CN101568647B - 无需信号肽从细菌分泌抗体 - Google Patents

Abstract

本发明大体涉及复合物和方法，用于通过利用具有改变分泌特性的突变体宿主菌株无需信号肽从原核生物获得抗体或抗原结合抗体片段的分泌。具体地讲，本发明提供了宿主细胞和方法，用于无需信号肽从细菌获得抗体或抗原结合抗体片段的分泌，并提供了由所述方法得到的抗体序列的多样性库。本发明还提供了多样性库。

Description

无需信号肽从细菌分泌抗体

相关申请的交叉引用 

本申请根据35U.S.C§119要求申请日为2005年7月22日，名称为“无需信号肽从细菌分泌抗体”的美国临时专利申请序列号60/701,902的优先权，该文献的公开内容在此以其全文形式为所有目的被引入作为参考。 

技术领域

本发明总体涉及从原核生物分泌抗体、抗体片段、或抗体相关多肽的方法，而不需要信号肽。更具体地，本发明提供了从细菌分泌抗体、抗原结合抗体片段、或抗体相关多肽而不需要信号肽的宿主细胞和方法，并提供了所述方法获得的抗体、抗体片段、或抗体相关多肽的不同库。本发明还涉及通过本发明的方法制得的抗体、抗体片段、抗体相关多肽及其库。 

背景技术

指定用于周质或格兰阴性细菌，如肠道菌外膜的大多数蛋白质，通过一般分泌途径或Sec系统，一种蛋白复合物，传送穿过细胞质膜，所述途径或系统识别输出的多肽并将其转移穿过细胞质膜。这种系统被用于从肠道细菌(大肠埃希氏菌(E.coli))分泌哺乳动物蛋白，包括抗体片段。天然原核分泌蛋白和外源蛋白如哺乳动物蛋白通过添加功能性信号肽被导向分泌器，所述信号肽是通常在蛋白的N端具有13-30个氨基酸的序列，具有疏水内芯和附加序列以引导新生多肽链到分泌器并允许在分泌后准确除去信号肽。已经描述了许多原核信号肽，其使至少某些抗体片段进行有效分泌，包括来自Erwinia caratovora果胶裂解酶B(PelB)蛋白，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)耐热性肠毒素(StII)和大肠埃希氏菌(E.coli)OmpA蛋白的信号肽。其他原核生物具有类似的分泌系统，并且已经描述了许多所述其他原核生物的信号肽。 

不过，分泌系统对于分泌何种抗体、抗体分段或抗体相关多肽在效率上是非常不同的。分泌的效率取决于抗体的重链和轻链的可变区的序列。例如，含有鼠科V区的Fab片段分泌很少，即使有的话。此外，根据V-区序列和/或V_H亚类，通过可变效率分泌人类Fab片段。这种可变的分泌效率导致可从生成的抗体库中筛 选的抗体序列的偏倚性。 

在一些情况中，可引入V-区中的突变，以便改善分泌。不过，抗体V-区的氨基酸序列的变化可能危及抗体功能并且一般是不希望的。 

另外，从分泌多肽分裂信号肽不总是有效的。例如，当融合蛋白在大肠埃希氏菌显示时，大肠埃希氏菌OmpA或PhoA的信号肽没有从具有人类白细胞介素1β(IL-1β)的融合蛋白分裂。 

本发明的一个目的是提供从细菌获得分泌的抗体、抗体片段、或抗体相关多肽而不需要信号序列的组合物和方法，从而除去由可变区序列造成的任何分泌约束。 

发明内容

本发明涉及分泌原核生物中抗体、抗体片段、和/或抗体相关多肽而不需要信号肽的方法，从而克服由可变区序列施加的限制。在一个实施例中，本发明的方法包括在原核宿主细胞表达不带信号序列的多核苷酸编码抗体、抗体片段、或抗体相关多肽，随后是通过宿主细胞的细胞质膜的抗体、抗体片段、或抗体相关多肽的分泌。在本发明的一个实施例中，通过利用原核宿主细胞，不用信号序列来分泌抗体、抗体片段、或抗体相关多肽，其中所述宿主细胞包含基因中的一个或多个突变，它编码细胞分泌途径的蛋白。在另一个实施例中，宿主细胞是大肠埃希氏菌，而分泌突变体是蛋白质定位(prl)突变体。 

本发明还涉及由本发明方法获得的抗体或相关多肽的库。在一个实施例中，本发明的库包括当利用信号序列来引导传送穿过细胞质膜时，在原核生物中不能被分泌或难以分泌的抗体、抗体片段、或抗体相关多肽克隆体。在另一个实施例中，本发明的抗体、抗体片段、抗体相关多肽、或其他多肽库比通过信号序列表达的库具有更好表示的不同VH和VL亚类。本发明的抗体和相关多肽包括完整的免疫球蛋白、单链抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、camelid抗体、抗原结合支架、抗体或抗体相关多肽融合蛋白，以及下述的其他多肽。 

在另一个实施例中，本发明的抗体相关多肽包括被本发明的抗体、抗体片段、或抗体相关多肽识别的抗原。在本发明的一个实施例中，这些抗原是自体抗原。 

在本发明的一个实施例中，本发明的方法允许多亚基蛋白质的表达、分泌和聚合，其中所述多亚基蛋白质的一个或多个亚基缺少功能性信号序列。

附图说明

为了更好地理解本发明一些实施例的性质和目的，以下将结合附图更详细地进行描述，其中： 

图1示出了突变体F286Y和I408N(prlA4)的大肠埃希氏菌Sec Y蛋白的氨基酸序列，其中突变的氨基酸用粗体下划线(SEQ ID NO：1)示出。 

图2示出了用于为大肠埃希氏菌中不带信号肽的抗体片段表达重链和轻链基因的载体的质粒图。所述质粒具有氯霉素乙酰化转移酶基因，以抗氯霉素和lacIq基因，所述基因表达lac抑制子，用于校准基因表达。轻链和重链基因各自在tac启动子的控制下，而表达通过乳糖或IPTG可诱导。 

图3示出了蛋白质印迹分析(western blot analysis)，示出通过质粒KB5246转化的SE6004的周质片段中装配Fab 1A8的分泌。通过在所示的浓度(μM)添加IPTG(SEQ ID NO：2)来诱导Fab表达。样品在非还原条件下在SDS-PAGE凝胶上，并利用结合辣根过氧物酶的抗人Kappa抗体进行和用探针探查。 

图4示出了ELISA的结果，表明Fab片段的抗原结合活性在SE6004细胞的周质段呈现。通过质粒KB5246转化的细胞的周质提取物的系列稀释物或提取物的十倍稀释物(524610％)，与含有抗PcrV Fab在具有信号肽引导分泌的野生型大肠埃希氏菌菌株表达的标准周质提取物(1150)或十倍稀释物(1150 10％)进行比较，来分析结合到PcrV抗原。PcrV结合显示在450nm处吸收率增大，这是由于TMB培养基通过HRP结合的抗体酶转化成显色产物。 

图5是对来自周质提取物中识别的SE6004和TOP10F′细胞的Fab的分泌效率的比较。Fab利用IPTG(SEQ ID NO：2)诱导在所示浓度在SE6004细胞(prlA)中不使用信号肽来进行表达。该表达与来自野生型菌株(TOP10F)的相同Fab的依赖于信号的表达相比较。通过蛋白质印迹分析利用抗人kappa检测试剂来检测存在于周质提取物中的Fab。 

图6是突变体SecY过度表达的质粒KB5282图。prlA4突变体SecY基因从pTrc启动子表达。NPT2基因对卡那霉素有抵抗性。 

图7是蛋白质印迹分析，比较了prlA4突变体菌株SE6004，表达野生型SecY的Top10F’细胞，和通过prlA4突变体SecY基因共转化的DH5α细胞的Fab 1A8 的分泌效率。利用来自非变性SDS-PAGE的印迹的抗人kappa抗体来检测分泌进入培养基的抗体相关蛋白。在培养基中检测到装配Fab，轻链二聚物和轻链单体。 

具体实施方式

定义

如本文所使用的，″抗原″是指能够在适当的条件下，与特定抗体、抗体片段、或抗体相关多肽反应的物质。抗原可以是可溶物质，例如毒素或外源蛋白，不过，只有称为抗原决定簇(表位)的蛋白或抗原分子部分与抗体、抗体片段、或抗体相关多肽结合。更广义地讲，文本所用的术语″抗原″是指，抗体可结合或抗体需要的物质，而不管该物质是否是免疫原的。对于所述抗原，抗体可通过重组子方法识别，独立于任何免疫应答。 

如本文所使用的，″抗体″是指一种蛋白，功能上定义为结合蛋白，而结构上定义为包括氨基酸序列，所述氨基酸序列由本领域技术人员认定为从免疫球蛋白的可变区获得。抗体可由一种或多种多肽组成，基本通过免疫球蛋白基因，免疫球蛋白基因片段，杂交免疫球蛋白基因(通过组合来自不同动物的遗传信息得到)，或合成免疫球蛋白基因编码。认可的天然免疫球蛋白基因包括k(kappa)、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因和多个D-区段和J-区段。轻链可分类为k或λ。重链可分类为γ、μ、α、δ或ε，分别依次定义免疫球蛋白类，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。 

已知通常的抗体结构单元包括四聚物。每个四聚物由两个相同对的多肽链构成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的N端定义具有约100-110或更多氨基酸，主要负责抗原识别的可变区(V)。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。 

抗体作为完整的免疫球蛋白，作为多个通过与不同肽酶水解产生的良好表征的片段，或作为由重组DNA技术获得的多种片段而存在。因而，例如，木瓜蛋白酶使抗体水解进入抗原结合Fab片段和残留Fc片段；胃蛋白酶使抗体在铰链区的二硫键下水解，以产生F(ab′)₂，一种Fab二聚物，其自身是通过二硫键连接至VH-CH1的轻链。在温和条件下可以还原F(ab′)₂，以断开铰链区的二硫键，从而将F(ab′)₂二聚物转化成Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区部分的Fab(参见W.E.Paul，ed.，1993，Fundamental Immunology，Raven Press，NY，对其他抗体片段进 行了更详细的描述)。虽然不同抗体片段根据完整抗体的水解进行定义，本领域技术人员会理解，所述Fab′片段或其他片段可通过化学方法或利用重组DNA方法重新合成。此外，重组DNA方法可用来产生无法通过酶解获得的抗体片段。因而，这里所用的术语“抗体”，还包括通过整个抗体的变异或利用重组DNA方法重新合成的抗体片段。抗体包括单链抗体(以单个多肽链存在的抗体)，包括单链Fv抗体(sFv或scFv)，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过多肽接头)，以形成连续多肽。单链Fv抗体是共价链接的VH-VL异源二聚体，它可由核酸表达，所述核酸包括直接连接或通过肽编码键连接的VH-和VL-编码序列(Huston等人，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883)。虽然VH和VL彼此连接作为单个多肽链，VH和VL域非共价结合。在丝状噬菌体表面表达的第一功能性抗体分子是单链Fv′s(scFv)，不过，其他的表达策略也是成功的。例如，如果其中一个链(重链或轻链)熔合到输送至周质的g3衣壳蛋白和互补链作为可溶分子，Fab分子可在噬菌体上表达。这两条链可以在相同或不同的复制子上编码；关键点是每个Fab分子中的两条抗体链翻译后转移装配(assemble post-translationally)，并且二聚物通过其中一条链与g3p的链接结合入噬菌体颗粒中(参见例如，美国专利号5,733,743，该文献以全文形式在此被结合入本文参考)。本领域技术人员已知scFv抗体和许多其他结构将自然凝聚但化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转化为折叠成三维结构基本类似于抗原结合部位的结构的分子(参见例如，美国专利号5,091,513；5,132,405和4,956,778)。具体地讲，优选的抗体包括所有那些在噬菌体上显示的抗体(例如，scFv，Fv，Fab和二硫键连接的Fv(Reiter等人，1995，Protein Eng.8：1323-1331)。抗体还可以包括双抗体和微抗体。 

抗体可来源自多个物种。例如，抗体包括啮齿动物(如小鼠和大鼠)，兔子，羊，骆驼和人的抗体。抗体还可包括嵌合抗体，嵌合抗体将一个物种的可变区连接到另一个物种的恒定区。同样地，抗体可以人化，这通过重组DNA技术来构造，以产生免疫球蛋白，它具有来自一个种类的人框架区结合来自另一个种类的免疫球蛋白的互补决定区(CDR′s)(参见例如，EPO公开号0239400)。在抗体的情况中，模块由“框架”和“CDR”模块组成。通过创建分离的框架和CDR模块，能够获得不同组合装配的可能性。此外，如果两个或多个人造基因在每个遗传子元素的边界携带相同的断裂位点对，先前建立的子元素库可同时插入这些基因中， 而不用有关任何具体基因序列的任何其他信息。这种策略能够快速优化，例如抗体亲和性，因为基因子元素的DNA盒编码库可被(i)预先建立、存储和再利用，和(ii)在正确位置插入任何所述序列，而不用了解实际序列或必须确定单独库成分的序列。生成抗体合成库的示例性方法披露于，例如美国专利号5,885,793和6,300,064，这些文献在此全文结合入文本参考。 

抗体还包括表位聚焦的抗体，其具有至少一个来自参考抗体的重链或轻链CDR3的最小基本结合特性定子，制备所述表位聚焦的抗体的方法披露于美国专利申请号11/040,159，该文献在此全文被结合入本文参考。 

术语″细胞质膜″是指包围细胞的细胞质的膜，并且在细菌中该膜位于格兰氏阴性细菌的周质和外膜内部。 

正如本文所用的，术语″多样性″是指不同特定抗原结合抗体或相关多肽的数量。 

″表达载体″是核酸构成物，通过允许在宿主细胞中转录具体核酸的一系列指定核酸元素重组或合成而生成。表达载体可以是质粒，病毒或核酸片段的部分。通常，表达载体包括可操作地转录连接至启动子的核酸。 

正如本文所用的，术语″框架区″是指免疫球蛋白轻链和重链可变区的那些部分，所述部分在由Kabat定义的单个物种中的不同免疫球蛋白之间相对守恒(即，除了CDR之外)。正如这里所用的，“人框架区”是与自然存在的人抗体的框架区基本相同的(大约85％或更多)框架区。 

正如本文所用的，术语″融合抗体″是指分子，其中抗体在抗体多肽的N-或C-端融合非抗体多肽。在一个实施例中，抗体片段可包括一个或多个C-端肽标记，以便于检测和纯化。在另一个实施例中，抗体可融合到肽或多肽，用于展示在细胞、孢子或病毒的表面上。例如，一条抗体片段链可在噬菌体，如丝状噬菌体的表面上展示为融合蛋白。 

术语″宿主细胞″是指具有细胞机器用于表达和分泌来自表达载体的多肽的细胞。 

术语″人源化抗体″是指由重组DNA技术构造的抗体，以生成免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有来自一个种类的人框架区结合来自另一个种类的免疫球蛋白的互补决定区(CDR′s)(参见例如，EPO公开号0239400)。 

正如本文所用的，术语″免疫球蛋白″是指四聚抗体以及抗体之外的多种形式；包括，例如，Fv、Fab，和F(ab′)₂以及双功能性杂交抗体、融合抗体、嵌合抗体、人源化抗体、humaneered抗体和单链抗体。 

″库″表示核苷酸序列的集合，例如，克隆体中的DNA，编码抗体或相关多肽；或者，抗体或相关多肽的不同遗传集合。 

本文使用的″多聚体蛋白″是指球状蛋白，包含多于一个的分离多肽或蛋白链彼此相连，以在体外或体内形成单个球状蛋白。多聚体蛋白可由多于一个同类多肽组成，以形成″同源多聚体″。另外，多聚体蛋白还可由多于一个不同序列的多肽构成，以形成″异源多聚体″。因而，″异源多聚体″是包括至少第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽在氨基酸序列上与第一多肽至少有一个氨基酸残基不同。异源多聚体可包括由第一和第二多肽形成的″杂二聚体″或可以形成更高级的三级结构，其中具有多于两个的多肽。杂交多聚体的示例性结构包括异源二聚体(例如，Fv和Fab片段，二聚体，GABA_B受体1和2复合物)，三聚G-蛋白，异源四聚体(例如F(ab′)₂片段)和其他的低聚物结构。 

″蛋白定位(prl)突变体″是指其分泌器上具有改变的宿主细胞，它可挽救含有缺陷信号肽的蛋白和没有信号肽的蛋白中的分泌缺陷。 

术语″分泌″是指从细胞的细胞质转运通过细胞质膜，包括需要信号序列的转运途径和不需要信号的转运途径。 

术语″信号序列″和″信号肽″均是指能够帮助分泌相连新生肽到宿主细胞外部的肽序列。 

术语″VH和VL亚类″在人体是指7个已识别的VH亚类(VH1-VH7)和16个VL亚类(Vk1-Vk6和Vλ1-Vλ10)。 

术语″载体″包括任意核酸，适于克隆或适于表达在本发明的宿主细胞中的本发明的核酸。载体可以，例如是质粒、噬菌粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。载体可以是自调节的或可结合入宿主细胞染色体或宿主细胞中的其他复制核酸。载体还可以，例如在瞬间表达系统中不能复制或很难复制。 

具体实施方式

本发明提供了从原核宿主细胞分泌抗体，抗体片段，或抗体相关多肽，而无需信号肽的方法。在本发明的一个方面，提供了一种分泌抗体或抗原结合片 段及其装配进入功能性抗原结合分子的新方法。抗体由一个或多个包括抗体V区编码序列的核酸进行编码。本发明的抗体可包含信号序列，如美国专利号6,204,023所述，该文献在此全文结合入本文作为参考。在一些实施例中，本发明的抗体或多聚体蛋白由缺少信号肽的一个或多个多核苷酸编码多肽来表达。抗体由一个或多个能够表达抗体，抗体片段，或抗体相关多肽的载体进行编码。如果抗体由一条重链和一条轻链形成，两条链的编码序列可以在相同的载体上存在，或者编码序列可以在转化宿主细胞内的不同载体上存在。在一个优选的实施例中，抗体的重链或轻链由不对信号序列编码的多核苷酸来表达。在一些优选的实施例中，重链和轻链由不对信号序列编码的多核苷酸来编码。载体的实施例包括质粒，病毒载体，附加体和染色体组成部分。 

一般，重组体表达载体会包括至少一个复制源，表型可选标记，允许在宿主细胞中选择，例如大肠杆菌(E.coli)的氨苄西林耐药基因和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)TRP1基因，功能性启动子，以引导下游结构序列的转录，以及在可操作读取框中合适的翻译启动和终止信号。用于转化的合适原核宿主包括在肠杆菌科中的种类，如大肠杆菌，或鼠伤寒沙门氏菌，假单胞菌、链霉菌和葡萄球菌属中的不同种类，其他种类如枯草杆菌，和其他细菌宿主也可作为一种选择被采用。 

有许多用于产生本发明多肽的表达系统对于本领域技术人员来说是公知的。(参见例如，Fernandes and Hoeffler，Eds.，1999，Gene Expression Systems，Academic Press.)。大量合适的载体对本领域技术人员来说是已知的，并且可商业获得用于生成本发明的重组体构造。下述载体作为代表性提供而非限制性的例子：细菌：pBs，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBs KS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pSKF，pET23D，λ-噬菌体派生载体，基于p15A的载体(Rose，1988，Nucleic AcidsRes.16：355和356)，和融合表达系统如GST和LacZ。细菌用途的一些表达载体可包括可选标记和复制细菌源，从商业可购的质粒派生，所述质粒包括公知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的基因元素。所述商用载体包括，例如，pKK223-3(PharmaciaFine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM 1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322″骨架″部分与适当启动子和要表达的构造序列组合。 

通常，编码多肽的多核苷酸的表达是在启动子的控制下进行的，所述启动子在希望的宿主细胞中是有功能的。大多数启动子是可获得的，并可用于本发明的表达载体中。一般，启动子的选择取决于要使用启动子的细胞类型。所述启动子可源自操纵子编码糖解酶，如酸性磷酸酶，或热休克蛋白及其他。具体指定的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λP_R，tac和trc。通常使用的原核启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Change等人，1990，Nature198：1056)，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，1980，Nucleic Acids Res.8：4057)，tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)；和λ-派生P_L 启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，1981，Nature 292：128)。具体的启动子系统对于本发明不是至关重要的，可以使用作用在原核生物中的任何可用的启动子。适当载体和启动子的选择是本领域技术人员已知的。 

对于多肽在原核细胞而非大肠杆菌中的表达，需要作用在具体原核种类用于转录和翻译的调控序列。所述启动子可从自所述种类克隆的基因获得，或者可以使用异源启动子。例如，杂交trp-lac启动子除了大肠杆菌之外还作用于芽胞杆菌。这些以及其他合适的细菌启动子是本领域技术人员公知的，并且披露于例如，Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.。用于表达本发明蛋白的细菌表达系统可以在，例如大肠杆菌、Bacillus(芽胞杆菌)sp.，和沙门氏菌(Palva等人，1983，Gene 22：229-235；Mosbach等人，1983，Nature 302：543-545)中获得。所述表达系统的试剂盒可商业购得。 

组成型启动子或调节启动子可用于本发明。调节大肠杆菌表达的方法是本领域技术人员熟知的，并包括使用诱导启动子，如可被IPTG诱导的lac或tac启动子，和树胶醛糖诱导的启动子。调节启动子是有利的，因为可以控制宿主细胞中的外源蛋白浓度。可诱导启动子是引导基因表达的启动子，其中表达级别通过环境或发展因素，诸如例如温度、pH、无氧或有氧条件、光照、转录因子和化学制品可改变。 

对于大肠杆菌和其他细菌宿主细胞，可诱导的启动子是本领域技术人员已知的。这些启动子包括，例如，lac启动子、噬菌体λP_L启动子、杂交trp-lac启 动子(Amann等人，1983，Gene 25：167；de Boer等人，1983，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 80：21)，和噬菌体T7启动子(Studier等人，1986，JMoI.Biol.；Tabor等人，1985，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 82：1074-8)。这些启动子及其应用在Sambrook等人，supra中讨论。 

其他有机体的可诱导启动子也是本领域技术人员熟知的。这些包括，例如，金属硫蛋白启动子、热休克启动子以及许多其他的启动子。 

还包括其他表达控制序列，如核糖体结合位点、转录终止位点、操纵子等等。包括一个或多个这些控制序列的DNA构造被称为″表达盒″。相应地，编码多肽的核酸可被结合用于在希望宿主细胞中的希望级别的表达。 

翻译-起始密码子可直接被引导到成熟抗体或抗体片段编码序列的上游，以便表达抗体或抗体片段多肽，具有在N-端的甲二磺酰基(或N-甲酰甲二磺酰基)残基。其他序列可包括在抗体的编码序列中，例如以便抗体的纯化或检测，或出于其他目的。异源构造序列装配在适当的翻译读取框，并具有适当的翻译启动和终止序列。可选地，异源序列可编码融合蛋白，它包括N端识别肽，传递希望特征，如，表达重组体产品的稳定性或简化的纯化。 

ATG密码子存在于编码序列的5′端，以便表达的蛋白在氨基端具有N-甲酰蛋氨酸残基。编码序列表达后，N端氨基酸可以保留在宿主细胞中或被蛋白酶除去。根据本发明由DNA编码序列的表达生成的抗体、抗体片段或抗体相关多肽能够结合抗原。在抗体片段由重链和轻链形成的情况，一条链或两条链可由具有ATG密码子的编码序列表达。优选地，两条链均不用信号肽表达。 

转译偶联可用于增强表达。这种策略使用来自对于转译系统具有天然高表达基因的短上游开放翻译读框，或合成/非天然高表达开放读框，它位于启动子和核糖体结合位点的下游和终止密码子的上游。第二核糖体结合位点正好位于终止密码子之前，并且跟随终止密码子的是起始密码子，用于翻译要表达的多肽。该系统允许翻译的有效起始。参见Squires等人，1988，J.Biol.Chem.263：16297-16302。 

在适于抗体表达的条件下，细菌生长一定周期后，可从培养基检测或分离出分泌的抗体。监控培养基中抗体的方法包括蛋白质印迹分析，SDS-PAGE和酶连接的免疫吸附化验(ELISA)。还可从细菌的周质中检测或分离出分泌的抗体。 破坏周质并从周质部分释放抗体的方法是本领域技术人员熟知的，并包括使用低pH(例如pH4.0)或渗压休克。 

为了有利于纯化本发明的多肽，编码多肽的核酸还可包括表位或“标签(tag)”的编码序列，它可利用亲和力结合试剂。这种表位标签包括，例如，c-myc，HA-标签，麦芽糖结合蛋白，VSV-G标签，抗DYKDDDDK(SEQ ID NO：3)标签，或任何所述标签，其中很多是本领域技术人员熟知的。可用于具有这些表位的融合多肽的重组制备的表达载体是可商业获得的(例如，Invitrogen，Carlsbad，CA)载体pcDNA3.1/Myc-His和pcDNA3.1/V5-His适于在哺乳动物细胞中表达)。其他适于将标签附着在本发明融合蛋白上的表达载体，和相应的检测系统是本领域技术人员已知的，并且若干是可商业获得的(例如，″FLAG″(Kodak，Rochester NY))。合适标签的另一个示例是多聚组氨酸序列，它能够结合金属螯合亲和配基。通常，使用6个相邻的组氨酸，虽然也可以使用多于或少于6个。可用作多聚组氨酸标签的结合部分的适当金属螯合亲和配基包括氮川三乙酸(NTA)(Hochuli，E.，1990，″Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents″in GeneticEngineering：Principles and Methods，J.K.Setlow，Ed.，Plenum Press，NY；可从Qiagen，Santa Clarita，CA商业购得)。 

本领域技术人员可认识到，可对蛋白域进行变异，而不减少它们的生物学活性。所述变异可用来便于克隆，表达，或将域结合入多肽。所述变异是本领域技术人员熟知的，并包括，例如，在编码结合域的多核苷酸的任一端添加密码子，以便例如在氨基端添加蛋氨酸来提供起始位点，或者在任一端设置附加氨基酸(例如，poly His)，以产生方便设置的限制性位点或终止密码子或纯化序列。 

多肽

抗体 

在一个实施例中，分泌的多肽是抗体。已知基本的抗体结构单元包括四聚物。每个四聚物由两个相同的多肽链对构成，每对均具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括大约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分定义恒定区，主要负责效应功能。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。每个链具有恒定区(C)和可变区(V)。每个链可组成一系列域。轻 链具有两个域，一个对应C区而另一个对应V区。重链具有四个域，一个对应于V区，而三个域(1、2和3)在C区。抗体具有两个臂(每个臂是Fab区)，各自具有VL和VH区彼此相连。正是这对V区(VL和VH)将一个抗体与其他抗体区分开(由于氨基酸序列变化)，并且一起负责识别抗原并提供抗原结合位点。更详细地讲，每个V区由3个互补决定区(CDR)组成，所述互补决定区由4个框架区(FR)分隔。CDR是可变区中变化最大的部分，并且它们执行关键的抗原结合功能。经由涉及重组、突变和选择的复杂过程，CDR区可从许多潜在的种系序列获得。 

轻链可分为k或λ。重链可分为γ、μ、α、δ或ε，并且分别定义抗体的同种型为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。人类的重链亚类被指定为VH1-VH7。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过有约12个或更多氨基酸的“J”区来连接，重链还包括有约10个额外氨基酸的“D”区(总体参见1993，Paul，W.，ed.，FundamentalImmunology，3^rd ed.Raven Press，N.Y.，SH.9(为所有目的，该文献在此全文引入作为参考))。 

从N端到C端，轻链和重链的可变区均包括交替框架和互补决定区(CDR)：FR，CDR.FR，CDR.FR，CDR和FR。将氨基酸分配到每个区是根据Kabat，1987，和1991，supra，和/或Chothia & Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883的定义。 

已示出，结合抗原的功能可通过整个抗体的片段执行。示例性的结合片段是(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iii)由抗体单个臂的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)由VH域组成的dAb片段(Ward，E.S.等人，1989，Nature 341：544-546)；(v)分离的CDR区；和(vi)F(ab′)₂ 片段，它是包括通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段。 

在本发明的不同实施例中，抗体或抗体片段可以是单链抗体或可由重链和轻链形成。示例性的抗体包括完整的免疫球蛋白，单链抗体，scFv，dAB，VHH，Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，camelid抗体，纳米抗体，抗原结合支架，和抗体或抗体相关多肽融合蛋白。如果抗体包含重链和轻链，表达一个或多个链而不用信号肽，并优选不用信号肽表达两个链。 

已知存在构成camelid(包括骆驼、骆马和相关种系)免疫球蛋白(抗体分子)的IgG的两种结构：一个是具有重链和轻链的异源四聚体，而另一个由重链 二聚物组成。四聚体结构是人类和多数动物中IgG的一般特征。另一方面，具有重链二聚物结构的后者的IgG被认为是camelid的特征。 

由于camelid中重链二聚物IgG的VH区不必须与轻链发生疏水作用，因此通常接触轻链的重链中的区被变成camelid中的亲水氨基酸残基。由于与通常异四聚体IgG的VH相比结构不同，重链二聚物IgG的VH域被称为重链抗体(VHH)的重链的可变域。 

由于其亲水性氨基酸残基，VHH具有很好的可溶性。氨基酸取代分散在整个VHH的主结构(氨基酸序列)上。此外，这些亲水性氨基酸残基在VH的三级结构空间对应与VL域交互作用的位点形成簇。这里，三级结构的上述空间特别称为成形VL侧。这些氨基酸取代基是，例如，V37F或V37Y，G44E，L45R或L45C，和W47也大多通过Gly来取代。所述取代基提高VHH的成形VL侧的亲水性。 

此外，与小鼠异四聚体抗体相比，得自骆驼和骆马的VHH具有非常高的热稳定性。使用得自所述物种的VHH可提供，例如，即使在90℃也可维持抗原结合能力的分子(Van der Linden等人，1999，Biochim.Biophys.Acta 1431(1)：37)。 

camelid的抗体谱的多样性由VH或VHH区中的互补决定区(CDR)1，2和3来确定。三个CDR的占有与其他动物种类的IgG相同。不过，骆驼VHH区中的CDR3通过其平均16个氨基酸的相对长的长度表征(Muyldermans等人，1994，proteinEngineering 7(9)：1129)。例如，与具有平均9个氨基酸的小鼠VH的CDR3相比，骆驼IgG的CDR3非常长。 

得自camelid的抗体可变区库维持camelid的可变区的体内多样性，可通过例如公开日为2005年2月17日的美国专利申请序列号20050037421描述的方法获得，该文献在此全文被结合入本文作为参考。 

在本发明的另一个实施例中，抗体相关多肽是支架多肽。支架多肽是非免疫球蛋白结合多肽，显示对预定配基的选择结合活性。非免疫球蛋白结合多肽得自含有支架的免疫球蛋白类域，可以通过亲本多肽的结合域移植，将亲本多肽的结合特异性赋予含有支架的免疫球蛋白类域。本发明的非免疫球蛋白结合多肽的优点是在支架域结构以及接受大范围异源多肽结合域的能力上是稳定和模块化的。此外，含有支架的免疫球蛋白类域可易于从人类获得，因此当用作人类治疗剂时可以忽略它们的免疫原性。本发明的支架还可易于构建成含有或省略自然存在的多糖链或包括新型链或其他额外支架部分或多肽结构。

在一个实施例中，本发明涉及非免疫球蛋白结合多肽，它具有抗体可变区互补决定区(CDR)插入含有支架的Thy1免疫球蛋白类域。CDR插入Thyl多肽的环区，所述多肽允许CDR折叠成如同其在供体或亲本抗体的三维结构中的类似构造。获得的杂交或嵌合的抗体相关多肽显示比拟亲本抗体的相似结合特性。 

在另一个实施例中，本发明涉及抗体相关多肽，它具有在某些或所有位置通过氨基酸取代获得的改变的免疫球蛋白类域环。环域中改变的氨基酸序列向配基赋予选择性结合活性，而不是通过抗体相关多肽结合。可利用本领域技术人员已知的各种方法在核酸或多肽级进行氨基酸变化。 

在另一个实施例中，本发明涉及抗体相关多肽，它得自含有多肽的免疫球蛋白类域的ThyOx族。ThyOx多肽可用作包含支架的免疫球蛋白类域或作为载体多肽以生成本发明的抗体相关多肽。支架多肽和所述支架多肽库可通过，例如，披露于公开日为2004年12月30日的美国专利申请号20040266993中的方法获得，该文献在此全文引入本文作为参考。 

如本文所用的，当涉及支架时，术语″免疫球蛋白类域″或″Ig类域″是指在不同功能的蛋白，包括例如，细胞外基质蛋白，肌肉蛋白，免疫蛋白，细胞表面受体和酶中找到的现有技术可识别的β-sandwich结构基元。Ig-类域构件已经被分成各种总科，包括例如，免疫球蛋白，纤维连接蛋白型III和钙粘蛋白总科。其他含有Ig-类域结构基元的总科包括，例如，PKD域，β-半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸酶域，转谷氨酰胺酶两个C端域，放线黄质素-类，CuZn超氧物歧化酶-类，CBD9-类，核纤层蛋白A/C球状尾(globulartail)域，网格蛋白衔接附属域，整合素域，PapD-类，紫色酸性磷酸酶N端域，超氧化物还原酶-类，巯基-二硫键互换蛋白DsbD N端域和透明质酸酶/内膜细胞粘附片段总科构件。在不同总科构件之间不考虑重要序列一致性，保持Ig-类域结构相似性。该术语旨在包括每个总科内和横跨每个总科的Ig-类域构件。因此，术语″免疫球蛋白类(Ig-类)域包含总科″旨在表示Ig-类域包含任意所述总科内以及现有技术已知的构件多肽。不同Ig-类域包含总科的描述可以在，例如，Clarke等人，1999，Structure Fold.Des.7：1145-53和在诸如URLpdb.weizmann.ac.il/scop/da-ta/scop.b.c.b.html的结构数据库内找到。 

正如本文所用的，当涉及本发明的抗体相关多肽时，术语″ThyOx″或 ″ThyOx族多肽″旨在表示免疫球蛋白类域的免疫球蛋白总科(IgSF)中的多肽亚类，所述域包含由它们共同的β-sandwich结构基元相关联的多肽并包含类似于抗体可变区域的支架框架结构。多肽的ThyOx族内的具体多肽包括，例如，Thy-1，Ox2，GP40，Ox2-类蛋白和Ox2同族体。 

正如本文所用的，术语″支架″旨在表示支撑多肽框架，用于组织、定向和容纳异源结合域或改变的氨基酸序列，向配基赋予结合特异性。支架可以与赋予结合特异性的氨基酸序列在结构上分离。支架的结构上可分离部分可以包括多种不同的结构基元，包括例如，β-sandwich、β-sheet、α-helix、β-barrel、coil-coiled和其他现有技术公知的多肽二级和三级结构。本发明的支架还会包含一个或多个区，可在氨基酸序列上变化，而不会实质降低支撑框架结构的稳定性。可以变化的示例性区包括连接两股β-sandwich或β-sheet的环区片段。对应支架在结构上分离部分的氨基酸残基在本文被称作支架框架。本发明包含支架的免疫球蛋白类域显示与人类免疫球蛋白可变重链或轻链框架氨基酸序列相比少于约50％的氨基酸一致性。一般，包含支架的免疫球蛋白类域会显示，例如，与人类免疫球蛋白可变重链或轻链框架氨基酸序列相比，有小于约45％，约40％，大约30％，大约20％，大约15％或大约10％的氨基酸序列一致。可以变化的支架残基在本文是指关于其结构特性诸如环区，或关于其容纳变化残基的能力。因此，可以变化的支架区被称作例如，支架可变区，突变区，交换区，可变区或易变区。只要保持支架的整体结构，就可以保留、改变或保存具有二级或三级结构特性的残基。本领域技术人员已知或可以确定，哪些残基在多肽支架的结构稳定性上起作用以及所述残基可被改变到何种程度。 

本发明的支架的特定例子包括免疫球蛋白类域包含总科构件。这些总科构件含有免疫球蛋白类域表征为β-sandwich，可用作本发明的支架。β-sandwich由含有两层反平行的β-sheet的大约18-150个氨基酸残基组成，其中β-sheets的扁平疏水性面彼此压抵。每个β-sheet包含环区，可以在氨基酸序列上改变，以便将独特的结合特异性赋予给支架多肽。包含总科构件的Ig-类域的例子包括，例如，ThyOx族构件多肽以及前述包含总科的免疫球蛋白类域中的不同个体构件。这些个体构件包括，例如，T细胞受体，CD8，CD4，CD2，I类MHC，II类MHC，CD1，细胞因子受体，GCSF受体，GMCSF受体，激素受体，生长激素受体，促红细胞生成 素受体，干扰素受体，干扰素γ受体，催乳素受体，NCAM，VCAM，ICAM，N-caderin，E-caderin，纤维连接蛋白，腱生蛋白，和含有域多肽的I-set，或其功能性片段。这些及其它包含总科构件的Ig-类域的示例性描述可以在，例如，Isacke andHorton，2000，The Adhesion Molecule FactsBook，Second Ed.，Academic Press，SanDiego；Fitzgerald等人，2001，The Cytokine FactsBook，Second Ed.，Academic Press，San Diego；和Marsh等人，1999，The HLA FactsBook，Second Ed.，Academic Press，San Diego中找到。 

本发明的抗体、抗体片段或抗体相关多肽可得自多种来源。在不同的实施例中，抗体、抗体片段或抗体相关多肽得自哺乳动物基因，并可以是人、小鼠、兔子、绵羊、大鼠、仓鼠嵌合的、人源化、杂交、或表位聚焦的。本发明的抗体可以是单克隆的。由于对于给定抗原具有高特异性，单克隆抗体(Kohler，G.和Milstein C，1975，Nature 256：495)的出现代表了在科学和商业上具有重要结果的重大技术突破。 

传统上单克隆抗体通过建立永生哺乳动物细胞系获得，它得自单个免疫球蛋白分泌细胞，分泌具有特定特异性的一种形式的生物学功能抗体分子。因为抗体分泌哺乳动物细胞系是永生的，因此抗体的特性可从一批到一批繁殖。单克隆抗体的关键特性是它们对于特定抗原的特异性及制备它们时的可再现性。 

早期制备单克隆体的方法是费力和费时的。选择的一种动物，例如，小鼠，通过希望的抗原使其免疫，从该动物收获抗体分泌细胞(通常通过脾切除术)，并融合到合适的永生化细胞，例如，骨髓瘤细胞，获得可无性繁殖生成抗体的杂交瘤细胞。所述杂交瘤细胞技术披露于，例如，美国专利号4,172,124和4,196,265；Zurawski等人，1980，Federation Proceedings 39：4922；Frankel andGerhard，1979，Molecular Immunology，16：101-106。 

生成完全人抗体的转基因动物的引入已允许选择也生成完全人抗体的杂交瘤细胞。所述转基因动物披露于，例如，美国专利号6,075,181和6,300,129，上述文献在此全文引入本文作为参考。 

呈现技术还允许选择单克隆抗体，所述抗体是完全人源化或其他动物，嵌合的、合成的和/或半合成的。所述呈现技术的一个例子是噬菌体呈现(示例披露于美国专利号5,565,332；5,580,717；5,821,047；5,871,907；5,885,793；5,922,545； 5,403,484；5,885,793；6,172,197；6,291,158；6,291,650；和6,387,627，上述文献在此全文引入作为参考)，其中构建了表达融合抗体的载体，其中一个或多个抗体链在噬菌体蛋白的N端融合。所述载体可被引入本发明的prl突变宿主株，以便表达抗体和以信号独立的方式分离噬菌体-抗体。本发明宿主细胞中的噬菌体-抗体的表达提供了改进的分泌不佳抗体的表达并更好表示库中存在的各种亚类抗体。融合蛋白还可由缺少信号序列的多核苷酸编码抗体融合蛋白表达。在上述专利中已经描述了筛选、纯化和分析噬菌体抗体的方法。所述呈现技术的另一个例子是酵母呈现(示例披露于美国专利号6,300,065，该文献在此全文引入作为参考)。 

噬菌体-呈现技术一般使用丝状噬菌体M13或紧密相关的噬菌体fd。这些噬菌体由环形单链DNA组成，所述DNA通过圆柱形外壳蛋白包围。大多数病毒衣壳由主要蛋白pVIII组成，其中每个噬菌体具有2700个复制品。在噬菌体颗粒的一端，有5个复制品各为pIII和pVI，涉及宿主细胞结合和终止装配过程。另一方面，有5个复制品分别各为pVII和pIX，33和32氨基酸的疏水性肽，需要用于装配的起始和用于病毒体稳定性的维持。 

本发明的实施例包括嵌合抗体和合成抗体。上述早期的单克隆技术制造非人抗体。这些抗体在人体潜在地产生免疫性，并且这种免疫性严重阻碍治疗抗体的开发。所谓“嵌合抗体”的制造，例如，一个种类的可变区连接另一个种类的恒定区，已经相当成功了，但是在许多情况中没有克服免疫原性问题。嵌合抗体的示例性方法披露于，例如，美国专利号4,816,567，该文献在此全文引入作为参考。 

已经利用重组DNA技术来制造免疫球蛋白，它具有来自一个种类的人框架区结合来自另一种类的免疫球蛋白的互补决定区(CDR)(参见例如，EPO公开号0239400)。这些新蛋白被称为“改造的”或“人源化的”(当框架区是人时)免疫球蛋白，而通过将其CDR与人框架相结合来将供体免疫球蛋白转化为人类免疫球蛋白的过程被称为“人源化”。人源化抗体的示例性方法披露于，例如，美国专利号6,180,370，该文献在此全文引入作为参考。 

人造抗体及其片段可以根据已知的抗体序列构建，所述抗体序列反映整组同源抗体基因的结构特性。因此，减少不同基因的数量而结构所有组成部分中没有任何损失是可能的。该方法导致有限组的人造基因，其可以重新合成，从 而允许引入切割位点并除去不想要的切割位点。此外，该方法能够(i)使密码子用途的基因适应任意希望宿主细胞中的高表达基因，和(ii)根据交互作用优先、抗原优先或重组表达效价来分析所有可能的抗体轻链(L)和重链(H)对，而事实上利用有机体的抗体基因的全部集合及其所有组合是不可能的。 

使用有限组的全合成基因使得在编码结构子元素的边界创建切割位点成为可能。因此，每个基因都是通过模块建立的，所述模块表示蛋白/(多)肽级上的结构子元素。在抗体的情况中，模块由″框架″和″CDR″模块组成。通过创建分离的框架和CDR模块，能够实现不同组合装配的可能性。此外，如果两个或更多人造基因在每个基因子元素的边界上携带相同对的切割位点，预先建立的子元素库可同时插入这些基因，而不需任何有关任何特定基因序列的其他信息。这种策略能够迅速优化，例如，抗体亲和力，因为基因子元素的DNA盒编码库可以是(i)预先建立、存储和再用的，和(ii)在正确位置插入任何所述序列，而不需知道实际的序列或必须确定个体库构件的序列。产生抗体合成库的示例性方法披露于，例如，美国专利号5,885,793和6,300,064，上述文献在此全文引入作为参考。 

在一个实施例中，抗体是表位聚焦的人抗体，通过用于基因工程抗体的方法获得，其中所得到的抗体保留表位结合特异性和亲和力，并同时具有大部分非人序列替换为人序列，如申请日为2005年1月20日的专利申请美国专利申请序列号11/040,159中所描述，该文献在此全文引入作为参考。这通过从参考抗体，如CDR3对蛋白(CDR3₂)，转移BSD而实现。在亲和力成熟(affinity-matured)的抗体中，例如参考抗体，重链和轻链BSD彼此紧密接触，并且优化用于组合的抗原结合构象的相互稳定，因此，它们形成单元，即BSD对。当然，抗原结合构象取决于V区下面框架的支撑。当亲和力成熟的BSD，例如参考抗体的BSD，结合重链或轻链V片段对的完整人所有组成部分的结构多样性和稳定性时，借助于选定系统，可易于识别完全支撑BSD的最佳抗原结合构造的支架，所述选定系统包括但不限于噬菌体展示技术，细胞活性，菌落转移结合测定法(CLBA)，或多种免疫测定法，如ELISA测定法。 

此外，BSD对转移到不同种系的V段通常导致选定亲和力大于50nM的的V区。这些选定的V区还可以结合入任何抗体的亲和力成熟过程。没有CDR3组成部分的V段库相对较小，因而人V区的选择还可与很多传统选定系统可供搜索尺 寸的库中有限诱变多样化的一个或两个BSD相结合。 

用于生成库以取代参考抗体的重链和/或轻链V区段的V区段组成成分可以来自任何来源。人的所有组成成分可以，例如，利用适合从外周血或脾脏获得的cDNA的希望片段的引物通过多聚酶链式反应(PCR)扩增来产生，在这里期望所有组成成分包含具有体细胞突变的克隆体。另外，可以通过扩增来自非免疫系统细胞的基因组DNA来获得所有组成成分，以便获得种系编码的序列。 

人种系V片段所有组成成分由51个重链V区，40κ轻链V片段，和31λ轻链V片段组成，总共具有3621个种系V区对。另外，这些V片段大多具有稳定的等位基因变异体，但是这些变异体对种系所有组成成分的结构多样性的贡献是有限的。所有人种系V片段基因的序列是已知的，并可在V-base数据库中访问获得，该数据库由MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，United Kingdom提供(参见，Chothia等人，1992，J MoI Biol 227：776-798；Tomlinson等人，1995，EMBO J14：4628-4638；和Williams等人，1996，J Mol Biol 264：220-232)。在亲和成熟过程期间由体细胞超诱变作用产生的V片段变异体还可对V片段的所有组成成分做出重要贡献，因为这些突变看上去是非随机的，并可具有有利于高亲和力抗原特异性的结构调整。当天然抗体被优化成广泛特异性和低亲和力用于最大结合多样性时，亲和成熟抗体可包含支持高亲和力抗原特异结合所需的更刚性CDR的结构变化(例如，Diaz and Klinman，2000，Immunol Res.21：89-102)。 

人V区组成成分，种系和亲和力成熟的，例如，可由外周血淋巴细胞(PBL)恢复，通常从多个(例如，至少10)健康个体收集，利用传统的cDNA克隆方法(Sambrook and Russell，eds，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd Ed，vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)。在种系频数分布在表达序列中不均衡的范围内，为3个V区同种型(VH、Vκ，和Vλ)的每一个谨慎捕获至少10³个单独克隆体，以确保组成成分的最佳多样性。PCR可用于在克隆过程中扩增V区序列。不过，指数扩增机制倾向于随机偏差，并且这可以通过利用兼并引物合成，所述引物具有可变引发效率，导致多样性的损失。因而，当需要扩增时，理想的如果可能，使用引物非依赖的线性扩增方法，如体外转录(Sambrook and Russell，eds，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd Ed，vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press，2001)。 

来自参考抗体的BSD被转移到如上所述生成的V片段序列库。BSD可在V片段群体克隆到表达载体之前或之后结合入表达载体中。转移的BSD可以是CDR3-FR4，CDR3，D片段(其中BSD来自重链)，MEBSD，或CDR3-FR4的任意其它片段，所述片段具有结合特异性，与来自参考抗体其他链的互补BSD结合。可以理解，当将BSD从参考抗体转移到不同的V区时，在所得到的V区中重链或轻链V区的结构保持。因此，如果来自参考抗体的BSD是CDR3-FR4亚区，那么整个CDR3-FR4结构长度被保持，即，不是来自参考抗体的CDR3-FR4残基的剩余部分由其它残基构成，通常是人种系残基。 

注意到，BSD可以包括框架4区，例如，来自参考抗体，是J片段的一部分，但在哺乳动物中高度保存，并对CDR3结构是重要的。这些序列可以，例如，通过具有引物的PCR进行扩增，所述引物包含框内连接到框架3的限制性位点，及其他位于框架4的羧基端下游的独特限制性位点，例如，例如用于连接到C区。每个CDR3-FR4随后转移进入V区库构造的适当位点。另外，CDR3-FR4区的理想序列或序列的混合可合成为一个连续的寡核苷酸或寡核苷酸混合物，并可以通过引物延伸连接到V片段组成成分，利用由组成成分合成的体外转录的cRNA作为第一链cRNA合成模板。多样性可被引入区，例如，CDR3和/或FR4。 

BSD也可以是序列，它比完整的CDR3小，例如，重链CDR3的D片段或MEBSD。本领域技术人员可以理解，当参考抗体BSD小于完整CDR3时，完整的CDR3仍在抗体表达库中得到，因为剩余的CDR3残基被结合入构造。例如，可以设计适当的寡核苷酸，以结合人序列，例如，种系J片段，来取代不是MEBSD一部分的CDR3残基。 

MEBSD是在CDR3序列或CDR3对内的区，要求在与人序列组合重建CDR3剩余部分和V区剩余部分时保留参考抗体的结合特异性。MEBSD可以通过经验确定或可以由结构方面进行预测。 

抗体库可以是一个库，其中抗体是IgG，Fv，Fab，Fab′，F(ab′)₂，单链Fv，删除一个/多个域的IgG，或任意其他包括V区的抗体片段。 

抗体可以在病毒、细胞、孢子或病毒样颗粒的表面上展示。为了这个目的，抗体片段的一个或两个链通常表达为融合蛋白，例如作为对噬菌体外壳蛋白的融合用于展示在丝状噬菌体的表面上。另外，抗体库的抗体可由宿主细胞分 泌。 

下文利用分泌系统提供示例性描述，来表达抗体作为Fab或Fab′片段。不过，对于本领域技术人员来说显而易见，表达系统可适于任何库格式。对于本通常的例子，完整V区库是通过上述将寡核苷酸编码CDR3-FR4片段连接到V片段组成成分来构建的。扩增的序列编码整个V区被克隆到合适的表达载体并且可在这时融合恒定区序列，用于表达Fab或Fab′分子。抗体片段可从包括细菌，酵母，植物细胞和哺乳动物细胞的原核或真核细胞分泌。 

已经描述了过滤筛选方法，用于检测对具体抗原特定的分泌抗体。在一种形式中，分泌的抗体片段被捕集在膜上，所述膜用可溶抗原进行针探(Skerra等人，1991，Anal Biochem.196：151-5)。在这里，引导Fab片段的分泌进入细菌周质的细菌存在质粒载体在膜或滤器上生长。分泌的片段被允许扩散到覆盖有抗体的第二“捕获”膜上，所述抗体可以结合抗体片段(如，抗免疫球蛋白抗血清)，并且捕获滤器用特定的抗原针探。可用抗体-酶偶联物来检测捕获膜上当作色点的抗原结合抗体片段。菌落在第一膜上重新生长，并且表达希望抗体片段的克隆体恢复。 

已经描述了菌落转移结合测定法，其中允许抗体直接扩散到覆盖有抗原的膜上。Giovannoni等人已经描述了这种筛选单链抗体库的协议(Giovannoni等人，2001 Nucleic Acids Research，Vol.29，No.5 e27)。 

分泌的抗体片段库也可以通过ELISA筛选，利用多个克隆体池(pool)或筛选单个克隆体每个分泌唯一的抗体序列。一种所述筛选单个克隆体的方法披露于Watkins等人，1997，Anal.Biochem.253：37-45。在这里，微量测试孔覆盖有抗Fab抗体，以捕获直接分泌在孔上的Fab片段。随后用可溶性生物素标记抗原对Fab样品进行针探，随后用抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶络合物进行检测。 

融合抗体 

在一个实施例中，多肽可以是融合抗体。在一个实施例中，抗体片段可以包括一个或多个C端肽标签，以便于检测和纯化。在另一个实施例中，抗体可融合到肽或多肽，用于在细胞、孢子或病毒的表面上展示。例如，抗体片段的一条链可在诸如丝状噬菌体的噬菌体表面上展示为融合蛋白。在噬菌体上展示抗体的方法是本领域技术人员公知的，并且包括融合到丝状噬菌体的pIII和pVIII蛋白。 在一个优选的实施例中，包括抗体-噬菌体蛋白融合的至少一种肽不需信号肽在大肠杆菌的prl菌株上表达，并呈现在噬菌体的表面上。 

分泌的链可保留N端蛋氨酸(或N-甲酰-蛋氨酸)。另外，并在一些情况，根据抗体的序列，最初的蛋氨酸可通过宿主细胞的蛋白水解处理除去。 

实施例还包括其他展示技术，如酵母细胞展示，细菌细胞展示，核糖体展示，和哺乳动物细胞展示。在一个实施例中，通过筛选库构件池进行筛选。 

本发明中可以使用片段和亚单位补体系统，来选择/筛选具有希望特性的抗体(“补体系统”)。一般，片段补体系统由应答器构成，它被分段或分成两个(或更多)部分，必须再组合以得到功能性应答器。应答器的片段/亚单位单独融合到结合集合的构件，并且随后应答器的重组通过两个结合集合构件的直接或间接交互作用驱动。在一个优选的实施例中，结合集合由抗体和抗原构成。可用于本发明的片段/亚单位补体系统的例子披露于美国专利号6,342,345；6,270,964；6,294,330；5,503,977；5,585,245，上述文献在此全文引入作为参考；PCT专利申请WO 00/71702，和Fields等人，1989，Nature 340：245-247；Bai等人，1996，Meth.Enzymol.273：331-347；Luo等人，1997，Biotechniques 22：350-352，上述文献在此全文引入作为参考。 

基于再活化分子交互作用系统(例如，RAIR.TM.)可用于本发明，以选择/筛选具有希望特性的抗体(“再活化系统”)。一般，基于再活化分子交互作用系统由应答器，抑制子，再活化器和两个或更多构件的结合集合构成。该系统具有两个复合物，一个含有应答器、抑制子和结合集合构件(应答器复合物)，而另一个含有再活化器和结合集合构件(再活化复合物)。应答器在其复合物中被抑制，通过结合集合构件的直接或间接交互作用将再活化复合物对接应答器复合物，使得再活化器通过置换抑制子来“再活化”应答器。通常，应答器复合物包括应答器分子，应答器抑制子，和第一结合集合构件。应答器复合物的成分可通过共价或非共价链接排列成不同构造。在优选的实施例中，结合集合由抗体和抗原构成。 

在一个优选的再活化系统中，可以通过称作“自动抑制应答器的再活化作用”或“RAIR”的过程来检测分子交互作用。RAIR系统包括以下成分：应答器复合物和再活化器复合物。自动抑制是表示应答器直接连接到应答器，以便自动 抑制基态，直到抑制子被置换并且应答器被再活化器复合物激活。该链接是通过共价键，共价链接可进一步包括链接子。再活化器复合物包括再活化器分子以置换抑制子和第二结合集合构件。如同应答器复合物的成分，再活化器和结合集合构件可共价或非共价链接。 

可以通过下述机制检测第一和第二集合构件之间的分子交互作用：应答器复合物中的应答器的信号或活性通过抑制子隔离，所述抑制子存在于复合物中，即应答器是自动抑制的；当引入再活化器复合物，如果再活化器复合物中的第二集合构件与应答器复合物中的第一集合构件具有充分亲和力进行结合，再活化器将能够置换应答器复合物中的抑制子，并导致所谓的“自动抑制应答器的再活化作用”。应答器活性或信号的检测表示第一和第二集合构件之间的相互作用。 

RAIR系统的变化可用于绘制相互作用的图谱，改进第一结合对构件的亲和力，和多个结合分子的各向同性选择。在一些变化中，可使用第三集合构件。 

再活化系统的例子披露于美国专利申请序列号10/208,730，该文献在此全文引入作为参考。 

利用通过竞争激活的分子传感器的系统也可用于本发明，来选择/筛选具有希望特性的抗体。这些系统被指定为COMPACT.TM。一般，竞争性激活系统由结合集合，应答器和抑制子构成。应答器与一个结合集合构件络合，而抑制子与另一个结合集合构件络合。结合集合构件一旦彼此结合，将应答器和抑制子集合在一起，所以应答器被抑制。然后可以选择本发明的抗体，它破坏结合集合或抑制结合集合形成并从而激活应答器。在一个优选的实施例中，结合集合是抗体和抗原，而″竞争性激活子″是抗体。例如，结合集合抗体可以是参考抗体，而竞争性激活子可包括抗体库，它与参考抗体竞争结合抗原。可用于本发明的竞争性激活系统的例子披露于美国专利申请序列号10/076,845，该文献在此全文引入作为参考。 

所述系统可进一步采用″掩模″来控制系统的敏感性。这些系统披露于，例如，共同申请的申请日为2002年2月14日的美国专利申请序列号10/076,845中。″掩模″，在竞争性激活系统的上下文中，是指分子，它对指示器或抑制子具有低亲和力，因此掩模不在工作浓度有可观的结合，除非它共价限定到指示器或抑制子。掩模不影响指示器的活性，只影响抑制子的结合，反之亦然。用掩模控制 系统允许使用高亲和力的抑制子，而不需担心增大背景抑制，这时因为其结合速率常数被掩模大胆降低，而不影响指示器-抑制子复合物的解离速率常数，从而降低整体亲和力，同时保留高亲合力指示器-抑制子复合物的稳定性。 

库 

在本发明的另一个实施例中，分泌的多肽可以是具有不同结合特性由原核宿主细胞如表达prl突变的大肠杆菌菌株表达的抗体，抗体片段，或抗体相关多肽的多样库，其中一个或多个抗体链不需信号肽表达。在另一个实施例中，分泌的多肽以信号独立的方式表达。依据本发明这方面的库显示更宽的VH和VL亚类表示。 

现有技术已知，不同的抗体在不同水平分泌进入周质，并且抗体的某些亚类只较低地分泌在可溶的正确折叠形式。在多数情况，抗体的V区序列可影响从大肠杆菌分泌抗体的能力。例如，鼠科V区难以在周质中折叠，并可能导致聚合和无活性抗体的积聚(Skerra and Pluckthun，1991，Prot.Eng.4：971；Bothmann andPluckthun，1998，Nature Biotech.18：376；Helle等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11907)。伴侣蛋白质可改进一些抗体片段的折叠和表达(Bothmann andPluckthun，1998，Nature Biotech.18：376；Bothmann and Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.275：17100)。从细菌分泌一些亚类抗体的偏性可导致从库中筛选出的抗体序列出现偏性。本发明的一个实施例指出允许以不依赖于信号的方式通过抗体链的分泌从细菌分泌系统获得高产量的功能性正确折叠抗体和抗体片段。 

本发明的实施例包括天然库和免疫库。天然库由适当宿主的B-淋巴细胞获得，所述宿主既没有用任意免疫原进行免疫性测试，也没有显示感染或炎症症状。免疫库由从合适“免疫”宿主获得的B-细胞和浆细胞的混合获得，即该宿主已通过免疫原进行了免疫性试验。在一个实施例中，利用本领域技术人员公知的方法将来自这些细胞的mRNA转译成cDNA(例如，寡-dT引物和逆转录酶)。在另一个实施例中，来自宿主细胞的核酸编码抗体(mRNA或遗传DNA)通过具有合适引物的PCR进行扩增。所述抗体基因扩增的引物是本领域公知的(例如，美国专利号6,096,551，该文献在此全文引入作为参考，和PCT专利申请WO 00/70023A1公开了所述引物)。在一个杂交的实施例中，来自宿主细胞的mRNA合成为cDNA，并且所述eDNA随后在与抗体特定引物的PCR反应中扩增(例如，美国专利号6,319,690公开 了所述杂交方法，该文献在此全文引入作为参考)。另外，可通过传统的cDNA克隆技术克隆所有组成成分(Sambrook and Russell，eds，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd Ed，vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)，而不需使用PCR。 

在本发明的一个实施例中，建立了人源的已公布抗体序列的数据库，其中抗体序列彼此比对。该数据库用于定义抗体序列的亚群，在CDR环的序列和规范折叠上显示高度类似性(如通过抗体结构分析所确定的)。对于每个亚群，推断共有序列，它表示该亚群的构件；因而共有序列的完整集合表示人抗体的完整的结构组成成分。 

随后通过，例如，全基因合成或利用合成的基因亚单位来构建这些人造基因。这些基因亚单位对应(多)肽水平的结构子元素。在DNA水平上，这些基因亚单位通过在每个子元素的起始和结束处的切割位点确定，这在载体系统中是唯一的。所有共有序列集合构件的基因如此构建，使得它们含有相应基因子序列的类似模式。最优选地，所述(多)肽是或者得自HuCAL共有基因：Vk1，Vk2，Vk3，Vk4，Vl1，Vl2，Vl3，VH1A，VH1B，VH2，VH3，VH4，VH5，VH6，Ck，Cl，CH1或所述HuCAL共有基因的任意组合。 

该DNA分子集合随后可用于创建抗体的“合成库”，优选Fv，二硫键连接的Fv，单链Fv(scFv)，Fab片段，或Fab′片段，可用作对抗新靶点抗原的特异性源。美国专利号6,300,064公开了制成包含多于10⁸个转化体的合成库的方法，该文献在此全文引入作为参考。 

在另一个实施例中，合成人抗体现已通过确定V基因元素的合成体制成。Winter(EP 0368 684 B1)提供了扩增(通过PCR)，克隆和表达抗体可变区基因的方法。由这些基因开始，能够通过随机化重链和/或轻链的CDR3来创建功能性抗体片段库。这个过程在功能上与在免疫系统中B-细胞发展期间出现的VJ和VDJ重组的自然过程是等同的。例如，人种系V_H基因片段的所有组成成分可以通过连接到5个随机氨基酸残基的合成“D片段”和J片段在体外重新排列，以创建8个残基的合成第三互补决定区(CDR)。美国专利号5,885,793公开了制备所述抗体库的方法，如创建含有10⁷个噬菌体克隆体的库，该文献在此全文引入作为参考。 

依据本发明这方面的抗体片段可以是可溶性分泌抗体片段或可作为 融合蛋白存在于细胞、孢子或病毒的表面上。因而，例如，抗体库可以是噬菌体展示库，其中抗体片段的一条链或多条链作为具有噬菌体蛋白的融合蛋白表达，其中包含融合蛋白的至少一个肽不需信号肽来表达。如果抗体片段由重链和轻链组成，优选两条链均不需信号肽来表达。在本发明的这方面，选择宿主株以适于表达抗体库，并且宿主株可以是诸如prlA4的突变株或可以是为另一个目的选定的株，例如具有高转化频率的菌株，其中突变体prl蛋白由质粒表达载体来表达。 

已经使用pIII和pVIII来展示肽和抗体库。已经使用在pIII上展示非免疫或“天然”抗体-噬菌体库，来分离多种靶抗原的人抗体。抗体可以scFv或Fab方式分离，scFv或一个Fab链融合在噬菌体蛋白的N端。在先前描述的所有情况中，信号肽融合在抗体链的N端，以便引导抗体-噬菌体融合蛋白的分泌。也已使用噬菌体外壳的其它蛋白来展示抗体链。使用pVII和pIX来分别展示抗体可变重链区(V_H)和可变轻链区(V_L)。根据scFv融合到pIX的N端，利用PelB信号肽进行分泌，也使用pIX展示技术来构建天然人抗体库(Gao等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci 99：12612)。由于噬菌体转导的高效率，噬菌体展示的抗体库可以很大，每个库具有超过10⁹个抗体分子或某时超过10¹⁰或甚至10¹¹个抗体的多样性。 

在一些实施例中，库可以是表位聚焦的人抗体库，如披露于申请日为2005年1月20日的美国专利申请序列号11/040,159，该文献在此全文引入作为参考。例如，所述库可包括多个编码多样种群的重链V片段的核酸，其中V片段不连接到CDR3。本发明还提供了包括编码多样种群的轻链V片段的核酸的库，其中V片段不连接到CDR3。一个或两个库的V片段可以是，例如人种系。表位聚焦的人抗体库的每个库的大小可在10³至10⁵个抗体的范围内。 

抗体库也可以是集中库，主要包括一个或多个亚类的VH或VL基因片段的构件。因而，例如在人中，有7个识别的VH亚类(VH1-VH7)和16个VL亚类(Vk1-Vk6和Vλ1-Vλ10)，并且集中库可被构建成包括一个或多个VH亚类的构件与Vk链或Vλ轻链的多样库的组合。另外，一个或多个VL亚类的集中库可以与重链的多样性库组合。另外，集中库可被构建成主要包括单个VL亚类和单个VH亚类的构件。当以依赖信号的方式表达时，VH3亚类的抗体片段通常在大肠杆菌中有效表达。其他VH亚类的抗体使用信号肽不能有效分泌。类似地，具有鼠科V区的抗体片段使用信号肽分泌较差。本发明允许改进表示不同亚类的分泌抗体并允许包括 鼠科V区的抗体库的有效分泌。 

在另一个实施例中，本发明提供了包括多个人抗体V区对的库，其中V区对包括：i)未选择的重链V区，包括来自参考抗体的人V片段和重链CDR3，和ii)未选择的轻链V区，包括来自参考抗体的人V片段和轻链CDR3。 

在其他实施例中，所述库是包括核酸编码人抗体V区对的库，其中VH和VLV片段各自连接到关注参考抗体的MEBSD。 

本发明的库还可包括核酸编码多个VH或VL区，其中VH或VL区包括来自一个VH或VL亚类的V片段，其中V区缺少D和/或J片段。在一个实施例中，VH区的V片段是种系和/或VL区的V片段是种系。 

本发明还提供了包括多个抗体V区对的库，其中一对包括：i)一个重链V区，包括来自参考抗体的重链CDR3的结合特异性决定子BSD连接多样性V片段；和ii)一个轻链V区，包括来自参考抗体的轻链CDR3的BSD连接多样性V片段，其中至少一个BSD包括少于参考抗体CDR3。 

多聚体蛋白 

需要适当装配多聚体蛋白的多肽亚基以形成稳定的复合物，来确保多聚体的生物学功能。本发明的一个实施例能够表达、分泌和装配选定的单体多肽，以进行细胞质外异源多聚体的有效产生。一个或多个多聚体蛋白的单体多肽利用本发明的方法可以不需信号序列而制得，而其他单体多肽在具有或不具有信号序列的情况下表达。可通过本发明制得的装配多聚体蛋白包括抗体，抗体片段或抗体相关多肽。 

核酸 

可用于本发明方法的核酸序列，即，那些编码本发明方法分泌的至少部分单个肽，多肽和蛋白的，或那些在本发明的库中表达或包括本发明的库的，可以是天然的、合成的或其组合。它们可以是mRNA，DNA或cDNA。在优选的实施例中，核酸编码抗体。 

重组DNA方法可用于创建不能通过酶消化得到的抗体片段。因而，本文所用的术语“抗体”还包括抗体片段，通过整个抗体的改性，或者利用重组DNA技术重新合成的那些(例如，单链Fv)或利用噬菌体展示库识别的那些(参见例 如，McCafferty等人，1990，Nature 348：552-554)。核酸编码本发明的多肽可利用重组基因领域的常规技术获得(参见例如，Sambrook and Russell，eds，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd Ed，vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press；和Ausubel，ed.，1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.New York)。 

通常，编码本发明多肽的核酸序列通过探针杂交由cDNA或基因组DNA库克隆获得，或利用具有寡核苷酸引物的扩增技术分离获得。扩增技术可用于从DNA或RNA扩增和分离序列(参见例如，Dieffenbach & Dveksler，1995，PCRPrimers：A Laboratory Manual)。另外，交迭寡核苷酸可通过合成制得，并连接以生成一个或多个域。编码成分域的核酸也可利用抗体作为探针从表达库中分离。 

在利用PCR获得编码本发明多肽的核酸的实施例中，核酸序列或子序列是PCR扩增的，利用含有一个限制性位点的正向引物和含有另一个限制性位点的反向引物。这会制得编码希望多肽和具有端限制性位点的核酸。该核酸随后可易于结合具有适当相应限制性位点的载体。如果希望的多肽是融合蛋白，域可以直接被连接或可通过连接体或其他蛋白序列分开。合适的PCR引物可由本领域技术人员利用GenBank或其他来源中的序列信息来确定。适当的限制性位点还可添加到通过位点导向诱变编码蛋白或蛋白子序列的核酸。含有本发明多肽编码序列的质粒通过适当的限制性核酸内切酶分裂并随后结合适当的载体用于根据标准方法进行扩增和/或表达。 

足以引导本领域技术人员通过体外扩增方法的技术的例子披露于Berger，Sambrook，and Ausubel，以及美国专利号4,683,202，该文献在此全文引入作为参考；Innis等人，eds，1990，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications，Academic Press Inc.San Diego，CA；Arnheim & Levinson，1990，C&EN 36-47，The Journal Of NIH Research 3：81-94；Kwoh等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173；Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1874；Lomell等人，1989，J.Clin.Chem.，35：1826；Landegren等人，1988，Science 241：1077-1080；Van Brunt，1990，Biotechnology 8：291-294；Wu and Wallace，1989，Gene 4：560；和Barringer等人，1990，Gene 89：117。 

在一些实施例中，希望改性本发明的多肽。本领域技术人员可认识到 生成给定核酸构造的变化的多种方式。所述公知的方法包括定点诱变，利用简并寡核苷酸的PCR扩增，暴露含有核酸的细胞于诱变剂或辐射，化学合成希望的寡核苷酸(例如，结合连接和/或克隆以生成大核酸)和其他公知的技术。参见，例如，Giliman and Smith，1979，Gene 8：81-97，Roberts等人，1987，Nature 328：731-734。 

在一些实施例中，改性编码本发明多肽的重组核酸，以获得优选的密码子，它增强选定有机体中核酸的翻译(例如，酵母优选的密码子被取代入译码核酸中用于在酵母中表达)。 

本发明的多核苷酸还包括多核苷酸，包括基本等同于本发明多核苷酸的核苷酸序列。根据本发明的多核苷酸可具有与本发明的多核苷酸至少大约80％，更通常至少大约90％，更通常至少大约95％的序列相同。本发明还提供了互补的多核苷酸，包括核苷酸序列具有与上述编码多肽的多核苷酸至少大约80％，更通常至少大约90％，并甚至更通常至少大约95％的序列相同。多核苷酸可以是DNA(基因组，cDNA，扩增的，或合成的)或RNA。获得所述多核苷酸的方法和算法是本领域技术人员公知的，并可包括，例如，确定常规分离希望序列相同的多核苷酸的杂交条件的方法。 

可用于本发明的核酸可以是天然多样性，合成多样性可以引入那些天然多样性构件，或者多样性可以是完全合成的。例如，合成多样性可以引入一个或多个抗体基因的CDR中。优选地，引入免疫球蛋白的CDR1和CDR2中。优选地，天然多样性在来自B细胞的本发明免疫球蛋白基因的CDR3区捕获。最优选地，本发明的核酸包括免疫球蛋白基因种群，其包括在CDR1和CDR2中的至少一个或更优选两个的合成多样性，和从B细胞捕获的CDR3的多样性。 

根据本发明编码蛋白类似物的核酸(即，其中一个或多个氨基酸被设计以不同于野生型多肽)可利用定位诱变或PCR扩增制得，其中引物具有希望的点突变。对于合适诱变技术的详细描述，参见Sambrook等人，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和/或Ausubel等人，editors，1994，Current Protocols in Molecular Biology，GreenPublishers Inc.和Wiley and Sons，N.Y.Chemical synthesis using methods described byEngels等人，1989，in Angew.Chem.Intl.Ed.，Volume 28，pages 716-734，也可用于制备所述核酸。 

″重组变异体″是指任何多肽，不同于天然存在的多肽，通过氨基酸插入、删除和取代，利用重组DNA技术创建。通过将具体多肽的序列与同源肽的序列进行比较，并使在高同源区进行的氨基酸序列变化数量最小化，可以找到确定哪些氨基酸残基可被替换、添加或删除，而不废除关注的活性，如酶或结合活性的指导。 

优选地，氨基酸″取代″是用另一具有类似结构和/或化学特性的氨基酸来取代一个氨基酸的结果，即，保守氨基酸替换。氨基酸取代可以在所涉残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性特性的相似性的基础上进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸，和蛋氨酸；中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺，和谷酰胺；正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸，和组氨酸；和，负电荷(酸性)氨基酸包括门冬氨酸和谷氨酸。 

″插入″或″删除″通常在大约1-5个氨基酸的范围内。允许的变化可通过利用重组DNA技术，并试验所获得重组变异体的活性，在多肽分子中系统地进行氨基酸的插入、删除或取代来进行实验确定。 

另外，当希望功能改变时，可以工程进行插入、删除或非保守变化，以产生变化的多肽或嵌合多肽。所述变化可以，例如，改变本发明多肽的一个或多个生物学功能或生化特性。例如，这种变化可改变多肽特性，如配基结合亲和力，链间亲和力，或简并/更新率。此外，可以选择所述变化，以便产生在选定表达的宿主细胞中更适于表达、按比例增加等的多肽。例如，半胱氨酸残基可被删除或用另一个氨基酸残基取代，以便消除二硫键。 

另外，编码这些相同或类似多肽的重组变异体可利用遗传密码的“冗余”来进行合成或选择。可以引入不同的密码子取代，如产生不同限制性位点的静态变化，来优化克隆到质粒或病毒载体或在具体的原核或真核系统中表达。多核苷酸序列中的突变可在多肽或添加到多肽以改性多肽任意部分特性的其它肽的域中反映，以改变特性，如配基结合亲和力，链间亲和力，或简并/更新率。 

本发明的核酸序列还涉及编码所述核酸变异体的序列。这些氨基酸序列变异体可通过本领域已知的方法通过将适当的核苷酸变化引入天然或变化的多核苷酸进行制备。氨基酸序列变异体的构造中有两种变化：突变的位置和突变的 性质。核酸的氨基酸序列变异体优选通过使多核苷酸突变来构建，以得到不是天然存在的氨基酸序列。这些氨基酸变化可以在不同于其他种类的核酸(可变位置)或高度保守的区域(恒定区)的位点进行。在所述位置的位点通常进行系列改性，例如，通过首先用保守选择取代(例如疏水性氨基酸改为不同的疏水性氨基酸)，并然后用更远的选择取代(例如疏水性氨基酸改为带电荷的氨基酸)，并然后在靶位点进行删除或插入。 

氨基酸序列删除一般在大约1-30个残基的范围内，优选约1-10个残基，并且通常是连续的。氨基酸插入包括氨基-和/或羧基端融合，长度在1-100或更多残基的范围内，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入一般在大约1-10个氨基残基的范围内，优选1-5个残基。末端插入的例子包括在不同宿主细胞中进行细胞内靶向所必需的异源信号序列。 

在优选的方法中，通过定位诱变来改变编码新型核酸的多核苷酸。这种方法利用编码希望氨基酸变异体的多核苷酸序列的寡核苷酸序列，以及变化的氨基酸两侧上的足够相邻核苷酸，以便在被改变位点的任一侧形成稳定的双螺旋。一般，定位诱变技术是本领域技术人员公知的，并且这种技术公开物，如Edelman等人，1983，DNA 2：183中有例示。用于在多核苷酸序列中产生定位变化的通用和有效的方法公开在Zoller and Smith，1982，Nucleic Acids Res.10：6487-6500。 

PCR还可用于创建新颖核酸的氨基酸序列变异体。当将少量模板DNA用作起始材料时，与模板DNA中相应区在序列上稍微不同的引物可产生希望的氨基酸变异体。PCR扩增导致DNA片段产物种群不同于在由引物指定位置上编码胶原的多核苷酸模板。DNA片段产物替换质粒中的相应区域，而这给予了希望的氨基酸变异体。 

另一种产生氨基酸变异体的方法是盒式诱变技术，披露于Wells等人，1985，Gene 34：315；而其它诱变技术是本领域技术人员公知的，例如，Sambrook等人，supra，和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人中的技术。 

由于遗传密码的固有简并性，其他编码基本相同或功能上等同氨基酸序列的DNA序列可用于本发明的实践中，用于这些新型核酸的克隆和表达。所述DNA序列包括那些能够在严苛条件下杂交适当新型核酸序列的序列。另外，编码与本发明多肽相同的氨基酸序列但由于遗传密码的简并性而具有非常不同的核酸 序列的核酸也落入本发明的范围内。 

宿主细胞

本发明的另一方面提供了原核宿主细胞，允许分泌抗体或抗原结合抗体片段或多聚体蛋白而不需信号肽。适用于本发明的菌株不具有一般增强的渗透性，但是选择性地分泌天然指定用于分泌的蛋白，包括本发明的抗体和抗体片段。在一个优选的实施例中，原核生物优选是格兰氏阴性细菌，并最优选是大肠杆菌细菌。 

已经描述了格兰氏阴性细菌分泌蛋白的多个途径，从细胞质到周质或通过内膜和外膜，传统上归结成4种不同的系统。III型和IV型系统一般用于直接转移细菌蛋白到相邻的真核宿主细胞。I型系统形成连接外膜和内膜的“通道”，以便由该途径输出的蛋白直接分泌到细胞外介质。II型分泌系统，也称为通用分泌途径或Sec途径，负责分泌大多数蛋白通过内膜进入周质。其他的分泌系统，同样利用特定N端信号肽来引导经由周质的蛋白分泌，是双精氨酸转运系统(TAT)途径。与分泌松散折叠蛋白至发生蛋白装配的周质的Sec系统不同，TAT途径用来分泌已经折叠的酶(回顾Berks等人，2005，Current Opinion 8：174-181)。 

II型分泌系统广泛用于从大肠杆菌中分泌重组蛋白。在本发明的一个实施例中，宿主细胞包括II型或Sec途径中的突变基因。将短N端信号序列添加到重组蛋白起到引导重组蛋白到该分泌途径，并且在分泌过程中除去信号肽的作用。途径用于表达诸如Fab片段的抗体片段，所述片段由利用该途径从细菌蛋白自然分泌的信号序列引导，包括OmpA，PelB和PhoA。抗体重链和轻链示出在周质中装配，以形成抗原结合Fab片段(例如，Skerra and Pluckthun，1991，Protein Eng.4：971-979)。 

Sec途径的易位机构是已经深入研究了的酶复合物，移位酶，由若干个内膜蛋白和连接的三磷酸腺苷酶(ATPase)组成，以提供易位的能量(参见Fekkes andDriessen，1999，Microbiology and Molecular Biology Reviews，63：161-173；van derWolk等人，1998，EMBO J.17：3631-3639)。该酶复合物的核心由膜包围的异源三聚体和外周同源二聚体三磷酸腺苷酶SecA组成，其中异源三聚体由SecY、SecE和SecG蛋白(SecYEG复合物)组成。SecD、SecF和YajC蛋白形成分离的异源三聚体复合物，它与SecYEG复合物相连接以形成完整移位酶。 

新合成的前体蛋白由伴侣蛋白SecB结合，所述伴侣蛋白以松散折叠的构造稳定前蛋白使其能够易位。SecB和信号序列将前蛋白定向到膜，并且两者均与SecA相连接，SecA与SecYEG复合物的SecY亚基高亲和力地结合。作为SecB-SecA相互作用的结果，前蛋白转移到SecA，它结合其信号序列及其成熟域。从膜释放SecB需要在SecA的两个ATP-结合位点中的一个上结合ATP。这时，前蛋白的信号序列和N端区的环存在于膜的周质面，允许通过引导肽酶切割信号序列。 

前蛋白的N端信号序列被认为是对初始靶向，SecA识别前蛋白非常重要的。异常信号序列不能有效被移位酶识别，导致移位的缺陷。 

I型分泌系统还用于引导从大肠杆菌分泌外源蛋白。在本发明的一个实施例中，宿主细胞包括I型分泌系统中的突变基因。由I型途径成分识别的分泌信号位于分泌蛋白的羧基端，并在大多数情况下，在分泌期间或分泌后分泌信号没有被劈开。经由I型分泌途径分泌的明显表征的大肠杆菌蛋白是α-溶血素。来自该蛋白的信号序列被用于引导多个外源蛋白的分泌，包括通过融合溶血素的C端区到scFv译码区的C端的scFv抗体片段(Fernandez and Lorenzo，2001，MoI.Microbiology 40：332-346)。在这里，C端溶血素信号肽保留在分泌的产物中。 

已知Sec系统成分中的若干个突变，其允许具有缺陷或缺少信号序列的正常分泌的大肠杆菌蛋白的有效分泌。所述蛋白定位(prl)突变已在Sec系统的多个成分中识别，包括例如，SecY(prlA)、SecE(prlG)、SecG(prlH)和SecA(prlD)(Bost and Belin，1997，J.Biol Chem.272：4087-93，该文献在此全文引入作为参考)。 

还发现prl突变可以在完全缺少信号肽的情况下使一些天然分泌的大肠杆菌蛋白进行分泌。因而缺少信号肽的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白和碱性磷酸酶被从prlA突变体中分泌(Derman等人，1993，EMBO J.12：879)。噬菌体蛋白LamB也可在没有信号序列的情况下在prlA突变体中分泌(Flower等人，1994，J Bacteriol176：18)。不过，先前没有示出外源蛋白如真核蛋白在没有信号序列的情况下从prl菌株分泌。Wong等人(1988，Gene 68：193)已经成功利用来自LamB或OmpF基因的信号序列获得从大肠杆菌分泌胰岛素类生长因子-1，并显示在载有prlA4突变体菌株中LamB-IGF-1和OmpF-IGF-的处理效率得到增强。还显示人CD4融合到OmpA，PhoA或OmpF信号肽，以在prlA突变体中有效表达(Rockenbach等人，1991，Appl Microbiol Biotechnol.35：32-7)。也已尝试在质粒载体上过表达SecY突变蛋白， 用于增强来自大肠杆菌人蛋白的表达。因而，prlA4突变体SecY蛋白的过表达与secE一起增加了人IL-6融合到OmpA信号肽的分泌(Perez-Perez等人，1994，BioTechnology 12：178)。 

PrlA菌株也用于改进利用pIII信号肽在丝状噬菌体fd表面上展示的肽的多样性(Peters等人，1994，J.Bacteriol.176：4296)，并表达牛胰岛素抑制因子为PhoA信号肽的噬菌体融合蛋白(US专利号5,223,409，该文献在此全文引入作为参考；Ladner等人)。因而，可以看出，prlA突变体蛋白可利于表达以依赖于信号肽方式表达的某些真核蛋白。 

当在大肠杆菌中重组表达而不需信号序列时，正常从细胞分泌出的蛋白通常形成不可溶性包涵体。例如，基因编码抗体重链和轻链或抗体片段已在大肠杆菌中不需信号序列进行表达，并且产生的蛋白通常在细胞内的包涵体中积聚为不可溶性产物(Boss等人，1984，Nucl.Acids Res 12：3791；Cabilly等人，1984 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3273)。所述蛋白不可用于传送通过细胞质膜并且不形成功能性蛋白。从包涵体重折叠抗体片段的方法披露于美国专利6,331,415和4,816,567。不过，所述产生抗体的方法并不有效，并获得较低产量的功能性抗体，以及不能用于库筛选的目的。 

在本发明的一个优选实施例中，原核宿主细胞在分泌器的一个或多个成分中含有prl突变，这允许在缺少编码信号肽的情况下分泌抗体。Prl突变体是突变，它允许分泌少信号的单体蛋白，并可包括影响SecY、SecA、SecE或SecG基因或另一基因活性的突变。Prl突变体还允许信号肽编码的蛋白以不依赖信号的方式进行分泌。本发明的一个实施例包括在具有prl突变的宿主株中分泌具有信号序列的抗体多肽，并装配抗体获得功能性多聚体蛋白。这是一个出乎意料的结果，因为分泌和链装配被认为是紧密协调的。另一个实施例包括在具有prl突变的宿主株中分泌缺少信号序列的多肽。优选地，prl突变包括在SecY(prlA)或SecE(prlG)中的突变。最优选地，prl突变体包括在SecY的一个或多个突变，例如prlA4突变体菌株(Emr and Bassford，1982，J.Biol Chem 257：5852-5860)。PrlA4等位基因包含secY基因中的两个错义突变，导致氨基酸取代F286Y和I408N。最优选地，prlA突变体包括至少一个I408N突变在SecY中。图1示出了PrlA4突变体SecY蛋白的序列。 

prl突变体可含有prl突变在宿主株的染色体中，如大肠杆菌的prlA4突 变体菌株。另外，prl突变体可通过突变体Sec基因的附加复制件的过表达得到，例如，通过在基于质粒的表达载体中表达。因而，比如，prl突变体可包括在质粒上表达的突变体SecY或SecE基因。所述质粒可利用组成型或诱导型启动子来构建，使得只在希望的时候诱导分泌多肽而不需信号序列。调节大肠杆菌中表达的方法是本领域技术人员公知的，并包括利用诱导型启动子诸如可由IPTG诱导的lac、trc或tac启动子，和阿拉伯糖诱导的启动子。突变体Sec基因可以是来自大肠杆菌或来自其他格兰氏阴性细菌的突变Sec基因。因而，例如，形成SecY的prlA4突变体可由大肠杆菌宿主细胞中的质粒表达，以便允许分泌Fab片段而不需信号肽表达。 

宿主细胞可以是诸如W3110的野生型大肠杆菌菌株或可以是大肠杆菌的其它菌株。合适的宿主株包括TOP10、DH5、DH5α、Origami和HB101。可选择宿主细胞，以提供影响外源蛋白折叠、装配和分泌的其它伴侣蛋白和基因中的突变。已经证实分子伴侣蛋白组合，如细菌DnaK和GroE系统，可以增加蛋白的再折叠，所述蛋白与伴侣素相互作用但未能适当折叠(Buchberger，A.，Schroder，H.，Hesterkamp，T.，Schonfeld，H.J.，和Bukau，B.，1996，J.Mol.Biol.261，328-233，Petit，M.A.，Bedale，W.，Osipiuk，J.，Lu，C.，Rajagopalan，M.，McInerney，P.，Goodman，M.F.，Echols，H.，1994，J.Biol.Chem.269，23824-23829)。DnaK还结合触发因子(Trigger Factor)来折叠新合成的蛋白。 

本发明的库实施例可以prl突变体菌株表达，以便允许分泌，用于筛选不同功能性测试的抗体片段。相同的载体也可在大肠杆菌的其它菌株表达，用于在细胞质内表达而无需再设计抗体分子。细胞内表达可用于有效产生抗体片段，例如，利用trxB gor突变体来获得氧化细胞质以允许二硫键结合。正确折叠并装配的Fab片段的高水平表达可在大肠杆菌的细胞质中获得，该大肠杆菌携带谷胱甘肽氧化还原酶(gor)和硫氧还蛋白还原酶(trxB)基因中的突变体(Venturi等人，2002，Mol Biol.315：1-8)。利用分子伴侣蛋白的协同表达，可进一步增强正确折叠抗体片段的表达和装配(Levy等人，2001Protein Expr Purif.23：338-47；Jurado等人，2002J.Mol Biol.28：320：1-10)。 

本发明的另一个实施例包括突变体在第二分泌途径，双精氨酸转运系统或TAT途径。预计所有依赖于tat的信号肽包括在本发明中。特定的例子包括但不限于phoD和lipA序列。 

本发明的另一个实施例包括在第三分泌途径的突变体，称作III型分泌系统。III型分泌机制存在于使人、动物和植物致病的多种格兰氏阴性菌(包括种类志贺氏菌、沙门氏菌、耶尔森氏菌、大肠杆菌、假单胞菌属、黄单胞菌属、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)和欧文氏菌属)。例如，耶尔森氏菌抗宿主蛋白的分泌中涉及不依赖于Sec的III型分泌途径。在沙门氏菌和志贺氏菌属种类中，涉及进入上皮细胞的过程。它还可包含在EPEC信号转导蛋白，铜绿假单胞菌毒素，和许多植物病原体的病毒性因子，以及如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和枯草杆菌的细菌的鞭毛装配中。 

这种分泌途径的特征可以包括通过使细菌与宿主细胞接触来激活分泌(Menard等人，1994，The secretion of the Shigella flexneri Ipa invasins is activatedby epithelial cells and controlled by IpaB and IpaD，EMBO J.，13：5293-5302；Watarai等人，1995，Contact of Shigella with host cells triggers release of Ipa invasins and is anessential function of invasiveness，EMBO J.，14：2461-2470；Zierler and Galan，1995，Contact with cultures epithelial cells stimulates secretion of Salmonella typhimuriuminvasion proteins InvJ，Infect.Immun.，63：4024-4028)；一些分泌的蛋白被传递到宿主细胞的细胞质(Rosqvist等人，1994，Target cell contact triggers expression andpolarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells，EMBO J.，13：964-972；Sory and Cornelis，1994，Translocation of an hybridYopE-adenylate-cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells，Mol.Microbiol.，14：583-594；Wood等人，1996，SopE，a secreted protein of Salmonella dublin，istranslocated into the target eukaryotic cell via a sip-dependent mechanism and promotesbacterial entry，Mol.Microbiol.，22：327-338；Collazo and Galan，1997，Theinvasion-associated type III system of Salmonella typhimurium directs the translocationof Sip proteins into the host cell，Mol.Microbiol，24：747-756)；和编码分泌蛋白的基因的转录由调节蛋白的分泌控制(Hughes等人，1993，Sensing structural intermediatesin bacterial flagellar assembly by export of a negative regulator，Science，262：1277-1280；Pettersson等人，1996，Modulation ofvirulence factor expression bypathogen target cell contact，Science，273：1231-1233)。 

在本发明该方面的另一个实施例中，可以选择宿主株，用于其他突变影响分泌。为了这个目的，在宿主细胞中表达分泌的可选标记蛋白而不需信号肽， 并且选择突变体，它允许标记蛋白的分泌。宿主株可用诱变剂处理，以增加突变数量，或可以使用其他方法以引入突变，如转位子突变形成技术。合适的标记蛋白是β-内酰胺酶，它对β-内酰胺抗生素如氨比西林有抗性。β-内酰胺酶不需信号肽表达，并且选定抗氨比西林的突变体。筛选这些突变体，用于在缺少信号肽的情况下分泌其他蛋白如抗体片段的能力，以便识别prl突变。通过这种方法，不需信号序列允许分泌的突变可被引入任意希望的大肠杆菌菌株中，如野生型W3110菌株或具有高转化频率的菌株或在其他侣伴蛋白具有突变的菌株。 

本发明的一些实施例使用单独或多个蛋白酶缺陷的突变体宿主。不同的蛋白会或多或少对通常由微生物产生的不同蛋白酶敏感。可使用蛋白酶有缺陷的菌株，如ompT和degP，蛋白酶III，La蛋白酶，ClpYQ，ClpXP和ClpAP。 

本发明会通过下述实验细节更好地得以理解。不过，本领域技术人员会意识到，这里讨论的特定方法和结果仅仅是对所附权利要求书更全面描述本发明的例证。 

示例 

示例1：无信号肽的人抗PcrV Fab片段的表达和分泌 

人抗体1A8的Fab片段可在无信号肽的情况下由大肠杆菌突变体prlA4表达和分泌。Fab 1A8是工程人抗体片段，它特定结合到铜绿假单胞菌的PcrV蛋白上的表位，具有高亲合力。它竞争结合相同表位确定的小鼠抗体Mab166(Frank等人，2002，J Infect Dis.186：64-73)。1A8的轻链由Vk1-kappa轻链组成，而Fd链是VH3亚类V区融合到IgG1 CH1域。 

表达Fab1A8的少信号表达载体如下所述由pGEX-4T-1(GE Healthcare)得到。pGEX-4T-1中的氨比西林抗性基因通过AatII和A1wNI的水解删除，并用氯霉素抗性基因取代，所述氯霉素抗性基因通过PCR扩增由质粒pACYCDuet(Novagen)获得，以形成pGEX-CAT。在位置256处T-A的点突变通过PCR诱变产生，以正好在pTac启动子的翻译起始密码子下游前的pGEX-CAT上引入唯一的Bst1107I限制性位点。 

pGEX-CAT的pTac启动子用来表达轻链，该轻链通过PCR利用下述引物在Bst1 107I和EcoRI位点之间克隆，以获得载体KB-L。T7终止子序列在EcoRI位点前结合入引物2。 

引物1：GGAAACAGTATACATGGACATCCAGTTGACCCAGTC(SEQ IDNO：4) 

引物2：GCCAGTGAATTCAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAATCGATTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC(SEQ ID NO：5) 

该引物对扩增了1A8的成熟轻链编码序列并添加翻译-起始密码子和上游序列，以便在Shine-Dalgarno核糖体结合序列(AGGA(SEQ ID NO：6))和9核苷酸的起始密码子之间提供适当距离。预测的轻链N端氨基酸序列(在单字母氨基酸代码中)是： 

MDIQLTQ(SEQ ID NO：7) 

Fab 1A8的重链(Fd链)类似地通过PCR，利用引物3和4进行克隆，并引入在pGEX-CAT的Bst1 107I和NotI位点之间，以获得载体KB-H。 

引物3：GGAAACAGTATACATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC(SEQ IDNO：8) 

引物4：CACGATGCGGCCGCTTAACAAGATTTGGGCTCAACTTTC(SEQID NO：9) 

该引物对扩增了成熟Fd链编码序列并添加了翻译-起始密码子和序列，以提供9个核苷酸的Shine-Dalgarno-ATG距离。预测的重链N端氨基酸序列是： 

MEVQLVE(SEQ ID NO：10) 

KB-H的pTac表达盒随后通过PCR利用引物4和5扩增，并克隆入KB-L，在EcoRI和NotI位点之间，以获得载体KB-LH。 

引物5：CGATGCGAATTCGACTCTAGCGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCG(SEQ ID NO：11) 

表达Fab 1A8的最终少信号表达载体通过将pUC19(Fermentas)的EcoRI和FspI片段(138核苷酸)克隆入EcoRI和AfeI位点之间的KB-LH，以在2个pTac表达盒之间提供间隔。质粒KB5246的图谱在图2示出。 

大肠杆菌株SE6004，包含prlA4突变体(Emr等人，1982，J.Biol.Chem257：5852；Wong等人，1988，Gene 68：193)，可从Netherlands Culture Collection ofBacteria(NCCB目录号2976)获得。 

质粒KB5246通过电穿孔引入SE6004。电感受态细胞利用标准技术制 备，如Short Protocols in Molecular Biology(第三版)，Ausubel等人，(John Wiley andSons Inc)中所述。使用Biorad大肠杆菌脉冲源电穿孔设备，根据制造商的说明用1.8kV脉冲和5ms时间常数来实施电穿孔。电穿孔试管从BTX获得。在34μg/ml氯霉素上选定的转化株在2xYT介质中培养，并利用浓度高达1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导FablA8重链和轻链的表达。诱导实施3小时，用于分析周质中的Fab表达，或者培养16小时，用于分析释放到介质的Fab。 

为了分析Fab分泌通过细胞质膜进入周质，将细胞按如下进行分级。1升培养基中的细菌细胞团再悬浮在10ml的TES缓冲液中(0.2M Tris pH 8.0，17.12％蔗糖和0.5mM EDTA)并在4℃下培养15分钟。在加入1/4比例的12.5ml的TES/H₂O后，细胞混合物在4℃下再培养15分钟。细胞通过离心法以7000rpm在Sorvallbench-top离心机经15分钟制成球团，并保留上清液。随后将球团再悬浮在补充有15mM Mg₂SO₄的10ml TES中，并在4℃下培养10分钟，随后以7000rpm重制成球团，并保留上清液。 

10μl的周质提取物在非还原条件下继续SDS-PAGE凝胶，转移到PVDF膜，并利用与辣根过氧化物酶(Zymed labs)络合的抗人Kappa特定抗体进行蛋白印迹检测。过氧化物酶底物ECL plus(GE Healthcare)被用来产生发光信号，它随后在射线照相胶片上被检测到，以检测Fab分泌。图3示出了代表性的蛋白印迹法，显示在周质中检测到的装配1A8Fab的分泌。还可检测到少量较低分子量的免疫球蛋白相关蛋白。这些谱带与轻链二聚物和单体轻链的分泌一致，如同通常在其它依赖于信号的分泌系统中从大肠杆菌分泌Fab片段所发现的。 

利用特定基于抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析Fab1A8分泌进入周质或进入介质的抗原结合活性。为了这个目的，如前所述使用重组PcrV抗原，在具有氨基端谷胱甘肽S-转移酶(GST)纯化标签的框内克隆成融合蛋白(Frank等人，2002，J.Infectious Diseases 186：64-73)。PcrV编码序列在表达载体pGEX 2TK(GE Healthcare)中克隆，以产生GST-PcrV融合蛋白。 

为了制备用于ELISA以便检测功能性抗PcrV Fabs的抗原，如下所述，GST-PcrV融合蛋白由通过pGEX 2TK-PcrV转化并纯化的大肠杆菌(BL21)表达。在用0.5mM IPTG诱导蛋白表达并进一步3小时生长前，表达GST-PcrV的多批4升液体培养基的大肠杆菌在2xYT介质中生长，至在600nm光学密度为0.6。细菌细胞通过 离心成球状并细胞溶解在按生产商说明书稀释的加有1U/ml rLysozyme(Novagen)的Bug Buster(Novagen)和蛋白酶抑制子鸡尾酒(Sigma-Aldrich)的溶液中。在通过离心和过滤清除溶解产物后，它回流谷胱甘肽琼脂糖柱(GSTrap FF，GEHealthcare)，清洗并且纯GST-PcrV在10mM谷胱甘肽中洗脱。抗原被脱盐回到PBS。 

用于检测周质部分或介质样品中抗PcrV Fab的抗原结合ELISA的实施如下所述。ELISA板(Costar EIA/RIA)涂覆有溶于PBS的100ng/well GST-PcrV(见上)，通过在4℃下培养16小时，并用溶于PBS 0.1％Tween20(PBST)的5％脱脂奶粉溶液阻断1小时。周质部分样品作2倍系列稀释，并在33℃下应用于ELISA板1小时。在用PBST清洗后，通过在PBST稀释1/1000的山羊抗人k-HRP络合物(US Biological)来检测结合抗原的抗体片段。利用过氧化物酶底物四甲基联苯胺(TMB)(100μl/well)来展示抗体结合，并且反应通过加入100ul 2N H₂SO₄停止，并由标准板读取器读取。 

抗原结合ELISA确认了在周质中存在功能性Fab 1A8(参见图4)并释放了含有质粒KB5246的转化体到SE6004介质。图4显示分泌相当量能够结合到PcrV的Fab片段，与Fab片段的标准制备相比，所述标准制备是以依赖于信号的方式在细胞周质表达Fab 1A8(图4中的制备1150)。 

因而，从prlA4突变体大肠杆菌分泌Fab 1A8的重链和轻链，而不需任一链上的信号肽。两条链装配以形成Fab片段，它可在周质中检测到并释放进入培养基作为功能性抗原结合分子。 

示例2：通过菌落转移结合试验法(CLBA)检测抗原结合Fab 

在质粒KB5246中克隆并转化成SE6004的抗体Fab片段库用板固定在含有适当抗生素(34μg/ml的氯霉素)的2YT琼脂上(Becton，Dickinson Difco^TM 2xYT酵母提取胰胨介质)。调节平板效率，使得所得到的细菌菌落分离但具有足够密度以使平板面积最大化。根据要被筛选的克隆菌落数量使用不同尺寸的平板。因而，在最佳密度，10cm直径的板上含有4000个菌落，15cm直径的板上含有10000个菌落，而25cm的正方形板上含有50,000个菌落。 

直径8.2cm、13.2cm或20cm正方形的硝基纤维素滤膜(Schleicher &Schuell BA85)预先涂覆有靠经验确定浓度溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)的抗原(通常在0.5和20μg/ml之间)。涂覆溶液的体积取决于滤膜的尺寸。对于上述列举的不 同滤膜尺寸可使用4ml、8ml或20ml。滤膜面向下放置在抗原池中，利用毛细管作用均匀分布抗原。滤膜在33℃下进行涂覆2-3小时，并不时搅动。随后，用余量PBS一次冲洗滤膜，并在25℃下用5％的脱脂奶粉的PBS溶液阻断另外2小时，带搅动。随后排干滤膜，并用加有0.1％Tween 20(PBST)的PBS冲洗一次，和用加有抗生素选择(34μg/ml氯霉素)和转录诱导剂的余量2YT液体介质冲洗两次。可对每个库优化IPTG浓度，但通常是在0.01-0.1mM的范围中。在使滤膜排干后，它们被放置在加有相同浓度的抗生素和诱导剂的2YT-琼脂板(表达板)上。 

未涂覆、干的硝基纤维素膜面朝下放置在含有抗体片段库的菌落板上。一旦可见滤膜变湿(～20秒)并一个动作，滤膜被举起并将菌落侧向上放置在已在表达板上的涂覆滤膜上。用无菌针以对位的模式来穿刺滤膜。 

中间夹有硝基纤维素滤膜的表达板在33℃下放置12-16小时。在这期间，抗体片段分泌并扩散通过第一硝基纤维素膜到第二涂有抗原的膜。如果来自给定细菌菌落的抗体片段具有抗原结合活性，它保留在抗原滤膜上并随后被检测到。 

在12-16个小时的表达周期后，菌落滤膜从表达板除去，并在4℃下存储在具有抗生素选择但没有转录诱导剂的2YT-琼脂板上。 

除去涂有抗原的滤膜，并在余量PBST清洗3次(5分钟的清洗)，随后在25℃下用5％的脱脂奶粉PBST溶液阻断1.5小时。保留在抗原滤膜上的抗体片段随后通过首先与下述一种可选的主要抗体一起培养来检测：用山羊抗人k-HRP络合物(US Biological)来显示结合。在4次10分钟的清洗后，滤膜在过氧化物酶底物溶液(ECL plus，GE Healthcare)中培养，并用于暴露光敏照相胶片。另外，可使用与荧光标记络合的抗体。在这里，平台式激发扫描仪诸如Typhoon(GE Healthcare)、FX-Pro(Biorad)或Odyssey(Licor)可用来使阳性点可视化。 

使用光盒作为背景照明，照相胶片或数字图像上的点图案与菌落滤膜对准(对于这个步骤，滤膜可从2YT-琼脂板移开，并置于透明塑胶上)。识别的阳性菌落被挑选并用于注入2YT液体微培养基。来自主筛网的细菌随后以较低密度重新用板固定，并被挑选用于随后的分析，以确保克隆种群扩展。 

示例3：利用CLBA无需信号肽检测从prlA4细胞分泌出的抗PcrV Fab 

对于不用信号肽在质粒KB5246表达的Fab片段，转化的细胞被装载在 含有氯霉素(34μg/ml)和10μM IPTG的2YT表达板上。诱导细胞16小时，并且检测到结合到GST-PcrV在涂覆有抗原的滤膜上的抗体片段，如示例2所述，利用山羊抗人k抗体-辣根过氧化物酶络合物在PBST稀释1/5000(US Biological)。在4次15分钟的清洗后，并应用ECL Plus(GE Healthcare)，滤膜被用来曝光放射自显影胶片(来自GE Healthcare的Hyperfilm)。 

质粒KB5246，表达FablA8，转移进入SE6004细胞，该细胞具有突变体SecY基因(含有prlA4突变)，和进入TOP10细胞，该细胞含有野生型SecY基因。分泌Fab1A8的阳性菌落在只来自SE6004转化体的PcrV抗原-CLBA中检测到；TOP10转化体不分泌可检测到量的Fab1A8。这个结果表示prlA4突变体菌株能够分泌Fab片段，而不需重链或轻链上的信号肽。重链和轻链装配并能够形成完整功能性Fab片段，该片段能够结合涂覆在硝基纤维素滤膜上的同源抗原。 

示例4：筛选不需信号肽分泌的Fab的特定抗原的结合子 

第二种人Fab FB42-8，特定用于人细胞因子，通过将适当的V区序列克隆到KB5246来代替Fab1A8 V区在SE6004上表达而不用信号肽。表达所述两种Fab(FB42-8和Fab1A8)的细胞以50/50的比例进行混合，并装载在2xYT琼脂上。如示例2所述，执行CLBA，涂覆的抗原为PCRV或对FB42-8特定的细胞因子抗原。复制CLBA，检测和定位显示可以从两种转化体的混合物中挑选特定用于每个抗原的Fab。 

可以用相同方式为特定抗原的结合子筛选多样Fab库。 

实施例5：无信号肽的Fab的分泌效率 

Fab克隆到具有细菌分泌前导肽(KB1150)的通常细菌表达质粒中或到KB5246中来取代Fab 1A8编码序列。比较这两种结构在不同IPTG诱导条件下的表达和分泌效率。培养生长直到在600nmOD为0.6，并随后进行诱导。继续生长16小时。通过抗k-HRP多克隆，如示例1所述的蛋白印迹法检测分泌进入培养基的Fab(参见图5)。 

已知含有鼠科V区的Fab难以在细菌中表达高产量。在这个实验中，与在野生型TOP10菌株中带信号肽表达相比，在无信号肽的情况下Fab更有效地从SE6004分泌。确实，利用信号肽做媒介的分泌在TOP10F’细胞中不能检测到Fab分泌。因而，在大肠杆菌中表达较差的Fab和其他抗体可通过在缺少信号肽的情况下从适当的突变体菌株如prlA4突变体SE6004分泌而方便地产生。示例6：构造prlA4突变体SecY基因的表达载体 

如下述构造表达载体p15A，用于在强细菌启动子、trc启动子的控制下在细菌细胞中表达基因。 

质粒pACYC177(Fermentas)通过BanI水解并通过StuI部分水解。随后利用DNA聚合酶I的Klenow片段使2386bp DNA片段的末端钝化。pTrc启动子从质粒p6xHis-GFP(Clontech)进行PCR扩增，通过下述引物：引物1：TCTTCCAGGCCTGAGCTCGAGCTGTTGACAATTAATCA(SEQ IDNO：12)引物2：CAGTTACAGGCCTGGTACCTCACCGGCCGTTAAACCCCCCATGGTTTATTCC(SEQ ID NO：13)然后用StuI水解PCR产物，并与pACYC177的2386DNA片段结合，以得到载体pl5A，它在pTrc启动子之后具有NcoI和KpnI位点。 

通过PCR扩增利用下述引物从SE6004细胞克隆prlA4突变体SecY基因：引物3：ACGGAATTCACCATGGCTAAACAACCGGGATTAGATTTTC(SEQ IDNO：14)引物4：CAGTTACGGTACCTTATCGGCCGTAGCCTTTCAGGTTC(SEQ IDNO：15) 

随后用NcoI和KpnI水解PCR产物，并克隆入相同两个位点之间的载体pl5A，以得到KB5282，它在细菌trc启动子的控制下表达突变体SecY基因(pTrc；参见图6)。具有KB5282的大肠杆菌的转化使宿主细胞具有prlA表型，并允许经由外源蛋白，如抗体的周质，从不编码信号肽的编码序列进行分泌。 

通过电穿孔用质粒KB5282来转化电感受态DH5-α细胞，并利用2xYT介质中35μg/ml卡那霉素来选择转化体。 

评估在过表达突变体SecY存在的情况下DH5α细胞中Fab1A8的表达。通过电穿孔用质粒KB5246(不带信号序列表达Fab)和KB5282(表达突变体SecY)来协同转化DH5α细胞。在氯霉素和卡那霉素上选定的转化体在2xYT介质中培养， 并利用浓度为20μM或200μM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导Fab1A8的重链和轻链的表达。在33℃下摇动，表达持续16小时。通过突变体SecY的协同转化从DH5α细胞表达和分泌的完整Fab片段的水平，与如示例1所述利用相同浓度的IPTG从prlA4菌株SE6004的Fab表达相比较。利用特定用于人k链的检测抗体的蛋白印迹法在非还原条件下在SDS-PAGE上的表达介质上进行(图7)。在表达突变体SecY的DH5α细胞的介质中检测到高水平的分泌Fab。确实，与SE6004细胞比较，当利用20μM IPTG诱导时这些细胞分泌更高水平的Fab。与此相反，当KB5246转化为TOP10F′细胞，表达野生型SecY的菌株时，没有观察到可检测的Fab分泌(见图7)。示例7：在prl突变体大肠杆菌株中具有信号序列的抗体片段的表达 

编码抗体多肽包括信号肽的表达载体还可如下在prl突变体大肠杆菌菌株中表达。信号肽被引入重链编码序列、轻链编码序列或两者的N端，以便从prl突变体菌株分泌装配的或功能性的Fab或Fab′片段。 

为了产生便利的prl突变体菌株用于表达含有信号肽的抗体片段，利用质粒KB5282(示例6)来转化DH5-α细胞。对卡那霉素有抗性的转化体具有prlA显型并可以分泌缺少信号肽的Fab片段，如示例6所述。在这里，通过电穿孔随后转化KB5282 DH5-α转化体，具有表达载体表达抗体重链和轻链，其中一条链或两条链用信号肽表达。根据标准技术如Short Protocols in Molecular Biology(第三版)，Ausubel等人(John Wiley and Sons Inc.)中所述制备电感受态细胞，并且进行电穿孔如示例1所述。 

如以上示例1、2和3所述，可以识别功能性Fab或Fab′片段，并可以从周质部分或培养基分离功能性Fab或Fab′片段。 

序列表

<110>KaloBios Pharmaceuticals，Inc.

     Yarranton，Geoffrey T.

     Bebbington，Christopher R.

<120>无需信号肽从细菌分泌抗体

<130>073678-0025

<150>US 60/701,902

<151>2005-07-22

<150>US 11/273,906

<151>2005-11-14

<160>15

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>443

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>1

Met Ala Lys Gln Pro Gly Leu Asp Phe Gln Ser Ala Lys Gly Gly Leu

 1               5                  10                  15

Gly Glu Leu Lys Arg Arg Leu Leu Phe Val Ile Gly Ala Leu Ile Val

            20                  25                  30

Phe Arg Ile Gly Ser Phe Ile Pro Ile Pro Gly Ile Asp Ala Ala Val

        35                  40                  45

Leu Ala Lys Leu Leu Glu Gln Gln Arg Gly Thr Ile Ile Glu Met Phe

    50                  55                  60

Asn Met Phe Ser Gly Gly Ala Leu Ser Arg Ala Ser Ile Phe Ala Leu

65                  70                  75                  80

Gly Ile Met Pro Tyr Ile Ser Ala Ser Ile Ile Ile Gln Leu Leu Thr

                85                  90                  95

Val Val His Pro Thr Leu Ala Glu Ile Lys Lys Glu Gly Glu Ser Gly

            100                 105                 110

Arg Arg Lys Ile Ser Gln Tyr Thr Arg Tyr Gly Thr LGu Val Leu Ala

        115                 120                 125

Ile Phe Gln Ser Ile Gly Ile Ala Thr Gly Leu Pro Asn Met Pro Gly

    130                 135                 140

Met Gln Gly Leu Val Ile Asn Pro Gly Phe Ala Phe Tyr Phe Thr Ala

145                 150                 155                 160

Val Val Ser Leu Val Thr Gly Thr Met Phe Leu Met Trp Leu Gly Glu

                165                 170                 175

Gln Ile Thr Glu Arg Gly Ile Gly Asn Gly Ile Ser Ile Ile Ile Phe

            180                 185                 190

Ala Gly Ile Val Ala Gly Leu Pro Pro Ala Ile Ala His Thr Ile Glu

        l95                 200                 205

Gln Ala Arg Gln Gly Asp Leu His Phe Leu Val Leu Leu Leu Val Ala

    210                 215                 220

Val Leu Val Phe Ala Val Thr Phe Phe Val Val Phe Val Glu Arg Gly

225                 230                 235                 240

Gln Arg Arg Ile Val Val Asn Tyr Ala Lys Arg Gln Gln Gly Arg Arg

                245                 250                 255

Val Tyr Ala Ala Gln Ser Thr His Leu Pro Leu Lys Val Asn Met Ala

           260                 265                 270

Gly Val Ile Pro Ala Ile Phe Ala Ser Ser Ile Ile Leu Tyr Pro Ala

        275                 280                 285

Thr Ile Ala Ser Trp Phe Gly Gly Gly Thr Gly Trp Asn Trp Leu Thr

    290                 295                 300

Thr Ile Ser Leu Tyr Leu Gln Pro Gly Gln Pro Leu Tyr Val Leu Leu

305                 310                 315                 320

Tyr Ala Ser Ala Ile Ile Phe Phe Cys Phe Phe Tyr Thr Ala Leu Val

                325                 330                 335

Phe Asn Pro Arg Glu Thr Ala Asp Asn Leu Lys Lys Ser Gly Ala Phe

            340                 345                 350

Val Pro Gly Ile Arg Pro Gly Glu Gln Thr Ala Lys Tyr Ile Asp Lys

        355                 360                 365

Val Met Thr Arg Leu Thr Leu Val Gly Ala Leu Tyr Ile Thr Phe Ile

    370                 375                 380

Cys Leu Ile Pro Glu Phe Met Arg Asp Ala Met Lys Val Pro Phe Tyr

385                 390                 395                 400

Phe Gly Gly Thr Ser Leu Leu Asn Val Val Val Val Ile Met Asp Phe

                405                 410                 415

Met Ala Gln Val Gln Thr Leu Met Met Ser Ser Gln Tyr Glu Ser Ala

            420                 425                 430

Leu Lys Lys Ala Asn Leu Lys Gly Tyr Gly Arg

        435                 440

<210>2

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>2

Ile Pro Thr Gly

 1

<210>3

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>3

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp AspLys

 1               5

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>4

ggaaacagta tacatggaca tccagttgac ccagtc        36

<210>5

<211>90

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>5

gccagtgaat tcaaacccct caagacccgtttagaggccc caaggggtta tgctagttaa    60

tcgatttaac actctcccct gttgaagctc                                    90

<210>6

<211>4

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>6

agga                                                                4

<210>7

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>7

Met AspIle Gln Leu Thr Gln

 1              5

<210>8

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>8

ggaaacagta tacatggagg tgcagctggt ggagtc                             36

<210>9

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>9

cacgatgcgg ccgcttaaca agatttgggc tcaactttc                          39

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>化学合成

<400>10

Met Glu Val Gln Leu Val Glu

 1               5

<210>11

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>11

cgatgcgaat tcgactctag cgctgtggta tggctgtgca ggtcg             45

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>12

tcttccaggc ctgagctcga gctgttgaca attaatca                     38

<210>13

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>13

cagttacagg cctggtacct caccggccgttaaacccccc atggtttatt cc      52

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>14

acggaattca ccatggctaa acaaccggga ttagattttc                   40

<210>15

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸

<400>15

cagttacggt accttatcgg ccgtagcctt tcaggttc                     38

Claims (33)

1.一种制备抗体的方法，包括以下步骤：

(a)在表达多核苷酸编码重链多肽和多核苷酸分子编码抗体的轻链多肽的条件下，培养含有prlA4突变和至少一个表达载体的大肠杆菌宿主细胞，所述表达载体包括编码抗体的重链多肽的多核苷酸分子和编码抗体的轻链多肽的多核苷酸分子，其中至少一个多核苷酸编码缺少信号肽的多肽，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，

(b)分泌重链多肽和轻链多肽穿过细胞质膜，和

(c)由重链多肽和轻链多肽形成抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体选自：人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔子抗体、骆驼抗体、绵羊抗体、嵌合抗体、人源化抗体和表位聚焦的抗体。

3.根据权利要求1所述的方法，其中编码重链多肽和轻链多肽的多核苷酸存在于多个不同的载体。

4.根据权利要求1所述的方法，其中编码重链多肽和轻链多肽的多核苷酸存在于相同的载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其中多核苷酸编码缺少信号肽的重链多肽。

6.根据权利要求1所述的方法，其中多核苷酸编码缺少信号肽的轻链多肽。

7.根据权利要求1所述的方法，其中多核苷酸编码缺少信号肽的重链和轻链多肽。

8.根据权利要求1所述的方法，其中大肠杆菌宿主细胞包括Sec途径中的突变基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中突变基因包括SecY基因中的突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中宿主细胞包括一SecY基因编码具有实质野生型功能的蛋白和一prlA4突变编码实质缺少野生型功能的蛋白。

11.根据权利要求9所述的方法，其中SecY基因中的突变体携带在载体上。

12.一种制备抗体的方法，包括以下步骤：

(a)在表达多核苷酸编码抗体的条件下，培养含有prlA4突变和表达载体的大肠杆菌宿主细胞，所述表达载体包括多核苷酸分子编码抗体，其中多核苷酸编码缺少信号肽的多肽，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，和

(b)分泌抗体穿过细胞质膜。

13.根据权利要求12所述的方法，其中大肠杆菌宿主细胞包括Sec途径中的突变基因。

14.根据权利要求13所述的方法，其中突变基因携带在载体上。

15.根据权利要求14所述的方法，其中抗体选自：单链抗体、dAB、VHH、camelid抗体和纳米体。

16.一种制备融合抗体的方法，包括以下步骤：

(a)在表达载体表达一个或多个多核苷酸编码融合抗体的条件下，培养含有prlA4突变和至少一个表达载体的大肠杆菌宿主细胞，所述表达载体包括一个或多个编码融合抗体的多核苷酸分子，其中至少一个多核苷酸编码缺少信号肽的多肽，并且其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQID NO：1所示；

(b)转运一个或多个多肽穿过细胞质膜，和

(c)形成融合抗体，其中所述融合抗体能够结合抗原。

17.根据权利要求16所述的方法，其中大肠杆菌细胞包括Sec途径中的突变基因。

18.根据权利要求16所述的方法，其中融合抗体在噬菌体的表面上展示为融合蛋白。

19.一种制备表达库的方法，包括以下步骤：

(a)在表达多个多核苷酸从多个宿主细胞的多个表达载体编码抗体的条件下，培养多个大肠杆菌宿主细胞，每个所述大肠杆菌宿主细胞含有prlA4突变和多个表达载体中的至少一个，其中每个表达载体编码多个多核苷酸中的一个，所述多核苷酸编码多个抗体中的一个，其中每个宿主细胞中的一个或多个所述多核苷酸编码缺少信号肽的多肽，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，

(b)转运多个多肽穿过多个宿主细胞的细胞质膜，和

(c)形成多个抗体，其中所述多个抗体中的至少一个能够结合抗原。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述多核苷酸编码多个表位聚焦的人抗体。

21.根据权利要求20所述的方法，其中多核苷酸编码缺少信号肽的所有重链或所有轻链多肽。

22.根据权利要求19所述的方法，其中表达库是小鼠、大鼠、绵羊或兔子表达库。

23.一种含有prlA4突变和由权利要求19制得的表达库的成员的大肠杆菌宿主细胞。

24.一种制备抗体的方法，包括以下步骤：

(a)在表达一个或多个多核苷酸编码抗体的条件下，培养含有prlA4突变和至少一个表达载体的大肠杆菌宿主细胞，所述表达载体包括一个或多个多核苷酸分子编码抗体，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，

(b)以不依赖于信号的方式转运一个或多个多肽穿过细胞质膜，和

(c)形成抗体，其中所述抗体能够结合抗原。

25.根据权利要求24所述的方法，还包括分离抗体的步骤。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗体是融合抗体，并且还包括分离融合抗体的步骤。

27.一种表达库，包括多个多核苷酸编码多个抗体，其中多个多核苷酸中的一个或多个编码缺少信号肽的多肽，并且其中当在含有prlA4突变体的大肠杆菌宿主细胞中表达时多肽能够被分泌，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

28.一种格兰氏阴性菌原核宿主细胞，包含prlA4突变，它分泌至少一个多肽穿过其细胞质膜，其中多肽形成抗体，其中抗体能够结合抗原，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

29.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括SecY基因编码具有实质野生型功能的蛋白，并且包括prlA4突变编码实质缺少野生型功能的蛋白。

30.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包括突变prlA4基因携带在载体上。

31.一种表达载体，允许在包含prlA4突变的大肠杆菌宿主细胞中进行转录和翻译，其中一多核苷酸分子编码抗体的重链多肽而一多核苷酸分子编码抗体的轻链多肽，其中多核苷酸中的一个编码缺少信号肽的抗体多肽，而另一个多核苷酸编码具有信号肽的抗体多肽，其中所述prlA4突变是Sec Y基因的F286Y和I408N突变基因，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

32.根据权利要求31所述的表达载体，其中多核苷酸编码缺少信号序列的重链多肽。

33.根据权利要求31所述的表达载体，其中多核苷酸编码缺少信号序列的轻链多肽。

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