ES2243240T3 - Anticuerpos para la terapia y diagnostico del cancer. - Google Patents
Anticuerpos para la terapia y diagnostico del cancer.Info
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Abstract
Procedimiento ex vivo o in vitro para la producción de un anticuerpo que comprende las etapas siguientes: (a) unión de un anticuerpo expresado en un fago de una librería de fagos que expresan anticuerpos desnudos con una célula viva cancerosa; (b) selección de un fago que expresa un anticuerpo o de un anticuerpo que se une selectivamente con una célula cancerosa viva; y (c) identificación del antígeno al que se une el fago que expresa el anticuerpo o el anticuerpo.
Description
Anticuerpos para la terapia y diagnóstico del
cáncer.
La presente invención se refiere a un
procedimiento ex vivo o in vitro para obtener
anticuerpos que pueden, por ejemplo, ser usados en el diagnóstico o
la terapia del cáncer. Además, la invención proporciona un
procedimiento ex vivo o in vitro para identificar un
antígeno que se exprese de forma diferencial en la superficie
celular de poblaciones celulares distintas. La presente invención,
así mismo, proporciona anticuerpos humanos dirigidos contra el
factor acelerador de la desintegración (del inglés, decay
accelerating factor, DAF), así como composiciones terapéuticas que
contienen dichos anticuerpos. Además, la invención abarca los
posibles usos médicos de los anticuerpos dirigidos contra el DAF en
el tratamiento del cáncer de pulmón.
La eficacia antitumoral de los anticuerpos se ha
demostrado sobradamente en la clínica. Y últimamente, se ha puesto
en evidencia la utilidad y eficacia de los anticuerpos
quiméricos/humanizados "desnudos" (Riethmüller y col.,
Lancet 343: 1177-1183 (1994); Riethmüller y
col., J. Clin. Oncol. 16 1788-1794 (1988)
Maloney y col., Blood 90:2188-2195 (1997)
McLaughin y col., J. lin. Oncol. 16:
2825-2833 (1998) and Baselga y col., J. Clin.
Oncol. 14, 697-699 (1996) y de anticuerpos
murinos radioactivos (Press y col., Lancet 346:
336-340 (1995) Kaminski y col., N Engl J Med.
329: 459-465 (1993): Kaminski y col., J Clin
Oncol. 14:1974-1981 (1996)). Es más, un
anticuerpo anti-CD20 quimérico (Reft y col.,
Blood. 83:435-445 (1994)) y un anticuerpo
quimérico humanizado anti-HER2 (Carter y col.,
PNAS (USA) 89:4285-4289 (1992)) han sido
aprobados recientemente por la Administración de la Agencia Federal
del Medicamento de los Estados Unidos de América para el tratamiento
del linfoma de no Hodgkin y del cáncer de mama metastático,
respectivamente. Estos éxitos con anticuerpos antitumorales en
pacientes, ha propiciado un interés renovado en la identificación de
nuevos antígenos asociados a tumores que puedan resultar adecuados
para dirigir los anticuerpos a una diana concreta.
El enfoque tradicional para la obtención de
anticuerpos específicos antitumorales consiste en la inmunización
de ratones con células tumorales y la selección de los anticuerpos
monoclonales resultantes según su especificidad de unión.
Desgraciadamente, los anticuerpos antitumorales, obtenidos de esta
manera, presentan con frecuencia reactividad cruzada con muchas
células normales, y esto puede interferir con su posible utilidad
clínica. Idealmente, se debería seleccionar en lugar de realizar un
cribado de los anticuerpos que se unen selectivamente al tumor. La
aparición de nuevos procedimientos, como la expresión de fragmentos
de anticuerpos en la superficie de fagos (McCafferty y col.,
Nature, 348:552-554 (1990) y el desarrollo de
amplias (>10^{10} clones) librerías de fagos (Griffiths y
col., EMBO J. 13:3245-3260 (1994), Vayghan y
col. Nat Biotechnol. 14: 309-314 (1996)
ofrecen una vía potencial de producción de anticuerpos. Con el
cribado de anticuerpos, al contrario que la tecnología del
hibridoma, se facilita la obtención de anticuerpos que se unen a
antígenos altamente conservados entre el ratón y el hombre (Nissim
y col., EMBO J. 13:692-698 (1994)).
Las librerías de anticuerpos desnudos en fagos
han demostrado ser un procedimiento rápido y generalizable para la
identificación de la unión de anticuerpos con antígenos
purificados, (Griffiths y col., EMBO J. 13
3245-3280 (1994), Vaughan y col., Nat.
Biotechnol 14: 309-314 (1996) Nissim y col.,
EMBO J. 13: 692-698 (1994). En cambio,
realizar una selección de fagos que expresan anticuerpos con un
panel de dianas celulares es un procedimiento más complejo y
difícil, debido a una concentración menor del antígeno efectivo, a
una mayor complejidad antigénica y a la tendencia del fago a unirse
inespecíficamente a las células. A pesar de ello, ha sido posible
identificar algunos anticuerpos contra antígenos de la superficie
celular (Marks y col., Biol Technol.
11:1145-1149 (1992), Portolano y col., J.
Immunol. 151: 2839-2851 (1993): de Kruf y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3938-3942
(1995) Van Ewijk y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
3903-3908 (1997), Cai y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92: 6537-6541 (1997), Cai y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6280-6285 (1996),
Cai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:
9261-9268 (1997). Así, por ejemplo se han
identificado anticuerpos específicos para el melanoma mediante
selección de anticuerpos expresados en fagos que se unen a células
de melanoma pero no a los melanocitos, utilizando librerías de
fagos construidas de donantes humanos inmunizados con sus propias
células tumorales (Cai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
6537-6541(1995), Cai y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93: 6280-6285 (1996) Cai y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9261-6266
(1997).
El factor acelerador de la degradación (DAF) es
una proteína unida a GPI que actúa conjuntamente con otras dos
proteínas unidas también a GPI, CD46 y CD59, que protegen las
células huéspedes de la lisis celular mediada por el sistema del
complemento (Nicholson Weller y col., J. Lab. Clin.
Med. 123:485-491 (1994). DAF se expresa en
una amplia variedad de niveles en líneas celulares tumorales y su
sobreexpresión se correlaciona con un aumento de la resistencia a
la lisis celular mediada in vitro por el complemento (Cheung
y col., J. Clin. Invest. 81:1122-1128
(1988)). La sobreexpresión de DAF, se ha observado en una variedad
de tejidos tumorales humanos, en 6/9 adenocarcinomas de pulmón y
2/7 carcinomas de célula escamosa de pulmón (Niehans y col., Am.
J. Path. 149:129-142 (1996)). En el tejido
normal de pulmón, DAF se ha detectado mediante immunohistoquímica en
el epitelio alveolar, intersticio y endotelio así como en el
epitelio bronquial, glándulas y ductos además de en los vasos
sanguíneos (Niehans y col., Am. J. Path.
149:129-142 (1996)).
Otras publicaciones referidas a DAF se citan a
continuación: Hara y col., Immunology Letters 37:
148-152 (1993), Nicholson Weller y Wang J. Lab.
Clin. Med. 123(4): 485-491 (1994); Lublin
y col., J. Immunol. 131:1629-1635 (1986);
WO99/43800; WO98/3959; Patente de US No. 6.695.945; Patente de US
No. 5.763.224; y WO 86/07062.
Vollmers y col., Cancer Research
49:2471-2476 (1989); y Vollmers y col.,
Cancer 76(4): 550-558 (1995) describen
el anticuerpo monoclonal humano IgM "SC-1" que
es sabido inhibe el crecimiento de las células de adenocarcinoma de
estómago in vitro e in vivo por inducción de la
apoptosis. En Vollmers y col., Oncology Reports
5:549-552 (1998) se informa de los resultados de un
ensayo clínico en el que los pacientes con un adenocarcinoma de
estómago poco diferenciado se trataron con el anticuerpo
SC-1. La última publicación, de Hensel y col.,
Cancer Research 59:5299-5306 (1999),
identifica a la proteína DAF como el antígeno unido por
SC-1.
En la presente solicitud de patente, se utilizó
una librería amplia de anticuerpos desnudos expresados en fagos,
para la búsqueda de antígenos asociados al cáncer, en consecuencia,
se obvia la necesidad de crear librerías para cada caso a partir de
donantes inmunizados. Además, los anticuerpos se seleccionaron
utilizando células vivas para la obtención de anticuerpos, más
adecuado que utilizar células fijadas para la obtención de
anticuerpos contra antígenos nativos en lugar de desnaturalizados.
Esto se hizo para facilitar el subsiguiente clonado y expresión del
antígeno correspondiente, así como para aumentar el potencial
terapéutico de los anticuerpos producidos. Así, un antígeno que
corresponde a un fragmento scFv identificado por presentar una
selectividad significativa por el tumor se clonó de acuerdo con los
presentes procedimientos.
La invención proporciona un procedimiento ex
vivo o in vitro para producir un anticuerpo que incluye
las siguientes etapas: (a) unión de un anticuerpo expresado en un
fago de una librería de fagos que expresan anticuerpos desnudos a
una célula viva cancerosa (b) selección de un fago que expresa un
anticuerpo o de un anticuerpo que se une selectivamente a una célula
cancerosa viva; y (c) identificación del antígeno al que se une el
fago que expresa el anticuerpo o el anticuerpo.
La invención proporciona además un derivado de
anticuerpo de acuerdo con el procedimiento del párrafo anterior y
opcionalmente incluye alteraciones en la secuencia aminoacídica
(p.ej., adiciones, deleciones y/o sustituciones respecto al
anticuerpo seleccionado en la etapa anterior (b)) de un anticuerpo o
derivado de anticuerpo susceptibles de uso terapéutico.
La invención proporciona además un procedimiento
ex vivo o in vitro para identificar antígenos que se
expresan de manera diferencial en la superficie celular o de dos o
más poblaciones distintas, que comprende los siguientes pasos; (a)
unión del fago que expresa el anticuerpo de una librería de fagos de
anticuerpos desnudos con una primera población celular; (b) unión
del fago que expresa el anticuerpos con una segunda población
celular distinta de la primera; (c) selección de un fago que
expresa el anticuerpo o del anticuerpo que se une selectivamente a
la primera población celular; y (d) identificación de un antígeno
con el que se una el fago que expresa el anticuerpo o del
anticuerpo.
La invención proporciona además un antagonista,
como un anticuerpo, dirigido contra un antígeno, el cual ha sido
identificado de acuerdo con el procedimiento del párrafo
anterior.
La invención hace referencia además a un
anticuerpo humano aislado que se dirige contra, o se une
específicamente con, el factor de aceleración de la degradación
(DAF), y que se obtiene según los procedimientos aquí descritos. La
invención proporciona además un anticuerpo humano que tiene una
mejor afinidad de unión para DAF que el anticuerpo
SC-1 de IgM humana, p.ej., aproximadamente 10 nM o
mejor afinidad de unión para DAF (en por ejemplo el intervalo de 10
nM hasta 1pM). Un ejemplo de anticuerpo con una fuerte afinidad de
unión para DAF es el anticuerpo LU30 que posee una afinidad de
unión (K_{d}) para DAF de alrededor de 13 nM tal como se ha
determinado mediante el instrumento BIACORE^{TM}. El anticuerpo
se une opcionalmente a un epitopo de DAF que puede unirse a los
anticuerpos LU30, LU13 o LU20, aquí descritos. El anticuerpo humano
puede incluir residuos de aminoácidos de unión antigénica de los
anticuerpos LU30, LU13 o LU20. La solicitud proporciona
adicionalmente anticuerpos humanos designados aquí como LU30, LU13
y LU20 así como las variantes de cualquier de estos anticuerpos.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos incluyen los dominios
V_{H} y V_{L} que comparten ambos el 90-100% de
identidad de secuencia aminoacídica y preferentemente el
95-100% y aún más preferentemente el
98-100% de identidad de secuencia aminoacídica con
las secuencia de aminoácidos de V_{H} y V_{L} de los anticuerpos
LU30, LU13 o LU20 tal como se muestra en las Figs. 5A y 5B. Una
variante preferida de secuencia aminoacídica es una variante de
afinidad madurada que comprende una o más modificaciones de la
secuencia aminoacídica (p.ej., alrededor de 1-20 y
más preferentemente de 3-10 sustituciones
aminoacídicas) en una o más regiones hipervariables de las
secuencias aminoacídica de V_{H} y/o V_{L} de LU30, LU13 o LU20,
descritas aquí. Otro tipo de variante es la variante glicosilada
que tiene una glicosilación alterada en comparación con el
anticuerpo parental y que por tanto tiene alteradas la(s)
función(es) efectoras. Se pueden utilizar las formas del
fragmento Fv (p.ej., fragmentos Fv de cadena única, scFv) de los
anticuerpos LU30, LU13, o LU20, además las regiones variables de
estos anticuerpos se pueden fusionar opcionalmente con
polipétido(s) heterólogos como (1) una toxina polipeptídica
para generar una inmunotoxina; o (2) secuencias de región constante
de un anticuerpo para producir moléculas de anticuerpo mayores como
los fragmentos Fab, F(ab')_{2} o los anticuerpos intactos.
Los anticuerpos intactos generalmente tienen las regiones
constantes de cadena pesada y ligera, y por tanto presentan las
funciones efectoras de anticuerpos, como la citotoxicidad mediada
por células y dependiente de anticuerpo (ADCC) y la citotoxicidad
dependiente del complemento (CDC).
En otra solicitud, la invención hace referencia a
una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo humano
dirigido contra DAF y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además, la invención proporciona el uso médico de los anticuerpos
obtenidos por dicho procedimiento para tratar a un paciente que
tenga, o presente predisposición a padecer un cáncer de pulmón. Por
cáncer de pulmón se incluye el cáncer de pulmón de células
pequeñas, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma
de pulmón de células grandes, el adenocarcinoma de pulmón y el
carcinoma de pulmón de células escamosas.
La Fig. 1 muestra el análisis por citometría de
flujo de poblaciones de fagos en los ciclos 1, 2 y 3 de unión a la
línea celular tumoral 1264 (en oscuro) utilizada para la selección
y la línea no tumoral BEAS-2B (en claro) utilizada
para la contra-selección. También se muestra una
población de fagos de control negativo.
La Fig. 2A-C muestra los
dendrogramas para los scFv selectivos para el tumor que satisfacen
los criterios de selección primarios y secundarios (Tabla 1). Se
realizó la comparación entre las secuencias aminoacídicas de scFv
(Fig. 2A), así como de sus dominios de V_{H} (Fig. 2B) y V_{L}
(Fig. 2C).
| Cribado primario de los clones de fagos que expresan los scFV | ||
| Diana BstNI de tipo | #Clones selectivos para | Identidad de los clones |
| "fingerprint" | el tumor# | (#clones secuenciados) |
| 1 | 110 | LU(8) |
| 2 | 49 | LU(7) |
| 3 | 10 | LU20(9) |
| 4 | 7 | LU13 (3) LU34 (4)^{b} |
| 5 | 4 | LU22 (4) |
| 6 | 3 | LU36 (3) |
| 7 | 3 | LU41 (3) |
| 8 | 3 | LU57 (2) |
| 9 | 3 | LU3 (1) LU77(2)^{b} |
| 10 | 2 | LU30 (2) |
| 11 | 1 | LU7 (1) |
| 12 | 1 | LU71 (1) |
| 13 | 1 | LU100 (1) |
| 14 | 1 | LU 60 (1)^{c} |
| 15 | 1 | LU78 (1) |
| ^{a} \begin{minipage}[t]{125mm}Clones selectivos para el tumor según el ensayo del ELISA de fagos: unión fuerte con las células 1264 (A450-A650>0.3) y unión más débil con las células BEAS-28 (\geq10 veces señal menor).\end{minipage} | ||
| ^{b} \begin{minipage}[t]{125mm}A partir de las secuencias nucleotídicas, se predijo que en los clones LU13 y LU34 se generaría un patrón idéntico de "fingerprint", mientras que en los clones LU3 y LU77, al compartir un patrón de "fingerprint" más estrechamente relacionado no eran diferenciables por nuestro análisis electroforético.\end{minipage} | ||
| ^{c} \begin{minipage}[t]{125mm}El codón 3 que en VH es el codón ámbar (TAG), se leerá como glutamina en la cepa de E. coli supE, TG1.\end{minipage} |
La Fig. 3 muestra el análisis por citometría de
flujo de los fragmentos scFV con las líneas celulares tumorales
(1264 A549, CALU6 y SKLU1) y no tumorales (BEAS-28
y NHEK).
La Fig. 4 muestra la unión de fragmentos scFv
LU30 (3 \mug/ml) con las células 1264 en ausencia y presencia de
DAF humano recombinante (30 \mug/ml).
La Fig. 5A y 5B muestra las secuencias
aminoacídicas los dominios variables de cadena ligera (VL) (Fig. 5A
SEC ID NOS 1-3, respectivamente) y de cadena pesada
(VH) (Fig. 5B SEC ID NOS 4-6, respectivamente) de
los anticuerpos humanos LU30, LU13 y LU20 identificados en el
ejemplo 1. Los residuos de la Región Determinante de la
Complementariedad (CDR) están en negrita y los residuos del bucle
hipervariable entre paréntesis.
El término "anticuerpo" se utiliza en
sentido amplio y abarca específicamente los anticuerpos
monoclonales, los policlonales, los multiespecíficos (p.ej.,
anticuerpos biespecíficos) formados por al menos dos anticuerpos
intactos siempre que presenten la actividad biológica deseada.
Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden
una porción de un anticuerpo intacto preferentemente la región de
unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto.
Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab,
Fab', F(ab')2 y Fv; los diacuerpos; los "anticuerpos
lineales" (patente americana U.S. 5.64.870); molécula de
anticuerpo de una sola cadena como los fragmentos de cadena
sencilla (scFv); y los anticuerpos multiespecíficos formados por
fragmentos de anticuerpos.
Un "anticuerpo intacto" es un anticuerpo que
comprende una región variable de unión al antígeno, así como un
dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de
cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser
dominios constantes de secuencia nativa (p.ej., dominios constantes
de secuencia nativa humana) o variantes de secuencia aminoacídica de
los mismo. Preferentemente, el anticuerpo intacto tiene una o más
funciones efectoras.
Las "funciones efectoras" del anticuerpo
hacen referencia a las actividades biológicas atribuibles a la
región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de
variante de secuencia aminoacídica) de un anticuerpo. Ejemplos de
funciones afectoras de anticuerpo incluyen la unión C1q; la
citotoxicidad dependiente de complemento; la unión al receptor Fc;
la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo
(ADCC); la fagocitosis; la regulación negativa de receptores de
superficie celular (p.ej., el receptor de células B; BCR), etc.
Dependiendo de la secuencia aminoacídica del
dominio constante de las cadenas pesadas, los anticuerpos intactos
pueden asignarse a "clases" distintas. Existen cinco clases
principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y
algunos de estos pueden subdividirse además en "subclases"
(isotipos), p.ej., IgG1 (incluyendo los alotipos humanos A y los
no-A), IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Las
estructuras de las subunidades y las configuraciones
tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son
bien conocidas.
"La citotoxicidad mediada por células y
dependiente de anticuerpos" o el "ADCC" hacen referencia a
la reacción mediada por células en la que células citotóxicas
inespecíficas que expresan receptores Fc (p.ej., células supresoras
(NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido a una
célula diana y en consecuencia causan la lisis de la célula diana.
Las células iniciales para la mediación ADCC, células NK, expresan
únicamente FcgammaRIII, mientras que los monocitos expresan
FcgammaRI, FcgammaRII y FcgammaRII. La expresión de FcR en las
células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de
Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92
(1991). Para valorar la actividad ADCC de una molécula de interés,
se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, como el que se
describe en la patente americana U.S. 5.500.362 o la 5.821.337. Las
células efectoras de utilidad para dicho ensayo incluyen las células
mononucleares de sangre periférica (PBMC) y las células supresoras
(NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la
molécula de interés puede valorarse in vivo, p.ej., en un
modelo animal como el descrito en Clynes y col., PNAS (USA)
95:652-656 (1998).
"La citotoxicidad dependiente del
complemento" o "CDC" hace referencia a la capacidad de una
molécula para lisar una diana en presencia del complemento. La vía
de activación del complemento se inicia por la unión del primer
componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula (p.ej.,
un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno afín. Para
valorar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo
CDC, p.ej., tal como se describe en Gazzano-Santoro
y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Los residuos "de unión antigénica" de un
anticuerpo son aquellos que contactan con el antígeno y dan como
resultado una unión específica del anticuerpo con el antígeno. En
general, los residuos de unión al antígeno coinciden con los
residuos de la región hipervariable de un anticuerpo. Las regiones
hipervariables comprenden por lo general residuos aminoacídicos de
una "región determinante de la complementariedad" o "CDR"
(p.ej., los residuos 24-34 (L1),
50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el
dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1),
50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el
dominio variable de cadena pesada; Kabat y col., Sequences of
Proteins of Immunological Interest 5ª Ed. Public Health Service,
National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los
residuos de un "bucle hipervariable" (p.ej., los residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y
26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada;
Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
Los residuos de la "región de entramado" o "FR" son
aquellos residuos del dominio variable distintos a los residuos de
la región hipervariable, tal como se definió aquí.
El término "anticuerpo monoclonal", tal como
se utiliza aquí, hace referencia a un anticuerpo obtenido de una
población de anticuerpos esencialmente homogéneos, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos
excepto por mutaciones que ocurren de forma natural y que pueden
estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales
son altamente específicos, al estar dirigidos contra un sitio único
antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de
anticuerpo convencionales (policlonales) que incluyen típicamente
anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes distintos
(epitopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un
único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los
anticuerpos monoclonales presentan la ventaja de que se sintetizan
en cultivos de hibridomas, sin contaminarse con otras
inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el
carácter del anticuerpo como el obtenido de una población
esencialmente homogénea de anticuerpos y no debe considerarse que
necesite de una producción del anticuerpo por ningún procedimiento
particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizar de
acuerdo con la presente invención pueden generarse por el
procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y
col., Nature, 256:495 (1975), o pueden generarse mediante
tecnología del DNA recombinante (véase la patente americana, U.S.
4.816.567). Los anticuerpos "monoclonales" también pueden
aislarse a partir de librerías de fagos que expresan
anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales incluyen
específicamente "anticuerpos quiméricos" (inmunoglobulinas) en
los que una porción de una cadena ligera y/o pesada es idéntica a u
homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados
de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de
anticuerpo particular, mientras que el resto de cadenas son
idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en los
anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra
clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos
anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada
(patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (984)).
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una
secuencia aminoacídica que corresponde con la de un anticuerpo
producido por un humano y/o se ha generado utilizando cualquiera de
las técnicas para generar anticuerpos humanos tal como se describe
aquí. Esta definición de un anticuerpo específicamente humano
excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión
antigénicos no humanos. Los anticuerpos humanos pueden generarse
utilizando técnicas diversas conocidas en la materia. En la
realización preferida, el anticuerpo humano se selecciona a partir
de una librería de fagos, en donde dicha librería de fagos expresa
anticuerpos humanos (Vaughan y col., Nature Biotechnology,
14:309-314 (1996), Sheets y col., PNAS (USA)
95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol.
Biol., 227:381 (19919; Marks y col., 222:581 (1991); y el Ejemplo 1
de la presente invención. Los anticuerpos humanos también pueden
generarse introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales
transgénicos, p.ej., ratones en los que genes de inmunoglobulina
endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras un
estímulo, se observa la producción de anticuerpos, que se parece
estrechamente a la observada en humanos en todos los aspectos,
incluyendo el reordenamiento y ensamblaje de genes y el repertorio
de anticuerpos. Esta aproximación se describe, por ejemplo, en la
patente americana U.S. 5.45.807; 5.45.806; 5.569.825; 5.625.126;
5.633.425; 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas:
Marks y col., Biol/Technology 10:779-783 (1992);
Lonberg y col., Nature 368:856-859 (19949; Morrison,
Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature
Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature
Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev.
Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, el
anticuerpo humano puede prepararse mediante inmortalización de
linfocitos B humanos productores de un anticuerpo dirigidos contra
un antígeno diana (como los linfocitos B que pueden recuperarse de
un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro);
véase, p.ej., Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R Liss, pág. 77 (1985); Boemer y col., J. Immunol., 147
(1):86-95 (1991); patente americana U.S.,
5.750.373.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos
no-humanos (p.ej., murinos) son inmunoglobulinas
quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de lo mismo
(como Fv, Fab, Fab', F(ab')2, u otras subsecuencias de unión
antigénica de anticuerpos) que contienen una secuencia mínima
derivada de una inmunoglobulina no-humana. Para la
mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en los que residuos de una región determinante
de la complementariedad (CDR) del recipiente se reemplaza por
residuos de una CDR de una especie no-humana
(anticuerpo donante) como el ratón, rata o conejo con la
especificidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos
de la región de entramado de Fv (FR) de la inmunoglobulina humana
se reemplazan por residuos no-humanos
correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden
comprender residuos que no se hallan ni en el anticuerpo receptor
ni en las secuencias CDR o de entramado importadas. Estas
modificaciones se realizan para una mejor y mayor producción de
anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá
esencialmente todos o al menos uno, y típicamente dos dominios
variables, en los que todas o esencialmente todas las CDRs
corresponden a las inmunoglobulinas no-humanas y
todas o esencialmente todas las FRs corresponden con una secuencia
de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también
comprenderá óptimamente al menos una porción de una región constante
de inmunoglobulina (Fc), típicamente el de una inmunoglobulina
humana. Para mayores detalles, véase Jones y col., Nature,
321.522-525 (1986); Reichmann y col., Nature,
332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op.Struct.
Biol., 2:593-506 (1992). El anticuerpo humanizado
incluye un anticuerpo PRIMATIZED^{TM}, en donde la región de unión
al antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido por
inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.
Los "Fv de una sola cadena" o fragmentos de
anticuerpo "scFv" comprenden dominios VH y VL de anticuerpo, en
donde estos dominios están presentes en una sola cadena
polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además
un engarce polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite la
formación de scFv a partir de la estructura deseada para la unión
antigénica. Para una revisión de scFv véase Plückthun en The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenberg y Moore
eds., Springer-Verlag, New York, págs.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" hace referencia a
fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión
antigénica, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de
cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena
ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica
(VH-VL). Utilizando un engarce que sea demasiado
corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la
misma cadena, se fuerzan los dominios a emparejarse con los
dominios complementarios de otra cadena y se crean así dos sitios
de unión antigénica. Los diacuerpos se describen más completamente
en, por ejemplo, la patente europea EP 404.097; patente
internacional WO 93/11161; y Hollinger y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Un anticuerpo "de afinidad madurada" es uno
que presenta una o más alteraciones en una o más CDRs, lo que da
como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el
antígeno, comparado con un anticuerpo parental que no posee dichas
alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos
tendrán afinidades del orden nanomolar o incluso picomolar para el
antígeno diana. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen
mediante procedimientos conocidos en la materia, Marks y col., Biol
Technology 10:779-783 (1992) describen la maduración
de la afinidad para el barajamiento de dominios VH y VL. La
mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos de la región de entramado
se describe por Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:3809-3813 (1994); Schier y col., Gene
169:147-155 (1995); Yelton y col., J. Immunol.
155:1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol.
154 (7):3310-9 (1995); y Hawkins y col., J. Mol.
Biol. 226:889-896 (1992).
Un anticuerpo que está "dirigido contra" o
que "se une específicamente a" un antígeno de interés, p.ej.,
el antígeno DAF, es un anticuerpo capaz de unir el antígeno con
suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente
terapéutico para dirigirse contra un antígeno. El antígeno aquí es
normalmente DAF, ya que existe en un paciente a ser tratado con el
anticuerpo (especialmente el antígeno que se expresa por las
células tumorales en el paciente). A pesar de ello, se pueden
utilizar para generar o producir el anticuerpo diversas formas de
DAF (p.ej., DAF nativo, recombinante y sintético, incluyendo
variantes de DAF y fragmentos de éste).
La "afinidad de unión" de un anticuerpo por
un antígeno diana, como el DAF, puede determinarse mediante
procedimientos diversos (p.ej., ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzima, ELISA; o radioinmunoensayo, RIA; o análisis cinéticos,
p.ej., análisis BIACORE^{TM}; véase el ejemplo 1 de más
adelante.
Para determinar si un anticuerpo se une a un
"epitopo" en un antígeno, como el DAF, unido por otro
anticuerpo, se puede realizar un ensayo de bloqueo cruzado de
rutina como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lane (1988).
El término "fago de anticuerpos" hace
referencia a un bacteriófago que expresa en su superficie un
anticuerpo (en particular un fragmento de anticuerpo como un scFv,
diacuerpo, anticuerpo lineal o Fab).
Una "librería de anticuerpos desnudos
expresados en fagos" o una "librería de fagos que expresan
anticuerpos desnudos" comprende diversos anticuerpos expresados
en fagos que no han sido derivados de un huésped inmunizado, es
decir, "librería de expresión en fagos
no-inmunizados" (véase, p.ej., Vaughn y col.,
Nat. Biotechnol. 14, 309-314 (1996); y Sheets y
col., PNAS (USA) 95:6157-6162 (1988)). Ejemplos de
procedimientos para la generación de dichas librerías de fagos de
anticuerpos "desnudos" o "no-inmunizados"
se elaboran más adelante.
El hecho de "unir" un fago de anticuerpos a
una célula o a una población celular implica la exposición o
contacto del fago de anticuerpos con la célula o la población
celular en condiciones adecuadas y durante un período de tiempo
suficiente para que el anticuerpo expresado en la superficie el fago
se una de forma no covalente con uno o más antígenos en la célula o
población celular. En general, los antígenos con quienes se une el
anticuerpo están presentes en la superficie de una célula (es decir,
"antígenos de superficie celular"). El "antígeno" es
generalmente una proteína, pero puede ser una molécula
no-proteica como un lípido, carbohidrato,
glicolípido o ácido nucleico, etc.
Una célula "viva" es una célula que no ha
sido fijada histológicamente con un fijador como el glutaraldehído.
La célula viva puede ser una célula "primaria", p.ej., que ha
sido extraída quirúrgicamente de un mamífero o una "línea
celular" capaz de cultivarse de forma continua en un cultivo
celular. Una "célula cancerosa viva" es una célula cancerosa o
tumoral que no ha sido fijada histológicamente y una "célula no
cancerosa viva" es una célula no cancerosa (es decir, que no se
deriva de un cáncer o tumor) que no ha sido fijada
histológicamente.
Una célula o población celular "distinta" es
una que célula o población genotípica y/o fenotípicamente distinta
de otra célula o población celular con la que se compara. Las
células o poblaciones celulares "distintas" pueden sin
embargo, ser del mismo tipo tisular; por ejemplo, una célula
cancerosa y una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. En el
ejemplo de más abajo, se utilizaron líneas celulares de cáncer de
pulmón (1264, SKLU1, A549 y CALU6) y líneas de células de pulmón no
cancerosas (BEAS-2B, CCD19LU y NHBE 4683) como
poblaciones celulares distintas.
El término "selección" de un fago de
anticuerpos o de un anticuerpo hace referencia a la elección para
posteriores análisis, o para la utilización en otros
procedimientos, de un fago de anticuerpos o un anticuerpo derivado
de éstos.
Un fago de anticuerpos o un anticuerpo que "se
une selectivamente" a una célula o población celular es uno que
se une preferentemente a dicha célula o población celular comparada
con una célula o población celular distinta. El fago de anticuerpo
o anticuerpo se une preferentemente de forma selectiva a una célula
cancerosa comparada con una célula no cancerosa o del mismo tipo
tisular. Dicha unión selectiva puede determinarse mediante diversos
procedimientos conocidos en la materia incluyendo el ensayo ELISA
(con scFv, Fab o fagos de anticuerpos); citometría de flujo (con
scFv, Fab o fagos de anticuerpos); e inmunohistoquímica (con scFv,
Fab o fagos de anticuerpos).
El término
"contra-selección" hace referencia a la unión
del fago de anticuerpo de una librería de fagos de anticuerpos con
una célula o población celular (p.ej., una célula o población
celular no cancerosa) que es distinta de una segunda célula o
segunda población celular de interés (p.ej., una célula o población
celular cancerosa) y la sustracción o eliminación de dicho fago de
anticuerpo que se une con la primera célula o población celular
(p.ej., los fago de anticuerpos que se unen con la primera célula o
primera población celular no están sometidos a análisis siguientes
o rastreos). Esto puede, por ejemplo, lograrse centrifugando el fago
de anticuerpo unido a la primera célula y utilizando el
sobrenadante obtenido para análisis o rastreos posteriores.
El término "clonaje de expresión" hace
referencia a la caracterización de un ácido nucleico que codifica
una proteína (p.ej., un antígeno proteico) de interés, en donde el
procedimiento implica la detección de la proteína expresada por el
ácido nucleico. La detección es posible utilizando un anticuerpo
dirigido contra la proteína, p.ej., un fago de anticuerpos o
anticuerpo derivado de una librería de fagos de anticuerpos
desnudos, tal como se describió anteriormente.
El término "tratamiento" hace referencia al
tratamiento terapéutico y al profiláctico o preventivo. Los
individuos que requieren tratamiento incluyen los que ya presentan
la enfermedad, así como en los que se ha de prevenir. El paciente a
tratar puede tener, o estar predispuesto al, cáncer (p.ej., cáncer
de pulmón). El paciente que está "predispuesto" al cáncer,
puede presentar factores de riesgo, como la
sobre-expresión de DAF y/o la expresión de una
glicoforma de DAF asociada con el cáncer.
El término "mamífero" con propósitos de
tratamiento hace referencia a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluyendo el hombre, los animales domésticos y de
granja, y los del zoo, los de competición, o los animales de
compañía, como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferentemente,
el mamífero es el hombre.
El término "cantidad efectiva
terapéuticamente" hace referencia a una cantidad efectiva de un
fármaco para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En
el caso del cáncer, la cantidad efectiva terapéuticamente del
fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el
tamaño del tumor; inhibir (es decir, ralentizar en cierta manera y
preferentemente parar) la infiltración de células cancerosas en
órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierta manera
y preferentemente parar) la metástasis tumoral; inhibir, en cierta
manera, el crecimiento tumoral, y/o mitigar en cierta manera los
síntomas asociados con el trastorno. El fármaco en general puede
prevenir el crecimiento y/o eliminar las células cancerosas
existentes, y puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia
del cáncer, su eficacia puede cuantificarse, por ejemplo, valorando
el tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) y/o la determinación
de la rapidez de respuesta (RR).
Los términos "cáncer" y "canceroso"
hacen referencia a o describen la condición fisiológica en un
mamífero que se caracteriza por un crecimiento celular desregulado.
Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma,
linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de
dichos cánceres incluyen el cáncer de células escamosas, el cáncer
de pulmón de células pequeñas, el cáncer de pulmón de células no
pequeñas, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el
glioblastoma, el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de
hígado, el cáncer de vejiga, el hepatoma, el cáncer de mama, el
cáncer de colon, el cáncer colorectal, el carcinoma endometrial, el
carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de riñón, el cáncer de
hígado, el cáncer de próstata, el cáncer vulvar, el cáncer de
tiroides, el carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza
y cuello.
El término "agente citotóxico" tal como se
utiliza aquí hace referencia a una sustancia que inhibe o previene
la función de las células y/o causa la destrucción de las células.
El término pretende incluir isótopos radioactivos (p.ej.,
At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188},
Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} y los isótopos radioactivos de Lu),
los agentes quimioterapéuticos y las toxinas como las toxinas de
moléculas pequeñas o las toxinas activas enzimáticamente de origen
bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo los fragmentos
y/o las variantes de lo mismo.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico de utilidad en el tratamiento del cáncer. Ejemplos
de agentes quimioterapéuticos incluyen los agentes alquilantes como
el tiotepa y la ciclosfosfamida (CYTOXAN^{TM}); los alquil
sulfonatos como el busulfán, improsulfan y el piposulfan; las
aziridinas como la benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa,
etilenniminas y metilamelaminas incluyendo la altretamina,
trietilenemalamina, trieltielenfosforamida,
trieetilenetiofosfaoramida y trimetilolomelamina; las acetogeninas
(especialmente el bullatacin, y la bullatacinona); un camptotecin
(incluyendo el topotecan, análogo sintético); briostatina;
callystatina; CC-1605 (incluyendo sus análogos
sintéticos adozelesin, carzelesin y bizelesin); criptoficinas
(particularmente la criptoficina-1 y la 8),
dolastatin; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos,
KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobin;
pancratistatin; un sarcodictin; spongiastin; mostazas nitrogenadas
como el clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina,
ifosfamida, mecloretamina, mecloretamina óxido hidrocloruro,
melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida,
mostaza de uracil; nitrosoureas como la camustina, clorozotocina,
fotemustina, iomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como
los antibióticos de enedina (p.ej., calicheamicin, especialmente
calicheamicin \gamma_{1}^{1} y calicheamicin
\theta_{1}^{1}, véase p.ej., Agnew Chem Intl. Ed. Engl.
33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo la
dinemicina A; una esperamicina; así como el cromóforo
neocarzinostatin y los cromóforos antibióticos de cromoproteína
enedina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,
bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina,
carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina,
detorubicina,
6-diazo-6-oxo-L-norleucina,
doxorubicina (incluyendo la morfolinodoxorubicina,
cianomorfolino-doxorubicina,
2-pirrolino-doxirubicina y
desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina,
marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina,
olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina,
rodorubicina, estretonigrina, estreptozocina, tubercidina,
ubenimiex, zinostatina, zorubicina;
anti-metabolitos como el metotrexato y el
5-fluorouracil (5-FU); análogos de
ácido fólico como la denopterina, metotrexato, pteropterina,
trimetrexato; análogos de purina como la fludarabina,
6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos
de pirimidina como la ancitabina, azacitidina,
6-uazauridina, carmofur, citarabina,
didesoxiuridina, dosxifluridinak enocitabina, floxiuridina,
5-FU; andrógenos como el calusterone, dromostanolona
propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales
como la aminoglutetimida, mitotano, triistotano; una fuente de
ácido fólico como el ácido frolínico; aceglatona aldofosfamida
glicósido; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil;
bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona;
elfornitina; eliptinium acetato; una epotilona; nitrato gálico;
hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maytansinoides como la
mantansina y las ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona;
mopidamol; nitracina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido
podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; PSK®;
razoxan; rizoxin; sizofrian; spirogermanium; ácido tenuazónico;
triazicuona;
2,2'-2''-tricloroetilamina;
trichotecenos (especialmente T-2 toxin, verracurin
A, roridin A y anguidina); uretan; vindesin; dacarbazina;
mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina;
arabinósido ("AraC"); ciclosfofamida; tiotepa; taxoides, p.ej.,
paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology,
Princeton, NJ) y el doxetaxel (TAXOTERE®,
Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France); chlorambucil;
gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina;
metotrexato; análogos de platino como el cisplatin y carboplatin;
vinblastina, Platino; etoposido (VP-16);
ifosfamida, mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina;
navelbina; novantrona; teniposido; daunomicina; aminopterina;
xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de
topoisomerasas RFS2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido
retinoico; capecitabina; y sales aceptables farmacéuticamente,
ácidos o derivados de los anteriores. También se incluyeron en esta
definición los agentes anti-hormonales que actúan
para regular o inhibir la acción hormonal en tumores como los
anti-estrógenos incluyendo por ejemplo el
tamoxifen, raloxifeno, los inhibidores de aromatasas como
4(5)-imidazoles,
4-hidroxitamoxife, trioxifen, keoxifen, LY117018,
onapristona, y toremifenel (Fareston); y
anti-andrógenos como la flutamida, nilutamida,
bicalutamida, leuprolido, y goserelina; y sales, ácidos, o
derivados de lo anterior farmacéuticamente aceptables.
El término "citoquina" es un término
genérico para las proteínas liberadas por una población celular que
actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos
de dichas citoquinas son las linfoquinas, monoquinas y las hormonas
polipeptídicas tradicionales. Se incluyen entre las citoquinas la
hormona de crecimiento como la hormona de crecimiento humano, la
hormona N-metionil de crecimiento humano y la
hormona de crecimiento bovino; la hormona paratiroidea; la
tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la prorelaxina;
las hormonas glicoproteicas como la hormona estimulante del folículo
(FSH), la hormona estimulante del tiroides (TSH) y la hormona
luteinizante (LH); el factor de crecimiento hepático, el factor de
crecimiento de fibroblastos; la prolactina; el lactógeno placental;
el factor de necrosis tumoral alfa y beta; la sustancia inhibidora
mulleriana; el péptido asociado a gonadotropina de ratón; la
inhibina; la activina; el factor de crecimiento endotelial
vascular; la integrina; la trombopoyetina (TPO); los factores de
crecimiento nervioso como el NGF-alfa; el factor de
crecimiento de plaquetas; los factores de crecimiento
transformantes (TGFS) como el TGF-alfa y el
TGF-beta; el factor-I y -II de
crecimiento de tipo insulina; la eritropoyetina (EPO); los factores
osteoinductores; los interferones como el
interferón-alfa, -beta y -gamma, los factores
estimulantes de la formación de colonias (CSFs) como el CSF de
macrófagos (M-CSF); el CSF de macrófagos y
granulocitos (GM-CSF); y el CSF de granulocitos
(G_CSF); las interleuquinas (ILs) como la IL-1,
IL-1alfa, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10, IL-11,
IL-12; un factor de necrosis tumoral como el
TNF-alfa o el TNF-beta; y otros
factores polipeptídicos incluyendo el LIF y el ligando del equipo
(KL). Tal como se utiliza aquí, el término citoquina incluye
proteínas de fuentes naturales o procedentes del cultivo de células
recombinantes y los equivalentes activos biológicamente de las
citoquinas de secuencia nativa.
El término "profármaco" tal como se utiliza
aquí en esta solicitud hace referencia a una forma precursora o
derivada de una sustancia activa farmacéuticamente que es menos
citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco
parental y que es capaz de activarse enzimáticamente o de
convertirse en una forma parental más activa. Véase, p.ej., Wilman,
"Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society
Transactions, 14 pág. 375-382, 615^{th} Meeting
Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to
Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt y
col., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Los
profármacos de la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, profármacos que contienen fosfato, tiofosfato, sulfato o
péptidos; profármacos modificados de ácido D-amino,
profármacos glicosilados, profármacos que contienen
beta-lactama, opcionalmente profármacos que
contienen fenoxiacetamida sustituida u opcionalmente fenilacetamida
sustituida, profármacos de 5-fluorcitosina y otros
de 5-fluorouridina que pueden convertirse en una
forma libre del fármaco más activo y citotóxico. Ejemplos de
fármacos citotóxicos que pueden derivarse de una forma profármaco
para utilizar en la presente invención incluyen, pero no se limitan
a, los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.
El término "inserto del paquete" se utiliza
para referirse a las instrucciones para el usuario incluidas en los
paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen
información sobre las indicaciones, utilización, dosificación,
administración, contraindicaciones y/o advertencias respecto a la
utilización de dichos productos terapéuticos.
Las combinaciones de fármacos
"sinergísticos" hacen referencia a fármacos cuya acción
combinada (p.ej., la capacidad para tratar el cáncer) es
clínicamente superior a la de cada uno por separado.
"Factor acelerador de la desintegración
(DAF)" y "CD55" se utilizan de modo intercambiable en la
presente invención y hacen referencia a la proteína DAF tal como se
describe en la patente americana U.S. 5.763.224 y se ha incorporado
aquí como referencia, incluyendo las variantes e isoformas de lo
mismo (véase la patente americana U.S. 5.763.224; Caras y col.,
Nature 325:545-549 (1987); Lublin y col.,
J.Immunol. 137:1629-1635 (1986); Hara y col.,
Immunol. Lett. 37:145-152 (1993); y la patente
internacional WO 99/43800). El DAF preferido es un DAF de secuencia
nativa humana, incluyendo el DAF secretado de secuencia nativa
humana (DAF-A) y el DAF unido a membrana
(DAF-B) (Caras y col., Nature
325:545-549 (1987)). Esta definición incluye
específicamente las variantes de glicosilación de DAF, en particular
si estas variantes se expresan de forma preferente por las células
tumorales (como células de tumores gástricos, Hensel y col., Cancer
Research 59:5399-5306 (1999), o células tumorales
de pulmón) en comparación con células del mismo tipo celular. Un
ejemplo de una variante de glicosilación es el "antígeno
791Tgp72" descrito en la patente internacional WO99/43800.
Ejemplos de anticuerpos dirigidos contra DAF (o
anticuerpos que se unen específicamente a DAF) incluyen los
anticuerpos monoclonales murinos IA10, IIH6 y VIIIA7, tal como se
describió en la patente internacional WO86/07062 publicada el 4 de
diciembre de 1986 y expresamente incorporada aquí como referencia;
los anticuerpos humanos denominados LU30, LU13, LU20; los
anticuerpos monoclonales 110 murino y BRIC 216 dirigidos contra DAF
tal como se describe en la patente internacional WO99/43800; el
anticuerpo murino 791T36 dirigido contra el antígeno 79Tgp72 (ATCC
HB9173; patente internacional WO99/43800); el anticuerpo murino D17
descrito en Hara y col. Immunol. Lett. 37:145-152
n(1993) que se une a DAF en las células sanguíneas, pero no
en el semen o en los testículos; el anticuerpo humano
SC-1 (Vollmers y col., Cancer
76(4):550-558 (1995); Vollmers y col.,
Cancer Research 49:2471-2476 (1989); Vollmers y
col., Oncology Reports 5:549-552 (1998); y Hensel y
col., Cancer Research 59:5299-5306 (1999)), así
como las variantes de cualquier otro de los anticuerpos anteriores.
Las variantes de anticuerpo incluyendo las variantes de secuencia
aminoacídica (p.ej., los anticuerpos de afinidad madurada y las
variantes humanizadas de anticuerpos murinos), las variantes de
glicosilación con una función efectora alterada, etc.
Una proteína de "secuencia nativa" comprende
la secuencia aminoacídica de una proteína tal como se halla en la
naturaleza, p.ej., en el hombre. La proteína de secuencia nativa
puede generarse mediante medios sintéticos de recombinación, o
puede aislarse de una fuente nativa.
El "porcentaje de identidad de secuencia
aminoacídia (%)" se define como el porcentaje de los residuos
aminoacídicos en una secuencia candidata que son idénticos con los
residuos aminoacídicos en una secuencia seleccionada, después de
alinear las secuencias e introducir los huecos, si fuera necesario,
para lograr la el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y
sin considerar cualquier sustitución conservada como parte de la
identidad de secuencia. El alineamiento con propósitos de
determinar el porcentaje de identidad de secuencia aminoacídica
puede lograrse de diferentes maneras dentro del ámbito de la
materia, por ejemplo, utilizando programas informáticos disponibles
públicamente como el BLAST, BLAST2, ALIGN, ALIGN-2,
o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar
los parámetros adecuados para cuantificar el alineamiento,
incluyendo cualquier alogritmo que se necesite para lograr el
máximo alineamiento en la totalidad de las secuencias que se
comparan. Para los propósitos de la presente invención, la
identidad de secuencia aminoacídica en % se obtiene tal como se
describe más adelante utilizando el programa de comparación de
secuencias ALIGN-2. El programa de comparación de
secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech
Inc., y se ha registrado con la documentación del usuario en la
Oficina de Derechos de Autor Americana, Washington D.C., 20559, con
el número TXU510087, y está disponible a través de Genentech, Inc.,
South San Francisco, California. El programa ALIGN-2
debería recopilar los datos para utilizar en un sistema operativo
UNIX, preferentemente UNIX V4.0D. Todos los parámetros de
comparación de secuencia se ajustan por el programa
ALIGN-2 y no se varían.
Para los propósitos de la presente invención, el
% de identidad de secuencia aminoacídica de una secuencia
aminoacídica dada A respecto a, en relación con, una secuencia
aminoacídica dada B (que alternativamente puede describirse como
una secuencia aminoacídica A que tiene o comprende un cierto % de
identidad de secuencia aminoacídica con, respecto a, una secuencia
aminoacídica dada B) se calcula de la manera siguiente:
100 veces la
fracción
X/Y
Donde X es el número de los residuos
aminoacídicos valorados como coincidencias por el programa de
alineamiento de secuencia ALIGN-2 en el alineamiento
informático de A y B, y en donde Y es el número total de residuos
aminoacídicos en B. Se apreciará que si la longitud de secuencia
aminoacídica A no es igual a la longitud de secuencia aminoacídica
B, el % de identidad de secuencia aminoacídica de A respecto a B no
será igual al % de identidad de secuencia de B respecto a A.
La presente solicitud proporciona un
procedimiento para la realización de un anticuerpo de utilidad, por
ejemplo, para el diagnóstico o la terapia, y un procedimiento para
la identificación de un antígeno que se expresa diferencialmente en
la superficie de dos o más poblaciones celulares distintas. Estos
procedimientos utilizan una librería de fagos de anticuerpos
desnudos que puede prepararse de acuerdo con las técnicas
conocidas, incluyendo las discutidas más adelante.
El dominio de unión al antígeno de un anticuerpo
está formado de dos regiones variables (V) de aproximadamente 110
aminoácidos de una cadena ligera (VL) y de otra pesada (VH),
presentes ambas en tres regiones hipervariables. Los dominios
variables pueden expresarse funcionalmente en los fagos, por
ejemplo, como fragmentos de una sola cadena Fv (scFv), en los que
VH y VL están unidas covalentemente a través de un péptido corto y
flexible; o como fragmentos Fab, en los cada uno está fusionado con
un dominio constante e interactúa de forma
no-covalente, tal como se describe en Winter y col.,
Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994).
El repertorio de anticuerpos desnudos de un
animal (el repertorio antes del estímulo antigénico) proporciona
anticuerpos que pueden unirse con afinidad moderada (Kd de
aproximadamente 10^{6} a 10^{7} M^{-1}) a esencialmente
cualquier molécula ajena. La diversidad de secuencias de sitios de
unión de anticuerpos no está codificada directamente por la línea
germinal, pero se reordena de forma combinatorial a partir de
segmentos génicos V. Cada reordenación combinatorial de segmentos V
en las células madre ocasiona una célula B que expresa una
combinación única VH-VL. La inmunización provoca que
cualquier célula B que produzca una combinación que se una al
inmunógeno prolifere (expansión clonal) y secrete el anticuerpo
correspondiente. Los anticuerpos desnudos maduran a continuación
hasta alcanzar una elevada afinidad (Kd mejor que 10^{9}
M^{-1}) mediante un proceso de mutagénesis y selección conocido
por maduración de la afinidad. Es a partir de dicho momento, en que
las células se extraen para preparar hibridomas y generar
anticuerpos monoclonales de elevada afinidad.
En las tres etapas de este proceso, los
repertorios de genes VH y VL pueden clonarse separadamente por la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y recombinarse
aleatoriamente en librerías de fagos, y a continuación se puede
realizar la búsqueda de clones de unión al antígeno tal como se
describió por Winter y col., Ann. Rev. Immunol.,
12:433-455 (1994). Al contrario que las librerías
inmunizadas, un repertorio de anticuerpos desnudos puede clonarse
para proporcionar una fuente única de anticuerpos humanos en un
intervalo amplio de antígenos no propios y también de propios sin
inmunización tal como se describió por Vaughan y col., Nat.
Biotehcnol. 14:309-314 (1996); y Sheets y col.,
PNAS (USA) 95:6157-6162 (1988). Por último, las
librerías también pueden generarse sintéticamente mediante clonaje
de los segmentos del gen V no reordenados de células madre, y
utilizando cebadores de PCR que contengan una secuencia aleatoria
que codifique las regiones CDR3 altamente variables y lograr así
reordenamientos in vitro tal como se describe por
Hoohgenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388
(1992); y Griffiths y col., EMBO J., 13:3245-3260
(1994).
La expresión en fagos simula la expresión en
células B. Los fagos filamentosos se utilizan para expresar
fragmentos de anticuerpos mediante fusión con la proteína de la
cubierta pIII. Los fragmentos de anticuerpo pueden, por ejemplo,
expresarse como fragmentos Fv de una sola cadena, en los que los
dominios VH y VL están conectados en la misma cadena polipeptídica
por un espaciador polipeptídico flexible, p.ej., tal como se
describe por Marks y col., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991); o como fragmentos Fab, en los
que se fusiona una cadena con pIII y la otra se secreta en el
periplasma de la célula huésped. El ensamblamiento de una estructura
Fab-proteína de la cubierta se expresa en la
superficie del fago desplazando algunas de las proteínas de la
cubierta de tipo salvaje, p.ej., tal como se describe en Hoogenboom
y col., Nucl. Acids. Res., 19:4133-4137 (1991).
Cuando fragmentos de anticuerpo se fusionan con el extremo
N-terminal de pIII, el fago es infeccioso. Sin
embargo, si el dominio N-terminal de pIII se
escinde y las fusiones se realizan con el segundo dominio, el fago
no es infeccioso y la proteína pIII de tipo salvaje debe ser
proporcionada por el fago auxiliar.
La fusión de pIII y de otras proteínas del fago
pueden codificarse totalmente dentro del mismo replicón del fago, o
en replicones distintos. Cuando se utilizan dos replicones, la
fusión de pIII está codificada en un fagémido, un plásmido que
contiene un origen de replicación de fago. Los fagémidos pueden
empaquetarse en partículas mediante "rescate" con un fago
auxiliar como el M13K07 que proporciona todas las proteínas del
fago, incluyendo el pIII, pero debido a un origen defectuoso él
mismo se empaqueta mal en competición con los fagémidos, tal como
se describe en Vieira y Messing, Meth. Enzymol.,
153:3-11 (19897). En un procedimiento preferido, el
sistema de expresión de fagos se diseña de forma que el fago
recombinante pueda crecer en células huésped en condiciones tales
que se permita que una cantidad pequeña de partículas fágicas
expresen más de una copia de la fusión Fv-proteína
de la cubierta en la superficie de la partícula, tal como se
describe en Bass y col., Proteins, 8:309-314 (1990)
y en la patente internacional WO 92/09690, publicada el 11 de junio
de 1992.
En general, los ácidos nucleicos que codifican
fragmentos de genes de anticuerpos se obtienen de células inmunes
cosechadas a partir de humanos o animales. La utilización de
células del bazo y/o células B o de otros PBLs de un donante no
inmunizado proporciona una mejor representación del repertorio de
anticuerpos posibles y también permite la construcción de una
librería de anticuerpos utilizando cualquier especie animal (humana
o no humana). Para las librerías que incorporan una construcción de
genes de anticuerpos in vitro, se cosechan las células madre
del individuo para proporcionar ácidos nucleicos que codifican
segmentos de genes de anticuerpos no reordenados. Las células
inmunes de interés pueden obtenerse de diversas especies animales,
como el hombre, ratón, rata, lagomorfa, luprina, canina, felina,
porcina, bovina, equina y especies aviares, etc.
El ácido nucleico que codifica segmentos de genes
variables de anticuerpos (incluyendo segmentos VH y VL) se recupera
de las células de interés y se amplifica. En el caso de
reordenamiento de librerías de genes VH y VL, el DNA deseado puede
obtenerse mediante aislamiento de DNA genómico o del mRNA de
linfocitos seguido de la reacción en cadena (PCR) con cebadores que
hibridan con los extremos 5' y 3' de los genes VH y VL reordenados,
tal como se describe en Orlandi y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA), 86:3833-3837 (1989), produciendo en
consecuencia repertorios de genes V diversos para la expresión. Los
genes V pueden amplificarse a partir del cDNA y de DNA genómico,
con cebadores de sentido 3' de transcripción en el extremo 5' del
exón codificante del dominio V y cebadores de sentido 5' de
transcripción derivados de secuencias internas del segmento J, tal
como se describe en Orlandi y col., supra y en Ward y col.,
Nature, 341:544-546 (989). Sin embargo, para
amplificar a partir del cDNA, los cebadores de sentido 3' de
transcripción también pueden basarse en el exón líder tal como se
describe en Jones y col., Biotechnol. 9:88-89
(1991), y los cebadores de sentido 5' de transcripción en la región
constante tal como se describe en Sastry y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 86:5728-5732 (1989). Para maximizar la
complementariedad, se puede incorporar degeneración en los cebadores
tal como se describe en Orlandi y col., supra, o Sastry y
col., supra. Preferentemente, se maximiza la diversidad de
librerías mediante cebadores de PCR para cada familia de genes V
con el fin de amplificar todos los reordenamientos VH y VL
presentes en el ácido nucleico de la célula muestra, p.ej., tal
como se describe en el procedimiento de Marks y col., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991), o como se describe en el
procedimiento de Orum y col., Nucleic Acids Res.,
21:4491-4498 (1993). Para el clonaje del DNA
amplificado en vectores de expresión, se pueden introducirse dianas
de restricción raras dentro de los cebadores de PCR como una
etiqueta en cada uno de los extremos, tal como se describe en
Orlandi y col., supra, o mediante amplificación por PCR
posterior con un cebador etiquetado tal como se describe en
Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991).
Los repertorios de genes V reordenados
sintéticamente pueden derivarse in vitro de segmentos de
genes V. La mayoría de segmentos de genes-VH se han
clonado y secuenciado (publicado por Tomlinson y col., J.Mol. Biol.,
227:776-798 (1992)) y se han mapeado (publicado en
Matsuda y col., Nature Genet., 3:88-94 (1993);
estos segmentos clonados (incluyendo todas las conformaciones
importantes del bucle H1 y H2) pueden utilizarse para generar
repertorios de genes VH diversos con cebadores de PCR que codifican
bucles H3 de secuencias y longitudes varias, tal como se describe
en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388
(1992). Los repertorios VH también pueden generarse con toda la
diversidad de secuencia focalizada en un bucle de H3 largo de una
sola longitud, tal como se describe en Barbas y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:4457-4461 (1992). También se
pueden obtener repertorios de cadena ligera sintéticos (Williams y
Winter, Eur. J. Immunol., 23:1456-1461 (1993)). Los
repertorios de genes V, en un intervalo de VH y VL veces y de
longitudes L23 y H3, codificarán anticuerpos de diversidad
estructural. Después de la amplificación de los DNAs que codifican
genes V, se pueden reordenar segmentos de genes V in vitro de
acuerdo con los procedimientos de Hoogenboom y winter, J. Mol.
Biol., 227:381-388 (1992).
Los repertorios de fragmentos de anticuerpo
pueden construirse combinando repertorios de genes VH y VL juntos de
muy diversas maneras. Cada repertorio puede crearse en vectores
distintos, y los vectores pueden combinarse in vitro, p.ej.,
tal como se describe en Hogrefe y col., Gene,
128.119-126 (1993), o in vivo mediante
infección combinatorial, p.ej., el sistema loxP descrito en
Waterhouse y col., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266
(1993); y Griffiths y col., EMBO J., 13:3245-3260
(1994). La aproximación de la recombinación in vivo explota
dos cadenas naturales de fragmentos Fab para sobrepasar el límite
del tamaño de la librería impuesto por la eficiencia de
transformación en E. coli. Los repertorios de VH y VL de
anticuerpos desnudos se clonan separadamente, uno en un fagémido y
el otro en un vector de fagos. Las dos librerías se combinan
entonces mediante infección fágica de las bacterias que contienen
el fagémido, de modo que cada célula contiene una combinación
distinta y el tamaño de la librería se limita únicamente por el
número de células presentes (aproximadamente 10^{12} clones).
Ambos vectores contienen señales recombinantes in vivo, de
modo que genes VH y VL se recombinan en un único replicón y se
co-empaquetan en viriones de fagos. Estas enormes
librerías proporcionan un gran número de anticuerpos diversos de
buena afinidad (Kd de aproximadamente 10^{-8} M).
Alternativamente, los repertorios pueden clonarse
secuencialmente en el mismo vector, p.ej., tal como se describe en
Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
88:7978-7982 (1991), o ensamblarse juntos mediante
PCR y luego clonarse, tal como se describe en Clackson y col.,
Nature, 352:624-628 (1991). El ensamblaje de PCR
puede también utilizarse para unir DNAs de VH y VL con el DNA que
codifica un espaciador peptídico flexible para formar repertorios de
Fv de una sola cadena (scFv). En otras técnicas, "el
ensamblamiento por PCR en la célula" se utiliza para combinar
los genes VH y VL en los linfocitos mediante PCR y luego clonar los
repertorios de los genes unidos, tal como se describe en Embleton y
col., Nucl. Acids. Res. 20:3831-3837 (1992).
Los anticuerpos desnudos producidos por librerías
(naturales o sintéticas) pueden tener una afinidad moderada (kd de
aproximadamente 10^{6} a 10^{7}M^{-1}), pero la maduración de
la afinidad puede también ser también simulada in vitro
mediante construccion y reselección de librerías secundarias, tal
como se describe en Winter y col., (1994), supra. Por
ejemplo, la mutación puede introducirse aleatoriamente in
vitro utilizando una polimerasa propensa a errores (publicada
en Leung y col., Technique, 1:11-15 (1989)) en el
procedimiento de Hawkins y col., J. Mol. Biol.,
226:889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580
(1992). Adicionalmente, la maduración de la afinidad puede
realizarse mutando aleatoriamente una o más CDRs, p.ej., utilizando
la PCR con cebadores que contienen una secuencia aleatoria en la
CDR de interés, en clones Fv individuales seleccionados y su
posterior rastreo para clones de mayor afinidad. La patente
internacional WO 96/07754 (publicada el 14 de marzo de 1996)
describe un procedimiento para inducir la mutagénesis en una región
determinante de la complementariedad de una cadena ligera de
inmunoglobulina para crear una librería de genes de cadena ligera.
Otra aproximación efectiva es recombinar los dominios VH y VL
seleccionados mediante expresión en fagos con repertorios de
variantes de dominios V que ocurren de forma natural obtenidos de
donantes no inmunizados y el rastreo para una mayor afinidad en
diversas tandas de rebarajamiento de cadenas, tal como se describe
en Marks col., Biotechnol., 10:779-783 (1992). Esta
técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de
anticuerpos con afinidades en el rango de 10^{-9}M.
La librería de fagos de anticuerpos de interés
particular es una que comprende desde aproximadamente 10^{9} a
aproximadamente 10^{15} de fagos de anticuerpos.
La librería de fagos de anticuerpos desnudos se
criba con o se rastrea contra células cancerosas vivas. Las células
cancerosas pueden, por ejemplo, obtenerse quirúrgicamente de un
paciente con cáncer o pueden derivarse de una línea de células
cancerosas. Diversas líneas celulares de cáncer están disponibles
públicamente, p.ej., del American Type Culture Collection (ATCC).
Ejemplos de líneas de células cancerosas incluyen las líneas de
cáncer de mama como la SK-BR-3,
BT-483, MCF-7,
BT-20, ZR-751,
MDA-MB-231, CAMA1,
BT-474; las líneas celulares de adenocarcinoma de
pulmón como SKLU1, A549 y 1264; las líneas celulares de cáncer de
gliomas como Hs683; las líneas de carcinoma de ovario como
SK-OV-3 y Hey; las líneas celulares
de carcinoma colorectal HT-29 Ls180; las líneas
celulares de carcinoma de próstata como DU145; las líneas celulares
de carcinoma gástrico por ejemplo MS; y las líneas celulares de
carcinoma renal como Caki-1. El cáncer de donde se
deriva la célula cancerosa puede ser un carcinoma, linfoma,
blastoma, sarcoma o leucemia. Ejemplos de tipos de cáncer de donde
se puede obtener la célula cancerosa incluyen el cáncer de pulmón,
el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el glioblastoma,
el cáncer cervical, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado, el
cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer
colorectal, el carcinoma de glándulas salivares, el cáncer de
riñón, el cáncer de hígado, el cáncer de próstata, el cáncer de
vulva, el cáncer de tiroides, o el carcinoma hepático.
Preferentemente, la célula cancerosa es una célula de cáncer de
pulmón.
En una realización preferida de la invención, el
procedimiento incluye una etapa de contra-selección
utilizando una célula no cancerosa viva que preferentemente es del
mismo tipo tisular que la célula cancerosa. La
contra-selección puede llevarse a cabo en cualquier
momento, es decir antes, durante o después (o combinaciones de lo
mismo) del rastreo de la librería de fagos de anticuerpos con las
células cancerosas vivas. En la realización preferida, sin embargo,
la contra-selección precede al menos una etapa que
implica una selección contra células cancerosas vivas de interés.
Según la etapa de contra-selección, el fago de
anticuerpo "sustraido" (p.ej., los presentes en un
sobrenadante) se exponen a las células cancerosas vivas. Se
descubrió de forma sorprendente que podrían identificarse los
anticuerpos contra un antígeno compartido por la célula cancerosa y
la célula no cancerosa, a pesar de esta etapa de
contra-selección realizada antes del cribado con la
célula cancerosa de interés. Se anticipó que dicha etapa de
contra-selección puede haber mermado la librería de
fagos de anticuerpos capaces de unirse al antígeno compartido.
Las células no-cancerosas pueden,
por ejemplo, obtenerse quirúrgicamente de un paciente o pueden
obtenerse de algunas o de otras fuentes celulares in vivo de
células, o pueden derivarse de una línea celular
no-cancerosa, dichas líneas celulares son de
disponibilidad pública, p.ej., del ATCC.
Las células a utilizar en el cribado serán a
menudo "adherentes", de forma que se adhieren a la superficie
de una placa de cultivo celular u otra fase sólida en la que se
cultiven. La presente solicitud proporciona un procedimiento
mejorado para desenganchar las células de la superficie en donde
están adheridas y que comprende la utilización de una solución que
no incluya ninguna proteasa y preferentemente comprende EDTA para
desenganchar las células cancerosas. Esto evita la degradación
proteolítica de los antígenos de superficie celular en la etapa de
liberación de tripsina comúnmente utilizada.
Las células cancerosas y
no-cancerosas no se fijan antes de la exposición con
los fagos de anticuerpos en la librería de fagos de anticuerpos. La
utilización de dichas células vivas sirve para conservar los
antígenos de superficie en su estado nativo. Por ello, los
anticuerpos preparados de acuerdo con el presente procedimiento se
unen más probablemente al antígeno en su estado endógeno en un
mamífero y así pueden facilitar un mejor diagnóstico (p.ej.,
diagnóstico in vivo) y utilizarse como anticuerpos
terapéuticos.
Los fagos de anticuerpo de la librería de fagos
de anticuerpos se ponen en contacto con, o se unen a, las células
cancerosas (y opcionalmente con las células
no-cancerosas). Antes de la etapa de unión, se puede
bloquear una alícuota de los fagos de anticuerpo para reducir la
unión inespecífica con las superficies celulares. Dichos fagos de
anticuerpos bloqueados pueden añadirse a las células.
Alternativamente, las células, que se bloquean pueden añadirse,
opcionalmente, a los fagos de anticuerpos. Las células y los fagos
de anticuerpos se ponen en contacto durante un periodo de tiempo
suficiente y en condiciones adecuadas para que se produzca la unión
del fago con los antígenos de superficie celular. Dichas
condiciones pueden determinarse sin demasiada experimentación.
Además, las etapas de cribado pueden repetirse tantas veces como se
desee para lograr la unión entre los antígenos y fagos de
anticuerpos. Las células pueden sedimentarse entre cada etapa de
cribado mediante centrifugación o de otras formas.
La unión de los fagos de anticuerpos o de los
derivados de anticuerpos con las células puede, por ejemplo,
determinarse mediante metodologías como el ELISA, citometría de
flujo e inmunohistoquímica.
En consecuencia, un fago de anticuerpo o el
anticuerpo se selecciona si se une selectivamente a la célula
cancerosa de interés. Dichos anticuerpos "selectivos del
cáncer" pueden someterse a uno o más análisis posteriores. Por
ejemplo, el análisis de los clones puede llevarse a cabo de acuerdo
con procedimientos conocidos (p.ej., mediante enzimas de
restricción, "finger-printing" y/o
secuenciación del DNA). Alternativamente, o adicionalmente, la
selectividad respecto al cáncer de los anticuerpos seleccionados o
de los fagos de anticuerpos puede determinarse comparando la unión
de los anticuerpos o fagos de anticuerpos con las células
cancerosas y las no cancerosas, p.ej., del mismo tipo tisular.
Dicho cribado puede realizarse utilizando las mismas células
cancerosas o no-cancerosas utilizadas para cribar la
librería de fagos, u otras células cancerosas y
no-cancerosas.
El anticuerpo, o anticuerpos seleccionados pueden
ser alterados o modificados como se desee para generar un
anticuerpo especialmente adaptado para la terapia in vivo o
el diagnóstico. Dichas alteraciones pueden implicar uno o más
sustituciones en una o más regiones hipervariables del anticuerpo
para incrementar su afinidad por el antígeno; es decir, el
anticuerpo seleccionado puede ser de "afinidad madurada".
Además, el anticuerpo o el anticuerpo de afinidad madurada puede
fusionarse a, o conjugarse con, un agente citotóxico, enzima
(p.ej., para ADPT, véase más adelante), marcaje detectable, u otro
anticuerpo (para generar un anticuerpo biespecífico). Dichas
alteraciones se discuten con mayor detalle más adelante en la
Sección titulada "Otros Procedimientos para la Generación de
Anticuerpos". Las secuencias de dominio variable del anticuerpo
o del anticuerpo de afinidad madurada pueden fusionarse a una
secuencia de región constante humana para generar una molécula de
anticuerpo mayor, como el Fab, F(ab')2 o anticuerpo intacto,
dependiendo, por ejemplo, de la utilización pretendida del
anticuerpo.
El ácido nucleico que codifica el anticuerpo (que
opcionalmente se ha alterado tal como se explica en el párrafo
anterior) puede aislarse e insertarse en un vector de expresión
recombinante y utilizarse para transformar una célula huésped
adecuada para la expresión del anticuerpo. Ejemplos de células
huésped incluyen las células procariotas (p.ej., E. coli),
las células de levaduras (como Saccharomyces cerevisiae y
Pichia pastoris), las células de mamífero como las células
linfoides y las células de ovario de hámster chino (CHO), o la
células vegetales. El anticuerpo expresado y recuperado de la célula
huésped, puede utilizarse para diversas aplicaciones diagnósticas y
terapéuticas como las discutidas más adelante.
El procedimiento actual facilita la
identificación de un antígeno expresado a niveles elevados en una
primera población celular (generalmente una célula cancerosa)
comparada con una segunda población celular (p.ej., una célula
no-cancerosa del mismo tipo celular que la primera
célula). Por ejemplo, el nivel de expresión del antígeno en la
primera población celular o célula cancerosa puede ser de
aproximadamente dos o cinco veces a aproximadamente 100 a 1000
veces superior al nivel de expresión del antígeno en la segunda
población celular o célula no-cancerosa. Dichos
antígenos pueden ser de utilidad en la terapia o el diagnóstico al
utilizarse antagonistas como anticuerpos, o fármacos de pequeñas
moléculas dirigidas contra éstos. Los anticuerpos dirigidos contra
dichos "antígenos sobre-expresados" pueden
prepararse mediante rastreo de librerías de fagos de anticuerpos
tal como se discutió más adelante, o de acuerdo con otros
procedimientos para la realización de anticuerpos disponibles en la
materia, incluyendo los discutidos más adelante.
Otra ventaja de la presente invención es la
capacidad para expresar fácilmente el ácido nucleico del clon que
codifica el antígeno. Para la expresión del clon del antígeno, se
puede preparar una librería de cDNA, p.ej., de células cancerosas
utilizadas para rastrear una librería de fagos. Los cDNAs así
preparados se expresan en una célula huésped y la expresión de la
proteína deseada puede rastrearse utilizando uno o más anticuerpos
seleccionados de la librería de fagos. De este modo, puede
identificarse y secuenciarse el cDNA que codifica el antígeno.
En el presente ejemplo, un anticuerpo
anti-penta-histidina se utilizó para
unirse, mediante las etiquetas epitópicas de
penta-histidina, a los fragmentos scFv utilizados
para rastrear la expresión del antígeno deseado. La unión
incrementó la avidez por la interacción entre el antígeno scFv y el
antígeno. Además, un anticuerpo anti-ratón se
utilizó para recubrimiento de una placa de ensayo y se unió a las
células unidas al anticuerpo en la placa de ensayo.
Tal como se describió anteriormente, los
procedimientos presentes proporcionan un medio para la
identificación de antígenos expresado a niveles superiores en una
célula comparada con otra. Dichas células pueden, por ejemplo, ser
células cancerosas y el antígeno de interés puede ser un antígeno
de utilidad para dirigir contra una diana concreta anticuerpos
específicos con fines terapéuticos o diagnósticos.
Una vez se ha identificado un antígeno, tal como
se describe aquí, se pueden generar otros anticuerpos dirigidos
contra éstos antígenos mediante rastreo de librerías de fagos de
anticuerpos, tal como se discutió anteriormente, o puede generarse
un anticuerpo mediante otra técnicas como las descritas más
adelante.
En una realización, se generó un anticuerpo
policlonal contra el antígeno de interés. Los anticuerpos
policlonales se preparan preferentemente en animales mediante
inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) del
antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser de utilidad conjugar el
antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la
especie a ser inmunizada, p.ej., la hemocianina de la lapa, la
seroalbúmina, la tiroglobulina bovina, o el inhibidor de la
tripsina de soja utilizando un agente bifuncional o de derivación,
por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida
(conjugación a través de residuos de cisteína),
N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de
lisina), glutaraldehído, anhidrido de succínico, SOCl_{2} o
R^{1}N=C=NR, donde R y R^{1} son grupos alquilo distintos.
Los animales se inmunizan contra el antígeno,
conjugados inmunogénicos, o derivados por combinación, p.ej., 100
\mug o 5 \mug de la proteína o conjugado (para conejos o
ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de
Freund e inyección de la solución intradérmicamente en sitios
múltiples. Un mes más tarde, los animales se volvieron a estimular
con 1/5 a 1/10 de la cantidad original del péptido o conjugado en
adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en
sitios múltiples. De 7 a 14 días más tarde, los animales se
sangraron y se analizó el suero para la titulación de anticuerpos.
Los animales se estimularon de nuevo hasta alcanzar la meseta en la
curva logarítmica de producción de anticuerpos. Preferentemente, el
animal se estimuló con el conjugado del mismo antígeno, pero
conjugado con una proteína y/o a través de un reactivo de unión
cruzada distinta. Los conjugados también se pueden generar en
cultivo de células como proteínas de fusión. También, son adecuados
los agentes agregantes como el alumbre para aumentar la respuesta
inmune.
Los anticuerpos monoclonales se obtuvieron de una
población de anticuerpos esencialmente homogénea, es decir, los
anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos,
excepto por posibles mutaciones que suceden de forma natural y que
pueden estar presentes en cantidades menores. Por ello, el
modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como
no perteneciente a una mezcla de anticuerpos discretos.
Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden
generarse utilizando el procedimiento del hibridoma descrito por
primera vez por Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o pueden
generarse mediante procedimientos de DNA recombinantes (patente
americana U.S. 4.816.567).
En el procedimiento del hibridoma, un ratón u
otro animal huésped, como el hámster, se inmuniza tal como se
describió anteriormente para estimular linfocitos que produzcan o
sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente
a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los
linfocitos se inmunizan in vitro. Los linfocitos se fusionan
a continuación con las células de mieloma utilizando un agente de
fusión adecuado, como el polietilén glicol, para formar una célula
de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, pág. 59-103, Academic Press (1986)).
Las células de hibridoma así preparadas se
siembran y crecen en un medio de cultivo adecuado que contiene
preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o
la supervivencia de las células de mieloma parentales no
fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales
carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa
(HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para el hibridoma incluirá
típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), que
previene el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Las células de mieloma preferidas son aquellas
que se fusionan eficientemente, soportan niveles elevados de
producción estable de anticuerpo por las células productoras de
anticuerpos seleccionados, y son sensibles a un medio como el HAT.
Entre las líneas celulares que se utilizan, las de mieloma son las
preferidas, como por ejemplo las derivadas de tumores de ratón
MOPC-21 y MPC-11 disponibles del
Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA y
las células SP-2 o
X-63-Ag8-653
disponibles del American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland USA. Las líneas celulares de mieloma humano y de
heteromieloma ratón-humano también se han descrito
para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J.
Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody
Production Techniques and Applications, pág. 51-63
Marcel Dekker, Inc., New york (1987).
El medio de cultivo en donde las células de
hibridoma se crecen se analiza para la producción de anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la
especificidad de unión de anticuerpos monoclonales producidos por
células de hibridomas se determina por inmunoprecipitación o
mediante ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo
(RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).
La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal
puede, por ejemplo, determinarse por el análisis de Scatchard de
Munson y col., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Después de identificar las células de hibridomas
que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o
actividad deseadas, se pueden subclonar los clones mediante
procedimientos de dilución limitante y crecer mediante
procedimientos estándares (Goding, Monoclonal Antibodies:
Principles and Practice, pág. 59-103, Academic
Press 81986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito
incluye, por ejemplo, el medio DMEM, o el RPMI-1640.
Además, las células de hibridomas pueden crecer in vivo como
tumores de ascitas en un animal.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones se separan de forma adecuada del medio de cultivo, líquido
ascítico, o suero mediante procedimientos de purificación de
inmunoglobulinas convencionales, como por ejemplo, proteína
A-Sepharos, cromatografía de hidroxiapatita,
electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
El DNA que codifica anticuerpos monoclonales se
aísla fácilmente y se secuencia utilizando procedimientos
convencionales (p.ej., utilizando sondas oligonucleotídicas que son
capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas
ligera y pesada de los anticuerpos murinos). Las células de
hibridoma sirven como una fuente de referencia de estos DNAs. Una
vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, y
luego transfectarse en células huésped como por ejemplo E.
coli, células COS de mono, células de ovario de hámster chino
(CHO), o células de mieloma que de otra manera no producirían
proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de
revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del DNA
codificante del anticuerpo incluyen Skerra y col., Curr. Opinion in
Immunol., 5:256-262 (1993) y Plückthum, Immunol
Revs. 130:151-188 (1992).
El DNA puede modificarse, por ejemplo, mediante
sustitución de la secuencia codificante de los dominios constantes
de cadena ligera y pesada en lugar de las secuencias murinas
homólogas (patente americana U.S. 4.816.567; Morrison y col., Proc.
Natl. Acad. Sci., 81:6851 (1984), o mediante unión covalente con la
secuencia codificante de la inmunoglobulina de toda o parte de la
secuencia codificante de un polipéptido no inmunoglobulina.
Típicamente dichos polipéptidos no
inmunoglobulina se sustituyen por dominios constantes de un
anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio
de combinación antigénica de un anticuerpo para crear un anticuerpo
bivalente quimérico, que comprende un sitio de combinación
antigénica con especificidad de unión por un antígeno y otro sitio
de combinación antigénica que tiene especificidad por un antígeno
distinto.
Los procedimientos para la humanización de
anticuerpos no humanos son bien conocidos en la materia.
Preferentemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos
aminoacídicos introducidos de una fuente que no es humana. Estos
residuos aminoacídicos no humanos a menudo son referidos como
residuos de "importación", típicos de un dominio variable
"de importación". La humanización puede realizarse
esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores
(Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann
y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y
col., Science, 239:1534-1536 (1988)), mediante
sustitución de CDRs o secuencias CDR humanas por las secuencias
correspondientes de un anticuerpo de roedor. De acuerdo con ello,
los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos
(patente americana, U.S. 4.816.567), en donde menos de un dominio
variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia
correspondiente de una especie no-humana. En la
práctica, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en
donde los residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR se
sustituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos de
roedor.
La elección de dominios variables humanos,
ligeros o pesados, para utilizar en la generación de anticuerpos
humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De
acuerdo con el procedimiento denominado "del mejor ajuste", la
secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se hibrida
con la librería entera de secuencias de dominio variable humano
conocidas. La secuencia humana más cercana a la del roedor se
acepta como región de entramado humana (FR) para el anticuerpo
humanizado (Sims y col., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia y
col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Otro procedimiento utiliza una
región de entramado particular derivada de la secuencia consenso de
todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas
ligera o pesada. La misma región de entramado puede utilizarse para
diversos anticuerpos humanizados distintos (Carter y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol.,
151:2623 (1993)).
Es además importante que los anticuerpos se
humanicen con retención de una elevada afinidad por el antígeno y
otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo,
de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos
humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de
secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales
utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y
humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están
generalmente disponibles y son familiares a los expertos en la
materia. Existen programas informáticos disponibles que ilustran y
presentan las estructuras conformacionales tridimensionales
probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas
seleccionadas. El análisis de dichas estructuras permite analizar la
posible función de los residuos en el funcionamiento de la
secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de
residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina
candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos
FR pueden seleccionarse y combinarse a partir de las secuencias
receptoras y de importación, para que puedan conseguirse las
características deseadas del anticuerpo, como por ejemplo una
afinidad acentuada hacia el antígeno diana. En general, los residuos
CDR están directa y esencialmente implicados en influenciar la
unión con el antígeno.
Alternativamente, actualmente es posible producir
animales transgénicos (p.ej., ratón) que sean capaces, tras
inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos
humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por
ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen (JH) de
la región de unión de cadena pesada del anticuerpo en ratones
quiméricos y de línea germinal da como resultado la inhibición
completa de la producción de anticuerpos endógenos. La
transferencia del reordenamiento de genes de inmunoglobulina de
línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal
dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el
estímulo del antígeno. Véase, p.ej., Jakobovits y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits y col., Nature,
362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in
Immuno., 7:33 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden
derivarse de librerías de expresión en fagos (Hoogenboom y col., J.
Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol.,
222:581-597 (1991)).
Se han desarrollado diversas técnicas para la
producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos
fragmentos se derivan de la digestión proteolítica de anticuerpos
intactos (véase, p.ej., Morimoto y col., Journal of Biochemical and
Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y
col., Science, 229:81 (1985). Sin embargo, estos fragmentos ahora
pueden producirse directamente mediante recombinación de células
huésped. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse
de librerías de fagos de anticuerpos tal como se discutió
anteriormente. Alternativamente, se pueden recuperar fragmentos
Fab'-SH de E. coli y acoplarse químicamente
para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Biol.
Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otra
aproximación, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse
directamente del cultivo de células huésped recombinante. Otras
técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán
evidentes para un experto en la materia. En otras realizaciones, el
anticuerpo de elección es un fragmento de una sola cadena (scFv).
Véase la patente internacional WO 93/16185.
Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que
tienen especificidades de unión por al menos dos epitopos
distintos. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a epitopos
distintos del antígeno de interés. Alternativamente, un brazo que
se une al antígeno de interés puede combinarse con un brazo que se
une a una molécula activadora de un leucocito como una molécula
receptor de célula T (p.ej., CD2 o CD3), o receptores Fc para IgG
(Fc\gammaR), como Fc\gammaRI (CD64), Fc\gammaRII (CD32) y
Fc\gammaR (CD16), de modo que los mecanismos de defensa celular se
focalizan en expresar el antígeno de interés. Los anticuerpos
biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes
citotóxicos para las células que expresen el antígeno. Estos
anticuerpos poseen un brazo de unión antigénica y un brazo que se
une al agente citotóxico (p.ej., saporina,
anti-interferon-\gamma, alcaloide
vinca, cadena A de la ricina, metotrexato o hapteno isótopo
radioactivo). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como
anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos
(p.ej., anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}).
Los procedimientos para producir anticuerpos
biespecíficos son conocidos en la materia. La producción tradicional
de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la
compresión de dos pares de cadena ligera-pesada de
inmunoglobulina, y en donde ambas cadenas tienen especificidades
distintas (Milstein y col., Nature 305:537-539
(1983)). Debido al reordenamiento aleatorio de las cadenas ligera y
pesada de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen
una mezcla potencial de 10 moléculas distintas de anticuerpo, de
las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta.
La purificación de la molécula correcta, que generalmente se produce
por etapas de cromatografía de afinidad, es a veces engorrosa y el
rendimiento es bajo. Procedimientos similares se describen en la
patente internacional WO 93/08829 y en Traunecker y col., EMBO J.,
10:3655-3659 (1991).
De acuerdo con una aproximación distinta, los
dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión
deseadas (sitios de combinación
anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias
de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente
se realiza con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra y las
regiones CH2 y CH3. Es preferible que la primera región constante
de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para la
unión de cadena ligera, esté presente en al menos una de las
fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se inserten en vectores de expresión separados y se
co-transfecten en un organismo huésped adecuado.
Esto proporciona una gran flexibilidad en el ajuste de proporciones
mutuas de los fragmentos de los tres polipéptidos en las
realizaciones cuando se utilizan proporciones desiguales de las tres
cadenas polipeptídicas en la construcción, y se facilitan
rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar secuencias
codificantes para dos o tres cadenas polipeptídicas en un vector de
expresión, cuando la expresión de al menos dos cadenas
polipeptídicas en iguales proporciones da como resultado
rendimientos elevados o cuando las proporciones no tienen una
significación particular.
En una realización preferida de esta
aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una
cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera
especificidad de unión en un brazo y una pareja de cadena
ligera-pesada de inmunoglobulina híbrida (que
proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo.
Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del
compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de
inmunoglobulina no deseadas, al igual que la presencia de una cadena
ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula
biespecífica proporciona una vía de separación fácil. Esta
aproximación se describe en la patente internacional WO 94/04690.
Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos,
véase por ejemplo Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210
(1986).
De acuerdo con otra aproximación descrita en la
patente internacional WO 96/27011, la interfície entre un par de
moléculas de anticuerpo puede diseñarse para maximizar el
porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo de células
recombinantes. La interfície preferida comprende al menos una parte
del dominio CH3 de un dominio constante de un anticuerpo. En este
procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos de la
interfície de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con
cadenas laterales más largas (p.ej., tirosina o triptófano).
"Cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar al de
la cadena lateral larga se crean en el interfície de la segunda
molécula del anticuerpo, reemplazando cadenas laterales
aminoacídicas grandes por otras más pequeñas (p.ej., alanina o
treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el
rendimiento del heterodímero respecto a otros productos finales no
deseados como los homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos incluyen los
anticuerpos unidos o "heteroconjugado". Por ejemplo, uno de
los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con la
avidina, el otro con la biotina. Dichos anticuerpos, por ejemplo,
han sido propuestos para dirigir las células inmunes contra las
células no deseadas (patente americana U.S. 4.676.980), y para el
tratamiento de la infección por VIH (patentes internacionales WO
91/00360, WO 92/200373 y la patente europea EP 03089). Los
anticuerpos heteroconjugados pueden generarse utilizando cualquiera
de los procedimientos de unión adecuados. Los agentes de unión
adecuados son bien conocidos en la materia, y se describen en la
patente americana U.S. 4.676.980, junto con diversas técnicas de
unión.
Las técnicas para generar anticuerpos
biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se
describen en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos
biespecíficos pueden prepararse utilizando uniones químicas. Brennan
y col., Science, 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde
los anticuerpos intactos se cortan proteolíticamente para generar
fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos se reducen en
presencia del ditiol del arsenito sódico o agente formador de
complejos para estabilizar los ditioles colindantes y evitar la
formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab'
generados se convierten en derivados de tionitrobenceno (TNB). Uno
de los derivados del Fab'-TNB se reconvierte a
continuación a Fab'-tiol mediante reducción con
mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro
derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo
biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden
utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de
enzimas.
Progresos recientes han facilitado la
recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E.
coli, los cuales pueden acoplarse para formar anticuerpos
biespecíficos. Shalaby y col., J. Exp. Med.,
175:217-225 (1992) describen la producción de una
molécula F(ab')_{2} de anticuerpo biespecífico humanizado.
Cada fragmento Fab' se secretó separadamente en E. coli y se
sometió a un acoplamiento químico dirigido in vitro para
formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así
formado fue capaz de unirse a las células que
sobre-expresaban el receptor ErbB2 y a las células
humanas normales T, así como provocar la actividad lítica de los
linfocitos citotóxicos humanos contra las dianas de tumor de
mama.
También se han descrito varias técnicas para
producir y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se
han producido anticuerpos biespecíficos mediante cremalleras de
leucina. Kosteiny y col., J. Immunol. 148(5):
1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de
leucina de las proteínas Fos y Jun se encuentran unidos a las
porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los
anticuerpos homodiméricos se reducen a la región bisagra para formar
monómeros y después se re-oxidan para formar
anticuerpos heterodiméricos. El procedimiento puede también
utilizarse para la producción de anticuerpos homodiméricos. La
tecnología de los "diacuerpos" descrita por Hollinger y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448
(1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir
fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden
un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio
variable de cadena ligera (VL) por un conector demasiado corto para
permitir el emparejamiento entre dos dominios de la misma cadena.
Por ello, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a
emparejar con los dominios VL y VH complementarios de otro
fragmento, formando por tanto dos sitios de unión al antígeno. Otra
estrategia consiste en producir fragmentos de anticuerpos
biespecíficos utilizando dímeros de cadena única Fv (sFv), tal como
se ha descrito, por ejemplo, por Gruber y col., J. Immunol.
152:5368 (1994).
Se han contemplado anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, se hanpreparado anticuerpos triespecíficos
Tutt y col., J. Immunol. 147:60(1991).
Puede desearse modificar el anticuerpo de la
invención con respecto a la función efectora de manera que se
aumente la efectividad del anticuerpo en, por ejemplo, el
tratamiento del cáncer. Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden
introducirse en la región Fc, permitiendo por tanto la formación de
enlaces disulfito intercatenarios en esta región. De esta manera,
el anticuerpo homodimérico generado, puede tener una capacidad de
internalización aumentada y/o aumentar la respuesta de muerte
celular mediada por el complemento y de toxicidad celular
dependiente de la unión del anticuerpo (ADCC). Véase Caron y col.,
J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes
B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los
anticuerpos homodímericos que aumentan la actividad antitumoral
pueden también prepararse utilizando conectores cruzados
heterobifuncionales tal como se ha descrito en Wolff y col.
Cancer Research 53:2560-2565 (1993). De
forma alternativa, un anticuerpo puede ser diseñado con dos
regiones Fc y por tanto puede aumentarse la capacidad de lisis vía
complemento y ADCC. Véase Stevenson y col. AntiCancer Drug Design
3:2.19-329 (1989).
La invención también está relacionada con
inmunoconjugados que incluyen anticuerpos conjugados con un ajente
citotóxico tal como un agente quimioterapéutico o toxina (p.ej.,
una molécula de toxina pequeña o una toxina activa enzimáticamente
de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo
fragmentos y/o vitaminas o un isotipo radioactivo (p.ej.,
radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la
generación de tales inmunoconjugados se han descrito más arriba.
Los conjugados de un anticuerpo y una o más
toxinas pequeñas, como una caliqueamicina, maitansina (patente
americana US No. 5.208.020) tricoteno y CC1065, se contemplan en la
presente invención.
En una realización preferida de la presente
invención, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de
maitansina (p.ej., aproximadamente de 1 a 10 moléculas de
maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina puede, por
ejemplo, ser convertida a Mai-SS-Me
que puede reducirse a Mai-SH3 y reaccionar con
anticuerpos modificados (Chari y col., Cancer Research 52:
127-131 (1992)) para generar un inmunoconjugado
maitansinoide del anticuerpo.
Otro inmunoconjugado de interés incluye un
anticuerpo conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La
familia de antibióticos caliqueamicináceos es capaz de producir
roturas en el DNA de doble cadena en concentraciones inferiores a
los picomoles. Los análogos estructurales de la caliqueamicima que
pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a éstos, la
\gamma_{1}^{1}, \alpha_{2}^{1}, \alpha_{3}^{1},
N-acetil-\gamma_{1}^{1}, PSAG
y \theta_{1}^{1}(Himman y col., Cancer Research
53: 3336-3342 (1993) y Lode y col., Cancer
Reserach 58: 2925-2928 (1998)) Véase también las
patentes americanas US 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586 y
5.773.001.
Toxinas activas enzimáticamente y fragmentos de
éstas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la difteria,
fragmentos activos de no unión de la toxina de la difteria, cadena
A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A
de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina,
la cadena A de la alfa sarcina; las proteínas de Aleurites
fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de
Phytolaca americana (PAP, PAP11 y PAP-S), el
inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor
de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogeliina,
restrictocina, fenomieina, enomicina y tricotecenos. Véase, por
ejemplo, la patente internacional WO 93/21232 publicada el 28 de
Octubre de 1993.
La presente invención además contempla un
inmunoconjugado formado entre el anticuerpo y un compuesto que
tienen actividad nucleotídica (p.ej. una ribonucleasa o una
endonucleasa de DNA como una desoxirribonucleasa; DNAasa).
Una variedad de isótopos radioactivos se
encuentran disponibles para la producción de radioconjugados con
anticuerpos anti-DAF. Los ejemplos incluyen
At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188},
Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} e isótopos radioactivos de Lu.
Pueden producirse conjugados de anticuerpos y
agentes citotóxicos utilizando una variedad de proteínas
bifuncionales conjugadas con agentes como el
N-succinimidil-3-(-2-piriditiol)
propionato (SPDP),
succinimidil-4-(-N-maleimidometil)
ciclohexiamo-1-carboxilato,
iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como
dimetil adipimidato HCl), ésteres activos (como disuccinimidil
suberato), aldehidos (como el glutaraldehido), compuestos
bis-azido (como el bis
(p-azidobenzoil)hexanediamina), derivados de
bis-diazonium (como el
bis-(p-dip-diazoniumbenzonil)-etilenodiamina),
diisocianatos (como tolieno 2, 6-diisocianato) y
compuestos de fluorina bis-activos (como
1,5-difluoro-2,
4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina
como la ricina puede prepararse tal como se ha descrito en Vizetta
y col., Science 238: 1098 (1987). El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietileno
triaminopentaacético (MX-DTPA) marcado con
carbono-14, es un ejemplo de agente quelante para
la conjugación de radionucleótidos a un anticuerpo. Véase la
patente internacional WO94/11026. El conector puede ser un
"conector extraible" que facilite la liberación del fármaco
citotóxico en la célula. Por ejemplo, pueden utilizarse conectores
ácido lábiles, sensibles a peptidasa y conteniendo dimetilo o
disulfito (Chari y col., Cancer Research 52:
127-131 (1992)).
De forma alternativa, una proteína de fusión que
incluya el anticuerpo y el agente citotóxico puede producirse,
p.ej., por técnicas recombinantes o de síntesis peptídica.
En otra realización, el anticuerpo puede ser
conjugarse con un "receptor" (como la estreptavidina) para su
utilización en una pre-señalización del tumor, donde
el anticuerpo conjugado con el receptor se administra a un
paciente, seguido de la eliminación de la circulación del conjugado
no unido mediante un agente clarificador y la administración de un
ligando (p.ej., avidina) que está conjugado con agente citotóxico
(p.ej., radionucleótidos).
Los anticuerpos descritos aquí, pueden también
formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen
anticuerpos se preparan por procedimientos conocidos en la materia,
descritos en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:
3688 (1985): Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
4030 (1980) y patentes americanas US 4.485.045 y 4.544.545. Los
liposomas con un tiempo de circulación aumentado se describen en la
patente americana US 5.013.556.
Particularmente útiles son los liposomas que se
generan por el procedimiento de evaporación en fase inversa con una
composición lipídica que incluye fosfatidilcolina, colesterol y
derivada con PEG a fosfatidiletanolamina (PEG-PE).
Los liposomas se filtran a través de filtros de un tamaño de poro
definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los
fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden
conjugarse con los liposomas, tal como se describe en Martin y
col., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)
mediante una reacción de intercambio de disulfito. Un agente
quimioterapéutico se incluye de manera opcional en el liposoma.
Véase Gabizon y col., J. National Cancer Inst.
81(19)1484 (1989).
Los anticuerpos de la presente invención pueden
utilizarse en la Terapia ADEPT (Antibody Dependent Enzyme Mediated
Prodrug Therapy) por conjugación del anticuerpo con una enzima
activadora de un compuesto químico que convierte al profármaco
(p.ej., peptidil, un agente quimioterapético, véase la patente
internacional WO81/01145) en un fármaco activo anticancerígeno.
Véase por ejemplo la patente internacional WO 88/07378 y la patente
americana US 4.975.278.
El componente enzimático del inmunoconjugado
adecuado para ADEPT implica una enzima capaz de activar el
profármaco de manera para convertirlo en la forma citotóxica más
activa.
Las enzimas adecuadas para el procedimiento de la
invención incluyen, pero no se limitan, la fosfatasa alcalina para
la conversión de profármacos que contienen fosfato en sus formas
activas libres; la arilsulfatasa para la conversión del profármaco
que contiene sulfato en sus formas activas libres, la citosina
deaminasa para convertir la 5-fluorocitosina no
tóxica en el compuesto anticancerígeno
5-fluoroacilo; las proteasas como la proteasa de
Serratia, la termolisina, la subtilisina, la
carboxipeptidasas y las catepsinas (como la catepsina B y L) que
son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en su
forma libre; las D-alanilcarboxipeptidasas, para
convertir compuestos que contienen sustituyentes de
D-aminoácidos; las peptidasas hidrolíticas de
carbohidratos como la beta-galactosidasa y la
neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en sus
formas libres; la beta-lactamasa para convertir
fármacos derivados con beta-lactamas en sus formas
libres,; y las amidasas de penicilina como la penicilina V amidasa
o la penicilina G amidasa, útiles para convertir en su forma libre,
compuestos modificados en sus nitrógenos del grupo amino con grupos
fenoxiacetil o fenilacetil respectivamente. De forma alternativa,
los anticuerpos con actividad enzimática que son conocidos también
en este campo como "abzimas" se pueden utilizar para convertir
profármacos de la invención en formas activas libres (véase p.ej.,
Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Pueden
prepararse conjugados de abzimas-anticuerpos, tal
como se ha descrito aquí para la liberación de la abzima a una
población de células tumorales.
Las enzimas de esta invención pueden unirse
covalentemente a los anticuerpos por técnicas bien conocidas en la
materia, como el uso de reactivos de unión heterobifuncionales
discutidos más arriba. De forma alternativa, pueden construirse
utilizando técnicas de DNA recombinante bien conocidas en la materia
(véase p.ej., Neuberger y col., Nature 312: 604-608
(1984)), las proteínas de fusión que incluyen al menos la región
unión antígenica de un anticuerpo de la invención, conectada, por
lo menos, a una parte funcionalmente activa de una enzima de la
invención.
El anticuerpo puede también utilizarse en ensayos
diagnósticos, p.ej., para detectar la expresión de un antígeno de
interés en células específicas, tejidos o suero.
Para aplicaciones diagnósticas, el anticuerpo
normalmente se marcará con una porción detectable. Se encuentran
disponibles numerosos marcajes, los cuales se agrupan generalmente
en las siguientes categorías:
(a) Radioisótopos como ^{35}S, ^{14}C,
^{125}I, ^{3}H y ^{131}I. El anticuerpo puede marcarse con
los radioisotopos mediante las técnicas descritas en el Current
Protocols en Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen y col., Ed.
Wiley-Inter-science, New York, New
York, Pubs, (1991), y la radioactividad puede medirse mediante
contadores de centelleo.
(b) Marcadores fluorescentes como son los
quelatos de metal alcalino-térreo (quelatos de
europium), o de la fluoresceína y sus derivados, la rodamina y sus
derivados, el dansyl, la Lissamina, la ficoeritrina y el Texas Red,
están disponibles. Los marcadores fluorescentes pueden conjugarse,
por ejemplo, con el anticuerpo mediante las técnicas descritas en
el Current Protocols in Immunology, supra. La
fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro.
(c) Varios marcadores
enzima-sustrato se encuentran disponibles y la
patente americana U.S. 4275.149 proporciona una revisión de algunos
de ellos. La enzima generalmente cataliza una alteración química
del substrato cromogénico que puede ser cuantificado mediante
diversas técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio
de color en un sustrato que puede cuantificarse
espectrofotométricamente. De forma alternativa, la enzima puede
alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las
técnicas para cuantificar el cambio de fluorescencia se han descrito
más arriba. El sustrato quimioluminiscente se excita
electrónicamente por una reacción química y después emite luz que
puede cuantificarse mediante un quimioluminómetro (por ejemplo), o
puede donar su energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de
marcadores enzimáticos incluyen las luciferasas (p.ej., la
luciferasa de la luciérnaga y la luciferasa bacteriana; patente
americana U.S. 4.3737.456), la luciferina
2-3-dihidroftalazinedionas, la
malato deshidrogenasa, la ureasa, la peroxidasa como la peroxidasa
de rábano (HR-PO), la fosfatasa alcalina, la
\beta-galactosidasa, la glucoamilasa, la lisozima,
las sacárido oxidasas (p.ej., la glucosa oxidasa, la galactosa
oxidasa y la glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa), las oxidasas heterocíclicas (como la uricasa y la
xantina oxidasa), la lactoperoxidasa, la microperoxidasa y
similares. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se
describen en O'Sullivan y col., Methods for the Preparation of
Enzyme-Antivbody Conjugates for use in Enzyme
immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langons & H
Can Vunakis), Academic press New York, 73:147-166
(1981).
Los ejemplos de combinaciones de
enzima-sustrato incluyen, por ejemplo:
(i) la peroxidasa de rábano (HRPO) con la
peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de
hidrógeno oxida un precursor con color (p.ej., la ortofenilen
diamina (OPD), o el 3, 3', 5, 5'-tetrametil
hidrocloruro (TMB)).
(ii) la fosfatasa alcalina (AP) con el
para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico;
y
(iii) la
\beta-D-galactosidasa
(\beta-D-Gal) con un sustrato
cromogénico (p.ej., al
p-nitrofenil-\beta-D-galactosidasa),
o un sustrato fluorogénico, como la
4-metilumberiferil-\beta-D-galactosidasa.
Numerosas otras combinaciones de
enzima-sustrato se encuentran disponibles paralos
expertos en la materia. Para una revisión general, véanse las
patentes americanas U.S. 4.275.149 y 4.318.980.
Algunas veces, el marcaje se conjuga
indirectamente con el anticuerpo. El especialista en la materia será
consciente de los diversos procedimientos existentes para lograrlo.
Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina; y
cualquiera de las tres categorías de marcajes mencionadas más arriba
puede conjugarse con avidina o viceversa. La biotina se une
selectivamente a la avidina y por tanto, el marcaje puede
conjugarse con el anticuerpo indirectamente. Alternativamente, para
conseguir la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo,
el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno (p.ej., la
digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores mencionados
más arriba se conjuga con el anticuerpo
anti-hapteno (p. ej., el anticuerpo
anti-digoxina). De este modo, puede conseguirse la
conjugación indirecta del marcaje y el anticuerpo.
En otra realización de la invención, el
anticuerpo no necesita tener un marcaje y su presencia puede ser
detectada mediante otro anticuerpo marcado que se le una.
El anticuerpo de la presente invención puede
utilizarse en cualquier procedimiento de ensayo conocido, tal como
en ensayos de unión competitiva, sándwich directo o indirecto, y
ensayos de immunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A
Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.
1987).
El anticuerpo puede también ser utilizado en
ensayos diagnósticos in vivo. En general, el anticuerpo se
marca con un radionucleótido (como In^{111}, Tc^{199},
C^{14}, I^{125}, H^{3}, P^{32} o S^{35}) de manera que el
antígeno o las células que lo expresan puedan ser localizadas
mediante inmunoescintografía.
De acuerdo con la presente invención, las
formulaciones terapéuticas de los anticuerpos utilizados se preparan
para su almacenamiento mezclando un anticuerpo con el deseado grado
de pureza con un vehículo, excipiente o estabilizante farmacéutico
aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{th}
edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones
liofilizadas de soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o
estabilizantes no son tóxicos para los receptores a las dosis y
concentraciones empleadas, e incluyen tampones como el fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyen el
ácido ascórbico y la metionina; los conservantes (como el cloruro
de octadecidimetil benzilamonio, el cloruro de hexametonio, el
cloruro de benzalkonio, el cloruro de benzetonio, el fenol, el butil
o el bencil alcohol, los alquil parabenos como el metil o el propil
paraben; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol; el
3-pentanol y el m-cresol);
polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos);
proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las
inmuglobulinas; polímeros hidrofílicos como la
polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la
asparraguina, la histidina, la arginina o la lisina; los
monosacáridos, los disacaráridos y otros carbohidratos incluyendo
la glucosa, la manosa o las dextrinas; los agentes quelantes como
el EDTA; los azúcares como la sacarosa, el manitol, la trehalosa
o el sorbitol; los iones formadores de sales como el sodio; los
complejos de metales (p.ej., complejos
proteicos-Zn); y/o los tensoactivos como el
TWEEN^{TM}, el PLURONICS™ o el polietilén glicol (PEG). Las
formulaciones de anticuerpos liofilizados preferidas se encuentran
descritas en la patente internacional WO 97/04801. También se
contemplan formulaciones líquidas de anticuerpos, p.ej., como las
descritas en la patente internacional WO98/56418.
Las formulaciones aquí descritas pueden también
incluir más de un compuesto activo según sea necesario para la
indicación particular de tratamiento y preferentemente aquellas
formulaciones con actividades complementarias no produzcan efectos
adversos unas con otras. Por ejemplo, puede requerirse proporcionar
anticuerpos que se unan a EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 o al factor de
crecimiento endotelial vascular (VEGF) en una formulación.
Alternativa, o adicionalmente, la composición puede incluir un
agente citotóxico, una citocina o un agente inhibidor del
crecimiento. Estas moléculas han de presentarse en una combinación
y cantidad adecuadas que sean efectivas para el propósito
pretendido.
Los ingredientes activos también pueden estar
atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de
coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, con
hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de
poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación
de fármacos coloidales (por ejemplo liposomas, microsferas de
albúmina, microemulsiones, nano-partículas y
nanocápsulas), o en macroemulsiones. Estas técnicas están descritas
en Remington's Pharmaceutical Sciences 16^{th} edition, Osol, A.
Ed. (1960).
Las formulaciones para ser utilizadas en la
administración in vivo, deben ser estériles. Esto se
consigue por filtración a través de membranas estériles.
También pueden prepararse preparaciones de
liberación sostenida. Ejemplos de éstas incluyen las matrices
semipermeables o los polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen
el anticuerpo, las matrices, tienen formas de p.ej., películas, o
microcápsulas. Ejemplos de matrices para la
liberación-sostenida incluyen los poliestirenos,
los hidrogeles (por ejemplo, el
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
o el poli(vinilalcohol), los poliláctidos (patente americana
U.S. 3.773.919), los copolímeros degradables de ácido láctico-ácico
glicólico como LUPRON DEPOT™ (microsferas inyectables compuestas de
copolímero de ácido láctico y ácido glicólico y acetato de
leuprolido), y el ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Se contempla que de acuerdo con la presente
invención, los anticuerpos puedan utilizarse para el tratamiento de
varias condiciones incluyendo tumores benignos o malignos (p.ej.
renales, de hígado, de riñón, de vejiga, de mama, gástricos, de
ovario, colorectales, de prótasta, pancreáticos, de pulmón, de
vulva, de la tiroides, carcinomas hepáticos; sarcomas,
glioblastomas y varios tumores de cabeza y cuello), leucemias y
patologías malignas linfoides, otros trastornos neuronales,
gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares,
macrofagales, epiteliales, estromales y blastocoéticos, y
desórdenes inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos.
La presente invención proporciona un
procedimiento para el tratamiento del cáncer de pulmón (incluyendo
el cáncer de pulmón de células pequeñas, y el cáncer de pulmón de
célula no pequeña, p.ej. el carcinoma de pulmón de células grandes,
el adenocarcinoma de pulmón y el carcinoma de pulmón de células
escamosas) que comprende administración de cantidades
terapéuticamente efectivas de un anticuerpo que se dirige contra, o
que se une específicamente a DAF. Opcionalmente, dicho anticuerpo
está conjugado con, o fusionado a un agente citóxico. El
procedimiento puede también implicar la
co-administración de otro agente adecuado en el
tratamiento del cáncer de pulmón, tal como uno o más agentes
quimioterapétuicos (p.ej., la navelbina, la gemcitabina o un
taxoide, el carboplatino, el cisplatino, el etoposido, la
ciclosfoosfamida, la mitomicina o la vimblastina) y/o un anticuerpo
adicional (como el anticuerpo anti-ErbB2, un
anticuerpo anti-factor angiogénico, un anticuerpo
anti-mucina o un anticuerpo dirigido contra un
epitopo diferente de DAF, etc.) y/o otro(s) agente(s)
citotóxico(s) o citocina(s). Un "factor
angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el
desarrollo de los vasos sanguíneos. El factor angiogénico preferido
aquí, es el factor de crecimiento endotelial vascular o VEGF. Su
co-administración incluye el tratamiento con agentes
adicionales al paciente antes o simultáneamente con otras
formulaciones (p.ej., una o dos formulaciones separadas, o mediante
la administración de 2 o más agentes al paciente mediante la vía
i.v., etc.) o después de la administración del anticuerpo
anti-DAF.
Los anticuerpos de la invención se administran a
pacientes humanos de acuerdo con procedimientos conocidos, como la
administración intravenosa (i.v.) como un bolo o la contínua
infusión durante un período de tiempo, por vía intramuscular,
intraperitoneal, intracerebrospinal, subcutánea, intraarticular,
intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. Se
prefiere la administración intravenosa del anticuerpo.
El tratamiento de la presente invención puede
implicar la administración combinada de un anticuerpo y un agente
quimioterapéutico. La administración combinada incluye la
co-administración, mediante formulaciones
separadas, de una única formulación farmacéutica y la
administración consecutiva en cualquier orden, preferentemente
durante un período de tiempo en el que ambos (o todos) los agentes
activos ejerzan sus actividades biológicas simultáneamente. Los
programas de la preparación y dosificación de los agentes
quimioterapéuticos se desarrollan según las instrucciones
proporcionadas por el fabricante o se determinan empíricamente por
parte de un especialista. Los programas de preparación y
dosificación para dicha quimioterapia también se encuentran
descritos en Chemoterapy Service Ed., M.C. Perry Williams &
Wilkins, Baltimore MD (1992). El agente quimioterapéutico se puede
administrar antes, después, o simultáneamente a la administración
del anticuerpo. El anticuerpo puede combinarse con un compuesto
anti-estrógenico como el tamoxifeno o una
anti-progesterona como la onapristona (véase la
patente europea E.P. 616,812) en dosificaciones conocidas para cada
molécula.
Puede ser deseable administrar también
anticuerpos contra antígenos asociados al tumor, como los
anticuerpos que se unen al EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4 o VEGF. Algunas
veces, puede resultar beneficioso administrar también una o más
citocinas al paciente.
El paciente también puede someterse a terapia con
radiación junto con la administración del anticuerpo.
Para la prevención o el tratamiento de la
enfermedad, la dosificación adecuada del anticuerpo dependerá del
tipo de enfermedad a tratar, tal como se ha descrito más arriba, de
la gravedad y curso de la enfermedad, del propósito de
administración del anticuerpo: si preventivo o terapéutico, de la
terapia previa, de la historia clínica y la respuesta al
anticuerpo, así como del criterio del médico que incidirá en la
dosificación. El anticuerpo puede administrarse al paciente en una
sola toma o durante una serie de tratamientos.
Dependiendo del tipo y gravedad de la enfermedad,
de 1 \mug/kg a 15 mg/kg aproximadamente (p.ej.,
0,1-20 mg/kg) de anticuerpo, se consideran una dosis
inicial candidata para la administración al paciente, en una o más
administraciones separadas o por infusión contínua. Una dosificación
diaria normal puede estar en el intervalo de 1 \mug/kg a 100
mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados más arriba. En
la administración repetida durante varios días o prolongada,
dependiendo de la condición, el tratamiento se prolonga hasta la
supresión de los síntomas. Otros regímenes de dosificación también
pueden ser útiles. El progreso de esta terapia se controla
fácilmente por las técnicas y ensayos convencionales.
La invención se comprenderá más completamente por
los ejemplos siguientes, sin que por ello, los ejemplos representen
una limitación del ámbito de la invención.
En el presente ejemplo, se utiliza una librería
grande de fagos de fragmentos Fv(sc) de una sola cadena
desnudos y humanos para la búsqueda de antígenos asociados al tumor
por selección con una línea celular de adenocarcinoma de pulmón,
1264 y contra-selección con una línea celular
epitelial bronquial no tumoral BEAS-2B. Después de
3 rondas de selección sustractiva, 239 de los 673 clones analizados
se unieron selectivamente a células tumorales 1264en un ELISA de
fagos. El análisis de la diversidad de estos clones selectivos para
el tumor con fingerprinting/BstNI y secuenciación
nucleotídica reveló hasta 14 fragmentos scFv distintos. Cuatro
clones unidos selectivamente a 1264, tras contra selección con
BEAS-2B, se analizaron por un ensayo de
discriminación por citometria de flujo. Estos clones mostraron sólo
una reactividad cruzada limitada a algunas líneas celulares
primarias. Un clon, LU30 también presentó una gran reactividad
cruzada con la línea A459 de adenocarcinoma de pulmón. El antígeno
L30 se identificó como el factor acelerador de la degradación (DAF,
CD55) según clonado y expresión de una librería de cDNA 1264. El
promedio de moléculas DAF en la superficie de células 1264 y BEAS
utilizadas en la selección y contra selección, se estimó en
75000\pm5.000 y 13.000\pm10.000, respectivamente. Por tanto la
selección de la librería de fagos combinada con el clonado y
expresión permite la identificación de anticuerpos y sus antígenos
afines para proteínas que se expresan diferencialmente en la
superficie de distintas poblaciones celulares.
Líneas celulares. La línea de adenocarcinoma de
pulmón, 1264, fue facilitada amablemente por el Dr. A. Gazdar
(Simmons Cancer Center, University of
Texas-Southwestern, Dallas, TX) y se creció en medio
RPMI suplementado con 10% (v/v) de FBS. Las líneas celulares de
adenocarcinoma de pulmón SKLU1, A549 y CALU6, se obtuvieron de la
ATCC y se crecieron en una mezcla de los medios RPMI y DMEM 1:1
suplementados con 10%(v/v) FBS (RPMI/DMEM/FBS). La línea celular
BEAS-2B generada por la mediante transformación con
SV40 de células epiteliales bronquiales humanas, se obtuvo de la
ATCC, al igual que la CCD19LU, una línea de células tipo
fibroblasto aisladas de pulmón humano sano. Ambas,
BEAS-2B y CCD19LU, se cultivaron en medio
RPMI/DMEM/FBS. Las células epiteliales bonquiales humanas (NHBE
4683) y los queratinocitos epidérmicos normales humanos (NHEK 4021)
son líneas celulares primarias (Clonetics, San Diego, CA)que
cultivaron en medio sin suero, BEGM y KGM (Clonetics)
respectivamente. Las líneas NHBE 4683 y NHEK 4021 se utilizaron
para selección sustractiva o análisis entre el tercer y cuarto
pase. Todas las líneas celulares eran adherentes y se desprendieron
con EDTA 2,5 mM en PBS antes de utilizarse.
Selección de células vivas con fagos de scFv. Una
alícuota que contenía 2,5 X 10^{12} cfu de fagos, de una librería
grande de fagos de scFv humano (Vaughan y col., Nat. Biotechnol.
14: 309-314 (1996)) se bloqueó con 500 \mul de
RPMI y FBS al 10% (v/v), PMSF 1 mM y EDTA 2,5 mM para reducir la
unión inespecífica a las superficies celulares. El fago bloqueado
se añadió a 1 X 10^{6} células BEAS-2B en 500
\mul de medio RPMI/DMEM/FBS y se mezcló cuidadosamente durante
30 min a 20ºC. Las células después se precipitaron y realizaron
subsiguientes pasos de selección por centrifugación a 500 Xg durante
5 min a 5ºC. El sobrenadante que contenía el fago se utilizó para
resuspender un precipitado fresco de 1 X 10^{6} células
BEAS-2B y se incubó durante 30 minutos a \sim20ºC
seguido por la precipitación de las células. Después de la
repetición de este paso de contra selección, el fago resultante en
el sobrenadante "sustraído" se incubó con 5 X 10^{6} células
1264 durante 1 h a 20ºC con agitación suave. Las células se
precipitaron y lavaron 3 veces con PBS. El fago unido a las células
se eluyó con 0,5 ml de PBS que contenía ácido cítrico 100 mM con pH
2,2 durante 10 min y después se neutralizó con 0,5 ml de
Tris-HCl 1,0 M a pH 7,5.
La cepa de Escherichia coli TG1 (New
England Biolabs, Beverly MA) en la fase media de crecimiento
logarítmico (A_{550}=0,4-0,8) se infectó con el
eluído del fago y se sembró en agar 2YT que contenía glucosa al 2%
(w/v) y 50 \mug/ml de carbenicilina (2YTGC). Las colonias
resultantes se propagaron y utilizaron para preparar los fagos
(Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597
(1991)). Una alícuota que contenía 1 X 10^{12} cfu de fagos se
utilizó para una segunda ronda de selección que consistió en 5
contra-selecciones con 1 X 10^{6} células
BEAS-2B seguido por la selección con 1 X
10^{7}células1264 durante 15 h. a 20ºC. Después de 10 lavados con
PBS los fagos unidos a las células se eluyeron y se neutralizaron
como en la primera ronda de selección. El fago eluído se propagó y
la tercera ronda de se realizó con 1,0 X 10^{12} cfu de fagos y
el protocolo de la segunda ronda.
ELISA de células y fagos. Se comparó la unión de
fago-scFv a células vivas tumorales y no tumorales
por ELISA en primer cribado por especificidad de unión. Después de
la tercera ronda de selección, un cultivo de TG1 se infectó con el
fago eluído y se sembró en 2YTGC. Los clones para su análisis se
transfirieron a placas de 96 pocillos con 100 \mul de medio 2YT
que contenía glucosa al 2% (w/v) y carbenicilina (100 \mug/ml) y
se crecieron durante 18 h con agitación a 30ºC. Se añadieron 50
\mul de glicerol al 50% (v/v) a cada pocillo de esta placa madre
antes de su almacenamiento a -70ºC.
Se prepararon réplicas de las placas madres y se
indujo el scFv-fago por superinfección con el fago
auxiliar M134K07 y se incubaron toda la noche a 30ºC (Marks y col.,
J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991). Las placas
se centrifugaron (300 x g 5 min, 4ºC) en este y en los
subsiguientes pasos del ELISA para precipitar las bacterias y los
100 \mul de sobrenadante que contenían fago-scFv
se transfirieron a placas de 96 pocillos que contenían 100 \mul de
seroalbúmina bovina al 6% (w/v) en PBS por pocillo. Se añadieron
100 \mul del sobrenadante de fago-scFv bloqueado
a placas paralelas que contenía tanto 1X10^{5} células 1284 o
BEAS-2B por pocillo (1 h a 4ºC y agitación suave).
Las placas se centrifugaron y los sobrenadantes se aspiraron sin
alterar los precipitados. Las células se lavaron dos veces y se
resuspendieron en 200 \mul de FBS al 4% (v/v) en PBS (tampón del
ELISA) a 4ºC seguido de centrifugación. Los precipitados se
resuspendieron en 100 \mul de tampón de ELISA que contenía una
dilución 1:5.000 de peroxidasa de rábano conjugada con un policlonal
de oveja anti-M13 (Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, MJ) y se incubaron durante 20 minutos a 4ºC. Las
células se centrifuagron y se lavaron 3 veces en tampón de ELISA.
Los perecipitados celulares se resuspendieron en 100 \mul de
reactivos TMB (Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc. Gathersburg,
MD) y se revelaron durante 10 min antes de detener la reacción con
100 \mul de ácido fosfórico 1 M. Las placas de ELISA se leyeron
(A_{450}-A_{650}) en un lector de placas
SPECTRAMAX™ 340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y los datos se
analizaron en un programa de cálculo (Microsoft Excel 5.0a).
Citometría de flujo con Fagos y scFv. Los
sobrenadantes del cultivo que contenía fago-scFv se
incubaron con células y se lavaron tal como se ha descrito más
arriba para el ELISA de células con las siguientes modificaciones.
El anticuerpo policlonal anti-M13 se utilizó en una
forma no conjugada. Después de lavar, las células se incubaron
durante 20 min a 4ºC con
R-ficoeritina-conjugada con un
fragmento F(ab')_{2} anti-oveja IgG de
burro (Jackson Iimmunoresearch Laboratories, West Grove, PA)
diluido a 1:200 en tampón ELISA, seguido por 3 lavados y
resuspensión en 0,5 ml de tampón de ELISA. Las células se analizaron
mediante citometría de flujo FACScan (Beckton and Dickinson,
Mountain Veiw, CA).
Para el análisis de los fragmentos de scFv por
citometría, 1 X 10^{5} células en tampón de ELISA se incubaron
durante 1 h a 4ºC con 3 \mug/ml de fragmento scFv. Las células se
lavaron dos veces por centrifugación y resuspensión en tampón de
ELISA. Los precipitados celulares se resuspendieron en 100 \mul de
tampón de ELISA que contenía 1 \mug/ml de anticuerpo monoclonal
anti-hexahistidina BMG-His1
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, N). Las células se lavaron 3
veces en tampón de ELISA antes de su resuspensión en 100 \mul de
tampón de ELISA que contenía una dilución de fragmentos
F(ab')_{2} a1:2000 de anti-ratón IgG de
cabra conjugada con FITC (Jakson Immunoresearch Laboratrories).
Después de 3 lavados adicionales, las células se analizaron por
citometría de flujo.
Cuantificación de DAF en la superficie celular.
El promedio de moléculas de DAF por células se estimó por
citometría de flujo mediante anticuerpos marcados con FITC y en
comparación con bolas conjugadas con FITC, según el procedimiento
de Christensen y Leslie J. Immunol. Methods. 132:
211-219 (1990) con las siguientes modificaciones:
250 mg de anticuerpo monoclonal murino anti-DAF 1A10
(Genentech) en carbonato sódico 50 mM, pH 8,5 se incubaron con 12
\mug de
N-hidroxisuccinimidil-fluoresceína
(Pierce, Rockford, IL) durante 2 h a 20ºC, seguido por una diálisis
extensa contra PBS. La proporción molar de FITC respecto a proteína
se determinó por absorbancia a 280 nm y 492 nm (Christensen et a.,
J. Immunol. Methods. 132: 211-219 (1990)).
Las células se incubaron con varios niveles de anticuerpo
anti-DAF marcado con FITC hasta alcanzar la
saturación, y se prepararon para citometría de flujo tal como se
describió más arriba.
Análisis de la diversidad de los Clones. La
diversidad de los clones antígeno-positivos se
analizó mediante amplificación por PCR del inserto scFv con los
cebadores, fdtetseq y PUC19 reverso (Nissim y col., EMBO J.
13:692-698(1994)), digestión con BstNI (Marks
y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)) y
análisis por electroforesis en geles de poliacrilamida. La
comparación de los patrones de restricción o fingerprinting
obtenidos con BstNI se facilitó por digitalización de los datos del
gel con un AlphaImager (Alpha innotech Corp., San Leandro CA) y
análisis mediante ProRFLP versión 2.34 (DNA ProScan, Nashville TN).
Se secuenciaron un total de 10 clones por patrón de BstNI mediante
didesoxiterminadores marcados con rodamina (Applied Biosysteme,
Foster City, CA) utilizando los cebadores M13reverso (New England
Biolabs) y myxseq10 (Nissim y col., EMBO J,
13:692-698, 194). Las muestras se analizan
utilizando secuenciadores de DNA de Applied Biosystems (modelos 373
y 377) y los resultados de las secuencias se analizaron con el
programa Sequencher versión 3.1 (Gene Codes Corp., Ann Arbor
MI).
Producción de scFv. Los clones de scFv
seleccionados se transformaron en TG1 y se cultivaron durante 18 h
a 30ºC en medio 2YT que contenía
isopropil-\beta-D-galactopiranósido
2 mM para inducir la expresión de scFv. Los extractos
periplasmáticos se prepararon por resuspensión del precipitado
bacteriano de un cultivo de 500 ml en 10 ml de tampón de fosfato
sódico 50 mM pH 8,0 que contenía NaCl 0.5 M, imidazol 25 mM,
lisozima de clara de huevo 0,2 mg/ml y PMSF 1 mM. Después de una
incubación durante 1 h a 4ºC, se eliminaron los residuos por
centrifugación. Los sobrenadanete se filtraron (0,2 \mum) y se
purificaron los fragmentos scFv etiquetados con His por
inmovilización en cromatrografía de afinidad con metales utilizando
ácido
nitriotrotriacético-agarosa-Ni^{2}+
(Quiagen, Valencia, CA). Los fragmentos scFv se eluyeron en
imidazol 250 mM en PBS y se analizaron después en PBS se congelaron
rápidamente y se guardaron a -70ºC. Los c lones LU1, LU4, LU13, Lu29
y LU30 se crecieron a alta densidad celular en un fermentador, tal
como se ha descrito previamente (Carter y col., Bio Technol.
119:163-167 (1992)). Los fragmentos scFv se
purificaron a partir de 2g de la pasta de fermentación como
precipitados celulares de fermentadores en agitación.
Construcción de la librería de cDNA. El RNA total
celular se purificó de homogenados de guanidinio tiocinato de 6 g de
células 1264 cultivadas (Chirgwn y col., Biochemnistry 18:
5294-5299). El mRNA se aisló del RNA total con
oligo-d(T) celulosa (Collaborative Research
Bedford, MA) (Aviv y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
69:1408-1412 (1972)). Tránscritos de cDNA orientados
se prepararon de 5 \mug de mRNA poli-(A)+ con SuperScript Plasmid
System (Gibco BRL, Gaithersburg, MD.), se fraccionaron migrando en
electroforesis en geles de poliacrilamida al 5% y se seleccionaron
por tamaño en el intervalo de 0,6-0,2 kb y >
2kb. Loss cDNAs eluídos se ligaron en dianas de XhoI y NotI a un
vector de expresión pRK5 (Suva y col., Science 237:
893-896 (1987)) y se electroporaron en células DH10B
(Gibco BRL) según las condiciones recomendadas por el
suministrador.
Clonado de un antígeno de expresión de una
librería de cDNA. El DNA de 10 conjuntos de 50.000 clones cada uno,
de 0,6-2 kb y \geq 20 kb librerías de cDNAs, se
preparó para el clonado y expresión de antígenos reconocidos por los
fragmentos de scFv seleccionados por su afinidad tumoral. 10 \mug
del DNA plasmídico de cada una de los 20 conjuntos se
electroporaron en 2 X 10^{6} células COS7con cubetas de 4 mm con
un electroporador GenePulser (BioRad, Hercules, CA) con un voltaje
de 300V y una capacitancia de 125 \muF. Después de la incubación
de 72 h a 37ºC, se desprendieron las células COS7 con EDTA 2,5 mM
en PBS. Las células se lavaron y después se incubaron en 1 ml de
medio de crecimiento que contenía uno o más fragmentos scFv
purificados (10 \mug/ml cada uno) durante 1 h a 4ºC. Las células
se lavaron dos veces para extraer el scFv no unido y se
resuspendieron en 1ml de medio que contenía 5 \mug de anticuerpo
anti-penta-histidina (Quiagen) y se
incubaron durante 1 h a 4ºC. Después de 2-3 lavados
las células se resuspendieron en 5 ml de medio y se transfirieron a
un disco de poliestireno recubierto con un policlonal
anti-ratón IgG (ICN/Cappel Aurora, OH) y se
permitió la unión 1 h a 4ºC. Las placas se lavaron cuidadosamente
3-4 veces con PBS. Las células que permanecieron
enganchadas se lisaron, el DNA plasmídico se extrajo y amplificó
(Seed y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:
3365-3369 (1987)). Después, el DNA se electroporó en
células COS7 para un cribado adicional. En un caso, un número mayor
de células se capturaron de la segunda a la cuarta ronda del
cribado. El DNA plasmídico extraído de células COS7 se transformó
en TG1 y se repicaron las colonias aisladas en placas de 96
pocillos. Se preparó el DNA cada uno de los conjuntos de
10-20 clones, se electroporó en células COS7 y se
cribó con fragmentos scFv tal como se ha descrito más arriba. Los
conjuntos de clones positivos para la unión de células a la placa
de petri se tomaron de las placas madre de E. coli y los
clones individuales se examinaron por selección. Un clon positivo
individual se secuenció mediante didesoxiterminadores marcados
con
rodamina.
rodamina.
Cuantificación de la afinidad. Las
cuantificaciones de las cinéticas se realizaron por resonancia de
superficie plasmón en un Biosensor BIACORE1000™ (Biacore, AB,
Uppsala, Sweden). CM-5 chips se funcionalizaron con
350 unidades de respuesta al DAF recombinante humano en acetato
sódico 10 mM (pH 4,6) o 8.000 unidades de respuesta a la
seroalbúmina bovina como control negativo. El chip derivado de DAF
se saturó con LU30 scFv (25-100 nM) por inyección de
este fragmento a 10 \mul/min en PBS que contenía seroalbúmina
bovina al 0,5% (w/v) y TWEEN20™ al 0,05% (v/v). Los sensogramas
resultantes se analizaron con el software BIAEVALUATION™ 3.0.
Selección celular sustractiva con
fago-scFv. Se utilizó una librería grande de
fago-scFv (Vaughan y col., Nat. Biotechnol. 14:
309-314(1996)) para la búsqueda de nuevos
antígenos asociados a tumor por selección con la línea celular de
adenocarcinoma de pulmón 1264, y se contra seleccionó con las
células de la línea epitelial bronquial no tumoral
BEAS-2B. Se tomaron precauciones para mantener la
integridad de los antígenos de membrana durante la selección y para
facilitar la subsiguiente identificación del antígeno por clonado y
expresión de fragmentos aislados sc-Fv. En primer
lugar, se utilizaron células vivas en vez de fijadas para la
selección en un intento por preservar los antígenos de superficie
en su estado nativo. Segundo, las células crecidas de forma
adherente se desprendieron con EDTA sólo, evitando así la
degradación proteolítica de los antígenos de superficie celular que
resulta del uso común de la tripsina en esta etapa.
El número de fagos recogidos después de 1, 2, y 3
rondas de cribado fue de 1,5 X 10^{7}, 7,0 X 105 y 4,0 X 106 cfu
respectivamente. Las poblaciones de fagos después de cada ronda de
cribado se analizaron por citometría de flujo. El fago de la
tercera ronda mostró un gran aumento de la unión a las células 1264
y un pequeño aumento con las células BEAS-2B cuando
se comparó con fago de las rondas previas y con fago sin
seleccionar (Fig. 1). Este aparente aumento diferencial en la unión
a las células 1264 sobre las BEAS-2B nos animó a
buscar fagos individuales de la población de la tercera ronda por
unión selectiva a las células tumorales 1264.
Análisis de la Especificidad y Diversidad de los
Clones. La especificidad de unión de clones individuales de la
tercera ronda de selección se analizó por ELISA con
fago-scFv y células vivas. El primer criterio
utilizado para determinar la sectividad al tumor fue la unión
fuerte a las células 1264 (señal en el ELISA
A_{450}-A_{950} \geq 0,3) y mucho más débil si
existe unión detectable con las células BEAS-2B
(\geq 10 veces menor señal en el ELISA). La diversidad de clones
que satisfacieron este criterio primero se determinó por digestión
con BstNI de los fragmentos scFv amplificados por PCR y se
secuenciaron los nucleótidos de hasta 10 clones. Un número pequeño
de clones que no satisfacieron el primer criterio se digirieron con
BstNI también (n=29) y se secuenciaron (n=11). Se utilizó entonces
el segundo criterio para escoger clones únicos y aparentemente
selectivos para el tumor, para análisis posteriores. 1) Patrón de
fingerprint ambiguo, 2) pauta abierta de lectura para scFv,
3) la mayoría de clones que comparten la misma secuencia
nucleotídica también safisfacieron el primer criterio de
selección.
De 673 clones analizados, 239 satisfacieron el
primer criterio por unión selectiva y 197 clones pudieron ser
asignados a 15 patrones de digestión (fingerprinting) con
BstNI (Tabla 1). En la mayoría de los casos (13/15) un modelo
correspondió con una secuencia única de nucleótidos, mientras en
2/15 casos 2 secuencias diferentes presentaron un patrón de
digestión por BstNI no diferenciable. Se identificó un total de 17
clones scFv que satisfacieron el segundo criterio de selección. Los
2 clones más abundantes, patrones de fingerprint 1 y 2,
representaron aproximadamente el 80% de los clones que
satisfacieron el segundo criterio de selección. En cambio, los otros
15 clones representan cada uno \geq 5% de los clones
identificados. Cuatro de los 17 clones (LU1, LU3, LU22 y LU36)
están estrechamente relacionados (con una identidad de secuencia
\geq 97% para scFv) (Fig. 2A). De los 673 clones investigados
inicialmente 14 clones scFv distintos con unión selectiva por
células BEA S-2B, según el ELISA. Estos fragmentos
scFv distintos tienen secuencias de V_{H} divergentes (Fig. 2B),
mientras que sus correspondientes dominios V_{L} están más
limitados en cuanto a diversidad (Fig. 2C). Muchos de los clones
scFv aislados utilizan secuencias idénticas o muy parecidas de
V_{L}, tal como se ha descrito previamente (Vaughan y col.,
Nat. Biotechnol. 14: 309-314 (1996)).
Merchant y col., Nat. Biotechnol. 16:677-661
(1998)). Esto refleja el tamaño muy limitante del repertorio de
cadena ligera en la librería de fagos.
Análisis astringente de la especificidad de los
clones. De los 14 clones diferentes que satisfacieron el segundo
criterio de selección (Tabla 1), se analizaron por un procedimiento
más discriminativo pero con menor rendimiento por citometría de
flujo con fragmentos scFv (resultados representativos en la Fig.
3). Cuatro clones, denominados LU1, LU13, LU20 y LU30, demostraron
una unión significativa con las células 1264, pero una mínima
reactividad cruzada con las células BEAS-2B. En
contraste, los clones restantes (representados por LU4 en la Fig.
3) mostraron una reactividad cruzada con las células
BEAS-2B. El clon LU30 que rindió el mayor grado de
unión con las células 1264, también mostró la mayor tinción con 1/3
líneas adicionales de adenocarcinoma de pulmón que se analizaron
(A549). Los clones LU1, LU13, LU20 y LU30 mostraron una reactividad
cruzada mínima con BEAS-2B y la línea primaria
humana, NHEK 4021 (Fig. 3). El análisis por citometría de flujo con
las líneas primarias humanas, CCD-19LU y NHBE 4683
dio una unión muy similar entre los fagos LU1, LU13, LU20 y LU30
como control, aunque con una unión de fondo mayor que con las otras
líneas.
Clonado y Expresión del Antígeno LU30. Los
fragmentos ScFv correspondientes a los clones LU13, LU20 y LU30 se
prepararon por secreción de E. coli y se inmovilizaron por
cromatrografía de afinidad con metales y se utilizaron para clonado
y expresión. El cribado se realizó mediante una mezcla de estos 3
fragmentos scFv y la expresión de la librería de cDNA construida a
partir de células 1264 que se expresaron de forma transitoria en
células COS7. Después de 3 rondas de selección mediante la mezcla
de estos 3 fragmentos scFv, se demostró una captura celular
eficiente con algunas fuentes de plásmido con fragmentos scFv de
LU30 pero no de LU13 ni LU20. La selección repetida utilizando los
clones de LU13 y LU20 en ausencia de LU30 fue un fracaso. Los
conjuntos de clones positivos para el clon LU30 se separaron
primero en grupos pequeños y después en clones individuales. Esto
llevó a la identificación de un único clon que expresaba una
proteína que se unía específicamente a los fragmentos scFv de LU30.
El análisis de la secuencia nucleotídica de este clon lo identificó
como el factor acelerador de la degradación (DAF, CD55). La unión
de scFc LU30 (GenBank número de acceso AF117206) a las células
1260 puede competir con el DAF recombinante (Fig. 4), pero no con
el anticuerpo monoclonal anti-DAF, 1A10, (estos
resultados no se incluyen aquí). Una confirmación adicional de la
unión de LU30 con DAF se proporcionó por la medida de la afinidad
obtenida con el instrumento BIACORE™: K_{d}=(13 \pm 5) nM,
K_{on}=(3,4 \pm 1,0) X 10^{5} M^{-1} s^{-1}, K_{off}=
(4,5 \pm 1,3) X 10^{-3} s^{-1}.
Niveles celulares de DAF. El promedio de
moléculas de DAF en las líneas celulares 1264 y
BEAS-2B se estimó por citometría de flujo
cuantitativa con un anti-DAF IgG marcado con un
promedio de 5,3 moléculas de FITC, en relación a los estándares. El
número de moléculas de DAF en las células tumorales 1264 utilizadas
para el cribado y en las células no tumorales
BEAS-2B utilizadas en la contra selección, se
estimó en 75.000\pm5.000 y 13.000\pm10.000, respectivamente.
Los intentos por estimar el número de sitios DAF en las células
BEAS-2B y 1264 con estos procedimientos utilizando
fragmentos scFv de LU30 no fueron fiables porque el marcaje con
FITC de scFv de LU30 impidió su unión a DAF.
Mediante cribado y sustracción de células vivas
con una librería de fagos de anticuerpos desnudos, se han
identificado cuatro fragmentos scFv que se unen más extensamente a
una o más líneas celulares tumorales que a las líneas no tumorales
relacionadas. El antígeno afín correspondiente a un clon scFv, LU30,
se identificó como DAF por clonado y expresión. DAF se expresó a
aproximadamente 6 veces más en las células 1264 que en las BEAS
utilizadas para la contra-selección. El proceso de
contra-selección no es eficiente al 100%, ya que
permite la identificación del fragmento scFv que se une al antígeno
que está presente en los mayores niveles en las células diana que
en las control. Esto es un buen presagio en cuanto a la utilidad del
procedimiento ya que ocurre frecuentemente que los antígenos de
superficie celular se sobreexpresan en tumores en comparación con
los tejidos normales p.ej., HER2/neu (Tzahar y col., Bioche.
Biophys. Acta. 1377:M25-M37 (1998)) y EGFR
(Voldborg y col., Annals Oncol. 8: 1197-1207
(1997)).
El procedimiento de cribado del fago de
anticuerpos ofrece una vía potencial de aplicación amplia y directa
para la identificación de anticuerpos humanos susceptibles de
utilizarse en terapia anti-tumoral. Esta estrategia
favorece la identificación de anticuerpos contra antígenos
altamente expresados, como el DAF que se muestra aquí, ya que
niveles altos de antígeno puede presumirse que facilitarán el
enriquecimiento de los fagos afines durante la selección. Esto
parece deseable ya que una alta expresión de antígenos facilitaría
también la localización tumoral de los anticuerpos
anti-tumorales in vivo.
El cribado de fagos de anticuerpos podría
identificar, potencialmente, antígenos asociados a tumores que
resulten de modificaciones post-traduccionales que
difieren entre células tumorales o no tumorales p.ej., el producto
de la mucina del gen MUC-1, se encuentra con bajo
nivel de glicosilación en muchos tumores humanos
(Barran-Boyes y col., Cancer Immunol.
Immunother. 43:142-151 (1986)), esto supone que
se exponen nuevos epitopos para la detección por anticuerpos. Ello
ha provocado el desarrollo de anticuerpos humanizados
anti-MUC1 (Couto y col., Adv. Exp. Med. Biol.
353:55-59(1994)); Couto y col., Hybridoma
13:215-219 (1994); Baker y col., Adv. Exp. Med.
Biol. 353:61-82 (1994)). Además, los anticuerpos
humanos que reconocen MUC1 en las células tumorales han sido
identificados por cribado con un péptido MUC1 (Henderikx y col.,
Cancer Res. 58:4324-4332(1998)). En
contraste, estas diferencias post-traduccionales
entre células tumorales y no tumorales no serán detectadas por
procedimientos de análisis del transcriptoma y análisis genómico de
alto rendimiento como la expresión diferencial de cDNAs (Liang y
col., Curr. Opin. Immunol. 7:274-280 (1995); Schena
M. y col., Science, 270:467-470(1995);
DeRisi y col., Nat. Genet. 14:457-460 (1996)), o los
microarrays de oligonucleótidos (Chee y col., Science,
274:610-614 (1996); y el SAGE (Veiculescu y col.,
Science, 276:1268-1272 (1997); Zhang y col.,
Science, 276: 1268-1272 (1997).
Hibi y col., Cancer Res., 58:
5690-5694 (1998)). Los métodos análisis
transcriptómicos y genómicos de alto rendimiento fallarán también en
la detección de proteínas que están sobreexpresadas en tumores a
pesar de no presentar variación a nivel del transcrito del RNA ni
del número de copias del gen, respectivamente.
El procedimiento SAGE ha identificado diferencias
significativas en los niveles del transcrito de RNA entre tumores
humanos primarios y líneas celulares tumorales (Xhang y col.,
Science, 276:1268-1271 (1997)). Esto aumenta la
posibilidad de que el cribado del fago de anticuerpos pueda detectar
antígenos asociados al tumor en tumores humanos primarios pero no
en líneas celulares. A la inversa, pueden identificarse anticuerpos
que sean específicos de una línea celular y no se unen a células
tumorales primarias. Es previsible que la selección/cribado directa
de las células tumorales primarias humanas pueda evitar estos
problemas.
Según la purificación por inmunoafinidad seguida
por transferencia de western, el anticuerpo monoclonal
anti-DAF, A10, (patente internacional W086/07062),
LU20 y LU13 se unían también a DAF. Las secuencias V_{L} y
V_{H} de los anticuerpos LU30, LU20 y LU13 se muestran en las
Figs. 5A y 5B.
Este Ejemplo describe cómo debe tratarse un
paciente humano con cáncer de pulmón con un anticuerpo humano según
se ha descrito aquí.
Los dominios V_{L} y V_{H} del anticuerpo
humano LU30, identificado tal como se ha descrito en el Ejemplo
anterior, se unen con dominio constantes de IgG1 humana para
generar un anticuerpo intacto con funciones efectoras in
vivo. El anticuerpo puede expresarse en células de ovario de
hámster chino (CHO) (patente americana US 4.816.567). El anticuerpo
recombinante se recoge de las células CHO y se formula como una
preparación liofilizada que puede reconstituirse con agua
bacteriostática por inyección (BWF1) para generar una formulación
reconstituida para la administración intravenosa o subcutánea a un
paciente humano (véase la patente internacional WO 97/04801). La
formulación reconstituida se administra a un paciente humano
diagnosticado de cáncer de pulmón, p.ej., en una dosis de carga
inicial de 4 mg/kg i.v. seguido por dosis semanales de
aproximadamente 2mg/Kg i.v. Los pacientes candidatos para la
terapia pueden opcionalmente ser investigados para determinar si
expresan la variante DAF (p.ej. una variante de glicosilación de
DAF) que se expresa preferentemente en el tejido canceroso de
pulmón en contraposición con el tejido de pulmón normal (p.ej., no
canceroso) y /o establecer si el tumor sobreexpresa DAF. La
inmunohistoquímica (IHC) y los ensayos basados con tecnología del
DNA (p.ej. hibridización in situ fluorescente, FISH) que
pueden utilizarse para determinar la amplificación génica y/o
sobreexpresión de la proteína, se encuentran disponibles en este
campo. El anticuerpo humano LU30 puede utilizarse para determinar
la sobreexpresión de DAF por IHC. El anticuerpo
anti-DAF se combina opcionalmente con otros agentes
citotóxicos utilizados en el tratamiento del cáncer de pulmón, como
la navelbina, gemcitabina, y un taxoide, carboplatino, cisplatino,
etoposido, ciclofosfamida, mitomicina, vimblastina y/o un
anticuerpo adicional (como un anticuerpo anti-ErbB2,
un anticuerpo anti-factor angiogénico, un anticuerpo
anti-mucina, o un anticuerpo dirigido contra un
epitopo diferente de DAF en las cantidades convenientes para cada
agente. La administración de anticuerpos anti-DAF al
paciente es previsible que aumente el tiempo de progresión de la
enfermedad, resulta en una velocidad de respuesta mayor (ORRs) y
aumento de la duración media de respuesta y/o aumento de 1 año del
índice de supervivencia en comparación con pacientes tratados con
placebo.
<110> Genentech, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTIBODIES FOR CANCER THERAPY AND
DIAGNOSIS
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
Claims (22)
1. Procedimiento ex vivo o in vitro
para la producción de un anticuerpo que comprende las etapas
siguientes: (a) unión de un anticuerpo expresado en un fago de una
librería de fagos que expresan anticuerpos desnudos con una célula
viva cancerosa; (b) selección de un fago que expresa un anticuerpo o
de un anticuerpo que se une selectivamente con una célula cancerosa
viva; y (c) identificación del antígeno al que se une el fago que
expresa el anticuerpo o el anticuerpo.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 que además comprende la contra-selección del fago
que expresa anticuerpos utilizando una célula no cancerosa viva.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde la etapa de contra-selección se realiza
antes de la etapa (a).
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde el promedio de moléculas antigénicas por célula
cancerosa es superior al promedio de moléculas antigénicas por
célula no cancerosa.
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4, en donde el promedio de moléculas antigénicas por célula
cancerosa es aproximadamente de 2 a 1000 veces superior al promedio
de moléculas antigénicas por célula no cancerosa.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
4, en donde el promedio de moléculas antigénicas por célula
cancerosa es aproximadamente de 5 a 100 veces superior al promedio
de moléculas antigénicas por célula no cancerosa.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
2, en donde la célula no cancerosa es del mismo tipo tisular que la
célula cancerosa.
8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la célula cancerosa es una célula de cáncer de
pulmón.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la librería de fagos de anticuerpos comprende
aproximadamente de 10^{9} a 10^{15} fagos que expresan
anticuerpos.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 que además comprende el clonaje y expresión del
antígeno.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde la célula cancerosa procede de una línea
de células cancerosas.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2 que además comprende la unión comparativa del fago
de anticuerpos o del anticuerpo con una célula cancerosa y una
célula no cancerosa.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 que además comprende la separación de la célula
cancerosa de una superficie al cual dicha célula cancerosa está
adherida, mediante la utilización de una solución que no incluya
ninguna proteasa.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, en donde la solución comprende EDTA para
desenganchar la célula cancerosa.
15. Procedimiento ex vivo o in
vitro para identificar un antígeno que se expresa
diferencialmente en la superficie de dos o más poblaciones celulares
vivas distintas, que comprende las siguientes etapas: (a) unión del
fago que expresa el anticuerpo procedente de una librería de fagos
de anticuerpos desnudos con una primera población celular viva; (b)
unión del fago que expresa el anticuerpos con una segunda población
celular viva distinta de la primera población celular; (c)
selección de un fago que expresa el anticuerpo o del anticuerpo que
se une selectivamente a la primera población celular; y (d)
identificación de un antígeno al cual se una el fago que expresa el
anticuerpo o del anticuerpo.
16. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 15, en donde la primera población celular es una
población celular cancerosa y la segunda población celular es una
población celular no cancerosa del mismo tipo tisular que la
población cancerosa.
17. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en donde el fago que expresa el anticuerpo
procedente de una librería de fagos se
contra-selecciona con la segunda población celular,
antes de unirse con la primera población celular.
18. Anticuerpo humano aislado, dirigido contra el
factor acelerador de la degradación (DAF) obtenible por el
procedimiento de la reivindicación 1, el cual tiene una afinidad de
unión por el DAF humano de aproximadamente igual o mejor que 10
nM.
19. Composición farmacéutica que comprende el
anticuerpo de la reivindicación 18 y un vehículo aceptable
farmacéuticamente.
20. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
18 para utilizar en la terapia.
21. Utilización de un anticuerpo de acuerdo con
la reivindicación 18 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento del cáncer de pulmón.
22. Utilización de acuerdo con la reivindicación
21, en donde el cáncer de pulmón se selecciona del grupo que
consiste en cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón
de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células grandes,
adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón escamoso.
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