CN103209709A - 抗mhc抗体抗病毒性细胞因子融合蛋白 - Google Patents

抗mhc抗体抗病毒性细胞因子融合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含抗体和抗病毒细胞因子的融合蛋白和使用所述融合蛋白的方法，所述抗体结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物。

Description

抗MHC抗体抗病毒性细胞因子融合蛋白
发明领域
本发明涉及包含抗体和抗病毒细胞因子的融合蛋白和使用所述融合蛋白的方法，所述抗体结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物。该融合蛋白可用于治疗病毒感染，例如乙肝病毒感染。
背景
HBV对I型和II型干扰素的抗病毒效应敏感，但由于慢性HBV与受抑制的抗病毒性先天性和适应性免疫应答相关，所以在慢性HBV感染过程中，这些细胞因子的功效被降低。为了规避这些免疫缺陷并增加当前的干扰素疗法对慢性HBV感染的功效，我们创造了新的工具，所述工具以抗肝抑制形式组合了HBV特异的CD8T细胞精致的特异性和细胞因子的抗病毒效应。
干扰素，特别是干扰素2α，是具有抗病毒和抗增殖活性的药物活性蛋白质。例如，干扰素用于治疗多毛细胞白血病和卡波西肉瘤，且对肝炎是有活性的。为了改进稳定性和溶解度，并降低免疫原性，可以将药物活性蛋白质如干扰素与聚合物聚乙二醇(PEG)缀合(参见EP0809996)。
Noy，R.等人报道了T细胞受体样抗体是用于临床癌免疫学和免疫治疗的新的试剂(Expert Review of Anticancer Therapy5(2005)523-536)。
在WO2009/136874中报道了HBV表位反应性的外源性T细胞受体(TCR)及其用途。
Sastry，K.S.等人报道了靶向HBV感染的肝细胞的T细胞受体样抗体(J.Hepatol.52(2010)S5-S6)。在WO03/068201中报道了具有T细胞受体样特异性的更高亲和力的抗体，及其在检测和治疗癌症、病毒感染和自身免疫病中的用途。在WO2005/077980中报道了可溶的TCR样分子及其用途。在WO2009/136874中报道了HBV表位反应性的外源性T细胞受体(TCR)及其用途。
概述
已经发现本文报道的融合蛋白可以用比裸露的或PEG化的干扰素更高的效价将干扰素-α递送至HBV感染的靶细胞。本文报道的融合蛋白是新的定向治疗递送平台，以提供具有潜在降低的干扰素的多效性效果的用于HBV感染患者的治疗。
本发明提供了融合蛋白，其包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是抗病毒细胞因子。
在一个实施方案中，乙肝病毒蛋白是乙肝病毒包膜(env)蛋白或乙肝病毒核心蛋白。
在一个实施方案中，乙肝病毒蛋白是乙肝病毒包膜(表面)蛋白，并且肽片段对应于其氨基酸残基的第172至180位，或乙肝病毒蛋白是乙肝病毒包膜(表面)蛋白，肽片段对应于其氨基酸残基的第183至191位，或乙肝病毒蛋白是乙肝病毒核心蛋白，肽片段对应于其氨基酸残基的第18至27位。在一个实施方案中，肽片段具有SEQ ID NO：01的氨基酸残基第172至180位的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO：01的氨基酸残基第182至190位的氨基酸序列，或具有SEQ ID NO：02的氨基酸残基第18至27位的氨基酸序列。在一个实施方案中，肽片段具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列，或肽片段具有SEQ ID NO：31的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体特异地结合感染了乙肝病毒的对象的肝细胞。
在一个实施方案中，抗病毒细胞因子是干扰素。在一个实施方案中，抗病毒细胞因子是天然存在的抗病毒细胞因子的变体。在一个实施方案中，变体是天然存在的细胞因子截短的形式或具有共有的氨基酸序列的抗病毒细胞因子。在另一个实施方案中，抗病毒细胞因子选自I型干扰素，或II型干扰素，或III型干扰素。在一个实施方案中，干扰素是人干扰素α-2a。在另一个实施方案中，抗病毒细胞因子是人干扰素α-2a截短的变体。在一个实施方案中，干扰素具有SEQ ID NO：03的氨基酸序列，或是其片段，所述片段具有SEQ ID NO：03的多肽可比较的生物学活性。
在一个实施方案中，融合蛋白具有与携带CD8的T细胞相同的特异性。
在一个实施方案中，抗体不被血清乙肝病毒抗原抑制。
在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗体是人、人源化或嵌合的抗体。
在一个实施方案中，抗体是结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体片段。
在一个实施方案中，细胞因子与抗体的轻链或重链的N端或C端融合。在一个实施方案中，细胞因子与抗体的重链C端融合。
在一个实施方案中，结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒性细胞因子通过接头肽融合。在一个实施方案中，接头肽选自SEQ ID NO：22至SEQ ID NO：27。在一个实施方案中，接头肽具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3，(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3，(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L2；(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3；或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)与SEQ ID NO：07的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：11的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：07的VH序列或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：11的VL序列或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体重链具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，或者是其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体重链具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列，或者是其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体轻链具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列，或者是其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体轻链具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列，或者是其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，(b)含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3，(c)含有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)含有SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)含有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，(c)含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)含有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1；(b)含有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2；(c)含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3；或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含(a)与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VH序列；或(b)与SEQ IDNO：39的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VL序列；或(c)如(a)中的VH序列和如(b)中的VL序列，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：35的VH序列，或其人源化变体。
在一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO：39的VL序列，或其人源化变体.
在一个实施方案中，抗体是全长的人IgG1抗体。
本发明进一步提供了编码本文报道的融合蛋白的分离的核酸。还提供了编码本文报道的抗体重链的分离的核酸。进一步提供了编码本文报道的抗体轻链的分离的核酸。
本发明还提供了包含一种或多种本文报道的核酸的宿主细胞。
还提供了产生本文报道的融合蛋白的方法，其包括培养本文报道的宿主细胞，以便产生融合蛋白。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)提供根据本文报道的细胞，(b)培养所提供的细胞，(c)从细胞或培养基回收融合蛋白，从而产生融合蛋白。
本发明提供了药物制剂，其包含本文报道的融合蛋白和可药用的载体。
本发明还提供了本文报道的融合蛋白，其作为药物使用。
本发明还提供了本文报道的融合蛋白，其用于治疗乙肝病毒感染。
本发明还提供了本文报道的融合蛋白，其用于将抗病毒细胞因子递送至感染乙肝病毒的肝细胞。
本发明还提供了本文报道的融合蛋白在生产药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于乙肝病毒感染的治疗。在另一个实施方案中，乙肝病毒感染是慢性感染。在另一个实施方案中，药物用于将抗病毒性细胞因子递送至感染乙肝病毒的肝细胞。
本发明提供了治疗具有乙肝病毒感染的个体的方法，其包括向个体施用有效量的本文报道的融合蛋白。
本发明还提供了向个体中感染了乙肝病毒的肝细胞递送抗病毒细胞因子的方法，其包括向个体施用有效量的本文报道的融合蛋白，从而将抗病毒细胞因子递送至感染乙肝病毒的肝细胞。
附图简述
图1显示了测定的(a)干扰素α-2a和(b)抗体(人Fc区)-干扰素α-2a融合蛋白(实施例3)的SPR结合曲线。
图2显示了重链表达质粒9924(实施例1)的质粒图。
图3显示了轻链表达质粒9922(实施例1)的质粒图。
图4显示了用不同的干扰素α-2a变体获得的标准化的RLU。
图5显示了不同抗体对感染HBV的细胞的结合特异性；两幅图中测试的抗体：i)结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：30的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体；ii)结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：31的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体；iii)两个不同的抗MAGE抗体；iv)两个不同的抗HBV抗体；v)抗hCMV抗体；vi)两个不同的抗EBV抗体；和vii)两个不同的抗流感病毒抗体；在图(A)中，仅结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：31的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体显示出结合；在图(B)中，仅结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：30的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体显示出结合。
图6显示了(A)i)结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：31的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体；ii)结合呈递了乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：30的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体对感染的肝细胞(HepG2细胞)表面的肽-MHC复合物的识别。
图7显示了肝活组织检查的感染HBV的肝细胞上的肽-MHC复合物的识别。
图8显示了本文报道的融合蛋白保留其对表达HBV的靶细胞的结合；1：对照抗体；2：对照肽；3：融合蛋白，其包含干扰素-α和结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体；4：结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体。
图9显示了用SEQ ID NO：30的肽进行的预阻断消除了如图8所示的增强的干扰素-α活性。
本发明实施方案的详述
I.定义
“接纳体人构架”表示这样的人抗体构架，所示人抗体构架包含源自如下文定义的人免疫球蛋白构架或人共有构架的轻链可变结构域(VL)构架或重链可变结构域(VH)构架的氨基酸序列。“源自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含上述构架相同的氨基酸序列，或它可以含有氨基酸序列的改变。在一些实施方案中，氨基酸改变的数目是10个或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL接纳体人构架在序列上与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。
术语“亲和力”表示在分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合的配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总数。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以用解离常数(KD)表示。可以通过本领域已知的常用方法，包括本文中描述的那些方法测定亲和力。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个抗体的高变区(HVR)或互补决定区(CDR)具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲代抗体相比，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的改进，即，在抗体结合位点及其结合配偶体(抗原)之间的解离常数的降低。
术语“氨基酸”表示羧基α-氨基酸，其直接或以前体的形式由核酸编码。单个氨基酸是由被称为密码子或碱基三联体的三个核苷酸组成的核酸编码的。每个氨基酸由至少1个密码子编码。这被称为“遗传密码的简并性”。在本申请中使用的术语”氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸，包含丙氨酸(三字母密码：ala，一字母密码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)。
术语“结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体”指能够以足够的亲和力结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体，以便所述抗体可用作靶向展示呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的细胞的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体具有≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更少，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
本文中的术语″抗体″是以广义使用的，并包括各种抗体结构，其包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要所述抗体显示出所希望的抗原结合活性。天然存在的抗体是具有变化结构的分子。例如，天然的IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-至C-端，每条重链具有可变结构域(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是三个或四个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和任选地CH4)。类似的，从N-至C-端，每条轻链具有可变结构域(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻链(CL)结构域。基于抗体的恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可属于被称为：kappa(κ)(SEQ ID NO：16)和lambda(λ)(SEQ ID NO：17)的两种类型之一。
″抗体片段″指除除了完整抗体之外的，包含完整抗体的一部分的分子，所述完整抗体的一部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如，scFv)和由抗体片段形成的多特异性抗体。
作为参考抗体，“结合相同表位的抗体”指在竞争性测定中，阻断参考抗体与其抗原50％或更多结合的抗体，反过来，在竞争性测定中，参考抗体阻断抗体与其抗原50％或更多的结合。本文提供了示例性的竞争性测定。
术语“抗病毒细胞因子”表示在感染后介导建立抗病毒应答和募集炎性细胞至感染位点的细胞因子。抗病毒细胞因子包含I型(干扰素(IFN)-α和IFN-β)、II型(IFN-γ)和III型(IFN-λ或白介素(IL)-28/29)干扰素。干扰素α、β、γ和λ是在对病毒感染的先天性免疫应答中产生的重要干扰素。
术语″嵌合的″抗体表示这样的抗体，所述抗体中的重链和/或轻链的部分源自特定的来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分源自不同的来源或物种。在某些实施方案中，嵌合的抗体包含源自第一来源或物种的可变结构域，而重链和轻链的剩余部分源自第二种不同的来源或物种。
抗体的“类”指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类人抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步被分为亚类(同种型)，例如，IgG1(SEQ ID NO：18和19)、IgG2、IgG3、IgG4(SEQID NO：21)、IgA1和IgA2。对应于不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ、和μ。
“效应子功能”表示归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而改变。抗体的效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合(FcRn)、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的巨噬细胞介导的细胞毒性(ADMC)、细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调和B细胞活化。
活性剂(例如，药物制剂)的″有效量″表示在必需的剂量和时间段实现所希望的治疗和预防结果或效果的有效量。
术语“Fc区”表示含有恒定区的至少部分的免疫球蛋白重链的C端区域。该术语包括天然的序列Fc区和Fc区变体。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区自约氨基酸残基第226(Cys)位，或自约氨基酸残基第230(Pro)位延伸至重链的羧基端。然而，Fc区C端的赖氨酸残基(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另外指定，则抗体轻链和重链的氨基酸残基编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第5版，第1-3卷，Public HealthService，National Institutes of Health，Publication No.91-3242，Bethesda，MD(1991)所述。
术语“来源于人起源的恒定区”表示亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区(包含例如，CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域，和任选的CH4结构域)和/或恒定轻链κ或λ区(CL结构域)。此类恒定区是现有技术中普遍已知的，并且例如如Kabat，E.A.所述(参见例如，Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72(1975)2785-2788)。当IgG4亚类的抗体显示出降低的Fc受体(FcγRIIIa)结合时，其他IgG亚类的抗体显示出强的结合。然而，Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(缺失Fc糖)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435是这样的残基，其如果改变则也提供了降低的Fc受体结合(Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J.等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.等人，Immunology86(1995)319-324；EP0307434)。在一个实施方案中，融合蛋白的抗体具有来自人起源的恒定区。在另一个实施方案中，融合蛋白的抗体具有恒定区，其具有选自SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：22的氨基酸序列。在另一个实施方案中，融合蛋白的抗体具有恒定区，其具有SEQ ID NO：18或19的氨基酸序列。
″构架″或″FR″表示除高变区(HVR)残基或互补决定区(CDR)残基外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR(CDR)和FR序列一般出现在VH(或VL)的下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换的使用，表示具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体，或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。
术语″宿主细胞″″宿主细胞系″和″宿主细胞培养物″可互换的使用，并且指已经引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括″转化体″、″转化细胞″和“转染细胞”，包括原代转化的细胞和来自其的后代(不考虑传代数量)。后代可以不与亲代细胞的核酸内容上完全相同，而可以含有突变。在原始转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变后代也包括在本文中。
“人抗体”是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述序列对应于由人或人细胞产生的抗体的序列，或源自利用人抗体所有组成成分或其他人抗体-编码序列的非人来源。人抗体的这一定义特异地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有构架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的构架。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是自可变结构域序列的亚类中。一般而言，序列亚类是如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService，NIH Publication91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚类。在一个实施方案中，对于VL，亚类是如在Kabat等人，同上中的亚类κI。在一个实施方案中，对于VH，亚类是如在Kabat等人，同上中的亚类III。
术语“人源化抗体”指包含来自非人HVR，尤其CDR的氨基酸残基，和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个，通常2个可变结构域的基本上的全部，在所述可变结构域中全部的或基本上全部的HVR(CDR)对应于非人抗体的HVR，且全部的或基本上全部的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人起源的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化变体”指经历人源化的抗体。人源化抗体或抗体的人源化变体可以包含在FR和恒定区中的氨基酸改变。
术语“高变区”或“HVR”在本文中指在序列中高变的和/或形成结构上所定义的环(“高变环”)的抗体可变结构域的每个区。一般而言，天然的四链抗体包含6个HVR，其中3个在VH(H1、H2、H3)中，3个在VL(L1、L2、L3)中。HVR一般包含来自高变环或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。在一个实施方案中，高变环存在于VL结构域的氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)，和VH结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。在一个实施方案中，CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于VL结构域的氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)，和VH结构域的31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，第1-3卷，Public Health Service，National Institutes of Health，Publication No.91-3242，Bethesda，MD(1991))。除VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包括“特异性决定残基”或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR被包含在CDR的区域中，被称为缩短的CDR，或a-CDR。在一个实施方案中，a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2和a-CDR-H3)存在于VL结构域的氨基酸残基31-34(L1)、50-55(L2)、89-96(L3)和VH结构域的31-35B(H1)、50-58(H2)和95-102(H3)(参见例如，Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)。除非另外指出，可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中是根据Kabat等人，同上编号的。“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子缀合的抗体，其包括但不限于细胞毒性剂。
“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(例如，人和非人灵长类，例如猴)、兔和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或对象是人。
″分离的″抗体是已经与它的天然环境中的组分分离的抗体。在一些实施方案中，抗体被纯化至大于95％或99％的纯度，所述纯度是通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)方法测定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如，Flatman，S.等人，J.Chromatogr.B848(2007)79-87。
″分离的″核酸指与它的天然环境中的组分分离的核酸分子。(分离的核酸包括通常含有该核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外，或不同于其天然染色体位置的染色体位置上)。
“编码结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体的分离的核酸”指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞的一个或多个位置上的此类核酸分子。
本文使用的术语″单克隆抗体″指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即，除可能的变体抗体外，群体包含的单个抗体是相同的和/或结合相同表位，所述抗体变体例如，含有天然存在的突变或在生产单克隆抗体制品的过程中产生的，此类变体一般以少量存在。与多克隆抗体制品相反(多克隆抗体制品通常包括针对不同决定簇(表位)的不同的抗体)，单克隆抗体制品的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，而不被理解为需要通过任何特定的方法生产抗体。例如，通过多种技术可以制备根据本发明的待使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、单个抗体产生细胞分离方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性的方法。
“裸露的抗体”指不与异质部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸露的抗体可以存在于药物制剂中。
″天然抗体″指具有变化结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然的IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N-至C-端，每条重链都具有可变区(VH)，也被称为可变重链结构域或重链可变结构域，之后是3个或4个恒定结构域(CH1、CH2、CH3和任选的CH4)。相似的，从N-至C-端，每条轻链具有可变区(VL)，也被称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，之后是恒定轻链(CL)结构域。基于抗体恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以归属于称为kappa(κ)和lambda(λ)的两种类型中的一种。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或使用此类治疗产品的警告的信息。
相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性的百分比(％)″定义为在比对候选序列和参照多肽序列和引入空位(根据需要)且不认为任何保守取代是序列同一性的一部分后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分比，所述引入空位是为了实现最大百分比序列同一性。以本领域技术中的多种方式，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，可以实现为确定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行的比对。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括实现在所比较的全长序列上的最大比对所需的任何算法。然而，对于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.创造，并且源代码已经作为用户文件提交给美国版权局(U.S.Copyright Office，Washington D.C.，20559)，注册为U.S.版权注册号TXU510087。ALIGN-2程序是可从Genentech，Inc.，South SanFrancisco，California公开获得的，或可以从源代码编译。ALIGN-2程序应该被编译用于UNIX操作系统，包括数据化UNIX V4.0D。通过ALIGN-2程序设定所有序列比较参数且不改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，如下计算给定的氨基酸序列A对、与或针对给定的氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(备选地可以表达为给定的氨基酸序列A对、与或针对给定的氨基酸序列B具有或包括某一％氨基酸序列同一性)：
100倍的分数X/Y
其中，X是在A和B的程序比对中，由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数，而其中Y是B中的氨基酸残基的总数。将理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外特别指出，则本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都如前文段落中使用ALIGN-2计算机程序所述获得。
术语″药物制剂″指为这样的形式的制品，所述形式允许其中所含的活性成分的生物学活性是有效的，且所述制品中不含对待被施用该制剂的对象有不可接受的毒性的额外组分。
“可药用载体”指在药物制剂中，除活性成分外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
如本文使用的，“治疗”(及其语法变化的各种形式)指临床尝试干预，以改变正在被治疗个体的天然病程，可以为预防或在临床病理的病程中进行。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理后果、阻止转移、降低疾病发展速率、改善或减缓疾病状态，和减轻或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。
术语“I型干扰素”表示结合细胞表面受体复合体的干扰素，所述受体复合体由IFNAR1和IFNAR2蛋白链组成(IFN-α受体，IFNAR)。存在于人中的I型干扰素包含干扰素α、干扰素β和干扰素ω。
术语“II型干扰素”表示结合干扰素-γ受体(IFNGR)的干扰素。存在于人中的II型干扰素包含干扰素γ。
术语“III型干扰素”表示通过由II类细胞因子受体(CIICR)IL10R2和IFNLR1组成的受体复合体传递信号的干扰素。III型干扰素群由被称为IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3(也分别称为白介素-29、白介素-28A和白介素-28B)的3个IFN-λ分子组成。
术语“可变区”或“可变结构域”指涉及抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然的抗体的重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构，每个结构域包含4个保守构架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91版(2007))。单个VH或VL结构域足以赋予抗原结合特异性。此外，使用结合抗原的抗体的VH或VL结构域，分别筛选互补的VL或VH结构域文库，可以分离结合特定抗原的抗体(参见例如，Portolano，S.等人，J.Immunol.150(1993)880-887；Clarkson，T.等人，Nature352(1991)624-628)。
本文使用的，术语″载体″指能够使与其相连的另一个核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入到其已经被引入的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其有效连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为″表达载体″。
II.组合物和方法
本文中报道的融合蛋白证明了与来自确诊肝炎患者的HBV特异性CD8T细胞相似的敏感性。所述融合蛋白还识别来自慢性HBV患者的离体的感染HBV的肝细胞。这一识别作用不受存在的循环HBV抗原的影响。重要的是，抗体与干扰素-α的融合不改变抗体对表达HBV抗原的细胞的敏感性，同时降低了融合干扰素-α对其自身受体的亲和力。还发现显著增强了表达HBV抗原的细胞上的干扰素-α活性。用TCRL预先阻断MHC/肽位点，消除了本文报道的增强的融合蛋白的干扰素-α活性(图9)。
图5中显示了抗体对感染HBV的细胞的特异性。在图5(a)中，仅结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：31的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体显示了结合；在图5(b)中，仅结合呈递乙肝病毒蛋白的SEQ ID NO：30的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体显示了结合。
对感染的肝细胞上的肽-MHC复合物的识别作用显示在图6和7中。
图8显示了本文报道的融合蛋白维持了非缀合抗体的特异性，所述非缀合抗体结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物。
在一个方面，本发明是部分地基于研发了这样的融合蛋白，所述融合蛋白包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒细胞因子，用于例如递送抗病毒细胞因子至乙肝病毒感染的肝细胞。本发明的融合蛋白可用于例如治疗感染乙肝病毒的个体。
在一个方面报道了包含抗体的融合蛋白，所述抗体具有对HBV包膜(包膜183-191/A201)的肽/MHC-I和存在于感染HBV的细胞上的HBV核心(核心18-27/A201)抗原的特异性。该抗体模拟T细胞受体对HBV特异的CD8T细胞的识别。
A.包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒细胞因子的示例性融合蛋白
在一个方面，本发明提供了包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒细胞因子的融合蛋白。
在一个方面，本发明提供了包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体的融合蛋白，所述抗体包含至少1个、2个、3个、4个、5个或6个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供了包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体的融合蛋白，所述抗体包含至少1个、2个、3个、4个、5个或6个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，(d)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(e)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(f)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供了包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体的融合蛋白，所述抗体包含至少1个、至少2个或全部3个VH HVR序列，所述VH HVR序列选自：(a)包含SEQID NO：04的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3、含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2。
在一个方面，本发明提供了包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体的融合蛋白，所述抗体包含至少1个、至少2个或全部3个VHHVR序列，所述VHHVR序列选自：(a)包含SEQID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3和含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。在一个实施方案中，抗体包含含有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3和含有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2。
在一个方面，本发明提供了包含抗体的融合蛋白，所述抗体包含至少1个、至少2个或全部3个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明提供了包含抗体的融合蛋白，所述抗体包含至少1个、至少2个或全部3个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自：(a)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明的融合蛋白包含这样的抗体，所述抗体具有(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含至少1个、至少2个或全部3个VH HVR序列，所述VH HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3，，所述VL结构域包含至少1个、至少2个或全部3个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，本发明的融合蛋白包含这样的抗体，所述抗体具有(a)VH结构域和(b)VL结构域，所述VH结构域包含至少1个、至少2个或全部3个VH HVR序列，所述VH HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(iii)包含选自SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3，所述VL结构域包含至少1个、至少2个或全部3个VL HVR序列，所述VL HVR序列选自(i)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(iii)包含SEQID NO：38的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒细胞因子的融合蛋白包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体，所述抗体包含与SEQ IDNO：07或SEQ ID NO：35或其人源化变体的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)氨基酸序列。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VH氨基酸序列相对于参照序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留了结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的能力。在特定的实施方案中，VH包含1、2或3个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的HVR-H3。在特定的实施方案中，VH包含1、2或3个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的HVR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的HVR-H3。
在一个方面，包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒性细胞因子的融合蛋白包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体，所述抗体包含与SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：39或其人源化变体的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留了结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的能力。在另一个特定的实施方案中，VL包含1、2或3个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ IDNO：09的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的HVR-L3。在另一个特定的实施方案中，VL包含1、2或3个HVR，所述HVR选自：(a)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的HVR-L2，和(c)包含SEQ IDNO：38的氨基酸序列的HVR-L3。
在一个方面，提供了包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒细胞因子的融合蛋白，所述融合蛋白包含结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体，其中所述抗体包含上文提供的任一实施方案中的VH和上文提供的任一实施方案中的VL。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：07和SEQID NO：11中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰，或其人源化变体。在一个实施方案中，抗体包含分别在SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：39中的VH和VL序列，包括这些序列的翻译后修饰，或其人源化变体。
在一个方面，本发明提供了包含抗体的融合蛋白，所述抗体与结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物且具有SEQ ID NO：07的VH和SEQ ID NO：11的VL的抗体结合相同表位。
在一个方面，本发明提供了包含抗体的融合蛋白，所述抗体与结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物且具有SEQ ID NO：35的VH和SEQ ID NO：39的VL的抗体结合相同表位。
在本发明的一个方面，根据任一上述实施方案和方面的融合蛋白的抗体是单克隆抗体，包括嵌合的、人源化的或人抗体。在一个实施方案中，抗体是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。在一个实施方案中，抗体是全长的抗体，例如，完整IgG1抗体或本文定义的其他抗体种类或同种型。
在一个方面，根据任一上述实施方案和方面的融合蛋白可以单独或组合地整合以下章节中描述的任何特征：
1.亲和力
在某些实施方案中，本文提供的融合蛋白或包含在本文提供的融合蛋白中的抗体具有与呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更少，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
在一个实施方案中，通过表面等离振子共振方法测量Kd。
可以使用
Figure BDA00002822290200211
3000仪器(GE Healthcare)，在25℃通过表面等离振子共振(SPR)，测定干扰素α-2a或含有干扰素α-2a的融合物对人干扰素-α/β受体β链(IFNAR2)的结合亲和力。IFNAR2是异二聚体干扰素受体复合体的高亲和力的、初始结合组分，所述复合体不包含IFNAR1/2和作为配体的干扰素α-2a。
Figure BDA00002822290200221
系统被成熟地确立，用于研究分子相互作用。
Figure BDA00002822290200222
系统允许连续的实时监控配体/分析物的结合，从而测定缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡解离常数(Kd)。SPR技术是基于测量金包被的生物传感芯片表面附近处的折射率。折射率的改变指示由固定的配体与被注射到溶液中的分析物之间的相互作用引起的表面质量改变。如果分子结合固定在表面上的配体，则质量增加，如果解离，则质量减少。
使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，可以在pH4.5在CM5芯片上进行约750共振单位(RU)的捕获系统(例如，捕获特异性结合人IgG的单克隆抗体，Jackson Immunoresearch)的胺偶联。可以以5μg/ml的浓度捕获huFc标记的IFNAR2(RnD Systems，Cat-Nr.4015-AB)。可以通过以1.25μM的浓度注射人Fc-部分(huFc)混合物(Biodesign，Cat-Nr.50175)，封闭过量的结合位点。从0.1nM至50nM范围的不同浓度的干扰素或干扰素融合蛋白可以在298K以10μl/min的流速通过流动池，进行120-240秒以记录结合相(association phase)。可以监测解离相多达600秒，并可以通过转换样品溶液至运行缓冲液来触发所述解离相。可以通过用100mM磷酸溶液以30μl/min的流速洗涤1min，来再生表面。对于实验，可以选择由GE Healthcare供应的HBS-P+缓冲液(10mM HEPES，pH7.4，150mM NaCl，0.05％(v/v)表面活性剂P20)。
可以通过减去从空白偶联表面获得的响应，校正物质折射率差异(bulkrefractivce index difference)。还减去空白注射(＝双重参照)。
通过使用BIA评估4.1软件包分析用若干个不同的浓度获得的传感图曲线，可以确定定义为ka/kd的平衡解离常数(Kd)。按照合适的结合模型拟合数据。
为了确定人野生型干扰素α-2a的Kd，可以在IFNAR2包被的传感器芯片上注射0.1nM至50nM的干扰素α-2a。相应的传感图显示在图1a)中。对于人干扰素α-2a(其C端融合至人起源的Fc区)，可以在IFNAR2包被的表面以0.5nM至50nM的浓度注射此类融合蛋白。复合体的稳定性从干扰素α-2a的35秒增加至干扰素α-2a Fc部分融合蛋白的23min。亲和力分别从干扰素α-2a的4nM增加至融合蛋白的0.3nM的显著亲和力。由于IFNAR1对于活性是重要的，因此仅能够确定初始结合。通过此类测定不能确定干扰素信号传递活性。在一个实施方案中，融合蛋白与IFNAR2具有1nM或更低的结合亲和力。
2.抗体片段
在某些实施方案中，融合蛋白的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段，和下文所述的其他片段。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134。对于scFv片段的综述，参见例如，Plueckthun，In：ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg and Moore(编著)，Springer-Verlag，New York，第269-315页(1994)；WO93/16185；US5,571,894和5,587,458。对于包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半寿期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见US5,869,046。
双抗体是具有2个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如，EP0404097；WO1993/01161；Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134；Hollinger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448。Hudson，P.J.等人，Nat.Med.9(2003)129-134中还描述了三抗体和四抗体。
单一结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单一结构域抗体是人的单一结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如，US6,248,516)。
可以通过各种技术制备抗体片段，所述技术包括但不限于通过如本文所述的重组宿主细胞(例如，大肠杆菌或噬菌体)进行的生产。
3.嵌合的和人源化的抗体
在某些实施方案中，融合蛋白的抗体是嵌合抗体。某些嵌合的抗体报道在例如US4,816,567；和Morrison，L.E.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855中。在一个实例中，嵌合抗体包括非人可变区(即，源自小鼠的可变区)和人起源的恒定区。在另一实例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，它的类或亚类已经从亲本抗体改变。嵌合的抗体包括它的抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。一般而言，人源化抗体包括一个或多个可变结构域，在所述可变结构域中的HVR(例如，CDR)(或其部分)源自非人抗体，而FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人起源的恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被用来自非人抗体(例如，HVR残基来源的抗体)的相应残基取代，以例如重建或改善抗体的特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中综述，并进一步报道在例如Riechmann，L.等人，Nature332(1988)323-327；Queen，C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；US5,821,337；US7,527,791；US6,982,321和US7,087,409；Kashmiri，S.V.等人，Methods36(2005)25-34(报道了SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28(1991)489-498(报道了“重修表面”)；Dall’Acqua，W.F.等人，Methods36(2005)43-60(报道了“FR改组”)；和Osbourn，J.等人，Methods36(2005)61-68与Klimka，A.等人，Br.J.Cancer83(2000)252-260(报道了FR改组的“指导选择”方法)。
可用于人源化的人构架区包括但不限于：使用″最佳拟合″方法选择的构架区(参见例如Sims，J.E.等人，J.Immunol.151(1993)2296-2308)；源自人抗体特定亚类的轻链或重链可变区的共有序列的构架区(参见例如Carter，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1992)4285-4289；Presta，L.G.等人，J.Immunol.151(1993)2623-2632)、人成熟(体细胞突变)的构架区或人种系构架区(参见例如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)，和源自筛选FR文库的构架区(参见例如Baca，M.等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684；Rosok，M.J.等人，J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
4.人抗体
在某些实施方案中，融合蛋白的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体一般描述在van Dijk，M.A.和van deWinkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374；Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459中。
可以通过对转基因动物施用免疫原，制备人抗体，所述转基因动物已经被修饰以对抗原攻击应答来产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部的或部分的人免疫球蛋白基因座，其替换了内源性免疫球蛋白基因座，或存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座一般是已经失活的。对于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，N.，Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。还参见例如US6,075,181和US6,150,584，报道了XENOMOUSETM技术；US5,770,429，报道了
Figure BDA00002822290200251
技术；US7,041,870，报道了K-M
Figure BDA00002822290200252
技术；和US2007/0061900，报道了
Figure BDA00002822290200253
技术。例如，通过不同的人恒定区组合，可以进一步修饰由此类动物产生的完整抗体的人可变区。
还可以通过基于杂交瘤的方法制备人抗体。已报道了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和鼠-人异骨髓瘤细胞系(参见例如，Kozbor，D.，J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)pp.51-63；Boerner，P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述在Li，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103(2006)3557-3562中。额外的方法包括描述在例如US7,189,826(报道了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，J.，Xiandai Mianyixue26(2006)265-268(报道了人-人杂交瘤)中的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)还报道在Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Histology and Histopathology20(2005)927-937；Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology27(2005)185-191中。
还可以通过分离从人衍生的噬菌体展示文库中选择的Fv克隆可变结构域序列，产生人抗体。然后，可以组合此类可变结构域序列与所希望的人恒定结构域。下文描述了从抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
包含在本发明的融合蛋白中的抗体可以通过筛选组合文库中具有所希望活性的抗体而分离。例如，本领域已知用于产生噬菌体展示文库和筛选此类文库中具有所希望的结合特征的抗体的多种方法。此类方法在例如Hoogenboom，H.R.等人，Methods in Molecular Biology178(2001)1-37(O’Brien等人编著，Human Press，Totowa，NJ)中进行了综述，并进一步报道在例如McCafferty，J.等人，Nature348(1990)552-554；Clackson，T.等人，Nature352(1991)624-628；Marks，J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597；Marks，J.D.等人，in Methods in Molecular Biology248(2003)161-176；Sidhu，S.S.等人，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee，C.V.等人，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(2004)12467-12472；Lee，C.V.等人，J.Immunol.Methods284(2004)119-132。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的所有组成成分，并在噬菌体文库中随机重组，然后可如Winter，G.等人，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455所述筛选在所述文库中结合抗原的噬菌体。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段展示抗体片段。来自免疫源的文库提供了对免疫原的高亲和力的抗体，而不需要构建杂交瘤。备选地，如Griffiths，A.D.等人，EMBO J.12(1993)725-734所述，可以克隆初生的所有组成成分(例如，从人)，以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原而不用任何免疫的单一来源抗体。最后，如Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388中的报道，还可以通过从干细胞克隆未重排的V基因片段，和使用含有随机序列的PCR引物以编码高可变CDR3区且在体外实现重排，来合成地制备初生文库。报道了人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如US5,750,373；US2005/0079574；US2005/0119455；US2005/0266000；US2007/0117126；US2007/0160598；US2007/0237764；US2007/0292936和US2009/0002360。
分离自人抗体文库的抗体或抗体片段被认为是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本文报道的融合蛋白包含为多特异性抗体，例如双特异性抗体的抗体。多特异性抗体是对至少两个不同的位点具有结合特异性的单克隆抗体。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。
制备多特异性抗体的技术包括但不限于两个具有不同特异性的免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein，C.和Cuello，A.C.，Nature305(1983)537-540)；WO93/08829；和Traunecker，A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)和“knob-in-hole”改造(参见例如，US5,731,168)。还可以如下制备多特异性抗体，通过改造静电指向效应(electrostaticsteering effect)来制备抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004)；交联两个或多个抗体或片段(参见例如，US4,676,980；和Brennan，M.等人，Science229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用″双抗体″技术来制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber，M.等人，J.Immunol.152(1994)5368-5374)；如例如Tutt，A.等人，J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。
具有三个或四个功能性抗原结合位点的改造抗体，包括“Octopus抗体”(参见例如，US2006/0025576)也包括在本文中。
抗体或片段还包括“双作用的Fab(Dual Acting Fab)”或“DAF”，其包含结合第一个抗原和另一个不同抗原的抗原结合位点(例如参见US2008/0069820)。
抗体或抗体片段还包括描述在WO2009/080251；WO2009/080252；WO2009/080253；WO2009/080254；WO2010/112193；WO2010/115589；WO2010/136172；WO2010/145792和WO2010/145793中的多特异性抗体。
7.抗体变体
在某些实施方案中，考虑了包含在本文提供的融合蛋白中的抗体的氨基酸序列变体。例如，所希望的是改进抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质。可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入恰当的修饰，或通过肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如在抗体的氨基酸序列中的残基缺失和/或插入和/或取代。可以产生缺失、插入和取代的任意组合，以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所希望的特征，例如结合抗原。
a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了包含具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体的融合蛋白。取代诱变的目的位点包括HVR和FR。保守性取代显示在表1的标题″优选的取代″下。更多的实质性改变提供在表1的标题″示例性取代″下，并在下文中对氨基酸侧链类别进行进一步描述。可以向抗体中引入氨基酸取代，并就所希望活性筛选产物，例如，保持的/改进的抗原结合、降低的免疫原性或改进的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA00002822290200291
氨基酸可以根据共有的侧链特性分类：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链定位的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe.
非保守取代将需要将这些种类之一的成员调换为另一种类的成员。
一类取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般而言，选择用于进一步研究的而得到的变体相对于亲本抗体具有某些生物学特性的修饰(例如，改进)(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学性质。示例性的取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以是例如使用如本文所述的基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地产生。简而言之，突变一个或多个HVR残基，在噬菌体上展示变体抗体，并筛选特定的生物学活性(例如，结合亲和力)。
可以产生HVR中的改变(例如，取代)，来例如提高抗体亲和力。可以产生HVR的“热点”和/或SDR(a-CDR)中的这类改变，所述热点即：由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2003)179-196)，并测试所得到的变体VH或VL的结合亲和力。例如在Hoogenboom，H.R.等人，Methods in Molecular Biology178(2001)1-37(O’Brien等人编著，HumanPress，Totowa，NJ)中，已经报道了通过构建和再选择次级文库进行亲和力成熟。
在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法的任一种向所选择的成熟的可变基因中引入多样性(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)。然后产生次级文库。之后，筛选该文库，以鉴定具有所希望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，在所述方法中随机化若干HVR残基(例如，每次4-6个残基)。例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异地鉴定抗原结合所涉及的HVR残基。特别是经常靶定CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以存在一个或多个HVR中的取代、插入或缺失，只要此类改变基本上不降低抗体结合其抗原的能力。例如，可以产生HVR中的基本不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守取代)。此类改变可以位于HVR的“热点”或SDR以外。在某些实施方案中，在上文提供的变体VH和VL序列中，每个HVR都是未改变的，或含有不超过1、2或3个氨基酸的取代。
用于鉴定可以靶向诱变的抗体残基或区域的有用的方法被称为″丙氨酸扫描诱变″，其如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science244(1989)1081-1085所述。在这种方法中，鉴定并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多聚丙氨酸)替换残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、lys和glu)，以确定是否影响抗体与抗原的相互作用。还可以在对起始取代显示功能性敏感的氨基酸位置引入其他取代。备选地或额外地，抗原-抗体复合体的晶体结构用于鉴别抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基，作为取代的候选者。可以筛选变体，以确定其是否具有所希望的性质。
氨基酸序列的插入物包括长度范围从1个残基至含有上百个残基或以上的多肽的氨基端和/或羧基端的融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入物。末端插入物的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，本文提供的融合蛋白包含被改变以增加或降低抗体糖基化程度的抗体。通过改变氨基酸序列，使得产生或去除了一个或多个糖基化位点，可以方便地实现在抗体中添加或缺失糖基化位点。
当抗体包括Fc区时，可以改变与其连接的糖。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双触角的寡糖，所述寡糖一般通过N-连接连接到Fc区的CH2结构域的Asn297上(参见例如Wright，A.等人，TIBTECH15(1997)26-32)。寡糖可以包括多种糖，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸(NANA，Neu5Ac)，以及与双触角的寡糖结构的“茎”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以进行抗体中的寡糖的修饰，以产生具有某些改良性质的抗体变体。
在一个实施方案中，抗体具有缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的糖结构。例如，此类抗体中的岩藻糖的量可以从1％至80％，从1％至65％，从5％至65％，从5％至20％或从20％至40％。相对于例如如WO2008/077546中报道的，通过MALDI-TOF质谱测量的与Asn297连接的全部糖结构(例如，复杂的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，通过计算在Asn297处的糖链内的岩藻糖平均量，来确定岩藻糖的量。Asn297指位于Fc区的约第297位(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基。然而，由于抗体中的较小的序列变化，Asn297还可以位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即，在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改良的ADCC功能(参见例如US2003/0157108和US2004/0093621)。涉及“去岩藻糖基化”或“岩藻糖缺陷型”抗体变体的出版物实例包括：US2003/0157108；WO2000/61739；WO2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO2003/085119；WO2003/084570；WO2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki，A.等人，J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。能够产生去岩藻糖基化抗体的细胞系实例包括蛋白岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka，J.等人，Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US2003/0157108；WO2004/056312,，尤其是实施例11)，和敲除细胞系，例如敲除α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki，N.等人，Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda，Y.等人，Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；WO2003/085107)。
提供了包含具有二分寡糖(bisected oligosaccharide)的抗体的其他融合蛋白，例如，在所述二分寡糖中与抗体的Fc区连接的双触角寡糖被GlcNAc二分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改良的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述在例如WO2003/011878；US6,602,684和US2005/0123546中。还提供了包含寡糖中的至少1个半乳糖残基与Fc区连接的抗体的融合蛋白。此类抗体变体可具有改良的CDC功能。此类抗体变体描述在例如WO1997/30087；WO1998/58964和WO1999/22764中。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以在本文提供的融合蛋白的抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如取代)的人来源的Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在某些实施方案中，本发明考虑了包含具有一些但并非全部效应子功能的抗体变体的融合蛋白，使其成为这样的应用的所希望的候选者，在所述应用中，抗体的体内半寿期是重要的，而某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必需或有害的。可以进行体外和/或体内的细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但保留了FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞——NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.(Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492)的464页的表3中概括了在造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例报道在US5,500,362(参见例如，Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063)和Hellstrom，I.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)1499-1502；US5,821,337(参见Brueggemann，M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。备选地，可以使用非放射性的测定方法(参见例如，用于流式细胞仪的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI))。用于此类测定的有效的效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或额外地，例如，如Clynes，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(1998)652-656中公开的，可以评估体内，例如在动物模型中的目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q，因而缺少CDC活性(参见例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体的激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro，H.等人，J.Immunol.Methods202(1997)163-171；Cragg，M.S.等人，Blood101(2003)1045-1052；和Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法，确定FcRn的结合和体内清除率/半寿期(参见例如，Petkova，S.B.等人，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个取代的那些抗体(参见例如US6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在两个或多个氨基酸位置265、269、270、297和327处取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的、所称作“DANA”的Fc变体(US7,332,581)。
报道了对FcR具有改进的或降低的结合的某些抗体变体(参见例如，US6,737,056；WO2004/056312；Shields，R.L.等人，J.Biol.Chem.9(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，抗体包含具有一个或多个改进了ADCC的氨基酸取代的Fc区，所述取代例如，在Fc区的位置第298位、第333位和/或第334位的取代(残基的EU编号)。
在一些实施方案中，例如US6,194,551、WO99/51642和Idusogie，E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184中报道的，在抗体Fc区产生的改变导致改变的(即，增强的或减弱的)C1q结合和/或补体依赖细胞毒性(CDC)。
在US2005/0014934中报道了这样的抗体，所述抗体具有增加的半寿期，和对新生儿Fc受体(FcRn)增强的结合，所述FcRn负责将母体IgG转移到胎儿中(Guyer，R.L.等人，J.Immunol.117(1976)587-593和Kim，J.K.等人，Eur.J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含具有在其中一个或多个取代的Fc区，所述取代增强了Fc区对FcRn的结合。此类Fc变体包括具有在以下的一个或多个Fc区残基上取代的那些变体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc区残基434(US7,371,826)。
还参见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature332(1988)738-740；US5,648,260；US5,624,821和WO94/29351关于Fc区变体的其他实例。
B.重组方法和组合物
例如如US4,816,567中报道的，可以使用重组方法和组合物产生融合蛋白和抗体。在一个实施方案中，提供了编码本文报道的融合蛋白的一个或多个分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一个或多个载体(例如表达载体)。在一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经被转化或转染了)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一个载体，和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二个载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仑鼠肾(BHK)细胞或人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在一个实施方案中，提供了制备本文报道的融合蛋白的方法，其中所述方法包括在适合表达融合蛋白的条件下，培养包含编码上文提供的融合蛋白的核酸的宿主细胞，和任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收融合蛋白。
为了重组产生本文报道的融合蛋白，分离例如上文所述的、编码融合蛋白的核酸，并将其插入到用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达的一个或多个载体中。使用常规方法可以容易地分离此类核酸并进行测序。
用于克隆或表达编码融合蛋白的载体的合适的宿主细胞包括本文报道的原核或真核细胞。例如，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，可以在细菌中产生融合蛋白。对于在细菌中表达片段和多肽，参见例如US5,648,237；US5,789,199和US5,840,523，还参见Charlton，Methods inMolecular Biology，第248卷，Lo，B.K.C.(编著)，Humana Press，Totowa，NJ，(2003)，第245-254页，其报道了在大肠杆菌中表达抗体片段。在表达后，融合蛋白可以以可溶的级分从细菌细胞浆中被分离，并可以被进一步纯化。
除原核细胞外，真核微生物如丝状真菌或酵母，包括糖基化途径已经被“人源化”的真菌和酵母菌株是编码融合蛋白的载体的合适的克隆或表达宿主，导致产生的融合蛋白具有部分或完全的人糖基化模式(参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；Li，H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用于表达糖基化融合蛋白的合适的宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了多种杆状病毒株，其可用于与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主(参见例如US5,959,177；US6,040,498；US6,420,548；US7,125,978和US6,417,429(报道了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
还可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，可使用适应悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)、人胚肾系(报道在例如Graham，F.L.等人，J.GenVirol.36(1977)59-74)中的293或293细胞)、幼地鼠肾细胞(BHK)、小鼠支持细胞(报道在例如Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中的TM4细胞)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人子宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、水牛鼠肝细胞(BRL3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)、报道在例如Mather，J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中的TRI细胞、MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77(1980)4216-4220)和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合融合蛋白的产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki，P.J.和Wu，A.M.，Methods in MolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo，编著，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。
C.药物制剂
通过混合具有所希望纯度的融合蛋白与一个或多个任选的可药用载体(Reminggton′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(编著)(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式，制备本文报道的融合蛋白的药物制剂。可药用的载体在所使用的剂量和浓度下一般对接受者是无毒的，并且可药用的载体包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化己烷双胺、苯扎氯胺、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽、蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他的糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反荷离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性的可药用载体还包括间质性药物分散剂，如可溶性中性活性的透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuPH20(BaxterInternational，Inc.)。某些示例性的sHASEGP(包括rhuPH20)和使用方法报道在US2005/0260186和US2006/0104968中。
在一个方面，sHASEGP与一个或多个额外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
US6,267,958中报道了示例性的冻干的抗体制剂。水性抗体制剂包括US6,171,586和WO2006/044908中报道的，后者的制剂包括组氨酸醋酸盐缓冲液。
对于所治疗的特定适应症，本文中的制剂还可以根据需要含有一种以上的活性成分，优选地是具有互补的活性且彼此无不利的影响的那些活性成分。此类活性成分以对于预期目的有效的量合适地组合存在。
在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米囊)或粗滴乳状液中，活性成分可以被捕获在通过例如凝聚技术或界面聚合法制备的微胶囊中，分别例如为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基异丁烯酸微胶囊。此类技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，，第16版，Osol，A.(编著)(1980)中。
可以制备缓释制品，缓释制品的合适实例包括含有融合蛋白的固态疏水聚合物的半渗透基质，所述基质是成型物体的形式，例如膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂一般是无菌的。可以通过例如无菌过滤膜过滤，容易地实现灭菌。
D.治疗方法和组合物
本文提供的任何融合蛋白都可用于治疗方法中。
在一个方面，本发明提供了融合蛋白在生产或制备药物中的用途。
在一个方面，本发明提供了治疗乙肝病毒感染的方法。
在一个方面，本发明提供了包含本文提供的任何融合蛋白的药物制剂，例如其用于任何上述治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何融合蛋白和可药用载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何融合蛋白和至少一种额外的治疗剂，例如如下文所述的。
本发明的融合蛋白可以在治疗中单独使用或与其他活性剂组合使用。例如，本发明的融合蛋白可以与至少一种额外的治疗剂共同施用。
上文提及的此类组合治疗包括组合施用(其中两种或多种治疗剂包括在相同或单独的制剂中)和单独施用，在此情况下，本发明的融合蛋白的施用可以发生在额外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后。
可以通过任何合适的方法施用本发明的融合蛋白(和任何其他治疗剂)，所述方法包括肠胃外、肺内和鼻内、以及病灶内(当需要局部治疗时)的施用。肠胃外的输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任何合适的途径，例如部分地取决于施用是否是短暂的或长期性的，通过注射，例如静脉内或皮下注射给药。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在多个时间点的单次或多次施用、快速浓注施用和脉冲输注。
本发明的融合蛋白可以以与良好医疗实践一致的方式配制、给药和施用。在此情况下考虑的因素包括待治疗的特定病症、待治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病因、活性剂的递送位点、施用方法、施用方案和医师已知的其他因素。融合蛋白不是必须但可任选地与当前用于预防或治疗被考虑的病症的一种或多种活性剂一起配制。此类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的融合蛋白的量、病症或治疗的类型和上文讨论的其他因素。一般以与本文所述相同的剂量和施用途径使用所述活性剂，或者以本文所述剂量的约1％至99％，或者以在经验/临床上确定的适当的任何剂量和任何途径使用所述活性剂。
为了预防或治疗疾病，本发明的融合蛋白的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他的额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、融合蛋白是否施用于预防性或治疗性目的、先前的治疗、患者的临床史和对融合蛋白的应答，以及主治医师的考虑。融合蛋白在一次或一系列的治疗中适当地施用给患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1mg/kg-10mg/kg)的融合蛋白可以是施用给患者的起始候选剂量，不论是通过例如一次或多次分别施用，或通过连续输注。取决于上文提及的因素，一种典型的日常剂量的范围可以是从约1μg/kg至100mg/kg或以上。对于在若干天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗一般持续到出现疾病症状的所希望的抑制。融合蛋白的一种示例性剂量的范围将是从约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的剂量。可以间隔地施用此类剂量，例如，每周或每三周施用(例如，使患者接受约2个至约20个剂量的抗体，或者例如约6个剂量的抗体)。可以施用初始的较高负荷剂量，之后施用一个或多个较低的剂量。
E.物品
在本发明的一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的物品。物品包含容器，和位于容器上，或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料，如玻璃或塑料制成。该容器内有组合物，并具有无菌入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)，其中所述组合物自身或与另一种组合物组合后，可有效治疗、预防和/或诊断病症。组合物中的至少一种活性剂是本文报道的融合蛋白。标签或包装插页指示了组合物用于治疗的病症选项。此外，物品可以包含(a)其中含有组合物的第一个容器，其中所述组合物包括本文报道的融合蛋白，和(b)其中含有组合物的第二个容器，其中所述组合物包含其他治疗剂。在本发明的这一实施方案中的物品可以进一步地包含这样的包装插页，其指示组合物可用于治疗特定的病症。备选地或额外地，物品可以进一步地包含含有可药用的缓冲液的第二个(或第三个)容器，所述缓冲液例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸缓冲盐水、任氏液和葡萄糖溶液。还可以包括从商业和用户的观点所希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针和注射器。
III.序列描述
SEQ ID NO：01乙肝病毒包膜蛋白的氨基酸序列(乙肝病毒C型基因型adr亚型(分离群Japan/A4/1994)(HBV-C))
SEQ ID NO：02乙肝病毒核心蛋白的氨基酸序列(乙肝病毒C型基因型adr亚型(分离群Japan/A4/1994)(HBV-C))
SEQ ID NO：03成熟人干扰素α-2a的氨基酸序列
SEQ ID NO：04c18/A2mAb的CDR-H1氨基酸序列
SEQ ID NO：05c18/A2mAb的CDR-H2氨基酸序列
SEQ ID NO：06c18/A2mAb的CDR-H3氨基酸序列
SEQ ID NO：07鼠重链可变结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO：08c18/A2mAb的CDR-L1氨基酸序列
SEQ ID NO：09c18/A2mAb的CDR-L2氨基酸序列
SEQ ID NO：10c18/A2mAb的CDR-L3氨基酸序列
SEQ ID NO：11鼠轻链可变结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO：12c18/A2mAb的嵌合鼠-人重链氨基酸序列
SEQ ID NO：13C末端c18/A2抗体重链干扰素-α2a抗体融合物的嵌合鼠-人氨基酸序列
SEQ ID NO：14c18/A2mAb的嵌合鼠-人轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：15C末端c18/A2抗体轻链干扰素-α2a抗体融合蛋白的嵌合鼠-人氨基酸序列
SEQ ID NO：16人Ig kappa轻链恒定结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO：17人Ig lambda轻链恒定结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO：18人IgG1恒定区(白种人同种异型)的氨基酸序列
SEQ ID NO：19人IgG1恒定区(美国黑人同种异型)的氨基酸序列
SEQ ID NO：20人IgG1恒定区变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：21人IgG4恒定区的氨基酸序列
SEQ ID NO：22人IgG4恒定区变体的氨基酸序列
SEQ ID NO：23接头1的氨基酸序列
SEQ ID NO：24接头2的氨基酸序列
SEQ ID NO：25接头3的氨基酸序列
SEQ ID NO：26接头4的氨基酸序列
SEQ ID NO：27接头5的氨基酸序列
SEQ ID NO：28接头6的氨基酸序列
SEQ ID NO：29HBV包膜衍生的肽片段
SEQ ID NO：30HBV核心衍生的的肽片段
SEQ ID NO：31HBV包膜衍生的的肽片段
SEQ ID NO：32e183/A2mAb的CDR-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO：33e183/A2mAb的CDR-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO：34e183/A2mAb的CDR-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO：35针对SEQ ID NO：01的氨基酸残基182至190的HBV包膜肽片段的抗体的鼠重链可变结构域的氨基酸序列
SEQ ID NO：36e183/A2mAb的CDR-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO：37e183/A2mAb的CDR-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO：38e183/A2mAb的CDR-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO：39针对SEQ ID NO：01的氨基酸残基182至190的HBV包膜肽片段的抗体的鼠轻链可变结构域的氨基酸序列
实施例
下文是本发明的方法和组合物的实例。考虑上文提供的一般性描述，理解还可以实践多种其他实施方案。
材料&方法
在Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，第1-3卷，Public Health Service，NIH Publication No91-3242给出了关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。
根据EU编号计数抗体链的氨基酸(Edelman，G.M.等人，PNAS63(1969)78-85；Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，第1-3卷，Public Health Service，NIHPublication No91-3242)。
重组DNA技术
使用如Sambrook，J.等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)所述的标准方法来操作DNA，。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
DNA序列的测定
通过在SequiServe GmbH(Vaterstetten，Germany)处进行的双链测序，测定DNA序列。
DNA和蛋白序列分析和序列数据管理
使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包variant10.2和Infomax的Vector NTI Advance suite variant8.0进行序列产生、作图、分析、注解和说明。
基因合成
由Geneart GmbH(Regensburg，Germany)制备编码小鼠c18/A2mAb和e183/A2mAb的重链和轻链可变结构域的所希望的基因片段。基因片段侧翼是单数的限制性内切酶切割位点，以有利于如下文所述的表达构建体的克隆。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。
实施例1
嵌合的鼠-人c18/A2TCR样抗体干扰素-α2a融合蛋白的表达质粒的产生
通过将化学合成的编码成熟人IFN-α2a的DNA片段和由2个Gly4Ser重复组成的甘氨酸-丝氨酸接头融合至c18/A2TCR样抗体重链基因的3’端，来组装嵌合的鼠-人c18/A2TCR样抗体重链干扰素-α2a融合基因(重链...LSPG--GGGSGGGGS--IFNa2a)，其中所述c18/A2TCR样抗体重链基因编码略微截短的人γ-1重链恒定区(去除了最后一个天然氨基酸Lys)。
嵌合的鼠-人c18/A2TCR样亲代抗体的表达质粒的产生
将编码小鼠c18/A2TCR样mAb kappa轻链(VK)和重链可变区(VH)的基因片段分别连接至编码人kappa轻链恒定区(CK)或人γ-1重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的基因片段。两个抗体链基因都是从包括抗体基因的基因组外显子-内含子结构的两个单独的表达质粒中表达的。
抗体链的表达受来自人巨细胞病毒(HCMV)的删除了缩短的内含子A的立即早期增强子和启动子的控制，所述启动子包括人重链免疫球蛋白的5’-非翻译区(UTR)、鼠免疫球蛋白重链信号序列和来自牛生长激素的强多聚腺苷酸化信号。表达质粒还含有来自载体pUC18的复制起点和β-内酰胺酶基因(用于在大肠杆菌中的质粒扩增)和任选的新霉素抗性基因(用于稳定转染的哺乳动物细胞系的产生/选择)。
a)质粒9924
质粒9924是用于在HEK293细胞中瞬时表达嵌合的鼠-人c18/A2TCR样抗体γ1-重链IFN-α2a融合蛋白(基因组结构的表达盒；外显子-内含子结构)的表达质粒。
除c18/A2TCR样抗体γ1-重链IFN-α2a表达盒外，这个载体还含有：
-来自载体pUC18的复制起点，其允许这个质粒在大肠杆菌中复制，和
-赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
编码在SEQ ID NO：13中给出的成熟c18/A2TCR样抗体γ1-重链IFN-α2a融合蛋白的c18/A2TCR样抗体γ1-重链IFN-α2a融合基因转录单元包含下列元件：
-来自人巨细胞病毒(CMV)的立即早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白的5’-非翻译区(UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，其包括信号序列内含子(信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2])，
-可变重链编码片段(SEQ ID NO：07)，其在5’端(L2信号序列)排列了唯一的BsmI限制性位点，在3’端排列了剪接供体位点和唯一的XhoI限制性位点，
-截短的小鼠/人重链杂合内含子2，其包括小鼠重链增强子元件(部分JH3、JH4)(参见例如，Neuberger，M.S.，EMBO J.2(1983)1373-1378)，
-基因组结构的人γ1-重链基因恒定区，其中已经删除了编码C端Lys的最后的密码子，
-甘氨酸-丝氨酸接头(SEQ ID NO：23)
-成熟的人IFNa2a基因(SEQ ID NO：03)和
-牛生长激素的多聚腺苷酸化(BGH pA)信号序列。
重链表达质粒9924的质粒图显示在图2中。
b)质粒9922
质粒9922是用于在HEK293细胞中瞬时表达嵌合的鼠-人c18/A2TCR样抗体轻链(基因组结构的表达盒；外显子-内含子结构)的表达质粒。
除c18/A2TCR样抗体κ轻链表达盒外，这个载体还含有：
-SV40启动子
-新霉素抗性基因作为选择标记，
-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，和
-赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
编码SEQ ID NO：14中给出的成熟c18/A2TCR样抗体κ-轻链蛋白的c18/A2TCR样抗体κ-轻链基因转录单元由下列元件组成：
-来自人巨细胞病毒(CMV)的立即早期增强子和启动子，
-人重链免疫球蛋白的5’-非翻译区(UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列，其包括信号序列内含子(信号序列1、内含子、信号序列2[L1-内含子-L2])，
-可变轻链编码片段(SEQ ID NO：11)，其在5’端(L2信号序列)排列了唯一的BsmI限制性位点，在3’端排列了剪接供体位点和唯一的BamHI限制性位点，
-截短的人kappa轻链内含子2
-人kappa轻链基因恒定区，和
-牛生长激素的多聚腺苷酸化(BGH pA)信号序列。
轻链表达质粒9922的质粒图显示在图3中。
实施例2
嵌合的鼠-人e183/A2TCR样抗体IFN-α2a融合蛋白的表达质粒的产生
以对嵌合的鼠-人c18/A2TCR样抗体IFN-α2a融合基因描述的相同方式，装配嵌合的鼠-人e183/A2TCR-L抗体IFN-α2a融合基因，以得到表达质粒9976(抗体重链-IFN-α2a融合基因)、9977(抗体轻链基因)。
实施例3
免疫球蛋白-干扰素α融合蛋白在HEK293细胞中的瞬时表达、纯化和分析表征
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.)中培养的HEK293细胞(人胚肾细胞系293衍生的)，产生免疫球蛋白-干扰素α融合蛋白。转染使用″293-Free″转染试剂(Novagen)。使用等摩尔比值的轻链：重链编码质粒，从两种不同的质粒表达免疫球蛋白轻链和重链。如″293-Free″生产商的说明中指定的进行转染。在转染7天后，收获含融合蛋白的细胞培养上清液。在纯化前，将上清液储藏在低温下。
在Meissner，P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中给出了关于在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息。
通过两个层析步骤过滤和纯化含抗体的培养上清液。使用0.1M的pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡过的蛋白A SepharoseTMCL-4B(GE Healthcare)，通过亲和层析捕获抗体。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白，用0.1M pH3.5的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，然后立即用1M Tris碱中和至pH6.0。使用Superdex200TM(GE Healthcare)上的尺寸排阻层析作为第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液，0.14M NaCl，pH6.0中进行尺寸排阻层析。用装配了Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心滤器单位浓缩洗脱的抗体，并储藏在-80℃。
通过测量280nm处的光密度(OD)，使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数来测定抗体和抗体融合物的蛋白质浓度。在存在和缺乏还原剂(5mM1，4--二硫苏糖醇)的条件下，通过SDS-PAGE和用考马斯亮蓝染色分析抗体和抗体融合物的纯度和正确的四聚体形成。使用SK3000SWxl分析级尺寸排阻柱(Tosohaas，Stuttgart，Germany)，通过高效SEC分析抗体和抗体融合物制品的聚集量。在用肽-N-糖苷酶F(Peptide-N-Glycosidase F)(Roche Molecular Biochemicals)酶处理，去除N-聚糖后，通过Nano Electrospray QTOF质谱，验证还原抗体和抗体融合物轻链和重链的氨基酸骨架的完整性。
实施例4
测定结合亲和力
使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，在pH4.5在CM5芯片上，进行约750共振单位(RU)的捕获系统(特异性针对人IgG的捕获mAb，Jackson Immunoresearch)的胺偶联。以5μg/ml的浓度捕获HuFc-标记的IFNAR2(RnD Systems，Cat-Nr.4015-AB)。通过以1.25μM的浓度注射huFc混合物(Biodesign，Cat-Nr.50175)，封闭过量的结合位点。从0.1nM至50nM范围的不同浓度的干扰素或干扰素融合物在298K以10μl/min的流速通过流动池，进行120-240秒，以记录结合相。可以监测解离相达600秒，并可以通过转换样品溶液至运行缓冲液来触发所述解离相。可以通过用流速为30μl/min的100mM磷酸溶液洗涤1min，来再生表面。所有的实验都选用由GE Healthcare供应的HBS-P+缓冲液(10mMHEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))，pH7.4，150mM NaCl，0.05％(v/v)表面活性剂P20)。
通过减去从空白偶联表面获得的响应，校正物质折射率差异。还减去空白注射(＝双重参照)。
使用BIA评估4.1软件包分析用若干种不同的浓度获得的传感图曲线，可以确定定义为ka/kd的平衡解离常数(Kd)。按照合适的结合模型拟合数据。
对于野生型IFNα-2a，在IFNAR2包被的传感器芯片上注射0.1nM至50nM的干扰素α-2a，如图1a)所示。对于C端融合至huFc片段的IFNα-2a，可以在IFNAR2包被的表面以0.5nM至50nM的浓度注射此类蛋白。由于是二价结合，复合体的稳定性从IFNα-2a的35秒增加至Fc IFNα-2a融合物的23min。分别地，亲和力从IFNα-2a的4nM增加至0.3nM的显著亲和力。由于IFNAR1对于活性是重要的，因此仅能够确定初始结合。通过此类测定不能确定干扰素信号传递的活性。
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Claims (35)

1.融合蛋白，其包含特异地结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体和抗病毒细胞因子。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述乙肝病毒蛋白的肽片段具有SEQ ID NO：01的氨基酸残基182至190的氨基酸序列，或具有SEQ IDNO：02的氨基酸残基18至27的氨基酸序列。
3.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体特异地结合被乙肝病毒感染的肝细胞。
4.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗病毒细胞因子选自I型和/或II型干扰素。
5.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白与携带CD8的T细胞具有相同的特异性。
6.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体不是特异地结合血清的乙肝病毒抗原。
7.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体是单克隆抗体。
8.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体是人、人源化或嵌合抗体。
9.根据权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体是结合呈递乙肝病毒蛋白的肽片段的人主要组织相容性复合物的抗体片段。
10.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的CDR-H3，(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-L3，和(c)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的CDR-H2，或其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H3，(b)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-L3，和(c)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H2。
11.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：04的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：05的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：06的氨基酸序列的CDR-H3，或其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列的CDR-H1，(b)包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDR-H2，和(c)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的CDR-H3。
12.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：08的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO：09的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR-L3，或其中所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的CDR-L1，(b)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的CDR-L2，和(c)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的CDR-L3。
13.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体包含
(i)与SEQ ID NO：07的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VH序列；
与SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VL序列；或
与SEQ ID NO：07的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：11的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VL序列，
或
(ii)与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VH序列；
与SEQ ID NO：39的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VL序列；或
与SEQ ID NO：35的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO：39的氨基酸序列或其人源化变体具有至少95％序列同一性的VL序列，。
14.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体包含SEQ IDNO：07或SEQ ID NO：35的VH序列，或其人源化变体。
15.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体包含SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：39的VL序列，或其人源化变体。
16.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述一条或两条抗体重链具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。
17.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述一条或两条抗体轻链具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列。
18.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述一条或两条抗体轻链具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列。
19.根据前面权利要求任一项的融合蛋白，其中所述抗体是全长人IgG1抗体，或包含截短的人γ-1重链恒定区
20.编码权利要求1的融合蛋白的分离的核酸。
21.编码权利要求16或18的抗体链的分离的核酸。
22.编码权利要求17的抗体轻链的分离的核酸。
23.包含权利要求20、或21和22的任一项的核酸的宿主细胞。
24.产生融合蛋白的方法，其包括培养权利要求23的宿主细胞，以便产生融合蛋白。
25.根据权利要求24的方法，其包括下列步骤：
(a)提供根据权利要求23的细胞，
(b)培养所提供的细胞，
(c)从细胞或培养基回收融合蛋白，从而产生融合蛋白。
26.药物制剂，其包含权利要求1至19的任一项的融合蛋白和可药用的载体。
27.权利要求1至19的任一项的融合蛋白，其用作为药物。
28.权利要求1至19的任一项的融合蛋白，其用于治疗乙肝病毒感染。
29.权利要求1至19的任一项的融合蛋白，其用于将抗病毒细胞因子递送至乙肝病毒感染的肝细胞。
30.权利要求1至19的任一项的融合蛋白在生产药物中的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述药物用于乙肝病毒感染的治疗。
32.权利要求31的用途，其中所述乙肝病毒感染是慢性乙肝病毒感染。
33.权利要求30的用途，其中所述药物用于将抗病毒细胞因子递送至乙肝病毒感染的肝细胞。
34.治疗具有乙肝病毒感染的个体的方法，其包括对个体施用有效量的权利要求1至19的任一项的融合蛋白。
35.向个体中的乙肝病毒感染的肝细胞递送抗病毒细胞因子的方法，其包括对个体施用有效量的权利要求1至19的任一项的融合蛋白，以将抗病毒细胞因子递送至乙肝病毒感染的肝细胞。
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