JP2002544238A - 抗−ＥｒｂＢ２抗体による治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ）治療的有効量な量の抗ＥｒｂＢ２抗体によって患者を治療すること、（ｂ）外科的に腫瘍を除去すること、（ｃ）治療的有効量な量の抗ＥｒｂＢ２抗体又は化学療法剤によって患者を治療すること、を含んでなるＥｒｂＢ２タンパク質を発現する腫瘍を患いやすい又はその腫瘍であると診断されたヒト患者の治療方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 (発明の分野) 本発明は抗-ＥｒｂＢ２抗体による癌の治療に関する。

【０００２】 (発明の背景) 成長因子及び成長因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、乳癌を
含む、様々なヒトの悪性腫瘍の原因に重要な役割を担っていることが確認されて
いる。表皮成長因子レセプター(ＥＧＦＲ)に関連した１８５ｋｄの膜貫通糖タン
パク質レセプター(ｐ１８５^ＨＥＲ２)をコードするヒトeｒｂＢ２遺伝子(ＨＥＲ
２又はｃ-ｅｒｂＢ-２としても知られている)は、ヒトの乳癌の約２５％〜３０
％で過剰発現していることが見出されている(Slamonら, Science 235:177-182[1
987]；Slamonら, Science 244:707-712[1989])。

【０００３】 いくつかの証拠情報は、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍の病原性及び臨床的病
原力におけるＥｒｂＢ２の直接的な役割を支持している。非新生物細胞へＥｒｂ
Ｂ２を導入すると、その悪性形質転換を引き起こすことが示されている(Hudziak
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7159-7163[1987]；DiFioreら, Science 23
7:78-182[1897])。ＨＥＲ２を発現するトランスジェニックマウスには、乳房腫
瘍が発生することが見出されている(Guyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10
578-10582[1992])。

【０００４】 ヒトｅｒｂＢ２タンパク産物に対する抗体とｅｒｂＢ２遺伝子(ｎｅｕ)のラッ
ト等価物によりコードされたタンパク質が記述されている。Drebinら, Cell 41:
695-706(1985)は、ラットｎｅｕ遺伝子産物に対するＩｇＧ２ａモノクローナル
抗体に言及している。７.１６.４と呼ばれるこの抗体は、Ｂ１０４-１-１細胞(
ｎｅｕプロトオンコジーンを形質移入したＮＩＨ-３Ｔ３細胞)における細胞表面
ｐ１８５発現のダウンモジュレーションを引き起こし、これらの細胞のコロニー
形成を阻害する。Drebinら, PNAS(USA)83:9129-9133(1986)では、７.１６.４抗
体が、ヌードマウスに移植されたｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞並びにラッ
ト神経芽腫細胞(ｎｅｕオンコジーンが最初に単離されたものからのもの)の腫瘍
形成成長を阻害することが示されている。Drebinら, Oncogene 2:387-394(1988)
では、ラットｎｅｕ遺伝子産物に対する抗体パネルの生産が検討されている。全
ての抗体は、軟質寒天に懸濁したｎｅｕ形質転換細胞の成長に対して細胞分裂停
止効果を発揮することが見出されている。ＩｇＭ、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂア
イソタイプの抗体は、補体の存在下でｎｅｕ形質転換細胞の有意なインビトロ溶
解を媒介し得たが、いずれの抗体もｎｅｕ形質転換細胞の高レベルの抗体依存性
細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を媒介することはできなかった。Derbinら, Oncogene 2
:273-277(1988)は、ｐ１８５分子上の２つの異なる領域と反応性のある抗体混合
物が、ヌードマウス中に移植されたｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞に相乗的
な抗腫瘍効果を生じることを報告している。抗ｎｅｕ抗体の生物学的効果は、My
ersら, Meth. Enzym. 198:277-290(1991)においてレビューされている。また、
１９９４年１０月１３日に公開された国際公開第９４／２２４７８号もまた参照
のこと。

【０００５】 Hudziakら, Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)には、ヒトの乳房腫瘍
株化細胞ＳＫＢＲ３を使用して特徴付けられた抗ＥｒｂＢ２抗体パネルの産生が
記載されている。抗体への暴露に続いてＳＫＲＢ３細胞の相対的細胞増殖が、７
２時間後の単層のクリスタルバイオレット染色により測定された。このアッセイ
を使用して、４Ｄ５と呼ばれる抗体により最大の阻害度が得られ、これは細胞増
殖を５６％阻害した。７Ｃ２と７Ｆ３を含むパネルの他の抗体は、このアッセイ
においてより少ない度合いで細胞増殖を低減した。Hudziakらは、ＳＫＢＲ３細
胞は培地からの抗体の除去に続いて、ほぼ通常の速度で成長を再開したので、Ｓ
ＫＢＲ３細胞に対する４Ｄ５抗体の効果は細胞障害というよりも細胞分裂停止で
あると結論付けている。さらに、抗体４Ｄ５は、ＴＮＦ-αの細胞障害効果に対
し、ｐ１８５^{ｅｒｂＢ２}過剰発現乳房腫瘍株化細胞を感作させることが見出され
ている。また、１９８９年７月２７日に公開された国際公開８９／０６６９２号
を参照のこと。Hudziakらにより検討された抗ＥｒｂＢ２抗体は、Fendlyら,Canc
er Research 50:1550-1558(1990)；Kottsら,In Vitro 26(3):59A(1990)；Sraup
ら,Growth Regulation 1:72-82(1991)；Shepardら,J. Clin. Immunol. 11(3):11
7-127(1991)；Kumarら, Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986(1991)；Lewisら, Can
cer. Immunol. Immunother. 37:255-263(1993)；Pietrasら, Oncogene 9:1829-1
838(1994)；Vitettaら, Cancer Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowskiら,
J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)；Scottら, J. Biol. Chem. 266:14
300-5(1991)；及びD'souzaら, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206(1994)に
おいてもさらに特徴付けられている。

【０００６】 Tagliabueら, Int. J. Cancer 47:933-937(1991)には、ＥｒｂＢ２を過剰発現
する肺腺癌株化細胞(Ｃａｌｕ-３)に対するその応答性によって選択された２つ
の抗体について記載されている。ＭＧＲ３と呼ばれる抗体の一つは内部移行し、
ＥｒｂＢ２のリン酸化を誘発し、インビトロでの腫瘍細胞成長を阻害することが
見出されている。

【０００７】 McKenzieら,Oncogene 4:543-548(1989)は、ＴＡ１と命名された抗体を含む、
様々なエピトープ特異性を持つ抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルを産生した。このＴＡ
１抗体はＥｒｂＢ２の加速度的エンドサイトーシスを誘発することが見出されて
いる(Maierら, Cancer Res. 51:5361-5369[1991])。Bacusら, Molecular Carcin
ogenesis 3:350-362(1990)では、ＴＡ１抗体が乳癌株化細胞ＡＵ-５６５(ｅｒｂ
Ｂ２遺伝子を過剰発現する)とＭＣＦ-７(過剰発現しない)の成熟を誘発すること
が報告されている。これらの細胞における成長の阻害と成熟表現型の獲得には、
細胞表面におけるＥｒｂＢ２レセプターレベルの減少と、細胞質内におけるレベ
ルの一時的増加が伴うことが見出されている。

【０００８】 Stancovskiら, PNAS(USA)88:8691-8695(1991)は、抗ＥｒｂＢ２抗体のパネル
を産生し、それらをヌードマウスの腹腔内注入し、ｅｒｂＢ２遺伝子の過剰発現
により形質転換したマウス繊維芽細胞の腫瘍成長に対するそれらの効果を評価し
た。４つの抗体では、種々のレベルの腫瘍阻害が検出されたが、抗体の一つ(Ｎ
２８)は、一貫して腫瘍の成長を刺激した。モノクローナル抗体Ｎ２８は、Ｅｒ
ｂＢ２レセプターの有意なリン酸化を誘発するのに対し、他の４つの抗体は、一
般的にリン酸化誘発活性が低いか、もしくはないことが示された。また、ＳＫＢ
Ｒ３細胞の増殖に対する抗ＥｒｂＢ２抗体の影響も評価された。このＳＫＢＲ３
細胞増殖アッセイにおいて、２つの抗体(Ｎ１２とＮ２９)は、対照に対して、細
胞増殖の減少を引き起した。抗体媒介性の細胞依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)と
補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)を介したインビトロでの細胞溶解を誘発する種
々の抗体の能力を評価して、この論文の著者は、抗体の阻害機能が顕著にはＣＤ
Ｃ又はＡＤＣＣに帰するものではないと結論づけた。

【０００９】 Bacusら, Cancer Research 52:2580-2589(1992)は、先の段落のStancovskiら
及びBacusら(1990)に記載されている抗体をさらに特徴付けた。Stancovskiらの
腹腔内研究を拡大して、ヒトＥｒｂＢ２を過剰発現するマウス繊維芽細胞を有す
るヌードマウスに静脈注射した後の抗体の影響を評価した。彼らのより早い研究
において知見されているように、Ｎ２８は腫瘍成長を加速するのに対し、Ｎ１２
とＮ２９はＥｒｂＢ２発現細胞の成長を有意に阻害した。また、Ｎ２４抗体では
、部分的な腫瘍阻害も観察された。さらに、Bacusらは、ヒト乳癌株化細胞ＡＵ-
５６５及びＭＤＡ-ＭＢ４５３(ＥｒｂＢ２を過剰発現する)並びにＭＣＦ-７(低
レベルのレセプターを含む)における成熟表現型を促進するための抗体の能力を
試験した。Bacusらは、インビボでの腫瘍阻害と細胞分化との間に相関関係があ
ることを見出した；腫瘍刺激性抗体Ｎ２８は分化に何ら影響せず、Ｎ１２、Ｎ２
９及びＮ２４抗体の腫瘍阻害作用はそれらが誘発した分化の程度と相関関係があ
った。

【００１０】 Xuら,Int. J. Cancer 53:401-408(1993)では、エピトープ結合特異性に対する
抗ＥｒｂＢ２抗体のパネル、並びに(個々の抗体又は組合せたものにより)ＳＫＢ
Ｒ３細胞の足場非依存性及び足場依存性成長を阻害し、細胞表面ＥｒｂＢ２を変
調し、リガンド刺激足場非依存性成長を阻害する能力について評価した。また、
１９９４年１月６日公開の国際公開９４／００１３６号及び抗ＥｒｂＢ２抗体の
組合せに関連したKasprzykら, Cancer Research 52:2771-2776(1992)を参照のこ
と。他の抗ＥｒｂＢ２抗体は、Hancockら, Cancer Res. 51:4575-4580(1991)；S
hawverら, Cancer Res. 54:1367-1373(1994)；Arteagaら, Cancer Res. 54:3758
-3765(1994)；及びHarwerthら, J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)におい
て検討されている。

【００１１】 組換えヒト化抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体(ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２又はハ
ーセプチン(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ^Ｒ)と称されるマウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５の
ヒト化体)は、広範な抗癌治療を前に受けたＥｒｂＢ２過剰発現転移性乳癌を持
つ患者において臨床的に活性であった(Baselgaら, J. Clin. Oncol. 14:737-744
[1996])。

【００１２】 ＥｒｂＢ２過剰発現は、特に腋窩リンパ節に関与する原疾患を有する患者にお
ける、乏しい予後のプレディクターであると一般的に考えられており(Slamonら,
[1987]及び[1989], 前掲；Ravdin及びChamness, Gene 159:19-27[1995]；及びH
ynesとStern, Biochim Biophys Acta 1198:165-184[1994])、ＣＭＦ(シクロホス
ファミド、メトトレキセート及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリン(Ba
selgaら, Oncology 11(3 Suppl 1):43-48[1997])を含む、ホルモン治療法及び化
学療法に対する感受性及び／又は耐性に関連している。しかしながら、ＥｒｂＢ
２過剰発現が乏しい予後に関連しているにもかかわらず、タキサンでの治療に臨
床的に反応するＨＥＲ２陽性患者の見込みは、ＨＥＲ２陰性患者の３倍を越えて
いた(同上)。ｒｈｕＭａｂ ＨＥＲ２は、高レベルのＨＥＲ２を発現するＢＴ-４
７４ヒト乳腺癌細胞を注射したヌードマウスにおける乳癌異種移植片に対するパ
クリタキセル(タキソール(登録商標））とドキソルビシンの活性を高めることが
示されている(Baselgaら, Breast Cancer, Proceeding of ASCO, vol.13, Abstr
act 53[1994])。

【００１３】 (発明の概要) 最初の側面では、本発明は、下記の段階を含んでなり、順次実行される、Ｅｒ
ｂＢ２タンパク質を発現する腫瘍に罹りやすい、又はＥｒｂＢ２タンパク質を発
現する腫瘍と診断されたヒトの患者を治療する方法を提供する： （ａ）治療的有効量の抗-ＥｒｂＢ２抗体によって患者を治療する、及び、随意
的に、更に治療的有効量の化学療法薬剤(例えば、パクリタキセル又はドキシタ
キセルのようなタキソイド）によって患者を治療することを含んでなる； （ｂ）外科的に腫瘍を除去する；及び （ｃ）患者を、治療的有効量の抗-ＥｒｂＢ２抗体及び／又は化学療法剤(例えば
、パクリタキセル又はドキシタキセルのようなタキソイド）によって治療する。

【００１４】 好ましくは、腫瘍はＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現し、乳腫瘍、扁平上皮細
胞腫瘍、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍、神経膠芽細胞腫
瘍、子宮頸腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、膀胱腫瘍、肝細胞腫瘍、大腸腫瘍、結腸
直腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、唾液腺腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、産卵口腫瘍、甲
状腺腫瘍、肝腫瘍(hepatic carcinoma)及び様々な種類の頭部及び頸部の腫瘍か
ら構成される群から選択される。 本発明は、更に、容器と、該容器内の組成物で、抗ＥｒｂＢ２抗体、及び組成
物が上記の方法に記載の患者そのものを治療するために使用可能であることを示
すパッケージ挿入物とを含んでなる製造品に関する。

【００１５】 (好ましい実施態様の詳細な説明) Ｉ． 定義 「ＨＥＲ２」、「ＥｒｂＢ２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」という用語には互換的に
使用される。特にそうでないことを示さない限り、ここで使用される「ＥｒｂＢ
２」、「ｃ-Ｅｒｂ-Ｂ２」及び「ＨＥＲ２」という用語は、ヒトタンパク質を指
し、「Ｈｅｒ２」、「ｅｒｂＢ２」及び「ｃ-ｅｒｂ-Ｂ２」はヒト遺伝子を指す
。ヒトｅｒｂＢ２遺伝子及びＥｒｂＢ２タンパク質は、例えばSembaら, PNAS(US
A)82:6497-6501(1985)及びYamamotoら, Nature 319:230-234(1986)(ジーンバン
ク受託番号 X03363)に記載されている。ＥｒｂＢ２は４つのドメインを有する(
ドメイン１-４)。

【００１６】 「エピトープ４Ｄ５」は抗体４Ｄ５(ATCC CRL 10463)が結合するＥｒｂＢ２の
細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはＥｒｂＢ２の膜貫通領域に近
接している。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例
えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Ha
rlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うこ
とができる。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の４Ｄ５エピトープ(すなわち、約残
基５２９から、例えば約残基５６１から、約残基６２５までを含む領域における
任意の一又は複数の残基；配列番号：４)に結合するか否かを評価するために、
エピトープマッピングを行うこともできる(Ｆｉｇ１参照)。

【００１７】 「エピトープ３Ｈ４」は抗体３Ｈ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中
の領域である。このエピトープはＦｉｇ１に示すもので、ＥｒｂＢ２の細胞外ド
メインのアミノ酸配列(配列番号：３）のうち、約５４１〜約５９９の残基を含
む。 「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は７Ｃ２及び／又は７Ｆ３抗体(各々以下のATC
Cで寄託)が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのＮ末端領域である。７Ｃ２／
７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodi
es, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDav
id Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる
。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープ(すなわち、Ｅｒｂ
Ｂ２の約残基２２から約残基５３までの領域における任意の一又は複数の残基（
配列番号：２）)に結合するか否かを確認するために、エピトープマッピングを
行うこともできる。

【００１８】 「細胞死を誘発」又は「細胞死を誘発可能な」という用語は、生存している細
胞を生存不能とさせる抗体の能力を意味する。ここでの「細胞」とはＥｒｂＢ２
レセプターを発現するもの、特にＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞のこ
とである。ＥｒｂＢ２を「過剰発現する」細胞は、同じ組織型の非癌化細胞に比
べて、正常よりも顕著に高いＥｒｂＢ２レベルを有する。好ましくは細胞は癌細
胞、例えば乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓
又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌ
ｕ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる
。インビトロでの細胞死は、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され
、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)又は補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)によ
り誘発される細胞死と区別される。よって、細胞死に対するアッセイは、熱不活
性化血清(すなわち補体の不在下)を使用し、免疫エフェクター細胞の不在下で行
うことができる。抗体が細胞死を誘発可能であるか否かを測定するために、ヨウ
化プロピジウム(ＰＩ)、トリパンブルー(Mooreら, Cytotechnology 17:1-11[199
5]を参照)又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜インテグリティの損失度合
いが未処理細胞と比較して評価される。好ましい細胞死誘発抗体は、「ＢＴ４７
４細胞におけるＰＩ取込みアッセイ」において、ＰＩの取込みを誘発するもので
ある。

【００１９】 「アポトーシスを誘発」又は「アポトーシスを誘発可能な」という用語は、ア
ネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及
び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)により決定されるようなプロ
グラム細胞死を誘発する抗体の能力を意味する。細胞は、ＥｒｂＢ２レセプター
を過剰発現するものである。好ましくは「細胞」は、腫瘍細胞、例えば乳房、卵
巣、胃、子宮体、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。
インビトロでは、細胞はＳＫＢＲ３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-Ｍ
Ｂ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシス
に伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホス
ファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；Ｄ
ＮＡ断片化は以下の実施例に開示されているようにＤＮＡラダーリングにより評
価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞の何
らかの増加により評価することができる。好ましくは、「ＢＴ４７４細胞を使用
するアネキシン結合アッセイ」において、アポトーシスを誘発する抗体は、未処
理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０
倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである(以下参照)。

【００２０】 時として、プロアポトーシス抗体は、ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３複合体のＨＲＧ
結合／活性化をブロックするものであろう(例えば７Ｆ３抗体)。他の状況では、
抗体はＨＲＧによるＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３レセプター複合体の活性化を有意に
はブロックしないものである(例えば７Ｃ２)。さらに、抗体は、アポトーシスを
誘発しながら、Ｓ期中の細胞のパーセントの大きな低減を誘発しない７Ｃ２のよ
うなものでありうる(例えば、対照に対して、これらの細胞のパーセントの約０
−１０％の低減だけを誘発するもの)。

【００２１】 関心のある抗体は、ヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合するが、他のタンパク質、
例えばｅｒｂＢ１、ｅｒｂＢ３及び／又はｅｒｂＢ４遺伝子によりコードされた
ものと有意には交差反応を起こさない７Ｃ２のようなものである。時として、抗
体は、例えばSchecterら, Nature 312:513(1984)及びDrebinら, Nature 312:545
-548(1984)に記載されているように、ラットｎｅｕタンパク質と有意には交差反
応しない。このような実施態様では、これらのタンパク質に対する抗体の結合度
合い(例えば内在性レセプターに対する細胞表面結合性)は、蛍光活性化細胞選別
(FACS)分析又は放射性免疫沈降(ＲＩＡ)による測定では約１０％未満であろう。

【００２２】 ここで使用される「ヘレグリン」(ＨＲＧ)は、ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３及びＥ
ｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タンパク質複合体を活性化するポリペプチドを意味する(す
なわち、そこに結合する際に複合体のチロシン残基のリン酸化を誘発する)。こ
の用語に包含される種々のヘレグリンポリペプチドは、例えば、Holmesら, Scie
nce, 256:1205-1210(1992)；国際公開９２／２０７９８；Wenら, Mol. Cell. Bi
ol., 14(3):1909-1919(1994)；及びMarchionniら, Nature, 362:312-318(1993)
に開示されている。この用語には、天然に生じたＨＲＧポリペプチドの変異体及
び／又は生物学的に活性なフラグメント、例えばそれらのＥＧＦ様ドメインフラ
グメント(例えばＨＲＧβ１_{１７７−２４４})が含まれる。

【００２３】 「ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３タンパク質複合体」と「ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４タン
パク質複合体」は、それぞれ、ＥｒｂＢ２レセプターと、ＥｒｂＢ３レセプター
又はＥｒｂＢ４レセプターの非共有結合的に結合したオリゴマーである。Sliwko
wskiら, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665(1994)に記載されているように
、これらのレセプターの両方を発現する細胞がＨＲＧに暴露された場合に複合体
が形成され、免疫沈降法により単離され、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析される。

【００２４】 「抗体」(Ａｂ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は同じ構造的特徴を有する糖タン
パク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫
グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである
。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫によ
り増加したレベルで産生される。

【００２５】 「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及
び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖
タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合して
おり、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の
中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を
有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を一端に
有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)を、他端に定常ドメインを有し；
軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは
重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変
ドメイン間の界面を形成すると考えられている。

【００２６】 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲
に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使
用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイ
ンにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高
頻度可変領域又は相補性決定領域(ＣＤＳ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮さ
れる。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と
呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある
場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結さ
れたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤ
Ｒは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原
結合部位の形成に寄与している(Kabatら, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-6
69頁[1991]を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連し
ているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活
性への抗体の関与を示す。

【００２７】 抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フ
ラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、その名称が容易に
結晶化する能力を表す、残りの「Ｆｃ」フラグメントが産生される。ペプシン処
理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')２
フラグメントが得られる。

【００２８】 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントで
ある。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ド
メインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは
相互に作用してＶ_Ｈ-Ｖ_Ｌ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６
つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(
又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合
部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。

【００２９】 またＦａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ
１)を有する。Ｆａｂ'フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシス
テインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点で
Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残
基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａ
ｂ')_２抗体フラグメントは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'フラグメン
トの対として生産された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。

【００３０】 任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメ
インのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明
確に区別される型の一つが割り当てられる。

【００３１】 重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラス
に割り当てることができる。免疫グロブリンには５つの主たるクラス：ＩｇＡ、
ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかはさらにサブクラ
ス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡ
及びＩｇＡ２に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常
ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グ
ロブリンのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。

【００３２】 「抗体」という用語は最も広義に使用され、特に無傷のモノクローナル抗体、
ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗
体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体フラグ
メントも含む。

【００３３】 「抗体フラグメント」には、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原
結合又は可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、
Ｆ(ａｂ')_２及びＦｖフラグメント；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体(Z
apataら, Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062[1995])；単鎖抗体分子；及び抗体
フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれる。

【００３４】 ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体
の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量
で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル
抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基
(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体
と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである
。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚
染されていないハイブリドーマ培養から合成される点で有利である。「モノクロ
ーナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の
特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するも
のではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初に
Kohlerら, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって
作ることができ、あるいは例えば組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例
えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例
えばClacksonら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 2
22:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離す
ることもできる。

【００３５】 ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の
抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同
一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体ク
ラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限り
それら抗体のフラグメントを特に含む(米国特許第４，８１６，５６７号; Morri
sonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。

【００３６】 非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫
グロブリン鎖あるいはそれらのフラグメント(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ
(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリ
ンに由来する最小配列を含むものである。大部分においてヒト化抗体はレシピエ
ントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所
望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によ
って置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、
ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基（ＦＲ）は、対応する非ヒト
残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入さ
れたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。
これらの修飾は抗体の特性を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、
ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリン
のものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配
列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全
てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的には
ヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。さらなる詳細
は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmanら, Nature 332, 323-329(
1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)を参照のこと。
ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が、関心のある抗原でマカクザルを免疫化す
ることにより生産された抗体から由来するプリマタイズした(PRIMATIZED(商品名
）)抗体を含む。

【００３７】 「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌド
メインを含有するもので、これらのドメインはポリペプチド単鎖に存在する。好
ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に対する所望の構造を形成で
きるようにするポリペプチドリンカーをＶ_ＨとＶ_Ｌドメインの間にさらに含んで
いる。ｓＦｖのレビューには、例えば、Plueckthun, The Pharmacology of Mono
clonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New Y
ork, pp.269-315(1994)を参照されたい。

【００３８】 「ダイアボディー」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フ
ラグメントを意味するもので、フラグメントは軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に結合し
た重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を同じポリペプチド鎖(Ｖ_Ｈ-Ｖ_Ｌ)に含有する。同じ
鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用すること
により、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原
結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許４０４０９７；国
際公開９３／１１１６１号；及びHollingerほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:6444-6448 (1993)にさらに詳しく記載されている。

【００３９】 「単離された」抗体とは、自然環境の成分から、同定され分離され及び／又は
回収されたものである。その自然環境における汚染成分は、抗体に対する診断又
は治療用途と干渉する物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質様又は非
タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ラウリ
ー(Lowry)法により測定して抗体の９５重量％以上、最も好ましくは９９重量％
以上、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あ
るいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分な程度に；あるい
は(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元
条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで、精製される。抗体の
自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換
え細胞内のインシトゥー抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗
体は少なくとも１つの精製工程により調製される。

【００４０】 「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ここで使用されると
きは、ＩｇＧ分子のインビボでの血清半減期を増加させる原因となるＩｇ分子(
例えばＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４)のＦｃ領域のエピトープを
意味する。

【００４１】 「治療」とは、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を意味する。治療の必
要があるものには、既に羅患しているもの、並びに疾患が予防されるべきものが
含まれる。 治療の目的とされる「哺乳動物」とは、ヒト、家庭又は農場用動物、及び動物
園、スポーツ又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む、哺乳
動物に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは哺乳動物はヒトである。

【００４２】 「疾患」は抗ＥｒｂＢ２抗体で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のこと
である。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含
む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで治療される疾患の例は、こ
れに限定されるものではないが、良性及び悪性の腫瘍；白血病及びリンパ悪性腫
瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上
皮、ストロマ及び割腔の疾患；及び炎症、血管形成及び免疫性疾患が含まれる。

【００４３】 「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬
剤の量に相当する。癌の場合は、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させ
；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある
程度に遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に
遅く、好ましくは止める）し；腫瘍の成長をある程度阻害し；及び／又は疾患に
関連する一つ或いはそれ以上の症状をある程度和らげることが可能である。ある
程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分
裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、効力は、例えば病状
の進行時間(ＴＴＰ)の評価、又は応答速度(ＲＲ)の決定及び／又は全生存を評価
することにより測定される。

【００４４】 「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長により特
徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態に相当するか表すものである。癌
の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉
腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定な例には、扁平上皮細胞癌
、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵
巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液
腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭
部及び頸部の癌が含まれる。

【００４５】 ここで使用される「細胞障害剤」という用語は、細胞機能を阻害又は抑制する
か、及び／又は細胞の崩壊を引き起こす物質を意味する。その用語は放射性アイ
ソトープ(例えばＩ^１３１、Ｉ^１２３、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ａｔ^２１１、Ｃｕ^６
７、Ｂｉ^２１２、Ｐｄ^１０９、Ｒｅ^１８８及びＲｅ^１８６)、化学療法剤、及び
毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒又はそれらのフラグメ
ントを含むことを意図している。

【００４６】 「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チ
オテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商品名）)のようなアルキル化剤；ブス
ルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル
類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及
びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；ウレドーパ(uredopa)；アルトレ
ートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド
、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメ
チローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメ
ラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスフ
ァミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、メクロレタミン、メクロレタミ
ンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェ
ネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスフ
ァミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；
クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、
ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマ
イシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)
、アザセリン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheam
icin)、カラビシン(carabicin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマ
イシン、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ダウノルビシン、マイコフェ
ノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン
(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピュー
ロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidi
n)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの
抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ）のような抗-
代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pte
ropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラ
ビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリ
ミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリ
ジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフ
ルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)、
５−ＦＵのようなプリン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ド
ロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testo
lactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタ
ンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャ
ー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブ
リン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレ
ン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)
；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(el
fornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；
硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾ
ン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン
(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポド
フィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；Ｐ
ＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(s
pirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquon
e)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカー
バジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(m
itolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；シトシンア
ラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例え
ばパクリタキセル（タキソール、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Franc
e）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカ
プトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチ
ナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ−１６）；イフォスフ
ァミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；
ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシ
ン；カルミノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナー
ト(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００
；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；
カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、
酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を
調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェ
ン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキ
シタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene
)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)；及び抗アンドロゲン、
例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)；並びに上記のもの
の製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。

【００４７】 ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいず
れかにおいて、細胞、特にＥｒｂＢ２過剰発現癌細胞の成長を阻害する化合物又
は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、Ｓ期におけるＥｒｂＢ２
過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例
には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤(Ｓ期以外の場所において)、例え
ばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーに
は、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及び
トポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン
、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤
、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバ
ジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシ
ル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「
細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation,
oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Mole
cular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Phil
adelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。また、４Ｄ５抗体(及びそ
の機能的等価物)も、この目的のために使用することができる。

【００４８】 「ドキソルビシン」はアントラサイクリン系抗生物質である。ドキソルビシン
の正式な化学名は(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２,３,６-トリデオキシ-α-Ｌ
-リキソ-ヘキソピラノシル)オキシ]-７,８,９,１０-テトラヒドロ-６,８,１１-
トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５,１２-ナフタセンジ
オンである。

【００４９】 「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質で
あって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用
語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン
、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには
、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、
及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロイン
スリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タ
ンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(Ｌ
Ｈ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫
瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチ
ド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエ
チン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αある
いはＴＧＦ-βのような形質転換成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及び
II；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェ
ロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)
のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳ
Ｆ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、
ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-
１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-
β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれ
る。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え
細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を
含む。

【００５０】 本出願で使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物に比べて、腫瘍細
胞に対する細胞毒性が低く、より活性な親形態に、酵素的に活性化又は転換され
得る製薬的に活性な物質の先駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman,
「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 1
4, pp.375-382, 615th Meeting Belfast(1986)及びStellaら,「Prodrugs:A Chem
ical Approach to Targeted Drug Delivery」, Directed Drug Delivery, Borch
ardtら,(編), pp.247-267, Humana Press(1985)を参照。 限定するものではない
が、本発明のプロドラッグには、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファ
ート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラ
ッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム
含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ
又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある
細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジ
ンプロドラッグが含まれる。限定するものではないが、本発明で使用されるプロ
ドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害剤の例には、前掲の化学療法剤が含まれ
る。

【００５１】 「リポソーム」は、哺乳動物への薬剤(例えば、ここで開示されている抗Ｅｒ
ｂＢ２抗体、場合によっては化学療法薬)の送達に有用な、種々の種類の脂質、
リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体である。リポソームの成分は、通
常、生物膜の脂質配置に似た２層構造に配されている。

【００５２】 「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／
又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販
用パッケージに通常含まれるインストラクションを意味するために使用される。

【００５３】 心臓保護剤(cardioprotectant）は、患者へのアントラサイクリン抗生物質及
び／又は抗-ＥｒｂＢ２抗体のような薬剤の投与に関連する心筋機能障害(すなわ
ち心筋症及び／又はうっ血性心不全）を予防する又は減じる化合物或いは組成物
である。心臓保護剤は、例えば、フリーラジカル媒介心毒性効果を妨害又は減じ
及び／又は酸化的ストレス障害を防止或いは減じる。現定義で包含される心臓保
護剤の例は、イオンキレート剤dexrazoxane(ICRF-187)(Seifertら，The Annals
of Phamacotherapy 28:1063-1072(1994)）；脂肪低減剤及び／又はプロブコール
(Singalら, J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063(1995)のような抗酸化剤；ア
ミフォスチン(amifostine）(アミノチオール2-［(3-アミノプロピル)アミノ］エ
タンチオール-二水素リン酸塩エステル、またWR-2721と呼ばれている、及びWR-1
065と呼ばれる、その脱リン酸化細胞取り込み型）及びS-3-(3-メチルアミノプロ
ピルアミノ)プロピルホスホチオ酸(WR-151327)、Greenら，Cancer Research 54:
738-741(1994)を参照のこと；ジゴキシン(Bristow, M.R. In : Bristow MR, ed.
Drug-Induced Heart Disease. New York : Elsevier 191-215[1980]）；メトプ
ロロール(Hjalmarsonら，Drugs 47: Suppl 4:31-9[1994]; 及びShaddy ら，Am.
Heart J. 129:197-9[1995]）のようなベーターブロッカー；ビタミンＥ；アスコ
ルビン酸(ビタミンＣ）；オレアノール酸、ウルソル酸及びＮ-アセチルシステイ
ン(ＮＡＣ）のようなラジカルスカベンジャー；アルファ-フェニル-ブチルニト
ロン(ＰＢＮ）のようなスピントラップ化合物(Paracchiniら，Anticancer Res.
13:1607-1612[1993]）；Ｐ２５１(Elbesen）のようなセレン有機化合物；類似物
を含む。

【００５４】 ＩＩ． 抗ＥｒｂＢ２抗体の製造 本発明で使用される抗体を製造するための例示的な技術を以下に説明する。抗
体の製造に使用されるＥｒｂＢ２抗原は、例えば所望のエピトープを含むＥｒｂ
Ｂ２の細胞外ドメイン又はそれらの一部の可溶形態のものであってよい。あるい
は、抗体を産生するために、その細胞表面にＥｒｂＢ２を発現する細胞(例えば
ＥｒｂＢ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ-３Ｔ３細胞；又は癌腫
株化細胞、例えばＳＫＢＲ３細胞、Stancovskiら, PNAS(USA)88:8691-8695[1991
]を参照)を使用することもできる。抗体の産生に有用な他の形態のＥｒｂＢ２は
当業者には明らかであろう。

【００５５】 (ｉ) ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮
下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される
種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニ
ン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビター
に関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホ
スクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシン
イミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、
又はＲとＲ^１が異なったアルキル基であるＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させるこ
とが有用である。

【００５６】 動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞ
れウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この
溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、
又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバ
ントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用
いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動
物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達する
まで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、
異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によっ
てコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた
タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバ
ンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。

【００５７】 (ｉｉ) モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する
、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な
突然変異を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個
の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。 例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最
初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国
特許第４，８１６，５６７号)によって作製することができる。 ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハ
ムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的
に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別
法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、
ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハ
イブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice,59-103頁[Academic Press, 1986])。

【００５８】 このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫
細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地
に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば
、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨
げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろ
う(ＨＡＴ培地)。

【００５９】 好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体
の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であ
る細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、
例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センタ
ー、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及び
ＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ
８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ
骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(K
ozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Produ
ction Techniques and Applications,51-63頁[Marcel Dekker, Inc., New York,
1987])。

【００６０】 ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体
の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生され
るモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例え
ばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によっ
て測定する。 モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 10
7:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。 所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な
方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principl
es and Practice, 59-103頁[Academic Press, 1986])。この目的に対して好適な
培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて
、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させる
ことができる。

【００６１】 サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-
セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析
、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製
法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。 モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウ
スの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオ
チドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリド
ーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたな
らば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブ
リンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムス
ター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクト
し、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗
体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら
, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Rev
s., 130:151-188(1992)がある。

【００６２】 更なる実施態様では、抗体又は抗体フラグメントは、McCaffertyら, Nature,
348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブ
ラリから分離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び
Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用し
たマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親
和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783[1992]
)、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビ
ナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-226
6[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に
対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法で
ある。

【００６３】 ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相
同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号
；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851[1984])、又は免疫グロブリン
コード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有
結合させることで修飾できる。 典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメイ
ンに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗
原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有
するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。

【００６４】 (ｉｉｉ) ヒト化又はヒト抗体 非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非
ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる
「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的には齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配
列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方
法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323
-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536[1988])を使用して実施
することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメ
インより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗
体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的
にはいくらかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体
の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。

【００６５】 抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の
可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物
抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対
してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体
のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 15
1:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901[1987])。他の方法では、
軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導さ
れる特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異
なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:42
85 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623[1993])。

【００６６】 更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持して
ヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親
及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物
の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的
に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリ
ン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは
購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能にお
ける残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合
能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原
に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ
残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般
的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。

【００６７】 別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリ
ーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、
マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体
マウスにおける抗体重鎖結合領域(Ｊ_Ｈ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生
の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体
マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒ
ト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1
993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Imm
uno., 7:33 (1993)を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブ
ラリから取り出すこともできる(Hoogenboomら, J.Mol.Biol., 227:381(1991)；M
arksら, J.Mol.Biol. 222:581-597[1991])。

【００６８】 (ｉｖ) 抗体フラグメント 抗体フラグメントを生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には
、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導され
た(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24
:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81[1985]を参照されたい)。しか
し、これらのフラグメントは現在は組換え宿主細胞により直接生産することがで
きる。例えば、抗体フラグメントは上において検討した抗体ファージライブラリ
から分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨフラグメントは大腸菌か
ら直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')_２フラグメントを形成
することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167[1992])。他のアプロ
ーチ法では、Ｆ(ａｂ')_２フラグメントを組換え宿主細胞培養から直接分離する
ことができる。抗体フラグメントの生産のための他の方法は当業者には明らかで
あろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖフラグメント(ｓｃＦＶ)である
。国際公開９３／１６１８５号を参照のこと。

【００６９】 (ｖ) 二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を
有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２タンパク質の２つの
異なるエピトープに結合しうる。例えば、一方のアームがＥｒｂＢ２のドメイン
１のエピトープ、例えば７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合し、他方が異なるＥｒ
ｂＢ２エピトープ、例えば４Ｄ５エピトープに結合しうる。他のこのような抗体
ではＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３及び／又はＥｒｂＢ４に対する結合部位と、ＥｒｂＢ
２結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＥｒｂＢ２アームは、ＥｒｂＢ２発現
細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、Ｆｃγ
ＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対する
Ｆｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血
球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＥ
ｒｂＢ２を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これ
らの抗体はＥｒｂＢ２結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、
抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート
又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長
抗体又は抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')_２二重特異性抗体)として調製する
ことができる。

【００７０】 二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異
性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき
、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-
539[1983])。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、
これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合
物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィ
ニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩
わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開９３／０８８２９号及びTrau
neckerら、EMBO J. 10:3655-3659[1991]に開示されている。

【００７１】 異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗
原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は
好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブ
リン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重
鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免
疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしている
ＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェ
クトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比
率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相
互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペ
プチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重
要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配
列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。

【００７２】 このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異
性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハ
イブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからな
る。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提
供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロ
ブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプ
ローチ法は、国際公開９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を
産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121
:210 (1986)を参照されたい。

【００７３】 国際公開９６／２７０１１号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の
抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパ
ーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣ_Ｈ３ド
メインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又
は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトフ
ァン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビ
ティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と
置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイ
マーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメ
カニズムが提供される。

【００７４】 二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合
体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。こ
のような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせ
ること（米国特許第4,676,980号）及びＨＩＶ感染の治療（WO 91/00360、WO 92/
200373及びEP 03089）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方
法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、そ
れらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号に記されている。

【００７５】 抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例
えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,
Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')
_２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤
亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジス
ルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアー
ト(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプ
トエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮ
Ｂ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性
抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。

【００７６】 最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、
これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.
Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')
_２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、イ
ンビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成され
た二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活
性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒト
Ｔ細胞へ結合することが可能であった。

【００７７】 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及び
Ｊｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異
なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で
還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成す
る。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ho
llingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された
「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供し
た。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短い
リンカーにより軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を結合してな
る。従って、一つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ _Ｈ ドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆ
ｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告され
ている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。

【００７８】 (ｖｉ) 所望の特性を有する抗体のスクリーニング 抗体を生産するための技術は上述した。ここで記載されている特徴を有する抗
体が選択される。 細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばＰＩ、トリパンブルー又は７
ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いを対照と比較して
求める。好ましいアッセイは「ＢＴ４７４細胞を使用するＰＩ取込みアッセイ」
である。このアッセイでは、ＢＴ４７４細胞(アメリカン・タイプ・カルチュア・コ
レクション[Rockville, MD])が、ダルベッコの変性イーグル培地(D-MEM)；１０
％の熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)と２ｍＭのＬ-グルタミンを補ったハムのＦ-１
２(５０：５０)で培養される。(従って、アッセイは補体及び免疫エフェクター
細胞の不在下で行われる)。ＢＴ４７４細胞を１００ｘ２０ｍｍ皿に、皿当たり
３ｘ１０^６の密度で播種し、一晩付着させたままにする。ついで培地を除去し、
新しい培地を単独で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替え
る。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、単層をＰＢＳで洗浄し
、トリプシン処理により分離する。ついで、１２００ｒｐｍ、５分間、４℃で細
胞を遠心分離し、ペレットを３ｍｌのＣａ^２＋結合氷冷バッファー(１０ｍＭの
Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ_２)に
再懸濁させ、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２ｘ７
５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。
サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(商品名）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥ
ＲＴ(商品名）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用
して分析する。ＰＩ取込みにより測定されるような、統計的に有意なレベルの細
胞死を誘発する抗体が選択される。

【００７９】 アポトーシスを誘発する抗体を選択するためには、「ＢＴ４７４細胞を使用す
るアネキシン結合アッセイ」が利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養し、先の段落
において記載したように皿に播種する。ついで培地を回収し、新しい培地を単独
で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替える。３日間インキ
ュベートした後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離する。つい
で細胞を遠心分離し、Ｃａ^２＋結合氷冷バッファーに再懸濁させ、細胞死アッセ
イに対して上述したようにチューブに等分する。ついでチューブに標識化アネキ
シン(例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ)(１μｇ／ｍｌ)を入れる。サンプルをＦＡ
ＣＳＣＡＮ(商品名）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(商品名）セ
ルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。
対照に対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘発する抗体がアポト
ーシス誘発抗体として選択される。

【００８０】 アネキシン結合アッセイに加えて、「ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色ア
ッセイ」が利用できる。このアッセイを行うために、先の２段落に記載したよう
に関心のある抗体で処理されたＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μｇ／ｍ
ｌのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２(商品名）と共にインキュベートし、ついでＭＯ
ＤＦＩＴＬＴ(商品名）ソフトウエア(Verity Software House)を使用し、ＥＰＩ
ＣＳ ＥＬＩＴＥ(商品名）フローサイトメータ(Coulter Corporation)で分析す
る。このアッセイを使用し、未処理細胞(最大１００％のアポトーシス細胞)より
も２倍又はそれ以上(好ましくは３倍以上)のアポトーシス細胞のパーセンテージ
の変化を誘発する抗体が、プロアポトーシス抗体として選択される。

【００８１】 関心のある抗体により結合したＥｒｂＢ２上のエピトープに結合する抗体をス
クリーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r Laboratory, Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交
差ブロッキングアッセイを実施することができる。別法として、従来から公知の
方法により、エピトープマッピングを実施することもできる。

【００８２】 細胞培養においてＳＫＢＲ３細胞の成長を５０-１００％阻害する抗ＥｒｂＢ
２抗体を同定するために、国際公開８９／０６６９２号に記載されているＳＫＢ
Ｒ３アッセイを実施することができる。このアッセイに従って、ＳＫＢＲ３細胞
を１０％のウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリンストレプトマイシンを補っ
たＤＭＥＭ及びＦ１２培地の１：１混合物で生育させる。ＳＫＢＲ３細胞を３５
ｍｍの細胞培養皿で２０，０００細胞を蒔く(２ｍｌ／３５ｍｍ皿)。１皿当り２
．５μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ２抗体を追加する。６日後、未処理細胞と比べた細
胞数を電子ＣＯＵＬＴＥＲ(商品名）細胞カウンタを使用してカウントする。Ｓ
ＫＢＲ３細胞の成長を５０-１００％阻害する抗体が、上述したアポトーシス抗
体と組合せるために選択される。

【００８３】 (ｖｉｉ) エフェクター機能の設計 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における
抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導
入して、この領域における鎖間ジスルイド結合の形成を許容する。このようにし
て産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／
又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しう
る。Caronら, J.Exp.Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes,B. J.Immunol. 148
:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体
は、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘ
テロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。別法として、二重Ｆｃ領
域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計する
ことができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参
照。

【００８４】 (ｖｉｉｉ) 免疫コンジュゲート また本発明はここで記載され、細胞障害剤、例えば化学療法剤、毒素(例えば
、細菌、真菌、植物または動物由来の酵素活性毒又はそれらのフラグメント)、
又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)に抱合した抗体を含
有する免疫コンジュゲートに関する。

【００８５】 このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述している。 抗体のコンジュゲート及び一つ以上の小分子毒素、例えばカリケアミシン(cal
icheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第５，２０８，０２０号）、
トリコテン(trichothene）及びＣＣ１０６５もここにおいて考慮される。本発明
のひとつの好ましい実施態様では、抗体は、一つ以上のマイタンシン(maytansin
e)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子）と共役し
ている。マイタンシンは、例えばＭａｙ−ＳＨ３へ還元されるＭａｙ−ＳＳ−Ｍ
ｅへ変換され、修飾抗体(Chariら，Cancer Research 52:127-131[1992]）と反応
してマイタンシノイド(maytansinoids)−抗体免疫コンジュゲートを生じる。

【００８６】 その他の対象免疫コンジュゲートは、一つ以上のカリケアマイシン(calicheam
icin)分子と共役している抗ＥｒｂＢ２抗体を包含する。抗体のカリケアマイシ
ンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができ
る。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものでは
ないが、γ_１ ^Ｉ、α_２ ^Ｉ、α_３ ^Ｉ、Ｎ−アセチルγ_１ ^Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ^Ｉ _１（
Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342[1993]及びLodeら，Cancer Research
58:2925-2928[1998]）を含む。

【００８７】 使用可能な酵素活性毒及びそのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリ
ア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノ
ーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modecc
in)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites
fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリ
カーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)
、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン
(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、
ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictoc
in)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含ま
れる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２を
参照のこと。

【００８８】 本発明は、更に、抗体と核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮ
Ａエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；DNA分解酵素）をと
もなう化合物との間に形成される免疫コンジュゲートについて考慮する。

【００８９】 種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗ＥｒｂＢ２抗体の生成に利用でき
る。具体例にはＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｓｍ^{１ ５３} 、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２及びＬｕの放射線各種が含まれる。

【００９０】 抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリン
グ剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート
(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例え
ばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスク
シンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合
物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム
誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイ
ソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素
化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製さ
れる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載
されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナ
トベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放
射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開
９４／１１０２６号を参照されたい。 リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」
でもよい。例えば、酸に弱いリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチル
リンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら，Cancer Research 52:127-131
[1992]）を使用してもよい。

【００９１】 あるいは、抗ＥｒｂＢ２抗体及び細胞毒性剤を含んでなる融合タンパク質を、
例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。 他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプタ
ー」(例えばストレプトアビジン)に抗体がコンジュゲートされ得、ここで、抗体
-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用
し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレ
オチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。

【００９２】 (ｉｘ) 免疫リポソーム ここで開示されている抗ＥｒｂＢ２抗体は、免疫リポソームとして処方するこ
ともできる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1
980)；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号に記載
されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が
増したリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。

【００９３】 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物
を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められ
たフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。
本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Marti
nら,J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソーム
にコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム
内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参
照されたい。

【００９４】 (ｘ) 抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ) また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公
開８１／０１１４５号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化
酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用するこ
とができる。例えば国際公開８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７
８号を参照されたい。 ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形
態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。

【００９５】 限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含
有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；
スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスル
ファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化す
るのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアー
ゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例
えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化
するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用
なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル
化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラ
クトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに
有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシ
アセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化さ
れた薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシ
リンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵
素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるた
めに使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458[1987]を参照)
。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍
細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。

【００９６】 この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討
したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＥｒｂＢ２抗体に共有的
に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも結合領域を本
発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質
を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成するこ
とができる(Neubergerら, Nature 312:604-608[1984])。

【００９７】 (ｘｉ) 抗体-サルベージレセプター結合エピトープ融合 本発明のある実施態様においては、例えば腫瘍浸透性を増大させるために無傷
の抗体よりも抗体フラグメントを使用することが望ましい。この場合、その血清
半減期を増大させるために抗体フラグメントを改変することが望ましい。これは
、例えば、抗体フラグメントにサルベージレセプター結合エピトープを導入する
ことにより(例えば、抗体フラグメント中の適当な領域の突然変異により、ある
いはついで抗体フラグメントの何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプ
チド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを導入することにより)
、達成できる。

【００９８】 インビボでの半減期が増加したこのような抗体変異体を調製するための組織的
方法は、いくつかの工程を含んでなる。第１にはＩｇＧ分子のＦｃ領域のサルベ
ージレセプター結合エピトープの配列及び高次構造を同定することが含まれる。
ひとたびこのエピトープが同定されると、同定された結合エピトープの配列及び
高次構造を含むように、関心のある抗体の配列を修飾する。配列を変異させた後
、抗体変異体を検査して元の抗体よりもインビボ半減期が長くなっているかどう
か調査する。検査では、抗体変異体がより長いインビボ半減期を有していなかっ
たら、その配列をさらに改変して、同定された結合エピトープの配列及び高次構
造が含まれるようにする。改変された抗体をインビボ半減期が長くなっているか
否かについて検査し、このプロセスを、より長いインビボ半減期を示す分子が得
られるまで続ける。

【００９９】 関心のある抗体にこのようにして導入されているサルベージレセプター結合エ
ピトープは、上述したような任意の適切なエピトープであり、その性質は、例え
ば修飾されている抗体のタイプに依存する。転移は、関心のある抗体がここで記
載した生物学的活性を有するようになされる。

【０１００】 エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二つのループからの一又は
複数のアミノ酸残基が抗体フラグメントの類似位置に移される領域を構成する。
更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二つのループの３又はそれ以上の残
基が移される。更に好ましくは、エピトープはＦｃ領域(例えばＩｇＧの)のＣＨ
２ドメインから取上げられ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶ_Ｈ領域、あるいは一
以上のそのような領域に移される。別法として、エピトープをＦｃ領域のＣＨ２
ドメインから取上げ、抗体フラグメントのＣ_Ｌ領域又はＶ_Ｌ領域、又は両方に移
す。ここにおいて、参考文献として特別に取り上げられた、１９９８年４月１４
日発行の米国特許第５，７３９，２７７号を参照のこと。

【０１０１】 ＩＩＩ． 医薬製剤 本発明で使用される抗体の治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の
形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製
度を有する抗体とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences
, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許容できる担
体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒
性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメ
チオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム
クロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウ
ム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えば
メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノー
ル；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリ
ペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリ
ビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ア
ルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデ
キストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ス
クロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム
等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴ
ＷＥＥＮ(商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商品名）又はポリエチレングリコール
(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。

【０１０２】 ここで、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好まし
くは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。例えば、
ある製剤に、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、又はＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２(例えば
ＥｒｂＢ２の異なるエピトープに結合する抗体)、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４に結
合する抗体をさらに提供することが望ましい。あるいは、又は加えて、組成物は
細胞障害剤、サイトカイン又は成長阻害剤を含有してもよい。但し、細胞障害剤
はアントラサイクリン誘導体、例えばドキソルビシン又はエピルビシン以外のも
のである。このような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組合せて存
在する。

【０１０３】 また活性成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製された
マイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-
マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロ
イド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロ
エマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉する
ことができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th
edition, A. Osol編(1980)に開示されている。 インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅
菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。

【０１０４】 徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固
体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又
はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポ
リエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、
又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３，７７３，９１９号)
、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレ
ン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(
商品名）(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能
なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン
-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できる
が、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化抗体は
、長時間体内に残存すると、３７℃の水分に曝されることで変性又は凝集し、生
物学的活性の喪失や免疫原生の変化のおそれがある。関連するメカニズムに応じ
て安定性を得るための合理的な処置が案出できる。例えば、凝集機構がチオ−ジ
スルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリ
ル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使
用し、特定の重合体マトリックス組成物を開発することで安定化を達成すること
ができる。 腫瘍特異性を増すために、生分解性ナノ粒子(例えば、ポリ乳酸コーグリコー
ル酸）へ共役させた抗ＥｒｂＢ２抗体が、またここにおいて考慮されている。

【０１０５】 ＩＶ． 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた治療 ここにおける発明は、ＥｒｂＢ２タンパク質を発現している腫瘍に罹りやすい
又はそのような腫瘍であると診断されたヒトの患者を治療するための三段階の方
法を提供する。一般的には、治療されるべき腫瘍は原発腫瘍である。第一段階で
は、治療的有効量の抗ＥｒｂＢ２抗体を、腫瘍の大きさを減じるため、又は腫瘍
を除去するために、手術前に患者へ投与する。患者は、随意的に更に、手術前に
一つ以上の化学治療剤で治療される。第二段階では、腫瘍を、標準的な手術法(
例えば、乳腺腫瘤摘出又は乳房切除）によって除去する。手術に続き第三段階で
は、治療的有効量の抗ＥｒｂＢ２抗体、又は少なくとも一つの化学治療剤を、疾
患の再発の可能性を減じるために患者へ投与する。一般的には、手術後に、抗Ｅ
ｒｂＢ２抗体は患者へ投与され、随意的にこの段階の治療において、一つ以上の
化学的治療剤が患者へ投与される。

【０１０６】 本発明によれば、抗ＥｒｂＢ２抗体を、ＥｒｂＢ２タンパク質の過剰発現及び
／又は活性化により特徴付けられる種々の病状の治療に使用することが考えられ
ている。病状又は疾患の例には、良性又は悪性の腫瘍(例えば、腎性、肝臓、腎
臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、直腸結腸、前立腺、膵臓、肺、陰門、甲状腺、肝臓
(hepatic)の癌腫；肉腫；神経膠芽細胞腫、及び様々な種類の頭部及び頸部の腫
瘍)；白血病及びリンパ悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及
び他の腺、マクロファージ、上皮、ストロマ及び割腔の疾患；及び炎症、血管由
来及び免疫性疾患が含まれる。

【０１０７】 本発明の抗体は、公知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわた
る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液
包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与さ
れる。抗体の静脈投与が好ましい。

【０１０８】 アントラサイクリン誘導体以外の化学療法剤と抗ＥｒｂＢ２抗体を組合せる場
合、化学療法剤は、好ましくはタキソイド、例えばパクリタキセル又はドキセタ
キセル(doxetaxel）である。組合せ投与には、別々の調製物又は単一の医薬製剤
を使用する同時投与、及び好ましくは両方(又は全ての)活性剤が同時にその生物
学的活性を働かせる時間がある、いずれかの順での連続投与が含まれる。このよ
うな化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者のインストラクションに従
い使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化
学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service M.C.Perry編, Wi
lliams ＆Wilkins, Baltimore, MD(1992)に記載されている。化学療法剤は抗体
投与の前又は後に、又は投与と同時に与られる。また抗体は、抗-エストロゲン
化合物、例えばタモキシフェン又は抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(o
napristone)(欧州特許第６１６８１２号を参照)と、このような分子に対して既
知の投薬量で組合せてもよい。

【０１０９】 また、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、Ｅｒｂ
Ｂ４、又は血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することが望まれ
る。あるいは、又は加えて、２又はそれ以上の抗ＥｒｂＢ２抗体を患者に同時投
与してもよい。しばしば、一又は複数のサイトカインを患者に投与することも有
益なことである。好ましい実施態様では、ＥｒｂＢ２抗体が成長阻害剤と共に同
時投与される。例えば、まず成長阻害剤が投与され、続いてＥｒｂＢ２抗体が投
与される。しかしながら、同時投与又はＥｒｂＢ２抗体の投与を最初に行うこと
も考えられる。成長阻害剤の適切な投与量は現在使用されている量であり、成長
阻害剤と抗ＥｒｂＢ２抗体の組合せ作用(相乗作用)に応じてより少なくすること
ができる。心臓毒性が観察された場合には、適切な処置として心臓保護剤を患者
へ投与してもよい。

【０１１０】 病気の予防又は治療のための抗体の適切な投与量は、上述するように、治療さ
れる病気の種類、病気の重症度及び過程、抗体を防止目的で投与するのか治療目
的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする
医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に
適切に投与される。

【０１１１】 病気の種類及び重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入
のいずれであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１-２０ｍｇ
／ｋｇ)の抗体が患者への最初の投与量の候補である。上述した因子に応じて、
典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上
の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病
気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬
計画も有効であろう。この治療の進行状態は通常の技術やアッセイで容易にモニ
ターされる。適切な投与量のさらなる情報は、以下の実施例で提供されている。

【０１１２】 Ｖ． 製造品 本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造
品が提供される。製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を含んでなる。適
切な容器には、例えばボトル、ガラス瓶、シリンジ等が含まれる。容器はガラス
又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治
療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器
は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はガ
ラス瓶であってよい)。組成物中の少なくとも１つの活性剤は抗ＥｒｂＢ２抗体
である。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の治療
に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、
例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する第
２の容器をさらに具備する。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針
及びシリンジを含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んで
いてもよい。

【０１１３】材料の寄託 以下のハイブリドーマ株化細胞を、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクシ
ョン12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA(ATCC)に寄託した。 抗体名 ATCC 番号 寄託日 ７Ｃ２ ATCC HB-12215 1996年10月17日 ７Ｆ３ ATCC HB-12216 1996年10月17日 ４Ｄ５ ATCC CRL 10463 1990年 5月24日

【０１１４】 本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例により例証する。本明細書
中で開示された全ての引用例は、出典明示によりここに特に取り入れている。

【０１１５】実施例１ 抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体 ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに特異的な抗
ＥｒｂＢ２ＩｇＧ_１κマウスモノクローナル抗体４Ｄ５を、Fendlyら,Cancer Re
search 50:1550-1558(1990)及び１９９７年１０月１４日に発行の米国特許５，
６７７，１７１に記載されているようにして生産した。簡単には、Hudziakら, P
roc. Natl. Acad. Sci.(USA)84:7159(1987)に記載されているようにして生産さ
れたＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２-３_４００細胞(約１ｘ１０^５ＥｒｂＢ２分子/細胞
を発現)を２５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で収集し、
ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスに、０、２、５及び７
週に、０．５ｍｌのＰＢＳに１０^７細胞が入ったものを腹腔内注射した。^３２Ｐ
標識化ＥｒｂＢ２を免疫沈降させた抗血清を有するマウスに、９及び１３週に、
小麦麦芽凝集素-セファロース(ＷＧＡ)精製ＥｒｂＢ２膜抽出物を腹腔内注射し
た。続いて０．１ｍｌのＥｒｂＢ２調製物を静脈内注射し、脾細胞をマウス骨髄
腫系Ｘ６３-Ａｇ８.６５３と融合させた。ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡ及び
放射性免疫沈降により、ＥｒｂＢ２結合性についてスクリーニングした。アイソ
タイプ適合対照として、ＭＯＰＣ-２１(ＩｇＧ１)(Cappell, Durham, NC)を使用
した。

【０１１６】 ４Ｄ５抗体のヒト化体(ハーセプチン(HERCEPTIN(登録商標）))は、共通ヒト免
疫グロブリンＩｇＧ_１(ＩｇＧ_１)のフレームワークにマウス４Ｄ５抗体の相補性
決定領域を挿入して設計した(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-
4289[1992]；1998年10月13日発行の米国特許第5,821,337号)。得られたヒト化抗
ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体は、ｐ１８５^ＨＥＲ２に対し高い親和性を有し(D
illohiation定数[Ｋ_ｄ]＝０．１ｎｍｏｌ／Ｌ)、インビトロ及びヒト異種移植片
において、高レベルのｐ１８５^ＨＥＲ２を含む乳癌細胞の成長を顕著に阻害し、
抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を誘発し、広範な治療を前に受けたＥｒｂＢ
２過剰発現転移性乳癌患者において、単一の薬剤としての臨床的に活性であるこ
とが見出された。

【０１１７】 ハーセプチン(登録商標)は、培地に抗体を分泌する、大規模に成長した遺伝子
操作されたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞により生産される。抗
体は標準的なクロマトグラフィーと濾過方法を使用して培地から精製される。こ
の研究で使用される抗体の各ロットをアッセイし、同一性、純度及び効能、並び
に滅菌性と安全性に関する食品医薬品局の要求を満たしていることを証明した。 ＥｒｂＢ２(ＨＥＲ２)オンコジーンの過剰発現(免疫組織化学又は蛍光インサ
イツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)により測定して２＋ないし３＋)によっ
て特徴付けられる原発性乳腫瘍の症状は、ここにおいて治療される。ＥｒｂＢ２
の腫瘍発現は、先に記載されているようにして(Slamonら, Science 235:177-182
[1987];Slamonら，Science 244:707-712[1989]）、患者のパラフィン保存腫瘍ブ
ロックから調製された薄片を免疫組織化学分析することにより測定することがで
きる。腫瘍細胞の少なくとも２５％がＥｒｂＢ２に特徴的な膜染色を示す場合、
腫瘍はＥｒｂＢ２を過剰発現すると考えられる。

【０１１８】 患者は、最初に、手術前に腫瘍の大きさを減じる又は腫瘍を除去するために、
随意的にパクリタキセル(TAXOL(登録商標））との組合せで、８−２４週間に渡
ってＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標）によって治療される。０日には、９０分以
上の時間をかけて、４ｍｇ／ｋｇのハーセプチン(登録商標）を静脈投与した。
７日目に開始して、患者は９０分以上の時間をかけて、２ｍｇ／ｋｇの抗体(静
脈内)の毎週の投与を受けた。患者は、更にパクリタキセル(TAXOL(登録商標））
を投与されてもよい。ハーセプチン(登録商標）抗体の最初の投与は、化学療法
の最初のサイクルを２４時間先行する。抗体の初期投与が十分に許容された場合
は、抗体の次の投与は化学療法投与の直前になされる。抗体の最初の投与が十分
に許容されなかった場合は、化学療法剤投与より２４時間前に次の注入を継続し
た。パクリタキセル(TAXOL(登録商標））を、静脈投与により３時間以上かけて
１７５ｍｇ／ｍ^２の投与量で与えた。パクリタキセルを受けた全ての患者には、
パクリタキセルの投与１２及び６時間前に経口的に２０ｍｇｘ２のデキサメタゾ
ン(又はその等価物)；パクリタキセルの投与３０分前に静脈内に５０ｍｇのジフ
ェンヒドラミン(又はその等価物)、及びパクリタキセルの投与３０分前に静脈内
に３００ｍｇのジメチジン(又は他のＨ_２ブロッカー)を前投与した。上記の治療
の後、応答の典型的な手段は、手術の直前に評価されてもよい；すなわち観察下
のすべての腫瘍小塊の交叉寸法直径の産物の合計である。 上記に記した治療に続き、腫瘍は、標準的な手術法によって除去される；乳腺
腫瘤摘出又は乳房切除である。病理学的応答は、この段階で評価してもよい。

【０１１９】 手術後、患者は、疾患の再発の可能性を減じるために、随意的にパクリタキセ
ル(TAXOL(登録商標））との組合せによりＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標）によっ
て治療される。０日には、９０分以上の時間をかけて、４ｍｇ／ｋｇのハーセプ
チン(登録商標）を静脈投与した。７日目に開始して、患者は９０分以上の時間
をかけて、２ｍｇ／ｋｇの抗体(静脈内)の毎週の投与を受けた。ＨＥＲＣＥＰＴ
ＩＮ(登録商標）による治療は、一年間継続される。患者は、更にパクリタキセ
ル(TAXOL(登録商標））を６−２４週間投与されてもよい。ハーセプチン(登録商
標）抗体の最初の投与は、化学療法の最初のサイクルを２４時間先行する。抗体
の初期投与が十分に許容された場合は、抗体の次の投与は化学療法投与の直前に
なされる。抗体の最初の投与が十分に許容されなかった場合は、化学療法剤投与
より２４時間前に次の注入を継続した。パクリタキセル(TAXOL(登録商標））を
、静脈投与により３時間以上かけて１７５ｍｇ／ｍ^２の投与量で与えた。パクリ
タキセルを受けた全ての患者は、上記に記した前投与を受けた。 上記の治療方法に従って治療された患者は、全体的に改善された生存者、及び
／又は腫瘍の進行時間(ＴＴＰ)の減小を示した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ１】 切断変異体分析法及び部位特異的突然変異誘発(Nakamuraら,
J. of Virology 67(10):6179-6191[1993年10月]；Renzら, J. Cell Biol. 125(
6):1395-1406[1994年6月])により決定されたＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのエピ
トープマッピングを示す。抗増殖性ＭＡｂｓ ４Ｄ５及び３Ｈ４は、膜貫通ドメ
インに隣接して結合している。種々のＥｒｂＢ２-ＥＣＤ切断又は点変異を、ポ
リメラーゼ連鎖反応法を使用してｃＤＮＡから調製した。ＥｒｂＢ２変異体は、
哺乳類発現プラスミドにおけるｇＤ融合タンパク質として発現された。この発現
プラスミドとして、挿入ｃＤＮＡの下流に位置するポリアデニル化シグナルとＳ
Ｖ４０末端を有するサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサーが使用
される。プラスミドＤＮＡを２９３Ｓ細胞にトランスフェクションした。トラン
スフェクション１日後、細胞を、^３５Ｓメチオニン及び^３５Ｓシステインを各々
２５ｕＣｉと、透析されたウシ胎児血清を１％含むメチオニン及びシステインフ
リーの低グルコースＤＭＥＭ中で、一晩かけて代謝標識した。上清を回収し、Ｅ
ｒｂＢ２ ＭＡｂ又は対照抗体のいずれかを上清に添加し、４℃で２−４時間イ
ンキュベートした。複合体を沈殿させ、１０-２０％のトリシンＳＤＳ勾配ゲル
に塗布し、１００Ｖで電気泳動にかけた。ゲルは膜上にエレクトロブロットされ
、これをオートラジオグラフィーで分析した。配列番号：３及び４が、それぞれ
３Ｈ４及び４Ｄ５エピトープを示すものである。

【Ｆｉｇ２】 ＥｒｂＢ２のドメイン１のアミノ酸配列(配列番号：１)に下
線を付して示すものである。太字のアミノ酸は欠失マッピングにより決定された
ＭＡｂ ７Ｃ２及び７Ｆ３により認識されたエピトープ、すなわち「７Ｃ２／７
Ｆ３エピトープ」(配列番号：２)の位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA19 NA14 ZB262 4C085 AA13 AA14 DD62 4C086 AA01 AA02 BA02 MA01 MA02 MA04 NA14 ZB26

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）治療的有効量の抗ＥｒｂＢ２抗体によって患者を治療
   する、（ｂ）外科的に腫瘍を除去する、及び（ｃ）治療的有効量の抗ＥｒｂＢ２
   抗体又は化学治療剤によって患者を治療する、段階を順次行うことを含んでなる
   、ＥｒｂＢ２タンパク質が発現される腫瘍に罹りやすい又はその腫瘍であると診
   断されたヒトの患者を治療する方法。
2. 【請求項２】 段階（ａ）が、更に治療的有効量の化学療法剤によって患者
   を治療することを含む、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 段階（ｃ）が、治療的有効量の抗ＥｒｂＢ２抗体で患者を治
   療することを含む、請求項１の方法。
4. 【請求項４】 段階（ｃ）が、更に治療的有効量の化学療法剤によって患者
   を治療することを含む、請求項３の方法。
5. 【請求項５】 腫瘍がＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現する、請求項１の方
   法。
6. 【請求項６】 乳腫瘍、扁平上皮細胞腫瘍、小細胞肺腫瘍、非小細胞肺腫瘍
   、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍、神経膠芽細胞腫瘍、子宮頸腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、
   膀胱腫瘍、肝細胞腫瘍、大腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、唾液腺腫瘍、
   腎臓腫瘍、肝臓腫瘍、前立腺腫瘍、産卵口腫瘍、甲状腺腫瘍、肝腫瘍、頭部腫瘍
   、頸部腫瘍から構成される群から選択される腫瘍である、請求項５の方法。
7. 【請求項７】 腫瘍が乳腫瘍である、請求項６の方法。
8. 【請求項８】 抗体がＥｒｂＢ２タンパク質の細胞外ドメインへ結合する、
   請求項１の方法。
9. 【請求項９】 抗体がＥｒｂＢ２細胞外ドメイン配列内のエピトープ４Ｄ５
   へ結合する、請求項８の方法。
10. 【請求項１０】 抗体がヒト化４Ｄ５抗ＥｒｂＢ２抗体である、請求項９の
    方法。
11. 【請求項１１】 化学療法剤がタキソイドである、請求項２の方法。
12. 【請求項１２】 タキソイド(taxoid）がパクリタキセル(paclitaxel）又は
    ドキシタキセル(doxetaxel）である、請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 化学療法剤がタキソイドである、請求項４の方法。
14. 【請求項１４】 容器と、抗ＥｒｂＢ２抗体を含んでなる該容器内の組成物
    と、請求項１に記載の方法による患者の治療が必須である旨のインストラクショ
    ンを含むパッケージ挿入物とを含んでなる製造品。