KR20140027232A

KR20140027232A - 장시간 작용하는 펩티드 유사체

Info

Publication number: KR20140027232A
Application number: KR1020137029474A
Authority: KR
Inventors: 셰우 유 수; 치아 린 창
Original assignee: 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
Priority date: 2011-04-07
Filing date: 2012-04-05
Publication date: 2014-03-06
Also published as: JP6143740B2; TWI635868B; JP6522020B2; WO2012138867A3; TW201302218A; TWI561242B; US20140155329A1; EP2696884A4; CN103458916B; JP2014511862A; BR112013024784A2; CA2830372A1; US11666633B2; AU2012240144A1; US9694051B2; WO2012138867A2; JP2017082000A; AU2012240144B2; US20170014485A1; TW201717996A

Abstract

체내에서 확장된 반감기를 갖는, 칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질을 위하여 장시간 작용하는 아고니스트성 유사체들이 제공된다.

Description

장시간 작용하는 펩티드 유사체{LONG-ACTING PEPTIDE ANALOGS}

본 발명은 칼시토닌 펩티드 호르몬 군의 구성원들인, 인터메딘(intermedin) 또는 아드레노메둘린(adrenomedullin)의 신규 폴리펩티드 유사체들에 관한 것이다.

단식, 스트레스 반응, 및 생식을 포함하는 생리학의 많은 양상들은 제어를 위한 호르몬 균형에 의존한다. 이러한 균형은 내부 및 외부 자극 모두에 반응할 수 있다. 예를 들면, 뇌하수체 전엽(anterior pituitary gland)에 의한 호르몬들의 분비는 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체 바로 위에 위치하는 뇌의 영역에 의해 주로 제어된다. 시상하부 뉴런들은 뇌하수체에서 생산하는 일련의 특이 세포들에 의해 특정 호르몬의 분비를 자극하거나 저해하는 펩티드 인자들을 만들고 방출하는 것으로 알려졌다.

다양한 시상하부 방출 펩티드는 성장 호르몬(Growth hormone, GH), 부신피질자극 호르몬(Adrenocorticotropic Hormone, ACTH), 갑상선 자극 호르몬(Thyroid Stimulating Hormone, TSH) 및 난포 자극 호르몬(follicle stimulating hormone, FSH)과 같은 서로 다른 뇌하수체 전엽 호르몬들의 분비의 조절에 중요하다. 그러나, 뇌하수체 전엽에 의한 프로락틴(prolactin) 방출의 조절은 더 복잡하며, 시상하부와 중간엽(intermediate lobe) 모두로부터 기원하는 자극 인자를 포함한다(Laudon 등 (1990) Endocrinology 126: 3185-3192; Ben-Jonathan과 Hnasko (2001) Endocr. Rev. 22: 724-763 참조). 비록 프로락틴 분비의 조절에서 중간엽의 역할이 잘 설명되고, 중간엽 및 후엽(posterior lobe)이 프로락틴 방출에서 흡유(suckling)- 또는 에스트라디올(estradiol)-유도 증가를 위하여 필요하나, 중간엽으로부터의 프로락틴 방출 인자들의 식별은 여전히 특징지어져야 하는 것들로 남아 있다(Allen 등 (1995) Endocrinology 136: 3093-3099).

뇌하수체 칼시토닌 수용체-유사 수용체(calcitonin receptor-like receptor, CRLR)는 비록 뇌 내에 칼시토닌 수용체-유사 수용체들을 위한 결합 부위를 갖는 오버래핑 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 발현 패턴의 결여가 존재하나(Kruger 1988. Brain Res. 463: 223-244), 프로락틴 방출과 관련되어 왔다(Meeran 등 1997. J. Clin. Endocrinol. Metab. 82: 95-100). 원래 칼슘 균형에 필수적인 폴리펩티드 호르몬으로서 분리되는, 칼시토닌은 알파 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 베타 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 아드레노메둘린(ADM), 및 아밀린(amylin)을 포함하는, 펩티드 호르몬들의 그룹에 속한다(Eto (2001) Peptides 22: 1693-1711). 이러한 조직-특이 펩티드들은 맥관 및 호흡계에서의 항상성 유지를 위한 중요한 내분비 및 신경분비 통합자(integrator)들이다.

이러한 펩티드들의 생물학적 작용들은 2형 G 단백질 결합 수용체(type Ⅱ G protein-coupled receptor)들로의 결합을 거쳐 매개된다(Christopoulos 등. (1999) Mol. Pharmacol. 56: 235-242; Poyner 등. (2002) Pharmacol. Rev. 54: 233-246). 비록 칼시토닌 수용체가 칼시토닌 작용을 위한 주요 중재자이나, 이것은 또한 아밀린을 결합한다. 최근의 클로닝 및 가능 연구들은 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 및 세 가지 수용체 활성 변형 단백질(Receptor Activity-Modifying Protein, RAMP)들의 서로 다른 조합들과 상호작용한다는 것을 나타내었다(McLatchie 등. (1998) Nature 393: 333-339 참조).

많은 세포들은 다수의 수용체 활성 변형 단백질을 발현한다. 칼시토닌 수용체 유사 수용체 및 수용체 활성 변형 단백질의 공동 발현은 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 및 아드레노메둘린을 위한 기능 수용체들을 발생시키는데 필요하다. 수용체 활성 변형 단백질 및 칼시토닌 수용체 유사 수용체 사이의 헤테로다이머(heterodimer)의 형성은 두 칼시토닌 수용체 유사 수용체 및 아드레노메둘린 수용체의 적절한 세포 표면 표적화(targeting) 및 약학적 특성들에 필수적이다. 수용체 활성 변형 단백질 패밀리(family)는 3가지 구성원(수용체 활성 변형 단백질1, -2, 및 -3)를 포함하는데, 이는 30% 이하의 서열 동일성을 공유하나 통상의 위상 조직을 공유한다. 큰 세포외 N 말단(∼ 100 아미노산), 단일 세포막관통 도메인(transmembrane domain), 및 매우 짧은 세포내 도메인(10 아미노산)을 갖는 작은 고유 세포막 단백질들(예측되는 크기들: M _r 14,000-17,000)이 존재한다. 수용체 활성 변형 단백질 1의 칼시토닌 수용체 유사 수용체와의 공동 발현은 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 수용체의 형성에 이르게 하며, 수용체 활성 변형 단백질 2 및 수용체 활성 변형 단백질 3은 아드레노메둘린 수용체의 발현을 촉진한다. 칼시토닌 수용체가 수용체 활성 변형 단백질 1과 공동 발현될 때 이는 칼시토닌 유전자 관련 펩티드/아밀린 수용체를 위하여 제공하며, 수용체 활성 변형 단백질3과 공동 발현될 때 이는 아밀린 수용체를 위하여 제공한다.

알파 칼시토닌 유전자 관련 펩티드, 아드레노메룰린, 또는 아밀린이 결핍된 돌연변이 쥐들을 사용하는 연구는 서로 다른 시스템들에서, 칼시토닌 수용체-유사 수용체는 심혈관 형태발생, 감각 신경전달작용, 염증성 반응들, 침해 반응(nociceptive reaction), 및 글루코오스(glucose) 항상성을 위하여 중요할 수 있다는 것을 나타내었다. 따라서, 이러한 과에서의 펩티드들의 생리학적 기능은 개별 리간드(ligand)들의 수용체-결합 특이성 및 조직 발현 프로파일에 의해 결정된다.

펩티드 호르몬들은 고혈압의 치료와 심혈관 항상성의 유지를 포함하는, 임상 사용과 치료의 개발을 위한 커다란 관심의 대상이다. 이러한 효과들에 더하여, 프로락틴 방출 인자의 식별이 관심사다. 비록 프로락틴이 포유류에서의 임신과 젖 분비에 중요하고, 유선(mammary gland)의 발생과 모유 합성의 촉진에 관여하지만, 특정한 프로락틴 방출 호르몬은 지금까지 알려지지 않았다.

관련 문헌들

Hay와 Smith(2001, Trends Pharmacol. Sci. 22:57-59) 및 Shindo 등(2001, Circulation 104: 1964-197)은 맥관구조(vasculature)에서의 아드레노메둘린의 중요성을 논의한다. 칼시토닌 유전자 관련 펩티드의 역할은 Zhang 등(2001, Pain 89: 265-273); Salmon 등(1999, Neuroreport 10: 849-854); 및 Salmon 등(2001, Nat. Neurosci. 4: 357-358)에 의해 논의된다. 아밀린의 역할은 Mulder 등(2000, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278: E684-691)에 의해 논의된다.

젠뱅크 엔트리(GenBank entry) AF529213.

여기에 칼시토닌 수용체 유사 수용체를 위한 리간드로서의 작용을 포함하는, 인터메딘(intermedin) 또는 아드레노메둘린의 생물학적 활성을 위하여 제공하나, 원래의 폴리펩티드와 비교하여 실질적으로 더 긴 체내(in vivo) 반감기를 위하여 제공하는, 장시간 작용하는 펩티드 유사체들이 제공된다. 본 발명의 유사체들은 원래의 폴리펩티드보다 지속시간에서 적어도 2배 길게 지속하는, 그리고 5배, 10배, 20배, 또는 그 이상 길 수 있는 체내 효과성을 위하여 제공한다. 증가된 체내 활성은 폴리펩티드의 안정성, 생리학적 효과의 길이 등을 결정함으로써 체내, 또는 체외(in vitro)에서 측정될 수 있다.

본 발명의 일부 실시 예들에서, 유사체들은 N-말단에서 변형된 생물학적으로 활성인 인터메딘 또는 아드레노메둘린 폴리펩티드를 포함한다. 흥미 있는 N-말단 변형들은 지방산, 일반적으로 불포화되거나 포화될 수 있는, 일반적으로 C4 내지 C30 지방산으로의 접합을 포함한다. 흥미 있는 지방산들은 제한 없이, 팔미트산(palmitic acid); 스테아르산(stearic acid); 아라키드산(arachidic acid); 라우르산(lauric acid); 미리스트산(myristic acid); 미리스트올레산(myristoleic acid); 팔미톨레산(palmitoleic acid); 사피에닉산(sapienic acid); 올레산(oleic acid); 리놀레산(linoleic acid); 알파-리놀레산; 아라키돈산(arachidonic acid); 에이코사펜타메노산(eicosapentaenoic acid); 에루스산(erucic acid); 도코사헥사에노산(docosahexaenoic acid) 등을 포함한다. 다른 실시 예들에서, 폴리펩티드는 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여 페길화(pegylation), 글리코실화(glycosylation), 알부민과 같은 거대 단백질과의 접합, 또는 D-아미노산 또는 베타 아미노산들의 사용과 같은 아미노산 변형들과 결합되는 중합체들로의 접합에 의해 변형된다.

본 발명의 유사체들은 칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질 수용체들을 위하여 장시간 작용하는 유사체들을 제공한다. 유사체들은 혈압에 영향을 주는 동안에 심박수에 대한 제한된 효과를 제공할 수 있다. 혈청 내의 장기간 작용하는 펩티드의 구분(compartmentalization)은 주어진 시점에서 세포 자극을 위한 아고니스트(agonist)들의 이용가능한 부분을 감소시켰으며, 그렇게 함으로써 주입된 펩티드들의 최대 및 최저 효과(peak and trough effect)를 완화하고 원치 않는 부작용을 제거한다.

도 1a-1c는 장시간 작용하는 인터메딘 펩티드(팔미트산 변형 인터메딘, IMD-PA)로의 처리 후에 자연발생성 고혈압 쥐들(spontaneously hypertensive rats, SHR, 이하 SBR로 표기)에서의 혈압 측정들의 예들이다, A. 30 nmole/㎏ 체중(BW); B/C, 100 nmole/㎏ 체중.
도 2a-2b는 야생형 인터메딘 펩티드(IMD, 100 nmole/㎏ 체중)로의 주입 후에 SBR 쥐들에서의 혈압 측정들의 예들이다. 팔미트산 변형 인터메딘 펩티드의 혈압강하 효과는 체내에서 5시간 이상 지속되었으나, 변형되지 않은 인터메딘 펩티드는 1.5시간 이하로 지속되었다.
도 3a-3b는 대조군 동물들에 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS, 이하 PBS로 표기)로의 주입 후의 혈압 측정들을 도시한다.
도 4는 세 가지의 서로 다른 수용체(칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질1, 칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질2, 칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질3)를 발현하는 293T 세포들 내의 인터메딘 및 팔미트산 변형 인터메딘의 자극 효과를 도시한다.
도 5a-5c는 장시간 작용하는 아드레노메둘린 펩티드(팔미트산 접합 아드레노메둘린, Palmitic acid-conjugated ADM, ADM-PA, 100 nmole/㎏ 체중)의 주입 후에 SBR 쥐들이 수축기 압력의 예들을 도시한다. 본 펩티드의 혈압강하 효과는 체내에서 5시간 이상 지속되었다. 그에 반해, 변형되지 않은 아드레노메둘린 펩티드의 혈압강하 효과는 정상적으로 1.4시간 이하로 지속되었다.
도 6a-6b는 대조군 식염수의 주입 후에 SHR 쥐들의 수축기 압력 측정의 예들을 도시한다.
도 7은 재조합 아드레노메둘린 수용체 1(칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질2) 및 2(칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질3)을 발현하는 293T 세포들 내의 아드레노메둘린 및 팔미트산 접합 아드레노메둘린의 자극 효과를 도시한다. 비록 팔미트산 접합 아드레노메둘린 펩티드의 자극 효과가 체외 야생형 아드레노메둘린의 그것보다 낮으나, 체내에서 상당히 긴 유효 기간을 갖는다.
도 8은 복강내 주입 후 12시간에서의 아드레노메둘린 펩티드와 비교하여 상당히 높은 레벨의 면역반응성 팔미트산 접합 아드레노메둘린이 유지되는 것을 도시한다.

본 발명은 칼시토닌 펩티드 호르몬 군의 구성원들인, 인터메딘 또는 아드레노메둘린의 신규 폴리펩티드 유사체들을 제공한다.

인터메딘은 칼시토닌 수용체 유사 수용체를 위한 리간드이다. 인간 인터메딘 유전자는 N-말단에서의 분비를 위한 24 아미노산 신호 펩티드 및 성숙 아미드화 펩티드로(서열목록의 서열번호: 1 및 서열목록의 서열번호: 3에 도시), 148 아미노산 개방 판독 프레임(open reading frame, ORF)을 인코딩한다. 성숙 인간 인터메딘 펩티드들은 제한 없이 성숙 단백질의 잔기 8-47과 상응하는, 서열목록의 서열번호:3에 제시된 것과 같은 40 아미노산 펩티드(인터메딘-결핍(short) 또는 IMDS); 및 서열목록의 서열번호: 4에 제시된 것과 같은 47 아미노산 성숙 펩티드(인터메딘-지속(long) 또는 IMDL)를 포함한다. 인터메딘 펩티드는 변형의 편리를 위하여 말단 라이신 잔기로 치환될 수 있다. 예를 들면, 흥미있는 인터메딘 펩티드는 서열목록의 서열번호: 7: K(mod)GCVLGTCQVQNLSHRLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY에 제시된 것과 같은데, 말단 라이신은 예를 들면, 지질 또는 다른 그룹의 부착(attachment)에 의해 변형된다.

아드레노메둘린은 칼시토닌 수용체 유사 수용체를 위한 리간드이다. 아드레노메둘린 유전자는 2가지의 생물학적으로 활성인 펩티드, 아드레노메둘린 및 프로아드레노메둘린 N-말단 20 펩티드(PAMP)를 발생시키기 위하여 번역 후에(posttranslationally) 변형되는, 프리프로호르몬(preprohormone)을 위하여 인코딩한다. 프리프로아드레노메둘린(preproadrenomedullin)으로 불리는, 전구체는 185 아미노산 길이이다. 젠뱅크 참조 NM_001124가 참조되는데, 이는 여기에 특히 참조로써 통합된다. 전구체 폴리펩티드(서열목록의 서열번호: 5)는 다음과 같은 아미노산 서열을 갖는다:

MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGLADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGSAPHFL.

본 발명의 목적을 위하여, 용어 "아드레노메둘린 펩티드"는 달리 명시되지 않는 한, 아드레노메둘린 전구체 펩티드로부터 유래하는 어떠한 활성 펩티드를 언급할 수 있다. 그중 특히 흥미 있는 것은 저혈압 펩티드들이다. 활성 펩티드는 제한 없이, 다음과 같은 아미노산 서열(서열목록의 서열번호: 6)을 갖는 아드레노메둘린 펩티드를 포함하는데:

K(mod)GCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY,

여기서 전기 1에서 라이신은 예를 들면, 지질 또는 다른 그룹의 부착에 의해 변형된다.

본 발명의 일부 실시 예들에서, 하나 또는 그 이상의 인터메딘 및 아드레노메둘린은 오래 지속되는 유사체를 제공하기 위하여 본 발명의 방법에 의해 변형된다.

본 발명의 일부 실시 예들에서, 유사체들은 구조 Ⅰ에 도시된, N-말단에서 변형된 생물학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시 예들에서 폴리펩티드는 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여 페길화, 글리코실화, 알부민과 같은 거대 단백질과의 접합, 또는 D-아미노산 또는 베타 아미노산들의 사용과 같은 아미노산 변형들과 결합되는 중합체들로의 접합에 의해 변형될 수 있다.

여기서 R₁은 선형 또는 분기된 C₃-C₁₀₀ 알킬; 바람직하게는 선택적으로 할로(halo), 히드록시(hydroxy), 알콕시(alkoxy), 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노(dialkylamino), 설페이트(sulfate), 또는 포스페이트(phosphate)로 치환되고, 예를 들면, 18:0, 24:0 및 24:1로 포화되거나, 혹은 모노(mono)- 또는 디(di)-불포화되는 C₄-C₃₀ 알킬이다. 흥미 있는 지방산들은 제한 없이, 팔미트산; 스테아르산; 아라키드산; 라우르산; 미리스트산; 미리스트올레산; 팔미톨레산; 사피에닉산; 올레산; 리놀레산; 알파-리놀레산; 아라키돈산; 에이코사펜타메노산; 에루스산; 도코사헥사에노산 등을 포함한다.

본 발명의 유사체들은 원래의 폴리펩티드보다 지속시간에서 적어도 2배 길게 지속하는, 그리고 5배, 10배, 20배, 또는 그 이상 길 수 있는 체내 효과성을 위하여 제공한다. 증가된 체내 활성은 폴리펩티드의 안정성, 생리학적 효과의 길이 등을 결정함으로써 체내, 또는 체외에서 측정될 수 있다. 특히 흥미로운 것은 저혈압 효과인데, 적어도 약 10%의 수축기 혈압을 감소시키는데 유효한 유사체 펩티드의 단일 투여량은 적어도 약 1시간, 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 또는 그 이상 동안 감소된 혈압을 유지하는데 효과적이다.

인터메딘들 또는 아드레노메둘린들은 칼시토닌 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질 수용체들의 리간드들이고, 결합 상에서 수용체를 활성화한다. 인터메딘에 의한 활성은 프로락틴의 방출, 성장 호르몬 방출의 조절을 야기하고, 맥관계 효과들에서 혈압과 혈관 확장의 저하를 포함한다. 따라서, 인터메딘은 말초 혈관확장 관련 과정들을 조절하기 위하여 칼시토닌 수용체 유사 수용체를 통하여 신호를 보낸다. 아드레노메둘린에 의한 활성은 혈압과 혈관 확장의 저하를 포함하는 맥관계 효과들을 야기한다. 따라서, 아드레노메둘린은 말초 혈관확장 관련 과정들을 조절하기 위하여 칼시토닌 수용체 유사 수용체를 통하여 신호를 보낸다.

본 발명의 방법에 의한 변형을 위하여, 미접촉(naive) 인터메딘, 아드레노메둘린 또는 그것들의 변형들이 사용될 수 있다. 흥미 있는 펩티드들은 적어도 약 12 인접 아미노산, 더 일반적으로 적어도 약 20 인접 아미노산의 단편들을 포함하고, 완전한 펩티드까지, 30, 35, 40 또는 그 이상의 아미노산들을 포함할 수 있으며, 전구체 단백질에 존재하는 다른 서열들을 포함하기 위하여 더 신장할 수 있다. 결실(deletion)들은 펩티드의 잔기 1부터 10까지 신장할 수 있으며, 잔기 10-15 또는 그 이상에서 부가적으로 아미노산들을 더 결실할 수 있다. 1부터 5 아미노산까지의 더 작은 결실들은 N-말단에서 결실될 수 있다. 치료 목적을 위한 흥미 있는 펩티드들은 실질적으로 제공되는 펩티드 모두를 포함할 수 있거나, 또는 인터메딘의 생물학적 활성을 유지하는 그것들의 단편들을 포함할 수 있다.

폴리펩티드의 서열은 서열 내의 표적화 변경들을 발생시키기 위하여 종래에 알려진 다양한 방법으로 변경될 수 있다. 폴리펩티드들은 여기서 제공되는 서열들과 상당히 유사할 것인데, 즉, 적어도 하나의 아미노산이 다를 것이며, 적어도 두 개, 그러나 약 10개의 아미노산 이하로 다를 것이다. 서열 변화들은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 필수 아미노산들을 결정하기 위하여 계통적으로 알라닌(alanine) 또는 다른 잔기들을 도입하는 돌연변이의 스캐닝이 사용될 수 있다. 보전적 아미노산 치환들은 일반적으로 다음의 그룹들 내의 치환들을 포함한다: (글리세린(glycine), 알라닌); (발린(valine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine)); (아스파르트산(aspartic acid), 글루타민산(glutamic acid)); (아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine)); 세린(serine), 트레오닌(threonine)); (라이신, 아르기닌(arginine)); 또는(페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine)).

일차 서열을 변경하지 않는 흥미 있는 변형들은 폴리펩티드들의 화학 유도체화(chemical derivatization), 예를 들면, 아세틸화, 또는 카르복실화를 포함한다. 글리코실화의 변형들, 예를 들면, 그것의 합성 및 처리 동안에 또는 미래의 처리 단계들에서 폴리펩티드의 글리코실화 패턴들의 변형에 의해, 예를 들면, 폴리펩티드들의 포유류 글리코실화 효소들 또는 탈글리코실화 효소들과 같은, 글리코실화에 영향을 미치는 효소들로의 노출에 의해 만들어지는 변형들이 또한 포함된다. 또한 인산화 아미노산 작기들, 예를 들면, 포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린(phosphoserine) 또는 포스포트레오닌(phosphothreonine)을 갖는 서열들이 포함된다.

가수분해 저하에 대한 그것들의 저항성을 향상시키거나 용해 특성들을 최적화하거나 또는 치료 제제로서 그것들을 더 적합하게 제공하기 위하여 통상의 분자생물학적 기술들 및 합성 화학을 사용하여 변형된 폴리펩티드들이 본 발명 내에 포함된다. 예를 들면 펩티드의 백본(backbone)은 안전성을 향상시키도록 고리화될(cyclized) 수 있다(Friedler 등 (2000) J. Bio. Chem. 275: 23783-23789 참조). 그러한 폴리펩티드들의 유사체들은 자연적으로 발생하는 L-아미노산들, 예를 들면, D-아미노산들 또는 비자연적으로 발생하는 합성 아미노산들 이외의 잔기들을 포함하는 것들을 포함한다.

대상 펩티드들은 종래에 알려진 방법들을 사용하여, 체외 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치들, 미국 캘리포니아주 포스터시 소재의 Applied Biosystems사, Beckman사 등의 자동 펩티드 합성기(automated peptide synthesizer)들이 이용가능하다. 합성기들의 사용에 의해, 자연적으로 발생하는 아미노산들이 비천연 아미노산들로 대체될 수 있다. 특정 서열 및 제조 방법은 편이성, 경제성, 필요한 순도 등에 의해 결정될 것이다.

만일 원하면, 다양한 기(group)들이 합성 또는 발현 동안에 펩티드 내로 도입될 수 있는데, 이는 다른 분자들 또는 표면들로의 결합을 허용한다. 따라서, 시스테인(cysteine)들은 금속 이온 복합체에 결합하기 위한 티오에테르(thioether), 히스티딘(histidine), 아미드(amide) 또는 에스테르(ester)들을 형성하기 위한 카르복실기들, 아미드들을 형성하기 위한 아미노기들을 만들기 위하여 사용될 수 있다.

폴리펩티드는 또한 종래의 재조합 합성 방법에 따라 분리되고 정제될 수 있다. 용해물들은 고성능액체크로마토그래피(HPLC, 이하 HPLC로 표기), 배제(exclusion) 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 사용하여 정제된 발현 숙주 및 용해물로 제조될 수 있다. 대부분, 사용되는 조성물들은 제품의 제조 방법과 관련된 오염물질 및 그것의 정제와 관련하여, 원하는 제품의 적어도 20% 중량, 더 일반적으로 적어도 75% 중량, 바람직하게는 약 9%% 중량, 및 치료 목적을 위하여, 일반적으로 약 99.5% 중량을 포함할 것이다. 일반적으로 퍼센트 비율은 총 단백질을 기초로 할 것이다.

인터메딘/아드레노메둘린의 사용

인터메딘 및 아드레노메둘린의 약학적 활성들을 고려하여 많은 임상 indication이 명백하며, 제한 없이 고혈압, 예를 들면 임신 고혈압(pregnancy hypertension), 폐동맥(pulmonary arterial) 고혈압, 비만과 관련된 고혈압 등; 기관지폐형성장애(bronchopulmonary dysplasia), 상처 치유; 등을 포함한다. 예를 들면, 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드 혹은 그것들의 변형들이 발견할 수 있는 임상 indication들은 특히 고혈압의 치료에서 사용한다. 본 발명의 유사체들은 심박동수에 영향을 미치지 않고, 혈압, 예를 들면, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20% 또는 그 이상의 수축기압에서의 감소를 위하여 제공한다.

고혈압은 만일 치료되지 않으면, 죽상경화성 심장혈관병(atherosclerotic cardiovascular disease)에 매우 취약하게 하는 질병이다. 고혈압은 비만증이 없는 사람보다 비만증을 갖는 사람들에 보통 약 2배이다 고혈압의 유병률은 연령에 따라 증가한다.

고혈압은 단일 측정을 기초로 하여 진단되어서는 안 된다. 초기 높은 혈압 측정은 고혈압의 진단을 위하여 필요한 90 ㎜Hg 또는 그 이상의 평균 확장기(diastolic) 혈압 혹은 140 ㎜Hg 또는 그 이상의 수축기 혈압으로 1주일에 적어도 2회 또는 그 이상의 추가 방문이 확인되어야만 한다. 혈압의 큰 가변성 및 고립형(isolated) 수축기 고혈압의 더 큰 가능성 때문에 당뇨병을 갖는 사람들에서의 고혈압의 진단에 특별한 주의가 요구된다. 이러한 환자들을 위하여 130/85 ㎜Hg 미만의 목적 혈압이 추천된다.

식이 변화에 더하여, 고혈압을 제어하기 위하여 약물학적 치료가 필요할 수 있다. 동맥 혈압을 감소시키기 위하여 대상 펩티드들이 투여될 수 있다. 게다가, 고혈압을 감소시키는 이차 효과는 부종 및 염증성 삼출액(exedate) 양의 감소이다.

인터메딘 또는 아드레노메둘린 유사체들을 포함하는 약학 조성물은 예를 들면, 심근 허혈(myocardial ischemia)의 결과로 나타나는 허혈 손상 또는 심근 경색 크기(myocardial infarct size)를 완화하기 위한 심근예방 제제로서 유용하다. 심근 손상의 정도, 즉, 급성 심근 허혈이 뒤따르는, 심근 경색의 정도를 제한할 수 있는 새로운 치료제의 개발은 현대 심장학의 주요 관심사이다. 또한 혈전 용해 요법(thrombolytic therapy)과 함께, 또는 단독으로 투여될 수 있는 추가의 심근 보호를 제공할 수 있는 치료의 개발에 관심을 가져왔는데. 그 이유는 후향성 전염병학적 연구들이 처음 수년 동안의 사망률이 원래의 경색 크기에 관련된 것으로 나타나기 때문이다.

심근 허혈(myocardinal ischemia)은 심근 산소 공급과 수요의 불균형의 결과이며 운동성 및 혈관경련성(vasospastic) 심근 기능장애를 포함한다. 운동성 허혈은 일반적으로 하부심내막 흐름(subendocardial flow)에서의 감소를 야기하는 큰 관상 동맥 질환(coronary arteries)을 포함하는 중요한 죽상경화성 협착증(atherosclerotic stenosis)의 존재의 결과로 간주된다. 혈관경련성 국소빈혈(vasospastic ischemia)은 다양한 경련(spasm)과 관련되는데, 이것의 발명은 과로 또는 스트레스와 관련되지 않는다. 경련은 혈관 긴장도(vascular tone)에서의 갑작스런 증가로서 더 잘 정의된다.

본 발명의 화합물들은 심장보호 치료가 필요한 환자들의 치료에 정상적으로 경구로 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 투여 요법(dosage regimen)은 개선이 획득될 때까지 최대 치료 반응 및 그 후에 완화를 주는 최소 실효 레벨을 보장하는 것이다. 따라서, 일반적으로, 투여량들은 심장보호 효과, 즉, 심근 허혈(myocardial ischemia)의 결과로 나타나는 허혈 손상 또는 심근 경색 크기(myocardial infarct size)의 완화를 생산하는데 치료상으로 효과적인 양이다. 펩티드들이 비상시에 심근 허혈 등으로 고통받는 환자에 투여될 수 있는 주사 투여 형태로서 유용할 수 있다는 것이 또한 기대된다.

인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드 및 그것들로부터의 유도체는 또한 예를 들면 , 류마티스성 관절염에서의, 부종(edema), 뇌종양 또는 암을 위한 방사선조사에 이차적인 부종, 뇌졸증(stroke), 두부 외상(head trauma) 또는 척수 손상(spinal cord injury)에 기인하는 부종, 수술 후 부종, 천식(asthma)과 다른 호흡기 질병들 및 눈의 낭포 황반 부종(cystoid macular edema)의 감소에서의 사용에서 발견한다.

제형들

본 발명의 화합물들은 치료 투여를 위한 다양한 제형들로 통합될 수 있다. 특히, 활성이 바람직하지 않게 높거나 낮은, 인터메딘 또는 아드레노메둘린 장애의 치료를 위한 환자들에 투여하기 위하여 인터메딘 또는 아드레노메둘린 활성, 혹은 인터메딘 또는 아드레노메둘린 폴리펩티드와 그것들의 유사체을 조절하는 제제(agent)가 제형화된다. 더 구체적으로, 본 발명의 화합물들은 적절한, 약학적으로 수용가능한 캐리어들 또는 희석제(diluent)와의 조합에 의해 약학 조성물로 제형화될 수 있으며, 정제(tablet), 캡슐, 분말, 입자, 연고(ointment), 용액, 좌약(suppository), 주사제, 흡입제(inhalant), 겔, 미소구체(microsphere) 및 에어로졸(aerosol)과 같은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태로 제조될 수 있다. 그와 같이, 화합물의 투여는 경구(oral), 구강(buccal), 직장(rectal), 비경구(parenteral), 복강내(intraperitoneal), 피내(intradermal), 경피(transdermal), 기관내(intracheal) 등의 투여를 포함하는, 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 활성 제제는 투여 후에 침투성(systemic)일 수 있거나 또는 이식의 부위에서 활성 투여량을 유지하도록 작용하는 임플란트의 사용에 의해 국부적이 될 수 있다.

약학적 투여량에 있어서, 화합물들은 그것들의 약학적으로 수용가능한 염의 형태로 투여될 수 있거나, 혹은 단독으로 또는 적절하게 공동으로, 뿐만 아니라 다른 약학적으로 활성인 화합물들과 결합하여 사용될 수 있다. 다음의 방법들 및 첨가제들은 단지 실례이고 이에 한정되어서는 안 된다.

경구용 제조를 위하여, 화합물들은 정제, 분말, 입자 또는 캡슐들을 만들기 위하여 단독으로 사용될 수 있거나 또는 예를 들면, 락토오스(lactose), 만니톨(mannitol), 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 종래의 첨가제들; 결정성 셀룰로오스(crystalline cellulose), 셀룰로오스 유도체, 아카시아(acacia), 옥수수 전분 또는 젤라틴(gelatin)과 같은 결합제(binder)들; 옥수수 전분, 감자 전분 또는 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose)와 같은 분해제(disintegrator); 활석(talc) 또는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate)과 같은 윤활제(lubricant); 및 만일 원하면, 완충제(buffering agent), 습윤제(moistening agent), 방부제(preservative) 및 방향제(flavoring agent)들과 같은 희석제들을 갖는, 적절한 첨가제들과 결합하여 사용될 수 있다.

화합물들은 식물성 또는 유사한 오일들, 합성 알리파틱산 글리세리드(aliphatic acid glycerides), 높은 알리파틱산들 또는 프로필렌 글리콜(propylene glycol)의 에스테르들과 같은, 수성 용제 또는 비수성 용제(nonaqueous solvent)에서; 및 만일 원하면, 가용화제(solubilizers), 등장화제(isotonic agents), 현탁화제(suspending agents), 유화제(emulsifying agents), 안정제(stabilizer)들 및 방부제들과 같은 종래의 첨가제들과 함께 그것들을 용해하거나, 현탁하거나 또는 유화(emulsifying)함으로써 주입을 위한 제조물로 제형화될 수 있다.

화합물들은 흡입을 통하여 투여되도록 에어로졸 제형으로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물들은 디클로로디플루오로메탄(dichlorodifluoromethane), 프로판(propane), 질소 등과 같은 가압된 수용가능한 추진제(propellant)로 제형화될 수 있다.

게다가, 화합물들은 유화 염기들 또는 수용성 염기들과 같은 다양한 염기들과 혼합함으로써 좌약들로 만들어질 수 있다. 본 발명의 화합물들은 좌약을 통하여 직장으로 투여될 수 있다. 좌약은 코코아 버터(cocoa butter), 카보왁스(carbowaxes) 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 매개체(vehicle)을 포함하는데, 이는 체온에서는 녹으나, 실온에서는 고형화된다.

시럽, 일릭서(elixir) 및 현탁액과 같은 경구 또는 직장 투여를 위한 단위 투여량 형태들이 제공될 수 있는데 각각의 투여량 단위, 예를 들면, 티수푼의(teaspoonful), 큰 수푼의(tablespoonful), 정제 또는 좌약은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함하는 조성물의 미리 결정된 양을 포함한다. 유사하게, 주입 또는 정맥내 투여를 위한 단위 투여량 형태들은 멸균 물, 생리식염수 또는 다른 약학적으로 수용가능한 캐리어 내의 용액으로서 조성물 내에 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다.

지속적인 방출 제형들을 위한 임플란트들이 종래에 알려져 있다. 임플란트들은 생분해성 또는 비 생분해성 중합체들을 갖는 미소구체 또는 슬래브(slab) 등으로서 제형화된다. 예를 들면, 젖산 및/또는 글리콜산의 중합체들은 숙주에 의해 뛰어난 내성이 있는 붕괴성(errodible) 중합체들을 형성한다. 임플란트는 주입의 부위에 근접하여 위치되는데, 따라서 활성 제제의 총 농도는 나머지 신체에 대하여 증가된다.

여기서 사용되는 것과 같이 용어 "단위 투여량 형태"는 인간 또는 동물 대상들을 위한 단일 투여량으로서 적절한 물리적으로 별개의 단위들을 언급하는데, 각각의 단위는 약학적으로 수용가능한 희석제, 캐리어 또는 매개체와 관련하여 바람직한 효과를 생산하는데 충분한 양으로 계산되는 본 발명의 화합물들의 미리 결정된 양을 포함한다. 본 발명의 신규 단위 투여량 형태들의 사양들은 사용되는 특정 화합물과 달성되려는 효과, 및 숙주 내의 각각의 화합물과 관련된 약력학(pharmacodynamics)에 의존한다.

소포(vesicle), 보조제(adjuvant), 캐리어 또는 희석제들과 같은, 약학적으로 수용가능한 첨가제들은 이미 대중적으로 이용가능하다. 게다가, pH 조절 및 완충제, 긴장성 조정제(tonicity adjusting agent), 안정제(stabilizer), 습윤제 등과 같은, 약학적으로 수용가능한 보조 물질들이 대중적으로 이용가능하다.

침투성 투여에 대한 일반적인 투여량은 투여 당 대상의 ㎏ 중량 당 0.1 ㎍부터 100 ㎎까지의 범위이다. 일반적인 투여량은 하루에 2회부터 6회까지 투여되는 하나의 정제, 혹은 하루에 1회 투여되는 하나의 지효성 캡슐(time-release capsule) 또는 정제 및 활성 성분의 이에 비례하는 높은 함량을 포함할 수 있다. 지효성 효과는 서로 다른 pH 값들에서 용해되는 캡슐 물질들, 삼투압에 의해 느리게 방출되는 캡슐들, 또는 제어 방출의 다른 알려진 수단들에 의해 획득될 수 있다.

통상의 지식을 가진 자들은 투여량 레벨들이 특정 화합물의 기능, 증상의 심각성 및 부작용에 대한 대상의 민감성에 따라 다양할 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다. 일부 특정 화합물들은 다른 것보다 더 강력하다. 주어진 화합물을 위한 바람직한 투여량들은 다양한 수단에 의해 통상의 식을 가진 자들에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 바람직한 수단은 주어진 화합물의 생리학적 효능을 측정하는 것이다.

리포솜들은 체내 및 체외에서 단백질 전달을 위하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 리포솜들은 종래의 다양한 리포솜 제조 기술 중 어느 하나를 사용하여 제조될 수 있다. 통상의 지식을 가진 자들이 쉽게 이해할 수 있는 것과 같이, 그러한 종래의 기술들은 초음파처리(sonication), 킬레이트 투석(chelate dialysis), 균질화(homogenization), 압출과 결합된 용제 주입, (olvent infusion coupled with extrusion, 동결 융해 압출(freeze-thaw extrusion), 마이크로유화( microemulsification) 등을 포함한다. 이러한 기술들뿐만 아니라 다른 기술들이 예를 들면, 미국특허 제 4,728,578, 영국특허출원 제 G.B. 2193095 A, 미국특허 제 4,728,575, 미국특허 제 4,737,323, 국제특허출원 제 PCT/US85/01161, Mayer 등, Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 858, pp. 161-168 (1986), Hope 등, Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 812, pp. 55-65 (1985), 미국특허 제 4,533,254, Mahew 등, Methods In Enzymology, Vol. 149, pp. 64-77 (1987), Mahew 등, Biochimica et Biophysica Acta, Vol. 75, pp. 169-174 (1984), 및 Cheng 등, Investigative Radiology, Vol. 22, pp. 47-55 (1987)에서 설명된다. 국제특허 제 PCT/US85/01161에서 설명되는 것과 유사한 무용제 시스템이 리포솜 구성을 제작하는데 사용될 수 있다.

리포솜들을 제조하는데 사용되는 물질들은 리포솜 구성에 적합할 수 있는 것과 같이 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 모든 물질 또는 그것들의 조합을 포함한다. 사용되는 지질들은 자연 또는 합성 유래일 수 있다. 그러한 물질들은 콜레스테롤(cholesterol), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티드산(phosphatidic acid), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 라이소지질(lysolipid)들, 지방산(fatty acid)들, 스핑고미엘린(sphingomyelin), 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)들, 글루코리피드(glucolipid)들, 당지질들, 설파타이드(sulphatide)들, 아미드, 에테르와 에스테르 결합 지방산들을 갖는 지질들, 중합가능 지질(polymerizable lipid)들, 및 그것들의 조합을 포함하나. 이에 한정되지 않는다. 통상의 지식을 가진 자들이 이해할 것과 같이, 리포솜들은 종래의 방법들을 사용하여 통합 단지질, 복합 탄수화물, 단백질 또는 합성 중합체의 존재 하에서 또는 이들 없이 합성될 수 있다. 리포솜의 표면은 또한 이미 통상의 지식을 가진 자들에 자명한 방법들을 사용하여, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 갖는 것과 같은, 중합체로 변형될 수 있다. 지질 또는 지질들의 조합 및 지질 매트릭스 내에 통합되는 관련 물질들이 생리학적으로 적절한 조건 하에서 이중층 상(bilayer phase)을 형성해야만 하는 조건으로, 어떠한 종류의 지질도 사용될 수 있다. 통상의 지식을 가진 자들은 리포솜들의 조성물은 결과로서 생기는 리포솜들의 생물학적 분배 및 제거(clearance) 특성들을 조절하도록 변경될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

이러한 구조들에서의 막 이중층은 일반적으로 수성 볼륨을 캡슐화하며, 캡슐화된 볼륨과 외부 용액 사이에 투과성 벽을 형성한다. 수용액 내에 분산되는 지질들은 자연발생적으로 물과 상호작용하도록 안쪽으로 향하는 탄화수소 고리 및 바깥쪽으로 향하는 극성 머리기(polar headgroup)를 갖는 이중층을 형성한다. 혼합물의 간단한 교반(agitation)은 일반적으로 다층판 소포(multilamellar vesicle, MLV)들, 1-10 .mu.m (1000-10,000 ㎚)의 지름을 갖는 양파 형태의 많은 이중층을 갖는 구조체들을 생산한다. 이러한 구조체들의 초음파처리, 또는 종래에 알려진 다른 방법들은 약 30-300 ㎚의 평균 지름을 갖는 단층판 소포들의 형성에 이르게 한다. 그러나, 예를 들면, 체내 최대 순환 시간의 관점에서 최적이 되도록 50 내지 200 ㎚의 범위가 고려된다. 실제 평형 지름은 대체로 사용되는 인지질의 본질 및 콜레스테롤과 같은 다른 지질들의 결합의 정도에 의해 결정된다. 리포솜들의 형성을 위한 표준 방법들이 종래에 알려졌는데, 예를 들면, 리포솜들의 상업적 생산을 위한 방법들이 미국특허 제 4,753,788 및 미국특허 제 4,935,171에서 설명된다.

중합 리포솜들은 지질 분자들의 자기 조립 집합체(self-assembled aggregate)들이며, 이는 미국특허 제 5,512,294와 6,132,764 및 미국특허출원 제 20020071843에서 설명된다. 중합가능 지질들의 소수성 꼬리기는 자외선 또는 다른 라디칼, 음이온 또는 양이온의 개시 종들에 노출될 때 비가역적으로 교차 결합하거나 중합하며, 반면에 리포솜의 표면에서 기능적 그룹들의 분산을 유지하는, 디아세틸렌(diacetylene) 그룹들과 같은, 중합가능 그룹들로 유도된다. 결과로서 생기는 중합 리포솜 입자는 세포막 또는 다른 리포솜들과의 융합에 대하여 안정되고, 효소성 저하에 대하여 안정된다. 중합 리포솜들의 크기는 압출 또는 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 다른 방법들에 의해 제어될 수 있다. 중합 리포솜들은 중합가능 지질로 구성될 수 있으나, 또한 포화 및 비-알킨(alkyne), 불포화 지질들을 포함할 수 있다. 중합 리포솜들은 친수성 노출 표면상에 서로 다른 기능적 그룹들을 제공하는, 지질의 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 일부 친수성 머리기들은 기능적 표면 그룹들, 예를 들면 바이오틴(biotin), 아민(amines), 시아노(cyano), 카르복실산(carboxylic acids), 이소티오시안염(isothiocyanates), 티올(thiols), 이황화물(disulfides), 알파-할로카르보닐(α-halocarbonyl) 화합물들, 알파,베타-불포화 카르보닐(α,β-unsaturated carbonyl) 화합물들 및 알킬 하이드라진(alkyl hydrazine)들을 가질 수 있다.

위에서 설명된 제형들에서의 사용을 위하여, 인터메딘 또는 아드레노메둘린 혹은 그것으로부터의 유도체들은 합성될 수 있고 사용 전에 즉시 약학적으로 수용가능한 액체로 환원되는 고체의 냉동건조된 분말로서 저장될 수 있다. 그러한 제형들이 일반적으로 바람직한데 그 이유는 냉동건조된 제조물들이 일반적으로 액체 대용물보다 시간에 지남에 따라 더 나은 약학적 활성을 유지한다는 것이 통상의 지식을 가진 자들에 알려져 있기 때문이다.

게다가, 인터메딘 또는 아드레노메둘린 및 그것들의 유사체들은 피부 상에 국소로(topically) 적용될 뿐만 아니라 에어로졸 분무제로서 투여될 수 있다.

대안으로서, 펩티드들은 예를 들면, pH를 유지하는 기능을 하는 약 1 mM부터 약 50 mM까지의 농도에서 버퍼를 포함하는 액체로서 제형화될 수 있는데, 상기 버퍼의 음이온은 아세트산염(acetate), 인산염(phosphate), 탄산염(carbonate), 숙신산(succinate), 시트르산염(citrate), 붕산염(borate), 타르타르산염(tartrate), 푸마르산염(fumarate) 및 젖산(lactate); 및 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 리보톨(ribotol), 아라비톨(arabitol), 자일리톨(xylitol), 이노시톨(inositol), 갈락시톨(galactitol), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol) 및 글리세롤(glycerol)로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있는 알코올;을 구성하는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 다른 첨가제들은 메티오닌(methionine), 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 글루타민산(glutamic acid), 시스테인, 글루타티온(glutathione) 등과 같은 아미노산을 포함하며, 아미노산들은 일반적으로 약 1 mM부터 약 100 mM까지의 범위의 농도로 존재한다. 예를 들면, 글루코오스, 수크로오스(sucrose), 락토오스, 프럭토오스(fructose), 트리할로오스(trehalose), 만노오스(mannose) 등을 포함하는, 다양한 당들이 제형들 내에 선택적으로 포함된다. 첨가 당들은 일반적으로 약 1%부터 약 10%까지의 범위의 농도로 존재한다.

실험

통상의 지식을 가진 자들에게 완전한 내용 및 본 발명이 어떻게 만들어지고 사용되는가의 설명을 제공하기 위하여, 다음의 실시 예들이 제안되는데, 이는 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않으며 아래의 실험들이 모두이거나 또는 단지 실행된 실험들이라는 것을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 사용되는 숫자들(예를 들면, 양, 온도 등)에 대한 정확성을 보장하기 위한 노력들이 행해졌으나, 일부 실험 오차들 및 편차들이 고려되어야 한다. 달리 설명되지 않으면, 단위는 중량 단위이고, 분자량은 중량 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이며, 압력은 대기압 수준이다.

실시 예 1

인터메딘의 변형. 펩티드들은 표준 고체-상 플루오레닐메톡시카르보닐 클로라이드(fluorenylmethoxycarbonyl chloride, Fmoc, 이하 Fmoc로 표기) 펩티드 화학을 사용하여 스탠포드 대학의 Pan Facility에 의해 Applied Biosystems사의 자동 펩티드 합성기 상에서 합성되었다(Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. Int J Pept Protein Res 35: 161-214, 1990). 변형된 펩티드들은 펩티드들의 합성 동안에 Fmoc-보호(protected) [C16] 팔미테이트 지방산으로 접합된 라이신 잔기(Lys(PAL))를 결합함으로써 합성되었다. 순도는 역상(reversed-phase) HPLC에 의해 결정되었으며 그 뒤에 전기분무 이온화 질량 분석법(electrospray ionisation mass spectrometry)을 사용하여 특징지어졌다.

도 1-4에 제시된 것과 같은 변형된 그리고 미접촉 인터메딘의 체내 생물학적 활성. 인터메딘 펩티드들은 10 마이크로몰/리터에서 10-20% 디메틸술폭시드(Dimethylsulfoxide, DMSO, 이하 DMSO로 표기)를 갖는 식염수에 용해되었다. 주입 전에, 펩티드들의 표본(aliquot)들이 100 ㎕의 최종 용량으로 PBS 내에 용해되었다. 측정 과정에 미리 적응된 의식이 있는 SBR 쥐들(9-16 주 연령)에 혈압이 측정되었다. 간접적인 수축기 압력은 테일-커프 방법(tail-cuff method)을 사용하는 프로그램가능 비침습적 혈압 시스템(Kent Scientific사)에 의해 결정되었다. 압력 변환기(pressure transducer)의 부착 후에, 쥐들은 10-15분 간격에 걸친 베이스-라인(base-line) 측정들 전에 10분 동안 그대로 두었다(undisturbed). 베이스-라인 측정 다음으로, 쥐들은 다양한 펩티드의 투여량 또는 10% DMSO를 갖는 식염수로 복강내로 주입되었다. 혈압과 심박동수가 30초 간격으로 20-40분 동안 모니터링되었다. 혈압의 변화들은 주어진 시간 간격에서 실행된 측정들의 평균으로 계산되었다. 대조군 동물들의 기초 혈압은 인터메딘 펩티드로 처리된 동물들과 유사하다.

도 1a-1c에 도시된 것과 같이, 쥐들이 변형된 인터메딘(IMD-팔미트산-변형 인터메딘)으로 주입되고 시간에 따라 혈압이 측정될 때, 수축기 압력에서의 상당하고 지속적인 강하가 존재한다. 이러한 펩티드의 혈압강하 효과는 체내에서 5시간 이상 지속되었으며, 반면에 변형되지 않은 인터메딘 펩티드는 1시간 이하로 지속되었다. PBS로 주입된 대조군 동물들의 결과가 도 3에 도시되고, 변형되지 않은 펩티드로부터의 결과가 도 2에 도시된다.

실시 예 2

아드레노메둘린의 변형. 펩티드들은 표준 고체-상 Fmoc 펩티드 화학을 사용하여 스탠포드 대학의 Pan Facility에 의해 Applied Biosystems사의 자동 펩티드 합성기 상에서 합성되었다(Fields GB, Noble RL. Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl amino acids. Int J Pept Protein Res 35: 161-214, 1990). 변형된 펩티드들은 펩티드들의 합성 동안에 Fmoc-보호 [C16] 팔미테이트 지방산으로 접합된 라이신 잔기(Lys(PAL))를 결합함으로써 합성되었다. 순도는 역상 HPLC에 의해 결정되었으며 그 뒤에 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 특징지어졌다.

아드레노메둘린의 체외 생물학적 활성. 아드레노메둘린 및 팔미트산 접합 아드레노메둘린의 자극 효과의 일반적인 설명이 도 7에 도시된다.

아드레노메둘린 유사체의 체외 생물학적 활성. 아드레노메둘린 펩티드들은 10 마이크로몰/리터에서 10-20% DMSO를 갖는 식염수에 용해되었다. 주입 전에, 펩티드들의 표본들이 200 ㎕의 최종 용량으로 PBS 내에 용해되었다. 측정 과정에 미리 적응된 의식이 있는 SBR 쥐들(9-16 주 연령)에 혈압이 측정되었다. 간접적인 수축기 압력은 테일-커프 방법을 사용하는 프로그램가능 비침습적 혈압 시스템(Kent Scientific사)에 의해 결정되었다. 압력 변환기의 부착 후에, 쥐들은 10-15분 간격에 걸친 베이스-라인 측정들 전에 10분 동안 그대로 두었다. 베이스-라인 측정 다음으로, 쥐들은 다양한 펩티드의 투여량 또는 10% 디메틸술폭시드(Dimethylsulfoxide, DMSO, 이하 DMSO로 표기)를 갖는 식염수로 복강내로 주입되었다. 혈압과 심박동수가 20초 간격으로 20-40분 동안 모니터링되었다. 혈압의 변화들은 주어진 시간 간격에서 실행된 측정들의 평균으로 계산되었다.

데이터는 팔미트산 접합 아드레노메둘린 펩티드 또는 식염수의 주입 후 SBR 쥐들의 수축기 혈압 프로파일을 나타낸다(Roh 등. Mol Endocrinol. 2005 Nov; 19(11): 2824-38 참조).

도 5a-5c에 도시된 것과 같이, 쥐들이 변형된 아드레노메둘린(아드레노메둘린-팔미트산-변형 아드레노메둘린)의 100 nmole/㎏ 체중으로 주입되고 시간에 따라 혈압이 측정될 때, 수축기 압력에서의 상당하고 지속적인 강하가 존재한다. 팔미트산 접합 아드레노메둘린 펩티드는 효소 결합 면역 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 사용하는 면역반응성 아드레노메둘린의 측정을 기초로 하여 사용하는 아드레노메둘린과 비교하여 긴 반감기를 갖는다.

본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 특허 출원은 각각의 개별 문서 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로써 통합되도록 나타냈던 것과 같이 여기에 참조로써 통합된다.

본 발명의 실행을 위한 바람직한 방식들을 포함하기 위하여 본 발명의 발명자에 의해 발견되거나 제안된 특정 실시 예들과 관련하여 본 발명이 설명되었다. 본 발명을 고려하여, 통상의 지식을 가진 자들은 본 발명의 의도된 범위를 벗어나지 않고 예시된 특정 실시 예들에서 다양한 변형들 및 변경들이 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 게다가, 생물학적 기능적 등가성 고려사항들에 기인하여, 종류 또는 양에서의 생물학적 작용에 영향을 미치지 않고 단백질 구조의 변경들이 만들어질 수 있다. 그러한 모든 변형들은 첨부된 청구항들의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Hsu, Sheau Yu Chang, Chia Lin <120> Long Acting Peptide Analogs <130> STAN-691WO <150> 61/474,177 <151> 2011-04-11 <150> 61/473,054 <151> 2011-04-07 <150> 61/474,182 <151> 2011-04-11 <160> 7 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 535 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 cgcccacgcc cggcgccccg accgcggagg actccccgag ccccgcccgc catggcccgg 60 atcccgacgg ccgccctggg ttgcatcagc ctcctctgcc tgcagctccc tggctcgctg 120 tcccgcagcc tgggcgggga cccgcgaccc gtcaaaccca gggagccccc agcccggagc 180 ccttccagca gcctgcagcc caggcacccc gcaccccgac ctgtggtctg gaagcttcac 240 cgggccctcc aggcacagag gggtgccggc ctggcccctg ttatgggtca gcctctccgg 300 gatggtggcc gccaacactc gggcccccga agacactcgg gcccccgcag gacccaagcc 360 cagctcctgc gagtgggctg tgtgctgggc acctgccagg tgcagaatct cagccaccgc 420 ctgtggcaac tcatgggacc ggccggccgg caggactcag ctcctgtgga ccccagcagc 480 ccccacagct atggctgagg tggggccggg ccacacccct gcccatccca gccag 535 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> H. sapiens <400> 2 Met Ala Arg Ile Pro Thr Ala Ala Leu Gly Cys Ile Ser Leu Leu Cys 1 5 10 15 Leu Gln Leu Pro Gly Ser Leu Ser Arg Ser Leu Gly Gly Asp Pro Arg 20 25 30 Pro Val Lys Pro Arg Glu Pro Pro Ala Arg Ser Pro Ser Ser Ser Leu 35 40 45 Gln Pro Arg His Pro Ala Pro Arg Pro Val Val Trp Lys Leu His Arg 50 55 60 Ala Leu Gln Ala Gln Arg Gly Ala Gly Leu Ala Pro Val Met Gly Gln 65 70 75 80 Pro Leu Arg Asp Gly Gly Arg Gln His Ser Gly Pro Arg Arg His Ser 85 90 95 Gly Pro Arg Arg Thr Gln Ala Gln Leu Leu Arg Val Gly Cys Val Leu 100 105 110 Gly Thr Cys Gln Val Gln Asn Leu Ser His Arg Leu Trp Gln Leu Met 115 120 125 Gly Pro Ala Gly Arg Gln Asp Ser Ala Pro Val Asp Pro Ser Ser Pro 130 135 140 His Ser Tyr Gly 145 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> H. sapiens <400> 3 Val Gly Cys Val Leu Gly Thr Cys Gln Val Gln Asn Leu Ser His Arg 1 5 10 15 Leu Trp Gln Leu Met Gly Pro Ala Gly Arg Gln Asp Ser Ala Pro Val 20 25 30 Asp Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr 35 40 <210> 4 <211> 47 <212> PRT <213> H. sapiens <400> 4 Thr Gln Ala Gln Leu Leu Arg Val Gly Cys Val Leu Gly Thr Cys Gln 1 5 10 15 Val Gln Asn Leu Ser His Arg Leu Trp Gln Leu Met Gly Pro Ala Gly 20 25 30 Arg Gln Asp Ser Ala Pro Val Asp Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr 35 40 45 <210> 5 <211> 185 <212> PRT <213> H. sapiens <400> 5 Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe 1 5 10 15 Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys 20 25 30 Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met 35 40 45 Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala 50 55 60 Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg 85 90 95 Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe 100 105 110 Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr 115 120 125 Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln 130 135 140 Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly 145 150 155 160 Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro 165 170 175 Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu 180 185 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> H. sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)...(1) <223> N terminal lysine modification with a lipid <400> 6 Lys Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser 20 25 30 Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr 35 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> H. sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (1)...(1) <223> N terminal lysine modification with a lipid <400> 7 Lys Gly Cys Val Leu Gly Thr Cys Gln Val Gln Asn Leu Ser His Arg 1 5 10 15 Leu Trp Gln Leu Met Gly Pro Ala Gly Arg Gln Asp Ser Ala Pro Val 20 25 30 Asp Pro Ser Ser Pro His Ser Tyr 35 40

Claims

1.5시간보다 큰 혈청 반감기를 갖는 생물학적으로 활성인 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드.

제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 중합체의 상기 펩티드의 아미노 말단으로의 접합에 의해 변형되는 것을 특징으로 하는 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드.

제 2항에 있어서, 상기 펩티드는 다음의 구조를 가지며:

여기서 R₁은 선형 또는 분기된 C₃-C₁₀₀ 알킬; 바람직하게는 선택적으로 할로, 히드록시, 알콕시, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 설페이트, 또는 포스페이트로 치환되고, 포화되거나, 혹은 모노- 또는 디-불포화될 수 있는 C₄-C₃₀ 알킬인 것을 특징으로 하는 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드.

제 3항에 있어서, 상기 R₁은 팔미트산; 스테아르산; 아라키드산; 라우르산; 미리스트산; 미리스트올레산; 팔미톨레산; 사피에닉산; 올레산; 리놀레산; 알파-리놀레산; 아라키돈산; 에이코사펜타메노산; 에루스산; 도코사헥사에노산;으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드.

제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열목록의 서열번호: 3; 서열목록의 서열번호: 4; 또는 서열목록의 서열번호: 7로서 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 구성하는 것을 특징으로 하는 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드.

제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열목록의 서열번호: 6으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 구성하는 것을 특징으로 하는 인터메딘 또는 아드레노메둘린 펩티드.

제 1항 내지 6항 중 어느 한 항의 펩티드의 치료상으로 유효량, 및 약학적으로 수용가능한 유도체를 포함하는 약학 조성물.

장시간 동안 숙주 동물에 대한 칼시토닌 수용체 유사 수용체/수용체 활성 변형 단백질 활성을 위하여 장시간 작용하는 아고니스트를 전달하는 방법에 있어서,
제 7항에 따른 약학 조성물을 상기 동물에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

심박출량이 증가하는 동안에 개인의 말초 혈액 압력을 감소시키는 방법에 있어서,
상기 개인에 제 7항에 따른 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 펩티드는 매 4시간마다 1회보다 큰 시간 간격에서 전달되는 것을 특징으로 하는 말초 혈액 압력을 감소시키는 방법.

제 9항에 있어서, 상기 펩티드는 매 12시간마다 1회씩보다 큰 시간 간격에서 전달되는 것을 특징으로 하는 말초 혈액 압력을 감소시키는 방법.