BRPI0712077A2 - prolongamento de sobrevivência de pacientes com cáncer com niveis elevados de egf ou tgf-alfa - Google Patents

Abstract

PROLONGAMENTO DE SOBREVIVêNCIA DE PACIENTES COM CáNCER COM NìVEIS ELEVADOS DE EGF OU TGF-ALFA. A presente invenção refere-se ao prolongamento da sobrevivêneia em um paciente com câncer, onde o paciente está produzindo um nívelelevado de EGF ou TGF-alfa, através de tratamento do paciente com um inibidor de dimerização de HER, tal como pertuzumab.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROLON- GAMENTO DE SOBREVIVÊNCIA DE PACIENTES COM CÂNCER COM NÍVEIS ELEVADOS DE EGF OU TGF-ALFA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao prolongamento de sobrevivên- cia de um paciente com câncer, onde o paciente está produzindo um nível elevado de EGF ou TGF-alfa, através de tratamento do paciente com um inibidor de dimerização de HER1 tal como pertuzumab.

Antecedentes da Invenção

Receptores de HER e anticorpos contra o mesmo

A família HER de quínases de tirosina de receptor é um media- dor importante de crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A famí- lia de receptor inclui quatro membros distintos, incluindo receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR, ErbBI ou HER1), HER2 (ErbB2 ou p185 neü), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2).

O EGFR, codificado pelo gene eròB1, foi causalmente implicado em malignidade humana. Em particular, expressão aumentada de EGFR tem sido observada câncer de mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estô- mago, bem como glioblastomas. Expressão aumentada do receptor de EG- FR é freqüentemente associada à produção aumentada do ligante de EGFR, fator alfa de crescimento de transformação (TGF-α) pelas mesmas células tumorígenas, resultando em ativação do receptor através de uma via estimu- latória autócrina. Baselga e Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64: 127-154 (1994). Anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR ou seus ligantes, TGF-α e EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de tais malignidades. Veja, por exemplo, Baselga e Mendelsohn., supra; Masui e colaboradores, Câncer Research 44: 1002-1007 (1984); e Wu e colabora- dores, J. Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995).

O segundo membro da família HER1 p185 neü, foi originalmente identificado como o produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos quimicamente tratados. A forma ativada do proto-oncogene neu re- sulta de uma mutação de ponto (valina para ácido glutâmico) na região transmembrana da proteína codificada. Amplificação do homólogo humano de neu é observada em cânceres de mama e ovariano e se correlaciona com um pobre prognóstico (Slamon e colaboradores, Science, 235: 177-182 (1987); Slamon e colaboradores, Science, 244: 707-712 (1989); e Pat. US N0. 4.968.603). Até o momento, nenhuma mutação de ponto análoga àquela no proto-oncogene neu foi reportada para tumores humanos. Superexpres- são de HER2 (freqüentemente, mas não uniformemente, em virtude de am- plificação de gene) também foi observada em outros carcinomas, incluindo carcinomas do estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas e bexiga. Veja, dentre outros, King e colaboradores, Scien- ce, 229: 974 (1985); Yokota e colaboradores, Lancet: 1: 765-767 (1986); Fu- kushige e colaboradores, Mol Cell Biol, 6: 955-958 (1986); Guerin e colabo- radores, Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen e colaboradores, Oncoge- ne, 4: 81-88 (1989); Yonemura e colaboradores, Câncer Res., 51: 1034 (1991); Borst e colaboradores, Gynecol. Oncol, 38: 364(1990); Weinere co- laboradores, Câncer Res., 50: 421-425 (1990); Kernel e colaboradores, Cân- cer Res., 50: 5184 (1990); Park e colaboradores, Câncer Res., 49: 6605 (1989); Zhau e colaboradores, Mol Carcinog., 3: 254-257 (1990); Aasland e colaboradores, Br. J. Câncer 57: 358-363 (1988); Williams e colaboradores, Pathobiology 59: 46-52 (1991); e McCann e colaboradores, Câncer, 65: 88- 92 (1990). HER2 pode ser superexpresso em câncer de próstata (Gu e cola- boradores, Câncer Lett. 99: 185-9 (1996); Ross e colaboradores, Hum. Pa- thol. 28: 827-33 (1997); Ross e colaboradores, Câncer 79: 2162-70 (1997); e Sadasivan e colaboradores, J. Urol 150: 126-31 (1993)).

Anticorpos dirigidos contra p185neü de rato e os produtos da pro- teína HER2 humana foram descritos.

Drebin e colaboradores estimularam anticorpos contra o produto do gene neu de rato, p185neu. Veja, por exemplo, Drebin e colaboradores, Cell 41: 695-706 (1985); Myers e colaboradores, Meth. Enzym. 198: 277-290 (1991); e W094/22478. Drebin e colaboradores, Oncogene 2: 273-277 (1988) reportam que misturas de anticorpos reativas com duas regiões dis- tintas de p185"eo resultam em efeitos anti-tumor sinergísticos sobre células ΝΙΗ-3Τ3 /7et/-transformadas implantadas em camundongos nus. Veja tam- bém Patente U.S. 5.824.311 emitida em 20 de Outubro de 1998.

Hudziak e colaboradores, Mol Celi Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) descrevem a geração de um painel de anticorpos ao HER2 os quais foram caracterizados usando a linhagem de célula de tumor de mama humano SK- BR-3. A proliferação celular relativa das células SK-BR-3 após exposição aos anticorpos foi determinada através de coloração com violeta cristal das monocamadas após 72 horas. Usando esse ensaio, inibição máxima foi ob- tida com o anticorpo denominado 4D5, o qual inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação celular em uma extensão menor nesse ensaio. Descobriu-se ainda que o anticorpo 4D5 sen- sibiliza linhagens de células de tumor de mama superexpressando HER2 aos efeitos citotóxicos do TNF-α. Veja também Patente U.S. N0 5.677.171 emitida em 14 de Outubro de 1997. Os anticorpos ao HER2 discutidos em Hudziak e colaboradores são ainda caracterizados em Fendly e colaborado- res, Câncer Research 50: 1550-1558 (1990); Kotts e colaboradores, In Vitro 26(3): 59A (1990); Sarup e colaboradores, Growth Regulation 1: 72-82 (1991); Shepard e colaboradores, J. Clin. Immunol 11(3): 117-127 (1991); Kumar e colaboradores, Mol. Cell. Biol. 11 (2): 979-986 (1991); Lewis e cola- boradores, Câncer Immunol. Immunother. 37: 255-263 (1993); Pietras e co- laboradores, Oncogene 9: 1829-1838 (1994); Vitetta e colaboradores, Cân- cer Research 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski e colaboradores, J. Biol Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott e colaboradores, J. Biol. Chem. 266: 14300-5 (1991); D'souza e colaboradores, Proc. Nati Acad. Sei. 91: 7202-7206 (1994); Lewis e colaboradores, Câncer Research 56: 1457-1465 (1996); e Schaefer e colaboradores, Oncogene 15: 1385-1394 (1997).

Uma versão humanizada recombinante do anticorpo ao HER2 de murino 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, trastuzumab ou HERCEP- TIN®; Patente U.S. N0 5.821.337) é clinicamente ativo em pacientes com cânceres de mama metastáticos superexpressando HER2 que receberam terapia anti-câncer extensiva prévia (Baselga e colaboradores, J. Clin. Oncoi 14: 737-744 (1996)). Trastuzumab recebeu aprovação para comercialização da administração da comida e fármaco em 25 de Setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores expressam a proteína HER2.

Outros anticorpos a HER2 com várias propriedades foram des- critos em Tagliabue e colaboradores, Int. J. Câncer 47: 933-937 (1991); Mc- Kenzie e colaboradores, Oncogene 4: 543-548 (1989); Maier e colaborado- res, Câncer Res. 51: 5361-5369 (1991); Bacus e colaboradores, Molecular Carcinogenesis 3: 350-362 (1990); Stancovski e colaboradores, PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991); Bacus e colaboradores, Câncer Research 52: 2580- 2589 (1992); Xu e colaboradores, Int. J. Câncer 53: 401-408 (1993); W094/00136; Kasprzyk e colaboradores, Câncer Research 52: 2771-2776 (1992); Hancockero e colaboradores, Câncer Res. 51: 4575-4580 (1991); Shawver e colaboradores, Câncer Res. 54: 1367-1373 (1994); Arteaga e colaboradores, Câncer Res. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth e colaborado- res, J. Bioi Chem. 267: 15160-15167 (1992); Patente U.S. N0 5.783.186; e Klapper e colaboradores, Oncogene 14: 2099-2109 (1997).

Triagem por homologia resultou na identificação de dois outros membros da família do receptor de HER: HER3 (Pats. US N0S 5.183.884 e 5.480.968, bem como Kraus e colaboradores, PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989)) e HER4 (Ped. Pat. EP N0 599.274; Plowman e colaboradores, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman e colaboradores, Nature, 366: 473-475 (1993)). Ambos esses receptores mostram expressão aumentada sobre pelo menos algumas linhagens de células de câncer de mama.

Os receptores de HER são geralmente encontrados em várias combinações em células e acredita-se que a heterodimerização aumenta a diversidade das respostas celulares a uma variedade de Iigantes de HER (Earp e colaboradores, Breast Câncer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR é ligado por seis Iigantes diferentes; o fator de crescimento epidérmico (EGF), fator alfa de crescimento de transformação (TGF-α), am- piregulina, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF), betacelulina e epiregulina (Groenen e colaboradores, Growth Factors 11: 235-257 (1994)). Uma família de proteínas heregulina resultante de splicing alternativo de um único gene são Iigantes para HER3 e HER4. A família de heregulina inclui heregulinas alfa, beta e gama (Holmes e colaboradores, Science, 256: 1205-1210 (1992); Patente U.S. N0 5.641.869; e Schaefer e colaboradores, Oncogene 15: 1385-1394 (1997)); fatores de diferenciação de neu (NDFs), fatores de crescimento glial (GGFs); atividade de indução do receptor de acetilcolina (ARIA); e fator derivado de neurônio sensório e mo- tor (SMDF). Para uma revisão, veja Groenen e colaboradores, Growth Fac- tors, 11: 235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & CeH Neurosci. 7: 247-262 (1996) e Lee e colaboradores, Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995). Recentemente, três Iigantes adicionais de HER foram identificados: neuregulina-2 (NRG-2) a qual é reportada como se ligando a HER3 ou HER4 (Chang e colaboradores, Nature 387, 509-512 (1997); e Carraway e colaboradores, Nature 387: 512- 516 (1997)); neuregulina-3 a qual se liga a HER4 (Zhang e colaboradores, PNAS (USA) 94(18): 9562-7 (1997)); e neuregulina-4 a qual se liga a HER4 (Harari e colaboradores, Oncogene 18: 2681-89 (1999)). HB-EGF, betacelu- Iina e epiregulina também se ligam a HER4.

Embora EGF e TGF-α não se liguem a HER2, o EGF estimula EGFR e HER2 a formar um heterodímero, o qual ativa EGFR e resulta em transfosforilação de HER2 no heterodímero. Dimerização e/ou transfosforila- ção parecem ativar a quínase de tirosina HER2. Veja Earp e colaboradores, supra. Da mesma forma, quando HER3 é co-expressa com HER2, um com- plexo de sinalização ativo é formado e anticorpos dirigidos contra HER2 são capazes de romper esse complexo (Sliwkowski e colaboradores, J. Biol Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Adicionalmente, a afinidade de HER3 pela heregulina (HRG) é aumentada para um estado de maior afinidade quando co-expressa com HER2. Veja também Levi e colaboradores, Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435 (1995); e Lewis e colaboradores, Câncer Res., 56: 1457-1465 (1996) com relação ao complexo de proteína HER2- HER3. HER4, semelhante à HER3, forma um complexo de sinalização ativo com HER2 (Carraway e Cantley, Cell 78: 5-8 (1994)). Publicações de patente relacionadas a anticorpos a HER inclu- em: US 5.677.171, US 5.720.937, US 5.720.954, US 5.725.856, US 5.770.195, US 5.772.997, US 6.165.464, US 6.387.371, US 6.399.063, US2002/0192211 A1, US 6.015.567, US 6.333.169, US 4.968.603, US 5.821.337, US 6.054.297, US 6.407.213, US 6.719.971, US 6.800.738, US2004/0236078 A1, US 5.648.237, US 6.267.958, US 6.685.940, US 6.821.515, W098/17797, US 6.127.526, US 6.333.398, US 6.797.814, US 6.339.142, US 6.417.335, US 6.489.447, W099/31140, US2003/0147884 A1, US2003/0170234 A1, US2004/0037823 A1, US2005/0002928 A1, US 6.573.043, US 6.905.830, US2003/0152987 A1, W099/48527, US2002/0141993 A1, US2005/0244417 A1, Patente US N0 6.949.245, US2003/0086924, US2004/ 0013667 A1, W000/69460, US2003/0170235 A1, US 7.041.292, W001/ 00238, US2006/0083739, W001/15730, US 6.627.196 B1, US 6.632.979 B1, W001/00244, US2002/0001587 A1, US2002/0090662 A1, US 6.984.494 B2, W001/89566, US2002/0064785, US2003/0134344, WO~ 2005/099756, US2006/0013819, W02006/07398 A1, US2006/0018899, WO 2006/33700, US2006/0088523, US 2006/0034840, WO 04/24866, US2004/0082047, US2003/0175845 A1, W003/087131, US2003/0228663, W02004/008099 A2, US2004/0106161, W02004/048525, US2004/0258685 A1, WO 2005/ 16968, US2005/0038231 A1, US 5.985.553, US 5.747.261, US 4.935.341, US 5.401.638, US 5.604.107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 B1, EP 494.135 B1, US 5.824.311, EP 444.181 B1, EP 1.006.194 A2, US 2002/0155527 A1, WO 91/02062, US 5.571.894, US 5.939.531, EP 502.812 B1, WO 93/03741, EP 554.441 B1, EP 656.367 A1, US 5.288.477, US 5.514.554, US 5.587.458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5.877.305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5.856.089, WO 94/22478, US 5.910.486, US 6.028.059, WO 96/07321, US 5.804.396, US 5.846.749, EP 711.565, WO 96/16673, US 5.783.404, US 5.977.322, US 6.512.097, WO 97/00271, US 6.270.765, US 6.395.272, US 5.837.243, WO 96/40789, US 5.783.186, US 6.458.356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6.214.388, US 5.925.519, WO 98/02463, US 5.922.845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5.994.071, WO 98/45479, US 6.358.682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 Α1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, W002/05791, WO 02/11677, US 6.582.919, US2002/0192652 Α1, US 2003/0211530 Α1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6.602.670 Β2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, W003/012072, WO 03/028638, US 2003/ 0068318, WO 03/041736, EP 1.357.132, US 2003/0202973, US 2004/ 0138160, US 5.705.157, US 6.123.939, EP 616.812 B1,US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6.403.630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6.333.348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/ 0051785 A1, US 6.767.541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 e WO 03/86467.

Diagnóstico

Pacientes tratados com o anticorpo ao HER2 trastuzumab são selecionados para terapia baseado em superexpressão/amplificação de HER2. Veja, por exemplo, W099/31140 (Paton e colaboradores), US2003/0170234 A1 (Hellmann, S.) e US2003/0147884 (Paton e colabora- dores); bem como WOO 1/89566, US2002/0064785 e US2003/0134344 (Mass e colaboradores;. Veja também Patente US N0 6.573.043, Patente US N0 6.905.83 e US2003/0152987, Cohen e colaboradores, referente à imuno- histoquímica (IHC) e hibridização por fluorescência in situ (FISH) para detec- ção de superexpressão e amplificação de HER2.

O W02004/053497 e US2004/024815 A1 (Bacus e colaborado- res), bem como US 2003/0190689 (Crosby e Smith), referem-se à determi- nação ou previsão da resposta à terapia com trastuzumab. O US2004/ 013297A1 (Bacus e colaboradores) refere-se à determinação ou previsão de resposta à terapia com anticorpo a EGFR ABX0303. O W02004/000094 (Bacus e colaboradores) é dirigido à determinação da resposta ao GW572016, um inibidor de quínase de tirosina de EGFR-HER2 de pequena molécula. O W02004/063709, Amler e colaboradores, refere-se a biomarca- dores e métodos para determinação da sensibilidade ao inibidor de EGFR erlotinib HCI. O US2004/0209290 e W004/065583, Cobleigh e colaborado- res, referem-se a marcadores de expressão de gene para o prognóstico de câncer de mama. Veja também W003/078662 (Baker e colaboradores) e W003/040404 (Bevilacqua e colaboradores). O W002/44413 (Danenberg, K.) refere-se à determinação de expressão de gene de EGFR e HER2 para determinação de um regime quimioterapêutico.

Pacientes tratados com pertuzumab podem ser selecionados pa- ra terapia baseado em ativação ou dimerização de HER. Publicações de pa- tente referentes ao pertuzumab e seleção de pacientes para terapia com o mesmo incluem: Patente US N0 6.949.245, W001/00245, US2005/0208043, US2005/0238640, US2006/0034842 e US2006/0073143 (Adams e colabora- dores); US2003/0086924 (Sliwkowski, M.); US2004/0013667 A1 (Sliwkowski, M.); bem como W02004/008099 A2 e US2004/0106161 (Bossenmaier e co- laboradores).

Cronin e colaboradores, Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004) des- crevem a medição de expressão de gene em tecidos incrustados em parafi- na armazenados. Ma e colaboradores, Câncer Cell 5: 607-616 (2004) des- crevem caracterização de perfil genético através de microarranjo com oligo- nucleotídeo genético usando RNA isolado de seções de tecido de tumor to- madas de biópsias primárias armazenadas.

O pertuzumab (também conhecido como anticorpo monoclonal humano recombinante 2C4; OMNITARG®, Genentech1 Inc., South San Francisco) representa o primeiro de uma nova classe de agentes conhecidos como inibidores de dimerização de HER (HDI) e funciona para inibir a capa- cidade de HER2 de formar heterodímeros ativos com outros receptores de HER (tais como EGFR/HER1, HER3 e HER4) e é ativo a despeito dos níveis de expressão de HER2. Veja, por exemplo, Harari e Yarden, Oncogene 19: 6102-14 (2000); Yarden e Sliwkowski, Nat Rev Mol Cell Biol 2: 127-37 (2001); Sliwkowski, Nat Struct Biol 10: 158-9 (2003); Cho e colaboradores, Nature 421: 756-60 (2003); e Malik e colaboradores, Pro Am Soc Câncer Res 44: 176-7 (2003). Foi demonstrado que o bloqueio, pelo pertuzumab, da formação de heterodímeros de HER2-HER3 em células tumorígenas inibe a sinaliza- ção celular crítica, o que resulta em proliferação e sobrevivência reduzidas do tumor (Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127-37 (2002)).

O pertuzumab tem sofrido testagem como um agente único na clínica com um experimento em fase Ia em pacientes com cânceres avança- dos e experimentos em fase II em pacientes com câncer ovariano e câncer de mama, bem como câncer de pulmão e próstata. Em um estudo em Fase I, pacientes com tumores sólidos incuráveis, localmente avançados, recor- rentes ou metastáticos que tinham progredido durante ou após terapia pa- drão foram tratados com pertuzumab fornecido intravenosamente a cada 3 semanas. O pertuzumab foi, em geral, bem tolerado. Regressão de tumor foi obtida em 3 de 20 pacientes cuja resposta foi avaliada. Dois pacientes tive- ram respostas parciais confirmadas. Doença estável durante mais de 2,5 meses foi observada em 6 de 21 pacientes (Agus e colaboradores, Pro Am Soc Clin Oncol 22: 192 (2003)). Em doses de 2,0-15 mg/kg, a farmacocinéti- ca do pertuzumab foi linear e a liberação média oscilava de 2,69 a 3,74 mL/dia/kg e a meia-vida de eliminação terminal média oscilava de 15,3 a 27,6 dias. Anticorpos ao pertuzumab não foram detectados (Allison e colabo- radores, Pro Am Soc Clin Oncol 22: 197(2003)).

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona os dados clínicos de pacientes com câncer humano tratados com um inibidor de dimerização de HER, per- tuzumab. Os pacientes foram avaliados com relação aos níveis de expres- são de vários biomarcadores no soro e a correlação entre tais níveis de ex- pressão e o benefício clínico em resposta ao tratamento com trastuzumab foi avaliada. Os dados clínicos indicaram que pacientes com câncer ovariano que produzem níveis elevados de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa) mostraram benefícios para a sobrevivência com relação a pacientes com níveis normais de EGF ou TGF-alfa, em resposta ao tratamento com pertuzumab. Benefícios simila- res foram esperados em outro experimento clínico em andamento, incluindo pacientes com câncer ovariano resistente à platina, câncer peritoneal primá- rio e do tubo falopiano.

Consequentemente, em um aspecto, a invenção refere-se a um método para prolongar a sobrevivência de um paciente com câncer compre- endendo administração de um inibidor de dimerização de HER ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a sobrevivência do paciente, em que o paciente é determinado como produzindo um nível elevado de fator de cres- cimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa) e o câncer é selecionado do grupo consistindo de câncer ovaria- no, câncer peritoneal e câncer do tubo falopiano.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para pro- longar a sobrevivência de um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo falopiano compreendendo administração de pertuzumab ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a sobrevivência do paciente, em que o paciente é determinado como produzindo um nível elevado de fator de cres- cimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa).

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para prolongar a sobrevivência isenta de progressão (PFS) de um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo falopiano compreendendo adminis- tração de pertuzumab ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a PFS no paciente, em que é determinado que o soro do paciente tem um ní- vel elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) no mesmo.

Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um método para prolongar a sobrevivência isenta de progressão (PFS) de um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo falopiano compreendendo admi- nistração de pertuzumab ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a PFS no paciente, em que é determinado que o soro do paciente tem um ní- vel elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator alfa de cresci- mento de transformação (TGF-alfa) no mesmo.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método de seleção de um paciente para tratamento com um inibidor de dimerização de HER compreendendo tratamento do paciente com o inibidor de dimerização de HER se é determinado que o paciente produz um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transfor- mação (TGF-alfa).

Para todos os aspectos, em uma modalidade particular, desco- briu-se que o paciente tem um nível elevado de EGF no soro.

Em outra modalidade, descobriu-se que o paciente tem um nível elevado de TGF-alfa no soro.

Em outra modalidade, o inibidor de dimerização de HER inibe a heterodimerização de HER.

Em uma outra modalidade, o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo ao HER o qual pode, por exemplo, se ligar a um receptor de HER selecionado do grupo consistindo de EGFR1 HER2 e HER3.

Em uma modalidade particular, o anticorpo se liga a HER2, tal como o Domínio Il do domínio extracelular de HER2 ou a uma junção entre os domínios I1 Il e Ill do domínio extracelular de HER2.

Em uma modalidade específica, o inibidor de dimerização de HER é pertuzumab.

O câncer pode ser, por exemplo, câncer ovariano avançado, re- sistente ou recorrente, câncer ovariano resistente à platina, câncer peritoneal primário ou do tubo falopiano.

O inibidor de dimerização de HER pode ser administrado como um agente anti-tumor único ou em combinação com um segundo agente te- rapêutico ao paciente.

O segundo agente terapêutico pode ser, por exemplo, um agen- te quimioterapêutico, um anticorpo ao HER, um anticorpo dirigido contra um antígeno tumor-associado, um composto anti-hormonal, um cardioprotetor, uma citocina, um fármaco EGFR-objetivado, um agente anti-angiogênico, um inibidor de quínase de tirosina, um inibidor de COX, um fármaco anti- inflamatório não esteroidal, um inibidor de farnesil transferase, um anticorpo que se liga à proteína oncofetal CA 125, vacina de HER2, uma terapia de objetivação de HER1 um inibidor de Raf ou Ras1 uma doxorubicina lipossô- mica, um topotecan, um taxano, um inibidor duplo de quínase de tirosina, TLK286, EMD-7200, um medicamento que trata náusea, um medicamento que previne ou trata rash cutâneo ou terapia padrão para acne, um medica- mento que trata ou previne diarréia, um medicamento para redução da tem- peratura corporal ou um fator de crescimento hematopoiético.

Em uma modalidade particular, o segundo agente terapêutico é um agente quimioterapêutico, tal como um agente quimioterapêutico anti- metabólito, por exemplo, gemcitabina, trastuzumab, erlotinib ou bevacizumab.

O benefício clínico é, de preferência, medido em termos de so- brevivência, incluindo sobrevivência global (OS) e sobrevivência isenta de progressão (PFS), de preferência PFS.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um kit compreendendo um inibidor de dimerização de HER e uma bula ou rótulo na embalagem in- dicando um benefício clínico para o inibidor de dimerização de HER se o paciente a ser tratado produz um nível elevado de fator de crescimento epi- dérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa), em que o benefício clínico é, de preferência, sobrevivência prolongada, em par- ticular PFS prolongada.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de promoção de um inibidor de dimerização de HER para tratar pacientes que produzem um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa), onde a promoção pode tomar quaisquer formas, incluindo a forma de um material escrito, tal como uma bula na embalagem.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 proporciona um esquema da estrutura da proteína HER2 e seqüências de aminoácido para os Domínios I-IV (SEQ ID N0S 19- 22, respectivamente) do domínio extracelular da mesma.

As figuras 2A e 2B representam alinhamentos das seqüências de aminoácido dos domínios variável de cadeia leve (Vl) (figura 2A) e variá- vel de cadeia pesada (Vh) (figura 2B) do anticorpo monoclonal de murino 2C4 (SEQ ID N0S 1 e 2, respectivamente); os domínios Vl e Vh da variante 574/pertuzumab (SEQ ID N0S 3 e 4, respectivamente) e estrutura de con- senso de VL e VH humana (hum κ1, subgrupo I kappa leve; humlll, subgru- po Ill pesada) (SEQ ID N0S 5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identifi- cam diferenças entre os domínios variáveis do pertuzumab e do anticorpo monoclonal de murino 2C4 ou entre domínios variáveis do pertuzumab e a estrutura humana. Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) estão entre parênteses.

As figuras 3A e 3B mostram as seqüências de aminoácido da cadeia leve do pertuzumab (figura 3 A; SEQ ID N0 13) e cadeia pesada (figu- ra 3B; SEQ ID N0 14). CDRs são mostradas em negrito. A massa molecular calculada da cadeia leve e da cadeia pesada é de 23.526,22 Da e 49.216,56 Da (cisteínas na forma reduzida). A porção de carboidrato está presa a Asn 299 da cadeia pesada.

A figura 4 representa, esquematicamente, a ligação de 2C4 ao sítio de ligação heterodimérica de HER2, desse modo, impedindo a hetero- dimerização com EGFR ou HER3 ativada.

A figura 5 representa o acoplamento de HER2/HER3 às vias de MAPK e Akt.

A figura 6 compara várias atividades do trastuzumab e pertuzu- mab.

As figuras 7A e 7B mostram as seqüências de aminoácido da cadeia leve do trastuzumab (figura 7A; SEQ ID N0 15) e cadeia pesada (figu- ra 7B; SEQ ID N0 16), respectivamente.

As figuras 8A e 8B representam uma seqüência de cadeia leve do pertuzumab variante (figura 8A; SEQ ID N0 17) e uma seqüência de ca- deia pesada do pertuzumab variante (figura 8B; SEQ ID N0 18), respectiva- mente.

A figura 9 representa a correlação de Spearman entre os bio- marcadores HER2, TGF-alfa, ampiregulina e EGF.

A figura 10 representa a média/correlação de marcadores com co-variáveis clínicas. A figura 11 mostra a determinação de limite de corte ("cutoff") usando a sobrevivência isenta de progressão (PFS) para HER2, TGF-alfa, ampiregulina e EGF.

A figura 12 mostra a determinação de limite de corte usando a sobrevivência global (OS) para HER2, TGF-alfa, ampiregulina e EGF.

A figura 13 reflete a distribuição de pacientes de acordo com os limite de cortes.

A figura 14 representa as curvas de PFS e OS de KapLan Meir separadas por 3 marcadores de limite de corte determinados na análise uni- variável para o marcador HER2.

A figura 15 representa as curvas de PFS e OS de KapLan Meir separadas por 3 marcadores de limite de corte determinados na análise uni- variável para o marcador TGF-alfa.

A figura 16 representa as curvas de PFS e OS de KapLan Meir separadas por 3 marcadores de limite de corte determinados na análise uni- variável para o marcador EGF.

Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas

I. Definições

"Sobrevivência" refere-se à vida restante do paciente e inclui sobrevivência global, bem com sobrevivência isenta de progressão.

"Sobrevivência global" refere-se à vida restante do paciente du- rante um período de tempo definido, tal como 1 ano, 5 anos, etc. a partir do momento de diagnóstico ou tratamento.

"Sobrevivência isenta de progressão" refere-se à vida restante do paciente, sem a progressão ou piora do câncer.

Por "prolongamento de sobrevivência" entenda-se aumento na sobrevivência global ou isenta de progressão em um paciente tratado com relação a um paciente não tratado (isto é, com relação a um paciente não tratado com um inibidor de dimerização de HER, tal como pertuzumab) ou com relação a um paciente que não mostra ativação de HER e/ou com rela- ção a um paciente tratado com um agente anti-tumor aprovado (tal como topotecan ou doxorubicina lipossômica, onde o câncer é câncer ovariano). Aqui, "tempo para progressão da doença" ou "TTP" refere-se ao tempo, geralmente medido em semanas ou meses, para o momento de tra- tamento inicial (por exemplo, com um inibidor de dimerização de HER, tal como pertuzumab) até que o câncer progrida ou piore. Tal progressão pode ser avaliada pelo clínico habilitado. No caso de câncer ovariano, por exem- plo, a progressão pode ser avaliada através do RECIST (vejam por exemplo, Therasse e colaboradores, J. Nat Câncer Inst. 92(3): 205-216 (2000)).

Por "prolongamento de TTP" entenda-se aumento do tempo pa- ra progressão da doença em um paciente tratado com relação a um paciente não tratado (isto é, com relação a um paciente não tratado com um inibidor de dimerização de HER, tal como pertuzumab) ou com relação a um pacien- te que não mostra ativação de HER e/ou com relação a um paciente tratado com um agente anti-tumor aprovado (tal como topotecan ou doxorubicina lipossômica, onde o câncer é câncer ovariano).

Uma "resposta objetiva" refere-se a uma resposta mensurável, incluindo resposta completa (CR) ou resposta parcial (PR).

Por "resposta completa" ou "CR" entenda-se o desaparecimento de todos os sinais de câncer em resposta ao tratamento. Isso nem sempre significa que o câncer tenha sido curado.

"Resposta parcial" ou "PR" refere-se a uma diminuição no tama- nho de um ou mais tumores ou lesões ou na extensão do câncer no corpo, em resposta ao tratamento.

Um "receptor de HER" é uma quínase de tirosina de proteína de receptor a qual pertence à família do receptor de HER e inclui os receptores de EGFR, HER2, HER3 e HER4. O receptor de HER geralmente compreen- derá um domínio extracelular, o qual pode se ligar a um Iigante de HER e/ou dimerizar com outra molécula de receptor de HER; um domínio transmem- brana lipofílico; um domínio de quínase de tirosina intracelular conservado; e um domínio de sinalização carbóxi-terminal abrigando vários resíduos de tirosina os quais podem ser fosforilados. O receptor de HER pode ser um receptor de HER com "seqüência nativa" ou uma "variante de seqüência de aminoácido" do mesmo. De preferência, o receptor de HER é um receptor de HER humano com seqüência nativa.

Os termos "ErbB1," "HER1", "receptor de fator de crescimento epidérmico" e "EGFR" são usados permutavelmente aqui e referem-se ao EGFR conforme descrito, por exemplo, em Carpenter e colaboradores, Ann. Rev. Biochem. 56: 881-914 (1987), incluindo formas mutantes que ocorrem naturalmente do mesmo (por exemplo, um EGFR mutante com delação con- forme em Humphrey e colaboradores, PNAS (USA) 87: 4207-4211 (1990)). erbB1 refere-se ao gene que codifica o produto da proteína de EGFR.

As expressões "ErbB2" e "HER2" são usadas permutavelmente aqui e referem-se à proteína HER2 descrita, por exemplo, em Semba e co- laboradores, PNAS (USA) 82: 6497-6501 (1985) e Yamamoto e colaborado- res, Nature 319: 230-234 (1986) (número de acesso ao Genebank X03363). O termo "enbB2" refere-se ao gene que codifica a ErbB2 humana e "neu" refere-se ao gene que codifica p185"eu de rato. HER2 preferida é HER2 hu- mana de seqüência nativa.

Aqui, "domínio extracelular de HER2" ou "ECD de HER2" refere- se a um domínio de HER2 que está fora de uma célula, quer ancorado a uma membrana celular ou em circulação, incluindo fragmentos do mesmo. Em uma modalidade, o domínio extracelular de HER2 pode compreender quatro domínios: "Domínio I" (resíduos de aminoácido de cerca de 1-195 SEQ ID NO: 19), "Domínio II" (resíduos de aminoácido de cerca de 196-319 SEQ ID NO: 20), "Domínio IH" (resíduos de aminoácido de cerca de 320-488 SEQ ID NO: 21) e "Domínio IV" (resíduos de aminoácido de cerca de 489- 630; SEQ ID NO: 22) (numeração de resíduo sem peptídeo sinalizador). Ve- ja Garrett e colaboradores, Mol. Cell.. 11: 495-505 (2003), Cho e colaborado- res, Nature 421: 756-760 (2003), Franklin e colaboradores, Câncer Cell 5: 317-328 (2004) e Plowman e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 1746- 1750 (1993), bem como figura 1 aqui.

"ErbB3" e "HER3" referem-se ao polipeptídeo receptor conforme descrito, por exemplo, nas Pats. US N0S 5.183.884 e 5.480.968, bem como em Kraus e colaboradores, PNAS (USA) 86: 9193-9197 (1989).

Os termos "ErbB4" and "HER4" referem-se aqui ao polipeptídeo receptor conforme descrito, por exemplo, no Ped. de Pat. EP N0 599.274; Plowman e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 1746-1750 (1993); e Plowman e colaboradores, Nature, 366: 473-475 (1993), incluindo isoformas do mesmo, por exemplo, conforme descrito no W099/19488, pu- blicado em 22 de Abril de 1999.

Por "ligante de HER" entenda-se um polipeptídeo o qual se liga a e/ou ativa um receptor de HER. O ligante de HER de interesse particular aqui é um ligante de HER humano de seqüência nativa, tal como fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage e colaboradores, J. Biol. Chem. 247: 7612-7621 (1972)); fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa) (Marquardt e colaboradores, Science 223: 1079-1082 (1984)); ampiregulina, também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrino de queratinócito (Shoyab e colaboradores, Science 243: 1074-1076(1989); Ki- mura e colaboradores, Nature 348: 257-260 (1990); e Cook e colaboradores, Mol. Cell. Biol. 11: 2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing e colaboradores, Science 259: 1604-1607 (1993); e Sasada e colaboradores, Biochem. Bio- phys. Res. Commun. 190: 1173 (1993)); fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina (HB-EGF) (Higashiyama e colaboradores, Science 251: 936-939 (1991)); epiregulina (Toyoda e colaboradores, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500 (1995); e Komurasaki e colaboradores, Oncogene 15: 2841-2848 (1997)); uma heregulina (veja abaixo); neuregulina-2 (NRG-2) (Carraway e colaboradores, Nature 387: 512-516 (1997)); neuregulina-3 (NRG-3) (Zhang e colaboradores, Proc. Nati Acad. Sei. 94: 9562-9567 (1997)); neuregulina-4 (NRG-4) (Harari e colaboradores, Oncogene 18: 2681-89 (1999)); e cripto (CR-1) (Kannan e colaboradores, J. Biol. Chem. 272(6): 3330-3335 (1997)). Ligantes de HER os quais se ligam ao EGFR incluem EGF, TGF-α, ampire- gulina, betacelulina, HB-EGF e epiregulina. Ligantes de HER os quais se ligam a HER3 incluem heregulinas. Ligantes de HER capazes de ligação a HER4 incluem betacelulina, epiregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e heregulinas.

"Heregulina" (HRG), quando usada aqui, refere-se a um polipep- tídeo codificado pelo produto do gene de heregulina, conforme descrito na Patente U.S. N0 5.641.869 ou Marchionni e colaboradores, Nature, 362: 312- 318 (1993). Exemplos de heregulinas incluem heregulina-a, heregulina-βΐ, heregulina-p2 e heregulina-p3 (Holmes e colaboradores, Science, 256: 1205- 1210 (1992); e Patente U.S. N0 5.641.869); fator de diferenciação de neu (NDF) (Peles e colaboradores, Cell 69: 205-216 (1992)); atividade de indu- ção do receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls e colaboradores, Cell 72: 801- 815 (1993)); fatores de crescimento glial (GGFs) (Marchionni e colaborado- res, Nature, 362: 312-318 (1993)); fator derivado de neurônio sensório e mo- tor (SMDF) (Ho e colaboradores, J. Bioi Chem. 270: 14523-14532 (1995)); γ-heregulina (Schaefer e colaboradores, Oncogene 15: 1385-1394 (1997)).

Um "dímero de HER" aqui é um dímero não covalentemente as- sociado compreendendo pelo menos dois receptores de HER. Tais comple- xos podem se formar quando uma célula expressando dois ou mais recepto- res de HER é exposta a um Iigante de HER e pode ser isolada através dé imunoprecipitação e analisada através de SDS-PAGE, conforme descrito em Sliwkowski e colaboradores, J. Biol Chem., 269(20): 14661-14665 (1994), por exemplo. Outras proteínas, tal como uma subunidade do receptor de citocina (por exemplo, gp130), podem estar associadas ao dímero. De prefe- rência, o dímero de HER compreender HER2.

Um "heterodímero de HER" aqui é um heterodímero não cova- lentemente associado compreendendo pelo menos dois receptores de HER diferentes, tais como heterodímeros de EGFR-HER2, HER2-HER3 ou HER2-HER4.

Um "inibidor de HER" é um agente o qual interfere com ativação ou função de HER. Exemplos de inibidores de HER incluem anticorpos a HER (por exemplo, anticorpos a EGFR, HER2, HER3 ou HER4); fármacos EGFR-objetivados; antagonistas de HER de pequena molécula; inibidores de quínase de tirosina de HER; inibidores duplos de quínase de tirosina de HER2 e EGFR, tal como lapatinib/GW572016; moléculas anti-senso (veja, por exemplo, W02004/87207); e/ou agentes que se ligam a ou interferem com a função de moléculas de sinalização a jusante, tais como MAPK ou Akt (veja figura 5). De preferência, o inibidor de HER é um anticorpo ou pequena molécula a qual se liga a um receptor de HER.

Um "inibidor de dimerização de HER" é um agente o qual inibe a formação de um dímero de HER ou heterodímero de HER. De preferência, o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo, por exemplo, um anticorpo o qual se liga a HER2 no sítio de ligação heterodimérica do mesmo. O inibidor de dimerização de HER mais preferido aqui é pertuzumab ou MAb 2C4. A ligação de 2C4 ao sítio de ligação heterodimérica de HER2 é ilustrada na figura 4. Outros exemplos de inibidores de dimerização de HER incluem an- ticorpos os quais se ligam ao EGFR e inibem a dimerização do mesmo com um ou mais receptores de HER (por exemplo, anticorpo monoclonal ao EG- FR 806, MAb 806, o qual se liga ao EGFR ativado ou "não unido"; veja Johns e colaboradores, J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)); anti- corpos os quais se ligam a HER3 e inibem a dimerização do mesmo com um ou mais de outros receptores de HER; anticorpos os quais se ligam a HER4 e inibem a dimerização do mesmo com um ou mais de outros receptores de HER; inibidores de dimerização de peptídeo (Patente US N0 6.417.168); ini- bidores de dimerização anti-senso, etc.

Um "inibidor de dimerização de HER2" é um agente que inibe a formação de um dímero ou heterodímero compreendendo HER2.

Um "anticorpo ao HER2" é um anticorpo que se liga a um recep- tor de HER. Opcionalmente, o anticorpo ao HER ainda interfere com ativa- ção ou função de HER. De preferência, o anticorpo ao HER se liga ao recep- tor HER2. Um anticorpo ao HER2 de interesse particular aqui é pertuzumab. Outro exemplo de um anticorpo ao HER2 é trastuzumab. Exemplos de anti- corpos ao EGFR incluem cetuximab e ABX0303.

"Ativação de HER" refere-se à ativação ou fosforilação de qual- quer um ou mais dos receptores de HER. Geralmente, ativação de HER re- sulta em transdução de sinal (por exemplo, aquela causada por um domínio de quínase intracelular de fosforilação de resíduos de tirosina do receptor de HER no receptor de HER ou um polipeptídeo substrato). Ativação de HER pode ser mediada através de ligação ao ligante de HER a um dímero de HER compreendendo o receptor de HER de interesse. Ligação do Iigante de HER a um dímero de HER pode ativar um domínio de quínase de um ou mais dos receptores de HER no dímero e, desse modo, resulta em fosforila- ção de resíduos de tirosina em uni ou mais dos receptores de HER e/ou fos- forilação de resíduos de tirosina em polipeptídeo(s) substrato adicional(is), tais como quínases intracelulares Akt ou MAPK; veja figura 5, por exemplo.

"Fosforilação" refere-se à adição de um ou mais grupos fosfato a uma proteína, tal como um receptor de HER ou substrato do mesmo.

Um anticorpo o qual "inibe a dimerização de HER" é um anticor- po o qual inibe ou interfere com a formação de um dímero de HER. De prefe- rência, tal anticorpo se liga ao HER2 no sítio de ligação heterodimérica do mesmo. O anticorpo de inibição de dimerização mais preferido aqui é pertu- zumab ou MAb 2C4. A ligação de 2C4 ao sítio de ligação heterodimérica de HER2 é ilustrada na figura 4. Outros exemplos de anticorpos os quais inibem a dimerização de HER incluem anticorpos os quais se ligam ao EGFR e ini- bem a dimerização do mesmo com um ou mais de outros receptores de HER (por exemplo, anticorpo monoclonal ao EGFR 806, MAb 806, o qual se liga ao EGFR ativado ou "não unido"; veja Johns e colaboradores, J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)); anticorpos os quais se ligam ao HER3 e ini- bem a dimerização do mesmo com um ou mais de outros receptores de HER; e anticorpos os quais se ligam ao HER4 e inibem a dimerização do mesmo com um ou mais de outros receptores de HER.

Um anticorpo o qual "bloqueia a ativação de Iigante de um re- ceptor de HER mais eficazmente do que o trastuzumab" é um o qual reduz ou elimina a ativação de Iigante de HER do(s) receptor(es) de HER ou díme- ro(s) de HER mais eficazmente (por exemplo, pelo menos cerca de 2 vezes mais eficazmente) do que o trastuzumab. De preferência, tal anticorpo blo- queia a ativação do Iigante de HER de um receptor de HER pelo menos cer- ca de tão eficazmente quanto o anticorpo monoclonal de murino 2C4 ou um fragmento Fab do mesmo ou quanto o pertuzumab ou um fragmento Fab do mesmo. Pode-se avaliar a capacidade de um anticorpo de bloquear a ativa- ção de Iigante de um receptor de HER estudando dímeros de HER direta- mente ou avaliando a ativação de HER ou sinalização a jusante, a qual re- sulta de dimerização de HER e/ou avaliando o sítio de ligação de anticorpo- HER2, etc. Ensaios para seleção de anticorpos com a capacidade de inibir a ativação de Iigante de um receptor de HER mais eficazmente do que o tras- tuzumab são descritos em Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127-137 (2002) e Patente US N0 6.949.245 (Adams e colaboradores). À guisa de e- xemplo apenas, se pode ensaiar: a inibição de formação de dímero de HER (veja, por exemplo, figuras 1A-B de Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127-137 (2002); e Patente US N0 6.949.245); a redução na ativação de Ii- gante de HER de células as quais expressam dímeros de HER (Patente US N0 6.949.245 e figuras 2A-B de Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127- 137 (2002), por exemplo); o bloqueio de ligação de Iigante de HER à células as quais expressam dímeros de HER (Patente US N0 6.949.245 e figura 2E de Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo); a inibição de crescimento celular de células câncerígenas (por exemplo, célu- las MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D) as quais expressam dímeros de HER na presença (ou ausência) de Iigante de HER (Patente US N0 6.949.245 e figuras 3A-D de Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127- 137 (2002), por exemplo); a inibição de sinalização a jusante (por exemplo, inibição de fosforilação de AKT HRG-dependente ou inibição de fosforilação de MAPK HRG- ou TGFa-dependente) (veja Patente US N0 6.949.245 e fi- guras 2C-D de Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127-137 (2002), por exemplo). Se pode também avaliar se o anticorpo inibe a dimerização de HER estudando o sítio de ligação de anticorpo-HER2, por exemplo, avalian- do uma estrutura ou modelo, tal como uma estrutura de cristal do anticorpo ligado ao HER2 (veja, por exemplo, Franklin e colaboradores, Câncer Cell 5: 317-328 (2004)).

Um "sítio de ligação heterodimérica" sobre HER2 refere-se a uma região no domínio extracelular de HER2 que contata ou interfere com uma região no domínio extracelular de EGFR, HER3 ou HER4 quando de formação de um dímero com a mesma. A região é encontrada no Domínio Il de HER2. Franklin e colaboradores, Câncer Cell 5: 317-328 (2004).

O anticorpo ao HER2 pode "inibir a fosforilação de AKT HRG- dependente" e/ou "inibir a fosforilação de MAPK HRG- ou TGFa-depen- dente" mais eficazmente (por exemplo, pelo menos 2 vezes mais eficazmen- te) do que o trastuzumab (veja Agus e colaboradores, Câncer Cell 2: 127- 137 (2002) e Patente US N0 6.949.245 à guisa de exemplo).

O anticorpo ao HER2 pode ser um o qual, tal como o pertuzu- mab, "não inibe clivagem do ectodomínio de HER2" (Molina e colaboradores, Câncer Res. 61: 4744-4749(2001)). O trastuzumab, por outro lado, pode ini- bir clivagem do ectodomínio de HER2.

Um anticorpo ao HER2 que "se liga a um sítio de ligação hetero- dimérica" de HER2 se liga a resíduos no domínio Il (e opcionalmente tam- bém se liga a resíduos em outros dos domínios do domínio extracelular de HER2, tais como domínios I e III) e pode impedir estericamente, pelo menos até algum grau, a formação de um heterodímero de HER2-EGFR, HER2- HER3 ou HER2-HER4. Franklin e colaboradores, Câncer Cell 5: 317-328 (2004) caracterizaram a estrutura de cristal de HER2-pertuzumab, deposita- da no RCSB Protein Data Bank (Código de ID IS78), ilustrando um anticorpo exemplificativo que se liga ao sítio de ligação heterodimérica de HER2.

Um anticorpo que "se liga ao domínio II" de HER2 se liga a resí- duos no domínio II e opcionalmente resíduos em outro(s) domínio(s) de HER2, tais como domínios I e III. De preferência, o anticorpo que se liga ao domínio II se liga à junção entre os domínios I, II e III de HER2.

"Expressão" de proteína refere-se à conversão da informação codificada em um gene em RNA mensageiro (mRNA) e, então, à proteína.

Aqui, uma amostra ou célula que "expressa" uma proteína de interesse (tal como um receptor de HER ou Iigante de HER) é uma na qual o mRNA que codifica a proteína ou a proteína, incluindo fragmentos da mes- ma, é determinada como estando presente na amostra ou célula.

A técnica de "reação em cadeia de polimerase" ou "PCR", con- forme usado aqui, geralmente refere-se a um procedimento em que quanti- dades diminutas de um pedaço específico de ácido nucleico, RNA e/ou DNA é amplificado, conforme descrito na Pat. U.S. No. 4.683.195 emitida em 28 de Julho de 1987. Geralmente, informação de seqüência das extremidades da região de interesse ou além precisa estar disponível, de modo que inicia- dores de oligonucleotídeo podem ser projetados; esses iniciadores serão idênticos ou similares, quanto à seqüência, às fitas opostas do padrão a ser amplificado. Os nucleotídeos 5' terminais dos dois iniciadores podem coinci- dir com as extremidades do material amplificado. PCR pode ser usada para amplificar seqüências de RNA específicas, seqüências de DNA específicas a partir de DNA genômico total e cDNA transcrito de RNA celular total, bacteri- ófago ou seqüências de plasmídeo, etc. Veja, de modo geral, Mullis e cola- boradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY1 1989). Conforme usado aqui, PCR é considerada como sendo um, mas não o único, exemplo de um mé- todo de reação de polimerase de ácido nucleico para amplificação de uma amostra de teste de ácido nucleico compreendendo o uso de um ácido nu- cleico conhecido (DNA ou RNA) como um iniciador e utiliza uma polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar um pedaço específico de ácido nucleico ou amplificar ou gerar um pedaço específico de ácido nucleico o qual é complementar a um ácido nucleico em particular.

"Reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real" ou "qRT-PCR" refere-se a uma forma de PCR em que a quantidade de pro- duto de PCR é medida em cada etapa em uma reação de PCR. Essa técnica foi descrita em várias publicações, incluindo Cronin e colaboradores, Am. J. Pathol. 164(1): 35-42 (2004); e Ma e colaboradores, Câncer Cell 5: 607-616 (2004).

O termo "microarranjo" refere-se a uma disposição ordenada de elementos de arranjo passíveis de hibridização, de preferência sondas de polinucleotídeo, sobre um substrato.

O termo "polinucleotídeo", quando usado no singular ou plural, geralmente refere-se a qualquer poliribonucleotídeo ou polideóxiribonucleo- tídeo, o qual pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modifi- cado. Assim, por exemplo, polinucleotídeos, conforme definido aqui, incluem, sem limitação, DNA fita simples e dupla, DNA incluindo regiões fita simples e dupla, RNA fita simples e dupla e RNA incluindo regiões fita simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que pode ser fita simples ou, mais tipicamente, envolvem apenas uma região de algumas das molécu- las. Uma das moléculas de uma região com hélice tripla freqüentemente é um oligonucleotídeo. O termo "polinucleotídeo" inclui, especificamente, cD- NAs. O termo inclui DNAs (incluindo cDNAs) e RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas. Assim, DNAs ou RNAs com partes principais modi- ficadas para estabilidade ou outras razões são "polinucleotídeo" conforme esse termo é usado aqui. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo ba- ses incomuns, tal como inosina, ou bases modificadas, tais como bases triti- adas, são incluídos dentro do termo "polinucleotídeos" conforme definido aqui. Em geral, o termo "polinucleotídeo" abrange todas as formas química, enzimática e/ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos não modi- ficados, bem como as formas químicas de DNA e RNA característicos de vírus e células, incluindo células simples e complexas.

O termo "oligonucleotídeo" refere-se a um polinucleotídeo relati- vamente curto incluindo, sem limitação, deóxiribonucleotídeos fita simples, ribonucleotídeos fita simples ou dupla, híbridos de RNA:DNA e DNAs fita dupla. Oligonucleotídeos, tais como oligonucleotídeos de sonda de DNA fita simples, são freqüentemente sintetizados através de métodos químicos, por exemplo, usando sintetizadores de oligonucleotídeo automáticos que estão comercialmente disponíveis. Contudo, oligonucleotídeos podem ser feitos através de uma variedade de outros métodos, incluindo técnicas DNA re- combinante-mediadas in vitro e através de expressão de DNAs em células e organismos.

A frase "amplificação de gene" refere-se a um processo pelo qual múltiplas cópias de um gene ou fragmento de gene são formadas em uma célula ou linhagem de célula em particular. A região duplicada (um tre- cho de DNA amplificado) é freqüentemente referida como "amplicon". Usu- almente, a quantidade do RNA mensageiro (mRNA) produzido também au- menta na proporção do número de cópias feitas do gene expresso em parti- cular.

"Estringência" de reações de hibridização é prontamente deter- minável por aqueles habilitados na técnica e geralmente é um cálculo empí- rico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e con- centração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas maiores para anelamento apropriado, enquanto que sondas mais curtas pre- cisam de temperaturas menores. Hibridização geralmente depende da capa- cidade do DNA desnaturado de reanelar quando fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre a sonda e a seqüência passível de hibridização, maior a temperatura relativa a qual pode ser usada. Como um resultado, segue que maiores temperaturas relativas tenderão a tornar as condições de reação mais estringentes, enquanto que temperaturas me- nores não. Para detalhes adicionais e explicação de estringência de reações de hibridização veja Ausubel e colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência", conforme definido aqui, tipicamente: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura de lavagem, por exemplo, cloreto de sódio a 0,015M / citra- to de sódio a 0,0015M / dodecil sulfato de sódio a 0,1% a 50°C; (2) empre- gam, durante hibridização, um agente de desnaturação, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) com albumina de soro bovino a 0,1% / Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão de fosfato de sódio a 50 mM em um pH de 6,5 com cloreto de sódio a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida a 50%, 5X SSC (NaCI a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão subme- tido a ultra-som (50 μg; g/ml), SDS a 0,1% e sulfato de dextrana a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 χ SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55°C, seguido por uma lavagem em alta estringência consistindo de 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55°C.

"Condições de estringência moderada" podem ser identificadas conforme descrito por Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning: A La- boratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989 e incluem o uso de uma solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, tem- peratura, resistência iônica e % de SDS) menos estringentes do que aquelas descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes é incubação durante a noite a 37°C em uma solução compreendendo: forma- mida a 20%, 5 χ SSC (NaCl a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, se- guido por lavagem dos filtros em 1x SSC em torno de 37-50°C. Aqueles ha- bilitados na técnica reconhecerão como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc. conforme necessário para acomodar fatores tal como compri- mento da sonda e semelhantes.

Um polipeptídeo de "seqüência nativa" é um o qual tem a mes- ma seqüência de aminoácido que um polipeptídeo (por exemplo, receptor de HER ou ligante de HER) derivado da natureza, incluindo variantes alélicas ou que ocorrem naturalmente. Tais polipeptídeos de seqüência nativa po- dem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos através de meios recombinantes ou sintéticos. Assim, um polipeptídeo de seqüência nativa pode ter a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo humano, polipeptí- deo de murino ou polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamífero que ocorre naturalmente.

O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo e a- brange especificamente anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anti- corpos multi-específicos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmen- tos de anticorpo, na medida em que eles exibam a atividade biológica dese- jada.

O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogê- neos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idên- ticos e/ou se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s), exceto quanto a possíveis variantes que podem surgir durante produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em quantidades mínimas. Tal anti- corpo monoclonal inclui, tipicamente, um anticorpo compreendendo uma se- quência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a seqüência polipep- tídica de ligação ao alvo foi obtida através de um processo que inclui a sele- ção de uma seqüência polipeptídica de ligação a um único alvo de uma plu- ralidade de seqüências polipeptídicas. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único de uma pluralidade de clones, tal co- mo um reservatório de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve ser entendido que a seqüência de ligação ao alvo selecionada pode ser ainda alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade pelo alvo, para humanizar a seqüência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção em cultura de células, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multi-específico, etc. e que um anticorpo compreen- dendo a seqüência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo mo- noclonal da presente invenção. Em contraste a preparados de anticorpo po- liclonal os quais incluem, tipicamente, diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de um pre- parado de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante so- bre um antígeno. Além de sua especificidade, os preparados de anticorpo monoclonal são vantajosos pelo fato de que eles não são, tipicamente, con- taminados com outras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser construído como requerendo a produção de anticorpo através de qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente in- venção podem ser feitos através de uma variedade de técnicas incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e colaboradores, Nature, 256: 495 (1975); Harlow e colaboradores, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling e colaboradores em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. N0 4.816.567), tecnologias de phage display (veja, por exem- plo, Clackson e colaboradores, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks e cola- boradores, J. Moi Biol, 222: 581-597 (1991); Sidhu e colaboradores, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee e colaboradores, J. Moi Biol. 340, 5: 1073- 1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee e colaboradores, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhan- tes aos humanos em animais que têm partes ou todos os Ioci de imunoglo- bulina humana ou genes que codificam seqüências de imunoglobulina hu- mana (veja, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits e colaboradores, Nature, 362: 255- 258 (1993); Bruggemann e colaboradores, Year in Immuno., 7: 33 (1993) Patentes U.S. N0S 5.545.806; 5.569.825; 5.591.669 (todas da GenPharm) Patente U.S. N0 5.545.807; WO 1997/17852; Patentes U.S. N0S 5.545.807 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks e colabora- dores, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg e colaboradores, Natu- re, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild e colaboradores, Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Natu- re Biotechnology 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar1 lntern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995)).

Os anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anti- corpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga à seqüências correspondentes em anticorpos deri- vados de uma espécie em particular ou pertencendo a uma classe ou sub- classe de anticorpo em particular, enquanto que o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo à seqüências correspondentes em anticorpos deri- vados de outra espécie ou pertencendo à outra classe ou subclasse de anti- corpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, na medida em que eles exi- bam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N0 4.816.567; e Morrison e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Anticor- pos quiméricos de interesse aqui incluem os anticorpos Aprimatized® com- preendendo seqüências de ligação a antígeno de domínio variável derivadas de um primata não-humano (por exemplo, antigo mundo dos macaco, Maca- co, etc.) e seqüências de região constante humana, bem como anticorpos "humanizados".

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (por exem- plo, de roedor) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Em sua maioria, anticorpos huma- nizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resí- duos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não-humana (anticorpo doa- dor), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não-humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resí- duos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituí- dos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anti- corpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e, tipicamente, dois domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os Ioops hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, opcionalmente, pelo menos uma porção de uma região Constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobuli- na humana. Para detalhes adicionais veja Jones e colaboradores, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann e colaboradores, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

Anticorpos ao HER2 humanizados incluem huMAb4D5-l, hu- MAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, hu- MAb4D5-7 e huMAb4D5-8 ou trastuzumab (HERCEPTrN®), conforme des- crito na Tabela 3 da Patente U.S. 5.821.337, expressamente incorporada aqui por referência; anticorpo 520C9 humanizado (W093/21319); e 2C4 hu- manizado, tal como pertuzumab, conforme descrito aqui.

Para as finalidades aqui, "trastuzumab," "HERCEPTIN®" e "hu- MAb4D5-8" referem-se a um anticorpo compreendendo as seqüências de aminoácido de cadeia leve e pesada em SEQ ID N0S 15 and 16, respecti- vamente.

Diferenças entre as funções do pertuzumab e trastuzumab são ilustradas na figura 6.

Um "anticorpo intacto" aqui é um o qual compreende duas regi- ões de ligação a antígeno e uma região Fe. De preferência, o anticorpo in- tacto tem uma região Fc funcional.

"Fragmentos de anticorpo" compreende uma porção de um anti- corpo intacto, de preferência compreendendo a região de ligação a antígeno do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo com cadeia simples; e anticorpos multi-específicos formados de fragmen- to(s) de anticorpo.

"Anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínas heterotetra- méricas de cerca de 150.000 dáltons, compostas de cadeias leve (L) idênti- cas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação covalente de dissulfeto, enquanto que o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de dife- rentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem ligações em ponte de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (Vh) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável (Vl) em uma extremidade e um domínio constante em sua outra ex- tremidade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido particulares formem uma interface entre os domínios variá- veis de cadeia leve e cadeia pesada.

O termo "variável" refere-se ao fato de que determinadas por- ções dos domínios variáveis diferem extensivamente, quanto à seqüência, dentre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticor- po particular por seu antígeno em particular. Contudo, a variabilidade não está uniformemente distribuída por todos os domínios variáveis de anticor- pos. Ela está concentrada em três segmentos denominados regiões hiperva- riáveis nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas as regiões de estrutura (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesada e leve nativas compreendem, cada um, quatro FRs1 que adotam grandemente uma configuração de β-folha, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam Ioops que conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura de β-folha. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade íntima pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis de outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antígeno dos anti- corpos (veja Kabat e colaboradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos em ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetua- doras, tal como participação do anticorpo em citotoxicidade celular anticorpo- dependente (ADCC).

O termo "região hipervariável", quando usado aqui, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo os quais são responsáveis pela ligação a antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, os resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no do- mínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no do- mínio variável de cadeia pesada; Kabat e colaboradores, Sequences of Pro- teins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institu- tes of Health, Bethesda, MD (1991)) e/ou aqueles resíduos de um "laço hi- pervariável" (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia pesada e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Moi Bioi 196: 901-917 (1987)). Resíduos de "região de estrutura" ou "FR" são aqueles ou- tros resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariá- vel, conforme definido aqui. Digestão por papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação a antígeno idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação a antígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo no- me reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. Tratamento com pep- sina proporciona um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação a antí- geno e ainda é capaz de ligação cruzada com o antígeno.

"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo o qual contém um sítio de ligação a antígeno e reconhecimento de antígeno completo. Essa região consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de ca- deia leve em associação íntima não covalente. É nessa configuração que há três regiões hipervariáveis de cada interação de domínio variável para definir um sítio de ligação a antígeno sobre a superfície do dímero Vh-Vl. Coletiva- mente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação a antígeno ao anticorpo. Contudo, mesmo um único domínio variável (ou me- tade de um Fv compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específi- cas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar a antíge- no, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação todo.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab= diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no carbóxi término do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designação aqui para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes tra- zem pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' os quais têm ciste- ínas na dobradiça dos mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmen- tos de anticorpo também são conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos de qualquer espécie de verte- brado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denomi- nadas kappa (κ) e Iambda (λ), baseado nas seqüências de aminoácido de seus domínios constantes.

O termo "região Fc" aqui é usado para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo as regiões Fc de seqüência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de ca- deia pesada de IgG humana é usualmente definida como se estendendo de um resíduo de aminoácido na posição Cys266 ou de Pro230 ao carbóxi- término do mesmo. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o siste- ma de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, duran- te produção ou purificação do anticorpo ou através de manipulação recombi- nante do ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Con- sequentemente, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo com todos os resíduos K447 removidos, popula- ções de anticorpo sem resíduos K447 removidos e populações de anticorpo tendo uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.

A menos que de outro modo indicado, aqui, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do índice EU conforme em Kabat e colaboradores, Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Be- thesda, MD (1991), expressamente incorporado aqui por referência. O "índi- ce EU conforme em Kabat" refere-se à numeração EU de resíduo do anti- corpo IgGI humano.

Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetuadora" de uma região Fc de seqüência nativa. "Funções efetuadoras" exemplificativas incluem ligação a C1q; citotoxicidade complemento-dependente; ligação ao receptor de Fc; citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente (ADCC); fagocitose; subregulação de receptores na superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR); etc. Tais funções efetuadoras geralmente re- querem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios, conforme aqui descrito por exemplo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüên- cia de aminoácido idêntica à seqüência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões Fc humanas de seqüência nativa incluem uma região Fc de IgG1 humana de seqüência nativa (alotipos não-A e A); região Fc de lgG2 humana de seqüência nativa; região Fc de lgG3 humana de seqüência nativa; e região Fc de lgG4 humana de seqüência nativa, bem como variantes que ocorrem naturalmente das mesmas.

Uma "região Fc variante" compreende uma seqüência de ami- noácido a qual difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em vir- tude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência uma ou mais substituições de aminoácido. De preferência, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparado com uma região Fc de seqüência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo precursor, por exemplo, de cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácido e, de preferência, de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácido em uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo pre- cursor. A região Fc variante aqui possuirá, de preferência, pelo menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo precursor e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de homologia com a mesma, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de homologia com a mesma.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a dife- rentes classes. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser ainda divididas em subclas- ses (isotipos), por exemplo, IgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2. Os domí- nios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de i- munoglobulinas são bem conhecidas.

"Citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente" e "ADCC" referem-se a uma reação célula-mediada na qual células citotóxicas especí- ficas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo, células Assas- sinas Naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo liga- do sobre uma célula alvo e subseqüentemente causam lise da célula alvo. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam FcyRIII apenas, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991).

Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente US N0 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Células efetuadoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células As- sassinas Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como aquele descrito em Clynes e colaboradores, PNAS (USA) 95: 652-656 (1998).

"Células efetuadoras humanas" são leucócitos os quais expres- sam um ou mais FcRs e desempenham funções efetuadoras. De preferên- cia, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham função efe- tuadora ADCC. Exemplos de leucócitos humanos os quais mediam a ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assas- sinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetuadoras podem ser isoladas de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, de sangue ou PBMCs, conforme descrito aqui.

Os termos "receptor de Fc" ou "FcR" são usados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR é um o qual se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, for- mas com splicing desses receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), os quais têm seqüências de aminoácido similares que diferem primariamente quanto aos domínios citoplásmicos dos mesmos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado em tirosina de imuno-receptor (I- TAM) em seu domínio citoplásmico. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em tirosina de imuno-receptor (ITEM) em seu domínio citoplásmico (veja revisão em M. Daeron, Arma. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)). FcRs são revistos em Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immu- nol 9: 457-92 (1991); Capei e colaboradores, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas e colaboradores, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são a- brangidos pelo termo "FcR" aqui. O termo também inclui o receptor neo- natal, FcRn, o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer e colaboradores, J. Immunol. 117: 587 (1976) e Kim e colabo- radores, J. Immunol. 24: 249 (1994)) e regula a homeostase de imunoglobu- linas.

"Citotoxicidade complemento-dependente" ou "CDC" refere-se à capacidade de uma molécula de submeter à Iise um alvo na presença de complemento. A via de ativação de complemento é iniciada através da Iiga- ção do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molé- cula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro e colaboradores, J. Immunol. Me- thods 202: 163 (1996), pode ser realizado.

Fragmentos de anticorpo "Fv com cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios Vh e Vl do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica única. De preferência, o poli- peptídeo de Fv ainda compreende um Iigante polipeptídico entre os domínios Vh e Vl o qual permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv veja Pliickthun em The Pharmaco- Iogy of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Sprin- ger-Verlag, New York, páginas 269-315 (1994). Fragmentos de anticorpo scFv são descritos no W093/16185; Patente U.S. N0 5.571.894; e Patente U.S. N0 5.587.458.

O termo "diacorpos" refere-se a pequenos fragmentos de anti- corpo com dois sítios de ligação a antígeno, fragmentos os quais compreen- dem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL). Usando um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de Iiga- ção a antígeno. Diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, na patente EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993).

Um "anticorpo naked" é um anticorpo que não está conjugado a uma molécula heteróloga, tal como uma porção citotóxica ou rádio-rótulo.

Um anticorpo "isolado" é um o qual tenha sido identificado e se- parado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Com- ponentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais os quais po- dem interferir com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo e po- dem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não protei- náceos. Em modalidades preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de 95% em peso do anticorpo, conforme determinado através do método de Lowry e, mais preferivelmente, mais de 99% em peso, (2) até um grau sufi- ciente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido inter- no ou N-terminal através do uso de um sequenciador com copo de centrífu- ga ou (3) até homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de re- dução ou não redução usando azul Coomassie ou, de preferência, coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células re- combinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não está presente. Comumente1 contudo, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

Um anticorpo "maturado por afinidade" é um com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis do mesmo, as quais re- sultam em aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo por um antígeno, comparado com um anticorpo precursor o qual não possui essa(s) altera- ção(ões). Anticorpos maturados por afinidade preferidos têm afinidades em nanomolar ou mesmo picomolar pelo antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos através de procedimentos conhecidos na técni- ca. Marks e colaboradores, Bio/Technology 10: 779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade através de embaralhamento de domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por Bar- bas e colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 91: 3809-3813 (1994); Schi- er e colaboradores, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton e colaboradores, J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson e colaboradores, J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995); e Hawkins e colaboradores, J. Moi Biol. 226: 889-896 (1992).

O termo "anticorpo de espécie principal" aqui refere-se à estrutu- ra de anticorpo em uma composição a qual é a molécula de anticorpo quanti- tativamente predominante na composição. Em uma modalidade, o anticorpo de espécie principal é um anticorpo a HER2, tal como um anticorpo que se liga ao Domínio II de HER2, um anticorpo que inibe a dimerização de HER mais eficazmente do que o trastuzumab e/ou um anticorpo o qual se liga ao sítio de ligação heterodimérica e seqüências de aminoácido de cadeia pesa- da variável em SEQ ID N0S 3 e 4 e, mais preferivelmente, compreendendo as seqüências de aminoácido de cadeia pesada e de cadeia leve em SEQ ID N0S 13 e 14 (pertuzumab).

Um anticorpo com "seqüência de aminoácido variante" aqui é um anticorpo com uma seqüência de aminoácido a qual difere de um anti- corpo de espécie principal. Comumente, variantes de seqüência de aminoá- cido possuirão pelo menos cerca de 70% de homologia com o anticorpo de espécie principal e, de preferência, eles serão pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% homólogos com o anticorpo de espécie principal. As variantes de seqüência de aminoácido possuem substituições, deleções e/ou adições em determinadas posições dentro ou adjacentes à seqüência de aminoácido do anticorpo de espécie de anticorpo. Exemplos de variantes de seqüência de aminoácido aqui incluem uma vari- ante ácida (por exemplo, variante de anticorpo deamidada), uma variante básica, um anticorpo com uma extensão líder amino-terminal (por exemplo, VHS-) sobre uma ou duas cadeias leves do mesmo, um anticorpo com um resíduo de Iisina C-terminal sobre uma ou duas cadeias pesadas do mesmo, etc. e inclui combinações de variações nas seqüências de aminoácido de cadeias pesada e/ou leve. A variante de anticorpo de interesse particular aqui é o anticorpo compreendendo uma extensão líder amino-terminal sobre uma ou duas cadeias leves do mesmo, opcionalmente ainda compreenden- do outra seqüência de aminoácido e/ou diferenças de glicosilação com rela- ção ao anticorpo de espécie principal.

Um anticorpo com "variante de glicosilação" aqui é um anticorpo com uma ou mais porções de carboidrato presas ao mesmo as quais diferem de uma ou mais porções de carboidrato presas a um anticorpo de espécie principal. Exemplos de variantes de glicosilação aqui incluem um anticorpo com uma estrutura de oligossacarídeo G1 ou G2, ao invés de uma estrutura de oligossacarídeo GO, presa a uma região Fc do mesmo, um anticorpo com uma ou duas porções de carboidrato presas a uma ou duas cadeias leves do mesmo, um anticorpo sem carboidrato preso a uma ou duas cadeias pesa- das do anticorpo, etc. e combinações de alterações de glicosilação.

Onde o anticorpo tem uma região Fc, uma estrutura de oligossa- carídeo pode ser presa a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, por exemplo, no resíduo 299 (298, numeração EU de resíduos). Para o pertu- zumab, GO era a estrutura de oligossacarídeo predominante, com outras estruturas de oligossacarídeo, tais como GO-F1 G-1, ManS, Mand, G-1, G1(1-6), G1(1-3) e G2, sendo encontradas em quantidades menores na composição do pertuzumab.

A menos que de outro modo indicado, uma estrutura de oligos- sacarídeo AG1 aqui inclui estruturas G-1, G1-1, G1(1-6) e G1(1-3).

Uma "extensão líder amino-terminal" aqui refere-se a um ou mais resíduos de aminoácido da seqüência líder amino-terminal que estão presentes no amino-término de qualquer uma ou mais cadeias pesadas ou leves de um anticorpo. Uma extensão líder amino-terminal exemplificativa compreende ou consiste de três resíduos de aminoácido, VHS, presentes sobre uma ou ambas as cadeias leves de uma variante de anticorpo.

Um anticorpo "deamidado" é um no qual um ou mais resíduos de asparagina do mesmo foram derivatizados, por exemplo, a um ácido aspárti- co, uma succinimida ou um ácido iso-aspártico.

Os termos "câncer" e "cânceroso" referem-se a ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é, tipicamente, caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não es- tão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluindo meduloblastoma e retinoblastoma), sarcoma (incluindo Iiposarcoma e sarcoma de células sino- viais), tumores neuroendócrinos (incluindo tumores carcinóides, gastrinoma e câncer de células da ilhota), mesotelioma, schwannoma (incluindo neuro- ma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma e leucemia ou ma- lignidades linfóides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células peque- nas (SCLC), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), adeno- carcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritô- nio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindo câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer o- variano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama (incluindo câncer de mama metastático), câncer de cólon, câncer retal, cân- cer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pênis, câncer tes- ticular, câncer esofageal, tumores do trato biliar, bem como câncer de cabe- ça e pescoço.

Um câncer "avançado" é um o qual disseminou para fora do Io- cal ou órgão de origem, quer através de invasão local ou metástase.

Um câncer "resistente" é um o qual progride mesmo embora um agente anti-tumor, tal como um agente quimioterapêutico, está sendo admi- nistrado ao paciente com câncer. Um exemplo de um câncer resistente é um o qual é resistente à platina.

Um câncer "recorrente" é um o qual crescer novamente, no local inicial ou em um local distante, após uma resposta à terapia inicial.

Aqui, um "paciente" é um paciente humano. O paciente pode ser um paciente com câncer, isto é, um que está sofrendo ou em risco de sofrer de um ou mais sintomas de câncer.

Uma "amostra de tumor" aqui é uma amostra derivada de ou compreendendo células tumorígenas do tumor de um paciente. Exemplos de amostras de tumor aqui incluem, mas não estão limitados a, biópsias de tu- mor, células tumorígenas em circulação, proteínas em circulação no plasma, fluido ascítico, culturas de células primárias ou linhagens de células deriva- das de tumores ou exibindo propriedades semelhante a tumor, bem como amostras de tumor preservadas, tais como amostras de tumor fixadas em formalina, incrustadas em parafina ou amostras de tumor congeladas.

Uma amostra de tumor "fixada" é uma a qual tenha sido histolo- gicamente preservada usando um fixador.

Uma amostra de tumor "fixada em formalina" é uma a qual tenha sido preservada usando formaldeído como o fixador.

Uma amostra de tumor "incrustada" é uma envolvida por um meio firme e geralmente duro, tal como parafina, cera, celoidina ou uma re- sina. Incrustação torna possível o corte de seções finas para exame micros- cópico ou para a geração de microarranjos teciduais (TMAs).

Uma amostra de tumor "incrustada em parafina" refere-se a uma amostra de tumor a qual é envolvida por uma mistura purificada de hidrocar- bonetos sólidos derivados de petróleo.

Aqui, uma amostra de tumor "congelada" refere-se a uma amos- tra de tumor a qual é ou tenha sido congelada.

Uma amostra de câncer ou biológica a qual "mostra expressão, amplificação ou ativação de HER" é uma a qual, em um teste diagnóstico, expressa (incluindo superexpressa) um receptor de HER, tem um gene de HER amplificado e/ou de outro modo demonstra ativação ou fosforilação de um receptor de HER.

Uma amostra de câncer ou biológica a qual "mostra ativação de HER" é uma a qual, em um teste diagnóstico, demonstra ativação ou fosfori- lação de um receptor de HER. Tal ativação pode ser determinada diretamen- te (por exemplo, através de medição de fosforilação de HER através de ELI- SA) ou indiretamente (por exemplo, através de caracterização de perfil de expressão ou através de detecção de heterodímeros de HER1 conforme descrito aqui).

Aqui, "caracterização de perfil de expressão de gene" refere-se a uma avaliação de expressão de um ou mais genes como um substituto para determinação de fosforilação de HER diretamente.

Um "ensaio fosfo-ELISA" aqui é um ensaio no qual fosforilação de um ou mais receptores de HER1 especialmente HER2, é avaliada em um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) usando um reagente, usu- almente um anticorpo, para detectar o receptor HER fosforilado, substrato ou molécula de sinalização a jusante. De preferência, um anticorpo o qual de- tecta HER2 fosforilado é usado. O ensaio pode ser realizado sobre Iisatos de célula, de preferência de amostras biológicas frescas ou congeladas.

Uma célula câncerígena com "amplificação ou superexpressão do receptor de HER" é uma a qual tem níveis significativamente maiores de uma proteína ou gene do receptor de HER comparado com uma célula não câncerígena do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode ser causada por amplificação de gene ou através de transcrição ou tradução aumentada. Superexpressão ou amplificação do receptor de HER pode ser determinada em um ensaio diagnóstico ou prognóstico através de avaliação dos níveis aumentados da proteína de HER presente sobre a superfície de uma célula (por exemplo, via um ensaio de imunohistoquímica; IHC). Alternativa ou adi- cionalmente, se pode medir os níveis de ácido nucleico que codifica HER na célula, por exemplo, via hibridização fluorescente in situ (FTSH; veja W098/45479 publicado em Outubro de 1998), Southern blotting ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Também se pode estar a superexpressão ou amplifi- cação do receptor de HER através de medição do antígeno de proteção (por exemplo, domínio extracelular de HER) em um fluido biológico, tal como soro (veja, por exemplo, Patente U.S. N0 4.933.294 emitida em 12 de Junho de 1990; W091/05264 publicado em 18 de Abril de 1991; Patente U.S. 5.401.638 emitida em 28 de Março de 1995; e Sias e colaboradores, J. Im- munol. Methods 132: 73-80 (1990)). Além dos ensaios acima, vários ensaios in vivo estão disponíveis para o praticante habilitado. Por exemplo, se pode expor as células dentro do corpo do paciente a um anticorpo o qual é opcio- nalmente rotulado com um rótulo detectável, por exemplo, um isótopo radio- ativo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, através de exploração externa pela radioatividade ou através de análise de uma biópsia tomada de um paciente previamente exposto ao anticorpo.

Inversamente, um câncer o qual "não superexpressa ou amplifi- ca o receptor de HER" é um o qual não tem níveis maiores do que o normal de proteína ou gene do receptor de HER comparado com uma célula não câncerígena do mesmo tipo de tecido. Anticorpos que inibem a dimerização de HER, tal como pertuzumab, podem ser usados para tratar câncer o qual não superexpressa ou amplifica o receptor de HER2.

Aqui, um "agente anti-tumor" refere-se a um fármaco usado para tratar câncer. Exemplos não Iimitativos de agentes anti-tumor aqui incluem agentes quimioterapêuticos, inibidores de dimerização de HER, anticorpos ao HER, anticorpos dirigidos contra antígenos tumor-associados, compostos anti-hormonais, citocinas, fármacos EGFR-objetivados, agentes citotóxicos, anticorpos que induzem à apoptose, inibidores de COX, inibidores de farnesil transferase, anticorpos que se ligam à proteína oncofetal CA 125, vacinas de HER2, inibidores de Raf ou Rãs, doxorubicina lipossômica, topotecan, taxa- no, inibidores duplos de quínase de tirosina, TLK286, EMD-7200, pertuzu- mab, trastuzumab, erlotinib e bevacizumab.

Um "agente anti-tumor aprovado" é um fármaco usado para tra- tar câncer o qual tenha tido aprovação para comercialização por uma autori- dade regulatória, tal como a administração da comida e fármaco (FDA) ou equivalente estrangeiro da mesma.

Onde um inibidor de dimerização de HER é administrado como um "único agente anti-tumor", ele é o único agente anti-tumor administrado para tratar o câncer, isto é, ele não é administrado em combinação com ou- tro agente anti-tumor, tal como quimioterapia. Por "padrão de cuidados" aqui entenda-se o agente ou agentes anti-tumor os quais são rotineiramente usados para tratar uma forma de câncer em particular. Por exemplo, para câncer ovariano resistente à platina, o padrão de cuidados é topotecan ou doxorubicina lipossômica.

Um "agente inibitório de crescimento", quando usado aqui, refe- re-se a um composto ou composição a qual inibe o crescimento de uma cé- lula, especialmente uma célula câncerígena expressando HER, quer in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibitório pode ser um o qual reduz significativa- mente o percentual de células expressando HER na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a pro- gressão do ciclocelular (em uma outra que não a fase S), tais como agentes que induzem à interrupção de G1 e interrupção da fase M. Bloqueadores de fase M clássicos incluem os vinca (vincristina e vinblastina), taxanos e inibi- dores de topo II, tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopo- sídeo e bleomicina. Aqueles agentes que interrompem G1 também atuam sobre a interrupção da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C. Informação adicional pode ser encon- trada em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capi- tulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplastic drugs" por Murakami e colaboradores (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especial- mente página 13.

Exemplos de anticorpos "inibitórios de crescimento" são aqueles os quais se ligam ao HER2 e inibem o crescimento de células câncerígenas superexpressando HER2. Anticorpos ao HER2 inibitórios de crescimento preferidos inibem o crescimento de SK-BR-3 em mais de 50% (por exemplo, de cerca de 50% a cerca de 100%) em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 μg/ml, onde a inibição de crescimento é determinada seis dias após exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (veja Patente U.S. N0 5.677.171 emitida em 14 de Outubro de 1997). O ensaio de inibição de cres- cimento de células SK-BR-3 é descrito em maiores detalhes nessa patente e aqui abaixo. O anticorpo inibitório de crescimento preferido é uma variante humanizada do anticorpo monoclonal de murino 4D5, por exemplo, trastu- zumab.

Um anticorpo o qual "induz à apoptose" é um o qual induz à mor- te celular programada, conforme determinado através de ligação de anexina V, fragmentação de DNA, retração celular, dilatação do retículo endoplasmá- tico, fragmentação celular e/ou formação de vesículas na membrana (deno- minados corpos apoptóticos). A célula usualmente é uma a qual superex- pressa o receptor HER2. De preferência, a célula é uma célula tumorígena, por exemplo, uma célula de mama, ovariana, estômago, endometrial, glân- dula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pancreática ou bexiga. In vitro, a cé- lula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, célula Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Vários métodos estão disponíveis para avaliação dos eventos celulares associados à apoptose. Por exemplo, translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida através de ligação à anexina; fragmen- tação de DNA pode ser avaliada através de Iaddering de DNA; e condensa- ção nuclear/cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada através de qualquer aumento em células hipodiplóides. De preferência, o anticorpo o qual induz à apoptose é um o qual resulta em uma indução de cerca de 2 a 50 vezes, de preferência cerca de 5 a 50 vezes e, mais preferi- velmente, cerca de 10 a 50 vezes da ligação à anexina com relação a uma célula não tratada em um ensaio de ligação à anexina usando células BT474 (veja abaixo). Exemplos de anticorpos ao HER2 que induzem à apoptose são 7C2 e 7F2.

O "epítopo 2C4" é a região no domínio extracelular de HER2 à qual o anticorpo 2C4 se liga. De forma a selecionar anticorpos os quais se ligam ao epítopo 2C4, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser realizado. De prefe- rência, o anticorpo bloqueia a ligação de 2C4 ao HER2 em cerca de 50% ou mais. Alternativamente, mapeamento de epítopo pode ser realizado para avaliar se o anticorpo se liga ao epítopo 2C4 de HER2. O epítopo 2C4 com- preende resíduos do Domínio II no domínio extracelular de HER2. 2C4 e pertuzumab se ligam ao domínio extracelular de HER2 na junção dos domí- nios I, II e III. Franklin e colaboradores, Câncer Cell 5: 317-328 (2004).

O "epítopo 4D5" é a região no domínio extracelular do HER2 à qual o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463) e trastuzumab se ligam. Esse epí- 5 topo está próximo do domínio transmembrana do HER2 e dentro do Domínio IV de HER2. Para selecionar anticorpos os quais se ligam ao epítopo 4D5, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descritos em Anti- bodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser realizado. Alternativamente, mapeamento de epítopo pode ser realizado para avaliar se o anticorpo se liga ao epítopo 4D5 do HER2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região de cerca do resíduo 529 a cerca do resíduo 625, inclusive, da ECD de HER2, a numera- ção de resíduo incluindo o peptídeo sinalizador).

O "epítopo 7C2/7F3" está na região no N-término, dentro do Domínio I, do domínio extracelular de HER2 à qual os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (cada um depositado na ATCC, veja abaixo) se ligam. Para selecionar anticorpos os quais se ligam ao epítopo 7C2/7F3, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como aquele descritos em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), pode ser realizado. Alternativamente, mapeamento de epítopo pode ser rea- lizado para estabelecer se o anticorpo se liga ao epítopo 7C2/7F3 do HER2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região de cerca do resíduo 22 a cerca do resíduo 53 da ECD do HER2, a numeração de resíduo incluin- do o peptídeo sinalizador).

"Tratamento" refere-se a tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já estão com câncer, bem como aqueles nos quais câncer tem de ser prevenido. Consequentemente, o paciente a ser tratado aqui pode ter sido diagnosticado como tendo câncer ou pode estar predisposto ou suscetível a câncer.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar câncer no paciente. A quanti- dade eficaz do fármaco pode reduzir o número de células câncerígenas; re- duzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até algum ponto e, de prefe- rência, parar) a infiltração de células câncerígenas em órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até algum ponto e, de preferência, parar) a metástase de tumor; inibir, até algum ponto, o crescimento de tumor; e/ou aliviar, até algum ponto, um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Até o ponto em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou matar células câncerí- genas existentes, ele pode ser citostático e/ou citotóxico. A quantidade efi- caz pode prolongar a sobrevivência isenta de progressão (por exemplo, con- forme medido através do Response Evaluation Criteria for Solid Tumors, RECIST, ou alterações em CA-125), resulta em uma resposta objetiva (inclu- indo uma resposta parcial, PR ou resposta completa, CR), aumenta o tempo global de sobrevivência e/ou melhora um ou mais sintomas de câncer (por exemplo, conforme avaliado através de FOSI).

O termo "agente citotóxico", conforme usado aqui, refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destrui- ção de células. O termo se destina a incluir isótopos radioativos (por exem- plo, At211lI131lI125, Y901 Re'86, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas de pequena molécula ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes das mesmas.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem a- gentes de alquilação, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN; alquil sulfonatos, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais co- mo benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metila- melaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietileno tiofosforamida e trimetilolomelamina; TLK 286 (TELCYTA®); aceto- geninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetrahidro- canabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, escopolectina e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (in- cluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); po- dofilotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análo- gos sintéticos KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma saír- codictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidro- cloreto de oxido de mecloretamina, melphalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosuréias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimustina; bisfosfonatos, tal como clodronato; antibióticos, tais como os antibióticos de enodiína (por exemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina gamall e calicheamicina omegall (veja, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)) e antraciclinas, tais como anamicina, AD 32, alcarubici- na, daunorubicina, dexrazoxano, DX-52-1, epirubicina, GPX-100, idarubicina, KRN5500, menogaril, dinemicina, incluindo dinemicina A, uma esperamicina, cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enodiína rela- cionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomici- nas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRI- AMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2- pirrolino-doxorubicina, doxorubicina lipossômica e deóxidoxorubicina), eso- rubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C1 ácido micofe- nólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ube- nimex, zinostatina e zorubicina; análogos de ácido fólico, tais como denopte- rina, pteropterina e rimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6- mercaptopurina, tiamiprina e tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideóxiuridina, doxifluridina, enocitabina e floxuridina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano e testolactona; an- ti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano e trilostano; repositores de ácido fólico, tal como ácido folínico (leucovorina); aceglatona; agentes anti- neoplásicos anti-folato, tais como ALIMTA®, LY231514 pemetrexed, inibido- res de reductase de dihidrofolato, tal como metotrexato, anti-metabólitos, tal como 5-fluorouracila (5-FU) e seus pró-fármacos, tais como UFT, S-1 e ca- pecitabina e inibidores de sintase de timidilato e inibidores de formiltransfe- rase de ribonucleotídeo de glicinamida, tal como raltitrexed (TOMUDEX®, TDX); inibidores de dehidrogenase de dihidropirimidina, tal como eniluracila; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulírico; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; a- cetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucid; nitrato de gálio; hidróxiuréia; lentinan; lonidainina; maytansinóides, tais como maytansina e ansamitoci- nas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phe- namet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK7 (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxi- na; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclo- rotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISPNE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides e taxanos, por exemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE Cremophor-free, formulação em nanopartícula albumina-manipulada de pa- clitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg1 Illinois) e doceta- xel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer1 Antony1 França); cloranbucil; gem- citabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; platina; análogos de platina ou análogos baseados em platina, tais como cisplatina, oxaliplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mito- xantrona; vincristina (ONCOVIN®); vinca alcalóide; vinorelbina (NAVELBI- NE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandro- nato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); re- tinóides, tal como ácido retinóico; sais, ácidos ou derivados farmaceutica- mente aceitáveis de qualquer um dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima, tal como CHOP, uma abreviação para terapia com- binada com ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona e FOL- FOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELO- XATIN®) combinada com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nessa definição estão agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormônios sobre tumores, tais como anti-estrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVA- DEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidróxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais tais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimi- da, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formesta- no, fadrozola, vorozola RIVISOR®, Ietrozola FEMARA® e anastrozola ARI- MIDEX®; e anti-androgênios, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo de citosina de nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos anti-senso, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em vias de sinalização implicadas em proliferação celular anormal tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H- Ras e receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas, tais como vacinas para terapia genética, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECT1M® e vacina VAXID®; rlL-2PROLEUKIN®; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.

Um "agente quimioterapêutico anti-metabólito" é um agente o qual é estruturalmente similar a um metabólito, mas não pode ser usado pelo corpo de uma maneira produtiva. Muitos agentes quimioterapêuticos anti- metabólito interferem com a produção de ácidos nucleicos, RNA e DNA. E- xemplos de agentes quimioterapêuticos anti-metabólito incluem gemcitabina (GEMZAR®), 5-fluorouracila (5-FU), capecitabina (XELODA®), 6-mercapto- purina, metotrexato, 6-tioguanina, pemetrexed, raltitrexed, arabinosilcitosina ARA-C citarabina (CYTOSAR-U®), dacarbazina (DTIC-DOME®), azocitosi- na, deóxicitosina, piridmideno, fludarabina (FLUDARA®), cladrabina, 2- deóxi-D-glicose, etc. O agente quimioterapêutico anti-metabólito preferido é gemcitabina.

"Gemcitabina" ou "monohidrocloreto de 2'-deóxi-2', 2'-difluoro- citidina (b-isômero)" é um análogo de nucleosídeo que exibe atividade anti- tumor. A fórmula empírica para HCI de gemcitabina é C9H11F2N304 A HCI. HCI de gemcitabina é vendido pela Eli Lilly sob a marca comercial GEM- ZAR®.

Um "agente quimioterapêutico baseado em platina" compreende um composto orgânico o qual contém platina como uma parte integral da molécula. Exemplos de agentes quimioterapêuticos baseados em platina incluem carboplatina, cisplatina e oxaliplatina.

Por "quimioterapia baseada em platina" entenda-se terapia com um ou mais agentes quimioterapêuticos baseados em platina, opcionalmente em combinação com um ou mais de outros agentes quimioterapêuticos.

Por câncer "resistente à quimioterapia" entenda-se que o pacien- te com câncer progrediu enquanto estava recebendo um regime de quimiote- rapia (isto é, o paciente é "resistente à quimioterapia") ou o paciente progre- diu dentro de 12 meses (por exemplo, dentro de 6 meses) após terminar um regime de quimioterapia.

Por "câncer resistente à platina" entenda-se que o paciente com câncer progrediu enquanto estava recebendo quimioterapia baseada em platina (isto é, o paciente é "resistente à platina") ou o paciente progrediu dentro de 12 meses (por exemplo, dentro de 6 meses) após terminar um re- gime de quimioterapia baseado em platina.

Um "agente anti-angiogênico" se a um composto o qual bloqueia ou interfere, até algum grau, com o desenvolvimento de vasos sangüíneos. O fator anti-angiogênico pode, por exemplo, ser uma pequena molécula ou anticorpo que se liga a um fator de crescimento ou receptor de fator de cres- cimento envolvido na promoção de angiogênese. O fator anti-angiogênico preferido aqui é um anticorpo que se liga ao fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), tal como bevacizumab (AVASTIN®).

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células a qual atua sobre células, tais como mediado- res intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos dentre as citocinas estão hormônio do crescimento, tal como hormônio de crescimento humano, hor- mônio de crescimento humano de N-metionila e hormônio de crescimento bovino; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteína, tal como hormônio de estimulação folicular (FSH), hormônio de estimulação da tiróide (TSH) e hormônio Iuteini- zante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblas- to; prolactina; lactogênio placental; fator-α e -β de necrose de tumor; subs- tância de inibição muleriana; peptídeo gonadotropina de camundongo- associado; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integri- na; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de nervo, tal como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores de crescimento de transformação (TGFs), tais como TGF-α e TGF-β; fator-l e -II de crescimento semelhante à insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteo-indutivos; interferons, tais como interferon-α, -β e -γ; fatores de estimulação de colônia (CSFs), tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granuló- cito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs)1 tais como IL-1, IL-1aa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose de tumor, tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos, incluindo LIF e ligante kit (KL). Conforme usado aqui, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de célula recombinante e equivalentes biologi- camente ativos das citocinas de seqüência nativa.

Conforme usado aqui, o termo "fármaco EGFR-objetivado" refe- re-se a um agente terapêutico que se liga ao EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos e peque- nas moléculas que se ligam ao EGFR. Exemplos de anticorpos os quais se ligam ao EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (veja Patente US N0 4.943.533, Mendelsohn e colaboradores) e variantes dos mesmos, tal como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximab; ERBUTIX®) e 225 humano re-formatado (H225) (veja WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, um anticorpo EGFR-objetivado totalmente humano (Imclo- ne); anticorpos que se ligam ao EGFR mutante do tipo II (Patente US N0 5.212.290); anticorpos humanizados e quiméricos que se ligam ao EGFR1 conforme descrito na Patente US N0 5.891.996; e anticorpos humanos que se ligam ao EGFR, tais como ABX-EGF (veja W098/50433, Abgenix); EMD 55900 (Stragliotto e colaboradores, Eur. J. Câncer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab), um anticorpo ao EGFR humanizado dirigido contra o EGFR que compete com o EGF e TGF-alfa pela ligação ao EGFR; e mAb 806 ou mAb 806 humanizado (Johns e colaboradores, J. Biol. Chem. 279(29): 30375-30384 (2004)). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, assim, gerando um imunoconjugado (veja, por exemplo, EP659,439A2, Patente da Merck GmbH). Exemplos de pequenas moléculas que se ligam ao EGFR incluem ZD1839 ou Gefitinib (IRESSA; Astra Zeneca); CP-358774 ou Eriotinib (TARCEVA®; Genentech/OSI); e AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen); EMD-7200.

Um "inibidor de quínase de tirosina" é uma molécula a qual inibe a atividade de quínase de tirosina de uma quínase de tirosina, tal como um receptor HER. Exemplos de tais inibidores incluem os fármacos EGFR- objetivados mencionados no parágrafo precedente; inibidor de quínase de tirosina de HER2 de pequena molécula, tal como TAK165 disponível da Ta- keda; CP-724,714, um inibidor seletivo oral da quínase de tirosina do recep- tor ErbB2 (Pfizer and OSI); inibidores duplos de HER, tal como EKB-569 (disponível da Wyeth) o qual, de preferência, se liga ao EGFR mas inibe cé- lulas superexpressando HER2 e EGFR; GW572016 (disponível da Glaxo), um inibidor oral de quínase de tirosina de HER2 e EGFR; PKI-166 (disponí- vel da Novartis); inibidores de pan-HER, tal como canertinib (CI-1033; Phar- macia); inibidores de Raf-1, tal como o agente anti-senso ISIS-5132 disponí- vel da ISIS Pharmaceuticals, o qual inibe a sinalização à Raf-1; inibidores de TK não objetivados ao HER, tal como mesilato de Imatinib (Gleevac®) dis- ponível da Glaxo; inibidor de quínase I extracelular-regulada MAPK CI-1040 (disponível da Pharmacia); quinazolinas, tal como PD 153035,4-(3-cloroani- lino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(feni- lamino)-7H-pirrolo 2,3-d pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis (4- fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas contendo porções de nitrotiofeno; PD- 0183805 (Warner-Lamber); moléculas anti-senso (por exemplo, aquelas que se ligam ao ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (Patente US N0 5.804.396); trifostinas (Patente US N0 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores de pan-HER, tais como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de Imatinib (Gleevac; Novar- tis); PKI166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKIine); CI-1033 (Pfizer); EKB- 569 (Wyeth); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novar- tis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); ou conforme descrito em qualquer uma das seguintes publicações de patente: Patente US N0 5.804.396; W099/09016 (American Cyanimid); W098/43960 (American Cyanamid); W097/38983 (Warner Lambert); W099/06378 (Warner Lambert); W099/06396 (Warner Lambert); W096/30347 (Pfizer, Inc); W096/33978 (Zeneca); W096/3397 (Zeneca); e W096/33980 (Zeneca).

Uma dose "fixa" ou "plana" de um agente terapêutico aqui refere- se a uma dose que é administrada a um paciente humano sem considerar o peso (WT) ou área de superfície corporal (BSA) do paciente. A dose fixa ou plana, portanto, não é fornecida como uma dose em mg/kg ou uma dose em mg/m2, mas antes como uma quantidade absoluta do agente terapêutico.

Uma dose de "carregamento" aqui geralmente compreende uma dose inicial de um agente terapêutico administrada a um paciente e é segui- da por uma ou mais doses de manutenção da mesma. Geralmente, uma Cí- nica dose de carregamento é administrada, mas múltiplas doses de carre- gamento são consideradas aqui. Usualmente, a quantidade de dose(s) de carregamento administrada excede a quantidade da(s) dose(s) de manuten- ção administrada(s) e/ou a(s) dose(s) de carregamento é(são) administra- da(s) mais freqüentemente do que a(s) dose(s) de manutenção, de modo a obter a concentração em estado uniforme desejada do agente terapêutico mais cedo do que pode ser obtido com a(s) dose(s) de manutenção. Uma dose de "manutenção" aqui refere-se a uma ou mais doses de um agente terapêutico administradas ao paciente durante um período de tratamento. Usualmente, as doses de manutenção são administradas em intervalos de tratamento espaçados, tal como aproximadamente a cada se- mana, aproximadamente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3 semanas ou aproximadamente a cada 4 semanas.

II. Produção de anticorpo

Uma vez que, na modalidade preferida, o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo, segue uma descrição de técnicas exemplificativas para a produção de anticorpos ao HER usados de acordo com a presente invenção. O antígeno HER a ser usado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de um receptor HER ou uma porção do mesmo, contendo o epítopo desejado. Alternativa- mente, células expressando HER em sua superfície celular (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para superexpressar HER2; ou uma linha- gem de células de carcinoma, tal como células SK-BR-3, veja Stancovski e colaboradores, PNAS (USA) 88: 8691-8695 (1991)), pode ser usada para gerar anticorpos. Outras formas do receptor HER úteis para geração de anti- corpos serão evidentes para aqueles habilitados na técnica.

(i) Anticorpos policlonais

Anticorpos policlonais são, de preferência, estimulados em ani- mais através de múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno re- levante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina do caramujo Megathura crenulata, albumina do soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja usando um agente bifun- cional ou de derivatização, por exemplo, maleimidobenzoil sulfo-succinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidróxi-succinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCI2 ou R1N=C=NR, onde ReR' são diferentes grupos alquila.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imu- nogênicos ou derivados através de combinação, por exemplo, 100 μg ou 5 μ9 da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectiva- mente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solu- ção intradermicamente em múltiplos locais. Um mês depois, os animais re- cebem um reforço com 1/5 a 1/10 da quantidade original do peptídeo ou con- jugado em adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias depois, o sangue dos animais é coletado e o soro é ensaiado com relação à titulação de anticorpo. Os animais recebem o reforço até que a titulação nivele. De preferência, o animal recebe um refor- ço com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada diferente. Conju- gados também podem ser feitos em cultura de célula recombinante como fusões de proteína. Também, agentes de agregação, tal como alume, são adequadamente usados para intensificar a resposta imune.

(ii) Anticorpos monoclonais

Vários métodos para fazer anticorpos monoclonais aqui estão disponíveis na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos usando o método de hibrídoma primeiro descrito por Kohler e colabo- radores, Nature, 256: 495 (1975), através de métodos de DNA recombinante (Patente U.S. N0 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hos- pedeiro apropriado, tal como um hâmster, é imunizado conforme aqui antes descrito para estimular linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são, então, fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão ade- quado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Go- ding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas 59-103 (Aca- demic Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são cultivadas e crescidas em um meio de cultura adequado que contém, de preferência, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma precursoras não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras carecem da enzima fosforibosil transferase de guanina de hipoxantina (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá, tipicamente, hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), subs- tâncias as quais impedem o crê de células HGPRT-deficientes.

Células de mieloma preferidas são aquelas as quais se fundem eficientemente, sustentam produção estável em alto nível de anticorpo pelas células que produzem anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio, tal como meio HAT. Dentre essas, linhagens de células de mieloma preferidas são linhagens de mieloma de murino, tais como aquelas derivadas de tumo- res de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego1 Califórnia EUA e células SP-2 ou X63-Ag8- 653 disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Linhagens de célula de heteromieloma de camundongo-humano e mie- loma humano também foram descritas para a produção de anticorpos mono- clonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur e cola- boradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., New York, 1987)).

O meio de cultura no qual células de hibridoma estão crescendo é avaliado com relação à produção de anticorpos monoclonais dirigidos con- tra o antígeno. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como radio imunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exem- plo, ser determinada através de análise de Scatchard de Munson e colabo- radores, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Após serem identificadas células de hibridoma que produzem os anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição Iimitativa e crescidos através de métodos padrões (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Praetice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura adequados para essa finalidade incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser crescidas in vitro como tumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são, a- dequadamente, separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro atra- vés de procedimentos convencionais de purificação de anticorpo tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidróxiapatita, eletro- forese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

DNA que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente iso- lado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, u- sando sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especifica- mente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão os quais são, então, transfectados em células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símio, células de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem, de outro modo, proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre expressão recombi- nante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra e cola- boradores, Curr. Opinion in Immunol, 5: 256-262 (1993) e Pluckthun, Immu- nol. Revs., 130: 151-188(1992).

Em uma outra modalidade, anticorpos monoclonais ou fragmen- to de anticorpo podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo gera- das usando as técnicas descritas em McCafferty e colaboradores, Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson e colaboradores, Nature, 352: 624-628 (1991) e Marks e colaboradores, J. Mol. Biol, 222: 581-597 (1991) descre- vem a produção de anticorpos humanos com alta afinidade (faixa de nM) através de embaralhamento de cadeia (Marks e colaboradores, Bio/ Techno- logy, 10: 779-783 (1992)), bem como infecção combinatorial e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse e colaboradores, Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Assim, essas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibri- doma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais.

O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a seqüência de codificação pelos domínios constantes de cadeia pesada e cadeia leve humana em lugar das seqüências homólogas de murino (Paten- te U.S. N0 4.816.567; e Morrison e colaboradores, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81: 6851 (1984)) ou através de união covalente, à seqüência de codificação de imunoglobulina, de toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo de não-imunoglobulina.

Tipicamente, tais polipeptídeos de não-imunoglobulina são subs- tituídos pelos domínios constantes de um anticorpo ou eles são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anti- corpo para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um sítio de combinação de antígeno tendo especificidade por um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno tendo especificidade por um antígeno dife- rente.

(iii) Anticorpos humanizados

Métodos para humanização de anticorpos não humanos foram descritos na técnica. De preferência, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de uma fonte a qual é não-humana. Esses resíduos de aminoácido não-humanos são fre- qüentemente referidos como resíduos "importados" os quais são, tipicamen- te, tomados de um domínio variável "importado". Humanização pode ser rea- lizada essencialmente seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones e colaboradores, Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann e colaboradores, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen e colaboradores, Science, 239: 1534-1536 (1988)), substituindo seqüências de região hipervariável pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N0 4.816.567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espé- cie não-humana. Na prática, anticorpos humanizados são, tipicamente, anti- corpos humanos nos quais alguns resíduos da região hipervariável e possi- velmente alguns resíduos da FR são substituídos por resíduos de sítios aná- logos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, leve e pesado, a se- rem usados para fazer os anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim denominado método "best- fit", a seqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é seleciona- da contra a biblioteca toda de seqüências de domínio variável humanas co- nhecidas. A seqüência humana a qual é mais próxima daquela do roedor é, então, aceita como a região de estrutura humana (FR) para o anticorpo hu- manizado (Sims e colaboradores, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia e colaboradores, J. Moi BioL1 196: 90.1 (1987)). Outro método usa uma região de estrutura particular derivada da seqüência de consenso de todos os anti- corpos humanos de um subgrupo em particular de cadeias pesada ou leve. A mesma estrutura pode ser usada para diferentes anticorpos humanizados (Carter e colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta e colaboradores, J. Immunoi, 151: 2623 (1993)).

É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para obter esse objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das seqüências precursoras e vários produtos humanizados conceituais u- sando modelos tridimensionais das seqüências precursoras e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles habilitados na técnica. Programas de computa- dor estão disponíveis, os quais ilustram e mostram prováveis estruturas con- formacionais tridimensionais de seqüências de imunoglobulina candidatas. Inspeção dessas visualizações permite análise do provável papel dos resí- duos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candi- data de se ligar a seu antígeno. Dessa forma, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e importar seqüências de modo que a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade aumen- tada pelo(s) antígeno(s) alvo, seja obtida. Em geral, os resíduos de região hipervariável estão direta e mais substancialmente envolvidos ao influenciar a ligação a antígeno.

A Patente U.S. N0 6.949.245 descreve a produção de anticorpos ao HER2 humanizados exemplificativos os quais se ligam ao HER2 e blo- queiam a ativação de Iigante de um receptor HER. O anticorpo humanizado de interesse particular aqui bloqueia ativação EGF-, TGF-α e/ou HRG- mediada de MAPK essencialmente tão eficazmente quanto o anticorpo mo- noclonal de murino 2C4 (ou um fragmento Fab do mesmo). O anticorpo hu- manizado aqui pode, por exemplo, compreender resíduos de região hiperva- riável não humana incorporados em um domínio pesado variável humano e pode ainda compreender uma substituição na região de estrutura (FR) em uma posição selecionada do grupo consistindo de 69H, 71H e 73H utilizando o sistema de numeração de domínio variável apresentado em Kabat e cola- boradores, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Em uma modalidade, o anticorpo humanizado compreende substituições na FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H.

Um anticorpo humanizado exemplificativo de interesse aqui compreende os resíduos de determinação de complementaridade do domí- nio pesado variável GFTFTDYTMX, onde X é, de preferência, D ou S (SEQ ID NO: 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8); e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID NO: 9), opcionalmente compreendendo modificações de aminoáci- do desses resíduos de CDR, por exemplo, onde as modificações mantêm essencialmente ou melhoram a afinidade do anticorpo. Por exemplo, a vari- ante de anticorpo de interesse pode ter de cerca de uma a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácido nas seqüências de CDR pesada variável acima. Tais variantes de anticorpo podem ser preparadas através de maturação por afinidade, por exemplo, conforme descrito abaixo. O anticor- po humanizado mais preferido compreende a seqüência de aminoácido de domínio pesado variável SEQ ID NO: 4. O anticorpo humanizado pode compreender resíduos de deter- minação de complementaridade de domínio leve variável KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX1X2X3, onde X1 é, de preferência, R ou L, X2 é, de preferência, Y ou E e X3 é, de preferência, T ou S (SEQ ID NO: 11); e/ou QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), por exemplo, além daqueles resíduos de CDR de domínio pesado variável no parágrafo precedente. Tais anticorpos humanizados compreendem opcionalmente modificações de aminoácido dos resíduos de CDR acima, por exemplo, onde as modificações mantêm essen- cialmente ou melhoram a afinidade do anticorpo. Por exemplo, a variante de anticorpo de interesse pode ter de cerca de uma a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácido nas seqüências de CDR leve variável a- cima. Tais variantes de anticorpo podem ser preparadas através de matura- ção por afinidade, por exemplo, conforme descrito abaixo. O anticorpo hu- manizado mais preferido compreende a seqüência de aminoácido de domí- nio leve variável em SEQ ID NO: 3.

O presente pedido também considera anticorpos maturados por afinidade os quais se ligam ao HER2 e bloqueiam a ativação de Iigante de um receptor HER. O anticorpo precursor pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, um compreendendo as seqüências leve variável e/ou pesada variável de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente (isto é, compreendendo o Vl e/ou Vh do pertuzumab). O anticorpo maturado por afinidade, de preferência, se liga ao receptor HER2 com uma afinidade superior àquela do 2C4 de murino ou pertuzumab (por exemplo, uma afini- dade aperfeiçoada de cerca de duas a cerca de quatro vezes, a cerca de 100 vezes ou cerca de 1000 vezes, por exemplo, conforme avaliado usando um ELISA do domínio extracelular de HER2 (ECD). Resíduos de CDR pesa- da variável exemplificativos para substituição incluem H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete desses resíduos). Exemplos de resíduos de CDR leve variável para alteração incluem L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois a três, quatro, cinco ou até cerca de dez desses resíduos). Várias formas do anticorpo humanizado ou do anticorpo matura- do por afinidade são consideradas. Por exemplo, o anticorpo humanizado ou anticorpo maturado por afinidade pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, o qual é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos, de forma a gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anti- corpo humanizado ou anticorpo maturado por afinidade pode ser um anticor- po intacto, tal como um anticorpo de IgGI intacto. O anticorpo de IgGI intac- to preferido compreende a seqüência de cadeia leve em SEQ ID NO: 13 e a seqüência de cadeia pesada em SEQ ID NO: 14.

(iv) Anticorpos humanos

Como uma alternativa à humanização, anticorpos humanos po- dem ser gerados. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgêni- cos (por exemplo, camundongos) que são capazes, quando de imunização, de produzir um repertorio completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a de- leção homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada (JH) do anticorpo em camundongos mutantes para linhagem germinativa e quimérica resulta em inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transfe- rência do conjunto do gene de imunoglobulina de linhagem germinativa hu- mana para tais camundongos mutantes para linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos quando de estímulo com antígeno. Ve- ja, por exemplo, Jakobovits e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits e colaboradores, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann e colaboradores, Year in Immuno., 7: 33 (1993); e Patentes U.S. N°s 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807. Alternativamente, a tecnologia de phage display (McCafferty e colaboradores, Nature 348: 552-553 (1990)) pode ser usada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo in vitro, a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imuno- globulina de doadores imunizados.

De acordo com essa técnica, genes de domínio V de anticorpo são clonados em-rede em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd e visualizados como fragmentos de anticorpo funcional sobre a superfície da partícula de fago. Em virtude do fato de a partícula filamentosa conter uma cópia de DNA fita simples do genoma do fago, seleções baseadas nas propriedades fun- cionais do anticorpo também resulta em seleção do gene que codifica o anti- corpo exibindo essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propri- edades da célula B. Phage display pode ser realizado em uma variedade de formatos; para sua revisão veja, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Várias fon- tes de segmentos de V-gene podem ser usadas para phage display. Clack- son e colaboradores, Nature, 352: 624-628 (1991) isolaram uma série diver- sa de anticorpos anti-oxazolona de uma pequena biblioteca combinatorial aleatória de genes V derivados do baço de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser cons- truído e anticorpos a uma diversa série de antígenos (incluindo auto- antígenos) pode ser isolada seguindo essencialmente as técnicas descritas por Marks e colaboradores, J. Moi Biol 222: 581-597 (1991) ou Griffith e co- laboradores, EMBO J. 12: 725-734 (1993). Veja também Patentes U.S. N°s 5.565.332 e 5.573.905.

Conforme discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados por células B in vitro (veja Patentes5.567.610 e 5.229.275).

Anticorpos ao HER2 humano são descritos na Patente U.S. N0 5.772.997, emitida em 30 de Junho de 1998 e WO 97/00271 publicado em 3 de Janeiro de 1997.

(v) Fragmentos de anticorpo

Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de frag- mentos de anticorpo compreendendo uma ou mais regiões de ligação a an- tígeno. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados via digestão proteolítico de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto e colabora- dores, Journal of Biochemical and Biophysieal Methods 24: 107-117 (1992); e Brennan e colaboradores, Science, 229: 81 (1985)). Contudo, esses frag- mentos agora podem ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isola- dos das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab1-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter e colabora- dores, Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outra aborda- gem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente da cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para aqueles habilitados. Em outras modalida- des, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Veja WO 93/16185; Patente U.S. N0 5.571.894; e Patente U.S. N0 5.587.458. O fragmento de anticorpo pode também ser um anticorpo Alinear®, por e- xemplo, conforme descrito na Patente U.S. N0 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser mono-específicos ou biespecíficos.

(vi) Anticorpos biespecíficos

Anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades de ligação por pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplificativos podem se ligar a dois epítopos diferentes da proteína de HER2. Outros de tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação a HER2 com sítio(s) de ligação para EGFR, HER3 e/ou HER4. Alternativamen- te, um braço de HER2 pode ser combinado com um braço o qual se liga a uma molécula de disparo sobre um leucócito, tal como uma molécula recep- tora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3) ou receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FeyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) de modo a focalizar mecanismos de defesa celular à célula expressando HER2. Anti- corpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes cito- tóxicos à células as quais expressam HER2. Esses anticorpos possuem um braço de ligação a HER2 e um braço o qual se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, vinca alcalóide, cadeia de ricina A, me- totrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de an- ticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

O WO 96/16673 descreve um anticorpo ao HER2/FcyRIII bies- pecífico e Patente U.S. N0 5.837.234 divulga um anticorpo ao HER2/FcyRI biespecífico IDM1 (Osidem). Um anticorpo biespecífico ao HER2/Fca é mos- trado no W098/02463. A Patente U.S. N0 5.821.337 ensina um anticorpo ao HER2/CD3 biespecífico. MDX-210 é um Ab ao 33-FcyRIII biespecífico.

Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (Millstein e colaboradores, Nature, 305: 537-539 (1983)). Em virtude da es- colha aleatória de cadeias pesada e leve de imunoglobulina, esses hibrido- mas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 diferentes molécu- las de anticorpo, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. Purificação da molécula correta, a qual usualmente é feita através de etapas de cromatografia por afinidade, é problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos no WO 93/08829 e em Traunecker e colaboradores, EMBOJ., 10: 3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combina- ção de anticorpo-antígeno) são fundidos à seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é, de preferência, com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região constan- te de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação à cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fu- sões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão distintos e são co- transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias polipeptídicas usadas na estrutura proporcionam os rendimentos ótimos. Contudo, é possível inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias polipeptídicas em um vetor de expressão quando a expres- são de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em proporções iguais resulta em altos rendimentos ou quando as proporções não são de significância par- ticular.

Em uma modalidade preferida dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina hí- brida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina (proporcionando uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que essa estrutura facilita a separação do composto biespecífico desejado das combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma ca- deia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífi- ca proporciona uma forma fácil de separação. Essa abordagem é descrita no WO 94/04690. Para outros detalhes de geração de anticorpos biespecíficos veja, por exemplo, Suresh e colaboradores, Methods in Enzymology, 121: 210(1986).

De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. N0 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser ma- nipulada para maximizar o percentual de heterodímeros os quais são recu- perados da cultura de célula recombinante. A interface preferida compreen- de pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante de anti- corpo. Nesse método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoáci- do da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por ca- deias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano).

"Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) maior(es) são criadas sobre a interface da segunda mo- lécula de anticorpo substituindo grandes cadeias laterais de aminoácido pe- las pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). Isso proporciona um me- canismo para aumentar o rendimento do heterodímero com relação a outros subprodutos indesejados, tais como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos cruzadamente liga- dos ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heterocon- jugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para objetivar células do sistema imune à células indesejadas (Patente U.S. N0 4.676.980) e para tratamento de infecção pelo HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjuga- dos podem ser feitos usando quaisquer métodos de ligação cruzada conve- nientes. Agentes de ligação cruzada adequados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente U.S. N0 4.676.980, junto com uma série de técnicas de ligação cruzada.

Técnicas para geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpo também foram descritos na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan e colaboradores, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedi- mento em que anticorpos intactos são proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente de formação de complexo de ditiol, arsenita de sódio, para estabilizar ditióis proximais e impedir formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos F(ab')2 gerados são, então, convertidos aos derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab'-TNB é, então, re-convertido ao Fab'-tiol através de redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quanti- dade equimolar do outro derivado de Fab1-TNB para formar o anticorpo bies- pecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Progresso recente tem facilitado a recuperação direta de frag- mentos Fab1-SH de E. coli, a qual pode ser quimicamente acoplada para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby e colaboradores, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo F(ab')2 biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab1 foi separadamen- te secretado de E. coli e submetido a acoplamento químico direto in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar à células superexpressando o receptor HER2 e células T humanas normais, bem como disparar a atividade lítica de linfócitos citotó- xicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Várias técnicas para fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpo biespecífico diretamente a partir de cultura de células recombinan- tes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos têm sido produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny e colaboradores, J. Immu- nol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteí- nas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão genética. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e, então, reoxidados para formar os heterodimeros de anticorpo. Esse método pode também ser utili- zado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "dia- corpo" descrita por Hollinger e colaboradores, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 6444-6448 (1993) tem proporcionado um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpo biespecífico. Os fragmentos compre- endem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) através de um Iigante o qual e muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia.

Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento, desse modo, formando dois sítios de ligação a antígeno. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico através do uso de dímeros de Fv com cadeia simples (sFv) também foi reportada. Veja Gruber e colabo- radores, J. Immunol, 152: 5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são considerados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt e colaborado- res, J. Immunol. 147: 60 (1991).

(vii) Outras modificações de seqüência de aminoácido

Modificação(ões) de seqüência de aminoácido dos anticorpos descritos aqui é(são) considerada(s). Por exemplo, pode ser desejável me- lhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticor- po. Variantes de seqüência de aminoácido do anticorpo são preparadas a- través de introdução de alterações de nucleotídeo apropriadas no ácido nu- cleico do anticorpo ou através de síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de e/ou inserções em e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer com- binação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar às seqüên- cias do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é feita para chegar à estrutura final, contanto que a estrutura final possua as características desejadas. As alterações de aminoácido também podem alte- rar processos pós-traducionais do anticorpo, tal como alteração do número ou posição de sítios de glicosilação.

Um método útil para identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferidos para mutagênese é denomi- nado "mutagênese por exploração de alanina", conforme descrito por Cun- ningham e Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou gru- po de resíduos alvo é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, Iys e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou ne- gativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Aqueles locais de ami- noácido demonstrando sensibilidade funcional às substituições são, então, refinados através de introdução de outras variantes em ou para os locais de substituição. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação de se- qüência de aminoácido seja predeterminado, a natureza da mutação per se não precisa ser determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um determinado sítio, exploração por ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpo expressas são selecionadas com relação à atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácido incluem fusões amino- e/ou carbóxi-terminais oscilando, quanto ao comprimento, de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra- sequência de um único ou múltiplos resíduos de aminoácido. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo com um resíduo de metionila N- terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras varian- tes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-tér- mino do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipep- tídeo o qual aumenta a meia-vida no soro do anticorpo. Outro tipo de variante é uma variante com substituição de ami- noácido. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na mo- lécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariá- veis, mas alterações na FR também são consideradas. Substituições con- servativas são mostradas na Tabela 1 sob o cabeçalho de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam em uma alteração na atividade biológica, então, alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" na Tabela 1 ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos selecionados.

Tabela 1

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Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anti- corpo são realizadas através de seleção de substituições que diferem signifi- cativamente quanto a seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da par- te principal polipeptídica na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da mo- lécula no sítio alvo ou (c) o grosso da cadeia lateral. Aminoácidos podem ser agrupados de acordo com similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger1 em Biochemistry, segunda ed., páginas 73-75, Worth Publishers1 NewYork (1975)):

(1) não-polar: Ala (A)1 Val (V)1 Leu (L)1 Ile (I)1 Pro (P)1 Phe (F)1 Trp (W)1 Met (M)

(2) polar não carregado: Gly (G)1 Ser (S)1 Thr (T)1 Cys (C)1 Tyr (Y)1 Asn (N)1 Gln (Q)

(3) ácido: Asp (D)1 Glu (E)

(4) básico: Lys (K)1 Arg (R)1 His (H)

Alternativamente, resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseado em propriedades em comum da cadeia lateral:

(1) hidrofóbicos: Norleucina1 Met1 Ala1 Val1 Leu1 lie;

(2) hidrofílicos neutros: Cys1 Ser1 Thr1 Asn1 Gln;

(3) ácidos: Asp1 Glu;

(4) básicos: His1 Lys1 Arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly1 Pro;

(6) aromáticos: Trp1 Tyr1 Phe.

Substituições não conservativas requererão troca de um mem- bro de uma dessas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também podem ser substituído, geral- mente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e pre- venir ligação cruzada anormal. Inversamente, ligação(ões) de cisteína po- de(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (parti- cularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).

Um tipo particularmente preferido de variante com substituição envolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo precursor (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado).

Geralmente, a(s) variante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aperfeiçoadas com relação ao anticorpo precursor do qual ela(s) é(são) gerada(s). Uma forma conveniente para ge- ração de tais variantes com substituição envolve maturação por afinidade usando phage display. Resumidamente, vários sítios de região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) sofrem mutação para gerar todas as possíveis substituições em cada sítio. As variantes de anticorpo assim geradas são mostradas de um modo monovalente a partir de partículas de fago filamen- tosas como fusões ao produto do gene III de M13 acondicionado dentro de cada partícula. As variantes visualizadas em fago são, então, selecionadas com relação à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação), conforme aqui descrito. De forma a identificar sítios de região hipervariável candidatos para modificação, mutagênese por exploração de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente para a ligação a antígeno. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antíge- no-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e HER2 humano. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido à seleção confor- me descrito aqui e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

Outro tipo de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosi- lação original do anticorpo. Por alteração entenda-se deleção de uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

Glicosilação de anticorpos é, tipicamente, N-ligada ou O-ligada. N-ligada refere-se à fixação da porção carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para fixação enzimática da porção carboidra- to à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma des- sas seqüências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à fixação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidróxi aminoácido, mais co- mumente serina ou treonina, embora 5-hidróxiprolina ou 5-hidróxilisina tam- bém pode ser usada.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é, conveniente- mente, realizada através de alteração da seqüência de aminoácido, de modo que ela contenha uma ou mais das seqüências tripeptídicas descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligada). A alteração também pode ser feita a- través da adição de ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O- ligada).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc1 o carboidrato pre- so à mesma pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato maduro que carece de fucose presa a uma região Fc do anti- corpo são descritos no Pedido de Patente US N0 2003/0157108 A1, Presta, L. Veja também US 20 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltda). Anticorpos com uma N-acetilglicosamina de bisseção (GIcNAc) no carboidra- to preso a uma região Fc do anticorpo são mencionados no W003/011878, Jean-Mairet e colaboradores e Patente US N0 6.602.684, Umana e colabo- radores. Anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossaca- rídeo preso a uma região Fc do anticorpo são reportados no W097/30087, Patel e colaboradores. Veja também W098/58964 (Raju, S.) e W099/22764 (Raju, S.) referentes a anticorpos com carboidrato alterado preso à região Fc do mesmo.

Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com rela- ção à função efetuadora, por exemplo, de modo a intensificar a citotoxicida- de célula-mediada antígeno-dependente (ADCC) e/ou citotoxicidade com- plemento-dependente (CDC) do anticorpo. Isso pode ser obtido através de introdução de uma ou mais substituições de aminoácido em uma região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região Fc1 desse modo, permitindo a formação de Iiga- ção de dissulfeto intercadeia nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização aperfeiçoada e/ou morte celu- lar complemento-mediada e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) aumentadas. Veja Caron e colaboradores, J. Exp Med. 176: 1191- 1195 (1992) e Shopes1 B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumor intensificada também podem ser preparados usando Iigantes cruzados heterobifuncionais conforme descrito em Wolffs e colaboradores, Câncer Research 53: 2560-2565 (1993). Alterna- tivamente, um anticorpo pode ser manipulado, o qual tem regiões Fc duplas e pode, assim, ter Iise de complemento e capacidades de ADCC intensifica- das. Veja Stevenson e colaboradores, Anti-Câncer Drug Design 3: 219-230 (1989).

O WO00/42072 (Presta, L.) descreve anticorpos com função ADCC aperfeiçoada na presença de células efetuadoras humanas, onde os anticorpos compreendem substituições de aminoácido na região Fc dos mesmos. De preferência, o anticorpo com ADCC aperfeiçoada compreende substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos). De preferência, a região Fc alterada é uma região Fc de IgGI humana compreendendo ou consistindo de substituições em uma, duas ou três dessas posições. Tais substituições são opcionalmente combinadas com substituição(ões) as quais aumentam a ligação a C1q e/ou CDC.

Anticorpos com ligação a C1q e/ou citotoxicidade complemento- dependente (CDC) alterada são descritos no W099/51642, Patente US N0 6.194.551 B1, Patente US N0 6.242.195 B1, Patente US N0 6.528.624 B1 e Patente US N0 6.538.124 (ldusogie e colaboradores). Os anticorpos com- preendem uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições de aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 e/ou 334 da região Fc dos mesmos (numeração EU de resíduos).

Para aumentar a meia-vida no soro do anticorpo, pode-se incor- porar um epítopo de ligação a receptor de salvamento no anticorpo (especi- almente um fragmento de anticorpo), conforme descrito na Patente US 5.739.277, por exemplo. Conforme descrito aqui, o termo "epítopo de ligação a receptor de salvamento" refere-se a um epítopo da região Fc de uma mo- lécula de IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida in vivo no soro da molécula de IgG. Anticorpos com ligação aperfeiçoada ao receptor de Fc neonatal (FcRn) e meia-vida aumentada são descritos no WO00/42072 (Presta, L.) e US2005/0014934A1 (Hinton e colaboradores). Esses anticorpos compreen- dem uma região Fc com uma ou mais substituições, as quais melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Por exemplo, a região Fc pode ter substitui- ções em uma ou mais das posições 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382,413, 424, 428 ou 434 (numeração EU de resíduos). A variante de anticorpo compreen- dendo região Fc preferida com ligação aperfeiçoada ao FcRn compreende substituições de aminoácido em uma, duas ou três posições 307, 308 e 434 da região Fc da mesma (numeração Eu de resíduos).

Anticorpos manipulados com três ou mais (de preferência qua- tro) sítios de ligação a antígeno funcionais também são considerados (Pedi- do US N0. US2002/0004587 A1, Miller e colaboradores).

Moléculas de ácido nucleico que codificam variantes de seqüên- cia de aminoácido do anticorpo são preparadas através de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes de se- qüência de aminoácido que ocorrem naturalmente) ou preparo através de mutagênese oligonucleotídeo-mediada (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese por cassete de uma variante previamente preparada ou uma versão não-variante do anticorpo.

(viii) Seleção de anticorpos com as propriedades desejadas

Técnicas para a geração de anticorpos foram descritas acima. Pode-se selecionar ainda anticorpos com determinadas características bio- lógicas, conforme desejado.

Para identificar um anticorpo o qual bloqueia a ativação de ligan- te de um receptor HER, a capacidade do anticorpo de bloquear a ligação de um ligante de HER à células expressando o receptor HER (por exemplo, em conjugação com outro receptor HER com o qual o receptor HER de interesse forma um hetero-oligômero de HER) pode ser determinada. Por exemplo, células expressando naturalmente ou transfectadas para expressar recepto- res HER do hetero-oligômero de HER podem ser incubadas com o anticorpo e, então, expostas ao ligante de HER rotulado. A capacidade do anticorpo de bloquear a ligação de ligante ao receptor HER no hetero-oligômero de HER pode, então, ser avaliada.

Por exemplo, inibição de ligação de HER à linhagens de células de tumor de mama MCF7 por anticorpos ao HER2 podem ser obtida usando culturas de MCF7 em monocamadas sobre gelo em um formato de lâmina com 24 cavidades essencialmente conforme descrito na Patente U.S. N0 6.949.245. anticorpos monoclonais ao HER2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubadas durante 30 minutos. RHRGp1177.224 125l-rotulado (25 pm) pode, então, ser adicionado e a incubação pode ser continuada durante 4 a 16 horas. Curvas de dose-resposta podem ser preparadas e um valor de IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma modalidade, o anticorpo o qual bloqueia a ativação de Iigante de um receptor HER terá uma IC50 para inibição de ligação de HRG à células MCF7 nesse ensaio de cerca de 50 nM ou menos, mais preferivelmente 10 nM ou menos. Onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, a IC50 para inibição de ligação de HRG à células MCF7 nesse ensaio pode, por exemplo, ser cerca de 100 nM ou menos, mais preferivelmente 50 nM ou menos.

Alternativa ou adicionalmente, a capacidade de um anticorpo de bloquear a fosforilação de tirosina ligante de HER-estimulada de um receptor HER presente em um hetero-oligômero de HER pode ser avaliada. Por e- xemplo, células expressando endogenamente os receptores HER ou trans- fectadas para expressar os mesmos podem ser incubadas com o anticorpo e, então, ensaiadas com relação à atividade de fosforilação de tirosina Iigan- te de HER-dependente usando um anticorpo monoclonal anti-fosfotirosina (o qual é opcionalmente conjugado a um rótulo detectável). O ensaio de ativa- ção de quinase de receptor descrito na Patente U.S. N0 5.766.863 está tam- bém disponível para determinação de ativação e bloqueio de receptor HER dessa atividade por um anticorpo.

Em uma modalidade, pode-se selecionar um anticorpo o qual inibe a estimulação por HRG de fosforilação de tirosina p180 em células MCF7 essencialmente conforme descrito na Patente U.S. N0 6.949.245. Por exemplo, as células MCF7 podem ser colocadas em lâminas com 24 cavida- des e anticorpos monoclonais ao HER2 podem ser adicionados a cada cavi- dade e incubados durante 30 minutos em temperatura ambiente; então, r- HRGpI 177.244 pode ser adicionado a cada cavidade até uma concentração final de 0,2 nM e a incubação pode ser continuada durante 8 minutos. Meio pode ser aspirado de cada cavidade e as reações podem ser cessadas atra- vés da adição de 100 μΙ de tampão de amostra de SDS (SDS a 5%, DTT a 25 mMe Tris-HCI a 25 mM, pH de 6,8). Cada amostra (25 μΙ) pode ser sub- metida à eletroforese sobre um gel com gradiente de 4-12% (Novex) e, en- tão, eletroforeticamente transferida para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunoblots anti-fosfotirosina (a 1 μg/ml) podem ser reveladas e a intensidade da banda reativa predominante a Mr - 180.000 pode ser quantificada através de densitometria por refletância. O anticorpo seleciona- do, de preferência, inibirá significativamente a estimulação por HRG de fos- forilação de tirosina p180 em cerca de 0-35% do controle nesse ensaio. Uma curva de dose-resposta para inibição de estimulação por HRG de fosforila- ção de tirosina p180, conforme determinado através de densitometria por refletância, pode ser preparada e uma IC5o para o anticorpo de interesse po- de ser calculada. Em uma modalidade, o anticorpo o qual bloqueia ativação de Iigante de um receptor HER terá uma IC5o para inibição de estimulação por HRG de fosforilação de tirosina p180 nesse ensaio de cerca de 50 nM ou menos, mais preferivelmente 10 nM ou menos. Onde o anticorpo é um frag- mento de anticorpo, tal como um fragmento Fab, a IC50 para inibição de es- timulação por HER de fosforilação de tirosina p180 nesse ensaio pode, por exemplo, ser cerca de 100 nM ou menos, mais preferivelmente 50 nM ou menos.

Pode-se também avaliar os efeitos inibitórios de crescimento do anticorpo sobre células MDA-MB-175, por exemplo, conforme essencialmen- te descrito em Schaefer e colaboradores, Oncogene 15: 1385-1394 (1997). De acordo com esse ensaio, células MDA-MB-175 podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal ao HER2 (10 μο/ιηί) durante 4 dias e coradas com violeta cristal. Incubação com um anticorpo ao HER2 pode mostrar um efeito inibitório de crê sobre essa linhagem de célula similar àquele mostrado pelo anticorpo monoclonal 2C4. Em uma outra modalidade, HRG exógeno não reverterá significativamente essa inibição. De preferência, o anticorpo será capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175 em uma exten- são maior do que o anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente em uma extensão maior do que o anticorpo monoclonal 3F7), na presença e na au- sência de HRG exógeno.

Em uma modalidade, o anticorpo ao HER2 de interesse pode bloquear a associação heregulina-dependente de HER2 com HER3 em célu- las MCF7 e SK-BR-3, conforme determinado em um experimento de coimu- noprecipitação, tal como aquele descrito na Patente U.S. N0 6.949.245 subs- tancialmente mais eficazmente do que o anticorpo monoclonal 4D5 e, de preferência, substancialmente mais eficazmente do que o anticorpo mono- clonal 7F3.

Para identificar anticorpos HER2 inibitórios de crescimento, po- de-se selecionar anticorpos os quais inibem o crescimento de células cânce- rígenas as quais superexpressam HER2. Em uma modalidade, o anticorpo inibitório de crescimento de escolha é capaz de inibir o crescimento de célu- las SK-BR-3 em cultura de células em cerca de 20-100% e, de preferência, em cerca de 50-100% em uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 μg/ml. Para identificar tais anticorpos, o ensaio com SK-BR-3 descrito na Patente U.S. N0 5.677.171 pode ser realizado. De acordo com esse ensaio, células SK-BR-3 são crescidas em uma mistura a 1:1 de meio F12 e DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, glutamina e penicilina/estrep- tomicina. As células SK-BR-3 são colocadas a 20.000 células em um disco de cultura de células de 35 mm (2 ml/disco de 35 mm). 0,5 a 30 μg/ml do anticorpo HER2 são adicionados por disco. Após seis dias, o número de cé- lulas, comparado com as células não tratadas, é contado usando um conta- dor de células eletrônico COULTER®. Aqueles anticorpos os quais inibem o crescimento de células SK-BR-3 em cerca de 20-100% ou cerca de 50-100% podem ser selecionados como anticorpos inibitórios de crescimento. Veja Pat. U.S. N0. 5.677.171 para ensaios para seleção de anticorpos inibitórios de crescimento, tais como 4D5 e 3E8.

De forma a selecionar anticorpos os quais induzem à apoptose, um ensaio de ligação à anexina usando células BT474 está disponível. As células BT474 são cultivadas em discos conforme discutido no parágrafo precedente. O meio é, então, removido e substituído por meio fresco apenas ou meio contendo 10 μg/ml do anticorpo monoclonal. Após um período de incubação de três dias, monocamadas são lavadas com PBS e soltas atra- vés de tripsinização. As células são, então, centrifugadas em tampão de li- gação de Ca2+ e transformadas em alíquotas em tubos conforme discutido acima para o ensaio de morte celular. Os tubos, então, recebem anexina rotulada (por exemplo, anexina V-FITC) (1 μg/ml). As amostras podem ser analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCAN® e o software FACS- CONVERT® CeIIQuest (Becton Dickinson). Aqueles anticorpos os quais in- duzem a níveis estatisticamente significativos de ligação à anexina com rela- ção ao controle são selecionados como anticorpos que induzem à apoptose. Além do ensaio de ligação à anexina, um ensaio de coloração de DNA u- sando células BT474 está disponível.

De forma a realizar esse ensaio, células BT474 as quais tenham sido tratadas com o anticorpo de interesse conforme descrito nos dois pará- grafos precedentes são incubadas com 9 μg/ml de HOECHST 33342® du- rante 2 horas a 37°C, então, analisadas em um citômetro de fluxo EPICS ELITE® (Coulter Corporation) usando o software MODFIT LT® (Verity Soft- ware House). Anticorpos os quais induzem a uma alteração no percentual de células apoptóticas a qual é 2 vezes ou maior (e, de preferência, 3 vezes ou maior) do que células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser selecionados como anticorpos pró-apoptóticos usando esse ensaio. Veja W098/17797 para ensaios para seleção de anticorpos os quais induzem à apoptose, tais como 7C2 e 3F3.

Para selecionar anticorpos os quais se ligam a um epítopo sobre o HER2 ligado por um anticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio cruza- do de rotina, tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado para avaliar se o anticorpo bloqueia cruzadamente a ligação de um anticorpo, tal como 2C4 ou pertuzumab, ao HER2. alternativa ou adicional- mente, mapeamento de epítopo pode ser realizado através de métodos co- nhecidos na técnica e/ou pode-se estudar a estrutura de anticorpo-HER2 (Franklin e colaboradores, Câncer Cell 5: 317-328 (2004)) para ver qual(is) domínio(s) do HER2 é(são) ligado(s) pelo anticorpo.

(ix) Composições de pertuzumab

Em uma modalidade de uma composição de anticorpo HER2, a composição compreende uma mistura de um anticorpo de pertuzumab de espécie principal e uma ou mais variantes do mesmo. A modalidade preferi- da aqui de um anticorpo de pertuzumab de espécie principal é uma compre- endendo as seqüências de aminoácido leve variável e pesada variável sele- cionadas de SEQ ID N0S 3 e 4 e, mais preferivelmente, compreendendo uma seqüência de aminoácido de cadeia leve selecionada de SEQ ID NO: 13 e 17 e uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NO: 14 e 18 (incluindo variantes deamidadas e/ou oxidadas dessas se- qüências). Em uma modalidade, a composição compreende uma mistura do anticorpo de pertuzumab de espécie principal e uma variante de seqüência de aminoácido do mesmo compreendendo uma extensão líder amino- terminal. De preferência, a extensão líder amino-terminal está sobre uma cadeia leve da variante de anticorpo (por exemplo, sobre uma ou duas ca- deias leves da variante de anticorpo). O anticorpo HER2 de espécie principal ou a variante de anticorpo pode ser um anticorpo de comprimento total ou fragmento de anticorpo (por exemplo, fragmento Fab ou F(ab)'2) mas, de preferência, ambos são anticorpos de comprimento total. A variante de anti- corpo aqui pode compreender uma extensão líder amino-terminal sobre qualquer uma ou mais das cadeias pesada ou leve da mesma. De preferên- cia, a extensão líder amino-terminal está sobre uma ou duas cadeias leves do anticorpo. A extensão líder amino-terminal compreende ou, de preferên- cia, consiste de VHS-. A presença da extensão líder amino-terminal na com- posição pode ser detectada através de várias técnicas analíticas incluindo, mas não limitado a, análise de seqüência N-terminal, ensaio com relação à heterogeneidade de carga (por exemplo, cromatografia de troca de cátions ou eletroforese em zona capilar), espectrometria de massa, etc. A quantida- de da variante de anticorpo na composição geralmente oscila de uma quan- tidade que constitui o limite de detecção de qualquer ensaio (de preferência, análise de seqüência N-terminal) usada para detectar a variante em uma quantidade menor do que a quantidade do anticorpo de espécie principal. Geralmente, cerca de 20% ou menos (por exemplo, de cerca de 1% a cerca de 15%, por exemplo, de 5% a cerca de 15%) das moléculas de anticorpo na composição compreendem uma extensão líder amino-terminal. Tais quanti- dades percentuais são, de preferência, determinadas usando análise de se- qüência N-terminal quantitativa ou análise de troca de cátions (de preferên- cia, usando uma coluna de troca de cátions fraca de alta resolução, tal como uma coluna de troca de cátions aPROPAC WCX-10®). Além da variante com extensão líder amino-terminal, outras alterações de seqüência de ami- noácido do anticorpo de espécie principal e/ou variante são consideradas incluindo, mas não limitado a, um anticorpo compreendendo um resíduo de. lisina C-terminal sobre uma ou ambas as cadeias pesadas do mesmo, uma variante de anticorpo deamidada, etc.

Além disso, o anticorpo de espécie principal ou variante pode a- inda compreender variações de glicosilação, exemplos não Iimitativos das quais incluem um anticorpo compreendendo uma estrutura de oligossacarí- deo G1 ou G2 presa à região Fc do mesmo, um anticorpo compreendendo uma porção de carboidrato presa a uma cadeia leve do mesmo (por exem- plo, uma ou duas porções de carboidrato, tais como glicose ou galactose, presas a uma ou duas cadeias leves do anticorpo, por exemplo, presas a um ou mais resíduos de lisina), um anticorpo compreendendo uma ou duas ca- deias pesadas não glicosiladas ou um anticorpo compreendendo um oligos- sacarídeo sialilado preso a uma ou duas cadeias pesadas do mesmo, etc.

A composição pode ser recuperada de uma linhagem de célula geneticamente manipulada, por exemplo, uma linhagem de célula de Ovário de Hâmster Chinês (CHO) expressando o anticorpo HER2 ou pode ser pre- parada através de síntese de peptídeo.

(x) Imunoconjugados

A invenção também refere-se a imunoconjugados compreen- dendo um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma toxina de pequena molécula ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes da mesma) ou um isótopo radio- ativo (isto é, um radioconjugado).

Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunocon- jugados foram descritos acima. Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de pequena molécula, tal como uma calicheamicina, uma maytansi- na (Patente U.S. N0 5.208.020), um tricoteno e CC1065 também são consi- derados aqui.

Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo é conju- gado a uma ou mais moléculas de maytansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maytansina por molécula de anticorpo). Maytansi- na pode, por exemplo, ser convertida a May-SS-Me, o qual pode ser reduzi- do a May-SH3 e reagido com anticorpo modificado (Chari e colaboradores, Câncer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunoconjugado de maytansinóide-anticorpo.

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de calicheamicina. A família de antibió- ticos de calicheamicina é capaz de produzir DNA fita-dupla que rompe em concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais de calicheamicina os quais podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, γι1, α.2, az, N- acetil-γι1, PSAG e θ-1 (Hinman e colaboradores, Câncer Research 53: 3336- 3342 (1993) e Lode e colaboradores, Câncer Research 58: 2925-2928 (1998)). Veja também Patentes US N0S 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586; e 5.773.001, expressamente incorporada aqui por referência.

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas os quais podem ser usados incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charan- tia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja, por exemplo, WO 93/21232 publicado em 28 de Outubro de 1993.

A presente invenção ainda considera um imunoconjugado for- mado entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma endonuclease de DNA, tal como deóxiri- bonuclease; DNase).

Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos HER2 radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, 1125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser feitas usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncional, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclohexano- 1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometil), iminotiolano (IT), deriva- dos bifuncionais de imidoésteres (tal como HCI de dimetil adipimidato), éste- res ativos (tal como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tal como gluta- raldeído), compostos de bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodia- mina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazôniobenzoil)-etiile- nodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolileno) e compos- tos de flúor bis-ativo (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta e colaboradores, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3- metildietileno triamina pentaacético (MX-DTPA) carbono-14-rotulado é um agente de quelação exemplificativo para conjugação de radionuclídeo ao anticorpo. Veja W094/11026.

O ligante pode ser um ligante Acleavable® que facilita a libera- ção do fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, um ligante peptidase-sensível, ligante de dimetila ou ligante contendo dissulfeto (Chari e colaboradores, Câncer Research 52: 127-131 (1992)) pode ser usado.

Alternativamente, uma proteína de fusão compreendendo o anti- corpo e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, através de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo.

Outros imunoconjugados são considerados aqui. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não protei- náceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo tam- bém pode estar encerrado em microcápsulas preparadas, por exemplo, atra- vés de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial (por exemplo, hidróximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de (poli)metil metacrilato, respectivamente), em sistemas de distribuição de fármaco coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, mi- cro-emulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macro-emulsões. Tais técnicas são descritas em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 16a edi- ção, Oslo, A., Ed., (1980).

Os anticorpos descritos aqui também podem ser formulados co- mo imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados a- través de métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein e colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang e cola- boradores, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77: 4030 (1980); Pats. U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545; e W097/38731, publicado em 23 de Outubro de 1997. Lipossomas com tempo de circulação intensificado são descritos na Patente U.S. N0 5.013.556.

Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação em fase reversa com uma composição lipídica com- preendendo fosfatidil colina, colesterol e fosfatidil etanolamina PEG- derivatizada (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através de filtros de ta- manho de poro definido para proporcionar lipossomas com o diâmetro dese- jado. Fragmentos Fab1 do anticorpo da presente invenção podem ser conju- gados aos lipossomas conforme descrito em Martin e colaboradores, J. BioL Chem. 257: 286-288 (1982) via uma reação de inter-alteração de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido dentro do Iiposso- ma. Veja Gabizon e colaboradores, J. National Câncer Inst. 81(19): 1484 (1989).

III. Seleção de pacientes para terapia

O paciente aqui é submetido a um teste diagnóstico antes de terapia. Geralmente, se um teste diagnóstico é realizado, uma amostra pode ser obtida de um paciente que precisa de terapia. Onde o indivíduo tem cân- cer, a amostra pode ser uma amostra de tumor ou outra amostra biológica, tal como um fluido biológico incluindo, sem limitação, sangue, urina, saliva, fluido de ascite ou derivados, tais como soro sangüíneo e plasma sangüíneo e semelhantes.

Onde o ensaio diagnóstico é realizado em uma amostra de tu- mor, a amostra de tumor pode ser de um câncer ovariano, câncer peritoneal, câncer do tubo falopiano, câncer de mama metastático (MBC), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de próstata ou tumor de câncer cólon-retal, etc. A amostra biológica aqui pode ser uma amostra fixa- da, por exemplo, uma amostra fixada em formalina, uma amostra incrustada em parafina (FFPE) ou uma amostra congelada.

Em uma modalidade, o nível de EGF e/ou TGF-alfa no paciente é avaliado, em que um nível elevado do mesmo comparado com níveis nor- mais indica que o paciente é um candidato para terapia com um inibidor de dimerização de HER. Tais níveis de EGF e/ou TGF-alfa podem ser avaliados in vivo ou em várias amostras biológicas tomadas do paciente. De preferên- cia, contudo, a amostra biológica testada é uma amostra de soro ou plasma.

Vários métodos para determinação de expressão de mRNA ou proteína incluem, mas não estão limitados a, caracterização de perfil de ex- pressão de gene, reação em cadeia de polimerase (PCR), incluindo PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR), análise de microarranjo, análise seri- al de expressão de gene (SAGE), MassARRAY, Análise de Expressão de Gene através de Sequenciamento por Assinatura Paralela (MPSS), proteô- mica, imunohistoquímica (IHC), etc. De preferência, mRNA é quantificado. Tal análise de mRNA é, de preferência, realizada usando a técnica de rea- ção em cadeia de polimerase (PCR) ou através de análise de microarranjo. Onde PCR é empregada, uma forma preferida de PCR é PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). Em uma modalidade, expressão de um ou mais dos genes mencionados acima é considerada expressão positiva se ela está em um nível médio ou acima, por exemplo, comparado com outras amostras do mesmo tipo de tumor. O nível de expressão pode ser determinado de modo essencialmente contemporâneo com medição de expressão de gene ou pode ter sido determinado previamente.

As etapas de um protocolo representativo para caracterização de perfil de expressão de gene usando tecidos fixados, incrustados em para- fina como a fonte de RNA, incluindo isolamento de RNA1 purificação, exten- são de iniciador e amplificação, são fornecidas em vários artigos de jornal publicados (por exemplo, Godfrey e colaboradores, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht e colaboradores, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Resumidamente, um processo representativo começa com corte de seções de cerca de 10 microgramas de espessura de amostras de tecido de tumor incrustadas em parafina. O RNA é, então, extraído e proteína e DNA são removidos. Após análise da concentração de RNA, etapas de reparo de RNA e/ou amplificação podem ser incluídas, se necessário, e o RNA é transcrito inversamente usando promotores gene-específicos, seguido por PCR. Fi- nalmente, os dados são analisados para identificar a(s) melhor(es) op- ção(ões) de tratamento disponível(eis) para o paciente com base no padrão de expressão de gene característico identificado na amostra de tumor examinada.

Um protocolo de bioensaio ELISA do soro específico é fornecido no Exemplo 1.

EGF e/ou TGF-alfa também pode ser avaliado usando um en- saio diagnóstico in vivo, por exemplo, através de administração de uma mo- lécula (tal como um anticorpo) a qual se liga à molécula a ser detectada e é rotulada com um rótulo detectável (por exemplo, um isótopo radioativo) e exploração externa do paciente para localização do rótulo. Além de avaliação de EGF e/ou TGF-alfa, pode-se determinar expressão ou amplificação de HER no câncer. Vários ensaios diagnósti- cos/prognósticos estão disponíveis para isso. Em uma modalidade, superex- pressão de HER pode ser analisada através de IHC1 por exemplo, usando o HERCEPTEST® (Dako). Seções de tecido incrustadas em parafina de uma biópsia de tumor podem ser submetidas ao ensaio IHC e classificadas com critérios de intensidade de coloração de proteína de HER2 como segue:

Escore 0 - nenhuma coloração é observada ou coloração da membrana é observada em menos de 10% das células tumorígenas

Escore 1+ - uma coloração desbotada/dificilmente perceptível da membrana é observada em mais de 10% das células tumorígenas. As célu- las são coradas apenas em parte de sua membrana

Escore 2+ - uma coloração fraca a moderadamente completa da membrana é observada em mais de 10% das células tumorígenas

Escore 3+ - uma coloração moderada a fortemente completa da membrana é observada em mais de 10% das células tumorígenas

Aqueles tumores com escores 0 ou 1 + para avaliação de super- expressão de HER2 podem ser caracterizados como não superexpressando HER2, enquanto que aqueles tumores com escores 2+ ou 3+ podem ser ca- racterizados como superexpressando HER2.

Tumores superexpressando HER2 podem ser classificados atra- vés de escores imunohistoquímicos correspondendo ao número de cópias de moléculas de HER2 expressas por célula e pode ser determinado bio- quimicamente:

0 = 0-10.000 cópias/célula, 1+ = pelo menos cerca de 200.000 cópias/célula, 2+ = pelo menos cerca de 500.000 cópias/célula, 3+ = pelo menos cerca de 2.000.000 cópias/célula.

Superexpressão de HER2 ao nível 3+, o qual leva à ativação ligante-dependente da quínase de tirosina (Hudziak e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 7159-7163 (1987)), ocorre em aproximadamente 30% dos tumores de mama e, nesses pacientes, a sobrevivência isenta de reincidência e a sobrevivência global são diminuídas (Siamon e colaborado- res, Science, 244: 707-712 (1989); Slamon e colaboradores, Science, 235: 177-182(1987)).

Alternativa ou adicionalmente, ensaios FISH1 tal como o IN- FORM® (vendido pela Ventana, Arizona) ou PATHVISION® (Vysis, Illinois) podem ser realizados sobre tecido de tumor incrustado em parafina, fixado em formalina para determinar a extensão (se houver) de amplificação de HER2 no tumor.

Em uma modalidade, o câncer será um o qual expressa (e pode superexpressar) EGFR, tal expressão podendo ser avaliada conforme os métodos para avaliação de expressão de HER2 mencionados acima.

IV. Formulações farmacêuticas

Formulações farmacêuticas dos inibidores de dimerização de HER de acordo com a presente invenção são preparadas para armazena- mento através de mistura de um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), ge- ralmente na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Cristais de anticorpo são também considerados (veja Pedido de Pat. US 2002/0136719). Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecil dimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; cetacol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resí- duos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação, tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, mani- tol, trealose ou sorbitol; contra-íons de formação de sal, tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoa- tivos não-iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG). Formulações de anticorpo Iiofilizadas são descritas no WO 97/04801, expressamente incorporado aqui por referência.

A formulação de pertuzumab preferida para uso terapêutico compreende 30 mg/mL de pertuzumab em acetato de histidina a 20 mM, sacarose a 120 mM, polisorbato 20 a 0,02% em um pH de 6,0. Uma formu- lação de pertuzumab alternativa compreende 25 mg/mL de pertuzumab, tampão de histidina-HCI a 10 mM, sacarose a 240 mM, polisorbato 20 a 0,02%, pH de 6,0.

A formulação aqui pode também conter mais de um composto ativo, conforme necessário para a indicação que está sendo tratada em par- ticular, de preferência aqueles com atividades complementares que não afe- tam adversamente uns aos outros. Vários fármacos os quais podem ser combinados com o inibidor de dimerização de HER são descritos na Seção Métodos abaixo. Tais moléculas estão, adequadamente, presentes em com- binação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

Os ingredientes ativos também podem estar encerrados em mi- crocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hi- dróximetil celulose ou gelatina e microcápsulas de (poli)metil metacrilato, respectivamente, em sistemas de distribuição de fármaco coloidais (por e- xemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícu- las e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparados com liberação sustentada podem ser feitos. Exem- plos adequados de preparados com liberação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos contendo o anticorpo, matrizes as quais estão na forma de artigos formatados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, (poli)2-hidróxietil metacrilato ou álcool (poli)vinílico), polilactídeos (Pat. U.S. N0 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradável, copo- límeros de ácido iáctico-ácido glicólico degradáveis, tal como LUPRON DE- POT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico- ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidróxibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de- vem ser estéreis. Isso é prontamente obtido por meio de filtração através de uma série de membranas de filtração.

V. Tratamento com inibidores de dimerização de HER

A invenção aqui proporciona um método para prolongar a sobre- vivência em um paciente com câncer que produz um nível elevado de EGF e/ou TGF-alfa, compreendendo administração de um inibidor de dimerização de HER ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a sobrevivência do paciente. De preferência, o inibidor de dimerização de HER é um inibidor de dimerização de HER2 e/ou inibe a heterodimerização de HER.

Métodos para identificar pacientes candidatos à terapia com um inibidor de dimerização de HER foram discutidos na Seção Ill acima.

Exemplos de vários cânceres que podem ser tratados com um inibidor de dimerização de HER são listados na seção definições acima. In- dicações de câncer preferidas incluem câncer ovariano; câncer peritoneal; câncer do tubo falopiano; câncer de mama, incluindo câncer de mama me- tastático (MBC); câncer de pulmão, incluindo câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC); câncer de próstata; e câncer cólon-retal. Em uma modalidade, o câncer o qual é tratado é câncer avançado, resistente, recor- rente, resistente à quimioterapia e/ou resistente à platina.

Terapia com o inibidor de dimerização de HER prolonga o TTP e/ou sobrevivência. Em uma modalidade, terapia com o inibidor de dimeriza- ção de HER prolonga a TTP ou sobrevivência pelo menos cerca de 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 25% mais do que o TTP ou sobrevivência obtida através de administração de um agente anti-tumor aprovado, ou padrão de assistência, para o câncer que está sendo tratado. Na modalidade preferida, a invenção proporciona um método para prolongar o tempo para progressão da doença (TTP) ou sobrevivência em um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo falopiano, cujo câncer mostra ativação de HER2, compreendendo administração de pertu- zumab ao paciente em uma quantidade a qual prolonga o TTP ou sobrevi- vência do paciente. O paciente pode ter câncer ovariano, peritoneal ou do tubo falopiano avançado, resistente, recorrente, resistente à quimioterapia e/ou resistente à platina. Administração de pertuzumab ao paciente pode, por exemplo, prolongar o TTP ou sobrevivência pelo menos cerca de 5% ou pelo menos 10% ou pelo menos 15% ou pelo menos 20% ou pelo menos 25% mais do que o TTP ou sobrevivência obtida através de administração de topotecan ou doxorubicina lipossômica a tal paciente.

O inibidor de dimerização de HER é administrado a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tal como administração intra- venosa, por exemplo, como um bolo ou através de infusão contínua durante um período de tempo, através das vias intramuscular, intraperitoneal, intra- cérebro-espinhal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação. Administração intravenosa do anticorpo é preferida.

Para a prevenção ou tratamento de câncer, a dose de inibidor de dimerização de HER dependerá do tipo de câncer a ser tratado, conforme definido acima, da gravidade e curso do câncer, se o anticorpo é administra- do para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, a história clínica do paciente e resposta ao anticorpo e o critério do médico que faz o atendimento.

Em uma modalidade, uma dose fixa de inibidor de dimerização de HER é administrada. A dose fixa pode, adequadamente, ser administrada ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos. Onde uma dose fixa é administrada, de preferência, ela está na faixa de cerca de 20 mg a cerca de 2000 mg do inibidor de dimerização de HER. Por exemplo, a do- se fixa pode ser de aproximadamente 420 mg, aproximadamente 525 mg, aproximadamente 840 mg ou aproximadamente 1050 mg do inibidor de di- merização de HER, tal como pertuzumab. Onde uma série de doses são administradas, essas podem, por exemplo, ser administradas aproximadamente a cada semana, aproximada- mente a cada 2 semanas, aproximadamente a cada 3 semanas ou aproxi- madamente a cada 4 semanas mas, de preferência, aproximadamente a cada 3 semanas. As doses fixas podem, por exemplo, continuar a ser admi- nistradas até progressão da doença, evento adverso ou outro tempo, con- forme determinado pelo médico. Por exemplo, de cerca de duas, três ou quatro até cerca de 17 ou mais doses fixas podem ser administradas.

Em uma modalidade, uma ou mais doses de carregamento do anticorpo são administradas, seguido por uma ou mais doses de manuten- ção do anticorpo. Em outra modalidade, uma pluralidade da mesma dose é administrada ao paciente.

De acordo com uma modalidade preferida da invenção, uma do- se fixa de inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) de aproximadamente 840 mg (dose de carregamento) é administrada, seguido por uma ou mais doses de aproximadamente 420 mg (dose(s) de manuten- ção) do anticorpo. As doses de manutenção são, de preferência, administra- das a cerca de cada 3 semanas, durante um total de pelo menos duas do- ses, até 17 ou mais doses.

De acordo com outra modalidade preferida da invenção, uma ou mais doses fixas de aproximadamente 1050 mg do inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) são administradas, por exemplo, a cada 3 semanas. De acordo com essa modalidade, uma, duas ou mais doses fi- xas são administradas, por exemplo, durante até um ano (17 ciclos) e mais conforme desejado.

Em outra modalidade, uma dose fixa de aproximadamente 1050 mg do inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertuzumab) é admi- nistrada como uma dose de carregamento, seguido por uma ou mais doses de manutenção de aproximadamente 525 mg. Cerca de uma, duas ou mais doses de manutenção são administradas ao paciente a cada 3 semanas de acordo com essa modalidade.

Embora o inibidor de dimerização de HER possa ser administra- do como um único agente anti-tumor, o paciente é opcionalmente tratado com uma combinação do inibidor de dimerização de HER e um ou mais a- gentes quimioterapêuticos. De preferência, pelo menos um dos agentes quimioterapêuticos é um agente quimioterapêutico anti-metabólito, tal como gemcitabina. A administração combinada inclui coadministração ou adminis- tração concorrente, usando formulações distintas ou uma única formulação farmacêutica e administração consecutiva em qualquer ordem em que, de preferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas. Assim, o agente quimioterapêutico anti-metabólito pode ser administrado antes ou após ad- ministração do inibidor de dimerização de HER. Nessa modalidade, o tempo entre pelo menos uma administração do agente quimioterapêutico anti- metabólito e a administração de pelo menos um inibidor de dimerização de HER é, de preferência, de aproximadamente 1 mês ou menos e, mais prefe- rivelmente, aproximadamente 2 semanas ou menos. Alternativamente, o a- gente quimioterapêutico anti-metabólito e o inibidor de dimerização de HER são administrados concorrentemente ao paciente, em uma única formulação ou em formulações distintas. Tratamento com a combinação do agente qui- mioterapêutico (por exemplo, agente quimioterapêutico anti-metabólito, tal como gemcitabina) e o inibidor de dimerização de HER (por exemplo, pertu- zumab) pode resultar em um benefício terapêutico sinergístico ou mais do que aditivo para o paciente.

Um agente quimioterapêutico anti-metabólito, se administrado, usualmente é administrado em dosagens conhecidas para o mesmo ou op- cionalmente diminuído em virtude da ação combinada dos fármacos ou efei- tos colaterais negativos atribuíveis à administração do agente quimiotera- pêutico anti-metabólico. O preparo e esquemas de dosagem para tais agen- tes quimioterapêuticos podem ser usados de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente por aqueles habilitados. Onde o agente quimioterapêutico anti-metabólito é gemcitabina, de prefe- rência, ele é administrado em uma dose entre cerca de 600 mg/m2 a 1250 mg/m2 (por exemplo, aproximadamente 1000 mg/m2), por exemplo, nos dias 1 e 8 de um ciclo de 3 semanas.

Além do inibidor de dimerização de HER e agente quimiotera- pêutico anti-metabólito, outros regimes terapêuticos podem ser combinados com os mesmos. Por exemplo, um segundo (terceiro, quatro, etc.) agente quimioterapêutico pode ser administrado, em que o segundo agente quimio- terapêutico é outro agente quimioterapêutico anti-metabólito diferente ou um agente quimioterapêutico que não é um anti-metabólito. Por exemplo, o se- gundo agente quimioterapêutico pode ser um taxano (tal como paclitaxel ou docetaxel), capecitabina ou agente quimioterapêutico baseado em platina (tal como carboplatina, cisplatina ou oxaliplatina), antraciclina (tal como do- xorubicina, incluindo doxorubicina lipossômica), topotecan, pemetrexed, vin- ca alcalóide (tal como vinorelbina) e TLK 286. ACocktails® de diferentes a- gentes quimioterapêuticos podem ser administrados.

Outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com o inibidor de dimerização de HER incluem qualquer um ou mais de: um se- gundo inibidor de dimerização de HER diferente (por exemplo, um anticorpo HER2 inibitório de crescimento tal como trastuzumab ou um anticorpo HER2 o qual induz à apoptose de uma célula superexpressando HER2, tal como 7C2, HER3, HER4; compostos anti-hormonal, por exemplo, um composto anti-estrogênio, tal como tamoxifeno ou um inibidor de aromatase; um cardi- oprotetor (para prevenir ou reduzir qualquer disfunção do miocárdio associa- da à terapia); uma citocina; um fármaco EGFR-objetivado (tal como TAR- CEVA®, IRESSA® ou cetuximab); um agente anti-angiogênico (especial- mente bevacizumab vendido pela Genentech sob a marca comercial AVAS- TIN®); um inibidor de quínase de tirosina; um inibidor de COX (por exemplo, um inibidor de COX-1 ou COX-2); fármaco anti-inflamatório não esteroidal, celecoxib (CELEBREX®); inibidor de farnesil transferase (por exemplo, Tipi- farnib/ZARNESTRA® R115777 disponível da Johnson and Johnson ou Lo- nafamib SCH66336 disponível da Schering-Plough); anticorpo que se liga à proteína oncofetal CA 125, tal como Oregovomab (MoAb B43.13); vacina de HER2 (tal como vacina HER2 AutoVac da Pharmexia ou vacina de proteína APC8024 da Dendreon ou vacina de peptídeo de HER2 da GSK/Corixa); outra terapia de objetivação de HER (por exemplo, trastuzumab, cetuximab, ABX-EGF, EMD7200, gefitinib, erlotinib, CP724714, Cl1033, GW572016, EV1C-11F8, TAK165, etc); inibidor de Raf e/ou ras (veja, por exemplo, WO 2003/86467); injeção de lipossoma de HCI de doxorubicina (DOXIL®); inibi- dor de topoisomerase I, tal como topotecan; taxano; e inibidor duplo de quí- nase de tirosina de HER2 e EGFR, tal como lapatinib/GW572016; TLK286 (TELCYTA®); EMD-7200; um medicamento que trata náusea, tal como um antagonista de serotonina ou benzodiazepina; um medicamento que previne ou trata rash cutâneo ou terapias padrões para acne, incluindo um antibiótico oral ou tópico; um medicamento que trata ou previne diarréia; um medica- mento para redução da temperatura corporal, tal como acetaminophen, dife- nidramina ou meperidina; fator de crescimento hematopoiético, etc.

Dosagens adequadas para qualquer um dos agentes co-admi- nistrados acima são aquelas presentemente usadas e podem ser diminuídas em virtude de ação combinada (sinergia) do agente e do inibidor de dimeri- zação de HER.

Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser sub- metido à remoção cirúrgica de células câncerígenas e/ou terapia de radiação.

Onde o inibidor é um anticorpo, de preferência, o anticorpo ad- ministrado é um anticorpo nu. Contudo, o inibidor administrado pode ser con- jugado com um agente citotóxico. De preferência, o inibidor conjugado e/ou antígeno ao qual ele está ligado é internalizado pela célula, resultando em eficácia terapêutica aumentada do conjugado na morte da célula cânceríge- na à qual ele se liga. Em uma modalidade preferida, o agente citotóxico obje- tiva ou interfere com o ácido nucleico na célula câncerígena. Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem maytansinóides, calicheamicinas, ribonucle- ases e endonucleases de DNA.

O presente pedido considera administração do inibidor de dime- rização de HER através de terapia genética. Veja, por exemplo, W096/07321 publicado em 14 de Março de 1996, referente ao uso de terapia genética para gerar anticorpos intracelulares. Existem duas abordagens principais para colocar o ácido nuclei- co (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para distribuição in vivo, o ácido nucleico é injetado diretamente no pa- ciente, usualmente no local onde o anticorpo é requerido. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paci- ente diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas po- rosas as quais são implantadas no paciente (veja, por exemplo, Patentes U.S. N0S 4.892.538 e 5.283.187). Há uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico em células de mamífero in vitro incluem o uso de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão de célula, DEAE- dextrana, o método de precipitação com fosfato de cálcio, etc. Um vetor co- mumente usado para distribuição ex vivo do gene é um retrovírus.

As técnicas de transferência de ácido nucleico in vivo presente- mente preferidas incluem a transfecção com vetores virais (tais como ade- novírus, vírus do Herpes simplex I ou vírus adeno-associado) e sistemas baseados em lipídio (lipídios úteis para transferência lipídio-mediada do ge- ne são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Em algumas situações, é desejável proporcionar a fonte de ácido nucleico com um agente que objeti- va as células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína na membrana celular ou a célula alvo, um Iigante para um receptor sobre a cé- lula alvo, etc. Onde lipossomas são empregados, proteínas as quais se li- gam a uma proteína na membrana da superfície celular associada à endoci- tose podem ser usadas para objetivação e/ou facilitar a captação, por exem- plo, proteínas de capsídeo ou fragmentos das mesmas trópicas para um tipo de célula em particular, anticorpos para proteínas as quais sofrem internali- zação em ciclização e proteínas que objetivam a localização intracelular e intensificam a meia-vida intracelular. A técnica de endocitose receptor- mediada é descrita, por exemplo, por Wu e colaboradores, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); e Wagner e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 3410-3414 (1990). Para revisão de marcação de gene e protocolos de terapia genética presentemente conhecidos veja Anderson e colaborado- res, Science 256: 808-813 (1992). Veja também WO 93/25673 e referências citadas no mesmo.

VI. Depósito de materiais

As linhagens de célula de hibridoma a seguir foram depositadas na American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manas- sas, VA 20110-2209, EUA (ATCC):

Designação de anticorpo ATCC N0. Data de depósito

7C2 ATCC HB-12215 17 de Outubro de 1996

7F3 ATCC HB-12216 17 de Outubro de 1996

4D5 ATCC CRL 10463 24 de Maio de 1990

2C4 ATCC HB-12697 8 de Abril de 1999

Esses depósitos foram feitos sob as condições do Tratado de Budapeste sob o International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations (Tratado de Buda- peste). Isso assegura manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data de depósito. Os depósitos serão tornados disponí- veis pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste e estão sujeitos a uma concordância entre a Genentech, Inc. e a ATCC, o que assegura que todas as restrições impostas pelo depositário sobre a disponibilidade ao pú- blico do material depositado serão irrevogavelmente removidas quando de emissão da patente U.S. pertinente, assegura disponibilidade permanente e irrestrita da prole da cultura do depósito ao público quando de emissão da patente U.S. pertinente ou quando de depósito em aberto ao público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeiro àqueles determinados pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks como sendo intitulada ao mesmo de acordo com 35 USC § 122 e as normas do Comissário pertinen- tes ao mesmo (incluindo 37 CFR § 1.14 com referência particular a 886 OG 638).

Outros detalhes da invenção são ilustrados pelos Exemplos não limitativos a seguir. As divulgações de todas as citações na especificação são expressamente incorporadas aqui por referência.

EXEMPLO 1

ANÁLISE DE BIOMARCADOR CLÍNICO NO SORO EM PACIENTES COM CÂNCER OVARIANO TRATADO COM PERTUZUMAB

Design de Estudo

Um estudo de Fase II, rótulo aberto, ramificação única, multicen- tro foi realizado para avaliar o efeito de ativação de HER2 tumor-baseada da eficácia do rhuMAb 2C4 (pertuzumab) em indivíduos com câncer ovariano avançado, resistente ou recorrente.

No Grupo 1 do experimento, 65 indivíduos com câncer ovariano avançado que eram resistentes a ou onde recorrência tinha havido, antes de quimioterapia, foram arrolados e receberam 420 mg por ciclo de rhuMAb (pertuzumab). Desses, 61 indivíduos foram tratados, 4 indivíduos saíram do estudo e não receberam qualquer tratamento com pertuzumab.

Os indivíduos que foram arrolados no Grupo 1 e preenchiam os critérios de elegibilidade, sofreram uma biópsia de tecido do tumor ou aspi- ração de células tumorígenas de fluido ascítico. Esse tecido foi analisado com relação à fosforilação de HER2 através de ELISA, medindo quantitati- vamente o HER2 fosforilado e HER2 total nas amostras.

Pertuzumab foi fornecido como uma formulação para uso único contendo 25 mg/mL de rhuMAb 2C4 formulado em L-histidina a 10 mM (pH de 6,0), sacarose a 240 mM e polisorbato 20 a 0,02%. Cada frasco de 10-15 cc continha cerca de 175 mg de rhuMAb 2C4 (7,0 mL/frasco). Quando de receita, os frascos foram refrigerados a 2°C - 8°C até uso. Em virtude do fato de a formulação não conter um conservante, instrução foi fornecida para per- furar a vedação do frasco apenas uma vez. Qualquer solução restante foi descartada. A solução de rhuMAb 2C4 para infusão diluída em sacos de po- Iietileno de PVC e poliolefina de não-PVC contendo Cloreto de Sódio para Injeção a 0,9%, USP, foi deixado armazenado a 2°C - 8°C durante 24 horas antes de uso.

Pertuzumab foi administrado como uma infusão IV a cada 3 se- manas durante até um ano (17 ciclos) para indivíduos que não mostraram evidência de doença progressiva. Os indivíduos decidiram por uma dose de carregamento de 840 mg (Ciclo 1), seguido por 420 mg no Ciclo 2 e depois.

Após arrolamento no Grupo 1 ter terminado, arrolamento no Grupo 2 começou. Os indivíduos no Grupo 2 que preenchiam os critérios de elegibilidade receberam 1050 mg de pertuzumab administrado como uma infusão IV a cada 3 semanas durante até um ano (17 ciclos). Os indivíduos no Grupo 2 (o qual está em andamento) não sofreram uma biópsia do tecido tumorígeno ou aspiração de células tumorígenas de fluidos de ascite.

A resposta foi avaliada após 6 semanas, 3 meses e a cada 3 meses depois. Uma resposta adicional é avaliada a 18 semanas (4,5 meses) para indivíduos no Grupo 2 apenas.

Doença mensurável foi avaliada usando o Response Evaluation Criteria for Solid Tumors (RECIST) (veja, por exemplo, Therasse e colabora- dores, J. Nat. Câncer Inst. 92(3): 205-216 (2000)), através de avaliação clíni- ca e exploração por CT ou equivalente. A resposta para indivíduos com do- ença avaliável, mas não mensurável, foi avaliada de acordo com alterações na CA-125 e evidência clínica e radiológica da doença.

Endpoint de eficácia primários

A melhor resposta global a qualquer momento durante o estudo após início de tratamento com pertuzumab, conforme determinado através de avaliação do investigador usando RECIST ou através de alterações na CA-125, após início de tratamento com pertuzumab.

Endpoints de eficácia secundários

Duração de resposta,

Tempo de sobrevivência (sobrevivência global, OS) e Percentual de indivíduos sem progressão da doença a 3, 6 e 12 meses (sobrevivência sem doença, DFS).

A progressão da doença foi definida como doença progressiva documentada ou morte, o que ocorresse primeiro.

O tempo para progressão da doença (TTDP) foi definido como o tempo do primeiro dia de tratamento com o fármaco de estudo (Dia 1) até o momento de progressão documentada da doença ou morte. A duração de sobrevivência foi definida como o tempo do Dia 1 até o momento da morte.

A duração de resposta foi definida como o tempo a partir da res- posta completa ou parcial inicial até o momento de progressão da doença ou morte.

O intervalo de confiança de 95% exato foi construído para o per- centual de indivíduos sem progressão após 3, 6 e 12 meses no estudo.

O tempo médio para progressão da doença e duração de sobre- vivência foi calculado usando métodos de sobrevivência de Kaplan-Meier.

Avaliação exploratória de marcadores biológicos foi incorporada nesse experimento. A finalidade dessa avaliação foi encontrar um ou mais marcadores biológicos pré-tratamento que pudessem prever quais indivíduos responderiam ou não ao tratamento com pertuzumab ou identificar um ou mais marcadores biológicos pós-terapêuticos que poderiam atuar como um biomarcador de atividade do pertuzumab. Em particular, avaliação de mar- cadores biológicos permite identificação de uma população de pacientes que provavelmente se beneficiará especialmente de tratamento com pertuzumab, conforme medido através de um ou mais endpoints significativos, tais como sobrevivência global (OS) ou sobrevivência sem doença (DFS).

Assim, caracterização de perfil de gene foi realizada sobre tecido epitelial ovariano normal e tumores epiteliais ovarianos. Amostras de tumor ovariano obtidas nesse estudo foram submetidas à caracterização de perfil de expressão de RNA de forma a explorar a relação entre expressão de RNA e resposta ao pertuzumab.

Medição de biomarcadores no soro

Soro sangüíneo de pacientes com câncer de mama metastático expressando HER2 tratados com pertuzumab foi avaliado com relação aos níveis de ampiregulina, EGF, TGF-alfa e HER2 protegido (HER2 ECD), con- forme descrito abaixo. <table>table see original document page 103</column></row><table> Protocolos

HER2-ECP

ELISA de HER2-ECD foi realizado de acordo com as recomen- dações do fabricante.

Ampiregulina

Reagentes, diluições padrões e amostras foram preparados se- guindo as instruções do fabricante. Tiras de microlâmina de IgG anti- camundongo de cabra EvenCoat (R&D, Cat. # CP002; não fornecidas com o kit) foram presas à lâmina para criar uma lâmina de ELISA. 100 μΙ de anti- corpo de captura diluído (fornecido com o kit; 1:180 em PBS) foram adicio- nados a cada cavidade e as cavidades foram incubadas em temperatura ambiente durante uma hora.

Cada cavidade foi aspirada e lavada e o processo foi repetido três vezes durante um total de quatro lavagens. As cavidades foram lavadas através de enchimento de cada cavidade com 400 μΙ de Tampão de Lava- gem (Tween 20 a 0,05% em PBS) usando um distribuidor de derivação e subsequente aspiração. Após a última lavagem, qualquer Tampão de Lava- gem restante foi removido através de aspiração. A lâmina foi, então, inverti- da e seca contra papel toalha limpo.

Diluição padrão de 100 μΙ ou amostra diluída (veja abaixo) por cavidade foi adicionada. A ponta foi trocada após cada etapa de pipetea- mento. A lâmina foi coberta com a fita adesiva (fornecida com o kit) e incu- bada durante 2 horas em temperatura ambiente em uma plataforma girató- ria. Após o que, as etapas de aspiração e lavagem foram repetidas conforme descrito acima.

As amostras aspiradas e soluções de lavagem foram tratadas com desinfetante de laboratório. 100 μΙ de Anticorpo de Detecção (fornecido com o kit) foram adicionados, diluídos a 1:180 em Diluente de Reagente (BSA a 1%; Roth; Fração V de Albumina, Cat. # T844.2 em PBS) por cavi- dade e a lâmina foi incubada durante 2 horas em temperatura ambiente. A- pós o que, as etapas de aspiração e lavagem foram repetidas conforme des- crito acima. 100 μl de diluição de trabalho da Estreptavidina-HRP foram adi- cionados a cada cavidade (fornecido com o kit; diluição a 1:200 em diluente de reagente) e as cavidades foram cobertas com uma nova fita adesiva e incubadas durante 20 minutos em temperatura ambiente. As etapas de aspi- ração e lavagem foram repetidas conforme descrito acima.

100 μl de solução de substrato (R&D, Cat. # DY999; não forne- cida com o kit) foram adicionados a cada cavidade e as cavidades foram incubadas em temperatura ambiente durante 20 minutos, sob proteção con- tra a luz.

50 μl de solução de término (H2SO4 a 1,5 M (Schwefelsaure re- inst, Merck, Cat. # 713)) foram adicionados a cada cavidade, seguido por mistura cuidadosa. A densidade óptica de cada cavidade foi medida imedia- tamente, usando um leitor para microlâmina ajustado a 450 nm.

Curva padrão de ampiregulina

Uma solução de estoque de ampiregulina a 40 ng/ml foi prepa- rada em BSA a 1% em PBS, transformada em alíquota e armazenada a - 80°C. Soluções de ampiregulina em BSA a 20% em PBS não eram estáveis além de 2 semanas e, portanto, não foram usadas. A partir da solução de: estoque de ampiregulina em alíquota, a curva padrão de ampiregulina foi preparada recentemente em BSA a 20% em PBS antes de cada experimen- to. A maior concentração foi de 1000 pg/ml (diluição a 1:40 da solução de estoque de ampiregulina). Os padrões fornecidos com o kit ELISA produzi- ram uma curva padrão linear. Análise baseada em excel das curvas permitiu a determinação de equações de curva para cada ELISA.

Amostras de ampiregulina

Quando as amostras foram diluídas a 1:1 em diluente de reagen- te, todas as amostras estavam dentro da faixa linear do ELISA. Cada amos- tra foi medida em duplicata. Dependendo da qualidade dos dados e de quan- tidades suficientes de soro, as determinações foram repetidas em experi- mentos subsequentes se necessário.

EGF

Reagentes, diluições padrões e amostras foram preparados se- guindo as instruções do fabricante. Tiras de lâmina de microtitulação revesti- das com anticorpo (fornecidas com o kit) foram removidas da estrutura para criar uma lâmina para ELISA. Após determinar o número requerido de cavi- dades e o Iayout de lâmina, 50 μl de diluente de ensaio RD1 (fornecido com o kit) foram adicionados a cada cavidade. Diluição padrão de 200 μl ou a- mostra diluída (por exemplo, 1:20 em Calibrator Diluent RD6H) por cavidade foi, então, adicionada. A ponta foi trocada após cada etapa de pipeteamento. A lâmina foi coberta com a fita adesiva (fornecida com o kit) e incubada em temperatura ambiente durante duas horas sobre uma plataforma giratória.

Cada cavidade foi aspirada e lavada, repetindo o processo três vezes durante um total de quatro lavagens. Lavagem foi realizada enchendo cada cavidade com 400 μΙ de tampão de lavagem (fornecido com o kit) u- sando um distribuição de derivação e subsequente aspiração. Após a última lavagem, qualquer tampão de lavagem restante foi removido através de as- piração. A lâmina foi, então, invertida e seca contra papel toalha limpo.

As amostras aspiradas e soluções de lavagem foram tratadas com desinfetante de laboratório e 200 μΙ de conjugado (fornecido com o kit) foram adicionados a cada cavidade. A lâmina foi, então, coberta com uma nova fita adesiva e incubada em temperatura ambiente durante duas horas.

As etapas de aspiração e lavagem foram repetidas conforme descrito anteriormente.

200 μl de solução de substrato (fornecida com o kit) foram adi- cionados a cada cavidade, seguido por incubação durante 20 minutos em temperatura ambiente, sob proteção contra a luz. 50 μl de solução de térmi- no (fornecida com o kit) foram adicionados a cada cavidade, seguido por mistura cuidadosa.

A densidade óptica de cada cavidade foi determinada dentro de 30 minutos, usando um leitor para microlâmina ajustado a 450 nm.

Curva padrão de EGF

Os padrões fornecidos com o kit ELISA produziram uma curva padrão linear. Também, concentrações muito pequenas mostraram resulta- dos detectáveis. Amostras de EFG

Um total de quatro ensaios com as amostras foi realizado. Cada amostra foi medida 2-5 vezes, o número de determinações sendo dependen- te da qualidade dos resultados (média + SD) e da viabilidade de quantidades suficientes de soro.

Quando as amostras foram diluídas a 1:20 em Calibrator Diluent RD6H, todas as amostras estavam dentro da faixa linear do ELISA.

TGF-alfa

Reagentes1 diluições padrões e amostras foram preparados se- guindo as instruções do fabricante. Tiras de lâmina de microtitulação revesti- das com anticorpo em excesso (fornecidas com o kit) foram removidas da estrutura para criar uma lâmina para ELISA. Após determinar o número re- querido de cavidades e o layout de lâmina, 100 μl de diluente de ensaio RD1W (fornecido com o kit) foram adicionados a cada cavidade, seguido pela adição de diluição padrão de 50 μl ou amostra diluída por cavidade. A ponta foi trocada após cada etapa de pipeteamento.

A lâmina foi coberta com a fita adesiva fornecida com o kit e in- cubada em temperatura ambiente durante duas horas sobre uma plataforma giratória.

Cada cavidade foi aspirada e lavada, repetindo o processo três vezes durante um total de quatro lavagens. Na etapa de lavagem seguinte, cada cavidade foi enchida com 400 μl de tampão de lavagem (fornecido com o kit) usando um distribuição de derivação, seguido por aspiração. Após a última lavagem, qualquer tampão de lavagem restante foi removido através de aspiração e a lâmina foi, então, invertida e seca contra papel toalha limpo.

As amostras aspiradas e soluções de lavagem foram tratadas com desinfetante de laboratório.

200 μl de conjugado de TGF-alfa (fornecido com o kit) foram adi- cionados a cada cavidade e a lâmina foi, então, coberta com uma nova fita adesiva e incubada em temperatura ambiente durante duas horas.

As etapas de aspiração e lavagem foram repetidas conforme descrito anteriormente. Após o que, 200 μΙ de solução de substrato (forneci- da com o kit) foram adicionados a cada cavidade e a lâmina foi incubada em temperatura ambiente durante 30 minutos, sob proteção contra a luz.

50 μl de solução de término (fornecida com o kit) foram adicio- nados a cada cavidade com mistura cuidadosa.

A densidade óptica de cada cavidade foi determinada dentro de 30 minutos, usando um leitor para microlâmina ajustado a 450 nm.

Curva padrão de TGF-alfa

Os padrões fornecidos com o kit ELISA produziram uma curva padrão linear. Também, concentrações muito pequenas mostraram resulta- dos detectáveis.

Amostras de TGF-alfa

Um total de quatro ensaios com as amostras foi realizado. Cada amostra foi medida em 2-4 ensaios independentes.

Resultados

A correlação entre os vários marcadores foi testada usando o teste de coeficiente de correlação da magnitude de classificação de Spear- man e os resultados são mostrados na figura 9. De acordo com esse teste, a correlação é classificada entre -1 (para a melhor correlação negativa) e +1 (para a melhor correlação positiva). Conforme mostrado na figura 9, os ní- veis no soro de HER2, TGF-alfa, ampiregulina e EGF mostraram muito pou- ca correlação, o que confirma que esses genes atuam como marcadores independentes. A figura 10 mostra a correlação dos marcadores testados com co-variáveis clínicas, incluindo escores de ECOG (BECOG = escore de ECOG de linha de base), antes de quimioterapia (PRITCN), carga do tumor e duração de diagnóstico (DIAGDUR, isto é, quanto tempo o indivíduo teve câncer antes de diagnóstico). Menores escores de ECOG (0 e 1) indicam que a doença é menos grave e o paciente está em uma condição relativa- mente boa. Maiores escores de ECOG (> 1) indicam gravidade crescente dos escores 2 a 4. Conforme mostrado na figura 10, não houve correlação significativa entre os níveis no soro dos marcadores testados e a gravidade da doença. Por outro lado, os níveis no soro de ampiregulina e EGF eram significativamente maiores em indivíduos que foram submetidos a mais de 4 tratamentos prévios de quimioterapia.

As curvas de sobrevivência foram plotadas de acordo com o mé- todo de Kaplan-Meier. Essas curvas foram comparadas entre subgrupos de pacientes usando o teste de log-classificação, de forma a definir os cutoffs que proporcionam a melhor discriminação ao definir a probabilidade de so- brevivência sem progressão (PFS) e a sobrevivência global (OS). Os resul- tados para PFS e OS são mostrados nas figuras 11 e 12, respectivamente. Conforme mostrado na figura 11, o ponto de limite de corte em termos de PFS é particularmente claro para os níveis de EGF (correlação positiva clara).

A distribuição de pacientes de acordo com os cutoffs, usando a PFS, é mostrada na figura 13. Conforme mostrado na figura, os cutoffs de- terminados funcionam bem para os marcadores individuais RGF-alfa e EGF e são particularmente úteis como uma função desse aos marcadores combi- nados.

Curvas de sobrevivência foram calculadas através de análise de sobrevivência de Kaplan-Meier. O efeito dos níveis de HER2 sobre a PFS e, OS é ilustrado pelas plotagens de Kaplan-Meier na figura 14. O efeito dos níveis de TGF-alfa sobre a PFS e OS é ilustrado pelas plotagens Kaplan- Meier na figura 15. O efeito dos níveis de EGF sobre a PFS e OS é ilustrado pelas plotagens Kaplan-Meier na figura 16.

EXEMPLO 2

ANÁLISE DE BIOMARCADOR NO SORO EM PACIENTES COM CÂNCER OVARIANO, PERITONEAL PRIMÁRIO OU DO TUBO FALOPiANO TRA- TADOS COM PERTUZUMAB E QUIMIOTERAPIA

Design de estudo

Um experimento de Fase II, aleatório, placebo-controlado, du- plamente cego, multicentro é realizado de forma a fazer uma avaliação pre- liminar da eficácia do pertuzumab (rhuMAb 2C4) em combinação com o a- gente quimioterapêutico gemcitabina com placebo em indivíduos com câncer ovariano, peritoneal primário ou do tubo falopiano resistente à platina, con- forme medido através da sobrevivência sem progressão (PFS) para todos os indivíduos. Outro objetivo do experimento é avaliar a segurança e tolerabili- dade do pertuzumab em combinação com gemcitabina com relação à gemci- tabina em combinação com placebo em indivíduos com câncer ovariano, peritoneal primário ou do tubo falopiano resistente à platina.

Indivíduos que experimentaram progressão da doença em ou dentro de 6 meses ao receber regime de quimioterapia baseado em platina administrado para doença avançada são elegíveis para esse estudo. Não mais do que um regime prévio para doença resistente à platina é permitido.

Os indivíduos são aleatoriamente distribuídos, em uma propor- ção de 1:1, ao Grupo de tratamento 1 (gemcitabina + pertuzumab) ou Grupo 2 (gemcitabina + placebo). Gemcitabina é administrada nos Dias 1 e 8 de um ciclo de 21 dias. Gemcitabina é infundida durante 30 minutos (± 5 minu- tos) em uma dose inicial de 800 mg/m2, fármaco de estudo às cegas (gemci- tabina ou placebo) é administrado em uma dose de carregamento inicial de 840 mg (Ciclo 1), seguido por 420 mg para o Ciclo 2 e depois. O placebo equivalente é administrado em um volume equivalente à quantidade de flui- do de suspensão requerida para preparar a dose de pertuzumab.

Indivíduos sem doença progressiva são deixados receber trata- mento com gemcitabina mais fármaco de estudo às cegas durante até 17 ciclos nesse estudo. A resposta é avaliada a cada 6 semanas para os pri- meiros oito ciclos e cerca de a cada 3 meses depois do final dos Ciclos 2, 4, 6, 8, 12 e 17). Doença mensurável é avaliada usando o Response Evaluati- on Criteria for Solid Tumors (RECIST) através de avaliação clínica e explo- ração por tomografia computadorizada ou equivalente. A resposta para indi- víduos com doença avaliável é analisado de acordo com alterações na CA- 125 e evidência clínica radiológica da doença.

Pacientes que forneceram consentimento adicional tinham a op- ção de fornecer amostras de soro e plasma para estudos exploratórios de marcador biológico. Esses estudos incluem avaliação de mutações potenci- ais na família do gene do receptor HER, imunohistoquímica para proteínas da família HER e proteínas a jusante associadas à sinalização ao HER, en- saios de dimerização ou ensaios de proximidade para avaliar a ativação de HER2 e determinação da expressão dos níveis de genes específicos que são identificados como estando associados à sinalização ao HER2 ou po- dem servir como marcadores ou prognósticos de resposta. Os estudos in- cluem análise de expressão de gene e técnicas proteômicas.

Medidas de resultados primários

Sobrevivência sem progressão, conforme determinado através de avaliação do investigador usando RECIST ou através de alterações de CA-125 (indivíduos com doença não mensurável apenas).

Medidas de resultados secundários

Taxa de resposta objetiva (resposta parcial ou resposta comple- ta), duração de resposta, tempo de sobrevivência e tempo sem progressão a 4 meses.

Endpoint primário

O endpoint de eficácia primário é a sobrevivência sem progres- são, definida como o tempo de distribuição aleatória até progressão docu- mentada da doença ou morte por qualquer causa quando de estudo, o que ocorrer primeiro. A progressão da doença é avaliada pelo investigador de acordo com o RECIST ou alterações na CA-125 para indivíduos com doença mensurável e não mensurável, respectivamente. Morte quando de estudo é definida como morte por qualquer causa dentro de 30 dias da última dose do medicamento de estudo.

Um censo dos dados para indivíduos sem progressão da doença ou morte é feito no momento de última avaliação de tumor ou CA-125 (ou, se nenhuma avaliação de tumor ou CA-125 é feita após a visita de linha de ba- se, no momento de distribuição aleatória mais 1 dia).

Métodos de Kaplan-Meier são usados para estimar a sobrevi- vência sem progressão média para cada grupo de tratamento. Modelos de perigo proporcional de Cox, usando dois modelos (com e sem os fatores de estratificação de distribuição aleatória capacidade de medição do estado da doença pelo Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) e número de re- gimes anteriores para doença resistente à platina são usados para estimar a proporção de perigo (isto é, a magnitude de efeito de tratamento em um in- tervalo de confiança de 95%). O modelo estratificado produz o intervalo de confiança primário. O teste de log-classificação, estratificado através dos fatores de estratificação de distribuição aleatória (estado ECOG, capacidade de medição da doença e número de regimes prévios para doença resistente à platina) é usado para realizar testagem teórica exploratória para avaliar a diferença entre os grupos de tratamento. O teste de log-classificação não estratificado também é fornecido. Análises distintas de sobrevivência sem progressão também são apresentadas para indivíduos com doença mensu- rável e para indivíduos com doença não mensurável; em virtude do fato de o número de indivíduos em cada grupo ser pequeno, o teste de log-classi- ficação exploratório não pode ser realizado para ambos os grupos. Análises distintas de sobrevivência sem progressão são também conduzidas para indivíduos que não têm qualquer regime prévio para doença resistente à pla- tina e para indivíduos que têm um regime prévio para doença resistente à platina; testes de log-classificação exploratórios são realizados para ambos os grupos.

Endpoints secundários

Resposta objetiva

A resposta objetiva é definida como uma resposta completa ou parcial determinada em duas ocasiões consecutivas > 4 semanas de distân- cia. Indivíduos sem um tumor pós-linha de base ou avaliação de CA-125 são considerados não respondedores. Uma estimativa da taxa de resposta obje- tiva e intervalos de confiança de 95% (BIyth-StiII-CaseIIa) é calculada para cada grupo de tratamento. Intervalos de confiança para a diferença na taxa de resposta do tumor são calculados (Santer e Snell1 J. Am. Stat. Assoc. 75: 386-94 (1980); Berger e Boos, J. Am. Stat. Assoc. 89: 4087-91 (1990)). Tes- te exato de Fisher é usado para realizar testagem teórica exploratória para explorar a diferença entre os grupos de tratamento.

Duração de resposta objetiva

Para indivíduos com uma resposta objetiva, a duração da res- posta objetiva é definida com o tempo da resposta inicial para progressão da doença ou morte por qualquer causa quando de estudo.

Métodos para manipular a realização de censo e para análise são os mesmos conforme descrito para a sobrevivência sem progressão.

Tempo sem progressão a 4 meses

A proporção de indivíduos sem progressão a 4 meses para cada grupo de tratamento é estimada a partir da curva de Kaplan-Meier para so- brevivência sem progressão. Uma estimativa da taxa sem progressão e in- tervalos de confiança de 95% (Greenwood, Rep. Pub. Health. Med. Subjects 33: 1-26 (1926)) é calculada para cada grupo de tratamento. Um Z-teste com dois lados é usado para realizar testagem teórica exploratória para avaliar a diferença entre os grupos de tratamento.

Duração de sobrevivência

Duração de sobrevivência é definida como o tempo de distribui- ção aleatória até morte por qualquer causa. Todas as mortes são incluídas, quer elas ocorram quando de estudo ou após descontinuação de tratamento. Para indivíduos que não morreram, o censo da duração de sobrevivência é feito na data do último contato. Os métodos de análise são os mesmos con- forme descrito para sobrevivência sem progressão.

O estudo está em andamento, mas espera-se que, baseado em análise de expressão de gene de amostras do soro ou plasma, pacientes que produzem um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) e/ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa) mostrem uma sobrevivência prolongada (especialmente sobrevivência sem progressão) em resposta ao tratamento com pertuzumab e gemcitabina. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> GENENTECH, INC.

F. HOFFMANN-LA ROCHEf AG LUKAS C. AMLER NUSRAT RABBEE ANDREAS STRAUSS JOACHIM MOECKS

<120> PROLONGAMENTO DE SOBREVIVÊNCIA DE PACIENTES COM CÂNCER COM NÍVEIS ELEVADOS DE EGF OU TGF-ALFA

<130> 39766-0198 PCT

<140> A SER ATRIBUÍDO <141> COM O MESMO

<150> US 60/811,234 <151> 2006-06-05

<160> 22

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1 Asp Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Ser 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gln Asp Val Ser 30 Ile Gly Val Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Arg Pro 40 Gly Gln Ser Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Thr Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Phe Thr Ile 75 Ser Ser Val Gln Ala 80 Glu Asp Leu Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105

Ile Lys

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Thr Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr Thr Met Asp 35 Trp Val Lys Gln Ser 40 His Gly Lys Ser Leu 45 Glu Trp Ile Gly Asp 50 Val Asn Pro Asn Ser 55 Gly Gly Ser Ile Tyr 60 Asn Gln Arg Phe Lys 65 Gly Lys Ala Ser Leu 70 Thr Val Asp Arg Ser 75 Ser Arg Ile Val Tyr 80 Met Glu Leu Arg Ser 85 Leu Thr Phe Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr 95 100 105

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 3

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada

<400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gln Asp Val Ser 30 Ile Gly Val Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Thr Gly Val Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gln Pro 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Tyr Tyr Ile Tyr Pro 95 Tyr Thr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Val Glu 105

Ile Lys

<210> 4

<211> 119

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr Thr Met Asp 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Asp 50 Val Asn Pro Asn Ser 55 Gly Gly Ser Ile Tyr 60 Asn Gln Arg Phe Lys 65 Gly Arg Phe Thr Leu 70 Ser Val Asp Arg Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asn Leu 100 Gly Pro Ser Phe Tyr 105 Phe Asp Tyr Trp Gly 110 Gln Gly Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada <400> 5 Asp Ile Gln 1

Gly Asp Arg Asn Tyr Leu Leu Leu Ile Arg Phe Ser Ser Ser Leu Tyr Asn Ser Ile Lys

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

5 10 15

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada

<4 00> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr Ala Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Val 50 Ile Ser Gly Asp Gly 55 Gly Ser Thr Tyr Tyr 60 Ala Asp Ser Val Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Gly Arg 100 Val Gly Tyr Ser Leu 105 Tyr Asp Tyr Trp Gly 110 Gln Gly Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo humanizado <220>

<221> VARIANTE <222> 10

<223> Xaa é, de preferência, Asp ou Ser <400> 7

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Xaa 15 10

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de anticorpo humanizado <400> 8

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9 <211> 10 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de anticorpo humanizado <400> 9

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo humanizado <400> 10

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala 1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência de anticorpo humanizado <220>

<221> VARIANTE

<222> 5

<223> Xaa é de preferência, Arg ou Leu <220>

<221> VARIANTE

<222> 6

<223> Xaa é de preferência, Tyr ou Glu <220>

<221> VARIANTE

<222> 7

<223> Xaa é de preferência, Thr ou Ser

<400> 11

Ser Ala Ser Tyr Xaa Xaa Xaa 1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência de anticorpo humanizado <400> 12

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> <211> <212>

13

214

PRT

<213> Seqüência artificial <220> <223> Seqüência é sintetizada <4 00> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val 20 25 Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro 50 55 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 80 85 Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 95 100 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 110 115 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 125 130 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys 140 145 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 155 160 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 170 175 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 185 190 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 200 205 Arg Gly Glu Cys <210> 14 <211> 448 <212> PRT

Val 15 Ser 30 Lys 45 Ser 60 Ile 75 Gln 90 Glu 105 Pro 120 Leu 135 Val 150 Glu 165 Thr 180 Glu 195 Asn 210

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada

<4 00> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

1 5 10

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala

35 40

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser

50 55

Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu

65 70

Leu Val Gln Pro Gly 15

Gly Phe Thr Phe Thr 30

Pro Gly Lys Gly Leu 45

Gly Gly Ser Ile Tyr 60

Ser Val Asp Arg Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asn Leu 100 Gly Pro Ser Phe Tyr 105 Phe Asp Tyr Trp Gly 110 Gln Gly Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser Ala 120 Ser Thr Lys Gly Pro 125 Ser Val Phe Pro Leu 130 Ala Pro Ser Ser Lys 135 Ser Thr Ser Gly Gly 140 Thr Ala Ala Leu Gly 145 Cys Leu Val Lys Asp 150 Tyr Phe Pro Glu Pro 155 Val Thr Val Ser Trp 160 Asn Ser Gly Ala Leu 165 Thr Ser Gly Val His 170 Thr Phe Pro Ala Val 175 Leu Gln Ser Ser Gly 180 Leu Tyr Ser Leu Ser 185 Ser Val Val Thr Val 190 Pro Ser Ser Ser Leu 195 Gly Thr Gln Thr Tyr 200 Ile Cys Asn Val Asn 205 His Lys Pro Ser Asn 210 Thr Lys Val Asp Lys 215 Lys Val Glu Pro Lys 220 Ser Cys Asp Lys Thr 225 His Thr Cys Pro Pro 230 Cys Pro Ala Pro Glu 235 Leu Leu Gly Gly Pro 240 Ser Val Phe Leu Phe 245 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Asp Thr Leu Met Ile 255 Ser Arg Thr Pro Glu 260 Val Thr Cys Val Val 265 Val Asp Val Ser His 270 Glu Asp Pro Glu Val 275 Lys Phe Asn Trp Tyr 280 Val Asp Gly Val Glu 285 Val His Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gln Tyr Asn Ser 300 Thr Tyr. Arg Val Val 305 Ser Val Leu Thr Val 310 Leu His Gln Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320 Tyr Lys Cys Lys Val 325 Ser Asn Lys Ala Leu 330 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Lys Thr Ile Ser Lys 340 Ala Lys Gly Gln Pro 345 Arg Glu Pro Gln Val 350 Tyr Thr Leu Pro Pro 355 Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gln Val 365 Ser Leu Thr Cys Leu 370 Val Lys Gly Phe Tyr 375 Pro Ser Asp Ile Ala 380 Val Glu Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gln Pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro Pro Val Leu 400 Asp Ser Asp Gly Ser 405 Phe Phe Leu Tyr Ser 410 Lys Leu Thr Val Asp 415 Lys Ser Arg Trp Gln 420 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 425 430 435 Asn His Tyr Thr Gln 440 Lys Ser Leu Ser Leu 445 Ser Pro Gly

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> Seqüência

<220>

<223> Seqüência

artificial

é sintetizada

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn

20 25 30

Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

80 85 90

His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

95 100 105

Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

110 115 120

Ser Asp Glu Gln Leu.Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

125 130 135

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val

140 145 150

Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

155 160 165

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

170 175 180

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

185 190 195

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn

200 205 210

Arg Gly Glu Cys

<210> 16 <211> 449 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada <400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 10 15

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys

20 25 30

Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr

50 55 60

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser

65 70 75

Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

80 85 90

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr

95 100 105

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

110 115 120

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

125 130 135

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

140 145 150

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

155 160 165

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

170 175 180

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

185 190 195

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

200 205 210

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

215 220 225 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu 245 Phe Pro Pro Lys Pro 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Val Thr Cys Val 265 Val Val Asp Val Ser 270 His Glu Asp Pro Glu 275 Val Lys Phe Asn Trp 280 Tyr Val Asp Gly Val 285 Glu Val His Asn Ala 290 Lys Thr Lys Pro Arg 295 Glu Glu Gln Tyr Asn 300 Ser Thr Tyr Arg Val 305 Val Ser Val Leu Thr 310 Val Leu His Gln Asp 315 Trp Leu Asn Gly Lys 320 Glu Tyr Lys Cys Lys 325 Val Ser Asn Lys Ala 330 Leu Pro Ala Pro Ile 335 Glu Lys Thr Ile Ser 340 Lys Ala Lys Gly Gln 345 Pro Arg Glu Pro Gln 350 Val Tyr Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu Glu 360 Met Thr Lys Asn Gln 365 Val Ser Leu Thr Cys 370 Leu Val Lys Gly Phe 375 Tyr Pro Ser Asp Ile 380 Ala Val Glu Trp Glu 385 Ser Asn Gly Gln Pro 390 Glu Asn Asn Tyr Lys 395 Thr Thr Pro Pro Val 400 Leu Asp Ser Asp Gly 405 Ser Phe Phe Leu Tyr 410 Ser Lys Leu Thr Val 415 Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gln Gln Gly Asn Val 425 Phe Ser Cys Ser Val 430 Met His Glu Ala Leu 435 His Asn His Tyr Thr 440 Gln Lys Ser Leu Ser 445 Leu Ser Pro Gly

<210> 17

<211> .217

<212> PRT

<213> Seqüência

<220>

<223> Seqüência

artificial

é sintetizada

<4 00> 17 Val His Ser 1

Ala Ser Val Asp Val Ser Ala Pro Lys Val Pro Ser Leu Thr Ile Cys Gln Gln Lys Val Glu Phe Pro Pro Val Cys Leu Trp Lys Val Val Thr Glu Thr Leu Thr Ala Cys Glu

Asp Ile Gln 5

Gly Asp Arg 20

Ile Gly Val 35

Leu Leu Ile 50

Arg Phe Ser 65

Ser Ser Leu 80

Tyr Tyr Ile

95

Ile Lys Arg 110

Ser Asp Glu 125

Leu Asn Asn 140

Asp Asn Ala 155

Gln Asp Ser 170

Leu Ser Lys 185

Val Thr His 200

Met Thr Gln Val Thr Ile Ala Trp Tyr Tyr Ser Ala Gly Ser Gly Gln Pro Glu Tyr Pro Tyr Thr Val Ala Gln Leu Lys Phe Tyr Pro Leu Gln Ser Lys Asp Ser Ala Asp Tyr Gln Gly Leu

Ser 10 Thr 25 Gln 40 Ser 55 Ser 70 Asp 85 Thr 100 Ala 115 Ser 130 Arg 145 Gly 160 Thr 175 Glu 190 Ser 205

Pro Cys Gln Tyr Gly Phe Phe Pro Gly Glu Asn Tyr Lys Ser

Ser Ser Lys Ala Lys Pro Arg Tyr Thr Asp Ala Thr Gly Gln Ser Val Thr Ala Ala Lys Ser Gln Ser Leu His Lys Pro Val

Leu Ser Gly Thr Phe Tyr Gly Phe Ser Val Glu Ser Val Thr

Ser 15 Gln 30 Lys 45 Gly 60 Thr 75 Tyr 90 Thr 105 Ile 120 Val 135 Gln 150 Ser 165 Ser 180 Tyr 195 Lys 210 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 215

<210> 18 <211> 449 <212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Seqüência é sintetizada <400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Thr 30 Asp Tyr Thr Met Asp 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Asp 50 Val Asn Pro Asn Ser 55 Gly Gly Ser Ile Tyr 60 Asn Gln Arg Phe Lys 65 Gly Arg Phe Thr Leu 70 Ser Val Asp Arg Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asn Leu 100 Gly Pro Ser Phe Tyr 105 Phe Asp Tyr Trp Gly 110 Gln Gly Thr Leu Val 115 Thr Val Ser Ser Ala 120 Ser Thr Lys Gly Pro 125 Ser Val Phe Pro Leu 130 Ala Pro Ser Ser Lys 135 Ser Thr Ser Gly Gly 140 Thr Ala Ala Leu Gly 145 Cys Leu Val Lys Asp 150 Tyr Phe Pro Glu Pro 155 Val Thr Val Ser Trp 160 Asn Ser Gly Ala Leu 165 Thr Ser Gly Val His 17 0 Thr Phe Pro Ala Val 175 Leu Gln Ser Ser Gly 180 Leu Tyr Ser Leu Ser 185 Ser Val Val Thr Val 190 Pro Ser Ser Ser Leu 195 Gly Thr Gln Thr Tyr 200 Ile Cys Asn Val Asn 205 His Lys Pro Ser Asn 210 Thr Lys Val Asp Lys 215 Lys Val Glu Pro Lys 220 Ser Cys Asp Lys Thr 225 His Thr Cys Pro Pro 230 Cys Pro Ala Pro Glu 235 Leu Leu Gly Gly Pro 240 Ser Val Phe Leu Phe 245 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Asp Thr Leu Met Ile 255 Ser Arg Thr Pro Glu 260 Val Thr Cys Val Val 265 Val Asp Val Ser His 270 Glu Asp Pro Glu Val 275 Lys Phe Asn Trp Tyr 280 Val Asp Gly Val Glu 285 Val His Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gln Tyr Asn Ser 300 Thr Tyr Arg Val Val 305 Ser Val Leu Thr Val 310 Leu His Gln Asp Trp 315 Leu Asn Gly Lys Glu 320 Tyr Lys Cys Lys Val 325 Ser Asn Lys Ala Leu 330 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Lys Thr Ile Ser Lys 340 Ala Lys Gly Gln Pro 345 Arg Glu Pro Gln Val 350 Tyr Thr Leu Pro Pro 355 Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gln Val 365 Ser Leu Thr Cys Leu 370 Val Lys Gly Phe Tyr 375 Pro Ser Asp Ile Ala 380 Val Glu Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gln Pro Glu 390 Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro Pro Val Leu 400 Asp Ser Asp Gly Ser 405 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

410 415 420

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

425 430 435

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 445

<210> 19

<211> 195

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala

1 5 10 15

Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly

20 25 30

Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr

35 40 45

Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly

50 55 60

Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln

65 70 75

Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

80 85 90

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr

95 100 105

Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu

110 115 120

Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg

125 130 135

Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile

140 145 150

Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn

155 160 165

Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser

170 175 180 Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg

185 190 195

<210> 20

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro 1 5 10 15 Thr Asp Cys Cys His 20 Glu Gln Cys Ala Ala 25 Gly Cys Thr Gly Pro 30 Lys His Ser Asp Cys 35 Leu Ala Cys Leu His 40 Phe Asn His Ser Gly 45 Ile Cys Glu Leu His 50 Cys Pro Ala Leu Val 55 Thr Tyr Asn Thr Asp 60 Thr Phe Glu Ser Met 65 Pro Asn Pro Glu Gly 70 Arg Tyr Thr Phe Gly 75 Ala Ser Cys Val Thr 80 Ala Cys Pro Tyr Asn 85 Tyr Leu Ser Thr Asp 90 Val Gly Ser Cys Thr 95 Leu Val Cys Pro Leu 100 His Asn Gln Glu Val 105 Thr Ala Glu Asp Gly 110 Thr Gln Arg Cys Glu 115 Lys Cys Ser Lys Pro 120

Cys Ala Arg Val <210> 21

<211> 169

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val 1 5 10 15 Thr Ser Ala Asn Ile 20 Gln Glu Phe Ala Gly 25 Cys Lys Lys Ile Phe 30 Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala 35 40 45 Ser Asn Thr Ala Pro 50 Leu Gln Pro Glu Gln 55 Leu Gln Val Phe Glu 60 Thr Leu Glu Glu Ile 65 Thr Gly Tyr Leu Tyr 70 Ile Ser Ala Trp Pro 75 Asp Ser Leu Pro Asp 80 Leu Ser Val Phe Gln 85 Asn Leu Gln Val Ile 90 Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln 95 100 105 Gly Leu Gly Ile Ser 110 Trp Leu Gly Leu Arg 115 Ser Leu Arg Glu Leu 120 Gly Ser Gly Leu Ala 125 Leu Ile His His Asn 130 Thr His Leu Cys Phe 135 Val His Thr Val Pro 140 Trp Asp Gln Leu Phe 145 Arg Asn Pro His Gln 150 Ala Leu Leu His Thr 155 Ala Asn Arg Pro Glu 160 Asp Glu Cys Val Gly 165

Glu Gly Leu Ala

<210> 22

<211> 142

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 22

Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro 1 5 10 15 Thr Gln Cys Val Asn 20 Cys Ser Gln Phe Leu 25 Arg Gly Gln Glu Cys 30 Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val 35 40 45 Asn Ala Arg His Cys 50 Leu Pro Cys His Pro 55 Glu Cys Gln Pro Gln 60 Asn Gly Ser Val Thr 65 Cys Phe Gly Pro Glu 70 Ala Asp Gln Cys Val 75 Ala Cys Ala His Tyr 80 Lys Asp Pro Pro Phe 85 Cys Val Ala Arg Cys 90 Pro Ser Gly Val Lys 95 Pro Asp Leu Ser Tyr 100 Met Pro Ile Trp Lys 105 Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys 110 115 120 Thr His Ser Cys Val 125 Asp Leu Asp Asp Lys 130 Gly Cys Pro Ala Glu 135 Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr

140

Claims (67)

1. Método para prolongar a sobrevivência de um paciente com câncer compreendendo administração de um inibidor de dimerização de HER ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a sobrevivência do paciente, em que o paciente é determinado como produzindo um nível ele- vado de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa) e o câncer é selecionado do grupo consistindo de câncer ovariano, câncer peritoneal e câncer do tubo falopiano.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente é determinado como produzindo um nível elevado de EGF.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que se desco- briu que há um nível elevado de EGF no soro do paciente.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente é determinado como produzindo um nível elevado de TGF-alfa.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que se desco- briu que há um nível elevado de TGF-alfa no soro do paciente.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de dimerização de HER é inibidor de dimerização de HER2.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de dimerização de HER inibe heterodimerização de HER.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo ao HER.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo se liga a um receptor de HER selecionado do grupo consistindo de EGFR, HER2 e HER3.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o anticorpo se liga a HER2.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o anticor- po ao HER2 se liga ao Domínio II do domínio extracelular de HER2.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o anticor- po se liga a uma junção entre os domínios I, II e III do domínio extracelular de HER2.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o anticor- po ao HER compreende as seqüências de aminoácido de cadeia pesada variável e leve variável em SEQ ID NOs 3 e 4, respectivamente.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o inibidor de dimerização de HER é pertuzumab.

15. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo ao HER é um anticorpo naked.

16. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o anticorpo ao HER é um anticorpo intacto.

17. Método de acordo com a reivindicação 8 em que o anticorpo ao HER é um fragmento de anticorpo compreendendo uma região de ligação a antígeno.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o câncer é câncer ovariano avançado, resistente ou recorrente.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o câncer é câncer ovariano resistente à platina.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o câncer é câncer peritoneal primário ou do tubo de falópio.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o inibidor de dimerização de HER é administrado como um único agente anti-tumor.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, compreendendo administração de um agente terapêutico secundário ao paciente.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o segun- do agente terapêutico é selecionado do grupo consistindo de agente quimio- terapêutico, anticorpo ao HER, anticorpo dirigido contra um antígeno tumor- associado, composto anti-hormonal, cardioprotetor, citocina, fármaco EGFR- objetivado, agente anti-angiogênico, inibidor de quínase de tirosina, inibidor de COX, fármaco anti-inflamatório não esteroidal, inibidor de farnesil transfe- rase, anticorpo que se liga à proteína oncofetal CA 125, vacina de HER2, terapia de objetivação de HER, inibidor de Raf ou ras, doxorubicina lipossô- mica, topotecan, taxano, inibidor duplo de quínase de tirosina, TLK286, EMD-7200, um medicamento que trata náusea, um medicamento que previ- ne ou trata rash cutâneo ou terapia padrão para acne, um medicamento que trata ou previne diarréia, um medicamento para redução da temperatura cor- poral e um fator de crescimento hematopoiético.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o segun- do agente terapêutico é um agente quimioterapêutico.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o agente quimioterapêutico é um agente quimioterapêutico anti-metabólito.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o agente quimioterapêutico anti-metabólito é gemcitabina.

27. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o segun- do agente terapêutico é trastuzumab, eroltinib ou bevacizumab.

28. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sobrevi- vência de progressão livre (PFS) é prolongada.

29. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sobrevi- vência global (OS) é prolongada.

30. Método para prolongar a sobrevivência de um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo de falópio compreendendo adminis- tração de pertuzumab ao paciente em uma quantidade a qual prolonga a sobrevivência do paciente, em que o paciente é determinado como produ- zindo um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa).

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o pacien- te tem câncer ovariano.

32. Método de acordo com a reivindicação 30, ou a reivindicação -31 em que o paciente tem câncer ovariano avançado, resistente ou recorrente.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 -30 a 32, ainda compreendendo administração de um agente quimioterapêutico ao paciente.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o agente quimioterapêutico é um agente quimioterapêutico anti-metabólito.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o agente quimioterapêutico anti-metabólito é gemcitabina.

36. Método para prolongar a sobrevivência de progressão livre (PFS) de um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo de falópio compreendendo administração de pertuzumab ao paciente em uma quanti- dade a qual prolonga a PFS no paciente, em que o soro do paciente é de- terminado como tendo um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) no mesmo.

37. Método para prolongar a sobrevivência de progressão livre (PFS) de um paciente com câncer ovariano, peritoneal ou do tubo de falópio compreendendo administração de pertuzumab ao paciente em uma quanti- dade a qual prolonga a PFS no paciente, em que o soro do paciente é de- terminado como tendo um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa) no mesmo.

38. Método de acordo com a reivindicação 26 ou a reivindicação 37, em que o câncer é câncer ovariano.

39. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o câncer ovariano é câncer ovariano avançado, resistente ou recorrente.

40. Método de seleção de um paciente para tratamento com um inibidor de dimerização de HER compreendendo tratamento do paciente com o inibidor de dimerização de HER se o paciente é determinado como produ- zindo um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa).

41. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a sobre- vivência do paciente é prolongada com relação à sobrevivência do paciente que não produz um nível elevado de EGF ou TGF-alfa e recebe o mesmo tratamento.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a sobre- vivência é sobrevivência global (OS).

43. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a sobre- vivência é sobrevivência de progressão livre (PFS).

44. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o inibidor de dimerização de HER é um inibidor de dimerização de HER2.

45. Método de acordo com a reivindicação 41, em que o inibidor de dimerização de HER inibe heterodimerização de HER.

46. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo ao HER.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o anticor- po se liga a um receptor de HER selecionado do grupo consistindo de EG- FR, HER2 e HER3.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, em que o anticor- po se liga a HER2.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o anticor- po ao HER2 se liga ao Domínio Il do domínio extracelular de HER2.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, em que o anticor- po se liga a uma junção entre os domínios I, Il e Ill do domínio extracelular de HER2.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o anticor- po ao HER compreende as seqüências de aminoácido de cadeia pesada variável e leve variável em SEQ ID NOs 3 e 4, respectivamente.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que o inibidor de dimerização de HER é pertuzumab.

53. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o anticor- po ao HER é um anticorpo naked.

54. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o anticor- po ao HER é um anticorpo intacto.

55. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o anticor- po ao HER é um fragmento de anticorpo compreendendo uma região de li- gação a antígeno.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 55, ainda compreendendo tratamento do referido paciente com um agente quimioterapêutico.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que o agente quimioterapêutico é gemcitabina.

58. Kit compreendendo um inibidor de dimerização de HER e uma bula de embalagem ou rótulo indicando um uso benéfico para o inibidor de dimerização de HER se o paciente a ser tratado produz um nível elevado de fator de crescimento epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa).

59. Método como definido na reivindicação 58, em que o câncer é câncer ovariano, peritoneal ou do tubo de falópio.

60. Método de acordo com a reivindicação 38, em que o uso be- néfico é prolongamento de sobrevivência.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, em que a sobre- vivência é sobrevivência de progressão livre.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 61, em que o inibidor de dimerização de HER é um anticorpo.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, em que o anticor- po é um anticorpo ao HER2.

64. Método de acordo com a reivindicação 63 em que o anticor- po é pertuzumab.

65. Método para promover um inibidor de dimerização de HER para tratar pacientes que produzem um nível elevado de fator de crescimen- to epidérmico (EGF) ou fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa).

66. Método de acordo com a reivindicação 65, em que a promo- ção é na forma de um material por escrito.

67. Método de acordo com a reivindicação 66, em que a promo- ção é na forma de uma bula para embalagem.