KR20080031452A - 신호 펩타이드 없이 박테리아로부터 항체의 분비 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 항체들, 항원 결합 항체 단편을 원핵생물에서, 분비 경로에서 변형된 돌연변이 숙주세포를 사용하여, 신호 펩타이드 없이 얻기 위한 조성과 방법과 관련된다.

더욱 상세하게, 본원 발명은 신호 펩타이드에 대한 필요없이 박테리아로부터의 항체들 또는 항원 결합 항체 단편의 분비를 얻기 위한 숙주세포와 방법을 제공하고, 상기 방법으로부터 얻어진 항체 서열의 다양한 라이브러리를 제공한다. 본원 발명은 또한 다양한 라이브러리들을 제공한다.

항체, 신호 펩타이드

Description

신호 펩타이드 없이 박테리아로부터 항체의 분비{SECRETION OF ANTIBODIES WITHOUT SIGNAL PEPTIDES FROM BACTERIA}

<관련 출원>

본 출원은 “신호 펩타이드 없이 박테리아로부터 항체의 분비”라고 명명되고, 2005년 7월 22일자로 출원된 미합중국 임시 출원 제 60/701,902에 대하여 35 U.S.C. §119 에 의한 우선권을 주장하며, 상기 특허 출원의 개시 내용 전체는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 신호 펩타이드에 대한 필요없이 원핵세포로부터 항체들, 항체 단편들, 항체 관련 폴리펩타이드를 분비하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본원 발명은, 항체들, 항원결합 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들을, 박테리아로부터 신호 펩타이드의 도움없이 분리하는 숙주세포들과 그 방법, 상기 방법들의 결과로서 항체들, 항체 단편들 또는 항체 관련 폴리펩타이드들의 다양한 염기서열을 제공한다. 본원 발명은 또한 상기 본 발명의 방법에 의해 만들어진 항체들, 항체 단편들, 항체 관련 폴리펩타이드들과 라이브러리에 관한 것이다.

페리플라즘(periplasm) 또는, 예를 들면, 장내 세균들과 같은 그램 음성 박테리아의 바깥쪽 멤브레인으로 정해진(destined) 대부분의 단백질들은, 일반적인 경로 또는 Sec 시스템에 의해 사이토플라즈믹 멤브레인을 통과하여 수송(transport)되며, 이들은 항체 배출을 위한 폴리펩타이드를 동정(identifies)하고, 사이토플라즈믹 멤브레인을 통하여 그들을 전위(translocate)시킨다.

이러한 시스템은 포유동물의 단백질(mammalian proteins)을 항체 단편을 포함하는 장내 대장균(enteric bacteria)으로부터 분리하기 위해 사용되어 왔다. 자연 원핵 분리된 단백질과 포유동물의 단백질과 같은 이종 단백질들(heterologous proteins)은 기능적 신호 펩타이드를 가하여 분비기구로 유도되며, 일반적인 단백질의 N 말단에 있는 13개 내지 30개의 아미노산 서열로, 소수성 코아(a hydrophobic core)와 추가 서열을 가지고 있어서 주변 폴리펩타이드 사슬을 분비기구로 유도하고, 분비 후 신호 펩타이드의 정확한 제거를 가능하게 한다.

다수의 원핵 신호 펩타이드들은 Erwinia caratovora 균의 펙테이트리아제 B 단백질(pectate lyase B (PeIB) protein), 대장균 열안정 엔테로톡신(Escherichia coli heat-stable enterotoxin (StII)) 및 대장균 OmpA 단백질(E. coli OmpA protein)을 포함하는 적어도 몇몇 항체 단편들에 대한 효율적인 분비를 가능하게 하는 것으로 알려져 있다. 다른 원핵세포들은 유사한 분비 시스템을 가지고 있으며, 이런 다른 원핵세포를 위한 신호 펩타이드들이 기술되어 있다.

그러나, 분비 시스템은 항체, 항체 단편 또는 항체 관련 폴리펩타이드가 분비되는 효율면에서 매우 다양하다. 분비 효율은 항체의 중사슬(heavy chain) 과 경사슬(light chain) 양자의 가변 부위의 서열에 의존한다. 예를 들면, 뮤린 V-부위(murine V-regions)를 포함하는 Fab 단편은 거의 분비되지 않는다. 게다가 인간 Fab 단편은, V-부위의 서열 및/또는 VH 서브클래스에 따라 다양한 효율로 분비된다. 그러한 다양한 분비 효율은 생산된 항체 라이브러리로부터 스크리닝될 수 있는 항체의 서열에서 치우치게 된다.

몇몇의 경우, 분비를 증가시키기 위해 V 부위에서의 변형이 유도될 수 있다. 그러나, 항체 V 부위의 아미노산 서열의 변형은 항체의 기능과 타협할 수 있지만, 일반적으로 바람직하지 않다.

또한, 분비된 폴리펩타이드로부터 신호 펩타이드를 분리하는 것이 항상 효율적이지 않다. 예를 들면, 융합 단백질(fusion protein)이 대장균(E. coli)에서 발현될 경우 대장균(E. coli )의 신호 펩타이드 OmpA 또는 PhoA 가 항상 인간 인터루킨-1 베타(IL-I beta)과의 융합 단백질(fusion protein)으로부터 분리되는 것은 아니다.

본원 발명의 목적은 항체들, 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들을 신호 서열 필요없이 박테리아로부터 분리해 내고, 가변 부위(variable region)에 의해 유발된 분비 제약조건(secretion constraints)을 제거하는 조성물 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

<요약>

본원 발명은 항체들, 항체 단편들 및/또는 항체 관련 폴리펩타이드들을 원핵생물에서 신호 펩타이드 없이 분리함으로써 여러 국부적인 가변 부위 서열에 의한 제한을 극복하는 것과 관련되어 있다.

일 실시예에서, 본원 발명의 방법은 항체들, 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를, 원핵세포 내에서 신호 서열 없이 발현한 후, 항체들, 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들을 숙주 세포의 사이토플라즈믹 멤브레인을 통하여 분비하는 것으로 구성된다.

본 발명의 실시예에서 항체들, 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들은, 신호 서열 없이, 세포 분비 경로의 단백질을 인코드하고 있는 유전자 부분에 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 갖는 원핵세포를 사용함으로써 분비된다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 만들어진 항체 또는 관련 폴리펩타이드의 라이브러리와 관련된다. 일 실시예에서, 본 발명의 라이브러리는, 신호 서열이 사이토플라즈믹 멤브레인을 가로지르는 직접 수송(direct transport)에 쓰일 경우, 원핵세포에서 분비될 수 없거나 또는 분비가 어려운 항체들, 항체 단편들 또는 항체 관련 폴리펩타이드 클론들을 포함한다. 다른 실시예에서, 항체들, 항체 단편들, 항체 관련 폴리펩타이드들, 또는 본 발명의 다른 폴리펩타이드 라이브러리는 신호 서열에 의해 발현된 라이브러리보다 다양한 VH 와 VL 서브 클래스를 좀더 잘 나타낸다. 항체와 본 발명의 관련 폴리펩타이드는 인택트 면역글로블린(intact immunogloblins), 단일 사슬 항체(single chain antibodies), Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 카멜리드 항체, 항원-결합 스캐폴드, 항체 또는 항체 관련 폴리펩타이드 융합 단백질 및 아래 설명된 다른 폴리펩타이드를 포함한다.

다른 실시예에 의하면, 본 발명의 항체 관련 폴리펩타이드는 본 발명의 항체들, 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들에 의해 감지되는 항원을 포함한다. 본 발명의 실시예에 의하면 이러한 항체들은 자가 항원들(self-antigens)이다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명의 방법은 발현, 분비와, 하나 또는 그 이상의 다중체 단백질(multimeric proteins)의 서브 유니트의 기능적 신호 서열이 부족한 다중체 단백질(multimeric proteins)의 어셈블리를 가능하게 한다.

정의(DEFINITIONS)

이하에서 사용되는 “항원”은, 적절한 조건하에서, 특정 항체들, 항체 단편들 또는 항체 관련 폴리펩타이드들과 결합할 수 있는 물질을 가리킨다. 항원은 톡신(toxins)이나 외부 단백질과 같이 용해가능한 물질일 수 있으나, 항원결정소(에피토프)라고 알려진 단백질 또는 항원분자들만이 항체, 항체 단편 또는 항체 관련 폴리펩타이드와 결합한다. 좀더 넓은 의미로 “항원”이라는 말은 항체가 결합하는 어떠한 물질, 또는 물질이 면역성인지 여부에 관계없이 항체가 원하는 물질을 가리킨다. 그러한 항원에 대해서, 항체들은 어떠한 면역 반응과도 독립적으로, 재조합 방법에 의해 동정될 수 있다.

이하에서 사용되는 "항체”는 기능적으로는 결합 단백질로 정의되며, 구조적으로는 면역글로블린항체의 가변 부위(variable region)으로부터 유도되어, 당업자에 의해 감지되는 아미노산 서열로 구성되는 것으로 정의된다. 항체는 면역글로불린 유전자, 면역글로불린유전자 단편, 하이브리드 면역글로블린 유전자(다른 동물들로부터 유전 정보를 조합해서 만들어진), 또는 합성 면역글로블린 유전자들에 의해 실질적으로 코딩된 하나 또는 그 이상의 폴리펩타이드로 구성된다. 인식된, 네이티브(native) 면역글로블린 유전자는 만 여개의 면역글로블린 가변 부위(variable region) 유전자와 D-세그멘트, J-세그멘트 뿐만 아니라 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론과 뮤의 정상 부위(constant region) 유전자들을 포함한다. 경사슬(light chain)은 카파 또는 람다로 분류된다. 중사슬(heavy chain)은 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이들은 다시 면역글로블린을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD and IgE 으로 정의한다.

전형적인 항체 구조 단위는 테트라머로 구성되는 것으로 알려져 있다. 각각의 테트라머는 두 개의 같은 폴리펩타이드 사슬 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 경사슬(light chain)(약 25kD)와 하나의 중사슬(heavy chain)(약 50-70 kD)를 가지고 있다. 각 사슬의 N 말단은 주로 항체의 인식에 관여하는 100개에서 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 부위(V)로 정의된다. 가변 경사슬(VL)과 가변 중사슬(VH)는 각각 이들 경사슬(light chain)과 중사슬(heavy chain)을 가리킨다.

항체는 인택트 면역글로블린(intact immunoglobulins)으로 존재하며, 다양한 펩티다제에 의해 분해되어 만들어져 특징지워진 수개의 단편들, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 다양한 단편들로 존재한다. 따라서, 예를 들면, 파파인(papain)은 항체를 항원 결합 Fab 단편과 나머지 Fc 단편으로 분해한다; 펩신은 힌지 부위에서 이황화 결합을 하고 있는 항원을 F(ab')2와, 자체가 이황화 결합에 의해 VH-CHl에 결합되어 있는 경사슬(light chain)인 Fab의 이합체(dimer)로 분해한다.

F(ab')2 는 적절한 조건하에서 힌지 부위의 이황화 결합이 깨져서 F(ab')2 이합체가 Fab' 모노머로 전환되도록 저해될 수 있다. Fab1 모노머는 필수적으로 힌지 부위의 일부로서 Fab이다 (좀더 자세한 항체 단편에 대한 기술을 보기 위해서는 W. E. Paul, ed., 1993, Fundamental Immunology, Raven Press, NY 참조). 다양한 항체 단편들이 인택트 항체(intact antibody)의 분해(digestion)라는 용어로 정의되지만, 이 분야의 당업자는 Fab' 단편 또는 다른 단편들은 처음부터 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용함으로써 합성될 수 있다는 점을 알수 있을 것이다. 게다가 재조합 DNA 방법론은 효소 분해에 의해서는 만들어질 수 없는 항체 단편들을 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 여기서 사용되는 항체라는 용어는, 전체 항체의 변형에 의해 만들어진 항체 단편 뿐만 아니라 처음부터 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성되어진 항체 단편들도 포함한다.

항체들은 단일 사슬 항체(하나의 폴리펩타이드 체인으로 존재하는 항체)와 다양한 중사슬(heavy chain) 과 다양한 경사슬(light chain) 이 같이 결합(직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해서)하여 연속적인 폴리펩티드를 형성하는 단일 사슬 Fv 항체(sFv 또는 scFv)를 포함한다. 단일 사슬 Fv 항체는, 직접적으로 또는 펩타이드 인코딩 링커에 의해 연결된 VH- 과 VL-의 인코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 VH-VL 이형이합체와 공유결합적으로 연결된다(Huston, et al, 1988, Proc . Nat . Acad . Sci. USA, 85: 5879-5883). VH와 VL은 서로 단일 펩타이드 사슬로 연결되어 있지만, VH과 VL 도메인들은 비공유적으로 연결되어 있다. 선형 파아지(compfilamentous phage)의 표면에서 발현되는 첫 번째 기능적 항체 분자들은 단일 사슬 Fv's (scFv) 이었으나, 선택적인 발현 전략들 또한 성공적이었다. 예를 들면, Fab 분자들은 사슬들(경사슬(light chain) 또는 중사슬(heavy chain)) 중 어느 하나가 g3 캡시드 단백질(g3 capsid protein)에 삽입되고, 상보 사슬(complementary chain)이 용해성 분자로 페리플라즘으로 배출되면 파아자에서 디스플레이될 수 있다.

두 개의 사슬들은 같거나 또는 다른 레플리콘(replicon)에 인코드될 수 있다. 중요한 점은 각각의 Fab 분자의 두 개의 항체 사슬들은 전사 후에 어셈블하며 이합체는 사슬들 중 어느 하나와 g3p와의 결합을 통해 파아지 입자내로 혼합된다{U.S. Patent No: 5,733,743 참조, 상기 특허는 전체로서 본원 발명에서 참조로서 사용됨). scFv 항체들과, 자연적으로는 응집됐지만, 화학적으로는 항체 V 부위로부터 분리된 경사슬과 중사슬 폴리펩타이드(light and heavy polypeptide chains)를, 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조를 갖도록 폴딩된 분자로 컨버팅하는 수개의 구조들이 이 분야에 알려져 있다{U.S. 특허 Nos. 5,091,513, 5,132,405, 및 4,956,778 참조). 특히 바람직한 항체들은 파아지에 디스플레이되었던 모든 이러한 것들은 포함한다 {예를 들면 scFv, Fv, Fab 와 이황화 결합된 Fv(Reiter et al, 1995, Protein Eng. 8: 1323-1331). 항체들은 디안티바디(diantibodies)와 미니항체Iminiantibodies)를 포함할 수 있다.

항체들은 다양한 종들(species)로부터 만들어질 수 있다. 예를 들면, 항체들은 설치류(rodent)(예를 들면 마우스(mouse)와 랫(rat)), 토끼, 양, 낙타, 그리고 인간 항체들을 포함한다. 항체들은 또한 잡종항체(chimeric antibodies)들을 포함할 수 있으며, 이들은 한 종의 가변 변위와 다른 종의 정상 부위와 결합한다. 같은 방법으로, 항체들은 인간화(humanized) 될 수 있으며, 이는 한 종으로부터 인간의 구조 부위(framework region)를 갖는 것과 다른 종의 면역글로불린으로부터 상보적 결정 부위(CDR's)를 재조합 DNA 기술로 결합한 면역글로블린을 만드는 것이다{참조, 예, EPO Publication No. 0239400). 항체의 경우 모듈은 "구조(framework)"와 "CDR" 모듈로 구성된다. 구조와 CDR 모듈을 분리해서 만드는 것에 의해 다른 조합 어셈블리 가능성이 가능하다. 게다가, 두 개 또는 그 이상의 인공적인 유전자들은 각각의 유전적 하부 요소의 경계에서 동일한 쌍의 분할 사이트(cleavage site)를 가진다면, 어떠한 특별한 유전자 서열에 관한 추가적인 정보 없이, 미리 만들어진 하부 요소(sub-elements)의 라이브러리가, 자동적으로 이러한 유전자들에 삽입될 수 있다.

이러한 전략은, 예를 들면, 항체 친화력(antibody affinity)의 빠른 최적화를 가능하게 한다. 왜냐하면, 유전적 하부 요소(sub-elements)의 라이브러리를 코딩하고 있는 DNA 카세트가 (i) 미리 만들어져서, 저장되고, 다시 쓰이거나, (ii) 실제적인 서열에 대한 지식없이 또는 각각의 라이브러리 멤버의 서열에 대한 결정없이 이러한 서열의 어느 것에서도 적절한 위치에 삽입될 수 있기 때문이다. 항체들에 관한 합성 라이브러리의 생성을 위한 예시적 방법이 예를 들면 미국 특허 No. 5,885,793 와 6,300,064에 공개되어 있으며, 상기 발명들은 전체로서 이하에서 참조로 사용되었다.

항체는 에피토프-포커스트(epitope-focused) 항체를 포함하며, 이는 중사슬 (heavy chain)로부터 적어도 하나의 최소 필수 결합 특성 결정인자(minimal essential binding specificity determinant)를 갖거나, 또는 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터 경사슬(light chain) CDR3를 갖는 것으로서, 상기 에피토프-포커스트(epitope-focused) 항체를 만드는 방법에 관해서는 미국 특허 출원번호 No. 11/040,159 에 기술되어 있으며, 이 특허는 전체로서 이하에서 참조로 사용한다.

"사이토플라즈믹 멤브레인(cytoplasmic membrane)"이라는 용어는 세포의 사이토 플라즘을 둘러싸고 있는 멤브레인을 가리키며, 그램 음성 박테리아에서는 페리플라즘과 외부 멤브레인의 내부에 놓여 있다.

이하에서 사용되는 “다양성(diversity)”이라는 용어는 항체에 결합하는 다른 특정 항원 또는 관련 폴리펩타이드의 숫자를 가리킨다.

"발현 벡터(expression vector)"는 재조합적으로 또는 합성에 의해 생성된, 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 특정 핵산 소자들의 시리즈를 갖는 것을 말한다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 핵산 단편의 일부분이 될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 조작적으로 프로모터와 연결되어 전사되는 핵산을 포함한다.

여기서 사용되는 “구조 부위(framework region)"은, Kabat 에 의해 정의된 바에 의하면, 싱글 종들의 다른 면역글로블린 중에서 상대적으로 (즉, CDR에 비해) 보존되는, 면역글로불린의 경사슬(light chain)과 중사슬(heavy chain)의 가변 부위를 가리킨다. ”인간 구조 부위(human framework region)“는 자연 발생 인간 항체의 구조 부위와 실질적으로 동일한(약 85% 또는 그 이상) 구조 부위를 가리킨다.

“융합 항체(fusion antibody)”는 항체가 항체 폴리펩타이드의 N- 또는 C- 말단에서 비-항체 폴리펩타이드(non-antibody polypeptide)에 융합된 항체를 가리킨다. 일 실시예에서 항체 단편은 하나 또는 그 이상의 C-말단 펩타이드 태그(tag)를 가지고 있어 검출과 정제가 용이하다. 다른 실시예에서 항체는 세포, 배종(spore), 또는 바이러스의 표면에서의 디스플레이를 위해 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합된다. 예를 들면, 항체 단편의 한 사슬은 선형 파아지(a filamentous phage)와 같은 박테리오 파아지의 표면에서 융합 단백질로서 나타날 수 있다.

"숙주 세포(host cell)"라는 용어는 발현 벡터로부터 폴리펩타이드의 발현과 분리를 위한 세포 공장을 제공하는 세포를 가리킨다.

"인간화 된 항체(humanized antibody)”는 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진 항체로서, 한 종으로부터 사람 구조 부위를 갖는 부분과 결합된 다른 종의 면역글로불린으로부터의 상보적 결정부위(CDR's)를 갖는 면역글로불린을 가리킨다(예, EPO 공개특허 No. 0239400 참조),.

“면역글로블린(immunoglobulin)”은 항체 외의 여러 가지 형태의 항체들 뿐만 아니라 테트라머 항체를 가리키며, 예를 들면 두가지 기능을 하는 하이드리브 항체들, 융합 항체, 잡종 항체(chimeric antibodies), 인간화된 항체(humanized antibodies), humaneered antibodies 및 단일 사슬 항체 뿐만 아니라 Fv, Fab, and F(ab')2 를 포함한다.

"라이브러리(Library)"는 항체들을 인코드하거나, 클론 내의 폴리펩타이드와 관련된 DNA 등과 같은 뉴클레오티드 서열의 모음, 또는 유전적으로 다양한 항체들 또는 관련 폴리펩타이드들의 모음을 의미한다.

이하에서 사용되는 “다중체 단백질(multimeric protein)”이라는 용어는, 하나 이상의 분리된 폴리펩타이드 또는 세포외(in vitro) 또는 세포내(in vivo)에서 하나의 구형 단백질을 형성하기 위해 서로 연관된 단백질 사슬을 포함하는, 구형의 단백질을 의미한다. 다중체 단백질은 “균일다중체(homomultimer)"를 형성하기 위해 같은 종류의 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성된다. 선택적으로 다중체 단백질은 별개의 서열을 가진 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성되어, ”이형다중체(heteromultimer)“를 형성할 수 있다. 따라서 ”이형다중체(heteromultimer)“는 적어도 제 1 폴리펩타이드와 제 2 폴리펩타이드로 구성되며, 상기 제 2 폴리펩타이드는 아미노산 서열에서 제 1 폴리펩타이드와 적어도 하나의 아미노산 잔기(amino acid residue)가 다르다. 이형다중체(heteromultimer)는 상기 제1, 제2 펩타이드로 형성된 ”이형이합체“로 구성되거나, 또는 2개 이상의 폴리펩타이드가 존재하는 높은 차수의 3차 구조를 형성할 수 있다. 이형다중체(heteromultimer)에 대한 예시적인 구조에는 이형이합체(예로는 Fv, Fab 단편, 다이아바디(diabodies), GABAB 수용체 1과 2 복합체), 삼량체(trimeric) G 단백질, 이형테트라머(예 F(ab')2 단편)과 올리고머 구조들이 포함된다.

“단백질 위치(prl) 돌연변위”는 장애가 있는 신호 펩타이드를 갖는 단백질이나 신호 펩타이드가 없는 단백질에서의 분비 결함을 치료하는 분비 기구에서의 변화가 있는 숙주 세포를 가리킨다.

“분비/분비하기/분비하는 것”은 세포의 사이토플라즘으로부터 사이토플라즈믹 멤브레인을 통과하여 수송(transport)하는 것을 말하며, 신호 서열을 필요로 하는 수송 경로(transport pathway)와 신호를 필요로 하지 않는 수송 경로(transport pathway)를 포함한다.

“신호 서열”과 “신호 펩타이드”는 모두, 연결된 신생 펩타이드를 숙주 세포 외부로 분비하는 것을 도울 수 있는 펩타이드 서열을 가리킨다.

“VH와 VL 서브 클래스”라는 용어는 인간에 있어서 7까지 인식된 VH 서브 클래스들(VHl-VH7)과 16 VL 서브 클래스들(V카파1 - V카파6 and V람다l- V람다10)을 가리킨다.

“벡터”라는 용어는 본원 발명의 숙주세포에 있어서 핵산의 클로닝이나 발현을 위해 적당한 모든 핵산을 가리킨다. 벡터는, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파아지와 같은 형태가 될 수 있다. 벡터는 자기 조절되거나, 또는 숙주세포 염색체 또는 숙주 세포의 다른 복제 핵산에 될 수 있다. 벡터는 복제가 안되거나, 또는, 예를 들면 과도 발현 시스템(transient expression system)에서는 복제가 어려울 수 있다.

발명의 발현 시스템( EXPRESSION SYSTEMS OF THE INVENTION )

본 발명은 신호 펩타이드에 대한 필요없이 원핵세포로부터 항체들, 항체 단편들, 항체 관련 펩타이드들을 분비하는 방법을 제공한다. 본 발명은 항체 또는 항원 결합 단편과 이들의 어셈블리를 기능적 항원 결합 분자로 분비하는 새로운 방법을 제공한다. 항체는 항체를 위한 V 부위의 코딩 서열을 구성하는 하나 또는 그 이상의 핵산에 의해 인코딩된다. 본원 발명의 항체들은, 개시 내용 전체가 이하에서 참조로 쓰인 미국 특허 No. 6,204,023에 기재된 바와 같이, 신호 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시예들에서 본원 발명의 항체 또는 다중체 단백질(multimeric protein)은 신호 펩타이드가 부족한 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 발현된다. 항체는 항체, 항체 단편 또는 항체 관련 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 하나 또는 그 이상의 벡터(들)에 의해 인코딩된다. 항체가 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)로부터 만들어진다면, 2개의 사슬을 위한 코딩 서열은 같은 벡터에 있거나 또는 코딩 서열은 형질 전화된 숙주 세포 내의 다른 벡터에 있을 수 있다. 바람직한 실시예에서, 항체의 중사슬(heavy chain) 또는 경사슬(light chain)은 신호 서열을 인코드하지 않은 폴리튜클레오티드로부터 발현된다. 바람직한 실시예에서 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain) 모두는 신호 서열을 인코드하지 않은 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된다. 벡터의 실시예에는 플라스미드, 바이러스 벡터, 에피좀(episome)과 염색체 성분이 포함된다.

일반적으로 재조합 발현 벡터는 적어도 하나의 복제시발점(origin of replication), 숙주세포에서의 선택을 가능하게 하는, 즉, 대장균(E. coli)의 항암피실린 유전자, 사카로미세스 세레비시아 TRPl 유전자(Saccharomyces cerevisiae TRPl gene)와 같은 페노타입적인(phenotypic) 선택표시인자, 조작가능한 해독 영역에서 적절한 개시 신호와 종결 신호를 번역하는 것 뿐만 아니라 하류 구조 서열의 전사를 이끄는 기능적 프로모터를 포함한다. 형질전환을 위해 적절한 원핵 세포는 장내세균(Enterobacteriaceae)과에 속하는 대장균(E. coli), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 수도모나스(Pseudomonas) 종에 속하는 여러 종들, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 포도상구균(Staphylococcus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 다른 박테리아 숙주들도 선택 가능 대상이 될 수 있다.

본원 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 이 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 많은 발현 시스템이 있다{참조, Fernandes and Hoeffler, Eds., 1999, Gene Expression Systems, Academic Press.). 수많은 벡터들이 당업자들에게 알려져 있고, 본원 발명의 재조합 구조를 생성하기 위해 상업적으로 가능하다. 다음의 벡터들은 대표적인 것들로서 이들에 한정되는 것은 아니다: 박테리아: pBs, 파아지스크립(phagescript), PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNHlβa, pNH18a, pNH46a(Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSKF, pET23D, λ-phage 유도 벡터, pi 5A- 기초 vectors (Rose, 1988, nucleic Acids Res. 16:355 and 356) 및 GST와 LacZ와 같은 융합 발현 시스템. 박테리아 사용을 위한 몇몇 벡터들은 선택가능한 표시와 잘 알려진 클로닝 벡터인 pBR322 (ATCC 37017) 의 유전적 요소를 구성하는 상업적으로 이용가능한 플라스미드로부터 얻어진 박테리아의 복제시발점으로 구성된다. 이러한 상업적 벡터들은, 예를 들면 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden)과 GEM 1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA)를 포함한다. 이들 pBR322 "백본(backbone)" 섹션들은 적절한 프로모터와 발현된 구조 서열과 결합한다.

일반적으로 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현은 바람직한 숙주 세포에서 기능적인 프로모터의 조절하에 있다. 다양한 프로모터들이 이용가능하며, 본원 발명의 벡터로 사용될 수 있다. 일반적으로 프로모터의 선택은 상기 프로모터가 사용될 세포 타입에 의해 결정된다. 상기 프로모터들은 산성인산분해효소(acid phosphatase) 또는 열충격 단백질(heat shock proteins) 및 다른 것과 같은 해당 작용 효소(glycolytic enzyme)를 인코드하는 오페론으로부터 유래된다. 특별하게 명명된 박테리아 프로모터는 lad, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, tac 과 trc를 포함한다. 일반적으로 사용되는 원핵 프로모터는, 베타 락타메이즈 페니실리나제(the beta-lactamase (penicillinase))와 락토오즈 (lac) 프로모터 시스템(Change, et al, 1990, Nature 198: 1056), 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (Goeddel et al, 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4057), tac 프로모터 (DeBoer, et al, 1983, Proc . Natl. Acad . Sci U.S.A. 80:21-25); 과 람다-유도 P_L 프로모터 및 N-유전자 리보솜 결합 부위(Shimatake et al, 1981, Nature 292: 128)를 포함한다. 특별한 프로모터 시스템이 본 발명에 중요한 것은 아니며, 원핵 생물 내에서의 기능할 수 있는 어떠한 프로모터라면 사용가능하다. 적절한 벡터와 프로모터의 선택은 당업계의 일반적인 범위에 있다.

대장균(E. coli ) 외의 원핵 세포에서의 폴리펩타이드의 발현을 위해서는, 특별한 원핵 종들에서 기능하는 전사와 번역을 위한 조절 서열들이 필요하다. 그러한 프로모터들은 상기 종들로부터 클론된 유전자로부터 얻어지거나, 또는 이종 프로모터들이 사용될 수 있다. 예를 들면 하이브리드 trp - lac 프로모터는 대장균(E. coli) 뿐만 아니라 바실러스(Bacillus)에서도 기능한다. 이들 및 적절한 다른 박테리아 프로모터들은 당업계에는 잘 알려져 있으며, 예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. and Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 등에 기술되어 있다. 본원 발명의 단백질의 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은 즉, 대장균(E. coli), 바실러스(Bacillus sp.)와 살모넬라(Salmonella)(Palva et al, 1983, Gene 22:229-235; Mosbach et al, 1983, Nature 302:543-545)에서 얻어질 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트들은 상업적으로 얻어질 수 있다.

보존적(constitutive)이거나 조절된 프로모터들이 본원 발명에서 사용될 수 있다. 대장균(E. coli)에서의 발현을 조절하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, IPTG에 의해 유도될 수 있는 lac 또는 tac 과 같은 유도성 프로모터(inducible promoter)와 아라비노즈-유도성 프로모터(arabinose-inducible promoters)의 사용을 포함한다. 조절된 프로모터(Regulated promoters)는 숙주 세포에서의 이종 단백질의 농도가 조절될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 유도성 프로모터(inducible promoter)는 발현 레벨이 예를 들면 온도, pH, 호기 또는 혐기적 상황, 빛, 전사 요건 또는 화학약품 등의 환경적 또는 발달적 요인에 의해 변할 수 있는 유전자의 발현을 이끄는 프로모터이다.

대장균(E.coli)와 다른 박테리아 숙주세포를 위한 유도성 프로모터(inducible promoter)가 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들에는, 예를 들면 lac 프로모터, 박테리오 파아지 람다 P_L 프로모터, 하이브리드 trp - lac 프로모터(Amann et al., 1983, Gene 25: 167; de Boer et al, 1983, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 80: 21)와 박테리오 파아지 T7 프로모터(Studier et al, 1986, J. Mol . Biol ; Tabor et al, 1985, Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 82: 1074-8)들이 포함된다. 이들 프로모터들과 그 사용에 대해서는 Sambrook et al ., supra.에 논의되어 있다.

다른 생물을 위한 유도성 프로모터(inducible promoter)도 당업계에 잘 알려져 있다. 이들에는, 예를 들면 메탈로치오넨 프로모터(metallothionein promoter), 열충격 프로모터(heat shock promoter)와 다른 많은 것들이 포함된다.

리보좀 결합 부위, 전사 종결 부위, 오퍼레이터 및 유사한 것들과 같은 다른 발현 조절 서열들도 또한 포함될 수 있다. 이러한 서열들 중 하나 또는 그 이상을 포함하는 DNA 구조들은 “발현 카세트(expression cassettes)”라고 한다. 따라서, 폴리펩타이드들을 인코드하고 있는 핵산들은 원하는 숙주 세포에서의 원하는 발현 레벨을 위해서 결합된다.

번역 개시 코돈(translation-initiation codon)은 직접적으로 서열을 코딩하는 성숙 항체(mature antibody) 또는 항체 단편의 하류에 도입되어, 항체 또는 항체 단편 폴리펩타이드는 N-말단에서 메티오닐(또는 N-포밀 메티오닐) 잔기를 가지고 발현된다. 추가적인 서열은 항체의 코딩 서열, 예를 들면 항체의 정제 또는 감지의 편의를 용의하게 하거나 또다른 목적을 위해서, 항체의 코딩 서열에 포함될 수 있다. 이형 구조 서열(heterologous structural sequence)은 적절한 번역 해독 영역(translational reading frame)에 적절한 번역 개시 서열과 종결 서열에 어셈블된다. 선택적으로 이형 서열(heterologous sequence)은 바라는 특성, 즉 발현된 재조합 프로덕트의 안정화 또는 간단화된 정제와 같은 바라는 특성을 부여한 N-말단 동정 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코드할 수 있다.

ATG 코돈은 코딩 서열의 5' 말단에 존재하여, 발현된 단백질은 아미노 말단에 N-포밀-메티오닌을 가진다. 코딩 서열의 발현에 있어서 N-말단 아미노산은 유지되거나, 또는 숙주 세포 내에서 프로테아제에 의해 제거될 수 있다. 본원 발명에 따른 DNA 코딩 서열의 발현으로부터 만들어진 항체, 항체 단편, 항체 관련 폴리펩타이드는 항원 결합할 수 있다. 항체 단편이 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)로부터 형성된 경우, 두 개의 체인 중 어느 하나 또는 양쪽 모두는 ATG 코돈을 가진 코딩 서열로부터 발현될 수 있다. 바람직하게 두 개 사슬 모두는 신호 펩타이드 없이 발현된다.

번역 커플링(Translation coupling)은 발현을 증가시키기 위해 사용된다. 전략은, 번역 시스템에 번역 시스템에 익숙한 고발현된 유전자로부터 유도된 짧은 상류 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 또는 합성적/비-자연적으로 고발현된 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 사용하고, 프로모터와 리보솜 결합 사이트의 하류와, 종결 코돈의 상류에 위치한다. 시스템은 효율적인 번역의 개시를 허용한다. 참조. Squires, et al, 1988, J. Biol . Chem. 263: 16297-16302. 종결 코돈 바로 앞부분이 두 번제 리보솜 결합 부위이며, 뒤따르는 종결 코돈은 폴리펩타이드가 발현되기 위한 복사를 위한 개시 코돈이다. 상기 시스템은 효율적인 복사의 개시를 위해서 허용된다. Squires, et . al , 1988, J. Biol . Chem . 263: 16297-16302 참조.

분비된 항체는 항체 발현을 위한 적절한 조건에서 박테리아의 성장기간이 지난 후에 배양액 내에서 또는 배양액으로부터 분리되어 감지할 수 있다. 배양액 내에서의 항체를 모니터링하기 위한 방법으로는 웨스턴 블롯(Western blot), SDS-PAGE, 효소면역측정법(ELISA)이 있다. 분비된 항체는 박테리아의 페리플라즘에서 또는 페리플라즘으로부터 분리되어 감지될 수 있다. 페리플라즘의 붕괴와 페리플라즘 부분으로부터 항체의 릴리스(relaese)를 위한 방법은 이 분야에 잘 알려져 있으며, 낮은 pH(즉 pH 4.0)와 삼투압 충격을 사용하는 것을 포함한다.

본원 발명의 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하기 위해서, 폴리펩타이드를 인코드하고 있는 핵산은 에피토프 또는 친화성 결합 시약을 위한 “태그”를 위한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 그러한 에피토프 태그에는, 예를 들면, c-myc, HA- 태그, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein), VSV-G 태그, 안티-D YKDDDDK (SEQ ID NO: 3) 태그, 또는 다른 태그들이 포함되며, 이들 중 많은 부분이 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 에피토프들을 갖는 융합 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해 유용한 발현 벡터들은 상업적으로 이용가능하다(즉, Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 이용 가능한 벡터인 pcDNA3.1/Myc-His 과 pcDNA3.1/V5-His 는 포유 동물에서의 발현에 적합하다). 본원 발명의 융합 단백질에 태그를 결합시키기 위해 적당한 추가적인 발현벡터들과 그에 따른 감지 시스템들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 몇몇은 상업적으로 이용가능하다{즉, "FLAG" (Kodak, Rochester NY)). 적절한 태그에 대한 다른 예로써는 폴리히스티딘 서열이 있으며, 이는 메탈 킬레이트 친화 리간드(metal chelate affinity ligands)에 결합하는 것이 가능하다. 전형적으로, 6개의 인접한 히스티딘이 사용되며, 6개 이상이나 이하를 사용하는 것도 가능하다. 폴리히스티딘 태그를 위한 결합 모이어티(moiety)로 사용될 수 있는 적절한 메탈 킬레이트 친화 리간드(metal chelate affinity ligands)에는 니트릴로-트리-아세트산(NTA)이 포함된다(Hochuli, E., 1990, "Purification of recombinant proteins with metal chelating adsorbents" in Genetic Engineering: Principles and Methods , J.K. Setlow, Ed., Plenum Press, NY; Qiagen, Santa Clarita, CA로부터 상업적으로 이용가능).

당업자는 생물학적 활성의 감소없이 단백질 도메인에 변형이 만들어 질 수 있다는 것을 알 수 있다. 몇몇의 변형이 클로닝, 발현, 또는 도메인을 폴리펩타이드 내로 결합시키는 것을 용이하게 하기 위해서 만들어질 수 있다. 그러한 변형들은 당업자에게는 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 개시 사이트를 제공하기 위해 아미노 말단에 첨가된 메티오닌, 또는 편리하게 위치한 제한 사이트(restriction sites) 또는 종결 코돈 또는 정제 서열들을 생성하기 위해 양 끝단에 위치한 추가적 아미노산(즉, 폴리 His)를 제공하기 위한 결합 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 양 끝단에 코돈을 추가하는 것을 포함한다.

폴리펩타이드( POLYPEPTIDES )

항체( Antibodies )

일실시예에서, 분비된 폴리펩타이드들은 항체들이다. 기본적 항체 구조 단위는 테트라머로 구성되는 것으로 알려져 있다. 각각의 테트라머는 두 개의 동일한 폴리펩타이드 쌍으로 구성되어 있으며, 각각의 쌍들은 하나의 “경사슬”(약 25kDa)과 하나의 “중사슬”(약 50-70 kDa)을 가지고 있다. 각각의 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식에 가장 중요한, 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산 가변 부위를 포함한다. 각각 사슬의 카르복시 말단 부분은 작동체 기능(effector function)에 가장 중요한 정상 부위(constant region)가 된다. 각각 경사슬(light chain) /중사슬(heavy chain) 쌍의 가변 부위는 항체 결합 사이트를 형성한다. 따라서, 항체 자체는 두 개의 결합 사이트를 가진다. 각각의 사슬은 정상 부위(C,constant region)과 가변 부위(V, variable region)을 가지고 있다. 각각의 사슬은 일렬의 도메인으로 구성된다. 경사슬(light chain) 은, 두 개의 도메인을 가지고 있으며, 하나는 C 부위에 해당하고, 다른 하나는 V 부위에 해당한다. 중사슬(heavy chain)은 4개의 도메인을 가지고 있으며, 하나의 V 부위에 해당하고, C 부위에 3개의 도메인(1, 2 와 3)을 가지고 있다. 항체는 두 개의 갈라진 부분(arms)(각각의 갈라진 부분은 Fab 부위)을 가지고 있고, 각각은 서로 연결된 VL, VH 부위를 가지고 있다. 하나의 항체와 다른 항체가 다른 부분(아미노산 서열의 변화에 따라)은 V 부위의 쌍(VL 과 VH)이며, 이들은 같이 항원 인식과 항원 결합 부위를 제공하는 역할을 한다. 좀더 자세하게, 각각의 V 부위는 4개의 구조 부위(framework region)(FR)으로 나누어지는 3개의 상보적 결정 부위(complementarity determining regions) (CDR)로 구성된다. CDRs는 가변 부위 중 가장 변화되는 부위이며 중요한 항원 결합 기능을 한다. CDR 부위는 재조합, 변이와 선택을 포함하는 복잡한 과정을 통한 장래 생식세포 서열로부터 얻어진다.

* 경사슬(light chain)은 카파 또는 람다로 분류된다. 중사슬(heavy chain)은 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 각각 항체의 아이소타입인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 로 된다. 인간의 중사슬(heavy chain) 서브 클래스는 VHl - VH7를 가리킨다. 경사슬(light chain) 과 중사슬(heavy chain) 내에, 가변 부위와 정상 부위가 12개 또는 그 이상의 아미노산의 “J" 부위에 의해 연결되어 있고, 중사슬(heavy chain) 은 10 개 이상의 아미노산으로 구성된 ”D"부위를 포함한다.{참조 일반적으로 1993, Paul, W., ed., Fundamental Immunology , 3rd ed. Raven Press, N.Y., SH. 9 참조(모든 목적을 위해 전체로서 참조로서 삽입))

N 말단에서 C 말단까지, 경사슬(light chain)과 중사슬(heavy chain) 모두의 가변 부위는 구조 부위(framework)와 상보적 결정 부위(omplementarity determining regions,CDRs)이 교대로 구성한다: FR, CDR. FR, CDR. FR, CDR 및 FR. 아미노산의 각 부위로의 분배는 Kabat, 1987, 과, 1991, supra, 및/또는 Chothia & Lesk, 1987, J. MoI . Biol. 196: 901-917; Chothia et al, 1989, Nature 342: 878-883에서의 정의에 따라 이루어진다.

결합 항원의 기능은 전체 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 보여져 왔다. 결합 단편의 일예로 (i) VL, VH, CL 및 CHl 도메인으로 구성된 Fab 단편, (ii) VH 및 CHl 도메인으로 구성된 Fd 단편 ; (iii) 항체의 하나의 가지(arm)의 VL과 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (iv) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편 (Ward, E.S. et al, 1989, Nature 341: 544-546) ; (v) 분리된 CDR 부위; 및 (vi) F(ab')2 단편들, 힌지 부위에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편으로 구성된 2가의 단편이 있다.

본원 발명의 여러 가지 실시예에서, 항체 또는 항체 단편은 단일 사슬 항체이거나 또는 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)로 만들어진 것일 수 있다. 항체들의 예로 인택트 면역글로블린(intact immunogloblin), 단일 사슬 항체들, scFv, dAB, VHH, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 카멜리드 항체(camelid antibodies), 나노바디(nanobodies), 항원 결합 스캐폴드(antigen-binding scaffolds) 및 항체 또는 항체 관련 폴리펩타이드 융합 단백질(fusion protein)이 있다. 만약 항체가 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)을 포함한다면, 하나 또는 그 이상의 사슬들은 신호 펩타이드 없이 발현되며, 바람직하게는 두 개의 사슬들 모두 신호 펩타이드 없이 발현된다.

카멜리드(camelid)의 면역글로블린(항체 분자)을 구성하는 IgGs의 2가지 구조가 존재하는 것으로 알려져 있다. 하나는 중사슬(heavy chain) 과 경사슬(light chain)을 가진 이형테트라머이고, 다른 하나는 중사슬(heavy chain)의 이합체로 구성된다. 테트라머의 구조는 인간과 대부분의 동물 사이의 IgGs의 일반적 특징이다. 다른 한편으로 중사슬(heavy chain) 이합체 구조를 가진 IgG 격자는 카멜리드(camelid)의 특징으로 여겨진다.

캐트네리드(catnelid)에서 중사슬(heavy chain) IgG 이합체의 VH 부위는 L 체인과 소수성 결합을 만들어서는 안되기 때문에, 경사슬(light chain)과 수직으로 접하는 무거운 중사슬(heavy chain) 부위는 캐트네리드(catnelid)에서 친수성 아미노산 잔기로 변한다. 일반 이형테트라머의 IgGs의 VHs와 대비한 구조상의 차이점 때문에 중사슬(heavy chain) IgGs 이합체의 VH 도메인들은 중사슬(heavy chain) 항체의 중사슬(heavy chain)의 가변도메인(VHH)으로 불린다.

VHH는 친수성 아미노산 잔기 때문에 뛰어난 용해성을 갖고 있다. 아미노산 치환체들은 VHH의 1차 구조(아미노산 서열)에 퍼져 있다. 게다가, 이러한 친수성 아미노산 잔기는 VL 도메인과 상호작용하는 부위에 상응하는 VH의 4차 구조 공간에서 클러스터를 형성한다. 4차 구조의 상기 공간은 특히 VL 사이드 전구체(former VL side)라고 불린다. 이러한 아미노산 치환체들은, 예를 들면, V37F 또는 V37Y, G44E, L45R 또는 L45C이고, W47은 주로 GIy와 치환된다. 이러한 치환체들은 VHH의 VL 사이드 전구체의 친수성을 증가시킨다. 게다가 낙타와 라마로부터 얻어진 VHH들은, 쥐의 이형테트라머 항체들에 비해서 열안정성이 매우 높다. 이런 종들로부터 얻어진 VHH를 사용하면, 예를 들면 900C에서도 항원 결합 능력을 유지하는 분자를 제공할 수 있다.

카멜리드 항체 레퍼토리의 다양성은 VH 또는 VHH 부위에서의 상보적 결정 부위(complementary determining regions (CDR)) 1, 2 및 3에 의해 결정된다. 세 개의 CDRs를 가지는 것은 다른 동물 종의 IgGs와 같다. 그러나, 낙타 VHH 부위에서의 CDR3는 상대적으로 긴 길이인 평균 16개의 아미노산의 의해 특징지워진다(Muyldermans et al, 1994, Protein Engineering 7(9): 1129). 예를 들면, 평균적으로 9개의 아미노산을 갖는 마우스 VH의 CDR3와 대비해서, 낙타 IgG의 CDR3는 매우 길다.

카멜리드(camelid)의 가변부위의 생체내(in vivo) 다양성을 유지하는, 카멜리드로부터 얻어진 항체 가변부위의 라이브러리는, 예를 들면, 2005년 2월 17일에 공개된 미국 특허 출원 번호 No. 20050037421에서 공개된 방법에 따라 만들어 질 수 있으며, 상기 특허는 전체로서 본원 발명에서 참조로 사용되었다.

본 발명의 다른 실시예에서 항체 관련 폴리펩타이드들은 스캐폴드 폴리펩타이드들(scaffold polypeptides)이다. 스캐폴드 폴리펩타이드들(scaffold polypeptides)은 미리 결정된 리간드에 대한 선택성 결합 활성을 나타내는 비-면역글로블린(non-immunoglobulin) 결합-폴리펩타이드이다. 상기 비-면역글로블린(non-immunoglobulin) 결합-폴리펩타이드들은, 부모 폴리펩타이드(parent polypeptide)의 결합 특이성을 스캐폴드를 가진 비-면역글로블린으로 부여하기 위해서, 부모 폴리펩타이드(parent polypeptide)의 결합 도메인과 그래프트 될 수 있는 스캐폴드를 가진 면역글로블린 유사 도메인(immunoglobulin-like domain)으로부터 만들어진다.

본 발명의 비 면역글로블린 결합 폴리펩타이드(non-immunoglobulin binding polypeptide)는 넓은 범위의 이형 폴리펩타이드 결합 도메인을 받아들이는 능력 뿐만 아니라 스캐폴드 도메인 구조에서 안정하다는 장점을 가지고 있다. 추가적으로 스캐폴드를 포함하는 면역글로블린 유사 도메인(immunoglobulin-like domain)은 인간 소스로부터 쉽게 얻어지기 때문에, 이들이 인간 치료에 사용될 경우의 면역력은 무시할 만하다. 본 발명의 스캐폴드는 자연적으로 발생한 폴리사카라이드 사슬을 포함하거나 또는 배제하도록, 또는 새로운 사슬들 또는 추가 스캐폴드 모이어티 또는 폴리펩타이드 구조를 포함하도록 쉽게 만들어 질 수 있다.

일실시예에서 본 발명은 스캐폴드를 포함한 Thy1 면역글로블린 유사 도메인(a Thy1 immunoglobulin-like domain)에 삽입된 항체 가변 부위 상보적 결정부위(antibody variable region complementarity determining regions, CDRs)를 가진 비면역글로블린 결합 폴리펩타이드로 유도될 수 있다. CDRs 는 CDRs가 도너, 또는 부모(parent), 항체에서의 3차 구조와 유사한 형태를 갖도록 폴딩하는 Thy1 폴리펩타이드의 루프 부위(the loop regions)에 삽입된다. 결과적인 하이브리드, 키메릭(chimeric), 항체 관련 폴리펩타이드는 부모 항체(parent antibody)와 비교하여 유사한 결합 특성을 나타낸다.

다른 실시예에서, 본 발명은 몇몇 또는 모든 위치에서 아미노산 치환에 의해 만들어진 변형된 면역글로블린-유사 도메인 루프를 가지는 항체 관련 폴리펩타이드와 관련된다. 루프 도메인에서 변형된 아미노산 서열은 항체 관련 폴리펩타이드로 둘러싸인 리간드에 대해 선택적 결합 활성을 부여한다. 아미노산 변형은 당업자들에게 알려진 여러 방법을 사용한 핵산 또는 폴리펩타이드 레벨에서 만들어질 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명은 폴리펩타이드를 포함하는 면역글로블린 유사 도메인(immunoglobulin-like domain)의 ThyOx 패밀리(ThyOx family)로부터 유도되는 항체 관련 폴리펩타이드와 관련된다. ThyOx 폴리펩타이드는 스캐폴드를 포함하는 면역글로블린 유사 도메인(immunoglobulin-like domain)으로 사용되거나, 또는 폴리펩타이드의 캐리어로 사용되어 본원 발명의 항체 관련 폴리펩타이드를 생성한다. 스캐폴드 폴리펩타이드와 상기 스캐폴드 폴리펩타이드의 라이브러리는, 2004년 12월 30일에 공개된 미국 특허 출원 번호 20040266993에 개시되어 있으며, 전체로서 본원 발명의 참조로 삽입되었다.

“면역글로블린-유사 도메인(immunoglobulin-like domain)” 또는 “Ig-유사 도메인(Ig-like domain)”가, 스캐폴드를 가리키기 위해 사용될 때는, 여러 기능을 하는 단백질, 예를 들면, 세포외 기질 단백질(extracellular matrix proteins), 근육 단백질(muscle proteins), 면역 단백질(immune proteins), 세포 표면 리셉터(cell-surface receptors)와 효소를 포함하는 다양한 기능의 단백질에서 발견되는 인위적으로 감지되는 α-샌드위치 구조 모티브를 가리킨다. Ig-유사 도메인 멤버들은 여러 수퍼패밀리들(superfamilies), 예를 들면, 면역글로블린, 파이버넥틴 타입 III (fibronectin type III)와 카드헤린 수퍼패밀리들(cadherin superfamilies)을 포함하는 여러 슈퍼패밀리로 나뉘어진다. Ig-유사 도메인 구조적 모티브를 포함하는 다른 수퍼패밀리들은, 예를 들면, PKD 도메인의 멤버들, α-갈락토시다아제/글루코니다아제 도메인(α-galactosidase/glucuronidase domain), 트랜스글루타마아제(transglutamase) 2개의 C- 말단 도메인, 악티노산틴 유사(actinoxanthin-like), CuZn 수퍼옥사이드 디스무타아제-유사(superoxide dismutase-like), CBD9-유사, 라민 AJC 글로블라 테일 도메인(globular tail domain), 크라트린 어뎁터 부속 도메인(clathrin adaptor appendage domain), 인테그린 도메인(integrin domains), PapD-유사, 자산 포스파타제 N-말단 도메인(purple acid phosphatase N-terminal domain), 수퍼옥사이드 리덕타제 유사(superoxide reductase-like), 티올:이황화 인터체인지 프로테인(thiol:disulfide interchange protein) DsbD N-말단 도메인과 인베신/인티민 세포 접착 단편 수퍼패밀리 등을 포함한다. Ig-유사 도메인 구조적 유사성은 중요한 서열 동일성과 관계없이 다양한 슈퍼패밀리들의 멤버들 사이에서 유지된다. 이러한 용어는 각각의 수퍼패밀리 내와 수퍼패밀리를 가로지르는 Ig-유사 도메인 멤버들을 포함하는 것을 목적으로 한다. 그러므로, “수퍼패밀리를 포함하는 면역 글로블린 유사(Ig-like) 도메인”은 업계에 알려진 다른 것들과 더불어 이러한 수퍼패밀리 내의 멤버 폴리펩타이드를 포함하는 Ig-유사 도메인을 가리키는 것을 의도한다. 수퍼패밀리를 포함하는 다른 Ig-유사 도메인에 대한 설명은, 예를 들면, Clarke et al, 1999, Structure Fold . Des . 7:1145-53과 URL pdb.weizmann.ac.il/scop/da- ta/scop.b.c.b.html. 과 같은 구조적 데이터 베이스에서 발견될 수 있다.

"ThyOx" 또는 "ThyOx 패밀리 폴리펩타이드(ThyOx family polypeptide)“라는 용어가 본 발명의 항체 관련 폴리펩타이드를 가리키는 걸로 사용될 경우, 공통 α샌드위치 구조 모티브에 의해 관련되고, 항체 가변 부위 도메인과 유사한 스캐폴드 구조를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역글로블린-유사 도메인의 면역글로블린 수퍼패밀리(immunoglobulin superfamily, IgSF)내의 폴리펩타이드의 서브 클래스를 의미한다. 폴리펩타이드의 ThyOx 패밀리 내의 특별한 폴리펩타이드는, 예를 들면, Thy-1, Ox2, GP40, Ox2-유사 단백질과 0x2 호모로그를 포함한다.

이하에서 사용된 “스캐폴드”라는 용어는 이종 결합 도메인을 조직하고, 순응시키고, 번식시키기 위해 사용되거나, 리간드에 대한 결합 특이성을 부여하는 아미노산 서열이 변형된 지지 폴리펩타이드 구조(a supporting polypeptide framework)를 의미한다. 스캐폴드는 결합 특이성을 부여하는 아미노산 서열로부터 구조적으로 분리가능하다. 스캐폴드의 구조적으로 분리가능한 부분은, 예를 들면, α샌드위치, α쉬트, α헬릭스(α helix), α 바렐(αbarrel), 코일된 코일과 업계에 잘 알려진 다른 폴리펩타이드 2차, 3차 구조 등을 포함하는 다양한 다른 구조 모티브를 포함할 수 있다.

본 발명의 스캐폴드는 지지 구성 구조의 안정성의 실질적인 저하 없이 아미노산 서열에서 변화될 수 있는 하나 또는 그 이상의 부위를 포함할 수 있다. 변화될 수 있는 예시적 부위는 두 가닥의 α샌드위치 또는 α 쉬트의 두 가닥을 연결하는 루프 부위 세그멘트(a loop region segment)를 포함할 수 있다. 스캐폴드의 구조적으로 분리된 부위에 상응하는 아미노산 잔기는 이하 스캐폴드 구조(a scaffold framework)라고 명명한다. 본 발명의 스캐폴드를 포함하는 면역글로블린-유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)은 인간 면역글로블린의 여러 중사슬(heavy chain) 또는 경사슬(light chain) 구조 아미노산 서열에 대해 적어도 50% 아미노산 동일성을 나타낸다. 일반적으로, 스캐폴드를 포함하는 면역글로블린-유사 도메인은, 예를 들면, 인간 면역글로블린의 여러 중사슬(heavy chain) 또는 경사슬(light chain) 구조 아미노산 서열과 대비할 때 적어도 약 45%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 15% 또는 약 10% 아미노산 유사성을 보일 것이다. 변화할 수 있는 스캐폴드 잔기는 루프 부위와 같은 구조적 특성과 더불어 명명되거나 또는 변화된 잔기들을 수용할 수 있는 능력과 더불어 명명된다. 따라서 변화할 수 있는 스캐폴드 부위는 예로써, 스캐폴드 가변부위, 뮤터블 부위(mutable region), 교환 부위(exchange region), 변경할 수 있는 부위(alterable region) 또는 변화할 수 있는 부위(changeable region) 등을 가리킨다. 2차 또는 3차 구조적 특징을 갖는 잔기들은 전체적인 스캐폴드의 구조가 유지되는 한, 유지되거나, 변형되거나 보존될 수 있다. 당업자라면 이를 알고 있으며, 그러한 잔기들이 어느 정도까지 변형될 수 있는지 뿐만 아니라, 폴리펩타이드 스캐폴드의 구조적 안정성에서 어떠한 잔기 기능인지를 결정하는 것을 할 수 있다.

본 발명의 스캐폴드에 대한 특정 예로는 수퍼패밀리 멤버를 포함하는 면역글로블린-유사 도메인을 포함한다. 이러한 수퍼패밀리 멤버들은 본 발명의 스캐폴드로 사용될 수 있고 α-샌드위치로 특징지워지는 면역글로블린 유사 도메인을 포함한다. α-샌드위치는, α 쉬트의 편평한 소수성 면들이 각각 대향해서 패킹되는 두 개의 안티패러렐한 D 쉬트를 포함하는 약 80 내지 150개의 아미노산 잔기로 구성된다. 각각의 α쉬트는 루프 부위를 포함하며, 스캐폴드 폴리펩타이드에 독특한 결합 특이성을 부여할 수 있도록, 아미노산 서열이 변화할 수 있다. 수퍼패밀리 멤버를 포함하는 Ig-유사 도메인의 예로는, 예를 들면, 위에서 설명한 수퍼패밀리를 포함하는 면역글로블린-유사 도메인 내의 여러 개별적인 멤버들 뿐만 아니라, ThyOx 패밀리 멤버 폴리펩타이드도 포함된다. 상기 개별적인 멤버들로는, 예를 들면, T 세포 리셉터, CD8, CD4, CD2, 클래스 I MHC, 클래스 II MHC, CDl, 사이토카인 리셉터(cytokine receptor), GCSF 리셉터, GMCSF 리셉터, 호르몬 리셉터(hormone receptors), 성장 호르몬 리셉터(growth hormone receptor), 에리스로포이에틴 리셉터(erythropoietin receptor), 인터페론 리셉터, 인터페론 감마 리셉터(interferon gamma receptor), 프로락틴 리셉터(prolactin receptor), NCAM, VCAM, ICAM, N-캐더린(N-caderin), E-캐더린(E-caderin), 피브로넥틴(fibronectin), 테나신(tenascin), 및 도메인 폴리펩타이드를 포함하는 I-세트, 또는 이들의 기능적 단편들이 포함된다. 수퍼패밀리 멤버들을 포함하는 이러한 Ig-유사 도메인의 예들은, 예를 들면, Isacke and Horton, 2000, The Adhesion Molecule FactsBook, Second Ed., Academic Press, San Diego; Fitzgerald et al , 2001, The Cytoldne FactsBook, Second Ed., Academic Press, San Diego; and Marsh et al, 1999, The HLA FactsBook, Second Ed., Academic Press, San Diego 들에서 찾아볼 수 있다.

본원 발명의 항체들, 항체 단편들, 또는 항체 관련 폴리펩타이드들은 다양한 기원으로부터 만들어진다. 여러 실시예에서 항체들, 항체 단편들 또는 항체 관련 폴리펩타이드들은 포유동물 유전자로부터 만들어지며, 인간, 마우스, 토끼, 양, ㄹ랫(rat), 햄스터 변종, 인간화(humanized), 하이브리드 또는 에피토프 포커스트(epitope-focus)들이 될 수 있다. 본 발명의 항체들은 단일 클론 항체 일 수 있다. 이들의 주어진 항원에 대한 높은 특이성 때문에 단일 클론 항체의 도래(advent)(Kohler, G. and Milstein C, 1975, Nature 256: 495)는 과학적으로 또는 상업적으로 중요한 결과를 나타내는 중요한 기술적 전화점이 되었다.

단일 클론 항체는 전통적으로 특별한 특이성을 갖는 생물학적으로 기능을 하는 항체 분자의 한 형태를 분비하는 단일 면역글로블린을 생산하는 세포로부터 만들어진 불멸의 포유동물 세포 라인을 만듦으로써 만들어진다. 항체를 생산하는 포유동물의 세포 라인이 불멸이기 때문에, 항체의 특징들은 배치마다 복제가 가능하다. 단일 클론항체의 중요한 특징은 특별한 항원에 대한 그들의 특이성과 그들이 생산될 수 있는 생산성에 있다.

단일클론항체를 생산하는 초기의 방법은 노동과 시간이 필요했다. 선택된 동물, 즉 마우스는 원하는 항원에 대해 면역을 가지고 있었으며 항체를 생산하는 세포들은 동물로부터(일반적으로 비장절제술에 의해) 얻어져서, 적당한 불멸의 세포, 즉 골수 세포에 주입되어 항체를 동일하게 생산하는 하이브리도마를 만든다. 이러한 하이브리도마 기술은, 예를 들면 미국 특허 U.S. Patent Nos. 4,172,124 and 4,196,265; Zurawski et al, 1980, Federation Proceedings 39:4922; Frankel and Gerhard, 1919, Molecular Immunology , 16:101-106.에 개시되어 있다. .

인간 항체를 완전히 생산하는 형질전화 동물(transgenic animal)의 도입은 인간 항체를 완전히 생산하는 하이브리도마의 선택을 가능하게 했다. 이러한 형질 전화 동물(transgenic animal)은 예를 들면 U.S. Patent Nos. 6,075,181 과 6, 300,129에 개시되어 있으며, 전체로 본 발명에서 참조로서 삽입되었다.

디스플레이 기술은 완전한 인간 또는 다른 동물, 잡종의(chimeric), 합성의, 및/또는 세미-합성의 모노클로날 항체들의 선택을 허용한다. 이러한 디스플레이 기술들의 한 예는, 파아지 단백질의 N-말단에서 하나 또는 그 이상의 항체 사슬이 삽입된 융합 항체의 발현을 위한 벡터가 만들어지는 파아지 디스플레이이다(예들이 미국특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,821,047; 5,871,907; 5,885,793; 5,922,545; 5,403,484; 5,885,793; 6,172,197; 6,291,158; 6,291,650; and 6,387,627들에 개시되어 있으며, 본 발명의 참조로서 사용됨). 이러한 벡터들은, 신호 무관 방법에 의해 항체를 발현하고, 파아지 항체들을 분리하기 위해서 본원 발명의 prl 돌연변이 숙주세포 스트레인에 도입될 수 있다. 본원 발명의 숙주세포에서의 파아지-항체의 발현은 거의 분비되지 않는 항체의 개선된 발현과, 라이브러리 내에 존재하는 항체의 다양한 서브 클래스의 좀더 나은 표현을 제공한다. 융합 단백질은 신호 서열이 부족한 항체 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 파아지 항체의 스크리닝, 정제 및 분석을 위한 방법이 상기 특허들에 기술되어 있다. 이러한 파아지 디스플레이 기술들의 다른 예는 효모 디스플레이(예는 미국 특허 6,300,065,에 기술되어 있으며, 전체로서 본 발명에서 참조로서 삽입됨)이다.

파아지-디스플레이 기술은 일반적으로 선형 박테리오 파아지(the filamentous bacteriophage) M13 또는 밀접하게 관련된 파아지 fd 를 사용해 왔다. 이러한 파아지들은 코트 단백질의 실린더에 의해 둘러쌓인 원형, 선형-가닥의 DNA 로 구성된다. 대부분의 바이러스 캡시드(capsid)는 주된 단백질 pVIII로 구성되며, 파아지 당 약 2,700개의 카피들이 있다. 파아지 파티클의 한 끝에는 숙주 세포 결합과 어셈블리 프로세스의 종결에 포함되는 각각 5개의 pIII과 pVI 카피들이 있다. 다른 한 끝에는 각각 5개의 pVII과 pIX, 어셈블리의 개시와 비리온 안정성 유지를 위해 각각 요구되는, 33 개와 32개의 아미노 산의 소수성 펩타이드가 있다.

본 발명의 실시예는 잡종 항체(chimeric antibodies)와 합성 항체(synthetic antibodies)를 포함한다. 초기 모노클로날 기술들은 상기 생산된 비-인간 항체들에 대해 기술했었다. 이러한 항체들은 인체내에서 잠재적으로 면역성이며, 이러한 면역성은 치료적 항체의 발달을 심각하게 방해했다. 예를 들면, 한 종의 가변 부위가 다른 종의 정상 부위와 결합된, 소위 “잡종 항체(chimeric antibodies)”의 생산은 다소 성공적이었으나, 많은 경우 면역성 문제를 극복하지는 못했다. 잡종항체를 만드는 예시적인 방법이 미국 특허 4,816,567에 예시되어 있으며 본 발명에서 전체로서 참조로서 사용되었다.

재조합 DNA 기술은 한 종으로부터의 인간의 구조 부위(framework regions)가 다른 종의 면역 글로블린으로부터의 상보적 결정부위(complementarity determining regions, CDR's)와 결합된 면역글로블린을 생산하기 위해 사용되어 왔다(참조, 예, EPO 공개 No.0239400). 이러한 새로운 단백질들은“재생성된(reshaped)" 또는 ”인간화된(humanized)(구조 부위가 인간일 때)" 면역글로블린으로 불리웠고, 도너 면역글로블린(donor immunoglobulin)이 CDR's 을 인간 구조와 결함함으로써, 인간 유사 면역글로블린(human-like immunoglobulin)으로 전환되는 과정은 "인간화(humanization)"으로 불리웠다. 항체의 인간화(humanization)의 예시적인 방법들이, 예를 들면, 미국 특허 No. 6,180,370,에 개시되어 있으며, 전체로서 본 발명의 참조로 사용되었다.

인공적인 항체와 그들의 단편들은 알려진 항체 서열에 기반을 두고 만들어 질 수 있으며, 이는 동형 항체 유전자의 전체 그룹의 구조적 특징을 반영한다. 그러므로, 구조적 레퍼토리의 손실 없이 다른 유전자의 숫자를 줄이는 것이 가능하다. 이러한 시도는 한정된 인공 유전자(artificial genes)의 세트를 유도하며, 처음부터 합성에 의할 수 있으며, 그에 따라 분할 사이트(cleavage sites)의 도입이 가능이 가능하고, 원하지 않는 분할 사이트(cleavage site)를 제거한다. 게다가, 이러한 시도는, (i)유전자의 코돈 사용을 모든 원하는 숙주세포에서의 고발현에 적합하도록 조절, (ii)모든 가능한 항체 경사슬(light chain)과 중사슬(heavy chain) 의 쌍을, 상호 작용 선호(interaction preference), 항원 선호(antigen preference) 또는 재조합 발현 타이터(적정 농도)의 관점에서의 분석하는 것을 가능하게 했고, 이러한 것들은 생물체의 항체 유전자와 그들의 모든 조합의 완전한 콜렉션을 사용하더라도 실제적으로는 불가능하다.

완전히 합성된 유전자의 한정된 세트를 사용하는 것은 인코드된 구조적 서브-요소(sub-elements)의 경계에서 분할 사이트(cleavage sites)를 만드는 것을 가능하게 했다. 따라서, 각각의 유전자는, 단백질/(폴리)펩타이드 수준에서 구조적 서브 요소(sub-elements)를 나타내는 모듈로부터 만들어진다. 항체의 경우, 모듈은 “구조(framework)”와 “CDR" 모듈로 구성된다. 분리된 구조(framework)와 CDR 모듈을 만드는 것에 의해, 다른 조합적인 어셈블리 가능성이 가능해졌다. 더구나, 두 개 또는 그 이상의 인공 유전자가 각각의 유전적 서브-요소(sub-elements)의 경계 부분에 동일한 분할 사이트(cleavage sites) 쌍을 운반할 경우, 서브-요소(sub-element)의 프리 빌트(pre-built) 라이브러리는, 어떤 특정한 유전자 서열에 관련된 추가적인 정보없이, 이러한 유전자들에 동시에 삽입될 수 있다. 유전자 서브-요소(sub-elements)의 라이브버리를 인코딩하고 있는 DNA 카세트가 Ii)프리-빌트(pre-built)되고 저장되고 재사용되며, (ii)실제적인 서열에 대해 안다거나 각각의 라이브러리 멤버들의 서열을 결정해야 하는 것 없이 이러한 서열들의 적절한 위치에 삽입될 수 있기 때문에, 이러한 전략이, 예를 들면, 항체 친화성(antibody affinity) 등의 신속한 최적화를 가능하게 한다. 항체들의 합성적 라이브러리를 생성하는 예시적인 방법은, 예를 들면, 미국 특허 5,885,793 과 6,300,064에 개시되어 있으며, 상기 특허는 전체로서 본원 발명의 참조로 사용되었다.

일 실시예에서 항체들은 항체공학을 위한 방법에 의해 만들어진 에피토프-포커스트 휴먼 항체들(epitope-focused human antibodies)로서, 본원 발명의 참조로서 사용되고, 2005년 1월 20일 출원된 미국 특허 출원 U.S. 특허 출원 Ser. No. 11/040,159에 기술된 바와 같이, 결과 항체들은 비 인간 서열들(non-human sequences)의 대부분이 인간 서열들로 대치됨과 동시에 에피토프 결합 특이성(epitope binding specificity)과 친화성을 가진다. 이것은 레퍼런스 항체(reference antibody), 즉 CDR3 쌍 (CDR32)의 단백질로부터 BSD를 전이(transfer)으로써 이루어진다. 친화성-성숙된 항체, 즉 레퍼런스 항체(reference antibody)인 항체들에서, 중사슬(heavy chain) 과 경사슬(light chain) BSD들은 서로 밀접하게 접하고 있으며, 조합된 항원-결합 형성의 상호 안정화를 위해 최적화되고, 따라서 유니트, 즉 BSD 쌍을 형성하게 된다.

항원-결합 배좌(antigen-binding conformation)는, 물론 아래 놓인 V 부위 구조의 지지에 의존한다. 친화성-성숙 BSD, 즉, 레퍼런스 항체(reference antibody)의 그것이, 중사슬(heavy chain) 또는 경사슬(light chain) V-세그먼트 쌍들의 완전 인간 레파토리의 구조적 다양성 및 안정성과 결합될 경우, BSD의 옵티칼 항원 결합 배좌를 완전히 지지하는 스캐폴드들은, 한정되지 않고, 파아지 디스플레이, 세포 활성, 콜로니 리프트 바인딩 어세이(colony lift binding assays, CLBA) 또는 ELISA 분석등에 제한되지는 않지만 이들을 포함하는 선택 시스템의 도움으로, 쉽게 동정된다.

또한, BSD 쌍을 다양한 생식 계열 V-절편으로 전이하는 것은 50nM 보다 큰 친화성을 갖는 V-부위의 선택이 된다. 이러한 선택된 V- 세그멘트는 항체의 친화성 성숙 프로세스로 조합될 수 있다. V-세그멘트 라이브러리들은 CDR3 레퍼토리가 없어 상대적으로 작으며, 따라서 인간 V-부위의 선택은 다양한 일반적인 선택시스템을 위해 조사할 수 있는 크기의 라이브러리에서, 하나 또는 두 개의 BSD의 제한된 돌연변이적 다양성과 조합될 수 있다.

레퍼런스 항체(reference antibody)의 중사슬(heavy chain) 및/또는 경사슬(light chain) V 세그멘트를 치환하기 위해 생성 라이브러리(generating libraries)에서 사용되는 V-세그멘트 레파토리는 어떠한 소스로부터도 가능하다. 인간 레파토리도, 말초 혈액 또는 비장(spleen)으로부터 얻어진 cDNA로부터의 원하는 세그멘트에 적절한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 사슬 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 증폭에 의해 생성될 수 있으며, 이 경우 레파토리는 체세포 돌연변이를 가진 클론을 포함하는 것으로 기대된다. 선택적으로 레퍼토리는, 서열을 인코드하는 생식 계열을 얻기 위해, 비-면역 시스템 세포로부터의 유전자 DNA의 증폭에 의해 얻어질 수 있다.

인간 생식계열 V-세그멘트 레파토리는 51개의 중사슬(heavy chain) V-부위, 40K 경사슬(light chain) V-세그멘트, 31 λ 경사슬(light chain) V-세그멘트로 구성되며, 토탈 3,621개의 생식 계열 V-부위의 쌍을 만든다. 게다가, 이러한 V-세그멘트의 대부분을 위한 안정적인 알러릭 변위(allelic variants)가 있으나, 이러한 변위들의 생식 계열 레파토리의 구조 다양성에 대한 기여는 제한적이다. 모든 인간의 생식 계열 V 절편의 서열들은 알려져 있으며 영국 캠브리지의 the MRC Centre for Protein Engineering에서 제공하는 V-베이스 데이터 베이스(V-base database)에서 알수 있다. (참조 Chothia et al., 1992, J MoI Biol 227:776- 798; Tomlinson et al, 1995, EMBO J 14:4628-4638; and Williams et al, 1996, JMol Biol 264:220-232). 친화적 성숙(affinity maturation) 과정에서 체세포 과다 돌연변이유발제(somatic hypermutagenesis)에 의해 유발된 V-세그멘트 변위(V-segment variants)는, 이러한 돌연변이들이 비작위적으로 보이기 때문에, V-세그멘트 레파토리에 중요한 기여를 할 수 있으며, 고친화적 항원 특이성을 용이하게 할 수 있는 구조적 조정을 하게 할 수 있다. 나이브 항체(naive antibodies)는 다양한 특이성과 최대 결합 다양성을 위한 낮은 친화성을 위해 최적화되나, 친화적 성숙 항체의 경우 고친화적 항원 특이적 결합(high-affinity antigen-specific binding)을 위해 필요한 좀더 리지드한 CDR들을 위한 구조적 조정을 포함할 수 있다(예., Diaz and Klinman, 2000, Immunol Res. 21:89-102).

인간 V-부위 레파토리, 생식계열과 친화적 성숙 모두는, 예를 들면, 말초혈액림파구(peripheral blood lymphocytes (PBL))로부터 회복될 수 수 있으며, 전형적인 cDNA 클로닝 방법을 사용하여, 전형적인 cDNA 클로닝 방법으로 다수의 (적어도 10개 이상의) 건강한 인간들로부터 풀(pool)로 만들어진다.(Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). 지금까지 생식계열의 빈도 분포(the germline frequency distribution)는 발현 서열에서는 단일하지 않지만, 각각 3개의 V 절편(VH, VK, 및 Vλ)을 위해서 적어도 10³개의 독립된 클론을 캡쳐하는 것이, 레파토리의 최적 다양성을 위해서 필요하다. PCR 은 클로닝 과정에서 V-부위 서열의 증폭을 위해서 사용될 수 있다. 그러나, 실험적 증폭 메카니즘은 무작위적으로 치우치기 쉽고, degenerate primers 를 사용하여 합성될 수 있으며, 이는 다양한 프라이밍 효율(priming efficiencies)을 가지고, 다양성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 증폭이 필요할 경우, 가능하다면 프라이머 독립적인 선증폭 방법, 예를 들면 실험관에서의 전사(in vitro transcription)를 사용하는 것인 바람직하다(Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).

레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 BSD 는 위에서 설명한 방법에 위해 만들어진 V-세그멘트 서열의 라이브러리로 운반된다. BSD는 V-세그먼트가 발현벡터로 클로닝 되기 전이나 후에 발현 벡터로 삽입(incorporate)될 수 있다. 운반된 BSD는 a CDR3-FR4, a CDR3, a D 세그먼트(BSD는 중사슬(heavy chain)로부터), a MEBSD, 또는 레퍼런스 항체(reference antibody)의 다른 사슬로부터의 상보 BSD과 조합된 결합 특이성을 갖는 CDR3-FR4의 다른 절편이다. 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터 다른 V-부위로 BSD가 운반될 때, V 부위의 중사슬(heavy chain) 또는 경사슬(light chain)의 구조는 얻어진 V-부위에서 유지된다. 따라서, 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 BSD가 CDR3-FR4의 하부 부위(subregion)라면, 전체 CDR3-FR4의 구조 길이는 유지되며, 즉, 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터 유래되지 않은 CDR3-FR4 잔기의 나머지 부분은 다른 잔기, 일반적으로는 인간 생식 계열 잔기로 만들어진다. .

알려진 바와 같이, BSD는 즉, 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의, 4개의 구조부위를 포함하며, 이는 J 세그먼트의 일부분이지만 포유동물에서는 잘 보존되지 않으며, CDR 3 구조에 중요하다. 이러한 서열들은 예를 들면, 구조부위 3에 구조 결찰(in-frame ligation)을 위한 제한 사이트(restriction site)와, C 부위에 결찰을 위한, 구조 부위 4의 카르복실 말단으로부터 하류 다른 독특한 제한 사이트(restriction sites)를 포함하는 프라이머에 위한 PCR에 의해 증폭될 수 있다. 각각의 CDR3-FR4는, 그후, V-부위 라이브러리 구조의 적절한 사이트로 운반된다. 선택적으로, CDR3-FR4 부위를 위한 바람직하거나 또는 혼합된 서열은, 하나의 연속적인 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들의 혼합에 의해 합성될수 있고, 제 1 주형 cDNA의 합성을 위한 주형으로서 레파토리로부터 합성된, 시험관 내에서 전사된 cRNA를 사용하여, 프라이머 확장(primer extension)에 의해 V 세그멘트에 결합될 수 있다. BSD는 완전한 CDR3 보다는 작은, 즉 중사슬 (heavy chain) CDR3의 D 세그멘트 또는 MEBSD 일 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 레퍼런스 항체(reference antibody) BSD가 완전한 CDR3보다 작을 경우, 완전한 CDR3는, 남은 CDR 3가 구조에 삽입됨으로써, 여전히 항체 발현 라이브러리에 남을 것이다. 예를 들면, 적절한 올리고뉴클레오티드는 MEBSD의 일부가 아닌 CDR3를 치환하기 위해, 인간 서열, 즉 생식 계열의 J 세그멘트에 삽입되도록 디자 될 수 있다.

MEBSD 는 CDR3 서열 또는 CDR3 의 쌍에 있는 부위로서, CDR3의 나머지와 V부위의 나머지 부분을 재건하는 인간 서열과 결합할 때 레퍼런스 항체(reference antibody)의 결합특이성을 유지하기 위해 필요하다. MEBSD는 실험적으로 정의되거나 구조를 살펴봄으로써 예측할 수 있다.

항체 라이브러리는 항체가 IgG, Fv, Fab, Fab', a F(ab')2, 단순 사슬 Fv, 하나 또는 그 이상의 도메인이 없는 IgG, 또는 V 부위를 포함하는 다른 항체 단편이 될수 있다.

항체들은 바이러스, 세포, 배종(spore) 또는 바이러스 유사 파티클(virus- like particle)의 표면에서 보일 수 있다. 이러한 목적을 위해, 항체 단편의 하나 또는 두개의 사슬은 융합 단백질, 예를 들면 섬유상 파아지(filamentous phage)의 표면에서 디스플레이 되기 위한 파아지 코트 단백질로 융합되는, 융합 단백질로서 발현된다. 선택적으로, 항체 라이브러리의 항체들은 숙주 세포로부터 분비될 수 있다.

Fab 또는 Fab' 단편과 같은 항체를 발현하기 위해 분비 시스템을 사용하는, 예시적 설명을 제공한다. 그러나, 발현 시스템이 어떠한 라이브러리 포맷에도 적응(adapt)된다는 것은 당업자들에게는 당연한 것이다. 이러한 일반적인 예를 위해 완전한 V-부위의 라이브러리는 CDR3-FR4 세그멘트를 인코딩하는 올리고뉴클레오티드를 앞에서 언급한 V-세그멘트에 주합(litigation) 시킴으로써 만들어진다. 완전한 V-부위를 인코딩하는 증폭된 서열은 적절한 발현 벡터에 클로닝되고, Fab 또는 Fab' 분자들의 발현을 위한 스테이지에서 정상 부위 서열(constant region sequences)에 삽입될 수 있다. 항체 단편은 박테리아, 이스트, 식물 세포와 포유 동물 세포를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포로부터 분비될 수 있다.

필터 스크리닝 방법들은 특별한 항원에 대해 특이적인 분비된 항체의 감지를 위해 설명되었다. 한 포맷에서, 분비된 항체 단편들은 가용성 항원들로 프로브(probe)된 멤브레인에서 성장된다(Skerra et al, 1991, Anal Biochem . 196:151-5). 이러한 경우, Fab 단편의 박테리아 페리플라즘으로의 분비를 유도하는 플라스미스 벡터를 포함하는 박테리아는 멤브레인 또는 필터에서 자란다. 분비된 단편들은 항체 단편에 결합할 수 있는 항체(예를 들면 안티-면역글로블린 안티세럼(anti-immunoglobulin antiserum))로 코팅된 제2의 “캡쳐” 멤브레인에 삽입(diffuse)되게 되고, 캡쳐 필터는 특정 항원으로 프로브된다. 항체-효소 주합(Antibody - enzyme conjugates)은 항원-결합 항체 단편을 캡쳐 멤브레인에서 색깔을 띤 스폿으로 감지하기 위해 사용될 수 있다. 콜로니들은 첫 번째 멤브레인에서 다시 자라며, 원하는 항체 단편을 발현하는 클론이 회복된다.

콜로니 리프트 바인딩 어세이(Colony lift binding assays)는 항체들이 직접적으로 항원-코팅된 멤브레인으로 삽입(diffuse)되는 것이 허용된다는 것으로 기술되었다. Giovannoni 등은 그러한 단순 사슬 항체 라이브러리의 스크리닝을 위한 프로토콜을 기술하고 있다 (Giovannoni et al, 2001 Nucleic Acids Research , Vol. 29, No. 5 e27).

분비된 항체 단편의 라이브러리는 복수의 클론의 풀을 사용하거나 또는 각각 독특한 항체 서열을 분비하는 클론의 개별적 스크리닝하는 ELISA 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. 개별 클론의 스크리닝을 위한 그러한 한 방법이 Watkins et al, 1997, Anal. Biochem. 253: 37-45에 기술되었다. 이러한 경우, 마이크로타이터 웰이 웰에서 직접 분비된 Fab 단편을 캡쳐하기 위해 안티-Fab 항체로 코팅된다. Fab 샘플들은 그후 가용성 biotin이 부착된 항원과 프로브되고, 그후 스트렙타비딘-알카라인 포스파아제 주합(streptavidin-alkaline phosphatase conjugates)에 위해 검출된다.

융합 항체(Fusion Antibodies)

일 실시예에서, 폴리펩타이드는 융합항체 일 수 있다. 일 실시예에서 항체 단편은 감지와 정제를 용이하게 하기 위해, 하나 또는 그 이상의 C- 말단 펩타이드 택으로 구성된다. 다른 실시예에서 항체는 세포, 배종(spore) 또는 바이러스의 표면에서의 디스플레이를 위해 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편의 하나 사슬은 융합 단백질로 선형 파아지(filamentous phage)와 같은 박테리오 파아지의 표면에서 디스플레이 될 수 있다. 파아지에서의 항체의 디스플레이를 위한 방법은 업계에는 잘 알려져 있으며 선형 파아지(filamentous phage)의 pIll 과 pVIII 단백질로의 융합을 포함한다. 바람직한 실시예에서 항체-파아지 단백질 융합을 구성하는 적어도 하나의 펩타이드는 대장균(E. coli)의 aprl 스트레인에서 신호 펩타이드 없이 발현되고, 파아지의 표면에 나타난다.

분비된 사슬들은 N-말단 메티오닌(또는 N-포르밀-메티오닌)을 보유할 수 있다. 선택적으로, 그리고 몇몇 케이스에서는, 항체의 서열에 의존하여, 개시 메티오닌은 숙주세포에 의해서 프로페오리틱 프로세싱(proteolytic processing)에 의해 제거된다.

실시예는 다른 디스플레이 기술, 이스트 세포 디스플레이(yeast cell display), 박테리아 세포 디스플레이, 리보솜 디스플레이, 및 포유동물 세포 디스플레이와 같은, 다른 디스플레이 테크놀로지를 포함한다. 일 실시예에서, 스크리닝은 라이브러리 멤버들의 스크리닝 풀에 의하여 행해진다.

단편과 서부 유니트 상보 시스템은 원하는 성질을 가진 항체를 선택/스크린 하기 위해 본원 발명에서 사용될 수 있다(“상보 시스템”). 일반적으로 단편 상보 시스템은 단편화되거나, 또는 기능적 응답자(functional responder)를 만들기 위해 재결합되어야 하는 2개 부분으로 분리되는, 응답자(responder)로 구성된다. 응답자의 단편/서브 유니트는 각각 결합 앙상블에 삽입되고, 응답자의 리어셈블리는 두 개의 결합 앙상블 멤버들의 직접적 또는 간접적인 상호작용에 의해 유도된다. 바람직한 실시예에서 결합 앙상블은 항체(들)와 항원(들)으로 구성된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 단편/서브 유니트 상보 시스템의 예는 미국 특허 번호 Nos. 6,342,345, 6,270,964, 6,294,330, 5,503,977, 5,585,245 에 공개되어 있으며, 전체로서 본 발명의 참조로 삽입되었고, PCT 특허 출원 WO 00/71702와 Fields et al, 1989, Nature 340:245-247; Bai et al, 1996, Meth . Enzymol. 273:331-347, Luo et al, 1997, Biotechniques 22:350-352 도 전체로서 참조로 삽입되었다.

재활 기반 분자 상호 작용 시스템(Reactivation-based molecular interaction systems)(즉, RAIR.TM.)이 본 발명에서 원하는 특징을 가진 항체를 선택/스크린 하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 재활 기반 분자 상호 작용 시스템은 반응자(responders), 저해자(inhibitors), 재활 반응자(reactivators), 2개 또는 그 이상의 결합 앙상블(binding ensembles)로 구성된다. 시스템은 두 개의 컴플레스로 구성되며, 그 중 1개는 1개의 반응자, 저해자(inhibitor), 그리고 결합 앙상블 멤버(반응자 컴플렉스)를 포함하며, 다른 하나는 재활성자와 결합 앙상블 멤버(재활 반응자 콤플렉스)이다. 반응자는 그 콤플레스 내에서 저해되며, 결합 앙상블의 직접 또는 간접 상호 작용에 의하 재활반응자 콤플렉스의 도킹이, 저해자를 치환함으로써 재활반응자가 반응자와 재반응하는 것을 가능하게 한다. 전형적으로 반응자 콤플렉스(a responder complex)는 반응자 분자(a responder molecule), 반응자의 저해자(inhibitor), 제·1 결합 앙상블 멤버로 구성된다. 반응자 콤플렉스(a responder complex)의 구성요소는 공유 결합 또는 비공유 결합의 여러 형상으로 만들어질 수 있다. 바람직한 실시예에서 결합 앙상블은 항체(들)과 항원(들)으로 구성된다.

바람직한 재활성 시스템에서, 분자 상호 작용은 “자기 억제 반응자의 재활성화(reactivation of an auto-inhibited responder)” 또는 “RAIR"로 명명된 프로세스에 의해 감지될 수 있다. RAIR 시스템은 반응자 콤플렉스와 재활성자 콤플렉스로 구성된다. 자기 억제(auto-inhibited)에 의해, 우리는 반응자가 직접적으로 반응자와 연결됨으로써, 저해자(inhibitor)가 제거되고 반응자가 재활반응자 콤플렉스(reactivator complex)에 의해 활성화될때까지, 기본 상태(base state)는 자동적으로 억제된다. 이 결합이 공유결합일 때에는, 공유 결합은 링커를 더욱 형성할 수 있다. 재활성자 콤플렉스는 재활성자 분자를 구성하고 저해자(inhibitor)와 제2 결합 앙상블 멤버를 대신한다. 반응자 콤플렉스의 구성요소 같이, 재활성자와 결합 앙상블 멤버도 각각 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 연결될 수 있다.

제1, 제2 앙상블 멤버들간의 분자 상호 작용은 다음 메카니즘에 의해 감지될 수 있다. 반응자 콤플렉스(responder complex)에서의 반응자(responder)의 신호 또는 활성이 콤플렉스에 존재하는 저해자(inhibitor)의 존재에 의해 고립된다. 즉, 반응자는 자기 억제(auto-inhibited)된다; 재활성자 콤플렉스(reactivator complex)가 도입될 때, 재활성자 콤플렉스(reactivator complex) 내에 제2 앙상블 멤버가 충분한 친화성으로 반응자 콤플렉스 내의 제1 앙상블 멤버와 결합하며, 재활성자는 반응자 콤플렉스 내의 반응억제제를 대신할 수 있고, 소위 “자기 억제된 반응자의 재활성화(reactivation of an auto-inhibited responder)를 유도한다. 반응자 활성 또는 신호의 감지는 제1, 제2 앙상블 멤버들간의 상호작용을 나타낸다.

RAIR 시스템의 변이들은 상호작용 맵핑 및 제1 결합 쌍 멤버의 친화성과 복수개의 결합 분자들의 이소트로픽 선택을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 변이에서, 제3 앙상블 멤버들이 사용될 수 있다.

재활성 시스템에 대한 예들이 미국 특허 출원 번호 10/208,730에 개시되어 있으며, 이는 전체로서 본원 발명의 참조로 사용되었다.

경쟁에 의해 활성화되는 분자 센서를 사용하는 시스템들은 본원 발명에서 원하는 성질을 갖는 항체를 위한 선택/스크린에 사용될 수 있다. 이러한 시스템을 COMPACT.TM이라고 한다. 일반적으로 경쟁적 활성화 시스템(competitive activation systems)은 결합 앙상블(binding ensemble), 반응자와 저해자(inhibitor)로 구성된다. 반응자는 하나의 결합 앙상블(binding ensemble)과 콤플렉스를 이루고, 저해자(inhibitor)는 다른 결합 앙상블과 콤플렉스를 이룬다. 결합 앙상블(binding ensemble) 멤버들은 서로 결합함에 따라 반응자와 저해자(inhibitor)를 같이 가져옴으로써 반응자가 저해되게 된다. 결합 앙상블(binding ensemble)을 붕괴시키거나, 결합 앙상블(binding ensemble) 형성을 저해하고, 그에 따라 반응자를 활성화시키는 본원 발명의 항체들은 식별될 수 있다. 바람직한 실시예에서 결합 앙상블은 항체(들)와 항원(들)이며, 그리고 경쟁적 활성자(competitive activator)는 항체이다. 예를 들면, 결합 앙상블 항체는 레퍼런스 항체(reference antibody)가 될 수 있으며, 경쟁적 활성자는 항원에 대한 결합을 위해 레퍼런스와 경쟁하는 항체의 라이브러리를 구성할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 경쟁적 활성화 시스템의 예는 U.S. 특허 출원 Ser. No. 10/076,845에 공개되어 있으며, 전체로서 본원 발명의 참조로 삽입되었다.

이러한 시스템은 시스템의 민감성을 조절하기 위해 “마스크”를 더 포함할 수 있다. 이러한 시스템들은, 즉, 2002년 2월 14일 함께 출원된 미국 출원 번호 10/076,845에서 설명되고 있다. “마스크”는, 경쟁적인 활성화 시스템(a competitive activation system)의 배경에서, 리포터 또는 저해자(inhibitor)에 대한 낮은 친화성을 갖는 분자들을 가리키나, 상기 마스크는, 리포터 또는 저해자(inhibitor)에 공유결합적으로 결합되지 않으면, 조작 농도에서는 적절하게 결합하지 않는다. 마스크는 리포터의 활성저해자의 결합에는 영향을 주지 않으며, 그 역도 이와 같다. 마스크로 시스템을 조절하는 것은, 리포터-저해자(reporter-inhibitor) 콤플렉스의 분해 속도 상수에 영향을 주지 않고, 마스크에 위해 결합속도상수가 크게 감소하기 때문에, 주변 저해를 증가시키는 것에 대한 걱정없이, 고친화성 저해자(high-affinity inhibitor)를 사용하는 것을 가능하게 하고, 따라서, 고 친화성 리포터-저해자(high-affinity reporter-inhibitor) 콤플렉스의 안정성을 유지하면서 전체적 친화성을 줄인다.

라이브러리(Libraries)

다른 일 실시예에서, 분비된 폴리펩타이드들은 항체들, 항체 단편들, 또는 prl 변위를 발현하는 E. coli의 스트레인과 같은 원핵 숙주 세포로부터 발현되는 다양한 결합 특성을 갖는 항체 관련 폴리펩타이드의 다양한 라이브러리일 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 항체 사슬은 신호 펩타이드 없이 발현된다. 다른 실시예에서 분비된 폴리펩타이드들은 신호 독립적 방법에 의해 발현된다. 본 발명에 따른 라이브러리들은 VH과 VL 서브 클래스들보다 더 넓게 나타난다.

다양한 항체들이 다양한 레벨로 페리플라즘으로 분비된다는 것과, 항체의 어떤 서브 클래스들은 용해 가능한 적절하게 폴딩된 폼(correctly-folded form)으로만 분비된다는 것이 당 분야에 알려져 있다. 많은 경우에서, 항체의 V-부위 서열은 대장균(E. coli)로부터 분비되는 항체의 능력에 영향을 줄 수 있다. 뮤린 V- 부위(murine V-regions)는, 예를 들면, 페리플라즘에서는 폴딩이 잘 되지 않고, 집결되고 비활성적인 항체의 축적으로 유도된다. (Skerra and Pluckthun, 1991, Prot. Eng. 4:971; Bothmann and Pluckthun, 1998, Nature Biotech. 18: 376; Helle et al, 1995, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 92: 11907). 샤프롱 단백질(Chaperone proteins)은 몇몇 항체 단편의 폴딩과 발현을 개선할 수 있다.(Bothmann and Pluckthun, 1998, Nature Biotech. 18: 376; Bothmann and Pluckthun, 2000, J. Biol . Chem . 275: 17100). 박테리아로부터 항체의 몇몇 서브-클래스의 분비에 있어서 편중(bias)은, 라이브러리로부터 스크리닝 될 수 있는 항체 서열에서의 편중으로 유도할 수 있다. 본 발명의 일 실시예는, 기능적으로 적절하게 폴딩된 항체(functional correctly folded antibodies)와 항체 단편을, 박테리아 분비시스템으로부터, 신호 무관 방법에 따른 항체 사슬의 분비에 의해서, 높은 수율을 나타낸다.

본 발명의 실시예는 나이브 라이브러리(naive libraries)와 면역화된 라이브러리를 포함한다. 나이브 라이브러리(Naive libraries)는 어떤 면역원에 의해서도 공격받거나 감염 또는 염증 증상을 보이지 않는 적당한 숙주의 B-림프구로부터 만들어진다. 면역된 라이브러리는 적당히 “면역된” 숙주, 즉 면역원(immunogen)에 의해 공격을 받았던 숙주로부터 얻어진 B-세포와 플라즈마 세포의 혼합으로부터 만들어진다. 일 실시예에서, 이러한 세포로부터의 mRNA는, 당업자에게 잘 알려진 방법(예를 들면, oligo-dT 프라이머와 역전사효소)에 의해 cDNA로 복사된다. 추가적 실시예에서, 숙주세포(mRNA 또는 genomic DNA)로부터 항체를 인코딩하는 핵산은 적절한 프라이머로 PCR에 의해 증폭된다. 이러한 항체 유전자 증폭를 위한 프라이머들은 당업자에게는 잘 알려져 있다(예를 들면 미국 특허 No.6,096,551이 있으며, 이는 전체로서 본원 발명의 참조로 사용되었고, PCT 출원번호 WO 00/70023A1도 이러한 프라이머에 대해 공개한다). 하이브리드 실시예에서, 숙주세포로부터의 mRNA는 cDNA로 합성되며, 이러한 cDNA는 항체 특이적 프라이머로 PCR 반응에서 증폭된다(예를 들면 미국 특허 No.6,319,690은 전체로서 본원 발명의 참조로 사용되었으며, 이러한 하이브리드 방법에 대해 개시하고 있음). 선택적으로 레파토리는 전형적인 cDNA 클로닝 기술(Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)에 의해 PCR을 사용하지 않고 클로닝될 수 있다..

본 발명의 일 실시예에서, 인간 기원의 공개된 항체 서열의 데이터 베이스는, 항체 서열이 서로 정렬되었을 때에 만들어진다. 데이터 베이스는 서열과 CDR 루프의 카노니칼 폴드(canonical fold)의 모두에서, 높은 정도의 유사성을 보여주는 항체 서열의 서브 그룹을 정의하기 위해 사용된다(항체 구조 분석에 의해 결정되는 바에 따라). 각각의 서브 그룹에 대하여, 콘센서스 서열(consensus sequence)은 유래하고, 이는 상기 서브 그룹의 멤버를 나타낸다. 콘센서스 서열(consensus sequence)의 완전한 집합은 따라서 인간 항체들의 완전한 구조적 레파토리를 나타낸다.

이러한 인공적인 유전자들은 그후, 예를 들면 토탈 유전자 합성, 또는 합성적 유전적 서브유니트의 사용에 의하여 만들어진다. 이러한 유전적 서브유니트들은 (폴리)펩타이드 레벨에서의 구조적 서브-요소에 상응한다. DNA 레벨에서는, 이러한 유전적 서브 유니트들은 서브-요소 각각의 시작과 끝부분에서의 분할 사이트(cleavage site)에 의하여 정의되고, 이는 벡터 시스템에서는 유일하다. 콘센서스 서열(consensus sequence) 집합의 멤버들인 모든 유전자들은, 이상과 같이 만들어져서 상응하는 유전적 서브-서열의 비슷한 패턴을 가지고 있다. 가장 바람직하게, 상기 (폴리)펩타이드들은 상기 HuCAL 콘센서스 유전자들이거나 또는 이들로부터 유도되는 유전자로서: VkI, Vk2, Vk3, Vk4, VIl, V12, V13, VHlA, VHlB, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, Ck, Cl, CHl 또는 상기 HuCAL 콘센서스 유전자들의 조합이다.

이러한 DNA 분자들의 집합은 항체, 바람직하게는 Fv, 이황화 결합된 Fv, 단일 사슬 Fv (scFv), Fab 단편들 또는 새로운 타겟 항원에 대한 특이성의 소스로 사용될 수 있는 Fab' 단편 등의 항체들의 “합성 라이브러리”를 만들기 위해 사용될 수 있다. 미국 특허 No. 6,300,064가 전체로서 본원 발명의 참조로 사용되었으며 108개 이상의 형질 전환체를 포함하는 합성 라이브러리를 만들기 위한 방법을 공개하고 있다.

다른 실시예에서 합성 인간 항체들은 정의된 V-유전자 요소로부터 합성에 의해서 만들어진다. 윈터(EP 0368 684 Bl)는 증폭(PCR에 의한), 클로닝, 그리고 항체의 가변 부위 유전자의 발현을 위한 방법을 제공했다. 이러한 유전자들로부터 시작해서, 그는 중사슬(heavy chain) 및/또는 경사슬(light chain)의 CDR3를 무작위함으로써 기능적 항체 단편의 라이브러리를 만드는 것이 가능했다. 이러한 프로세스는 면역 시스템에서 B-세포의 발달과정에서 발생하는 VJ 와 VDJ의 재조합의 자연적 과정과 기능적으로 대응한다. 예를 들면, 인간 생식 계열 VH 유전자 세그멘트의 레파토리는 5개의 무작위 아미노산 잔기의 합성 “D-세그멘트”과 J-세그멘트에 조인함으로써 시험관적으로 재정비될 수 있으며, 8개의 잔기로 된 3번째 합성 상보적 결정 부위를 만든다. 전체로써 본 발명의 참조로 사용된 미국 특허 No.5,885,793 은 그러한 항체 라이브러리를 만드는 방법들을 공개하여, 107 파아티 클론을 포함하는 라이브러리를 생성한다.

본 발명에 따른 항체 단편들은 분비된 가용성 항체 단편이거나 또는 세포, 배종(spore) 또는 바이러스의 표면에서 융합 단백질로 나타날 수 있다. 따라서, 예를 들면, 항체의 라이브러리는, 파아지-디스플레이 라이브러리 일 수 있으며, 여기서 하나 또는 그 이상의 항체 단편 사슬들이, 융합 단백질을 구성하는 적어도 하나의 펩타이드가 신호 펩타이드 없이 발현되는 파아지 단백질과 융합 단백질로 발현된다.

항체 단편이 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)로 구성된다면, 두 개의 사슬이 신호 펩타이드 없이 발현되는 것이 바람직하다. 이러한 점에서 숙주 스트레인은 항체 라이브러리의 발현에 적합하도록 선택되며, prlA4와 같은 변위 스트레인이 될 수 있거나, 또는 다른 목적을 위해, 예를 들면 고형질전환 주기를 나타내는 스트레인을 위해 선택된 스트레인일 수 있으며, 여기서 돌연변이 prl 단백질은 플라스미드 발현 벡터로부터 발현된다.

pIll와 pVIII 모두가 펩타이드와 항체 라이브러리를 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다. 비면역 또는 pIll에서의 나이브(naive) 항체 파아지 라이브러리의 디스플레이가 타겟 항원의 다양성에 대항한 인간 항체의 분리에 사용되어 왔다. g항체들은 scFv 또는 Fab 포맷에서 분리될 수 있으며, scFv 또는 Fab 사슬 중 하나는 파아지 프로테인의 N-말단에서 삽입된다. 이미 설명한 모든 경우에서, 신호 펩타이드는 항체-파아지 융합 단백질의 분리를 유도하기 위해 항체 사슬의 N- 말단에 주입된다. 파아지 코트의 다른 단백질들은 항체 사슬들을 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다. pVII 와 pFX 는 각각 항체 가변 중사슬 (heavy chain) 부위(VH)와 가변 경사슬(light chain) 부위(VL)를 디스플레이하기 위해 사용되어 왔다. pIX 디스플레이가, 분비를 위한 PeIB 신호 펩타이드를 사용하여 pIX의 N-말단에 scFv를 주입하는 것에 기초한 나이브(naive) 인간 항체 라이브러리를 만들기 위해, 사용되어져 왔다.(Gao et al, 2002, Proc. Natl . Acad. Sci 99: 12612). 파아지 전이의 높은 효율 때문에, 파아지-디스플레이 항체 라이브러리는 10⁹ 항체 분자 이상 또는 때때로 라이브러리당 10¹⁰ 이나 10¹¹ 이상의 항체의 다양성을 갖는 정도로 커질 수 있다.

몇몇 실시예에서, 라이브러리는, 2005년 1월 20일 출원되고, 전체로서 본 발명의 참조로 사용된 미국 특허 출원 No. 11/040,159에 기술된 바와 같이, 에피토프-포커스트(epitope-focused) 인간 항체의 라이브러리일 수 있다. 예를 들면, 그러한 라이브러리는 다양한 종류의 중사슬 V 세그멘트를 인코드하는 복수의 핵산으로 구성될 수 있으며, V 세그멘트는 CDR3와 링크되어 있지 않다. 본 발명은 V 세그멘트가 CDR3에 링크되어 있지 않은, 다양한 종류의 경사슬(light chain) V 세그멘트를 인코드하는 핵산으로 구성된 라이브러리를 제공한다. 각각의 또는 모든 라이브러리의 V 세그멘트는, 즉,인간 생식 계열일수 있다. 에피토프-포커스트(epitope-focused) 인간 항체의 라이브러리는 라이브러리당 103 내지 105 항체의 사이즈 범위일 수 있다.

항체 라이브러리는 주로 VH 또는 VK 유전자 세그멘트의 하나 또는 그 이상의 서브 클래스의 멤버를 구성한다. 따라서, 예를 들면, 인간에 있어서 7개의 알려진 VH-서브 클래스(VHl - VH7)와 16개의 VL 서브 클래스(Vkappal - Vkappaδ 와 Vlambdal-VlambdalO)가 있고, 집중을 받는 라이브러리는 Vkappa 사슬들 또는 Vlambda 경사슬(light chain)의 다양한 라이브러리와 조합된 하나 또는 그 이상의 VH-서브 클래스의 멤버를 구성하는 것으로 만들어진다. 선택적으로, 집중을 받는 하나 또는 그 이상의 VL 서브 클래스는 H사슬의 다양한 라이브러리와 조합될 수 있다. 좀더 선택적으로, 집중을 받는 라이브러리는 단순 VL 서브클래스와 단순 VH 서브-클래스의 멤버들로 주로 구성되도록 만들어질 수 있다. VH3 서브 클래스의 항체 단편은, 신호 의존 형식으로 발현될 때, 전형적으로 대장균(E. coli)내에서 효율적으로 발현된다. 다른 VH 서브 클래스의 항체들은 신호 펩타이드를 사용하여 효율적으로 분비되지 않는다. 유사하게, 뮤린 V-부위를 가진 항체 단편들은 신호 펩타이드를 사용하여 약하게 분비된다. 본 발명은 다른 서브 클래스의 분비된 항체의 표현을 개선하는 것을 가능하게 하며, 뮤린 V-부위를 구성하는 항체 라이브러리의 효율적 분비를 가능하게 한다.

다른 실시예에서, 본 발명은, V-부위 쌍이 i) 인간 V 절편을 구성하는 선별되지 않는 중사슬(heavy chain)과 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 중사슬(heavy chain) CDR3, II)인간 V 세그멘트를 구성하는 선별되지 않은 경사슬(light chain) V-부위와 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 경사슬(light chain) CDR3일 때, 인간 항체 V-부위의 다양성을 구성하는 라이브러리를 제공한다.

다른 실시예에서, 라이브러리는 인간 항체 V-부위 쌍을 인코딩하는 핵산으로 구성된 라이브러리이며, VH와 VL V 세그멘트는 각각 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 MEBSD와 연결된다.

본 발명의 라이브러리는 또한 다수의 VH 또는 VL 부위를 인코딩하는 핵산으로 구성될 수 있으며, VH 또는 VL 부위는 하나의 VH 또는 VL 서브클래스로부터의 V 세그멘트로 구성되고, 여기서 V 부위는 D 및/또는 J 세그멘트가 부족하다. 일 실시예에서, VH 부위의 V 세그멘트는 생식 계열이거나/또는 VL 부위의 V 절편은 생식계열이다.

본 발명은 다수의 항체 V 부위 쌍으로 구성된 라이브러리를 제공하며, 여기서 쌍은 i)여러 가지 V 세그멘트에 조인된 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 중사슬 CDR3로부터 결합특이성 결정자 BSD로 구성되는 중사슬 V 부위, ii) 여러 가지 V 세그멘트에 조인된 레퍼런스 항체(reference antibody)로부터의 경사슬(light chain) CDR3로부터 결합특이성 결정자 BSD로 구성되는 경사슬(light chain) V 부위이다.

다중체 단백질들(MULTIMERIC PROTEINS)

안정한 콤플렉스를 형성하기 위한 다중체 단백질의 폴리펩타이드 서브 유니트의 적절한 어셈블리가 다중체 단백질의 생물학적 기능을 확실하게 하기 위해 필요하다. 본 발명의 일 실시예는, 발현, 분비와 선택된 모노머릭 폴리펩타이드의 어셈블리가 사이토플라즘의 외부의 이형다중체(heteromultimer)의 효율적 생산에 영향을 주는 것을 가능하게 한다. 다중체 단백질의 하나 또는 그 이상의 모노머 폴리펩타이드는, 본 발명의 방법에서 신호 서열없이 만들어 질 수 있고, 다른 모노머 폴리펩타이드들은 신호 서열(들)이 있거나, 또는 없을 때에 발현될 수 있다. 본 발명에 의해 생산될 수 있는 어셈블된 다중체 단백질은 항체들, 항체 단편들 또는 항체 관련 폴리펩타이드들을 포함한다.

핵산(NUCLEIC ACIDS)

본 발명의 방법들에 유용한 핵산 서열, 즉, 적어도 일부에서, 개별 펩타이드들, 폴리펩타이드들, 본 발명의 방법으로 분비된 단백질들, 또는 본 발명의 라이브러리를 구성하거나 발현된 것들은 자연적, 합성적이거나 또는 그들의 조합일 수 있다. 이들은 mRNA, DNA 또는 cDNA 일수 있다. 바람직한 실시예에서, 핵산은 항체들을 인코드한다.

재조합 DNA 방법은 효소분해반응(enzymatic digestion)에 위해서는 만들어질 수 없는 항체 단편을 만들기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 항체라는 용어는, 지금까지 사용된 것과 같이, 전체 항체의 변형에 의해 만들어지거나, 또는 재조합 DNA 방법(즉, 단일 사슬 Fv)을 사용하여 처음부터 합성되거나, 또는 파아지 디스플레이 라이브러리{참조, 예 McCafferty et al, 1990, Nature 348:552-554)를 사용하여 동정된 것을 포함한다.

본원 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은, 재조합 유전학 분야의 일반적인 기술을 사용하여 얻어질 수 있다.{참조, 예, Sambrook and Russell, eds, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Ausubel, ed., 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York).

자주, 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은, 프로브(probe)와의 교배(hybridization)에 의한 cDNA 또는 게노믹 DNA 라이브러리로부터 클로닝되거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머와의 증폭 기술에 의해 동정된다. 증폭 기술은 DNA 또는 RNA 로부터 서열을 증폭, 동정하기 위해 사용될 수 있다 {참조, 예, Dieffenbach & Dveksler, 1995, PCR Primers: A Laboratory Manual). 선택적으로, 중첩 올리고뉴클레오티드는 합성적으로 만들어질 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 도메인을 만들기 위해 결합될 수 있다. 컴포넌트 도메인을 인코딩하는 핵산은 프로브(probe)로서 항체를 사용하여 발현 라이브러리로부터 동정될 수 있다.

PCR을 사용하여 본원 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 얻는 예에서, 핵산 서열 또는 서브 서열들은, 하나의 제한 사이트(restriction site)를 포함하는 센스 프라이머와 다른 제한 사이트를 포함하는 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR 증폭된다. 이것은 원하는 폴리펩타이드를 인코딩하고 말단 제한 사이트를 가진 핵산을 생산할 것이다. 이러한 핵산은 적절한 상응 제한 사이트를 가진 벡터로 쉽게 결찰(ligate)된다. 원하는 폴리펩타이드가 융합 단백질일 경우, 도메인은 직접적으로 결합하거나, 링커, 또는 다른 단백질 서열에 위해 분리될 수 있다. 적절할 PCR 프라이머는 GenBank 나 다른 소스에서 제공된 서열 정보를 사용하여, 당업자에 위해 정해질 수 있다. 적절한 제한 사이트(restriction site)는 단백질 또는 사이트 유도 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의한 단백질 서열을 인코딩하는 핵산에 첨가될 수 있다. 본 발명의 서열을 인코딩하는 폴리펩타이드를 포함하는 플라스미드는 적절한 제한 엔도뉴클레아제(restriction endonuclease)에 의해 절단되고, 그후, 기본 방법에 따른 증폭 및/또는 발현을 위한 적절한 벡터로 결찰(ligate)된다.

시험관 증폭 방법(in vitro amplification methods)에 익숙한 당업자를 유도하기에 충분한 기술들의 예들은 미국 특허 U.S. Patent No. 4,683,202뿐만 아니라 Berger, Sambrook, and Ausubel,에 기술되어 있으며, 이들은 전체로서 본원의 참조로 사용되었다. ; Innis et al, eds, 1990, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, CA; Arnheim & Levinson, 1990, C&EN 36-47, The Journal Of NIH Research 3: 81-94; Kwoh et al , 1989, Proc . Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al, 1990, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87, 1874; Lomell et al., 1989, J. Clin . Chem ., 35: 1826; Landegren et al, 1988, Science 241: 1077-1080; Van Brunt, 1990, Biotechnology 8: 291-294; Wu and Wallace, 1989, Gene 4: 560; and Barringer et al, 1990, Gene 89: 117.

몇몇 실시예에서는 본 발명의 폴리펩타이드를 변형하는 것이 바람직하다. 당업자는 주어진 핵산 구조에서 변형을 일으키는 많은 방법에 대해 알고 있을 것이다. 이러한 잘 알려진 방법은 사이트 유도 돌연변이(site-directed mutagenesis), 퇴화 올리고뉴클레오티드(degenerate oligonucleotides)를 사용한 PCR 증폭, 핵산을 함유한 세포를 돌연변이 유발자 또는 방사선에 노출, 원하는 올리고 뉴클레오티드의 화학적 합성(예를 들면, 거대한 핵산을 생산하기 위한 주합 및/또는 클로닝의 접속) 및 다른 잘 알려진 기술들이 있다. 참조예 Giliman and Smith, 1979, Gene 8:81-97, Roberts et al, 1987, Nature 328: 731-734.

몇몇 실시예에서, 본원 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 핵산은 선택된 생물체 내에서 핵산의 번역을 증가시키는 바람직한 코돈을 제공하기 위해 변형된다.(예 이스트 선호 코돈은 이스트에서의 발현을 위해 코딩 핵산으로 치환된다.)

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한, 실질적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드는 적어도 80%, 전형적으로는 적어도 90%, 더욱 전형적으로는 적어도 95% 이상 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 가질 수 있다. 본 발명은 적어도 80%, 전형적으로는 적어도 90%, 더욱 전형적으로는 적어도 95% 이상 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 서열 일치성을 갖는 뉴클레오티드서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 구성을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA(게놈의, cDNA, 증폭되거나 또는 합성된) 또는 RNA가 될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 얻는 방법과 알고리즘은 당업자에게는 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 원하는 서열 아이덴티티를 가진 폴리뉴클레오티드를 정기적으로 동정할 수 있는 하이브리디제이션 콘디션(hybridization conditions)을 결정하는 방법을 포함할 수 있다.

본 발명에서 유용한 핵산은 자연적으로 다양할 수 있으며, 합성적으로 다양성은 상기 자연적으로 다양한 멤버들(naturally diverse members)에 도입되거나, 또는 다양성이 전체적으로 합성에 의한 것일 수 있다. 예를 들면, 합성에 의한 다양성은 하나 또는 그 이상의 항체 유전자의 CDR에 도입될 수 있다. 바람직하게 이것은 면역글로블린의 CDR1과 CDR2에 도입된다. 바람직하게 자연적 다양성은 본 발명의 B 세포로부터의 면역글로블린 유전자의 CDR3 부위에 캡쳐된다. 가장 바람직하게 본 발명의 핵산은 CDR1 과 CDR2 중 적어도 하나, 좀더 바람직하게는 양쪽 모두에서의 합성 다양성과 B 세포로부터 캡쳐된 CDR3에서의 다양성으로 구성된 면역글로블린 유전자의 다수로 구성된다.

본 발명에 따른 단백질 유사체(protein analogs)를 인코드하고 있는 핵산(하나 또는 그 이상의 아미노산이 와일드 타입 폴리펩타이드와 다르도록 디자인된)은 사이트 유도 돌연변이(site-directed mutagenesis) 또는 프라이머가 원하는 포인트 돌연변이를 가지는 PCR 증폭을 사용하여 만들어질 수 있다. 적절한 돌연변이 유발 기술의 좀더 자세한 설명을 위해서는 Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. and/or Ausubel et al, editors, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, N. Y.를 참조한다. Engels et al, 1989, in Angew . Client . Intl . Ed., Volume 28, pages 716-734에 기술된 방법을 사용한 화학 합성은 이러한 핵산을 준비하기 위해 사용될 수 있다.

“재조합 다양성(Recombinant variant)”은 아미노산 삽입, 삭제와 치환에 의해서 자연적으로 발생하는 폴리펩타이드와 다른 어떠한 폴리펩타이드라도 가리키며, 이는 재조합 DNA 기술에 의해 만들어진다. 활성, 효소 또는 결합 활성과 같은 관심이 있는 활성 등에 영향을 주지 않으면서도, 어떠한 아미노산 잔기가 치환되고, 첨가되거나 또는 삭제될 것인지를 결정하는 것에 대한 가이드는 특정 폴리펩타이드의 서열을 동형 펩타이드와 비교하고, 함으로써 발견할 수 있고, 고동형(high homology)부위에서 만들어지는 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 발견될 수 있다.

바람직하게, 아미노산 “치환체”는 하나의 아미노산을 유사한 구조 및/또는 화학적 특징을 갖는 다른 아미노산과 바꾼, 즉, 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacements.)의 결과이다. 아미노산 치환체는 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 포함된 잔기의 양친매성(amphipathic)등의 유사성에 기반을 두고 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성)아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판과 메티오닌을 포함하며; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 테오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진과 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된(염기의) 아미노산은 아르기닌, 리신과 히스티딘; 음으로 하전된(산성의) 아미노산은 아스파틱산과 글루타믹산을 포함한다.

“삽입” 또는 “삭제”는 일반적으로 1 내지 5개의 아미노산의 범위이다. 허용되는 변위는 재조합 DNA 기술을 사용하여 폴리펩타이드에 시스템적으로 만들어진 삽입, 삭제 또는 치환과 얻어진 재조합 변수들의 활성을 분석함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.

선택적으로, 기능의 변화가 필요할 경우 삽입, 제거 또는 비 보존적 변화가, 변화된 폴리펩타이드 또는 잡종(chimeric)의 폴리펩타이드를 만들기 위해, 꾀하여 질 수 있다. 그러한 변화는, 예를 들면, 본원 발명의 폴리펩타이드의 하나 또는 그 이상의 생물학적 기능 또는 생화학적 특징을 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 그러한 변화는 리간드 결합 친화성(ligand-binding affinities), 사슬간 친화성(interchain affinities,) 또는 퇴화/전복 비율과 같은 폴리펩타이드의 특징을 변화시킬 수 있다. 게다가, 그러한 변화들은, 발현을 위해서 선택된 세포 안에서, 발현, 스케일 업 및 그 유사한 것을 위해 더욱 적합한 폴리펩타이드를 생산하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기는 이황화 결합을 제거하기 위해 제거되거나 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.

선택적으로, 이런 동일하거나 유사한 폴리펩타이드를 인코딩하는 재조합 변수(recombinant variants)는 유전자 코드에서 잉여물(redundancy)을 사용함으로써 합성되거나 선택될 수 있다. 여러 제한 사이트를 만드는 조용한 변화(silent changes)와 같은 다양한 코돈 치환체들이, 플라스미드 또는 바이러스 벡터로의 클로닝 또는 특정한 원핵 시스템 또는 진핵 시스템에서의 발현을 최적화하기 위해 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이는 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드의 어느 부위라도 변형시키기 위해, 또는 리간드 결합 친화성, 사슬간 친화성 또는 퇴화/전복 속도와 같은 특징을 변화시키기 위해 폴리펩타이드에 첨가된 다른 펩타이드의 도메인에서 검출될 수 있다.

본 발명의 핵산 서열은 앞서 설명한 핵산의 변이들을 인코드하고 있는 서열들로 더욱 유도된다. 이러한 아미노산 서열 변이는 업계에 알려진 방법에 의해 적절한 뉴클레오티드의 변화를 자연적인 또는 변위적인 폴리뉴클레오티드로 도입함으로써 준비될 수 있다. 아미노산 서열의 변이를 만드는 데에는 변위의 위치와 변위의 성질이라는 2가지 변수가 있다. 핵산의 아미노산 서열 변위는, 자연적으로는 만들어지지 않는 아미노산 서열을 만들기 위해 폴리뉴클레오티드를 변형시킴으로써 유도된다. 이러한 아미노산 변화는 다른 종(다양한 위치)으로부터의 핵산 또는 잘 보존된 부위(정상부위)의 핵산에서 다른 사이트에서 만들어질 수 있다. 그러한 위치의 사이트는 일반적으로 시리즈로, 즉 보수적 방법(예를 들면 소수성 아미노산을 다른 소수성 아미노산으로)에 위해 첫 번째를 치환하고, 그리고 나서 좀더 다른 방법(예를 들면 소수성 아미노산을 하전된 아미노산으로), 그리고 타겟 사이트에서 절단 또는 삽입이 만들어질 수 있다.

아미노산 서열 절단 부위은 일반적으로 1 내지 30개 잔기의 범위이며 바람직하게는 1 내지 10개 잔기의 범위이고, 일반적으로는 인접해 있다. 아미노산 삽입은, 하나에서부터 수백개의 또는 그 이상의 잔기를 가지는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합, 또는 하나 또는 복수개의 아미노산 잔기의 서열내의 삽입을 포함한다. 서열내의 삽입은 일반적으로 1에서 10개의 아미노 잔기들이며, 바람직하게는 1에서 5개의 잔기이다. 말단 삽입의 예에는 다른 숙주 세포에서의 세포내 타겟을 위해 필요한 이형 신호 서열을 포함한다.

바람직한 방법으로, 새로운 핵산을 인코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드는, 사이트 유도 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해서 변화한다. 이러한 방법은 원하는 아미노산 변이의 폴리뉴클레오티드 서열을 인코드하는 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하고, 또한 상기 바뀐 아미노산의 양 사이드에 있는 주변의 많은 뉴클레오티드를 이용하여 변화되는 사이트의 양쪽으로 안정한 듀플렉스(duplex)를 만든다. 일반적으로, 사이트 유도 돌연변이(site-directed mutagenesis)는 당업자에게는 잘 알려져 있으며, 이러한 기술은, 예를 들면 Edelman et al, 1983, DNA 2:183에 예로 사용되고 있다. 폴리뉴클레오티드 서열에서의 사이트 특정 변화를 만들기 위한 훌륭하고 효율적인 방법들은 Zoller and Smith, 1982,Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 에 의해 공개되었다.

PCR이 새로운 핵산의 아미노산 서열 변위를 일으키기 위해 사용될 수 있다. 주형 DNA의 소량이 출발 물질로서 사용될 경우, 주형 DNA의 대응 부위로부터의 서열과 약간 다른 프라이머가 원하는 아미노산 변이를 만들 수 있다. PCR 증폭은 프라이머에 의해 특정된 위치에서의 콜라겐을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 주형과는 다른 생산된 DNA 단편의 양으로 결론지어진다. 생산된 DNA 단편은 플라스미스에서의 대응 부위를 치환하고, 원하는 아미노산 변이를 일으키게 된다.

아미노산 변이를 일으키기 위한 다른 기술은 Wells et al, 1985, Gene 34:315에 기술된 카세트 돌연변이 유발 기술이며; 다른 돌연변이 유발 기술은, 예를 들면, the techniques in Sambrook et al , supra , and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al등에서 잘 알려져 있다.

암호 코드의 본질적 퇴화에 의해, 실질적으로 동일하거나 기능적으로 상응하는 아미노산 서열을 인코드하는 다른 DNA 서열들은, 클로닝과 이러한 새로운 핵산의 발현을 위해서 본원 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 DNA 서열들은 긴박한 상황에서 적절한 새로운 핵산 서열과 하이브리드 될 수 있는 것을 포함한다. 게다가, 본원 발명의 폴리펩타이드의 것과 동일한 아미노 산 서열을 인코딩하지만 암호 코드의 본질적 퇴화에 의해 매우 다른 핵산 서열을 갖는 핵산들도 본원 발명에 포함된다.

숙주 세포들(HOST CELLS )

본원 발명은 다른 한편으로, 항체들 또는 항원 결합 항체 단편 또는 신호 펩타이드가 필요하지 않은 다중체 단백질의 분비를 허용하는 원핵 숙주 세포를 제공한다. 본원 발명의 사용에 적합한 스트레인(strain)은 일반적으로 증가된 투과성을 갖는 것이 아니라, 본원 발명의 항체와 항체 단편을 포함하는 분비를 위해 자연적으로 정해진 단백질을 선택적으로 분비한다. 바람직한 실시예에서, 원핵세포는 바람직하게는 그램-음성 박테리아이며, 가장 바람직하게는 박테리아 대장균(E. coli) 이다.

그램-음성 박테리아에서 사이토플라즘으로부터 페리플라즘으로 또는 안과 바깥의 멤브레인을 모두 통한 단백질의 분비를 위한 다양한 경로가 기술되어 있으며, 전통적으로 4개의 다른 시스템으로 나뉘어진다. 타입 III와 타입 IV 시스템은 일반적으로 박테리아 단백질을 주변 진행 숙주세포로 직접 전달하기 위해 사용된다. 타입 I 시스템은 “터널(tunnel)”을 형성하며, 이는 안과 바깥의 멤브레인을 연결하여, 이 경로에 의해 배출된 항체와 같은 단백질을 세포 외의 미디엄(extracelluar medium)으로 바로 분비한다. 타입 II 분비 시스템은, 일반적 분비 경로 또는 Sec 경로로 알려져 있으며, 안쪽 멤브레인을 통해서 페리플라즘으로 분비되는 단백질의 대다수의 분비를 책임지고 있다. 추가적 분비 시스템은, 단백질을 페리플라즘으로 직접 분비하기 위해 특정 N-말단 신호 펩타이드를 사용하며, 2개의 알긴 전좌 경로(the twin-arginine translocation (TAT) pathway)이다. 느슨하게 폴딩된 단백질(loosely folded protein)을 단백질 어셈블리가 일어나는 페리플라즘으로 분비하는 Sec 시스템과는 대비되게, TAT 경로는 이미 폴딩된 효소들의 분비를 위해서 사용된다(Berks et al, 2005, Current Opinion 8: 174-181 리뷰).

타입 II 분비 시스템은 대장균(E.coli)로부터 재조합 단백질의 분비를 위해 보편적으로 사용되어온 시스템이다. 본원 발명의 실시예에서, 숙주세포는 타입 II 또는 Sec 경로상의 돌연변이를 포함한다. 짧은 N-말단 신호 서열을 재조합 단백질에 추가하는 것은 재조합 단백질을 상기 분비 경로로 유도하는 역할을 하고, 신호 펩타이드는 분비 프로세스 중에 제거된다. 경로는 이 경로를 통해 자연적으로 분비된 박테리아 단백질로부터의 신호 서열에 의해 유도되며, OmpA, PeIB 및 PhoA를 포함하는 Fab 단편과 같은 항체 단편을 발현하기 위해 사용되어 왔다. 항체 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain) 은 항원 결합 Fab 단편을 만들기 위해 페리플라즘에서 어셈블 되는 것으로 알려져 있다{e.g., Skerra and Pluckthun, 1991, Protein Eng. 4: 971-979).

Sec 경로에서의 전위 기구는 잘 연구된 효소 복합체, 트랜스로케이스(translocase)이며, 이들은 전위를 위한 에너지를 공급하기 위해 수개의 필수 멤브레인 단백질과 연관된 ATPase를 구성한다(Fekkes and Driessen, 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 63: 161-173; van der WoIk et al, 1998, EMBO J. 17: 3631-3639에서 리뷰). 효소 복합체의 코아는 멤브레인에 임베디드된, SecY, SecE 및 SecG 단백질로 구성된 이형삼합체(the SecYEG complex) 및 주변 동형 이합체 ATPase SecA로 구성된다. SecD, SecF 및 YajC 단백질은 상기 the SecYEG 콤플렉스와 연과되어 완전한 트랜스로케이스(translocase)를 형성하는 별도의 이형삼합체 콤플렉스(heterotrimeric complex)를 형성한다.

새롭게 합성된 프리커서 단백질은 샤프롱 SecB 에 의해 결합되어 있으며, 전위를 위한 느슨하게 폴딩된 구조 컴피턴트(conformation competent)에서 단백질 전구체(pre-protein)을 안정화한다. SecB와 신호 서열은 단백질 전구체(pre-protein)을 멤브레인으로 이끌고, 이들 두 개 모두는, SecYEG 콤플렉스의 서브 유니트인 SecY 에 대한 높은 친화성을 가지고 결합된, SecA와 연관된다. SecB-SecA 상호작용의 결과, 단백질 전구체(pre-protein)은 SecA로 전이되며, 이는 신호 서열과 성숙(mature) 도메인 모두와 결합한다. 멤브레인으로부터 SecB의 방출은 SecA의 ATO 결합 사이트 2개 중 하나에서 ATP의 결합을 필요로 한다. 이 단계에서 신호 서열의 루프와 단백질 전구체(pre-protein)의 N-말단 부위는 멤브레인의 페리플라즘 표면에 나타나며, 리더 펩티다아제에 의한 신호 서열의 절단을 허용한다.

단백질 전구체(pre-protein)의 N 말단 신호 서열은 최초 타겟팅, SecA에 의한 단백질 전구체(pre-protein)의 인식(recognition)을 위해 중요하다고 생각된다. 비정상적 신호 서열은 전위의 부족으로 이어지는 트랜스로케이스(translocase)에 의해 효율적으로 인식되지 못한다.

타입 I 분비 시스템은 대장균(E.coli)로부터 이종 단백질의 직접적 분비를 위해 이미 사용되어 왔다. 본원 발명의 실시예에서, 숙주 세포는 타입 I 분비 시스템에서의 돌연변이를 포함한다. 타입 I 경로의 구성 요소에 의해 인식되는 분비 신호는 분비된 단백질의 카르복시 말단에 위치하며, 대부분의 경우, 분비 신호는 분비 중이나 후에 절단되지 않는다. 타입 I 분비 경로에 의해 분비되고 성질이 잘 알려진 대장균(E. coli) 단백질은 알파-헤모리신이다. 상기 단백질로부터의 신호 서열은 헤모리신의 C-말단을 scFV 코딩 부위의 C-말단에 융합한 a scFv 항체를 포함하는 다수의 이종단백질의 직접적 분비를 위해 사용되어 왔다 (Fernandez and Lorenzo, 2001, MoI . Microbiology 40: 332-346). 이 경우 C-말단 헤모리신 신호 펩타이드는 분비된 프로덕트에 보유된다.

Sec 시스템 구성요소의 몇몇 돌연변이들이, 신호 서열이 부족하거나 없는 상태에서 정상적으로 분비된 대장균(E. coli) 단백질의 효율적 분비를 허용하는 것이 알려져 있다. 그러한 단백질 위치 변이(protein localization mutation, prl )는, 예를 들면, SecY (prlA), SecE (prlG), SecG (prlH) and SecA (prlD) (Bost and Belin, 1997, J. Biol Chem. 272:4087-93, 전체로서 본원 발명의 참조로 사용됨)과 같은 Sec 시스템의 복수 구성요소에서 밝혀졌다.

prl 돌연변이가 신호 펩타이드가 전혀 없는 상태에서 몇몇 자연적으로 분비된 대장균(E. coli) 단백질의 분비를 도울 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 신호 펩타이드가 부족한 대장균(E. coli) 말토스 결합 단백질과 알라린 포스파타아제는 prl A 돌연변이로부터 분비된다 (Derman et al, 1993, EMBO J. 12: 879). 박테리오파아지 단백질 LamB는 prlA 돌연변이에서 신호서열 없이 분비될 수 있다. (Flower et al, 1994, J Bacteriol 176: 18). 그러나, 진핵 세포 단백질과 같은 이종 단백질은 신호 서열없이 prl 스트레인으로부터 분비된다는 것이 전부터 알려져 있지 않다. Wong et al., 1988, Gene 68: 193) 은 the LamB 또는 OmpF 유전자로부터의 신호 서열을 사용하여 인슐린 유사 성장 팩터-1(insulin-like growth factor-1)을 대장균(E.coli)으로부터의 분비를 성공했고, LamB-IGF-1과 OmpF-IGF-1의 처리 효율(processing efficiency)이 prlA4 돌연변이를 가지고 있는 스트레인 내에서 더욱 증가된다는 것을 보였다. OmpA, PhoA, 또는 OmpF 신호 서열들에 융합된 인간 CD4 는 prlA 돌연변이에서 효율적으로 발현한다는 것이 알려져 있다(Rockenbach et al, 1991, Appl Microbiol Biotechnol . 35:32-7). SecY 돌연변이의 단백질의 플라스미드 벡터에서의 과발현이 대장균(E. coli)으로부터 인간 단백질의 발현을 증가시키기 위해 연구되어 왔다. 따라서 secE 와 함께 prlA4 돌연변이 SecY 단백질의 과발현은 OmpA 신호 펩타이드에 삽입된 인간 IL-6의 분비를 증가시킨다. (Perez-Perez et al, 199 A, BioTechnology 12: 178).

prl A 스트레인이 pill 신호 펩타이들 사용하는 선형 파아지(filamentous phage)fd 의 표면에서 디스플레이되는 펩타이드의 다양성을 증가시키고(Peters et al, 1994, J. Bacteriol. 176: 4296), PhoA 신호 펩타이드로부터 파아지 융합 단백질로서 보빈 췌장 트립신 저해자(bovine pancreatic trypsin inhibitor)를 발현시키기 위해(US Patent No. 5,223,409, 전체로서 본원 발명에서 참조로 삽입됨; Ladner et al.) 사용되어져 왔다. 따라서, prl A 돌연변이 단백질은 신호-펩타이드-의존 방법에 의해 발현된 특정 진핵 단백질의 발현을 용이하게 할 수 있다. .

세포로부터 일반적으로 분비된 단백질들은, 대장균(E. coli ) 내에서 신호 서열없이 재조합적으로 발현될 때, 불용성 세포함유물(insoluble inclusion bodies)을 자주 형성한다. 예를 들면, 항체 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain) 또는 항체 단편을 인코딩하는 유전자들은 대장균(E. coli) 내에서 신호 서열없이 발현되어 왔고, 생산된 단백질은 일반적으로 세포 내에서 불용성 세포함유물로 축적된다(Boss et al, 1984, Nucl. Acids Res 12: 3791; Cabilly et al , 1984 Proc . Natl Acad . Ssi USA 81:3273). 그러한 단백질은 사이토플라즈믹 멤브레인을 통한 수송(transport)에는 적당하지 않으며, 기능성 단백질을 형성하지 않는다. 세포 함유물로부터의 항체 단편의 재-폴딩을 위한 방법이 미국 특허 6,331,415 과 4,816,567에 나와 있다. 그러나, 항체를 생성하기 위한 그러한 방법들은 비효율적이고, 기능성 항체의 낮은 수율을 보이며, 라이브러리 스크리닝 목적을 위해서는 사용될 수 없다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 원핵 숙주 세포는 분비 기구의 하나 또는 그 이상의 요소에서 인코드된 신호 펩타이드 없이 항체의 분비를 허용하는 prl 돌연변이를 포함한다. prl 돌연변이는 신호없는 모노머 단백질의 분비를 허용하는 돌연변이며, Sec Y, SecA, SecE or SecG 유전자 또는 다른 유전자들의 활성에 영향을 주는 돌연변이를 구성한다. prl 돌연변이는 또한 신호 펩타이드로 신호-독립적인 방법으로 인코드된 단백질의 분비를 허용한다. 발명의 일 실시예는 항체 펩타이드를 신호서열에 의해 prl 돌연변이가 있는 숙주 스트레인에서 분비하는 것과 항체의 어셈블리를 기능적 다중체 단백질로 구성하는 것으로 구성된다. 이러한 것은 분비와 사슬 어셈블리가 밀접하게 관련되어 있다고 생각되기 때문에 기대하지 않았던 결과이다. 다른 실시예는 prl 돌연변이를 가진 숙주 스트레인에서 신호 서열이 부족한 폴리펩타이드의 분비로 구성된다. 바람직하게 prl 돌연변이는 SecY (prlA) 또는 SecE (prl G)에서의 돌연변이로 구성된다. 가장 바람직하게 prl 돌연변이는 prl A 4 돌연변이 스트레인 같은 SecY에서의 돌연변이로 구성된다(Emr and Bassford, 1982, J. Biol Chem 257: 5852-5860). prl A4 대립 유전자는 SecY에서 두 개의 미스센스 돌연변이(missense mutations)를 포함하며, 이는 아미노산 치환 F286Y 과 I408N로 된다. 가장 바람직하게, prl A4 돌연변이는 적어도 SecY에서의 I408N 돌연변이이다. prl A4 돌연변이 SecY 단백질의 서열은 도 1에 나타내었다.

prl 돌연변이는, 예를 들면 대장균(E. coli)의 prl A4 돌연변이와 같은, 숙주 스트레인의 염색체에서의 prl 돌연변이를 포함할 수 있다. 선택적으로, prl 돌연변이는 돌연변이 Sec 유전자의 추가적 카피의 과발현, 예를 들면 플라스미드-베이스 발현 벡터의 발현에 의하여 유도된다. 따라서, 예를 들면, prl 돌연변이는 플라스미드에서 발현되는 SecY 또는 SecE 돌연변이 유전자로 구성된다. 그러한 플라스미드는, 신호 서열 없이, 원하는 시간에만 폴리펩타이드의 분비 유도를 허용하는 보존적이거나 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)를 사용하여 만들어질 수 있다. 대장균(E. coli)에서의 발현을 조절하기 위한 방법은 관련 업계에 잘 알려져 있으며, IPTG 에 의해 유도될 수 있는 lac, trc, 또는 tac 프로모터와 아라비노오즈-유도성 프로모터(arabinose-inducible promoter)와 같은 유도성 프로모터의 사용을 포함한다. Sec 유전자 돌연변이는 대장균(E. coli)으로부터의 또는 다른 그램-음성 박테리아로부터의 Sec 유전자 돌연변이일 수 있다. 따라서, 예를 들면, SecY의 prl A4 돌연변이 형태는 신호 펩타이드 없이 발현되는 Fab 단편의 분비를 허용하기 위해서 대장균(E. coli) 숙주세포에서의 플라스미드로부터 발현된다.

숙주 세포는 W3110과 같은 와일드 타입 대장균(E. coli) 이거나 다른 대장균(E. coli)의 스트레인이 될 수 있다. 적절한 숙주 스트레인은 TOPlO, DH5, DH5α, 오리가미(Origami) 및 HBlOl을 포함한다. 숙주 세포는 이종 단백질의 폴딩, 어셈블리와 분비에 영향을 주는 다른 샤프롱(chaperones)과 유전자에서의 돌연변이를 제공하기 위해 선택될 수 있다. 박테리아 DnaK 와 GroE 시스템과 같은 분자 샤프롱(molecular chaperones)의 조합은 샤프롱(chaperones)과 상호작용하지만 적당히 폴딩하지는 못하는 단백질의 리폴딩(refolding)을 증가시킬 수 있다(Buchberger, A., Schroder, H., Hesterkamp, T., Schonfeld, H. J., and Bukau, B., 1996, J. Mol Biol . 261, 328-233, Petit, M. A., Bedale, W., Osipiuk, J., Lu, C, Rajagopalan, M., Mclnerney, P., Goodman, M. F., Echols, H., 1994, J. Biol. Chem . 269, 23824-23829). DnaK 는 또한 새롭게 합성된 단백질의 폴딩에 있어서 트리거 팩터(Trigger Factor)와 상호작용한다.

본 발명의 라이브러리 실시예는, 여러 기능적 분석법에서 항체 단변의 스크리닝을 위한 분비를 허용하기 위해서, prl 돌연변이 스트레인에서 발현될 수 있다. 동일한 벡터가 항체 분자의 리-엔지니어 필요없이, 사이토플라즘에서의 발현을 위해 선택적인 스트레인에서도 발현될 수 있다. 세포내의 발현은, 예를 들면, 이황화 결합 형태를 허용하는 산화 사이토플라즘을 제공하기 위해 trxB gor 돌연변이를 사용하는, 항체 단편의 효율적인 생산을 위해 사용될 수 있다. 적절하게 폴딩되고 어셈블된 Fab 단편의 고레벨 발현은 글루타티온-옥시도리덕타아제(glutathione oxidoreductase, gor)와 티오리독신 리덕타아제(trxB)에서의 돌연변이를 가지는 대장균(E. coli)의 사이토플라즘에서 이루어질 수 있다(Venturi et al, 2002, Mol Biol. 315:1-8). 적절하게 폴딩된 항체 단편의 발현과 어셈블리는 분자 샤프롱(molecular chaperones)과 함께 발현되는 것을 사용하여 더 증가될 수 있다(Levy et al, 2001 Protein Expr Purif. 23: 338-47; Jurado et al, 2002 J. Mol Biol . 28: 320:1-10).

본원 발명의 다른 실시예는 두번째 분비 경로, 2개의 알기닌 전위(arginine translocation) 또는 TAT 경로에서의 돌연변이를 포함한다. 모든 tat-의존 신호 펩타이드들은 현재 발명에 의해 다뤄지도록 하였다. 특정한 실시예들이 phoD과 HpA 서열을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 실시예는 타입 III 분비경로로 명명되어진 세 번재 분비 경로에서의 돌연변이를 포함한다. 타입 III 분비 기구는, 인간과 동물, 식물을 위해 발병하는 다수의 그램-음성 박테리아(시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 예르시니아(Yersinia), 대장균(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 산토모나스(Xanthomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 및 에르위니아(Erwinia)의 종들의 멤버들을 포함하는)에 존재한다. 예를 들면 Sec-독립적 타입 III 분비 경로는 예르시니아 안티 호스트 단백질(Yersinia anti-host proteins)의 분비에 포함된다. 살포넬라(Salmonella)와 시겔라(Shigella) 종에서 상피 세포(epithelial cells)로 들어가는 프로세스에 포함된다. 살모넬라(S. typhimurium)와 바실러스 서틸(Bacillus subtilis)과 같은 박테리아의 편모 어셈블리 뿐만 아니라 EPEC 신호 변환성 단백질(EPEC signal transducing proteins), 녹농균 독소(Pseudomonas aeruginosa toxins), 및 많은 식물 병원균의 독성에도 포함되어 있다.

이러한 분비 경로의 특징은 박테리아가 숙주 세포와 접촉함으로써 분비의 활성화를 포함할 수 있고.(Menard et al, 1994, The secretion of the Shigella flexneri Ipa invasins is activated by epithelial cells and controlled by IpaB and IpaD, EMBO J, 13:5293-5302; Watarai et al, 1995, Contact of Shigella with host cells triggers release of Ipa invasins and is an essential function of invasiveness, EMBO J., 14:2461-2470; Zierler and Galan, 1995, Contact with cultures epithelial cells stimulates secretion of Salmonella typhimurium invasion proteins hαvJ, Infect . Immun ., 63:4024-4028); 분비된 단백질 중 몇몇은 숙주세포의 사이토플라즘으로 전해지고(Rosqvist et al, 1994, Target cell contact triggers expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells, EMBO J.,13:964-972; Sory and Cornells, 1994, translocation of an hybrid YopE-adenylate-cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells, MoI. Microbiol., 14:583-594; Wood et al, 1996, SopE, a secreted protein of Salmonella dublin, is translocated into the target eukaryotic cell via a sip-dependent mechanism and promotes bacterial entry, Mol Microbiol, 22:327-338; Collazo and Galan, 1997, The invasion-associated type III system of Salmonella typhimurium directs the translocation of Sip proteins into the host cell, Mol . Microbiol, 24:747-756), 분비된 단백질을 인코딩하는 유전자의 전사는 조절 단백질의 분비에 의해 조절된다. (Hughes et al, 1993, Sensing structural intermediates in bacterial flagellar assembly by antibody export of a negative regulator, Science, Al - 262:1277-1280; Pettersson et al, 1996, Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact, Science, 273: 1231-1233).

본 발명의 이런 측면에 대한 다른 실시예에서, 숙주 스트레인은 분비에 영향을 주는 다른 돌연변이를 위해서 선택될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 분비된 선택될만한 표지 단백질(marker protein)은 신호 펩타이드 없이 숙주세포에서 발현되고, 표지 단백질(marker protein)의 분비를 가능하게 하는 돌연변이가 선택된다. 숙주 스트레인은 돌연변이 숫자를 증가시키기 위해 돌연변이원과의 접촉하게 되거나, 또는 트랜스포슨 돌연변이 유발(transposon mutagenesis)과 같은 돌연변이를 일으키는 다른 방법이 사용될 수 있다. 적절한 표지 단백질(marker protein)은 베타-락타마제이고, 이는 암피실린과 같이 베타-락탐 항체에 저항성을 부여한다. 베타-락타마제는 신호 펩타이드 없이 발현되며, 암피실린-저항성 돌연변이(ampicillin-resistant mutants)가 선택된다. 이러한 돌연변이는 prl 돌연변이를 동정하기 위해, 신호 펩타이드가 없는 상태에서, 항체 단편과 같은 다른 단백질을 분비하는 능력을 위해 스크리닝된다. 이는 신호 서열 없이 분비를 허용하는 돌연변이는 와일드-타입(wild- type) W3110, 또는 고형질전화 빈도를 가진 스트레인 또는 다른 샤프롱 단백질에서의 돌연변이를 가진 스트레인과 같은 바람직한 대장균(E. coli ) 스트레인으로 도입될 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시예는 하나 또는 복수개의 프로테아제가 없는 돌연변이 숙주세포를 사용한다. 다른 단백질은, 미생물에 의해 일반적으로 만들어진 다른 프로테아제에 대해 다소 민감할 것이다. ompT과 degP, 프로테아제 III, La 프로테아제, CIpYQ, CIpXP 과 CIpAP 등과 같은 프로테아제가 부족한 스트레인들이 사용될 수 있다. .

본 발명은 이하에서 설명되는 실험적 설명에 의해 좀더 잘 이해될 수 있다. 그러나, 당업자는 본 발명의 논의된 특정한 방법과 결과는 뒤에 설명되는 청구항에서 좀더 자세하게 설명되는 본원 발명의 설명에 불과하다는 것을 이해할 것이다.

실시예의 특징과 목적을 보다 잘 이해하기 위해서, 첨부된 도면에 맞춰 자세하게 설명된 다음의 설명을 참조하도록 한다.

도 1은 돌연변이 F286Y 과 I408N (prl A4)로부터의 대장균(E. coli ) Sec Y 단백질 (E. coli Sec Y protein)의 아미노산 서열을 나타내며, 돌연변이된 아미노산은 굵은 밑줄로 표시되어 있다 (SEQ ID NO: 1).

도 2는 대장균(E. coli)에서 신호 펩타이드 없이 항체 단편을 위한 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)의 발현을 위해 사용되는 벡터의 플라스미드 지도(plasmid map)을 나타낸다. 상기 플라스미드는 클로람페니콜-아세틸 전달 유전자(a chloramphenicol-acetyl transferase gene)를 가지고 있으며, 클로람페티콜 및 유전자 발현을 조절하기 위한 lac 저해제를 발현하는 Lac 유전자에 저항성을 전달한다. 경사슬(light chain)과 중사슬(heavy chain)은 각각 tac 프로모터에 의해 조절되며, 발현은 락토오스 또는 IPTG에 의해 유도될 수 있다.

도 3은 플라스미드 KB5246과 형질전환된 SE6004의 페리플라즘 부분에서 어셈블된 Fab1 A8의 분비를 보여주는 웨스턴 블롯 분석(a western blot analysis ) 결과를 나타낸다. Fab 발현은 표시된 농도(μM)의 IPTG (SEQ ID NO:2)를 첨가하여 유도된다. 샘플들은 비감수분열상태(non-reducing conditions)에서 SDS-PAGE를 하였으며, Horseradish peroxidase와 접합된 항-인간 카파 특이성 항체(anti-Human Kappa specific antibody)를 사용하여 프로브되었다.

도 4는 SE6004 세포의 페리플라즘 부분에 존재하는 Fab 단편의 항체-결합 활성을 보여주는 ELISA 결과를 나타낸다. 표준 페리플라즘 추출(1150) 또는 분비를 유도하기 위한 신호 펩타이드를 가진 와일드 타입 대장균 스트레인(a wild-type E. coli strain)에서 발현된 anti-PcrV Fab 을 포함한 10배 (1150 10%) 희석용액과 대비하여, 플라스미드 KB5246로 형질전환된 세포로부터의 페리플라즘 추출물의 시리즈 희석용액 또는 추출물(5246 10%)을 10 배 희석시킨 용액을 분석하였다. PcrV 결합은 TMB 기질의 색깔을 띤 HRP-접합 항체로의 효소 전환 결과로 450 nm 에서의 흡수가 증가되는 것으로 알 수 있다.

도 5는 SE6004과 페리플라즘 추출물로부터 동정된 Top 10F‘ 세포로부터의 Fab 분비 효율의 비교를 나타낸다. Fab는 신호 펩타이드 없이 SE6004 세포(prl A)에서 나타낸 농도에서의 IPTG (SEQ ID NO:2) 유도를 사용하여 발현되었다. 발현은 와일드 타입 스트레인(a wild-type strain)(TOP10F)로부터와 같은 Fab의 신호-의존 발현과 비교되었다. 페리플라즘 추출물에 존재하는 Fab 는 항-인간 카파 감지 시약(anti-human kappa detection reagent)을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의하여 감지되었다.

도 6은 돌연변이 Sec Y의 과발현을 위한 플라스미드 KB5282 의 지도를 나타 낸다. prl A4 돌연변이 SecY 유전자는 pTrc 프로모터로부터 발현된다. NPT2 유전자는 카나마이신에 대한 저항성을 전달한다.

도 7은 와일드 타입 SecY 를 발현하는 prl A4 돌연변이 스트레인 SE6004, Top 1OF' 세포들로부터의 Fab1A8과, prl A4 돌연변이 SecY 유전자와 함께 형질전환된 DH5α세포의 분비 효율을 비교하기 위한 웨스턴 블롯 분석법이다. 미디엄으로 분비된 항체 관련 단백질은 비-디네이쳐링 SDS-PAGE(non-denaturing SDS-PAGE)로부터 항-인간 카파 항체(anti-human kappa antibody)를 사용하여 감지된다. 어셈블된 Fab 경사슬(light chain) 이합체(dimer)와 경사슬(light chain) 모노머가 배양 미디엄에서 감지되었다.

실시예 1. 신호 펩타이드 없이 인간 anti-PcrV Fab 단편의 발현 및 분비

인간 항체 1 A8의 Fab 단편은, 대장균(E. coli) 돌연변이 prl A4로부터 신호 펩타이드 없이 발현되고 분비된다. Fab 1 A8은 슈도모나스 균(Pseudomonas aeruginosa)의 PcrV 단백질 표면의 에피토프에 높은 친화성으로 특별하게 결합되고 있는 인간 항체 단편으로부터 만들어진다. 이것은 결합에 대해서 같은 에피토프로 동정되는 마우스 항체 Mabl 66과 경쟁한다(Frank et al, 2002, J Infect Dis . 186:64-73). 1A8의 경사슬(light chain) 은 VkI -kappa 경사슬(light chain) 로 구성되며, Fd 사슬은 IgGl CHl 도메인으로 삽입된 VH3 서브 클래스 V-부위이다.

Fab 1A8의 발현을 위한 신호없이 발현하는 벡터는 아래와 같이 pGEX-4T-l(GE Healthcare)로부터 유도된다. pGEX-4T-l 내의 암피실린 저항성 유전자는 AatII 과 AIwNI에 의한 소화로 제거되고, PCR 증폭에 의해 플라스미드 pACYCDuet (Novagen)으로부터 얻어진 클로람페니콜(Chloramphenicol) 저항성 유전자로 대체되어 pGEX-CAT를 형성한다. 포지션 256에서 T가 A로 변이된 포인트 돌연변이(point mutation)는 특징적인 BstllO7I 제한 사이트(restriction site)를 pGEX-CAT의 pTac 프로모터의 하류 번역개시 코돈의 바로 앞에 도입하여 만들어진다.

pGEX-CAT의 pTac 프로모터는, KB-L.벡터를 만들기 위해 다음의 프라이머를 사용하는 PCR 에 의해 Bstl lO7I 과 EcoRI 사이트 사이에 클로닝된 경사슬(light chain)을 발현하기 위해 사용된다. A T7 종결 서열은 EcoRI 사이트 앞의 프라이머 2에 조합된다.

프라이머 1: GGAAACAGTATACATGGACATCCAGTTGACCCAGTC (SEQ IDNO:4)

프라이머 2: GCCAGTGAATTCAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAATCGA

TTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC TC (SEQ ID NO:5)

상기 프라이머 쌍은 1 A8의 성숙 경사슬(mature light chain) 코딩 서열을 증폭하고 번역-개시 코돈과 상류 서열을 추가하여 Shine-Dalgarno 리보솜-결합 서열(AGGA (SEQ ID NO: 6))와 9 뉴클레오티드의 개시 코돈의 사이에 적당한 거리를 제공한다. 경사슬(light chain)의 N-말단의 예상되는 아미노산 서열(단글자 아미노산 코드)은 다음과 같다.

MDIQLTQ (SEQ ID NO:7)

Fab 1 A8의 중사슬(heavy chain) (Fd 사슬)이 PCR에 의해 3,4 프라이머를 사용하여 유사하게 클로닝되었고, KB-H 벡터를 주기 위해 pGEX-CAT 의 Bstl 1071 과 Notl 사이트 사이에 도입되었다.

프라이머 3: GGAAACAGTATACATGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 8)

프라이머 4: CACGATGCGGCCGCTTAACAAGATTTGGGCTCAACTTTC (SEQ ID NO:9)

상기 프라이머 쌍은 서열을 코딩하는 성숙 Fd 사슬을 증폭시키고, 번역-개시 코돈과 서열들을 추가해서 9개 뉴클레오티드 길이의 Shine-Dalgarno-ATG 를 공급한다. 중사슬(heavy chain) 의 N-말단의 예상되는 아미노산 서열은 다음과 같다.

MEVQLVE (SEQ ID NO: 10)

KB-H의 pTac 발현 카세트는 프라이머 4,5 를 사용한 PCR 방법에 의해 증폭되고, EcoRI 와 Notl 사이트 사이의 KB-L로 클로닝되어 KB-LH 벡터가 된다.

프라이머 5: CGATGCGAATTCGACTCTAGCGCTGTGGTATGGCT GTGCAGGTCG (SEQ ID NO: 11)

Fab 1A8의 발현을 위한 마지막 신호 없는 발현 벡터는 pUC19 (Fermentas) 의 EcoRI 과 Fspl 절편(138 뉴클레오티드)를 EcoRI과 Afel 사이트 사이의 KB-LH에 클로닝하여 2pTac 발현 카세트 사이의 스페이서를 공급하게 된다. 플라스미드 KB5246의 지도는 도 2에서 보는 바와 같다.

prlA4 변이를 포함하는 대장균 스트레인(E. coli strain) SE6004(Emr et al, 1982, J. Biol . Chem 257: 5852; Wong et al , 1988, Gene 68: 193)은 Netherlands Culture Collection of Bacteria (NCCB catalog number 2976)으로부터 얻었다.

플라스미드 KB5246는 전기천공법(electroporation)에 의해 SE6004로 도입된다. 일렉트로-컴피턴트(Electro- competent)한 세포는 분자 생물학(3^rd edition)의 Short protocol, Ausubel et al, (John Wiley and Sons Inc)에 기술된 표준 방법에 의해 준비된다. 전기 천공은 공급자의 사용방법에 따라 1.8kV 펄스와 5 ms의 상수로 a Biorad E. coli Pulser electroporation apparatus를 사용하여 진행된다. 전기천공 큐벳(Electroporation cuvettes)은 BTX로부터 준비한다. 34 μg/ml의 클로람페니콜에서 선택된 형질전환체는 2xYT 미디엄에서 배양되고 FablA8의 중사슬 (heavy chain)과 경사슬(light chain)은 이소프로필-베타-D-티오갈라토피라노사이드(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG))를 1 mM의 농도까지 사용해서 유도(induction)된다. 유도는 페리플라즘에서 Fab 발현의 분석을 위해 3시간 동안 진행되거나, 또는 미디엄으로 배포된 Fab의 분석을 위해서 16시간동안 배양된다.

사이토플라즈믹 멤브레인을 통과하여 페리플라즘으로 분비된 Fab의 분석을 위하여, 세포들은 다음과 같이 분별(fractionated)된다. 1 리터의 세포 배양액으로부터 박테리아 세포 펠렛은 10 ml의 TES 버퍼 (0.2M Tris pH 8.0, 17.12% sucrose 과 0.5mM EDTA)에 리서스펜드되고, 40C℃ 에서 15 분간 인큐베이트된다. 12.5ml 의 TES / H₂O 를 1 / 4 비율로 첨가한 후 세포 혼합액은 40℃ 에서 15 분간 더 인큐베이트된다. 세포들은 Sorvall bench-top centrifuge를 사용 7000rpm에서 15분간 원심분리되어 펠렛화되고, 부유액을 저장한다. 펠렛은 그 후 15mM Mg₂SO₄가 추가된 10ml TES 에 리서스펜드되고, 40℃에서 10 분간 배양된 후 7000rpm에서 다시 펠렛화된 후 부유액을 보유한다.

페리플라즘 추출물 10 μl 로 비-환원 조건(non-reducing conditions)에서 SDS-PAGE 를 시행하고 PVDF 멤브레인으로 옮겨져서, Horseradish peroxidase(Zymed labs)와 주합한 항-인간 카파 특이적 항체(anti-Human Kappa specific antibody)를 이용하여 웨스턴 블롯을 행하였다. 퍼록시다아제 기질 ECL 플러스(GE 헬스케어제품)가 Fab 분비를 감지하기 위해 라디오그래픽 필름에서 검출된 형광 신호를 만들기 위해 사용되었다. 도 3은 페리플라즘에서 검출된 어셈블된 1A8 Fab 의 분비를 나타낸다. 작은 분자량의 면역글로블린 관련 단백질의 작은 양도 감지될수 있다. 이러한 밴드들은 일반적으로 대장균(E. coli)의 다른 신호-의존 분비 시스템으로부터의 Fab 단편의 분비로 발견되는 경사슬(light chain) 이합체와 모노머릭 경사슬 (light chain)의 분비와 일치한다.

페리플라즘이나 미디엄으로 분비되는 Fab1A8은 특이 항원에 기초(a specific antigen-based)한 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용한 항원-결합 활성을 위해 분석된다. 이러한 목적을 위해서, 아미노 말단 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GST) (an amino terminal glutathione S-transferase (GST)) 정제 태그(tag)을 가진 프레임으로 융합된 단백질로 클로닝된 재조합 PcrV 항원이, 위에서 기술한 바와 같이 사용된다 (Frank et al, 2002, J. Infectious Diseases 186: 64-73). PcrV 코딩 서열은 GST-PcrV 융합단백질을 생성하기 위한 발현 벡터 pGEX 2TK (GE Health Care)에 클로닝된다.

기능적 안티-PcrV Fabs의 검출을 위한 ELISA에서의 사용을 위한 항원의 생산 을 위해, GST-PcrV 융합 단백질이, pGEX 2TK-PcrV과 형질전환된 대장균(E. coli)(BL21)으로부터 발현되고 다음과 같이 정제된다. GST-PcrV을 발현하는 대장균(E. coli)의 배양 배치 4 리터가, 0.5 mM EPTG로 단백질 발현이 유도되기 전에, 2xYT 미디엄에서, 600nm에서의 광학 밀도가 0.6이 될 때까지 배양되고 3시간 더 배양된다. 박테리아 세포는 원심분리로 펠렛으로 되어, lU/ml rLysozyme (Novagen) 및 제조자의 설명서에 따라 희석된 프로테아제 저해자 칵텍일(a protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich))가 보충된 Bug Buster(Novagen)용액에 용해된다. 원심분리와 여과에 의해 용해물을 제거하고 난 후, 글루타티온 세타로즈 컬럼(glutathione sepharose column (GSTrap FF, GE Healthcare))을 통과하고, 세정되어, 순수 GST-PcrV는 10 mM 글루타티온에 녹여서 분리된다. 항원은 PBS로 탈염된다.

페리플라즘 부분 또는 미디엄 샘플에서 안티-PcrV Fab 검출을 위한 항원 결합 ELISA는 다음과 같이 행하여진다. ELISA 플레이트(Costar EIA / RIA)는 PBS에서 100 ng/well GST-PcrV(위부분 참조)로 40 ℃에서 16시간 인큐베이팅하고, PBS 0.1% Tween 20 (PBST)에서 비-지방 드라이 밀크 5% 용액으로 1시간 동안 블로킹하여 코팅된다. 페리플라즘 부분 샘플들은 2 배 시리즈로 희석되고 ELISA 플레이트에 330 ℃에서 1시간동안 적용된다. PBST로 세정하고 난 후, 항원에 결합한 항체 단편들이 1/1000 로 희석된 PBST의 염소 항-인간 카파 (goat anti-human kappa)-HRP conjugate (US Biological)로 검출된다. 항체 결합은 퍼록시다아제 서브스트레 이트 테트라메틸 벤지딘(Tetramethyl benzidine (TMB))(웰당 lOOμl)을 사용하여 검출되고, l00ul 2N H2SO4를 가하여 반응이 멈춰지고 표준 플레이트 리더로 판독된다.

항원 결합 ELISA는 페리플라즘에서의 기능적 Fab1A8의 존재를 확인하고, 플라스미드 KB5246을 포함하는 SE6004 전환체의 미디엄으로 릴리스(release)된다. 도 4는 PcrV에 결합할 수 있는 Fab 단편이, 신호-의존적 방법에 의해 Fab1A8을 발현하는 세포의 페리플라즘에서의 Fab의 표준 표본(도 4의 표본 1150)와 비교하여, 상당량이 분비되는 것을 나타낸다.

따라서, Fab1A8의 중사슬(heavy chain) 과 경사슬(light chain)은 prl A4 돌연변이 대장균(E. coli )으로부터 각각의 사슬의 신호 펩타이드에 대한 필요없이 분비된다. 두 개의 사슬들은, 페리플라즘에서 검출될 수 있는 Fab 단편을 형성하기 위해 어셈블되고, 기능적 항원-결합 분자로 배양 미디엄으로 릴리스된다.

실시예 2. 콜로니-리프트 바인딩 어세이(CLBA)를 통한 항원 결합 Fab의 검출

플라스미드 KB5246에 클로닝되고 SE6005로 전환된 항체 Fab 단편들의 라이브러리가 적절한 항생제(34μg/ml의 클로람페니콜)을 함유한 2YT 아가(Becton, Dickinson Difco™ 2xYT yeast extract tryptone medium)에 플레이트되었다. 플레 이팅 효율은 결과적인 박테리아 콜로니들이 디스크리트(discreet)하지만 플레이트의 면적을 최대화할 수 있을 정도로 빽빽하도록 조절된다. 여러 사이즈의 플레이트가 스크리닝될 클로닝 콜로니의 숫자에 따라 사용된다. 따라서, 지름 10cm 플레이트는 4000 콜로니, 지름 15cm 플레이트는 10000 콜로니들, 25cm의 사각 플레이트는 50,000콜로니들을 포함하는 정도의 광학 밀도가 된다.

지름 8.2 cm, 13.2cm 또는 20cm 사각 니트로 셀룰로오스 필터(Schleicher & Schuell BA85)가 실험적으로 결정된 농도(일반적으로 0.5 내지 20 μg/ml)의 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline (PBS))의 항원으로 미리 코팅된다. 코팅 용액의 부피는 필터사이즈에 따르며, 4 ml, 8ml, 또는 20ml 이 위에서 리스트한 여러 필터를 위해 사용될 수 있다. 필터들은 항원 풀(pool)에서 아래면을 향하도록 위치하며, 모세관 작용이 항원을 고르게 분포시킨다. 필터는 330℃에서 2-3시간동안 간헐적 교반으로 코팅된다. 필터는 그 후 과한(excess) PBS로 한번 세정되고, PBS에서 5% 비지방 드라이 밀크 용액과 추가 2시간 동안 250℃에서 교반되어 블록된다. 필터는 그후 배수되고, 0.1% Tween 20 (PBST)가 보충된 PBS에서 한번, 항생제 셀렉션(클로람페니콜 34 μg/ml)과 전사 유도제(IPTG)가 보충된 과한(excess) 2YT 미디어에서 2번 세정된다. PTG 농도는 각각의 라이브러리에 대해 최적화될 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 0.1 mM 범위이다. 필터가 배수되고 난 후, 같은 농도의 항생제와 유도제가 보충된 2YT-아가 플레이트(발현 플레이트)에 위치된다.

코팅되지 않은, 드라이 니트로셀룰로오스 멤브레인이 항체 단편 라이브러리를 포함하는 콜로니의 플레이트에 아래면을 향하여 배치된다. 일단 필터는 눈에 보일 정도로 한 동작으로 젖게 되고(~20sec), 필터는 들어올려져서, 이미 발현 플레이트 위에 있는 코팅된 필터에 콜로니 사이드가 위로 가게 놓여진다. 살균된 바늘(needle)이, 정돈을 허용하는 패턴의 필터를 통과하는데 사용된다.

니트로셀룰로오스 필터 샌드위치를 가진 발현 플레이트가 12-16시간동안 330℃에 놓여진다. 이 시간 동안 항체 단편들은 분비되고 첫 번째 니트로셀룰로오스 멤브레인을 통과하여 두 번째 항원-코팅 멤브레인으로 삽입된다. 주어진 박테리아 콜로니로부터의 항체 단편이 항원 결합 활성(antigen binding activity)을 가지고 있다면, 항원 필터에 보유되고, 그 후에 검출된다.

12 내지 16시간의 발현 주기 후에, 콜로니 필터는 발현 플레이트로부터 제거되고, 2YT-아가 플레이트에 전사 유도제 없는 항생제 세렉션과 함께 4℃에서 저장된다.

항원 코팅된 필터는 제거되고, 과(excess) PBST로 세 번 세척(5분간 세척)되고, PBST에서 비-지방 드라이 밀크 5% 용액으로 250℃에서 1.5 시간동안 블록킹(blocking)된다. 항원 필터에 보유된 항체 단편은 그후 다음의 선택적 프라이머리 항체 중 어느 하나로 첫 번째 인큐베이팅되어 감지된다. 결합을 보이기 위해, Goat anti-human Kappa-HRP conjugate (US Biological)이 사용된다. 4번의 10분간 세정 후 필터는 퍼록시다아제 서브스트레이트 용액(peroxidase substrate solution)(ECL plus, GE Healthcare)에서 인큐베이트되고, 빛-민감 포로그래픽 필름을 노출하기 위해 사용된다. 선택적으로 형광라벨과 주합된 항체가 사용될 수 있다. 이 경우 Typhoon (GE Healthcare), FX-Pro (Biorad) 또는 Odyssey (Licor)와 같은 플랫베드 여기 스캐너(a flatbed excitation scanner)가 포지티브 스팟을 보이게 하기 위하여 사용될 수 있다.

백 일루미네이션(back illumination)을 위한 라이트 박스를 사용하여, 포로그래픽 필름 또는 디지털 이미지위의 스폿의 패턴은 콜로니 필터와 정렬된다(필터는 2YT-아가 플레이트로부터 제거되고, 이러한 프로세스를 위한 플라스틱 투명필름위에 놓일 수 있다). 동정된 포지티브 콜로니들이 선택되고 2YT 액체 미니 배양을 접종시키기 위해 사용된다. 프라이머리 스크린으로부터의 박테리아는 그 후 낮은 밀도로 다시 플레이팅되고 클로날 밀도가 확장된다는 것을 확신하기 위한 그후의 분석을 위해서 선택된다. .

실시예 3. 신호펩타이드 없이 CLBA를 사용한, prl A4로부터 분비된 안티-PcrV Fab의 감지

플라스미드 KB5246,에서 신호 펩타이드 없이 발현되는 Fab 단편을 위해, 형 질전환된 세포들이 클로람페니콜(34μg/ml)과 IPTG 10 μM을 함유한 2YT 발현 플레이트에 플레이트 되었다. 세포들은 16시간동안 유도되고 항원-코팅된 필터위에서 GST-PcrV에 결합한 항체 단편은 실시예 2에서 기술된 바와 같이, PBST에서 1/5000 로 희석화한 a goat anti-human kappa antibody - Horseradish peroxidase conjugate (US Biological)를 사용하여 감지된다. 15분간 4번 세정과 ECL 플러스(GE Healthcare)의 적용 후에, 필터는 오토라디오그래픽 필름(autoradiographic film)(Hyperfilm from GE Healthcare)을 노출시키기 위해 사용된다.

FablA8을 발현하는 플라스미드 KB5246는, (th.eprlA4 돌연변이를 포함하는)돌연변이 SecY 유전자를 가지는 SE6004로 형질전환되고, 와일드 타입 SecY 유전자를 가지는 TOP10 세포로 도입된다. FablA8를 분비하는 포지티브 콜로니들이 SE6004 형질전환체로부터의 PcrV 항원-CLBA 에서 감지되었다. TOP10 형질전환체는 감지될 정도의 양의 FablA8을 분비하지 않는다. 이 결과는 prl A4 돌연변이 스트레인이, 중사슬(heavy chain) 또는 경사슬(light chain) 중 어느 하나에서 신호 펩타이드의 도움없이 Fab 단편을 분비할 수 있다는 것을 나타낸다. 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)은 어셈블되고, 니트로셀룰로스 필터에 코팅된 같은 기원의 항원을 결합할 수 있는 완전한 기능의 Fab 단편을 형성할 수 있다.

실시예 4 신호 펩타이드 없이 발현된 Fab의 특이적 항원에 대한 바인더를 위한 스크리닝

인간 사이토카인에 대한 특이적인 제 2 인간 Fab FB42-8은, 적절한 V 부위 서열을 Fab1A8 V 부위에서 KB5246으로 클로닝함으로써 SE6004에서 신호 펩타이드없이 발현된다. 두 개의 Fab(FB42-8과 FablA8)를 발현하는 세포들이 50/50 비율로 혼합되어 2xYT 아가에 플레이트된다. CLBA가, 실시예 2에서 기술된 바와 같이, PCRV 또는 FB42-8에 대해 특이적인 사이토카이 항원으로 코팅하여.행하여진다. 복제된 CLBA 감지와 얼라인먼트는 각각의 항원에 대해 특이적인 Fab 가 두 개의 형질전환체(transformants)의 혼합으로부터 선택될 수 있다는 것을 보여준다.

다양한 Fab의 라이브러리가 같은 방법으로 특이적 항원에 대한 바인더를 위해 스크린될 수 있다.

실시예 5. 신호 펩타이드 없는 Fab 발현의 효율성

Fab 가 박테리아 분비 리더 펩타이드(KB 1150)를 가진 일반적 박테리아 발현 플라스미드 또는 서열을 코딩하는 Fab1A8 위치의 KB5246으로 클론된다. 이러한 2개의 구조는 여러 EPTG 유도 조건에서 발현과 분비의 효율을 위해 비교된다. OD가 600nm에서 0.6이 될 때까지 배양되고 그후 유도된다. 성장은 16시간동안 계속된다. 배양 미디엄으로 분비된 Fab는, 실시예 1(도 5 참조)에서와 같이 안티-카파-HRP 폴리클로날(anti-kappa-HRP polyclonal)에 의한 웨스턴 블롯으로 검출된다.

뮤린 V-부위를 가진 Fab 는 박테리아에서 고 산출로 발현되는 것이 어렵다는 것이 알려져 있다. 본 실험에서는 Fab가 신호 펩타이드 없이 SE6004로부터, 와일드 타입 TOP10 스트레인에서 신호펩타이드와 같이 발현될 때보다 좀더 효율적으로 분비된다. TOP10F' 세포들에서 신호 펩타이드가 중재하는 분비를 사용하는 Fab 분비는 검출할 수 없고, SE6004스트레인이 신호-없는 Fab의 분비를 위해 사용될 때는 미디엄에서 쉽게 검출할 수 있다. 따라서 Fabs와 E. coli에서 잘 발현되지 않는 다른 항체들은, prl A4 돌연변이 SE6004와 같은 적절한 돌연변이 스트레인으로부터 신호 펩타이드가 없는 상태에서 분비에 의해 유리하게 생산될 수 있다.

실시예 6. yrlA4 돌연변이 SecY 유전자를 위한 발현 벡터의 구성

강한 박테리아 프로모터, trc 프로모터의 조절하의 박테리아 세포에서의 유전자의 발현을 위한 발현 벡터 pl5A는 다음과 같이 만들어진다.

플라스미드 pACYC177(페르멘타스)는 Banl로 소화되고 부분적으로는 Stul로 소화된다. 2386 bp DNA 단편은 DNA 폴리머라제 I의 Klenow 단편을 사용하여 끝부분이 무뎌지게 된다. pTrc 프로모터는 다음의 프라이머로 플라스미드 p6xHis-GFP (Clontech)으로부터 PCR 증폭된다.

프라이머 1: TCTTCCAGGCCTGAGCTCGAGCTGTTGACAATTAATCA (SEQ ID NO: 12)

프라이머 2: CAGTTACAGGCCTGGTACCTCACCGGCCGTTAAACCCCCCATGGTTTATTCC (SEQ ID NO: 13)

PCR 결과물은 그후 Stul로 소화되고, pl5A 벡터를 주기 위해서, pACYC177의 2386 DNA 단편으로 주합(ligate)되고, 이는 pTrc 프로모터를 따라 Ncol과 Kpnl 사이트를 가지고 있다.

prl A4 돌연변이 SecY 유전자는 SE6004로부터 다음의 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 클로닝된다.

프라이머3: ACGGAATTCACCATGGCTAAACAACCGGGATTAGATTTTC (SEQ ID NO: 14)

프라이머4: CAGTTACGGTACCTTATCGGCCGTAGCCTTTCAGGTTC (SEQ ID NO: 15)

PCR 결과물은 그후 Ncol과 Kpnl로 소화되고, 동일한 두 개의 사이트 사이의 벡터 pl5A로 클로닝되어, 박테리아 trc 프로모터의 조절하에 돌연변이 SecY 유전자를 발현하는 KB5282를 준다. 대장균(E. coli) 스트레인과 KB5282와의 형질전환체는 prl A 페노파입(phenotype)에 숙주세포를 부여하며, 신호 펩타이드를 인코드하지 않는 코딩 서열로부터의 항체와 같은 이종 단백질의 페리플라즘을 통하는 분비를 허용한다.

일렉트로-컴피턴트 DH5-α 세포들(Electro-competent DH5-alpha cells)은, 전기 천공에 의해 플라스미드 KB5282로 형질전환되고, 형질전환체들은 2xYT 미디엄에서 35 μg/ml 카나마이신을 사용하여 선택된다.

과발현된 SecY의 존재하에 DH5α에서의 FablA8의 발현은 다음과 같이 분석된다. DH5α세포는 플라스미드 KB5246(신호 서열 없이 Fab 발현)과 KB5282(돌연변이 SecY 발현)과 전기 천공에 의해 코-형질전환(co-transformed)된다. 클로람페니콜과 카나마이신에서 선택된 형질전환체는 2xYT 미디엄에서 배양되고, FablA8의 중사슬(heavy chain)과 경사슬(light chain)의 발현은 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG))을 20μM 또는 200μM. 농도로 사용하여 유도된다. 발현은 33°C에서 16시간 동안 쉐이킹되면서 계속된다. DH5α세포와 SecY 돌연변이의 코-형질전환과 DH5α로부터의 인택트 Fab 단편(intact Fab fragment)의 발현과 분비 레벨은, 실시예 1에서 기술된 인간 카파 사슬에 대해 특이적인 검출 항체를 사용한 웨스턴 블롯은 비-산화 조건하에서의 SDS-PAGE를 행하는 발현 미디아에서 실행된다(도 7). 분비된 Fab의 고레벨은 돌연변이 SecY를 발현하는 DH5α 세포의 미디아에서 검출된다. 이러한 세포들은 20μM IPTG를 사용하여 유도될 때 SE6004 세포에서보다 높은 레벨로 분비된다. 이와 대조적으로, KB5246이 TOP10F' 세포, 와일드 타입 SecY를 발현하는 스트레인으로 형질전환될 때 검출할 수 있는 Fab의 분비는 관찰되지 않는다(도 7 참조).

실시예 7. prl 돌연변이 대장균(E. coli ) 스트레인에서의 신호 서열에 의한 항체 단편의 발현

신호 펩타이드를 포함하는 항체 폴리펩타이드를 인코드하는 발현 벡터는, prl 돌연변이 돌연변이(E. coli) 스트레인에서 다음과 같이 발현될 수 있다. 신호 펩타이드는, 어셈블되고 기능적인 Fab 또는 Fab' 단편을, prl 돌연변이 스트레인으로부터 분비하기 위해, 서열을 코딩하는 중사슬(heavy chain)의 N-말단과 서열을 코딩하는 경사슬(light chain) 또는 두 개 모두에서 도입된다.

신호 펩타이드를 함유한 항체 단편의 발현을 위해 편리한 prl 돌연변이 스트레인을 만들기 위해, 플라스미스 KB5282 (실시예 6)이 DH5-알파 세포를 형질전환하기 위해 사용되었다. 카나마이신-저항 형질전환체(transformants)는 prl A 페노타입(phenotype)을 가지고 있으며 실시예 6에서 기술한 바와 같이 신호 펩타이드가 부족해도 Fab 단편을 분비할 수 있다. 이러한 경우 KB 5282 DH5α형질전환체는 결과적으로, 하나 또는 두 개의 사슬이 신호 펩타이드로 발현되는 항체 중사슬 (heavy chain)과 경사슬(light chain)을 발현하는 발현 벡터로, 전기천공에 의해 형질전환된다 일렉트로컴피턴트 세포(Electrocompetent cells)는 분자 생물학((3rd edition), Ausubel et al (John Wiley and Sons Inc.)에 기술된 short protocol 같은 표준 기술에 따라 준비되고 전기천공은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 행해진다.

기능적 Fab 또는 Fab' 단편은 동정되고 페리플라즘 부분 또는 상기 실시예 1,2 와 3에서 기술한 배양 미디엄으로부터 분리될 수 있다.

<110> KALOBIOS PHARMACEUTICALS, INC. <120> SECRETION OF ANTIBODIES WITHOUT SIGNAL PEPTIDES FROM BACTERIA <130> 73678-023 <140> 04815827.3 <141> 2008-02-22 <150> US 60/701,902 <151> 2005-07-22 <150> US 11/273,906 <151> 2005-11-14 <160> 53 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Hamster <400> 1 Met Ala Gln Ala Gly Arg Thr Gly Tyr Asp Asn Arg Glu Ile Val Met 1 5 10 15 Lys Tyr Ile His Tyr Lys Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Glu Trp Asp Val 20 25 30 Gly Asp Val Asp Ala Ala Pro Leu Gly Ala Ala Pro Thr Pro Gly Ile 35 40 45 Phe Ser Phe Gln Pro Glu Ser Asn Pro Thr Pro Ala Val His Arg Asp 50 55 60 Met Ala Ala Arg Thr Ser Pro Leu Arg Pro Ile Val Ala Thr Thr Gly 65 70 75 80 Pro Thr Leu Ser Pro Val Pro Pro Val Val His Leu Thr Leu Arg Arg 85 90 95 Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg Asp Phe Ala Glu Met 100 105 110 Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe Thr Ala Arg Gly Arg Phe Ala 115 120 125 Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile 130 135 140 Val 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cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360 gatcttaccg gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420 gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480 cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540 atgtttgtct acagtaagtg aaaattatgg gcagtgggtg atagagtggt gggtttggtg 600 tggtaatttt ttttttaatt tttacagttt tgtggtttaa agaattttgt attgtgattt 660 ttttaaaagg tcctgtgtct gaacctgagc ctgagcccga gccagaaccg gagcctgcaa 720 gacctacccg ccgtcctaaa atggcgcctg ctatcctgag acgcccgaca tcacctgtgt 780 ctagagaatg caatagtagt acggatagct gtgactccgg tccttctaac acacctcctg 840 agatacaccc ggtggtcccg ctgtgcccca ttaaaccagt tgccgtgaga gttggtgggc 900 gtcgccaggc tgtggaatgt atcgaggact tgcttaacga gcctgggcaa cctttggact 960 tgagctgtaa acgccccagg ccataa 986 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cccgaattcg ccgccaccat gagacatatt atctgccac 39 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cccgtcgacc ttatggcctg gggcgttt 28 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cccggtaccg ccgccaccat gagacatatt atctgccac 39 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cccgcggccg ccttatggcc tggggcgttt 30 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggaggtgatc gatcttaccg gccac 25 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cctacccttc acgaactgca tgatttagac gtgacg 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cgtcacgtct aaatcatgca gttcgtgaag ggtagg 36 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cccgaattcg ccgccaccat ggaggcttgg gagtgttt 38 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cccgtcgacc aacattcatt cccgagggt 29 <210> 15 <211> 558 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 15 gaattcgccg ccaccatgga ggcttgggag tgtttggaag atttttctgc tgtgcgtaac 60 ttgctggaac agagctctaa cagtacctct tggttttgga ggtttctgtg gggctcatcc 120 caggcaaagt tagtctgcag aattaaggag gattacaagt gggaatttga agagcttttg 180 aaatcctgtg gtgagctgtt tgattctttg aatctgggtc accaggcgct tttccaagag 240 aaggtcatca agactttgga tttttccaca ccggggcgcg ctgcggctgc tgttgctttt 300 ttgagtttta taaaggataa atggagcgaa gaaacccatc tgagcggggg gtacctgctg 360 gattttctgg ccatgcatct gtggagagcg gttgtgagac acaagaatcg cctgctactg 420 ttgtcttccg tccgcccggc gataataccg acggaggagc agcagcagca gcaggaggaa 480 gccaggcggc ggcggcagga gcagagccca tggaacccga gagccggcct ggaccctcgg 540 gaatgaatgt tggtcgac 558 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cccgtcgacg ccgccaccat gccgcccaaa accccccg 38 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cccgcggccg ccggtcctga gatcctcatt tc 32 <210> 18 <211> 2824 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gtcgacgccg ccaccatgcc gcccaaaacc ccccgaaaaa cggccgccac cgccgccgct 60 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gagaaggacc aactgatcac cttgaatctg cttgtcctct taatcttcct 1800 ctccagaata atcacactgc agcagatatg tatctttctc ctgtaagatc tccaaagaaa 1860 aaaggttcaa ctacgcgtgt aaattctact gcaaatgcag agacacaagc aacctcagcc 1920 ttccagaccc agaagccatt gaaatctacc tctctttcac tgttttataa aaaagtgtat 1980 cggctagcct atctccggct aaatacactt tgtgaacgcc ttctgtctga gcacccagaa 2040 ttagaacata tcatctggac ccttttccag cacaccctgc agaatgagta tgaactcatg 2100 agagacaggc atttggacca aattatgatg tgttccatgt atggcatatg caaagtgaag 2160 aatatagacc ttaaattcaa aatcattgta acagcataca aggatcttcc tcatgctgtt 2220 caggagacat tcaaacgtgt tttgatcaaa gaagaggagt atgattctat tatagtattc 2280 tataactcgg tcttcatgca gagactgaaa acaaatattt tgcagtatgc ttccaccagg 2340 ccccctacct tgtcaccaat acctcacatt cctcgaagcc cttacaagtt tcctagttca 2400 cccttacgga ttcctggagg gaacatctat atttcacccc tgaagagtcc atataaaatt 2460 tcagaaggtc tgccaacacc aacaaaaatg actccaagat caagaatctt agtatcaatt 2520 ggtgaatcat tcgggacttc tgagaagttc cagaaaataa atcagatggt atgtaacagc 2580 gaccgtgtgc 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agcagctcat gcaacatcat ctgctcccac cgtaactcta 180 gtacagctgc ccaatgggca gacagttcaa gtccatggag tcattcaggc ggcccagcca 240 tcagttattc agtctccaca agtccaaaca gttcagattt caactattgc agaaagtgaa 300 gattcacagg agtcagtgga tagtgtaact gattcccaaa agcgaaggga aattctttca 360 aggaggcctt ccttcaggaa aattttgaat gacttatctt ctgatgcacc aggagtgcca 420 aggattgaag aagagaagtc tgaagaggag gcttcagcac ctgccatcac cgctgtagcg 480 gtgccaacgc caatttaccg gactagcagt ggacagtata ttaccattac ccagagagga 540 gcaatacagc tggctagcaa tggtaccgat ggggtacagg gcctgcaaac attaaccatg 600 gccaatgcag cagccactca gccgggtact accattctac agtatgcaca gaccactgat 660 ggacagcaga tcttagtgcc cagcaaccaa gttgttgttc aagctgcctc tggagacgta 720 caaacatacc agattcgcac agcacccact agcactattg cccctggagt tgttatggca 780 tcctccccag cacttcctac acagcctgct gaagaagcag cacgaaagag agaggtccgt 840 ctaatgaaga acagggaagc agctcgtgag tgtcgtagaa agaagaaaga atatgtgaaa 900 tgtttagaaa acagagtggc agtgcttgaa aatcaaaaca agacattgat tgaggagcta 960 aaagcactta aggaccttta ctgccacaaa 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tattatctgc cacgg 45 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cgcagtctcg agttatggcc tggggcgttt acagctc 37 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cacctaccct tcacgaactg catgatttag acgtgacggc c 41 <210> 27 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ggccgtcacg tctaaatcat gcagttcgtg aagggtaggt g 41 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 cggaggtgat cgatcttacc ggccacgagg ctggctttcc ac 42 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gtggaaagcc agcctcgtgg ccggtaagat cgatcacctc cg 42 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gtcaagcaag cttgccgcca ccatgaccat ggaatctgga gc 42 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgcagtggat ccttaatctg atttgtggca gtaaagg 37 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gtcattcaaa attttcctga aggaaggcct ccttgaaag 39 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tctttcaagg aggccttcct tcaggaaaat tttgaatgac 40 <210> 34 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ggcattccaa gcttactgtt ggtaaagccg ccaccatgga ggcttgggag tgtttgg 57 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gatcgactct agatcattcc cgagggtcca ggccgg 36 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 taaagccacc atggctcaag ctgggagaac agggtatg 38 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gatcgactct agatcacttg tggcccaggt aggtaccc 38 <210> 38 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gtgggagatg tggacgccgc ggccgcggcc gcgagccccg tgccacctgt ggtcc 55 <210> 39 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ggaccacagg tggcacgggg ctcgcggccg cggccgcggc gtccacatct 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tgactccggt 720 ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 780 gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 840 cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataactcga g 891 <210> 42 <211> 1047 <212> DNA <213> hamster CREB-B cDNA <400> 42 aagcttgccg ccaccatgac catggaatct ggagcagaca accagcagag tggagatgct 60 gctgtaacag aagctgaaaa tcaacaaatg acagctcaag cccaaccaca gattgccaca 120 ttagcccagg tatccatgcc agcagctcat gcgacatcat ctgctcccac tgtaacctta 180 gtgcagctgc ccaatgggca gacagtccaa gtccatggag ttattcaggc ggcccagcca 240 tcagttattc agtctccaca agtccaaaca gttcagtctt cctgtaagga cttaaaaaga 300 cttttctccg gaactcagat ttcaactatt gcagaaagtg aggattcaca ggaatctgtg 360 gatagtgtaa ctgattccca aaagcgaagg gaaattcttt caaggaggcc ttcctacagg 420 aaaattttga atgacttatc ttctgatgca ccaggggtgc caaggattga agaagaaaag 480 tcggaagagg agacttcagc ccctgccatc accactgtga cagtgccaac tccgatttac 540 cagacaagca gtgggcagta tattgccatt acccagggag gagctataca gctggctaac 600 aatggtaccg 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gtggggtcat gtgtgtggag agcgtcaaca 360 gggagatgtc acccctggtg gacaacatcg ccctgtggat gaccgagtac ctgaaccggc 420 atctgcacac ctggatccag gataacggag gctgggacgc atttgtggaa ctgtacggcc 480 ccagtgtgag gcctctgttt gatttctctt ggctgtctct gaagaccctg ctcagcctgg 540 ccctggtcgg ggcctgcatc actctgggta cctacctggg ccacaagtga tctaga 596 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 cgcagtacta gtttatggcc tggggcgttt acagctc 37 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gagctattcc agaagtagtg 20 <210> 48 <211> 289 <212> PRT <213> E1a cDNA <400> 48 Met Arg His Ile Ile Cys His Gly Gly Val Ile Thr Glu Glu Met Ala 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Asp Gln Leu Ile Glu Glu Val Leu Ala Asp Asn Leu 20 25 30 Pro Pro Pro Ser His Phe Glu Pro Pro Thr Leu His Glu Leu Tyr Asp 35 40 45 Leu Asp Val Thr Ala Pro Glu Asp Pro Asn Glu Glu Ala Val Ser Gln 50 55 60 Ile Phe Pro Asp Ser Val Met Leu Ala Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu 65 70 75 80 Leu Thr Phe Pro Pro Ala Pro Gly 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Tyr 50 55 60 Arg Arg Asp Phe Ala Glu Met Ser Ser Gln Leu His Leu Thr Pro Phe 65 70 75 80 Thr Ala Arg Gly Arg Phe Ala Thr Val Val Glu Glu Leu Phe Arg Asp 85 90 95 Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Glu Phe Gly Gly Val 100 105 110 Met Cys Val Glu Ser Val Asn Arg Glu Met Ser Pro Leu Val Asp Asn 115 120 125 Ile Ala Leu Trp Met Thr Glu Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp 130 135 140 Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu Tyr Gly Pro 145 150 155 160 Ser Val Arg Pro Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu 165 170 175 Leu Ser Leu Ala Leu Val Gly Ala Cys Ile Thr Leu Gly Thr Tyr Leu 180 185 190 Gly His Lys 195

Claims (41)

1. (a) prl 돌연변이와, 항체의 중사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 항체의 경사슬을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포의, 항체의 중사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와 항체의 경사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는 조건하에서, 적어도 하나의 상기 폴리뉴클레오티드가 신호 펩타이드가 부족한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 배양단계;

   (b)중사슬 폴리펩타이드와 경사슬 폴리펩타이드를 사이토플라즈믹 멤브레인을 통과하여 분비하는 단계; 및

   (c)상기 중사슬 폴리펩타이드와 상기 경사슬 폴리펩타이드로부터 항체를 형성하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 항체는 인간 항체, 마우스 항체, 랫 항체, 토끼 항체, 낙타 항체, 양 항체, 잡종 항체, 인간화된 항체, 엔지니어드 인간 항체 및 에피토프-집중된 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
3. 제 1항에 있어서,

   상기 중사슬 폴리펩타이드와 상기 경사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 복수개의 다른 벡터에 존재하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
4. 제 1항에 있어서,

   상기 중사슬 폴리펩타이드와 상기 경사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 같은 벡터에 모두 존재하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
5. 제 1항에 있어서,

   상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩타이드가 부족한 중사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법
6. 제 1항에 있어서,

   상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩타이드가 부족한 경사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
7. 제 1항에 있어서,

   상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩타이드가 부족한 상기 중사슬과 상기 경사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
8. 제 1항에 있어서,

   상기 숙주세포는 그램 음성 박테리아인 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
9. 제 8항에 있어서,

   상기 그램 음성 박테리아는 대장균인 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
10. 제 9항에 있어서,

    상기 대장균은 Sec 경로에 돌연변이 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
11. 제 10항에 있어서,

    상기 돌연변이 유전자는 SecY 유전자 돌연변이인 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
12. 제 11항에 있어서,

    상기 숙주세포는 실질적으로 와일드 타입 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 SecY 유전자와 실질적으로 와일드 타입 기능이 부족한 단백질을 인코딩하는 SecY 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
13. 제 11항에 있어서,

    상기 숙주 세포는 벡터에 의해 운반되는 돌연변이 SecY 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
14. (a) prl 돌연변이와, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 조건하에서, 상기 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자로 구성되는 발현 벡터를 배양하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩타이드가 부족한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것이며,

    (b) 상기 항체를 사이토플라즈믹 멤브레인을 통하여 분비하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
15. 제 14항에 있어서,

    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
16. 제 15항에 있어서,

    상기 대장균은 Sec 경로에 돌연변이 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
17. 제 16항에 있어서,

    상기 돌연변이 유전자는 벡터로 운반되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법
18. 제 17항에 있어서,

    상기 항체는 단순 사슬 항체, sdFV, dAB, VHH, 카멜리드 항체, 및 나노바디로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
19. (a) prl 돌연변이와

    발현 벡터 또는 벡터들이 폴리뉴클레오티드 또는 융합 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 조건에서 융합 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 분자로 구성되는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포의 배양 단계로, 상기 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 신호 펩타이드가 부족한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것이며,

    (b)상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 사이토플라즈믹 멤브레인으로 통해서 수송되는 단계

    (c)상기 융합 항체는 항원과 결합할 수 있는 것인 융합 항체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 융합항체 생산 방법.
20. 제 19항에 있어서,

    상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
21. 제 20항에 있어서,

    상기 대장균은 Sec 경로에서의 돌연변이 유전자로 구성되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
22. 제 19항에 있어서,

    융합 항체는 박테리오 파아지의 표면에서 융합 단백질로 디스플레이되는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
23. (a) prl 돌연변이와

    각 발현벡터는 복수의 숙주 세포에서 복수의 발현 벡터로부터 항체를 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 조건에서 복수의 항체 중 하나를 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드 중 하나를 인코딩하는 복수의 발현 벡터 중 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 복수의 원핵 숙주 세포의 배양이고, 하나 또는 그 이상의 상기 폴리뉴클레오티드는 각각의 숙주세포에서 신호 펩타이드가 부족한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것이며,

    (b)복수의 폴리펩타이드를 복수의 숙주 세포에서 사이토플라즈믹 멤브레인을 통해 수송(transporting)하는 단계

    (c)복수의 항체를 형성하는 단계로서, 적어도 하나의 상기 복수의 항체들은 항원에 결합할 수 있는 것인 복수의 항체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
24. 제 23항에 있어서,

    상기 숙주세포 중 적어도 하나는 대장균인 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
25. 제 24항에 있어서,

    상기 폴리뉴클레오티드는 복수의 에피토프-집중된 인간 항체를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
26. 제 25항에 있어서,

    상기 폴리뉴클레오티드는 신호 펩타이드가 부족한 모든 중사슬 또는 모든 경사슬을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
27. 다중체 단백질을 형성하는 방법으로서,

    (a)prl 돌연변이와, 복수의 폴리펩타이드를 발현하는 조건에서, 다중체 단백질의 멤버인 복수의 폴리펩타이드를 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드 분자로 구성되며, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나는 신호 펩타이드가 부족한 상기 다중체 단백질의 폴리펩타이드 서브 유니트를 인코딩하는 것인, 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 원핵 숙주 세포를 배양하는 단계;

    (b)복수의 폴리펩타이드를 사이토플라즈믹 멤브레인을 통하여 수송하는 단계; 및

    (c)다중체 단백질을 어셈블링하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다중 체 단백질의 생산 방법.
28. 제 27항에 있어서,

    상기숙주 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 다중체 단백질의 생산 방법.
29. (a) prl 돌연변이와,

    폴리뉴클레오티드 또는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 조건에서 항체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드 분자로 구성되는 적어도 하나의 발현 벡터를 포함하는 원핵 세포를 배양하는 단계;

    (b)폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들은 신호-의존적 방법에 따라 사이토플라즈믹 멤브레인을 통하여 수송하는 단계; 및

    (c)항체를 형성하는 단계로서, 상기 항체는 항원과 결합할 수 있는 항체인 것인 항체 형성 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 생산 방법.
30. (a) prl 돌연변이와

    각각의 발현 벡터가, 복수의 숙주 세포에서 복수의 발현벡터로부터 항체를 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 조건에서, 복수의 항체 중 하나를 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드 중 하나를 인코딩하는 것인, 복수의 발현 벡터 중 적어도 하나 발현 벡타를 포함하는 복수의 원핵 숙주 세포를 배양하는 단계;

    (b)신호 서열에 무관한 방법으로 복수의 숙주 세포에서 사이토플라즈믹 멤브 레인을 통하여 복수의 폴리펩타이드를 수송하는 단계; 및

    (c) 복수의 항체를 형성하고, 복수의 항체 중 적어도 하나는 항원 결합할 수 있는 것인 복수의 항체 형성 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 라이브러리 생산 방법.
31. 제 30항에 있어서, 상기 발현 라이브러리는 마우스, 랫, 양 또는 토끼 발현 라이브러리인 것을 특징으로 하는 발현 라이브러리 생산 방법.
32. prl 돌연변이와 청구항 30항에 의하여 생산된 발현 라이브러리의 멤버를 포함하는 원핵 숙주 세포.
33. 하나 또는 그 이상의 복수의 폴리뉴클레오티드가, 신호 펩타이드가 부족한 폴리펩타이드를 인코딩하는 것이고, 복수의 항체를 인코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드로 구성되며, 상기 폴리펩타이드는 분비되는 것인 발현 라이브러리.
34. 적어도 하나의 폴리펩타이드를 사이토 플라즈믹 멤브레인을 통하여 분비하는 prl 돌연변이를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 항체를 형성하며, 상기 항체가 항원에 결합할 수 있는 그램 음성 박테리아 원핵 숙주 세포.
35. 제 34항에 있어서,

    상기 숙주 세포는 실질적으로 와일드-타입 기능을 가지고 있고, 실질적으로 와일드 타입 기능이 부족한 단백질을 인코딩하는 상기 prl 유전자로 구성되는 단백질을 인코딩하는 prl 유전자로 구성되는 숙주 세포인 것을 특징으로 하는 청구항 34항의 숙주세포.
36. 제 34항에 있어서,

    상기 숙주세포는 벡터로 운반되는 돌연변이 prl 유전자로 구성되는 것인 숙주세포.
37. 항체 제조 방법으로서,

    (a) prl 돌연변이를 갖는 원핵 숙주세포에서 항체 또는 항체 융합을 인코딩하는 적어도 하나의 발현벡터로부터 항체 또는 항체 융합을 발현하는 단계

    (b)항체 또는 항체 융합을 형성하는 단계,

    (c) 항체 또는 항체 융합을 만드는 숙주세포를 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 제조 방법.
38. 제 37항에 있어서,

    항체 또는 항체 융합을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 제조 방법.
39. 항체의 중사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자와 항체의 경사슬 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 원핵 숙주세포에서의 전사와 번역을 허용하고, 상기 폴리뉴클레오티드 중 하나는 신호 펩타이드가 부족한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하고, 다른 폴리뉴클레오티드는 신호 펩타이드를 가진 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 발현 벡터.
40. 제 39항에 있어서,

    상기 숙주 세포는 prl 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
41. 제 40항에 있어서,

    상기 폴리뉴클레오티드는 신호 서열이 부족한 중사슬 폴리펩타이드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.

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