CN101090963A - 蜜二糖操纵子表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及可在宿主中表达的新载体，该载体包含操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，其中该转录单元含有对于所述宿主而言是异源的核酸序列，而该核酸序列的表达由该蜜二糖的所述启动子区域控制。还涉及的是：所述新载体在原始生物宿主中调节核酸序列的异源表达中的用途；含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域的可在宿主中表达的分离纯化的核酸序列，其中所述转录单元含有对于所述宿主而言是异源的核酸序列，该核酸序列的表达由该蜜二糖的所述启动子区域控制；用所述载体或所述分离纯化的核酸序列转化的原核生物宿主；和使用所述载体在宿主中生产多肽的方法。

Description

蜜二糖操纵子表达系统

本发明涉及用于在原核生物宿主中异源表达编码如多肽(如重组蛋白)的核酸的载体。更具体而言，本发明涉及可在宿主中表达的新载体，它含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元含有对于所述宿主来说是异源的核酸序列，而此核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制。本发明还涉及使用这些载体异源表达编码例如多肽的核酸。

发明背景

已描述了许多用于在原核生物宿主中异源表达编码如多肽(如重组蛋白)的核酸的系统。但是，原核生物宿主系统中的大多数异源基因表达系统全部依赖于有限的细菌启动子组。最常用的原核生物启动子包括乳糖[lac](Yanisch-Perron等，1985，Gene 33，103-109)、和色氨酸[trp](Goeddel等，1980，Nature(伦敦)287，411-416)启动子，和衍生自这两种的杂交启动子[tac和trc](Brosius，1984，Gene 27：161-172；Amann和Brosius，1985，Gene 40，183-190)。其它可诱导的启动子系统，如可由阿拉伯糖诱导的araB启动子(WO 86 04356)、由L-鼠李糖诱导的鼠李糖启动子rhaSB(WO 03068956)或由L-鼠李糖诱导的鼠李糖启动子rhaBAD(WO 2004/050877)也已被描述用于蛋白质的异源表达。但是，许多已知用于异源基因表达的原核生物启动子存在各种缺点，例如异源产物对宿主细胞的毒性、产物的低表达率或非功能性聚集体(内涵体)的形成。

还有许多可诱导的启动子系统，它们已用于蛋白质的同源表达中，例如Belyaeva等(2000，Mol.Microbiol.，36(1)，211-222)所述的由蜜二糖诱导的蜜二糖操纵子。这类用于同源表达的可诱导启动子系统大多数存在这样的缺点，即诱导率低并因此导致所需同源产物的低表达。此外，这些启动子系统不能被非常严密地调节，因此产生了未诱导状态下的背景活性，这种活性对于严格的表达控制而言是不允许的。例如，Belyaeva等已使用与大肠杆菌(E.coli)的LacZ基因融合的蜜二糖操纵子的不同片段在大肠杆菌中表达β-半乳糖苷酶。但是，产生最高的β-半乳糖苷酶活性的片段(KK43、JK19)也产生了最高的背景活性。

因此，仍需要提供改进的原核生物表达系统，该系统可用来异源表达核酸序列，而不存在上述缺点。

发明概述

通过提供新的载体将可实现依前述说明而显而易见的这些和其它目标，该载体包含用于所需异源产物的高水平表达的原核生物启动子区域。令人惊讶的是，已发现蜜二糖操纵子的启动子区域允许对大量的异源产物的表达进行严密调控。第一方面，本发明的目的是提供可在宿主中表达的新载体，该载体包含操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，其中该转录单元含有对于所述宿主而言是异源的核酸序列，而该核酸序列的表达由该蜜二糖的所述启动子区域控制。还提供的是：所述新载体在原始生物宿主中核酸序列的调节异源表达中的用途；可在宿主中表达的分离纯化的核酸序列，其含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，其中所述转录单元含有对于所述宿主而言是异源的核酸序列，而该核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制；用所述载体或所述分离纯化的核酸序列转化的原核生物宿主；和使用所述载体在宿主中生产多肽的方法。

本领域技术人员根据以下的详细描述将更易于了解其它目的和优点，下文的描述将结合以下的阐述性附图以及附带的权利要求进行。

附图简述

图1显示含有蜜二糖可诱导的melAB2启动子(PmelAB2)和转录终止区域(rrnB)的质粒pBLL7。

图2显示了质粒pBLL15，其含有蜜二糖可诱导的启动子(PmelAB2)、编码操作性连接Fab-H片段的重链(phoA-Vh-CH)或轻链(ompA-VL3-CL)的信号序列的序列、和转录终止区域(rrnB)。

图3显示使用了不同表达质粒的未诱导的(一)和诱导的(+)W3110株的溶菌酶提取物的斑点印迹结果(采用用于检测Fab的抗人轻链，与碱性过氧化物酶偶联)。显示了时间间隔。

图4显示W3110株(pBLL15)的溶菌酶提取物的蛋白质印迹，其中使用了用于检测Fab且与碱性过氧化物酶偶联的抗人轻链(泳道1：参比Fab-H(2μg)；泳道2：W3110(pBLL15)，诱导的，9小时；泳道3：W3110(pBLL15)，诱导的，12小时；泳道4：W3110(pBLL15)，诱导的，23小时)。

图5显示含有蜜二糖可诱导的启动子(PmelAB2)和具有改变的信号序列的Fab-H基因的质粒pAKL15E。

图6显示具有高Fab-H抗体浓度的不同W3110株的溶菌酶提取物的SDS-PAGE。产生没有信号序列的轻链和重链的菌株作为阴性参比(泳道1：标记；泳道2：W3110(pMx9-HuCAL-Fab-H)；泳道3：W3110(pBW22-Fab-H)；泳道4：W3110(pBLL15)；泳道5：W3110(pAKL14)；泳道6：标准品(2μg))。

图7显示了质粒pJKL8，其含有蜜二糖可诱导的启动子(PmelAB2)和编码KIE153(伯克霍尔德氏菌属Burkholderia sp.DSM9925)的酰胺酶的序列以及转录终止区域(rrnB)。

图8显示在诱导剂蜜二糖的存在或缺乏的情况下，W3110(pAKL15E)的溶菌酶提取物的SDS-PAGE。显示了轻链和重链的位置(泳道1：标记；泳道2：W3110(pAKL15E)，未诱导；泳道3：W3110(pAKL15E)，诱导)。

图9显示含有蜜二糖可诱导的melAB2启动子和编码单链抗体(scFv，S1)的序列的质粒pBLL7-pelB-S1。编码S1的序列之前存在编码PelB信号肽的序列。

图10显示未诱导的(-)和(+)W3110(pBLL7-pelB-S1)株的粗提取物的SDS-PAGE。如所示在不同的时间间隔获取样品。分析溶菌酶处理后获得的可溶和不可溶的蛋白质级分。箭头表示scFv蛋白。M＝标记12(Mark12)，Invitrogen的分子量标准物。

发明详述

本文提供以下定义，以易于理解本发明。

“在宿主中可表达的载体”或“表达载体”指重组产生的或合成产生的多核酸构建物，其具有一系列的特定的多核酸元件，这些元件使得特定的核酸序列在宿主细胞中转录。一般而言，这种载体包括转录单元，该单元含有操作性连接于启动子的待转录特定核酸。可在宿主中表达的载体可以是如自主复制或自复制质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。

术语“宿主”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中交换使用，指其中已引入了本发明的一种或多种载体或分离纯化的核酸序列的原核生物细胞。应理解，这些术语不仅指特定细胞对象，还指这些细胞的后代或潜在后代。因为随后的世代可能由于突变或环境影响而发生某些变动，因此这些后代实际上与亲本细胞是不同的，但它们仍包括在本文所用术语的范围之内。

术语“包含”通常以“含有”的含义使用，即允许存在一个或多个特征或组分。

“启动子”在本文中指调节转录单元的表达的核酸序列。“启动子区域”是能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录的调节区域。在启动子区域中将可存在转录起始位点(通常通过核酸酶S1的图谱来定义)以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合区域(共有序列)，如推定的-35区域和Pribnow框。

“蜜二糖操纵子”指Hanatani等(1984，J Biol.Chem.，259(3)，1807-12)所述的大肠杆菌的蜜二糖操纵子。蜜二糖操纵子是一种正性调节的分解代谢操纵子，它含有两个趋异启动子。一个启动子(melR启动子)负责melR基因的表达，该基因是第二启动子(melAB启动子)的蜜二糖依赖性刺激所必需的。由此第二启动子开始的蜜二糖诱导的转录启动了编码α-半乳糖苷酶的melA基因和编码蜜二糖通透酶的melB基因的共转录。蜜二糖操纵子含有两个分解代谢物调节蛋白(Catabolite Regulator Protein)结合位点：在melAB启动子的转录起始位点的上游-81，5位置的CRP2和在-195，5位置的CRP1；和5个MelR结合位点，分别在MelAB启动子转录起始位点上游的-42，5(位点2’)、-62，5(位点2)、-100，5(位点1)、-120，5(位点1’)、-238，5(位点R)。“蜜二糖操纵子的启动子区域”指调节melA基因和melB基因表达的启动子区域，包括melAB启动子、melR启动子、melR基因和CRP结合位点以及MelR结合位点。“melAB启动子”在本文中基本上由转录启动子位点、推定的-35区域、Pribnow框、CRP结合位点和MelR结合位点构成。“缺之CRP1结合位点的melAB启动子”在本文中基本上由转录起始位点、推定的-35区域、Pribnow框、CRP2结合位点和MelR结合位点构成，而无位点R。“缺乏CRP1结合位点的melAB启动子”也可含有被抑制或阻断的CRP1结合位点。这可采用已知的技术实现，例如转位子支持的诱变或敲除突变。优选的，“缺乏CRP1结合位点的melAB启动子”不含任何CRP1结合位点。

蜜二糖(6-O-[α]-D-半乳糖基吡喃基-D-葡萄糖)是一种二糖，可用酵母发酵棉子糖获得。

“CRP”指”分解代谢物调节蛋白”。“CRP”在本领域中通常称作“环AMP受体蛋白”，它们具有相同的含义。CRP是由环AMP(cAMP)控制的调节蛋白，它介导分解代谢操纵子(如蜜二糖操纵子)的活化。

“增强子”是起到强化转录单元的转录的核酸序列，所述核酸序列不依赖于与转录单元的同一性、其序列相对于转录单元的位置、或其序列的取向。本发明的载体任选含有增强子。

“转录单元”在本文中指通常被转录成单一RNA分子的核酸序列。转录单单元可含有编码功能上相关的多肽分子的一个基因(单顺反子)或两个(双顺反子)或多个基因(多顺反子)。

当核酸序列与另一核酸序列功能性相关时，它是“操作性连接的”。例如，如果信号序列的DNA被表达为参与蛋白质的分泌的前体蛋白，则该信号序列的DNA操作性连接于该蛋白质的DNA；如果启动子影响到序列的转录，则该启动子与该序列操作性连接；或者如果翻译启动区域如核糖体结合位点的位置促进了多肽的翻译，则该翻译启动区域与编码所述多肽的核酸序列操作性连接。可在常规的限制性位点通过连接反应来实现连接。如果不存在这类位点，则根据常规实践使用合成寡核苷酸连接物或接头。

“核酸”或“核酸序列”或“分离纯化的核酸或核酸序列”在本发明中可以是DNA、RNA、或DNA/RNA杂交体。在核酸或核酸序列位于载体中的情况中，核酸或核酸序列通常是DNA。DNA在本文中可以是任何聚脱氧核苷酸序列，包括例如：双链DNA、单链DNA、其中一条或两条由两个或多个片段组成的双链DNA、其中一条或两条链含有不间断的磷酸二酯骨架的双链DNA、含有一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的DNA、其中DNA链完全互补的双链DNA、其中DNA链仅部分互补的双链DNA、环状DNA、共价封闭的DNA、线性DNA、共价交联的DNA、cDNA、化学合成的DNA、半合成的DNA、生物合成的DNA、自然分离的DNA、酶消化的DNA、剪切的DNA、标记的DNA(如放射性标记的DNA和荧光染料标记的DNA)、含一种或多种非天然存在的核酸种类的DNA。可采用标准的化学技术例如磷酸三酯法或通过自动合成方法和PCR方法合成DNA序列。还可采用酶技术生产纯化的和分离的DNA。

RNA在本文中可以是例如：单链RNA、cRNA、双链RNA、其中一条或两条由两个或多个片段组成的双链RNA、其中一条或两条链具有不间断的磷酸二酯骨架的双链RNA、含有一个或多个单链部分和一个或多个双链部分的RNA、其中RNA链完全互补的双链RNA、其中RNA链仅部分互补的双链RNA、共价交联的RNA、酶消化的RNA、剪切的RNA、mRNA、化学合成的RNA、半合成的RNA、生物合成的RNA、自然分离的RNA、标记的RNA(如放射性标记的RNA和荧光染料标记的RNA)、含一种或多种非天然存在的核酸种类的RNA。

“变体”或“序列的变体”指与参比序列相比发生了保守核酸取代，从而使得一个或多个核酸被其它具有相同特性的核酸取代的核酸序列。变体也包括简并序列、具有删除和插入的序列，只要这些修饰的序列具有与参比序列相同的功能即可(功能上等价)。

在本文中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白质”、“多肽的(polypeptidic)”以及“肽(peptidic)”交换使用，指通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接到另外的氨基酸残基的一系列氨基酸残基。

术语“分离纯化的核酸序列”指根据本发明所述核酸序列将呈现的状态。核酸序列将不含或基本上不含与它们天然结合的物质，如在它们的自然环境中或者当这种制品采用体外或体内的重组技术进行制备时在它们的制备环境(如细胞培养物)中所发现的与它们结合的其它核酸。

术语“转化”、“转化的”或“将核酸导入宿主细胞”指在具有或不具有伴随物质的情况下使胞外核酸(如载体)进入宿主细胞的任何过程。术语“细胞转化的”或种类的“转化的细胞”指其中已导入胞外核酸从而包含有该胞外核酸的细胞或其后代。核酸可以被导入细胞中，从而使得该核酸可作为染色体的组成部分或作为额外的染色体元件被复制。可采用已知的方法如微注射、电穿孔、颗粒轰击或采用化学方法如磷酸钙介导的转化(Maniatis等，1982，“Molecular Cloning，A laboratory Manual”《分子克隆实验指南》，ColdSpring Harbor Laboratory，或者Ausubel等，1994，“Current Protocols inMolecular Biology”《分子生物学最新进展》，John Wiley和Sons)，用如表达载体转化适当的宿主细胞。

“异源核酸序列”或“对于宿主而言是异源的核酸序列”指这样的核酸序列，其编码的表达产物如多肽对于宿主来说是外来的(“异源表达”或“异源产物”)，即是源自不同于宿主的供体的核酸序列，或者指化学合成的核酸序列，它编码的表达产物如多肽对于宿主来说是外来的。在宿主是特定的原核生物物种的情况下，异源的核酸序列较佳源自不同的属或科，更优选是源自不同的目或纲，尤其是源自不同的门(division)，更特别是来自不同领域(empire)的有机体。

可在将源自不同于宿主的供体的异源核酸序列导入宿主细胞之前，通过突变、插入、缺失或取代单个核酸或一部分异源核酸序列，从而对其进行修饰，只要这种修饰的序列仍具有与参比序列相同的功能(功能性等价)。本文所指的异源核酸序列也包括源自不同领域(empire)的有机体的核酸序列，如来自真核生物(真核生物来源的)，如人抗体，这些核酸序列已用于噬菌体展示文库并已根据原核生物宿主的“密码子选择”对单个核酸或一部分核酸序列进行了修饰。

“信号序列”或“信号肽序列”指编码在某些蛋白质的NH2-末端出现的短氨基酸序列(即信号肽)的核酸序列，所述蛋白质通常被细胞转运到非胞质位置(如分泌)或成为膜组分。信号肽指导蛋白质从胞质转运到非胞质位置。

“翻译起始区域”指一个信号区域，此区域促进翻译启动，并作为核糖体结合位点，如Shine Dalgarno序列。

“转录终止区域”指引起RNA聚合酶终止转录的序列。转录终止序列通常是转录单元的一部分，它增加mRNA的稳定性。

“抗体”指由抗原刺激后的免疫系统的B细胞产生的一类血浆蛋白。哺乳动物(即人)抗体是IgG、M、A、E或D类免疫球蛋白。对于本发明的目的，术语“抗体”包括但不限于：多克隆抗体、单克隆抗体、自身免疫疾病(如糖尿病、多发性硬化和类风湿性关节炎)中存在的抗个体基因型抗体和自身抗体、以及嵌合抗体。基本的抗体结构单元已知包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，各对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。各链的羧基末端定义了一个恒定区，主要负责效应物的功能。

轻链分为κ和λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12或更多的氨基酸的“J”区域连接，重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区域。

术语“抗体”指整个抗体或其结合片段。结合片段包括单链片段、Fv片段和Fab片段。术语Fab片段在本领域中有时指由完整抗体经木瓜蛋白酶解离而得到的结合片段。术语Fab’和F(ab’)2在本领域中有时指用胃蛋白酶解离完整的抗体产生的结合片段。在本发明的上下文中，Fab一般指完整抗体的双链结合片段，其具有足以用于抗原特异性结合的至少基本上完整的轻链和重链可变区、和足以维持轻链和重链的结合的部分轻链和重链恒定区。这种Fab的一个例子例如描述于如Skerra等(1988，Science 240(4855)，1038-41)中。诸如IgG独特型的Fab片段可含有或可不含有形成完整免疫球蛋白中的两条重链之间的两个链间二硫键的两个半胱氨酸残基中的至少一个。通常，通过将全长或基本上全长的轻链与含有可变区和恒定区的至少CH1区域的重链复合而形成Fab片段。此外，可用丝氨酸或其它氨基酸替换轻链上的C末端半胱氨酸，以消除本发明轻链和重链之间的链间二硫键。还包括的是嵌合抗体，通常采用遗传工程技术从例如不同物种的免疫球蛋白基因片段(如编码可变区的片段和编码恒定区的片段)构建这种抗体中的轻链和重链基因。例如，可将小鼠单克隆抗体基因的可变区(V)节段连接到人的恒定区(C)节段(如IgG1和IgG4)。因此，典型的嵌合抗体是杂合蛋白，由小鼠抗体的V或抗原结合区域和人抗体的C或效应物结构域构成。嵌合抗体的结合特异性和亲合力与小鼠抗体或其它提供抗体可变区的非人抗体的结合特异性和亲合力相同或类似。术语“人抗体”包括具有衍生自包括自然或人工的、工程处理的亲合力成熟的人种系(germline)免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如由体外随机或定点诱变或体内体细胞突变引入的突变)。但是，术语“人抗体”确实包括衍生自其它哺乳动物种系如小鼠的CDR序列，且已被移植到人框架序列上的抗体(即人源化抗体)。此术语也包括这些“人抗体”的功能性变体，如其截短形式，或其中例如单个脯氨酸或半胱氨酸残基已经本领域已知的遗传工程技术工程加工的工程加工变体。这些例子在WO 98/02462中有描述。但是，该术语仅涉及这些抗体的氨基酸序列，而不考虑肽骨架的任何糖基化或其它化学修饰。

一个方面，本发明提供可在宿主中表达的载体，该载体包含操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元包含对所述宿主来说异源的核酸序列，而此核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制。

本发明的载体优选是自主复制或自复制质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。可将大范围的宿主/载体组合用于表达本发明的核酸序列。有用的表达载体可由例如染色体、非染色体和/或合成核酸序列的节段构成。合适的载体包括具有特定宿主范围的载体，例如对如大肠杆菌特异的载体，以及具有广泛的宿主范围的载体，如用于革兰氏阴性菌的载体。可使用“低拷贝”、“中等拷贝”以及“高拷贝”质粒。

用于如大肠杆菌中表达的有用载体是：pQE70、pQE60和pQE-9(QIAGEN，Inc.)；pBluescript Vektoren、Phagescript Vektoren、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene Cloning Systems，Inc.)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia Bio-tech，Inc.)；pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pACYC177、pACYC184、pRSF1010和pBW22[Wilms等，2001，Biotechnology and Bioengineering，73(2)95-103]或其衍生物，如质粒pBLL15或pAKL15E。其它有用的质粒是本领域技术人员周知的，描述于如“Cloning Vectors”(《克隆载体》Pouwels P.H.等编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中。

本发明的优选载体是自主复制或自复制质粒，更优选是具有特定宿主范围的载体，如对如大肠杆菌特异的载体。最优选的是pBR322、pUC18、pACYC177、pACYC184、pRSF1010和pBW22或其衍生物(如质粒pBLL15或pAKL15E)，尤其优选的是pBW22或其衍生物(如质粒pBLL15或pAKL15E)，更尤其优选的是pBLL15或pAKL15E，最优选的是pAKL15E。

在优选的实施方式中，用于本发明的蜜二糖操纵子的启动子区域是melAB启动子。根据本发明的一个更优选实施方式，所述melAB启动子缺乏CRP1结合位点。在特别优选的实施方式中，缺乏CRP1结合位点的melAB启动子由SEQID NO：1、其互补序列或变体构成。通常，启动子区域的MelR结合位点不被修饰。用于本发明的蜜二糖操纵子的启动子区域、melAB启动子、缺乏CRP1结合位点的melAB启动子以及由SEQ ID NO：1、其互补序列或变体构成的缺乏CRP1结合位点的melAB启动子通常得自大肠杆菌的蜜二糖操纵子，或者得自其它原核生物尤其是肠杆菌科(enterobacteriaceae)的有机体的功能等价启动子区域。优选的，蜜二糖操纵子的启动子区域、melAB启动子、缺乏CRP1结合位点的melAB启动子以及由SEQ ID NO：1、其互补序列或变体构成的缺乏CRP1结合位点的melAB启动子得自大肠杆菌的蜜二糖操纵子。其它原核生物的功能等价启动子区域包括可由蜜二糖诱导的启动子区域，即蜜二糖存在下的表达活性高于不存在蜜二糖情况下的表达活性的启动子区域。

本发明的转录单元通常还包含所述转录单元的翻译起始位点上游的翻译起始区域，所述翻译起始区域由AGGAGATATACAT(SEQ ID NO：2)构成，而翻译起始区域操作性连接于该核酸序列。序列AGGAGATATACAT(SEQ ID NO：2)通常位于转录单元的翻译起始位点(通常为ATG、GTG或TTG)的上游，且直接邻接该位点。

通常，所述转录单元还含有操作性连接于本发明的异源核酸序列的信号序列。在使用双顺反子或多顺反子转录单元的情况下，可将不同的或相同的信号序列操作性连接于各顺反子。在这种情况下优选使用不同的信号序列。所使用的信号序列可以是原核生物或真核生物的信号序列。通常使用原核生物的信号序列。可使用的且特别可用于大肠杆菌的真核生物信号序列是如人血浆铜蓝蛋白信号序列、人嗜中性粒细胞防卫素1，2，3前体信号序列或WO 03068956中描述的莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)芳基硫酸酯酶的信号肽。通常使用的原核生物信号序列是糖、氨基酸、维生素和离子的周质(periplasmatic)结合蛋白的信号肽，如PelB(菊欧文氏菌(Erwiniachrysantemi)，果胶酸盐裂解酶前体)、PelB(胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)，果胶酸盐裂解酶前体)、PelB(野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)，果胶酸盐裂解酶前体)、LamB(大肠杆菌，麦芽糖孔蛋白前体)、MalE(大肠杆菌，麦芽糖结合蛋白前体)、Bla(大肠杆菌，β-内酰胺酶)、OppA(大肠杆菌，周质寡肽结合蛋白)、TreA(大肠杆菌，周质海藻糖酶前体)、MppA(大肠杆菌，周质胞壁质肽结合蛋白前体)、BglX(大肠杆菌，周质β-葡糖苷酶前体)、ArgT(大肠杆菌，赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸结合的周质蛋白前体)、MalS(大肠杆菌，α-淀粉酶前体)、HisJ(大肠杆菌，组氨酸结合的周质蛋白前体)、XylF(大肠杆菌，D-木糖结合的周质蛋白前体)、FecB(大肠杆菌，二柠檬酸结合的周质蛋白前体)、OmpA(大肠杆菌，外膜蛋白A前体)和PhoA(大肠杆菌，碱性磷酸酶前体)。

在优选的实施方式中，信号序列选自大肠杆菌信号肽LamB(麦芽糖孔蛋白前体)、MalE(麦芽糖结合蛋白前体)、Bla(β-内酰胺酶)、OppA(周质寡肽结合蛋白)、TreA(周质海藻糖酶前体)、MppA(周质胞壁质肽结合蛋白前体)、BglX(周质β-葡糖苷酶前体)、ArgT(赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸结合的周质蛋白前体)、MalS(α-淀粉酶前体)、HisJ(组氨酸结合的周质蛋白前体)、XylF(D-木糖结合的周质蛋白前体)、FecB(二柠檬酸结合的周质蛋白前体)、OmpA(外膜蛋白A前体)和PhoA(碱性磷酸酶前体)。这些信号序列尤其可用于大肠杆菌中的异源表达。更优选的是大肠杆菌信号肽LamB(麦芽糖孔蛋白前体)、MalE(麦芽糖结合蛋白前体)、Bla(β-内酰胺酶)、TreA(周质海藻糖酶前体)、ArgT(赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸结合的周质蛋白前体)、FecB(二柠檬酸结合的周质蛋白前体)。特别优选的是大肠杆菌信号序列LamB(麦芽糖孔蛋白前体)和MalE(麦芽糖结合蛋白前体)。

可从商业途径或通过化学合成获得用于本发明表达载体的信号序列。例如，可根据如Beaucage&Caruthers(Tetrahedron Letts.22：1859-1862，1981)所述的固相亚磷酰胺三酯法，采用自动合成仪如Van Devanter等(Nucleic Acids Res.12：6159-6168，1984)所述合成信号序列。可如Pearson&Reanier(J.Chrom.255：137-149，1983)所述通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC纯化寡核苷酸。

通常，所述转录单元还含有选自rrnB、RNAI、T7Te、rrnB T1、trp a L126、trp a、tR2、T3Te、P14、tonB t和trp a L153的转录终止区域。优选便用所述rrnB转录终止序列。

本发明的异源核酸序列编码对于宿主来说是异源的表达产物。在宿主是原核生物物种(如大肠杆菌)的情况下，感兴趣的核酸序列更优选得自另一类别，如γ变形菌(gammaproteobacteria)，如得自伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)，尤其是得自不同的门(如古细菌)，更优选是得自真核生物(如哺乳动物)，尤其是人。但是，可根据宿主的“密码子选择”对异源核酸序列进行修饰。本发明的异源序列通常是感兴趣的基因。感兴趣的基因优选编码异源多肽，如结构性的、调节性的或治疗性的蛋白质，或结构性的、调节性的或治疗性的蛋白质与其它蛋白质(“标签蛋白”)如绿荧光蛋白的N-或C-末端融合蛋白或其它融合蛋白。异源核酸序列也可编码可以RNA形式使用的转录子，如反义RNA。

可以存在于宿主细胞的胞质或周质空间、和/或存在于细胞外基质中的不溶聚集体或溶解的蛋白质的形式生产蛋白质。优选的，以存在于宿主细胞的周质空间和/或存在于胞外基质中的溶解蛋白的形式生产蛋白质。蛋白质的例子包括：激素(如生长激素)、生长因子(如表皮生长因子)、止痛物质(如脑啡肽)、酶(如胰凝乳蛋白酶)、抗体、激素受体，也包括通常用作可视标记物(如绿荧光蛋白)的蛋白质。

感兴趣的其它蛋白质是生长因子受体(如FGFR、PDGFR、EFG、NGFR和VEGF)以及它们的配体。其它蛋白质是G-蛋白受体，包括物质K受体、血管紧缩素受体、[α]-和[β]-肾上腺素受体、5-羟色胺受体和PAF受体(如见Gilman，Ann.Rev.Biochem.56，625-649，1987)。其它蛋白质包括离子通道(如钙、钠、钾通道)、毒蕈碱性受体、乙酰胆碱受体、GABA受体、谷氨酸盐受体和多巴胺受体(见Harpold，美国专利5,401,629和5,436,128)。感兴趣的其它蛋白质是黏着蛋白，如整联蛋白)、选择蛋白(selecting)、免疫球蛋白超家族成员(见Springer，Nature 346，425-433(1990)；Osborn，Cell 62，3(1990)；Hynes，Cell 69，11(1992))。其它蛋白质是细胞因子，如白介素IL-1到IL-3，肿瘤坏死因子[α]和[β]、干扰素[α]、[β]和[γ]、肿瘤生长因子β(TGF-[β])、集落刺激因子(CSF)和粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)(见Human Cytokines：Handbook forBasic&Clinical Research，“人细胞因子：基础和临床研究手册”，Aggrawal等编辑，Blackwell Scientific，Boston，Mass.，1991)。感兴趣的其它蛋白质是胞外或胞内信使，如腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶和磷脂酶C。药物也是感兴趣的蛋白质。感兴趣的异源蛋白质可以是人源的、哺乳动物来源的或原核动物来源的。其它蛋白质是抗原，如从微生物致病原(包括病毒和细菌)以及从肿瘤得到的糖蛋白和碳水化合物。其它蛋白质是酶，如凝乳酶、蛋白酶、聚合酶、脱氢酶、核酸酶、葡聚糖酶、氧化酶、α-淀粉酶、氧化还原酶、脂酶、酰胺酶、腈水合酶、酯酶或腈水解酶。

优选的，本发明的异源核酸序列编码多肽，更优选的是抗体，最优选的是Fab片段。尤其是，该核酸序列编码人抗体或人源化抗体，更特别是人Fab片段。由该核酸序列编码的人Fab片段优选是人抗体片段或嫁接有至少一个得自另一哺乳动物物种的CDR的人抗体片段。在一个特别优选的实施方式中，人Fab片段是完整的人HuCAL-Fab，得自人工的基于共有框架序列的人抗体噬菌体文库，其中CDR是人工随机排列的，如Knappik等(2000，J.Mol.Biol.，296(1)，57-86)所述。

在另一更优选的任选实施方式中，任选嵌合的嫁接了CDR的人Fab片段是与前述HuCAL Fab定义相反的非-HuCAL-Fab，在完整的人Fab片段的情况下，该非-HuCAL-Fab优选不含有HuCAL共有框架序列，但它的非CDR序列部分至少有70％、更佳至少85％、最佳至少95％与相对应的可变和恒定轻链和重链种系的编码序列的氨基酸序列相同，此外且更佳地，它的CDR直接得自包括基因组亲合力成熟事件的淋巴细胞的天然存在的基因组序列。

Fab片段优选得自IgG抗体，且不含有在完整的免疫球蛋白的两条重链之间形成两个链间二硫键的半胱氨酸残基。具体而言，抗体或优选的Fab片段的重链和轻链由双顺反子转录单元编码，而各链操作性连接于信号序列和位于该转录单元翻译起始位点上游的相同的翻译起始区域。该翻译起始区域优选由序列AGGAGATATACAT(SEQ ID NO：2)构成。

在本发明中，信号序列和异源核酸序列在表达载体中的顺序和距离是可以改变的。在优选的实施方式中，信号序列在编码如感兴趣多肽的核酸序列的5’端(上游)。该信号肽序列和编码如感兴趣多肽的核酸序列可由0到约1000个氨基酸隔开。在优选的实施方式中，信号肽序列和编码如感兴趣多肽的核酸序列直接相互邻接，即被0个氨基酸隔开。

优选的，本发明载体的启动子区域和操作性连接的转录单位由序列SEQ IDNO：3、其互补序列和变体构成。

更佳的，本发明载体的启动子区域和操作性连接的转录单元由序列SEQ IDNO：4、其互补序列和变体构成。

本发明还包括本发明载体调节原核生物宿主中的核酸序列异源表达中的应用。表达可由原核生物宿主可获得的蜜二糖的量来调节。通常，培养的原核生物宿主的培养基中蜜二糖的量为0.01-100g/l，优选0.1-10g/l，更优选1-5g/l。

优选地，异源核酸序列编码多肽，更优选地编码抗体，最优选地编码Fab片段，而抗体或Fab片段的重链和轻链以相等的量表达，从而产生高浓度的功能性抗体或Fab片段。尤其是，由该异源核酸序列编码上述的人抗体或人源化抗体、更优选是上述人Fab抗体、最优选是上述人Fab片段。

为了获得高浓度的功能性抗体或Fab片段，需要表达等量的重链和轻链。在两条链中的一条与另一条相比被过量生产时，可能产生不可还原的高分子量免疫反应性聚集体，这是不利的。令人惊讶的是，已发现使用本发明的载体可获得高滴度的功能性抗体，而仅产生非常少量的过生产轻链或重链或高分子量免疫反应性聚集体。通常，低于20％、优选低于10％的表达量的抗体或Fab片段表达为过生产的轻链或重链或高分子量免疫反应性聚集体。过生产的轻链、重链和高分子量免疫反应性聚集体的量可通过SDS-PAGE或蛋白质印迹分析宿主表达的抗体或Fab片段的提取物(如培养的宿主细胞的溶菌酶提取物)而测定。

在另一方面，本发明提供在宿主中表达的分离纯化的核酸序列，该序列包含操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元包含对于所述宿主而言是异源的核酸序列，而此核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制。melAB启动子是优选的启动子区域。更优选的是缺乏CRP1结合位点的melAB启动子。最优选的是，所述分离纯化的核酸序列由SEQ ID NO：1、其互补序列和变体构成，尤其是由SEQ ID NO：3、其互补序列和变体构成的分离纯化的核酸序列，最优选的是由SEQ ID NO：4、其互补序列和变体构成的分离纯化的核酸序列。可采用本领域熟知的标准PCR方案和方法分离本发明所述分离纯化的核酸序列。如本领域所知，所述分离纯化的DNA序列还可含有一条或多条通常用于所述核酸序列编码的产物表达中的调节序列，如增强子。

为了选择成功地、稳定地转化了本发明的载体或所述分离纯化的核酸序列的宿主细胞，可将编码可选择性标记物(如对抗生素有抗性的)的基因与所述感兴趣的核酸序列一同引入宿主细胞中。编码可选择性标记物的基因可位于载体之上，或者位于分离纯化的核酸序列之上，或者可任选地以如位于分离载体上的分离形式共引入。可使用各种可选择性标记物，包括赋予抗生素(如潮霉素、氨苄青霉素和四环素)抗性的标记物。抗生素的量可根据需要来调整，以产生选择性的条件。通常，使用一种可选择性标记物。也可将报道基因(如荧光蛋白)与所述感兴趣的核酸序列一同导入宿主细胞中，以测定转化效率。

本发明的另一方面是提供经本发明的载体转化的原核生物宿主。在本发明的一个特定实施方式中，用质粒pBLL15或pAKL15E转化原核生物宿主，优选用在其双顺反子表达盒中含有两个不同编码区域的质粒pAKL15E转化原核生物宿主，以用于在该宿主细胞中表达分泌的杂二聚体蛋白如Fab。优选的，这种二聚体蛋白是Fab。在本发明的另一实施方式中，用本发明分离纯化的核酸序列转化本发明的原核生物宿主。

可使用广泛的原核生物宿主细胞表达本发明的异源核酸序列。这些宿主可包括革兰氏阴性细胞株，如大肠杆菌和假单胞杆菌属(Pseudomonas)；或革兰氏阳性细胞株，如芽胞杆菌属(Bacillus)和链霉菌属(Streptomyces)。优选地，宿主细胞是革兰氏阴性细胞，更优选的是大肠杆菌细胞。可使用的大肠杆菌是如TG1、W3110、DH1、XL1-Blue和Origami株，这些菌株可从商业途径获得，或者可通过DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Braunschweig，德国)获得。最佳的是使用W3110。宿主细胞可代谢或可不代谢蜜二糖。可修饰通常能够摄取和代谢蜜二糖的宿主细胞(如大肠杆菌)，以使其缺少一种或多种与摄取和/或代谢蜜二糖有关的功能。与摄取和/或代谢蜜二糖有关的一种或多种功能的缺陷可通过如抑制或阻断编码与摄取和/或代谢蜜二糖相关蛋白质的基因(如编码α-半乳糖苷酶的melA基因)而实现。这可采用已知的技术(如转座子支持的诱变或敲除突变)来实现。通常，原核生物宿主对应于所选择的信号序列，如在使用大肠杆菌的信号序列的情况中，宿主细胞通常是相同的肠杆菌科家族成员，更优选宿主是大肠杆菌菌株。

本发明还提供的是一种在宿主细胞中生产多肽的方法，该方法包括以下步骤：

a)构建载体；

b)用所述载体转化原核生物宿主；

c)在适当条件下，使所述多肽在细胞培养系统中表达；

d)从细胞培养系统中回收所述多肽。

所使用的载体、以及其构建和原核生物宿主的转化如上所定义，而该载体含有的异源核酸序列则编码多肽。较佳的，所产生的多肽是抗体，最佳的是Fab片段，而该抗体或Fab片段的重链和轻链以相同的量在细胞培养系统中表达，从而产生高浓度的功能性抗体或Fab片段。

对于细胞培养系统，可在培养管、摇瓶或细菌发酵罐中使用连续或不连续地培养培养物，如批次培养或分批进料培养。通常在本领域已知的常规培养基中培养宿主细胞，例如复合培养基，如“营养酵母肉汤培养基”或在Kortz等(1995，J.Biotechnol.39，59-65)所述的含有甘油的培养基中进行培养，或者在Kulla等(1983，Arch.Microbiol，135，1)所述的矿物盐培养基中进行培养。用于实施所述多肽的表达的优选培养基是含有甘油的培养基，更优选是Kortz等(1995，J.Biotechnol.39，59-65)所述的培养基。

可通过如进一步加入其它成分，如缓冲液、盐、维生素或氨基酸，来适当改变培养基。在培养细胞期间还可使用不同的培养基或培养基的组合。优选的，为了实现蜜二糖启动子区域的严密调节，作为基础培养基使用的培养基不应含有蜜二糖。通常在培养基达到适当的OD₆₀₀(视培养系统而定)后加入蜜二糖。通常，培养原核生物宿主的培养基中蜜二糖的量是0.01-100g/l，优选是0.1-10g/l，更优选是1和5g/l。对于批次培养，通常的OD₆₀₀通常是0.4或更高。适当的pH范围是如6-8，优选是7-7.5，适当的培养温度是10-40℃，优选是20-37℃。通常，尽可能长时间地培养细胞，直到积累了最大量的表达产物，该时间优选是1小时到20天，更优选是5小时到3天。表达产物的量取决于所使用的培养系统。在摇瓶培养中，用本发明载体转化的宿主通常可产生0.5g表达产物/升培养基。在批次和/或分批进料模式的发酵罐培养中，每升发酵肉汤通常可产生高于0.5g、优选高于1g、更优选高于1.3g的表达产物。

在宿主细胞表达后，可从宿主细胞培养物中回收表达产物，如感兴趣的多肽。当感兴趣的多肽是免疫球蛋白链时，重链和轻链通常各自在宿主细胞中表达，并被分泌到细胞的周质中。然后，从免疫球蛋白链加工表达载体中信号序列编码的信号肽。然后将成熟的重链和轻链装配成完整的抗体或Fab片段。为了获得最大产量的表达产物，通常在培养结束时收集细胞，并进行裂解，例如通过溶菌酶处理、超声波或French Press进行裂解。因此，通常首先以宿主细胞的粗裂解物形式获得多肽。然后可采用本领域已知的标准的蛋白质纯化方法纯化它们，该方法可包括示差沉淀、分子筛色谱、离子交换色谱、等电点聚焦、凝胶电泳、亲合以及免疫亲合层析。这些周知的和常规实践的方法在如Ausuble等(同上)和Wu等(编辑)Academic Press Inc.，N.Y.；ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)中有描述。例如，为了纯化重组产生的免疫球蛋白或Fab片段，可采用免疫亲和层析使它们通过含有树脂的柱而纯化，其中该树脂上结合有靶分子，所表达的免疫球蛋白可特异性结合于该靶分子。

本发明还涉及用于原核生物宿主胞内异源表达编码如多肽的核酸的方法和工具。具体而言，本发明涉及在原核生物宿主中胞内表达异源多肽的载体，其中该载体可在原核生物宿主中表达，且含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元含有对于所述宿主来说是异源的核酸序列。由于在本发明载体的实施方式中该核酸序列不连接于原核生物信号序列，在用载体转化原核生物宿主细胞和由该异源核酸编码的多肽表达后，该多肽将不被从胞质中转移到非胞质位置。取而代之的是，该多肽将以内涵体的形式或可溶的形式表达在胞质中。因此，在表达后，可采用熟知的方法从细胞尤其是从细胞提取物中分离和纯化该多肽。本发明还提供所述载体在调节异源核酸序列在原核生物宿主中的胞内表达的应用；用所述载体转化的原核生物宿主或原核生物宿主细胞；使用所述载体在原核生物宿主中胞内生产异源多肽的方法；和用于胞内生产用于多肽的载体，其中该载体含有启动子区域、编码异源多肽的异源核酸序列和由序列AGGAGATATACAT构成的翻译起始区域。

在载体可用于胞内表达的优选实施方式中，蜜二糖操纵子的启动子区域是melAB启动子，它较佳为缺乏CRP1结合位点。特别优选的是，缺乏CRP1结合位点的melAB启动子由SEQ ID NO：1所示序列、其互补序列和其变体构成。在本发明的另一优选实施方式中，载体的转录单元还含有位于所示转录单元的翻译起始位点上游的翻译起始区域，而该翻译起始区域由序列AGGAGATATACAT(SEQ ID NO：2)构成。在另一优选的实施方式中，用于胞内表达的所述载体含有转录终止区域，如rrnB转录终止序列。根据本发明，该异源核酸序列可编码多肽，如抗体、抗体片段等。

本领域技术人员将理解到，可对本文所述的发明做出除本文具体描述的那些内容之外的修改和变动。应理解，本发明包括不偏离本发明精神和实质特征的所有这些修改和变动。本发明还包括本说明书中涉及的或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，不论是单独的还是共同的，以及任何和所有组合或任何两个或多个所述步骤或特征。本文公开内容因此被视为在所有各方面都已有阐述，且不是限制性的，本发明的范围由附带的权利要求所限定，落入等价形式的含义和范围之内的所有变化都包括在本文之中。在整篇说明书引用了各文献，本文将各文献纳入作为参考。

结合下述实施例将能更完全地理解前述描述。但是，这些实施例是实施本发明的示例性方法，它们并不限制本发明的范围。

实施例

实施例1

搜索大肠杆菌W3110的基因组，找出阳性调节的操纵子。基于可从KEGG数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.ad.jp/kegg/kegg2.html)中获得的基因组数据，鉴定阳性调节的分解代谢启动子，并对将它们用于表达质粒进行分析。启动子应当是以便宜和无毒性的方式被严密调节和诱导，并因此是工业上有用的化合物。选择以下不同阳性调节分解代谢操纵子的启动子：

用阳性调节启动子构建表达质粒：

——prp启动子(丙酸盐诱导的)

——gutA启动子(葡萄糖醇诱导的)

——melAB2启动子(蜜二糖诱导的)

基于相应的调节物结合位点上可获得的信息选择含有所述启动子元件的精确DNA片段。采用Pitcher等(1989，Letters in Applied Microbiology 8，151-156)所述的方法分离大肠杆菌的染色体DNA。采用PCR，以下引物从W3110株的染色体DNA扩增启动子片段。ClaI和AflII的限制性位点以下划线标出。这些片段的序列如下所示：

Pprp    Pprp-5    5’aaa  atc gat aaa tga aac gca tat ttg3’

        Pprp-3    5’aaa  ctt aag ttg tta tca act tgt tat3’

AAA ATCGATAACTGAAACGCATATTTGCGGATTAGTTCATGACTTTATCTCTAACAAA

TTGAAATTAAACATTTAATTTTATTAAGGCAATTGTGGCACACCCCTTGCTTTGTCTTT

ATCAACGCAAATAACAAGTTGATAACAA CTTAAGTTT

PgutA   PgutA-5    5’aaa  atc gat gca tca cgc ccc gca caa 3’

        PgutA-3    5’aaa  ctt aag tca gga ttt att gtt tta 3’

AAA ATCGATGCATCACGCCCCGCACAAGGAAGCGGTAGTCACTGCCCGATACGGAC

TTTACATAACTCAACTCATTCCCCTCGCTATCCTTTTATTCAAACTTTCAAATTAAAATA

TTTATCTTTCATTTTGCGATCAAAATAACACTTTTAAATCTTTCAATCTGATTAGATTAG

GTTGCCGTTTGGTAATAAAACAATAAATCCTGA CTTAAGTTT

PmelAB2 PmelAB-5-1  5’aaa  atc gat gac tgc gag tgg gag cac 3’

        PmelAB-3    5’aaa  ctt aag ggc ttg ctt gaa taa ctt 3’

        MelR                                 CRP

AAA ATCGATA

TT

GC

GTTTTCTGCA

GATTCGCCTGCCATGATGAAGTTATTCAAGCAAGCC CTTAAGTTT

                +1

(CRP2的结合位点以浅灰色显著标出，而MelR的结合位点以黑色标出)

经琼脂糖凝胶电泳分离各片段，并采用Qiagen(Hilden，德国)的凝胶提取试剂盒QiaexII进行分离。用ClaI和AflII切割分离的片段，并连接到CalI/AflII切割的pBW22(Wilms等，2001，Biotechnology and Bioengineering，73(2)，95-103)。所得的含有由序列SEQID NO：1构成的melAB2启动子的质粒(pBLL7)显示在图1中。除所连接的启动子区域外，所得的含prp启动子的质粒(pBLL5)和含gutA启动子的质粒(pBLL6)是相同的。通过测序(Microsynth GmbH，Balgach，Switzerland)确定插入的启动子的序列。

实施例2

Fab片段表达质粒的构建

作为IPTG诱导的lac启动子(质粒pMx9-HuCAL-Fab-H，Knappik等，19 85，Gene 33，103-119)的替换物，分析不同阳性调节表达系统生产Fab-H抗体片段的能力。采用PCR，以引物Fab-5(5’-aaa cat atg aaa aag aca gct atc-3’)和Fab-3(5’-aaa aag ctt tta tca gct ttt cgg ttc-3’)从质粒pMx9-HuCAL-Fab-H扩增出Fab-H片段。用NdeI和HindIII切割PCR片段，将其插入NdeI/HindIII切割的pBW22中，产生含有L-鼠李糖可诱导的rhaBAD启动子的质粒pBW22-Fab-H(Volff等，1996，Mol.Microbiol.22，1037-1047)。将相同的PCR片段插入具有可诱导的启动子的不同表达质粒中。所得的(推定的)含有Fab-H和melAB2启动子(SEQ ID NO：3)的表达质粒pBLL15显示在图2中。获得等价的含有prp启动子的质粒(pBLL13)和含gutA启动子的质粒(pBLL14)。通过测序确定质粒pBw22-Fab-H中插入的Fab-H的序列。

实施例3

Fab片段的表达

用不同的表达质粒转化W3110株(DSM 5911，Deutsche Sammlung yonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，德国)。从产生自不同的转化的克隆中分离出质粒，并经限制性酶切分析进行核对。除了质粒pBLL14外，其余所有质粒都具有预期的限制性图谱。再次分离的质粒pBLL14显示了改变的大小和限制性图谱，这表明是重组事件导致。因此，在接下来的实验中没有测试W3110株(pBLL14)。测试余下菌株分泌自动折叠的Fab-H抗体片段的能力。如实施例4所述实施此产率试验。以0.2％的浓度加入以下诱导子：

pBW22-Fab-H    L(+)-鼠李糖一水合物

pBLL13         丙酸钠

pBLL15         D(+)-蜜二糖一水合物

               D(+)-棉子糖一水合物

               D(+)-半乳糖

斑点印迹试验的结果显示在图3中。

L-鼠李糖和蜜二糖诱导的W3110(pBW22-Fab-H)株和W3110(pBLL15)株显示出期望的斑点印迹结果：信号随着时间的推移而增加，且几乎没有背景活性。用ELISA定量测定主动折叠的抗体片段部分。结果归纳在下表1中。

质粒	诱导子	8小时	11.5/12小时	22/25小时	22/25小时
								诱导的			未诱导的
在TG1F’-中
						pMx9-HuCAL-Fab-H	IPTG	nd	Nd	68.64	84.56
						在W3110中
pMx9-HuCAL-Fab-H	IPTG	nd	Nd	140.56	8.14
						pBW22-Fab-H	鼠李糖	176.88	259.56	328.62	6.52
pBLL13	丙酸盐	Nd	0.84	0.90	3.94
						pBLL15	蜜二糖	2.89	145.10	504.28	4.28

表1：具有不同表达质粒的W3110衍生物的ELISA结果。显示了诱导后的时间。测试22小时或25小时后的未诱导培养物，作为未诱导对照，将得自W3110(pMx9-HuCAL-Fab-H)株和TG1F’-(pMx9-HuCAL-Fab-H)株的结果作为参比。Fab-H的浓度以mg/100 OD/L计(nd指未测定)。

所有的菌株在存在或不存在相应的诱导子的情况下很好地生长，没有生长抑制，DO₆₀₀达到4-6之间。在过夜诱导后，表达质粒pBW22-Fab-H和pBLL15产生了最高的抗体片段滴度。蜜二糖诱导的W3110(pBLL15)株与L-鼠李糖(pBW22-Fab-H)诱导系统相比，在形成活性抗体片段方面显示出延迟的增加。

在呼吸活性监测系统(RAMOS，ACBiotec，Julich，德国)中测试L-鼠李糖可诱导的W3110(pBW22-Fab-H)株，该系统是一种新颖的用于实时测定摇瓶中的呼吸活性的测量系统。与正常的摇瓶实验相比，抗体滴度(由ELISA测量)加倍(诱导23小时后703.64mg/L/100 OD₆₀₀)。使用RAMOS装备的最佳生长有利于活性抗体片段的生产。

实施例4

摇瓶中的蜜二糖诱导

测试带有质粒pBLL15的大肠杆菌W3110生产主动折叠的Fab-H抗体片段的能力。在20ml新鲜的甘油培养基(如Kortz等，1995，J.Biotechnol.39，59-65所述，其中维生素溶液根据Kulla等，1983，Arch.Microbiol，135，1所述使用)中稀释(1∶50)过夜培养物[在NYB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母抽提物，5g/l氯化钠)中，该培养基补充有100μg/ml氨苄青霉素，37℃]，在30℃培育。当培养物达到约0.4的OD₆₀₀时加入蜜二糖(0.2％)。在不同的时间间隔获取样品(1ml)，离心，在-20℃保存沉淀物。根据上文所述的溶菌酶处理裂解冷冻的细胞，在斑点印迹和ELISA检测中分析上清液。获得了504.28mg/L/100 OD₆₀₀的功能性Fab-H抗体片段。

实施例5

高分子量聚集体的存在

为了查明是否产生了高分子量聚集体，使用抗人Fab-H+AP接合物对显示最高的抗体滴度(表1)的W3110(pBLL15)株的提取物进行蛋白质印迹。如实施例4所述进行培育。在蜜二糖诱导后第9、12和23小时获取样品。使用抗人Fab-H+AP接合物对W3110(pBLL15)株的溶菌酶提取物进行的蛋白质印迹显示在图4中。较低浓度的高分子量聚集体对应于较高滴度的功能性抗体片段。表达系统的选择看起来影响到抗体形成的方式：功能性的还是成聚集体形式的。

实施例6

信号肽的影响

使用大肠杆菌的基因组数据库寻找可与Fab-H片段VL3-CL和VH-CH一起使用的有用信号肽。选用从糖、氨基酸、维生素和离子的周质结合蛋白得到的信号肽。这些周质蛋白代表的是与其它周质蛋白相比被更广泛地研究的相对相均质(homogeneous)的组。由于它们通常很丰富，它们的信号序列不得不确保有效地转运过内膜，转运到胞质中。使用SignalP网站服务器(http://www.cbs.dtu.dk/serrices/SignalP-2.0/#submission)检查所有可能的信号肽Fab组合的序列肽和解离位点可能性，如下表2所示。

信号肽               信号    最大

                     肽      解离位点

                     可能性  可能性

OmpA(E.coli)-外膜蛋白a前体

MKKTA IAIAV ALAGF ATVAQ A        APKDN (OmpA)                1.000  0.993

MKKTA IAIAV ALAGF ATVAQ A        DIELT (OmpA-VL3-CL，Fab-H)  1.000  0.971

PhoA(E.coli)-碱性磷酸酶前体

VKQST IALAL LPLLF TPVTK A        RTPEM (PhoA)                0.996  0.765

MKQST IALAL LPLLF TPVTK A        QVQLK (PhoA-VH-CH，Fab-H)   0.999  0.784

PelB(菊欧文氏菌)-果胶酸盐裂解酶前体

MKSLI TPITA GLLLA LSQPL LA       ATDTG (PelB)                1.000  0.999

MKSLI TPITA GLLLA LSQPL LA       DIELT (PelB-VL3-CL，Fab-H)  1.000  0.998

MKSLI TPITA GLLLA LSQPL LA       QVQLK (PelB-VH-CH，Fab-H)   1.000  0.998

PelB(胡萝卜软腐欧文氏菌-果胶酸盐裂解酶前体

MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MA       ANTGG (PelB)                1.000  1.000

MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MA       DIELT (PelB-VL3-CL，Fab-H)  1.000  1.000

MKYLL PTAAA GLLLL AAQPA MA       QVQLK (PelB-VH-CH，Fab-H)   1.000  1.000

PelB(野油菜黄单胞菌)-果胶酸盐裂解酶前体

MKPKF STAAA ASLFV GSLLV IGVAS A  DPALE (PelB)                1.000  0.993

MKPKF STAAA ASLFV GSLLV IGVAS A  DIELT (PelB-VL3-CL，Fab-H)  1.000  0.985

MKPKF STAAA ASLFV GSLLV IGVAS A  QVQLK (PelB-VH-CH，Fab-H)   1.000  0.988

LamB(E.coli)-麦芽糖孔蛋白前体(λ受体蛋白)

MMITL RKLPL AVAVA AGVMS AQAMA    VDFHG (LamB)                1.000  0.975

MMITL RKLPL AVAVA AGVMS AQAMA    DIELT (LamB-VL3-CL，Fab-H)  1.000  0.979

MMITL RKLPL AVAVA AGVMS AQAMA    QVQLK (LamB-VH-CH，Fab-H)   1.000  0.988

MalE(E.coli)-麦芽糖结合蛋白前体

MKIKT GARIL ALSAL TTMMF SASAL A  KIEEG (MalE)                 1.000 0.956

MKIKT GARIL ALSAL TTMMF SASAL A  DIELT (MalE-VL3-CL，Fab-H)   1.000 0.978

MKIKT GARIL ALSAL TTMMF SASAL A  QVQLK (MalE-VH-CH，Fab-H)    1.000 0.990

Bla(pBR322)(E.coli)-β-内酰胺酶

MSIQH FRVAL IPFFA AFCLP VFA      HPETL (Bla)                  1.000  1.000

MSIQH FRVAL IPFFA AFCLP VFA      DIELT (Bla-VL3-CL，Fab-H)    1.000  1.000

MSIQH FRVAL IPFFA AFCLP VFA      QVQLK (Bla-VH-CH，Fab-H)     1.000  0.999

OppA(E.coli)-周质寡肽结合蛋白

MTNIT KRSLV AAGVL AALMA GNVAL A  ADVPA (OppA)                 1.000  0.996

MTNIT KRSLV AAGVL AALMA GNVAL A  DIELT (OppA-VL3-CL，Fab-H)   1.000  0.911

MTNIT KRSLV AAGVL AALMA GNVAL A  QVQLK (OppA-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.984

TreA(E.coli)-周质海藻糖酶前体(α-海藻糖糖水解酶)

MKSPA PSRPQ KMALI PACIF LCFAA

LSVQA                            EETPV (TreA)                 1.000  0.996

MKSPA PSRPQ KMALI PACIF LCFAA

LSVQA                            DIELT (TreA-VL3-CL，Fab-H)   1.000  0.961

MKSPA PSRPQ KMALI PACIF LCFAA

LSVQA                            QVQLK (TreA-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.989

MppA(E.coli)-周质胞壁肽肽结合蛋白前体

MKHSV SVTCC ALLVS SISLS YA       AEVPS (MppA)                 1.000  0.943

MKHSV SVTCC ALLVS SISLS YA       DIELT (MppA-VL3-CL，Fab-H)   1.000  0.906

MKHSV SVTCC ALLVS SISLS YA       QVQLK (MppA-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.938

BglX(E.coli)-周质β-葡萄糖苷酶前体

MKWLC SVGIA VSLAL QPALA          DDLFG (BglX)                 1.000  0.999

MKWLC SVGIA VSLAL QPALA          DIELT (BglX-VL3-CL，Fab-H)   0.999  0.999

MKWLC SVGIA VSLAL QPALA          QVQLK (BglX-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.996

ArgT(E.coli)-赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸结合周质蛋白前体

MKKSI LALSL LVGLS TAASS YA       ALPET                        1.000  0.929

MKKSI LALSL LVGLS TAASS YA       DIELT (ArgT-VL3-CL，Fab-H)   1.000  0.947

MKKSI LALSL LVGLS TAASS YA       QVQLK (ArgT-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.960

MalS(E.coli)-α-淀粉酶前体

MKLAA CFLTL LPGFA VA             ASWTS (MalS)                 1.000  0.794

MKLAA CFLTL LPGFA VA             DIELT (Mals-VL3-CL，Fab-H)   0.998  0.995

MKLAA CFLTL LPGFA VA             QVQLK (Mals-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.990

HisJ(E.coli)-组氨酸结合周质蛋白前体

MKKLV LSLSLVLAFS SATAA FA        AIPQN (HisJ)                 1.000  0.994

MKKLV LSLSLVLAFS SATAA FA        DIELT (HisJ-VL3-CL，Fab-H)   1.000  0.957

MKKLV LSLSLVLAFS SATAA FA        QVQLK (HisJ-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.988

XylF(E.coli)-D-木糖结合周质蛋白前体

MKIKN ILLTL CTSLL LTNVA AHA    KEVKI (XylF)                1.000  0.996

MKIKN ILLTL CTSLL LTNVA AHA    DIELT (XylF-VL3-CL，Fab-H)  1.000  0.992

MKIKN ILLTL CTSLL LTNVA AHA    QVQLK (XylF-VH-CH，Fab-H)   1.000  0.996

FecB(E.coli)-二柠檬酸铁(III)结合周质蛋白前体

MLAFI RFLFA GLLLV ISHAF A      ATVQD (FecB)                1.000  0.975

MLAFI RFLFA GLLLV ISHAF A      DIELT (FecB-VL3-CL，Fab-H)  1.000  0.989

MLAFI RFLFA GLLLV ISHAF A      QVQLK(FecB-VH-CH，Fab-H)    1.000  0.990

选用以下6个组合：

——LamB-VL3-CL(麦芽糖孔蛋白前体)

——MalE-VH-CH(麦芽糖结合蛋白前体)

——Bla-VL3-CL(β-内酰胺酶)

——TreA-VH-CH(周质海藻糖酶前体)

——ArgT-VL3-CL(赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸结合周质蛋白前体)

——FecB-VH-CH(二柠檬酸铁(III)结合周质蛋白前体)

使用重叠的PCR引物进行产生信号肽(SP)与VL3-CL和VH-CH的融合物的基因融合，该融合显示在以下扩增表3中。

引物	模板	片段
			LamB-VL3-CL
lamB-5Lamb-3	大肠杆菌W3110的基因组DNA	lamB-SP
			lamB-VL3-5VL3-3	pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S	VL3-CL
lamB-5VL3-3	lamB-SP/VL3-CL	lamB-VL3-CL
			MalE-VH-CH
malE-5male-3	大肠杆菌W3110的基因组DNA	malE-SP
			malE-VH-CHVH-3	pMx9-HuCAL-Fab-H	VH-CH

malE-5VL3-3	malE-SP/VH-CH	malE-VH-CH
			Bla-VL3-CL
bla-5bla-3	大肠杆菌W3110的基因组DNA	bla-SP
			bla-VL3-5VL3-3	pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S	VL3-CL
bla-5VL3-3	bla-SP/VL3-CL	bla-VL3-CL
			TreA-VH-CH
treA-5treA-3	大肠杆菌W3110的基因组DNA	treA-SP
			treA-VH-CHVH-3	pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S	VH-CH
treA-5VH-3	treA-SP/VH-CH	treA-VH-CH
			ArgT-VL3-CL
argT-5argT-3	大肠杆菌W3110的基因组DNA	argT-SP
			argT-VL3-5VL3-3	pMx9-HuCAL-Fab-H	VL3-CL
argT-5VL3-3	argT-SP/VL3-CL	argT-VL3-CL
			FecB-VH-CH
fecB-5fecB-3	大肠杆菌W3110的基因组DNA	fecB-SP
			fecB-VH-CHVL3-3	pMx9-HuCAL-Fab-H-S-S	VH-CH
fecB-5VL3-3	fecB-SP/VH-CH	fecB-VH-CH

如别处所述进行单一的肽序列与VL3-CL和VH-CH序列的融合((Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.和Pease，L.R.(1989)Engineeringhybrid genes without the use of restriction enzymes：gene splicing byoverlap extension.《不使用限制性内切酶的工程化杂交基因：通过重叠延伸获得的基因接合》Gene 77，61-68)。用限制酶NdeI和PstI剪切SP-VL3-CL基因，并连入NdeI/PstI剪切的pBw22中，以及连入pBLL7中。

用PstI和HindIII剪切所得的质粒，连接到PstI/HindIII剪切的SP-VH-CH基因。由于bla-VL3-CL和fecB-VH-CH基因不可能整合，因此仅检测含有lamB-VL3-CL和malE-VH-CH基因的Fab-H表达质粒。获得含有L-鼠李糖可诱导的启动子的lamB-VL3-CL/malE-VH-CH表达质粒(pAKL14)。将作为AflII/HindIII片段从pAKL15(实施例7)分离的lamB-VL3-CL/malE-VH-CH基因连接到AflII/HindIII剪切的pBLL7，获得pAKL15E。图5阐述了含有蜜二糖可诱导的启动子和lamB-VL3-CL/malE-VH-CH的表达质粒pAKL15E(Seq IDNO.4)。

实施例7

翻译起始区域对Fab表达的影响

质粒pAKL14和质粒pAKL15E的Fab-H基因含有起始密码子的相同DNA序列5’端(翻译起始区域)，而在原始质粒pMx9-HcCAL-Fab-H中，两个Fab-H基因的翻译起始区域是不同的。质粒pMx9-HuCAL-Fab-H和pAKL14/pAKL15E的翻译起始区域序列的比较显示在下表4中：

pMx9-HuCAL-Fab-H  ompA-VL3-CL  gagggcaaaaa    atg

                  phoA-VH-CH   aggagaaaataaa  atg

pAKL14/pAKL15E    lamB-VL3-CL  aggagatatacat  atg

                  malE-VH-CH   aggagatatacat  atg

如实施例4所述在摇瓶中测试W3110(pAKL14)的产率。菌株在存在和缺乏L-鼠李糖的情况下都能很好地生长。这意味着Fab-H的生产不影响细胞的生存能力。

新的信号肽构建物(与修饰的翻译起始信号联合)再次将抗体片段滴度从328.62mg/L/100 OD₆₀₀(含有得自pMx9-HuCAL-Fab-H质粒的MOR基因构建物的pBW22-Fab-H质粒)提高到596.14mg/L/100 OD₆₀₀(质粒pAKL14)和878.86mg/L/100 OD₆₀₀(质粒pAKL15E)。pAKL14中lamB-CL3-CL和malE-VH-CH基因的测序结果揭示了三个碱基互换，这可能是由于两个连续的PGR反应导致的融合基因的构建所致。碱基互换导致以下氨基酸变化(错误的氨基酸被着重指出)：

VL3-CL(pAKL14)-pI＝4.85

MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMADIELTQPPSVSVAPGQTARISCSG NALGDKYASWYQQ NPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQSYDSPQVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSBELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTBA

VH-CH(pAKL14)-pI＝9.52

MKIKTGARILALSLTMMFSASALAQVQLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIDWDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARYPVTQRSYMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSV LPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKS

Fab-H的轻链存在两个错误(D50N和K63N)，重链有一个氨基酸交换(F156L)。为了保存原始的Fab-H序列，针对质粒pBW22-Fab-H(带有未改变的Fab-H基因序列)的同源片段交换了质粒pAKL14的两条片段(138bp的SexAI/BamHI和310bp的BssHII/HindIII片段)。所得的质粒pAKL15带有正确的Fab-H序列。三个氨基酸的交换对总的Fab-H特性没有产生明显的影响，这是因为pI并没有发生改变。因此，W3110(pAKL15)株生产功能性Fab-H抗体片段的能力被认为应该类似W3110(pAKL14)的生产能力，没有对其进行分析。

可通过使用不同的最佳策略提高Fab-H抗体片段的产率。下表5总结了这些改进：

菌株	改进	功能性Fab-H抗体的浓度(mg/L/100 OD)	活性增加
				TGlF’-(pMx9-HuCAL-Fab-H)	MOR株	84.56
W3110(pMx9-HuCAL-Fab-H)	菌株背景	140.45	1.7
				W3110(pBW22-Fab-H)	表达系统(鼠李糖)	328.62	3.9
W3110(pBLL15)	表达系统(蜜二糖)	504.28	6
				W3110(pAKL14)	信号肽翻译(鼠李糖)	596.14	7
W3110(pAKL15E)	信号肽翻译(蜜二糖(	878,86	10.4

通过SDS-PAGE分析产生高Fab-H抗体滴度的菌株(图6)。在产生平衡量的轻链和重链(泳道4和5)的菌株中测量到最高的功能性Fab-H浓度。带有Fab-H片段的L-鼠李糖可诱导的菌株，如W3110(pBW22-Fab-H)(泳道3)强烈地过量生产轻链。

实施例8

摇瓶中蜜二糖的诱导

测试带有质粒pAKL15E的大肠杆菌W3110生产自动折叠的Fab-H抗体片段的能力。在20ml新鲜的甘油培养基(如Kortz等，1995，J.Biotechnol.39，59-65所述，其中维生素溶液根据Kulla等，1983，Arch.Microbiol，135，1所述使用)中稀释(1∶50)过夜培养物[在NYB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母抽提物，5g/l氯化钠)中，该培养基补充有100μg/ml氨苄青霉素，37℃]，在30℃培育。当培养物达到约0.4的OD₆₀₀时加入蜜二糖(0.2％)。在不同的时间间隔获取样品(1ml)，离心，在-20℃保存沉淀物。根据上文所述的溶菌酶处理裂解冷冻的细胞，在SDS-PAGE和ELISA检测中分析上清液。携带有具有改变的信号肽的Fab-H基因(lamB-VL3-CL/malE-VH-CH)的蜜二糖可诱导的菌株显示出最高的Fab-H抗体滴度(表5)。Fab-H的轻链和重链以相等的量生产(图8)。

实施例9

摇瓶中KIE153株(Burkholderia sp.DSM9925)的酰胺酶的蜜二糖诱导

测试携带有pJKL8的大肠杆菌W3110(图7)将外消旋哌嗪-2-羧酰胺转化成(R)-哌嗪-2-羧酸的能力。在20ml新鲜的甘油培养基(如Kortz等，1995，J.Biotechnol.39，59-65所述，其中维生素溶液根据Kulla等，1983，Arch.Microbiol，135，1所述使用)中稀释(1∶50)过夜培养物[在NYB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母抽提物，5g/l氯化钠)中，该培养基补充有100μg/ml氨苄青霉素，30℃]，在30℃培育。当培养物达到约0.8的OD₆₀₀时加入蜜二糖(0.2％)。在诱导19小时后收集细胞，-20℃保存。如Eichhorn等(1997，TetrahedronAsymmetry，8(15)，2533-36)所述测试酰胺酶活性。静止细胞以约1g/h/OD₆₀₀的转化速率对映选择性地(enantioselectively)将(R)-哌嗪-2-羧酰胺转化成(R)-哌嗪-2-羧酸。

实施例10

摇瓶中单链抗体(scFv，S1)的蜜二糖诱导

采用PCR，使用引物5-S(5’-aaa cat atg aaa tac cta ttg cct acg gc-3’)和3-S1(5’-aaa aag ctt act acg agg aga cgg-3’)分离scFv基因。对应的S1蛋白含有PelB信号序列，该序列负责将蛋白质转运到大肠杆菌周质中。用NdeI和HindIII切割PCR片段，并插入NdeI/HindIII切割的pBLL7中，产生含有蜜二糖可诱导的melAB2启动子的质粒pBLL7-pelB1-S1(图9)。通过测序确定了质粒pBLL7-S1的S1插入序列。用质粒pBLL7-pelB1-S1转化W3110株(DSM5911，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，德国)。从不同的克隆中分离质粒，采用限制酶切分析进行验证。测试大肠杆菌W3110(pBLL7-pelB-S1)生产可溶S1的能力。在20ml新鲜的甘油培养基(如Kortz等，1995，J.Biotechnol.39，59-65所述，除了其中维生素溶液不同(根据Kulla等，1983，Arch.Microbiol，135，1所述使用))中稀释(1∶50)过夜培养物[在NYB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母抽提物，5g/l氯化钠)中，该培养基补充有100μg/ml氨苄青霉素，37℃]，在30℃培育。当培养物达到约0.4的OD₆₀₀时加入蜜二糖(0.2％)。在不同的时间间隔获取样品(1ml)，离心，在-20℃保存沉淀物。根据上文所述的溶菌酶处理裂解冷冻的细胞，经SDS-PAGE和Bioanalyzer分析上清液和不溶性蛋白沉淀物。大多数S1蛋白(1.7g/Lx mg/100 OD₆₀₀)以可溶蛋白级分的形式生产。

                            序列表

<110>隆萨股份公司(LONZA AG)

     莫弗西斯股份公司(MORPHOSYS AG)

<120>蜜二糖操纵子表达系统

<130>B14868/EP

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>143

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<223>melAB2启动子

<400>1

actctgcttt tcaggtaatt tattcccata aactcagatt tactgctgct tcacgcagga     60

tctgagttta tgggaatgct caacctggaa gccggaggtt ttctgcagat tcgcctgcca    120

tgatgaagtt attcaagcaa gcc                                            143

<210>2

<211>13

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<223>翻译起始区域

<400>2

aggagatata cat                                                      13

<210>3

<211>1630

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<223>含有melAB2启动子和ompA-VL3-CL和phoA-VH-CH的序列

<400>3

atcgatactc tgcttttcag gtaatttatt cccataaact cagatttact gctgcttcac     60

gcaggatctg agtttatggg aatgctcaac ctggaagccg gaggttttct gcagattcgc    120

ctgccatgat gaagttattc aagcaagccc ttaagaagga gatatacata tgaaaaagac    180

agctatcgcg attgcagtgg cactggctgg tttcgctacc gtagcgcagg ccgatatcga     240

actgacccag ccgccttcag tgagcgttgc accaggtcag accgcgcgta tctcgtgtag     300

cggcgatgcg ctgggcgata aatacgcgag ctggtaccag cagaaacccg ggcaggcgcc     360

agttctggtg atttatgatg attctgaccg tccctcaggc atcccggaac gctttagcgg     420

atccaacagc ggcaacaccg cgaccctgac cattagcggc actcaggcgg aagacgaagc     480

ggattattat tgccagagct atgactctcc tcaggttgtg tttggcggcg gcacgaagtt     540

aaccgttctt ggccagccga aagccgcacc gagtgtgacg ctgtttccgc cgagcagcga     600

agaattgcag gcgaacaaag cgaccctggt gtgcctgatt agcgactttt atccgggagc     660

cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag gcgggagtgg agaccaccac     720

accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc tatctgagcc tgacgcctga     780

gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg catgagggga gcaccgtgga     840

aaaaaccgtt gcgccgactg aggcctgata agcatgcgta ggagaaaata aaatgaaaca     900

aagcactatt gcactggcac tcttaccgtt gctcttcacc cctgttacca aagcccaggt     960

gcaattgaaa gaaagcggcc cggccctggt gaaaccgacc caaaccctga ccctgacctg    1020

taccttttcc ggatttagcc tgtccacgtc tggcgttggc gtgggctgga ttcgccagcc    1080

gcctgggaaa gccctcgagt ggctggctct gattgattgg gatgatgata agtattatag    1140

caccagcctg aaaacgcgtc tgaccattag caaagatact tcgaaaaatc aggtggtgct    1200

gactatgacc aacatggacc cggtggatac ggccacctat tattgcgcgc gttatcctgt    1260

tactcagcgt tcttatatgg atgtttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctcagc    1320

gtcgaccaaa ggtccaagcg tgtttccgct ggctccgagc agcaaaagca ccagcggcgg    1380

cacggctgcc ctgggctgcc tggttaaaga ttatttcccg gaaccagtca ccgtgagctg    1440

gaacagcggg gcgctgacca gcggcgtgca tacctttccg gcggtgctgc aaagcagcgg    1500

cctgtatagc ctgagcagcg ttgtgaccgt gccgagcagc agcttaggca ctcagaccta    1560

tatttgcaac gtgaaccata aaccgagcaa caccaaagtg gataaaaaag tggaaccgaa    1620

aagctgataa                                                           1630

<210>4

<211>1659

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>misc_feature

<223>含有melAB2启动子和lamB-VL3-CL和malE-VH-CH的序列

<400>4

atcgatactc tgcttttcag gtaatttatt cccataaact cagatttact gctgcttcac      60

gcaggatctg agtttatggg aatgctcaac ctggaagccg gaggttttct gcagattcgc     120

ctgccatgat gaagttattc aagcaagccc ttaagaagga gatatacata tgatgattac     180

tctgcgcaaa cttcctctgg cggttgccgt cgcagcgggc gtaatgtctg ctcaggcaat     240

ggctgatatc gaactgaccc agccgccttc agtgagcgtt gcaccaggtc agaccgcgcg     300

tatctcgtgt agcggcgatg cgctgggcga taaatacgcg agctggtacc agcagaaacc     360

cgggcaggcg ccagttctgg tgatttatga tgattctgac cgtccctcag gcatcccgga     420

acgctttagc ggatccaaca gcggcaacac cgcgaccctg accattagcg gcactcaggc     480

ggaagacgaa gcggattatt attgccagag ctatgactct cctcaggttg tgtttggcgg     540

cggcacgaag ttaaccgttc ttggccagcc gaaagccgca ccgagtgtga cgctgtttcc     600

gccgagcagc gaagaattgc aggcgaacaa agcgaccctg gtgtgcctga ttagcgactt     660

ttatccggga gccgtgacag tggcctggaa ggcagatagc agccccgtca aggcgggagt     720

ggagaccacc acaccctcca aacaaagcaa caacaagtac gcggccagca gctatctgag     780

cctgacgcct gagcagtgga agtcccacag aagctacagc tgccaggtca cgcatgaggg     840

gagcaccgtg gaaaaaaccg ttgcgccgac tgaggcctga taactgcagg agatatacat     900

atgaaaataa aaacaggtgc acgcatcctc gcattatccg cattaacgac gatgatgttt     960

tccgcctcgg ctctcgccca ggtgcaattg aaagaaagcg gcccggccct ggtgaaaccg    1020

acccaaaccc tgaccctgac ctgtaccttt tccggattta gcctgtccac gtctggcgtt    1080

ggcgtgggct ggattcgcca gccgcctggg aaagccctcg agtggctggc tctgattgat    1140

tgggatgatg ataagtatta tagcaccagc ctgaaaacgc gtctgaccat tagcaaagat    1200

acttcgaaaa atcaggtggt gctgactatg accaacatgg acccggtgga tacggccacc    1260

tattattgcg cgcgttatcc tgttactcag cgttcttata tggatgtttg gggccaaggc    1320

accctggtga cggttagctc agcgtcgacc aaaggtccaa gcgtgtttcc gctggctccg    1380

agcagcaaaa gcaccagcgg cggcacggct gccctgggct gcctggttaa agattatttc    1440

ccggaaccag tcaccgtgag ctggaacagc ggggcgctga ccagcggcgt gcataccttt    1500

ccggcggtgc tgcaaagcag cggcctgtat agcctgagca gcgttgtgac cgtgccgagc    1560

agcagcttag gcactcagac ctatatttgc aacgtgaacc ataaaccgag caacaccaaa    1620

gtggataaaa aagtggaacc gaaaagctga taaaagctt                           1659

Claims (33)

1.一种可在宿主中表达的载体，它包含操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元含有对于所述宿主来说是异源的核酸序列，所述核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述启动子区域是melAB启动子。

3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述melAB启动子缺乏CRP1结合位点。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述缺乏CRP1结合位点的melAB启动子由SEQ ID NO：1、其互补序列和其变体构成。

5.如权利要求1-4所述的载体，其特征在于，所述转录单元在所述转录单元翻译起始位点上游还含有翻译起始区域，该翻译起始区域由序列AGGAGATATACAT(SEQ ID NO：2)构成，且所述翻译起始区域与所述核酸序列操作性连接。

6.如权利要求1-5所述的载体，其特征在于，所述转录单元还含有操作性连接于所述核酸序列的信号序列。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述信号序列是原核生物信号序列。

8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述原核生物信号序列选自糖、氨基酸、维生素和离子的周质结合蛋白的信号肽。

9.如权利要求1-8所述的载体，其特征在于，所述转录单元还含有转录终止区域，该转录终止区域是rrnB转录终止序列。

10.如权利要求1-9所述的载体，其特征在于，所述核酸序列编码多肽。

11.如权利要求1-9所述的载体，其特征在于，所述核酸序列编码抗体。

12.如权利要求1-9所述的载体，其特征在于，所述核酸序列编码Fab片段。

13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，所述Fab片段的重链和轻链由双顺反子转录单元编码，各链操作性连接于信号序列和位于所述转录单元翻译起始位点上游的相同的翻译起始区域。

14.如权利要求1-13所述的载体，其特征在于，所述启动子区域和所述操作性连接的转录单元由SEQ ID NO：3、其互补序列和其变体构成。

15.如权利要求1-13所述的载体，其特征在于，所述启动子区域和所述操作性连接的转录单元由SEQ ID NO：4、其互补序列和其变体构成。

16.如权利要求1-15所述的载体，其特征在于，所述载体是自主复制或自复制的质粒、粘粒、噬菌体、病毒或逆转录病毒。

17.权利要求1-16所述的载体在调节核酸序列在原核生物宿主中异源表达中的用途。

18.如权利要求17所述的载体的用途，其特征在于，所述核酸序列编码多肽。

19.如权利要求18所述的载体的用途，其特征在于，所述多肽是Fab片段，且该Fab片段的重链和轻链以相等的量表达。

20.一种在宿主中可表达的分离纯化的核酸，它含有操作性连接于转录单元的蜜二糖操纵子的启动子区域，该转录单元含有对于所述宿主来说是异源的核酸序列，所述核酸序列的表达由该蜜二糖操纵子的所述启动子区域控制。

21.如权利要求20所述的分离纯化的核酸序列，其特征在于，所述启动子是melAB启动子。

22.如权利要求21所述的分离纯化的核酸序列，其特征在于，所述melAB启动子缺乏CRP1结合位点。

23.如权利要求22所述的分离纯化的核酸序列，其特征在于，所述缺乏CRP1结合位点的melAB启动子由SEQ ID NO：1、其互补序列和其变体构成。

24.如权利要求20-23所述的分离纯化的核酸序列，其特征在于，所述启动子区域和所述操作性连接的转录单元由SEQ ID NO：3、其互补序列和其变体构成。

25.如权利要求20-23所述的分离纯化的核酸序列，其特征在于，所述启动子区域和所述操作性连接的转录单元由SEQ ID NO：4、其互补序列和其变体构成。

26.质粒pBLL15。

27.质粒pAKL15E。

28.用权利要求1-16所述的载体转化的原核生物宿主。

29.用权利要求20-25所述的分离纯化的核酸序列转化的原核生物宿主。

30.用权利要求26或27所述的质粒转化的原核生物宿主。

31.一种在宿主中生产多肽的方法，该方法包括步骤：

a)  构建权利要求10-16所述的载体；

b)  用所述载体转化原核生物宿主；

c)  在适当条件下，使所述多肽在细胞培养系统中表达；

d)  从细胞培养系统中回收所述多肽。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所产生的多肽是Fab片段，该Fab片段的重链和轻链在所述细胞培养系统中以相同的量表达。

33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述多肽的表达是在含有甘油的培养基中进行的。

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