KR102092025B1 - 페길화된 옥신토모둘린 변이체 - Google Patents

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Abstract

9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)과 같은 가역성 링커를 통해 연결된 옥신토모둘린 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG 중합체)를 포함하는 조성물이 개시된다. 역 페길화된 옥신토모둘린을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하는 방법이 또한 개시된다.

Description

페길화된 옥신토모둘린 변이체{PEGYLATED OXM VARIANTS}
발명의 분야
9-플우로레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)과 같은 가역성 결합제를 통해 연결된 옥신토모둘린 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 또한, 역 페길화된(reverse pegylated) 옥신토모둘린을 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 사용하는 방법이 기재되어 있다.
발명의 배경
위장관은 췌장 단백질(PP), 글루카곤-유사 펩타이드 1(GLP-1), 펩타이드 YY(PYY) 및 옥신토모둘린(OXM)을 포함하는 섭식 행위를 조절하는 많은 펩타이드 호로몬을 합성하고 방출하는데 관여한다. OXM은 장 및 CNS내에서 프로글루카곤(proglucagon)의 조직-특이적인 해독후 프로세싱으로부터 발생한다. 이는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 OXM의 특성에 기여하는 것으로 밝혀졌지만 펩타이드의 효과에는 단독으로 충분하지 않은 것으로 밝혀진 C-말단 염기성 옥타펩타이드 연장부를 지닌 완전한 글루카곤 서열을 포함하는, 37개 아미노산을 함유한다. 식품 섭취에 대한 반응시, OXM은 장 L 세포에 의해 식사 열량 함량에 비례적으로 혈류 내에 분비된다.
OXM은 경구 및 복강내 투여 둘 다 후 인슐린 분비의 자극을 통해 글루코즈 청소(glucose clearance)를 향상시킨다. 이는 또한 식품 섭취의 제어를 조절한다. 시상하부의 뇌실방 핵 및 아치형 핵(arcuate nucleus: ARC)내로 OXM의 뇌실내(ICV) 및 핵내 주사는 절식된 랫트에서 재-식사를 억제한다. 이러한 억제는 암실 상(dark phase)의 출발 시에 자유로이 먹이가 제공된 랫트에서 또한 입증되어 왔다. 더욱이, OXM의 말초 투여는 절식-유도되고 암실-상 식품 섭취 둘 다를 투여량 의존적으로 억제하였다.
단기간 혈청 반감기와 같은 양호하지 않은 약동학은 많은 다른 촉망되는 약물 후보물의 약제학적 개발을 방지할 수 있다. 혈청 반감기는 분자의 경험적 특징이며, 각각의 신규한 잠재적 약물에 대해 실험적으로 측정되어야만 한다. 예를 들어, 보다 낮은 분자량 단백질 약물을 사용하면, 신장 여과와 같은 생리학적 청소 메카니즘은 요구되는 투여량 요법의 비용 또는 빈도로 인하여 실행할 수 없는 약물의 치료학적 수준을 유지할 수 있다.
단백질 및 특히 짧은 펩타이드는 혈액, 간 또는 신장 속에서 변성 또는 효소적 분해에 민감할 수 있다. 따라서, 단백질은 전형적으로 수시간의 짧은 순환 반감기를 갖는다. 이들의 낮은 안정성으로 인하여, 펩타이드 약물은 일반적으로 지속적인 빈도로 전달되어서 활성 펩타이드의 유효 혈장 농도를 유지한다. 더욱이, 펩타이드 약물은 일반적으로 주입에 의해 투여되므로, 펩타이드 약물의 빈번한 주사는 대상자에게 고려할만한 불편함을 유발한다. 따라서, 치료학적 단백질 및 펩타이드의 높은 약리학적 효능을 유지하면서도, 이들의 반감기를 연장시킬 기술이 요구되고 있다. 이러한 바람직한 펩타이드 약물은 대상자에게 투여되는 경우 향상된 혈청 안정성, 고 활성 및 바람직하지 않은 면역 반응 유도의 낮은 가능성의 요건을 또한 충족하여야 한다.
본 발명은, 펩타이드의 반감기가 가역성 페길화 기술을 사용하여 연장된 OXM 유도체에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)로 이루어진 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노 말단에 부착된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)로 이루어진 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기(Lys12)에 부착된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)로 이루어진 조성물에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 Fmoc 또는 FMS를 통해 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 30번 위치의 라이신 잔기(Lys30)에 부착된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 곡선하 영역(area under the curve: AUC)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 투여량 빈도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:1:1의 몰비로 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합된다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명 실시예 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 취지 및 영역내에서 각종의 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 단지 나열하기 위해 제공됨을 이해하여야 한다.
도 1은 생산된 PEG-FMS-OXM 접합체의 상이한 변이체를 나타낸다.
도 2는 GLP-1 수용체를 과발현하는 CHO-K1 세포와 함께 항온처리하는 경우 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lys12 및 Lys30)의 시험관내 활성(cAMP 정량)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 IPGTT 모델에서 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lys12 및 Lys30)의 생체내 활성을 나타내는 그래프이다. 모든 화합물은 비히클 그룹과 비교하여 글루코즈 내성을 유도하였다.
도 4는 수컷 ob/ob 마우스에서 체중에 대한 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lys12 및 Lys30)의 효과를 나타낸다.
도 5는 수컷 ob/ob 마우스에서 식품 섭취에 대한 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lys12 및 Lys30)의 효과를 나타낸다.
도 6은 수컷 ob/ob 마우스에서 비-절식 및 절식 글루코즈에 대한 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lys12 및 Lys30)의 효과를 나타낸다.
도 7은 수컷 ob/ob 마우스에서 누적적인 식품 섭취에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 8은 수컷 ob/ob 마우스에서 체중에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 9는 수컷 ob/ob 마우스에서, 자유로이 먹이가 공급되고 절식된 혈장 글루코즈에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
도 10은 수컷 ob/ob 마우스에서, 연구 2일 째에 글루코즈 내성(2g/kg 경구)에 대한 MOD-6031 및 먹이가 공급된 그룹 쌍의 효과를 나타낸다.
도 11은 수컷 ob/ob 마우스에서, 연구 30일째에 글루코즈 내성(2g/kg 경구)에 대한 MOD-6031 및 먹이가 공급된 그룹 쌍의 효과를 나타낸다.
도 12는 수컷 ob/ob 마우스에 있어서, 말단 혈장 콜레스테롤에 대한 MOD-6031, OXM 및 리라글루타이드의 효과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
장기간 작용하는 옥신토모둘린 및 이를 생산하고 사용하는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 국면에서, 본 발명은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 포함하거나 이들로 이루어진 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 포함하거나 이로 이루어진 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, PEG 중합체는 옥신노모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기(Lys12)에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된다. 하나의 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및, 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기(Lys12)에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 포함하거나 이로 이루어진 조성물이다.
다른 국면에서, 펩타이드의 혈청 반감기를 연장시키는 신규 방법이 본원에 제공된다. 당해 방법은 화학적 링커(FMS 또는 Fmoc로 불림)를 통해 펩타이드에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 쇄를 가역적으로 부착시킴을 기본으로 한다. 이후에, 방출된 펩타이드는 또한 혈액 뇌 장벽을 가로질러 중추신경계(CNS) 또는 어떠한 다른 표적 기관내로 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, FMS 링커의 독특한 화학 구조는 특이적인 펩타이드 방출 속도를 초래한다.
따라서, 다른 구현예에서, OXM 펩타이드의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법이 본원에 제공된다. 다른 구현에에서, OXM의 생물학적 유액 속에서 순환 시간을 연장시키는 방법이 본원에 제공되며, 여기서, 상기 순환 시간은 완전한 OXM 펩타이드의 느린 방출에 의해 연장된다. 다른 구현예에서, 상기 생물학적 반감기의 연장 또는 상기 OXM 펩타이드의 순환 시간은, 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 가로질러 CNS를 표적화하도록 한다. 생물학적 유액이 혈액, 혈청, 뇌척수액(CSF) 등일 수 있음은 당해 분야의 숙련가에 의해 잘 인식될 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 페길화된(PEGylated) 옥신토모둘린 조성물을 대상자내로 투여하는 경우, 옥신토모둘린은 상기 조성물로부터 상기 FMS 또는 상기 Fmoc 링커의 화학적 가수분해의 결과로서 대상자내에서 생물학적 유액내로 방출된다. 다른 구현예에서, 방출된 옥신토모둘린은 완전하며 완전한 GLP-1 및 글루카곤 수용체 결합 활성을 재획득한다. 다른 구현예에서, 상기 FMS 또는 상기 Fmoc를 화학적으로 가수분해하는 것은 상기 생물학적 유액 속에서 상기 OXM 펩타이드의 순환 시간을 연장시킨다. 다른 구현예에서, 상기 OXM의 순환 시간을 연장시키는 것은, 상기 OXM이 상기 혈액 뇌 장벽을 가로질러 CNS를 표적화하도록 한다. 다른 구현예에서, 상기 OXM의 순환시간을 연장시키는 것은, 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 가로질러 시상하부를 표적화하도록 한다. 다른 구현예에서, 상기 OXM의 순환시간을 연장시키는 것은, 상기 OXM이 혈액 뇌 장벽을 가로질러 아치형 핵을 표적화하도록 한다.
하나의 국면에서, PEG30-FMS-OXM(MOD-6031로 지정됨)의 아미노 변이체는 이-기능적 링커(FMS 또는 Fmoc)를 통해 연결된 OXM 및 mPEG(30)-SH를 포함하는 부위 지시된 접합체이다. 다른 구현예에서, OXM 펩타이드는 한쪽으로부터의 링커 상에 N-석신이미드 에스테르(NHS)와 반응하는 N-말단 측면의 이의 말단 아민을 통해 연결되는 한편, mPEG(30)-SH는 이의 티올 그룹에 의해 FMS 링커의 말레이미드 잔기에 연결된다(본원의 실시예 참조). Lys12 및 Lys30 변이체는 Lys 잔기의 이들의 아민 그룹을 통해 FMS 링커에 접합된다. 하나의 구현예에서 가역성-페길화 방법을 본원에서 이용하여 본원에 제공된 장기 지속되는 옥신토모둘린(OXM) 펩타이드(예를 들면, PEG30-FMS-OXM)를 생성한다.
하나의 구현예에서, 용어 이중 "GLP-1/글루카곤 수용체 효능제" 및 "효능제"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 상기 용어는 또한 당해 분야에 공지된 어떠한 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제도 포함한다. 다른 구현예에서, 바람직한 효능제는 옥신토모둘린 또는 OXM 또는 이의 기능적 변이체이다.
하나의 구현예에서, 용어 "기능성"은, 본원에 제공된 효능제 또는 OXM이 생물학적 활성을 갖는 능력을 말하며, 본원에 추가로 제공된 바와 같은, 체중 감소, 인슐린 민감성 증가, 인슐린 내성 감소, 에너지 소비 증가, 글루코즈 내성 유도, 혈당 조절 유도, 콜레스테롤 수준 개선 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린 아미노산 서열의 30번 위치의 라이신 잔기(Lys30)에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된다. 하나의 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기(Lys30)에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 포함하거나 이로 이루어진 조성물이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)로 이루어진 조성물을 제공하며, 여기서 상기 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 30번 위치의 라이신 잔기(Lys30)에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된다. 하나의 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및, 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기(Lys30)에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 포함하거나 이로 이루어진 조성물이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린의 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된다. 하나의 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및, 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 포함하거나 이로 이루어진 조성물이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)로 이루어진 조성물을 제공하며, 여기서 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린의 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된다. 하나의 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 및, Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 부착된 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 포함하거나 이로 이루어진 조성물이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 당해 옥신토모둘린 펩타이드의 12번 위치(Lys12) 또는 30번 위치(Lys30) 또는 아미노 말단에서 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS) 링커를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 당해 옥신토모둘린 펩타이드의 12번 위치(Lys12) 또는 30번 위치(Lys30) 또는 아미노 말단에서 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS) 링커를 통해 옥신토모둘린 펩타이드 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체로 이루어진 변형된 옥신토모둘린 펩타이드를 제공한다. 다른 구현예에서, PEG가 Lys12, Lys30 또는 아미노 말단에서 옥신토모둘린에 부착된 조성물은 각각 옥신토모둘린의 "Lys12 변이체", "Lys30 변이체" 또는 "아미노 변이체"로 언급된다. 하나의 구현예에서, 용어 "아미노 변이체"는 "N-말단적 변이체", "N 변이체" 또는 "N-말단 변이체"와 동의어이다. 숙련가는 본 발명에 의해 OXM 서열 전체에서 부위-특이적 또는 무작위적 방식으로 라이신 잔기를 용이하게 삽입하여 이들 라이신 잔기에서 본원에 제공된 링커(Fmoc 또는 FMS)/PEG 접합체를 부착할 수 있게 하는 것을 안내받을 수 있음을 이해하여야 한다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 라이신 잔기가 OXM 서열 전체에서 상이한 위치에 위치하고 OXM을 PEG 및 절단가능한 링커(예를 들면, FMS 또는 Fmoc)에 접합시키는데 사용되는 변이체가 또한 본 발명에 포함된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 12번 위치(Lys12) 또는 30번 위치(Lys30)에서 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS) 링커를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 옥신토모둘린 펩타이드, 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 12번 위치(Lys12) 및 아미노 말단에서 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS) 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린 펩타이드, 및 30번 위치(Lys30) 및 아미노 말단 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS) 링커를 통해 상기 옥신토모둘린 펩타이드의 라이신 아미노산에 접합된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 페길화된 옥신토모둘린이다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 역 페길화된 옥신토모둘린이다. 다른 구현예에서, 어구 "장기간 작용하는 옥신토모둘린", "역(reversed) 페길화된 옥신토모둘린", "가역성 페길화된 OXM", 또는 "옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 포함하거나 이들로 이루어진 조성물"은 상호교환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 PEG에 Fmoc 또는 FMS를 통해 연결된 OXM이다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 OXM은 Fmoc 또는 FMS에 이의 Lys12 잔기, 또는 이의 Lys30 잔기 또는 이의 아미노(N') 말단을 통해 연결된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 PEG 중합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린 펩타이드의 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 접합된 PEG 중합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 12번 또는 30번 라이신 잔기에 접합된 PEG 중합체를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 Fmoc 또는 FMS를 통해 옥신토모둘린 펩타이드의 아미노 말단 및 옥신토모둘린의 12번 및 30번 라이신 잔기 둘 다에 접합된 PEG 중합체를 포함한다.
다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:0.2 내지 10:0.2 내지 10의 몰비로 포함하거나 이들로 이루어진 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:0.5 내지 2:0.5 내지 2의 몰비로 포함하거나 이들로 이루어진 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:1:1의 몰비로 포함하거나 이들로 이루어진 조성물이다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 옥신토모둘린의 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 접합된 PEG 중합체를 포함한다. 다른 구현예에서, OXM-PEG-및 링커의 몰비는 1:1:1 내지 1:1:3.5이다. 다른 구현예에서, 상기 몰비는 1:1:1 내지 1:1:10.0이다. 다른 구현예에서, 보다 높은 비의 링커가 조성물의 최적화된 수율을 위해 허용된다.
다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은, 예를 들면, Fmoc 및 FMS를 포함하나, 이에 한정되지 않는 가역성 링커를 통해 PEG에 연결된다. 다른 구현예에서, Fmoc 및 FMS는 염기에 대해 민감성이며 생리학적 조건하에서 제거가능하다. 다른 구현예에서, 가역성 링커는 염기에 대해 민감성이며 생리학적 조건하에 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 가역성 링커는 염기에 대해 민감성이며 혈액, 혈장, 또는 림프 속에서 생리학적 조건하에 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 가역성 링커는 염기에 대해 민감성이고 체액 속에서의 생리학적 조건하에 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 가역성 링커는 염기성 pH를 갖는 체액 속에서 제거가능한 링커이다. 다른 구현예에서, 염기에 대해 민감성인 링커는 염기성 환경에 노출시 절단되어 링커 및 PEG로부터 OXM을 방출한다. 다른 구현예에서, 온도에 대해 민감성인 링커는, 이러한 절단이 일어나도록 하는 특정한 온도에 대한 노출시 절단된다. 다른 구현예에서, 링커를 절단할 수 있는 온도는 생리학적 범위내에 있다.
다른 구현예에서, 역 페길화된 옥신토모둘린은, OXM이 PEG에 가역성 링커를 통해 연결된 조성물이다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 옥신토모둘린은 염기성 환경에 대한 노출시 유리 OXM을 방출한다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 옥신토모둘린은 혈액 또는 혈장에 대한 노출시 유리 OXM을 방출한다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은 표준 페길화 과정에서와 같이, 서로에 대해 직접 연결되지 않으나, 오히려 잔기 둘 다가 염기에 대해 고도로 민감성이고 일정한 생리학적 조건하에서 제거가능한 Fmoc 또는 FMS의 상이한 위치에 연결된 PEG 및 옥신토모둘린을 포함한다. 다른 구현예에서, 일정한 생리학적 조건은 혈액 또는 혈장과 같은 생리학적 환경을 포함한다.
다른 구현예에서, Fmoc 및 FMS의 구조 및 제조 공정은 미국 특허 제7585837호에 기술되어 있다. 미국 특허 제7585837호의 기재내용은, 이의 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
다른 구현예에서, 역 페길화는, OXM이 장기간 작용하는 OXM이 되도록 한다. 다른 구현예에서, 장기간 작용하는 옥신토모둘린은, 생물학적 반감기가 연장된 옥신토모둘린이다. 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 분해에 대한 보호를 제공한다. 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 Cmax에 영향을 미쳐 본원에서 제공된 조성물의 투여와 관련된 부작용을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 Tmax를 연장시킨다. 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 순환적 반감기를 연장시킨다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 변형되지 않은 OXM과 비교하여 개선된 생체이용성(bioavailability)을 갖는다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 변형되지 않은 OXM과 비교하여 개선된 생물학적 활성을 갖는다. 다른 구현예에서, 역 페길화는 OXM의 효능을 향상시킨다.
다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 생화학적 척도의 측면에서 변형되지 않은 OXM에 대해 적어도 등가이다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 생리학적 척도의 측면에서 변형되지 않은 OXM에 대해 적어도 등가이다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 결합능(Kd)의 측면에서 변형되지 않은 OXM에 대해 적어도 등가이다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 소화계 전체에서 흡수 측면에서 변형되지 않은 OXM에 대해 적어도 등가이다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 변형되지 않은 OXM보다 소화계 전체에서 흡수 동안 보다 더 안정하다.
다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 개선된 혈액 곡선하 영역(AUC)을 나타낸다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 개선된 생물학적 활성 및 혈액 곡선하 영역(AUC) 수준을 나타낸다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리된 OXM과 비교하여 개선된 혈액 보유 시간(t1/2)을 나타낸다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 개선된 생물학적 활성 및 혈액 보유 시간(t1/2)을 나타낸다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 개선된 혈액 Cmax 수준을 나타내며, 여기서 다른 구현예에서, 이는 본원에 제공된 역 페길화된 조성물의 투여와 관련된 부작용을 감소시키는 보다 느린 방출 공정을 초래한다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 개선된 생물학적 활성 및 혈액 Cmax 수준을 나타낸다. 다른 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 유리 OXM의 아미노 말단에 접합시키는 단계를 포함하거나 이로 이루어진 OXM의 AUC, Cmax, t1/2, 생물학적 활성, 또는 이의 어떠한 조합을 개선시키는 방법이 본원에 제공된다.
폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 유리 OXM의 아미노 말단에 접합시킴으로써 OXM의 AUC, Cmax, t1/2, 생물학적 활성 또는 이의 어떠한 조합의 개선은 OXM의 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 OXM의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 접합시키는 단계를 포함하거나 이로 이루어진, OXM의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 다른 구현예에서, OXM의 역 페길화는 보다 적은 용량이 사용되도록 하는데 유리하다.
다른 구현예에서, OXM은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, OXM은 서열 번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다. 다른 구현예에서, 서열 번호 1은 다음의 아미노산(AA) 서열을 포함하거나 이로 이루어진다: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(서열 번호: 1). 다른 구현예에서, OXM은 CAS 제62340-29-8호에 나타낸 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구현예에서, OXM은 사람 OXM 또는 어떠한 포유동물 OXM이다. 다른 구현예에서, OXM은 또한 글루카곤-37 또는 생활성 엔테로글루카곤으로 언급된다. 다른 구현예에서, OXM은 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제이다. 다른 구현예에서, OXM은 OXM의 생물학적 활성 단편이다. 다른 구현예에서, 생물학적으로 활성인 OXM은 서열 번호 1의 30번 아미노산으로부터 37번 아미노산으로 연장되어 있다. 다른 구현예에서, 생물학적으로 활성인 OXM은 서열 번호 1의 19번 아미노산으로부터 37번 아미노산으로 연장되어 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은, 이로부터 2개의 C-말단 아미노산이 결실된 옥타펩타이드에 상응한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은, 본원에 제공된 바와 같은 OXM 활성을 보유하는 서열 번호 1의 특정 단편에 상응한다.
하나의 구현예에서, OXM은 서열 번호 1의 펩타이드의 펩타이드 동족체를 말한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트(default) 매개변수들을 사용하는 생물과학 정보의 국립 센터(National Center of Biotechnology information: NCBI)의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 측정한 것으로서 서열 번호 1에 설정된 OXM 서열에 대해 적어도 50% 상동성이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 매개변수를 사용하는 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 측정된 것으로서 서열 번호 1에 설정된 OXM 서열에 대해 적어도 60% 상동성이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 매개변수를 사용하는 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 측정된 것으로서 서열 번호 1에 설정된 OXM 서열에 대해 적어도 70% 상동성이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 매개변수를 사용하는 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 측정된 것으로서 서열 번호 1에 설정된 OXM 서열에 대해 적어도 80% 상동성이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 매개변수를 사용하는 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 측정된 것으로서 서열 번호 1에 설정된 OXM 서열에 대해 적어도 90% 상동성이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM 아미노산 서열은 디폴트 매개변수를 사용하는 NCBI의 BlastP 소프트웨어를 사용하여 측정된 것으로서 서열 번호 1에 설정된 OXM 서열에 대해 적어도 95% 상동성이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM은 변형되지 않은 OXM의 생물학적 활성을 유지한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM은 OXM 생물학적 활성을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 소화성 분비를 감소시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 위장 비움을 감소시키고 지연시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 소장에서 절식 운동능 양식의 억제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 펜타가스트린에 의해 자극된 산 분비의 억제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 위 소마토스타틴 방출의 증가를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 펩타이드 YY의 효과를 강화시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 그렐린(ghrelin) 방출의 억제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 아미노피린 축적 및 cAMP 생산의 자극을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 GLP-1 수용체를 결합시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 글루카곤 수용체를 결합시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 아데닐레이트 사이클라제를 활성화시킴으로써 H+ 생산을 자극시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 히스타민-자극된 위산 분비를 억제함을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 식품 섭취를 억제함을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 인슐린 방출을 자극시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 엑소크린 췌장 분비를 억제함을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 인슐린 민감성을 증가시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 글루코즈 수준을 감소시킴을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:1:1의 몰 비로 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법을 추가로 제공하며, 여기서, 다른 구현예에서, PEG 중합체는 12번 위치에서 라이신 잔기 또는 30번 위치에서 라이신 잔기 또는 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:1:1의 몰비로 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:1:1의 몰비로 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 30번 위치의 라이신 잔기에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 옥신토모둘린, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 1:1:1의 몰비로 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 PEG 중합체는 상기 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합된다.
다른 구현예에서, OXM-PEG- 및 링커의 몰비는 1:1:1 내지 1:1:3.5이다. 다른 구현예에서, 몰비는 1:1:1 내지 1:1:10.0이다. 다른 구현예에서, 링커의 보다 높은 비는 조성물의 최적화된 수율을 허용한다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 곡선하 영역(AUC)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 곡선하 영역(AUC)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 30번 위치의 라이신 잔기에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 곡선하 영역(AUC)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 곡선하 영역(AUC)을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
다른 국면에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
다른 국면에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 30번 위치의 라이신 잔기에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
다른 국면에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)를 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 아미노 말단에 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)을 통해 접합시키는 단계로 이루어진, 옥신토모둘린의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상자에게 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)에 굴곡성 링커를 통해 접합된 옥신토모둘린으로 이루어진 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상자에서 식품 섭취를 감소시키는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 굴곡성 링커는 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)이고, 여기서 상기 PEG 중합체는 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 접합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상자에게 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)에 굴곡성 링커를 통해 접합된 옥신토모둘린으로 이루어진 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상자에서 체중을 감소시키는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 굴곡성 링커는 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)이고, 여기서 상기 PEG 중합체는 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 접합된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상자에게 폴리에틸렌 글리콜 중합체(PEG 중합체)에 굴곡성 링커를 통해 접합된 옥신토모둘린으로 이루어진 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상자에서 혈당 조절을 유도하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 상기 굴곡성 링커는 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 또는 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐(FMS)이고, 여기서 상기 PEG 중합체는 옥신토모둘린의 아미노산 서열의 12번 위치의 라이신 잔기 또는 30번 위치의 라이신 잔기 또는 아미노 말단에 Fmoc 또는 FMS를 통해 접합된다.
본원에 제공된 아미노 변이체는 본원(참조: 실시예 5)에 예시된 바와 같이, 예상치못하게도 감소된 식품 섭취, 체중 조절 및 혈당 조절을 달성한다. 하나의 구현예에서, 본원에 제공된 OXM 펩타이드의 PEG 변형은 예상치못하게 OXM 기능을 방해하지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상자에게 유효량의 본원에 제공된 조성물을 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상자에서 콜레스테롤 수준을 개선시키는 방법을 제공한다. 다른 구현예에서, 콜레스테롤 수준을 개선시키는 것은 대상자에서 LDL 콜레스테롤을 감소시키면서 HDL 콜레스테롤을 증가시키는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 200 mg/dL 이하, 그러나 0 mg/dL 초과로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 약 100 내지 129 mg/dL로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 100 mg/dL 이하, 그러나 0 mg/dL 초과로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 70 mg/dL 이하, 그러나 0 mg/dL 초과로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 5.2 mmol/L 이하, 그러나 0 mmol/L 초과로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 약 2.6 내지 3.3 mmol/L로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 2.6 mmol/L 이하, 그러나 0 mmol/L 초과로 감소된다. 다른 구현예에서, LDL 콜레스테롤 수준은 1.8 mmol/L 이하, 그러나 0 mmol/L 초과로 감소된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상자에게 본원에 제공된 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상자에서 인슐린 내성을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 미주 신경의 간접 메카니즘을 통해 췌장 분비를 억제함을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 소장을 통한 하이드로미네랄 수송을 감소시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 당 흡수를 자극시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 소마토스타틴 분비를 조절/자극함을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 식품 섭취 및 체중 증가 둘다에 있어서의 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 지방과다증에 있어서의 감소를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 식욕 억제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 식욕 부진증의 유도를 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 과체중 및 비만 대상자에서 체중을 감소시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 지방 호르몬 렙틴 및 아디포넥틴의 수준에 있어서의 변화를 유도함을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 장기간 작용하는 OXM의 생물학적 활성은 과체중 및 비만 대상자에서 에너지 흡수를 감소시키는 것 외에 에너지 소비를 증가시킴을 포함한다.
다른 구현예에서, PEG 중합체는 옥신토모둘린의 아미노 말단 또는 라이신 잔기에 Fmoc 또는 FMS를 통해 부착된다. 다른 구현예에서, 용어 "부착된" 및 "연결된"은 상호교환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, PEG 중합체는 OXM의 α-아미노 측쇄에 연결된다. 다른 구현예에서, PEG 중합체는 OXM의 ε-아미노 측쇄에 연결된다. 다른 구현예에서, PEG 중합체는 OXM의 하나 이상의 ε-아미노 측쇄에 연결된다. 다른 구현예에서, PEG 중합체는 설프하이드릴 잔기를 포함한다.
다른 구현예에서, PEG는 선형이다. 다른 구현예에서, PEG는 측쇄이다. 다른 구현예에서, PEG는, 분자량이 200 내지 200,000 Da의 범위이다. 다른 구현예에서, PEG는, 분자량이 5,000 내지 80,000 Da의 범위이다. 다른 구현예에서, PEG는, 분자량이 5,000 내지 40,000 Da의 범위이다. 다른 구현예에서, PEG는, 분자량이 20,000 Da 내지 40,000 Da의 범위이다.
다른 구현예에서, 장기간 작용하는 OXM은 Fmoc 또는 FMS 잔기의 플루오렌 환에 존재하는, NH2, OH, SH, COOH, CHO, --N=C=O, --N=C=S, --SO2Cl, --SO2CH=CH2, --PO2Cl, --(CH2)xHal와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 작용성 그룹과 반응할 수 있는 특정의 PEG 유도체를 의미하는 페길화제를 사용하여 제조된다. 다른 구현예에서, 페길화제는, PEG 분자의 하나의 말단에서 단지 하나의 하이드록실 그룹이 접합에 이용가능한 이의 모노-메톡실화된 형태에서 일반적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 말단 둘다가 접합에 이용가능한 PEG의 이작용성 형태가, 예를 들어 단일의 PEG 잔기에 공유결합으로 부착된 2개의 펩타이드 또는 단백질 잔기와 함께 접합체를 수득하기에 요구되는 경우, 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 측쇄된 PEG는 R(PEG-OH)m(여기서, R은 펜타에리트리톨 또는 글리세롤과 같은 중심 코어 잔기를 나타내고, m은 측쇄 팔(branching arm)의 수를 나타낸다)로 나타낸다. 측쇄 팔(m)의 수는 3 내지 100개 이상의 범위일 수 있다. 다른 구현예에서, 하이드록실 그룹은 화학적 변형에 적용된다. 다른 구현예에서, 측쇄된 PEG 분자는, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 제6,113,906호, 제5,919,455호, 제5,643,575호, 및 제5,681,567호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 표준 페길화 과정에서와 같이, OXM에 직접 부착되지 않지만, 오히려 PEG 잔기가 Fmoc 또는 FMS와 같은 링커를 통해 부착된 PEG 잔기를 지닌 OXM을 제공한다. 다른 구현예에서, 링커는 염기에 대해 고도로 민감성이며 온화한 염기성 조건 하에서 제거가능하다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과 동등하게 활성이다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM보다 더 활성이다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS를 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM보다 상이한 활성을 포함한다. 다른 구현예에서, 유리 OXM과는 달리, Fmoc 또는 FMS을 통해 PEG에 연결된 OXM은 중추 신경계 활성을 갖지 않는다. 다른 구현예에서, 유리 OXM과는 달리, Fmoc 또는 FMS을 통해 PEG에 연결된 OXM은 혈액 뇌 장벽을 통해 뇌에 도입될 수 없다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS을 통해 PEG에 연결된 OXM은 유리 OXM과 비교하여 연장된 순환 반감기를 포함한다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS을 통해 PEG에 연결된 OXM은 Fmoc 또는 FMS 잔기와 함께 이의 PEG 잔기를 상실함으로써 유리 OXM을 회수한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 화학식 (X)n-Y의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다[여기서, Y는 유리 아미노, 카복실, 또는 하이드록실을 지닌 OXM의 잔기이고 X는 하기 식 (i)의 라디칼이고:
Figure 112014128350031-pct00001
다른 구현예에서, R1은 단백질 또는 중합체 담체 잔기를 함유하는 라디칼; 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 잔기이고; R2는 수소, 알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 아릴, 알크아릴, 아르알킬, 할로겐, 니트로, --SO3H, --SO2NHR, 아미노, 암모늄, 카복실, PO3H2, 및 OPO3H2로 이루어진 그룹 중에서 선택되고; R은 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 그룹 중에서 선택되며; R3 및 R4는 동일하거나 상이하고 수소, 알킬 및 아릴로 이루어진 그룹 중에서 각각 선택되고; A는, 라디칼이 OXM-Y의 아미노 또는 하이드록실 그룹에 연결된 경우 공유 결합이며; n은 적어도 1의 정수이다].
다른 구현예에서, 용어 "알킬", "알콕시", "알콕시알킬", "아릴", "알크아릴" 및 "아르알킬"은, 탄소수 1 내지 8, 바람직하게는 1 내지 4의 알킬 라디칼, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 및 부틸, 및 탄소수 6 내지 10의 아릴 라디칼, 예를 들면, 페닐 및 나프틸을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "할로겐"은 브로모, 플루오로, 클로로 및 요오도를 포함한다.
다른 구현예에서, R2, R3 및 R4는 각각 수소이고 A는 --OCO--, 즉 9-플루오레닐메톡시카보닐 라디칼(이후 "Fmoc")이다. 다른 구현예에서, R은 플루오렌 환의 2번 위치에서 --SO3H이고, R3 및 R4는 각각 수소이며, A는 --OCO--, 즉 2-설포-9-플루오레닐메톡시카보닐 라디칼(이후 "FMS")이다.
다른 구현예에서, OXM의 페길화 및 (PEG-Fmoc)n-OXM 또는 (PEG-FMS)n-OXM 접합체의 제조는 MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를 OXM의 아민 성분에 부착시킴으로써 MAL-FMS-OXM 또는 MAL-Fmoc-OXM 접합체를 수득한 후, PEG-SH를 말레이미드 잔기로 치환시켜 (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM 접합체를 각각 생산함을 포함한다.
다른 구현예에서, OXM의 페길화는 MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를 PEG-SH와 반응시킴으로써, PEG-FMS-NHS 또는 PEG-Fmoc-NHS 접합체를 형성시킨 후, 이를 OXM의 아민 성분과 반응시켜 목적한 (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM 접합체를 각각 생성함을 포함한다. 다른 구현예에서, OXM과 같은 펩타이드/단백질의 페길화는, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된, 미국 특허 제7585837호에 기술되어 있다. 다른 구현예에서, Fmoc 또는 FMS을 지닌 OXM과 같은 펩타이드/단백질의 역-페길화는 미국 특허 제7585837호에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 어구 "장기간 작용하는 OXM" 및 "역 페길화된 OXM"은 상호교환적으로 사용된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 본원에 식: (PEG-FMS)n-OXM 또는 (PEG-Fmoc)n-OXM(여기서, n은 적어도 1의 정수이고, OXM은 적어도 하나의 아미노 그룹을 통해 FMS 또는 Fmoc 라디칼에 연결된다)에 의해 확인된 본원의 PEG-FMS-OXM 및 PEG-Fmoc-OXM으로 구성된다.
다른 구현예에서, OXM의 Lys12 또는 Lys30 또는 아미노 말단에 대한 PEG-Fmoc 또는 PEG-FMS의 접합은, OXM이 불활성화되도록 하지 않는다.
하나의 구현예에서, Lys12 변이체는 본원에 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 제공하는데 있어서 보다 더 효과적이다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 Lys30 변이체는 본원에 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 달성하는데 있어서 보다 더 효과적이다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 아미노 변이체는 본원에 제공된 다른 변이체보다 체중 조절을 달성하는데 있어서 보다 더 효과적이다.
하나의 구현예에서, Lys12 변이체는 본원에 제공된 다른 변이체보다 만성 당 조절을 달성하는데 있어서 보다 더 효과적이다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 Lys30 변이체는 본원에 제공된 다른 변이체보다 만성 당 조절을 달성하는데 있어서 보다 더 효과적이다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 아미노 변이체는 본원에 제공된 다른 변이체보다 당 조절을 달성하는데 있어서 보다 더 효과적이다.
치료학적 용도
다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 고혈당증을 예방하고, 혈당 조절을 개선하며, 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(하나의 구현예에서, 제2형 당뇨병), 인슐린-의존성 진성 당뇨병(하나의 구현예에서, 제1형 당뇨병), 및 임신성 진성 당뇨병, 또는 이의 어떠한 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 진성 당뇨병을 치료하는데 이용된다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 제2형 당뇨병을 치료하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 인슐린에 대한 민감성을 증가시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 인슐린 내성을 감소시키는데 이용된다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 식욕 억제에 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 포만감을 유도하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 감소에 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체지방 감소에 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체질량 지수의 감소에 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 식품 소비의 감소에 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 비만을 치료하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 비만과 관련된 진성 당뇨병을 치료하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 심박동수를 증가시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 기본 대사율(BMR)을 증가시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 에너지 소비를 증가시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 글루코즈 내성을 유도하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 당 조절을 유도하는데 이용된다. 하나의 구현예에서, 당 조절은 높지 않고/않거나 변동이 없는 혈당 수준 및/또는 높지 않고/않거나 변동이 없은 글리코실화된 헤모글로빈 수준을 말한다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 증가를 억제하는데 이용되며, 여기서 다른 구현예에서, 체중 증가는 지방 증가에 기인한다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 혈당 수준을 감소시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 열량 흡수를 감소시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 식욕을 감소시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 조절에 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 체중 감소를 유도 또는 촉진하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 요구되는 체중, 요구되는 체질량 지수, 요구되는 외형 및 양호한 건강 중의 어느 하나 이상을 유지하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 프로파일을 조절하는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 트리글리세라이드 수준을 감소시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 글리세롤 수준을 감소시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 아디포넥틴 수준을 증가시키는데 이용된다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 유리 지방산 수준을 감소시키는데 이용된다.
하나의 구현예에서, 용어 "의 수준을 감소시키는"은 원래의, 야생형, 정상 또는 대조군 수준과 비교하여 약 1 내지 10%의 감소를 말한다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 11 내지 20%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 21 내지 30%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 31 내지 40%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 41 내지 50%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 51 내지 60%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 61 내지 70%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 71 내지 80%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 81 내지 90%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 91 내지 95%이다. 다른 구현예에서, 상기 감소는 약 96 내지 100%이다.
하나의 구현예에서, 용어 "의 수준을 증가시키는" 또는 "연장시키는"은 원래의, 야생형, 정상 또는 대조군 수준과 비교하여 약 1 내지 10%의 증가를 말한다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 11 내지 20%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 21 내지 30%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 31 내지 40%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 41 내지 50%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 51 내지 60%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 61 내지 70%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 71 내지 80%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 81 내지 90%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 91 내지 95%이다. 다른 구현예에서, 상기 증가는 약 96 내지 100%이다.
다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 감소시키는데 이용된다. 하나의 구현예에서, 콜레스테롤 수준에 있어서의 감소는 천연의 OXM의 투여 후 관찰된 감소보다 더 크다. 하나의 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 60 내지 70%까지 저하시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 50 내지 100%까지 저하시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 25 내지 90%까지 저하시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 50 내지 80%까지 저하시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 콜레스테롤 수준을 40 내지 90%까지 저하시킨다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 HDL 콜레스테롤 수준을 증가시키는데 이용된다.
하나의 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 투여 과정에 걸쳐 효능에 있어서 유의적인 값소 없이 본원에 기술된 목적을 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 1일 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2 내지 6일 동안 효과적으로 남는다. 하나의 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 1주 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2주 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 3주 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 4주 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 6주 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 2개월 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 4개월 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 6개월 동안 효과적으로 남는다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 1년 이상 동안 효과적으로 남는다.
하나의 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은 본원에 기술된 목적에 사용될 수 있으며 제1 투여량의 투여 즉시 효과적일 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은, 2회 이상의 투여량이 투여된 후 효과적이다.
다른 구현예에서, 위에서 기술된 바와 같이 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법은 OXM에 의해 완화되고/되거나, 억제되고/되거나 치료될 수 있는 질병 또는 상태로 고생하는 사람 대상자에게 적용된다. 다른 구현예에서, 위에서 기술된 바와 같이 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법은 수의학적 방법이다. 다른 구현예에서, 위에서 기술된 바와 같이 본원에 제공된 PEG-Fmoc-OXM 및 PEG-FMS-OXM 변이체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 이용하는 방법은 농장 동물, 애완동물, 및 실험실 동물과 같은 동물에게 적용된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본 발명의 대상자는 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐, 말 등이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상자에게 치료학적 유효량의 본원에 제공된PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체를 투여함으로써 대상자에서 OXM에 의해 치료가능하거나 감소될 수 있는 질병을 치료하거나 감소시키는 단계를 포함하는, 대상자에서, OXM 또는 이를 포함하는 약제학적 제형에 의해 치료가능하거나 감소될 수 있는 질병을 치료하거나 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 구현예에서, 본원에 사용된 것으로서 OXM, "펩타이드" 또는 "단백질"은 천연의 펩타이드(분해 생성물, 합성적으로 합성된 단백질 또는 재조합체 단백질) 및 펩티도미메틱(전형적으로, 합성적으로 합성된 단백질), 및 또한 단백질 유사체이며, 일부 구현예에서 단백질이 체내에 있는 동안 훨씬 더 안정하거나 세포내로 보다 잘 침투할 수 있도록 하는 변형을 갖는 펩토이드 및 세미펩토이드(semipeptoid)이다.
다른 구현예에서, "PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체"는, FMS 또는 Fmoc가 Lys12에서 OXM에 결합된 PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체이다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체는, FMS 또는 Fmoc가 Lys30에서 OXM에 결합된 PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체이다. 다른 구현예에서, PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체는, FMS 또는 Fmoc가 아미노 말단에서 OXM에 결합된 PEG-Fmoc-OXM 및/또는 PEG-FMS-OXM 변이체이다.
다른 구현예에서, 변형은 N 말단 변형, C 말단 변형, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH를 포함하나 이에 한정되지 않는 펩타이드 결합 변형, 골격 변형, 및 잔기 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 펩티도미메틱 화합물을 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 본원에 완전히 설정되어 있는 바와 같이 참조로 포함된 문헌[참조: 예를 들면, Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)]에 명시되어 있다. 이와 관련된 추가의 세부사항은 이후에 제공된다.
다른 구현예에서, 펩타이드내 펩타이드 결합(-CO-NH-)은 치환된다. 일부 구현예에서, 펩타이드 결합은 N-메틸화된 결합(-N(CH3)-CO-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 에스테르 결합(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 케토메틸렌 결합(-CO-CH2-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 α-아자 결합(-NH-N(R)-CO-)[여기서, R은 특정 알킬, 예를 들면, 메틸, 카바 결합(-CH2-NH-)이다]에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 하이드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 티오아미드 결합(-CS-NH-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 올레핀성 이중 결합(-CH=CH-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 레트로 아미드 결합(-NH-CO-)에 의해 치환된다. 다른 구현예에서, 펩타이드 결합은 펩타이드 유도체(-N(R)-CH2-CO-)(여기서, R은 탄소 원자에서 천연적으로 나타나는 "정상"의 측쇄이다)에 의해 치환된다. 일부 구현예에서, 이들 변형은 펩타이드 쇄를 따라 결합의 어느 곳에서 및 심지어 동시에 수개(2 내지 3개의 결합)로 발생한다.
하나의 구현예에서, Trp, Tyr 및 Phe과 같은 단백질의 천연의 방향족 아미노산은 페닐글리신, TIC, 나프틸레라닌(Nol), Phe의 환-메틸화된 유도체, Phe 또는 o-메틸-Tyr의 할로겐화된 유도체와 같은 합성의 비-천연 산으로 치환된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 하나 이상의 변형된 아미노산 또는 하나 이상의 비-아미노산 단량체(예를 들면, 지방산, 복합체 탄수화물 등)를 포함한다.
야생형 OXM과 비교하여, 본 발명의 OXM 유도체 또는 변이체는 수개의 아미노산 치환을 함유하고/하거나 페길화되거나 달리는 변형(예를 들면, 재조합적으로 또는 화학적으로)될 수 있다.
본원에 제공된 OXM은 또한 상기 OXM 서열의 어떠한 유사체를 포함한다. 서열내 어떠한 하나 이상의 아미노산 잔기는 당해 분야에 잘 공지된 바와 같은 보존적 치환으로 독립적으로 치환할 수 있는데, 즉, 하나의 소수성 아미노산을 다른 것으로 대체하는 것과 같이, 아미노산을 유사한 화학적 유형 중의 하나로 대체할 수 있다. 달리는, OXM의 향상된 효과 또는 생물학적 활성을 생성하는 비-보존적 아미노산 돌연변이를 이룰 수 있다. 하나의 구현예에서, OXM은 디펩티딜 펩티다제 IV(DPP-IV)에 의한 절단 및 불활성화에 대해 내성이 되도록 변형된다. OXM의 유도체, 및 변이체 및 이를 생성하는 방법은 미국 특허원 공보 제2011/0152182호, 미국 특허원 공보 제2011/0034374호, 미국 특허원 공보 제2010/0144617호에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함되어 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 제공된 이중 GLP-1/글루카곤 수용체 효능제는 화학적으로 변형될 수 있다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 OXM은 화학적으로 변형될 수 있다. 특히, OXM의 아미노산 측쇄, 아미노 말단 및/또는 카복시 산 말단은 변형될 수 있다. 예를 들면, OXM은 알킬화, 이황화물 형성, 금속 복합체 형성, 아실화, 에스테르화, 아미드화, 질화, 산으로 처리, 염기로 처리, 산화 또는 환원 중 하나 이상을 겪을 수 있다. 이들 공정을 수행하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 특히, OXM은 저급 알킬 에스테르, 저급 알킬 아미드, 저급 디알킬 아미드, 산 부가염, 카복실레이트 염 또는 이의 알칼리 부가 염으로 제공된다. 특히, OXM의 아미노 또는 카복실 말단은 예를 들면, 에스테르화, 아미드화, 아실화, 산화 또는 환원에 의해 유도체화될 수 있다. 특히, OXM의 카복실 말단은 유도체화되어 아미드 잔기를 형성할 수 있다.
하나의 구현예에서, "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 천연적으로 존재하는 아미노산; 예를 들면, 하이드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 포함하는, 생체내에서 해독후 흔히 변형된 아미노산; 및 2-아미노아디프산, 하이드록실라이신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-루이신 및 오르니틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 일반적이지 않은 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다. 하나의 구현예에서, "아미노산"은 D- 및 L-아미노산 둘 다를 포함한다. 다른 합성 또는 변형된 아미노산도 또한 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM은, OXM이 가용성 형태임을 요구하는 치료제에서 이용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 이들의 하이드록실-함유 측쇄로 인하여 단백질 가용성을 증가시킬 수 있는 세린 및 트레오닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM은 표준 고체 상 기술을 사용함에 의한 것과 같이 생화학적으로 합성된다. 다른 구현예에서, 이들 생화학적 방법은 배타적인 고체 상 합성, 부분 고체 상 합성, 단편 압축, 또는 전통적인 용액 합성을 포함한다.
하나의 구현예에서, 고체상 OXM 합성은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며 존 모로우 스튜어트(John Morrow Stewart) 및 제니스 딜라하 영(Janis Dillaha Young)의 문헌[참조: Solid Phase Protein Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984)]에 추가로 기술되어 있다. 다른 구현예에서, 합성 단백질은 제조용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제되며[참조: Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.] 이의 조성은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 아미노산 서열 분석으로 확인될 수 있다.
다른 구현예에서, 재조합체 단백질 기술을 사용하여 본 발명의 OXM을 생성한다. 일부 구현예에서, 재조합체 단백질 기술은 본 발명의 다량의 OXM을 생성하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 재조합체 기술은 문헌[참조: Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 and Brogli et al., (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 and Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463]에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 본 발명의 OXM을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 합성한다. 일부 구현에에서, 본 발명의 OXM을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 시스-조절 서열(예를 들면, 프로모터 서열)의 전사적 조절을 포함하는, 발현 벡터내로 연결된다. 일부 구현예에서, 시스-조절 서열은 본 발명의 OXM의 구성적 발현을 지시하는데 적합하다.
하나의 구현예에서, 어구 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열(cDNA), 게놈성 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 상기의 조합)의 형태로 분리되어 제공되는 일본쇄 또는 이본쇄 핵산 서열을 말한다.
하나의 구현예에서, "상보성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 역 트랜스크립타제 또는 어떠한 다른 RNA 의존성 DNA 폴리머라제를 사용하여 전령 RNA의 역 전사로부터 생성되는 서열을 말한다. 하나의 구현예에서, 서열은 DNA 폴리머라제를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 후속적으로 증폭될 수 있다.
하나의 구현예에서, "게놈성 폴리뉴클레오타이드 서열"은 염색체로부터 기원한(분리된) 서열을 말하므로 이는 염색체의 연속된 부위를 나타낸다.
하나의 구현예에서, "복합체 폴리뉴클레오타이드 서열"은 적어도 부분적으로 상보성이고 적어도 부분적으로 게놈성인, 서열을 말한다. 하나의 구현예에서, 복합체 서열은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는데 요구되는 일부 외인성 서열, 및 또한 이들 사이에 삽입되는 일부 인트론 서열을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 인트론 서열은 다른 유전자를 포함하는 어떠한 공급원일 수 있으며, 전형적으로 보존된 스플라이싱 시그날 서열을 포함할 것이다. 하나의 구현예에서, 인트론 서열은 시스 작용성 발현 조절 성분을 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 PCR 기술, 또는 당해 분야의 기술자에게 공지된 어떠한 다른 방법 또는 과정을 사용하여 제조한다. 일부 구현예에서, 당해 과정은 2개의 상이한 DNA 서열의 연결을 포함한다(참조: 예를 들면, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).
하나의 구현예에서, 다양한 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주-발현 시스템으로 사용하여 본 발명의 OXM을 발현시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 이들은 단백질 암호화 서열을 함유하는 재조합체 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터; 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 재조합체 효모 발현 벡터로 혈질감염된 효모; 재조합체 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는, Ti 플라스미드와 같은 재조합체 플라스미드 발현 벡터로 형질감염된 식물 세포 시스템을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
하나의 구현예에서, 비-세균 발현 시스템(예를 들면, CHO 세포와 같은 포유동물 발현 시스템)을 사용하여 본 발명의 OXM을 발현시킨다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는데 사용된 발현 벡터는 CMV 프로모터 및 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터를 발현된 단백질에 대해 의도된 용도에 따라 유리하게 선택할 수 있다. 하나의 구현예에서, 다량의 OXM이 요구된다. 하나의 구현예에서, 단백질 생성물이 용이하게 정제되는 세포 배지 또는 세균의 주변 세포질내로 발현된 생성물을 지시하는, 가능하게는 소수성 시그날 서열과의 융합체로서, 높은 발현 수준의 단백질 생성물을 지시하는 벡터가 요구된다. 하나의 구현예에서, 특정의 융합 단백질을 특이적인 절단 부위를 사용하여 가공함으로써 단백질의 회수를 보조한다. 하나의 구현예에서, 이러한 조작에 대해 채택가능한 벡터는 이. 콜라이(E. coli) 발현 벡터의 pET 계열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다[참조: Studier et al., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
하나의 구현예에서, 효모 발현 시스템이 사용된다. 하나의 구현예에서, 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터를 미국 특허원 제5,932,447호에 기재된 바와 같이 효모 속에서 사용할 수 있다. 다른 구현예에서, 외부 DNA 서열의 효모 염색체내로의 통합을 촉진하는 벡터를 사용한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 발현 벡터는 예를 들면, 내부 리보솜 도입 부위(internal ribosome entry site: IRES)와 같은 단일 mRNA로부터의 수개의 단백질의 해독을 허용하는 추가의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 프로모터-키메라 단백질의 게놈성 통합을 위한 서열을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 포유동물 발현 벡터는 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 시판되는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, 프로메가(Promega)로부터 이용가능한 pCI, 스트라테겐(Strategene)으로부터 이용가능한 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, 클론테크(Clontech)로부티 이용가능한 pTRES, 및 이들의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 레트로바이러스와 같은 진핵세포 바이러스로부터의 조절 성분을 함유하는 발현 벡터를 본 발명에서 사용한다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 다른 구현예에서, 소 파필로마 바이러스로부터 기원한 벡터는 pBV-1MTHA이고, 엡슈타인 바르 바이러스(Epstein Bar virus)로부터 기원한 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 얼리 프로모터(early promoter), SV-40 레이트 프로모터(later promoter), 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스 프로모터, 로우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포속에서의 발현에 효과적인 것으로 입증된 다른 프로모터의 지시하에 단백질의 발현을 허용하는 어떠한 다른 벡터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 식물 발현 벡터가 사용된다. 하나의 구현예에서, OXM을 암호화하는 서열의 발현은 다수의 프로모터에 의해 구동된다. 다른 구현예에서, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터와 같은 바이러스 프로모터[참조: Brisson et al., Nature 310:511-514 (1984)], 또는 TMV에 대한 피복 단백질 프로모터[참조: Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-311 (1987)]가 사용된다. 다른 구현예에서, RUBISCO의 작은 소단위[참조: Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); and Brogli et al., Science 224:838-843 (1984)] 또는 열 쇼크 프로모터, 예를 들면, 대두 hsp17.5-E 또는 hsp17.3-B[참조: Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]와 같은 식물 프로모터가 사용된다. 하나의 구현예에서, 작제물은 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접적인 DNA 형질전환, 미세주사, 전기천공 및 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 다른 기술을 사용하여 식물 세포내로 도입된다. 예를 들면, 문헌[참조: Weissbach & Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]을 참조한다. 당해 분야에 익히 공지된, 곤충 및 포유동물 숙주 세포 시스템과 같은 다른 발현 시스템을 또한 본 발명에서 사용할 수 있다.
삽입된 암호화 서열(단백질을 암호화하는)의 전사 및 해독을 위한 필수 성분을 함유하는 것 외에, 본 발명의 발현 작제물은 또한 발현된 단백질의 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 활성을 최적화하기 위해 가공된 서열을 포함할 수 있음을 인지할 것이다.
일부 구현예에서, 각종 방법을 사용하여 본 발명의 발현 벡터를 숙주 세포 시스템내로 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 일반적으로 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]에 기술되어 있으며, 예를 들면, 안정하거나 일시적인 형질감염, 지질감염, 전기천공 및, 재조합체 바이러스 벡터를 사용한 감염을 포함한다. 또한, 양성-음성 선택 방법을 위해 미국 특허 제5,464,764호 및 제5,487,992호를 참조한다.
하나의 구현예에서, 형질전환된 세포를 다량의 재조합체 OXM의 발현을 허용하는 유효 조건하에 배양한다. 다른 구현예에서, 효과적인 배양 조건은 단백질 생산을 허용하는 유효 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 구현예에서, 유효 배지는, 세포를 배양하여 본 발명의 재조합체 OXM을 생산하는 특정 배지를 말한다. 또 다른 구현예에서, 유효 배지는 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원, 및 적절한 염, 무기물, 금속 및, 비타민과 같은 다른 영양소를 갖는 수용액를 전형적으로 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 세포는 통상의 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험 튜브, 미세역가 디쉬 및 페트리 플레이트 속에서 배양할 수 있다. 다른 구현예에서, 배양은 재조합체 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행한다. 다른 구현예에서, 배양 조건은 당해 분야의 통상의 기술자의 경험내에 있다.
하나의 구현예에서, 생산에 사용된 벡터 및 숙주 시스템에 따라서, 본 발명의 수득되는 OXM은 재조합체 세포내에 남거나, 발효 배지내로 분비되거나, 2개의 세포막 사이의 공간, 예를 들면, 이. 콜라이의 주변세포질 공간내로 분비되거나; 세포 또는 바이러스 막의 외부 표면에 보유된다.
하나의 구현예에서, 소정의 배양 시간 후, 재조합체 OXM의 회수를 수행한다.
하나의 구현예에서, 본원에 사용된 어구 "재조합체 OXM을 회수하는"은 OXM을 함유하는 전체 발효 배지를 수집하는 것을 말하며 분리 또는 정제의 추가의 단계를 내포할 필요는 없다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM은 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing) 및 차등 가용화와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제한다.
하나의 구현예에서, 회수를 촉진시키기 위해, 발현된 암호화 서열을 본 발명의 단백질을 암호화하도록 가공하여 절단가능한 잔기에 융합시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 융합 단백질을 설계함으로써 단백질을 친화성 크로마토그래피; 예를 들면, 절단가능한 잔기에 특이적인 컬럼상에 고정화시킴으로써 용이하게 분리할 수 있다. 하나의 구현예에서, 절단 부위를 단백질과 절단가능한 잔기 사이에서 가공하고 단백질을 적절한 효소 또는 당해 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 제제로 처리함으로써 크로마토그래피 컬럼으로부터 방출시킬 수 있다[참조: 예를 들면, Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); and Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)]. 다른 구현예에서, 본 발명의 OXM은 "실질적으로 순수한" 형태로 회복된다. 다른 구현예에서, 어구 "실질적으로 순수한"은 본원에 기술된 출원에서 OXM의 효과적인 사용을 허용하는 순도를 말한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 OXM은 또한 시험관내 발현 시스템을 사용하여 합성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 시험관내 합성 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 당해 시스템의 성분은 시판된다.
다른 구현예에서, 시험관내 결합 활성은 본원에 기술된 바와 같은 천연의, 재조합체 및/또는 역 페길화된 OXM 및 또한 이를 포함하는 약제학적 조성물의 진성 당뇨병, 비만, 섭식 장애, 대사 장애 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 질병 또는 상태를 치료하거나 완화시키는 능력을 측정함으로써 확인한다. 다른 구현예에서, 생체내 활성은 치료되는 질병의 공지된 척도로 추론한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 OXM 펩타이드의 투여량은 주사가능한 용액 중 0.005 내지 0.1 밀리그람/kg을 포함한다. 다른 구현예에서, 이는 0.005 내지 0.5 밀리그람/kg의 OXM 펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여량은 0.05 내지 0.1 밀리그람의 OXM 펩타이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 투여량은 주사가능한 용액 속에 0.005 내지 0.1 밀리그람/kg의 OXM 펩타이드를 포함한다.
다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 1일 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 36시간마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 48시간마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 60시간마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 72시간마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 84시간마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 96시간마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 5일마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 6일마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 7일마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 8 내지 10일마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 10 내지 12일마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 12 내지 15일마다 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM의 투여량은 매 15 내지 25일마다 1회 투여된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV) 주사로 주당 1회 투여된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 그 자체가 개인 등에 제공될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 개인에게 약제학적 조성물의 일부로서 제공될 수 있으며, 여기서 이는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합된다.
다른 구현예에서, "약제학적 조성물"은 본원에 기술된 장기간 작용하는 OXM과 생리학적으로 적합한 담체 또는 부형제와 같은 다른 화학 성분의 제제를 말한다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체에 화합물의 투여를 촉진시키는 것이다. 다른 구현에에서, 역 페길화된 OXM은 생리학적 효과에 대해 책임이 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 어느 것도 적어도 역 페길화된 OXM을 포함할 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 조합된 제제를 제공한다. 하나의 구현예에서, "조합된 제제"는, 위에 정의된 바와 같은 조합 파트너를 독립적으로 또는 조합 파트너의 구별된 양과의 상이한 고정된 조합을 사용함으로써 동시에, 함께, 별도로 또는 순차적으로 투여할 수 있다는 의미에서 "키트 부분(kit of parts)"으로 정의한다. 일부 구현예에서, 키트 부분중의 부분은 이후에, 예를 들면 키트 부분의 특정 부분에 대해 동일하거나 상이한 시간 간격으로 및 상이한 시점에서 연대순으로 시차를 두거나 동시 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 조합 파트너의 전체 양의 비를 조합 제제로 투여할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조합된 제제는 예를 들면, 치료될 환자 소집단의 요구 또는 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 이루어질 수 있는 특수 질병, 질병의 중증도, 연령, 성별, 또는 체중에 기인할 수 있는, 단일 환자의 요구를 처리하기 위해 변할 수 있다.
다른 구현예에서, 상호교환적으로 사용된 어구 "생리학적으로 허용되는 담체" 및 "약제학적으로 허용되는 담체"는 유기체에 유의적인 자극을 유발하지 않으며 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 담체를 말한다. 보조제는 이들 어구하에 포함된다. 하나의 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체 속에 포함된 성분 중 하나는 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 유기 및 수성 매질 둘 다에서 광범위한 가용성을 지닌 생접합성 중합체일 수 있다[참조: Mutter et al. (1979)].
다른 구현예에서, "부형제"는 장기간 작용하는 OXM의 투여를 추가로 촉진시키기 위해 약제학적 조성물에 첨가된 불활성 물질을 말한다. 하나의 구현예에서, 부형제는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당 및 전분 유형, 셀룰로즈 유도체, 젤라틴, 야채 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약물을 제형화하고 투여하기 위한 기술은 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition)에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 펩타이드의 적합한 투여 경로는 예를 들면, 경구, 직장, 경점막, 경비강, 장 또는 근육내, 피하 및 골수내 주사를 포함하는 비경구 전달 및 수막내, 직접적인 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 또는 안구내 주사를 포함한다.
본 발명은 또한 위에서 기술된 치료 방법 중의 어느 것을 위해 뇌로 말초 경로에 의해 투여하기 위한 의약의 제조시 사용하기 위한 역 페길화된 OXM을 포함한다. 말초 경로의 예는 경구, 직장, 비경구, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 또는 복강내, 점막, 예를 들면, 볼내, 설하, 비강, 피하 또는 흡입에 의한 투여를 포함하는, 경피 투여를 포함한다. 의약용의 OXM의 바람직한 투여량은 하기 제공된다.
본 발명은 역 페길화된 OXM 및 약제학적으로 적합한 담체를 포함하는, 경구, 직장, 비경구, 예를 들면, 정맥내, 근육내, 또는 복강내, 점막, 예를 들면, 볼내, 설하, 비강, 피하 또는 흡입에 의한 투여를 포함하는 경피 투여에 적합한 형태의 약제학적 조성물을 제공한다. 단위 용량형에서, 단위당 투여량은 예를 들면, 후술된 바와 같거나 하기 제공된 kg 투여량에 대한 것을 기준으로 계산한 바와 같을 수 있다.
다른 구현예에서, 당해 제제는 전신계 방식보다는 국소, 예를 들면, 환자에 신체의 특수 부위내로 직접 제제의 주사를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 비강내 투여형으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 주사가능한 용량형으로 제형화된다.
용량 범위의 다양한 양태가 본 발명에 의해 고려된다: 역 페길화된 OXM 조성물내의 OXM 펩타이드 성분은 3일 당 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위(PEG의 크기가 실질적으로 상이할 수 있는 때문에 역 상 페길화된 OXM 조성물내 OXM의 중량만이 제공된다)로 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내의 OXM 펩타이드 성분은 7일당 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM 펩타이드 성분은 10일 당 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM 펩타이드 성분은 14일 당 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 투여된다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, 역 페길화된 OXM 조성물 중의 OXM의 유효량은 유리 OXM의 유효량의 1/4 내지 1/10이다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을 유리 OXM과 비교하여 적어도 50% 제한할 수 있도록 한다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을 유리 OXM과 비교하여 적어도 70% 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을 유리 OXM과 비교하여 적어도 75% 제한할 수 있다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을 유리 OXM과 비교하여 적어도 80% 제한할 수 있도록 한다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을 유리 OXM과 비교하여 적어도 85% 제한할 수 있도록 한다. 다른 구현예에서, 예측하지 못하게, OXM의 역 페길화는 환자에게 처방된 OXM의 양을 유리 OXM과 비교하여 적어도 90% 제한할 수 있도록 한다.
다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM 펩타이드 성분은 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 매 3일마다 1회(PEG의 크기가 실질적으로 상이할 수 있기 때문에 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM의 중량만이 제공된다)로 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM 펩타이드 성분은 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 매 7일마다 1회로 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM 펩타이드 성분은 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 매 10일마다 1회로 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM 조성물내 OXM 펩타이드 성분은 0.01 내지 0.5 밀리그람/kg의 체중의 범위로 매 14일마다 1회로 투여된다.
다른 구현예에서, 유리 OXM과 비교하여 역 페길화된 OXM은 유효 투여 빈도를 적어도 2배 감소시키고 유효 주당 투여량을 적어도 2배 감소시킴으로써, OXM 치료요법의 사용으로 인한 부작용의 위험을 제한하고 순응도를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 유리 OXM과 비교하여 역 페길화된 OXM은 유효 투여 빈도를 적어도 3배 감소시키고 유효 주당 투여량을 적어도 3배 감소시킴으로써, OXM 치료요법의 사용으로 인한 부작용의 위험을 제한하고 순응도를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 유리 OXM과 비교하여 역 페길화된 OXM은 유효 투여 빈도를 적어도 4배 감소시키고 유효 주당 투여량을 적어도 4배 감소시킴으로써, OXM 치료요법의 사용으로 인한 부작용의 위험을 제한하고 순응도를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 유리 OXM과 비교하여 역 페길화된 OXM은 유효 투여 빈도를 적어도 5배 감소시키고 유효 주당 투여량을 적어도 5배 감소시킴으로써, OXM 치료요법의 사용으로 인한 부작용의 위험을 제한하고 순응도를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 유리 OXM과 비교하여 역 페길화된 OXM은 유효 투여 빈도를 적어도 6배 감소시키고 유효 주당 투여량을 적어도 6배 감소시킴으로써, OXM 치료요법의 사용으로 부작용의 위험을 제한하고 순응도를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 유효 투여 빈도 및 유효 주당 투여량은 (1) 역 페길화된 OXM 조성물내 투여된 OXM 성분의 중량; 및 (2) 유리 OXM(변형되지 않은 OXM) 조성물내 투여된 OXM 성분의 중량을 기본으로 한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 OXM 치료요법이 요구되는 만성 질병으로 고생하는 환자의 순응도를 증가시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 후술되는 바와 같이 OXM을 역 페길화함으로써 OXM의 투여 빈도에 있어서 감소를 가능하도록 한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 OXM의 투여 빈도를 감소시킴으로써 OXM 치료요법이 요구되는 환자의 순응도를 증가시킴을 포함한다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에 있어서의 감소는, OXM이 보다 안정하고 보다 강력하도록 하는 역 페길화에 의해 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에 있어서의 감소는 OXM의 T1/2을 증가시킨 결과로 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에 있어서의 감소는 OXM의 혈액 청소를 감소시킨 결과로서 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에 있어서의 감소는 OXM의 T1/2을 증가시킨 결과로서 달성된다. 다른 구현예에서, OXM의 투여 빈도에 있어서의 감소는 OXM의 AUC 척도를 증가시킨 결과로서 달성된다.
다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 1일 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 2일 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 3일 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 4일 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 5일 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 6일 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매주 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 7 내지 14일에 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 10 내지 20일에 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 5 내지 15일에 1회 대상자에게 투여된다. 다른 구현예에서, 역 페길화된 OXM은 매 15 내지 30일에 1회 대상자에게 투여된다.
하나의 구현예에서, 경구 투여는 정제, 캅셀제, 로젠지제, 저작가능한 정제, 현탁제, 유제 등을 포함하는 단위 용량형을 포함한다. 이러한 단위 용량형은 안정하고 유효한 양의 본 발명의 OXM을 포함하며, 이들 각각은 하나의 양태에서, 약 0.7 또는 3.5 mg 내지 약 280 mg/70 kg이거나, 다른 구현예에서, 약 0.5 또는 10 mg 내지 약 210 mg/70 kg이다. 경구 투여용 단위 용량형의 제제에 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 정제는 전형적으로 탄산칼슘, 탄산나트륨, 만니톨, 락토즈 및 셀룰로즈와 같은 불활성 희석제; 전분, 젤라틴 및 슈크로즈와 같은 결합제; 전분, 알긴산 및 크로스카멜로즈와 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘, 스테아르산 및 활석과 같은 윤활제와 같은 통상의 약제학적으로 혼화성인 보조제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 이산화규소와 같은 활주제를 사용하여 분말-혼합물의 유동 특성을 개선시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, FD&C 염료와 같은 착색제를 외형을 위해 가할 수 있다. 아스파르탐, 사카린, 멘톨, 페퍼민트, 및 과일 풍미와 같은 감미제 및 풍미제가 저작가능한 정제용으로 유용한 보조제이다. 캅셀제는 전형적으로 위에서 기재한 하나 이상의 고체 희석제를 포함한다. 일부 구현예에서, 담체 성분의 선택은 맛, 비용, 및 저장 안전성과 같은 제2의 고려사항에 의존하며, 이는 본 발명의 목적에 중요하지 않으며, 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서, 경구 용량형은 예정된 방출 프로파일을 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 경구 용량형은 연장된 방출 정제, 캅셀제, 로젠지제 또는 저작가능한 정제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 경구 용량형은 서방성 정제, 캅셀제, 로젠지제 또는 저작가능한 정제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 경구 용량형은 속방성 정제, 캅셀제, 로젠지제 또는 저작가능한 정제를 포함한다. 하나의 구현예에서, 경구 용량형은 당해 분야에 공지된 바와 같이 장기간 작용하는 OXN의 바람직한 방출 프로파일에 따라 제형화된다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 조성물은 액제 또는 유제를 포함하며, 이는 다른 구현예에서 안전하고 유효한 양의 본 발명의 화합물 및 임의로, 국소적 비강내 투여용으로 의도된 다른 화합물을 포함하는 수성 액제 또는 유제이다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.001% 내지 약 10.0% w/v의 대상 화합물, 보다 바람직하게는 약 00.1% 내지 약 2.0을 포함하며, 이는 비강내 경로로 화합물을 전신계 전달하기 위해 사용된다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 액체 제제의 정맥내, 동맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여된다. 다른 구현예에서, 액체 제형은 액제, 현탁제, 산제, 유제, 오일 등을 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여되므로, 정맥내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 동맥내 투여되므로, 동맥내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 근육내로 투여되므로, 근육내 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다.
또한, 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 체표면에 국소 투여되므로, 국소 투여용으로 적합한 형태로 제형화된다. 적합한 국소 제형은 겔제, 연고제, 크림제, 로션제, 점적제 등을 포함한다. 국소 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 약제학적 담체가 들어있거나 없는 생리학적으로 허용되는 희석제 속에 액제, 현탁제, 또는 유제로 제조되고 적용된 추가의 적절한 치료제 또는 제제와 조합된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면, 통상의 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 분쇄, 유화, 봉입, 포괄(entrapping) 또는 동결건조 공정의 수단에 의해, 당해 분야에 잘 공지된 공정으로 제조된다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 OXM을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제내로 가공하는 것을 촉진하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 사용하는 통상의 방식으로 제형화된다. 하나의 구현예에서, 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 주사제는 수용액 속에 제형화된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 주사제는 핸크스 용액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 혼화성인 완충제 속에 제형화된다. 일부 구현예에서, 경점막 투여를 위해, 투과될 장벽에 적절한 침투제를 제형 속에서 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 제제는 예를 들면, 볼내 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 주사용 제형은 예를 들면, 임의로 첨가된 방부제가 들어있는 앰플 또는 다중투여량 용기 속의 단위 용량형 속에 제공한다. 다른 구현예에서, 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 속의 현탁제, 액제 또는 유제이며, 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유한다.
다른 구현예에서, 조성물은 또한 벤즈알코늄 클로라이드 및 티메로살 등과 같은 방부제; 에데테이트 나트륨 및 기타의 것과 같은 킬레이트제; 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트와 같은 완충제; 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨 및 기타의 것과 같은 강직성 제제; 아스코르브산, 아세틸시스테인, 나트륨 메타비설페이트 및 기타의 것과 같은 항산화제; 방향족 제제; 셀룰로즈 및 이의 유도체를 포함하는 중합체와 같은 점도 조절제; 및 폴리비닐 알코올 및, 필요에 따라 이들 수성 조성물의 pH를 조절하기 위한 산 및 염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 또한 국소 마취제 또는 다른 활성제를 포함한다. 조성물은 스프레이제, 분무제, 점적제 등으로서 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 비경구 투여용 약제학적 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다 추가로, 일부 구현예에서, 장기간 작용하는 OXM의 현탁제는 주사 현탁제를 기본으로 한 적절한 오일성 또는 물로서 제조된다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클을 일부 구현예에서, 참깨 오일과 같은 지방 오일, 또는 에틸 올레에이트, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테를 포함한다. 수성 주사 현탁제는 일부 구현예에서, 현탁제의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유한다. 다른 구현예에서, 현탁제는 또한 장기간 작용하는 OXM의 용해도를 증가시키는 제제 또는 적합한 안정화제를 함유함으로써 고 농축된 액제를 제조하도록 한다.
다른 구현예에서, 활성 화합물은 비히클, 특히 리포좀으로 전달될 수 있다[참조: Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로 앞서 언급한 문헌 참조].
다른 구현예에서, 조절된 방출 시스템 속에 전달된 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 이식가능한 삼투압 펌프, 경피 패취, 리포좀, 또는 다른 투여 방식을 위해 제형화된다. 하나의 구현예에서, 펌프가 사용된다[참조: Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)]. 다른 구현예에서, 중합성 물질이 사용될 수 있다. 여전히 다른 구현예에서, 조절된 방출 시스템은 치료학적 표적, 즉, 뇌에 근접하게 위치함으로써 전신 투여량의 분획만을 필요로 한다[참조: 예를 들면, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). 다른 조절된 방출 시스템은 Langer( (Science 249:1527-1533 (1990))에 의한 검토사항에서 논의된다.
하나의 구현예에서, 장기간 작용하는 OXM은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균된, 발열물질이 없는 수계 용액을 사용한 구성을 위한 산제형이다. 조성물은 일부 구현예에서, 미립자화 및 흡입 투여용으로 제형화된다. 다른 구현예에서, 조성물은 부착된 미립자화 수단이 있는 용기 속에 함유된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 제제는 좌제 또는 보류 관장제와 같은 직장 조성물 속에, 예를 들면, 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌제 기재를 사용하여 제형화된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 내용에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은, 장기간 작용하는 OXM이 의도된 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 다른 구현예에서, 치료학적 유효량은 질병의 증상을 예방하거나, 완화시키거나 경감시키거나 치료하는 대상자의 생존을 연장시키는데 효과적인 장기간 작용하는 OXM의 양을 의미한다.
하나의 구현예에서, 치료학적 유효량의 측정은 당해 분야의 숙련가의 능력내에 있다.
조성물은 또한 벤즈알코늄 클로라이드 및 티메로살 등과 같은 방부제; 에데테이트 나트륨 및 기타의 것과 같은 킬레이트제; 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트와 같은 완충제; 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 무기질 및 기타의 것과 같은 강직성 제제; 아스코르브산, 아세틸시스테인, 나트륨 메타비설페이트 및 기타의 것과 같은 항산화제; 방향족 제제; 셀룰로즈 및 이이 유도체를 포함하는, 중합체와 같은 점도 조절제; 및, 폴리비닐 알코올 및 필요한 경우 이들 수성 조성물의 pH를 조절하기 위한 산 및 염기를 포함한다. 조성물은 또한 국소 마취제 또는 다른 활성제를 포함한다. 조성물은 분무제, 연무제, 점적제 등으로 사용할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체 또는 이의 성분으로서 제공될 수 있는 물질의 일부 예는 락토즈, 글루코즈 및 슈크로즈와 같은 당; 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 및 메틸 셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 및 이의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 스테아르산 및 스테아르산마그네슘과 같은 고체 윤활제; 황산칼슘; 땅콩 오일, 면화씨 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마(theobroma)의 오일과 같은 야채 오일; 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산; TweenTM 상표 유화제와 같은 유화제; 나트륨 라우릴 설페이트와 같은 습윤제; 착색제; 풍미제; 타정제, 안정화제; 항산화제; 방부제, 발열물질이 없는 물; 등장성 염수; 및 포스페이트 완충제 용액이다. 화합물과 함께 사용될 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은, 화합물이 투여될 방식에 의해 기본적으로 결정된다. 대상 화합물이 주사되는 경우, 하나의 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체는, pH가 약 7.4로 조절된, 혈액-혼화성 현탁화제가 들어있는, 멸균된, 생리학적 염수이다.
또한, 조성물은 결합제(예를 들면, 아카시아, 옥수수전분, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로즈, 구아 검, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로즈, 포비돈), 붕해제(예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 이산화규소, 크로스카멜로즈 나트륨, 크로스포비돈, 구아 검, 나트륨 전분 글리콜레이트), 다양한 pH 및 이온 강도의 완충제(예를 들면, 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), 표면에 대한 흡착을 방지할 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 세제(예를 들면, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙산 염), 프로테아제 억제제, 표면활성제(예를 들면, 나트륨 라우릴 설페이트), 투과 증진제, 가용화제(예를 들면, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 나트륨 메타비설파이트, 부틸화된 하이드록시아니솔), 안정화제(예를 들면, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈), 점도 증가제(예를 들면, 카보머, 콜로이드성 이산화규소, 에틸 셀룰로즈, 구아 검), 감미제(예를 들면, 아스파르탐, 시트르산), 방부제(예를 들면, 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 윤활제(예를 들면, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트), 유동 보조제(예를 들면, 콜로이드성 이산화규소), 가소제(예를 들면, 디에틸 프탈레이트, 트리에틸 시트레이트), 유화제(예를 들면, 카보머, 하이드록시프로필 셀룰로즈, 나트륨 라우릴 설페이트), 중합체 피복물(예를 들면, 폴록사머 또는 폴록사민), 피복 및 필름 형성제(예를 들면, 에틸 셀룰로즈, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트) 및/또는 보조제를 추가로 포함한다.
시럽, 엘릭시르제, 유제 및 현탁제용 담체의 대표적인 성분은 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 슈크로즈, 소르비톨 및 물을 포함한다. 현탁제의 경우, 대표적인 현탁제는 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈, 셀룰로즈(예를 들면, AvicelTM, RC-591), 트라가칸트 및 나트륨 알기네이트를 포함하며; 대표적인 습윤제는 레시틴 및 폴리에틸렌 옥사이드 소르비탄(예를 들면, 폴리소르베이트 80)을 포함한다. 대표적인 방부제는 메틸 파라벤 및 나트륨 벤조에이트를 포함한다. 다른 구현예에서, 경구 액체 조성물은 또한 상기 기재된 감미제, 풍미제 및 착색제와 같은 하나 이상의 성분을 함유한다.
조성물은 또한 폴리락트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등과 같은 중합체성 화합물의 미립자 제제내로 또는 위에, 또는 리포좀, 미세유제, 미셀(micelle), 단일라멜라(unilamellar) 또는 다중라멜라(multilamellar) 소낭, 적혈구 미세량, 또는 원형질체 위로 활성 물질의 포함을 포함한다. 이러한 조성물은 물리적 상태, 가용성, 안정성, 생체내 방출률, 및 생체내 청소율에 영향을 미칠 것이다.
또한 중합체(예를 들면, 폴록사머 또는 폴록사민)로 피복된 입자화된 조성물 및 조직-특이적인 수용체, 리간드 또는 항원에 대해 지시된 항체에 커플링되거나 조직-특이적인 수용체의 리간드에 커플링된 화합물이 본 발명에 의해 고려된다.
하나의 구현예에서, 화합물은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 카복시메틸 셀룰로즈, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린의 공중합체의 공유결합성 부착에 의해 개질된다. 다른 구현예에서, 개질된 화합물은 상응하는 개질되지 않은 화합물보다 정맥내 주사 후 혈액 속에서 실질적으로 보다 긴 반감기를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 개질은 또한 수용액 속에서 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집을 제거하며, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 향상시키고, 화합물의 면역원성 및 반응성을 감소시킨다. 다른 구현예에서, 목적한 생체내 생물학적 활성은 이러한 중합체-화합물을 개질되지 않은 화합물보다 훨씬 덜 흔하게 또는 보다 적은 투여량으로 투여함으로써 달성된다.
다른 구현예에서, 유효량 또는 투여량의 제조는 시험관내 검정으로부터 초기에 추정할 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여량은 동물 모델에서 제형화될 수 있으며 이러한 정보를 사용하여 사람에서 유용한 투여량을 보다 정밀하게 측정할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 장기간 작용하는 OXM의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 또는 실험실 동물에서 시험관내 표준 약제학적 과정으로 측정할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이들로부터 시험관내 및 세포 배양 검정 및 동물 연구에서 수득된 데이타를 사람에서 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 용량은 사용된 용량형 및 이용된 투여 경로에 따라 변한다. 하나의 구현예에서, 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 관점에서 개개 주치의가 선택할 수 있다[참조: 예를 들면, Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1].
하나의 구현예에서, 치료되는 상태의 중증도 및 반응성에 따라, 투여량은 수일 내지 수주 또는 치유가 수행되거나 질병의 약화가 달성될 때까지 지속되는 치료 과정과 함께 단일 또는 다수의 투여일 수 있다.
하나의 구현예에서, 투여될 조성물의 양은 물론 치료되는 대상자, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방하는 주치의의 판단 등에 의존할 것이다.
하나의 구현예에서, 양립될 수 있는 약제학적 담체 속에 제형화된 본 발명의 제제를 포함하는 조성물을 또한 제조하여, 적절한 용기 속에 두고, 나타낸 조건의 치료를 위해 표지한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 역 페길화된 OXM은 전신 투여를 통해 투여된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 역 페길화된 OXM은 정맥내, 근육내 또는 피하 주사로 투여된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 역 페길화된 OXM은 비이온성 표면 활성제(즉, 표면활성제), 각종 당, 유기 폴리올 및/또는 사람 혈청 알부민과 같은 복합체 유기 부형제 및 안정화제와 함께 동결건조(즉, 동결-건조(freeze-dried))된 제제이다. 다른 구현에에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균 수 속에 처방된 것으로서 동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균 PBS 속에 처방된 것으로서 동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 주사용 멸균 0.9% NaCl 속에 처방된 것으로서 동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다.
다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM 및 사람 혈청 알부민, 폴리올, 당, 및 비이온성 표면 활성 안정화제와 같은 복합체 담체를 포함한다[참조: 예를 들면, WO 89/10756(Hara et al.- 폴리올 및 p-하이드록시벤조에이트 함유)]. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM 및 락토비온산 및 아세테이트/글리신 완충제를 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM 및 인터페론 조성물의 수중 용해도를 증가시키는 아르기닌 또는 글루타메이트와 같은 아미노산을 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 것으로서 동결건조된 역 페길화된 OXM 및 글리신 또는 사람 혈청 알부민(HSA), 완충제(예를 들면, 아세테이트) 및 등장성 제제(예를 들면, NaCl)을 포함한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 것으로서 동결건조된 역 페길화된 OXM 및 인산염 완충제, 글리신 및 HSA를 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 페길화되거나 역 페길화딘 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은, pH가 약 4 내지 7.2인 완충된 용액 속에 두는 경우 안정화된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 안정화제로서 아미노산 및 일부 경우에 염(아미노산이 하전된 측쇄를 함유하지 않는 경우)으로 안정화된다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 아미노산인 약 0.3 중량% 내지 5 중량%의 안정화제를 포함하는 액제 조성물이다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 투여 정밀성 및 생성물 안전성을 제공한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 주사가능한 적용에 사용하기 위한 생물학적으로 활성인, 안정한 액체 제형을 제공한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 본원에 기술된 것으로서 비-동결건조된 역 페길화된 OXM을 포함한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 투여하기 전에 저장 및 운송을 용이하게 하는 액체 상태로 장기간 보관을 할 수 있게 하는 액체 제형을 제공한다.
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 매트릭스 물질로서 고체 지질을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물은 매트릭스 물질로서 고체 지질을 포함한다. 다른 구현예에서, 분무 콘질링(spray congealing)에 의한 지질 미세입자의 생산은 스페이서(Speiser) 등의 문헌[참조: Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54]에 기술되어 있으며 경구 투여용 지질 나노펠렛에 의한 지질 미세입자의 생산은 문헌[참조: Speiser EP 0167825 (1990)]에 기술되어 있다. 다른 구현예에서, 사용되는 지질은 또한 신체에 의해 내성이다(예를 들면, 비경구 영양을 위한 유제 속에 존재하는 지방산으로 구성된 글리세라이드).
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀의 형태이다[참조: J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275].
다른 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 중합체성 미세입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 주사가능한 약제학적 조성물은 중합체성 거대입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 유제를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 미세구를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 양쪽 친매성 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 것으로서 역 페길화된 OXM을 포함하는 약제학적 조성물은 약물, 지질 매트릭스 및 표면활성제를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 지질 매트릭스는 적어도 50% w/w의 모노글리세라이드 함량을 갖는다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장기간 작용하는 OXM을 함유하는, 하나 이상의 단위 용량형을 함유하는, FDA 승인된 키트와 같은, 팩 또는 디스펜서 장치(dispenser device) 속에 제공된다. 하나의 구현예에서, 예를 들어, 팩은 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일을 포함한다. 하나의 구현예에서, 팩 또는 디스펜서 장치는 투여용 지시사항을 동반한다. 하나의 구현예에서, 팩 또는 디스펜서는 약제의 제조, 사용 또는 판매를 관리하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 용기와 연합된 주의사항을 동반하며, 당해 주의사항은 조성물의 형태 또는 사람 또는 동물 투여 형태의 정부기관에 의한 승인을 반영한다. 하나의 구현예에서, 이러한 주의사항은 처방 약물에 대한 또는 승인된 생성물 삽입물의 미국 식품 의약국이 승인한 표지이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 역 페길화된 OXM은 추가의 활성제와 함께 개인에게 제공되어 각각이 제제 자체를 사용한 치료와 비교하여 개선된 치료학적 효과를 달성할 수 있다. 다른 구현예에서, 측정(예를 들면, 상보성 제제의 용량 및 선택)은 조합 치료요법와 관련된 부정적인 부작용에 대하여 수행된다.
본 발명의 추가의 목적, 장점, 및 신규 특징은 제한하는 것으로 의도되지 않는, 다음의 실시예의 실험시 당해 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 또한, 위에서 상세히 기술되고 하기 특허청구범위 단락에서 특허청구된 것으로서 본 발명의 각종 양태 및 국면 각각은 다음의 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에서 이용된 실험 과정은 분자, 생화학, 미생물 및 재조합체 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에서 상세히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌: "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)을 참조하며; 이용가능한 면역검정은 특허 및 과학 문헌에 집중적으로 기술되어 있고, 예를 들면, 미국 특허 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; 문헌, "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)을 참조하며; 이들 모두는 참조로 포함되어 있다. 다른 일반적인 참조 문헌은 당해 문서 전체에서 제공된다.
물질 및 방법
PEG30-FMS-OXM 합성-이종
1.1 제1 단계: OXM 합성
다음의 펩타이드 서열로 이루어진 옥신토모둘린을 합성하였다:
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (서열 번호 1)
펩타이드를 펩타이드 쇄 조합(제조원: Almac Sciences, 스코틀랜드 소재)을 통해 Fmoc-전략을 사용하는 고체 상 방법으로 합성하였다.
펩타이드 서열은 다음 단계로 조립하였다:
1. 캡핑(Capping)
수지를 DMF(제조원: Rathburn) 중 0.5M 아세트산 무수물(제조원: Fluka) 용액을 사용하여 캡핑하였다.
2. 탈보호
Fmoc-보호 그룹을 DMF(제조원: Rathburn) 중 20% v/v 피페리딘(제조원: Rathburn) 용액을 사용하여 성장하는 펩타이드 쇄로부터 제거하였다.
3. 아미노산 커플링
DMF(제조원: Rathburn) 중 0.5M 아미노산(제조원: Novabiochem) 용액을 DMF(제조원: Rathburn) 중 1M HOBt(제조원: Carbosynth) 및 DMF(제조원: Rathburn)중 1M DIC(제조원: Carbosynth) 용액을 사용하여 활성화시켰다. 4 당량의 각각의 아미노산을 커플링당 사용하였다.
조 펩타이드를 수지로부터 절단하여 트리이소프로필실란(제조원: Fluka), 물, 디메틸설파이드(제조원: Aldrich), 요오드화암모늄(제조원: Aldrich) 및 TFA(제조원: Applied Biosystems)의 칵테일(cocktail) 속에서 4시간 동안 교반하여 제거하였다. 조 펩타이드를 냉 디에틸 에테르로부터 침전에 의해 수집한다.
펩타이드 정제
조 펩타이드를 아세토니트릴(제조원: Rathburn)/물(제조원: MilliQ)(5:95) 속에 용해하고 제조용 HPLC 컬럼 위에 로딩한다. 크로마토그래피 매개변수는 다음과 같다:
컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 250mm x 30, 15μm, 300A
이동 상 A: 물 + 0.1% v/v TFA(제조원: Applied Biosystems)
이동 상 B: 아세토니트릴(제조원: Rathburn) + 0.1% v/v TFA(제조원: Applied Biosystems)
UV 검출: 214 또는 220 nm
구배: 4개 컬럼 용적에 걸쳐 25%B 내지 31%B
유동 속도 43mL/분
단계 2 - 링커 합성
반응도식 1 - MAL-FMS-NHS 링커의 합성
Figure 112014128350031-pct00002

화합물 2 내지 5의 합성은 문헌[참조: Albericio et al. in Synthetic Communication, 2001, 31(2), 225-232]에 기술된 과정을 기본으로 한다.
2-(Boc-아미노)플루오렌(2):
2-아미노플루오렌(18g, 99mmol)을 빙욕 속에서 디옥산:물(2:1)(200ml) 및 2N NaOH(60ml)의 혼합물 속에 자기 교반하면서 현탁시켰다. 이후에 Boc2O(109mmol, 1.1eq)을 가하고 RT에서 교반을 계속한다. 반응을 TLC(Rf=0.5, Hex./에틸 아세테이트 2:1)로 모니터링하고 pH를 2N NaOH를 첨가하여 9 내지 10으로 유지시켰다. 반응이 완료되면, 현탁액을 1M KHSO4로 pH = 3으로 산성화하였다. 고체를 여과하고 냉수(50ml), 디옥산-물(2:1)로 세척한 후 이를 다음 단계에 사용하기 전에 톨루엔으로 2회 공비(azeotroping)시켰다.
9-포르밀-2-(Boc-아미노)플루오렌(3):
3구 RBF 속에, NaH(오일 중 60%; 330mmol, 3.3eq)를 무수 THF (50ml) 속에 현탁시키고, 무수 THF (230ml)중 단계 2에 기술된 -(Boc-아미노)플루오린의 용액(28g; lOOmmol)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 진한 황색 슬러리가 관찰되었으며 혼합물을 질소하에 실온에서 10분 동안 교반하였다. 에틸 포르메이트(20.1 ml, 250mmol, 2.5eq)를 적가하였다(주의: 가스 방출). 슬러리는 담갈색 용액으로 변하였다. 용액을 20분 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(Rf=0.5, Hex./에틸 아세테이트 1 : 1)로 모니터링하고 단지 미량의 출발 물질만이 관찰된 경우, 이를 빙수(300ml)로 퀀칭(quenching)하였다. 혼합물을 감압하에 대부분의 THF가 제거될 때까지 증발시켰다. 수득되는 혼합물을 아세트산으로 pH=5가 되도록 처리하였다. 수득된 백색 침전물을 에틸 아세테이트 속에 용해하고 유기 층을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하고 모든 유기 층을 합하여 포화된 중탄산나트륨, 염수로 세척하고 MgSO4 위에서 건조시켰다. 여과하고 용매를 제거한 후 황색 고체를 수득하였다. 당해 물질을 다음 단계에서 사용하였다.
9-하이드록시메틸-2-(Boc-아미노)플루오렌 (4):
상기로부터의 화합물 3을 MeOH(200ml) 속에 현탁시키고 수소화붕소산나트륨을 15분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하였다(주의: 발열 반응 및 가스 방출). 반응을 TLC(Rf=0.5, Hex./EtOAc 1:1)로 모니터링하고 완료시켰다. 물(500ml)을 가하고 pH를 아세트산으로 5로 조절하였다. 후처리는 에틸 아세테이트를 사용한 2회 추출, 합한 유기 층을 중탄산나트륨 및 염수로 세척, MgSO4 위에서 건조, 여과 및 농축 건조를 포함하였다. 수득된 조 생성물을 헵탄/EtOAc(3:1)를 사용하는 플라스크 크로마토그래피로 정제하여 황색 발포체(36g, 97.5% 순도, 1H-NMR에서 관찰된 미량의 에틸 아세테이트 및 디에틸 에테르)를 수득하였다.
MAL-Fmoc-NHS (7):
깨끗한 무수 500ml RBF에 상부 교반하면서 무수 THF(55ml) 중 트리포스겐(1.58g, 0.35eq)을 충전하여 주위에서 용액을 형성시켰다. 이를 빙/수 욕을 사용하여 0℃로 냉각시키고 무수 THF(19ml) 중 NHS (0.67g, 0.38eq)의 용액을 질소하에 0℃에서 10분에 걸쳐 적가하였다. 수득되는 용액을 30분 동안 교반하였다. 무수 THF (36ml) 중 NHS (1.34g, 0.77eq)의 추가의 부위를 0℃에서 10분에 걸쳐 적가하고 15분 동안 교반하였다.
화합물 6(5.5g, leq), 무수 THF (55ml) 및 피리딘(3.07ml, 2.5eq)을 함께 교반하여 현탁액을 형성시켰다. 이를 NHS 용액에 0 내지 5℃에서 부분으로 가한 후 빙욕을 제거하여 RT가 되도록 하였다.
20 시간 후 반응을 중지시켰다(출발 물질이 여전히 존재하며, 반응을 밀어부쳐 완료하는 경우 흐릿한 불순물이 관찰되었다).
반응 혼합물을 여과하고, 여액에, 4% 염수(200ml) 및 EtOAc(200ml)를 가하였다. 분리 후, 유기 층을 5% 시트르산(220ml) 및 물(220ml)로 세척하였다. 이후에 유기 층을 농축시켜 7.67g의 조 MAL-Fmoc-NHS를 수득하였다. 물질을 사이클로헥산/EtOAc 구배 70:30 내지 40:60을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 진공하에 농축시켜 3.47g (45%)의 MAL-Fmoc-NHS를 수득하였다.
MAL-FMS-NHS
트리플루오로아세트산(10ml) 중 MAL-Fmoc-NHS (lOOmg, 0.2mmol)의 용액에, 클로로설폰산(0.5ml)을 가하였다. 15분 후, 빙냉 디에틸 에테르(90ml)를 가하고 생성물을 침전시켰다. 물질을 원심분리로 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하고 진공하에 건조시켰다. 41.3mg(35%)의 베이지색 고체를 수득하였다.
단계 3 - 접합
OXM 펩타이드(Lysl2, Lys30 및 아미노 말단)에서 3개 아민 부위의 이종 접합을 "1개 포트 반응"으로 수행하였으며, 여기서 각각의 성분: OXM, mPEG-SH 및 FMS 링커로부터의 1 eq을 pH 7.2에서 30분 동안 함께 혼합하였다. 반응은 아세트산을 가하여 pH를 4로 감소시킴으로써 중지시켰다.
PEG30-FMS-QXM 합성-동종
단계 1: 스페이서 - MAL-FMS-NHS (FMS) 합성: 이종 접합체에 대해 기술한 바와 같음.
단계 2: 옥신토모둘린(OXM) 합성:
N-말단 부위 지시된 OXM - 이종 접합체에 대해 위에서 기술된 바와 같음.
Lys12 또는 Lys30 부위 지시된 OXM - 커플링될 마지막 아미노산으로서 Boc-His(Boc)-OH 및 라이신의 12 또는 30번 위치의 Fmoc-Lys(ivDde)-OH를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 전략을 사용함.
단계 3: 동종 접합
OXM에 대한 FMS의 커플링:
MAL-FMS-NHS 링커 용액(0.746ml, DMF 중 lOmg/ml, 2eq)을 OXM 수지(leq, 200mg 수지, 31.998μmol/g의 유리 아민)에 가하였다. DMF를, 수지가 바로 자유로이 이동할 때까지 가한 후 19시간 동안 초음파처리하였다. 수지를 DMF 및 메탄올로 진공 건조기 속에서 밤새 건조시키기 전까지 세척하였다. 분해 칵테일은 TFA/TIS/H20를 함유하였다. 분해를 실온에서 3.5시간에 걸쳐 수행하였다. 수지를 여과한 후, FMS-OXM을 냉 디에틸 에테르 속에서 침전시켰다. 42.1mg의 조 FMS-OXM(36% 순도)을 분해 단계의 말기에 수득하였다.
Lys12 부위 지시된 OXM으로 FMS의 커플링:
MAL-FMS-NHS 링커 용액(DMF 중 lOmg/ml, 2.5 당량)을 (Lysl2)OXM 수지(1 당량)에 DIEA(5 당량)를 첨가하면서 가하였다. DMF를, 수지가 바로 자유로이 이동할 때까지 가한 후 밤새 초음파처리하였다. 수지를 DMF 및 메탄올로 진공 건조기 속에서 밤새 건조시키기 전까지 세척하였다. 분리 및 침전은 N-말단 부위 지시된 것에 대해 기술된 바와 같다.
Lys30 부위 지시된 OXM에 대한 FMS의 커플링:
MAL-FMS-NHS 링커(2.5 당량)를 DCM 속에서 DIEA(5 당량)을 첨가하면서 가용화하였다. 당해 링커/DIEA 용액을 (Lys30)OXM 수지에 가한 후 밤새 초음파처리하였다. 수지를 DCM 및 메탄올로 진공 건조기 속에서 밤새 건조시키기 전까지 세척하였다. 분해 및 침전은 N-말단 부위 지시된 것에 기술된 바와 같다.
정제
수득되는 조 FMS-OXM을 한번에 정제하였다.
시료 희석액: 수중 10% 아세토니트릴
컬럼: Luna C18 (2), 100Å, 250 x 21.2mm
주입 유동 속도: 9ml/분
이동 유동 속도: 9ml/분
완충제 A: 물(0.1% TFA)
완충제 B: 아세토니트릴(0.1% TFA)
구배: 32분에 걸쳐 10 내지 45% B
모니터링: 230nm
FMS-OXM에 대한 PEG30의 접합
FMS-OXM 용액(1 당량, l.5ml의 DMF 중 15.1mg)을 침전시켰다. PEG30(l 당량, pH 6.5 인산염 완충액 중 9.2ml의 lOmg/ml)을 FMS-OXM 용액에 가하였다. 이후에, 반응 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반한 후 빙초산(200μl)을 가하여 pH를 강하시킴으로써 반응을 퀀칭시켰다.
이후에, 수득되는 반응 혼합물을 RP-HPLC를 사용하여 정제하였다.
컬럼: Luna C18 (2), 100Å, 250 x 21.2mm
주입 유동 속도: 5ml/분
이동 유동 속도: 20ml/분
완충액 A: 물 & 0.1% TFA
완충액 B: 아세토니트릴/물(75:25) & 0.1% TFA
구배: 41분에 걸쳐 10 내지 65% B
모니터링: 220, 240, 280nm
IP 글루코즈 내성 시험
C57BL/6 수컷 마우스를 밤새 절식시킨 후 칭량하고, 혈당 수준을 꼬리 정맥 시료채취에 의해 포켓용 당측정기(handheld glucometer)를 사용하여 측정하였다. 마우스에게 PEG-SH(비히클), PEG30-FMS-OXM(이종) 및 PEG30-FMS-OXM의 3개의 동종 변이체(아미노, Lysl2 및 Lys30)를 복강내 주사하였다. 글루코즈(1.5gr/kg)를 시험 제품 투여 후 15분 째에 복강내 투여하였다. 혈당 수준을 꼬리 정맥 시료채취에 의해 글루코즈 투여 전, 및 글루코즈 투여 후 10, 20, 30, 60, 90, 120 및 180분 째에 포켓용 당측정기를 사용하여 측정하였다.
GLP-1 수용체 활성화의 시험관내 특성화
GLP-1 수용체의 활성화를 2개의 상이한 세포주: HTS163C2(제조원: Millipore) 및 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R(제조원: Discoverx)을 사용하여 평가하였으며, 이들 둘 다는 GLP-1 수용체를 과발현한다. HTS163C2(제조원: Millipore)를 96웰의 반-영역 백색 플레이트(half-area white plate)(제조원: Greiner) 속에 100,000개의 세포/ml로 씨딩하고 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 세포를 증가하는 농도의 이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 동종 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lysl2 및 Lys30)와 함께 항온처리하였다. 세포 cAMP 농도를 HTRF 검정(제조원: Cisbio 62AM4PEB)으로 정량하고 EC50 매개변수를 PRISM 소프트웨어로 분석하였다. cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R은, 수용체에 대한 리간드의 결합시 cAMP를 분비한다. 500000개 세포/ml의 밀도에서 세포를 96 웰 플레이트 속에 씨딩하고, 37℃에서 5% C02와 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 리간드를 IBMX를 함유하는 희석액 속에 희석시키고 배양 웰에 37℃에서 5% C02와 함께 30분 동안 2회 첨가하였다. PEG30-FMS-OXM의 농도 범위는 1.5*10-10 내지 1.2*10-6 M이었다. 분해 완충액 및 검출기 시약을 웰에 가하고 cAMP 농도를 화학발광 시그날을 사용하여 검출하였다. 투여량 의존성 곡선을 확립하고 다양한 리간드의 결합 친화성(EC50)을 최적 적합 투여량 반응 모델(best fit dose response model)(4개의 매개변수)을 적용시킴으로써 PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
글루카곤 수용체 활성화의 시험관내 특성화
글루카곤 수용체의 활성화를 글루카곤-수용체를 과발현하는 cAMP Hunter™ CHO-K1 GCGR 세포주를 사용하여 평가하였다. 당해 세포주는 글루카곤 수용체에 대한 리간드의 결합시 cAMP를 분비한다. 세포를 500000개 세포/ml의 밀도에서 96 웰 플레이트 속에 씨딩하고 37℃에서 5% CO2와 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 리간드를 IBMX를 함유하는 희석액 속에서 희석하고 배양 웰에 37℃에서 5% C02와 함께 30분 동안 2회 가하였다. MOD-6031의 농도 범위는 5.8*10-11 내지 2.7*10-7 M이었다. 분해 완충액 및 검출기 시약을 웰에 가하고 cAMP 농도를 화학발광 시그날을 사용하여 검출하였다. 투여량 의존적 곡선을 확립하고 각종 리간드의 결합 친화성(EC50)을 최적 적합 투여량 반응 모델(4개의 매개변수)를 적용함으로써 PRISM 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
비만( ob/ob ) 마우스 모델
연구 1: 25마리의 수컷 ob/ob 마우스(수컷, B6. V-Lep＾ob/01aHsd, 5 내지 6주령, 제조원: Harlan)을 취급 프로토콜에 따라 시설에 익숙해지도록 함으로써(10일) 동물들이 투여받지만 실제로는 칭량되거나 투여받지 않도록 취급하였다(10일). 후속적으로, 동물을 7일 동안 기본 기간을 겪도록 하고 여기서 이들에게 20ml/kg의 용적으로 피하 경로에 의해 적절한 비히클을 주당 2회 투여하였다. 체중, 먹이 및 물 섭취를 매일 기록하고, 시료를 절식되지 않은 및 절식된 글루코즈 측정 및 절식되지 않은 및 절식된 인슐린 측정을 위해 취하였다. 동물을 후속적으로 체중 및 혈당증 프로파일을 기준으로 하여 5개의 처리 그룹(N=5)으로 할당하였다. 동물에게 매 4일마다(1, 5, 9, 13 및 16일째) 표 1에 기술된 바와 같이 투여하였다. 치료 기간 동안, 먹이 섭취, 물 섭취 및 체중을 측정하고 투여 전 매일 기록하였다. 몇가지 과정 및 시료채취를 수행하였다: 2, 6, 14 및 17일째(17일째에는 절식되지 않은 글루코즈 만을 측정하였다) 절식되지 않은 및 절식된 글루코즈, 절식된 및 절식되지 않은 인슐린(2, 6 및 14일째). 19일째 말기 시료를 콜레스테롤에 대해 분석하였다.
[표 1] 연구 설계
Figure 112014128350031-pct00003

연구 2:
100마리의 수컷 ob/ob 마우스(5 내지 6주령, 제조원: Charles River)를 취급 프로토콜에 따라 시설에 익숙해지도록 함으로써(3일) 동물들이 투여받지만 실제로는 칭량되거나 투여받지 않도록 취급하였다(7일). 후속적으로, 동물을 7일 동안 기본 기간을 겪도록 하고 여기서 이들에게 20ml/kg의 용적으로 피하 경로에 의해 PEG30-SH 비히클(146mg/ml)를 주당 2회 투여하였다. 체중, 먹이 및 물 섭취를 매일 기록하였다. 후속적으로 동물을 8개의 처리 그룹, 대조군 및 먹이가 제공된 그룹 쌍(그룹 A-H, N=8)(N=5)으로 할당하였다(표 2). 먹이가 공급된 그룹 쌍에게 MOD-6031의 고 투여량(6000 nmol/kg) 그룹에게 쌍으로 공급하고 이를 앞서의 날에 그룹 D에서 이의 쌍을 이룬 대응그룹이 섭취한 1일 먹이의 비와 동일한 1일 먹이의 비를 제공하였다. 3개의 추가의 그룹(그룹 I-K, N=12)에게 MOD-6031을 1000, 3000 및 6000 nmol/kg으로 투여하고 PK 분석을 위한 시료채취를 위해 사용하였다. PEG-SH 비히클(292 mg/ml), 1000, 3000 및 6000 nmol/kg에서 MOD-6031, 및 먹이가 공급된 그룹 쌍에게 OXM, Liraglutide® 및 PBS를 자유로이 투여하는 32일 동안 주당 2회 투여하였다. 체중, 먹이 및 물 섭취를 매일 측정하였다. 절식되지 않은 및 절식된 글루코즈를 주당 1회 측정하고, OGTT를 2 및 30일째에 수행하였다. 말기 혈액 시료(33일)를 글루코즈, 인슐린, 콜레스테롤, 및 MOD-6031, PEG-FMS 및 OXM 농도에 대해 분석하였다. PK 그룹내 마우스에게 단일 투여량의 MOD-6031를 제공하고 혈액 시료를 PK 분석을 위해 4, 8, 24, 36, 48, 72, 96 및 120h(시점당 n=3)에 취하여 MOD-6031 및 이의 화합물 농도를 LC-MS/MS 방법으로 정량하였다.
[표 2] 연구 설계
Figure 112014128350031-pct00004

결과
실시예 1
제조 및 개발 합성
PEG-FMS-OXM 접합체의 조성물은 이의 합성 과정에 의존한다. PEG-FMS-OXM 접합체의 상이한 변이체가 생산되었다(도 1).
이종 접합체:
MOD-6030(PEG30-FMS-OXM)의 합성을 다음과 같이 수행하였다: FMS 스페이서를 OXM 및 PEG(30)-SH(1개 포트 반응으로서)와 혼합하였다. FMS 스페이서를 한쪽 면에서 이의 NHS 활성화된 에스테르에 의해 및 다른 쪽 면에서 말레이미드 그룹에 연결된 PEG-SH에 의해 OXM에 동시에 커플링하였다. 당해 방법으로, PEG-FMS-OXM 접합체의 이종 혼합물은 OXM 펩타이드(N-말단, Lys12 및 Lys30)의 3개 아민의 하나에 의해 연결된 3개의 변이체로 구성된다.
동종 접합체:
접합 공정을 2개 단계 공정으로 추가로 개발하며 여기서, FMS 스페이서에 대한 부착은 조절되고 부위 지시된 방식으로 실행하였다. 제1 단계에서, FMS 스페이서를 OXM(수지 상의 부분 보호된 OXM)에 커플링한 후, FMS-OXM(RP-HPLC에 의해)의 탈 보호 및 정제에 의해 절단하였다. 제2 단계는 정제된 동종 FMS-OXM에 대한 PEG30-SH의 부착이었다. 최종의 접합된 생성물을 RP-HPLC로 정제하였다. 추가의 정제 단계, 예를 들면, 이온 교환 또는 SEC- HPLC 또는 어떠한 다른 정제 단계를 적용시킬 수 있다.
수지 상의 3개의 펩타이드를 Fmoc 고체상 전략을 사용하여 합성하였다. OXM의 12 또는 30번 위치에서 아미노산 라이신에 의해 연결된 동종 접합체의 합성을 위해, 선택적인 보호 그룹을 염기성 조건 하에 제거될 수 있지만, 펩타이드의 나머지는 다른 보호 그룹과 함께 수지 상에 여전이 존재하는 ivDde(1-[(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리딘)에틸])로서 OXM의 Lysl2 또는 Lys30에 대해 적용시켰다.
따라서, 3개의 수지-결합된 OXM을 합성하였다: N-말단: Fmoc 전략(일반적으로 Boc 보호 그룹을 ε 아민에 대해 사용한다)을 사용하여 고체 상 합성에 적합한 보호 그룹 및 ivDde 보호 그룹을 지닌 Lys12 또는 Lys30을 사용. 이들 OXM 펩타이드는 FMS 링커와의 추가의 선택적인 커플링을 위해 의도되었다.
동종 접합을 '수지상 합성'으로서 수행하였다. 접합체를 2개의 단계로 합성하였다: 1. OXM과 FMS 사이의 커플링, 분해 및 정제. 2. PEG30-SH를 사용한 OXM-FMS의 페길화. 당해 과정에서, FMS 링커의 커플링을 OXM을 사용하여 수행하는 한편, 이는 수지에 결합된다. OXM은 완전히 보호되어 OXM 상의 특이적인 보호되지 않은 바람직한 아미노 부위가 NHS 잔기와 반응하도록 하였다. 정제된 FMS-OXM을 PEG-SH에 부착하였다. 조 접합체를 HPLC(RP 또는 양이온 교환 또는 둘 다)를 사용하여 정제하였다.
실시예 2
GLP-1 수용체 활성화의 시험관내 특성화
PEG-FMS-OXM(MOD-6030; 이종) 및 PEG-FMS-OXM의 3개의 상이한 동종 변이체; 아미노(MOD-6031), Lysl2 및 Lys30의 GLP-1 수용체 결합 활성화를 GLP-1 수용체를 과발현하는 2개의 상이한 세포주; Millipore HTS163C2 세포주 및 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R을 사용하여 평가하였다. 각각의 변이체의 EC50을 계산한 후, 효능을 이종 (MOD-6030) 버젼에 대한 각각이 변이체의 상대적인 효능(각각의 동종 변이체의 EC50을 이종 버젼의 EC50으로 나누고 이 값에 100을 곱함)을 계산함으로써 측정하였다. EC50 값 및 계산된 상대적인 효능을 표 3에 나타낸다. 비교를 위해, cAMP Hunter CHO-K1 GLP1R 세포주의 GLP-1 수용체에 대한 OXM 및 GLP-1의 결합 친화성을 측정하였다.
[표 3] GLP-1 및 글루카곤 수용체 결합 활성화
Figure 112014128350031-pct00005

동종 변이체의 상대적인 효능을 이종 버젼과 비교하여 표 3에 요약한다. 아미노 변이체 및 이종 변이체의 비교가능한 생활성은 Millipore HTS163C2 및 cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R를 사용하여 측정된 72.2% 및 99.1%의 상대적인 효능을 나타내었다.
Lysl2 및 Lys30 변이체는 Millipore HTS163C2 세포주를 사용한 GLP-1 수용체 결합 활성화의 2 및 4배 감소를 나타내었지만, cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1R 세포주를 사용하여, 각각 약간 및 2배 감소만을 나타내었다. 아미노 변이체가 다른 변이체와 비교하여 우수한 결합 활성을 입증하였다는 사실은, OXM의 N-말단이 GLP-1 수용체에 대한 OXM의 결합에 관여하는 것으로 보고된 바와 같이 예상치못한 것이다(참조: Druce et al., 2008). 전체적으로, 비교가능한 생활성을 아미노 변이체 및 이종 변이체에 대해 나타내었다. OXM 및 GLP-1 펩타이드의 GLP-1 수용체 결합 활성화를 측정하였다. OXM 및 GLP-1은 이종 PEG30-FMS-OXM과 비교하여 5.9 및 508.7까지 보다 높은 수용체 결합 활성화를 나타내었다.
실시예 3
글루카곤 수용체 활성화의 시험관내 특성화
글루카곤 수용체에 대한 PEG-FMS-OXM 변이체의 결합 친화성을 글루카곤-수용체를 과발현하는 cAMP Hunter™ CHO-K1 GCGR 세포주를 사용하여 측정하였다. 당해 세포주를 사용하여 이종 PEG-FMS-OXM(MOD-6030) 및 PEG-FMS-OXM의 3개의 상이한 동종 변이체; 아미노(MOD-6031), Lysl2 및 Lys30을 특성화하였다. 효능은 각각의 변이체의 EC50을 계산한 후 이종 버젼에 대한 각각의 변이체의 상대적인 효능(각각의 동종 변이체의 EC50을 이종 버젼의 EC50으로 나누고 이의 값에 100을 곱함)을 계산함으로써 측정하였다. EC50 값 및 계산된 상대적인 효능을 표 3에 나타낸다. 아미노 변이체는 이종 버젼에 대해 비교가능한 결합 활성을 나타내었다. Lys30 변이체는 최대 생활성을 나타내었고 Lysl2는 1.8배 감소를 나타내었다. OXM 및 글루카곤 펩타이드의 글루카곤 수용체 결합 활성화를 측정하였다. OXM 및 글루카곤은 이종 PEG30-FMS-OXM과 비교하여 11.1 및 283배까지 보다 높은 수용체 결합 활성을 나타내었다.
실시예 4
PEG30-FMS-OXM 변이체에 의한 글루코즈 내성의 유도
이종 PEG30-FMS-OXM 및 3개의 PEG30-FMS-OXM 변이체(아미노, Lys12 및 Lys30)의 생체내 활성을 평가하기 위하여, IPGTT 모델을 적용하였다. 밤새 절식된 C57BL/6 마우스에게 상이한 화합물 및 비히클(PEG-SH)을 복강내 주사한 후 글루코즈를 복강내 주사하고 꼬리 정맥으로부터 당측정기를 사용하여 혈당 수준을 측정하였다. PEG-SH(238.10nmol/kg), 이종 및 동종 PEG30-FMS-OXM(lOOnmol/kg의 펩타이드 함량)을 글루코즈 복강내 주사(1.5 gr/kg) 15분 전에 복강내 투여하였다. 모든 화합물은 비히클 그룹과 비교하여 글루코즈 내성을 유도하였다. 놀랍게도, 동종 아미노 변이체는 2개의 다른 변이체 및 이종 PEG30-FMS-OXM(표 4, 도 3)과 비교하여 시험관내 활성 결과에 대치되는 것으로서, 다른 변이체와 비교하여 약간 더 높은 글루코즈 AUC가 반영된 약간 적은 효능을 유도하였다. 아직까지, 모든 변이체는 비히클 PEG-SH 대조군과 비교하여 글루코즈 내성을 유의적으로 개선시켰다.
[표 4] C57BL/6 마우스에서 글루코즈 내성
Figure 112014128350031-pct00006

가역성 PEG30-FMS-OXM의 이종 및 동종 변이체는 시험관내 및 생체내 IPGTT 모델 둘 다에서 활성인 것으로 나타났다. 놀랍게도, 시험관내 결과는 천연의 OXM의 N-말단이 GLP-1 수용체에 대한 펩타이드 결합에 관여함을 제안하는 문헌의 것과 일치하지 않았으므로; 아미노 말단 변이체는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 최저 효능을 나타낼 수 있는 것으로 예측되었다. 그러나, PEG30-FMS-OXM의 동종 아미노 변이체는 2개의 상이한 세포주를 사용한 2개의 다른 동종 변이체와 비교하여 개선된 GLP-1 수용체 활성화를 입증하였지만(표 3) 생체내 모델에서 IPGTT에 있어서 비교가능한 효능을 입증하였다. 생체내 모델에서 IPGTT는 비교가능한 활성(동물들 사이의 가변성을 고려)을 나타내는 것으로 여겨진다. GLP-IR 및 GCGR에 대한 상이한 시험관내 결합 활성이 상이한 PEG30-FMS-OXM 변이체 사이에서 관찰되었다고 해도, 글루코즈 내성을 유도하는 비교가능한 능력이 나타나 있다(표 3 및 4). 예상치못하게, cAMP 유도 검정에서 나타낸 바와 같이 동종 아미노 PEG30-FMS-OXM의 시험관내 활성에 있어서의 우수성은 생체내 IP 글루코즈 내성 시험에서 반영되지 않았다. 동종 아미노 변이체 PEG30-FMS-OXM은 2개의 다른 변이체 및 이종 PEG30-FMS-OXM과 비교하여 최저의 글루코즈 내성 프로파일을 나타내었다. 그러나, 이는 비히클과 비교하여 여전히 유의적인 글루코즈 내성 효과를 나타내었다(도3).
실시예 5
ob/ob 마우스 모델에서 PEG30-FMS-OXM 변이체에 의한 체중, 혈당 및 지질 프로파일의 개선
ob/ob 마우스 모델은 ob 유전자의 돌연변이를 나타냄으로써 이들은 렙틴을 생산할 수 없고 고인슐린혈증, 비만, 과식증, 인슐린 내성 및 후속적으로 과혈당(hyperglycaemia)으로 특징화되는 표현형으로 진행될 수 없다. 이들 마우스를 2개의 상이한 연구에서 당뇨병의 유전 모델로서 사용하여 PEG30-FMS-OXM (이종) 및 PEG30-FMS-OXM의 3개의 동종 변이체(아미노, Lysl2 및 Lys30)의 효능을 평가하였다.
연구 1: 당해 연구를 2000 nmol/kg에서 투여한 경우 동종 변이체(아미노, Lysl2 및 Lys30) 및 이종 MOD-6030의 효능과 비교하였다. 체중의 감소를 비히클(PEG-SH) 그룹과 비교하여 모든 시험한 제품의 경우, Lysl2, MOD-6030, 아미노 및 Lys30 변이체에 대해 각각 3.1%, 4.7%, 4.9% 및 6.5%의 최종 감소(18일째)로 수득되었다(도 4). 체중 감소를 1, 5, 13 및 16일 째에 약물 주사 후 관찰하였다(도 4). 식품 섭취의 감소는 약물 투여 후(9일째 제외) 모든 시험한 그룹에 대해 관찰되었다(도 5). 연구에 따른 혈당 매개변수의 측정은 아미노 및 Lys12 처리된 그룹에 대해 절식되지 않은 글루코즈의 개선을 나타내었고(도 6a) 모든 처리된 그룹에 대해 절식된 글루코즈의 개선을 나타내었다(도 6b). 모든 처리된 그룹은 대조군과 비교하여 인슐린의 유의적으로 보다 낮은 수준을 나타내었다. 중요하게는, 당해 연구에서 투여된 투여량은 2000 nmol/kg이었으며 이는 MOD-6030의 보다 낮은 유효 투여량이므로 체중, 식품 섭취 및 혈당 프로파일의 개선은 비교적 중간이었다. 예상치못하게도, 아미노 변이체는 체중을 감소시키고, 먹이 섭취를 억제하며 혈당 조절을 증진시키는 능력에 있어서 우수한 효능을 나타낸 유일한 변이체였다. 제조 관점으로부터, 아미노 변이체의 수지상 합성은, 고체 상 합성시 펩타이드가 아미노 말단으로부터 연장된다는 점을 고려할 때 가장 간단한 과정이다. 말단 아민은 12 및 30번 위치에서 라이신의 내부 아민 그룹보다 커플링에 대해 바람직한 이용능을 가진다. 이러한 접근가능성은 Lysl2 및 Lys30 변이체와 비교하여 아미노 변이체의 보다 높은 제조 효율을 반영한다. 추가의 잇점은, 아미노 변이체가 이종 변이체에 대해 OXM 합성과 비교하여 변하지 않고 남지만, Lysl2 및 Lys30 변이체의 합성은 펩타이드 합성을 위해 사용된 Lys를 변화시키고 선택적인 절단 단계(Lys의 보호 그룹을 선택적으로 제거)의 첨가에 의해 변형된다는 것이다. 이종에 대해 이미 개발된 것으로서 OXM 합성은 이미 최적화되어 보다 우수한 수율 및 견고성을 달성하였다. 전체적으로, 제조 관점으로부터, 아미노 변이체 수지상 합성은 간단하며 대체 변이체보다도 장점을 지닌다. 동종 변이체인 경우, 이는 약물 개발 및 약물 치료에 보다 적합하다는 점에서 이종 변이체보다도 장점을 갖는다.
연구 2: 당해 연구는 ob/ob 마우스 모델에서 약리학적 및 약력학적 매개변수에 있어서 1000, 3000 및 6000 nmol/kg에서 MOD-6031(아미노 변이체)의 주당 2회 투여의 만성 효과를 시험한 반면, OXM 및 리라글루타이드(장기간 작용하는 GLP-1 수용체 효능제)는 참조 화합물로서 평가하였다. 측정된 약리학적 매개변수는 체중, 먹이 및 물 섭취, 글루코즈 조절 및 지질 프로파일이었다. 고 투여량의 MOD-6031(6000 nmol/kg)의 주당 2회 투여는 먹이 섭취 및 체중을 유의적으로 감소시킨 반면(도 7 및 8), 보다 적은 투여량(3000 및 1000 nmol/kg)은 보다 낮은 효과를 나타내었다. 연구의 결과로(33일째) 1000, 3000 및 6000 nmol/kg의 동물은 각각 5.2%, 12.3% 및 28.3%의 체중 감소를 나타내었다. 고 투여량 그룹과 쌍을 이루고 동량의 먹이(절식일 제외)를 섭취한, 먹이가 공급된 그룹 쌍은, 유사하게 먹이를 섭취하면서도 12.7%의 체중 감소를 나타내었다. 당해 현상은, 에너지 소비를 증가시키는 PEG30-FMS-OXM의 아미노 변이체의 능력에 기여할 수 있으므로, 6000nmol/kg의 아미노 변이체로 처리한 동물은 이의 먹이가 공급된 그룹 쌍의 체중 감소보다 증가된 체중 감소를 가졌다. 연구 전체에서 OXM 및 리라글루타이드 둘 다는 둘 다 체중을 각각 10.3% 및 8.3%까지 감소시켰다. 1, 5, 12, 19, 26 및 29일째 절식되지 않은 글루코즈 및 2, 9, 16, 23 및 30일째 절식 글루코즈를 모니터링하는 혈당 프로파일의 측정은 특히 6000 nmol/kg의 경우 이들 매개변수의 유의적인 개선을 나타내었다(도 9a, 9b). 경구 글루코즈 내성 시험(OGTT) 연구를 2일 및 30일째에 수행하였다(각각 도 10 및 도 11). 결과는, MOD-6031(아미노 변이체)가 1000, 3000 및 6000 nmoles/kg의 그룹에서 혈장 글루코즈를 유의적으로 감소시키면서 글루코즈 내성을 유의적으로 및 투여량 의존적으로 개선시킴을 나타내었다. 최대 MOD-6031 투여량으로 먹이가 공급된 동물은 시험한 시점 중 어느 것에서 대조군에 대해 유의적으로 상이하지 않은 글루코즈 투여량 후 글루코즈 운동(excursion)을 나타내었다. OGTT 연구 2일 째에, 개선된 글루코즈 프로파일은 인슐린 반응의 지연과 관련되었으며, 이는 약간 지연되고 AUC 0-120분에 대해 보다 높은 자극을 제공하였다(도 10). 이는 혈액 및 제2의 인슐린 분비 상 내로 글루코즈 방출에 있어서 지연을 생성하는 MOD-6031의 약리학적 활성에 의해 유도된 위장 공복의 억제에 기인할 수 있다. 30일째의 OGTT 연구는 대조군과 비교하여 감소된 인슐린 반응과 관련되어 있으며, 화합물이 인슐린 내성을 개선시킴을 나타낸다(도 11). 또한, MOD-6031 투여량은 말기 콜레스테롤을 투여량 의존적으로 감소시켰으며, 6000 nmoles/kg의 투여량의 MOD-6031로 관찰된 감소는 먹이가 공급된 대응물 쌍의 것보다 유의적으로 더 컸다(도 12). 체중, 식품 섭취, 혈당 및 지질 프로파일에 있어서 이들 약리학적 개선 모두는 OXM 또는 리라글루타이드를 사용하여 2일마다 처리한 동물보다 더 클뿐 아니라, 이들은 또한 먹이가 공급된 대응물 쌍에서 관찰된 효과보다 유의적으로 보다 더 컷다.
MOD-6031(PEG-FMS-OXM) 및 이의 가수분해된 화합물(PEG-FMS 및 OXM)의 말기 혈액 수준을 LC-MS/MS 자격의 방법을 사용하여 측정하였다. 결과는 MOD-6031 처리된 그룹에 대해 투여량 의존적인 농도를 나타내었다(도 5). 2일째에 화합물 수준에 대한 이들 데이타의 비교(단일 투여 후)는, OXM 펩타이드가 주당 2회 투여된 경우 연구 기간 동안 축적되지 않았음을 나타내었다. PEG-FMS 및 PEG-FMS-OXM은 연구에 걸쳐 중간의 축적을 나타내었다(표 5). 마지막 주사(33일째) 후 24시간째에 MOD-6031에 대한 상부 투여량에 대한 MOD-6031 및 OXM 펩타이드의 실제 농도는 각각 490μg/ml 및 0.37μg/ml이었다. 대조군 동물로부터의 모든 시료는 검정의 하부 제한값 이하이었다.
[표 5] 반복 MOD-6031 투여 요법의 단일 투여량(2일째) 및 마지막 주사 후 24시간째 형장 농도의 비교
Figure 112014128350031-pct00007
*불순물을 포함하는 투여량은 1515, 4545, 및 9090 nmol/kg이다.
실시예 6
ob/ob 마우스 모델에서 MOD-6031에 의한 약력학적 매개변수의 개선
ob/ob 마우스의 3개 그룹(n=12)에게 1000, 3000 및 6000 nmol/kg의 MOD-6031을 단일 투여하고 투여후 4, 8, 24, 36, 48, 72, 96 및 120시간 째에(시점당 n=3) PK 분석 및 LC-MS/MS 방법으로 측정된 MOD-6031의 양 및 이의 화합물의 농도를 위해 방혈시켰다. Cmax, Tmax, AUC, T1/2C1 및 Vz와 같은 약력학적 매개변수를 MOD-6031(PEG-FMS-OXM) 및 이의 가수분해된 생성물; PEG-FMS 및 OXM에 대해 계산하고, 이들 매개변수는 표 6a, 6b 및 6c에 각각 나타낸다. AUC 0-∞는 모든 투여량에서 모든 화합물에 대해 AUC 0-t의 15% 이내였으며, 이는, 시료채취 스케줄이 각각의 성분의 약력학적 프로파일을 특성화하는데 적절하였음을 나타낸다. 모든 3개의 성분에 대해, 노출은 투여량에 비례하는 것으로 여겨진다. 일반적으로, Cmax 및 AUCO-t는 투여량에 있어서의 증가와 대략적으로 동일한 비율로 및 투여량과 함께 증가하였다.
각각의 성분에 대한 매개변수는 표 7에 몰 농도로 나타낸다. Cmax 값은 PEG-FMS-OXM 및 PEG-FMS에 대해 거의 동일하며 OXM의 경우 보다 낮다. PEG-FMS-OXM 및 OXM에 대해 관찰된 T½은 각각 대략 9 및 12시간이었다. PEG-FMS에 대한 말기 T½은 보다 더 길어서, 대략 30시간이었다. 대조군 동물로부터의 모든 시료 및 투여 전에 수집한 모든 시료는 검정의 하한치 이하였다.
약력학 및 약리학적 데이타는 MOD-6031의 장기간 작용하는 특성을 확인한다. 3000 nmoles/kg의 MOD-6031의 주당 2회 투여량은 체중 및 먹이의 소비를 유의적으로 감소시켰으며 이는 또한 약물 부하에서 유의적인 감소를 이끄는 6000 nmoles/kg 투여량에서 투여된 OXM 펩타이드 처리 아암의 1일 2회와 비교가능하였다.
[표 6a] 1000, 3000, 또는 6000 nmoles/kg의 피하 주사 후 PEG-FMS-OXM 약력학적 매개변수
Figure 112014128350031-pct00008

[표 6b] 1000, 3000, 또는 6000 nmoles/kg의 MOD-6031의 피하 주사 후 PEG-FMS 약력학적 매개변수
Figure 112014128350031-pct00009
주목: 투여 용액 속에서 PEG-FMS 불순물로 인하여, 투여된 투여량의 PEG-FMS (MOD-6031 및 PEG-FMS 불순물)은 각각 1000, 3000 및 6000 nmol/kg 대신 1515, 4545, 및 9090 nmol/kg이었다.
[도 6c] 1000, 3000, 또는 6000 nmoles/kg의 MOD-6031의 피하 주사 후 OXM 약력학적 매개변수
Figure 112014128350031-pct00010
NC= 농도 대 시간 프로파일의 형태에 기인함, 매개변수는 계산될 수 없었다.
[표 7] 몰 기준으로 3개 성분을 비교하는 약력학적 매개변수
Figure 112014128350031-pct00011
aPEG-FMS의 투여량은 불순물(MOD-6031 및 PEG-FMS 불순물)에 대해 계산한다.
본 발명의 특정의 특징이 본원에 나열되고 기술되어 있다고 해도, 많은 변형, 치환, 변화, 및 등가물이 당해 분야의 통상의 기술자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 실제 취지내에 속하는 것으로서 모든 이러한 변형 및 변화를 포함하는 의도로 작성되었다는 것을 이해되어야 한다.
<110> Prolor Biotech Ltd. FIMA, Udi Eyal Oren, HERSHKOVITZ <120> PEGYLATED OXM VARIANTS <130> P-76093-PC <150> 61/655,367 <151> 2012-06-04 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35

Claims (43)

  1. 하기 구조:
    Figure 112019084126599-pct00024

    로 표시되는 접합체의 제조 방법으로서,
    상기 접합체는, 옥신토모둘린(OXM; 서열번호 1)이 상기 옥신토모둘린의 말단 아미노 기를 통해 연결되고; R2가 수소 또는 SO3H인, 각각의 PEG-Fmoc-OXM(N-말단) 또는 PEG-FMS-OXM(N-말단)이고,
    상기 방법은,
    MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를,
    Figure 112019084126599-pct00025

    Figure 112019084126599-pct00026

    수지-결합된 옥신토모둘린의 Lys12 및 Lys30의 아미노 측쇄가 보호기로 각각 보호된, 수지-결합된 서열번호 1의 옥신토모둘린과 반응시켜,
    Lys12 및 Lys30의 아미노 측쇄가 보호기로 각각 보호된, 수지-결합된 MAL-Fmoc-보호된 OXM(N-말단) 또는 수지-결합된 MAL-FMS-보호된 OXM(N-말단)을 각각 수득한 다음,
    (a) 상기 수지-결합된 MAL-Fmoc-보호된 OXM(N-말단) 또는 상기 수지-결합된 MAL-FMS-보호된 OXM(N-말단)을 설프하이드릴 PEG 폴리머(PEG-SH)와 반응시킨 다음, 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하거나; 또는
    (b) 상기 수지 및 보호기를 제거하여 MAL-Fmoc-OXM(N-말단) 또는 MAL-FMS-OXM(N-말단)을 각각 수득한 다음, 상기 MAL-Fmoc-OXM 또는 MAL-FMS-OXM을 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응시켜,
    PEG-Fmoc-OXM(N-말단) 또는 PEG-FMS-OXM(N-말단)을 각각 수득하는 단계
    를 포함하는,
    접합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PEG가 20,000 Da 내지 40,000 Da 범위의 분자량을 가지는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PEG가 PEG30인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    R2 또는 SO3H가 2번 위치인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 MAL-Fmoc-보호된 OXM(N-말단) 또는 MAL-FMS-보호된 OXM(N-말단)의 Lys12 및 Lys30의 아미노 기의 상기 보호기를 제거하여 MAL-Fmoc-OXM(N-말단) 또는 MAL-FMS-OXM(N-말단)을 각각 수득하고,
    상기 MAL-Fmoc-OXM(N-말단) 또는 MAL-FMS-OXM(N-말단)을 추가로 정제하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 Lys12 및 Lys30의 측쇄의 상기 보호기가 ivDde (1-[(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥스-1-일리딘)에틸])인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 보호기가 염기성 조건에서 제거되는, 방법.
  8. 하기 구조:
    Figure 112019084126599-pct00027

    로 표시되는 접합체의 제조 방법으로서,
    상기 접합체는, 옥신토모둘린(OXM; 서열번호 1)이 상기 옥신토모둘린의 Lys12의 아미노 측쇄를 통해 연결되고; R2가 수소 또는 SO3H인, 각각의 PEG-Fmoc-OXM(Lys12) 또는 PEG-FMS-OXM(Lys12)이고,
    상기 방법은,
    MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를,
    Figure 112019084126599-pct00028

    Figure 112019084126599-pct00029

    옥신토모둘린의 Lys30의 아미노 측쇄 및 His1의 아미노 말단이 각각 보호기로 보호된, 수지-결합된 서열번호 1의 옥신토모둘린과 반응시켜,
    옥시토모둘린의 Lys30의 아미노 측쇄 및 His1의 아미노 말단이 각각 보호기로 보호된, 수지-결합된 MAL-Fmoc-보호된 OXM(Lys12) 또는 수지-결합된 MAL-FMS-보호된 OXM(Lys12)을 각각 수득한 다음,
    (a) 상기 수지-결합된 MAL-Fmoc-보호된 OXM(Lys12) 또는 상기 수지-결합된 MAL-FMS-보호된 OXM(Lys12)을 설프하이드릴 PEG 폴리머(PEG-SH)와 반응시킨 다음, 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하거나; 또는
    (b) 상기 수지 및 보호기를 제거하여 MAL-Fmoc-OXM(Lys12) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys12)을 각각 수득한 다음, 상기 MAL-Fmoc-OXM(Lys12) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys12)을 설프하이드릴 PEG 폴리머 (PEG-SH)와 반응시켜,
    PEG-Fmoc-OXM(Lys12) 또는 PEG-FMS-OXM(Lys12)을 각각 수득하는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 PEG가 20,000 Da 내지 40,000 Da 범위의 분자량을 가지는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 PEG가 PEG30인, 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    R2 또는 SO3H가 2번 위치인, 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 MAL-Fmoc-보호된 OXM(Lys12) 또는 MAL-FMS-보호된 OXM(Lys12)의 Lys30 및 His1의 아미노 기의 상기 보호기를 제거하여 MAL-Fmoc-OXM(Lys12) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys12)을 각각 수득하고,
    상기 MAL-Fmoc-OXM(Lys12) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys12)을 추가로 정제하는, 방법.
  13. 하기 구조:
    Figure 112019084126599-pct00030

    로 표시되는 접합체의 제조 방법으로서,
    상기 접합체는, 옥신토모둘린(OXM; 서열번호 1)이 상기 옥신토모둘린의 Lys30의 아미노 측쇄를 통해 연결되고; R2가 수소 또는 SO3H인, 각각의 PEG-Fmoc-OXM (Lys30) 또는 PEG-FMS-OXM (Lys30)이고,
    상기 방법은,
    MAL-FMS-NHS 또는 MAL-Fmoc-NHS를,
    Figure 112019084126599-pct00031

    Figure 112019084126599-pct00032

    옥신토모둘린의 Lys12의 아미노 측쇄 및 His1의 아미노 말단이 각각 보호기로 보호된, 수지-결합된 서열번호 1의 옥신토모둘린과 반응시켜,
    옥시토모둘린의 Lys12의 아미노 측쇄 및 His1의 아미노 말단이 각각 보호기로 보호된, 수지-결합된 MAL-Fmoc-보호된 OXM(Lys30) 또는 수지-결합된 MAL-FMS-보호된 OXM(Lys30)을 각각 수득한 다음,
    (a) 상기 수지-결합된 MAL-Fmoc-보호된 OXM(Lys30) 또는 상기 수지-결합된 MAL-FMS-보호된 OXM(Lys30)을 설프하이드릴 PEG 폴리머(PEG-SH)와 반응시킨 후, 상기 보호기 및 상기 수지를 제거하거나; 또는
    (b) 상기 수지 및 보호기를 제거하여 MAL-Fmoc-OXM(Lys30) 또는 MAL-FMS-OXM (Lys30)을 각각 수득한 후, 상기 MAL-Fmoc-OXM(Lys30) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys30)을 설프하이드릴 PEG 폴리머(PEG-SH)와 반응시켜,
    PEG-Fmoc-OXM(Lys30) 또는 PEG-FMS-OXM(Lys30)을 각각 수득하는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 PEG가 20,000 Da 내지 40,000 Da 범위의 분자량을 가지는, 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 PEG가 PEG30인, 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    R2 또는 SO3H가 2번 위치인, 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 MAL-Fmoc-보호된 OXM(Lys30) 또는 MAL-FMS-보호된 OXM(Lys30)의 Lys12 및 His1의 아미노 기의 상기 보호기를 제거하여 MAL-Fmoc-OXM(Lys30) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys30)을 각각 수득하고,
    상기 MAL-Fmoc-OXM(Lys30) 또는 MAL-FMS-OXM(Lys30)을 추가로 정제하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 옥신토모둘린 접합체를 제조하는 단계를 포함하는, 옥신토모둘린의 생물학적 반감기를 연장하는 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따라 옥신토모둘린 접합체를 제조하는 단계를 포함하는, 옥신토모둘린의 필요한 투여 빈도를 줄이는 방법.
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