KR20140045433A - 아밀린 펩티드 및 그의 유도체 및 용도 - Google Patents

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KR20140045433A
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쳉자오 순
마노지 피. 사만트
스웨타 네라베틀라
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아밀린 파마슈티칼스, 엘엘씨.
아스트라제네카 파마수티컬스 엘피
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Abstract

생물학적 활성의 지속기간이 향상된 폴리펩티드 접합체, 및 그의 사용 방법이 제공된다. 폴리펩티드 접합체는 규정된 서열의 폴리펩티드 성분에 결합된, 수용성 중합체를 비롯한 지속기간 향상 모이어티를 포함한다. 대사 장애의 치료를 위한 사용 방법이 제공된다. 섭식 장애, 인슐린 저항성, 비만, 과체중, 비정상적 식후 고혈당, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 덤핑 증후군, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 고지혈증, 수면 무호흡, 암, 폐고혈압, 담낭염, 골관절염, 또는 단장 증후군의 치료를 위한 사용 방법이 제공된다.

Description

아밀린 펩티드 및 그의 유도체 및 용도 {AMYLIN PEPTIDES AND DERIVATIVES AND USES THEREOF}
서열 목록
본 출원은 EFS-웹(Web)을 통해 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 함유하며 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 2012년 5월 18일자로 생성된 상기 ASCII 카피(copy)는 123USPRO.txt로 명명되며 28,832 바이트 크기이다.
발명의 배경
생물학적 활성의 지속기간(duration)이 향상된(enhanced) 폴리펩티드 접합체, 및 그의 사용 방법이 제공된다. 폴리펩티드 접합체는, 임의로 링커를 통해, 하나 이상의 지속기간 향상 모이어티에 결합된 폴리펩티드 성분을 포함한다. 폴리펩티드 접합체 내에 포함된 폴리펩티드 성분은 아밀린, 칼시토닌 및 그의 키메라와 관련이 있다. 폴리펩티드 접합체는 추가로, 임의로 링커를 통해, 펩티드 접합체의 폴리펩티드 성분에 결합된 지속기간 향상 모이어티 (수용성 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 포함한다. 방법은 비만, 당뇨병, 및 다른 대사 장애의 치료를 포함한다.
진성 당뇨병은 만성적으로 상승된 혈당치의 존재 (고혈당)에 의해 정의되는 심각한 대사 질환이다. 이러한 고혈당 상태는 펩티드 호르몬인 인슐린의 작용의 상대적 또는 절대적 결핍의 결과이다. 인슐린은 췌장의 β 세포에 의해 생산되고 분비된다. 인슐린은 글루코스 이용, 단백질 합성, 및 중성 지질의 형성 및 저장을 촉진시키는 것으로 보고되어 있다. 탄수화물 에너지의 주요 공급원인 글루코스는 중합 글루코스의 형태인 글리코겐으로서 체내에 저장되고, 이는 글루코스로 다시 전환되어 신진대사의 요건을 충족시킬 수 있다. 정상적인 상태하에, 인슐린은 기본적인 속도로 분비되고 글루코스 자극 후에는 증가된 속도로도 분비되어, 모두 글루코스를 글리코겐으로 전환시킴으로써 대사의 항상성을 유지한다.
진성 당뇨병이라는 용어는 몇가지 상이한 고혈당 상태를 포괄한다. 이들 상태는 제1형 (인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 IDDM) 및 제2형 (비-인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM) 당뇨병을 포함한다. 제I형 당뇨병을 가진 개인에 존재하는 고혈당은 생리적 범위 내에서 혈당치를 유지하기에 불충분한, 결핍되거나, 감소되거나, 존재하지 않는 인슐린 농도와 관련이 있다. 제1형 당뇨병의 치료는, 일반적으로는 비경구 경로에 의한, 교체 용량의 인슐린의 투여를 포함한다. 제II형 당뇨병을 가진 개인에 존재하는 고혈당은 초기에는 정상 또는 상승된 인슐린 농도와 관련이 있으나; 이들 개인은 말초 조직 및 간에서의 인슐린 저항성의 상태로 인해 대사 항상성을 유지할 수 없으며, 인슐린의 분비의 원인이 되는 췌장의 β 세포의 점진적인 퇴보(deterioration)로 인해 질환이 진행된다. 따라서, 제2형 당뇨병의 초기 치료는 설포닐우레아와 같은 경구 혈당강하제를 이용한 치료법에 의해 보강된 식이 요법 및 생활 방식의 변화를 토대로 할 수 있다. 그러나, 인슐린 치료법은, 고혈당을 일부 제어하고 질환의 합병증을 최소화하려는 시도에서, 특히 질환의 후반 단계에서 종종 필요하다. 따라서, 많은 제2형 당뇨병 환자는 궁극적으로는 생존하기 위해 인슐린을 필요로 한다.
비만 및 그의 관련 장애는 미국에서 및 전 세계적으로 흔하고 매우 심각한 공중 보건 문제이다. 상체 비만은 제2형 진성 당뇨병에 대한 가장 강력한 위험 인자이고, 심혈관 질환에 대한 강력한 위험 인자이다. 비만은 고혈압, 죽상동맥경화증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 쓸개 질환, 골관절염, 수면 무호흡, 생식 장애, 예컨대 다낭성 난소 증후군, 유방, 전립선 및 결장의 암, 및 일반 마취의 합병증 발생 증가에 대한 인지된 위험 인자이다 (예를 들어, 문헌 [Kopelman, Nature 404:635-43 (2000)] 참조).
비만은 수명을 감소시키고, 상기 열거된 병존질환(co-morbidity)뿐만 아니라, 감염, 하지 정맥류, 흑색 극세포증(acanthosis nigrican), 습진, 운동 불내성(exercise intolerance), 인슐린 저항성, 고혈압 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 및 혈전 색전성 질환과 같은 장애의 심각한 위험을 지닌다 (문헌 [Rissanen et al., Br . Med. J. 301:835-7 (1990)]). 또한 비만은 인슐린 저항성 증후군, 또는 "X 증후군" 및 대사 증후군으로 칭해지는 병태 군에 대한 위험 인자이다. 비만 및 관련 장애의 전 세계적인 의료비가 막대하다.
당업계에 알려진 바와 같이, 아밀린은 영양소의 섭취에 반응하여 동시-분비되는 췌장의 β 세포에 의해 합성되는 펩티드 호르몬이다. 따라서, 아밀린은 대사 기능을 갖는다. 아밀린의 서열은 포유류 종에 걸쳐서 고도로 보존되어 있고 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP), 칼시토닌, 인터메딘, 및 아드레노메둘린과 구조적 유사성을 갖는다. 문헌 [Young A., 2005, Amylin : Physiology and Pharmacology. In: August JT, Murad F, Granner, D (eds), AMYLIN: PHYSIOLOGY AND PHARMACOLOGY, Elsevier Academic Press: San Diego, CA, USA, pp 1-18] 참조. 아밀린의 당 조절 작용(glucoregulatory action)은 영양소-자극 글루카곤 분비의 억제를 통해 순환에서 글루코스 생성의 속도를 조절하고 위 내용 배출(gastric emptying)을 둔화시킴으로써 인슐린의 그러한 작용을 보완한다. 문헌 [Young, 1997, Curr Opin Endocrinol Diabetes 4:282-290] 참조. 예를 들어, 당뇨병이 있는 인슐린-치료 환자에서, 인간 아밀린의 합성 유사체인 프람린타이드는, 부적절하게 상승된 식후 글루카곤 분리를 억제하고 위 내용 배출을 둔화시킴으로써 식후 글루코스 변동폭(excursion)을 감소시킨다. 예를 들어, 문헌 [Janes et al., 1996, Diabetes, 45(suppl 2):865 (abstract)] ; [Young et al., 1996, Drug Dev Res 37:231-248]; [Weyer et al., 2001, Curr Pharm Des 7: 1353-1373]; [Hoogwerf et al., 2008, Vasc Health Risk Manag 4:355-362]; [Edelman et al., 2008, Biodrugs 22:375-386] 참조.
본원에는 작용의 향상된 지속기간을 제공하는 수용성 중합체와 접합된 폴리펩티드가 제공된다.
본원에서 인용된 모든 참조문헌은 그 전문이 모든 목적상 참고로 포함된다.
발명의 간단한 개요
요약하면, 생물학적 활성의 지속기간이 향상된 폴리펩티드 접합체, 및 그의 사용 방법이 제공된다. 폴리펩티드 접합체 내에 포함된 폴리펩티드 성분은 아밀린, 칼시토닌 및 그의 키메라와 관련이 있다. 폴리펩티드 접합체는 추가로, 임의로 링커를 통해, 펩티드 접합체의 폴리펩티드 성분에 결합된 지속기간 향상 모이어티 (수용성 중합체를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 포함한다. 방법은 비만, 당뇨병, 및 다른 대사 장애의 치료를 포함한다.
제1 측면에서, 폴리펩티드 성분 및 거기에 공유결합으로 연결된 지속기간 향상 모이어티를 포함하는 폴리펩티드 접합체가 제공된다. 폴리펩티드 성분은 하기 화학식 I의 잔기 1 내지 37의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 화학식 I에 기재된 아미노산의 25% 이하는 결실되거나 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다:
<화학식 I>
Figure pct00001
화학식 I과 관련하여, X'는 수소, N-말단 캡핑기(capping group), 지속기간 향상 모이어티에 대한 결합, 또는 지속기간 향상 모이어티에 대한 링커이고, Xaa1은 Lys 또는 결합이고, Xaa18은 Lys, Cys, 또는 His이고, Xaa21은 Lys, Cys, 또는 Asn이고, Xaa24는 Lys, Cys, 또는 Gly이고, Xaa25는 Lys, Cys, 또는 Pro이고, Xaa26은 Lys, Cys, 또는 Ile이고, Xaa27은 Lys, Cys, 또는 Leu이고, Xaa28은 Lys, Cys, 또는 Pro이고, Xaa29는 Lys, Cys, 또는 Pro이고, Xaa31은 Lys, Cys, 또는 Asn이고, Xaa34는 Lys, Cys, 또는 Ser이고, Xaa35는 Lys, Cys, 또는 Asn이고, X는 치환 또는 비치환 아미노, 치환 또는 비치환 알킬아미노, 치환 또는 비치환 디알킬아미노, 치환 또는 비치환 시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환 아릴아미노, 치환 또는 비치환 아르알킬아미노, 치환 또는 비치환 알킬옥시, 치환 또는 비치환 아릴옥시, 치환 또는 비치환 아르알킬옥시, 히드록실, 지속기간 향상 모이어티에 대한 결합, 또는 지속기간 향상 모이어티에 대한 링커이다. 지속기간 향상 모이어티는, 임의로 링커를 통해, 연결 아미노산 잔기의 측쇄, X' 또는 X에 공유결합으로 연결될 수 있다. 지속기간 향상 모이어티는, 임의로 링커를 통해, 폴리펩티드 성분의 주쇄 원자에 공유결합으로 연결될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서, 대상체에서 비만, 당뇨병, 또는 다른 대사 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 제약 조성물을 비만, 당뇨병, 또는 다른 대사 장애를 치료하는데 유효한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 섭식 장애, 인슐린 저항성, 비만, 과체중, 비정상적 식후 고혈당, 제I형, 제II형 및 임신성 당뇨병을 비롯한 임의의 유형의 당뇨병, 대사 증후군, 덤핑 증후군, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 고지혈증, 수면 무호흡, 암, 폐고혈압, 담낭염, 골관절염, 또는 단장 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 상기 치료 방법이 제공된다. 방법은 본원에 기재된 화합물 또는 제약 조성물을 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
도 1a는 화합물 21, 25, 24, 22, 26 및 비히클에 관한 본원에 기재된 바와 같은 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 도 1b는 화합물 21, 25, 24, 22, 26 및 비히클에 관한 일일 음식 섭취 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 화합물 21 (네모); 화합물 25 (위가 뾰족한 세모); 화합물 24 (아래가 뾰족한 세모); 화합물 22 (마름모꼴); 화합물 26 (개방 원형); 비히클 (채워진 원형).
도 2a는 DIO 래트에서 2주 동안 화합물 26의 주 2회 SC 투여 및 화합물 1의 연속 투여의 비교 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 비히클 (채워진 원형); 화합물 26 (세모); 화합물 1 (네모).
도 2b는 DIO 래트에서 4주 동안 화합물 23의 주 1회 SC 투여 및 화합물 1의 연속 주입의 비교 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 비히클 (채워진 원형); 화합물 23 (세모); 화합물 1 (네모).
도 3a는 화합물 23에 관한 용량 반응 연구로부터의 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 도 3b는 화합물 23에 관한 용량 반응 연구로부터의 일일 음식 섭취 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 비히클 (네모); 12 nmol/kg (위가 뾰족한 세모); 25 nmol/kg (아래가 뾰족한 세모); 50 nmol/kg (마름모꼴); 125 nmol/kg (채워진 원형); 250 nmol/kg (개방 네모).
도 4a는 화합물 19에 관한 용량 반응 연구로부터의 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 비히클 (네모); 50 nmol/kg (위가 뾰족한 세모); 50 nmol/kg (아래가 뾰족한 세모); 50 nmol/kg (마름모꼴).
도 4b는 화합물 23, 27 및 비히클에 관한 본원에 기재된 바와 같은 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 비히클 (짙은 채워진 네모); 화합물 23 (옅은 채워진 네모); 화합물 27 (세모).
도 5a는 화합물 26, 28, 29, 30 및 비히클에 관한 본원에 기재된 바와 같은 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 도 5b는 화합물 26, 28, 29, 30 및 비히클에 관한 일일 음식 섭취 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 화합물 26 (아래가 뾰족한 세모); 화합물 28 (마름모꼴); 화합물 29 (큰 채워진 원형); 화합물 30 (개방 네모); 비히클 (작은 채워진 원형).
도 6a는 화합물 31과 비교하여, 화합물 29에 관한 용량 반응 연구로부터의 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 도 6b는 화합물 31과 비교하여, 화합물 29에 관한 일일 음식 섭취 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 화합물 31, 250 nmol/kg (네모); 화합물 29, 250 nmol/kg (위가 뾰족한 세모); 화합물 29, 125 nmol/kg (아래가 뾰족한 세모); 화합물 29, 62.5 nmol/kg (마름모꼴); 화합물 29, 31.25 nmol/kg (큰 채워진 원형); 비히클 (작은 채워진 원형).
도 7a는 화합물 29, 32, 33, 34, 35, 36 및 비히클에 관한 본원에 기재된 바와 같은 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 도 7b는 화합물 29, 32, 33, 34, 35, 36 및 비히클에 관한 일일 음식 섭취 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 화합물 29 (정사각형); 화합물 32 (마름모꼴); 화합물 33 (채워진 원형); 화합물 34 (정사각형); 화합물 35 (위가 뾰족한 세모); 화합물 36 (아래가 뾰족한 세모); 비히클 (작은 채워진 원형).
도 8a는 화합물 29, 41, 42 및 비히클에 관한 본원에 기재된 바와 같은 일일 누적 체중 증가 결과를 도시한다. 도 8b는 화합물 29, 41, 42 및 비히클에 관한 일일 음식 섭취 결과를 도시한다. 사용 부호의 설명: 화합물 29 (정사각형); 화합물 41 (위가 뾰족한 세모); 화합물 42 (아래가 뾰족한 세모); 비히클 (작은 채워진 원형).
발명의 상세한 설명
I. 정의
본원에서 사용된 약어는 화학 및 생물 분야 내에서 통상적인 의미를 갖는다. 본원에 기재된 화학 구조 및 화학식은 화학 분야에서 공지된 화학 원자가의 표준 규칙에 따라 도시된 것이다.
치환기 군(substituent group)는 좌측에서 우측으로 기재된 그의 통상적인 화학식에 의해 명시되는 경우, 이들은 우측에서 좌측으로의 구조를 기재한 결과일 수 있는 화학적으로 동일한 치환기를 동등하게 포함하며, 예를 들어, -CH2O-는 -OCH2-에 상당한다.
용어 "알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 달리 명기되지 않는 한, 직선형 (즉, 비분지형) 또는 분지형 쇄, 또는 그의 조합을 의미하고, 이는, 완전 포화, 단가- 또는 다가불포화일 수 있고 지정된 탄소 원자의 수 (즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함)를 갖는, 2가 - 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, (시클로헥실)메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체 및 이성질체와 같은 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 불포화 알킬기는 1개 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고가의 동족체 및 이성질체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 알콕시는 산소 링커 (-O-)를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 알킬이다.
용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 달리 명기되지 않는 한, 알킬로부터 유래된 2가 라디칼을 의미하고, -CH2CH2CH2CH2-에 의해 예시된 바와 같지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 알킬 (또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이고, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 그러한 기가 본 발명에서 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는, 단쇄의 알킬 또는 알킬렌 기이다. 용어 "알케닐렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 달리 명기되지 않는 한, 알켄으로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 또 다른 용어와 조합하여, 달리 명기되지 않는 한, 1개 이상의 탄소 원자 및 O, N, P, Si, 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 헤테로원자 (여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있음)로 이루어진, 안정한 직선형 또는 분지형 쇄, 또는 그의 조합을 의미한다. 헤테로원자(들) O, N, P, S, 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착된 위치에 배치될 수 있다. 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3, 및 -CN을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3와 같이 2개 이하의 헤테로원자가 연속될 수 있다.
유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 달리 명기되지 않는 한, 헤테로알킬로부터 유래된 2가 라디칼을 의미하고, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의해 예시된 바와 같지만, 이에 제한되지 않는다. 헤테로알킬렌 기에 관해, 헤테로원자는 또한 쇄 말단 (예를 들어, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등) 중 어느 하나 또는 둘 다를 점유할 수 있다. 또한 추가로, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 관해, 연결기의 어떤 배향도 연결기의 화학식이 기재된 방향에 의해 암시되지 않는다. 예를 들어, 화학식 -C(O)2R'-는 -C(O)2R'- 및 -R'C(O)2- 둘 다를 나타낸다. 상기한 바와 같이, 헤테로알킬기는, 본원에서 사용된 바와 같이, 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된 그러한 기, 예컨대 -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R", -OR', -SR', 및/또는 -SO2R'를 포함한다. "헤테로알킬"이 인용된 후, 구체적인 헤테로알킬기, 예컨대 -NR'R" 등이 인용될 경우, 용어 헤테로알킬 및 -NR'R"는 중복되거나 상호 배타적이지 않음이 이해될 것이다. 오히려, 구체적인 헤테로알킬기가 인용되어 명확히 더해진다. 따라서, 용어 "헤테로알킬"은 본원에서 구체적인 헤테로알킬기, 예컨대 -NR'R" 등을 배제하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여, 달리 명기되지 않는 한, "알킬" 및 "헤테로알킬" 각각의 환상 형태이다. 게다가, 헤테로시클로알킬에 관해, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 점유한다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라히드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "시클로알킬렌" 및 "헤테로시클로알킬렌"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬 각각으로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 그 자체로 또는 또 다른 치환기의 부분으로서, 달리 명기되지 않는 한, 플루오린, 염소, 브로민, 또는 아이오딘 원자를 의미한다. 게다가, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "아실"은 달리 명기되지 않는 한, -C(O)R을 의미하고, 여기서 R은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴을 의미한다.
용어 "아릴"은 달리 명기되지 않는 한, 다가불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미하고, 이는 단일 고리 또는 다중 고리 (바람직하게는 1 내지 3개의 고리)일 수 있고 이는 함께 융합되거나 (즉, 융합 고리 아릴) 공유결합으로 연결되어 있다. 융합 고리 아릴은 융합 고리 중 1개 이상이 아릴 고리인 함께 융합된 다중 고리를 지칭한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로 원자를 함유하는 아릴기 (또는 고리)를 지칭하고, 여기서 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 원자(들)는 임의로 4급화된다. 따라서, 용어 "헤테로아릴"은 융합 고리 헤테로아릴기 (즉, 융합 고리 중 1개 이상이 헤테로방향족 고리인 함께 융합된 다중 고리)를 포함한다. 5,6-융합 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하고, 여기서 하나의 고리는 5개의 구성원(member)을 갖고 다른 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고, 여기서 1개 이상의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 마찬가지로, 6,6-융합 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하고, 여기서 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고 다른 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고, 여기서 1개 이상의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 그리고 6,5-융합 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하고, 여기서 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고 다른 하나의 고리는 5개의 구성원을 갖고, 여기서 1개 이상의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 헤테로아릴기는 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템의 각각에 대한 치환기는 하기에 기재된 허용되는 치환기의 군으로부터 선택된다. "아릴렌" 및 "헤테로아릴렌"은 단독으로 또는 또 다른 치환기의 일부로서, 아릴 및 헤테로아릴 각각으로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다.
간결하게 하기 위해, 용어 "아릴"은 다른 용어와 조합하여 사용시 (예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬) 상기에서 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은, 탄소 원자 (예를 들어, 메틸렌기)가 예를 들어 산소 원자에 의해 대체된 그러한 알킬기 (예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등)를 비롯하여, 아릴기가 알킬기에 부착되어 있는 그러한 라디칼 (예를 들어, 벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등)을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "옥소"는 본원에서 사용된 바와 같이, 탄소 원자에 이중 결합된 산소를 의미한다.
용어 "알킬술포닐"은 본원에서 사용된 바와 같이, 화학식 -S(O2)-R' (여기서 R'는 상기에서 정의된 바와 같은 알킬기임)를 갖는 모이어티를 의미한다. R'는 특정된 수의 탄소 (예를 들어, "C1-C4 알킬술포닐")를 가질 수 있다.
상기 용어 각각 (예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴", 및 "헤테로아릴")은 명시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태 둘 다를 포함한다. 각각의 유형의 라디칼에 관한 바람직한 치환기는 하기에 제공되어 있다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼에 대한 치환기 (알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐, 및 헤테로시클로알케닐로서 종종 언급된 그러한 기를 포함)는 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, 및 -NO2로부터 0 내지 (2m'+1) (여기서 m'는 그러한 라디칼 중 탄소 원자의 총 수임)의 범위의 수로 선택되지만 이에 제한되지 않는 다양한 기 중 하나 이상일 수 있다. R', R", R'", 및 R""는 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴 (예를 들어, 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 아릴), 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시, 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R기를 포함하는 경우, 예를 들어, R기 각각은 독립적으로 각각의 R', R", R'", 및 R"" 기 (1개 초과의 이들 기가 존재하는 경우)와 같이 선택된다. R' 및 R"가 동일 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합하여 4-, 5-, 6-, 또는 7-원(membered) 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대 할로알킬 (예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실 (예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)을 포함하는 것을 의미하는 것을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 관해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하며, 예를 들어: -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', -NR'-C(O)NR"R'", -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -NRSO2R', -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터, 0 내지 방향족 고리계 상의 개방 원자가의 총 수의 범위의 수로 선택되고; 여기서 R', R", R'", 및 R""는 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택된다. 본 발명의 화합물이 1개 초과의 R기를 포함하는 경우, 예를 들어, R기 각각은 독립적으로 각각의 R', R", R'", 및 R"" 기 (1개 초과의 이들 기가 존재하는 경우)와 같이 선택된다.
2개 이상의 치환기는 임의로 결합되어 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬, 또는 헤테로시클로알킬 기를 형성할 수 있다. 그러한 소위 고리-형성 치환기는 전형적으로, 반드시는 아니지만, 환상 기저 구조(cyclic base structure)에 부착되는 것으로 발견된다. 한 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기저 구조의 인접 구성원에 부착된다. 예를 들어, 환상 기저 구조의 인접 구성원에 부착된 2개의 고리-형성 치환기는 융합 고리 구조를 창출한다. 또 다른 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기저 구조의 단일 구성원에 부착된다. 예를 들어, 환상 기저 구조의 단일 구성원에 부착된 2개의 고리-형성 치환기는 스피로시클릭 구조를 창출한다. 또 다른 실시양태에서, 고리-형성 치환기는 기저 구조의 인접하지 않은 구성원에 부착된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 치환기 중 2개는 임의로 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U- (여기서 T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'-, 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 3의 정수임)의 고리를 형성할 수 있다. 별법으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 치환기 중 2개는 임의로 화학식 -A-(CH2)r-B- (여기서 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'-, 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 4의 정수임)의 치환기로 대체될 수 있다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 임의로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 별법으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접 원자 상의 치환기 중 2개는 임의로 화학식 -(CRR')S-X'-(C"R'")d- (여기서 s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X'는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR'-임)의 치환기로 대체될 수 있다. 치환기 R, R', R", 및 R'"는 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 시클로알킬, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로원자" 또는 "고리 헤테로원자"는 산소 (O), 질소 (N), 황 (S), 인 (P), 및 규소 (Si)를 포함하는 것을 의미한다.
"치환기 군"은 본원에서 사용된 바와 같이, 하기 모이어티로부터 선택된 기를 의미한다:
(A) -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 옥소, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 시클로알킬, 비치환 헤테로시클로알킬, 비치환 아릴, 비치환 헤테로아릴, 및
(B) 하기로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴:
(i) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 시클로알킬, 비치환 헤테로시클로알킬, 비치환 아릴, 비치환 헤테로아릴, 및
(ii) 하기로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 및 헤테로아릴:
(a) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 시클로알킬, 비치환 헤테로시클로알킬, 비치환 아릴, 비치환 헤테로아릴, 및
(b) 옥소, -OH, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -NO2, 할로겐, 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 시클로알킬, 비치환 헤테로시클로알킬, 비치환 아릴, 및 비치환 헤테로아릴로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 또는 헤테로아릴.
"크기-제한된(size-limited) 치환기" 또는 "크기-제한된 치환기 군"은 본원에서 사용된 바와 같이, "치환기 군"에 관해 상기에 기재된 치환기 모두로부터 선택된 기를 의미하며, 여기서 각각의 치환 또는 비치환 알킬은 치환 또는 비치환 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 20 원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬은 치환 또는 비치환 C4-C8 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환 4 내지 8 원 헤테로시클로알킬이다.
"저급 치환기" 또는 "저급 치환기 군"은 본원에서 사용된 바와 같이, "치환기 군"에 관해 상기에 기재된 치환기 모두로부터 선택된 기를 의미하며, 여기서 각각의 치환 또는 비치환 알킬은 치환 또는 비치환 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 8 원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬은 치환 또는 비치환 C5-C7 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환 5 내지 7 원 헤테로시클로알킬이다.
용어 "제약상 허용되는 염"은, 본원에 기재된 화합물에서 발견되는 특정 치환기에 따라, 비교적 무독성인 산 또는 염기로 제조되는 활성 화합물의 염을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물이 비교적 산성인 관능기를 함유하는 경우, 그러한 화합물의 중성 형태를 충분한 양의 목적하는 염기와, 순수한 상태로(neat) 또는 적합한 불활성 용매 중에서 접촉시킴으로써 염기 부가염을 수득할 수 있다. 제약상 허용되는 염기 부가염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물이 비교적 염기성인 관능기를 함유하는 경우, 그러한 화합물의 중성 형태를 충분한 양의 목적하는 산과, 순수한 상태로 또는 적합한 불활성 용매 중에서 접촉시킴으로써 산 부가염을 수득할 수 있다. 제약상 허용되는 산 부가염의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 질산, 탄산, 일수소탄산, 인산, 일수소인산, 이수소인산, 황산, 일수소황산, 아이오딘화수소산, 또는 아인산 등으로부터 유래된 것뿐만 아니라, 비교적 무독성인 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-톨릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 옥살산, 메탄술폰산 등으로부터 유래된 염을 포함한다. 또한, 아미노산의 염, 예컨대 아르기네이트 등, 및 유기산, 예컨대 글루쿠론산 또는 갈락투론산의 염 등이 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Berge et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19] 참조). 특정의 본 발명의 구체적인 화합물은 염기성 및 산성 관능기 둘 다를 함유하고 이로써 화합물이 염기 부가염이나 또는 산 부가염 중 어느 하나로 전환되는 것이 가능해진다.
따라서, 본 발명의 화합물은 예컨대 제약상 허용되는 산과의 염으로서 존재할 수 있다. 본 발명은 그러한 염을 포함한다. 그러한 염의 예는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 술페이트, 메탄술포네이트, 니트레이트, 말레에이트, 아세테이트, 시트레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 (예를 들어, (+)-타르트레이트, (-)-타르트레이트, 또는 라세미 혼합물을 비롯한 그의 혼합물), 숙시네이트, 벤조에이트, 벤조에이트, 및 아미노산, 예컨대 글루탐산과의 염을 포함한다. 이들 염은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
화합물의 중성 형태는 바람직하게는, 염을 염기 또는 산과 접촉시키고 모체 화합물을 통상적인 방법으로 단리함으로써 재생된다. 화합물의 모체 형태는 특정 물리적 특성, 예컨대 극성 용매 중 용해도에서 다양한 염 형태와는 상이하다.
염 형태 이외에, 본 발명은 전구약물 형태의 화합물을 제공한다. 본원에 기재된 화합물의 전구약물은 생리적 조건하에 화학 변화를 용이하게 겪어 본 발명의 화합물을 제공하는 그러한 화합물이다. 게다가, 전구약물은 생체외 환경에서 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 본 발명의 화합물로 전환될 수 있다. 예를 들어, 전구약물은 적합한 효소 또는 화학 시약과 함께 경피 패치 저장소(reservoir)에 배치시 본 발명의 화합물로 서서히 전환될 수 있다.
본 발명의 특정 화합물은 비용매화 형태뿐만 아니라 수화된 형태를 비롯한 용매화 형태로도 존재할 수 있다. 일반적으로, 용매화 형태는 비용매화 형태와 등가물이며 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 특정 화합물은 다중 결정질 또는 무정형 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 모든 물리적 형태는 본 발명에 의해 고려된 용도에 대해 등가이고, 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다.
본 발명의 특정 화합물은 비대칭 탄소 원자 (광학 중심) 또는 이중 결합을 갖고; 라세미체, 부분입체이성질체, 호변이성질체, 기하 이성질체, 및 개별 이성질체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 화합물은, 너무 불안정하여 합성하고/거나 단리할 수 없는 당업계에 공지된 것을 포함하지 않는다.
본 발명의 화합물은 또한 그러한 화합물을 구성하는 1개 이상의 원자에서 부자연스러운 비율의 원자 동위원소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 방사성 동위원소, 예를 들어 삼중 수소 (3H), 아이오딘-125 (125I), 또는 탄소-14 (14C)로 방사성 표지될 수 있다. 본 발명의 화합물의 모든 동위원소 변화는, 방사성이든 아아니든, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
기호 "
Figure pct00002
"는 분자 또는 화학식의 나머지 부분으로의 화학 모이어티의 부착점을 나타낸다.
펩티드의 맥락에서 "오르토로그(ortholog)" 및 그와 유사한 용어는 2개 이상의 펩티드 유전자 생성물을 지칭하며 여기서 오르토로그를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 바와 같이, 공통 선조로부터 진화했다.
폴리펩티드의 맥락에서 본원에서 사용된 바와 같은 "유사체"는 모체 화합물에 대해 아미노산의 삽입, 결실 및/또는 치환을 갖는 화합물을 지칭한다. 유사체는 우수한 안정성, 용해도, 효능, 반감기 등을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 유사체는 모체 화합물에 대해 적어도 50%, 예를 들어 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 심지어 그 초과의 서열 동일성을 갖는 화합물이다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 비교하는 맥락에서 용어 "동일성", "서열 동일성" 등은, 당업계에 공지된 바와 같은 서열 비교 알고리즘, 예를 들어 블라스트(BLAST) 또는 블라스트 2.0을 사용하여 측정된 바와 같이, 동일하거나 동일한 특정된 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 (즉, 비교 창(window) 또는 지정된 영역에 걸쳐서 최대 일치에 관해 비교하고 정렬할 경우, 특정된 영역에 걸쳐서, 약 50% 동일성, 바람직하게는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과의 동일성)를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위 서열(subsequence)을 지칭한다. 이러한 정의는 결실 및/또는 첨가를 갖는 서열뿐만 아니라, 치환을 갖는 서열뿐만 아니라, 천연, 예를 들어, 다형 또는 대립유전자 변이체, 및 인공 변이체도 포함한다. 바람직한 알로리즘에서, 당업계에 공지된 바와 같이, 갭(gap) 등에 관한 해석이 이루어진다. 서열 비교용으로, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알로리즘의 사용시, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 바람직하게는, 디폴트(default) 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 대안적 파라미터를 지정할 수 있다. 그 다음 서열 비교 알고리즘은, 프로그램 파라미터를 기준으로, 참조 서열에 대해 시험 서열에 관한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교용 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, 문헌 [Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl . Math. 2:482]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol . Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson & Lipman, 1988, Proc . Nat'l . Acad . Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 관한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575)), 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)] 참조. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 블라스트 및 블라스트 2.0 알고리즘을 포함하며, 이들은 문헌 [Altschul et al., Nuci . Acids Res. 25:3389-3402 (1977)] 및 문헌 [Altschul et al., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성을 측정하기 위해 당업계에 공지된 바와 같은 블라스트 및 블라스트 2.0이 사용된다. 블라스트 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 웹사이트를 통해 공개적으로 이용가능하다. 이러한 알고리즘은 쿼리 서열(query sequence)에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍(high scoring sequence pair: HSP)을 우선 확인하는 것을 포함하며, 이는 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어로 정렬된 경우 일부 양의 임계값(positive-valued threshold) 점수 T에 일치하거나 충족된다. T는 주변 단어 점수 임계값으로 지칭된다 (앞서 언급된 바와 같은 문헌 [Altschul et al.,]). 이들 초기의 주변 단어 히트(hit)는 이들을 함유하는 더 긴 HSP를 찾는 조사를 개시하기 위한 근원으로 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 확장될 수 있다. 누적 점수는, 예를 들어 뉴클레오티드 서열에 대해서, 파라미터 M (일치하는 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (불일치하는 잔기에 대한 벌칙 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 점수표는 누적 점수를 계산하기 위해 사용된다. 각각의 방향에서 단어 히트의 확장은 다음의 경우에서 중단된다: 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 양 X 만큼 하락하는 경우; 누적 점수가 하나 이상의 음의 점수 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 이하로 되는 경우; 또는 둘 중 하나의 서열의 끝이 도달되는 경우. 블라스트 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 블라스트엔(BLASTN) 프로그램 (뉴클레오티드 서열을 위한)은 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4 및 두 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, 블라스트피(BLASTP) 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 10의 기대값 (E), 및 50의 BLOSUM62 점수표 (문헌 [Henikoff& Henikoff, 1989, Proc . Nati . Acad . Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬(B), 10의 기대값 (E), M=5, N=-4, 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
두 아미노산 서열의 또는 두 핵산의 퍼센트 동일성 또는 유사성을 측정하기 위해, 최적의 비교 목적으로 서열을 정렬한다 (예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과 최적의 정렬을 하도록 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있음). 그 다음 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열에서 한 위치가, 제2 서열에서 대응하는 위치와 동일하거나 유사한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유된 다면, 분자는 그 위치에서 동일하거나 또는 유사하다. 두 서열 사이에 퍼센트 동일성 또는 유사성은 서열에 의해 공유되는 동일하거나 또는 유사한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 (예를 들어, 겹쳐지는 위치) × 100). 두 아미노산의 유사성은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 무극성 중성 잔기 (예를 들어, Ala, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val)는 유사하다고 간주될 수 있고, 차례로 산성 전하 극성 (예를 들어, Glu, Asp), 염기성 전하 극성 (예를 들어, Arg, His, Lys) 및 중성 극성 (예를 들어, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr) 잔기들도 그럴 수 있다.
동일성 및 유사성 둘 다 쉽게 계산될 수 있다. 예를 들어, 퍼센트 동일성을 계산하는 경우, 정확한 매치만을 계수할 수 있고, 부분적인 정렬이 아니라 전체적인 정렬을 수행할 수 있다. 서열 사이의 동일성 또는 유사성을 측정하는데 통상적으로 사용되는 방법은, 예를 들어 문헌 [Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 개시된 것들을 포함한다. 동일성을 측정하기 위한 예시적인 방법은 시험되는 서열 사이에 가장 큰 매치를 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 측정하는 예시적인 방법은 또한 상업적 컴퓨터 프로그램으로 제공된다. 두 서열의 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 특별한 예는 문헌 [Karlin et al., 1990, Proc. Natl . Acad . Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘, 및 변형된 것, 예를 들어 문헌 [Karlin et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 90:5873-5877]에서의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol . Biol. 215:403-410]의 엔블라스트(NBLAST) 및 엑스블라스트(XBLAST) 프로그램에 혼입된다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기 위해, 갭이 있는 블라스트(Gapped BLAST)가 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 별법으로, PSI-블라스트는 반복되는 검색을 수행하는데 사용될 수 있고, 이는 분자 사이에 원연 관계를 감지한다. 블라스트, 갭이 있는 블라스트, 및 PSI-블라스트 프로그램을 이용할 때, 당업계에 공지된 바와 같이, 각각의 프로그램 (예를 들어, 엑스블라스트 및 엔블라스트)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. 게다가, 파스타(FASTA) 방법 (앞서 언급된 바와 같은 문헌 [Atschul et al., 1990])이 사용될 수 있다. 서열의 비교에 유용한 수학적 알고리즘의 또 다른 특별한 예는 문헌 [Myers et al., 1988, CABIOS 4:11-17]의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 얼라인(ALIGN) 프로그램 (버전 2.0)에 혼입되며, 이는 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부이다 (문헌 [Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12(1):387]). 퍼센트 동일성은 벡터 NTI®(Vector NTI®) 인비트로젠(Invitrogen; 캘리포니아주 칼즈배드)의 얼라인X®(AlignX®) 모듈을 사용한 분석에 의해 측정될 수 있다.
"비만" 및 "과체중"은 정상으로 예상되는 것 초과의 체중을 갖는 포유동물을 지칭하며, 이는 예를 들어 신체적 외모, 당업계에 공지된 바와 같은 체질량 지수 (BMI), 허리 둘레-대-둔부 둘레 비율, 피하지방 두께, 허리 둘레 등에 의해 측정될 수 있다. 질환 통제 예방 센터 (CDC)는 과체중을 25 내지 29.9의 BMI를 갖는 성인 인간으로서 정의하고; 비만을 30 이상의 BMI를 갖는 성인 인간으로서 정의한다. 비만을 결정하기 위한 추가의 측정 기준이 존재한다. 예를 들어, CDC는 1.0 초과의 허리-대-둔부 비율을 갖는 사람을 과체중으로 명시한다.
"지방 제외 체중(Lean body mass)"은 신체에서 지방이 없는 질량, 즉 총 체중에서 체지방 중량을 뺀 것이 지방 제외 체중이다. 지방 제외 체중은 당업계에 공지된 바와 같은 수중 체중측정, 컴퓨터화된 챔버(computerized chamber), 이중 에너지 X-선 흡광분석법, 스킨 캘리퍼(skin caliper), 자기 공명 영상법 (MRI) 및 생체 전기 임피던스 분석 (BIA)과 같은 방법에 의해 측정할 수 있다.
"포유동물"은 일반적으로 털(fur) 또는 헤어(hair)를 갖고, 그의 자손을 정상 출산하고, 그의 자손에게 밀크를 먹이는 온혈 동물을 지칭한다. 포유동물은 인간; 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이); 가축 (예를 들어, 소, 말, 양, 돼지, 염소); 야생 동물 등을 포함한다. 한 실시양태에서, 포유동물은 암컷이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 여성이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 고양이 또는 개이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 당뇨병이 있는 포유동물, 예를 들어, 제2형 당뇨병을 가진 인간이다. 한 실시양태에서, 포유동물은 비만인 당뇨병이 있는 포유동물, 예를 들어, 제2형 당뇨병을 가진 비만인 포유동물이다.
"아밀린 효능제 화합물"은 아밀린 효능제 활성을 갖는, 천연 아밀린 펩티드, 아밀린 유사 펩티드, 및 다른 화합물 (예를 들어, 소 분자)을 포함한다. "아밀린 효능제 화합물"은 천연 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 합성일 수 있거나, 재조합 DNA 기술(recombinant DNA technique)에 의해 유래될 수 있다. 아밀린 효능제 화합물은 아밀린 효능제 수용체 결합 활성을 갖고 아미노산 (예를 들어, 천연, 비천연, 또는 그의 조합), 펩티드 모방체, 화학 모이어티 등을 포함할 수 있다. 당업자는 아밀린 수용체 결합 검정을 사용하여 또는 가자미근 검정에서 아밀린 효능제 활성을 측정함으로써 아밀린 효능제 화합물을 인식할 것이다. 아밀린 효능제 화합물은 아밀린 수용체 결합 검정에서, 약 200 nM 이하, 약 100 nM 이하, 또는 약 50 nM 이하의 IC50을 가질 수 있고, 예컨대 본원에, 미국 특허 제5,686,411호, 및 US 공개 제2008/0176804호에 기재되어 있고, 그의 개시 내용은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 용어 "IC50"은 통상의 의미에서 생물학적 또는 생화학적 기능을 억제하는 화합물의 최대 억제 농도의 절반을 지칭한다. 따라서, 수용체 결합 연구의 맥락에서, IC50은 특정된 수용체로부터 공지된 리간드의 절반과 경쟁하는 시험 화합물의 농도를 지칭한다. 아밀린 효능제 화합물은 가자미근 검정에서 약 20 nM 이하, 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 또는 약 5 nM 이하의 EC50을 가질 수 있고, 예컨대 본원에, 및 미국 특허 제5,686,411호에 기재된 것이다. 용어 "EC50"은, 당업계에 공지된 바와 같이, 통상의 의미에서 기준 반응 및 최대 반응 사이에서 중간에서 반응을 유도하는 화합물의 유효한 농도를 지칭한다. 아밀린 효능제 화합물은 [25,28,29Pro]인간-아밀린 (프람린타이드)에 대해 적어도 90% 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 아밀린 효능제 화합물은 아밀린 (예를 들어, 인간 아밀린, 래트 아밀린 등) 및 칼시토닌 (예를 들어, 인간 칼시토닌, 연어 칼시토닌 등)의 펩티드 키메라일 수 있다. 적합하고 예시적인 아밀린 효능제 화합물은 또한 미국 공개 제2008/0274952호에 기재되어 있고, 그의 개시 내용은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 수치의 맥락에서 용어 "약"은 수치의 +/- 10%를 지칭한다.
폴리펩티드의 맥락에서 "단편"은 본원에서 통상의 화학 의미에서 폴리펩티드의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 단편은 모체 폴리펩티드의 하나 이상의 잔기의 N-말단 결실 또는 C-말단 결실로부터 생성될 수 있고/거나, 단편은 모체 폴리펩티드의 하나 이상의 잔기의 내부 결실로부터 생성될 수 있다. 용어 폴리펩티드의 맥락에서 "모체"는, 통상의 의미에서, 변형, 예를 들어, 삽입, 결실 및/또는 치환 이전에 참조 구조로서의 역할을 하는 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "접합체", "펩티드 접합체", "폴리펩티드 접합체" 등은 본원에 기재된 방법에 유용한 화합물의 맥락에서, 임의로 링커를 통해, 하나 이상의 지속기간 향상 모이어티에 결합되는 성분 폴리펩티드를 지칭한다.
용어 "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체의 폴리펩티드 성분의 맥락에서 동의어이다. 용어 "펩티드"는 통상의 의미에서 아미드 결합에 의해 연결되는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 용어 "데스(des)-아미노산", "데스-AA", "데스Lys" 등은 당업계에서 통상적인 바와 같이, 명시된 아미노산의 부재를 지칭한다. 아미노산 (또는 관능기)이 "부재"라는 것은 부재 아미노산의 N-말단 및 C-말단 측에 이전에 부착된 잔기 (또는 관능기)가 함께 결합되게 된 것을 의미한다. 용어 "펩티드 성분" 및 "폴리펩티드 성분"은 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 내에 포함된 폴리펩티드를 지칭한다.
폴리펩티드의 맥락에서 "유도체"는 그의 모체 또는 유사체의 아미노산 서열을 갖지만, 게다가 그의 아미노산 측기(side group), α-탄소 원자, 주쇄 질소 원자, 말단 아미노기, 또는 말단 카르복실산기 중 하나 이상의 화학적 변형을 갖는 분자를 지칭한다. 화학적 변형은 화학 모이어티를 첨가하는 것, 새로운 결합을 창출하는 것, 및 화학 모이어티를 제거하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 아미노산 측기에서의 변형은 리신 ε-아미노기의 아실화, 아르기닌, 히스티딘, 또는 리신의 N-알킬화, 글루탐산 또는 아스파르트산의 카르복실산기의 알킬화, 및 글루타민 또는 아스파라긴의 탈아미드화를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 말단 아미노의 변형은 데스아미노, N-저급 알킬, N-디-저급 알킬, 속박된(constrained) 알킬 (예를 들어 분지형, 시클릭, 융합, 아다만틸) 및 N-아실 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 말단 카르복시기의 변형은 아미드, 저급 알킬 아미드, 속박된 알킬 (예를 들어 분지형, 시클릭, 융합, 아다만틸), 디알킬 아미드, 및 저급 알킬 에스테르 변형을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 더욱이, 하나 이상의 측기, 또는 말단기는, 통상의 합성 화학자에게 공지된 보호기에 의해 보호될 수 있다. 아미노산의 알파-탄소는 모노- 또는 디메틸화될 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드 성분의 유도체가 또한 고려될 수 있고 여기서 개별 아미노산의 입체 화학은 하나 이상의 구체적인 부위에서 (L)/S에서 (D)/R로 전화(invert)될 수 있다. 또한, 예를 들어, Asn, Ser 및/또는 Thr 잔기에서 글리코실화에 의해 변형된 폴리펩티드 성분이 고려된다. 제공된 방법에서 유용한 화합물은 또한 본원에 기재된 생물학적으로 활성인 펩티드의 단편 (천연, 효능제, 유사체, 및 유도체)일 수 있다.
용어 "모방체", "펩티드모방체" 등은 통상의 의미에서 천연 모체 펩티드의 생물학적 작용(들)과 같은 작용을 하거나 이들 작용을 길항할 수 있는 비-펩티드성(non-peptidic) 구조 요소를 함유하는 화합물을 지칭한다.
본 출원 전체에 걸쳐서, 대안을 마쿠시(Markush) 그룹으로, 예를 들어, 하나 초과의 가능한 아미노산을 함유하는 각각의 아미노산 위치로 기재하고 있음을 주목해야 한다. 구체적으로 마쿠시 그룹의 각각의 구성원은 별개로 간주되어야 하고, 그로 인해 또 다른 실시양태를 포함하는 것으로 간주되고, 마쿠시 그룹은 단일 유닛으로 해석해서는 안 된다는 점이 고려된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")는 맥락으로부터 달리 명시되거나 명확하지 않는 한 복수형 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 맥락으로부터 명백하게 되는 바와 같이, 단수 형태("a") 유사체는 하나 이상의 유사체를 포함할 수 있다.
II . 화합물
제1 측면에서, 임의로 링커를 통해, 하나 이상의 지속기간 향상 모이어티에 연결되는 폴리펩티드 성분을 포함하는 폴리펩티드 접합체가 제공된다. 따라서, 폴리펩티드 성분은, 바람직하게는 공유결합 부착에 의해, 하나 이상의 지속기간 향상 모이어티가 부착되는 주형 ("폴리펩티드 주형")으로서의 역할을 한다. 폴리펩티드 성분으로의 지속기간 향상 모이어티의 연결은 본원에 기재된 바와 같이 링커를 통해서 일 수 있다. 별법으로, 폴리펩티드 성분으로의 지속기간 향상 모이어티의 연결은 직접 공유 결합을 통해서 일 수 있다. 지속기간 향상 모이어티는 본원에 기재된 바와 같이 수용성 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 복수의 지속기간 향상 모이어티가 폴리펩티드 성분에 부착되고, 이 경우에 각각의 지속기간 향상 모이어티에 대한 각각의 링커는 독립적으로 본원에 기재된 링커로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분은 하기 화학식 I의 잔기 1 내지 37의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 화학식 I에 기재된 아미노산의 25% 이하는 결실되거나 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다:
<화학식 I>
Figure pct00003
화학식 I에서, X'는 수소, N-말단 캡핑기, 지속기간 향상 모이어티에 대한 결합, 또는 지속기간 향상 모이어티에 대한 링커이다. Xaa1은 Lys 또는 결합이고, Xaa18은 Lys, Cys, 또는 His이고, Xaa21은 Lys, Cys, 또는 Asn이고, Xaa24는 Lys, Cys, 또는 Gly이고, Xaa25는 Lys, Cys, 또는 Pro이고, Xaa26은 Lys, Cys, 또는 Ile이고, Xaa27은 Lys, Cys, 또는 Leu이고, Xaa28은 Lys, Cys, 또는 Pro이고, Xaa29는 Lys, Cys, 또는 Pro이고, Xaa31은 Lys, Cys, 또는 Asn이고, Xaa34는 Lys, Cys, 또는 Ser이고, Xaa35는 Lys, Cys, 또는 Asn이다. 당업자는 화학식 I, 및 본원에 기재된 다른 화학식의 폴리펩티드 성분이 하나 이상의 지속기간 향상 모이어티에 부착하기 위해 적절한 원자가를 갖는다는 것을 즉시 인식할 것이다. 예를 들어, 단일 지속기간 향상 모이어티가 존재하는 경우, 화학식 I의 폴리펩티드 성분은 1가 펩티드이고, 이러한 원자가는, 임의로 링커를 통해, 지속기간 향상 모이어티에 부착한다. 따라서, 2개의 지속기간 향상 모이어티가 존재하는 경우, 화학식 I의 폴리펩티드 성분은 2가 펩티드 등등이다.
추가로 화학식 I과 관련하여, 변수 X는 C-말단 관능기 (예를 들어, C-말단 캡)를 나타낸다. X는 치환 또는 비치환 아미노, 치환 또는 비치환 알킬아미노, 치환 또는 비치환 디알킬아미노, 치환 또는 비치환 시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환 아릴아미노, 치환 또는 비치환 아르알킬아미노, 치환 또는 비치환 알킬옥시, 치환 또는 비치환 아릴옥시, 치환 또는 비치환 아르알킬옥시, 히드록실, 지속기간 향상 모이어티에 대한 결합, 또는 지속기간 향상 모이어티에 대한 링커이다. 일부 실시양태에서, 지속기간 향상 모이어티는, 임의로 링커를 통해, 연결 아미노산 잔기의 측쇄, X' 또는 X에 공유결합으로 연결된다. 일부 실시양태에서, 지속기간 향상 모이어티는, 임의로 링커를 통해, 폴리펩티드 성분의 주쇄 원자에 공유결합으로 연결된다. 화학식 I의 잔기 1 내지 37의 서열을 갖는 폴리펩티드 성분의 C-말단이 관능기 X에 의해 캡핑되면, X는 바람직하게는 아민이고 그로 인해 C-말단 아미드를 형성한다. 화학식 I에 따른 폴리펩티드 성분을 비롯한 본원에 기재된 폴리펩티드 성분의 N-말단은, 아세틸기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 관능기에 공유결합으로 연결될 수 있다. 용어 "N-말단 캡핑기"는 통상의 의미에서 폴리펩티드의 N-말단 질소에 공유 결합된 모이어티, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은, 치환 또는 비치환 아실, 치환 또는 비치환 아실옥시, 시프 염기(Schiff's base) 등을 지칭한다. 일부 실시양태에서, N-말단 관능기 X'는 당업계에 공지된 바와 같은 아민-보호기, 바람직하게는 Fmoc이다.
일부 실시양태에서, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 심지어 50% 이하의 화학식 I의 잔기 1 내지 37의 아미노산이 화학식 I에 따른 폴리펩티드 성분에서 결실되거나 치환된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분은 화학식 I에 기재된 아미노산 서열에 대해 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 심지어 16개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 접합체의 폴리펩티드 성분은 화학식 I에 따른 아미노산 서열의 잔기 1 내지 37에 대해 규정된 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 성분과 화학식 I의 잔기 1 내지 37 간의 서열 동일성은 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 심지어 그 초과이다. 일부 실시양태에서, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 이하 또는 심지어 그 미만의 화학식 I의 잔기 1 내지 37에 기재된 아미노산이 결실되거나 상이한 아미노산으로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 범위 75% 내지 100% 이내이다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 범위 75% 내지 90% 이내이다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 범위 80% 내지 90% 이내이다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 75% 이상이다. 일부 실시양태에서, 접합체의 폴리펩티드 성분은 화학식 I의 잔기 1 내지 37의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분은 화합물 12의 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분은 화합물 6의 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분은 화학식 I의 서열에 대해 하나 이상의 동류(conservative) 아미노산 치환을 갖는다. "동류 아미노산 치환"은 통상의 의미에서 측쇄에서 유사한 생화학적 특성 (예를 들어, 친수성, 소수성, 전하 유형, 반 데르 발스 반지름 등)을 갖는 아미노산의 치환을 지칭한다. "비-동류 아미노산 치환"은 통상의 의미에서 측쇄에서 유사하지 않은 생화학적 특성을 갖는 아미노산의 치환을 지칭한다.
본원에 기재된 (예를 들어, 화학식 I의 잔기 1 내지 37에서 발견되는 바와 같은) 임의의 폴리펩티드 성분에 관해서 서열 동일성을 계산하는데 있어서, 본원에 개시된 아미노산에 대해 비교될 서열을 존재하는 임의의 N-말단 (즉, X') 또는 C-말단 (즉, X) 관능기와 무관하게 취함이 이해된다. 추가로 아미노산의 측쇄에 공유결합으로 연결된 지속기간 향상 모이어티의 존재는 서열 동일성의 계산에 중요하지 않음이 이해된다. 예를 들어, 화학식 I의 임의의 위치에서 치환되고 게다가, 임의로 링커를 통해, 지속기간 향상 모이어티와 결합된 리신은 서열 동일성 계산을 위한 리신이다.
화학식 I의 잔기 1 내지 37의 서열을 포함하는 폴리펩티드는 아밀린 및 칼시토닌, 또는 그의 유사체의 키메라 조합물인 것으로 간주될 수 있다. 영양소 섭취에 반응하여 인슐린과 동시-분비되는 췌장의 β 세포에 의해 합성되는 펩티드 호르몬이다. 아밀린의 서열은 포유류 종에 걸쳐서 고도로 보존되어 있고, 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP), 칼시토닌, 인터메딘, 및 아드레노메둘린과 구조적 유사성을 갖는다. 아밀린의 당 조절 작용은 영양소-자극 글루카곤 분비의 억제를 통해 순환에서 글루코스 생성의 속도를 조절하고 위 내용 배출을 둔화시킴으로써 인슐린의 그러한 작용을 보완한다. 당뇨병을 가진 인슐린-치료 환자에서, 인간 아밀린의 합성 및 동등한 효력이 있는 유사체인 프람린타이드는, 부적절하게 상승된 식후 글루카곤 분비를 억제하고 위 내용 배출을 둔화시킴으로써 식후 글루코스 변동폭을 감소시킨다. 래트 아밀린, 인간 아밀린 및 프람린타이드의 서열은 각각 하기와 같다:
Figure pct00004
또 다른 측면에서, 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 위치 2 내지 37의 아미노산 잔기는 리신 잔기 또는 시스테인 잔기로 치환되어 있고 여기서 상기 리신 잔기 또는 시스테인 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체가 제공되고, 여기서 아미노산 번호 매김은 서열 3의 아미노산 수에 따른다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 또는 37 중 어느 한 위치의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 18, 21, 24 내지 29, 31, 34 또는 35 중 어느 한 위치의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 18의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신은, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 21의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 24의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 25의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 26의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 27의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 28의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 29의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 31의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 34의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 여기서 위치 1의 아미노산 잔기는 부재 (즉, 데스-Lys1)하고 여기서 위치 35의 아미노산 잔기는 리신 잔기로 치환되고 여기서 상기 리신 잔기는, 임의로 링커를 통해, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 연결되는, 서열 3을 갖는 프람린타이드의 유도체 또는 그의 유사체인 폴리펩티드 접합체에 관한 것이다.
링커. 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체에서 폴리펩티드 성분으로의 지속기간 향상 모이어티의 부착의 맥락에서 용어 "링커" 등은, 차례로 결합에 이용가능한 원자가를 갖는 폴리펩티드 성분에 및 결합에 이용가능한 원자가를 갖는 지속기간 향상 모이어티에 공유 결합하는 2가 종 (-L-)을 의미한다. 폴리펩티드 성분 상에 이용가능한 결합 부위는 편리하게는 측쇄 잔기 (예를 들어, 리신, 시스테인, 아스파르트산, 및 그의 동족체)이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분 상에 이용가능한 결합 부위는 리신 또는 시스테인 잔기의 측쇄이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분 상에 이용가능한 결합 부위는 N-말단 아민이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분 상에 이용가능한 결합 부위는 C-말단 카르복실이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분 상에 이용가능한 결합 부위는 그의 주쇄 원자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결 아미노산 잔기"는, 임의로 링커를 통해, 지속기간 향상 모이어티가 부착되는 화학식 I의 잔기 1 내지 37 내의 아미노산을 의미한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 성분을 지속기간 향상 모이어티와 공유결합으로 연결하는 링커를 갖는 화합물이 제공된다. 링커는 선택적이고; 즉 임의의 링커는 단순히 결합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 성분의 측쇄에서 부착된다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 성분의 주쇄 원자에 부착된다.
한 실시양태에서, 링커는 다관능성 아미노산, 예를 들어 리신 및 그의 동족체, 아스파르트산 및 그의 동족체 등이지만 이에 제한되지 않는다. 아미노산의 맥락에서 용어 "다관능성"은, 아미노산의 알파 아민 및 카르복실 관능기 이외에, 반응하여 결합을 형성할 수 있는 측쇄 관능기를 지칭한다. 다관능성 아미노산의 예시적인 관능기는 아민, 카르복실 및 술프히드릴 관능기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 결합에 의해 연결된 1 내지 30개의 아미노산 ("펩티드 링커")을 포함한다. 아미노산은 20개의 천연 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 별법으로, 비천연 아미노산은 화학 합성, 번역 후(post-translational) 화학적 변형에 의해 또는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의한 생체 내 혼입에 의한 것 중 어느 하나에 의해 혼입될 수 있다. 이들 링커 아미노산의 일부는 글리코실화될 수 있다. 또 다른 실시양태에서 1 내지 30개의 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 링커는 입체적 비장애(sterically unhindered)인 다수의 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌 및/또는 세린으로 이루어진다. 폴리글리신, 예를 들어 (Gly)3, (Gly)4 (서열 5), (Gly)5 (서열 6)은 특히 유용하고, 폴리알라닌, 폴리(Gly-Ala) 및 폴리(Gly-Ser)도 마찬가지이다. 링커의 다른 구체적 예는 (Gly)3Lys(Gly)4 (서열 7); (Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (서열 8); (Gly)3Cys(Gly)4 (서열 9); 및 GlyProAsnGlyGly (서열 10)이다. Gly 및 Ala의 조합이 특히 유용하고 Gly 및 Ser의 조합도 마찬가지이다. 따라서 추가 실시양태에서 펩티드 링커는 글리신 풍부 펩티드, 예를 들어 Gly-Gly-Gly; 서열 [Gly-Ser]n (서열 11), [Gly-Gly-Ser]n (서열 12), [Gly-Gly-Gly-Ser]n (서열 13) 및 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (서열 14)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고, 예를 들어 [Gly-Gly-Gly-Gly Ser]3 (서열 15)이다.
일부 실시양태에서, 링커는 2가 헤테로원자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는, -O-, -S-, -S-S-, -OCO-, -OCONH-, 및 -NHCONH-, 치환 또는 비치환 알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌이거나, 이들을 포함한다. 대표적인 링커는 지속기간 향상 모이어티 및 폴리펩티드 성분에 부착되는 -O-, -S-, -S-S-, -OCO-, -OCONH-, 및 -NHCONH-, 아미드 및/또는 우레탄을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드 성분의 주쇄 관능기 (모이어티)의 아미노산 측쇄와 지속기간 향상 모이어티 상의 관능기 간의 직접 화학 접합으로부터 생성된다. 예시적인 이러한 유형의 결합은 당분야에 주지된 바와 같은, 표준 고체-상 합성 방법에 의해 달성된 아미드 결합의 형성이다. 본원에 기재된 링커는 예시적인 것이고, 본 발명의 범위 내에 링커는 훨씬 더 길 수 있고 다른 잔기를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 링커는 2개 이상의 치환 또는 비치환 알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 구조 -L1-L2-이고, 여기서 L1 및 L2는 각각 독립적으로 2가 헤테로원자, -O-, -S-, -S-S-, -OCO-, -OCONH-, 및 -NHCONH-, 치환 또는 비치환 알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌이다. 일부 실시양태에서, L1 및 L2는 각각 독립적으로 -OCO-(CH2)n-CO- , -O-(CH2)n-NHCO-, -O-(CH2)n-, -O-(CH2)n-CONH-(CH2)n-, -O-(CH2)n-, -SO2-(CH2)n-, -SO2-(CH2)n-S-이고, 여기서 "n"은 독립적으로 각각의 경우에 1 내지 5이다.
일부 실시양태에서, 링커는 구조 OCO-(CH2)n-CO-, -O-(CH2)n-NHCO-, -O-(CH2)n-, -O-(CH2)n-CONH-(CH2)n-, -O-(CH2)n-, -SO2-(CH2)n-, -SO2-(CH2)n-S-를 갖고, 여기서 "n"은 독립적으로 각각의 경우에 1 내지 5이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 링커 또는 치환된 링커 기 내에 치환된 기는 1개 이상의 치환기 군으로 치환된다. 더욱 구체적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 링커 내에 각각의 치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 치환 시클로알킬, 치환 헤테로시클로알킬, 치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 치환 알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌은 1개 이상의 치환기 군으로 치환된다. 다른 실시양태에서, 이들 기 중 1개 이상 또는 모두는 1개 이상의 크기-제한된 치환기 군으로 치환된다. 별법으로, 이들 기 중 1개 이상 또는 모두는 1개 이상의 저급 치환기 군으로 치환된다.
본원에 기재된 링커의 다른 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환 알킬은 치환 또는 비치환 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 20 원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬은 치환 또는 비치환 C4-C8 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환 4 내지 8 원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 알킬렌은 치환 또는 비치환 C1-C20 알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌은 치환 또는 비치환 2 내지 20 원 헤테로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 C4-C8 시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 4 내지 8 원 헤테로시클로알킬렌이다.
별법으로, 각각의 치환 또는 비치환 알킬은 치환 또는 비치환 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 8 원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬은 치환 또는 비치환 C5-C7 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환 5 내지 7 원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 알킬렌은 치환 또는 비치환 C1-C8 알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌은 치환 또는 비치환 2 내지 8 원 헤테로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 C5-C6 시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 5 내지 7 원 헤테로시클로알킬렌이다.
폴리펩티드 성분. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 유용한 폴리펩티드 성분은 하기 표 1에 제공된 화학식 I의 잔기 1 내지 37에 기재된 폴리펩티드 성분을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 명시적으로 제공된 서열을 갖는 펩티드를 비롯한, 본원에 기재된 모든 펩티드가 유리 카르복실레이트 형태 및 아미드화된 형태 둘 다에서 고려된다.
Figure pct00005
지속기간 향상 모이어티 . 일부 실시양태에서, 지속기간 향상 모이어티는 화학식 -L-R (여기서 R은 본원에 기재된 바와 같은 지속기간 향상 모이어티이고, L은링커 또는 결합임)을 갖는 "연결된 지속기간 향상 모이어티"내에 포함된다. L이 링커인 경우, L은 당업계에 공지된 바와 같은, -C(O)-, -NH-, -O-, -S-, -S-S-, -OCO-, -OCONH-, -NHCONH-, 치환 또는 비치환 알킬렌, 치환 또는 비치환 알케닐렌, 치환 또는 비치환 우레탄, 치환 또는 비치환 알킬아미드, 치환 또는 비치환 알킬술폰, 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌 등일 수 있다.
일부 실시양태에서, L은 R1-치환 또는 비치환 알킬렌, R1-치환 또는 비치환 알케닐렌, R1-치환 또는 비치환 우레탄, R1-치환 또는 비치환 알킬아미드, R1-치환 또는 비치환 알킬술폰, R1-치환 또는 비치환 헤테로알킬렌, R1-치환 또는 비치환 시클로알킬렌, R1-치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌이다. R1은 R2-치환 또는 비치환 알킬, R2-치환 또는 비치환 헤테로알킬, R2-치환 또는 비치환 시클로알킬, R2-치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, R2-치환 또는 비치환 아릴, 또는 R2-치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. R2는 R3-치환 또는 비치환 알킬, R3-치환 또는 비치환 헤테로알킬, R3-치환 또는 비치환 시클로알킬, R3-치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬, R3-치환 또는 비치환 아릴, 또는 R3-치환 또는 비치환 헤테로아릴이다. R3는 비치환 알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 시클로알킬, 비치환 헤테로시클로알킬, 비치환 아릴 또는 비치환 헤테로아릴이다.
일부 실시양태에서, 연결된 지속기간 향상 모이어티 -L-R은 폴리펩티드 성분의 아미노산 측쇄에, 또는 그의 주쇄 원자 또는 모이어티에 공유결합된다. 예시적인 주쇄 모이어티는 N-말단에서 유리 아민, 및 C-말단에서 유리 카르복실 또는 카르복실레이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 측쇄 또는 주쇄 원자 또는 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체에 공유결합된다.
수용성 중합체. 일부 실시양태에서, 지속기간 향상 모이어티 R은 수용성 중합체이다. "수용성 중합체"는 본원에 기재된 방법에 유용하도록, 예를 들어, 당업계에 공지된 바와 같은, 온도, 이온 농도 등의 생리적 조건하에, 물에 충분히 가용성인 중합체를 의미한다. 수용성 중합체는 그러한 수용성 중합체가 부착되는 펩티드 또는 다른 생체 분자의 용해도를 증가시킬 수 있다. 사실은, 그러한 부착은 생체내에서, 투여된 단백질의 순환 수명(circulating life), 수 용해도 및/또는 항원성을 개선하는 수단으로 제안되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,179,337호; 미국 공개 출원 제2008/0032408호 참조. 많은 상이한 수용성 중합체 및 부착 화학, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체 중 어느 하나) 등은 이러한 목표를 위해 사용되어 왔다.
폴리에틸렌 글리콜. 일부 실시양태에서, 연결된 지속기간 향상 모이어티 -L-R은 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG")은 치료상 사용가능한 폴리펩티드를 수득하기 위한 노력에서 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌 [Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6:150-165]; [Mehvar, R., 2000, J. Pharm . Pharmaceut . Sci., 3:125-136] 참조. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, PEG 주쇄 [(CH2CH2-O-)n, n: 반복 단량체의 수]는 가요성이고 양친매성이다. 어떤 이론 또는 작용의 메커니즘에 의해서도 구속되는 것을 바라지 않으면서, 긴, 쇄-유사 PEG 분자 또는 모이어티는 수성 매질 중에 있을 경우 심하게 수화되고 고속 운동(rapid motion)하는 것으로 여겨진다. 이러한 고속 운동은 PEG가 큰 용적으로 소출(sweep out)하도록 하고 다른 분자의 접근 및 간섭을 방지하는 것으로 여겨진다. 그 결과, 또 다른 화학 물질 (예컨대 펩티드)에 부착시, PEG 중합체 쇄는 그러한 화학 물질을 면역 반응 및 다른 클리어런스(clearance) 메커니즘으로부터 보호할 수 있다. 그 결과, 페길화(pegylation)는 약동학을 최적화하고, 생체이용률을 증가시키고, 면역원성 및 투여 빈도를 감소시킴으로써 약물 효능 및 안전성을 개선할 수 있다. "페길화"는 통상의 의미에서 PEG 모이어티와 또 다른 화합물의 접합을 지칭한다. 예를 들어, PEG의 부착은 단백질분해에 대해 단백질을 보호하는 것으로 확인되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Blomhoff, H. K. et al., 1983, Biochim Biophys Acta, 757:202-208] 참조. 달리 분명히 나타내지 않는 한, 용어 "PEG, "폴리에틸렌 글리콜 중합체" 등은 폴리에틸렌 글리콜 중합체 및 메톡시-PEG (mPEG)를 비롯한 그의 유도체를 지칭한다.
중합체 모이어티, 예컨대 PEG 및 관련 중합체를 단백질 상에서 발견되는 반응성 기에 부착하기 위해 다양한 수단이 사용되어 왔다. 예를 들어, 미국 특허 제4,179,337호; 미국 특허 제4,002,531호; 문헌 [Abuchowski et al., 1981, in "Enzymes as Drugs," J. S. Holcerberg and J. Roberts, (Eds.), pp. 367-383]; [Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6:150-165] 참조. 단백질을 변형시키기 위한 PEG 및 다른 중합체의 사용이 논의되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Cheng, T.-L. et al., 1999m, Bioconjugate Chem., 10:520-528]; [Belcheva, N. et al.,1999, Bioconjugate Chem., 10:932-937]; [Bettinger, T. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:842-846]; [Huang, S.-Y. et al., 1998, Bioconjugate Chem., 9:612-617]; [Xu, B. et al. 1998, Langmuir, 13:2447-2456]; [Schwarz, J. B. et al., 1999, J. Amer . Chem . Soc ., 121:2662-2673]; [Reuter, J. D. et al., 1999, Bioconjugate Chem ., 10:271-278]; [Chan, T.-H. et al., 1997, J. Org . Chem., 62:3500-3504] 참조. 단백질에서의 전형적인 부착 부위는 1급 아미노기, 예컨대 리신 잔기 상에서 또는 N-말단에서의 것, 티올기, 예컨대 시스테인 측쇄 상의 것, 및 카르복실기, 예컨대 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기 상에서 또는 C-말단에서의 것을 포함한다. 부착의 통상적인 부위는 당단백질, 시스테인의 당 잔기로 또는 표적 폴리펩티드의 N-말단 및 리신으로이다. 용어 "페길화(pegylate)" 등은 본원에 기재된 바와 같이/또는 당업계에 공지된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜을, 임의로 링커를 통해, 폴리펩티드 또는 다른 생체 분자에 공유결합으로 부착시키는 것을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 중 PEG 모이어티는 특정된 범위 내에서 공칭 분자량을 갖는다. 당업계에서 통상적인 바와 같이, PEG 모이어티의 크기는, 전형적으로 킬로달톤(kD)으로 제공되는, 공칭 분자량을 참조로 나타내진다. 분자량은 수, 중량, 점도 및 "Z" 평균 분자량을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 계산된다. 중합체, 예컨대 PEG 등은 공칭 평균값에 관한 공지된 분자량의 분포로서 존재함이 이해된다.
PEG에 대한 분자량에 관한 예시적인 전문 용어, 용어 "mPEG40KD"는 40 킬로달톤의 공칭 분자량을 갖는 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 지칭한다. PEG의 다른 분자량의 언급은 이러한 관례에 따른다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 10-100 KD, 20-80 KD, 20-60 KD, 또는 20-40 KD 범위의 공칭 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 심지어 100 KD의 공칭 분자량을 갖는다. 바람직하게는, PEG 모이어티는 20, 25, 30, 40, 60 또는 80 KD의 분자량을 갖는다.
폴리펩티드의 유도체화에 유용한 PEG 분자는 당업자에게 공지된 바와 같이, 전형적으로 선형, 분지형 및 워릭(Warwick) (즉, 폴리PEG®) 부류의 PEG로 분류된다. 달리 분명히 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 PEG 모이어티는 선형 PEG이다. 더욱이, 용어 "양팔 분지형(two arm branched)", "Y-형상(shaped)" 등은 당업계에 공지된 바와 같이, 분지형 PEG 모이어티를 지징한다. PEG의 맥락에서 용어 "워릭" (또한 "콤(comb)" 또는 "콤-유형" PEG로서 공지됨)은, 당업계에 공지된 바와 같이, 주쇄, 전형적으로 폴리(메타크릴레이트)에 부착된 다양한 다중팔(multi-arm) PEG를 지징한다. 본원에서 제공된 표에서 사용된 관례를 비롯한 명명법과 관련하여, 달리 지시가 없는 한 PEG 모이어티는 펩티드의 주쇄에 부착된다. 예를 들어, 화합물 19는 화합물 1의 N-말단 질소로의 mPEG40KD의 접합의 결과이다. 유사하게, 화합물 20은 화합물 2의 N-말단 질소로의 mPEG40KD의 접합의 결과이다. 표준 3-문자 약어가 사용될 수 있는 바와 같이, 아미노산에 관한 표준 단일 문자 약어가 사용될 수 있다. 예를 들어, 화합물 24는 화합물 10의 유사체이고 여기서 화합물 9의 위치 26에서의 잔기가 리신을 대신하고, 리신 26의 펜던트 아민 관능기 (즉, K26)는 PEG40KD 모이어티와 접합된다. 예시적인 화합물이 하기 표 2에 제공된다.
Figure pct00006
재조합 PEG . 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드와 접합된 지속기간 향상 모이어티 -L-R은 일정한 형태가 없는(unstructured) 재조합 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 모든 목적상 본원에 참고로 포함된, 문헌 [Schellenberger et al., 2009, Nature Biotechnology, 27: 1186-1192] 참조. 용어 "재조합 PEG", "rPEG", "rPEG 지속기간 향상 모이어티" 등은, 화학식 I의 아미노산 서열에 대해 규정된 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 성분과 접합된 지속기간 향상 모이어티로서 PEG에 관한 대용물(surrogate)로서 작용하는, 실질적으로 일정한 형태가 없는 재조합 서열을 지칭한다. rPEG 및 그의 폴리펩티드 접합체는, 예를 들어 PEG와 폴리펩티드의 접합에 제한되지 않는, 고체-상 또는 용액-상 화학 합성 단계를 필요로 하지 않으면서, 합성이 재조합 방법에 의해 달성될 수 있다는 잠재적으로 중대한 이점을 갖는다.
안정하고, 고도로 발현된, 일정한 형태가 없는 폴리펩티드는 생물학적으로 활성인 분자와 접합될 수 있고, 이는 혈청 반감기를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 생물학적 파라미터의 조절을 가져오는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, A, E, G, P, S 및 T를 배타적으로 혼입함으로써, 앞서 언급된 바와 같은 문헌 [Schellenberger et al]은 엑세나티드(exenatide), 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 인간 성장 호르몬 (hGH)을 갖는 접합체의 겉보기 반감기(apparent half-life)가 접합되지 않은 폴리펩티드에 비해 상당히 증가됨을 개시한다.
일부 실시양태에서, rPEG 지속기간 향상 모이어티는 소수성 잔기 (예를 들어, F, I, L, M, V, W 또는 Y), 측쇄 아미드-함유 잔기 (예를 들어, N 또는 Q) 또는 양전하로 하전된 측쇄 잔기 (예를 들어, H, K 또는 R)를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, rPEG 지속기간 향상 모이어티는 A, E, G, P, S 또는 T를 포함한다. 일부 실시양태에서, rPEG는 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-99%에서 글리신, 또는 심지어 100%에서 글리신을 포함한다.
rPEG 지속기간 향상 모이어티가 화학식 I의 구조와 75% 이상 동일한 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 접합되는 실시양태에서, 접합 폴리펩티드 및 rPEG는 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해 합성된다. rPEG 지속기간 향상 모이어티가 화학식 I의 구조와 75% 이상 동일한 폴리펩티드의 측쇄에서 접합되는 실시양태에서, rPEG 모이어티는 재조합 방법에 의해 합성되고 후속적으로 당업계에 공지되고 본원에 개시된 방법에 의해 폴리펩티드에 접합된다.
화학 치환. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체 중 각각의 치환된 기는 1개 이상의 치환기 군으로 치환된다. 더욱 구체적으로, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 각각의 치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 치환 시클로알킬, 치환 헤테로시클로알킬, 치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 치환 알킬렌, 치환 헤테로알킬렌, 치환 또는 비치환 시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌, 치환 또는 비치환 아릴렌, 또는 치환 또는 비치환 헤테로아릴렌은 1개 이상의 치환기 군으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 이들 기 중 1개 이상 또는 모두는 1개 이상의 크기-제한된 치환기 군으로 치환된다. 일부 실시양태에서, 이들 기 중 1개 이상 또는 모두는 1개 이상의 저급 치환기 군으로 치환된다.
일부 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환 알킬은 치환 또는 비치환 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 20 원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬은 치환 또는 비치환 C4-C8 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환 4 내지 8 원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 알킬렌은 치환 또는 비치환 C1-C20 알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌은 치환 또는 비치환 2 내지 20 원 헤테로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 C4-C8 시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 4 내지 8 원 헤테로시클로알킬렌이다.
일부 실시양태에서, 각각의 치환 또는 비치환 알킬은 치환 또는 비치환 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬은 치환 또는 비치환 2 내지 8 원 헤테로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬은 치환 또는 비치환 C5-C7 시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬은 치환 또는 비치환 5 내지 7 원 헤테로시클로알킬이고, 각각의 치환 또는 비치환 알킬렌은 치환 또는 비치환 C1-C8 알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로알킬렌은 치환 또는 비치환 2 내지 8 원 헤테로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 C5-C6 시클로알킬렌이고, 각각의 치환 또는 비치환 헤테로시클로알킬렌은 치환 또는 비치환 5 내지 7 원 헤테로시클로알킬렌이다.
III . 예시적인 합성
펩티드 합성의 일반적인 방법. 본원에 기재된 폴리펩티드 접합체의 폴리펩티드 성분은 당업계에 공지된 생물학적, 화학적, 및/또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예시적인 방법은 본원에, 및 미국 특허 제6,872,700호; WO 2007/139941; WO 2007/140284; WO 2008/082274; WO 2009/011544; 및 미국 공개 제2007/0238669호에 기재되어 있으며, 그의 개시 내용은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 화합물의 제조를 위한 다른 방법은 본원에 기재되어 있고/거나 당업계에 공지되어 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 화합물의 폴리펩티드 성분은 표준 고체-상 펩티드 합성 기법, 예컨대 자동식 또는 반-자동식 펩티드 합성 장치를 사용하여 제조할 수 있다. 전형적으로, 이러한 기법을 사용하여, 알파-N-카르바모일 보호된 아미노산, 및 수지에서의 성장 펩티드 사슬에 부착된 아미노산을 염기 (예를 들어, 디이소프로필에틸아민 등)의 존재하에 커플링제 (예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드, 1-히드록시벤조-트리아졸 등)의 존재하에 불활성 용매 (예를 들어, 디메틸포름아미드, N-메틸 피롤리디논, 메틸렌 클로라이드 등) 중에서 실온에서 커플링시킨다. 알파-N-카르바모일 보호기를 시약 (예를 들어, 트리플루오로아세트산, 피페리딘 등)을 사용하여 생성된 펩티드-수지로부터 제거하고, 펩티드 사슬에 부가될 그 다음의 원하는 N-보호된 아미노산으로 커플링 반응을 반복한다. 적합한 N-보호기, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐 (tBoc), 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 등이 당업계에 주지되어 있다. 펩티드 합성 장치에서 사용되는 용매, 아미노산 유도체 및 4-메틸벤즈히드릴-아민 수지는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 인코퍼레이티드 (Applied Biosystems Inc.; 캘리포니아주 포스터 시티)를 비롯한 다양한 상업적 공급원으로부터 구매할 수 있다.
화학적 합성에 관해, 고체 상 펩티드 합성을 폴리펩티드 접합체를 위해 사용할 수 있는데, 그 이유는 일반적인 고체 상 합성이 상업적 규모로의 탁월한 확장성을 갖는 간단한 방법이며, 상대적으로 긴 폴리펩티드 접합체와 일반적으로 상용성이기 때문이다. 캡핑하면서 NMP/HOBt (옵션 1) 시스템, 및 tBoc 또는 Fmoc 화학 (예를 들어, 문헌 [Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3B Jul. 1, 1988, section 6, pp. 49-70] 참조, 어플라이드 바이오시스템즈 인코퍼레이티드 (캘리포니아주 포스터 시티))을 사용하여 자동 펩티드 합성 장치 (모델 430A, 어플라이드 바이오시스템즈 인코퍼레이티드 (캘리포니아주 포스터 시티))로 고체 상 펩티드 합성을 수행할 수 있다. HF (-5℃ 내지 0℃, 1시간)로 Boc-펩티드-수지를 분열시킬 수 있다. 교대되는 물 및 아세트산으로 펩티드를 수지로부터 추출할 수 있으며, 여액을 동결건조시켰다. 표준 방법 (예를 들어, 문헌 [Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12])에 따라 Fmoc-펩티드 수지를 분열시킬 수 있다. 또한, 어드밴스드 켐 테크(Advanced Chem Tech) 합성 장치 (모델 MPS 350, 켄터키주 루이빌)를 사용하여 펩티드를 조립할 수 있다.
아민 페길화 . PEG의 공유결합 부착은 합성 화학 분야의 당업자에게 이용가능한 다양한 방법에 의해 편리하게 달성될 수 있다. 주쇄 또는 측쇄 아민에서 페길화에 관해, PEG 시약은 전형적으로 온화한 조건하에 반응하여 페길화 화합물을 제공한다. 임의로, 환원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 단계를 사용한다. 전형적인 펩티드-mPEG 접합 구성, N-히드록실숙신이미드 (NHS) 관능화 mPEG를 적합한 시간 (예를 들어, 24시간) 동안 DIPEA (예를 들어, TFA 반대이온 당 3 당량)의 존재하에 질소하에 적합한 용매 (예를 들어, 무수 DMF) 중에서 유리 아민을 갖는 펩티드와 혼합할 수 있다. 접합체를 침전 시약 (예를 들어, 냉 디에틸 에테르)의 첨가에 의해 침전시킬 수 있다. 침전물을 원심 분리에 의해 단리하고 물에 용해시킨 후 동결건조시킬 수 있다. 다양한 크로마토크래피 절차 (예를 들어, 구배 0.5 M NaCl을 사용하는 마크로캡(MacroCap) SP 양이온 교환 칼럼)에 의해 정제할 수 있다. SDS-PAGE에 의해 순도를 점검할 수 있다. 질량 분석법 (예를 들어, MALDI)을 사용하여 물에 대해 투석 후 접합체를 특성화할 수 있다.
PEG - SS ( 숙신이미딜 숙시네이트 ). PEG-SS는 반응식 1에 도시된 바와 같이, 온화한 조건하에 아민기와 반응시켜 아미드를 형성한다. NHS 관능화는 아미노 반응성 PEG 유도체를 제공하며 이는 pH 7~9에서 1급 아민과 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성할 수 있다. 반응은 1시간 또는 심지어 그 미만 내에 마무리될 수 있다. 예시적인 반응은 반응식 1 및 2에 따른다.
<반응식 1>
Figure pct00007
PEG - SG ( 숙신이미딜 글루타레이트 ). 유사하게, PEG-SG는 반응식 2에 도시된 바와 같이, 아민기와 반응하여 상응하는 아미드를 형성한다.
<반응식 2>
Figure pct00008
PEG - NPC (p- 니트로페닐 카르보네이트 ). PEG-NPC는 반응식 3에 도시된 바와 같이, 아민 관능기와 반응하여 비교적 안정한 우레탄 관능기를 형성한다.
<반응식 3>
Figure pct00009
PEG -이소시아네이트. 반응식 4에 도시된 바와 같이, PEG-이소시아네이트는 아민과 반응하여 생성된 비교적 안정한 우레탄 연결을 형성할 수 있다.
<반응식 4>
Figure pct00010
PEG -알데히드. 아민과의 다양한 PEG-알데히드 반응은 이민을 제공할 수 있고, 이는 추가로 환원되어 페길화 아민을 제공할 수 있다. 반응 pH는 표적 선택성에 중요할 수 있다. N-말단 아민 페길화는 대략 pH 5에서 일 수 있다. 예를 들어, mPEG-프로피온알데히드와 펩티드 아민과의 반응 후, 환원시켜 하기 반응식 5에 도시된 화합물을 제공한다.
<반응식 5>
Figure pct00011
유사하게, mPEG-아미드-프로피온알데히드와 아민의 축합 및 후속 환원은 하기 반응식 6에 도시된 화합물을 제공할 수 있다.
<반응식 6>
Figure pct00012
mPEG-우레탄-프로피온알데히드와 아민의 반응 및 후속 환원은 하기 반응식 7에 도시된 화합물을 제공할 수 있다.
<반응식 7>
Figure pct00013
더욱이, mPEG-부틸알데히드와 아민의 반응 및 후속 환원은 하기 반응식 8에 도시된 화합물을 제공할 수 있다.
<반응식 8>
Figure pct00014
티올 페길화 : PEG - 말레이미드 . 페길화는 편리하게는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 유리 티올기에서 달성된다. 예를 들어, 하기 반응식 9에 도시된 바와 같이, PEG-말레이미드는 말레이미드 고리의 이중 결합이 파괴되어 티올과 연결되는 표적 화합물의 티올을 페길화한다. 반응의 속도는 pH 의존성이고 최상의 조건은 대략 pH 8에서 발견된다.
<반응식 9>
Figure pct00015
PEG - 비닐술폰 . 게다가, 하기 반응식 10에 도시된 바와 같이, PEG-비닐술폰은 유리 티올의 페길화에 유용하다.
<반응식 10>
Figure pct00016
PEG - 오르토피리딜 - 디술피드 ( OPSS ). 폴리펩티드로의 디술피드 연결된 PEG의 형성은, 하기 반응식 11에 도시된 반응을 비롯한, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 달성된다. 이러한 유형의 연결에서, 생성된 PEG 접합체를 수소화붕소, 소분자 디티올 (예를 들어, 디티오에리트리톨) 등이지만 이에 제한되지 않는 것으로 환원시켜 폴리펩티드로부터 분리할 수 있다.
<반응식 11>
Figure pct00017
PEG - 아이오도아세트아미드 . PEG-아이오도아세트아미드는 티올을 페길화하여 온화한 염기성 매질 중에서 안정한 티오에테르 결합을 형성한다. 이러한 유형의 접합은 강산 분석에 의해 단백질의 페길화 시스테인 잔기가 카르복시메틸시스테인을 생성할 수 있고 이는 표준 아미노산 분석 (예를 들어, 아미노산 시퀀싱)에 의해 평가될 수 있고, 따라서 반응의 발생을 검증하는 방법을 제공한다는 흥미로운 측면을 제시한다. 전형적인 반응 계획은 하기 반응식 12에 도시되어 있다.
<반응식 12>
Figure pct00018
화합물의 정제. 본원에 기재된 화합물의 정제는 일반적으로 당업자에게 이용가능한 방법에 따른다. 전형적인 정제 절차에서, 조 펩티드-PEG 접합체를 초기에 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들어, 마크로 캡 SP 양이온 교환기 칼럼을 통해 초기에 정제한다. 전형적인 정제 절차는 완충제 A (20 mM 아세트산나트륨 완충제, pH 5.0) 및 완충제 B (20 mM 아세트산나트륨 완충제, pH 5.0, 0.5 M 염화나트륨)를 구배 용리 프로그램, 예를 들어, 0-0% 완충제 B (20분), 이어서 0-50% 완충제 B (50분), 그 다음 100% 완충제 B (20분)로 사용한다. 유속은 전형적으로 3 mL/분이다. 수집된 분획의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 가시화를 수행한 후, 적합한 분획 풀(pool)의 물에 대해 투석하고 생성물을 동결건조시켰다. 분석 평가는 전형적으로 MALDI 질량 분석법을 사용한다.
IV . 사용 방법
한 측면에서, 대사 장애, 예컨대 비만, 당뇨병 (예를 들어, 제2형 또는 비-인슐린 의존성 당뇨병, 제1형 당뇨병, 및 임신성 당뇨병), 이상지질혈증, 섭식 장애, 인슐린-저항성 증후군, 및/또는 심혈관 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 치료 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 비정상적 식후 고혈당, 덤핑 증후군, 고혈압, 고지혈증, 수면 무호흡, 암, 폐고혈압, 담낭염, 골관절염, 및 단장 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 치료 방법이 제공된다. 방법은 본원에 기재된 유효량의 화합물 또는 제약 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"는 래트, 마우스 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 포유동물을 포함할 수 있다. "대상체"는 또한 가축 (예를 들어, 개, 고양이, 말)뿐만 아니라, 다른 동물도 포함할 수 있다. 대상체는 본원에 기재된 대사 장애 중 하나 이상을 가질 수 있다. 대상체는 어떤 연령이라도 될 수 있다. 따라서, 이들 장애는 청년 및 성인 (여기서는 65세 또는 그 미만인 사람으로 정의됨)에서 뿐만 아니라 유아, 소아, 청소년, 및 노인 (여기서는 65세를 초과하는 것으로 정의됨)에서도 발견될 수 있다. 사실은, 집단의 특정 부분은 특히 청소년 및 청년에서의 섭식 장애와 같은 특정한 병태를 갖는 경향이 있을 수 있다. 노인들은 특히 우울증과 같은 병태에 걸리기 쉬울 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같고, 본 기술분야에서 잘 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상적 결과를 비롯한 유익하거나 바람직한 결과를 수득하기 위한 방법이다. 질환, 장애, 또는 병태를 "치료하는", "완화하는", 또는 "개선하는"은 장애를 치료하지 않는 경우와 비교하여, 병태, 또는 장애 또는 질환 상태의 정도, 원치 않는 임상적 증후 또는 둘 다를 저하시키고/시키거나, 진행의 시간 과정을 둔화시키는 것 (즉, 시간을 연장시킴)을 의미한다. 본원에 개시된 방법의 목적상, 유익하거나 바람직한 임상적 결과에는, 검출가능한 것이든 아니든 간에, 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 장애 정도의 감소, 장애의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 장애 진행의 지연 또는 둔화, 장애의 개선 또는 완화, 및 관해 (부분적이든 또는 완전이든)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우에 예상되는 생존에 비해서 생존이 연장되는 것을 의미할 수 있다. 추가로, 치료하는 것은 반드시 1회 용량의 투여에 의해서 일어나지는 않으며, 종종 일련의 용량을 투여한 후에 일어난다. 따라서, "치료학적 유효량", 완화시키기에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 병태를 치료하기에 충분한 양을 1회 이상 투여로 투여할 수 있다.
비만 및 그의 관련 장애는 미국에서 및 전 세계적으로 흔하고 매우 심각한 공중 보건 문제이다. 상체 비만은 제2형 진성 당뇨병에 대한 가장 강력한 위험 인자이고, 심혈관 질환에 대한 강력한 위험 인자이다. 비만은 고혈압, 죽상동맥경화증, 울혈성 심부전, 뇌졸중, 쓸개 질환, 골관절염, 수면 무호흡, 생식 장애, 예컨대 다낭성 난소 증후군, 유방, 전립선 및 결장의 암, 및 일반 마취의 합병증 발생 증가에 대한 인지된 위험 인자이다 (예를 들어, 문헌 [Kopelman, 2000, Nature 404:635-43] 참조).
비만은 수명을 감소시키고, 상기 열거된 병존질환뿐만 아니라, 감염, 하지 정맥류, 흑색 극세포증, 습진, 운동 불내성, 인슐린 저항성, 고혈압 고콜레스테롤혈증, 담석증, 정형외과적 손상, 및 혈전 색전성 질환과 같은 장애의 심각한 위험을 지닌다 (문헌 [Rissanen et al., 1990, Br . Med. J. 301:835-7]). 또한 비만은 인슐린 저항성 증후군, 또는 "X 증후군" 및 대사 증후군으로 칭해지는 병태 군에 대한 위험 인자이다. 비만 및 관련 장애의 전 세계적인 의료비가 막대하다.
비만의 병인은 다인성인 것으로 여겨진다. 문제는, 비만 대상체에서, 과도한 지방 조직이 있을 때까지 영양소 이용가능성과 에너지 소비가 균형이 맞지 않는다는 것이다. 중추 신경계 (CNS)는 에너지 균형을 제어하고, 동물의 대사 상태에 적절한 다양한 행동, 자율신경 및 내분비 활성을 조정한다. 이들 활성을 제어하는 메커니즘 또는 시스템은 전뇌 (예를 들어, 시상하부), 후뇌 (예를 들어, 뇌간), 및 척수에 걸쳐서 광범위하게 분포된다. 궁극적으로, 이들 시스템으로부터의 대사 정보 (즉, 연료 이용가능성) 및 인지 정보 (즉, 학습된 선호도)가 통합되어, 식욕 (음식 추구) 및 완료 (섭취) 행동에 관여하는 결정이 켜지거나 (식사 획득 및 개시), 또는 꺼진다 (식사 종료). 시상하부는 이들 신호를 통합한 후 뇌간에 명령을 내리는 것을 주로 담당하는 것으로 생각된다. 뇌간 핵은 완료 운동 근육 제어 시스템의 요소 (예를 들어, 씹기 및 삼키기를 담당하는 근육)를 제어한다. 그와 같이, 이들 CNS 핵이 문자 그대로 섭취 행동에 대한 "최종 공통 경로"를 구성하는 것으로 언급되었다.
신경해부학적 및 약리학적 증거는 에너지 및 영양 항상성의 신호가 전뇌 핵에서 통합되고, 완료 운동 제어 시스템이 뇌간 핵 내에, 가능하게는 삼차신경 운동 핵을 둘러싼 영역 내에 존재한다는 것을 지지한다. 시상하부와 뇌간 사이에는 광범위한 상호 연관이 있다. CNS에 대해 지시된 다양한 항비만 치료제 (예를 들어, 소 분자 및 펩티드)는 시상하부에 존재하는 전뇌 기질 및/또는 뇌간에 존재하는 후뇌 기질에 주로 초점을 맞춘다.
인슐린 저항성은 비만 및 비-비만 제2형 당뇨병 환자 둘 다에서 주요 병리생리학적 특징이고, 이전에 주로 인슐린 작용에서 결합-후 결함(post-binding defect)으로 인한 것으로 여겨졌다. 예를 들어, 문헌 [Berhanu et al, 1982, J. Clin. Endoc . Metab. 55: 1226-1230] 참조. 그러한 결함은 말초 세포의 고유 특성으로 인한 것일 수 있거나, 혈장 중 체액 인자의 농도 변화에 의해 유발될 수 있거나, 이들 둘 다로 인한 것일 수 있다. 인슐린 저항성의 원인이 되는 체액 인자를 입증하는데 있어서 이전의 시도들은 모순되는 결과를 가져왔다. 제2형 진성 당뇨병에서 인슐린 저항성에서 고유 결합-후 결함을 입증하는 것이 전혀 가능하지 않았다 (참조: 문헌 [Howard, B. V. Diabetes 30: 562-567 (1981)]; [Kolterman, O. G. et al, J. Clin. Invest.: 68: 957-969 (1981]).
제2형 당뇨병의 인슐린 저항성의 메커니즘은 복잡하다. 주로 지방 조직에 대한 연구로부터 얻은 증거는 가장 온화한 경우에, 인슐린 저항성은 주로 말초 표적 세포에 대한 인슐린 수용체의 수의 결핍으로 인한 것일 수 있지만, 단식의 과혈당증 증가의 정도로서, 인슐린 작용의 수용체후(postreceptor) 결함이 나타나고 중요성이 꾸준히 증가함 (참조: 상기 문헌 [Kolterman et al.])을 시사하는 것으로 언급되었다. 제2형 당뇨병에서 인슐린 저항성을 수반하는 내당능 장애(impaired glucose tolerance)는 주로 말초 조직에서의 감소된 글루코스 흡수에 의해 유발되는 것으로 여겨지지만, 간의 글루코스 생성의 불완전한 글루코스에 의한 억제가 또한 연루되는 것으로 언급되었다. 예를 들어, 문헌 [Wajngot et al ., 1982, Proc . Natl. Acad . Sci . USA 70:4432-4436]. 비만 및 비-비만 제2형 당뇨병 환자에서, 인슐린 용량-반응 곡선은 우측으로 이동되며 당뇨병이 없는 대상체와 비교하여 제2형 당뇨병 환자에서의 당 처리의 최대 속도 및 총-체내 당(total-body glucose) 메커니즘의 최대 속도에서의 현저한 감소가 있다 (앞서 언급된 바와 같은 문헌 [Kolterman et al.]; 문헌 [De Fronzo, R. A. et al, 1985, J. Clin . Invest. 76: 149-155]).
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 음식 섭취 감소, 식욕 감퇴, 포만감 유도, 지방으로서 저장되기 위해 체내에서 이용가능한 영양소의 감소, 체중 감소 유발, 신체 조성의 영향, 신체 에너지 함량 또는 에너지 소비량의 변경, 지질 프로파일의 개선 (LDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수치의 감소 및/또는 HDL 콜레스테롤 수치 변화 포함), 위장 운동의 둔화, 위 내용 배출의 지연, 식후 혈당 변동폭 완화, 글루카곤 분비의 예방 또는 억제, 및 혈압 강하에 유용할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 지방으로서 저장되기 위해 체내에서 이용가능한 영양소를 감소시킴으로써 완화될 수 있는 병태 또는 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 그러한 병태 및 장애는 섭식 장애, 인슐린-저항성, 비만, 비정상적 식후 고혈당, 제I형, 제II형, 및 임신성 당뇨병을 비롯한 임의의 종류의 당뇨병, 대사 증후군, 덤핑 증후군, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 고지혈증, 수면 무호흡, 암, 폐고혈압, 담낭염, 및 골관절염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
심혈관 병태 또는 질환의 비제한적 예는 고혈압, 심근 허혈, 및 심근 재관류이다. 본 발명의 화합물은 또한 뇌졸증, 암 (예를 들어, 자궁내막, 유방, 전립선, 및 결장 암), 쓸개 질환, 수면 무호흡, 저 수정률, 및 골관절염을 비롯한 비만 관련 다른 병태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 심미적 이유로 신체 조성을 변경시키거나, 대상체의 육체적 능력을 향상시키거나, 지방이 더 적은 미트 소스(leaner meat source)의 제조에 사용될 수 있다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 그렐린의 분비를 억제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물을 이용하여 그렐린 관련 장애, 예컨대 프래더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 모든 유형의 당뇨병 및 그의 합병증, 비만, 과식증, 고지혈증, 또는 과영양과 관련된 다른 장애를 치료 또는 예방할 수 있다 .
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 바레트 식도(Barrett's esophagus), 위 식도 역류 질환 (GERD) 및 그와 관련된 병태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 그러한 병태는 속쓰림, 위/장의 내용물의 입 또는 폐로의 역류를 동반한 속쓰림, 삼킴 곤란, 기침, 간헐적인 천명 및 성대 염증 (GERD 관련 질환), 식도 미란, 식도 궤양, 식도 협착, 바레트 화생 (정상 상피의 비정상 상피로의 대체), 바레트 선암종, 및 폐 흡인을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 아밀린 및 아밀린 효능제는 항분비 특성, 예컨대 위산의 억제, 담즙산의 억제, 및 췌장 효소의 억제를 갖는다. 더욱이, 아밀린은 위보호 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 아밀린 및 아밀린 효능제의 이러한 특성으로 인해 이들은 바레트 식도, 및/또는 GERD 및 본원에 기재된 바와 같은 관련된 또는 관련 병태의 치료 또는 예방에 특히 유용하게 될 수 있다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 추가로 췌장염, 췌장 암종, 및 위염을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 내시경 역행 췌담관 조영술 (ERCP)을 겪은 환자에서 췌장염의 치료 및 예방에 유용할 수 있다. 아밀린 및 아밀린 효능제가 놀랍게도 소마토스타틴과 병용될 경우 우수한 치료 효과를 가질 수 있음이 추가로 밝혀졌다. 따라서, 특정 실시양태에서, 췌장염의 치료 또는 예방 방법은 본 발명의 화합물을 투여하는 것 및 소마스타틴 및 소마스타틴 효능제를 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 또한 골 흡수의 감소, 혈장 칼슘의 감소, 및 진통 효과의 유도에 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 골 장애, 예컨대 골연화증 및 골다공증을 치료하는데 유용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 통증 및 통증성 신경병증을 치료하는데 유용할 수 있다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 발명의 화합물은 또한 단장 증후군을 치료하는데 유용할 수 있다. 단장 증후군 또는 쇼트 것(short gut) 증후군은, 영양소의 흡수 불량, 예컨대 복통, 설사, 체액 저류(fluid retention), 의도하지 않은 체중 감소, 및 임신 동안 또는 상당한 길이의 소장의 수술적 절제에 따른 미발달 장으로 인한 극도의 피로로 인한 증상을 특징으로 하는 위장 증후군을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단장 증후군"은 또한 쇼트 것 증후군 및 거대한 소장 절제를 포함한다. 장의 호르몬에 의한 반사 및 피드백 루프(feedback loop)는 붕괴될 수 있어 이는 근위부 위장 및 소장 부분의 용적의 증가를 야기할 수 있고 운동 패턴을 변경할 수 있다. 물, 나트륨 및 마그네슘 손실은 전해질 평형이상을 야기할 수 있다. 장의 특정 부분에 특유한 특정 구체적인 흡수 기능, 예컨대 비타민 B12, 담즙산염 및 다른 지용성 비타민의 회장에 의한 흡수가 또한 손상될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단장 증후군 환자의 배변 습관, 영양 상태 및 삶의 질의 실질적인 개선을 제공할 수 있고, 추가로 비경구 영양 및 소장 이식에 대한 필요성을 감소시킬 수 있다.
V. 검정
본원에 기재된 화합물의 제조 및 검정에 관한 방법은 일반적으로 당업자에 의해 이용가능하다. 본원에 기재된 화합물 및 방법에 관한 대표적인 검정은 하기와 같다.
음식 섭취. 어떤 이론에 의해서도 구속되는 것을 바라지 않으면서, 음식 섭취는 본원에 기재된 바와 같은 화합물의 유용성 평가에 유용하다. 예를 들어, 다수의 대사 병상은 음식 섭취 (예를 들어, 당뇨병, 비만)와 관련된다는 것은 공지되어 있다. 따라서, 초기 선별을 수행하여 음식 섭취가 본원에 기재된 화합물의 투여에 의해 어느 정도로 조절되는지를 측정할 수 있고, 포지티브(positive) 초기 선별은 화합물의 후속 발달에 유용할 수 있다.
다양한 음식 섭취 검정은 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어, 음식 섭취의 소위 "홈 케이지 모델(home cage model)"에서, 대상체 (예를 들어, 래트)를 그들의 홈 케이지에 유지시키고, 시험 화합물의 주입 후 대상체의 총 중량에 따른 음식 섭취를 측정한다. 음식 섭취 검정의 소위 "급식 패턴(feeding patterns) 모델"에서, 대상체 (예를 들어, 래트)를 급식 챔버(feeding chamber)에 및 주입에 길들인 후에 시험한다. 시험 화합물 투여 후, 대상체를 즉시 급식 챔버에 배치하고, 음식 섭취를 시간의 함수 (예를 들어, 1분 간격)로 자동 측정한다. 실험 둘 다에 대해, 음식은 당업계에 공지된 표준 음식물(standard chow) 또는 다양한 음식물 중 어느 하나 (예를 들어, 고지방)이다. 소위 "마우스 음식 섭취" 검정에서, 시험 화합물을 식욕 억제에 관해, 또는 식이요법에 의해 유도된 비만 (DIO) 마우스에서 체중 증가에 관한 효과에 관해 시험할 수 있다. 전형적인 마우스 음식 섭취 검정에서, 암컷 NIH/스위스 마우스(Swiss mice) (생후 8 내지 24주)를 0600에서의 광으로 12:12 시간 명암 주기로 그룹으로 거주시킨다. 물 및 표준 펠렛화 마우스 음식물 규정식을 언급된 경우를 제외하고는 무제한으로 이용가능하게 한다. 동물을 실험 이전 대략 1500 시간, 1일에서 시작하여 단식시킨다. 실험의 아침에, 동물을 실험 군으로 나눈다. 전형적인 연구에서, n=4 케이지로 케이지당 3마리의 마우스로 한다. 시간=0분에서, 모든 동물에게 비히클 또는 화합물을, 전형적으로 약 10 nmol/kg 내지 75 nmol/kg 범위의 양으로 복강내 주사로 제공하고, 즉시 미리 중량을 잰 (10 내지 15 g) 표준 음식물을 제공한다. 음식을 제거하고 다양한 시간, 형적으로 30, 60, 및 120분에서 중량을 재어, 소비된 음식의 양을 측정한다. 예를 들어, 문헌 [Morley et al, 1994, Am . J. Physiol. 267:R178-R184] 참조. 시간=0에서 초기에 제공된 음식의 중량에서 예를 들어 30, 60, 120, 180 및/또는 240분 시점에서 남은 음식의 중량을 빼는 것으로써, 음식 섭취를 계산한다. 유의한 처리 효과를 ANOVA (p<0.05)에 의해 확인한다. 유의한 차이가 존재하는 경우, 둔네트 검정 (프리즘 버젼(Prism v). 2.01, 그래프패드 소프트웨어 인코퍼레이티드(GraphPad Software Inc.), 캘리포니아주 샌 디에이고)을 사용하여 시험 평균을 대조군 평균과 비교한다. 본원에 기재된 임의의 시험에 관해, 시험 화합물은 주사 (예를 들어, 피하, 복강내 등), 경구, 또는 당업계에 공지된 다른 투여 방법을 비롯한 임의의 수단으로 투여할 수 있다.
시험관내 검정. 어떤 이론 또는 작용의 메커니즘에 의해서도 구속되는 것을 바라지 않으면서, 시험관내 (예를 들어, 수용체) 검정에서의 결과와, 대사 질환 및 장애의 치료에 관한 작용제의 유용성의 상관 관계가 존재하는 것으로 여겨진다. 따라서, 시험관내 검정 (예를 들어, 세포 기반 검정)은, 본원에 기재된 바와 같은 가능한 대사 작용제에 관한 선별 계획으로서 유용하다. 하기와 같이 기재된 것을 비롯한, 다양한 시험관내 검정이 공지되어 있다.
칼시토닌 아데닐레이트 시클라제 검정 (기능 검정). 칼시토닌 수용체 매개된 아데닐레이트 시클라제 활성화는, 시스바이오(CisBio)로부터의 HTRF (균질 시간-분해 형광(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence)) 세포-기반 cAMP 검정 키트를 사용하여 측정할 수 있다. 본 키트는 d2 수용체 형광단(acceptor fluorophore)으로 표지된 cAMP 및 공여체(donor) 유로퓸 크립테이트로 표지된 항-cAMP 모노클로날 항체를 사용하는 경합 면역측정법(competitive immunoassay)이다. cAMP 수준의 증가는 공여체와 수용체 간의 시간-분해 형광 에너지 이동에서의 감소로서 기록된다. 펩티드를 완충제로 연속하여 희석시키고, 예를 들어, 384-웰 화합물 플레이트에 옮길 수 있다. 래트 C1a 칼시토닌 수용체를 안정하게 발현하는 C1a-HEK 세포를 세포 배양 플라스크에서 분리시키고 500 μM IBMX, 및 d2　형광단을 1:40로 함유하는 자극 완충제 중에 2 x 106개 세포/ml로 재현탁시킨다. 세포를 웰 당 12,500의 밀도로 화합물 플레이트에 첨가하고 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하여 수용체를 활성화시킬 수 있다. 후속적으로 키트 접합체/용해(lysis) 완충제 (1:40)로 희석된 항-cAMP 크립테이트 용액을 첨가함으로써 세포를 용해시킬 수 있다. 어두운 곳에서 1 내지 24시간 인큐베이션 후, 플레이트를 시간-분해 형광 에너지 이동을 측정할 수 있는 테칸 울트라(Tecan Ultra) 상에서 계수할 수 있다.
아밀린 수용체 결합 검정. RNA 막을, 예를 들어, 96-웰 폴리스티렌 플레이트 중에서, 주위 온도에서 1시간 동안 대략 20 pM (최종 농도)의 125I-래트 아밀린 (표지된 볼튼-헌터(Bolton-Hunter), 퍼킨엘머(PerkinElmer), 매사추세츠주 월섬) 및 증가 농도의 시험 화합물과 함께 인큐베이션할 수 있다. 웰 내용물의 결합된 분획을 96 웰 유리 섬유 플레이트 (0.5% PEI (폴리에틸렌이민) 중 30분 이상 동안 사전-차단됨) 상에 수집하고 퍼킨 엘머 플레이트 채취기(harvester)를 사용하여 1 X PBS로 세척할 수 있다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 신틸런트(scintillant)와 조합하고 다중웰 퍼킨 엘머 섬광 계수기로 계수한다.
CGRP 수용체 결합 검정. SK-N-MC 세포막을 96-웰 폴리스티렌 플레이트 중에서 주위 온도에서 1시간 동안 대략 50 pM (최종 농도)의 125I-인간 CGRP (퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬) 및 증가 농도의 시험 화합물과 함께 인큐베이션할 수 있다. 웰 내용물의 결합된 분획을 96 웰 유리 섬유 플레이트 (0.5% PEI 중 30분 이상 동안 사전-차단됨) 상에 수집하고 퍼킨 엘머 플레이트 채취기를 사용하여 1 X PBS로 세척할 수 있다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 신틸런트와 조합하고 다중웰 퍼킨 엘머 섬광 계수기로 계수할 수 있다.
칼시토닌 수용체 결합 검정. C1a-HEK 세포막을, 예를 들어, 96-웰 폴리스티렌 플레이트 중에서, 주위 온도에서 1시간 동안 대략 50 pM (최종 농도)의 125I-인간 칼시토닌 (퍼킨엘머, 매사추세츠주 월섬) 및 증가 농도의 시험 화합물과 함께 인큐베이션할 수 있었다. 웰 내용물의 결합된 분획을 96 웰 유리 섬유 플레이트 (0.5% PEI 중 30분 이상 동안 사전-차단됨) 상에 수집하고 퍼킨 엘머 플레이트 채취기를 사용하여 1 X PBS로 세척할 수 있었다. 건조된 유리 섬유 플레이트를 신틸런트와 조합하고 다중웰 퍼킨 엘머 섬광 계수기로 계수한다.
VI . 제약 조성물
한 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 화합물을 제약상 허용되는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
A. 제제
본원에 기재된 화합물은 다종다양한 경구, 비경구, 및 국소 투여 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물을 주사 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 십이지장내, 또는 복강내 주사)에 의해 투여할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 화합물을, 예를 들어, 비강내 흡입에 의해 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 경피 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 투여하기 위해 다중 경로의 투여 (예를 들어, 근육내, 경구, 경피 투여)를 사용할 수 있는 것으로 구상된다. 따라서, 본 발명은 또한 제약상 허용되는 담체 또는 부형제 및 본 발명의 하나 이상의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물로부터 제약 조성물을 제조하기 위해, 제약상 허용되는 담체는 고체 또는 액체 중 어느 하나일 수 있다. 고체 형태 제제는 분말, 정제, 환제, 캡슐제, 카세제, 좌제, 및 분산성 과립제를 포함한다. 고체 담체는 희석제, 풍미제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제, 또는 캡슐화 물질로서 또한 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다.
분말에서, 담체는 미분된 활성 성분과의 혼합물 중 미분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분을 필요한 결합 특성을 갖는 담체와 적합한 비율로 혼합하고 목적하는 형상 및 크기로 압축한다.
분말 및 정제는 바람직하게는 5% 내지 70%의 활성 화합물을 함유한다. 적합한 담체는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이다. 용어 "제제"는, 담체가 기타 담체가 있는 활성 성분 또는 기타 담체가 없는 활성 성분을 둘러싸고 따라서 그와 회합하는, 캡슐제를 제공하는 담체로서 캡슐화 물질을 갖는 활성 화합물의 제제를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 카세제 및 로젠지제가 포함된다. 정제, 분말, 캡슐제, 환제, 카세제, 및 로젠지제를 경구 투여에 적합한 고체 투여 형태로서 사용할 수 있다.
좌제를 제조하기 위해, 저융점 왁스, 예컨대 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물을 우선 용해시키고 활성 성분을 교반에 의해 그 안에 균질하게 분산시킨다. 그 다음, 용해된 균질 혼합물을 편리한 크기의 금형에 붓고, 냉각하도록 두어서 고화시킨다.
액체 형태 제제는 용액, 현탁액, 및 에멀젼, 예를 들어 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액을 포함한다. 비경구 주입을 위해, 폴리에틸렌 글리콜 수용액 중 용액으로 액체 제제를 조제할 수 있다.
비경구 적용이 필요하거나 또는 요망되는 경우, 본 발명의 화합물에 특히 적합한 혼합물은 멸균 주사 용액, 바람직하게는 유성 용액 또는 수용액뿐만 아니라, 현탁액, 에멀젼, 또는 좌제를 비롯한 임플란트(implant)이다. 특히, 비경구 투여용 담체는 덱스트로스, 염수, 순수, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 땅콩유, 참기름, 폴리옥시에틸렌-블록 중합체 등의 수용액을 포함한다. 앰플은 편리한 단위 제형이다. 또한, 본 발명의 화합물을 리포솜으로 혼입시킬 수 있거나 경피 펌프 또는 패치를 통해 투여할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 제약 혼합물은, 예를 들어 그 교시 내용이 본원에 모두 참고로 포함된 문헌 [PHARMACEUTICAL SCIENCES (17th Ed., Mack Pub. Co., Easton, PA)] 및 WO 제96/05309호에 기재된 것들을 포함한다.
활성 성분을 물에 용해시키고 목적하는 바와 같은 적합한 착색제, 풍미제, 안정화제, 및 증점제를 첨가하여 경구 용도로 적합한 수용액을 제조할 수 있다. 점성 물질, 예컨대 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및 기타 주지된 현탁화제와 함께 미분된 활성 성분을 물에 분산시켜 경구 용도로 적합한 수성 현탁액을 제조할 수 있다.
또한, 사용 직전에, 경구 투여용 액체 형태 제제로 전환되도록 의도된 고체 형태 제제가 포함된다. 그러한 액체 형태는 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 이들 제제는 활성 성분 이외에, 착색제, 풍미제, 안정화제, 완충제, 인공 및 천연 감미제, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.
제약 제제는 바람직하게는 단위 투여 형태로 존재한다. 그러한 형태에서, 제제는 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 세분된다. 단위 투여 형태는 패키징된 제제, 분리된 양의 제제를 함유하는 패키지, 예컨대 패킷 (packeted) 정제, 캡슐제, 및 바이알 또는 앰플 내의 분말일 수 있다. 또한, 단위 투여 형태는 그 자체로 캡슐제, 정제, 카세제, 또는 로젠지제일 수 있거나, 이들 중 임의의 적절한 수의 패키징된 형태일 수 있다.
단위 용량 제제 중 활성 성분의 양은 활성 성분의 특정 적용분야 및 효능에 따라, 0.1 mg 내지 10000 mg, 보다 전형적으로 1.0 mg 내지 1000 mg, 가장 전형적으로 10 mg 내지 500 mg으로 다양하게 하거나 조정할 수 있다. 또한, 조성물은, 목적하는 경우, 기타 상용성 치료제를 함유할 수 있다.
일부 화합물은 제한된 수 용해도를 가질 수 있기 때문에 조성물 중 계면활성제 또는 기타 적절한 공-용매를 필요로 할 수 있다. 그러한 공-용매는 폴리소르베이트(Polysorbate) 20, 60 및 80, 플루로닉(Pluronic) F-68, F-84 및 P-103; 시클로덱스트린; 및 폴리옥시 35 피마자유를 포함한다. 그러한 공-용매는 전형적으로 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량% 수준으로 사용된다.
제제를 조제하는데 있어 가변성을 감소시키기 위해, 제제의 현탁액 또는 에멀젼의 성분의 물리적인 분리를 감소시키고/거나, 그렇지 않으면 제제를 개선하기 위해, 단순한 수용액의 점도보다 큰 점도가 바람직할 수 있다. 그러한 점도 증강제(building agent)는, 예를 들어, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 히드록시 프로필 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시 프로필 셀룰로스, 콘드로이틴 술페이트 및 그의 염, 히알루론산 및 그의 염, 및 이들의 조합을 포함한다. 그러한 작용제는 전형적으로 약 0.01 중량% 내지 약 2 중량% 수준으로 사용된다.
본 발명의 조성물은 서방형 방출 및/또는 편안함을 제공하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 성분들은 고분자량의 음이온성 뮤코미메틱 (mucomimetic) 중합체, 겔화 다당류, 및 미분된 약물 담체 기재를 포함한다. 이들 성분은 미국 특허 제4,911,920호; 제5,403,841호; 제5,212,162호; 및 제4,861,760호에 보다 자세하게 논의되어 있다. 상기 특허의 전체 내용은 모든 목적상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
B. 유효한 투여
본 발명에 의해 제공되는 제약 조성물은 활성 성분이 치료상 유효량, 즉 그의 의도한 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유되는 조성물을 포함한다. 특정 적용에 효과적인 실제량은 그 중에서도 치료할 병태에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, 대사 질환 또는 장애를 치료하기 위한 방법에서 투여하는 경우, 그러한 조성물은 목적하는 결과 (예를 들어, 대사 질환 또는 장애의 증상 완화)를 달성하는데 효과적인 양의 활성 성분을 함유할 것이다.
투여되는 화합물의 투여량 및 빈도 (단일 또는 다중 용량)는 투여 경로; 수용체의 크기, 연령, 성별, 건강, 체중, 체질량지수, 및 식습관; 치료할 질환의 증상의 본질 및 정도; 기타 질환 또는 기타 건강 관련 문제점의 존재; 동시 치료의 종류, 및 임의의 질환 또는 치료 요법으로부터의 합병증을 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 기타 치료적 요법 또는 작용제를 본 발명의 방법 및 화합물과 함께 사용할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 화합물에 관해, 치료상 유효량은 세포 배양 검정 및 음식 섭취 검정을 비롯한 다양한 검정으로부터 초기에 결정할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 표적 농도는 세포 배양 검정에서 생물학적 반응을 도출할 수 있거나, 음식 섭취 반응을 도출할 수 있는 활성 화합물(들)의 그러한 농도일 것이다.
인간에서 사용하기 위한 치료상 유효량을 동물 모델로부터 결정할 수 있다. 예를 들어, 동물에서 유효한 것으로 밝혀진 농도를 달성하도록 인간을 위한 용량을 조제할 수 있다. 당업계에 공지되고/거나 본원에 기재된 바와 같이, 근본적인 대사 질환 또는 장애를 모니터링하고, 투여량을 위로 또는 아래로 조정하여 인간에서의 투여량을 조정할 수 있다.
투여량은 환자의 요건 및 사용되는 화합물에 따라 다양하게 할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 환자에서 투여되는 용량은 시간 경과에 따라 환자에서 유익한 치료적 반응을 가져오는데 충분해야 한다. 또한, 용량의 크기는 임의의 유해한 부작용의 존재, 본질, 및 정도에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 용량보다 적은 더 소량의 투여량으로 개시된다. 그 후, 상황 하에서 최적의 효과를 달성할 때까지 소량 증분에 의해 투여량을 증가시킨다. 본 발명의 한 실시양태에서, 투여량 범위는 0.001% 내지 10% w/v이다. 또 다른 실시양태에서, 투여량 범위는 0.1% 내지 5% w/v이다.
투여량 및 투여 간격을 개별적으로 조정하여 치료할 특정 임상적 적응증에 효과적인, 투여되는 화합물의 수준을 제공할 수 있다. 이는 개인의 질환 상태의 심각도에 적합한 치료적 요법을 제공할 것이다.
본원에 제공된 교시를 이용하여, 실질적인 독성을 유발하지 않고 게다가 특정 환자에 의해 나타나는 임상 증상을 치료하는데 전적으로 효과적인, 효과적인 예방 또는 치료적 치료 요법을 계획할 수 있다. 이러한 계획은 화합물 효능, 상대적인 생체이용률, 환자 체중, 유해한 부작용의 존재 및 심각도, 바람직한 투여 방식, 및 선택된 작용제의 독성 프로파일과 같은 인자를 고려하여 활성 화합물을 주의 깊게 선택하는 것을 포함해야 한다.
C. 독성
특정 화합물에 관한 독성 대 치료 효과의 비율은 그의 치료 지수이고, LD50 (집단의 50%에서 치명적인 화합물의 양) 대 ED50 (집단의 50%에서 유효한 화합물의 양)의 비율로서 나타낼 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및/또는 동물 연구로부터 얻은 치료 지수 데이터를 사용하여 인간에서 사용하기 위한 투여량의 범위를 책정할 수 있다. 그러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 독성이 없는 ED50을 포함하는 혈장 농도의 범위 내에 놓인다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Fingl et al ., In: THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, Ch.1, p.1, 1975]을 참조한다. 환자의 병태 및 화합물을 사용하는 특정 방법을 고려하여 개별 의사가 정확한 제제, 투여 경로, 및 투여량을 선택할 수 있다.
VII . 실시예
실시예 1. 화합물의 제조
본 발명의 화합물을 몇가지 방법에 의해 합성하였다.
a) 예를 들어, 화합물 19를 환원적 알킬화 반응으로 mPEG40K-알데히드를 화합물 1의 N-말단으로 처리함으로써 제조하여 특이적으로 N-말단 페길화된 화합물 1을 생성하였다.
b) 또 다른 예에서, 화합물 20을 화합물 2의 N-말단 아미노기를 mPEG40K-NHS (n-히드록시숙신이미드 에스테르)와 반응시킴으로서 제조하였다.
c) 또 다른 예에서, 화합물 21, 23, 25, 및 27을 하기와 같이 제조하였다:
Figure pct00019
Fmoc 보호된 리신 1 및 위치 21, 26 및 31에서 돌연변이된 리신을 갖는 화합물 1의 유사체를 DMF와 DIEA 중에서 mPEG40K-NHS로 처리하였다. 생성된 페길화 펩티드를 피페리딘에 의해 탈보호하여 페길화 유리 펩티드를 수득하였다.
d) 또 다른 예에서, 화합물 26, 22, 및 24를 리신 측쇄 상에서 선택적인 페길화에 의해 제조하였다. 위치 21, 24 내지 29 및 31에서 돌연변이된 리신을 갖는 화합물 2의 유사체를 DMF와 DIEA 중에서 mPEG40K-NHS로 처리하였다. 조 생성물을 정제하고 위치 특이성(regio-specificity)에 관해 분석하였다.
실시예 2. 수용체 결합 활성
방법. 아밀린 결합 검정을, 뇌 (래트)의 측좌핵(nucleus accumben) 부분으로부터 제조된 막에서 수행하여, 본원에 기재된 연속 희석된 펩티드 화합물을 시험하였다.
먼저, 펩티드를 200 μM 농도로 멸균 증류수 중에서 용매화하였다 (여기서 펩티드 중량은 대략 80%임). 그 다음 펩티드를 10-6 M으로 1X 완충제 (20 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.5% BSA)를 사용하여 2X 출발 농도로 희석하고 퍼킨 엘머 멀티-프로브 II 로봇(Perkin Elmer Multi-Probe II robot)을 사용하여 완충제로 연속 희석하였다. 제조된 막을 (16배)로 또는 32.5 ㎍/웰로 희석하고 1X 완충제와 합하거나 대조군 또는 펩티드 화합물 및 125I-r아밀린 각각으로 연속 희석하였다 (퍼킨 엘머 라이프 사이언스(Perkin Elmer Life Science), ID #I-3248). 플레이트를 진탕기 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 50℃에서 1.5시간 동안에 이어서, 실온에서 밤새 건조시켰다. 신틸런트를 첨가하고 (마이크로신트(Microscint) 20, 퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6013621) CPM을 방사성표지된 아이오딘을 판독할 수 있는 퍼킨 엘머/왈락 트리룩스(Wallac TriLux) 다중웰 섬광 계수기 상에서 판독함으로써 측정하였다.
수용체 결합 활성을, 예를 들어 표 3에, IC50 값으로 나타낼 수 있으며, 이는, 당업계에 공지된 바와 같이, 4-파라미터 로지스틱 방정식(4-parameter logistic equation)을 사용하는 반복 곡선 적합(iterative curve-fitting) 프로그램 (프리즘(PRISM)®, 그래프패드 소프트웨어, 캘리포니아주 라 호이야)을 사용하여 미가공(raw) 데이터로부터 계산되었다.
결과. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 페길화된 화합물은 아밀린 수용체에서 나노몰(nanomolar) 결합 활성을 입증하였다.
Figure pct00020
제2 아밀린 수용체 결합 검정을, 세포주, 예를 들어, 코덱스(Codex) ACTOne™ 세포주에서 이소적으로(ectopically) 발현된 인간 아밀린 수용체 3 (AMY3)로부터 125I-아밀린 (래트)를 대체하는데 있어서, 시험 화합물, 예를 들어 본원에 개시된 폴리펩티드의 효능을 측정하기 위해 수행하였다. 이러한 세포주를 인간 RAMP3 (NCBI 단백질 데이터베이스 CAA04474)을 안정하게 발현하는 ACTOne™ HEK293-CNG-hCalcR 세포주 (CB-80200-258)를 사용하여 발생시켜 인간 AMY3 수용체를 생성하였다.
AMY3 세포 배양물로부터의 조 막(crude membrane)을 프로테아제 억제제 (로슈(Roche) 카탈로그 번호 11873580001)를 함유하는 빙냉 20 mM HEPES에서 균질화함으로써 제조하였다. 조 막을 20 pM 125I-아밀린 (퍼킨 엘머 카탈로그 번호 NEX4480) (2000 Ci/mmol) 및 증가 농도의 시험 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션을 96-웰 폴리스티렌 플레이트 (코스타(Costar) 카탈로그 번호 3797) 중에서 주위 온도에서 60분 동안 20 mM HEPES과 5 mM MgCl2 및 1 mM CaCl2 중에서 수행하였다. 인큐베이션을 0.5% 폴리에틸렌이민에 30분 이상 사전에 함침시킨 유니필터(UniFilter)® 96 플레이트 GF/B (퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6005199)를 통해 급속 여과에 의해 종결하였다. 유니필터® 플레이트를 마이크로메이트(MicroMate) 96 셀 하비스터(Cell Harvester) (Perkin Elmer)를 사용하는 빙냉 PBS를 사용하여 수회 세척하였다. 유니필터 플레이트를 건조시키고 신틸런트를 첨가하고 (마이크로신트(Microscint) 20, 퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6013621) CPM을 방사성표지된 아이오딘을 판독할 수 있는 퍼킨 엘머/왈락 트리룩스 다중웰 섬광 계수기 상에서 판독함으로써 측정하였다.
시험 펩티드의 효능 (IC50)을, 4-파라미터 곡선에 적합화된 비선형 회귀 분석을 사용하는 농도-반응 곡선의 분석에 의해 측정하였다. 결합 친화성을 그래프패드 프리즘® 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어 인코퍼레이티드, 캘리포니아주 샌 디에이고)를 사용하여 계산하였다. 결과를 하기 표 4에 나타냈다.
결과. 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 페길화된 화합물은 AMY3 수용체에서 나노몰 결합 활성을 입증하였다.
Figure pct00021
실시예 3. 아밀린 기능 검정
방법. 본 검정을 사용하여, 과발현 인간 아밀린 3 수용체 (hAMY3, Gs 커플링됨)의 펩티드에 의한 활성화를 통해 코덱스 ACTOne™ 세포주에서 시클릭-AMP (cAMP)의 증가를 측정하였다. 384-웰 포맷으로 HTRF (시스바이오) 세포 기반 cAMP 검정 키트를 사용한 30' 펩티드 처리에 이어서 cAMP의 축적을 측정하였다. 펩티드의 효능을, 10 uM 포르스콜린 (아데닐레이트 시클라제의 구성적 활성제)을 사용한 세포 처리에 대해 측정하고, 펩티드의 효능 (EC50)을, 4-파라미터 모델에 적합화된 비선형 회귀 분석을 사용하는 농도-반응 곡선의 분석에 의해 측정하였다.
결과. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 페길화된 화합물은 AMY3 수용체에서 서브나노몰(subnanomolar) 내지 나노몰 결합 활성을 입증하였다.
Figure pct00022
실시예 4: 페길화가 음식 섭취에 미치는 영향: 화합물 21, 25, 24, 22, 26
여윈(lean) 래트에게 시험 화합물 또는 비히클을 주 1회 피하 (SC) 투여하였다. 도 1a 내지 1b는 멀티데이(multi-day) 음식 섭취 검정의 결과를 제공한다. 화합물 21, 25, 24, 22, 및 26이 24시간 음식 섭취에 미치는 영향을 대조군으로서 비히클을 사용하여 조사하였다. 도 1a 내지 1b의 결과는 시험 화합물 각각이 3일 동안 체중 및 음식 섭취 감소에서 효과적이었음을 입증한다. 일부 화합물의 경우, 체중 감소가 1주 후에도 여전히 명백하였다.
실시예 5. 페길화가 음식 섭취에 미치는 영향: 화합물 26, 23
화합물 26의 주 2회 용량 또는 주 1회 용량이 체중 감소에 미치는 영향을 SC 주사로 판단된 바와 같이 조사하였다. DIO ("식이요법에 의해 유도된 비만") 래트에서 125 nmol/kg로 주 2회 투여시, 화합물 26은 12.5 nmol/kg/d 화합물 1의 연속 주입과 유사한 효능을 가졌다 (도 2a). 125 nmol/kg으로 주 1회 투여된 화합물 23은 4주 동안 DIO 래트에게 제공시 주입된 화합물 1 만큼 효과적이지 않았지만, 체중의 지속적인 감소를 보였다 (도 2b). 화합물 23은 또한, 도 3a 내지 도 3b에 도시된 바와 같이, 여윈 래트에서 용량 의존 방식으로 체중 및 음식 섭취를 감소시켰다.
실시예 6. 페길화가 음식 섭취에 미치는 영향: 화합물 19, 23, 27
y-분지형 PEG (화합물 27) 또는 N-말단 PEG (화합물 19) 중 어느 하나를 갖는 화합물의 단일 용량이 24시간 음식 섭취에 미치는 영향을 SC 주사로 판단된 바와 같이 조사하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, N-말단 페길화 화합물인 화합물 19의 3회 용량은 DIO 래트에서 체중을 감소시키는데 비히클 만큼 효과적이지 않았다. y-분지형 페길화 화합물인 화합물 27은, 도 4b에 도시된 바와 같이, 여윈 래트에서 체중을 감소시키는데 선형 페길화 형태인 화합물 23 만큼 효과적이지 않았다.
실시예 7. 페길화가 음식 섭취에 미치는 영향: 화합물 26, 28, 29, 30, 31
화합물 26, 28, 29 및 30이 24시간 음식 섭취에 미치는 영향을 SC 주사로 판단된 바와 같이 조사하였다. 도 5a 내지 5b에 도시된 바와 같이, 시험된 페길화 화합물 28, 29, 및 30 각각은 여윈 래트에서 체중 및 음식 섭취 감소에서 적어도 화합물 26 만큼 효과적이었다. y-분지형 페길화 화합물인 화합물 31은, 도 6a 내지 6b에 도시된 바와 같이, 여윈 래트에서 체중 및 음식 섭취 감소에서 선형 페길화 형태인 화합물 29 만큼 효과적이지 않았다. 화합물 29는 또한 도 6a 내지 6b에서 입증된 바와 같이 용량 의존 효능을 보였다.
실시예 8. 페길화가 음식 섭취에 미치는 영향: 화합물 29, 32, 33, 34, 35 및 36
화합물 29, 32, 33, 34, 35 및 36이 누적 음식 섭취 및 체중 감소에 미치는 영향을 SC 주사로 판단된 바와 같이 조사하였다. 도 7a 내지 7b에 도시된 바와 같이, 시험된 페길화 화합물 각각은 125 nmol/kg으로 여윈 래트에서 체중 및 음식 섭취 감소에서 효과적이었다. 대부분의 화합물의 경우에, 체중 감소는 1주 후에도 여전히 명백하였다.
실시예 9. 페길화가 음식 섭취에 미치는 영향: 화합물 41 및 42
화합물 41 및 42 가 누적 음식 섭취 및 체중 감소에 미치는 영향을 SC 주사로 판단된 바와 같이 조사하였다. 도 8a 내지 8b에 도시된 바와 같이, 시험된 페길화 화합물 각각은 125 nmol/kg으로 여윈 래트에서 체중 및 음식 섭취 감소에서 효과적이었다.
요약하면, 실시예 4 내지 9에 기재된 음식 섭취 데이터는 시험 화합물의 폴리펩티드 요소의 페길화의 작용의 지속기간에 대한 효능 및 효과와 관련하여 귀중한 관찰을 제공하였다. 구체적으로, 폴리펩티드 성분의 40KD PEG 유도체는 페길화되지 않은 펩티드와 비교하여 작용의 연장된 시간 과정을 나타냈다. 위치 21, 26, 및 31에서 PEG의 부착은 작용의 지속기간 및 음식 섭취 반응의 크기 둘 다를 증가시켰다. 선형 PEG 화합물은 분지형 PEG 화합물과 비교하여 음식 섭취 검정에서 보다 큰 효능을 입증하였다.
SEQUENCE LISTING <110> AMYLIN PHARMACEUTICALS, INC. <120> AMYLIN PEPTIDES AND DERIVATIVES AND USES THEREOF <130> 0123WO1 <140> <141> <150> 61/489,781 <151> 2011-05-25 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 1 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 3 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 4 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term is hydrogen, an N-terminal capping group, a bond to a duration enhancing moiety, or a linker to a duration enhancing moiety <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Lys, Cys, or His <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Lys, Cys, or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Lys, Cys, or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Lys, Cys, or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Lys, Cys, or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Lys, Cys, or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(29) <223> Lys, Cys, or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Lys, Cys, or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Lys, Cys, or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (35)..(35) <223> Lys, Cys, or Asn <220> <223> C-term substituted or unsubstituted amino, substituted or unsubstituted alkylamino, substituted or unsubstituted dialkylamino, substituted or unsubstituted cycloalkylamino, substituted or unsubstituted arylamino, substituted or <220> <223> cont. from above; unsubstituted aralkylamino, substituted or unsubstituted alkyloxy, substituted or unsubstituted aryloxy, substituted or unsubstituted aralkyloxy, hydroxyl, or a bond or linker to a duration enhancing moiety <400> 4 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Xaa Ser Ser Xaa Asn Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Val 20 25 30 Gly Xaa Xaa Thr Tyr 35 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence0123WO1 <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Gly Gly Gly Asn Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Gly Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gly Pro Asn Gly Gly 1 5 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> This sequence may encompass 1, 2, 3, 4, 5, or 6 "Gly Ser" repeating units <400> 11 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> This sequence may encompass 1, 2, 3, 4, 5, or 6 "Gly Gly Ser" repeating units <400> 12 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> This sequence may encompass 1, 2, 3, 4, 5, or 6 "Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 13 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 <210> 14 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> This sequence may encompass 1, 2, 3, 4, 5, or 6 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 16 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 17 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 17 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 18 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 18 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Lys Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 19 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 19 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Lys Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 20 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 20 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 21 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 21 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 22 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 22 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 23 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 23 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 24 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 24 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 25 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 25 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 26 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 26 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Lys Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 27 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 27 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 28 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 28 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Lys Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 29 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 29 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Lys Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 30 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 30 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Lys Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 31 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 31 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Lys Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 32 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 32 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Lys Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 33 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 33 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Lys Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 34 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 34 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 35 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 35 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Lys Asn Thr Tyr 35 <210> 36 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> C-term NH2 <400> 36 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Lys Thr Tyr 35 <210> 37 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term mPEG40KD <220> <223> C-term NH2 <400> 37 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 38 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> N-term mPEG40KD <220> <223> C-term NH2 <400> 38 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 39 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 39 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Lys Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 40 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 40 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Lys Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 41 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 41 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 42 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 42 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 43 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 43 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 44 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 44 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Lys Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 45 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Lys(Y-shaped-mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 45 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 46 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 46 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Lys Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 47 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 47 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 48 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 48 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Lys Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 49 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Lys(Y-shaped-mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 49 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Lys Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 50 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (23)..(23) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 50 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Lys Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 51 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 51 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Lys Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 52 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 52 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Lys Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 53 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 53 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Lys Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 54 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 54 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Lys Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 55 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 55 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210> 56 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (33)..(33) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 56 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Lys Asn Thr Tyr 35 <210> 57 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Lys(mPEG40KD) <220> <223> C-term NH2 <400> 57 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Lys Thr Tyr 35

Claims (11)

  1. 지속기간 향상 모이어티에 공유결합으로 연결된 폴리펩티드 성분을 포함하는 폴리펩티드 접합체로서, 여기서 폴리펩티드 성분은 하기 화학식 I의 잔기 1 내지 37의 아미노산 서열을 포함하고, 화학식 I에 기재된 아미노산의 25% 이하는 결실되거나 상이한 아미노산으로 치환될 수 있으며, 지속기간 향상 모이어티는 임의로 링커를 통해 연결 아미노산 잔기의 측쇄, X' 또는 X에 공유결합으로 연결되는 것인, 폴리펩티드 접합체:
    <화학식 I>
    Figure pct00023

    상기 식에서,
    X'는 수소, N-말단 캡핑기, 지속기간 향상 모이어티에 대한 결합, 또는 지속기간 향상 모이어티에 대한 링커이고;
    Xaa1은 Lys 또는 결합이고;
    Xaa18은 Lys, Cys, 또는 His이고,
    Xaa21은 Lys, Cys, 또는 Asn이고;
    Xaa24는 Lys, Cys, 또는 Gly이고;
    Xaa25는 Lys, Cys, 또는 Pro이고;
    Xaa26은 Lys, Cys, 또는 Ile이고;
    Xaa27은 Lys, Cys, 또는 Leu이고;
    Xaa28은 Lys, Cys, 또는 Pro이고;
    Xaa29는 Lys, Cys, 또는 Pro이고;
    Xaa31은 Lys, Cys, 또는 Asn이고;
    Xaa34는 Lys, Cys, 또는 Ser이고;
    Xaa35는 Lys, Cys, 또는 Asn이고;
    X는 치환 또는 비치환 아미노, 치환 또는 비치환 알킬아미노, 치환 또는 비치환 디알킬아미노, 치환 또는 비치환 시클로알킬아미노, 치환 또는 비치환 아릴아미노, 치환 또는 비치환 아르알킬아미노, 치환 또는 비치환 알킬옥시, 치환 또는 비치환 아릴옥시, 치환 또는 비치환 아르알킬옥시, 히드록실, 지속기간 향상 모이어티에 대한 결합, 또는 지속기간 향상 모이어티에 대한 링커이다.
  2. 제1항에 있어서, 지속기간 향상 모이어티가 폴리에틸렌 글리콜 또는 그의 유도체인 폴리펩티드 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 연결 아미노산 잔기가 시스테인 또는 리신인 폴리펩티드 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜이 선형, 분지형 또는 빗살형인 폴리펩티드 접합체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 지속기간 향상 모이어티를 포함하는 폴리펩티드 접합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지속기간 향상 모이어티가 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 잔기에 부착되는 것인 폴리펩티드 접합체.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지속기간 향상 모이어티가 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 잔기에 부착되는 것인 폴리펩티드 접합체.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지속기간 향상 모이어티가 위치 11, 18, 24 내지 29, 31, 34, 또는 35에서의 아미노산의 측쇄에 부착되는 것인 폴리펩티드 접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 접합체, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  10. 제9항에 따른 조성물을 질환 또는 장애를 치료하는데 유효한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 질환 또는 장애가 섭식 장애, 인슐린 저항성, 비만, 과체중, 비정상적 식후 고혈당, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 대사 증후군, 덤핑 증후군, 고혈압, 이상지질혈증, 심혈관 질환, 고지혈증, 수면 무호흡, 암, 폐고혈압, 담낭염, 골관절염, 또는 단장 증후군인 방법.
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