JP7208380B2 - リコンビナーゼ媒介性カセット交換を使用した多重特異性抗体スクリーニング法 - Google Patents
リコンビナーゼ媒介性カセット交換を使用した多重特異性抗体スクリーニング法 Download PDFInfo
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Description
抗体または抗体様タンパク質を、2つの異なる標的に結合するように操作することができる。軽鎖と重鎖の正しいアセンブリは、様々な方法で促進可能である(Brinkmann and Kontermann、2017)。このようなタンパク質の1つのクラスは、2つの異なる標的に対して向けられた2つの異なるFab断片を持つIgG様の二重特異性抗体である。例えば、1つの共通の軽鎖と2つの異なる重鎖を持つIgG(Merchantら、1998)、または2つの異なる軽鎖と2つの異なる重鎖を含むCrossMab((Regulaら、2018、Schaeferら、2011)である。分子工学を使用することにより、軽鎖と重鎖の正しいアセンブリが促進される。
a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込みの宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列を含み、第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、該組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
b)a)で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1および第3の組換え認識配列と一致する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む第1のベクターのライブラリであり、ここで、該2つの組換え認識配列は、2つ以上の外因性ヌクレオチド配列、および少なくとも1つの第2の選択マーカー(の一部)に隣接している、ライブラリ、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2および第3の組換え認識配列と一致する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む第2のベクターのライブラリであり、ここで、該2つの組換え認識配列は、2つまたは(さらに)それ以上の外因性ヌクレオチド配列に隣接している、ライブラリを導入すること、
c)i)b)の第1および第2のベクターライブラリと同時に、またはii)その後、順次、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該1つ以上のリコンビナーゼは、第1および第2のベクターの組換え認識配列を認識し、(場合によっては、該1つ以上のリコンビナーゼが、2つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する)、導入すること、ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法である。
a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込みの宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列を含み、第1の組換え認識配列と第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、該組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
b)a)で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1および第3の組換え認識配列と一致し、2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーコード配列(の一部)に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む第1のベクター、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2および第3の組換え認識配列と一致し、少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む第2のベクターを導入することであり、ここで、第1のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、該第2のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、該抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、該抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、導入すること、
c)i)b)の第1および第2のベクターと同時に、またはii)その後、順次、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該1つ以上のリコンビナーゼは、第1および第2のベクターの組換え認識配列を認識する(場合によっては、該1つ以上のリコンビナーゼが2つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する)、導入すること、ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法である。
該外因性ヌクレオチド配列は、以下の要素:第1、第2および第3の組換え認識配列、第1および第2の選択可能マーカー、ならびに第1から第4の発現カセットを含み、
該要素の5’から3’の配列は、
RRS1-第1のEC-第2のEC-RRS3-SM1-第3のEC-第4のEC-RRS2-SM2であり、ここで、RRSは組換え認識配列、ECは発現カセット、SMは選択マーカーである。
i)第1の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする核酸、およびポリA部位を含み(場合によっては、ターミネーター配列を含む)、
ii)第2の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする核酸、およびポリA部位を含み(場合によっては、ターミネーター配列を含む)、
iii)第3の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸(ドメインクロスオーバーなし)、およびポリA部位を含み(場合によっては、ターミネーター配列を含む)、
iv)第4の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、抗体重鎖をコードする核酸(ドメインクロスオーバーなし)、およびポリA部位を含む(場合によっては、ターミネーター配列を含む)。
a)本発明による、または本発明による方法で調製される組換え宿主細胞を提供することと、
b)a)の組換え宿主細胞を培養し、細胞または培養培地から二重特異性抗体を回収することと
を含む。
[本発明1001]
二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
(a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供することであって、ここで、前記外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
(b)前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1および第3の組換え認識配列と一致しかつ2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第1のベクターのライブラリ、ならびに
前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2および第3の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第2のベクターのライブラリ
を、(a)で提供される細胞に導入することであって、ここで、前記4つの外因性ヌクレオチド配列のうち、1つは前記二重特異性抗体の第1の軽鎖、1つは前記二重特異性抗体の第2の軽鎖、1つは前記二重特異性抗体の第1の重鎖、および1つは前記二重特異性抗体の第2の重鎖をコードする、導入すること、
(c)(i)(b)の第1および第2のベクターのライブラリと同時に、または(ii)その後順次に、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記第1および第2のベクターの前記組換え認識配列を認識し、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記組換え認識配列を認識して、2つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する、導入すること、ならびに
(d)前記第2の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法。
[本発明1002]
前記第1および第2のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記第1および第2のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および同族の抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含む、本発明1001から1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記第1または第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、他方のベクターが、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列を含む、本発明1001から1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、一方のベクターでは、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、他方のベクターでは、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、本発明1001から1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記第1または第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、本発明1001から1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、本発明1001から1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、本発明1001から1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、前記第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、本発明1001から1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製するための方法であって、
(a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供することであって、ここで、前記外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、提供すること、
(b)前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1および第3の組換え認識配列と一致しかつ2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第1のベクター、ならびに
前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2および第3の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第2のベクター
を、(a)で提供される細胞に導入することであって、ここで、前記第1のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、前記第2のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、導入すること、
(c)(i)(b)の第1および第2のベクターと同時に、または(ii)その後順次に、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記第1および第2のベクターの前記組換え認識配列を認識する、導入すること、ならびに
(d)前記第2の選択マーカーを発現しかつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択すること
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法。
[本発明1013]
前記第1のベクターが、コドンATGに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、前記プロモーター配列は、上流に前記(2つの)外因性ヌクレオチド配列が隣接し(すなわち、前記外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され)、前記ATGコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し(すなわち、組換え認識配列の上流に配置され)、前記第2のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接しかつ下流に前記(2つの)外因性ヌクレオチド配列が隣接するATG転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む、本発明1001から1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
二重特異性抗体を産生する方法であって、
(a)本発明1001から1013のいずれかの方法で調製された組換え宿主細胞を提供することと、
(b)(a)の組換え宿主細胞を培養し、前記細胞または培養培地から二重特異性抗体を回収することと
を含む、方法。
本発明は、少なくとも部分的に、リコンビナーゼ媒介性カセット交換(RMCE)が、CHO細胞における二重特異性抗体のコンビナトリアル発現ライブラリを作製するために使用でき、各細胞が正確に1種類の二重特異性分子を発現するという発見に基づく。
抗体工学におけるノブ・イントゥー・ホール二量体化モジュールおよびそれらの使用は、Carter P.、Ridgway J.B.B.、Presta L.G.:Immunotechnology、第2巻、第1号、1996年2月、73-73(1)頁に記載されている。
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3)に生じる超可変ループ(Chothia,C.およびLesk,A.M.、J.Mol.Biol.196(1987)901-917)、
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b(H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)に生じるCDR(Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD(1991)、NIH Publication 91-3242)、
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、および93~101(H3)に生じる抗原接触(MacCallumら、J.Mol.Biol.262:732-745(1996))、ならびに
(d)アミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
従来の細胞株開発(CLD)は、目的の配列(SOI)を保持するプラスミドのランダム組込み(RI)に依存している。
標的化組込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組込みは、1つ以上の組換え認識配列(RRS)を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組込みは、相同組換えによって媒介される。
適切なTI宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の特定の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列、すなわち「ランディング部位」を含む。
上で概説した「1ベクターRMCE」のほかに、新しい「2ベクターRMCE」を実行することにより、標的化組込みおよびランダム化を同時に行うことができる。
隣接するRRS部位、RRS1とRRS3に挟まれた一方の発現プラスミド(フロント)、および、RRS3とRRS2による他方の発現プラスミド(バック)を必要とする。2プラスミドRMCEの効率は低いと予想されるため、まれなRMCE固有のイベントを強化するには、厳密な選択スキームが必要になる。2プラスミドRMCEには、2つの選択マーカーが必要である。1つの選択マーカー発現カセットは、2つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドンおよびRRS3配列を含む。バックプラスミドは、ATG開始を差し引いた、選択マーカーのコード領域のN末端に融合したRRS3配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳を確実にするために、RRS3部位と選択マーカー配列の間に追加のヌクレオチドを挿入する必要があり得る。2つのプラスミドが正しく標的化された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、細胞が選択に対して耐性を示す状態になる。図2は、2プラスミドRMCE戦略を示す模式図である。
上記のような外因性核酸(「ランディング部位」)を含む任意の既知または将来のTI宿主は、本発明を実施するのに適している。
a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むTI宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2のRRS、ならびに第1と第2のRRSの間に位置する第3のRRSを含み、すべてのRRSは異なる、提供すること、
b)a)で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1および第3のRRSに一致し、2つの外因性SOIおよび少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSをそれぞれ含む、第1のベクターのライブラリ、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2および第3のRRSに一致し、少なくとも2つのさらなる外因性SOIに隣接する2つのRRSをそれぞれ含む、第2のベクターのライブラリを導入することであり、ここで、該4つのSOIの1つは、二重特異性抗体の第1の軽鎖、第2の軽鎖、第1の重鎖、および第2の重鎖をコードする、導入すること、
c)i)b)の第1および第2のベクターのライブラリと同時に、またはii)その後、順次、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該1つ以上のリコンビナーゼは、第1および第2のベクターのRRSを認識し、該1つ以上のリコンビナーゼはRRSを認識し、2つのRMCEを実行する、導入すること、ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、二重特異性抗体を分泌するTI細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法を提供する。
a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むTI宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2のRRS、ならびに第1と第2のRRSの間に位置する第3のRRSを含み、すべてのRRSは異なる、提供すること、
b)a)で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1および第3のRRSに一致し、2つの外因性SOIおよび少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSをそれぞれ含む第1のベクター、ならびに該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2および第3のRRSに一致し、少なくとも2つのさらなる外因性SOIに隣接する2つのRRSをそれぞれ含む第2のベクターを導入することであり、ここで、第1のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つのSOIおよび抗体重鎖をコードする1つのSOIを含み、該抗体軽鎖および該抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードするSOIは、該ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードするSOIの上流(5’)に位置し、第2のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つのSOIおよび抗体重鎖をコードする1つのSOIを含み、該抗体軽鎖をコードするSOIは、該抗体重鎖をコードするSOIの上流(5’)に位置する、導入すること、
c)i)b)の第1および第2のベクターと同時に、またはii)その後、順次、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該1つ以上のリコンビナーゼは、第1および第2のベクターのRRSを認識する、導入すること、ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、二重特異性抗体を分泌するTI細胞を選択すること
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法を提供する。
a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むTI宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2のRRS、ならびに第1と第2のRRSの間に位置する第3のRRSを含む第1のDNAカセットを含み、3つのRRSはすべて異なる、提供すること、
b)a)で提供される細胞に、第2のDNAカセットをそれぞれ含む第1のベクターのライブラリであり、ここで、第2のDNAカセットは、第1のDNAカセットの第1および第3のRRSに一致し、2つの外因性SOIに隣接する2つの(異種特異的)RRSおよび少なくとも1つの第2の選択マーカーを含む、ライブラリ、および第3のDNAカセットをそれぞれ含む第2のベクターのライブラリであり、ここで、第3のDNAカセットは、第1のDNAカセットの第2および第3のRRSに一致し、少なくとも2つのさらなる外因性SOIに隣接する2つの(異種特異的)RRSを含み、該4つのSOIの1つは、二重特異性抗体の第1の軽鎖、第2の軽鎖、第1の重鎖、または第2の重鎖をコードする、ライブラリを導入すること、
c)i)b)の第1および第2のベクターのライブラリと同時に、またはii)その後、順次、1つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該1つ以上のリコンビナーゼは、RRSを認識し、2つのRMCEを実行する、導入すること、ならびに
d)第2の選択マーカーを発現し、二重特異性抗体を分泌するTI細胞を選択すること
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法を提供する。
該外因性ヌクレオチド配列は、以下の要素:
第1、第2および第3の組換え認識配列、
2つの選択可能マーカー、ならびに
第1~第4の発現カセットを含み、
該要素の5’から3’への配列は、
RRS1-第1のEC-第2のEC-RRS3-SM-第3のEC-第4のEC-RRS2-SMであり、
ここで、RRSは組換え認識配列、
ECは発現カセット、
SMは選択マーカーである。
i)第1の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする核酸、およびポリA部位、場合によっては、ターミネーター配列を含み、
ii)第2の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする核酸、およびポリA部位、場合によっては、ターミネーター配列を含み、
iii)第3の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸(ドメインクロスオーバーなし)、およびポリA部位、場合によっては、ターミネーター配列を含み、
iv)第4の発現カセットは、5’から3’の方向に、プロモーター、抗体重鎖をコードする核酸(ドメインクロスオーバーなし)、およびポリA部位、場合によっては、ターミネーター配列を含む。
a)本発明による、または本明細書に記載の方法で調製される組換え(宿主)細胞を提供することと、
b)SOIを発現し、細胞または培養培地から目的のポリペプチドを回収するのに適した条件下で、a)の組換え(宿主)細胞を培養することとを含む、方法に関する。
a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むTI宿主細胞を提供することであり、ここで、該外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2のRRS、ならびに第1と第2のRRSの間に位置する第3のRRSを含み、すべてのRRSは異なる、提供すること、
b)a)で提供される細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第1および第3のRRSに一致し、抗体軽鎖および抗体重鎖の第1のペアをコードする外因性SOIに少なくとも隣接し、少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つのRRSを含む第1のベクターを導入すること、
c)a)で提供されるか、b)で得られる細胞に、該組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第2および第3のRRSに一致し、抗体軽鎖および抗体重鎖の第2のペアをコードする外因性SOIに少なくとも隣接する2つのRRSを含む第2のベクターを導入すること、
d)1つ以上のリコンビナーゼを導入することであり、ここで、該1つ以上のリコンビナーゼは、b)またはc)で得られた細胞へのRRSを認識する、導入すること、ならびに
e)第2の選択マーカーを発現するTI細胞を選択して、それにより、目的の第1および第2のポリペプチドを発現するTI宿主細胞を単離すること
を含む、方法を提供する。
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一般的技術
組換えDNA技術
Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y、(1989)に記載されているように、標準的な方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。
DNA配列決定は、SequiServe GmbH(Vaterstetten、Germany)で実施した。
EMBOSS(European Molecular Biology Open Software Suite)ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン11.5を、配列の作成、マッピング、解析、注釈付け、および図解に使用した。
コンビナトリアル2x2CrossMAb発現ライブラリの作製と解析
ヒト抗原Aに特異的に結合する2つの異なる抗体の交差抗体鎖をコードする2つのフロントプラスミドF_1およびF_2、ならびにヒト抗原Bに特異的に結合する2つの異なる抗体の非交差抗体鎖をコードする2つのバックプラスミドB_1およびB_2を、TI CHO宿主細胞株に同時にトランスフェクトした(下の表を参照)。図4は、フロントプラスミドF_1およびバックプラスミドB_1のマップを示す。フロントプラスミドF_1およびF_2は、VLおよびVHのアミノ酸配列において、互いに異なる。バックプラスミドB_1およびB_2についても、同じことが当てはまる。
xLC:ドメインクロスオーバーを伴う軽鎖
LC:ドメインクロスオーバーを伴わない軽鎖
HChole:ドメインクロスオーバーおよびホール変異を伴わない重鎖
*B_1とB_2のハイブリッド
Claims (13)
- 二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製するための方法であって、
(a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供する段階であって、ここで、前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、前記段階、
(b)前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1および第3の組換え認識配列と一致しかつ2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第1のベクターのライブラリ、ならびに
前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2および第3の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第2のベクターのライブラリ
を、(a)で提供される細胞に導入する段階であって、ここで、前記2つの外因性ヌクレオチド配列及び前記2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列を合わせた4つの外因性ヌクレオチド配列のうち、1つは前記二重特異性抗体の第1の軽鎖、1つは前記二重特異性抗体の第2の軽鎖、1つは前記二重特異性抗体の第1の重鎖、および1つは前記二重特異性抗体の第2の重鎖をコードする、前記段階、
(c)(i)(b)の第1および第2のベクターのライブラリと同時に、または(ii)その後順次に、1つ以上のリコンビナーゼを導入する段階であって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記第1および第2のベクターの前記組換え認識配列を認識し、2つのリコンビナーゼ媒介性カセット交換を実行する、前記段階、ならびに
(d)前記第2の選択マーカーを発現し、かつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択する段階
を含み、それにより、二重特異性抗体のライブラリを発現する組換え宿主細胞ライブラリを調製する、方法。 - 前記第1および第2のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1および第2のベクターのそれぞれが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および同族の抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含む、請求項1から2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、一方のベクターでは、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、他方のベクターでは、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1または第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖が、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、前記第2のベクターが、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列が、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製するための方法であって、
(a)宿主細胞のゲノムの遺伝子座内のある部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、標的化組込み宿主細胞を提供する段階であって、ここで、前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも1つの第1の選択マーカーに隣接する第1および第2の組換え認識配列、ならびに前記第1の組換え認識配列と前記第2の組換え認識配列との間に位置する第3の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列のすべてが異なる、前記段階、
(b)前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第1および第3の組換え認識配列と一致しかつ2つの外因性ヌクレオチド配列および少なくとも1つの第2の選択マーカーに隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第1のベクター、ならびに
前記組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の前記第2および第3の組換え認識配列と一致しかつ少なくとも2つのさらなる外因性ヌクレオチド配列に隣接する2つの組換え認識配列をそれぞれ含む、第2のベクター
を、(a)で提供される細胞に導入する段階であって、ここで、前記第1のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖および前記抗体重鎖は、ドメインクロスオーバーを有し、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記ドメインクロスオーバーを伴う抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置し、前記第2のベクターは、抗体軽鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列および抗体重鎖をコードする1つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記抗体軽鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列は、前記抗体重鎖をコードする外因性ヌクレオチド配列の上流(5’)に位置する、前記段階、
(c)(i)(b)の第1および第2のベクターと同時に、または(ii)その後順次に、1つ以上のリコンビナーゼを導入する段階であって、ここで、前記1つ以上のリコンビナーゼは、前記第1および第2のベクターの前記組換え認識配列を認識する、前記段階、ならびに
(d)前記第2の選択マーカーを発現しかつ二重特異性抗体を分泌する組換え宿主細胞を選択する段階
を含み、それにより、ドメインクロスオーバーを伴う二重特異性抗体を発現する組換え宿主細胞を調製する、方法。 - 前記第1のベクターが、コドンATGに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、それにより、前記プロモーター配列は、上流に前記(2つの)外因性ヌクレオチド配列が隣接し(すなわち、前記外因性ヌクレオチド配列の下流に配置され)、前記ATGコドンは、下流に組換え認識配列が隣接し(すなわち、組換え認識配列の上流に配置され)、前記第2のベクターは、上流に組換え認識配列が隣接しかつ下流に前記(2つの)外因性ヌクレオチド配列が隣接するATG転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 二重特異性抗体を産生する方法であって、
(a)請求項1から12のいずれか一項に記載の方法で調製された組換え宿主細胞を提供する段階と、
(b)(a)の組換え宿主細胞を培養し、前記細胞または培養培地から二重特異性抗体を回収する段階と
を含む、方法。
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