EA031449B1

EA031449B1 - Бактериальный штамм-акцептор, экспрессирующий рекомбинантный dsbc

Info

Publication number: EA031449B1
Application number: EA201490274A
Authority: EA
Inventors: Марк Эллис; Дэвид Пол Хамфриз
Original assignee: Юсб Фарма, С.А.
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2019-01-31
Also published as: CA2841824A1; HUE035674T2; WO2013007388A1; IN2014DN00202A; LT2731973T; SI2731973T1; US20140141468A1; CN103649124A; JP2020028299A; PL2731973T3; EP3339325A1; CA2841824C; KR102023786B1; NO2731973T3; KR20140039240A; JP7062626B2; CN103649124B; CY1119985T1; ES2659155T3; JP2014521313A

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей мутантные протеазы, экспрессирующий вектор, содержащий рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154.

Description

Изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей мутантные протеазы, экспрессирующий вектор, содержащий рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD 154.

Изобретение относится к рекомбинантному бактериальному штамму-акцептору, в частности Е. coli. Изобретение также относится к способу получения в таких клетках интересующего белка.

Предпосылки изобретения

Бактериальные клетки, такие как Е. coli, общеупотребительны для получения рекомбинантных белков, не требующих гликозилирования. Существует множество преимуществ использования бактериальных клеток, таких как Е. coli, для получения рекомбинантных белков, в частности, по причине универсальности бактериальных клеток как клеток-хозяев, делающей возможным встраивание генов с помощью плазмид. Е. coli используют для получения многих рекомбинантных белков, включая инсулин человека.

Несмотря на множество преимуществ использования бактериальных клеток для получения рекомбинантных белков, все равно существуют ограничения, включая неудовлетворительный фенотип состояния клеток.

Таким образом, все еще существует потребность в получении новых бактериальных штаммов, представляющих удобные средства получения рекомбинантных белков.

Генерацию гуморального и клеточного иммунитета регулирует взаимодействие активированных Тхелперных клеток с антигенпредставляющими клетками (АПК) и эффекторными Т-клетками. Активация Т-хелперных клеток зависит не только от взаимодействия антиген-специфичного Т-клеточного рецептора (TCR) с соответствующим лигандом пептид-МНС, но также требует координированного связывания и активации ряда молекул клеточной адгезии и костимуляторных молекул.

В природе рецептор CD40 связывается с лигандом CD40 (CD40-L=CD154), ключевой костимуляторной молекулой, экспрессирующейся на поверхности CD4+ Т-клеток ограниченно по времени в зависимости от активации. После активации CD154 также экспрессируется на субпопуляции CD8+ Т-клеток, базофилах, тучных клетках, эозинофилах, естественных киллерах, В-клетках, макрофагах, дендритных клетках и тромбоцитах. CD40 конститутивно и обширно экспрессируется на поверхности многих типов клеток, включая В-клетки и другие антигенпредставляющие клетки.

Передача сигнала через CD40 после взаимодействия с CD154 инициирует каскад клеточных явлений, приводящих к активации несущих рецептор CD40 клеток и оптимальному примированию CD4+ Тклеток. Более конкретно, связывание CD154 с CD40 стимулирует дифференцировку В-клеток в антителосекретирующие клетки и В-клетки памяти.

Ключевая роль CD154 в регуляции функции и гуморального, и клеточно-опосредованного иммунного ответа способствует большому интересу к использованию ингибиторов этого пути в терапевтической иммуномодуляции. В связи с этим, показано, что антитела против CD154 являлись полезными в широком спектре моделей иммунного ответа на другие терапевтические белки или генотерапию, аллергены, аутоиммунность и трансплантацию (см., например, патент США № 5474771 и WO 2008/118356, включенные в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме).

В этой области существует необходимость эффективно и с оптимальными затратами продуцировать большие количества антител или фрагментов антител, препятствующих взаимодействию CD40 и CD154 и подходящих для терапевтического применения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей:

a) рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC; и

b) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, отличающейся тем, что клетка:

a) содержит рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC;

b) имеет сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа; и

c) один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154.

В одном из вариантов осуществления клетка содержит ген spr дикого типа или мутантный ген spr, например, способный супрессировать сниженную активность фенотипа Tsp.

Грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению демонстрирует предпочтительные фенотипы роста и продукции белка.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид DsbC, содержащий гистидиновую (His) метку, предпочтительно, где полипептид DsbC содержит последовательность his-his-his-his-his-his (6 остатков гистидина).

Более конкретно настоящее изобретение относится к рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетке, содержащей рекомбинантный полинуклеотид, содержащий полинуклеотид с последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 51.

Настоящее изобретение также относится к экспрессирующему вектору, содержащему рекомби

- 1 031449 нантный полинуклеотид, кодирующий DsbC и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид DsbC, содержащий гистидиновую (His) метку, предпочтительно, где полипептид DsbC содержит последовательность his-his-his-his-his-his (6 остатков гистидина).

Более конкретно, настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий полинуклеотид с последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 51.

Настоящее изобретение также относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, включающему:

a) культивирование рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки, определенной выше, в среде для культивирования в условиях, эффективных для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD 154, и рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC; и

b) выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, из периплазмы рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки и/или среды для культивирования.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана конструкция вектора для использования в получении клетки по варианту осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 2 показана структура соединения, содержащего модифицированный Fab'-фрагмент, ковалентно связанный через остаток цистеина с лизил-малеимидным линкером, где каждая аминогруппа на лизиловом остатке ковалентно связана с метокси-PEG остатком, где n составляет приблизительно от 420 до 450.

На фиг. 3 показан профиль роста штамма W3110, экспрессирующего Fab' против CD154, и профиль роста штамма МХЕ016, экспрессирующего Fab' против CD154 и рекомбинантный DsbC (W3110 ATsp, spr C94A). Можно видеть, что штамм МХЕ016, экспрессирующий рекомбинантный DsbC, проявляет улучшенный профиль роста и скорость роста в начальную фазу роста периодической культуры по сравнению со штаммом W3110.

На фиг. 4 показан общий выход Fab' (г/л) из периплазмы (закрашенные символы) и супернатанта (незакрашенные символы) штамма МХЕ016, экспрессирующего рекомбинантный DsbC, по сравнению с контрольным штаммом W3110. Штамм, экспрессирующий DsbC, демонстрирует более высокую периплазматическую экспрессию Fab' по сравнению с W3110. Кроме того, штамм МХЕ016, экспрессирующий DsbC, демонстрирует аналогичные уровни внеклеточных Fab' по сравнению со штаммом W3110.

На фиг. 5 показаны результаты анализа продуктов ферментации с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Штамм W3110 дикого типа, экспрессирующий Fab' против CD154, демонстрирует высокий уровень деградировавших легких каппа-цепей (фрагменты легкой цепи [LC]). В отличие от этого, штамм МХЕ016 (W3110 ATsp, spr C94A), экспрессирующий рекомбинантный DsbC и Fab' против CD154, в результате отсутствия активности протеазы Tsp слабо демонстрирует какие-либо фрагменты легкой цепи.

На фиг. 6 показан выход Fab' против CD154 (г/л) при сборе после ферментации в штамме W3110 и в штамме МХЕ016 (W3110 ATsp, spr C94A), экспрессирующем рекомбинантный DsbC. Выход при сборе из штамма МХЕ016 (W3110 ATsp, spr C94A), экспрессирующего рекомбинантный DsbC, существенно выше, и обнаруживают существенно меньше внеклеточных Fab', что является благоприятным, т.к. внеклеточные Fab' являются маркером риска лизиса клеток, и внеклеточные Fab трудно выделять с использованием того же способа, который используют для периплазматических Fab'.

На фиг. 7 показана жизнеспособность (а) клеток штамма W3110 и (b) клеток штамма МХЕ016 (W3110 ATsp, spr C94A), экспрессирующих рекомбинантный DsbC, в обоих случаях (а) и (b) экспрессирующих Fab' против CD154 (г/л). Клетки штамма МХЕ016 (W3110 ATsp, spr C94A), экспрессирующие рекомбинантный DsbC, проявляют более высокую жизнеспособность.

На фиг. 8 показан общий выход Fab' (г/л) при ферментациях штаммов МХЕ016, экспрессирующих Fab' против CD154. Правый столбик представляет штамм МХЕ016, дополнительно экспрессирующий рекомбинантный DsbC. Штамм МХЕ016, экспрессирующий рекомбинантный DsbC, демонстрирует более высокий выход.

На фиг. 9 показан полинуклеотид и аминокислотные последовательности области в гене ptr, являвшейся мутантной.

На фиг. 10 показан полинуклеотид и аминокислотные последовательности области в гене Tsp, являвшейся мутантной.

На фиг. 11 показан полинуклеотид и аминокислотные последовательности области в гене DegP, являвшейся мутантной.

- 2 031449

SEQ ID NO: 1 CD154.

SEQ ID NO: 2 CD154.

SEQ ID NO: 3 CD154.

SEQ

CD154.

SEQ

CD154.

SEQ

CD154.

ID

NO:

представляет

Краткое описание последовательностей собой аминокислотную последовательность

CDRH1 антитела против представляет представляет представляет представляет представляет собой собой собой собой собой аминокислотную аминокислотную аминокислотную аминокислотную аминокислотную последовательность последовательность последовательность последовательность последовательность

CDRH2

CDRH3

CDRL1

CDRL2

CDRL3 антитела антитела антитела антитела антитела против против против против против

SEQ ID NO: 7 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (gL4) антитела против CD154 (342).

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (gL4) антитела против CD154 (342).

SEQ ID NO: 9 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (gH1) антитела против CD154 (342).

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи (gH1) антитела против CD154 (342).

SEQ ID NO: 11 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность, содержащую вариабельную и константную области легкой цепи (gL4) фрагмента антитела против CD154.

SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую вариабельную и константную области легкой цепи (gL4) фрагмента антитела против CD154.

SEQ ID NO: 13 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи антитела против CD154, содержащего вариабельную область и область CH1 с делециями в шарнирной области.

SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи антитела против CD 154, содержащего вариабельную область и область CH1 с делециями в шарнирной области.

SEQ ID NO: 15 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи антитела против CD154, содержащего вариабельную область, область CH1 и шарнирную область.

SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи антитела против CD154, содержащего вариабельную область, область CH1 и шарнирную область.

SEQ ID NO: 17 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность легкой каппа-цепи антитела против CD154 (342), включающей сигнальный пептид (аминокислоты 1-22).

SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность легкой каппа-цепи антитела против CD154 (342), включающей сигнальный пептид (аминокислоты 1-22).

SEQ ID NO: 19 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность полной тяжелой цепи агликозилированного антитела IgG4 против CD154.

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность полной тяжелой цепи агликозилированного антитела IgG4 против CD154.

SEQ ID NO: 21 представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую gL4 и gH1 (без шарнирной области).

SEQ ID NO: 22 представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую gL4 и gH1.

SEQ ID NO: 23 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность spr Е. coli дикого типа (регистрационный номер GenBank D86610).

SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность spr E. coli дикого типа (регистрационный номер GenBank D86610).

SEQ ID NO: 25 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность Tsp E. coli дикого типа с сигнальной последовательностью (регистрационный номер GenBank M75634).

SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность Tsp E. coli дикого типа с сигнальным пептидом (регистрационный номер GenBank M75634).

SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность DsbC E. coli дикого типа (референсная последовательность NCBI АР 003452).

SEQ ID NO: 28 представляет собой полинуклеотидную последовательность подвергнутого нокауту

- 3 031449 мутантного гена Tsp.

SEQ ID NO: 29 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность DegP E. coli дикого типа.

SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность DegP E. coli дикого типа.

SEQ ID NO: 31 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность DegP, содержащего точечную мутацию S210A и рестрикционный маркер AseI.

SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность DegP, содержащего точечную мутацию S210A и рестрикционный маркер AseI.

SEQ ID NO: 33-36 представляют собой двухцистронные межгенные последовательности (IGS) IGS1, IGS2, IGS3 и IGS4 соответственно.

SEQ ID NO: 37 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность OmpT E. coli дикого типа.

SEQ ID NO: 38 представляет собой аминокислотную последовательность OmpT Е. coli дикого типа.

SEQ ID NO: 39 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность подвергнутого нокауту мутантного OmpT E. coli.

SEQ ID NO: 40 представляет собой аминокислотную последовательность подвергнутого нокауту мутантного OmpT E. coli.

SEQ ID NO: 41 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность мутантного OmpT E. coli, содержащего точечные мутации D210A и Н212А.

SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность OmpT E. coli, содержащего точечные мутации D210A и Н212А.

SEQ ID NO: 43 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность DsbC E. coli дикого типа.

SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность DsbC E. coli дикого типа.

SEQ ID NO: 45 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность DsbC E. coli без участка рестрикции EcoRI с гистидиновой меткой.

SEQ ID NO: 46 представляет собой аминокислотную последовательность DsbC E. coli без участка рестрикции EcoRI с гистидиновой меткой.

SEQ ID NO: 47 представляет собой полинуклеотидную последовательность праймера 6283 Tsp 3'.

SEQ ID NO: 48 представляет собой полинуклеотидную последовательность праймера 6283 Tsp 5'.

SEQ ID NO: 49 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность ptr E. coli дикого типа (протеазы III согласно регистрационному номеру Genbank X06227).

SEQ ID NO: 50 представляет собой аминокислотную последовательность ptr E. coli дикого типа (протеазы III, согласно регистрационному номеру Genbank X06227).

SEQ ID NO: 51 представляет собой полинуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность DsbC E. coli дикого типа с гистидиновой меткой.

SEQ ID NO: 52 представляет собой аминокислотную последовательность DsbC E. coli дикого типа с гистидиновой меткой.

Подробное описание изобретения

Tsp (также известный как Prc) является периплазматической протеазой массой 60 кДа. Первым известным субстратом Tsp являлся пенициллинсвязывающий белок-3 (PBP3) (Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli (Hara et al., 4799-813; Nagasawa et al., 5890-93)), но позднее открыли, что Tsp также способна расщеплять белки отростка фага и, таким образом, ее переименовали в протеазу, специфичную для белков хвоста (Tsp). В Silber, Keiler, and Sauer 295-99; Silber and Sauer 237-40 описывают штамм с делецией prc (KS1000), в котором получали мутацию, заменяя сегмент гена prc фрагментом, содержащим маркер Kan^r.

Снижение активности Tsp (prc) является желательным для снижения протеолиза интересующих белков. Протеолиз Fab может проявляться наличием примесей, таких как фрагмент, который можно обозначать как примесь легких цепей.

Однако обнаружено, что клетки без протеазы prc демонстрируют термочувствительный рост при низкой осмоляльности. Hara et al., выделяли термостабильные ревертанты, содержащие мутации экстрагенного супрессора (spr) (Hara et al., 63-72). Spr является мембраносвязанной периплазматической протеазой массой 18 кДа, и субстратами spr являются Tsp и пептидогликаны наружной мембраны, участвующие в гидролизе клеточной стенки при делении клетки. Ген spr обозначают как UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR ECOLI).

Протеиндисульфидизомераза является ферментом, катализирующим образование и разрыв дисульфидных связей между остатками цистеина в белках при их фолдинге. Для коэкспрессирующихся белков, катализирующих образование дисульфидных связей, известно улучшение экспрессии белков в клеткехозяине. В WO 98/56930 описывают способ получения гетерологичных содержащих дисульфидную связь полипептидов в бактериальных клетках, где прокариотическая дисульфидизомераза, такая как DsbC или DsbG, коэкспрессируется с эукариотическим полипептидом. В патенте США № 6673569 описывают ис

- 4 031449 кусственный оперон, содержащий полинуклеотиды, кодирующие каждый из DsbA, DsbB, DsbC и DsbD, для применения в получении чужеродного белка. В EP0786009 описывают способ получения гетерологичного полипептида в бактериях, где индуцируют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей DsbA или DsbC, перед индукцией экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный полипептид.

DsbC является прокариотическим белком, обнаруживаемым в периплазме Е. coli и катализирующим образование дисульфидных связей у Е. coli. DsbC имеет длину аминокислотной последовательности 23 6 аминокислот (включая сигнальный пептид) и молекулярную массу 25,6 КДа (UniProt № P0AEG6). Впервые DsbC идентифицировали в 1994 г. (Missiakas, Georgopoulos, and Raina 2013-20; Shevchik, Condemine, and Robert-Baudouy, 2007-12).

Неожиданно обнаружили, что гиперэкспрессия DsbC в грамотрицательной бактериальной клетке снижает лизис при культивировании клеток без протеазы Tsp. Таким образом, авторы настоящего изобретения представляют новый штамм, имеющий полезные свойства для получения интересующего белка.

Грамотрицательная бактериальная клетка, имеющая указанную выше конкретную комбинацию генетических модификаций, демонстрирует предпочтительные фенотипы роста и продукции белка.

В одном из вариантов осуществления геном клетки предпочтительно является изогенным по отношению к бактериальной клетке дикого типа, за исключением модификации, необходимой для снижения активности белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа.

В дополнительном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению имеет сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа и содержит рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC и измененный белок spr. В этом варианте осуществления геном клетки предпочтительно является изогенным по отношению к бактериальной клетке дикого типа, за исключением мутантного гена spr и модификации, приводящей к снижению или отсутствию экспрессии белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа.

В настоящем описании термины белок и полипептид используют взаимозаменяемо, если иное не следует из контекста. Термин пептид предназначен для обозначения 20 или менее аминокислот.

Термин полинуклеотид включает ген, ДНК, кДНК, РНК, мРНК и их аналоги, включая, в качестве неограничивающих примеров, замкнутую нуклеиновую кислоту (ЗНК), пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК), морфолино-нуклеиновую кислоту, гликоль-нуклеиновую кислоту (GNA) и треозо-нуклеиновую кислоту (TNA) и т.д., если иное не следует из контекста.

Как применяют в настоящем описании, термин содержащий в контексте настоящего описания необходимо интерпретировать как включающий.

В контексте настоящего изобретения термины немутантная клетка или контрольная клетка означают клетку того же типа, что и рекомбинантная грамотрицательная клетка по изобретению, где клетку не модифицируют так, что она несет рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154. Например, немутантная клетка может являться клеткой дикого типа, и ее можно получать из той же популяции клеток-хозяев, что и клетки по изобретению, перед модификацией для встраивания любых рекомбинантных полинуклеотидов.

Выражения клетка, клеточная линия, культура клеток и штамм используют взаимозаменяемо.

В контексте настоящего изобретения термин изогенный означает, что клетка содержит те же или, по существу, те же последовательности нуклеиновой кислоты, что и клетка дикого типа, за исключением встраиваемых в нее элементов, по которым изобретение отличается, например рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, и, необязательно, модификации, приводящей к снижению или отсутствию экспрессии белка Tsp, и, необязательно, мутантного гена spr. В этом варианте осуществления клетка по настоящему изобретению не содержит дополнительных неприродных или генетически введенных изменений в своем геноме.

В одном из вариантов осуществления, где в геном клетки встраивают полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, клетка по настоящему изобретению может иметь, по существу, ту же геномную последовательность, что и клетка дикого типа, за исключением полинуклеотида, кодирующего DsbC, и/или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и, необязательно, модификации, приводящей к снижению или отсутствию экспрессии белка Tsp или экспрессии белка Tsp со сниженной протеазной активностью, и, необязательно, мутантного гена spr, кодирующего белок со сниженной активностью по сравнению с диким типом с учетом любых природных мутаций, которые могут произойти. В одном из вариантов осуществления, где в геном клетки встраивают полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, клетка по настоящему изобретению может иметь точно такую же геномную последовательность, что и клетка дикого типа, за исключением полинуклеотида, кодирую

- 5 031449 щего DsbC, и/или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Полинуклеотид, кодирующий DsbC, может присутствовать в подходящем экспрессирующем векторе, с помощью которого трансформируют клетки и/или который встраивают в геном клетки-хозяина. В варианте осуществления, в котором полинуклеотид, кодирующий DsbC, встраивают в геном клеткихозяина, клетка по настоящему изобретению отличается от клетки дикого типа благодаря встраиваемому полинуклеотиду, кодирующему DsbC. В этом варианте осуществления геном клетки-хозяина может являться изогенным по отношению к геному клетки дикого типа, за исключением рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC.

Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий DsbC, находится в экспрессирующем векторе в клетке, таким образом, вызывая минимальное повреждение генома клетки-хозяина.

Один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, могут содержаться в подходящем экспрессирующем векторе, с помощью которого трансформируют клетки и/или который встраивают в геном клетки-хозяина. В варианте осуществления, где полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD 154, встраивают в геном хозяина, клетка по настоящему изобретению отличается от клетки дикого типа благодаря встроенным полинуклеотидам, кодирующим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В этом варианте осуществления геном клетки-хозяина может являться изогенным по отношению к геному клетки дикого типа, за исключением полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий интересующий белок, находится в экспрессирующем векторе в клетке, таким образом, вызывая минимальное повреждение генома клетки-хозяина.

В одном из вариантов осуществления рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, встраивают в геном хозяина. В этом варианте осуществления клетка по настоящему изобретению отличается от клетки дикого типа благодаря встраиваемому рекомбинантному полинуклеотиду, кодирующему DsbC, и одному или нескольким полинуклеотидам, кодирующим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и, необязательно, модификации, приводящей к снижению или отсутствию экспрессии белка Tsp или экспрессии белка Tsp со сниженной протеазной активностью, и, необязательно, мутантному гену spr, кодирующему белок со сниженной активностью по сравнению с диким типом. В этом варианте осуществления геном клетки-хозяина может являться изогенным по отношению к геному клетки дикого типа, за исключением рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, присутствуют в одинаковых или разных экспрессирующих векторах в клетке, таким образом, вызывая минимальное повреждение генома клетки-хозяина. В этом варианте осуществления геном клетки может являться, по существу, таким же или точно таким же, что и геном клетки дикого типа.

Один из вариантов осуществления относится к рекомбинантной клетке Е. coli, имеющей сниженную активность Tsp и, необязательно, ген spr или его мутантную форму, где модификации активности Tsp и любую мутацию в гене spr осуществляют через изменения генома клеток. Клетку по этому варианту осуществления можно трансформировать с использованием вектора, такого как плазмида, кодирующая вектор DsbC и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154. В одном из вариантов осуществления вектор или плазмида не встраивается в геном клетки.

Термин дикий тип в контексте настоящего изобретения означает штамм грамотрицательных бактериальных клеток в таком виде, в котором они могут существовать в природе или их можно выделять из окружающей среды, не несущий какой-либо рекомбинантный полинуклеотид или генетически введенные мутации. Примером штамма Е. coli дикого типа является штамм K-12 и родственный ему штамм W3110. Штамм Е. coli K-12 к настоящему моменту культивируют уже в течение 90 лет (Bachmann, 52557). Штамм Е. coli K-12 и родственные ему штаммы, такие как W3110, хорошо известны в этой области. Штамм W3110 доступен, например, в American Tissue Culture Collection (ATCC) под регистрационным номером 27325. W3110 имеет генотип: F^-, λ^-, IN(rrnD-rrnE)1, rph-1.

Авторы настоящего изобретения предоставляют рекомбинантную грамотрицательную бактериальную клетку, подходящую для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, содержащую рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC. Клетки по настоящему изобретению содержат рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC. Как применяют в настоящем описании, рекомбинантный полипептид относится к белку, сконструированному или продуцируемому с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Полинуклеотид, кодирующий DsbC, может являться идентичным эндогенному полинуклеотиду, кодирующему DsbC, обнаруживаемому в бактериальных клетках дикого типа. Альтернативно, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, является мутантной версией полинуклеотида DsbC дикого типа, например, измененным таким об

- 6 031449 разом, что из белка DsbC удален участок рестрикции, такой как участок EcoRI, и/или гистидиновая метка. Пример модифицированного полинуклеотида DsbC для использования в настоящем изобретении представлен в SEQ ID NO: 45, кодирующей последовательность DsbC с гистидиновой меткой, представленную в SEQ ID NO: 46.

DsbC отличается наличием активного центра, содержащего аминокислоты -СХХС-, где XX представляет собой аминокислоты GY. Варианты DsbC включают, где каждый X представляет собой независимо выбранную аминокислоту (при условии, что XX не представляет собой GY). Примеры XX включают NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH, RF, FA, GA, MA, GI или AV.

В одном из вариантов осуществления клетка-хозяин по изобретению содержит вариант DsbC, например, в котором изменяют активный центр, в частности, как описано выше.

В одном из вариантов осуществления вариант DsbC обладает, по меньшей мере, биологической активностью белка дикого типа, например, измеряемую с помощью анализа in vitro.

В одном из вариантов осуществления вариант DsbC имеет большую биологическую активность, чем белок дикого типа, например, измеряемую с помощью анализа in vitro.

В одном из вариантов осуществления вариант DsbC содержит изменение в активном центре СХХС-, где XX представляет собой NY, SF, TF, MF, GF, HH, VH, SH.

В одном из вариантов осуществления DsbC представляет собой дикий тип.

Авторы настоящего изобретения определяли, что выбор экспрессии рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, в бактериальной клетке, обеспечивал получение улучшенной клетки-хозяина для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154. Клетки по настоящему изобретению обладают улучшенным фенотипом состояния клеток и роста по сравнению с бактериальными клетками дикого типа.

Как применяют в настоящем описании, термин улучшенное состояние клеток предназначен для обозначения одного или нескольких улучшенных свойств по сравнению с клетками, не несущими характерные черты настоящего изобретения, например меньшую склонность к лизису клеток в фазу роста или после индукции экспрессии гетерологичного белка в клетке или другое благоприятное свойство, известное специалистам в этой области.

Клетки по настоящему изобретению демонстрируют улучшенный выход продукции белка, такого как антитело или фрагмент антитела, по сравнению с бактериальными клетками дикого типа. Улучшенный выход белка может являться скоростью продукции белка и/или продолжительностью продукции белка в клетке. Улучшенный выход белка может являться выходом периплазматического белка и/или выходом белка в супернатанте. Рекомбинантные бактериальные клетки могут быть способны к более быстрой скорости продукции белка, такого как антитело или его фрагмент, и, таким образом, одинаковое количество интересующего белка можно получать за более короткое время по сравнению с немутантной бактериальной клеткой. Более высокая скорость продукции интересующего белка может являться особенно значимой в начальный период роста клеток, например в первые 5, 10, 20 или 30 ч после индукции экспрессии белка.

Клетки по настоящему изобретению предпочтительно демонстрируют выход в периплазме и/или среде приблизительно 1,0, 1,5, 1,8, 2,0, 2,4, 2,5, 3,0, 3,5 или 4,0 г/л антитела.

Преимущественно сниженная активность белка Tsp и/или коэкспрессия DsbC приводит к снижению получения нежелательных примесей, обозначаемых в настоящем описании как фрагмент легкой цепи (LC), см., например, фиг. 5.

Специалист в этой области легко сможет тестировать предполагаемый клон клетки для определения того, имеет ли он желаемый выход интересующего белка, с использованием способов, хорошо известных в этой области, включая способ ферментации, ELISA и ВЭЖХ с протеином G. Подходящие способы ферментации описывают в Humphreys et al., 193-202; Backlund et al., 358-65, включенных в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Специалист в этой области также легко может тестировать секретируемый белок для определения того, правильно ли сворачивается белок, с использованием x хорошо известных в этой области способов, таких как ВЭЖХ с протеином G, определение кругового дихроизма, ЯМР, рентгеноструктурная кристаллография и способы измерения аффинности к эпитопу.

В одном из вариантов осуществления клетка по настоящему изобретению по сравнению с соответствующей клеткой дикого типа, такой как, например, штамм Е. coli W3110 K-12, также экспрессирует или гиперэкспрессирует один или несколько следующих дополнительных белков:

один или несколько белков, способных облегчать фолдинг белка, таких как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD; и/или один или несколько белков, способных облегчать секрецию или транслокацию белка, таких как SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY и Lep; и/или один или несколько белков, способных облегчать образование дисульфидной связи, таких как DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

Один или несколько полинуклеотидов, кодирующих указанные выше белки, можно встраивать в геном клетки и/или экспрессирующий вектор.

В одном из вариантов осуществления клетка по настоящему изобретению не экспрессирует или

- 7 031449 экспрессирует на низком уровне, являющемся по меньшей мере на 50, 75 или 90% более низким, чем уровень в соответствующей клетке дикого типа, такой как, например, штамм Е. coli W3110 K-12, один или несколько следующих дополнительных белков:

один или несколько белков, способных облегчать фолдинг белка, таких как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD;

один или несколько белков, способных облегчать секрецию или транслокацию белка, таких как SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY и Lep; и один или несколько белков, способных облегчать образование дисульфидной связи, таких как DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.

В одном из вариантов осуществления клетка по настоящему изобретению также экспрессирует один или несколько дополнительных белков, выбранных из FkpA, Skp и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления клетка дополнительно содержит один или несколько из следующих мутантных генов:

a) мутантный ген spr;

b) мутантный ген Tsp, где мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность, или является подвергнутым нокауту мутантным геном Tsp;

c) мутантный ген DegP, кодирующий белок DegP, имеющий шаперонную активность и сниженную протеазную активность;

d) мутантный ген ptr, где мутантный ген ptr кодирует белок протеазу III, имеющий сниженную протеазную активность, или является подвергнутым нокауту мутантным геном ptr; и

e) мутантный ген OmpT, где мутантный ген OmpT кодирует белок OmpT, имеющий сниженную протеазную активность, например, как представлено в SEQ ID NO: 42, или является подвергнутым нокауту мутантным геном OmpT, например, как представлено в SEQ ID NO: 40.

В основном варианте осуществления изобретения грамотрицательная бактериальная клетка не несет подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp, такой как, дефектный хромосомный Tsp.

Последняя мутация, в частности, важна в продукции антител и их фрагментов, специфически связывающихся с CD154, т.к. активность протеазы Tsp может приводить к расщеплению антитела-продукта в областях изгибов, таким образом, приводя к получению побочного продукта в значительных количествах и снижению выхода желаемого продукта.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления клетка по настоящему изобретению содержит мутантный ген Tsp, где мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность, или является подвергнутым нокауту мутантным геном Tsp, а также кодирует белок DsbC в дополнение к антителу или его фрагменту, специфически связывающемуся с CD154.

В вариантах осуществления настоящего изобретения клетка дополнительно содержит мутантный ген spr. Белок spr является мембраносвязанной периплазматической протеазой E.coli.

Аминокислотная последовательность белка Spr дикого типа представлена в SEQ ID NO: 24 с сигнальной последовательностью на N-конце (аминокислоты 1-26 согласно записи с регистрационным номером UniProt P0AFV4). Нумерация аминокислот в последовательности белка Spr в настоящем изобретении включает сигнальную последовательность. Таким образом, аминокислота 1 белка Spr является первой аминокислотой (Met), представленной в SEQ ID NO: 24.

В вариантах осуществления, где клетка по настоящему изобретению содержит мутантный ген spr, мутантный ген spr предпочтительно является хромосомным геном spr клетки. Мутантный ген spr кодирует белок Spr, способный супрессировать неблагоприятный фенотип, ассоциированный с клеткой, содержащей мутантный ген Tsp. Клетки, несущие мутантный ген Tsp, могут иметь хорошую скорость роста клеток, но одним из ограничений для таких клеток является их склонность к лизису, особенно при высокой плотности клеток. Таким образом, фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp, проявляется в склонности к лизису, особенно при высокой плотности клеток.

Клетки, несущие мутантный ген Tsp, демонстрируют термочувствительный рост при низкой осмоляльности. Однако мутации spr, который несут клетки по настоящему изобретению, при встраивании в клетку, имеющую сниженную активность Tsp, супрессируют этот фенотип термочувствительного роста при низкой осмоляльности, и клетка демонстрирует снижение лизиса, в частности, при высокой плотности клеток. Специалист в этой области легко может измерять этот фенотип термочувствительного роста клетки при ферментации во встряхиваемой колбе или ферментации культур с высокой плотностью клеток. Супрессия лизиса клеток очевидна из улучшенной скорости роста и/или продукции рекомбинантного белка, в частности, в периплазме, демонстрируемых клеткой, несущей мутантный spr и имеющей сниженную активность Tsp, по сравнению с клеткой, несущей мутантный Tsp и spr дикого типа.

Клетки по настоящему изобретению предпочтительно содержат мутантный ген spr, кодирующий белок spr, содержащий замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из N31, R62, I70, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, Н145, G147, Н157 и W174, более предпочтительно - одной или нескольких аминокислот, выбранных из С94, S95, V98, Y115, D133, V135, Н145, G147, Н157 и W174. Предпочтительно мутантный ген spr кодирует белок spr, содержащий замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из N31, R62, I70, Q73, С94, S95, V98, Q99, R100, L108,

- 8 031449

Y115, D133, V135, L136, G140, R144, Н145, G147 и Н157, более предпочтительно одной или нескольких аминокислот, выбранных из С94, S95, V98, Y115, D133, V135, Н145, G147 и Н157. В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не содержит любые дополнительные замены аминокислот. Предпочтительно мутантный ген spr кодирует белок spr, содержащий замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 и G147, более предпочтительно одной или несколько аминокислот, выбранных из S95, V98, Y115, D133, V135 и G147. В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не содержит любые дополнительные замены аминокислот.

Авторы настоящего изобретения идентифицировали изменения в spr, способный супрессировать фенотип роста клетки, содержащей мутантный ген Tsp.

Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаруживали, что клетки, несущие рекомбинантный ген DsbC, мутантный ген spr и имеющие сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа, проявляют повышенную скорость роста клеток и повышенную продолжительность выживания клеток по сравнению с клеткой, содержащей мутантный ген Tsp. В частности, клетки, несущие рекомбинантный ген DsbC, изменение в белке spr и имеющие сниженную активность белка Tsp, демонстрируют снижение лизиса клеток при культивировании по сравнению с клетками, несущими мутантный ген Tsp.

Замена одной или нескольких из указанных выше аминокислот в spr может являться результатом любой подходящей миссенс-мутации в одном, двух или трех нуклеотидах, кодирующих аминокислоту. Мутация приводит к замене аминокислотного остатка любой подходящей аминокислотой, что приводит к образованию мутантного белка spr, способного супрессировать фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. Миссенс-мутация может приводить к замене аминокислоты аминокислотой, имеющей другой размер и/или другие химические свойства по сравнению с аминокислотой в белке дикого типа.

В одном из вариантов осуществления замена относится к одной, двум или трем из каталитических триад аминокислотных остатков C94, Н145 и Н157 (Aramini et al., 9715-17).

Таким образом, мутантный ген spr может содержать мутацию, затрагивающую аминокислоту С94; или мутацию, затрагивающую аминокислоту H145; или мутацию, затрагивающую аминокислоту H157; или мутацию, затрагивающую аминокислоты С94 и H145; или мутацию, затрагивающую аминокислоты С94 и H157; или мутацию, затрагивающую аминокислоты H145 и H157; или мутацию, затрагивающую аминокислоты С94, H145 и H157.

В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не содержит любых других замен аминокислот.

Одну, две или три из С94, H145 и H157 можно заменять любой подходящей аминокислотой, что приводит к образованию белка spr, способного супрессировать фенотип клеток, содержащих мутантный ген Tsp. Например, одну, две или три из С94, Н145 и Н157 можно заменять небольшой аминокислотой, такой как Gly или Ala. Таким образом, ген spr может содержать одну, две или три мутации, приводящие к заменам С94А (т.е. цистеин в положении 94 заменяют аланином), Н14 5А (т.е. гистидин в положении 145 заменяют аланином) и Н157А (т.е. гистидин в положении 157 заменяют аланином). Предпочтительно ген spr содержит миссенс-мутацию, приводящую к замене Н145А, которая, как обнаружено, приводит к образованию белка spr, способного супрессировать фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp.

В настоящем описании обозначение замены состоит из буквы, за которой следует число, за которым следует буква. Первой буквой обозначают аминокислоту в белке дикого типа. Число относится к положению аминокислоты, в котором осуществляют замену аминокислоты, и второй буквой обозначают аминокислоту, используемую для замены аминокислоты дикого типа.

В предпочтительном варианте осуществления мутантный белок spr содержит замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 и G147, предпочтительно - замену одной или нескольких аминокислот, выбранных из S95, V98, Y115, D133, V135 и G147. В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не содержит любые дополнительные мутации. Таким образом, мутантный ген spr может содержать мутацию, затрагивающую аминокислоту N31; или мутацию, затрагивающую аминокислоту R62; или мутацию, затрагивающую аминокислоту I70; или мутацию, затрагивающую аминокислоту Q73; или мутацию, затрагивающую аминокислоту S95; или мутацию, затрагивающую аминокислоту V98; или мутацию, затрагивающую аминокислоту Q99; или мутацию, затрагивающую аминокислоту R100; или мутацию, затрагивающую аминокислоту L108; или мутацию, затрагивающую аминокислоту Y115; или

- 9 031449 мутацию, затрагивающую аминокислоту D133; или мутацию, затрагивающую аминокислоту VI35; или мутацию, затрагивающую аминокислоту L136; или мутацию, затрагивающую аминокислоту G140; или мутацию, затрагивающую аминокислоту R144; или мутацию, затрагивающую аминокислоту G147.

В одном из вариантов осуществления мутантный ген spr содержит многочисленные мутации, затрагивающие аминокислоты:

S95 и Y115; или

N31, Q73, R100 и G140; или

Q73, R100 и G140; или

R100 и G140; или

Q73 и G140; или

Q73 и R100; или

R62, Q99 и R144 или

Q99 и R144.

Одну или несколько из аминокислот N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 и G147 можно заменять любой подходящей аминокислотой, что приводит к образованию белка spr, способного супрессировать фенотип клетки, содержащей мутантный ген Tsp. Например, одну или несколько из N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 и R144 можно заменять небольшой аминокислотой, такой как Gly или Ala.

В предпочтительном варианте осуществления белок spr содержит одну или несколько из следующих замен: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D или V135G, L136P, G140C, R144C и G147C. Предпочтительно белок spr содержит одну или несколько из следующих замен: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D или V135G и G147C. В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не содержит любые дополнительные замены аминокислот.

В одном из вариантов осуществления белок spr содержит только одну замену аминокислоты, выбранную из N31Y, R62C, I70T, Q73R, С94А, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D или V135G, L136P, G140C, R144C и G147C, в частности С94А. В этом варианте осуществления белок spr предпочтительно не содержит любые дополнительные замены аминокислот.

В дополнительном варианте осуществления белок spr содержит многочисленные замены, выбранные из:

S95F и Y115F;

N31Y, Q73R, R100G и G140C;

Q73R, R100G и G140C;

R100G и G140C;

Q73R и G140C;

Q73R и R100G;

R62C, Q99P и R144C или

Q99P и R144C.

Предпочтительно мутантный ген spr кодирует белок spr, содержащий замены аминокислот, выбранные из С94А, D133A, Н145А и Н157А, в частности С94А.

В дополнительном варианте осуществления мутантный ген spr кодирует белок spr, содержащий замену аминокислоты W174R. В альтернативном варианте осуществления белок spr не содержит замену аминокислоты W174R.

Клетка по настоящему изобретению имеет сниженную активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа.

Выражение сниженная активность белка Tsp по сравнению с клеткой дикого типа означает, что активность Tsp в клетке снижена по сравнению с активностью Tsp в клетке дикого типа. Клетку можно модифицировать любыми подходящими средствами для снижения активности Tsp.

В одном из вариантов осуществления сниженная активность Tsp является результатом модификации эндогенного полинуклеотида, кодирующего Tsp и/или соответствующих регулирующих экспрессию последовательностей. Модификация может снижать или останавливать транскрипцию и трансляцию гена Tsp или может обеспечивать экспрессию белка Tsp, имеющего сниженную протеазную активность по сравнению с белком Tsp дикого типа.

В одном из вариантов осуществления соответствующую регулирующую экспрессию последовательность модифицируют для снижения экспрессии Tsp. Например, промотор гена Tsp можно подвергать мутагенезу для предотвращения экспрессии гена.

В предпочтительном варианте осуществления клетка по настоящему изобретению несет мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность, или подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp. Предпочтительно хромосомный ген Tsp является мутантным.

Как применяют в настоящем описании, термин ген Tsp означает ген, кодирующий протеазу Tsp

- 10 031449 (также известную как Prc), являющуюся периплазматической протеазой, способной действовать на пенициллинсвязывающий белок-3 (PBP3) и белки отростка фага. Последовательность гена Tsp дикого типа представлена в SEQ ID NO: 25, а последовательность белка Tsp дикого типа представлена в SEQ ID NO: 26.

Ссылка на мутантный ген Tsp или мутантный ген Tsp, кодирующий Tsp, если не указано иначе, относится к мутантному гену Tsp, кодирующему белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность, или подвергнутому нокауту мутантному гену Tsp.

В контексте настоящего изобретения выражение мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp, имеющий сниженную протеазную активность означает, что белок, кодируемый мутантным геном Tsp, не имеет полную протеазную активность по сравнению с белком, кодируемым немутантным геном Tsp дикого типа.

Предпочтительно мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp, имеющий 50 или менее, 40 или менее, 30 или менее, 20 или менее, 10 или менее или 5% или менее протеазной активности немутантного белка Tsp дикого типа. Более предпочтительно мутантный ген Tsp кодирует белок Tsp, не имеющий протеазной активности. В этом варианте осуществления клетка не является дефектной по хромосомному гену Tsp, т.е. последовательность гена Tsp не подвергают делеции или мутагенезу для предотвращения экспрессии любой формы белка Tsp.

Для получения белка, имеющего сниженную протеазную активность, в ген Tsp можно вносить любую подходящую мутацию. Специалист в этой области легко может тестировать протеазную активность белка Tsp, экспрессируемого грамотрицательной бактерией, любым подходящим способом, известным в этой области, таким как способ, описываемый в Keiler et al. (Keiler and Sauer, 28864-68), включенной в настоящее описание в полном объеме в качестве ссылки, где тестировали протеазную активность Tsp.

В Keiler et al. (см. выше) описано, что Tsp имеет активный центр, содержащий остатки S430, D441 и K455, а остатки G375, G37 6, Е433 и Т452 важны для поддержания структуры Tsp. В Keiler et al. (см. выше) приведены данные о том, что гены Tsp с мутациями, приводящими к заменам аминокислот S430A, D441A, 1<455А. K455B, K455R, G375A, G376A, Е433А и Т452А, кодируют белки, у которых не обнаруживали протеазную активность. Также сообщали, что ген Tsp с мутациями, приводящими к замене S430C, кодирует белок, проявляющий приблизительно 5-10% активности белка дикого типа. Таким образом, мутация в гене Tsp для получения белка, имеющего сниженную протеазную активность, может включать мутацию, такую как миссенс-мутация, приводящая к замене одного или нескольких из остатков S430, D441, 455, G375, G376, Е433 и Т452. Предпочтительно мутация в гене Tsp для получения белка, имеющего сниженную протеазную активность, может включать мутацию, такую как миссенсмутация, затрагивающая один, два или все три остатка S430, D441 и K455 в активном центре.

Таким образом, мутантный ген Tsp может содержать мутацию, затрагивающую аминокислоту S430; или мутацию, затрагивающую аминокислоту D441; или мутацию, затрагивающую аминокислоту K455; или мутацию, затрагивающую аминокислоты S430 и D441; или мутацию, затрагивающую аминокислоты S430 и K455; или мутацию, затрагивающую аминокислоты D441 и K455; или мутацию, затрагивающую аминокислоты S430, D441 и K455.

Один или несколько из остатков S430, D441, K455, G375, G376, Е433 и Т452 можно заменять любой подходящей аминокислотой, приводящей к образованию белка, имеющего сниженную протеазную активность. Примерами подходящих замен являются S430A, S430C, D441A, 1<455А, K455n, K455R, G375A, G376A, Е433А и Т452А. Мутантный ген Tsp может содержать одну, две или три мутации, приводящие к заменам остатков в активном центре, например ген может содержать мутации, приводящие к заменам:

S430A или S430C; и/или

D441A; и/или

455А или K455B или K455R.

Предпочтительно ген Tsp содержит мутацию, приводящую к замене S430A или S430C.

В контексте настоящего изобретения выражение подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp означает, что ген Tsp содержит одну или несколько мутаций, предотвращающих экспрессию белка Tsp, кодируемого геном дикого типа, для получения клетки, дефектной по белку Tsp. Подвергнутый нокауту ген может транскрибироваться частично или полностью, но не транслироваться в кодируемый белок. Подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp можно подвергать мутагенезу любым подходящим способом, например, с помощью одной или нескольких делеций, инсерций, точечных мутаций, миссенс-мутаций, нонсенс-мутаций и мутаций со сдвигом рамки считывания для предотвращения экспрессии белка. Например, ген можно подвергать нокауту с помощью инсерции чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирующую последовательность гена.

В предпочтительном варианте осуществления ген Tsp не подвергают мутагенезу с помощью инсерции чужеродной последовательности ДНК, такой как маркер устойчивости к антибиотику, в кодирую

- 11 031449 щую последовательность гена. В одном из вариантов осуществления ген Tsp содержит мутацию в инициаторном кодоне гена и/или в одном или нескольких стоп-кодонах, расположенных ниже в 5'-3' направлении от инициаторного кодона гена и выше в 3'-5' направлении от стоп-кодона гена, таким образом, предотвращая экспрессию белка Tsp. Мутация в инициаторном кодоне может являться миссенсмутацией одного, двух или всех трех нуклеотидов инициаторного кодона. Альтернативно или дополнительно, инициаторный кодон можно подвергать мутагенезу с помощью инсерционной или делетационной мутации со сдвигом рамки считывания. Ген Tsp содержит два кодона ATG на 5'-конце кодирующей последовательности, один или оба кодона ATG можно подвергать мутагенезу с помощью миссенсмутации. Ген Tsp можно подвергать мутагенезу по второму кодону ATG (кодону 3) с заменой его на TCG, как показано на фиг. 10. Альтернативно или дополнительно, ген Tsp может содержать один или несколько стоп-кодонов, расположенных ниже в 5'-3' направлении от инициаторного кодона гена и выше в 3'-5' направлении от стоп-кодона гена. Предпочтительно подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp содержит и миссенс-мутацию в инициаторном кодоне, и один или несколько встроенных стоп-кодонов. В предпочтительном варианте осуществления ген Tsp подвергают мутагенезу для делеции Т из пятого кодона, таким образом, вызывая сдвиг рамки считывания, приводящий к образованию стоп-кодонов в кодонах 11 и 16, как показано на фиг. 10. В предпочтительном варианте осуществления ген Tsp подвергают мутагенезу для инсерции участка рестрикции AseI для создания третьего стоп-кодона в рамке считывания в кодоне 21, как показано на фиг. 10.

В предпочтительном варианте осуществления подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp имеет последовательность ДНК SEQ ID NO: 25, включающую 6 нуклеотидов ATGAAT выше в 3'-5' направлении от инициаторного кодона. Мутации, осуществленные в подвергнутой нокауту мутантной последовательности Tsp SEQ ID NO: 25, представлены на фиг. 10. В одном из вариантов осуществления мутантный ген Tsp имеет последовательность ДНК нуклеотидов 7-2048 из SEQ ID NO: 25.

В вариантах осуществления настоящего изобретения клетка содержит мутантный ген DegP. Как применяют в настоящем описании, DegP означает ген, кодирующий белок DegP (также известный как HtrA), выполняющий двойную функцию шаперона и протеазы. Последовательность гена DegP дикого типа представлена в SEQ ID NO: 29, а последовательность немутантного белка DegP представлена в SEQ ID NO: 30.

При низких температурах DegP функционирует как шаперон, а при высоких температурах DegP предпочтительно функционирует как протеаза.

В вариантах осуществления, в которых клетка содержит мутацию в DegP, мутация DegP в клетке приводит к образованию мутантного гена DegP, кодирующего белок DegP, имеющий шаперонную активность, но не полную протеазную активность.

В контексте настоящего изобретения выражение имеющий шаперонную активность означает, что мутантный белок DegP имеет ту же или, по существу, ту же шаперонную активность, что и немутантный белок DegP дикого типа. Предпочтительно мутантный ген DegP кодирует белок DegP, имеющий 50 или более, 60 или более, 70 или более, 80 или более, 90 или более или 95% или более шаперонной активности немутантного белка DegP дикого типа. Более предпочтительно мутантный ген DegP кодирует белок DegP, имеющий ту же шаперонную активность, что и DegP дикого типа.

В контексте настоящего изобретения выражение имеющий сниженную протеазную активность означает, что мутантный белок DegP не имеет полную протеазную активность относительно немутантного белка DegP дикого типа. Предпочтительно мутантный ген DegP кодирует белок DegP, имеющий 50 или менее, 40 или менее, 30 или менее, 20 или менее, 10 или менее или 5% или менее протеазной активности немутантного белка DegP дикого типа. Более предпочтительно мутантный ген DegP кодирует белок DegP, не имеющий протеазной активности. Клетка не является дефектной по хромосомному гену DegP, т.е. последовательности гена DegP не подвергают делеции или мутагенезу для предотвращения экспрессии любой формы белка DegP.

Для получения белка, имеющего шаперонную активность и сниженную протеазную активность, в ген DegP можно вносить любую подходящую мутацию. Специалист в этой области легко может тестировать протеазную и шаперонную активности белка DegP, экспрессируемого грамотрицательной бактерией, любым подходящим способом, например, в котором протеазную и шаперонную активности DegP тестируют с использованием MalS, природного субстрата DegP.

DegP является сериновой протеазой и имеет активный центр, состоящий из каталитической триады аминокислотных остатков His105, Asp135 и Ser210. Мутация в гене DegP для получения белка, имеющего шаперонную активность и сниженную протеазную активность, может включать мутацию, такую как миссенс-мутация, затрагивающая одну, две или три из His105, Asp135 и Ser210.

Таким образом, мутантный ген DegP может содержать мутацию, затрагивающую аминокислоту His105; или мутацию, затрагивающую аминокислоту Asp135; или мутацию, затрагивающую аминокислоту Ser210; или мутацию, затрагивающую аминокислоты His105 и Asp135; или мутацию, затрагивающую аминокислоты His105 и Ser210; или

- 12 031449 мутацию, затрагивающую аминокислоты Asp135 и Ser210; или мутацию, затрагивающую аминокислоты His105, Asp135 и Ser210.

Одну, две или три из His105, Asp135 и Ser210 можно заменять любой подходящей аминокислотой, что приводит к образованию белка, имеющего шаперонную активность и сниженную протеазную активность. Например, одну, две или три из His105, Asp135 и Ser210 можно заменять небольшой аминокислотой, такой как Gly или Ala. Дополнительной подходящей мутацией является замена одной, двух или трех из His105, Asp135 и Ser210 аминокислотой, имеющей свойства, противоположные свойствам Asp135, заменяемой на Lys или Arg, полярную His105 заменяют неполярной аминокислотой, такой как Gly, Ala, Val или Leu, и небольшую гидрофильную Ser210 заменяют большим или гидрофобным остатком, таким как Val, Leu, Phe или Tyr. Предпочтительно ген DegP содержит мутацию, приводящую к замене S210A, как показано на фиг. 11, которая, как обнаруживали, приводит к образованию белка, имеющего шаперонную активность, но не протеазную активность.

DegP имеет два домена PDZ, PDZ1 (остатки 260-358) и PDZ2 (остатки 359-448), опосредующих белок-белковое взаимодействие. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ген degP подвергают мутагенезу для делеции домена PDZ1 и/или домена PDZ2. Делеция PDZ1 и PDZ2 приводит к полной утрате протеазной активности белка DegP и более низкой шаперонной активности по сравнению с белком DegP дикого типа, в то время как делеция любого из PDZ1 или PDZ2 приводит к уровню 5% протеазной активности и аналогичной шаперонной активности относительно белка DegP дикого типа.

Мутантный ген DegP также может содержать молчащий неприродный участок рестрикции, такой как AseI, для облегчения осуществления способов идентификации и скрининга, например, как показано на фиг. 11.

Предпочтительная последовательность мутантного гена DegP, содержащего точечную мутацию, приводящую к замене S210A, и маркерный участок рестрикции AseI, представлена в SEQ ID NO: 31, и последовательность кодируемого белка представлена в SEQ ID NO: 27. Мутации, осуществляемые в последовательности мутантного DegP SEQ ID NO: 32, представлены на фиг. 11.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, где клетка содержит мутантный ген DegP, кодирующий белок DegP, имеющий шаперонную активность и сниженную протеазную активность, одна или несколько клеток, к которым относится настоящее изобретение, могут обеспечивать улучшенный выход продукции правильно свернутых белков относительно мутантных клеток, где ген DegP подвергали мутагенезу для нокаута DegP, предотвращая экспрессию DegP, такого как дефектный хромосомный DegP. В клетке, содержащей подвергнутый нокауту мутантный ген DegP, предотвращающий экспрессию DegP, шаперонная активность DegP полностью утрачивается, в то время как в клетке по настоящему изобретению шаперонная активность DegP сохраняется при полной утрате протеазной активности. В этих вариантах осуществления одна или несколько клеток по настоящему изобретению имеют меньшую протеазную активность для предотвращения протеолиза белка при сохранении шаперонной активности для осуществления правильного фолдинга и транспорта белка в клетке-хозяине.

В одном из вариантов осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет подвергнутый нокауту мутантный ген OmpT, например, являясь дефектной по хромосомному OmpT SEQ ID NO: 39.

В одном из вариантов осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет подвергнутый нокауту мутантный ген DegP, например, являясь дефектной по хромосомному degP. В одном из вариантов осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет мутантный ген DegP.

В одном из вариантов осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет в подвергнутый нокауту мутантный ген ptr, например, являясь дефектной по хромосомному ptr.

В одном из вариантов осуществления грамотрицательная бактериальная клетка по настоящему изобретению не несет мутантный ген spr.

Для получения рекомбинантной клетки по настоящему изобретению в качестве родительской клетки можно использовать любую подходящую грамотрицательную бактерию. Подходящая грамотрицательная бактерия включает Salmonella typhiinurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и E. coli. Предпочтительно родительской клеткой является E. coli. В настоящем изобретении можно использовать любой подходящий штамм Е. coli, но предпочтительно используют штамм W3110 дикого типа, такой как K-12 W3110.

Недостаток, ассоциированный со штаммами, полученными ранее и используемыми для экспрессии рекомбинантных белков, включает использование мутаций в генах, вовлеченных в метаболизм клетки и репликацию ДНК, таких как, например phoA, fhuA, lac, тес, gal, ara, arg, thi и pro в штаммах Е. coli. Эти мутации могут оказывать многочисленные вредные воздействия на клетку-хозяина, включая эффекты в отношении роста клеток, стабильности, просачивания белков из периплазматического пространства, выхода экспрессии рекомбинантного белка и токсичности. Штаммы, имеющие одну или несколько из этих геномных мутаций, в частности штаммы, имеющие большое количество этих мутаций, могут демонстри

- 13 031449 ровать утрату формы, что снижает скорость роста бактерий до уровня, не подходящего для промышленной продукции белка. Кроме того, любая из указанных выше геномных мутаций может затрагивать другие гены в цис- и/или транс-положении непредсказуемым неблагоприятным образом, таким образом, изменяя фенотип штамма, форму клеток и белковый профиль. Кроме того, использование в значительной степени мутантных клеток, как правило, не подходит для получения рекомбинантных белков для коммерческого использования, в частности, в терапевтических средствах, т.к. такие штаммы, как правило, имеют дефектные метаболические пути и, таким образом, могут плохо расти или не расти в минимальной или химически определенной среде.

В предпочтительном варианте осуществления клетки несут только минимальные мутации для встраивания рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и, необязательно, мутацию, приводящую к сниженной протеазной активности Tsp, и, необязательно, ген spr или его мутантную форму.

В одном из вариантов осуществления, где полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, встраивают в геном клетки, осуществляют только минимальные мутации в геноме клетки для встраивания рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC и/или антитело. В дополнительном варианте осуществления, где рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело, присутствуют в одном и том же или разных экспрессирующих векторах, геном предпочтительно является изогенным относительно генома клетки дикого типа.

В одном из вариантов осуществления клетки не несут любые другие мутации, которые могут оказывать вредные воздействия на рост клеток и/или способность экспрессировать интересующий белок. Таким образом, одна или несколько рекомбинантных клеток-хозяев по настоящему изобретению могут проявлять улучшенную экспрессию белка и/или улучшенные характеристики роста по сравнению с клетками, содержащими генетически введенные мутации в последовательности генома. Клетки по настоящему изобретению также являются более пригодными для использования в получении терапевтических белков по сравнению с клетками, имеющими повреждения генома клетки.

В предпочтительном варианте осуществления клетка является изогенной относительно клетки Е. coli дикого типа, за исключением рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD 154, и, необязательно, мутацию, приводящую к сниженной протеазной активности Tsp, и, необязательно, ген spr или его мутантную форму.

Один из вариантов осуществления относится к клетке, изогенной штамму W3110 Е. coli, за исключением сниженной активности Tsp и гена spr или его мутантной формы, для использования вместе с плазмидой, подходящей для экспрессии DsbC и антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154.

Более предпочтительно клетка по настоящему изобретению является изогенной штамму W3110 Е. coli за исключением рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154.

Клетка по настоящему изобретению содержит один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антигенсвязывающий фрагмент антитела со специфичностью к CD154.

Как применяют в настоящем описании, термин клетка, содержащая предназначен для обозначения того, куда указанный объект встраивают в геном клетки, или где клетка содержит содержащий его вектор, такой как плазмида, как правило, для экспрессии объекта.

Антитело или фрагмент антитела может являться мультивалентным, полиспецифичным, гуманизированным, полностью человеческим или химерным. Антитело или фрагмент антитела может принадлежать любому виду, но предпочтительно его получают из моноклонального антитела, антитела человека или гуманизированного фрагмента. Фрагмент антитела можно получать из любого класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD или IgA) или подкласса иммуноглобулиновых молекул, и его можно получать из любого вида, включая, например, мышь, крысу, акулу, кролика, свинью, хомяка, верблюда, ламу, козу или человека. Части фрагмента антитела можно получать из нескольких видов, например фрагменты антител могут являться химерными. В одном примере константные области получают из одного вида, а вариабельные области - из другого.

Фрагмент антитела может являться VH, VL, VHH, Fab-, модифицированным Fab-, Fab'-, F(ab')₂- или Fv-фрагментом; мономером или димером легкой цепи или тяжелой цепи; а также диателом; триотелом; тетрателом; миниантителом; доменным антителом или одноцепочечным антителом, например одноцепочечным Fv, в котором вариабельные домены тяжелых и легких цепей соединяют пептидным линкером, Fab-Fv, или антителом с двойной специфичностью, таким как Fab-dAb, как описано в WO 2009/040562. Аналогично, вариабельные области тяжелой и легкой цепи при необходимости можно комбинировать с другими доменами антитела. В этой области известны фрагменты антител (Holliger and Hudson, 1126-36).

Антитело, специфически связывающееся с CD154, предпочтительно является антителом 342, опи

- 14 031449 сываемым в WO 2008/118356 (содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки) или содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи антитела 342, описываемого в WO 2008/118356. Фрагмент антитела, специфически связывающийся с CD154, предпочтительно получают из антитела 342, описываемого в WO 2008/118356 и/или содержащего CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи указанного антитела.

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела, специфически связывающийся с CD154, содержит тяжелую цепь, где вариабельный домен содержит три CDR, где CDR выбраны из SEQ ID NO: 1 для CDRH1, SEQ ID NO: 2 для CDRH2 и SEQ ID NO: 3 для CDRH3.

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела, специфически связывающийся с CD154, содержит легкую цепь, где вариабельный домен содержит три CDR, где CDR выбраны из SEQ ID NO: 4 для CDRL1, SEQ ID NO: 5 для CDRL2 и SEQ ID NO: 6 для CDRL3.

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела, специфически связывающийся с CD154, содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 для CDRH1, последовательность SEQ ID NO: 2 для CDRH2 и последовательность SEQ ID NO: 3 для CDRH3.

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела, специфически связывающийся с CD154, содержит легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 для CDRL1, последовательность SEQ ID NO: 5 для CDRL2 и последовательность SEQ ID NO: 6 для CDRL3.

В одном из вариантов осуществления антитело или фрагмент антитела, специфически связывающийся с CD154, содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 для CDRH1, последовательность SEQ ID NO: 2 для CDRH2 и последовательность SEQ ID NO: 3 для CDRH3, и легкую цепь, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 для CDRL1, последовательность SEQ ID NO: 5 для CDRL2 и последовательность SEQ ID NO: 6 для CDRL3.

Антитело предпочтительно является молекулой антитела с пересаженными CDR, и, как правило, вариабельный домен содержит акцепторные каркасные области человека и донорную не принадлежащую человеку CDR.

Предпочтительно антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (SEQ ID NO: 7) и вариабельный домен тяжелой цепи (SEQ ID NO: 9).

Предпочтительно антитело является Fab-фрагментом.

Предпочтительно Fab-фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую последовательность, указанную как SEQ ID NO: 14 или состоящую из нее, и легкую цепь, содержащую последовательность, указанную как SEQ ID NO: 12, или состоящую из нее. Аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 12, предпочтительно кодируют нуклеотидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 11 соответственно.

Альтернативно, предпочтительно фрагмент антитела является модифицированным Fabфрагментом, где модификацией является добавление на С-конец его тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот для возможности прикрепления эффекторной или репортерной молекулы. Предпочтительно дополнительные аминокислоты образуют модифицированную шарнирную область, содержащую один или два остатка цистеина, к которым можно прикреплять эффекторную или репортерную молекулу, как известно в этой области (см., например, WO 98/25971, который в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки).

Клетка по настоящему изобретению содержит последовательность ДНК, кодирующую антитело. Предпочтительно последовательность ДНК кодирует тяжелую и легкую цепь антитела.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления последовательность ДНК кодирует легкую цепь и содержит последовательность, представленную в настоящем описании.

Последовательность ДНК может содержать синтетическую ДНК, например, получаемую химической обработкой, кДНК, геномную ДНК или любую их комбинацию.

Домены константной области антитела, при наличии, можно выбирать с учетом предполагаемой функции молекулы антитела и, в частности, эффекторных функций, которые могут являться необходимыми. Например, домены константной области могут являться доменами IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В частности, можно использовать домены константной области IgG человека, особенно изотипов IgG1 и IgG3, если молекула антитела предназначена для терапевтического использования и необходимы эффекторные функции антитела. Альтернативно, можно использовать изотипы IgG2 и IgG4, если молекула антитела предназначена для терапевтических целей, и эффекторные функции антитела не являются необходимыми, например, просто для блокирования активности CD154.

Антитело можно применять в лечении заболеваний или нарушений, включая воспалительные заболевания и нарушения, иммунные заболевания и нарушения, фиброзные нарушения и злокачественные новообразования.

Термин воспалительное заболевание или аутоиммунное нарушение и иммунное заболевание или нарушение включает ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилит, ювенильный артрит, болезнь Стилла, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, синдром Шегрена, синдром Гудпасчера, болезнь Аддисона, васкулит, включая ANCA-ассоциированный васкулит и гранулематоз Вегенера, первичный биллиарный цирроз, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, ревмати

- 15 031449 ческую полимиалгию, синдром Гийена-Барре, антифосфолипидный синдром, идиопатическую тромбоцитопению, аутоиммунную гемолитическую анемию, пернициозную анемию, обыкновенную пузырчатку, дерматомиозит, буллезный пемфигоид, болезнь Шенлейна-Геноха, болезнь Макла-Уэллса, псориаз, болезнь Крона, язвенный колит, SLE (системную красную волчанку), глютеиновую болезнь, астму, аллергический ринит, атопический дерматит, рассеянный склероз, сахарный диабет I типа, трансплантацию и реакцию трансплантат против хозяина.

Как применяют в настоящем описании, термин фиброзное нарушение относится к нарушению, отличающемуся образованием или развитием избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани, часто, в качестве репаративного или реактивного процесса. Фиброзное нарушение может затрагивать отдельные органы, такие как легкие (в качестве неограничивающих примеров, идиопатический легочный фиброз, интерстициальную болезнь легких), печень, кишечник, почки, сердце или кожу, или затрагивать многие органы, в качестве неограничивающих примеров, при системном склерозе. Термин фиброзное нарушение также относится к рубцеванию кожи. Рубцы кожи включают, в качестве неограничивающих примеров, келоидные рубцы, контрактурные рубцы, развивающиеся, в качестве неограничивающих примеров, после ожогов кожи, гипертрофические рубцы и постугревые рубцы.

Клетка-хозяин по изобретению также может содержать дополнительный полинуклеотид, кодирующий один или несколько дополнительных интересующих белков.

Рекомбинантную грамотрицательную бактериальную клетку по настоящему изобретению можно получать любыми подходящими средствами.

Специалисту в этой области известны подходящие способы, которые можно использовать для встраивания рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и полинуклеотида, кодирующего антитело. Рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно встраивать в геном клетки с использованием подходящего вектора, такого как pKO3, описываемого в Link et al., включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме (Link, Phillips, and Church, 6228-37).

Альтернативно или дополнительно, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или полинуклеотид, кодирующий антитело, можно не встраивать в рекомбинантную экспрессирующую кассету. В одном из вариантов осуществления в настоящем изобретении используют экспрессирующую кассету, несущую полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или полинуклеотид, кодирующий антитело, как правило, содержащий кодирующую белок последовательность, кодирующую DsbC, одну или несколько кодирующих белок последовательностей, кодирующих антитело, и одну или несколько регулирующих экспрессию последовательностей. Одна или несколько регулирующих экспрессию последовательностей могут включать промотор. Одна или несколько регулирующих экспрессию последовательностей также могут включать 3'-нетранслируемую область, такую как терминирующая последовательность. Подходящие промоторы более подробно описаны ниже.

В одном из вариантов осуществления ген, кодирующий DsbC и/или антитело или его фрагмент, встраивают в геном клетки-хозяина для получения стабильной клеточной линии.

В одном из вариантов осуществления клетка по настоящему изобретению содержит один или несколько экспрессирующих векторов, таких как плазмида. Предпочтительно вектор содержит одну или несколько экспрессирующих кассет, определенных выше. Предпочтительно клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD 154, как описано выше. Предпочтительно экспрессирующий вектор содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154.

В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор является экспрессирующим вектором Е. coli.

В одном из вариантов осуществления полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, и полинуклеотид, кодирующий DsbC, встраивают в отдельные экспрессирующие векторы.

Для получения продуктов, содержащих тяжелые и легкие цепи, клеточную линию можно трансформировать с использованием двух векторов, первого вектора, кодирующего полипептид легкой цепи, и второго вектора, кодирующего полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, можно использовать один вектор, вектор, включающий последовательности, кодирующие полипептиды легкой цепи и тяжелой цепи.

Альтернативно, полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, и полинуклеотид, кодирующий DsbC, встраивают в один вектор. Предпочтительно вектор содержит последовательности, кодирующие полипептиды легкой и тяжелой цепи антитела.

Настоящее изобретение также относится к экспрессирующему вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154. Экспрессирующий вектор является полицистронным вектором, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую DsbC, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую антитело.

- 16 031449

Полицистронный вектор можно получать предпочтительным способом клонирования, делающим возможной повторное последовательное клонирование полинуклеотидных последовательностей в вектор. В способе используют совместимые липкие концы пары участков рестрикции, такие как концы AT участков рестрикции AseI и NdeI. Полинуклеотид, содержащий кодирующую последовательность и имеющий совместимые липкие концы, такие как фрагмент AseI-NdeI, можно клонировать по участкам рестрикции в векторе, таким как NdeI. Инсерция полинуклеотидной последовательности разрушает 5'участок рестрикции, но приводит к образованию нового 3'-участка рестрикции, такого как NdeI, который затем можно использовать для инсерции дополнительной полинуклеотидной последовательности, содержащей совместимые липкие концы. Затем способ можно повторять для встраивания дополнительных последовательностей. Каждая полинуклеотидная последовательность, встраиваемая в вектор, содержит 3'-некодирующую последовательность до стоп-кодона, которая может содержать участок SspI для скрининга, последовательность связывания рибосом Шайна-Дальгарно, А-богатый спейсер и участок NdeI, кодирующий инициаторный кодон.

Схематическое изображение получения вектора, содержащего полинуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь антитела (LC), тяжелую цепь антитела (НС), полинуклеотидную последовательность DsbC и дополнительную полинуклеотидную последовательность, представлено на фиг. 1.

Предпочтительно клетка по настоящему изобретению содержит экспрессирующий вектор, определенный выше.

В варианте осуществления, где клетка также экспрессирует один или несколько дополнительных белков из следующих:

один или несколько белков, способных облегчать фолдинг белка, таких как FkpA, Skp, SurA, PPiA и PPiD; и/или один или несколько белков, способных облегчать секрецию или транслокацию белка, таких как SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY и Lep; и/или один или несколько белков, способных облегчать образование дисульфидной связи, таких как DsbA, DsbB, DsbD, DsbG;

один или несколько дополнительных белков можно экспрессировать с одного или нескольких полинуклеотидов, встроенных в тот же вектор, что и полинуклеотид, кодирующий DsbC, и или одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154. Альтернативно, один или несколько полинуклеотидов можно встраивать в отдельные векторы.

Можно получать экспрессирующий вектор с помощью инсерции одной или нескольких экспрессирующих кассет, определенных выше, в подходящий вектор. Альтернативно, регулирующие экспрессию последовательности для регуляции экспрессии полинуклеотидной последовательности могут содержаться в экспрессирующем векторе, и, таким образом, для завершения экспрессирующего вектора может потребоваться только кодирующая область полинуклеотида.

Полинуклеотид, кодирующий DsbC, и/или полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, соответствующим образом встраивают в реплицирующийся вектор, как правило, автономно реплицирующийся экспрессирующий вектор, для экспрессии в клетке под контролем подходящего для клетки промотора. В этой области известно множество векторов для этой цели и выбор подходящего вектора может зависеть от размера нуклеиновой кислоты и, в частности, типа клеток.

Примеры экспрессирующих векторов, которые можно использовать для трансформации клеткихозяина с помощью полинуклеотида по изобретению, включают плазмиду, такую как pBR322 или pACYC184, и/или вирусный вектор, такой как бактериофаг, мобильный генетический элемент, такой как транспозон.

Такие экспрессирующие векторы, как правило, содержат точку начала репликации плазмиды, селективный маркер устойчивости к антибиотику, промотор и терминатор транскрипции, разделенные участком множественного клонирования (экспрессирующая кассета), и последовательность ДНК, кодирующую участок связывания рибосомы.

Используемые в настоящем изобретении промоторы можно соединять с соответствующим полинуклеотидом напрямую или, альтернативно, помещать в соответствующее положение, например в вектор, таким образом, что при встраивании соответствующего полипептида соответствующий промотор может на него действовать. В одном из вариантов осуществления промотор помещают перед кодирующей частью полинуклеотида, на который он действует, например соответствующий промотор помещают перед каждой кодирующей частью полинуклеотида. Как применяют в настоящем описании, перед предназначен для обозначения того, что промотор локализуется на 5'-конце относительно кодирующей части полинуклеотида.

Промоторы могут являться эндогенными или экзогенными относительно клеток-хозяев. Подходящие промоторы включают lac, tac, trp, phoA, Ipp, Arab, tet и T7.

Один или несколько используемых промоторов могут являться индуцибельными промоторами. В

- 17 031449 варианте осуществления, где полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело, встраивают в один вектор, нуклеотидные последовательности, кодирующие DsbC и антитело, могут находиться под контролем одного промотора или отдельных промоторов. В варианте осуществления, где нуклеотидные последовательности, кодирующие DsbC и антитело, находятся под контролем отдельных промоторов, промотор может являться независимым индуцибельным промотором.

Промоторы для применения в бактериальных системах, как правило, также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (S.D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей интересующий полипептид. Промотор можно выделять из ДНК бактериального происхождения посредством расщепления рестрикционными ферментами и встраивать в вектор, содержащий желаемую ДНК.

Предпочтительно экспрессирующий вектор также содержит бицистронную последовательность для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в WO 03/048208 или WO 2007/039714 (содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Предпочтительно цистрон, расположенный выше в 3'-5' направлении, содержит ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, и цистрон, расположенный ниже в 5'-3' направлении, содержит ДНК, кодирующую соответствующую тяжелую цепь, и бицистронная межгенная последовательность (IGS) предпочтительно содержит последовательность, выбранную из IGS1 (SEQ ID NO: 33), IGS2 (SEQ ID NO: 34), IGS3 (SEQ ID NO: 35) и IGS4 (SEQ ID NO: 36).

Предпочтительно экспрессирующий вектор содержит трицистронную последовательность для получения легкой цепи и тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано выше, и последовательность для получения рекомбинантного DsbC, предпочтительно содержащего гистидиновую метку.

Терминаторы могут являться эндогенными или экзогенными по отношению к клеткам-хозяевам. Подходящим терминатором является rrnB.

Дополнительные подходящие регуляторы транскрипции, включая промоторы и терминаторы, и способы воздействия на транспорт белка можно найти в Makrides et al., включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме (Makrides, 512-38).

Полинуклеотид DsbC, встраиваемый в экспрессирующий вектор, предпочтительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальную последовательность DsbC и кодирующую последовательность DsbC. Белок DsbC также можно направлять в периплазму посредством генетического слияния с другими сигнальными пептидами, например, такими как сигнальные пептиды из белков: OmpA, MalB, PelB, PhoA, PhoS, LppA, DsbA. Предпочтительно вектор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, позволяющую вектору реплицироваться в одной или нескольких выбранных клетках-хозяевах, предпочтительно реплицироваться независимо от хромосомы хозяина. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий.

В одном из вариантов осуществления DsbC и/или интересующий белок содержит гистидиновую метку на N-конце и/или С-конце.

Молекула антитела может секретироваться из клетки или транспортироваться в периплазму с помощью подходящих сигнальных последовательностей. Альтернативно, молекулы антител могут накапливаться внутри цитоплазмы клетки. Предпочтительно молекула антитела транспортируется в периплазму.

Полинуклеотид, кодирующий антитело, может экспрессироваться как продукт слияния с другим полипептидом, предпочтительно сигнальной последовательностью или другим полипептидом, имеющим конкретный участок расщепления на N-конце зрелого полипептида. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна распознаваться и процессироваться клеткой-хозяином. В случае прокариотических клеток-хозяев, не распознающих и не процессирующих сигнальную последовательность нативного или эукариотического полипептида, сигнальную последовательность заменяют прокариотической сигнальной последовательностью. Подходящие сигнальные последовательности включают OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA и DsbC. В варианте осуществления, где клетка содержит полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела, и полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела, каждый полинуклеотид может содержать сигнальную последовательность, такую как OmpA.

В конструировании подходящих векторов, содержащих один или несколько из указанных выше компонентов, используют стандартные способы лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК расщепляют, адаптируют и заново лигируют в форме, желательной для получения необходимых плазмид. Общие способы, с помощью которых можно конструировать векторы, способы трансфекции и способы культивирования хорошо известны специалистам в этой области.

Для получения последовательности ДНК, кодирующей антитело, можно использовать стандартные способы молекулярной биологии. Желаемые последовательности ДНК можно синтезировать полностью или частично с использованием способов синтеза олигонуклеотидов. При необходимости можно использовать способы сайт-специфического мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Варианты осуществления изобретения, представленные в настоящем описании со ссылкой на полинуклеотид, в равной степени относятся к альтернативным вариантам осуществления изобретения, например векторам, экспрессирующим кассетам и/или клеткам-хозяевам, содержащим используемые в на

- 18 031449 стоящем изобретении компоненты, настолько, насколько соответствующий аспект можно к ним отнести.

Настоящее изобретение также относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, включающему культивирование рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки, определенной выше, в среде для культивирования в условиях, эффективных для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD 154, и рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC; и выделения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, из периплазмы рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки и/или среды для культивирования.

Грамотрицательная бактериальная клетка и антитело, предпочтительно используемые в способе по настоящему изобретению, подробно описаны выше.

Рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, можно встраивать в клеткухозяина с использованием любых подходящих способов, известных в этой области. Как указано выше, как правило, полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело, встраивают как часть одного вектора или отдельных экспрессирующих векторов, с помощью которого трансформируют клетки.

Клетки можно трансформировать с помощью полинуклеотида, кодирующего DsbC, и полинуклеотида, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, с использованием стандартных способов, например, используя хлорид рубидия, PEG или электропорацию.

В способе по настоящему изобретению также можно использовать систему селекции для облегчения селекции стабильных клеток, успешно трансформированных с использованием полинуклеотида, кодирующего интересующий белок. В системе селекции, как правило, используют котрансформацию с использованием полинуклеотида, кодирующего селективный маркер. В одном из вариантов осуществления каждый полинуклеотид, с помощью которого трансформируют клетки, дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий один или несколько селективных маркеров. Таким образом, трансформацию с использованием полинуклеотидов, кодирующих DsbC и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих маркер, осуществляют совместно, и для селекции тех клеток, которые продуцируют желаемые белки, можно использовать систему селекции.

Клетки, способные экспрессировать один или несколько маркеров, способны выживать/расти/делиться в конкретных искусственно созданных условиях, например, при добавлении токсина или антибиотика, благодаря свойствам, придаваемым полипептидом/геном или полипептидным компонентом встроенной в них системы селекции (например, устойчивости к антибиотику). Те клетки, которые не могут экспрессировать один или несколько маркеров, не способны выживать/расти/делиться в этих искусственно созданных условиях. При необходимости можно выбирать более или менее жесткие искусственно созданные условия.

В настоящем изобретении можно использовать любую подходящую систему селекции. Как правило, система селекции может основываться на включении в вектор одного или нескольких генов, обеспечивающих устойчивость к известному антибиотику, например ген устойчивости к тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину или ампициллину. Клетки, растущие в присутствие соответствующего антибиотика, можно подвергать селекции, т.к. они экспрессируют и ген, придающий устойчивость к антибиотику, и ген, кодирующий желаемый белок.

Для экспрессии антитела и/или DsbC в настоящем изобретении можно использовать систему индуцируемой экспрессии или конститутивный промотор. Подходящие системы индуцируемой экспрессии и конститутивные промоторы хорошо известны в этой области.

В одном из вариантов осуществления, где полинуклеотид, кодирующий DsbC, и полинуклеотид, кодирующий антитело, находятся под контролем одного или отдельных индуцибельных промоторов, экспрессию полинуклеотидов, кодирующих антитело, и рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, индуцируют добавлением индуктора в среду для культивирования.

Для культивирования трансформированной клетки можно использовать любую подходящую среду. Среду можно адаптировать для конкретной системы селекции, например среда может содержать антибиотик, что позволяет расти в среде только тем клеткам, которые успешно трансформировали.

При необходимости клетки, получаемые из среды, можно подвергать дополнительному скринингу и/или очистке. При необходимости способ дополнительно может включать один или несколько этапов экстракции и очистки интересующего белка.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно выделять из клеток штамма, включая цитоплазму, периплазму или супернатант. Подходящие способы включают фракционирование на иммуноаффинных или ионообменных колонках, осаждение этанолом, обращенно-фазовую ВЭЖХ, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, хроматографию на силикагеле, хроматографию на ионообменной

- 19 031449 смоле, такой как S-SEPHAROSE и DEAE, хроматофокусирование, осаждение сульфатом аммония и гельфильтрацию.

В одном из вариантов осуществления способ дополнительно включает отделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента от DsbC.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно соответствующим образом выделять из среды для культивирования и/или экстракта цитоплазмы и/или экстракта периплазмы общепринятыми способами очистки антител, такими как, например, хроматография на протеин А-сефарозе, хроматография с протеином G, хроматография с протеином L, тиофильная хроматография, хроматография на смешанных смолах, с гистидиновой меткой, FLAGTag, хроматография на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ, аффинная хроматография, фракционирование/осаждение сульфатом аммония, этанолом или PEG, хроматография на ионообменных мембранах, хроматография с адсорбцией на слой вспученного адсорбента (ЕВА) или хроматография с псевдодвижущимся слоем.

Способ также может включать дополнительный этап измерения величины экспрессии интересующего белка и селекции клеток, имеющих высокие уровни экспрессии интересующего белка.

Один или несколько этапов способа, представленного в настоящем описании, можно осуществлять в комбинации в подходящем контейнере, таком как биореактор.

После экспрессии антитело можно дополнительно обрабатывать, например, посредством конъюгации с другой молекулой, такой как эффекторная молекула. Таким образом, способ по настоящему изобретению может включать дополнительный этап прикрепления эффекторной молекулы к антителу.

Как применяют в настоящем описании, термин эффекторная молекула включает, например, противоопухолевое средство, лекарственные средства, токсины (такие как ферментативно активный токсины бактериального или растительного происхождения и их фрагменты, например рицин и его фрагменты), биологически активные белки, например, ферменты, другое антитело или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, в частности радиоактивный йод, радиоактивные изотопы, комплексообразующие металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые можно определять с помощью ЯМР- или ЭПР-спектроскопии. Эффекторную молекулу можно прикреплять к антителу или его фрагменту любым подходящим способом, например фрагмент антитела можно модифицировать для прикрепления по меньшей мере одной эффекторной молекулы, как описано в WO 2005/003171 или WO 2005/003170 (содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). В WO 2005/003171 или WO 2005/003170 также описывают подходящие эффекторные молекулы.

Антитело может содержать макроцикл для образования комплекса с атомом тяжелого металла или токсином, таким как рицин, прикрепленным к нему с помощью ковалентной мостиковой структуры. Альтернативно, можно использовать способы рекомбинантных ДНК для получения молекулы антитела, в которой Fc-фрагмент (домены СН2, CH3 и шарнирные домены), домены СН2 и CH3 или домен CH3 полной молекулы иммуноглобулина заменяют или соединяют пептидной связью, функциональным неиммуноглобулиновым белком, таким как молекула фермента или токсина. В варианте осуществления, где антитело является модифицированным Fab-фрагментом, имеющим на С-конце своей тяжелой цепи одну или несколько аминокислот, позволяющих прикреплять эффекторную или репортерную молекулу, дополнительные аминокислоты предпочтительно образуют модифицированную шарнирную область, содержащую один или два остатка цистеина, к которым можно прикреплять эффекторную или репортерную молекулу.

Предпочтительная эффекторная группа является молекулой полимера, которую можно прикреплять к модифицированному Fab-фрагменту для повышения его времени полужизни in vivo.

В основном молекула полимера может являться синтетическим или природным полимером, например необязательно замещенным неразветвленным или разветвленным полиалкиленом, полиалкениленовым или полиоксиалкиленовым полимером или разветвленным или неразветвленным полисахаридом, например гомо- или гетерополисахаридом.

Конкретные необязательные заместители, которые могут присутствовать в указанных выше синтетических полимерах, включают одну или несколько гидроксигрупп, метиловых групп или метоксигрупп. Конкретные примеры синтетических полимеров включают необязательно замещенный неразветвленный или разветвленный поли(этиленгликоль), поли(пропиленгликоль) поли(виниловый спирт) или их производные, в частности необязательно замещенный поли(этиленгликоль), такой как метоксиполи(этиленгликоль) или его производные. Конкретные природные полимеры включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или его производные. Как применяют в настоящем описании, термин производные предназначен для включения реакционноспособных производных, например тиол-селективных реакционноспособных групп, таких как малеимиды и т.п. Реакционноспособную группу можно соединять с полимером напрямую или через линкерный сегмент. Следует понимать, что остаток такой группы в некоторых случаях будет образовывать часть продукта в качестве линкерной группы между фрагментом антитела и полимером.

При желании можно варьировать размер полимера, но, как правило, он будет находиться в среднем

- 20 031449 в диапазоне молекулярной массы от 500 до 50000 Да, предпочтительно от 5000 до 40000 Да и более предпочтительно от 25000 до 40000 Да. В частности, размер полимера можно выбирать с учетом предполагаемого применения продукта. Таким образом, например, если продукт предназначен для выхода из кровотока и проникновения в ткань, например, для применения в лечении воспаления, предпочтительным может являться использование низкомолекулярного полимера, например, с молекулярной массой приблизительно 5000 Да. Для областей применения, в которых продукт остается в кровотоке, предпочтительным может являться использование высокомолекулярного полимера, например, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 25000 до 40000 Да.

Особенно предпочтительные полимеры включают полиалкилен, полимер, такой как поли(этиленгликоль) или, в частности, метоксиполи(этиленгликоль) или его производное, и в частности, с молекулярной массой в диапазоне от приблизительно 25000 до приблизительно 40000 Да.

Каждую молекулу полимера, прикрепленную к модифицированному фрагменту антитела, можно ковалентно связывать с атомом серы на остатке цистеина, находящемся во фрагменте. Как правило, ковалентная связь будет являться дисульфидной связью или, в частности, сероуглеродной связью.

При желании к фрагменту антитела можно прикреплять одну или несколько эффекторных или репортерных молекул. Эффекторные или репортерные молекулы можно прикреплять к фрагменту антитела через любую доступную боковую цепь аминокислоты или функциональную группу концевой аминокислоты, находящейся во фрагменте, например любую свободную амино-, имино-, гидрокси- или карбоксигруппу. Одну или несколько эффекторных или репортерных молекул можно прикреплять к аминокислоте на С-конце или по направлению к С-концу тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела.

В качестве исходного материала в получении полимер-модифицированных фрагментов антител, как описано выше, можно использовать активированный полимер. Активированный полимер может являться любым полимером, содержащим тиольную реакционноспособную группу, такую как агалогенкарбоновая кислота или сложный эфир, например йодацетамид, имид, например малеимид, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные материалы можно получать коммерческим путем (например, из Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) или их можно получать из коммерчески доступных исходных материалов с использованием общепринятых химических способов.

Если желательно получать фрагмент антитела, соединенный с эффекторной или репортерной молекулой, его можно получать стандартными химическими способами или способами рекомбинантной ДНК, в которых, при необходимости, фрагмент антитела соединяют с эффекторной или репортерной молекулой напрямую или через связующее средство до или после реакции с активированным полимером. Конкретные химические способы включают, например, описываемые в WO 93/62331 и WO 92/22583. Альтернативно, если эффекторная или репортерная молекула является белком или полипептидом, соединение можно осуществлять с использованием способов рекомбинантной ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и EP-A-0392745.

Предпочтительно модифицированный Fab-фрагмент, получаемый способом по настоящему изобретению, пегилируют (т.е. он содержит ковалентно присоединенный к нему PEG (поли(этиленгликоль))) способом, описываемым в EP-A-0948544. Предпочтительно антитело является пегилированным модифицированным Fab-фрагментом, как показано на фиг. 2. Как показано на фиг. 2, модифицированный Fabфрагмент содержит прикрепленную к одному из остатков цистеина на С-конце модифицированной шарнирной области тяжелой цепи лизил-малеимидную группу, где каждая из двух аминогрупп лизилового остатка ковалентно связана с остатком метоксиполи(этиленгликоля), имеющим молекулярную массу приблизительно 20000 Да, таким образом, что общая средняя молекулярная масса остатков метоксиполи(этиленгликоля) составляет приблизительно 40000 Да, более предпочтительно лизил-малеимидная группа является [ 1 - [ [ [2- [ [3 -(2,5 -диоксо-1 -пирролидинил)-1 -ооксопропил] амино] этил] амино]карбонил]1,5-пентандиил]-бис-(иминокарбонилом). Остаток лизина ковалентно связывают с малеимидной группой. К каждой из аминогрупп на остатке лизина прикрепляют полимер метоксиполи(этиленгликоль), имеющий молекулярную массу приблизительно 20000 Да. Таким образом, общая молекулярная масса всей эффекторной молекулы составляет приблизительно 40000 Да.

Таким образом, способ по настоящему изобретению предпочтительно включает прикрепление к одному из остатков цистеина на С-конце тяжелой цепи лизил-малеимидной группы, где каждую аминогруппу лизилового остатка ковалентно связывают с остатком метоксиполи(этиленгликоля), имеющим молекулярную массу приблизительно 20000 Да.

В одном из вариантов осуществления физическое свойство примесного белка хозяина изменяют добавлением аминокислотной метки на С-конец или N-конец. В предпочтительном варианте осуществления изменяемое физическое свойство является изоэлектрической точкой, и аминокислотная метка является полиаспартатной меткой, прикрепленной на С-конец. В одном из вариантов осуществления белками Е. coli, изменяемыми добавлением указанной метки, являются дипептид-связывающий белок (DppA), мальтозо-связывающий белок (МВР), тиоредоксин и фосфат-связывающий белок (PhoS/PstS). В одном конкретном варианте осуществления pI фосфат-связывающего белка Е.отН (PhoS/PstS) снижают с 7,2 до 5,1 посредством добавления полиаспартатной метки (polyD), содержащей 6 остатков аспарагиновой кислоты на С-конце.

- 21 031449

Также предпочтительной является модификация конкретных остатков примесного белка B.coli для изменения его физических свойств в отдельности или в комбинации с добавлением N- или С-концевых меток. Такие изменения могут включать инсерции или делеции для изменения размера белка или замены аминокислот для изменения pI или гидрофобности. В одном из вариантов осуществления эти остатки локализуются на поверхности белка. В предпочтительном варианте осуществления поверхностные остатки белка PhoS изменяют для снижения pI белка. Предпочтительно для сохранения функционального белка PhoS избегают остатков, важных для связывания фосфата (US 5304472).

Примеры

Клеточные линии.

Для всех экспериментов использовали клеточную линию W3110 B. coli в качестве родительской клеточной линии дикого типа.

Получали клеточные линии, несущие следующие мутации:

a) мутантный ген Tsp;

b) мутантный ген Tsp и рекомбинантный DsbC;

c) мутантный ген Tsp и мутантный ген spr;

d) мутантный ген Tsp и мутантный ген spr и рекомбинантный DsbC.

Пример 1. Получение клеточной линии, несущей мутантный ген.

Tsp MXE001 (ATsp).

Штамм МХВ001 получали следующим образом.

Кассету Tsp перемещали в виде фрагментов, рестрицированных SalI, NotI, в аналогично рестрицированные плазмиды pKO3. В плазмиде pKO3 используют чувствительный к температуре мутантный участок начала репликации pSC101 (RepA) вместе с маркером хлорамфеникола для усиления и селекции явлений встраивания в хромосому. Ген sacB, кодирующий левансахаразу, является летальным для В. coli, выращиваемых на сахарозе, и, таким образом, его (вместе с маркером хлорамфеникола и точкой начала репликации pSC101) используют для усиления и селекции явлений разрывов и сшивания плазмид. Этот способ описывали ранее (Hamilton et al., 4617-22; Blomfield et al., 1447-57). В системе pKO3 из генома хозяина удаляют все селективные маркеры за исключением встраиваемого гена.

Конструировали следующие плазмиды.

рМХВ191, содержащую подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp, представленный в SEQ ID NO: 28, содержащую рестрикционные маркеры EcoRI и AseI.

Затем с использованием плазмиды трансформировали электрокомпетентные клетки В. coli W3110, получаемые с помощью способа, описываемого в статье Miller и Nickoloff, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме (Miller and Nickoloff, 105-13).

День 1. 40 мкл клеток E. coli смешивали с (10 пг) 1 мкл ДНК pKO3 в охлажденной кювете для электропорации BioRad 0,2 см перед электропорацией при 2500 В, 25 мкФ и 200 Ω. Сразу после этого добавляли 1000 мкл 2xPY, клетки восстанавливали встряхиванием при 250 об/мин в инкубаторе при 30°C в течение 1 ч. Получали серийные разведения клеток 1/10 в 2xPY перед тем, как аликвоты по 100 мкл помещали на предварительно нагретые до 30 и 43°C чашки с агаром 2xPY, содержащим хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл. Чашки инкубировали в течение ночи при 30 и 43°C.

День 2. С помощью подсчета количества колоний, выросших при 30°C, определяют приблизительную эффективность электропорации, в то время как количество колоний, выросших при 43°C, представляет собой потенциальные явления встраивания. Собирали отдельные колонии с чашки, инкубируемой при 43°C, и ресуспендировали в 10 мл 2xPY. 100 мкл этой суспензии помещали на предварительно нагретые до 30°C чашки с агаром 2xPY, содержащим 5% (мас./об.) сахарозы, для получения отдельных колоний. Чашки инкубировали в течение ночи при 30°C.

День 3. Колонии на этой чашке представляли потенциальные одновременные явления разрывов и сшивания плазмид. Всли явления разрывов и сшивания происходят на ранних этапах роста, то общая совокупность массы колоний будет клональной. Собирали отдельные колонии и реплики переносили на агар 2xPY, содержащий хлорамфеникол в концентрации 20 мкг/мл или 5% (мас./об.) сахарозу. Чашки инкубировали в течение ночи при 30°C.

День 4. Колонии, выращенные на сахарозе и погибающие в присутствие хлорамфеникола, представляют потенциальные явления хромосомных замен и сшивания плазмид. Эти колонии собирали и подвергали скринингу с помощью ПЦР со специфичным для мутации олигонуклеотидом. Колонии, для которых при ПЦР получали положительную полосу правильного размера, для получения отдельных колоний перепечатывали на агар 2xPY, содержащий 5% (мас./об.) сахарозы, и инкубировали чашки в течение ночи при 30°C.

День 5. Отдельные колонии ПЦР-положительных, чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к сахарозе В. coli использовали для получения стоков в глицерине, химически компетентных клеток и матриц для реакции ПЦР с 5'- и 3'-фланкирующими олигонуклеотидными праймерами для получения продукта ПЦР для прямого секвенирования ДНК с использованием Taq-полимеразы.

Для подтверждения успешного модифицирования геномной ДНК, несущей мутантный ген Tsp

- 22 031449 клетки штамма МХЕ001 тестировали с помощью ПЦР-амплификации области гена Tsp, содержащей неприродный участок рестрикции AseI (SEQ ID NO: 28), с использованием олигонуклеотидных праймеров. Затем амплифицированные области ДНК анализировали с помощью электрофореза в геле до и после инкубации с рестриктазой AseI для подтверждения наличия неприродного участка рестрикции AseI в мутантных генах. Этот способ осуществляют следующим образом:

Для амплификации геномной ДНК из полученных лизатов клеток Е. coli MXE001 и W3110 с использованием ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды:

6284 Tsp 3' 5'-GCATCATAATTTCTTTTTACCTC-3' (SEQ ID NO: 47)

6283 Tsp 5' 5'-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3' (SEQ ID NO: 48)

Лизаты получали нагреванием отдельной колонии клеток в течение 10 мин при 95°C в 20 мкл 1кратного буфера для ПЦР. Смеси позволяли охлаждаться до комнатной температуры, а затем центрифугировали при 13200 об/мин в течение 10 мин. Удаляли супернатант и помечали как лизаты клеток.

ДНК из клеток каждого штамма амплифицировали с использованием пары олигонуклеотидов Tsp.

ДНК амплифицировали с использованием стандартного способа ПЦР:

мкл 10-кратного буфера (Roche), мкл смеси dNTP (Roche, 10 мМ смесь),

1,5 мкл 5'-олигонуклеотида (5 пмоль),

1.5 мкл 3'-олигонуклеотида (5 пмоль), мкл лизата клеток,

0,5 мкл ДНК-полимеразы Taq (Roche 5 Ед./мкл),

38.5 мкл H2O, цикл ПЦР,

94°C 1 мин,

55°C 1 мин (повторяют в течение 30 циклов),

72°C 1 мин,

72°C 10 мин.

При завершении реакции 25 мкл реакционной смеси переносили в новую микроцентрифужную пробирку для обработки AseI. К 25 мкл реакционной смеси для ПЦР добавляли 19 мкл Н₂О, 5 мкл буфера 3 (New England Biolabs®), 1 мкл AseI (New England Biolabs®), смешивали и инкубировали при 37°C в течение 2 ч.

К оставшейся реакционной смеси для ПЦР добавляли 5 мкл буфера для внесения (6-кратного) и 20 мкл наносили на 200 мл агарозного геля с 0,8% ТАЕ (Invitrogen®) вместе с бромистым этидием (5 мкл стока с концентрацией 10 мг/мл) и осуществляли электрофорез при 100 В в течение 1 ч. На последнюю дорожку наносили 10 мкл маркера для определения размера фрагментов ДНК (Perfect DNA marker 0,1-12 т.п.н., Novagen®).

При завершении обработки AseI добавляли 10 мкл буфера для внесения (6-кратного) и 20 мкл наносили на агарозный гель с 0,8% ТАЕ (Invitrogen®) вместе с бромистым этидием (5 мкл стока с концентрацией 10мг/мл) и осуществляли электрофорез при 100 В в течение 1 ч. На последнюю дорожку наносили 10 мкл маркера для определения размера фрагментов ДНК (Perfect DNA marker 0,1-12 т.п.н., Novagen®). Оба геля визуализировали с использованием УФ-трансиллюминатора.

Амплифицированный фрагмент генома демонстрировал полосу правильного размера 2,8 т.п.н. для Tsp. После обработки AseI подтверждали наличие встроенных участков AseI в Tsp-дефектном штамме МХЕ001, но не в контрольном W3110.

МХЕ001: геномную ДНК, амплифицированную с использованием набора праймеров Tsp, и полученную ДНК обрабатывали AseI для получения полос, соответствующих размеру 2,2 и 0,6 т.п.н.

Амплифицированная с помощью ПЦР ДНК W3110 не расщеплялась рестриктазой AseI.

Пример 2. Получение клеточных линий, несущих мутантный ген spr, и клеточных линий, несущих мутантный ген Tsp и мутантный ген spr.

Получали мутации spr и подвергали селекции для использования в комплементационном анализе.

Ген spr (SEQ ID NO: 23) подвергали мутагенезу с использованием набора для случайного мутагенеза Diversify PCR random mutagenesis kit от Clontech®, с помощью которого встраивали от 1 до 2 мутаций на 1000 п.н. Полученную с помощью ПЦР ДНК мутантного spr клонировали в индуцибельный экспрессирующий вектор [рТТО CDP870], экспрессирующий Fab' CDP870 (как описано в WO 01/94585) вместе с мутантным spr. Затем этот продукт лигирования использовали для электротрансформации клеток штамма E.coli, содержащих вариант делеции Tsp (ATsp) (обозначаемый как МХЕ001), получаемых с использованием способа, обнаруженного в Miller et al. (Miller and Nickoloff, 105-13). Использовали следующий протокол, 40 мкл электрокомпетентных МХЕ001, 2,5 мкл продукта лигирования (100 пг ДНК) добавляли в кювету для электропорации размером 0,2 см, осуществляли электротрансформацию с использованием BioRad® Genepulser Xcell® со следующими настройками, 2500 В, 25 мкФ и 200 Ω. После электротрансформации добавляли 1 мл среды SOC (Invitrogen® кат. № 18045-088) (предварительно нагретой до

- 23 031449

37°C) и клетки оставляли для восстановления при 37°C в течение 1 ч с осторожным встряхиванием.

Клетки помещали на гипотонический агар [5 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л триптона, 15 г/л агара (все Difco®)] и инкубировали при 40°C. Клетки, образовывавшие колонии, переносили в HLB при 43°C для подтверждения восстановления способности вырастать в низкоосмотических условиях при высокой температуре в штамм МХЕ001. Из выбранных клонов получали плазмидную ДНК и секвенировали для идентификации мутаций в spr. С использованием этого способа выделяли следующие восемь одиночных мутаций, одну двойную мутацию и две тройные мутации в белке spr, соответствующих фенотипу ATsp:

1) V98E,

2) D133A,

3) V135D,

4) V135G,

5) G147C,

6) S95F и Y115F,

7) I70T,

8) N31T, Q73R, R100G, G140C,

9) R62C, Q99P, R144C,

10) L108S,

11) L136P.

Отдельные мутации 1-5, указанные выше, и три мутации каталитических триад spr (C94A, Н145А, Н157А) и W174R использовали для получения новых штаммов с помощью штамма Е. coli W3110 дикого типа (генотип: F-LAM-IN (rmD-rrnE)1 rph 1 (регистрационный № 27325 АТСС) для получения мутантных по spr штаммов или штамма МХЕ001 из примера 1 для получения комбинированных штаммов с ATsp/мутантным spr.

Следующие мутантные штаммы клеток Е. coli получали с помощью векторной системы замены генов с использованием плазмиды pKO3 для гомологичной рекомбинации/замены (Link et al., выше), как описано в примере 1 для получения МХЕ001.____________________________________

Мутантный штамм Е. coli	Генотип	Векторы Spr
МХЕ001	ATsp	-
МХЕ008	ATsp, spr D133A	pMXE339, pK03 spr D133A (-Sall)
МХЕ009	ATsp, spr H157A	pMXE345, pK03 spr H157A (-Sall)
МХЕ010	spr G147C	pMXE338, pK03 spr G147C (-Sall)
МХЕ011	spr C94A	pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall)
МХЕ012	spr H145A	pMXE344, pK03 spr H145A (-Sall)
МХЕ013	spr W174R	pMXE346, pK03 spr W174R (-Sall)
МХЕ014	ATsp, spr V135D	pMXE340, pK03 spr V135D (-Sall)
МХЕ015	ATsp, spr V98E	pMXE342, pK03 spr V98E (-Sall)
МХЕ016	ATsp, spr C94A	pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall)
МХЕ017	ATsp, spr H145A	pMXE344, pK03 spr H145A (-Sall)
МХЕ018	ATsp, spr V135G	pMXE341, pK03 spr V135G (-Sall)

Встраиваемые кассеты с мутантным spr перемещали в виде рестрицированных SalI, NotI в анало- 24 031449 гично рестрицированные плазмиды pKO3.

Во всех экспериментах в качестве клеточной линии дикого типа использовали клеточную линию E. coli W3110, а также клеточную линию E. coli W3110 ATsp, spr C94A (МХ016).

Пример 3. Получение плазмиды для Fab' против CD154 и экспрессии DsbC.

Конструировали плазмиду, содержащую последовательности тяжелой и легкой цепи Fab против CD154 (SEQ ID NO: 13 и 11 соответственно) и последовательность, кодирующую DsbC (SEQ ID NO: 27).

Плазмиду рМХЕ351 (pTTOD DsbC), экспрессирующий вектор для Fab против CD154 и DsbC (периплазматического полипептида) конструировали с использованием общепринятых способов клонирования с рестрикцией. Плазмида рМХЕ351 содержала следующие элементы: сильный промотор tac и последовательность оператора lac. Как показано на фиг. 1, плазмида содержала уникальный участок рестрикции EcoRI после кодирующей области тяжелой цепи Fab', за которой следовала некодирующая последовательность, а затем уникальный участок рестрикции NdeI. Ген DsbC клонировали посредством ПЦР с использованием неочищенной хромосомной ДНК W3110 в качестве матрицы. Участок EcoRI удаляли из последовательности DsbC дикого типа с помощью ПЦР с удлинением перекрывающихся фрагментов таким образом, что за продуктом ПЦР, кодирующим 5'-участок EcoRI, следовал сильный участок связывания рибосомы, за ним - нативный инициаторный кодон, сигнальная последовательность и зрелая последовательность DsbC, заканчиваясь С-концевой гистидиновой меткой и, в конечном итоге, некодирующим участок NdeI. ПЦР-фрагмент EcoRI-NdeI рестрицировали и лигировали в экспрессирующий вектор таким образом, что все три полипептида, легкую цепь Fab', тяжелую цепь Fab' и DsbC, кодирует одна полицистронная мРНК.

Гены легкой цепи, тяжелой цепи Fab и ген DsbC транскрибируются как одна полицистронная последовательность. ДНК, кодирующую сигнальный пептид из белка OmpA Е. coli, подвергали слиянию с 5'-концом последовательностей генов легкой и тяжелой цепи, что направляло транслокацию полипептидов в периплазму Е. coli. Транскрипцию терминировали с использованием двойного терминатора транскрипции rrnB tlt2. Ген lacIq кодировал конститутивно экспрессирующийся репрессорный белок Lac I. Он подавляет транскрипцию с промотора tac до индукции дерепрессии присутствием аллолактозы или IPTG. Использовали участок начала репликации р15А, поддерживающий низкую копийность. Плазмида содержала ген устойчивости к тетрациклину для селекции с использованием антибиотиков.

Пример 4. Экспрессия Fab' против CD154 и DsbC в клетках E. coli W3110 и МХЕ016 (E. coli W3110 ATsp, spr C94A).

Экспрессия Fab' против CD154 и DsbC в клетках Е. coli W3110 ATsp, spr C94A.

Клетки E. coli штамма W3110 ATsp, spr C94A (MXE016) трансформировали с использованием плазмиды рМХЕ351, полученной в примере 3. Трансформацию штаммов осуществляли с использованием способа, обнаруженного в Chung C.T et al. (Chung, Niemela, and Miller, 2172-75).

Экспрессия Fab' против CD154 в клетках Е. coli W3110.

Клетки E. coli штамма W3110 трансформировали с использованием плазмиды pTTOD, экспрессирующего вектора для Fab' против CD154, сконструированного с использованием общепринятых способов клонирования с рестрикцией. Плазмида pTTOD содержала следующие элементы: сильный промотор tac и последовательность оператора lac. Гены легкой и тяжелой цепи Fab транскрибировались как одна бицистронная последовательность. ДНК, кодирующую сигнальный пептид из белка OmpA E. coli, подвергали слиянию с 5'-концом последовательностей генов легкой и тяжелой цепи, что направляло транслокацию полипептидов в периплазму Е. coli. Транскрипцию терминировали с использованием двойного терминатора транскрипции rrnB tlt2. Ген lacIq кодировал конститутивно экспрессирующийся репрессорный белок Lac I. Он подавляет транскрипцию с промотора tac до индукции дерепрессии присутствием аллолактозы или IPTG. Использовали участок начала репликации р15А, поддерживающий низкую копийность. Плазмида содержала ген устойчивости к тетрациклину для селекции с использованием антибиотиков. Трансформацию штаммов осуществляли с использованием способа, обнаруженного в Chung C.T et al. (Chung, Niemela, and Miller, 2172-75).

Пример 5. Рост мутантных штаммов Е. coli и экспрессия Fab' против CD154 в мутантных штаммах Е. coli с использованием ферментации культур с высокой плотностью клеток.

Полученные в примере 4 штаммы тестировали в экспериментах по ферментации, сравнивая рост и экспрессию Fab' против CD154.

Среда для выращивания, этапы инокуляции и ферментации.

Ферментацию начинают, получая посевной материал из сосуда из банка клеток и амплифицируя посредством нескольких этапов прекультивирования (флаконы и реакторы) перед посевом в производственный ферментатор. В производственном ферментаторе клетки выращивают в определенных средах до достижения высокой плотности периодическим способом и способом с подпиткой. При достижении желаемой плотности клеток экспрессию Fab' индуцируют добавлением IPTG. Экспрессия Fab' направлена в периплазматическое пространство Е. coli, где Fab' накапливаются на всем протяжении фазы индукции. Для контроля экспрессии и роста клеток в течение фазы индукции использовали подпитку источником углерода. Контролируют температуру, растворенный кислород (pO2) и pH для поддержания культуры в

- 25 031449 условиях оптимального культивирования.

Измерения концентрации биомассы и скорости роста.

Концентрацию биомассы определяли, измеряя оптическую плотность культур при 600 нм.

Периплазматическая экстракция.

Клетки собирали из образцов культур посредством центрифугирования. Фракции супернатанта сохраняли (при -20°C) для дальнейшего анализа. Фракцию клеточного осадка ресуспендировали в буфере для экстракции до объема исходной культуры (100 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА; рН 7,4). После инкубации при 60°C в течение приблизительно от 10 до 16 ч экстракт очищали посредством центрифугирования и использовали свежую фракцию супернатанта или сохраняли ее (при -20°C) для анализа.

Количественный анализ Fab'.

Концентрацию Fab' в периплазматических экстрактах и супернатантах культур определяли с использованием ВЭЖХ с протеином G. Колонку HiTrap® с протеином G HP 1 мл (GE-Healthcare® или равнозначную) нагружали аналитом (приблизительно нейтральный рН, 30°C, фильтрованный через фильтр 0,2 мкм) при 2 мл/мин, колонку промывали 20 мМ фосфатом, 50 мМ NaCl с рН 7,4 и затем элюировали Fab' с использованием инъекции 50 мМ глицина/HCl с рН 2,7. Элюированный Fab' измеряли с помощью А280 посредством системы для ВЭЖХ Agilent® 1100 или 1200 и количественно анализировали с учетом стандартной кривой для очищенного белка Fab' с известной концентрацией.

Пример 6. Уровень фрагментов легкой цепи в полученных ферментацией экстрактах мутантных штаммов Е. coli.

Продукты ферментации, представленные в примере 2, тестировали на уровень фрагментов легкой цепи Fab' против CD154 в периплазматических экстрактах.

Количественный анализ фрагментов легкой цепи.

Количественную оценку уровня Fab' и протеолитических фрагментов Fab' осуществляли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ при высокой температуре. Разделение осуществляли на колонках для обращенно-фазовой хроматографии Poroshell® 300SB-C8 (Agilent Technologies®, кат. № 660750-906) при температуре 80°C. Равновесным растворителем являлась вода для ВЭЖХ, 0,1% (об./об.) TFA, а растворителем для элюции являлся 80:20 (об./об.) 1-пропанолацетонитрил, 0,03% (об./об.) TFA. Разделение осуществляли при скорости потока 2,0 мл/мин при линейном градиенте 16-38% растворителя В в 4,4 мин. Определение осуществляли по поглощению УФ при 214 нм. Данные обрабатывали посредством ручного интегрирования, и количество протеолитических фрагментов Fab выражали как % площади под пиком относительно пика интактного Fab.

Настоящее изобретение также относится к терапевтической или диагностической композиции, содержащей антитело, получаемое способом по настоящему изобретению, в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.

Настоящее изобретение также относится к способу получения терапевтической или диагностической композиции, включающему смешивание антитела, получаемого способом по настоящему изобретению, в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.

Несмотря на то что настоящее изобретение, в частности, представлено и описано со ссылкой на предпочтительные варианты осуществления, специалистам в этой области будет понятно, что можно осуществлять различные изменения формы и деталей изобретения без отклонения от объема изобретения, как определено в формуле изобретения.

- 26 031449

Список ссылок

Aramini, J. М., et al. Solution NMR structure of the NlpC/P60 domain of lipoprotein Spr from Escherichia coli: structural evidence for a novel cysteine peptidase catalytic triad. Biochemistry. 47.37 (2008): 9715-17.

Bachmann, B. J. Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12. Bacteriol.Rev. 36.4 (1972): 525-57.

Backlund, E., et al. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli. J.Biotechnol, 135.4 (2008): 358-65.

Blomfield, I. C., et al. Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSClOl replicon. Mol,Microbiol. 5.6 (1991): 1447-57.

Chung, С. T., S. L. Niemela, and R. H. Miller. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.

Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A, 86.7 (1989): 2172-75.

Hamilton, С. M., et al. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. J.Bacteriol, 171.9 (1989): 4617-22.

Hara, H., et al. Overproduction of penicillin-binding protein 7 suppresses thermosensitive growth defect at low osmolarity due to an spr mutation of Escherichia coli. Microb.Drug Resist. 2.1 (1996): 63-72.

Hara, H., et al. Cloning, mapping, and characterization of the Escherichia coli pre gene, which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3. J.Bacteriol. 173.15 (1991): 4799-813.

- 27 031449

Holliger, P. and P. J. Hudson. Engineered antibody fragments and the rise of single domains.

Nat Biotechnol 23.9 (2005): 1126-36.

Humphreys, D. P., et al. Formation of dimeric Fabs in Escherichia coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab' expression levels, tail piece sequences and growth conditions. J.Immunol.Methods. 209.2 (1997): 193-202.

Keiler, К. C. and R. T. Sauer. Identification of active site residues of the Tsp protease. J.Biol.Chem, 270.48 (1995): 28864-68.

Link, A. J., D. Phillips, and G. M. Church. Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization. J.Bacteriol, 179.20 (1997): 6228-37.

Makrides, S. C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.

Microbiol.Rev. 60.3 (1996): 512-38.

Miller, E. M. and J. A. Nickoloff Escherichia coli electrotransformation. Methods Mol,Biol, 47:105-13. (1995): 105-13.

Missiakas, D., C. Georgopoulos, and S. Raina. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation. EMBO J, 13.8 (1994): 2013-20.

Nagasawa, H., et al. Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3 of Escherichia coli. J.Bacteriol. 171.11 (1989): 5890-93.

Shevchik, V. E., G. Condemine, and J. Robert-Baudouy. Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity. EMBO J, 13.8 (1994): 2007-12.

Silber, K. R., К. C. Keiler, and R. T. Sauer. Tsp: a tail-specific proteasethat selectively degrades proteins with nonpolar C termini. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 89.1 (1992): 295-99.

Silber, K. R. and R. T. Sauer. Deletion of the pre (tsp) gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12. Mol,Gen.Genet. 242.2 (1994): 23740.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> UCB Pharma, S.A.

<120> БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ШТАММ-АКЦЕПТОР, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ФРАГМЕНТ <130> G0157 WO <150> EP11173880.3 <151> 2011-07-13 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 CDR-H1 <400> 1

АНТИТЕЛА

- 28 031449

Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr His Val His

5 10 <210> 2 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 CDR-H2 <400>2

Val Ile Trp Gly Asp Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser 1 5 1015

<210> <211> <212> <213>

3 10 БЕЛОК Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 CDR-H3 <400>3

Gln Leu Thr His Tyr Tyr Val Leu Ala Ala

510

<210>	4
<211>	11
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Описание	искусственной последовательности: 342 CDR-L1
<400>	4
Arg Ala Ser Glu	Asp Leu Tyr Tyr Asn Leu Ala
1		5 10

<210>	5
<211>	7
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Описание	искусственной последовательности: 342 CDR-L2
<400>	5
Asp Thr Tyr Arg	Leu Ala Asp
1		5

<210> 6 <211>9

- 29 031449 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 CDR-L3 <400>6

Gln Gln Tyr Tyr Lys Phe Pro Phe Thr <210>7 <211>384 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 вариабельная область легкой цепи (gL4) <220>

<221> сигнальный пептид <222> (1)..(63) <220>

<221> CDS <222> (64)..(384) <400> 7 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60

gct

gat Asp 1

atc Ile

cag Gln

atg Met

acc Thr 5

cag Gln

agt Ser

cca Pro

agc Ser

agt Ser 10

ctc Leu

tcc Ser

gcc Ala

agc Ser

gta Val 15

108

ggc

gat

cgt

gtg

act

att

acc

tgt

cgt

gcc

agt

gag

gac

ctc

tat

tac

156

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Asp

Leu

Tyr

20

25

30

aac

ctg

gcc

tgg

tat

cag

cgt

aaa

ccg

ggc

aaa

gcc

ccg

aag

ctg

ctc

204

Asn

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

35

40

45

atc

tat

gat

acg

tac

cgc

ctg

gct

gac

ggt

gtg

cca

agc

cgt

ttc

agt

252

Ile

Tyr

Asp

Thr

Tyr

Arg

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

50

55

60

ggc

agt

ggc

agc

ggt

act

gac

tat

acc

ctc

aca

att

tcg

tct

ctc

cag

300

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

65

70

75

ccg

gaa

gat

ttc

gcc

tct

tac

tat

tgt

cag

caa

tat

tac

aag

ttc

cct

348

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Ser

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Lys

Phe

Pro

80

85

90

95

ttc

acc

ttc

ggt

cag

ggc

act

aaa

gta

gaa

atc

aaa

384

Phe

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

- 30 031449 <210> 8 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400>8

Asp 1

Ile Gln Met

Thr 5

Gln Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Asp

Leu

Tyr

Asn

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Thr

Tyr

Arg

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Ser

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Lys

Phe

Pro

Phe

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100

105

<210>9 <211>351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 вариабельная область тяжелой цепи (gH1) <220>

<221> CDS <222> (1)..(351) <400> 9

gag Glu 1

gtg Val

cag Gln

ctg Leu

gtc Val 5

gag Glu

tct Ser

gga Gly

ggc Gly

ggg Gly 10

ctt Leu

gtc Val

cag Gln

cct Pro

ggt Gly 15

ggg Gly

48

agc

ctg

cgt

ctc

tct

tgt

gca

gtg

agc

ggc

ttc

agc

tct

acc

aat

tac

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

cat

gtg

cac

tgg

gtg

cgt

cag

gca

cct

ggg

aag

ggc

ctg

gag

tgg

atg

144

His

Val

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

- 31 031449

35

40

45

ggt

gtt

att

tgg

ggc

gac

ggc

gat

aca

tcc

tac

aac

tcc

gtc

ctg

aag

192

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

Val

Leu

Lys

50

55

60

agc

cgt

ttc

acc

att

tcc

cgt

gac

acc

tca

aag

aat

acc

gtt

tac

ctc

240

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

65

70

75

80

cag

atg

aac

tct

ctc

cgc

gca

gag

gac

aca

gca

gtc

tat

tac

tgt

gca

288

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

cgt

caa

ctg

acc

cac

tat

tac

gtt

ttg

gca

gcc

tgg

ggt

caa

ggg

act

336

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

100

105

110

ctg

gtc

aca

gtc

tcg

351

Leu

Val

Thr

Val

Ser

115 <210> 10 <211> 117 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 10

Glu Val 1 Ser Leu

Gln Arg His 35

Leu Val

Glu Cys Arg

Ser Gly Gly Gly Leu 10

Val Ser Gly

Gln Pro Gly Gly

Leu 20 Trp

5 Ser Val

Ser Thr

15

Ala Val

Ser Gly 25 Pro Gly

Phe Lys

Asn Trp

Tyr Met

Leu 45

30 Glu

His

Val

Gln

Ala 40

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

Val

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

100

105

110

Leu Val Thr Val Ser

- 32 031449

115 <210> 11 <211> 705 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 gL4 (V+C) <220>

<221> CDS <222> (64)..(705) <400> 11 atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa 60

gct

gat Asp 1

atc Ile

cag Gln

atg Met

acc Thr 5

cag Gln

agt Ser

cca Pro

agc Ser

agt Ser 10

ctc Leu

tcc Ser

gcc Ala

agc Ser

gta Val 15

108

ggc

gat

cgt

gtg

act

att

acc

tgt

cgt

gcc

agt

gag

gac

ctc

tat

tac

156

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Asp

Leu

Tyr

20

25

30

aac

ctg

gcc

tgg

tat

cag

cgt

aaa

ccg

ggc

aaa

gcc

ccg

aag

ctg

ctc

204

Asn

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

35

40

45

atc

tat

gat

acg

tac

cgc

ctg

gct

gac

ggt

gtg

cca

agc

cgt

ttc

agt

252

Ile

Tyr

Asp

Thr

Tyr

Arg

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

50

55

60

ggc

agt

ggc

agc

ggt

act

gac

tat

acc

ctc

aca

att

tcg

tct

ctc

cag

300

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

65

70

75

ccg

gaa

gat

ttc

gcc

tct

tac

tat

tgt

cag

caa

tat

tac

aag

ttc

cct

348

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Ser

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Lys

Phe

Pro

80

85

90

95

ttc

acc

ttc

ggt

cag

ggc

act

aaa

gta

gaa

atc

aaa

cgt

acg

gta

gcg

396

Phe

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

100

105

110

gcc

cca

tct

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tct

gat

gag

cag

ttg

aaa

tct

444

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

115

120

125

gga

act

gcc

tct

gtt

gtg

tgc

ctg

aat

aac

ttc

tat

ccc

aga

gag

492

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

130

135

140

gcc

aaa

gta

cag

tgg

aag

gtg

gat

aac

gcc

ctc

caa

tcg

ggt

aac

tcc

540

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

145

150

155

cag

gag

agt

gtc

aca

gag

cag

gac

agc

aag

gac

agc

acc

tac

agc

ctc

588

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

160

165

170

175

- 33 031449

agc Ser

acc Thr

ctg Leu

acg Thr 180

ctg Leu

agc Ser

aaa Lys

gca Ala

gac Asp 185

tac Tyr

gag Glu

aaa Lys

cac His

aaa Lys 190

gtc Val

636

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

agc

tca

cca

gta

aca

aaa

684

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

195

200

205

agt

ttt

aat

aga

ggg

gag

tgt

705

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

<210>	12
<211>	214
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная последовательность

<220>
<223>	Синтетическая конструкция
<400>	12

Asp 1

Ile

Gln

Met

Thr 5

Gln

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Glu

Asp

Leu

Tyr

Asn

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Asp

Thr

Tyr

Arg

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Ser

Tyr

Cys

Gln

Tyr

Lys

Phe

Pro

Phe

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

100

105

110

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

115

120

125

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

130

135

140

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

145

150

155

160

- 34 031449

Glu

Ser

Val

Thr

Glu 165

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp 170

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu 175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

195

200

205

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 <210> 13 <211> 726 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 gH1 HC Fab (без шарнирной области) с константной областью <220>

<221> CDS <222> (64)..(726) <400> 13 atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60

gct

gag Glu 1

gtt Val

cag Gln

ctg Leu

gtc Val 5

gag Glu

tct Ser

gga Gly

ggc Gly

ggg Gly 10

ctt Leu

gtc Val

cag Gln

cct Pro

ggt Gly 15

108

ggg

agc

ctg

cgt

ctc

tct

tgt

gca

gtg

agc

ggc

ttc

agc

tct

acc

aat

156

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Thr

Asn

20

25

30

tac

cat

gtg

cac

tgg

gtg

cgt

cag

gca

cct

ggg

aag

ggc

ctg

gag

tgg

204

Tyr

His

Val

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

atg

ggt

gtt

att

tgg

ggc

gac

ggc

gat

aca

tcc

tac

aac

tcc

gtc

ctg

252

Met

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

Val

Leu

50

55

60

aag

agc

cgt

ttc

acc

att

tcc

cgt

gac

acc

tca

aag

aat

acc

gtt

tac

300

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

65

70

75

ctc

cag

atg

aac

tct

ctc

cgc

gca

gag

gac

aca

gca

gtc

tat

tac

tgt

348

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

80

85

90

95

gca

cgt

caa

ctg

acc

cac

tat

tac

gtt

ttg

gca

gcc

tgg

ggt

caa

ggg

396

Ala

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

act

ctg

gtc

aca

gtc

tcg

agc

gct

tct

aca

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

444

- 35 031449

Thr

Leu

Val

Thr 115

Val

Ser

Ala

Ser 120

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser 125

Val

Phe

ccc

ctg

gca

ccc

tcc

aag

agc

acc

tct

ggg

ggc

aca

gcg

gcc

ctg

492

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

130

135

140

ggc

tgc

ctg

gtc

aag

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

540

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

aac

tca

ggc

gcc

ctg

acc

agc

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

gct

gtc

cta

588

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

160

165

170

175

cag

tcc

tca

gga

ctc

tac

tcc

ctc

agc

gtg

acc

gtg

ccc

tcc

636

Gln

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

agc

ttg

ggc

acc

cag

acc

tac

atc

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

ccc

684

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

agc

aac

acc

aag

gtc

gac

aag

aaa

gtt

gag

ccc

aaa

tct

tgt

726

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

210

215

220

<210> 14 <211> 221 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 14

Glu 1

Val

Gln

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly Gly Leu 10

Val

Gln Pro

Gly Gly 15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Thr

Asn

Tyr

20

25

30

His

Val

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

35

40

45

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

Val

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

- 36 031449

100 105 110

Leu

Val

Thr 115

Val

Ser

Ala

Ser 120

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser 125

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

Gly

130

135

140

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

165

170

175

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

195

200

205

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

210

215

220

<210> 15 <211> 750 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 gH1 HC Fab' с константной областью <220>

<221> CDS <222> (64)..(750) <400> 15 atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa 60

gct

gag Glu 1

gtt Val

cag Gln

ctg Leu

gtc Val 5

gag Glu

tct Ser

gga Gly

ggc Gly

ggg Gly 10

ctt Leu

gtc Val

cag Gln

cct Pro

ggt Gly 15

108

ggg

agc

ctg

cgt

ctc

tct

tgt

gca

gtg

agc

ggc

ttc

agc

tct

acc

aat

156

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

Thr

Asn

20

25

30

tac

cat

gtg

cac

tgg

gtg

cgt

cag

gca

cct

ggg

aag

ggc

ctg

gag

tgg

204

Tyr

His

Val

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

35

40

45

atg

ggt

gtt

att

tgg

ggc

gac

ggc

gat

aca

tcc

tac

aac

tcc

gtc

ctg

252

Met

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

Val

Leu

- 37 031449

aag Lys

agc Ser 65

cgt Arg

ttc Phe

acc Thr

att Ile

tcc Ser 70

cgt Arg

gac Asp

acc Thr

tca Ser

aag Lys 75

aat Asn

acc Thr

gtt Val

tac Tyr

300

ctc

cag

atg

aac

tct

ctc

cgc

gca

gag

gac

aca

gca

gtc

tat

tac

tgt

348

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

80

85

90

95

gca

cgt

caa

ctg

acc

cac

tat

tac

gtt

ttg

gca

gcc

tgg

ggt

caa

ggg

396

Ala

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

100

105

110

act

ctg

gtc

aca

gtc

tcg

agc

gct

tct

aca

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

444

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

115

120

125

ccc

ctg

gca

ccc

tcc

aag

agc

acc

tct

ggg

ggc

aca

gcg

gcc

ctg

492

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

130

135

140

ggc

tgc

ctg

gtc

aag

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

540

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

145

150

155

aac

tca

ggc

gcc

ctg

acc

agc

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

gct

gtc

cta

588

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

160

165

170

175

cag

tcc

tca

gga

ctc

tac

tcc

ctc

agc

gtg

acc

gtg

ccc

tcc

636

Gln

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

agc

ttg

ggc

acc

cag

acc

tac

atc

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

ccc

684

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

195

200

205

agc

aac

acc

aag

gtc

gac

aag

aaa

gtt

gag

ccc

aaa

tct

tgt

gac

aaa

732

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

210

215

220

act

cac

aca

tgc

gcc

gcg

750

Thr

His

Thr

Cys

Ala

225 <210> 16 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1	5	10	15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Thr Asn Tyr
20	25	30

- 38 031449

His

Val

His 35

Trp

Val

Arg Gln

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

Val

Leu

Lys

50

55

60

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

Val

Tyr

Leu

65

70

75

80

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Cys

Ala

85

90

95

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

Gln

Gly

Thr

100

105

110

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

115

120

125

Leu

Ala

Pro

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

Gly

130

135

140

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

145

150

155

160

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gln

165

170

175

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

Pro

Ser

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

195

200

205

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Val

Glu

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

210

215

220

His

Thr

Cys

Ala

225 <210> 17 <211> 711 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: hu342 каппа LC

- 39 031449

<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..(711
<400>	17

atg Met 1

gac Asp

atg Met

agg Arg

gtc Val 5

ccc Pro

gct Ala

cag Gln

ctc Leu

ctg Leu 10

ggg Gly

ctc Leu

ctg Leu

cta Leu

ctc Leu 15

tgg Trp

48

ctc

cga

ggt

gcc

aga

tgt

gat

atc

cag

atg

acc

cag

agt

cca

agc

agt

96

Leu

Arg

Gly

Ala

Arg

Cys

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

20

25

30

ctc

tcc

gcc

agc

gta

ggc

gat

cgt

gtg

act

att

acc

tgt

cgt

gcc

agt

144

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

35

40

45

gag

gac

ctc

tat

tac

aac

ctg

gcc

tgg

tat

cag

cgt

aaa

ccg

ggc

aaa

192

Glu

Asp

Leu

Tyr

Asn

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

Gly

Lys

50

55

60

gcc

ccg

aag

ctg

ctc

atc

tat

gat

acg

tac

cgc

ctg

gct

gac

ggt

gtg

240

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Asp

Thr

Tyr

Arg

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

65

70

75

80

cca

agc

cgt

ttc

agt

ggc

agt

ggc

agc

ggt

act

gac

tat

acc

ctc

aca

288

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

85

90

95

att

tcg

tct

ctc

cag

ccg

gaa

gat

ttc

gcc

tct

tac

tat

tgt

cag

caa

336

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Ser

Tyr

Cys

Gln

100

105

110

tat

tac

aag

ttc

cct

ttc

acc

ttc

ggt

cag

ggc

act

aaa

gta

gaa

atc

384

Tyr

Lys

Phe

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

115

120

125

aaa

cgt

acg

gtg

gct

gca

cca

tct

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tct

gat

432

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

130

135

140

gag

cag

ttg

aaa

tct

gga

act

gcc

tct

gtt

gtg

tgc

ctg

aat

aac

480

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

145

150

155

160

ttc

tat

ccc

aga

gag

gcc

aaa

gta

cag

tgg

aag

gtg

gat

aac

gcc

ctc

528

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

165

170

175

caa

tcg

ggt

aac

tcc

cag

gag

agt

gtc

aca

gag

cag

gac

agc

aag

gac

576

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

180

185

190

agc

acc

tac

agc

ctc

agc

acc

ctg

acg

ctg

agc

aaa

gca

gac

tac

624

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

195

200

205

gag

aaa

cac

aaa

gtc

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

agc

672

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

210

215

220

- 40 031449

tcg	ccc gtc	aca	aag	agc	ttc	aac agg	gga	gag	tgt tag	711
Ser	Pro Val	Thr	Lys	Ser	Phe	Asn Arg	Gly	Glu	Cys
225				230				235

<210> 18 <211> 236 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 18

Met 1

Asp

Met

Arg

Val 5

Pro

Ala

Gln Leu

Leu Gly 10

Leu

Leu 15

Trp

Leu

Arg

Gly

Ala

Arg

Cys

Asp

Ile

Gln

Met

Thr

Gln

Ser

Pro

Ser

20

25

30

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

35

40

45

Glu

Asp

Leu

Tyr

Asn

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gln

Arg

Lys

Pro

Gly

Lys

50

55

60

Ala

Pro

Lys

Leu

Ile

Tyr

Asp

Thr

Tyr

Arg

Leu

Ala

Asp

Gly

Val

65

70

75

80

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Tyr

Thr

Leu

Thr

85

90

95

Ile

Ser

Leu

Gln

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Ser

Tyr

Cys

Gln

100

105

110

Tyr

Lys

Phe

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gln

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

115

120

125

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Ser

Asp

130

135

140

Glu

Gln

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

145

150

155

160

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gln

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

165

170

175

Gln

Ser

Gly

Asn

Ser

Gln

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gln

Asp

Ser

Lys

Asp

180

185

190

- 41 031449

Ser

Thr

Tyr 195

Ser

Leu

Ser

Thr 200

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys 205

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gln

Gly

Leu

Ser

210

215

220

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

<210> 19 <211> 1392 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: hu342 aglyP-huIgG4 HC <220>

<221> CDS <222> (1)..(1392)

<400> 19

atg Met 1

gac Asp

tgg Trp

acc Thr

tgg Trp 5

agg Arg

gtc Val

ttc Phe

tgc Cys

ttg Leu 10

ctg Leu

gct Ala

gta Val

gca Ala

cca Pro 15

ggt Gly

48

gcc

cac

tcc

gaa

gta

caa

ttg

gtc

gag

tct

gga

ggc

ggg

ctt

gtc

cag

96

Ala

His

Ser

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

20

25

30

cct

ggt

ggg

agc

ctg

cgt

ctc

tct

tgt

gca

gtg

agc

ggc

ttc

agc

tct

144

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

acc

aat

tac

cat

gtg

cac

tgg

gtg

cgt

cag

gca

cct

ggg

aag

ggc

ctg

192

Thr

Asn

Tyr

His

Val

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

gag

tgg

atg

ggt

gtt

att

tgg

ggc

gac

ggc

gat

aca

tcc

tac

aac

tcc

240

Glu

Trp

Met

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

65

70

75

80

gtc

ctg

aag

agc

cgt

ttc

acc

att

tcc

cgt

gac

acc

tca

aag

aat

acc

288

Val

Leu

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

85

90

95

gtt

tac

ctc

cag

atg

aac

tct

ctc

cgc

gca

gag

gac

aca

gca

gtc

tat

336

Val

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

100

105

110

tac

tgt

gca

cgt

caa

ctg

acc

cac

tat

tac

gtt

ttg

gca

gcc

tgg

ggt

384

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

115

120

125

caa

ggg

act

ctg

gtc

aca

gtc

tcg

agc

gct

tca

acc

aag

ggc

cca

tcc

432

Gln

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

- 42 031449

130

135

140

gtc Val 145

ttc Phe

ccc Pro

ctg Leu

gcg Ala

ccc Pro 150

tgc Cys

tcc Ser

aga Arg

tct Ser

acc Thr 155

tcc Ser

gag Glu

agc Ser

aca Thr

gcc Ala 160

480

gcc

ctg

ggc

tgc

ctg

gtc

aag

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

528

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

tcg

tgg

aac

tca

ggc

gcc

ctg

acc

agc

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

gct

576

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

gtc

cta

cag

tcc

tca

gga

ctc

tac

tcc

ctc

agc

gtg

acc

gtg

624

Val

Leu

Gln

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

195

200

205

ccc

tcc

agc

ttg

ggc

acg

aag

acc

tac

acc

tgc

aac

gta

gat

cac

672

Pro

Ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

aag

ccc

agc

aac

acc

aag

gtg

gac

aag

aga

gtt

gag

tcc

aaa

tat

ggt

720

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Ser

Lys

Tyr

Gly

225

230

235

240

ccc

cca

tgc

cca

ccg

tgc

cca

gca

cct

gag

ttc

ctg

ggg

gga

cca

tca

768

Pro

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Phe

Leu

Gly

Pro

Ser

245

250

255

gtc

ttc

ctg

ttc

ccc

cca

aaa

ccc

aag

gac

act

ctc

atg

atc

tcc

cgg

816

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

260

265

270

acc

cct

gag

gtc

acg

tgc

gtg

gac

gtg

agc

cag

gaa

gac

ccc

864

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

Gln

Glu

Asp

Pro

275

280

285

gag

gtc

cag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gat

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

912

Glu

Val

Gln

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

290

295

300

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

cag

ttc

aac

agc

gcg

tac

cgt

gtg

gtc

960

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gln

Phe

Asn

Ser

Ala

Tyr

Arg

Val

305

310

315

320

agc

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aac

ggc

aag

gag

tac

1008

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

325

330

335

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

ggc

ctc

ccg

tcc

atc

gag

aaa

acc

1056

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

340

345

350

atc

tcc

aaa

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

cga

gag

cca

caa

gtg

tac

acc

ctg

1104

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

355

360

365

ccc

cca

tcc

cag

gag

atg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

1152

Pro

Ser

Gln

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

Gln

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

370 375 380

- 43 031449

ctg Leu 385

gtc Val

aaa Lys

ggc Gly

ttc Phe

tac Tyr 390

ccc Pro

agc Ser

gac Asp

atc Ile

gcc Ala 395

gtg Val

gag Glu

tgg Trp

gag Glu

agc Ser 400

1200

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtc

ctc

gat

1248

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

405

410

415

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ctc

tac

agc

agg

cta

acc

gtg

gac

aag

agc

1296

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

420

425

430

agg

tgg

cag

gag

ggg

aat

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

1344

Arg

Trp

Gln

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

435

440

445

ctg

cac

aac

cac

tac

aca

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tct

ctg

ggt

tga

1392

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

450

455

460

<210> 20 <211> 463 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 20

Met Asp 1

Trp

Thr Trp Arg 5

Val

Phe

Cys

Leu 10

Leu

Ala

Val

Ala

Pro 15

Gly

Ala

His

Ser

Glu

Val

Gln

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gln

20

25

30

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

Thr

Asn

Tyr

His

Val

His

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Met

Gly

Val

Ile

Trp

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Ser

Tyr

Asn

Ser

65

70

75

80

Val

Leu

Lys

Ser

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Thr

Ser

Lys

Asn

Thr

85

90

95

Val

Tyr

Leu

Gln

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

100

105

110

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gln

Leu

Thr

His

Tyr

Val

Leu

Ala

Trp

Gly

115

120

125

- 44 031449

Gln Gly

Thr

Leu

Val

Thr Val 135

Ser

Ala

Ser

Thr 140

Lys

Gly

Pro

Ser

130

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

Ser

Thr

Ala

145

150

155

160

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

165

170

175

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

180

185

190

Val

Leu

Gln

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Leu

Gly

Thr

Lys

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

Val

Asp

His

210

215

220

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Ser

Lys

Tyr

Gly

225

230

235

240

Pro

Cys

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Phe

Leu

Gly

Pro

Ser

245

250

255

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

260

265

270

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

Gln

Glu

Asp

Pro

275

280

285

Glu

Val

Gln

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

290

295

300

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Gln

Phe

Asn

Ser

Ala

Tyr

Arg

Val

305

310

315

320

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gln

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

325

330

335

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Gly

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

340

345

350

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

Val

Tyr

Thr

Leu

355

360

365

- 45 031449

Pro

Pro 370

Ser

Gln

Glu

Met 375

Thr

Lys

Asn

Gln

Val 380

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

385

390

395

400

Asn

Gly

Gln

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

405

410

415

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Arg

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

420

425

430

Arg

Trp

Gln

Glu

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

435

440

445

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Leu

Gly

450

455

460

<210> 21 <211> 1438 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 gL4gH1 векторная ДНК VH3 (V+C) Fab (без шарнирной области) <400> 21

atgaaaaaga	cagctatcgc	aattgcagtg	gccttggctg	gtttcgctac	cgtagcgcaa	60
gctgatatcc	agatgaccca	gagtccaagc	agtctctccg	ccagcgtagg	cgatcgtgtg	120
actattacct	gtcgtgccag	tgaggacctc	tattacaacc	tggcctggta	tcagcgtaaa	180
ccgggcaaag	ccccgaagct	gctcatctat	gatacgtacc	gcctggctga	cggtgtgcca	240
agccgtttca	gtggcagtgg	cagcggtact	gactataccc	tcacaatttc	gtctctccag	300
ccggaagatt	tcgcctctta	ctattgtcag	caatattaca	agttcccttt	caccttcggt	360
cagggcacta	aagtagaaat	caaacgtacg	gtagcggccc	catctgtctt	catcttcccg	420
ccatctgatg	agcagttgaa	atctggaact	gcctctgttg	tgtgcctgct	gaataacttc	480
tatcccagag	aggccaaagt	acagtggaag	gtggataacg	ccctccaatc	gggtaactcc	540
caggagagtg	tcacagagca	ggacagcaag	gacagcacct	acagcctcag	cagcaccctg	600
acgctgagca	aagcagacta	cgagaaacac	aaagtctacg	cctgcgaagt	cacccatcag	660
ggcctgagct	caccagtaac	aaaaagtttt	aatagagggg	agtgttaaaa	tgaagaagac	720
tgctatagca	attgcagtgg	cgctagctgg	tttcgccacc	gtggcgcaag	ctgaggttca	780
gctggtcgag	tctggaggcg	ggcttgtcca	gcctggtggg	agcctgcgtc	tctcttgtgc	840
agtgagcggc	ttcagctcta	ccaattacca	tgtgcactgg	gtgcgtcagg	cacctgggaa	900

- 46 031449

gggcctggag	tggatgggtg	ttatttgggg	cgacggcgat	acatcctaca	actccgtcct	960
gaagagccgt	ttcaccattt	cccgtgacac	ctcaaagaat	accgtttacc	tccagatgaa	1020
ctctctccgc	gcagaggaca	cagcagtcta	ttactgtgca	cgtcaactga	cccactatta	1080
cgttttggca	gcctggggtc	aagggactct	ggtcacagtc	tcgagcgctt	ctacaaaggg	1140
cccatcggtc	ttccccctgg	caccctcctc	caagagcacc	tctgggggca	cagcggccct	1200
gggctgcctg	gtcaaggact	acttccccga	accggtgacg	gtgtcgtgga	actcaggcgc	1260
cctgaccagc	ggcgtgcaca	ccttcccggc	tgtcctacag	tcctcaggac	tctactccct	1320
cagcagcgtg	gtgaccgtgc	cctccagcag	cttgggcacc	cagacctaca	tctgcaacgt	1380
gaatcacaag	cccagcaaca	ccaaggtcga	caagaaagtt	gagcccaaat	cttgttaa	1438

<210> 22 <211> 1459 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: 342 gL4gH1 векторная ДНК

VH3 (V+C) Fab'

<400> 22
atgaaaaaga	cagctatcgc	aattgcagtg	gccttggctg	gtttcgctac	cgtagcgcaa	60
gctgatatcc	agatgaccca	gagtccaagc	agtctctccg	ccagcgtagg	cgatcgtgtg	120
actattacct	gtcgtgccag	tgaggacctc	tattacaacc	tggcctggta	tcagcgtaaa	180
ccgggcaaag	ccccgaagct	gctcatctat	gatacgtacc	gcctggctga	cggtgtgcca	240
agccgtttca	gtggcagtgg	cagcggtact	gactataccc	tcacaatttc	gtctctccag	300
ccggaagatt	tcgcctctta	ctattgtcag	caatattaca	agttcccttt	caccttcggt	360
cagggcacta	aagtagaaat	caaacgtacg	gtagcggccc	catctgtctt	catcttcccg	420
ccatctgatg	agcagttgaa	atctggaact	gcctctgttg	tgtgcctgct	gaataacttc	480
tatcccagag	aggccaaagt	acagtggaag	gtggataacg	ccctccaatc	gggtaactcc	540
caggagagtg	tcacagagca	ggacagcaag	gacagcacct	acagcctcag	cagcaccctg	600
acgctgagca	aagcagacta	cgagaaacac	aaagtctacg	cctgcgaagt	cacccatcag	660
ggcctgagct	caccagtaac	aaaaagtttt	aatagagggg	agtgttaaaa	tgaagaagac	720
tgctatagca	attgcagtgg	cgctagctgg	tttcgccacc	gtggcgcaag	ctgaggttca	780
gctggtcgag	tctggaggcg	ggcttgtcca	gcctggtggg	agcctgcgtc	tctcttgtgc	840
agtgagcggc	ttcagctcta	ccaattacca	tgtgcactgg	gtgcgtcagg	cacctgggaa	900
gggcctggag	tggatgggtg	ttatttgggg	cgacggcgat	acatcctaca	actccgtcct	960

- 47 031449

gaagagccgt	ttcaccattt	cccgtgacac	ctcaaagaat	accgtttacc	tccagatgaa	1020
ctctctccgc	gcagaggaca	cagcagtcta	ttactgtgca	cgtcaactga	cccactatta	1080
cgttttggca	gcctggggtc	aagggactct	ggtcacagtc	tcgagcgctt	ctacaaaggg	1140
cccatcggtc	ttccccctgg	caccctcctc	caagagcacc	tctgggggca	cagcggccct	1200
gggctgcctg	gtcaaggact	acttccccga	accggtgacg	gtgtcgtgga	actcaggcgc	1260
cctgaccagc	ggcgtgcaca	ccttcccggc	tgtcctacag	tcctcaggac	tctactccct	1320
cagcagcgtg	gtgaccgtgc	cctccagcag	cttgggcacc	cagacctaca	tctgcaacgt	1380
gaatcacaag	cccagcaaca	ccaaggtcga	caagaaagtt	gagcccaaat	cttgtgacaa	1440
aactcacaca	tgcgccgcg					1459

<210> 23 <211> 986 <212> ДНК <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (379)..(945) <300>

<308> GenBank/D86610 <309> 2009-01-10 <313> (1)..(986) <400> 23

atagtgagga	taatcctgat	gatgcgcacc	gtgctttcat	ctatcgaacg	caaaaatcat	60
tctctaagta	aatgaatgga	ttgcatgcgt	ttcactcaat	tgtactttaa	ttgaccaacc	120
ccgcttatta	actttctgta	tcactttttc	ttataaaaaa	tcatgtaaaa	ccgctcgcca	180
agaccgcacc	aatcgggtaa	tctcgaactc	gttttgcctc	ggcggtagat	tatcctcaca	240
gcatataatt	ttgtgcgtta	gtccacagat	ttggccttaa	ggaattgttt	caacatgccc	300
aggtaattag	tctcgtgtcg	cttggcattt	ttttataacg	atatttgtcg	ttaaggactt	360

caagggaaaa caaacaac

atg Met 1

gtc Val

aaa Lys

tct Ser

caa Gln 5

ccg att

ttg aga Leu Arg

tat Tyr 10

atc Ile

411

Pro

Ile

ttg

cgc

ggg

att

ccc

gcg

att

gca

gta

gcg

gtt

ctg

ctt

tct

gca

tgt

459

Leu

Arg

Gly

Ile

Pro

Ala

Ile

Ala

Val

Ala

Val

Leu

Ser

Ala

Cys

15

20

25

agt

gca

aat

aac

acc

gca

aag

aat

atg

cat

cct

gag

aca

cgt

gca

gtg

507

Ser

Ala

Asn

Thr

Ala

Lys

Asn

Met

His

Pro

Glu

Thr

Arg

Ala

Val

30

35

40

ggt

agt

gaa

aca

tca

ctg

caa

gct

tct

cag

gat

gaa

ttt

gaa

aac

555

Gly

Ser

Glu

Thr

Ser

Leu

Gln

Ala

Ser

Gln

Asp

Glu

Phe

Glu

Asn

45

50

55

- 48 031449

ctg Leu 60

gtt Val

cgt Arg

aat Asn

gtc Val

gac Asp 65

gta Val

aaa Lys

tcg Ser

cga Arg

att Ile 70

atg Met

gat Asp

cag Gln

tat Tyr

gct Ala 75

603

gac

tgg

aaa

ggc

gta

cgt

tat

cgt

ctg

ggc

agc

act

aaa

ggt

651

Asp

Trp

Lys

Gly

Val

Arg

Tyr

Arg

Leu

Gly

Ser

Thr

Lys

Gly

80

85

90

atc

gat

tgt

tct

ggt

ttc

gta

cag

cgt

aca

ttc

cgt

gag

caa

ttt

ggc

699

Ile

Asp

Cys

Ser

Gly

Phe

Val

Gln

Arg

Thr

Phe

Arg

Glu

Gln

Phe

Gly

95

100

105

tta

gaa

ctt

ccg

cgt

tcg

act

tac

gaa

cag

gaa

atg

ggt

aaa

tct

747

Leu

Glu

Leu

Pro

Arg

Ser

Thr

Tyr

Glu

Gln

Glu

Met

Gly

Lys

Ser

110

115

120

gtt

tcc

cgc

agt

aat

ttg

cgt

acg

ggt

gat

tta

gtt

ctg

ttc

cgt

gcc

795

Val

Ser

Arg

Ser

Asn

Leu

Arg

Thr

Gly

Asp

Leu

Val

Leu

Phe

Arg

Ala

125

130

135

ggt

tca

acg

gga

cgc

cat

gtc

ggt

att

tat

atc

ggc

aac

aat

cag

ttt

843

Gly

Ser

Thr

Gly

Arg

His

Val

Gly

Ile

Tyr

Ile

Gly

Asn

Gln

Phe

140

145

150

155

gtc

cat

gct

tcc

acc

agc

agt

ggt

gtt

att

tcc

agc

atg

aat

gaa

891

Val

His

Ala

Ser

Thr

Ser

Gly

Val

Ile

Ser

Met

Asn

Glu

160

165

170

ccg

tac

tgg

aag

cgt

tac

aac

gaa

gca

cgc

cgg

gtt

ctc

agc

cgc

939

Pro

Tyr

Trp

Lys

Arg

Tyr

Asn

Glu

Ala

Arg

Val

Leu

Ser

Arg

175

180

185

agc taa taaaccgttt ggatgcaatc ccttggctat cctgacgagt t

986

Ser

<210> <211> <212> <213>	24 188 БЕЛОК Escherichia coli
<400>	24

Met 1

Val

Lys

Ser

Gln 5

Pro

Ile

Leu

Arg

Tyr 10

Ile

Leu

Arg Gly

Ile 15

Pro

Ala

Ile

Ala

Val

Ala

Val

Leu

Ser

Ala

Cys

Ser

Ala

Asn

Thr

20

25

30

Ala

Lys

Asn

Met

His

Pro

Glu

Thr

Arg

Ala

Val

Gly

Ser

Glu

Thr

Ser

35

40

45

Ser

Leu

Gln

Ala

Ser

Gln

Asp

Glu

Phe

Glu

Asn

Leu

Val

Arg

Asn

Val

50

55

60

Asp

Val

Lys

Ser

Arg

Ile

Met

Asp

Gln

Tyr

Ala

Asp

Trp

Lys

Gly

Val

70 75 80

- 49 031449

Arg

Tyr Arg

Leu

Gly 85

Gly

Ser Thr

Lys

Lys 90

Gly

Ile

Asp

Cys

Ser 95

Gly

Phe

Val

Gln

Arg

Thr

Phe

Arg

Glu

Gln

Phe

Gly

Leu

Glu

Leu

Pro

Arg

100

105

110

Ser

Thr

Tyr

Glu

Gln

Glu

Met

Gly

Lys

Ser

Val

Ser

Arg

Ser

Asn

115

120

125

Leu

Arg

Thr

Gly

Asp

Leu

Val

Leu

Phe

Arg

Ala

Gly

Ser

Thr

Gly

Arg

130

135

140

His

Val

Gly

Ile

Tyr

Ile

Gly

Asn

Gln

Phe

Val

His

Ala

Ser

Thr

145

150

155

160

Ser

Gly

Val

Ile

Ser

Met

Asn

Glu

Pro

Tyr

Trp

Lys

165

170

175

Arg

Tyr

Asn

Glu

Ala

Arg

Val

Leu

Ser

Arg

Ser

180

185

<210> 25 <211> 2196 <212> ДНК <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (69)..(2117) <220>

<221> сигнальный пептид <222> (69)..(134) <300>

<308> GenBank/M75634 <309> 1993-04-26 <313> (1)..(2196) <400> 25

gaattcgggt atgtctttga ttgtgcgcgc agaacacctg gtgttctgaa acggaggccg	60
ggccaggc atg aac atg ttt ttt agg ctt acc gcg tta gct ggc ctg ctt Met Asn Met Phe Phe Arg Leu Thr Ala Leu Ala Gly Leu Leu 1 5 10	110
gca ata gca ggc cag acc ttc gct gta gaa gat atc acg cgt gct gat	158
Ala Ile Ala Gly Gln Thr Phe Ala Val Glu Asp Ile Thr Arg Ala Asp 15 20 25 30
caa att ccg gta tta aag gaa gag acg cag cat gcg acg gta agt gag	206

- 50 031449

Gln

Ile

Pro Val

Leu 35

Lys

Glu

Thr

Gln His 40

Ala

Thr

Val

Ser 45

Glu

cgc

gta

acg

tcg

cgc

ttc

acc

cgt

tct

cat

tat

cgc

cag

ttc

gac

ctc

254

Arg

Val

Thr

Ser

Arg

Phe

Thr

Arg

Ser

His

Tyr

Arg

Gln

Phe

Asp

Leu

50

55

60

gat

cag

gca

ttt

tcg

gcc

aaa

atc

ttt

gac

cgc

tac

ctg

aat

ctg

ctc

302

Asp

Gln

Ala

Phe

Ser

Ala

Lys

Ile

Phe

Asp

Arg

Tyr

Leu

Asn

Leu

65

70

75

gat

tac

agc

cac

aac

gtg

ctg

gca

agc

gat

gtt

gaa

cag

ttc

gcg

350

Asp

Tyr

Ser

His

Asn

Val

Leu

Ala

Ser

Asp

Val

Glu

Gln

Phe

Ala

80

85

90

aaa

aag

aaa

acc

gag

tta

ggc

gat

gaa

ctg

cgt

tca

ggc

aaa

ctc

gac

398

Lys

Thr

Glu

Leu

Gly

Asp

Glu

Leu

Arg

Ser

Gly

Lys

Leu

Asp

95

100

105

110

gtt

ttc

tac

gat

ctc

tac

aat

ctg

gcg

caa

aag

cgc

cgt

ttt

gag

cgt

446

Val

Phe

Tyr

Asp

Leu

Tyr

Asn

Leu

Ala

Gln

Lys

Arg

Phe

Glu

Arg

115

120

125

tac

cag

tac

gct

ttg

tcg

gta

ctg

gaa

aag

ccg

atg

gat

ttc

acc

ggc

494

Tyr

Gln

Tyr

Ala

Leu

Ser

Val

Leu

Glu

Lys

Pro

Met

Asp

Phe

Thr

Gly

130

135

140

aac

gac

act

tat

aac

ctt

gac

cgc

agc

aaa

gcg

ccc

tgg

ccg

aaa

aac

542

Asn

Asp

Thr

Tyr

Asn

Leu

Asp

Arg

Ser

Lys

Ala

Pro

Trp

Pro

Lys

Asn

145

150

155

gag

gct

gag

ttg

aac

gcg

ctg

tgg

gac

agt

aaa

gtc

aaa

ttc

gac

gag

590

Glu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Leu

Trp

Asp

Ser

Lys

Val

Lys

Phe

Asp

Glu

160

165

170

tta

agc

ctg

aag

ctg

aca

gga

aaa

acg

gat

aaa

gaa

att

cgt

gaa

acc

638

Leu

Ser

Leu

Lys

Leu

Thr

Gly

Lys

Thr

Asp

Lys

Glu

Ile

Arg

Glu

Thr

175

180

185

190

ctg

act

cgc

tac

aaa

ttt

gcc

att

cgt

ctg

gcg

caa

acc

aac

686

Leu

Thr

Arg

Tyr

Lys

Phe

Ala

Ile

Arg

Leu

Ala

Gln

Thr

Asn

195

200

205

agc

gaa

gat

gtt

ttc

tcg

ctg

gca

atg

acg

gcg

ttt

gcg

cgt

gaa

atc

734

Ser

Glu

Asp

Val

Phe

Ser

Leu

Ala

Met

Thr

Ala

Phe

Ala

Arg

Glu

Ile

210

215

220

gac

ccg

cat

acc

aac

tat

ctt

tcc

ccg

cgt

aat

acc

gaa

cag

ttc

aac

782

Asp

Pro

His

Thr

Asn

Tyr

Leu

Ser

Pro

Arg

Asn

Thr

Glu

Gln

Phe

Asn

225

230

235

act

gaa

atg

agt

ttg

tcg

ctg

gaa

ggt

att

ggc

gca

gtg

ctg

caa

atg

830

Thr

Glu

Met

Ser

Leu

Ser

Leu

Glu

Gly

Ile

Gly

Ala

Val

Leu

Gln

Met

240

245

250

gat

gac

tac

acc

gtt

atc

aat

tcg

atg

gtg

gca

ggt

ccg

gca

878

Asp

Tyr

Thr

Val

Ile

Asn

Ser

Met

Val

Ala

Gly

Pro

Ala

255

260

265

270

gcg

aag

agt

aaa

gct

atc

agc

gtt

ggt

gac

aaa

att

gtc

ggt

gtt

ggt

926

Ala

Lys

Ser

Lys

Ala

Ile

Ser

Val

Gly

Asp

Lys

Ile

Val

Gly

Val

Gly

275

280

285

- 51 031449

caa Gln

aca Thr

ggc Gly

aag Lys 290

ccg Pro

atg Met

gtt Val

gac Asp

gtg Val 295

att Ile

ggc Gly

tgg Trp

cgt Arg

ctt Leu 300

gat Asp

974

gtg

gtt

gcc

tta

att

aaa

ggg

ccg

aag

ggc

agt

aaa

gtt

cgt

ctg

gaa

1022

Val

Ala

Leu

Ile

Lys

Gly

Pro

Lys

Gly

Ser

Lys

Val

Arg

Leu

Glu

305

310

315

att

tta

cct

gct

ggt

aaa

ggg

acc

aag

acc

cgt

act

gta

acg

ttg

acc

1070

Ile

Leu

Pro

Ala

Gly

Lys

Gly

Thr

Lys

Thr

Arg

Thr

Val

Thr

Leu

Thr

320

325

330

cgt

gaa

cgt

att

cgt

ctc

gaa

gac

cgc

gcg

gtt

aaa

atg

tcg

gtg

aag

1118

Arg

Glu

Arg

Ile

Arg

Leu

Glu

Asp

Arg

Ala

Val

Lys

Met

Ser

Val

Lys

335

340

345

350

acc

gtc

ggt

aaa

gag

aaa

gtc

ggc

gtg

ctg

gat

att

ccg

ggc

ttc

tat

1166

Thr

Val

Gly

Lys

Glu

Lys

Val

Gly

Val

Leu

Asp

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

355

360

365

gtg

ggt

ttg

aca

gac

gat

gtc

aaa

gtg

caa

ctg

cag

aaa

ctg

gaa

aaa

1214

Val

Gly

Leu

Thr

Asp

Val

Lys

Val

Gln

Leu

Gln

Lys

Leu

Glu

Lys

370

375

380

cag

aat

gtc

agc

gtc

atc

gac

ctg

cgt

agc

aat

ggc

ggt

ggg

1262

Gln

Asn

Val

Ser

Val

Ile

Asp

Leu

Arg

Ser

Asn

Gly

385

390

395

gcg

tta

act

gaa

gcc

gta

tcg

ctc

tcc

ggt

ctg

ttt

att

cct

gcg

ggt

1310

Ala

Leu

Thr

Glu

Ala

Val

Ser

Leu

Ser

Gly

Leu

Phe

Ile

Pro

Ala

Gly

400

405

410

ccc

att

gtt

cag

gtc

cgc

gat

aac

ggc

aag

gtt

cgt

gaa

gat

agc

1358

Pro

Ile

Val

Gln

Val

Arg

Asp

Asn

Gly

Lys

Val

Arg

Glu

Asp

Ser

415

420

425

430

gat

acc

gac

gga

cag

gtt

ttc

tat

aaa

ggc

ccg

ctg

gtg

ctg

gtt

1406

Asp

Thr

Asp

Gly

Gln

Val

Phe

Tyr

Lys

Gly

Pro

Leu

Val

Leu

Val

435

440

445

gac

cgc

ttc

agt

gct

tcg

gct

tca

gaa

atc

ttt

gcc

gcg

gca

atg

cag

1454

Asp

Arg

Phe

Ser

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Ile

Phe

Ala

Met

Gln

450

455

460

gat

tac

ggt

cgt

gcg

ctg

gtt

gtg

ggt

gaa

ccg

acg

ttt

ggt

aaa

ggc

1502

Asp

Tyr

Gly

Arg

Ala

Leu

Val

Gly

Glu

Pro

Thr

Phe

Gly

Lys

Gly

465

470

475

acc

gtt

cag

caa

tac

cgt

tca

ttg

aac

cgt

att

tac

gat

cag

atg

tta

1550

Thr

Val

Gln

Tyr

Arg

Ser

Leu

Asn

Arg

Ile

Tyr

Asp

Gln

Met

Leu

480

485

490

cgt

cct

gaa

tgg

cca

gcg

ctg

ggt

tct

gtg

cag

tac

acg

atc

cag

aaa

1598

Arg

Pro

Glu

Trp

Pro

Ala

Leu

Gly

Ser

Val

Gln

Tyr

Thr

Ile

Gln

Lys

495

500

505

510

ttc

tat

cgc

gtt

aac

ggc

agt

acg

caa

cgt

aaa

ggc

gta

acg

cca

1646

Phe

Tyr

Arg

Val

Asn

Gly

Ser

Thr

Gln

Arg

Lys

Gly

Val

Thr

Pro

515

520

525

gac

atc

atg

ccg

acg

ggt

aat

gaa

acg

gaa

acg

ggt

gag

aaa

1694

Asp

Ile

Met

Pro

Thr

Gly

Asn

Glu

Thr

Glu

Thr

Gly

Glu

Lys

530 535 540

- 52 031449

ttc Phe

gaa Glu

gat Asp 545

aac Asn

gcg Ala

ctg Leu

ccg Pro

tgg Trp 550

gat Asp

agc Ser

att Ile

gat Asp

gcc Ala 555

gcg Ala

act Thr

tat Tyr

1742

gtg

aaa

tca

gga

gat

tta

acg

gcc

ttt

gaa

ccg

gag

ctg

aag

gaa

1790

Val

Lys

Ser

Gly

Asp

Leu

Thr

Ala

Phe

Glu

Pro

Glu

Leu

Lys

Glu

560

565

570

cat

aat

gcg

cgt

atc

gcg

aaa

gat

cct

gag

ttc

cag

aac

atc

atg

aag

1838

His

Asn

Ala

Arg

Ile

Ala

Lys

Asp

Pro

Glu

Phe

Gln

Asn

Ile

Met

Lys

575

580

585

590

gat

atc

gcg

cgc

ttc

aac

gct

atg

aag

gac

aag

cgc

aat

atc

gtt

tct

1886

Asp

Ile

Ala

Arg

Phe

Asn

Ala

Met

Lys

Asp

Lys

Arg

Asn

Ile

Val

Ser

595

600

605

ctg

aat

tac

gct

gtg

cgt

gag

aaa

gag

aat

gaa

gat

gcg

acg

1934

Leu

Asn

Tyr

Ala

Val

Arg

Glu

Lys

Glu

Asn

Glu

Asp

Ala

Thr

610

615

620

cgt

ctg

gcg

cgt

ttg

aac

gaa

cgc

ttt

aaa

cgc

gaa

ggt

aaa

ccg

gag

1982

Arg

Leu

Ala

Arg

Leu

Asn

Glu

Arg

Phe

Lys

Arg

Glu

Gly

Lys

Pro

Glu

625

630

635

ttg

aag

aaa

ctg

gat

cta

ccg

aaa

gat

tac

cag

gag

ccg

gat

cct

2030

Leu

Lys

Leu

Asp

Leu

Pro

Lys

Asp

Tyr

Gln

Glu

Pro

Asp

Pro

640

645

650

tat

ctg

gat

gag

acg

gtg

aat

atc

gca

ctc

gat

ctg

gcg

aag

ctt

gaa

2078

Tyr

Leu

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Ala

Leu

Asp

Leu

Ala

Lys

Leu

Glu

655

660

665

670

aaa

gcc

aga

ccc

gcg

gaa

caa

ccc

gct

ccc

gtc

aag

taa

tatcaatcag

2127

Lys

Ala

Arg

Pro

Ala

Glu

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Lys

675

680

gcacaagaaa ttgtgcctga ttttttaaca gcgacaagat gccgtaaatc agatgctaca

2187 aaatgtaaa

2196

<210> <211> <212> <213>	26 682 БЕЛОК Escherichia coli
<400>	26

Met 1

Asn

Met

Phe

Phe 5

Arg

Leu

Thr Ala

Leu Ala Gly Leu 10

Leu

Ala 15

Ile

Ala

Gly

Gln

Thr

Phe

Ala

Val

Glu

Asp

Ile

Thr

Arg

Ala

Asp

Gln

Ile

20

25

30

Pro

Val

Leu

Lys

Glu

Thr

Gln

His

Ala

Thr

Val

Ser

Glu

Arg

Val

35

40

45

Thr

Ser

Arg

Phe

Thr

Arg

Ser

His

Tyr

Arg

Gln

Phe

Asp

Leu

Asp

Gln

55 60

- 53 031449

Ala 65

Phe

Ser

Ala

Lys

Ile 70

Phe

Asp Arg

Tyr

Leu Asn 75

Leu

Asp

Tyr 80

Ser

His

Asn

Val

Leu

Ala

Ser

Asp

Val

Glu

Gln

Phe

Ala

Lys

85

90

95

Lys

Thr

Glu

Leu

Gly

Asp

Glu

Leu

Arg

Ser

Gly

Lys

Leu

Asp

Val

Phe

100

105

110

Tyr

Asp

Leu

Tyr

Asn

Leu

Ala

Gln

Lys

Arg

Phe

Glu

Arg

Tyr

Gln

115

120

125

Tyr

Ala

Leu

Ser

Val

Leu

Glu

Lys

Pro

Met

Asp

Phe

Thr

Gly

Asn

Asp

130

135

140

Thr

Tyr

Asn

Leu

Asp

Arg

Ser

Lys

Ala

Pro

Trp

Pro

Lys

Asn

Glu

Ala

145

150

155

160

Glu

Leu

Asn

Ala

Leu

Trp

Asp

Ser

Lys

Val

Lys

Phe

Asp

Glu

Leu

Ser

165

170

175

Leu

Lys

Leu

Thr

Gly

Lys

Thr

Asp

Lys

Glu

Ile

Arg

Glu

Thr

Leu

Thr

180

185

190

Arg

Tyr

Lys

Phe

Ala

Ile

Arg

Leu

Ala

Gln

Thr

Asn

Ser

Glu

195

200

205

Asp

Val

Phe

Ser

Leu

Ala

Met

Thr

Ala

Phe

Ala

Arg

Glu

Ile

Asp

Pro

210

215

220

His

Thr

Asn

Tyr

Leu

Ser

Pro

Arg

Asn

Thr

Glu

Gln

Phe

Asn

Thr

Glu

225

230

235

240

Met

Ser

Leu

Ser

Leu

Glu

Gly

Ile

Gly

Ala

Val

Leu

Gln

Met

Asp

245

250

255

Asp

Tyr

Thr

Val

Ile

Asn

Ser

Met

Val

Ala

Gly

Pro

Ala

Lys

260

265

270

Ser

Lys

Ala

Ile

Ser

Val

Gly

Asp

Lys

Ile

Val

Gly

Val

Gly

Gln

Thr

275

280

285

Gly

Lys

Pro

Met

Val

Asp

Val

Ile

Gly

Trp

Arg

Leu

Asp

Val

290

295

300

Ala

Leu

Ile

Lys

Gly

Pro

Lys

Gly

Ser

Lys

Val

Arg

Leu

Glu

Ile

Leu

- 54 031449

305

310

315

320

Pro Ala

Gly

Lys

Gly Thr 325

Lys

Thr Arg Thr Val 330

Thr

Leu

Thr

Arg 335

Glu

Arg

Ile

Arg

Leu

Glu

Asp

Arg

Ala

Val

Lys

Met

Ser

Val

Lys

Thr

Val

340

345

350

Gly

Lys

Glu

Lys

Val

Gly

Val

Leu

Asp

Ile

Pro

Gly

Phe

Tyr

Val

Gly

355

360

365

Leu

Thr

Asp

Val

Lys

Val

Gln

Leu

Gln

Lys

Leu

Glu

Lys

Gln

Asn

370

375

380

Val

Ser

Val

Ile

Asp

Leu

Arg

Ser

Asn

Gly

Ala

Leu

385

390

395

400

Thr

Glu

Ala

Val

Ser

Leu

Ser

Gly

Leu

Phe

Ile

Pro

Ala

Gly

Pro

Ile

405

410

415

Val

Gln

Val

Arg

Asp

Asn

Gly

Lys

Val

Arg

Glu

Asp

Ser

Asp

Thr

420

425

430

Asp

Gly

Gln

Val

Phe

Tyr

Lys

Gly

Pro

Leu

Val

Leu

Val

Asp

Arg

435

440

445

Phe

Ser

Ala

Ser

Ala

Ser

Glu

Ile

Phe

Ala

Met

Gln

Asp

Tyr

450

455

460

Gly

Arg

Ala

Leu

Val

Gly

Glu

Pro

Thr

Phe

Gly

Lys

Gly

Thr

Val

465

470

475

480

Gln

Tyr

Arg

Ser

Leu

Asn

Arg

Ile

Tyr

Asp

Gln

Met

Leu

Arg

Pro

485

490

495

Glu

Trp

Pro

Ala

Leu

Gly

Ser

Val

Gln

Tyr

Thr

Ile

Gln

Lys

Phe

Tyr

500

505

510

Arg

Val

Asn

Gly

Ser

Thr

Gln

Arg

Lys

Gly

Val

Thr

Pro

Asp

Ile

515

520

525

Ile

Met

Pro

Thr

Gly

Asn

Glu

Thr

Glu

Thr

Gly

Glu

Lys

Phe

Glu

530

535

540

Asp

Asn

Ala

Leu

Pro

Trp

Asp

Ser

Ile

Asp

Ala

Thr

Tyr

Val

Lys

545 550 555 560

- 55 031449

Ser

Gly

Asp

Leu

Thr 565

Ala

Phe

Glu

Pro

Glu 570

Leu

Lys

Glu

His 575

Asn

Ala

Arg

Ile

Ala

Lys

Asp

Pro

Glu

Phe

Gln

Asn

Ile

Met

Lys

Asp

Ile

580

585

590

Ala

Arg

Phe

Asn

Ala

Met

Lys

Asp

Lys

Arg

Asn

Ile

Val

Ser

Leu

Asn

595

600

605

Tyr

Ala

Val

Arg

Glu

Lys

Glu

Asn

Glu

Asp

Ala

Thr

Arg

Leu

610

615

620

Ala

Arg

Leu

Asn

Glu

Arg

Phe

Lys

Arg

Glu

Gly

Lys

Pro

Glu

Leu

Lys

625

630

635

640

Lys

Leu

Asp

Leu

Pro

Lys

Asp

Tyr

Gln

Glu

Pro

Asp

Pro

Tyr

Leu

645

650

655

Asp

Glu

Thr

Val

Asn

Ile

Ala

Leu

Asp

Leu

Ala

Lys

Leu

Glu

Lys

Ala

660

665

670

Arg Pro Ala Glu Gln Pro Ala Pro Val Lys

675 680

<210>	27
<211>	236
<212>	БЕЛОК
<213>	Escherichia	coli
<300>
<308>	Референсная	последовательность NCBI/AP_003452
<309>	2011-06-21
<313>	(1)..(236)
<400>	27

Met 1

Lys

Gly Phe Met 5

Leu

Phe

Thr

Leu 10

Leu Ala

Ala

Phe

Ser Gly 15

Phe

Ala

Gln

Ala

Asp

Ala

Ile

Gln

Thr

Leu

Ala

Lys

Met

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

35

40

45

Thr

Val

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Tyr

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

50

55

60

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

70 75 80

- 56 031449

Asn

Val

Thr

Asn

Lys 85

Met

Leu

Lys

Gln 90

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu 95

Lys

Glu

Met

Ile

Val

Tyr

Lys

Ala

Pro

Gln

Glu

Lys

His

Val

Ile

Thr

Val

100

105

110

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

Arg

Gln

Gly

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Lys

Glu

Met

Lys

Ala

Ile

Trp

145

150

155

160

Cys

Ala

Lys

Asp

Lys

Asn

Lys

Ala

Phe

Asp

Val

Met

Ala

Gly

Lys

165

170

175

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210

215

220

Phe

Leu

Asp

Glu

His

Gln

Lys

Met

Thr

Ser

Gly

Lys

225

230

235

<210> 28 <211> 2048 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> подвергнутый нокауту мутантный ген Tsp <400> 28

atgaattcgt	ttttaggctt	accgcgttag	ctggcctgct	tgcaatagca	ggccagacat	60
taattgtaga	agatatcacg	cgtgctgatc	aaattccggt	attaaaggaa	gagacgcagc	120
atgcgacggt	aagtgagcgc	gtaacgtcgc	gcttcacccg	ttctcattat	cgccagttcg	180
acctcgatca	ggcattttcg	gccaaaatct	ttgaccgcta	cctgaatctg	ctcgattaca	240
gccacaacgt	gctgctggca	agcgatgttg	aacagttcgc	gaaaaagaaa	accgagttag	300
gcgatgaact	gcgttcaggc	aaactcgacg	ttttctacga	tctctacaat	ctggcgcaaa	360

- 57 031449

agcgccgttt	tgagcgttac	cagtacgctt	tgtcggtact	ggaaaagccg	atggatttca	420
ccggcaacga	cacttataac	cttgaccgca	gcaaagcgcc	ctggccgaaa	aacgaggctg	480
agttgaacgc	gctgtgggac	agtaaagtca	aattcgacga	gttaagcctg	aagctgacag	540
gaaaaacgga	taaagaaatt	cgtgaaaccc	tgactcgccg	ctacaaattt	gccattcgtc	600
gtctggcgca	aaccaacagc	gaagatgttt	tctcgctggc	aatgacggcg	tttgcgcgtg	660
aaatcgaccc	gcataccaac	tatctttccc	cgcgtaatac	cgaacagttc	aacactgaaa	720
tgagtttgtc	gctggaaggt	attggcgcag	tgctgcaaat	ggatgatgac	tacaccgtta	780
tcaattcgat	ggtggcaggt	ggtccggcag	cgaagagtaa	agctatcagc	gttggtgaca	840
aaattgtcgg	tgttggtcaa	acaggcaagc	cgatggttga	cgtgattggc	tggcgtcttg	900
atgatgtggt	tgccttaatt	aaagggccga	agggcagtaa	agttcgtctg	gaaattttac	960
ctgctggtaa	agggaccaag	acccgtactg	taacgttgac	ccgtgaacgt	attcgtctcg	1020
aagaccgcgc	ggttaaaatg	tcggtgaaga	ccgtcggtaa	agagaaagtc	ggcgtgctgg	1080
atattccggg	cttctatgtg	ggtttgacag	acgatgtcaa	agtgcaactg	cagaaactgg	1140
aaaaacagaa	tgtcagcagc	gtcatcatcg	acctgcgtag	caatggcggt	ggggcgttaa	1200
ctgaagccgt	atcgctctcc	ggtctgttta	ttcctgcggg	tcccattgtt	caggtccgcg	1260
ataacaacgg	caaggttcgt	gaagatagcg	ataccgacgg	acaggttttc	tataaaggcc	1320
cgctggtggt	gctggttgac	cgcttcagtg	cttcggcttc	agaaatcttt	gccgcggcaa	1380
tgcaggatta	cggtcgtgcg	ctggttgtgg	gtgaaccgac	gtttggtaaa	ggcaccgttc	1440
agcaataccg	ttcattgaac	cgtatttacg	atcagatgtt	acgtcctgaa	tggccagcgc	1500
tgggttctgt	gcagtacacg	atccagaaat	tctatcgcgt	taacggcggc	agtacgcaac	1560
gtaaaggcgt	aacgccagac	atcatcatgc	cgacgggtaa	tgaagaaacg	gaaacgggtg	1620
agaaattcga	agataacgcg	ctgccgtggg	atagcattga	tgccgcgact	tatgtgaaat	1680
caggagattt	aacggccttt	gaaccggagc	tgctgaagga	acataatgcg	cgtatcgcga	1740
aagatcctga	gttccagaac	atcatgaagg	atatcgcgcg	cttcaacgct	atgaaggaca	1800
agcgcaatat	cgtttctctg	aattacgctg	tgcgtgagaa	agagaataat	gaagatgatg	1860
cgacgcgtct	ggcgcgtttg	aacgaacgct	ttaaacgcga	aggtaaaccg	gagttgaaga	1920
aactggatga	tctaccgaaa	gattaccagg	agccggatcc	ttatctggat	gagacggtga	1980
atatcgcact	cgatctggcg	aagcttgaaa	aagccagacc	cgcggaacaa	cccgctcccg	2040

tcaagtaa

2048 <210> 29 <211> 1425

- 58 031449 <212> ДНК <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (1)..(1425)

<400> 29

atg Met 1

aaa Lys

acc Thr

aca Thr 5

tta Leu

gca Ala

ctg Leu

agt Ser

gca Ala 10

ctg Leu

gct Ala

ctg Leu

agt Ser

tta Leu 15

ggt Gly

48

ttg

gcg

tta

tct

ccg

ctc

tct

gca

acg

gcg

gct

gag

act

tct

tca

gca

96

Leu

Ala

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Glu

Thr

Ser

Ala

20

25

30

acg

aca

gcc

cag

atg

cca

agc

ctt

gca

ccg

atg

ctc

gaa

aag

gtg

144

Thr

Ala

Gln

Met

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Met

Leu

Glu

Lys

Val

35

40

45

atg

cct

tca

gtg

gtc

agc

att

aac

gta

gaa

ggt

agc

aca

acc

gtt

aat

192

Met

Pro

Ser

Val

Ser

Ile

Asn

Val

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

50

55

60

acg

ccg

cgt

atg

ccg

cgt

aat

ttc

cag

ttc

ggt

gat

tct

240

Thr

Pro

Arg

Met

Pro

Arg

Asn

Phe

Gln

Phe

Gly

Asp

Ser

65

70

75

80

ccg

ttc

tgc

cag

gaa

ggt

tct

ccg

ttc

cag

agc

tct

ccg

ttc

tgc

cag

288

Pro

Phe

Cys

Gln

Glu

Gly

Ser

Pro

Phe

Gln

Ser

Pro

Phe

Cys

Gln

85

90

95

ggt

ggc

cag

ggc

ggt

aat

ggt

ggc

cag

caa

cag

aaa

ttc

atg

gcg

336

Gly

Gln

Gly

Asn

Gly

Gln

Lys

Phe

Met

Ala

100

105

110

ctg

ggt

tcc

ggc

gtc

atc

att

gat

gcc

gat

aaa

ggc

tat

gtc

acc

384

Leu

Gly

Ser

Gly

Val

Ile

Asp

Ala

Asp

Lys

Gly

Tyr

Val

Thr

115

120

125

aac

cac

gtt

gat

aac

gcg

acg

gtc

att

aaa

gtt

caa

ctg

agc

432

Asn

His

Val

Asp

Asn

Ala

Thr

Val

Ile

Lys

Val

Gln

Leu

Ser

130

135

140

gat

ggc

cgt

aag

ttc

gac

gcg

aag

atg

gtt

ggc

aaa

gat

ccg

cgc

tct

480

Asp

Gly

Arg

Lys

Phe

Asp

Ala

Lys

Met

Val

Gly

Lys

Asp

Pro

Arg

Ser

145

150

155

160

gat

atc

gcg

ctg

atc

caa

atc

cag

aac

ccg

aaa

aac

ctg

acc

gca

att

528

Asp

Ile

Ala

Leu

Ile

Gln

Ile

Gln

Asn

Pro

Lys

Asn

Leu

Thr

Ala

Ile

165

170

175

aag

atg

gcg

gat

tct

gat

gca

ctg

cgc

gtg

ggt

gat

tac

acc

gta

gcg

576

Lys

Met

Ala

Asp

Ser

Asp

Ala

Leu

Arg

Val

Gly

Asp

Tyr

Thr

Val

Ala

180

185

190

att

ggt

aac

ccg

ttt

ggt

ctg

ggc

gag

acg

gta

act

tcc

ggg

att

gtc

624

Ile

Gly

Asn

Pro

Phe

Gly

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Ile

Val

195

200

205

tct

gcg

ctg

ggg

cgt

agc

ggc

ctg

aat

gcc

gaa

aac

tac

gaa

aac

ttc

672

- 59 031449

Ser Ala

Leu Gly Arg

Ser

Gly 215

Leu Asn Ala

Glu Asn Tyr 220

Glu

Asn

Phe

210

atc

cag

acc

gat

gca

gcg

atc

aac

cgt

ggt

aac

tcc

ggt

gcg

ctg

720

Ile

Gln

Thr

Asp

Ala

Ile

Asn

Arg

Gly

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

225

230

235

240

gtt

aac

ctg

aac

ggc

gaa

ctg

atc

ggt

atc

aac

acc

gcg

atc

ctc

gca

768

Val

Asn

Leu

Asn

Gly

Glu

Leu

Ile

Gly

Ile

Asn

Thr

Ala

Ile

Leu

Ala

245

250

255

ccg

gac

ggc

aac

atc

ggt

atc

ggt

ttt

gct

atc

ccg

agt

aac

atg

816

Pro

Asp

Gly

Asn

Ile

Gly

Ile

Gly

Phe

Ala

Ile

Pro

Ser

Asn

Met

260

265

270

gtg

aaa

aac

ctg

acc

tcg

cag

atg

gtg

gaa

tac

ggc

cag

gtg

aaa

cgc

864

Val

Lys

Asn

Leu

Thr

Ser

Gln

Met

Val

Glu

Tyr

Gly

Gln

Val

Lys

Arg

275

280

285

ggt

gag

ctg

ggt

att

atg

ggg

act

gag

ctg

aac

tcc

gaa

ctg

gcg

aaa

912

Gly

Glu

Leu

Gly

Ile

Met

Gly

Thr

Glu

Leu

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Lys

290

295

300

gcg

atg

aaa

gtt

gac

gcc

cag

cgc

ggt

gct

ttc

gta

agc

cag

gtt

ctg

960

Ala

Met

Lys

Val

Asp

Ala

Gln

Arg

Gly

Ala

Phe

Val

Ser

Gln

Val

Leu

305

310

315

320

cct

aat

tcc

gct

gca

aaa

gcg

ggc

att

aaa

gcg

ggt

gat

gtg

atc

1008

Pro

Asn

Ser

Ala

Lys

Ala

Gly

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Val

Ile

325

330

335

acc

tca

ctg

aac

ggt

aag

ccg

atc

agc

ttt

gcc

gca

ctg

cgt

gct

1056

Thr

Ser

Leu

Asn

Gly

Lys

Pro

Ile

Ser

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

340

345

350

cag

gtg

ggt

act

atg

ccg

gta

ggc

agc

aaa

ctg

acc

ctg

ggc

tta

ctg

1104

Gln

Val

Gly

Thr

Met

Pro

Val

Gly

Ser

Lys

Leu

Thr

Leu

Gly

Leu

355

360

365

cgc

gac

ggt

aag

cag

gtt

aac

gtg

aac

ctg

gaa

ctg

cag

agc

1152

Arg

Asp

Gly

Lys

Gln

Val

Asn

Val

Asn

Leu

Glu

Leu

Gln

Ser

370

375

380

cag

aat

cag

gtt

gat

tcc

agc

tcc

atc

ttc

aac

ggc

att

gaa

ggc

gct

1200

Gln

Asn

Gln

Val

Asp

Ser

Ile

Phe

Asn

Gly

Ile

Glu

Gly

Ala

385

390

395

400

gag

atg

agc

aac

aaa

ggc

aaa

gat

cag

ggc

gtg

gta

gtg

aac

gtg

1248

Glu

Met

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Asp

Gln

Gly

Val

Asn

Val

405

410

415

aaa

acg

ggc

act

ccg

gct

gcg

cag

atc

ggc

ctg

aag

aaa

ggt

gat

gtg

1296

Lys

Thr

Gly

Thr

Pro

Ala

Gln

Ile

Gly

Leu

Lys

Gly

Asp

Val

420

425

430

att

ggc

gcg

aac

cag

gca

gtg

aaa

aac

atc

gct

gaa

ctg

cgt

1344

Ile

Gly

Ala

Asn

Gln

Ala

Val

Lys

Asn

Ile

Ala

Glu

Leu

Arg

435

440

445

aaa

gtt

ctc

gac

agc

aaa

ccg

tct

gtg

ctg

gca

ctc

aac

att

cag

cgc

1392

Lys

Val

Leu

Asp

Ser

Lys

Pro

Ser

Val

Leu

Ala

Leu

Asn

Ile

Gln

Arg

450

455

460

- 60 031449 ggc gac agc acc atc tac ctg tta atg cag taa Gly Asp Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Met Gln

465470

1425 <210>30 <211>474 <212> БЕЛОК <213> Escherichia coli <400> 30

Met 1

Lys

Thr

Thr 5

Leu

Ala

Leu

Ser

Ala 10

Leu

Ala

Leu

Ser

Leu 15

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Glu

Thr

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Ala

Gln

Met

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Met

Leu

Glu

Lys

Val

35

40

45

Met

Pro

Ser

Val

Ser

Ile

Asn

Val

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

50

55

60

Thr

Pro

Arg

Met

Pro

Arg

Asn

Phe

Gln

Phe

Gly

Asp

Ser

65

70

75

80

Pro

Phe

Cys

Gln

Glu

Gly

Ser

Pro

Phe

Gln

Ser

Pro

Phe

Cys

Gln

85

90

95

Gly

Gln

Gly

Asn

Gly

Gln

Lys

Phe

Met

Ala

100

105

110

Leu

Gly

Ser

Gly

Val

Ile

Asp

Ala

Asp

Lys

Gly

Tyr

Val

Thr

115

120

125

Asn

His

Val

Asp

Asn

Ala

Thr

Val

Ile

Lys

Val

Gln

Leu

Ser

130

135

140

Asp

Gly

Arg

Lys

Phe

Asp

Ala

Lys

Met

Val

Gly

Lys

Asp

Pro

Arg

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Leu

Ile

Gln

Ile

Gln

Asn

Pro

Lys

Asn

Leu

Thr

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Met

Ala

Asp

Ser

Asp

Ala

Leu

Arg

Val

Gly

Asp

Tyr

Thr

Val

Ala

180

185

190

Ile

Gly

Asn

Pro

Phe

Gly

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Ile

Val

- 61 031449

195

200

205

Ser Ala 210

Leu Gly

Arg

Ser Gly 215

Leu Asn Ala Glu

Asn 220

Tyr

Glu

Asn

Phe

Ile

Gln

Thr

Asp

Ala

Ile

Asn

Arg

Gly

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

225

230

235

240

Val

Asn

Leu

Asn

Gly

Glu

Leu

Ile

Gly

Ile

Asn

Thr

Ala

Ile

Leu

Ala

245

250

255

Pro

Asp

Gly

Asn

Ile

Gly

Ile

Gly

Phe

Ala

Ile

Pro

Ser

Asn

Met

260

265

270

Val

Lys

Asn

Leu

Thr

Ser

Gln

Met

Val

Glu

Tyr

Gly

Gln

Val

Lys

Arg

275

280

285

Gly

Glu

Leu

Gly

Ile

Met

Gly

Thr

Glu

Leu

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Lys

290

295

300

Ala

Met

Lys

Val

Asp

Ala

Gln

Arg

Gly

Ala

Phe

Val

Ser

Gln

Val

Leu

305

310

315

320

Pro

Asn

Ser

Ala

Lys

Ala

Gly

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Val

Ile

325

330

335

Thr

Ser

Leu

Asn

Gly

Lys

Pro

Ile

Ser

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

340

345

350

Gln

Val

Gly

Thr

Met

Pro

Val

Gly

Ser

Lys

Leu

Thr

Leu

Gly

Leu

355

360

365

Arg

Asp

Gly

Lys

Gln

Val

Asn

Val

Asn

Leu

Glu

Leu

Gln

Ser

370

375

380

Gln

Asn

Gln

Val

Asp

Ser

Ile

Phe

Asn

Gly

Ile

Glu

Gly

Ala

385

390

395

400

Glu

Met

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Asp

Gln

Gly

Val

Asn

Val

405

410

415

Lys

Thr

Gly

Thr

Pro

Ala

Gln

Ile

Gly

Leu

Lys

Gly

Asp

Val

420

425

430

Ile

Gly

Ala

Asn

Gln

Ala

Val

Lys

Asn

Ile

Ala

Glu

Leu

Arg

435

440

445

- 62 031449

Lys Val

450

Leu Asp Ser Lys Pro Ser Val Leu Ala Leu Asn Ile Gln Arg 455460

Gly Asp Ser Thr Ile Tyr Leu Leu Met Gln

465470 <210>31 <211>1425 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> мутантный ген DegP, содержащий мутацию, приводящую к замене S210A, и рестрикционный маркер AseI <220>

<221> CDS <222> (1)..(1425) <400> 31

atg Met 1

aaa Lys

acc Thr

aca Thr 5

tta Leu

gca Ala

ctg Leu

agt Ser

gca Ala 10

ctg Leu

gct Ala

ctg Leu

agt Ser

tta Leu 15

ggt Gly

48

ttg

gcg

tta

tct

ccg

ctc

tct

gca

acg

gcg

gct

gag

act

tct

tca

gca

96

Leu

Ala

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Glu

Thr

Ser

Ala

20

25

30

acg

aca

gcc

cag

atg

cca

agc

ctt

gca

ccg

atg

ctc

gaa

aag

gtg

144

Thr

Ala

Gln

Met

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Met

Leu

Glu

Lys

Val

35

40

45

atg

cct

tca

gtg

gtc

agc

att

aac

gta

gaa

ggt

agc

aca

acc

gtt

aat

192

Met

Pro

Ser

Val

Ser

Ile

Asn

Val

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

50

55

60

acg

ccg

cgt

atg

ccg

cgt

aat

ttc

cag

ttc

ggt

gat

tct

240

Thr

Pro

Arg

Met

Pro

Arg

Asn

Phe

Gln

Phe

Gly

Asp

Ser

65

70

75

80

ccg

ttc

tgc

cag

gaa

ggt

tct

ccg

ttc

cag

agc

tct

ccg

ttc

tgc

cag

288

Pro

Phe

Cys

Gln

Glu

Gly

Ser

Pro

Phe

Gln

Ser

Pro

Phe

Cys

Gln

85

90

95

ggt

ggc

cag

ggc

ggt

aat

ggt

ggc

cag

caa

cag

aaa

ttc

atg

gcg

336

Gly

Gln

Gly

Asn

Gly

Gln

Lys

Phe

Met

Ala

100

105

110

ctg

ggt

tcc

ggc

gtc

atc

att

gat

gcc

gat

aaa

ggc

tat

gtc

acc

384

Leu

Gly

Ser

Gly

Val

Ile

Asp

Ala

Asp

Lys

Gly

Tyr

Val

Thr

115

120

125

aac

cac

gtt

gat

aac

gcg

acg

gtc

att

aaa

gtt

caa

ctg

agc

432

Asn

His

Val

Asp

Asn

Ala

Thr

Val

Ile

Lys

Val

Gln

Leu

Ser

130

135

140

gat

ggc

cgt

aag

ttc

gac

gcg

aag

atg

gtt

ggc

aaa

gat

ccg

cgc

tct

480

Asp

Gly

Arg

Lys

Phe

Asp

Ala

Lys

Met

Val

Gly

Lys

Asp

Pro

Arg

Ser

145 150 155 160

- 63 031449

gat Asp

atc Ile

gcg Ala

ctg Leu

atc Ile 165

caa Gln

atc Ile

cag Gln

aac Asn

ccg Pro 170

aaa Lys

aac Asn

ctg Leu

acc Thr

gca Ala 175

att Ile

528

aag

atg

gcg

gat

tct

gat

gca

ctg

cgc

gtg

ggt

gat

tac

acc

gta

gcg

576

Lys

Met

Ala

Asp

Ser

Asp

Ala

Leu

Arg

Val

Gly

Asp

Tyr

Thr

Val

Ala

180

185

190

att

ggt

aac

ccg

ttt

ggt

ctg

ggc

gag

acg

gta

act

tcc

ggg

att

gtc

624

Ile

Gly

Asn

Pro

Phe

Gly

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Ile

Val

195

200

205

tct

gcg

ctg

ggg

cgt

agc

ggc

ctg

aat

gcc

gaa

aac

tac

gaa

aac

ttc

672

Ser

Ala

Leu

Gly

Arg

Ser

Gly

Leu

Asn

Ala

Glu

Asn

Tyr

Glu

Asn

Phe

210

215

220

atc

cag

acc

gat

gca

gcg

att

aat

cgt

ggt

aac

gcc

ggt

gcg

ctg

720

Ile

Gln

Thr

Asp

Ala

Ile

Asn

Arg

Gly

Asn

Ala

Gly

Ala

Leu

225

230

235

240

gtt

aac

ctg

aac

ggc

gaa

ctg

atc

ggt

atc

aac

acc

gcg

atc

ctc

gca

768

Val

Asn

Leu

Asn

Gly

Glu

Leu

Ile

Gly

Ile

Asn

Thr

Ala

Ile

Leu

Ala

245

250

255

ccg

gac

ggc

aac

atc

ggt

atc

ggt

ttt

gct

atc

ccg

agt

aac

atg

816

Pro

Asp

Gly

Asn

Ile

Gly

Ile

Gly

Phe

Ala

Ile

Pro

Ser

Asn

Met

260

265

270

gtg

aaa

aac

ctg

acc

tcg

cag

atg

gtg

gaa

tac

ggc

cag

gtg

aaa

cgc

864

Val

Lys

Asn

Leu

Thr

Ser

Gln

Met

Val

Glu

Tyr

Gly

Gln

Val

Lys

Arg

275

280

285

ggt

gag

ctg

ggt

att

atg

ggg

act

gag

ctg

aac

tcc

gaa

ctg

gcg

aaa

912

Gly

Glu

Leu

Gly

Ile

Met

Gly

Thr

Glu

Leu

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Lys

290

295

300

gcg

atg

aaa

gtt

gac

gcc

cag

cgc

ggt

gct

ttc

gta

agc

cag

gtt

ctg

960

Ala

Met

Lys

Val

Asp

Ala

Gln

Arg

Gly

Ala

Phe

Val

Ser

Gln

Val

Leu

305

310

315

320

cct

aat

tcc

gct

gca

aaa

gcg

ggc

att

aaa

gcg

ggt

gat

gtg

atc

1008

Pro

Asn

Ser

Ala

Lys

Ala

Gly

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Val

Ile

325

330

335

acc

tca

ctg

aac

ggt

aag

ccg

atc

agc

ttt

gcc

gca

ctg

cgt

gct

1056

Thr

Ser

Leu

Asn

Gly

Lys

Pro

Ile

Ser

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

340

345

350

cag

gtg

ggt

act

atg

ccg

gta

ggc

agc

aaa

ctg

acc

ctg

ggc

tta

ctg

1104

Gln

Val

Gly

Thr

Met

Pro

Val

Gly

Ser

Lys

Leu

Thr

Leu

Gly

Leu

355

360

365

cgc

gac

ggt

aag

cag

gtt

aac

gtg

aac

ctg

gaa

ctg

cag

agc

1152

Arg

Asp

Gly

Lys

Gln

Val

Asn

Val

Asn

Leu

Glu

Leu

Gln

Ser

370

375

380

cag

aat

cag

gtt

gat

tcc

agc

tcc

atc

ttc

aac

ggc

att

gaa

ggc

gct

1200

Gln

Asn

Gln

Val

Asp

Ser

Ile

Phe

Asn

Gly

Ile

Glu

Gly

Ala

385

390

395

400

gag

atg

agc

aac

aaa

ggc

aaa

gat

cag

ggc

gtg

gta

gtg

aac

gtg

1248

Glu

Met

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Asp

Gln

Gly

Val

Asn

Val

- 64 031449

405 410 415

aaa Lys

acg Thr

ggc Gly

act Thr 420

ccg Pro

gct Ala

gcg Ala

cag Gln

atc Ile 425

ggc Gly

ctg Leu

aag Lys

aaa Lys

ggt Gly 430

gat Asp

gtg Val

1296

att

ggc

gcg

aac

cag

gca

gtg

aaa

aac

atc

gct

gaa

ctg

cgt

1344

Ile

Gly

Ala

Asn

Gln

Ala

Val

Lys

Asn

Ile

Ala

Glu

Leu

Arg

435

440

445

aaa

gtt

ctc

gac

agc

aaa

ccg

tct

gtg

ctg

gca

ctc

aac

att

cag

cgc

1392

Lys

Val

Leu

Asp

Ser

Lys

Pro

Ser

Val

Leu

Ala

Leu

Asn

Ile

Gln

Arg

450

455

460

ggc

gac

agc

acc

atc

tac

ctg

tta

atg

cag

taa

1425

Gly

Asp

Ser

Thr

Ile

Tyr

Leu

Met

Gln

465

470

<210> 32 <211> 474 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 32

Met 1

Lys

Thr

Thr 5

Leu

Ala

Leu

Ser

Ala 10

Leu

Ala

Leu

Ser

Leu 15

Gly

Leu

Ala

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Ala

Thr

Ala

Glu

Thr

Ser

Ala

20

25

30

Thr

Ala

Gln

Met

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Met

Leu

Glu

Lys

Val

35

40

45

Met

Pro

Ser

Val

Ser

Ile

Asn

Val

Glu

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

50

55

60

Thr

Pro

Arg

Met

Pro

Arg

Asn

Phe

Gln

Phe

Gly

Asp

Ser

65

70

75

80

Pro

Phe

Cys

Gln

Glu

Gly

Ser

Pro

Phe

Gln

Ser

Pro

Phe

Cys

Gln

85

90

95

Gly

Gln

Gly

Asn

Gly

Gln

Lys

Phe

Met

Ala

100

105

110

Leu

Gly

Ser

Gly

Val

Ile

Asp

Ala

Asp

Lys

Gly

Tyr

Val

Thr

115

120

125

Asn

His

Val

Asp

Asn

Ala

Thr

Val

Ile

Lys

Val

Gln

Leu

Ser

- 65 031449

130

135

140

Asp 145

Gly Arg

Lys

Phe

Asp 150

Ala

Lys

Met

Val

Gly 155

Lys

Asp

Pro

Arg

Ser 160

Asp

Ile

Ala

Leu

Ile

Gln

Ile

Gln

Asn

Pro

Lys

Asn

Leu

Thr

Ala

Ile

165

170

175

Lys

Met

Ala

Asp

Ser

Asp

Ala

Leu

Arg

Val

Gly

Asp

Tyr

Thr

Val

Ala

180

185

190

Ile

Gly

Asn

Pro

Phe

Gly

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ser

Gly

Ile

Val

195

200

205

Ser

Ala

Leu

Gly

Arg

Ser

Gly

Leu

Asn

Ala

Glu

Asn

Tyr

Glu

Asn

Phe

210

215

220

Ile

Gln

Thr

Asp

Ala

Ile

Asn

Arg

Gly

Asn

Ala

Gly

Ala

Leu

225

230

235

240

Val

Asn

Leu

Asn

Gly

Glu

Leu

Ile

Gly

Ile

Asn

Thr

Ala

Ile

Leu

Ala

245

250

255

Pro

Asp

Gly

Asn

Ile

Gly

Ile

Gly

Phe

Ala

Ile

Pro

Ser

Asn

Met

260

265

270

Val

Lys

Asn

Leu

Thr

Ser

Gln

Met

Val

Glu

Tyr

Gly

Gln

Val

Lys

Arg

275

280

285

Gly

Glu

Leu

Gly

Ile

Met

Gly

Thr

Glu

Leu

Asn

Ser

Glu

Leu

Ala

Lys

290

295

300

Ala

Met

Lys

Val

Asp

Ala

Gln

Arg

Gly

Ala

Phe

Val

Ser

Gln

Val

Leu

305

310

315

320

Pro

Asn

Ser

Ala

Lys

Ala

Gly

Ile

Lys

Ala

Gly

Asp

Val

Ile

325

330

335

Thr

Ser

Leu

Asn

Gly

Lys

Pro

Ile

Ser

Phe

Ala

Leu

Arg

Ala

340

345

350

Gln

Val

Gly

Thr

Met

Pro

Val

Gly

Ser

Lys

Leu

Thr

Leu

Gly

Leu

355

360

365

Arg

Asp

Gly

Lys

Gln

Val

Asn

Val

Asn

Leu

Glu

Leu

Gln

Ser

370

375

380

- 66 031449

Gln Asn 385

Gln

Val

Asp

Ser 390

Ser

Ile

Phe

Asn Gly 395

Ile

Glu

Gly

Ala 400

Glu

Met

Ser

Asn

Lys

Gly

Lys

Asp

Gln

Gly

Val

Asn

Val

405

410

415

Lys

Thr

Gly

Thr

Pro

Ala

Gln

Ile

Gly

Leu

Lys

Gly

Asp

Val

420

425

430

Ile

Gly

Ala

Asn

Gln

Ala

Val

Lys

Asn

Ile

Ala

Glu

Leu

Arg

435

440

445

Lys

Val

Leu

Asp

Ser

Lys

Pro

Ser

Val

Leu

Ala

Leu

Asn

Ile

Gln

Arg

450

455

460

Gly

Asp

Ser

Thr

Ile

Tyr

Leu

Met

Gln

465

470

<210>	33
<211>	67
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	IGS-кассета-1

<400> 33 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggagagtgt taatgaagaa gactgctata gcaattg

<210>	34
<211>	69
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	IGS-кассета-2
<400>	34
gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggggagtgt taaaatgaag aagactgcta	60
tagcaattg	69

<210>	35
<211>	81
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	IGS-кассета-3
<400>	35
gagctcacca gtaacaaaaa gctttaatag aggagagtgt tgaggaggaa aaaaaaatga	60

- 67 031449 agaaaactgc tatagcaatt g

<210>	36
<211>	81
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	IGS-кассета-4
<400>	36
gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggagagtgt tgacgaggat tatataatga	60

agaaaactgc tatagcaatt g <210> 37 <211> 954 <212> ДНК <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (1)..(954) <400> 37

atg Met 1

cgg Arg

gcg Ala

aaa Lys

ctt Leu 5

ctg Leu

gga Gly

ata Ile

gtc Val

ctg Leu 10

aca Thr

acc Thr

cct Pro

att Ile

gcg Ala 15

atc Ile

48

agc

tct

ttt

gct

tct

acc

gag

act

tta

tcg

ttt

act

cct

gac

aac

ata

96

Ser

Phe

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Asp

Asn

Ile

20

25

30

aat

gcg

gac

att

agt

ctt

gga

act

ctg

agc

gga

aaa

aca

aaa

gag

cgt

144

Asn

Ala

Asp

Ile

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Arg

35

40

45

gtt

tat

cta

gcc

gaa

gga

ggc

cga

aaa

gtc

agt

caa

ctc

gac

tgg

192

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gly

Arg

Lys

Val

Ser

Gln

Leu

Asp

Trp

50

55

60

aaa

ttc

aat

aac

gct

gca

att

aaa

ggt

gca

att

aat

tgg

gat

ttg

240

Lys

Phe

Asn

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Ile

Asn

Trp

Asp

Leu

65

70

75

80

atg

ccc

cag

ata

tct

atc

ggg

gct

ggc

tgg

aca

act

ctc

ggc

agc

288

Met

Pro

Gln

Ile

Ser

Ile

Gly

Ala

Gly

Trp

Thr

Leu

Gly

Ser

85

90

95

cga

ggt

ggc

aat

atg

gtc

gat

cag

gac

tgg

atg

gat

tcc

agt

aac

ccc

336

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Asp

Gln

Asp

Trp

Met

Asp

Ser

Asn

Pro

100

105

110

gga

acc

tgg

acg

gat

gaa

agt

aga

cac

cct

gat

aca

caa

ctc

aat

tat

384

Gly

Thr

Trp

Thr

Asp

Glu

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Thr

Gln

Leu

Asn

Tyr

115

120

125

gcc

aac

gaa

ttt

gat

ctg

aat

atc

aaa

ggc

tgg

ctc

aac

gaa

ccc

432

Ala

Asn

Glu

Phe

Asp

Leu

Asn

Ile

Lys

Gly

Trp

Leu

Asn

Glu

Pro

- 68 031449

130

135

140

aat Asn 145

tac Tyr

cgc Arg

ctg Leu

gga Gly

ctc Leu 150

atg Met

gcc Ala

gga Gly

tat Tyr

cag Gln 155

gaa Glu

agc Ser

cgt Arg

tat Tyr

agc Ser 160

480

ttt

aca

gcc

aga

ggt

tcc

tat

atc

tac

agt

tct

gag

gga

ttc

528

Phe

Thr

Ala

Arg

Gly

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Glu

Gly

Phe

165

170

175

aga

gat

atc

ggc

tcc

ttc

ccg

aat

gga

gaa

aga

gca

atc

ggc

tac

576

Arg

Asp

Ile

Gly

Ser

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Arg

Ala

Ile

Gly

Tyr

180

185

190

aaa

caa

cgt

ttt

aaa

atg

ccc

tac

att

ggc

ttg

act

gga

agt

tat

cgt

624

Lys

Gln

Arg

Phe

Lys

Met

Pro

Tyr

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Tyr

Arg

195

200

205

tat

gaa

gat

ttt

gaa

ctc

ggt

ggc

aca

ttt

aaa

tac

agc

ggc

tgg

gtg

672

Tyr

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Gly

Thr

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Val

210

215

220

gaa

tca

tct

gat

aac

gat

gaa

cac

tat

gac

ccg

gga

aaa

aga

atc

act

720

Glu

Ser

Asp

Asn

Asp

Glu

His

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

Arg

Ile

Thr

225

230

235

240

tat

cgc

agt

aag

gtc

aaa

gac

caa

aat

tac

tat

tct

gtt

gca

gtc

aat

768

Tyr

Arg

Ser

Lys

Val

Lys

Asp

Gln

Asn

Tyr

Ser

Val

Ala

Val

Asn

245

250

255

gca

ggt

tat

tac

gtc

aca

cct

aac

gca

aaa

gtt

tat

gtt

gaa

ggc

gca

816

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

Asn

Ala

Lys

Val

Tyr

Val

Glu

Gly

Ala

260

265

270

tgg

aat

cgg

gtt

acg

aat

aaa

ggt

aat

act

tca

ctt

tat

gat

cac

864

Trp

Asn

Arg

Val

Thr

Asn

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

275

280

285

aat

aac

act

tca

gac

tac

agc

aaa

aat

gga

gca

ggt

ata

gaa

aac

912

Asn

Thr

Ser

Asp

Tyr

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Gly

Ile

Glu

Asn

290

295

300

tat

aac

ttc

atc

act

gct

ggt

ctt

aag

tac

aca

ttt

taa

954

Tyr

Asn

Phe

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

305

310

315

<210> <211> <212> <213>	38 317 БЕЛОК Escherichia coli
<400>	38

Met 1

Arg

Ala

Lys

Leu 5

Leu Gly

Ile

Val

Leu 10

Thr

Pro

Ile

Ala 15

Ile

Ser

Phe

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Asp

Asn

Ile

20

25

30

Asn

Ala

Asp

Ile

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Arg

- 69 031449

Val

Tyr 50

Leu

Ala

Glu

Gly 55

Gly Arg

Lys

Val

Ser 60

Gln Leu Asp

Trp

Lys

Phe

Asn

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Ile

Asn

Trp

Asp

Leu

65

70

75

80

Met

Pro

Gln

Ile

Ser

Ile

Gly

Ala

Gly

Trp

Thr

Leu

Gly

Ser

85

90

95

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Asp

Gln

Asp

Trp

Met

Asp

Ser

Asn

Pro

100

105

110

Gly

Thr

Trp

Thr

Asp

Glu

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Thr

Gln

Leu

Asn

Tyr

115

120

125

Ala

Asn

Glu

Phe

Asp

Leu

Asn

Ile

Lys

Gly

Trp

Leu

Asn

Glu

Pro

130

135

140

Asn

Tyr

Arg

Leu

Gly

Leu

Met

Ala

Gly

Tyr

Gln

Glu

Ser

Arg

Tyr

Ser

145

150

155

160

Phe

Thr

Ala

Arg

Gly

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Glu

Gly

Phe

165

170

175

Arg

Asp

Ile

Gly

Ser

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Arg

Ala

Ile

Gly

Tyr

180

185

190

Lys

Gln

Arg

Phe

Lys

Met

Pro

Tyr

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Tyr

Arg

195

200

205

Tyr

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Gly

Thr

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Val

210

215

220

Glu

Ser

Asp

Asn

Asp

Glu

His

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

Arg

Ile

Thr

225

230

235

240

Tyr

Arg

Ser

Lys

Val

Lys

Asp

Gln

Asn

Tyr

Ser

Val

Ala

Val

Asn

245

250

255

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

Asn

Ala

Lys

Val

Tyr

Val

Glu

Gly

Ala

260

265

270

Trp

Asn

Arg

Val

Thr

Asn

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

275

280

285

- 70 031449

Asn Asn Asn 290

Thr

Ser Asp

Tyr 295

Ser

Lys

Asn Gly Ala 300

Gly Ile Glu Asn

Tyr

Asn

Phe

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

305 310 315 <210> 39 <211> 954 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> подвергнутый нокауту мутантный ген Ompl <220>

<221> CDS <222> (1)..(954) <400> 39

att Ile 1

cgg Arg

gcg Ala

aaa Lys

ctt Leu 5

ctg Leu

gga Gly

ata Ile

gtc Val

ctg Leu 10

aca Thr

acc Thr

cct Pro

att Ile

gcg Ala 15

atc Ile

48

agc

tct

ttt

gct

tct

acc

gag

act

tta

tcg

ttt

act

cct

gac

aac

ata

96

Ser

Phe

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Asp

Asn

Ile

20

25

30

aat

gcg

gac

att

agt

ctt

gga

act

ctg

agc

gga

aaa

aca

aaa

gag

cgt

144

Asn

Ala

Asp

Ile

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Arg

35

40

45

gtt

tat

cta

gcc

gaa

gga

ggc

cga

aaa

gtc

agt

caa

ctc

gac

tgg

192

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gly

Arg

Lys

Val

Ser

Gln

Leu

Asp

Trp

50

55

60

aaa

ttc

aat

aac

gct

gca

att

aaa

ggt

gca

att

aat

tgg

gat

ttg

240

Lys

Phe

Asn

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Ile

Asn

Trp

Asp

Leu

65

70

75

80

atg

ccc

cag

ata

tct

atc

ggg

gct

ggc

tgg

aca

act

ctc

ggc

agc

288

Met

Pro

Gln

Ile

Ser

Ile

Gly

Ala

Gly

Trp

Thr

Leu

Gly

Ser

85

90

95

cga

ggt

ggc

aat

atg

gtc

gat

cag

gac

tgg

atg

gat

tcc

agt

aac

ccc

336

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Asp

Gln

Asp

Trp

Met

Asp

Ser

Asn

Pro

100

105

110

gga

acc

tgg

acg

gat

gaa

agt

aga

cac

cct

gat

aca

caa

ctc

aat

tat

384

Gly

Thr

Trp

Thr

Asp

Glu

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Thr

Gln

Leu

Asn

Tyr

115

120

125

gcc

aac

gaa

ttt

gat

ctg

aat

atc

aaa

ggc

tgg

ctc

aac

gaa

ccc

432

Ala

Asn

Glu

Phe

Asp

Leu

Asn

Ile

Lys

Gly

Trp

Leu

Asn

Glu

Pro

130

135

140

aat

tac

cgc

ctg

gga

ctc

atg

gcc

gga

tat

cag

gaa

agc

cgt

tat

agc

480

Asn

Tyr

Arg

Leu

Gly

Leu

Met

Ala

Gly

Tyr

Gln

Glu

Ser

Arg

Tyr

Ser

145

150

155

160

- 71 031449

ttt Phe

aca Thr

gcc Ala

aga Arg

ggt Gly 165

ggt Gly

tcc Ser

tat Tyr

atc Ile

tac Tyr 170

agt Ser

tct Ser

gag Glu

gga Gly 175

ttc Phe

528

aga

gat

atc

ggc

tcc

ttc

ccg

aat

gga

gaa

aga

gca

atc

ggc

tac

576

Arg

Asp

Ile

Gly

Ser

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Arg

Ala

Ile

Gly

Tyr

180

185

190

aaa

caa

cgt

ttt

aaa

atg

ccc

tac

att

ggc

ttg

act

gga

agt

tat

cgt

624

Lys

Gln

Arg

Phe

Lys

Met

Pro

Tyr

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Tyr

Arg

195

200

205

tat

gaa

gat

ttt

gaa

ctc

ggt

ggc

aca

ttt

aaa

tac

agc

ggc

tgg

gtg

672

Tyr

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Gly

Thr

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Val

210

215

220

gaa

tca

tct

gat

aac

gat

gaa

cac

tat

gac

ccg

gga

aaa

aga

atc

act

720

Glu

Ser

Asp

Asn

Asp

Glu

His

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

Arg

Ile

Thr

225

230

235

240

tat

cgc

agt

aag

gtc

aaa

gac

caa

aat

tac

tat

tct

gtt

gca

gtc

aat

768

Tyr

Arg

Ser

Lys

Val

Lys

Asp

Gln

Asn

Tyr

Ser

Val

Ala

Val

Asn

245

250

255

gca

ggt

tat

tac

gtc

aca

cct

aac

gca

aaa

gtt

tat

gtt

gaa

ggc

gca

816

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

Asn

Ala

Lys

Val

Tyr

Val

Glu

Gly

Ala

260

265

270

tgg

aat

cgg

gtt

acg

aat

aaa

ggt

aat

act

tca

ctt

tat

gat

cac

864

Trp

Asn

Arg

Val

Thr

Asn

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

275

280

285

aat

aac

act

tca

gac

tac

agc

aaa

aat

gga

gca

ggt

ata

gaa

aac

912

Asn

Thr

Ser

Asp

Tyr

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Gly

Ile

Glu

Asn

290

295

300

tat

aac

ttc

atc

act

gct

ggt

ctt

aag

tac

aca

ttt

taa

954

Tyr

Asn

Phe

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

305

310

315

<210>	40
<211>	317
<212>	БЕЛОК
<213>	Искусственная	последовательность
<220>
<223>	Синтетическая	конструкция
<400>	40

Ile Arg 1

Ala

Lys

Leu 5

Leu

Gly

Ile Val

Leu 10

Thr

Pro

Ile

Ala 15

Ile

Ser

Phe

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Asp

Asn

Ile

20

25

30

Asn

Ala

Asp

Ile

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Arg

- 72 031449

Val

Tyr 50

Leu

Ala

Glu

Gly 55

Gly Arg

Lys

Val

Ser 60

Gln Leu Asp

Trp

Lys

Phe

Asn

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Ile

Asn

Trp

Asp

Leu

65

70

75

80

Met

Pro

Gln

Ile

Ser

Ile

Gly

Ala

Gly

Trp

Thr

Leu

Gly

Ser

85

90

95

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Asp

Gln

Asp

Trp

Met

Asp

Ser

Asn

Pro

100

105

110

Gly

Thr

Trp

Thr

Asp

Glu

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Thr

Gln

Leu

Asn

Tyr

115

120

125

Ala

Asn

Glu

Phe

Asp

Leu

Asn

Ile

Lys

Gly

Trp

Leu

Asn

Glu

Pro

130

135

140

Asn

Tyr

Arg

Leu

Gly

Leu

Met

Ala

Gly

Tyr

Gln

Glu

Ser

Arg

Tyr

Ser

145

150

155

160

Phe

Thr

Ala

Arg

Gly

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Glu

Gly

Phe

165

170

175

Arg

Asp

Ile

Gly

Ser

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Arg

Ala

Ile

Gly

Tyr

180

185

190

Lys

Gln

Arg

Phe

Lys

Met

Pro

Tyr

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Tyr

Arg

195

200

205

Tyr

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Gly

Thr

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Val

210

215

220

Glu

Ser

Asp

Asn

Asp

Glu

His

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

Arg

Ile

Thr

225

230

235

240

Tyr

Arg

Ser

Lys

Val

Lys

Asp

Gln

Asn

Tyr

Ser

Val

Ala

Val

Asn

245

250

255

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

Asn

Ala

Lys

Val

Tyr

Val

Glu

Gly

Ala

260

265

270

Trp

Asn

Arg

Val

Thr

Asn

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

275

280

285

- 73 031449

Asn Asn Asn Thr Ser Asp Tyr Ser

290 295

Lys

Asn Gly Ala Gly Ile

300

Glu Asn

Tyr Asn Phe Ile Thr Thr Ala Gly Leu Lys

305310

Tyr Thr Phe

315 <210>41 <211>954 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> мутантный ген OmpT, кодирующий белок с точечными мутациями

D210A и H212A

<220>
<221>	CDS
<222>	(1)..(954
<400>	41

atg Met 1

cgg Arg

gcg Ala

aaa Lys

ctt Leu 5

ctg Leu

gga Gly

ata Ile

gtc Val

ctg Leu 10

aca Thr

acc Thr

cct Pro

att Ile

gcg Ala 15

atc Ile

48

agc

tct

ttt

gct

tct

acc

gag

act

tta

tcg

ttt

act

cct

gac

aac

ata

96

Ser

Phe

Ala

Ser

Thr

Glu

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Asp

Asn

Ile

20

25

30

aat

gcg

gac

att

agt

ctt

gga

act

ctg

agc

gga

aaa

aca

aaa

gag

cgt

144

Asn

Ala

Asp

Ile

Ser

Leu

Gly

Thr

Leu

Ser

Gly

Lys

Thr

Lys

Glu

Arg

35

40

45

gtt

tat

cta

gcc

gaa

gga

ggc

cga

aaa

gtc

agt

caa

ctc

gac

tgg

192

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gly

Arg

Lys

Val

Ser

Gln

Leu

Asp

Trp

50

55

60

aaa

ttc

aat

aac

gct

gca

att

aaa

ggt

gca

att

aat

tgg

gat

ttg

240

Lys

Phe

Asn

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Ile

Asn

Trp

Asp

Leu

65

70

75

80

atg

ccc

cag

ata

tct

atc

ggg

gct

ggc

tgg

aca

act

ctc

ggc

agc

288

Met

Pro

Gln

Ile

Ser

Ile

Gly

Ala

Gly

Trp

Thr

Leu

Gly

Ser

85

90

95

cga

ggt

ggc

aat

atg

gtc

gat

cag

gac

tgg

atg

gat

tcc

agt

aac

ccc

336

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Asp

Gln

Asp

Trp

Met

Asp

Ser

Asn

Pro

100

105

110

gga

acc

tgg

acg

gat

gaa

agt

aga

cac

cct

gat

aca

caa

ctc

aat

tat

384

Gly

Thr

Trp

Thr

Asp

Glu

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Thr

Gln

Leu

Asn

Tyr

115

120

125

gcc

aac

gaa

ttt

gat

ctg

aat

atc

aaa

ggc

tgg

ctc

aac gaa ccc

432

Ala

Asn

Glu

Phe

Asp

Leu

Asn

Ile

Lys

Gly

Trp

Leu

Asn Glu Pro

130

135

140

- 74 031449

aat Asn 145

tac Tyr

cgc Arg

ctg Leu

gga Gly

ctc Leu 150

atg Met

gcc Ala

gga Gly

tat Tyr

cag Gln 155

gaa Glu

agc Ser

cgt Arg

tat Tyr

agc Ser 160

480

ttt

aca

gcc

aga

ggt

tcc

tat

atc

tac

agt

tct

gag

gga

ttc

528

Phe

Thr

Ala

Arg

Gly

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Glu

Gly

Phe

165

170

175

aga

gat

atc

ggc

tcc

ttc

ccg

aat

gga

gaa

aga

gca

atc

ggc

tac

576

Arg

Asp

Ile

Gly

Ser

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Arg

Ala

Ile

Gly

Tyr

180

185

190

aaa

caa

cgt

ttt

aaa

atg

ccc

tac

att

ggc

ttg

act

gga

agt

tat

cgt

624

Lys

Gln

Arg

Phe

Lys

Met

Pro

Tyr

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Tyr

Arg

195

200

205

tat

gaa

gat

ttt

gaa

ctc

ggt

ggc

aca

ttt

aaa

tac

agc

ggc

tgg

gtg

672

Tyr

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Gly

Thr

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Val

210

215

220

gaa

tca

tct

gat

aac

gct

gaa

gct

tat

gac

ccg

gga

aaa

aga

atc

act

720

Glu

Ser

Asp

Asn

Ala

Glu

Ala

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

Arg

Ile

Thr

225

230

235

240

tat

cgc

agt

aag

gtc

aaa

gac

caa

aat

tac

tat

tct

gtt

gca

gtc

aat

768

Tyr

Arg

Ser

Lys

Val

Lys

Asp

Gln

Asn

Tyr

Ser

Val

Ala

Val

Asn

245

250

255

gca

ggt

tat

tac

gtc

aca

cct

aac

gca

aaa

gtt

tat

gtt

gaa

ggc

gca

816

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

Asn

Ala

Lys

Val

Tyr

Val

Glu

Gly

Ala

260

265

270

tgg

aat

cgg

gtt

acg

aat

aaa

ggt

aat

act

tca

ctt

tat

gat

cac

864

Trp

Asn

Arg

Val

Thr

Asn

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

275

280

285

aat

aac

act

tca

gac

tac

agc

aaa

aat

gga

gca

ggt

ata

gaa

aac

912

Asn

Thr

Ser

Asp

Tyr

Ser

Lys

Asn

Gly

Ala

Gly

Ile

Glu

Asn

290

295

300

tat

aac

ttc

atc

act

gct

ggt

ctt

aag

tac

aca

ttt

taa

954

Tyr

Asn

Phe

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

305

310

315

<210> 42 <211> 317 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 42

Met Arg Ala Lys

Leu Leu Gly Ile Val

Leu Thr Thr Pro

Ile Ala Ile

Ser Ser Phe Ala Ser Thr Glu Thr Leu Ser Phe

25

Thr Pro Asp Asn Ile

- 75 031449

Asn Ala Asp

Ile

Ser

Leu

Gly

Thr Leu 40

Ser

Gly

Lys

Thr 45

Lys

Glu

Arg

35

Val

Tyr

Leu

Ala

Glu

Gly

Arg

Lys

Val

Ser

Gln

Leu

Asp

Trp

50

55

60

Lys

Phe

Asn

Ala

Ile

Lys

Gly

Ala

Ile

Asn

Trp

Asp

Leu

65

70

75

80

Met

Pro

Gln

Ile

Ser

Ile

Gly

Ala

Gly

Trp

Thr

Leu

Gly

Ser

85

90

95

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Asp

Gln

Asp

Trp

Met

Asp

Ser

Asn

Pro

100

105

110

Gly

Thr

Trp

Thr

Asp

Glu

Ser

Arg

His

Pro

Asp

Thr

Gln

Leu

Asn

Tyr

115

120

125

Ala

Asn

Glu

Phe

Asp

Leu

Asn

Ile

Lys

Gly

Trp

Leu

Asn

Glu

Pro

130

135

140

Asn

Tyr

Arg

Leu

Gly

Leu

Met

Ala

Gly

Tyr

Gln

Glu

Ser

Arg

Tyr

Ser

145

150

155

160

Phe

Thr

Ala

Arg

Gly

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Ser

Glu

Gly

Phe

165

170

175

Arg

Asp

Ile

Gly

Ser

Phe

Pro

Asn

Gly

Glu

Arg

Ala

Ile

Gly

Tyr

180

185

190

Lys

Gln

Arg

Phe

Lys

Met

Pro

Tyr

Ile

Gly

Leu

Thr

Gly

Ser

Tyr

Arg

195

200

205

Tyr

Glu

Asp

Phe

Glu

Leu

Gly

Thr

Phe

Lys

Tyr

Ser

Gly

Trp

Val

210

215

220

Glu

Ser

Asp

Asn

Ala

Glu

Ala

Tyr

Asp

Pro

Gly

Lys

Arg

Ile

Thr

225

230

235

240

Tyr

Arg

Ser

Lys

Val

Lys

Asp

Gln

Asn

Tyr

Ser

Val

Ala

Val

Asn

245

250

255

Ala

Gly

Tyr

Val

Thr

Pro

Asn

Ala

Lys

Val

Tyr

Val

Glu

Gly

Ala

260

265

270

Trp

Asn

Arg

Val

Thr

Asn

Lys

Gly

Asn

Thr

Ser

Leu

Tyr

Asp

His

- 76 031449

275

280

285

Asn Asn Asn Thr 290

Ser Asp

Tyr 295

Ser

Lys

Asn Gly Ala 300

Gly Ile Glu Asn

Tyr

Asn

Phe

Ile

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

305

310

315

<210> 43 <211> 711 <212> ДНК <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (1)..(711) <400> 43

atg Met 1

aag Lys

aaa Lys

ggt Gly

ttt Phe 5

atg Met

ttg Leu

ttt Phe

act Thr

ttg Leu 10

tta Leu

gcg Ala

ttt Phe

tca Ser 15

ggc Gly

48

ttt

gct

cag

gct

gat

gac

gcg

gca

att

caa

acg

tta

gcc

aaa

atg

96

Phe

Ala

Gln

Ala

Asp

Ala

Ile

Gln

Thr

Leu

Ala

Lys

Met

20

25

30

ggc

atc

aaa

agc

gat

att

cag

ccc

gcg

cct

gta

gct

ggc

atg

aag

144

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

35

40

45

aca

gtt

ctg

act

aac

agc

ggc

gtg

ttg

tac

atc

acc

gat

ggt

aaa

192

Thr

Val

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Tyr

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

50

55

60

cat

atc

att

cag

ggg

cca

atg

tat

gac

gtt

agt

ggc

acg

gct

ccg

gtc

240

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

65

70

75

80

aat

gtc

acc

aat

aag

atg

ctg

tta

aag

cag

ttg

aat

gcg

ctt

gaa

aaa

288

Asn

Val

Thr

Asn

Lys

Met

Leu

Lys

Gln

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu

Lys

85

90

95

gag

atg

atc

gtt

tat

aaa

gcg

ccg

cag

gaa

aaa

cac

gtc

atc

acc

gtg

336

Glu

Met

Ile

Val

Tyr

Lys

Ala

Pro

Gln

Glu

Lys

His

Val

Ile

Thr

Val

100

105

110

ttt

act

gat

att

acc

tgt

ggt

tac

tgc

cac

aaa

ctg

cat

gag

caa

atg

384

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

gca

gac

tac

aac

gcg

ctg

ggg

atc

acc

gtg

cgt

tat

ctt

gct

ttc

ccg

432

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

cgc

cag

ggg

ctg

gac

agc

gat

gca

gag

aaa

gaa

atg

aaa

gct

atc

tgg

480

Arg

Gln

Gly

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Lys

Glu

Met

Lys

Ala

Ile

Trp

145

150

155

160

- 77 031449

tgt Cys

gcg Ala

aaa Lys

gat Asp

aaa Lys 165

aac Asn

aaa Lys

gcg Ala

ttt Phe

gat Asp 170

gat Asp

gtg Val

atg Met

gca Ala

ggt Gly 175

aaa Lys

528

agc

gtc

gca

cca

gcc

agt

tgc

gac

gtg

gat

att

gcc

gac

cat

tac

gca

576

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

ctt

ggc

gtc

cag

ctt

ggc

gtt

agc

ggt

act

ccg

gca

gtt

gtg

ctg

agc

624

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

aat

ggc

aca

ctt

gtt

ccg

ggt

tac

cag

ccg

aaa

gag

atg

aaa

gaa

672

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210

215

220

ttt

ctc

gac

gaa

cac

caa

aaa

atg

acc

agc

ggt

aaa

taa

711

Phe

Leu

Asp

Glu

His

Gln

Lys

Met

Thr

Ser

Gly

Lys

225

230

235

<210> .

44

<211>

236

<212>

БЕЛОК

<213>

Escherichia coli

<400>

44

Met

Lys

Gly

Phe

Met

Leu

Phe

Thr

Leu

Ala

Phe

Ser

Gly

1

5

10

15

Phe

Ala

Gln

Ala

Asp

Ala

Ile

Gln

Thr

Leu

Ala

Lys

Met

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

35

40

45

Thr

Val

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Tyr

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

50

55

60

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

65

70

75

80

Asn

Val

Thr

Asn

Lys

Met

Leu

Lys

Gln

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu

Lys

85

90

95

Glu

Met

Ile

Val

Tyr

Lys

Ala

Pro

Gln

Glu

Lys

His

Val

Ile

Thr

Val

100

105

110

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

- 78 031449

Arg 145

Gln

Gly

Leu Asp

Ser 150

Asp

Ala

Glu Lys

Glu 155

Met

Lys

Ala

Ile

Trp 160

Cys

Ala

Lys

Asp

Lys

Asn

Lys

Ala

Phe

Asp

Val

Met

Ala

Gly

Lys

165

170

175

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210

215

220

Phe

Leu

Asp

Glu

His

Gln

Lys

Met

Thr

Ser

Gly

Lys

225

230

235

<210> 45 <211> 729 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> DsbC, содержащий гистидиновую метку и без участка рестрикции EcoRI <220>

<221> CDS <222> (1)..(729) <400> 45

atg Met 1

aag Lys

aaa Lys

ggt Gly

ttt Phe 5

atg Met

ttg Leu

ttt Phe

act Thr

ttg Leu 10

tta Leu

gcg Ala

ttt Phe

tca Ser 15

ggc Gly

48

ttt

gct

cag

gct

gat

gac

gcg

gca

att

caa

acg

tta

gcc

aaa

atg

96

Phe

Ala

Gln

Ala

Asp

Ala

Ile

Gln

Thr

Leu

Ala

Lys

Met

20

25

30

ggc

atc

aaa

agc

gat

att

cag

ccc

gcg

cct

gta

gct

ggc

atg

aag

144

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

35

40

45

aca

gtt

ctg

act

aac

agc

ggc

gtg

ttg

tac

atc

acc

gat

ggt

aaa

192

Thr

Val

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Tyr

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

50

55

60

cat

atc

att

cag

ggg

cca

atg

tat

gac

gtt

agt

ggc

acg

gct

ccg

gtc

240

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

65

70

75

80

aat

gtc

acc

aat

aag

atg

ctg

tta

aag

cag

ttg

aat

gcg

ctt

gaa

aaa

288

Asn

Val

Thr

Asn

Lys

Met

Leu

Lys

Gln

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu

Lys

- 79 031449

gag Glu

atg Met

atc Ile

gtt Val 100

tat Tyr

aaa Lys

gcg Ala

ccg Pro

cag Gln 105

gaa Glu

aaa Lys

cac His

gtc Val

atc Ile 110

acc Thr

gtg Val

336

ttt

act

gat

att

acc

tgt

ggt

tac

tgc

cac

aaa

ctg

cat

gag

caa

atg

384

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

gca

gac

tac

aac

gcg

ctg

ggg

atc

acc

gtg

cgt

tat

ctt

gct

ttc

ccg

432

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

cgc

cag

ggg

ctg

gac

agc

gat

gca

gag

aaa

gaa

atg

aaa

gct

atc

tgg

480

Arg

Gln

Gly

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Lys

Glu

Met

Lys

Ala

Ile

Trp

145

150

155

160

tgt

gcg

aaa

gat

aaa

aac

aaa

gcg

ttt

gat

gtg

atg

gca

ggt

aaa

528

Cys

Ala

Lys

Asp

Lys

Asn

Lys

Ala

Phe

Asp

Val

Met

Ala

Gly

Lys

165

170

175

agc

gtc

gca

cca

gcc

agt

tgc

gac

gtg

gat

att

gcc

gac

cat

tac

gca

576

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

ctt

ggc

gtc

cag

ctt

ggc

gtt

agc

ggt

act

ccg

gca

gtt

gtg

ctg

agc

624

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

aat

ggc

aca

ctt

gtt

ccg

ggt

tac

cag

ccg

aaa

gag

atg

aaa

gaa

672

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210

215

220

ttt

ctc

gac

gaa

cac

caa

aaa

atg

acc

agc

ggt

aaa

cac

cat

cac

cat

720

Phe

Leu

Asp

Glu

His

Gln

Lys

Met

Thr

Ser

Gly

Lys

His

225

230

235

240

729 cac cac taa

His His <210> 46 <211> 242 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 46

Met 1

Lys

Gly

Phe Met 5

Leu

Phe

Thr

Leu 10

Leu

Ala

Phe

Ser Gly 15

Phe

Ala

Gln

Ala

Asp

Ala

Ile

Gln

Thr

Leu

Ala

Lys

Met

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

- 80 031449

Thr Val 50

Leu Thr

Asn

Ser

Gly 55

Val

Leu Tyr

Ile

Thr Asp 60

Asp

Gly

Lys

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

65

70

75

80

Asn

Val

Thr

Asn

Lys

Met

Leu

Lys

Gln

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu

Lys

85

90

95

Glu

Met

Ile

Val

Tyr

Lys

Ala

Pro

Gln

Glu

Lys

His

Val

Ile

Thr

Val

100

105

110

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

Arg

Gln

Gly

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Lys

Glu

Met

Lys

Ala

Ile

Trp

145

150

155

160

Cys

Ala

Lys

Asp

Lys

Asn

Lys

Ala

Phe

Asp

Val

Met

Ala

Gly

Lys

165

170

175

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210

215

220

Phe

Leu

Asp

Glu

His

Gln

Lys

Met

Thr

Ser

Gly

Lys

His

225

230

235

240

His His <210> 47 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Праймер 6283 Tsp 3'

- 81 031449 <400>47 gcatcataat tttcttttta cctc

<210>	48
<211>	24
<212>	ДНК
<213>	Искусственная последовательность
<220>
<223>	Праймер 6283 Tsp 5'
<400>	48
gggaaatgaa cctgagcaaa acgc	24

<210>49 <211>3120 <212> ДНК <213> Escherichia coli <220>

<221> CDS <222> (206)..(3091) <223> прeпротеаза III (AA -23 - 939) <220>

<221> сигнальный пептид <222> (206)..(274) <220>

<221> зрелый пептид <222> (275)..(3091) <223> протеаза III (AA 1-939) <300>

<308> GenBank/X06227 <309> 2005-04-18 <313> (1)..(3120) <400>49 ttaccgctgt ttcgctttaa tcagtcatga gtgctgtata aaaattgcgc aatctatccg60 cttactttat gatgcgcacc agtcacggac tgatggttat ataaacatag gctgactcct120 gcagcacaag attaaattct ggcagatgat ttgcgttaac gtgttgaatc tggacagaaa180

attaagttga ttatgaggtc cgtga atg

ccc Pro

cgc Arg

agc Ser -20

acc Thr

tgg Trp

ttc Phe

aaa gca

232

Met

Lys

Ala -15

tta

ttg

tta

gtt

gcc

ctt

tgg

gca

ccc

tta

agt

cag

gca

gaa

acg

280

Leu

Val

Ala

Leu

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Gln

Ala

Glu

Thr

-10

-5

-1

1

gga

tgg

cag

ccg

att

cag

gaa

acc

atc

cgt

aaa

agt

gat

aaa

gat

aac

328

Gly

Trp

Gln

Pro

Ile

Gln

Glu

Thr

Ile

Arg

Lys

Ser

Asp

Lys

Asp

Asn

5

10

15

cgc

cag

tat

cag

gct

ata

cgt

ctg

gat

aac

ggt

atg

gtg

gtc

ttg

ctg

376

Arg

Gln

Tyr

Gln

Ala

Ile

Arg

Leu

Asp

Asn

Gly

Met

Val

Leu

25 30

- 82 031449

gtt Val 35

tct Ser

gat Asp

ccg Pro

cag Gln

gca Ala 40

gtt Val

aaa Lys

tcg Ser

ctc Leu

tcg Ser 45

gcg Ala

ctg Leu

gtg Val

ccc Pro 50

424

gtt

ggg

tcg

ctg

gaa

gat

ccc

gag

gcg

tac

cag

ggg

ctg

gca

cat

tac

472

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Pro

Glu

Ala

Tyr

Gln

Gly

Leu

Ala

His

Tyr

55

60

65

ctt

gaa

cat

atg

agt

ctg

atg

ggg

tcg

aaa

aag

tac

ccg

cag

gct

gac

520

Leu

Glu

His

Met

Ser

Leu

Met

Gly

Ser

Lys

Tyr

Pro

Gln

Ala

Asp

70

75

80

agt

ctg

gcc

gaa

tat

ctc

aaa

atg

cac

ggc

ggt

agt

cac

aat

gcc

agc

568

Ser

Leu

Ala

Glu

Tyr

Leu

Lys

Met

His

Gly

Ser

His

Asn

Ala

Ser

85

90

95

act

gcg

ccg

tat

cgc

acg

gct

ttc

tat

ctg

gaa

gtt

gag

aac

gac

gcc

616

Thr

Ala

Pro

Tyr

Arg

Thr

Ala

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Ala

100

105

110

ttg

cct

ggt

gcg

gta

gac

cgc

ctg

gcc

gat

gct

att

gct

gaa

cct

ttg

664

Leu

Pro

Gly

Ala

Val

Asp

Arg

Leu

Ala

Asp

Ala

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

115

120

125

130

ctc

gac

aag

aaa

tat

gcc

gaa

cgt

gag

cgt

aat

gcg

gtg

aac

gct

gaa

712

Leu

Asp

Lys

Tyr

Ala

Glu

Arg

Glu

Arg

Asn

Ala

Val

Asn

Ala

Glu

135

140

145

tta

acc

atg

gcg

cgt

acg

cgt

gac

ggg

atg

cgc

atg

gca

cag

gtc

agc

760

Leu

Thr

Met

Ala

Arg

Thr

Arg

Asp

Gly

Met

Arg

Met

Ala

Gln

Val

Ser

150

155

160

gca

gaa

acc

att

aac

ccg

gca

cac

ccc

ggt

tca

aag

ttt

tct

ggt

808

Ala

Glu

Thr

Ile

Asn

Pro

Ala

His

Pro

Gly

Ser

Lys

Phe

Ser

Gly

165

170

175

aac

ctc

gaa

act

tta

agc

gac

aaa

cct

ggt

aat

ccg

gtg

cag

gcg

856

Asn

Leu

Glu

Thr

Leu

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Asn

Pro

Val

Gln

Ala

180

185

190

ctg

aaa

gat

ttc

cac

gag

aag

tac

tat

tcc

gcc

aat

ttg

atg

aag

gcg

904

Leu

Lys

Asp

Phe

His

Glu

Lys

Tyr

Ser

Ala

Asn

Leu

Met

Lys

Ala

195

200

205

210

gtt

att

tac

agt

aat

aaa

ccg

ctg

ccg

gag

ttg

gca

aaa

atg

gcg

952

Val

Ile

Tyr

Ser

Asn

Lys

Pro

Leu

Pro

Glu

Leu

Ala

Lys

Met

Ala

215

220

225

gac

acc

ttt

ggt

cgc

gtg

ccg

aac

aaa

gag

agc

aaa

ccg

gaa

atc

1000

Asp

Thr

Phe

Gly

Arg

Val

Pro

Asn

Lys

Glu

Ser

Lys

Pro

Glu

Ile

230

235

240

acc

gtg

ccg

gta

gtc

acc

gac

gcg

caa

aag

ggc

att

atc

att

cat

tac

1048

Thr

Val

Pro

Val

Thr

Asp

Ala

Gln

Lys

Gly

Ile

His

Tyr

245

250

255

gtc

cct

gcg

ctg

ccg

cgt

aaa

gtg

ttg

cgc

gtt

gag

ttt

cgc

atc

gat

1096

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Arg

Lys

Val

Leu

Arg

Val

Glu

Phe

Arg

Ile

Asp

260

265

270

aac

tca

gcg

aag

ttc

cgt

agt

aaa

acc

gat

gaa

ttg

att

acc

tat

1144

Asn

Ser

Ala

Lys

Phe

Arg

Ser

Lys

Thr

Asp

Glu

Leu

Ile

Thr

Tyr

- 83 031449

275

280

285

290

ctg Leu

att Ile

ggc Gly

aat Asn

cgc Arg 295

agc Ser

cca Pro

ggt Gly

aca Thr

ctt Leu 300

tct Ser

gac Asp

tgg Trp

ctg Leu

caa Gln 305

aag Lys

1192

cag

gga

tta

gtt

gag

ggc

att

agc

gcc

aac

tcc

gat

cct

atc

gtc

aac

1240

Gln

Gly

Leu

Val

Glu

Gly

Ile

Ser

Ala

Asn

Ser

Asp

Pro

Ile

Val

Asn

310

315

320

ggc

aac

agc

ggc

gta

tta

gcg

atc

tct

gcg

tct

tta

acc

gat

aaa

ggc

1288

Gly

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Ala

Ile

Ser

Ala

Ser

Leu

Thr

Asp

Lys

Gly

325

330

335

ctg

gct

aat

cgc

gat

cag

gtt

gtg

gcg

gca

att

ttt

agc

tat

ctc

aat

1336

Leu

Ala

Asn

Arg

Asp

Gln

Val

Ala

Ile

Phe

Ser

Tyr

Leu

Asn

340

345

350

ctg

tta

cgt

gaa

aaa

ggc

att

gat

aaa

caa

tac

ttc

gat

gaa

ctg

gcg

1384

Leu

Arg

Glu

Lys

Gly

Ile

Asp

Lys

Gln

Tyr

Phe

Asp

Glu

Leu

Ala

355

360

365

370

aat

gtg

ctg

gat

atc

gac

ttc

cgt

tat

ccg

tcg

atc

acc

cgt

gat

atg

1432

Asn

Val

Leu

Asp

Ile

Asp

Phe

Arg

Tyr

Pro

Ser

Ile

Thr

Arg

Asp

Met

375

380

385

gat

tac

gtc

gaa

tgg

ctg

gca

gat

acc

atg

att

cgc

gtt

cct

gtt

gag

1480

Asp

Tyr

Val

Glu

Trp

Leu

Ala

Asp

Thr

Met

Ile

Arg

Val

Pro

Val

Glu

390

395

400

cat

acg

ctg

gat

gca

gtc

aat

att

gcc

gat

cgg

tac

gat

gct

aaa

gca

1528

His

Thr

Leu

Asp

Ala

Val

Asn

Ile

Ala

Asp

Arg

Tyr

Asp

Ala

Lys

Ala

405

410

415

gta

aag

gaa

cgt

ctg

gcg

atg

acg

ccg

cag

aat

gcg

cgt

atc

tgg

1576

Val

Lys

Glu

Arg

Leu

Ala

Met

Thr

Pro

Gln

Asn

Ala

Arg

Ile

Trp

420

425

430

tat

atc

agc

ccg

aaa

gag

ccg

cac

aac

aaa

acg

gct

tac

ttt

gtc

gat

1624

Tyr

Ile

Ser

Pro

Lys

Glu

Pro

His

Asn

Lys

Thr

Ala

Tyr

Phe

Val

Asp

435

440

445

450

gcg

ccg

tat

cag

gtc

gat

aaa

atc

agc

gca

caa

act

ttc

gcc

gac

tgg

1672

Ala

Pro

Tyr

Gln

Val

Asp

Lys

Ile

Ser

Ala

Gln

Thr

Phe

Ala

Asp

Trp

455

460

465

cag

aaa

gcc

gac

att

gcg

ctc

tct

ttg

cca

gag

ctt

aac

cct

1720

Gln

Lys

Ala

Asp

Ile

Ala

Leu

Ser

Leu

Pro

Glu

Leu

Asn

Pro

470

475

480

tat

att

cct

gat

ttc

tcg

ctg

att

aag

tca

gag

aag

aaa

tac

gac

1768

Tyr

Ile

Pro

Asp

Phe

Ser

Leu

Ile

Lys

Ser

Glu

Lys

Tyr

Asp

485

490

495

cat

cca

gag

ctg

att

gtt

gat

gag

tcg

aat

ctg

cgc

gtg

tat

gcg

1816

His

Pro

Glu

Leu

Ile

Val

Asp

Glu

Ser

Asn

Leu

Arg

Val

Tyr

Ala

500

505

510

cca

agc

cgt

tat

ttt

gcc

agc

gag

ccc

aaa

gct

gat

gtc

agc

ctg

att

1864

Pro

Ser

Arg

Tyr

Phe

Ala

Ser

Glu

Pro

Lys

Ala

Asp

Val

Ser

Leu

Ile

515

520

525

530

ttg

cgt

aat

ccg

aaa

gcc

atg

gac

agc

gcc

cgc

aat

cag

gtg

atg

ttt

1912

- 84 031449

Leu Arg Asn

Pro

Lys 535

Ala

Met

Asp

Ser

Ala 540

Arg

Asn

Gln Val

Met 545

Phe

gcg

ctc

aat

gat

tat

ctc

gca

ggg

ctg

gcg

ctt

gat

cag

tta

agc

aac

1960

Ala

Leu

Asn

Asp

Tyr

Leu

Ala

Gly

Leu

Ala

Leu

Asp

Gln

Leu

Ser

Asn

550

555

560

cag

gcg

tcg

gtt

ggt

ggc

ata

agt

ttt

tcc

acc

aac

gct

aac

ggc

2008

Gln

Ala

Ser

Val

Gly

Ile

Ser

Phe

Ser

Thr

Asn

Ala

Asn

Gly

565

570

575

ctt

atg

gtt

aat

gct

aat

ggt

tac

acc

cag

cgt

ctg

ccg

cag

ctg

ttc

2056

Leu

Met

Val

Asn

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Gln

Arg

Leu

Pro

Gln

Leu

Phe

580

585

590

cag

gca

ttg

ctc

gag

ggg

tac

ttt

agc

tat

acc

gct

acg

gaa

gat

cag

2104

Gln

Ala

Leu

Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Thr

Ala

Thr

Glu

Asp

Gln

595

600

605

610

ctt

gag

cag

gcg

aag

tcc

tgg

tat

aac

cag

atg

gat

tcc

gca

gaa

2152

Leu

Glu

Gln

Ala

Lys

Ser

Trp

Tyr

Asn

Gln

Met

Asp

Ser

Ala

Glu

615

620

625

aag

ggt

aaa

gcg

ttt

gag

cag

gcg

att

atg

ccc

gcg

cag

atg

ctc

tcg

2200

Lys

Gly

Lys

Ala

Phe

Glu

Gln

Ala

Ile

Met

Pro

Ala

Gln

Met

Leu

Ser

630

635

640

caa

gtg

ccg

tac

ttc

tcg

cga

gat

gaa

cgg

cgt

aaa

att

ttg

ccc

tcc

2248

Gln

Val

Pro

Tyr

Phe

Ser

Arg

Asp

Glu

Arg

Lys

Ile

Leu

Pro

Ser

645

650

655

att

acg

ttg

aaa

gag

gtg

ctg

gcc

tat

cgc

gac

gcc

tta

aaa

tca

ggg

2296

Ile

Thr

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

Ala

Tyr

Arg

Asp

Ala

Leu

Lys

Ser

Gly

660

665

670

gct

cga

cca

gag

ttt

atg

gtt

atc

ggc

aac

atg

acc

gag

gcc

cag

gca

2344

Ala

Arg

Pro

Glu

Phe

Met

Val

Ile

Gly

Asn

Met

Thr

Glu

Ala

Gln

Ala

675

680

685

690

aca

acg

ctg

gca

cgc

gat

gtg

caa

aaa

cag

ttg

ggc

gct

gat

ggt

tca

2392

Thr

Leu

Ala

Arg

Asp

Val

Gln

Lys

Gln

Leu

Gly

Ala

Asp

Gly

Ser

695

700

705

gag

tgg

tgt

cga

aac

aaa

gat

gta

gtg

gtc

gat

aaa

caa

tcc

gtc

2440

Glu

Trp

Cys

Arg

Asn

Lys

Asp

Val

Asp

Lys

Gln

Ser

Val

710

715

720

atc

ttt

gaa

aaa

gcc

ggt

aac

agc

acc

gac

tcc

gca

ctg

gca

gcg

gta

2488

Ile

Phe

Glu

Lys

Ala

Gly

Asn

Ser

Thr

Asp

Ser

Ala

Leu

Ala

Val

725

730

735

ttt

gta

ccg

act

ggc

tac

gat

gaa

tac

acc

agc

tca

gcc

tat

agc

tct

2536

Phe

Val

Pro

Thr

Gly

Tyr

Asp

Glu

Tyr

Thr

Ser

Ala

Tyr

Ser

740

745

750

ctg

ttg

ggg

cag

atc

gta

cag

ccg

tgg

ttc

tac

aat

cag

ttg

cgt

acc

2584

Leu

Gly

Gln

Ile

Val

Gln

Pro

Trp

Phe

Tyr

Asn

Gln

Leu

Arg

Thr

755

760

765

770

gaa

caa

ttg

ggc

tat

gcc

gtg

ttt

gcg

ttt

cca

atg

agc

gtg

ggg

2632

Glu

Gln

Leu

Gly

Tyr

Ala

Val

Phe

Ala

Phe

Pro

Met

Ser

Val

Gly

775 780 785

- 85 031449

cgt Arg

cag Gln

tgg Trp

ggc Gly 790

atg Met

ggc Gly

ttc Phe

ctt Leu

ttg Leu 795

caa Gln

agc Ser

aat Asn

gat Asp

aaa Lys 800

cag Gln

cct Pro

2680

tca

ttc

ttg

tgg

gag

cgt

tac

aag

gcg

ttt

ttc

cca

acc

gca

gag

gca

2728

Ser

Phe

Leu

Trp

Glu

Arg

Tyr

Lys

Ala

Phe

Pro

Thr

Ala

Glu

Ala

805

810

815

aaa

ttg

cga

gcg

atg

aag

cca

gat

gag

ttt

gcg

caa

atc

cag

gcg

2776

Lys

Leu

Arg

Ala

Met

Lys

Pro

Asp

Glu

Phe

Ala

Gln

Ile

Gln

Ala

820

825

830

gta

att

acc

cag

atg

ctg

cag

gca

ccg

caa

acg

ctc

ggc

gaa

gca

2824

Val

Ile

Thr

Gln

Met

Leu

Gln

Ala

Pro

Gln

Thr

Leu

Gly

Glu

Ala

835

840

845

850

tcg

aag

tta

agt

aaa

gat

ttc

gat

cgc

ggc

aat

atg

cgc

ttc

gat

tcg

2872

Ser

Lys

Leu

Ser

Lys

Asp

Phe

Asp

Arg

Gly

Asn

Met

Arg

Phe

Asp

Ser

855

860

865

cgt

gat

aaa

atc

gtg

gcc

cag

ata

aaa

ctg

acg

ccg

caa

aaa

ctt

2920

Arg

Asp

Lys

Ile

Val

Ala

Gln

Ile

Lys

Leu

Thr

Pro

Gln

Lys

Leu

870

875

880

gct

gat

ttc

cat

cag

gcg

gtg

gtc

gag

ccg

caa

ggc

atg

gct

att

2968

Ala

Asp

Phe

His

Gln

Ala

Val

Glu

Pro

Gln

Gly

Met

Ala

Ile

885

890

895

ctg

tcg

cag

att

tcc

ggc

agc

cag

aac

ggg

aaa

gcc

gaa

tat

gta

cac

3016

Leu

Ser

Gln

Ile

Ser

Gly

Ser

Gln

Asn

Gly

Lys

Ala

Glu

Tyr

Val

His

900

905

910

cct

gaa

ggc

tgg

aaa

gtg

tgg

gag

aac

gtc

agc

gcg

ttg

cag

caa

aca

3064

Pro

Glu

Gly

Trp

Lys

Val

Trp

Glu

Asn

Val

Ser

Ala

Leu

Gln

Thr

915

920

925

930

atg

ccc

ctg

atg

agt

gaa

aag

aat

gag

tgatgtcgcc gagacactag

3111

Met

Pro

Leu

Met

Ser

Glu

Lys

Asn

Glu

935 atcctttgc

3120 <210> 50 <211> 962 <212> БЕЛОК <213> Escherichia coli <400> 50

Met

Pro Arg

Ser -20

Thr

Trp

Phe

Lys

Ala -15

Leu

Val -10

Ala

Leu

Trp

Ala

Pro

Leu

Ser

Gln

Ala

Glu

Thr

Gly

Trp

Gln

Pro

Ile

Gln

Glu

-5

-1

1

5

Thr

Ile

Arg

Lys

Ser

Asp

Lys

Asp

Asn

Arg

Gln

Tyr

Gln

Ala

Ile

Arg

10

15

20

25

- 86 031449

Leu Asp

Asn

Gly Met 30

Val

Leu

Val 35

Ser

Asp

Pro

Gln

Ala 40

Val

Lys

Ser

Leu

Ser

Ala

Leu

Val

Pro

Val

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Pro

45

50

55

Glu

Ala

Tyr

Gln

Gly

Leu

Ala

His

Tyr

Leu

Glu

His

Met

Ser

Leu

Met

60

65

70

Gly

Ser

Lys

Tyr

Pro

Gln

Ala

Asp

Ser

Leu

Ala

Glu

Tyr

Leu

Lys

75

80

85

Met

His

Gly

Ser

His

Asn

Ala

Ser

Thr

Ala

Pro

Tyr

Arg

Thr

Ala

90

95

100

105

Phe

Tyr

Leu

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Ala

Leu

Pro

Gly

Ala

Val

Asp

Arg

110

115

120

Leu

Ala

Asp

Ala

Ile

Ala

Glu

Pro

Leu

Asp

Lys

Tyr

Ala

Glu

125

130

135

Arg

Glu

Arg

Asn

Ala

Val

Asn

Ala

Glu

Leu

Thr

Met

Ala

Arg

Thr

Arg

140

145

150

Asp

Gly

Met

Arg

Met

Ala

Gln

Val

Ser

Ala

Glu

Thr

Ile

Asn

Pro

Ala

155

160

165

His

Pro

Gly

Ser

Lys

Phe

Ser

Gly

Asn

Leu

Glu

Thr

Leu

Ser

Asp

170

175

180

185

Lys

Pro

Gly

Asn

Pro

Val

Gln

Ala

Leu

Lys

Asp

Phe

His

Glu

Lys

190

195

200

Tyr

Ser

Ala

Asn

Leu

Met

Lys

Ala

Val

Ile

Tyr

Ser

Asn

Lys

Pro

205

210

215

Leu

Pro

Glu

Leu

Ala

Lys

Met

Ala

Asp

Thr

Phe

Gly

Arg

Val

Pro

220

225

230

Asn

Lys

Glu

Ser

Lys

Pro

Glu

Ile

Thr

Val

Pro

Val

Thr

Asp

235

240

245

Ala

Gln

Lys

Gly

Ile

His

Tyr

Val

Pro

Ala

Leu

Pro

Arg

Lys

250

255

260

265

Val

Leu

Arg

Val

Glu

Phe

Arg

Ile

Asp

Asn

Ser

Ala

Lys

Phe

Arg

270 275 280

- 87 031449

Ser

Lys

Thr

Asp 285

Glu

Leu

Ile

Thr

Tyr 290

Leu

Ile

Gly

Asn

Arg 295

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Asp

Trp

Leu

Gln

Lys

Gln

Gly

Leu

Val

Glu

Gly

Ile

300

305

310

Ser

Ala

Asn

Ser

Asp

Pro

Ile

Val

Asn

Gly

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Ala

315

320

325

Ile

Ser

Ala

Ser

Leu

Thr

Asp

Lys

Gly

Leu

Ala

Asn

Arg

Asp

Gln

Val

330

335

340

345

Val

Ala

Ile

Phe

Ser

Tyr

Leu

Asn

Leu

Arg

Glu

Lys

Gly

Ile

350

355

360

Asp

Lys

Gln

Tyr

Phe

Asp

Glu

Leu

Ala

Asn

Val

Leu

Asp

Ile

Asp

Phe

365

370

375

Arg

Tyr

Pro

Ser

Ile

Thr

Arg

Asp

Met

Asp

Tyr

Val

Glu

Trp

Leu

Ala

380

385

390

Asp

Thr

Met

Ile

Arg

Val

Pro

Val

Glu

His

Thr

Leu

Asp

Ala

Val

Asn

395

400

405

Ile

Ala

Asp

Arg

Tyr

Asp

Ala

Lys

Ala

Val

Lys

Glu

Arg

Leu

Ala

Met

410

415

420

425

Met

Thr

Pro

Gln

Asn

Ala

Arg

Ile

Trp

Tyr

Ile

Ser

Pro

Lys

Glu

Pro

430

435

440

His

Asn

Lys

Thr

Ala

Tyr

Phe

Val

Asp

Ala

Pro

Tyr

Gln

Val

Asp

Lys

445

450

455

Ile

Ser

Ala

Gln

Thr

Phe

Ala

Asp

Trp

Gln

Lys

Ala

Asp

Ile

460

465

470

Ala

Leu

Ser

Leu

Pro

Glu

Leu

Asn

Pro

Tyr

Ile

Pro

Asp

Phe

Ser

475

480

485

Leu

Ile

Lys

Ser

Glu

Lys

Tyr

Asp

His

Pro

Glu

Leu

Ile

Val

Asp

490

495

500

505

Glu

Ser

Asn

Leu

Arg

Val

Tyr

Ala

Pro

Ser

Arg

Tyr

Phe

Ala

Ser

510

515

520

Glu

Pro

Lys

Ala

Asp

Val

Ser

Leu

Ile

Leu

Arg

Asn

Pro

Lys

Ala

Met

- 88 031449

525

530

535

Asp

Ser

Ala Arg 540

Asn Gln Val

Met 545

Phe

Ala

Leu

Asn

Asp 550

Tyr

Leu

Ala

Gly

Leu

Ala

Leu

Asp

Gln

Leu

Ser

Asn

Gln

Ala

Ser

Val

Gly

Ile

555

560

565

Ser

Phe

Ser

Thr

Asn

Ala

Asn

Gly

Leu

Met

Val

Asn

Ala

Asn

Gly

570

575

580

585

Tyr

Thr

Gln

Arg

Leu

Pro

Gln

Leu

Phe

Gln

Ala

Leu

Glu

Gly

Tyr

590

595

600

Phe

Ser

Tyr

Thr

Ala

Thr

Glu

Asp

Gln

Leu

Glu

Gln

Ala

Lys

Ser

Trp

605

610

615

Tyr

Asn

Gln

Met

Asp

Ser

Ala

Glu

Lys

Gly

Lys

Ala

Phe

Glu

Gln

620

625

630

Ala

Ile

Met

Pro

Ala

Gln

Met

Leu

Ser

Gln

Val

Pro

Tyr

Phe

Ser

Arg

635

640

645

Asp

Glu

Arg

Lys

Ile

Leu

Pro

Ser

Ile

Thr

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

650

655

660

665

Ala

Tyr

Arg

Asp

Ala

Leu

Lys

Ser

Gly

Ala

Arg

Pro

Glu

Phe

Met

Val

670

675

680

Ile

Gly

Asn

Met

Thr

Glu

Ala

Gln

Ala

Thr

Leu

Ala

Arg

Asp

Val

685

690

695

Gln

Lys

Gln

Leu

Gly

Ala

Asp

Gly

Ser

Glu

Trp

Cys

Arg

Asn

Lys

Asp

700

705

710

Val

Asp

Lys

Gln

Ser

Val

Ile

Phe

Glu

Lys

Ala

Gly

Asn

715

720

725

Ser

Thr

Asp

Ser

Ala

Leu

Ala

Val

Phe

Val

Pro

Thr

Gly

Tyr

Asp

730

735

740

745

Glu

Tyr

Thr

Ser

Ala

Tyr

Ser

Leu

Gly

Gln

Ile

Val

Gln

750

755

760

Pro

Trp

Phe

Tyr

Asn

Gln

Leu

Arg

Thr

Glu

Gln

Leu

Gly

Tyr

Ala

765

770

775

- 89 031449

Val

Phe Ala 780

Phe

Pro Met

Ser

Val 785

Gly

Arg

Gln

Trp

Gly 790

Met

Gly

Phe

Leu

Gln

Ser

Asn

Asp

Lys

Gln

Pro

Ser

Phe

Leu

Trp

Glu

Arg

Tyr

795

800

805

Lys

Ala

Phe

Pro

Thr

Ala

Glu

Ala

Lys

Leu

Arg

Ala

Met

Lys

Pro

810

815

820

825

Asp

Glu

Phe

Ala

Gln

Ile

Gln

Ala

Val

Ile

Thr

Gln

Met

Leu

Gln

830

835

840

Ala

Pro

Gln

Thr

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Lys

Leu

Ser

Lys

Asp

Phe

845

850

855

Asp

Arg

Gly

Asn

Met

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Asp

Lys

Ile

Val

Ala

Gln

860

865

870

Ile

Lys

Leu

Thr

Pro

Gln

Lys

Leu

Ala

Asp

Phe

His

Gln

Ala

875

880

885

Val

Glu

Pro

Gln

Gly

Met

Ala

Ile

Leu

Ser

Gln

Ile

Ser

Gly

Ser

890

895

900

905

Gln

Asn

Gly

Lys

Ala

Glu

Tyr

Val

His

Pro

Glu

Gly

Trp

Lys

Val

Trp

910

915

920

Glu

Asn

Val

Ser

Ala

Leu

Gln

Thr

Met

Pro

Leu

Met

Ser

Glu

Lys

925

930

935

Asn Glu <210> 51 <211> 729 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> DsbC дикого типа, содержащий гистидиновую метку <220>

<221> CDS <222> (1)..(729) <400> 51 atg aag aaa ggt ttt atg ttg ttt act ttg tta gcg gcg ttt tca ggc Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly 1 5 10 15

- 90 031449

ttt Phe

gct Ala

cag Gln

gct Ala 20

gat Asp

gac Asp

gcg Ala

gca Ala

att Ile 25

caa Gln

acg Thr

tta Leu

gcc Ala 30

aaa Lys

atg Met

96

ggc

atc

aaa

agc

gat

att

cag

ccc

gcg

cct

gta

gct

ggc

atg

aag

144

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

35

40

45

aca

gtt

ctg

act

aac

agc

ggc

gtg

ttg

tac

atc

acc

gat

ggt

aaa

192

Thr

Val

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Tyr

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

50

55

60

cat

atc

att

cag

ggg

cca

atg

tat

gac

gtt

agt

ggc

acg

gct

ccg

gtc

240

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

65

70

75

80

aat

gtc

acc

aat

aag

atg

ctg

tta

aag

cag

ttg

aat

gcg

ctt

gaa

aaa

288

Asn

Val

Thr

Asn

Lys

Met

Leu

Lys

Gln

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu

Lys

85

90

95

gag

atg

atc

gtt

tat

aaa

gcg

ccg

cag

gaa

aaa

cac

gtc

atc

acc

gtg

336

Glu

Met

Ile

Val

Tyr

Lys

Ala

Pro

Gln

Glu

Lys

His

Val

Ile

Thr

Val

100

105

110

ttt

act

gat

att

acc

tgt

ggt

tac

tgc

cac

aaa

ctg

cat

gag

caa

atg

384

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

gca

gac

tac

aac

gcg

ctg

ggg

atc

acc

gtg

cgt

tat

ctt

gct

ttc

ccg

432

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

cgc

cag

ggg

ctg

gac

agc

gat

gca

gag

aaa

gaa

atg

aaa

gct

atc

tgg

480

Arg

Gln

Gly

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Lys

Glu

Met

Lys

Ala

Ile

Trp

145

150

155

160

tgt

gcg

aaa

gat

aaa

aac

aaa

gcg

ttt

gat

gtg

atg

gca

ggt

aaa

528

Cys

Ala

Lys

Asp

Lys

Asn

Lys

Ala

Phe

Asp

Val

Met

Ala

Gly

Lys

165

170

175

agc

gtc

gca

cca

gcc

agt

tgc

gac

gtg

gat

att

gcc

gac

cat

tac

gca

576

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

ctt

ggc

gtc

cag

ctt

ggc

gtt

agc

ggt

act

ccg

gca

gtt

gtg

ctg

agc

624

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

aat

ggc

aca

ctt

gtt

ccg

ggt

tac

cag

ccg

aaa

gag

atg

aaa

gaa

672

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210

215

220

ttc

ctc

gac

gaa

cac

caa

aaa

atg

acc

agc

ggt

aaa

cac

cat

cac

cat

720

Phe

Leu

Asp

Glu

His

Gln

Lys

Met

Thr

Ser

Gly

Lys

His

225

230

235

240

cac cac taa

His His <210> 52 <211> 242

729

- 91 031449 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Синтетическая конструкция <400> 52

Met 1

Lys

Gly

Phe 5

Met

Leu

Phe

Thr

Leu 10

Leu

Ala

Phe

Ser 15

Gly

Phe

Ala

Gln

Ala

Asp

Ala

Ile

Gln

Thr

Leu

Ala

Lys

Met

20

25

30

Gly

Ile

Lys

Ser

Asp

Ile

Gln

Pro

Ala

Pro

Val

Ala

Gly

Met

Lys

35

40

45

Thr

Val

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Leu

Tyr

Ile

Thr

Asp

Gly

Lys

50

55

60

His

Ile

Gln

Gly

Pro

Met

Tyr

Asp

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

65

70

75

80

Asn

Val

Thr

Asn

Lys

Met

Leu

Lys

Gln

Leu

Asn

Ala

Leu

Glu

Lys

85

90

95

Glu

Met

Ile

Val

Tyr

Lys

Ala

Pro

Gln

Glu

Lys

His

Val

Ile

Thr

Val

100

105

110

Phe

Thr

Asp

Ile

Thr

Cys

Gly

Tyr

Cys

His

Lys

Leu

His

Glu

Gln

Met

115

120

125

Ala

Asp

Tyr

Asn

Ala

Leu

Gly

Ile

Thr

Val

Arg

Tyr

Leu

Ala

Phe

Pro

130

135

140

Arg

Gln

Gly

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Glu

Lys

Glu

Met

Lys

Ala

Ile

Trp

145

150

155

160

Cys

Ala

Lys

Asp

Lys

Asn

Lys

Ala

Phe

Asp

Val

Met

Ala

Gly

Lys

165

170

175

Ser

Val

Ala

Pro

Ala

Ser

Cys

Asp

Val

Asp

Ile

Ala

Asp

His

Tyr

Ala

180

185

190

Leu

Gly

Val

Gln

Leu

Gly

Val

Ser

Gly

Thr

Pro

Ala

Val

Leu

Ser

195

200

205

Asn

Gly

Thr

Leu

Val

Pro

Gly

Tyr

Gln

Pro

Lys

Glu

Met

Lys

Glu

210 215 220

- 92 031449

Phe

225

Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys His His His His

230 235 240

His

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантная грамотрицательная бактериальная клетка для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, содержащая:

a) экспрессирующий вектор, содержащий рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий белок дисульфидного обмена (DsbC), и один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154;

b) мутантный ген Tsp, кодирующий белок Tsp, имеющий сниженную на 50% или менее протеазную активность немутантного белка Tsp дикого типа; и

c) мутантный ген spr, кодирующий белок spr, чья последовательность дикого типа представлена в SEQ ID NO: 24, содержащей мутацию, которая приводит к замене аминокислоты цистеин на аланин в положении 94 (С94А).
2. Грамотрицательная бактериальная клетка по п.1, где DsbC содержит гистидиновую метку на Nконце или С-конце.
3. Грамотрицательная бактериальная клетка по п.1 или 2, где экспрессирующий вектор содержит полинуклеотид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 51.
4. Грамотрицательная бактериальная клетка по любому из пп.1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий три CDR, имеющих последовательность, представленную SEQ ID NO: 1 для CDRH1, SEQ ID NO: 2 для CDRH2 и SEQ ID NO: 3 для CDRH3, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий три CDR, имеющих последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4 для CDRL1, SEQ ID NO: 5 для CDRL2 и SEQ ID NO: 6 для CDRL3.
5. Грамотрицательная бактериальная клетка по п.4, где один или несколько полинуклеотидов кодируют антитело, содержащее последовательность вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 8, и вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 10.
6. Грамотрицательная бактериальная клетка по любому из пп.1-5, где антигенсвязывающим фрагментом антитела является Fab или Fab'.
7. Грамотрицательная бактериальная клетка по п.6, где Fab- или Fab'-фрагмент содержит легкую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12, и тяжелую цепь, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 14 или 16.
8. Грамотрицательная бактериальная клетка по любому из пп.1-7, где мутантный ген Tsp представляет собой подвергнутый нокауту ген Tsp.
9. Грамотрицательная бактериальная клетка по любому из пп.1-8, где клетка является изогенной для бактериальной клетки дикого типа, за исключением рекомбинантного полинуклеотида, кодирующего DsbC, и одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с CD154.
10. Грамотрицательная бактериальная клетка по любому из пп.1-9, где клетка является Е. coli.
11. Экспрессирующий вектор, содержащий рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий DsbC, и бицистронную последовательность для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, как определено в любом из пп.4-7, в которой выше в 3'-5' направлении цистрон содержит ДНК, кодирующую легкую цепь антитела, и ниже в 5'-3' направлении цистрон содержит ДНК, кодирующую соответствующую тяжелую цепь, отличающийся тем, что бицистронная последовательность содержит последовательность, выбранную из IGS1 (SEQ ID NO: 33), IGS2 (SEQ ID NO: 34), IGS3 (SEQ ID NO: 35) и IGS4 (SEQ ID NO: 36).
12. Экспрессирующий вектор по п.11, где DsbC определен в п.2 или кодирован полинуклеотидом, определенным в п.3.
13. Грамотрицательная бактериальная клетка по любому из пп.1-10, содержащая экспрессирующий вектор по любому из пп.11 и 12.
14. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, включающий:

a) культивирование рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки по любому из пп.110 или 13 в среде для культивирования в условиях, эффективных для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, и рекомбинантного полинуклео

- 93 031449 тида, кодирующего DsbC; и

b) выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с CD154, из периплазмы рекомбинантной грамотрицательной бактериальной клетки и/или среды для культивирования.
15. Способ по п.14, где способ дополнительно включает прикрепление эффекторной молекулы к аминокислоте на С-конце или по направлению к С-концу тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела.
16. Способ по п.15, где эффекторная молекула содержит поли(этиленгликоль) или метоксиполи(этиленгликоль).
17. Способ по п.16, где способ включает прикрепление к одному из остатков цистеина на С-конце тяжелой цепи лизил-малеимидной группы, где каждую аминогруппу лизилового остатка ковалентно связывают с остатком метоксиполи(этиленгликоля), имеющим молекулярную массу приблизительно 20000 Да.

EcoRl

Ndel

HlUCl , ( □НМаЕШ-ЬЯЯХ. L=

⁺ ня

EcoRl DsbC Ndel