa la reducción de la ingesta alimentaria o ingesta calórica, por ejemplo, obesidad, diabetes Tipo II, trastornos de la alimentación, síndrome metabólico y síndrome de resistencia a insulina.

Antecedentes

Se ha llevado a cabo mucho trabajo hasta la fecha sobre amilina, calcitonina, y péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP), para comprender su estructura y función. La Tabla 1 proporciona un resumen de algunos efectos biológicos de CGRP, calcitonina y amilina según se publica en Wimalawansa, S.J. (1997) Critical Reviews in Neurobiology, 11; 167-239.

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TABLA 1

1

Se ha dado a conocer que la amilina regula el vaciamiento gástrico y suprime la secreción de glucagón y la ingesta de alimentos, regulando así la velocidad de aparición de la glucosa en la circulación. Parece que complementa las acciones de la insulina, que regula la velocidad de desaparición de la glucosa de la circulación y su captación por tejidos periféricos. Estas acciones están apoyadas por hallazgos experimentales en roedores y seres humanos, que indican que la anilina complementa los efectos de insulina en el control de la glucosa postprandial mediante por lo menos tres mecanismos independientes, todos los cuales afectan a la velocidad de aparición de la glucosa. En primer lugar, la amilina suprime la secreción de glucagón postprandial, en comparación con adultos sanos, los pacientes con diabetes tipo 1 no tienen amilina en circulación, y los pacientes con diabetes tipo 2 tienen concentraciones reducidas de amilina postprandial. Además, la infusión de un anticuerpo monoclonal específico para amilina, que se une a la amilina en circulación, dio nuevamente como resultado concentraciones enormemente elevadas de glucagón con relación a los controles. Estos resultados señalan un papel fisiológico de amilina endógena en la regulación de la secreción de glucagón postprandial. En segundo lugar, la amilina ralentiza la movilidad gastrointestinal y el vaciamiento gástrico. Finalmente, se demostró que inyecciones intrahipotalámicas de amilina de rata reducen la alimentación en ratas y alteran el metabolismo de neurotransmisores en el hipotálamo. En ciertos estudios, la ingesta de alimentos se redujo significativamente durante hasta ocho horas tras la inyección intrahipotalámica de amilina de rata y CGRP de rata. En ensayos con humanos, se ha demostrado que un análogo de amilina, pramlintida, reduce el peso o la ganancia de peso. La amilina puede ser beneficiosa tratando afecciones metabólicas tales como diabetes y obesidad. La amilina también se puede usar para tratar dolor, trastornos óseos, gastritis, para modular lípidos, en particular triglicéridos, o para afectar a la composición corporal tal como la pérdida preferente de grasa y racionamiento de tejido magro.

La hormona calcitonina (CT) se denominó por su secreción en respuesta a hipercalcemia inducida y su rápido efecto hipocalcémico. Es producida en y segregada a partir de células neuroendocrinas en el tiroide, que desde entonces se ha denominado células C. La acción mejor estudiada de CT(1-32) es su efecto sobre el osteoclasto. Los efectos in vitro de CT incluyen la pérdida rápida de bordes desordenados y la liberación reducida de enzimas lisosómicas. Finalmente, la inhibición de las funciones del osteoclasto mediante CT da como resultado una disminución en la resorción ósea. Sin embargo, parece que ni una reducción crónica de CT sérica en el caso de tiroidectomía ni la CT sérica aumentada encontrada en el cáncer de tiroides medular están asociadas con cambios en el calcio sérico o masa ósea. De este modo, es muy probable que una función principal de CT(1-32) sea combatir la hipercalcemia aguda en situaciones de emergencia y/o proteger el esqueleto durante períodos de "estrés cálcico" tales como crecimiento, embarazo y lactancia (repasado en Becker, JCEM, 89(4): 1512-1525 (2004) y Sexton, Current Medicinal Chemistry 6: 1067- 093 (1999)). Consistente con esto están los datos recientes procedentes del ratón al que se le ha suprimido el gen de calcitonina, que elimina tanto la calcitonina como los péptidos de CGRP-I, que revelaron que el ratón tuvo niveles normales de valores relacionados con calcio basal, pero una respuesta calcémica incrementada (Kurihara H, et al, Hypertens Res., febrero de 2003; 26 Supl: S 105-8).

CT tiene un efecto sobre los niveles de calcio plasmático, e inhibe la función de osteoclastos y se usa ampliamente para el tratamiento de osteoporosis. Terapéuticamente, parece que la CT de salmón incrementa la densidad ósea y disminuye las tasas de fractura, con efectos adversos mínimos. CT también se ha usado con éxito durante los últimos 25 años como una terapia para la enfermedad ósea de Paget, que es un trastorno esquelético crónico que puede dar como resultado huesos alargados o deformados en una o más regiones del esqueleto. CT también se usa ampliamente por su efecto analgésico sobre dolor óseo experimentado durante la osteoporosis, aunque el mecanismo para este efecto no está claramente entendido.

El péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) es un neuropéptido cuyos receptores están ampliamente distribuidos en el cuerpo, incluyendo el sistema nervioso y el sistema cardiovascular. Parece que este péptido modula la neurotransmisión sensorial, y es uno de los péptidos vasodilatadores endógenos más potentes descubierto hasta la fecha. Los efectos biológicos dados a conocer para CGRP incluyen: modulación de la sustancia P en inflamación, actividad del receptor nicotínico en la unión neuromuscular, estimulación de la secreción de enzimas pancreáticas, una reducción de la secreción de ácidos gástricos, vasodilatación periférica, aceleración cardíaca, neuromodulación, regulación del metabolismo de calcio, estimulación osteogénica, secreción de insulina, un incremento en la temperatura corporal, y una disminución en la ingesta de alimentos (Wimalawansa, Amylin, calcitonin gene-related peptide, calcitonin and ADM: a peptide superfamily. Crit Rev Neurobiol. 1997; 11(2-3): 167-239). Un papel importante de CGRP es controlar el flujo sanguíneo a diversos órganos mediante sus potentes acciones vasodilatadoras, como se evidencia por un incremento de la presión arterial media tras la administración intravenosa de CGRP. Las acciones vasodilatadoras están también apoyadas por análisis recientes de ratones homocigóticos a los que se les ha suprimido CGRP, que demostraron una elevada resistencia vascular periférica y una elevada tensión arterial provocada por un incremento de la actividad simpática periférica ((Kurihara H, et al, Targeted disruption of ADM and alphaCG RP genes reveals their distinct biological roles. Hypertens Res. febrero de 2003; 26 SuppliS 105-8). De este modo, parece que CGRP provoca efectos vasodilatadores, efectos hipotensivos, y un incremento en la frecuencia cardíaca, entre otras acciones.

La infusión prolongada de CGRP en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva ha demostrado un efecto beneficioso sostenido sobre funciones hemodinámicas sin efectos adversos, sugiriendo un uso en insuficiencia cardíaca. Otras indicaciones de uso de CGRP incluyen insuficiencia renal, isquemia de la arteria coronaria crónica, tratamiento de arritmia cardíaca, otra enfermedad vascular periférica tal como el fenómeno de Raynaud, hemorragia subaracnoidea, hipertensión, e hipertensión pulmonar. También se puede tratar potencialmente la eclampsia de embarazo y parto prematuro (Wimalawansa, 1997). Usos terapéuticos recientes incluyen el uso de antagonistas de CGRP para el tratamiento de migrañas.

Hay muchas propiedades beneficiosas de cada péptido que se pueden usar solas o en combinación para tratar o prevenir una variedad de afecciones. Sería útil crear péptidos nuevos y útiles que tengan múltiples acciones que proporcionen características mejoradas no poseídas por los péptidos existentes. Por ejemplo, en ensayos de ingesta de alimentos, se ha demostrado que la amilina tiene un comienzo rápido, en 30 minutos, pero su efecto disminuye después de 60 minutos.

Por el contrario, se ha demostrado que la calcitonina de salmón tiene un efecto retrasado, con niveles pico mantenidos todavía a los 240 minutos. Los nuevos compuestos que pueden imitar los efectos de amilina y/o calcitonina y que tienen un rápido comienzo de actividad como amilina con la actividad sostenida de calcitonina pueden incrementar la potencia y eficacia de cualquier compuesto solo.

Además, la combinación de ciertas características fisicoquímicas de amilina, calcitonina, y/o CGRP en una sola modalidad puede facilitar la intervención en diferentes puntos en un circuito metabólico disfuncional. Estos nuevos compuestos combinan actividades o propiedades deseables para una terapéutica superior, lo que puede dar como resultado compuestos que tengan por lo menos una característica deseable tal como mayor eficacia, mayor potencia, mayor biodisponibilidad, menores efectos secundarios, facilidad en la fabricación, estabilidad, y/o solubilidad.

Sumario

La presente invención se refiere, por lo menos en parte, a nuevos péptidos de la familia amilina, en los que el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de SEC ID nº: 137 incluyendo una sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, en los que el péptido reduce la ingesta de alimentos. En un aspecto general, estos nuevos compuestos (también denominados como compuestos de la invención) tienen por lo menos una región de bucle de amilina o calcitonina y sus análogos; una región hélice \alpha de por lo menos una porción de una región hélice \alpha de calcitonina o sus análogos o una región hélice \alpha que tiene una porción de una región hélice \alpha de amilina y una región hélice \alpha de calcitonina; o sus análogos respectivos; y una cola C-terminal de amilina o calcitonina o sus análogos, con la condición de que la cola C-terminal de calcitonina o un análogo de calcitonina no sea prolina (Pro), hidroxiprolina (Hyp), homoserina (Hse) o derivados de Hse.

Como se usa aquí, un "análogo" se refiere a un péptido cuya secuencia derivó de la de un péptido de referencia base, por ejemplo, amilina y calcitonina, e incluye inserciones, sustituciones, extensiones, y/o supresiones de la secuencia de aminoácidos de referencia, que tiene preferentemente por lo menos 50 ó 55% de identidad de secuencias de aminoácidos con el péptido base, más preferentemente que tiene por lo menos 70%, 80%, 90%, o 95% de identidad de secuencias de aminoácidos con el péptido base. En una realización, tales análogos pueden comprender sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos (incluyendo aminoácidos no naturales y formas L y D). Los análogos incluyen compuestos que tienen actividad agonista y compuestos que tienen actividad antagonista. Los análogos, como se definen aquí, también incluyen derivados.

Un "derivado" se define como péptido de referencia o análogos, descritos anteriormente, que tienen una modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácidos, átomos de carbono en \alpha, grupo amino terminal, o grupo ácido carboxílico terminal. Una modificación química incluye, pero no se limita a, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces, y eliminar restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de los aminoácidos incluyen, sin limitación, acilación de grupos \varepsilon-amino de lisina, N-alquilación de arginina, histidina, o lisina, alquilación de grupos de ácidos carboxílicos de ácido glutámico o ácido aspártico, y desaminación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del amino terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones de desaminación, N-alquilo inferior, N-dialquilo inferior, y N-acilo. Las modificaciones del amino terminal incluyen, sin limitación, la desaminación, modificaciones de N-alquilo inferior, N-dialquilo inferior, y N-acilo, tales como alquilacilos, alquilacilos ramificados, alquilarilacilos. Las modificaciones del grupo carboxi terminal incluyen, sin limitación, las modificaciones amídicas, de alquilamida inferior, de dialquilamida, arilamida, alquilarilamida y éster de alquilo inferior. Alquilo inferior es alquilo de C1-C4. Además, uno o más grupos laterales, o grupos terminales, se pueden proteger mediante grupos protectores conocidos por el químico sintético experto normalmente. El carbono en \alpha de un aminoácido puede estar mono- o
dimetilado.

Se describen compuestos que tienen una región de bucle de amilina o análogo de amilina, por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de amilina o análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una región de bucle de calcitonina o análogo de calcitonina, por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de amilina o análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una región de bucle de amilina o análogo de amilina, por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de amilina o análogo de amilina y por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de amilina o análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una región de bucle de calcitonina o análogo de calcitonina, por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de amilina o análogo de amilina y por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de amilina o análogo de amilina. Se describen compuestos que tienen una región de bucle de amilina o análogo de amilina, una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina o por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de amilina o análogo de amilina y por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina, y una cola C-terminal de calcitonina o análogo de calcitonina.

La región de bucle de los nuevos compuestos puede comprender además no más de una modificación, incluyendo sustituciones, inserciones, o supresiones del bucle de amilina o calcitonina, y sus análogos. Se contempla además que los nuevos compuestos pueden tener modificaciones adicionales en la porción N-terminal del bucle que comprende una región N-cobertura, que puede tener características hidrófobas o hidrófilas tales como acetilo, isocaproílo, ácido 3,6-dioxioctanoico, o ácido 1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminsuccinímico. Las modificaciones pueden incluir además un aminoácido adicional. Esta es un área que permite muchas modificaciones muy numerosas de mencionar, pero se entenderá por el experto en la materia basándose en lo que se ejemplifica posteriormente en la presente solicitud.

En general, con respecto a la secuencia de aminoácidos, el término "modificación" incluye sustituciones, inserciones, alargamientos, supresiones y derivatizaciones, solas o en combinación. Los nuevos compuestos de la invención pueden incluir una modificación de un resto de aminoácido "no esencial". En el contexto de la invención, un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar, es decir, suprimir o sustituir, en la nueva secuencia de aminoácidos sin suprimir o sustancialmente reducir la actividad agonista del polipéptido análogo.

Las sustituciones incluyen sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es aquella en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar, o características fisicoquímicas similares (por ejemplo, características electrostáticas, de enlace de hidrógeno, isostérica, hidrófoba). Los aminoácidos pueden ser de origen natural, o no naturales (innaturales). En la técnica se conocen familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, metionina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano), cadenas laterales \beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Las sustituciones también pueden incluir cambios no conservativos.

Los compuestos de la invención también se pueden derivatizar adicionalmente mediante alteraciones químicas tales como amidación, glucosilación, acilación, sulfatación, fosforilación, acetilación, y ciclación. Tales alteraciones químicas se pueden obtener a través de metodologías químicas o bioquímicas, así como a través de procesos in vivo, o cualquier combinación de los mismos. Los derivados de los compuestos de la invención también pueden incluir conjugación a uno o más polímeros o sustituyentes de moléculas pequeñas. Un tipo de conjugación polimérica es la unión o enlazamiento de polímeros de polietilenglicol ("PEG"), poliaminoácidos (por ejemplo, poly-his, poly-arg, poly-lys, etc.) y/o cadenas de ácidos grasos de diversas longitudes a los términos N o C o cadenas laterales de restos de aminoácidos de un análogo de AFT-6. Los sustituyentes de pequeñas moléculas incluyen alquilos cortos y alquilos restringidos (por ejemplo, ramificados, cíclicos, condensados, adamantilo), y grupos aromáticos. Además, los restos básicos tales como R y K se pueden sustituir por homoR y homoK, citrulina, u ornitina, para mejorar la estabilidad metabólica del péptido. Los compuestos de la invención también incluyen formas ácidas así como formas amídicas de los péptidos.

Se describe que la región de hélice \alpha de los nuevos compuestos puede comprender por lo menos cuatro aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina. La región de hélice \alpha puede comprender por lo menos 5, 6, 7 u 8 aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina. La región de hélice \alpha puede comprender por lo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina. Cuando el número de aminoácidos consecutivos es menor que 8, se contempla que la región de hélice \alpha comprenda además por lo menos 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, o más aminoácidos consecutivos de una región de hélice \alpha de amilina o análogo de amilina. Se prevé que cuantos menos aminoácidos de calcitonina o análogo de calcitonina, mayor número de aminoácidos de amilina o análogo de amilina se pueden encontrar en la región de hélice \alpha de los nuevos compuestos. El número de aminoácidos que comprende la región de hélice \alpha puede ser de aproximadamante 10 a 23 aminoácidos. En consecuencia, la región de hélice \alpha puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, ó 23 aminoácidos. Además, los aminoácidos deberían proporcionar aproximadamante tres hasta aproximadamante seis vueltas de la hélice alfa. Se contempla además que la región de hélice \alpha de los nuevos compuestos puede comprender además no más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o 10 modificaciones, incluyendo sustituciones, inserciones, o supresiones de la región de hélice \alpha de calcitonina y/o amilina, y sus análogos.

Se describe que la cola C-terminal de los nuevos compuestos puede comprender por lo menos seis, cinco, o cuatro aminoácidos de amilina o calcitonina, y sus análogos. La cola C-terminal de los nuevos compuestos puede comprender por lo menos una porción del extremo C-terminal que tiene una vuelta \alpha \beta. La vuelta \beta se puede introducir mediante la combinación de aminoácidos de Gly-Ser. En consecuencia, los nuevos compuestos pueden tener un extremo C-terminal que comprende una porción de una cola C-terminal de amilina o calcitonina (y sus análogos) que tiene Gly-Ser o que comienza en Gly-Ser.

La cola C-terminal de los nuevos compuestos puede comprender además no más de uno, dos, o tres modificaciones, incluyendo sustituciones, inserciones o supresiones del bucle de amilina o calcitonina, y sus análogos. Se contempla además que los nuevos compuestos pueden tener modificaciones adicionales en la porción C-terminal de la cola C-terminal que puede incluir L-octilglicina, 4ABU (ácido 4-aminobutírico), 9Anc (ácido 9-aminononanoico), ácido 3,6-dioxioctanoico o ácido 1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminsuccinímico. La modificación puede incluir además uno, aminoácidos adicionales. Los tipos de modificación contemplados en esta área serán comprendidos por el experto en la materia basándose en lo que se ejemplifica adicionalmente en la presente solicitud.

En un aspecto, una región de bucle se define como aquella región encontrada en el extremo N-terminal que comprende por lo menos 5 a 8 aminoácidos, en la que el primer y el último aminoácidos son capaces de crear un enlace, por ejemplo restos en posiciones 2-7 de amilina o restos en posiciones 1-7 de calcitonina y sus regiones correspondientes en sus análogos respectivos. En otro aspecto, una región de hélice \alpha se define como la porción interna de amilina o calcitonina flanqueada por la región de bucle y la cola C-terminal que forma estructuralmente una hélice \alpha, por ejemplo restos en las posiciones 8-23 de amilina o restos en las posiciones 8-27 de calcitonina y sus regiones correspondientes en sus análogos respectivos. En todavía otro aspecto, una cola C-terminal se define como aquella región después de la hélice \alpha, por ejemplo restos en las posiciones 33-37 de amilina o más lejos, tales como restos en las posiciones 27-37 o restos en las posiciones 27 ó 28 a 32 de calcitonina. Se incluyen en los compuestos de la invención tanto las formas de amida como de ácido de los compuestos descritos.

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Amilina y calcitonina, como se define aquí, incluye todas las especies nativas y variaciones. Los ejemplos de amilina y calcitonina incluyen, pero no se limitan a:

amilina humana (hAmilina)	KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY	(SEC ID nº 1)

amilina de rata (rAmilina)	KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY	(SEC ID nº 2)

calcitonina de salmón (sCT)	CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP	(SEC ID nº 3)

calcitonina humana (hCT)	CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP	(SEC ID nº 4).

Por "aminoácido" y "resto de aminoácido" se quiere decir aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, y aminoácidos modificados. Excepto que se señale de otro modo, cualquier referencia a un aminoácido, general o específicamente por el nombre, incluye la referencia tanto a los estereoisómeros D como L si su estructura permite tales formas estereoisómeras. Los aminoácidos naturales incluyen alanina (Ala), arginina (Arg), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), cisteína (Cys), glutamina (Gln), ácido glutámico (Glu), glicina (Gly), histidina (His), isoleucina (Ile), leucina (Leu), Lisina (Lys), metionina (Met), fenilalanina (Phe), prolina (Pro), serina (Ser), treonina (Thr); triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y valina (Val). Los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido acetidincarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, terc-butilglicina, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico y tioprolina. Los aminoácidos no naturales adicionales incluyen restos de aminoácidos modificados que están químicamente bloqueados, reversible o irreversiblemente, o químicamente modificados en su grupo amino N-terminal o sus grupos de cadena lateral, como por ejemplo aminoácidos D y L N-metilados o restos en los que los grupos funcionales de cadena lateral están químicamente modificados por otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoácidos modificados incluyen sulfóxido de metionina; metionina sulfona; éster beta-metílico de ácido aspártico, un aminoácido modificado de ácido aspártico; N-etilglicina, un aminoácido modificado de glicina; o alanincarboxamida, un aminoácido modificado de alanina. Los restos adicionales que se pueden incorporar se describen en Sandberg et al., J. Med. Chem. 41: 2481-91, 1998. Como se señala previamente, se contempla además que se puede realizar en la región de bucle no más de una modificación, tal como sustitución, inserción, supresión y/o derivatización.

La región de bucle de los nuevos compuestos puede comprender además modificaciones o aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal. Tales modificaciones incluyen la adición de compuestos tales como Lys, Ala, Phe, Ile, Ser, octilglicina, isocap, ácido Fmoc-3,6-dioxaoctanoico, ácido Fmoc-1-amino-4,7,10-trioxa-13-tridecanaminsuccinímico, acetilo, y/o grupos para solubilidad, suministro, señalización. Bucles modificados ejemplares incluyen la adición de Lys a la secuencia de Xaa1 o la adición de Ile a la secuencia de Xaa1.

En toda la solicitud, las secuencias de aminoácidos se pueden referir como aminoácidos en la posición a a la posición b adyacente a un péptido de referencia. En la presente solicitud, el péptido de referencia es amilina y calcitonina, cuyas secuencias se proporcionan en SEC ID nºS:1-4. Por ejemplo, 1-7 hAmilina se refiere a la secuencia de aminoácidos desde la posición 1 a la posición 7, inclusive, de amilina humana (SEC ID nº:1). La modificación al péptido de referencia se puede mostrar como: posición de modificación adyacente a la modificación. Por ejemplo, (2Asp 7Lys) 1-7 hAmilina representa la secuencia de aminoácidos en posiciones 1 a 7 de amilina humana con una modificación de una Cys por Asp en la posición 2 y una modificación de Cys por Lys en la posición 7.

La región de hélice \alpha del nuevo compuesto puede tener una longitud de aproximadamante 8 a 23 aminoácidos. En ciertas formas de realización, la región de hélice \alpha es anfipática. La región de hélice \alpha puede comprender aproximadamante 3 a 6 vueltas helicoidales. La región de hélice \alpha puede comprender 3, 4, 5 ó 6 vueltas helicoidales. La región de hélice \alpha puede ser una estructura rígida equivalente a aproximadamante 3, 4, 5 ó 6 vueltas helicoidales. Un ejemplo de una hélice idealizada es LLQQLQKLLQKLKQY (SEC ID nº:28). En ciertas formas de realización, la hélice \alpha es una estructura anfipática. En consecuencia, se pueden seleccionar características de aminoácidos deseables que podrían proporcionar este tipo de estructura.

Se ha encontrado que la región de hélice \alpha de calcitonina, una combinación de una región de hélice \alpha de amilina y una calcitonina, o sus partes, y/o algunos elementos de CGRP son deseables en la región de hélice \alpha de los nuevos compuestos. Se contempla que, al igual que con la región del bucle, la región de hélice \alpha puede ser a partir de cualquier amilina o calcitonina, y sus análogos. En consecuencia, en ciertas formas de realización, la región de hélice \alpha es por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina. La región de hélice \alpha puede ser por lo menos una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina y por lo menos una porción de una hélice \alpha de una amilina o análogo de amilina. La región de hélice \alpha de los nuevos compuestos puede contener elementos de CGRP. Se contempla además que los nuevos compuestos pueden tener no más de una modificación, tales como sustituciones, inserciones, supresiones, y/o derivatizaciones.

La región de hélice \alpha de la invención puede comprender aminoácidos desde la posición 8 de sCT hasta la posición 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ó 27 de sCT. Además, la región de hélice \alpha puede comprender más de una porción de una región de hélice \alpha de calcitonina o análogo de calcitonina de la misma especie o de diferente especie, por ejemplo 8-21 sCT 19-27 sCT; 8-21 sCT 18-27 sCT; u 8-16 hCT 17-27 sCT; o (11Arg) 8-16 hCT (18are) 17-27 sCT. Como alternativa o adicionalmente, la hélice \alpha descrita anteriormente de 8-18 sCT a 8-27 sCT puede comprender además las sustituciones de uno o más de (10Aib), (11art), (110m), (11hArg), (11Cit), (11hLys), (11Lys(for)), (17Aib), (18Arg), (18Om), (18hArg), (18Cit), (18hLys), (18Lys(for)), (18Lys(PEG5000)), (22Leu), (24Pro) o cualquier combinación de los mismos.

Se describen compuestos que incluyen:

SEC ID nº 40: KCNTATCVLGKLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY

SEC ID nº 41: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPRTNTGSNTY

SEC ID nº 42: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPPTNTGSNTY

SEC ID nº 43: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNVGSNTY

SEC ID nº 44: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTLPPTNVGSNTY

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SEC ID nº 136: CSNLSTCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY

SEC ID nº 137: KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY

En todavía otro aspecto, se describen fragmentos biológicamente activos de SEC ID nºS:40 a 137. Los fragmentos biológicamente activos pueden comprender supresiones de 1 aminoácido. En ciertas formas de realización, las secuencias de aminoácidos comprenden por lo menos una modificación, tal como sustituciones, inserciones, supresiones, y/o derivatizaciones.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención pueden actuar como un agonista para por lo menos un efecto biológico de calcitonina, amilina y/o CGRP aquí descritos, o se pueden unir a por lo menos uno de los receptores de amilina, calcitonina, o CGRP.

En todavía otro aspecto general, los compuestos de la invención pueden ser útiles para reducir la ingesta de alimentos, reducir el apetito, inducir la saciedad, reducir la disponibilidad de los nutrientes, provocar pérdida de peso, afectar a la composición corporal, alterar el contenido de energía corporal o gasto de energía, mejorar el perfil lipídico (incluyendo reducir los niveles de colesterol LDL y triglicéridos y/o cambiar los niveles de colesterol HDL), ralentizar la movilidad gastrointestinal, retrasar el vaciamiento gástrico, moderar las excursiones de glucosa sanguínea postprandial, prevenir o inhibir la secreción de glucagón, y reducir la tensión arterial.

De este modo, en ciertas formas de realización, los métodos de la invención son útiles para tratar o prevenir afecciones o trastornos que se pueden aliviar reduciendo la disponibilidad de los nutrientes, que comprenden administrar a dicho sujeto una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención. Tales afecciones y trastornos incluyen, pero no se limitan a, trastornos alimentarios, resistencia a insulina, obesidad, hiperglucemia postprandial anormal, diabetes de cualquier tipo, incluyendo Tipo I, Tipo II y diabetes gravídica, síndrome metabólico, síndrome de evacuación gástrica rápida, hipertensión, dislipidemia, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, apnea del sueño, cáncer, hipertensión pulmonar, colecistitis, y osteoartritis.

Los ejemplos no limitantes de una afección o enfermedad cardiovascular son hipertensión, isquemia del miocardio, y reperfusión del miocardio. Los compuestos de la invención también pueden ser útiles para tratar o prevenir otras afecciones asociadas con obesidad, incluyendo apoplejía, cáncer (por ejemplo, cáncer endometrial, de mama, de próstata, y de colon), colecistopatía, apnea del sueño, fertilidad reducida, y osteoartritis (véase Lyznicki et al, Am. Fam. Phys. 63:2185, 2001). En otras formas de realización, los compuestos de la invención se pueden usar para alterar la composición corporal por razones estéticas, para potenciar las capacidades físicas, o para producir una fuente de carne más magra.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención se pueden usar para inhibir la secreción de grelina. En consecuencia, los compuestos de la invención pueden utilizar este mecanismo para tratar o prevenir trastornos relacionados con grelina, tales como síndrome de Prader-Willi, diabetes de todos los tipos y sus complicaciones, obesidad, hiperfagia, hiperlipidemia, y otros trastornos asociados con hipernutrición.

En otro aspecto general, ahora se reconoce que la amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, pueden ser útiles para tratar o prevenir el esófago de Barrett, la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) y afecciones asociadas con ella. Tales afecciones pueden incluir, pero no se limitan a, pirosis, pirosis acompañada de regurgitación de los contenidos gástricos/intestinal a la boca o los pulmones, dificultad para tragar, tos, sibilancia intermitente e inflamación de las cuerdas vocales (afecciones asociadas con GERD), erosión esofágica, úlcera esofágica, estenosis esofágica, metaplasia de Barrett (sustitución del epitelio esofágico normal por epitelio anormal), adenocarcinoma de Barrett, y aspiración pulmonar. La amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, tienen propiedades antisecretoras, tales como la inhibición de ácidos gástricos, la inhibición de ácidos biliares, y la inhibición de enzimas pancreáticas. Además, se ha encontrado que la amilina tiene un efecto gastroprotector. En consecuencia, estas propiedades de amilina, agonistas de amilina y compuestos de la invención pueden hacerlos particularmente útiles en el tratamiento o prevención de esófago de Barrett, y/o GERD y afecciones relacionadas o asociadas como se describe aquí.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención pueden ser útiles además para tratar o prevenir pancreatitis, carcinoma pancreático, y gastritis. Además, los compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento y prevención de pancreatitis en pacientes que han sufrido colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (ERCP). Además se ha descubierto que amilina y agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, pueden tener un efecto terapéutico sorprendentemente superior cuando se combinan con somatostatina. En consecuencia, en ciertas formas de realización, los métodos para tratar o prevenir pancreatitis comprenden administrar amilina, y agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, y administrar somatostatina y agonistas de somatostatina a un sujeto. En otras formas de realización, los métodos para tratar o prevenir pancreatitis comprenden administrar compuestos de la invención y administrar somatostatina y agonistas de somatostatina.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención también pueden ser útiles para disminuir la resorción ósea, disminuir el calcio plasmático, e inducir un efecto analgésico. En consecuencia, los compuestos de la invención pueden ser útiles para tratar trastorno óseo tal como osteopenia y osteoporosis. Todavía en otras formas de realización, los compuestos de la invención pueden ser útiles para tratar dolor y neuropatía dolorosa.

Todavía en otro aspecto general, los compuestos de la invención se pueden usar como parte de una terapia de combinación. En ciertas formas de realización, los compuestos de la invención se pueden usar con otros auxiliares de la dieta comercialmente disponibles u otros agentes contra la obesidad, tales como, a título de ejemplo, PYY y agonistas de PYY, GLP-1 y agonistas de GLP-1, un inhibidor de DPPIV, CCK y agonistas de CCK, exendina y agonistas de exendina, y leptina y agonistas de leptina. En otras formas de realización, los compuestos de la invención se pueden usar con otros analgésicos, supresores inmunitarios, u otros agentes antiinflamatorios.

Todavía en otro aspecto general, se describen nuevas composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención así como métodos para usarlos. En ciertas formas de realización, las composiciones farmacéuticas pueden comprender por lo menos 0,01% a 5% p/v. En ciertas formas de realización, el pH de la composición puede ser de aproximadamante 3,0 a aproximadamante 6,0. En ciertas formas de realización, el tampón puede ser acetato, fosfato, citrato, o glutamato. En ciertas formas de realización, la composición puede comprender un hidrato de carbono o un tonificador de tipo alcohol polihidroxilado. En ciertas formas de realización, la composición comprende además un conservante seleccionado del grupo que consiste en m-cresol, alcohol bencílico, parabenos y fenol. Todavía en otras formas de realización, la administración de los compuestos en una dosis en el intervalo de aproximadamante 0,05 mg/kg a aproximadamante 2 mg/kg. Por ejemplo, una dosis diaria puede ser 1 \mug a aproximadamante 5 mg por día. En ciertas formas de realización, los modos ejemplares de suministro pueden ser inyección, infusión, absorción (mucosal), e inhalación. Las vías de administración pueden ser intramuscular, intravenosa, subcutánea, transdérmica, transmucosal, oral, nasal, o mediante inhalación pulmonar.

También se contemplan nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos descrita aquí, vectores que contienen los nucleótidos, células hospedantes para propagar nucleótidos y/o expresar los polipéptidos codificados por los nucleótidos, anticuerpos dirigidos a los nuevos compuestos, y sus usos para cribar o detectar/diagnosticar una afección tal como las descritas aquí, en un sujeto.

Estos y otros aspectos se pondrán más claramente de manifiesto haciendo referencia a las siguientes formas de realización preferidas y descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una reducción dependiente de la dosis en el consumo de alimento en ratones que ayunaron toda la noche a dosis de un compuesto ejemplar de la invención (ensayo de ingesta de alimento).

La Figura 2A ilustra una ingesta calórica reducida en ratas engordadas (obesas inducidas por dieta, o DIO) con infusión periférica continua de un vehículo de compuestos ejemplares de la invención durante un período de dos semanas.

La Figura 2B ilustra una reducción en el peso corporal durante el período de tiempo correspondiente.

La Figura 3 representa los efectos sobre la composición corporal por un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 4A representa efectos sobre el vaciamiento gástrico mediante un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 4B representa el efecto de hipocalcemia por un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 5 representa efectos sobre los triglicéridos por un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 6A-6B representa el efecto sobre los triglicéridos a lo largo del tiempo por un compuesto ejemplar de la invención.

Las Figuras 7A-7E representan el efecto de la dosis sobre los triglicéridos a lo largo del tiempo por un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 8A representa el efecto sobre grelina por amilina.

Las Figuras 8B-8C representan el efecto sobre grelina por amilina.

La Figura 9A representa el efecto sobre un marcador de la función pancreática por un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 9B representa el efecto sobre un marcador de la función pancreática por un compuesto ejemplar de la invención.

La Figura 10A representa el efecto sobre la secreción de ácido gástrico por amilina.

La Figura 10B representa el efecto de la respuesta a la dosis sobre la secreción de ácido gástrico por amilina.

La Figura 11A representa el efecto gastroprotector de amilina.

La Figura 11B representa el efecto gastroprotector de amilina.

La Figura 11C representa la curva de dosis frente a respuesta de amilina.

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Descripción detallada

La presente invención se refiere a nuevos compuestos o agonistas de la familia amilina, en los que el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de SEC ID nº: 137 que incluye una sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, en los que el péptido reduce la ingesta de alimentos (también denominados como nuevos compuestos y compuestos de la invención). Estos nuevos compuestos pueden ser útiles para tratar o prevenir afecciones tales como trastornos metabólicos, trastornos vasculares, trastornos renales, y/o trastornos gastrointestinales. La sección previa proporciona la estructura de los compuestos. Los nuevos compuestos se pueden describir además por tener características deseables tales como actividad comparable y más elevada en el tratamiento y/o prevención de afecciones y trastornos metabólicos y aquellas citadas anteriormente, según se comparan con amilina, calcitonina, y/o CGRP. En otras formas de realización, los compuestos de la invención pueden no tener actividad comparable o más elevada, pero pueden tener una mayor estabilidad o solubilidad, menores efectos secundarios, combinación de actividades biológicas, comienzo más rápido de actividad, duración más prolongada de actividad, y/o facilidad en la fabricación, formulación, o uso que amilina, calcitonina o CGRP.

Mediante una actividad de amilina se quiere decir que un compuesto demuestra características fisiológicas similares a la amilina, tales como las descritas en la presente memoria descriptiva, por ejemplo reduciendo la ingesta de alimentos. Los compuestos de la presente invención pueden ser capaces de unirse a o interaccionar de otro modo directa o indirectamente con un receptor de amilina, u otro receptor o receptores con los cuales la propia amilina puede interaccionar para provocar una respuesta biológica, por ejemplo reduciendo la ingesta de alimentos.

Por una actividad de calcitonina se quiere decir que un compuesto demuestra características fisiológicas similares a calcitonina, tales como las descritas en la presente memoria descriptiva, por ejemplo inhibiendo la función de osteoclastos. Los compuestos de la presente invención pueden ser capaces de unirse a o interaccionar de otro modo directa o indirectamente con un receptor de CT, u otro receptor o receptores con los que la propia calcitonina puede interaccionar para provocar una respuesta biológica, por ejemplo inhibiendo la función de osteoclastos.

Por una actividad de CGRP se quiere decir que un compuesto demuestra características fisiológicas similares a CGRP, tales como las descritas en la presente memoria descriptiva, por ejemplo provocando un efecto vasodilatador. Los compuestos de la presente invención pueden ser capaces de unirse a o interaccionar de otro modo directa o indirectamente con un receptor de CGRP, u otro receptor o receptores con los cuales el propio CGRP pueda interactuar para provocar una respuesta biológica, por ejemplo provocando un efecto vasodilatador.

Los compuestos de la invención también pueden incluir fragmentos biológicamente activos de los péptidos más grandes descritos aquí que retienen actividad. Por lo tanto, los ejemplos de actividades deseables poseídas por los compuestos de la invención incluyen (1) tener actividad en un ensayo de ingesta de alimentos, vaciamiento gástrico, secreción pancreática, tensión arterial, frecuencia cardíaca o pérdida de peso, similar a amilina, calcitonina, o CGRP, y/o (2) unirse en un ensayo de unión al receptor para amilina, calcitonina, o CGRP. En el Ejemplo 1 se proporcionan algunos ensayos ejemplares.

Los compuestos de la invención pueden tener además un perfil de unión particular. Por ejemplo, se ha dado a conocer que las acciones biológicas de amilina, calcitonina, y CGRP están mediadas vía la unión a dos receptores acoplados a proteínas G tipo II estrechamente relacionados (GPCR), el receptor de calcitonina (CTR) y el receptor similar al receptor de calcitonina (CRLR). Estudios de clonación y funcionales han demostrado que CGRP y la amilina interaccionan con diferentes combinaciones de CTR o el CRLR y la proteína modificadora de la actividad del receptor (RAMP). Muchas células expresan múltiples RAMP. Se cree que la coexpresión de las RAMP y el CTR o CRLR es requerida para generar receptores funcionales para calcitonina, CGRP, y amilina. La familia RAMP comprende tres miembros RAMP1, -2 y -3), que comparten menos de 30% de identidad de secuencia, pero tienen una organización topológica común. La coexpresión de CRLR y RAMP1 conduce a la formación de un receptor para CGRP, como lo hace la coexpresión de CRKR y RAMP3. La coexpresión de hCTR2 y RAMP1 conduce a la formación de un receptor para amilina y CGRP. La coexpresión de hCTR2 y RAMP3 conduce a la formación de un receptor para
amilina.

En consecuencia, los compuestos de la invención para uso en los métodos de la presente invención pueden demostrar afinidad por receptores de amilina, CGRP, y calcitonina en la familia amilina. Los compuestos de la invención pueden mostrar una afinidad significativa por la unión al receptor de amilina, así como la capacidad para unirse a otros receptores tales como los receptores de calcitonina y CGRP. Los compuestos de la invención se pueden unir a un receptor de amilina con una afinidad mayor de 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, y más preferentemente con una afinidad mayor de 0,10 nM. Además, los compuestos de la presente invención también se pueden unir con afinidades similares a los receptores de calcitonina y CGRP, pero con una afinidad menor en el receptor de CGRP. En otras formas de realización, los compuestos de la invención se pueden unir a un receptor de calcitonina con una afinidad mayor de 20 nM, 10 nM, o 1 nM. En todavía otras formas de realización, los compuestos de la invención se pueden unir a un receptor de CGRP con una afinidad mayor de aproximadamante 1 \muM, 700 nM, o 500 nM. Los compuestos de la invención también se pueden unir a los tres receptores en grados variables. En consecuencia, se contempla que los compuestos de la invención pueden tener un perfil de unión con una afinidad de unión particular para cada receptor de los descritos aquí.

Los compuestos de la invención pueden retener por lo menos aproximadamante 25%, preferentemente aproximadamante 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% por ciento de la actividad biológica de amilina, calcitonina, CGRP o compuestos que tienen la secuencia de SEC ID nºS:40 a 137, o Compuestos 1-137 en el Ejemplo 3, con respecto a la reducción de la ingesta de alimentos o una de las otras actividades descritas aquí, por ejemplo, Tabla 1. En otra forma de realización, los compuestos de la invención muestran actividad biológica mejorada. Preferentemente, los nuevos compuestos presentan aproximadamante 110%, 125%, 130%, 140%, 150%, 200%, o más de la actividad biológica de amilina, calcitonina, CGRP o los compuestos que tienen la secuencia de SEC ID nºS:40 a 137, o Compuestos 1-137 en el Ejemplo 3, con respecto a la reducción de la ingesta de alimentos o una de las otras actividades descritas aquí, por ejemplo, Tabla 1. Por ejemplo, un compuesto deseable de la invención es aquel que tiene una actividad en uno de los ensayos descritos aquí (ingesta de alimento, ensayo de reducción del peso, vaciamiento gástrico, triglicéridos, pancreatitis, grelina, o calcio) que es mayor que la actividad de amilina, calcitonina, o CGRP en ese mismo ensayo.

A título únicamente ilustrativo, los compuestos deseables de la invención pueden demostrar una capacidad para reducir la ingesta de alimentos acumulativa más de 5% con respecto a la administración del vehículo, preferentemente más de 15%, más preferentemente más de 25%, incluso preferentemente más de 35% o 40%, lo más preferible más de 50% con respecto al vehículo.

En todavía otro aspecto general, los compuestos de la invención pueden ser útiles para reducir la ingesta de alimentos, reducir el apetito, inducir saciedad, reducir la disponibilidad de los nutrientes, provocar pérdida de peso, afectar a la composición corporal, alterar el contenido energético del organismo o gasto de energía, mejorar el perfil lipídico (incluyendo reducir los niveles de colesterol LDL y de triglicéridos y/o cambiar los niveles de colesterol HDL), ralentizar la movilidad gastrointestinal, retrasar el vaciamiento gástrico, moderar las excursiones de glucosa sanguínea postprandial, prevenir o inhibir la secreción de glucagón, y disminuir la tensión arterial. Los ensayos ejemplares para los efectos sobre la ingesta de alimentos, reducción del peso, vaciamiento gástrico, triglicéridos, y composición corporal se describen en por lo menos los Ejemplos 3, 4, 5, 6, y 7.

Los ejemplos no limitativos de una afección o enfermedad cardiovascular son hipertensión, isquemia del miocardio, y reperfusión del miocardio. Los compuestos de la invención también pueden ser útiles para tratar o prevenir otras afecciones asociadas con obesidad, incluyendo apoplejía, cáncer (por ejemplo, cáncer endometrial, de mama, de próstata, y de colon), colecistopatía, apnea del sueño, fertilidad reducida, y osteoartritis (véase Lyznicki et al, Am. Fam. Phys. 63:2185, 2001). En otras formas de realización, los compuestos de la invención se pueden usar para alterar la composición corporal por razones estéticas, para potenciar las capacidades físicas, o para producir una fuente de carne más magra.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención se pueden usar para inhibir la secreción de grelina. En consecuencia, los compuestos de la invención pueden utilizar este mecanismo para tratar o prevenir trastornos relacionados con grelina, tales como síndrome de Prader-Willi, diabetes de todos los tipos y sus complicaciones, obesidad, hiperfagia, hiperlipidemia, y otros trastornos asociados con hipernutrición. En el Ejemplo 8 se describe un ensayo ejemplar para los efectos sobre la grelina.

En otro aspecto general, ahora se reconoce que la amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, pueden ser útiles para tratar o prevenir el esófago de Barrett, la enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) y afecciones asociadas con ella. Tales afecciones pueden incluir, pero no se limitan a, pirosis, pirosis acompañada de regurgitación de los contenidos gástricos/intestinal a la boca o los pulmones, dificultad para tragar, tos, sibilancia intermitente e inflamación de las cuerdas vocales (afecciones asociadas con GERD), erosión esofágica, úlcera esofágica, estenosis esofágica, metaplasia de Barrett (sustitución del epitelio esofágico normal por epitelio anormal), adenocarcinoma de Barrett, y aspiración pulmonar. La amilina y los agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, tienen propiedades antisecretoras, tales como la inhibición de ácidos gástricos, la inhibición de ácidos biliares, y la inhibición de enzimas pancreáticas. En consecuencia, estas propiedades de amilina, agonistas de amilina y compuestos de la invención pueden hacerlos particularmente útiles en el tratamiento o prevención de esófago de Barrett, y/o GERD y afecciones relacionadas o asociadas como se describe aquí. En Los Ejemplos 10 y 11 se describen ensayos ejemplares que muestran los efectos sobre la secreción de ácido gástrico y el efecto gastroprotector.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención pueden ser útiles además para tratar o prevenir pancreatitis, carcinoma pancreático, y gastritis. Además, los compuestos de la invención pueden ser útiles en el tratamiento y prevención de pancreatitis en pacientes que han sufrido colangiopancreatografía retrógrada endoscópica (ERCP). Además se ha descubierto que amilina y agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, pueden tener un efecto terapéutico sorprendentemente superior cuando se combinan con somatostatina. En consecuencia, en ciertas formas de realización, los métodos para tratar o prevenir pancreatitis comprenden administrar amilina, y agonistas de amilina, incluyendo compuestos de la invención, y administrar somatostatina y agonistas de somatostatina a un sujeto. En otras formas de realización, los métodos para tratar o prevenir pancreatitis comprenden administrar compuestos de la invención y administrar somatostatina y agonistas de somatostatina. En el Ejemplo 9 se describe un ensayo ejemplar que muestra los efectos sobre la función pancreática.

En otro aspecto general, los compuestos de la invención también pueden ser útiles para disminuir la resorción ósea, disminuir el calcio plasmático, e inducir un efecto analgésico. En consecuencia, los compuestos de la invención pueden ser útiles para tratar trastorno óseo tal como osteopenia y osteoporosis. Todavía en otras formas de realización, los compuestos de la invención pueden ser útiles para tratar dolor y neuropatía dolorosa. En el Ejemplo 6 se proporciona un ensayo ejemplar que muestra los efectos sobre los niveles de calcio.

En los métodos de la presente invención, los polipéptidos se pueden administrar separadamente o juntos con uno o más compuestos diferentes y composiciones que muestran una acción a largo plazo o a corto plazo para reducir la disponibilidad de nutrientes, incluyendo, pero sin limitarse a, otros compuestos y composiciones que comprenden un agonista de amilina o de análogo de amilina, calcitonina de salmón, una colecistocinina (CKK) o agonista de CKK, una leptina (proteína OB) o agonista de leptina, una exendina o agonista de análogo de exendina, un GLP-1 o agonista de análogo de GLP-1, un inhibidor de DPPIV, un PYY o análogo de PYY, AFP-6 (intermedina) o agonista de AFP-6, urocortina o agonista de urocortina, o adrenomedulina o agonista de adrenomedulina. Los agonistas de amilina incluyen, por ejemplo, [25,28,29Pro-]-amilina humana (también conocida como "pramlintida", y se describe en las patentes U.S. n^{os} 5.686.511 y 5.998.367). La CKK usada es preferentemente el octopéptido de CKK (CKK-8). La leptina se explica en, por ejemplo, (Pelleymounter, Cullen et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas, Gajiwala et al., Science 269: 543-6 (1995); Campfield, Smith et al., Science 269: 546-549 (1995)). Las exendinas adecuadas incluyen exendina-3 y exendina-4, y los compuestos de agonistas de exendina incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones PCT WO 99/07404, WO 99/25727, y WO 99/25728. Los polipéptidos y análogos de PYY adecuados incluyen los descritos en la solicitud US nº: [números de caso 18528.662 y 18528.663].

Mientras que la "obesidad" se define generalmente como un índice de masa corporal de aproximadamante 30, para los fines de esta descripción, cualquier sujeto, incluyendo aquellos con un índice de masa corporal menor de 30, que necesite o desee reducir el peso corporal está incluido en el alcance de "obeso".

Preparación de compuestos de la invención

Los compuestos de la invención descritos aquí se pueden preparar usando técnicas recombinantes estándar o técnicas de síntesis peptídica química conocidas en la técnica, por ejemplo usando un sintetizador de péptidos automatizado o semiautomatizado, o ambas. Igualmente, los derivados de los polipéptidos de la invención se pueden producir usando metodologías químicas, bioquímicas, o in vivo estándar.

Los compuestos de la invención se pueden sintetizar en disolución o sobre un soporte sólido según técnicas convencionales. Existen comercialmente diversos sintetizadores automáticos, y se pueden usar según protocolos conocidos. Véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-7(1986); y Barany y Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York, 1-284 (1979). La síntesis peptídica en fase sólida se puede llevar a cabo con un sintetizador de péptidos automático (por ejemplo, Modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, California) usando el sistema NMP/HOBt (Opción 1) y química de tBoc o Fmoc (véase, Manual de Usuario de Applied Biosystems para el sintetizador peptídico ABI 430A, Versión 1.3B, 1 de julio de 1988, sección 6, p. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, California) con protección en los extremos. Los péptidos también se pueden ensamblar usando un Advanced ChemTech Synthesizer (Modelo MPS 350, Louisville, Kentucky). Los péptidos se pueden purificar mediante RP-HPLC (preparativa y analítica) usando, por ejemplo un sistema Waters Delta Prep 3000 y una columna preparativa C4, C8, o C18 (10 \mu, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, California). La proteína activa se puede sintetizar fácilmente y después se puede identificar en ensayos de identificación sistemática diseñados para identificar péptidos reactivos.

Además de la síntesis clásica de etapa por etapa, se ha desarrollado la síntesis peptídica en fase sólida convergente (también conocida como enfoque híbrido o como método de condensación de fragmentos) para la preparación de péptidos complejos y difíciles y pequeñas proteínas. Según este método, los fragmentos peptídicos adecuadamente protegidos que abarcan toda la secuencia peptídica y preparados en fase sólida se condensan, ya sea sobre soporte sólido o en disolución, al péptido diana. La disponibilidad de nuevas resinas y asas de resinas ha abierto la posibilidad de sintetizar rápidamente mediante técnica en fase sólida segmentos peptídicos completamente protegidos. El enfoque es particularmente atractivo para la fabricación de grandes moléculas, puesto que combina las ventajas tanto de los métodos en fase sólida como en fase de disolución. Los tiempos de los ciclos de producción son cortos, en comparación con las metodologías en fase de disolución, y los rendimientos y purezas son a menudo superiores. Adicionalmente, el aumento a mayor escala es mucho más fácil, y evita muchos de los problemas de agregación encontrados a menudo en la síntesis en fase sólida de péptidos largos.

En otra forma de realización, la estrategia sintética usa condensación de fragmentos convergente. La condensación de fragmentos convergente es un método superior para producir grandes péptidos de alta calidad con respecto a la síntesis en fase sólida estándar o en fase líquida estándar. Con tales métodos se puede sintetizar un fragmento en paralelo cortando en el momento para sintetizar así como para asegurar la calidad. A medida que los péptidos crecen con mayor tamaño, hay más riesgo de reacciones laterales y de síntesis incompleta. Se ha reconocido que las secuencias peptídicas de la invención pueden tener localizadas de forma ideal glicina y prolina que promueven un enfoque de fragmentos debido a que esos dos aminoácidos no son capaces de racemizarse durante el acoplamiento de los fragmentos y muestras velocidades de condensación muy eficaces. Además del hecho de que una síntesis en fase sólida directa presenta problemas importantes de aumento de escala y por lo tanto probablemente no es adecuada para la síntesis a gran escala, un enfoque con fragmentos es mucho más controlable y proporciona la oportunidad de purificar intermedios. El puente de disulfuro está localizado en el primer fragmento solo, y por lo tanto se puede formar en la etapa de fragmento con el precursor totalmente protegido. Puesto que este enfoque presenta un montón de ventajas en términos de estrategia y escala, acortará el tiempo de síntesis debido a que todos los fragmentos se pueden sintetizar simultáneamente. Esta es una gran herramienta para minimizar el riesgo y reducir costes. Los siguientes fragmentos se representan para mostrar una estructura esquelética de fragmentos deseables en los que permitirían la implementación de esta estrategia:

: Fragmento 1: Boc-X (Boc)-X-X (Trt)-X (tBu)-X-X(tBu)-X-X-X-Gly-OH

: Cíclico (la ciclación tendría lugar antes del acoplamiento de los fragmentos)

: Fragmento 2: Fmoc-K(Pbf)-X-X(tBu)-X(Trt)-X(OtBu)-X-X(Trt)-X(Pbf)-X-X(Trt)-X(tBu)-X(tBu)-Pro-OH

: Fragmento 3: Fmoc-X(Pbf)-X(tBu)-X(Trt)-X(tBu)-X-X(tBu)-X(Trt)-Thr(tBu)-OH

: Fragmento 4: H-Tyr(tBu)-NH_{2}

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Basándose en estas enseñanzas, sería comprensible para un experto en la materia qué compuestos de la invención serían ideales para tal síntesis. La tecnología de evolución puede hacer posible tener sólo tres fragmentos, es decir, no es necesario crear separadamente el 4º fragmento del 3º.

Los compuestos de la presente invención se pueden producir alternativamente mediante técnicas recombinantes bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor (1989). Estos polipéptidos producidos mediante tecnologías recombinantes se pueden expresar a partir de un polinucleótido. Estas secuencias polinucleotídicas pueden incorporar codones que facilitan la transcripción y traducción de ARNm en hospedantes microbianos. Tales secuencias de fabricación se pueden construir fácilmente según métodos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO 83/04053. Los polinucleótidos anteriores también pueden codificar opcionalmente un resto metionílico N-terminal. Los compuestos no peptídicos útiles en la presente invención se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos que contienen fosfato y los péptidos que contienen tales aminoácidos se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Bartlett y Landen, Bioorg. Chem. 14: 356-77 (1986).

Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión/hospedantes para contener y expresar la secuencia codificante de los nuevos compuestos. Aquellos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo, vaculovirus); sistemas de células vegetales transfectados con vectores de expresión víricos (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmido Ti o pBR322); o sistemas de células de animales. Las células de mamíferos que son útiles en las producciones de proteína recombinante incluyen pero no se limitan a células VERO, células HeLa, estirpes celulares de ovario de hámster chino (CHO), células COS (tales como COS-7), células WI 38, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MOCK, A549, PC12, K562 y 293. Más abajo se describen aquí protocolos ejemplares para la expresión recombinante de la proteína.

Como tales, las secuencias polinucleotídicas son útiles para generar nuevos y útiles vectores de ADN vírico y plasmídico, nuevas y útiles células hospedantes procariotas y eucariotas transformadas y transfectadas (incluyendo células bacterianas, de levaduras, y de mamíferos, que se hacen crecer en cultivo), y nuevos y útiles métodos para el crecimiento en cultivo de tales células hospedantes capaces de la expresión de los presentes polipéptidos. Las secuencias polinucleotídicas que codifican los nuevos compuestos aquí también pueden ser útiles para la terapia
génica.

Se describen procedimientos para la producción de ADN recombinante de los nuevos compuestos. Se describe un procedimiento para producir los péptidos a partir de una célula hospedante que contienen ácidos nucleicos que codifican los nuevos compuestos, que comprende: (a) cultivar dicha célula hospedante que contiene polinucleótidos que codifican tales polipéptidos en condiciones que facilitan la expresión de tal molécula de ADN; y (b) obtener los nuevos compuestos.

Las células hospedantes pueden ser procariotas o eucariotas, e incluyen bacterias, células de mamíferos (tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de monos, células de riñón de hámster recién nacido, células de cáncer u otras células), células de levaduras, y células de insectos.

Los sistemas de hospedantes mamíferos para la expresión de la proteína recombinante también son bien conocidos por los expertos en la materia. Las cepas de células hospedantes se pueden escoger en busca de una habilidad particular para procesar la proteína expresada o producir ciertas modificaciones post-traducción que serán útiles para proporcionar actividad proteica. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento post-traduccional, que escinde una forma "prepro" de la proteína, también puede ser importante para la inserción, plegamiento y/o función correctas. Las diferentes células hospedantes, tales como as CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, y similares, tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades post-traduccionales, y se pueden escoger para asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña introducida.

Como alternativa, se puede utilizar un sistema de levadura para generar los nuevos compuestos de la invención. La región codificante del ADN que codifica el nuevo compuesto se amplifica mediante PCR. Un ADN que codifica la secuencia líder pre-pro-alfa de levadura se amplifica a partir de ADN genómico de levadura en una reacción de PCR usando un cebador que contiene nucleótidos 1-20 del gen del factor de emparejamiento alfa y otro cebador complementario a los nucleótidos 255-235 de este gen (Kurjan y Herskowitz, Cell, 30: 933-43 (1982)). La secuencia codificante líder pre-pro-alfa y los fragmentos de la secuencia codificante del nuevo compuesto se ligan en un plásmido que contiene el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH2) de levadura, de forma que el promotor dirige la expresión de una proteína de fusión que consiste en el factor pre-pro-alfa fusionado al nuevo compuesto maduro. Como enseñan Rose y Broach, Meth. Enz. 185: 234-79, Goeddel ed., Academic Press, Inc., San Diego, California (1990), el vector incluye además un terminador de la transcripción de ADH2 en dirección 3' del sitio de clonación, el origen de replicación "2-micrón" de levadura, el gen leu-2d de levadura, los genes REP1 y REP2 de levadura, el gen de \beta-lactamasa de E. coli, y un origen de replicación de E. coli. Los genes de \beta-lactamasa y leu-2d proporcionan selección en bacterias y levaduras, respectivamente. El gen leu-2d también facilita un aumento del número de copia del plásmido en la levadura para inducir mayores niveles de expresión. Los genes REP1 y REP2 codifican proteínas implicadas en la regulación del número de copias plasmídicas.

El constructo de ADN descrito en el párrafo anterior se transforma en células de levadura usando un método conocido, por ejemplo tratamiento con acetato de litio (Steams et al., Meth. Enz. 185: 280-97 (1990)). El promotor de ADH2 es inducido al agotarse la glucosa en el medio de crecimiento (Price et al., Gene 55: 287 (1987)). La secuencia de pre-pro-alfa efectúa la secreción de la proteína de fusión a partir de las células. Concomitantemente, la proteína KEX2 de levadura escinde la secuencia de pre-pro de los compuestos maduros de la invención (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330-4 (1984)).

Los compuestos de la invención también se pueden expresar recombinantemente en levadura usando un sistema de expresión comercialmente disponible, por ejemplo, el Sistema de Expresión de Pichia (Invitrogen, San Diego, California), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este sistema también se basa en la secuencia de pre-pro-alfa para dirigir la secreción, pero la transcripción del inserto es dirigida por el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) con la inducción mediante metanol. El nuevo compuesto segregado se purifica del medio de crecimiento de levadura, por ejemplo, mediante los métodos usados para purificar el nuevo compuesto a partir de sobrenadantes de células bacterianas y de mamíferos.

Como alternativa, el ADN que codifica los nuevos compuestos se puede clonar en el vector de expresión de baculovirus pVL1393 (PharMingen, San Diego, California). Este nuevo vector que contiene el compuesto se usa entonces según las direcciones del fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda en medio libre de proteína de sF9 y producir proteína recombinante. La proteína se purifica y se concentra a partir del medio usando una columna de heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) y columnas de exclusión molecular secuenciales (Amicon, Beverly, Massachusetts), y se resuspende en PBS. El análisis mediante SDS-PAGE muestra una única banda y confirma el tamaño de la proteína, y la secuenciación de Edman en un secuenciador de péptidos Proton 2090 confirma su secuencia N-terminal.

Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el nuevo compuesto deseado se puede clonar en un plásmido que contiene un promotor deseado y, opcionalmente, una secuencia líder (véase, por ejemplo, Better et al., Science 240: 1041-3 (1988)). La secuencia de este constructo se puede confirmar mediante secuenciación automática. El plásmido se transforma entonces en la cepa MC1061 de E. coli usando procedimientos estándares que emplean incubación con CaCl_{2} y tratamiento de choque térmico de la bacteria (Sambrook et al., más arriba). Las bacterias transformadas se hacen crecer entonces en medio LB suplementado con carbenicilina, y la producción de la proteína expresada es inducida mediante crecimiento en un medio adecuado. Si está presente, la secuencia líder afectará a la secreción del nuevo compuesto maduro y se escindirá durante la secreción. La proteína recombinante segregada se purifica del medio de cultivo bacteriano mediante el método descrito aquí más abajo.

Como alternativa, los polipéptidos de la presente invención se pueden expresar en un sistema de insectos. Los sistemas de insectos para la expresión proteica son bien conocidos por los expertos en la materia. En uno de tales sistemas, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante del nuevo compuesto se clona en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y se coloca bajo el control del promotor de la polihedrina. La inserción con éxito del nuevo compuesto hará inactivo el gen de la polihedrina y producirá un virus que carece de recubrimiento proteico. Los virus recombinantes se usan entonces para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia, en las que se expresa el polipéptido (Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7 (1994)).

En otro ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el nuevo compuesto se puede amplificar mediante PCR y se puede clonar en un vector apropiado, por ejemplo pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). El vector pGEX se diseña para producir una proteína de fusión que comprende glutationa-S-transferasa (GST), codificada por el vector, y una proteína codificada por un fragmento de ADN insertado en el sitio de clonación del vector. Los cebadores para la PCR se pueden generar para incluir, por ejemplo, un sitio de escisión apropiado. La proteína de fusión recombinante se puede escindir entonces de la porción de GST de la proteína de fusión. El constructo polipeptídico del análogo de pGEX-3X/PYY se transforma en células de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, California), y los transformantes individuales se aíslan y se hacen crecer a 37ºC en medio LB (suplementado con carbenicilina) hasta una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm de 0,4, seguido de la incubación adicional durante 4 horas en presencia de 0,5 mM de \beta-D-tiogalactopiranósido de isopropilo (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). El ADN plasmídico procedente de los transformantes individuales se purifica y se secuencia parcialmente usando un secuenciador automático para confirmar la presencia del inserto génico deseado en la orientación apropiada.

La proteína de fusión, que se espera que sea producida como un cuerpo de inclusión insoluble en la bacteria, se puede purificar según lo siguiente. Las células se cosechan mediante centrifugación; se lavan en 0,15 M de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA; y se tratan con 0,1 mg/ml de lisozima (Sigma Chemical Co.) durante 15 minutos a temperatura ambiente. El lisado se aclara mediante ultrasonidos, y el desecho celular se peletiza mediante centrifugación durante 10 minutos a 12.000xg. El pelete que contiene la proteína de fusión se resuspende en 50 mM de Tris, pH 8, y 10 mM de EDTA, se estratifica sobre glicerol al 50%, y se centrifuga durante 30 minutos a 6000xg. El pelete se resuspende en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) estándar libre de Mg^{++} y Ca^{++}.

La proteína de fusión se purifica adicionalmente mediante fraccionamiento del pelete resuspendido en un gel de SDS-poliacrilamida desnaturalizante (Sambrook et al., más arriba). El gel se empapa en 0,4 M de KCl para visualizar la proteína, que se corta y electroeluye en un tampón que corre en gel que carece de SDS. Si la proteína de fusión de GST/nuevo compuesto se produce en bacterias como una proteína soluble, se puede purificar usando el Módulo de Purificación de GST (Pharmacia Biotech).

La proteína de fusión se puede someter a digestión para escindir la GST de la nueva proteína madura. La reacción de digestión (20-40 \mug de proteína de fusión, 20-30 unidades de trombina humana (4000 U/mg (Sigma) en 0,5 ml de PBS) se incuba 16-48 h a temperatura ambiente y se carga en un gel de SDS-PAGE desnaturalizante para fraccionar los productos de reacción. El gel se empapa en 0,4 M de KCl para visualizar las bandas de las proteínas. La identidad de la banda de la proteína que corresponde al peso molecular esperado del nuevo compuesto se puede confirmar mediante análisis de secuencias de aminoácidos parcial usando un secuenciador automático (Applied Biosystems Modelo 473A, Foster City, California).

En un método particularmente preferido de expresión recombinante de los nuevos compuestos, se pueden cotransfectar células 293 con plásmidos que contienen el ADN del nuevo compuesto en el vector pCMV (promotor 5' de CMV, secuencia poly A de 3' HGH) y pSV2neo (que contiene el gen de resistencia a neo) mediante el método de fosfato de calcio.

Preferentemente, los vectores se deberían de linealizar con ScaI antes de la transfección. De forma similar, se puede usar un constructo alternativo que usa un vector pCMV similar con el gen neo incorporado. Las estirpes celulares estables se seleccionan de clones celulares individuales limitando la dilución en medio de crecimiento que contiene 0,5 mg/ml de G418 (antibiótico similar a neomicina) durante 10-14 días. Las estirpes celulares se identifican en busca de la expresión del nuevo compuesto mediante ELISA o transferencia Western, y las estirpes celulares que se expresan en gran cantidad se expanden para el crecimiento a gran escala.

Es preferible que las células transformadas se usen para la producción a largo plazo de proteínas con rendimiento elevado, y como tal es deseable la expresión estable. Una vez que tales células se transforman con vectores que contienen marcadores seleccionables junto con el casete de expresión deseado, se puede dejar que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien al medio selectivo. El marcador seleccionable se diseña para conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Grupos resistentes de células transformadas de forma estable se pueden hacer proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para la célula.

Para recuperar las células que se han transformado en busca de la producción de proteína recombinante, se puede usar un número de sistemas de selección. Tales sistemas de selección incluyen, pero no se limitan a, genes de HSV timidina cinasa, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa, en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. También, se puede usar la resistencia antimetabolítica como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido, G418; también, que confiere resistencia a clorosulfurón; e higro, que confiere resistencia a higromicina.

Los genes seleccionables adicionales que pueden ser útiles incluyen trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina. Los marcadores que dan una indicación visual para la identificación de transformantes incluyen antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato, GUS, y luciferasa y su sustrato, luciferina.

Muchos de los nuevos compuestos de la presente invención se pueden producir usando una combinación tanto de síntesis peptídica automática como técnicas recombinantes. Por ejemplo, un compuesto de la invención puede contener una combinación de modificaciones que incluyen supresión, sustitución, e inserción mediante PEGilación. Tal compuesto se puede producir en etapas. En la primera etapa, una forma intermedia del nuevo compuesto que contiene las modificaciones de supresión, sustitución, inserción, y cualquier combinación de las mismas, se puede producir mediante técnicas recombinantes como se describe. Después, tras una etapa de purificación opcional como se describe más abajo, el polipéptido intermedio se somete a PEGilación a través de modificación química con un reactivo PEGilante apropiado (por ejemplo, de Nectar Transforming Therapeutics, San Carlos, California) para producir el compuesto deseado. Un experto en la materia apreciará que el procedimiento descrito anteriormente se puede generalizar para aplicarlo al nuevo compuesto que contiene una combinación de modificaciones seleccionadas de supresión, sustitución, inserción, derivatización, u otro medio de modificación bien conocido en la técnica y contemplado por la presente invención.

Puede ser deseable purificar los nuevos compuestos generados por la presente invención. Los expertos en la materia conocen bien técnicas de purificación de péptidos. Estas técnicas implican, en un nivel, el fraccionamiento bruto del medio celular en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. Habiendo separado el polipéptido de otras proteínas, el polipéptido de interés se puede purificar adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para lograr la purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad). Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel de poliacrilamida, y enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficaz de purificar péptidos es HPLC de fase inversa, seguida de la caracterización del producto purificado mediante cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) y espectrometría de masas de ionización de desorción por láser asistida por matriz (MALDI). La confirmación adicional de la pureza se obtiene mediante determinación por análisis de aminoácidos.

Ciertos aspectos de la presente invención se refieren a la purificación y, en formas de realización particulares, la purificación sustancial, de una proteína o péptido codificado. Diversas técnicas adecuadas para uso en la purificación de péptidos serán conocidas por los expertos en la materia. Estas incluyen, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos, y similares; desnaturalización por calor, seguido de centrifugación; etapas de cromatografía tales como cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, fase inversa, hidroxilapatito y cromatografía de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de tales otras técnicas. Como se conoce generalmente en la técnica, se cree que el orden de llevar a cabo las diversas etapas de purificación se pueden cambiar, o que se pueden omitir ciertas etapas, y todavía da como resultado un método adecuado para la preparación de una proteína o péptido sustancialmente puro. En la patente US nº 5.849.883 se pueden encontrar métodos para purificar un polipéptido. Estos documentos describen métodos ejemplares específicos para el aislamiento y purificación de composiciones de G-CSF que pueden ser útiles en aislar y purificar los nuevos compuestos de la invención. Dada la descripción de estas patentes, es evidente que un experto en la materia estará bien al tanto de las numerosas técnicas de purificación que se pueden usar para purificar polipéptidos a partir de una fuente dada. También se contempla que se puede emplear una combinación de cromatografía de intercambio aniónico e inmunoafinidad para producir compuestos purificados de la invención.

En consecuencia, la expresión "polipéptido o péptido aislado" se refiere a un polipéptido o péptido que está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes procedentes de la célula o fuente tisular de la que deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células a partir de las que se aísla o se produce recombinantemente. De este modo, proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos de aproximadamante 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína heteróloga (también denominada aquí como "proteína contaminante"). Cuando la proteína, péptido, o su fragmento se produce recombinantemente, también preferentemente está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamante 20%, 10%, o 5% del volumen de la preparación proteica. Cuando la proteína se produce mediante síntesis química, preferentemente está sustancialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos, es decir, está separada de precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En consecuencia, tales preparaciones de la proteína tienen menos de aproximadamante 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores o compuestos químicos distintos del polipéptido de interés. En formas de realización preferidas, las preparaciones purificadas o aisladas carecerán de cualesquiera proteínas contaminantes procedentes del mismo animal a partir del cual se produce normalmente la proteína, como se puede lograr mediante expresión recombinante de, por ejemplo, una proteína humana en una célula no humana.

Ciertos métodos preferidos para la síntesis se describen en la solicitud de patente nº de serie 454.533 (presentada el 6 de diciembre de 1999) cedida en común.

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Para todas las indicaciones, los nuevos compuestos se pueden administrar periféricamente a una dosis de aproximadamante 1 \mug a aproximadamante 5 mg por día en dosis individuales o divididas o liberación continua controlada, o a aproximadamante 0,01 \mug/kg a aproximadamante 500 \mug/kg por dosis, más preferentemente aproximadamante 0,05 \mug/kg a aproximadamante 250 \mug/kg, lo más preferible por debajo de aproximadamante 50 \mug/kg. Las dosis se pueden administrar una, dos, tres o cuatro veces al día. Las dosis en estos intervalos variarán con la potencia de cada análogo o derivado, por supuesto, y se pueden determinar por un experto en la materia.

En los métodos de la presente descripción, los polipéptidos se pueden administrar separadamente o junto con uno o más compuestos y composiciones diferentes que muestren una acción a largo plazo o a corto plazo para reducir la disponibilidad de nutrientes, incluyendo, pero sin limitarse a, otros compuestos y composiciones que comprenden una amilina o agonista de análogo de amilina, calcitonina de salmón o agonista de calcitonina de salmón, una colecistocinina (CKK) o agonista de CKK, una leptina (proteína OB) o agonista de leptina, una exendina o agonista de análogo de exendina, o un GLP-1 o agonista de análogo de GLP-1 o un PYY o análogo de PYY, o un polipéptido relacionado con PYY. Los agonistas de amilina adecuados incluyen, por ejemplo, [25,28,29Pro-]-amilina humana (también conocida como "pramlintida", y descrita en las patentes U.S. n^{os} 5.686.511 y 5.998.367). La CKK usada es preferentemente octopéptido de CKK (CKK-8). La leptina se explica en, por ejemplo, (Pelleymounter, Cullen et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas, Gajiwala et al., Science 269: 543-6 (1995); Campfield, Smith et al., Science 269: 546-549 (1995)). Las exendinas adecuadas incluyen exendina-3 y exendina-4, y los compuestos de agonistas de exendina incluyen, por ejemplo, los descritos en las publicaciones PCT WO 99/07404, WO 99/25727, y WO 99/25728. Los polipéptidos de PYY y análogos adecuados incluyen los descritos en la solicitud US nº: [números de casos 18528.740 y 18528.723].

Composiciones farmacéuticas

La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de por lo menos un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables útiles en el suministro de los nuevos compuestos. Tales composiciones pueden incluir diluyentes de diverso contenido de tampón (por ejemplo, acetato, citrato, tartrato, fosfato, TRIS), pH y fuerza iónica; aditivos tales como tensioactivos y agentes solubilizantes (por ejemplo, monooleato de sorbitán, lecitina, Pluronics, Tween 20 y 80, Polisorbate 20 y 80, propilenglicol, etanol, PEG-40, dodecilsulfato de sodio), antioxidantes (por ejemplo, monotioglicerol, ácido ascórbico, acetilcisteína, sales de ácidos azufrados (bisulfito y metabisulfito), conservantes (por ejemplo, fenol, meta-cresol, alcohol bencílico, parabenos (metílico, propílico, butílico), cloruro de benzalconio, clorobutanol, timersol, sales fenilmercúricas (acetato, borato, nitrato), y agentes para dar tonicidad/para dar volumen (glicerina, cloruro de sodio, manitol, sacarosa, trehalosa, dextrosa), incorporación del material en preparaciones en partículas de compuestos poliméricos, tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en asociación con liposomas. Tales composiciones influirán el estado físico, la estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo de los presentes compuestos. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 1435-712, 18ª ed., Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania (1990).

En general, los presentes compuestos serán útiles de la misma manera que la amilina es útil en vista de sus propiedades farmacológicas. Un uso preferido es administrar periféricamente tales nuevos compuestos para el tratamiento o prevención de afecciones y trastornos metabólicos. En particular, los compuestos de la invención poseen actividad como agentes para reducir la disponibilidad de los nutrientes, reducir la ingesta de alimentos, y llevar a cabo una pérdida de peso.

Los nuevos compuestos se pueden formular para la administración periférica, incluyendo la formulación para inyección, administración oral, administración nasal, administración pulmonar, administración tópica, u otros tipos de administración como reconocerá un experto en la materia. En la patente US nº 6.410.511 y en la solicitud de patente nº 10/159.779 se pueden encontrar ejemplos de formulaciones.

Más particularmente, la administración de las composiciones farmacéuticas según la presente invención puede ser vía cualquier ruta habitual en tanto que el tejido diana esté disponible vía esa ruta. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se pueden introducir en el sujeto mediante cualquier método periférico convencional, por ejemplo, intravenoso, intradérmico, intramuscular, intramamario, intraperitoneal, intratecal, retrovulvar, intrapulmonar (por ejemplo, liberación a largo plazo); mediante suministro oral, sublingual, nasal, anal, vaginal, o transdérmico, o mediante implantación quirúrgica en un sitio particular. El tratamiento puede consistir en una sola dosis o en una pluralidad de dosis a lo largo de un período de tiempo. También se contempla la liberación continua controlada de las composiciones de la presente invención. En la patente US nº 6.458.387 y en la patente US nº 5.578.708 se pueden encontrar ejemplos de tecnología de microesferas.

La formulación puede ser líquida o puede ser sólida, tal como liofilizada, para reconstitución. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de los nuevos compuestos, disueltos o dispersos en un vehículo o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. La frase "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no produzcan reacciones adversas, alérgicas o de otro modo indeseadas cuando se administran a un animal o a un ser humano. Como se usa aquí, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Se contempla su uso en composiciones terapéuticas excepto en cuanto a que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo. También se pueden incorporar en las composiciones ingredientes activos suplementarios. En algunos casos, será conveniente proporcionar un compuesto de la invención y otro agente que reduzca la ingesta de alimentos, que reduzca la glucosa en plasma o que altere los lípidos en plasma, tal como una amilina, un análogo de un agonista de amilina, una CCK o agonista de CCK, o una leptina o agonista de leptina, o una exendina o análogo de agonista de exendina, o un PYY o un análogo de PYY, en una única composición o disolución para la administración conjunta. En otros casos, puede ser ventajoso administrar separadamente el agente adicional del nuevo compuesto.

Los compuestos de la invención se pueden preparar para administración como disoluciones de base libre, o sales farmacológicamente aceptables en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Como se usa aquí, la frase "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales preparadas a partir de ácidos y bases farmacéuticamente aceptables, preferentemente no tóxicos, que incluyen ácidos y bases inorgánicos y orgánicos, incluyendo, pero sin limitarse a, sales sulfúrica, cítrica, maleica, acética, oxálica, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, nitrato, sulfato, bisulfito, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, acetato, lactato, salicilato, citrato, citrato ácido, tartrato, oleato, tannato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato y pamoato (es decir, 1,1'-metilen-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)). Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres, tales como, pero sin limitarse a, las derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, y tartárico. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen las formadas con grupos carboxílicos libres tales como, pero sin limitarse a, las derivadas de sodio, potasio, amonio, sodio litio, calcio, hidróxidos férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, y procaína.

En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se formulan para ser adecuadas para administración parenteral, por ejemplo, vía inyección o infusión. Preferentemente, el nuevo compuesto se suspende en un vehículo acuoso, por ejemplo en una disolución de tampón isotónica a un pH de aproximadamante 3,0 a aproximadamante 8,0, preferentemente un pH de aproximadamante 3,0 a aproximadamante 7,4, 3,5 a 6,0, o 3,5 a aproximadamante 5,0. Tampones útiles incluyen acetato de sodio/ácido acético, lactato de sodio/ácido láctico, ácido ascórbico, citrato de sodio-ácido cítrico, bicarbonato de sodio/ácido carbónico, succinato de sodio/ácido succínico, histidina, benzoato de sodio/ácido benzoico, y fosfatos de sodio, y tris(hidroximetil)aminometano. Se puede usar una forma de preparación de reposición o de liberación lenta de "depósito", de forma que se suministran cantidades terapéuticamente eficaces de la preparación en el torrente sanguíneo durante muchas horas o días tras la inyección o suministro transdérmico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debería de ser estéril y debería de ser fluida de forma que sea fácilmente inyectable. También es deseable que el polipéptido de PPF de la invención sea estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento, y se debe de conservar frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, sorbitol, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), dimetilacetamida, cremophor EL, mezclas adecuadas de los mismos, y aceites (por ejemplo, de haba de soja, de sésamo, de ricino, de semilla de algodón, oleato de etilo, miristato de isopropilo, glicofurol, maíz). La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede producir mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo metacresol, alcohol bencílico, parabenos (metílico, propílico, butílico), clorobutanol, fenol, sales fenilmercúricas (acetato, borato, nitrato), ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes de tonicidad (por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio). La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina). Una composición farmacéutica ejemplar puede ser 0,1 a 5% de compuesto de la invención en un sistema acuoso junto con aproximadamente 0,02 a aproximadamante 0,5% (p/v) de un tampón de acetato, de fosfato, de citrato, o de glutamato a un pH de la composición final de aproximadamente 3,0 a aproximadamante 6,0, así como aproximadamente 1,0 a 10% (p/v) de un hidrato de carbono o un tonificante de alcohol polihidroxilado; y, opcionalmente, aproximadamente 0,005 a 1,0% (p/v) de un conservante seleccionado de un grupo que consiste en m-cresol, alcohol bencílico, parabenos y
fenol.

Las disoluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado a vacío y liofilización, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una disolución previamente filtrada de forma estéril del mismo.

Generalmente, una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de los presentes nuevos compuestos se determinará por la edad, peso, y estado o gravedad de las enfermedades o afecciones o trastornos metabólicos del receptor. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences 697-773. Véase también Wang y Hanson, Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report nº 10, Sup. 42:25 (1988). Típicamente, se puede usar una dosis entre aproximadamante 0,001 \mug/kg de peso corporal/día y aproximadamante 1000 \mug/kg de peso corporal/día, pero se puede usar más o menos, según reconocerá un practicante experto. La dosificación se puede hacer una o más veces al día, o menos frecuentemente, y puede ser conjuntamente con otras composiciones como se describe aquí. Se debería observar que la presente invención no está limitada a las dosificaciones citadas aquí.

Las dosis apropiadas se pueden averiguar mediante el uso de ensayos consolidados para determinar el nivel de afecciones o trastornos metabólicos conjuntamente con datos pertinentes de dosis frente a respuesta. El régimen de dosificación final se determinará por el médico considerando factores que modifican la acción de fármacos, por ejemplo la actividad específica del fármaco, la gravedad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, estado, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. A medida que se realicen estudios, aparecerá información adicional con respecto a los niveles de dosificación apropiados y la duración del tratamiento para enfermedades y afecciones específicas.

Una dosis eficaz estará típicamente en el intervalo de aproximadamante 1 a 30 \mug a aproximadamante 5 mg/día, preferentemente aproximadamante 10 a 30 \mug a aproximadamante 2 mg/día, y más preferentemente aproximadamante 5 a 100 \mug a aproximadamante 1 mg/día, lo más preferible aproximadamante 5 \mug a aproximadamante 500 \mug/día, administrada en dosis individuales o divididas. Las dosificaciones pueden estar entre aproximadamante 0,01 y aproximadamante 500 \mug/dosis. Se contempla que los compuestos de la invención se pueden administrar 1, 2, 3, 4 o más veces al día. En consecuencia, las dosis ejemplares se pueden derivar de la cantidad total de fármaco a administrar en el día y el número de dosis administrado al día. Por ejemplo, las dosis ejemplares pueden oscilar desde aproximadamante 125 \mug/dosis (0,5 \mug dada cuatro veces al día) a aproximadamante 5 mg/dosis (5 mg dada una vez al día). Otras dosis pueden estar entre aproximadamante 0,01 y aproximadamante 100 \mug/kg dosis. Todavía otras dosis ejemplares pueden ser 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ó 200 \mug/dosis. La dosis exacta a administrar se puede determinar por un experto en la materia, y depende de la potencia del compuesto en particular, así como de la edad, peso y estado del individuo. La administración debería de comenzar siempre que se desee la supresión de la disponibilidad de nutrientes, la ingesta de alimentos, reducir el peso, la glucosa en sangre o el lípido en plasma, por ejemplo al primer signo de síntomas o poco después tras el diagnóstico de obesidad, diabetes mellitus, o síndrome de resistencia a insulina. La administración se puede realizar mediante cualquier ruta, por ejemplo, inyección, preferentemente subcutánea o intramuscular, oral, nasal, transdérmica, etc. Las dosis para ciertas rutas, por ejemplo administración oral, se pueden incrementar para dar cuenta de la biodisponibilidad reducida, por ejemplo en aproximadamante 5-100 veces.

En una realización, cuando la formulación farmacéutica se va a administrar parenteralmente, la composición es una formulación para suministrar una dosis de los nuevos compuestos que oscila desde 0,1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal/día, preferentemente a dosis que oscilan desde 10 \mug/kg hasta aproximadamante 50 mg/kg de peso corporal/día. La administración parenteral se puede llevar a cabo con un bolo inicial, seguido de la infusión continua para mantener los niveles circulantes terapéuticos de producto farmacéutico. Los expertos normales en la técnica optimizarán fácilmente las dosificaciones eficaces y regímenes de administración según se determina mediante la práctica médica y el estado clínico del paciente individual.

La frecuencia de la dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y las rutas de administración. La formulación farmacéutica óptima se determinará por el experto en la materia dependiendo de la ruta de administración y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, más arriba, páginas 1435-1712. Tales formulaciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de aclaramiento in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la ruta de administración, se puede calcular una dosis adecuada según el peso corporal, áreas superficiales corporales o tamaño del órgano. Un refinamiento adicional de los cálculos necesario para determinar la dosis de tratamiento apropiada se realiza de forma normal por los expertos normales en la técnica sin experimentación excesiva, especialmente a la luz de la información de la dosificación y ensayos descritos aquí, así como los datos farmacocinéticos observados en ensayos clínicos con animales o seres humanos.

Se apreciará que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser útiles en campos de medicina humana y medicina veterinaria. De este modo, el sujeto a tratar puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano u otro animal. Para fines veterinarios, los sujetos incluyen, por ejemplo, animales de granja que incluyen vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, animales de compañía tales como perros y gatos, animales exóticos y/o de zoológicos, animales de laboratorio, que incluyen ratones, ratas, conejos, cobayas y hámsters; y aves de corral tales como pollos, pavos, patos y gansos.

Para ayudar a comprender la presente invención, se incluyen los siguientes Ejemplos. Por supuesto, los experimentos que se refieren a esta invención no se deberían de interpretar como específicamente limitantes de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de los polipéptidos que reducen la ingesta calórica

Los siguientes polipéptidos se pueden sintetizar usando métodos de síntesis de polipéptidos estándar. Tales métodos se describen más abajo y en las patentes US 6.610.824 y US 5.686.411 y en la Solicitud de patente serie nº 454.533 (presentada el 6 de diciembre de 1999), cuyas totalidades se incorporan aquí como referencia.

Los polipéptidos se ensamblan en una resina de 4-(2'-4'-dimetoxifenil)-Fmoc aminometil fenoxi acetamida norleucina MBHA (Novabiochem, 0,55 mmoles/g) usando aminoácidos protegidos con Fmoc (Applied Biosystems, Inc.). En general, se usan ciclos de acoplamiento individuales durante la síntesis, y se emplea la química de Fast Moc (activación con HBTU). Sin embargo, en algunas posiciones el acoplamiento puede ser menos eficaz que el esperado, y se requieren acoplamientos dobles. La desprotección (eliminación del grupo Fmoc) de la cadena peptídica reciente usando piperidina igualmente puede no ser siempre eficaz, y requiere una doble desprotección. La desprotección final de la resina peptídica completa se logra usando una mezcla de trietilsilano (0,2 ml), etanoditiol (0,2 ml), anisol (0,2 ml), agua (0,2 ml) y ácido trifluoroacético (15 ml) según métodos estándar (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc.). Los péptidos se precipitan en éter/agua (50 ml) y se centrifugan. El precipitado se reconstituye en ácido acético glacial y se liofiliza. Los péptidos liofilizados se disuelven en agua. Entonces se determina la pureza bruta.

En las etapas de purificación y análisis se usan el Disolvente A (0,1% de TFA en agua) y el Disolvente B (0,1% de TFA en ACN).

Disoluciones que contienen los diversos polipéptidos se aplican a una columna C-18 preparativa y se purifican (10% a 40% de Disolvente B en Disolvente A durante 40 minutos). La pureza de las fracciones se determina isocráticamente usando una columna analítica C-18. Las fracciones puras se reúnen dando el péptido identificado anteriormente. La RP-HPLC analítica (gradiente 30% a 60% de Disolvente B en Disolvente A durante 30 minutos) del péptido liofilizado determina el tiempo de retención.

Ejemplo 2 Ensayos de unión al receptor

Inicialmente, los polipéptidos se pueden usar en ensayos para determinar la capacidad de unión a receptores de amilina, calcitonina y CGRP. Los ensayos de unión para determinar las interacciones con el receptor de amilina, el receptor de calcitonina y el receptor de CGRP se describen, por ejemplo, en la patente US nº 5.264.372, cuya totalidad se incorpora aquí como referencia.

Con más detalle, la evaluación de la unión de los compuestos de la invención a receptores de amilina se puede llevar a cabo según lo siguiente. La ^{125}I-amilina de rata (Bolton-Hunter marcado en la lisina N-terminal) se adquiere de Amersham Corporation (Arlington Heights, III.). Los péptidos no marcados se obtienen de BACHEM Inc. (Torrance, Calif.) y Peninsula Laboratories (Belmont, Calif.).

Ratas macho Sprague-Dawley® de (200-250) gramos se sacrifican por decapitación. Los cerebros se retiran en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) fría. De la superficie ventral, se realizan cortes rostrales al hipotálamo, unidos lateralmente mediante los tubos olfativos que se extienden medialmente un ángulo de 45 desde estos tubos. Este tejido prosencefálico basal, que contiene el nucleus accumbens y regiones circundantes, se pesa y se homogeneiza en tampón HEPES 20 mM (ácido HEPES 20 mM, pH ajustado hasta 7,4 con NaOH a 23C) enfriado con hielo. Las membranas se lavan tres veces en tampón reciente mediante centrifugación durante 15 minutos a 48.000 veces g. El pelete de membrana final se resuspende en tampón de HEPES 20 mM que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,2 mM.

Para unir la unión a ^{125}I-amilina, se incuban membranas de 4 mg de peso en húmedo original de tejido con ^{125}I-amilina a 12-16 pM en tampón HEPES 20 mM que contiene 0,5 mg/ml de bacitracina, 0,5 mg/ml de seroalbúmina bovina, y 0,2 mM de PMSF. Las disoluciones se incuban durante 60 minutos a 2C. Las incubaciones se terminan mediante filtración a través de filtros de fibra de vidrio GF/B (Whatman Inc., Clifton, N.J.) que se habían empapado previamente durante 4 horas en polietilenimina al 0,3% a fin de reducir la unión no específica de péptidos radiomarcados. Los filtros se lavaron inmediatamente antes de la filtración con 5 ml de PBS fría, e inmediatamente tras la filtración con 15 ml de PBS fría. Los filtros se eliminaron y la radioactividad se evaluó en un contador gamma a una eficacia de recuento de 77%. Se generaron curvas de competición midiendo la unión en presencia de 10^{-12} a 10^{-6} M de compuesto de ensayo sin marcar y se analizaron mediante regresión no lineal usando una ecuación logística de 4 parámetros (programa Inplot; GraphPAD Software, San Diego).

En este ensayo, la amilina humana purificada se une a su receptor a una IC_{50} medida de aproximadamante 50 pM. Los resultados para los compuestos de ensayo de la invención se exponen en la tabla más abajo, mostrando que cada uno de los compuestos tiene una actividad de unión al receptor significativa.

La evaluación de la unión de los compuestos de la invención a los receptores de CGRP fue esencialmente como se describe para amilina, excepto que se usó 125I hCGRP y membranas preparadas a partir de células SK-N-MC, que se sabe que expresan receptores de CGRP (Muff, R. et al. Ann NY Acad. Sci. 1992: 657, 106-16). Los ensayos de unión se llevaron a cabo como se describe para amilina, excepto que se usó 13.500 cpm de 125I-hCGRP/pocillo o 21,7 pM/pocillo (Amersham).

La unión al receptor de calcitonina se puede investigar usando células CHO o células T47D, que también expresan el receptor de calcitonina (Muff, R. et al. Ann NY Acad. Sci. 1992, 657: 106-16 y Kuestner R.E. et al. Mol Pharmacol. 1994, 46:246-55), como es conocido en la técnica.

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TABLA X Valores de EC_{50} (nM) para polipéptidos

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Ejemplo 3 Actividad de polipéptidos en la ingesta de alimentos

Ratones hembra NIH/Swiss (8-14 semanas) se enjaularon en grupos con un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas. El agua y una dieta de comida para ratón peletizada estándar están disponibles a voluntad, excepto según se señale. Los animales ayunan comenzando a aproximadamente 1500 horas, 1 día antes del experimento.

En el momento = 0 min., a todos los animales se les administra una inyección intraperitoneal de vehículo o polipéptido en un velocidad de 200 ul/ratón e inmediatamente se les da una cantidad pesada previamente (10-15 g) del pienso estándar. El alimento se retira y se pesan a los 30, 60, 120 y 180 minutos, para determinar la cantidad de alimento consumido. Los efectos del tratamiento sobre la ingesta de alimento se expresan como % de cambio con relación al control.

Como se puede ver en la Figura 1, el Compuesto 2, a dosis de 25-300 nmoles/kg, redujo de forma dependiente de la dosis la ingesta de alimentos a 30 minutos después de la inyección. La tabla a continuación presenta la ingesta reducida de alimentos con polipéptidos administrados periféricamente (inyección intraperitoneal) a dosis de 25 nmoles/kg. Los datos en los puntos de tiempo 30, 60, 120 y 180 minutos representan el porcentaje de disminución en la ingesta acumulativa de alimentos en comparación con el vehículo.

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Ejemplo 4 Actividad de los compuestos de la invención sobre la reducción de peso y la ingesta calórica

Ratas Sprague-Dawley® macho enjauladas individualmente (350 g; ciclo de luz/oscuridad de 12 h) se mantuvieron en una dieta rica en grasas (50% de kcal de grasa) durante 4 semanas. Al final del período de engorde, se implantaron interescapularmente bajo anestesia bombas osmóticas de 14 días (Durect Corp.). Las ratas recibieron bombas que suministran continuamente vehículo (50% de DMSO) o un polipéptido a una dosis de 2,9 nmoles/kg/día. Las medidas de ingesta de alimentos y de peso corporal se obtuvieron semanalmente. Las Figuras 2A y 2B muestran que los polipéptidos Compuesto 3, Compuesto 4, o Compuesto 5 produjeron una disminución en la ingesta calórica y ganancia de peso corporal a lo largo del período de ensayo de 14 días.

La tabla a continuación presenta el porcentaje de pérdida de peso corporal en la semana 1 y 2 para varios compuestos.

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TABLA X Pérdida de peso corporal tras la administración de compuestos ejemplares de la invención

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Ejemplo 5 Composición corporal

Ratas Sprague-Dawley® macho enjauladas individualmente (420 g; ciclo de 12 h de luz/oscuridad) se mantuvieron en una dieta rica en grasas (58% kcal de grasa) durante 4 semanas. Al final del período de engorde, se implantaron interescapularmente bajo anestesia bombas osmóticas de 14 días (Durect Corp.). Las ratas recibieron bombas que suministraron continuamente vehículo (50% de DMSO) o Compuesto 1 a una dosis de 70 nmoles/kg/día. Los animales se sacrificaron en el Día 12. Las carcasas se congelaron inmediatamente y la composición corporal (grasa y proteína) se midió mediante análisis químico (Covance Laboratories, Madison, WI). La Figura 3 muestra que, como porcentaje de masa corporal total, el contenido de grasa se redujo en ratas tratadas con Compuesto 1 en comparación con los controles. Además, el Compuesto 1 incrementó el porcentaje de contenido de masa magra.

Ejemplo 6 Vaciamiento gástrico e ion calcio

El vaciamiento gástrico se monitorizó midiendo el aspecto en plasma de glucosa tritiada alimentada por sonda. Los sujetos fueron ratas macho Sprague-Dawley® conscientes (7-9 semanas, ciclo de luz:oscuridad 12:12 h) con acceso a voluntad a alimento y agua hasta el comienzo del experimento. Antes de la dosificación, la comida y el agua se retiraron. A t = -5 min., se administró subcutáneamente péptido o vehículo (200 \mul de disolución salina). A t = 0 min., se proporcionó mediante tubo orofaríngeo una disolución de 1 ml de agua estéril que contiene 5 \muCi de D-[3-3H]glucosa (Dupont, Wilmington, DE, USA). A t = 20 min., se aplicó a la punta de la cola un anestésico tópico (Hurricaine®, 20% de benzocaína líquida). A t = 40 min., la punta de la cola se ligó con un escalpelo y se recogieron \sim250 \mul de sangre en tubos heparinizados. El plasma se estudió entonces inmediatamente para determinar el calcio ionizado usando un analizador Ciba/Corning 634 Ca/pH (Ciba/Corning, Inc., Medfield, MA). Se pipeteó una muestra de plasma de 10 \mul en viales de centelleo preparados (0,5 ml de agua + 2 ml de cóctel de centelleo (cóctel de centelleo Ecolite ICN, Costa Mesa, CA)), se sometió a vórtex y se contó en un contador \beta (1209 Rack-beta; LKB-Wallac, Gaithersburg, MD) durante 1 minuto/vial.

En la Figura 4A, los puntos representan media \pm sd de 6 ratas SD (alimentadas, conscientes). La dosis indicada de péptido se inyectó subcutáneamente a t = 0. Se recogió sangre 35 minutos después para el análisis de cpm. *Todos los puntos p < 0,001 frente a control salino; ANOVA, prueba de Dunnett. De la regresión no lineal: ED50 = 2,3 \mug/kg. Inferior = 25 cpm/10 \mul; superior = 328 cpm/10 \mul. Disminución máxima en cpm del plasma: -92%. Bondad del ajuste: r2 = 0,9992.

En la Figura 4B, los puntos representan media \pm sd de 6 ratas SD (alimentadas, conscientes). La dosis indicada de péptido se inyectó subcutáneamente a t = 0. Se recogió sangre 35 minutos después para el análisis de cpm. *P < 0,001 frente a control salino; ANOVA, prueba de Dunnett. De la regresión no lineal: ED50 = 1,1 \mug/kg. Inferior = 1,2 mmoles/l; superior = 1,3 mmoles/l. Disminución máxima en iCa plasmático: -14%. Bondad del ajuste: r2 = 0,9936.

Ejemplo 7 Triglicéridos

En el estudio 1, ratas Sprague-Dawley® de Harlan hembras (HSD; HarlanTeklad, Indianápolis, IN) retiradas de la crianza se alimentaron en una dieta rica en grasas (40% de calorías procedentes de la grasa; dieta #TD95217, HarlanTeklad) durante 9 semanas antes del inicio del estudio, continuando con esta dieta durante el período experimental. Un grupo de ratas se alimentó a voluntad durante el estudio para examinar los efectos metabólicos del Compuesto 1, un compuesto representativo de la invención, tratamiento (n = 10) con relación a ratas del control, no tratadas (n = 10).

Para determinar los efectos metabólicos del Compuesto 1 en el marco de la restricción del alimento ("dieta"), a un segundo grupo de ratas se les administró 75% de su ingesta de alimento de referencia antes del estudio cada día durante 10 días antes del inicio del tratamiento con el Compuesto 1 (n = 10) o vehículo (n = 10) (\sim5% de pérdida de peso corporal frente a peso corporal previo a la restricción). En ese momento, todas las ratas recibieron bombas osmóticas Alzet® (Durect, Cupertino, CA) implantadas quirúrgicamente en la región intraescapular subcutáneamente con anestesia con isoflurano. Las bombas se prepararon para suministrar continuamente Compuesto 1 (101 \mug/kg/día) o vehículo (50% de dimetilsulfóxido [DMSO] en agua) durante 21 días. Las ratas a las que se les restringió el alimento continuaron recibiendo 75% de su ingesta de alimento de referencia cada día. Después de 21 días de tratamiento, se obtuvieron muestras de sangre en jeringuillas heparinizadas vía punción cardíaca de ratas postabsortivas anestesiadas con isoflurano (\sim2-4 h en ayunas en a.m.) y plasma obtenido para el análisis de analitos. Los triglicéridos plasmáticos se determinaron usando el análisis automatizado estándar para química clínica (LabCorp, Inc., San Diego, CA).

En el estudio 2, ratas macho de la raza Levin que tienden a la obesidad de ratas HSD (Charles River, Wilmington, MA) se alimentaron con una dieta rica en grasas (32% de calorías procedente de la grasa; dieta #12266B, Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) durante 6 semanas antes del inicio del estudio, y continuaron con esta dieta durante el experimento. El inicio del tratamiento comenzó con la colocación de bombas osmóticas subcutáneas que contienen Compuesto 1 o vehículo DMSO como en el Estudio 1, y continuó durante 3 semanas (21 días). Los parámetros metabólicos se compararon entre ratas tratadas con el Compuesto 1 (303 \mug/kg/día; n = 10), controles tratados con el vehículo (n = 10), y un grupo alimentado por parejas (n = 10) que recibió diariamente la cantidad de alimento comido por las ratas tratadas con el Compuesto 1. La recogida de sangre y el análisis de la concentración de triglicéridos en plasma se realizó como en el Estudio 1, pero usando una recolección de la vena de la cola en los puntos de la 1ª semana y la 2ª semana.

El Estudio 3 se llevó a cabo como el Estudio 2, excepto que los animales se trataron durante 8 semanas (56 días) y a diferentes dosis de Compuesto 1. A los 28 días de tratamiento, las bombas osmóticas recientes sustituyeron a las bombas usadas. Las bombas se prepararon para suministrar Compuesto 1 a las dosis de 1, 3, 10 ó 100 \mug/kg/día (n = 10/grupo) o vehículo DMSO (controles, n = 10). Un grupo adicional alimentado por pares (n = 10) recibió vehículo y se alimentó diariamente la cantidad de alimento comido por el grupo de 100 \mug/kg/día de Compuesto 1. La recogida de sangre y el análisis de la concentración de triglicéridos en plasma para los puntos de referencia, 2, 4 y 6 semanas se obtuvieron de ratas alimentadas conscientes vía la recogida de la vena de la cola en tubos heparinizados; la recogida de sangre y el análisis de la concentración de triglicéridos en plasma para el punto de la 8ª semana se obtuvo a partir de ratas alimentadas anestesiadas con isoflurano en jeringuillas heparinizadas vía punción cardíaca, empleando un ensayo de triglicéridos estándar (Cobas Mira Plus, Roche Diagnostics).

Las diferencias entre los niveles medios de triglicérido en plasma a lo largo de los tratamientos para un punto de tiempo dado del estudio se evaluaron en un análisis de una vía de varianza (ANOVA), seguido del Ensayo de Comparación de Múltiples de Dunnett (Prism v. 4.01, GraphPad Software, San Diego, CA). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a p < 0,05.

Como se indica en las Figuras 5 a 7E, los estudios 1, 2, y 3, respectivamente, el tratamiento con Compuesto 1 durante 1-8 semanas dio como resultado concentraciones significativamente menores de triglicéridos. La Figura 5 muestra la concentración de triglicéridos en plasma en ratas de criador retiradas hembras tras un tratamiento de 21 días con el Compuesto 1 vía infusión continua subcutánea (s.c.). Las ratas a las que se les administró Compuesto 1 presentaron niveles de triglicéridos significativamente menores en comparación con los controles alimentados a voluntad: este efecto se observó independientemente de si el Compuesto 1 se administró en condiciones de alimentación a voluntad o en condiciones de alimento restringido. *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con los controles tratados con vehículo, a voluntad.

Las Figuras 6A-6C representan la concentración plasmática de triglicéridos en ratas Levin machos de obesidad inducida por la dieta (DIO) durante un tratamiento de 3 semanas con Compuesto 1 vía infusión s.c. continua. Las gráficas representan valores derivados de muestras de sangre recogidas a (A) 1 semana, (B) 2 semanas, y (C) 3 semanas de tratamiento. *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con los controles tratados con el vehículo.

Las Figuras 7A-7E muestran un estudio de respuesta frente a la dosis del Compuesto 1, en el que las dosis tan bajas como 1 \mug/kg/día dieron como resultado una reducción de las concentraciones plasmáticas de triglicérido cuando se compara con los controles del vehículo en los puntos de 2, 4, 6 y 8 semanas (Figura 7B, C, D, y E, respectivamente). *p < 0,05, **p < 0,01 comparadas con los controles tratados con vehículo. En la leyenda se indican los grupos de tratamiento.

Ejemplo 8 Ensayo de grelina

Este ejemplo proporciona un ensayo ejemplar para detectar el efecto de los compuestos de la invención sobre grelina.

Ratas macho Harlan Sprague Dawley® (HSD) se enjaularon a 22,8 +/- 0,8ºC en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas. Todos los experimentos se llevaron a cabo en el ciclo de luz. Los animales ayunaron durante aproximadamente 20 horas antes del experimento. A todos los animales se les dio acceso libre al agua hasta el comienzo del experimento. Las colas de los animales se anestesiaron con benzocaína al 20% (Hurricaine, Beutlich Pharmaceutical, Waukegan, IL), y las muestras de sangre se recogieron de la vena de la cola. Las concentraciones totales y activas de grelina se midieron usando Linco RIA kits GHRA-89HK y GHRA-88HK, respectivamente.

En el Estudio 1, las ratas HSD se sometieron a toma periódica de muestra de sangre a partir de la cola anestesiada tópicamente, y se evaluaron los niveles de grelina. A t = 0, a las ratas (n = 6) se les inyectó s.c. con 125 \mug/kg de pentagastrina (Sigma) para estimular la secreción de ácido gástrico (PG = 0 min. en la Figura 1), y 20 minutos más tarde se les inyectó subcutáneamente (s.c.) con 10 \mug de amilina de rata. Las muestras de sangre se analizaron para determinar la grelina total y activa (acilada) (Linco). Como se muestra en la Figura 8A, la amilina redujo grelina activa en \sim50% en 1 hora.

El Estudio 2 se llevó a cabo para examinar si la amilina exógena inhibe la secreción de grelina independiente de la estimulación con pentagastrina. A ratas en ayunas se les administró una inyección subcutánea de disolución salina o de amilina de rata 30 \mug/kg, o inyección subcutánea de disolución salina o pentagastrina 125 \mug/kg (Sigma, Lote #050K1525) en el momento = 0 min. Se administró mediante inyección subcutánea en el momento 20 min. amilina de rata (AC0128, lote #AR2081-42A, Amylin Pharmaceuticals), a una dosis de 30 \mug/kg en 100 \mul de disolución salina, o vehículo salino solo (n = 5,5 respectivamente). Se recogieron muestras plasmáticas de sangre por lo menos en los tiempos 0, 10, 20, 30, 60, y 90 min. Tanto las Figuras 8B como 8C muestran una reducción en grelina plasmática total con la administración de amilina en comparación con el control salino, y la Figura 8B confirma que la grelina plasmática se redujo en comparación con el control en presencia de amilina sola, es decir, sin pentagastrina. Parece que la pentagastrina potencia el efecto reductor de la grelina de amilina.

Ejemplo 9 Función pancreática

Se llevaron a cabo canulaciones de la arteria y vena femorales en ratas HSD anestesiadas en ayunas (peso 320-350 g), y se dejó que se estabilizaran durante 90 minutos. A t = -30, se comenzó una infusión de disolución salina (1 ml/h) o Compuesto 1 (1 ml/h). A t = 0, las ratas recibieron una inyección ip de caeruleína, 10 \mug/kg. Se recogieron muestras para amilasa y lipasa plasmáticas en diversos puntos de tiempo desde t = -30 hasta t = 240.

Como se muestra en las Figuras 9A y 9B, el tratamiento con el Compuesto 1 atenuó los incrementos en las actividades de enzimas pancreáticas en la sangre en el modelo de rata de pancreatitis aguda, sugiriendo que los agonistas de amilina pueden ser candidatos farmacéuticos objetivos para la prevención y tratamiento de pancreatitis.

Ejemplo 10 Secreción de ácido gástrico de amilina

Ratas macho Harlan Sprague Dawley® se enjaularon a 22,8 \pm 0,8ºC en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 horas. Los experimentos se llevaron a cabo durante el ciclo diurno. Las ratas, alimentadas con pienso para ratas (Teklad LM 485, Madison, WI), ayunaron durante aproximadamente20 horas antes del experimento. Se les dio agua a voluntad hasta el comienzo del experimento.

A las ratas (9-14 semanas, masa corporal 264-395 g) se les instaló quirúrgicamente fístulas gástricas dobles por el proveedor (Zivic Miller, número de Catálogo SCA03.00). Durante la laparotomía bajo anestesia con halotano, un tarugo de luz doble con forma de ojal se suturó en la pared del estómago. Se hicieron pasar a través de la pared abdominal, subcutáneamente a la región interescapular en la que se exteriorizaron separadamente dos cánulas silásticas de 2,3 mm de diámetro interno (entrada y salida) conectadas al tarugo y que comunican con la luz gástrica. La herida de la laparotomía se cerró con grapas, la rata se colocó en una jaula de recuperación calentada durante un día con acceso libre a agua. Después, las ratas se enjaularon individualmente con acceso libre a agua y a pienso para ratas hasta que se sometieron a ayuno durante toda la noche para los experimentos, que se llevaron a cabo sobre ratas conscientes, aproximadamante 10-15 días tras la cirugía.

Los catéteres gástricos se destaparon y se unieron a un tubo de PE240 flexible para inyección y toma de muestras. Para asegurar la permeabilidad de los catéteres, se inyectaron 2-3 ml de disolución salina a temperatura ambiente e inmediatamente se retiraron del estómago. Esto se repitió hasta que el flujo fue fácil y el efluente era claro. La secreción de ácido gástrico se midió a intervalos de 10 min. inyectando 5 ml de disolución salina y 2 ml de aire vía un catéter, retirando entonces inmediatamente esto mismo vía el otro catéter. De esta manera se pudieron minimizar los errores debido a la aspiración incompleta del pequeño volumen segregado. Se valoraron tres ml de cada aspirado gástrico a pH 7,0 con hidróxido sódico 0,01 N usando un pHmetro (modelo número PHI34 de Beckman, Fullerton, CA). La cantidad de base requerida para cada valoración, corregida para el volumen total aspirado, se usó para calcular los moles de ácido en cada muestra.

Después de que se recogió una muestra de referencia y se registró el volumen recuperado, a los animales se les suministró una inyección subcutánea de pentagastrina 125 \mug/kg (Peninsula Laboratories número de lote 019945 y 034686), y la toma de muestra gástrica a los 10 min. continuó durante otras 2 horas. A cuarenta minutos después de la inyección de pentagastrina, en cuyo momento se observó una meseta estable de secreción de ácido gástrico, a las ratas se les inyectó subcutáneamente con disolución salina (n = 6) o con amilina de rata (lote número AR905-80, Amylin Pharmaceuticals Inc., San Diego, CA) a dosis de 0,01, 0,1, 1,0, 10,0 ó 100 \mug (n = 3, 3, 4, 5, 5, respectivamente).

Como se muestra en la Figura 10A, la pentagastrina estimuló la secreción de ácido gástrico 4,6 veces con respecto a una velocidad basal de aproximadamante 13,8 \pm 2,2 \mumoles/10 min. hasta aproximadamante 63,4 \pm 3,3 \mumoles/10 min., 40 minutos después de la inyección de pentagastrina (media grande; P < 0,0001). La amilina inyectada 40 minutos después de la pentagastrina inhibió, de forma dependiente de la dosis, la producción de ácido gástrico con semividas para el comienzo de acción de 8,6, 10,4, 5,8 y 6,3 minutos para las dosis de 0,1, 1, 10 y 100 \mug, respectivamente. Con la dosis más elevada (100 \mug) de amilina, la secreción de ácido estimulada por pentagastrina se redujo en 93,4 + 2,6% una hora después de la inyección de amilina (P < 0,001 para dosis de 0,1-100 \mug). Esta velocidad de secreción fue sólo 32% de la velocidad basal que precedió a la inyección de pentagastrina (P < 0,01, prueba de la t, corrección de Welch). En la Figura 10B se muestra la respuesta frente a la dosis para la inhibición por amilina de la secreción de ácido estimulada por pentagastrina. La ED_{50} para el efecto supresor de ácido de amilina fue 0,05 \mug/rata \pm0,15 unidades logarítmicas (41 pmoles/kg).

Ejemplo 11 Efectos gastroprotectores de amilina

A ratas macho en ayunas, peso corporal 163-196 g, se les inyectó subcutáneamente 0,1 ml de disolución salina (n = 12) o el mismo volumen que contiene amilina de rata a dosis de 0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1, 3 ó 10 \mug (n = 5, 5, 5, 9, 9, 5, 6 respectivamente) 20 minutos antes de la alimentación por sonda nasogástrica con 1 ml de etanol absoluto (alcohol etílico-alcohol deshidratado prueba 200, USP, Spectrum Quality Products, Inc. Gardena, CA). Treinta minutos después de la alimentación por sonda, cada rata se anestesió con 5% de halotano, se cortó el estómago, se abrió a lo largo de la curvatura más pequeña y se volteó para extraer la mucosa. Los estómagos volteados se enjuagaron suavemente con disolución salina e inmediatamente se clasificaron para determinar el daño de la mucosa por cada uno de los 10 observadores que no conocían el tratamiento experimental. La escala de clasificación se restringió entre cero (sin daño observable) y 5 (100% de la superficie de la mucosa cubierta con hiperemia, ulceración, o tejido necrótico), comparable con el sistema de puntuación de 0-5 usado por otros, por ejemplo, Guidobono F. et al. Br J Pharmacol 120:581-586 (1997). La Figura 11A muestra los resultados de la puntuación de la lesión como un porcentaje de la lesión inducida por etanol.

Para determinar si el efecto gastroprotector de amilina fue atribuible a un mecanismo específico de amilina, se inyectaron a 4 ratas intravenosamente con 3,0 mg del antagonista de amilina selectivo, AC187 (Amylin Pharmaceuticals, Inc. San Diego, CA), 25 minutos antes de la alimentación nasogástrica de etanol, seguido 5 minutos más tarde (a t = -20 min. desde la alimentación nasogástrica) con 0,3 \mug de amilina de rata inyectada subcutáneamente. Los estómagos se cortaron y se clasificaron para la lesión 30 minutos después de la alimentación nasogástrica de etanol, como se describe anteriormente. El resultado se proporciona seguidamente a la última barra de la Figura 11A. La última barra muestra los resultados de la inyección de 3,0 mg de AC187 sin inyección de amilina de rata. En la Figura 11B se muestra una vista más selectiva de los resultados.

La Figura 11C muestra que la amilina, suministrada como una inyección subcutánea 5 minutos antes de la alimentación nasogástrica con etanol, protegió de forma dependiente de la dosis al estómago de la lesión mucosal (P < 0,05 con dosis de 0,1 \mug y superiores). La amilina redujo la puntuación de lesión un 67% con dosis de 0,3 \mug y superiores. La ED_{50} para el efecto gastroprotector de amilina en este sistema experimental fue 0,036 \mug (31 pmoles/kg) \pm 0,40 unidades logarítmicas.

Para explorar adicionalmente si se podría producir un efecto gastroprotector de amilina en respuesta a la secreción de amilina endógena estimulada por glucosa, se comparó el efecto de la gastritis inducida por etanol de la administración de glucosa intraperitoneal previa (250 mg/0,5 ml de D-glucosa; t = -30 minutos desde la alimentación nasogástrica; n = 9) con la lesión observada en ratas tratadas con el vehículo (n = 23). Los estómagos se cortaron y se clasificaron para determinar la lesión 30 minutos después de la alimentación nasogástrica de etanol, como se describe anteriormente, y se tomó sangre para la medida de la glucosa plasmática. La respuesta de la lesión también se midió en ratas tratadas con glucosa a las que se les coadministró un bolo intravenoso de 3 mg de AC187 (n = 9).

Antes de la administración de D-glucosa, que incrementó la glucosa plasmática a t = +30 minutos más tarde hasta 123 mg/dl (frente a 76 mg/dl en controles), y que previamente se había demostrado que incrementa las concentraciones de amilina plasmática endógena en ratas Sprague Dawley en ayunas hasta 4,8 \pm 0,6 pM, la puntuación de la lesión gástrica disminuyó significativamente en 18,5 \pm 4,6% (P < 0,0005). Sin embargo, la inyección previa de AC187 no tuvo ningún efecto sobre las puntuaciones de la lesión en ratas tratadas con glucosa.

Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de pericia de los expertos en la materia a la que pertenece la presente invención.

<110> AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC.

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<120> PÉPTIDOS DE LA FAMILIA AMILINA Y MÉTODOS PARA SU OBTENCIÓN Y UTILIZACIÓN

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<130> 18528.835

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<140> PCT/US05/004631

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<141> 2005-02-11

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<150> 60/550.447

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<151> 2004-03-03

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<150> 60/543.275

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<151> 11-02-2004

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<160> 138

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<170> PatentIn Ver. 3.3

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<210> 1

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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7

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<210> 2

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 2

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8

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<210> 3

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Oncorhynchus sp.

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<400> 3

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9

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<210> 4

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<211> 32

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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10

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<210> 5

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: motivo de péptido sintético

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (1)

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<223> Cualquier aminoácido o no presente; véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción detallada de sustituciones y formas de realización preferidas

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (2)

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (3)

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (4)

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<223> Cualquier aminoácido, véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción detallada de sustituciones y formas de realización preferidas

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (5)

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (6)

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<400> 5

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11

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<210> 6

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

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<400> 6

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12

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<210> 7

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

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<400> 7

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13

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<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\hskip1cm

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\hskip1cm

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D-Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\hskip1cm

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(OPO3H2)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\hskip1cm

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\hskip1cm

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\hskip1cm

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Hse

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\hskip1cm

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ahb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ahp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\hskip1cm

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de aminoácidos sintética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Esta región puede englobar 1-4 aminoácidos variables

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Arg, Orn, hArg, Cit, hLys, o Lys(for)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu o Phe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Arg, Orn, hArg, Cit, hLys, Lys(for), o Lys(PEG5000)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg o Pro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Esta región puede englobar 1-4 aminoácidos variables

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

35

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Esta región puede englobar 1-4 aminoácidos variables residuales

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Met, o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln, Gly, o His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Thr, Asn, Phe, Tyr, Ser, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn, Arg, Ala, Asp, Glu, Gln, Thr, o Gly

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Leu, Ser, Glu, Ala, Asp, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Asp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val, His, Ser, Phe, o Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His, Arg, Lys, Orn, hArg, Cit, hLys, Lys(for), o Lys(PEG5000)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu, Ser, o Phe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gln o His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr, Val, Phe, Leu, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Arg o Pro

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Esta región puede englobar 1-4 aminoácido variable residues

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia sintética de aminoácidos C-terminal

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Tyr, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser, Pro, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser, Pro, Arg, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Val, Thr, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn, Lys, o Gly

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Phe, o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Tyr, Phe, Pro, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable, hCys, hLys, hArg, Hse, Hyp, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable o no presente; véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción detallada de sustituciones y formas de realización preferidas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Asn, Gln, Gly, Val, Arg, Lys, hLys, hArg, His, Ile, Leu, Met, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Ile, Leu, Ser, Hse, Thr, Val, Met, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Ser, Thr, Hse, Tyr, Val, Ile, Leu, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ala, Ser, Hse, Tyr, Val, Ile, Leu, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Val, Ile, Leu, Phe, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu, Thr, Ser, Hse, Val, Ile, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly, His, Gln, Lys, Arg, Asn, hLys, o hArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Arg, Gln, Asn, hLys, hArg, o His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu, He, Val, Phe, Met, Trp, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Phe, Tyr, Asn, Gln, Ser, Hse, o Thr

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Lys, Gln, Arg, His, hArg, o hLys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Phe, Leu, Ser, Tyr, He, Val, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu, Phe, Met, Val, Tyr, o He

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His, Gln, Asn, Ser, Hse, Thr, o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, hLys, Arg, hArg, His, Cit, o Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Leu, Ser, Hse; Val, Ile, Thr, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His, Arg, Lys, hArg, hLys, Asn, Gln, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ser, Hse, Val, Ile, Leu, Gln, Asn, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Leu, Met, Val, Tyr, o Ile

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (23)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro o Hyp

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro, Hyp, Arg, Lys, hArg, hlys, o His

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ser, Hse, Val, Ile, Leu, Phe, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn, Gln, Asp, o Glu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Val, Ser, Phe, Ile, o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ser, Hse, Thr, Val, Ile, Leu, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu, Gly, Lys, Asn, Asp, Arg, hArg, hLys, His, o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Thr, Ser, Hse, Val, Ile Leu, Phe, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Pro, Tyr, Hse, Ser, Thr, o Hyp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Cys, Asp, Phe, Ile, Lys, Ser, Thr, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys, Asp, Ser, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Asn, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Leu Thr, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Ala, Ser, o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys, Lys, o Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Val, Leu, o Met

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly, His, o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Arg, Gln, o hArg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu, Trp, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Phe, Asn, Gln, Ser, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Lys, Gln, o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Phe, Leu, Ser, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Phe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Hie, Gln, Ser, o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Arg, hArg, Cit, o Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Leu, Ser, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His, Gln, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr, Asn, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Leu, Met, Val, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (27)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Glu, Gly, Lys, o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Pro, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Cys, Phe, Ile, Lys, Ser, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys, Asp, o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Leu, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cys o Lys

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Val

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

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<223> Gly, His, o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

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<223> Lys, Arg, o hArg

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Phe, Asn, Ser, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Asn, Gln, o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (15)

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<223> Ala, Glu, Phe, Leu, Ser, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (17)

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<223> His, Ser, o Val

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Arg, hArg, Cit, o Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (19)

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<223> Phe, Leu, o Ser

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (20)

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<223> His o Gln

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (21)

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<223> Thr o Asn

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)

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<223> Phe, Leu, Met, Val, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (24)

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<223> Pro o Arg

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (27)

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<223> Thr o Val

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (30)

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<223> Glu, Gly, Lys, o Asn

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (31)

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<223> Ala o Thr

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (32)

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<223> Phe, Pro, o Tyr

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

42

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

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<223> Ala, Cys, Asp, Phe, Lys, Thr, o no presente

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (2)

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<223> Ala, Cys, Asp, Ser, o no presente

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (3)

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<223> Ala, Asp, Asn, o no presente

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Leu Thr, o no presente

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Ser, Thr, o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Cys, o Lys

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Leu, Met, o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Gly, His, o Gln

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys, Gln, o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Leu, Trp, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asn, Gln, Ser, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

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<223> Ala, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Gln, o Arg

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Asp, Glu, Phe, Leu, Ser, o Tyr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe o Leu

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His, Gln, Ser, o Val

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Leu, Ser, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> His, Lys, Gln, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (21)

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<223> Gln, Thr, o no presente

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (22)

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<223> Phe, Leu, o Tyr

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (24)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Pro o Arg

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

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<222> (27)

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<223> Thr o Val

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<220>

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<221> MOD_RES

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<222> (30)

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<223> Glu, Lys, o Asn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Phe, Tyr, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211>32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Ser

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ac-Agy

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Agy

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ac-Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Agy

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Agy

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aib

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

70

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(For)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip1cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> D-Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> dAh

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ac-Ala

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Lys(PEG5000)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Hse

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ahb

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ahp

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Thr(OPO3H2)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> homoK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> homoK

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-Octilglicina

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\hskip1cm

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N-3,6-dioxaoctarioil-Cys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\hskip1cm

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\hskip1cm

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\hskip1cm

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\hskip1cm

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\hskip1cm

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 9Anc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\hskip1cm

97

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> L-octilglicina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\hskip1cm

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N-isocaproil-Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\hskip1cm

99

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> homoR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> homoR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\hskip1cm

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\hskip1cm

101

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cit

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\hskip1cm

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Orn

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\hskip1cm

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\hskip1cm

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 1-Octilglicina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\hskip1cm

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Cys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\hskip1cm

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cit

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\hskip1cm

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 4ABU

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\hskip1cm

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Isocaproil-Lys

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 4ABU

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\hskip1cm

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\hskip1cm

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\hskip1cm

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\hskip1cm

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\hskip1cm

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\hskip1cm

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\hskip1cm

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\hskip1cm

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\hskip1cm

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\hskip1cm

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\hskip1cm

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\hskip1cm

120

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\hskip1cm

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\hskip1cm

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\hskip1cm

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\hskip1cm

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\hskip1cm

125

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\hskip1cm

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\hskip1cm

127

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\hskip1cm

128

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\hskip1cm

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\hskip1cm

130

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\hskip1cm

131

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\hskip1cm

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\hskip1cm

133

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\hskip1cm

134

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\hskip1cm

135

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\hskip1cm

136

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\hskip1cm

137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\hskip1cm

138

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\hskip1cm

139

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\hskip1cm

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\hskip1cm

141

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\hskip1cm

142

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\hskip1cm

143

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable; véase la memoria descriptiva tal como se presenta para la descripción detallada de sustituciones y formas de realización preferidas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Aminoácido variable o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Gly, Ser, Asp, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asn, Ala, Asp, Gly, o no presente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Leu, Thr, o Ser

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Ser, o Thr

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Ala, Ser, Val, Hse, Ahb, Ahp, D-thr, Thr, o un derivado del mismo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> MOD_RES

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\hskip1cm

144

Claims

1. Péptido de la familia amilina, en el que el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 137, o la secuencia de SEC ID nº: 137 que incluye una sustitución, inserción o supresión de aminoácidos, en el que el péptido reduce la ingesta de alimentos.

2. Péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido comprende la secuencia de SEC ID nº: 43.

3. Uso de un péptido según la reivindicación 1 ó 2 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de trastornos alimentarios, resistencia a insulina, obesidad, hiperglucemia postprandial anormal, diabetes de cualquier tipo, incluyendo Tipo I, Tipo II y diabetes gravídica, síndrome metabólico, síndrome de evacuación gástrica rápida, hipertensión, dislipidemia, enfermedad cardiovascular, hiperlipidemia, apnea del sueño, cáncer, hipertensión pulmonar, colecistitis, y osteoartritis.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que la composición farmacéutica es para el tratamiento de obesidad.

5. Péptido según la reivindicación 1 ó 2 para uso como un medicamento.